RU2798281C1 - Set of sequences of primers and allele-specific probes for simultaneous genodiagnosis of four mutant alleles of beta-casein in cattle - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention can be used in veterinary practice and animal science for the diagnosis of 4 alleles of beta-casein (CSN2^A1, CSN2^B, CSN2^A2, CSN2^A3).

EFFECT: set of primer sequences and allele-specific probes is presented for the simultaneous gene diagnostics of four mutant beta-casein alleles in cattle by real-time polymerase chain reaction.

1 cl, 5 tbl, 1 ex

Description

Изобретение относится к области молекулярной генетики и может быть использовано в ветеринарной практике и зоотехнии с целью диагностики четырех важных аллелей бета-казеина (CSN2^A2, CSN2^A3, CSN2^A1, CSN2^B), ответственных за качество молока. Предложенный набор последовательности праймеров и аллельспецифических зондов позволяют одновременно идентифицировать четыре аллеля в локусе бета-казеина с помощью ПНР в режиме реального времени (ПЦР-РВ).The invention relates to the field of molecular genetics and can be used in veterinary practice and zootechnics in order to diagnose four important beta-casein alleles (CSN2 ^A2 , CSN2 ^A3 , CSN2 ^A1 , CSN2 ^B ) responsible for milk quality. The proposed set of primer sequences and allele-specific probes allow simultaneous identification of four alleles in the beta-casein locus using real-time PCR (RT-PCR).

У молочных пород крупного рогатого скота, локус бета-казеина очень полиморфен. Исследования показали, что бета-казеин представлен 12 аллелями: CSN2^A1, CSN2^A2, CSN2^A3, CSN2^B, CSN2^C, CSN2^D, CSN2^E, CSN2^F, CSN2^H1, CSN2^H2, CSN2^I, CSN2^G. Относительно 13-го CSN2^A4 аллеля, то он выявлен у местного южнокорейского крупного рогатого скота, встречается в виде гетерозигот, образуя генотипы вместе с CSN2^A1, CSN2^A2, CSN2^B вариантами. Структура формируемого им белка бета-казеина слабо изучена, как и большинство других выявленных вариантов [11].In dairy cattle, the beta-casein locus is highly polymorphic. Studies have shown that beta-casein is represented by 12 alleles: CSN2 ^A1 , CSN2 ^A2 , CSN2 ^A3 , CSN2 ^B , CSN2 ^C , CSN2 ^D , CSN2 ^E , CSN2 ^F , CSN2 ^H1 , CSN2 ^H2 , CSN2 ^I , CSN2 ^G. Regarding the 13th CSN2 ^A4 allele, it was found in local South Korean cattle, occurs as heterozygotes, forming genotypes together with CSN2 ^A1 , CSN2 ^A2 , CSN2 ^B variants. The structure of the beta-casein protein formed by it is poorly studied, like most other identified variants [11].

Группой ученых [12], известные аллели в локусе бета-казеина (CSN2), предложено делить на два семейства, с учетом влияния на качество молока. В семейство А1 входят следующие 5 аллелей, продукты которых являются ухудшателями качества молока: CSN2^A1, CSN2^B, CSN2^C, CSN2^F, CSN2^G. При этом первые два чаще всего встречаются у крупного рогатого скота.A group of scientists [12] proposed to divide the known alleles in the beta-casein locus (CSN2) into two families, taking into account the effect on milk quality. The A1 family includes the following 5 alleles, the products of which are deteriorating milk quality: CSN2 ^A1 , CSN2 ^B , CSN2 ^C , CSN2 ^F , CSN2 ^G . In this case, the first two are most often found in cattle.

В то же время А2 семейство представлено группой из 7 аллелей: CSN2^A2, CSN2^A3, CSN2^D, CSN2^E, CSN2^H1, CSN2^H2, CSN2^I, присутствие их продуктов оказывает, наоборот, позитивное влияние на качество молока [13].At the same time, the A2 family is represented by a group of 7 alleles: CSN2 ^A2 , CSN2 ^A3 , CSN2 ^D , CSN2 ^E , CSN2 ^H1 , CSN2 ^H2 , CSN2 ^I , the presence of their products, on the contrary, has a positive effect on milk quality [13].

Установлено, что CSN2^A1 и CSN2^B аллели распространены там, где использовались быки-носители в селекционных мероприятиях. На формирование аллелотипа стада коров с учетом CSN2^A2, CSN2^A3, CSN2^A1 и CSN2^B аллелей влияют такие факторы, как генетическая генеалогия быка, эффект основателя линии, дрейф мутантного или нормального аллеля.It was found that CSN2 ^A1 and CSN2 ^B alleles are common where carrier bulls were used in breeding activities. Factors such as the genetic genealogy of the bull, the effect of the founder of the line, the drift of the mutant or normal allele, influence the formation of the allelotype of the herd of cows, taking into account the CSN2 ^A2 , CSN2 ^A3 , CSN2 ^A1 and CSN2 ^B alleles.

Таким образом, в молекулярной генетике существует очевидная потребность в разработке высокочувствительного, специфичного и быстрого способа диагностики наиболее часто встречаемых четырех аллелей бета-казеина (CSN2^A1, CSN2^B, CSN2^A2, CSN2^A3). Кроме того, из-за незнания этих вопросов, закупаемый племенной материал не тестируют на (CSN2^A1, CSN2^B, CSN2^A2, CSN2^A3) аллели, в результате происходит «засорение» российских пород крупного рогатого скота нежелательными генотипами по локусу бета-казеина. Ранее нами были созданы аналогичные два Патента по каппа-казеину для оценки качества молока на сыропригодность.Thus, there is a clear need in molecular genetics to develop a highly sensitive, specific, and rapid method for diagnosing the most frequently occurring four beta-casein alleles (CSN2 ^A1 , CSN2 ^B , CSN2 ^A2 , CSN2 ^A3 ). In addition, due to ignorance of these issues, the purchased breeding material is not tested for (CSN2 ^A1 , CSN2 ^B , CSN2 ^A2 , CSN2 ^A3 ) alleles, as a result, Russian cattle breeds are “contaminated” with unwanted genotypes at the beta-casein locus. Previously, we created two similar patents for kappa-casein to assess the quality of milk for cheese suitability.

Причем дрейф мутантных CSN2^A1 и CSN2^B аллелей, как внутри одного государства, так и между странами обусловлен искусственным отбором. Главной причиной такого явления служит жесткая селекция и широкое использование небольшой группы элитных быков-носителей CSN2^A1 и CSN2^B аллелей для искусственного осеменения массива коров, множественной овуляции и эмбриотрансплантации (МОЭТ). Поступление мутантных CSN2^A1 и CSN2^B аллелей в Россию происходит также за счет покупки не аттестованного племенного материала: животные, семя, эмбрионы [3; 6].Moreover, the drift of mutant CSN2 ^A1 and CSN2 ^B alleles, both within one state and between countries, is due to artificial selection. The main reason for this phenomenon is the strict selection and widespread use of a small group of elite bulls carrying CSN2 ^A1 and CSN2 ^B alleles for artificial insemination of an array of cows, multiple ovulation and embryo transplantation (MOET). The entry of mutant CSN2 ^A1 and CSN2 ^B alleles into Russia also occurs through the purchase of non-certified breeding material: animals, semen, embryos [3; 6].

Коровы больше служат резерватом, т.е. биологическим хранителем его в стаде в виде гомозигот (CSN2^A1/A1, CSN2^B/B) или гетерозигот (CSN2^A1/A2, CSN2^A1/B, CSN2^A2/B), в силу более длительного использования [4].Cows serve more as a reserve, i.e. its biological custodian in the herd as homozygotes (CSN2 ^A1/A1 , CSN2 ^B/B ) or heterozygotes (CSN2 ^A1/A2 , CSN2 ^A1/B , CSN2 ^A2/B ), due to longer use [4].

Мутантные CSN2^A1 и CSN2^B аллели проявляются в виде кодоминантного фактора. Следует отметить, что это новое явление в диагностике аномальных аллелей в молочном скотоводстве. Ранее обнаруживаемые мутантные аллели, вызывающие наследственные болезни, встречались только как рецессивные факторы [7; 3; 5; 9; 10].Mutant CSN2 ^A1 and CSN2 ^B alleles appear as a codominant factor. It should be noted that this is a new phenomenon in the diagnosis of abnormal alleles in dairy cattle breeding. Previously detected mutant alleles that cause hereditary diseases were found only as recessive factors [7; 3; 5; 9; 10].

По материалам многих медицинских источников, А2 молоко является наиболее приемлемым в питании детей и взрослого человека [1; 2]. В то же время, причиной распространения мутантных CSN2^A1 и CSN2^B аллелей у пород крупного рогатого скота могли оказаться ряд факторов: высокий удой у коров, бык-носитель, семя которого широко использовалось для осеменения коров. Поскольку коммерческие породы крупного рогатого скота, пораженные мутацией, получили широкое распространение в силу высокой молочной продуктивности по всему миру, коров с А1 и В белками стало намного больше.According to many medical sources, A2 milk is the most acceptable in the diet of children and adults [1; 2]. At the same time, a number of factors could be the reason for the spread of mutant CSN2 ^A1 and CSN2 ^B alleles in cattle breeds: high milk yield in cows, a carrier bull whose semen was widely used for insemination of cows. Since commercial cattle breeds affected by the mutation have become widespread due to high milk production throughout the world, cows with A1 and B proteins have become much more.

Известно, что козье, овечье, верблюжье, кобылье, отчасти от коров Bos indicus L. и Bos taurus L. и женское грудное молоко, с точки зрения биохимии относится к А2 бета-казеиновому молоку. Главный вопрос заключается в том, почему это произошло, из-за чего носители CSN2^A1 и CSN2^B аллелей сохранились в процессе эволюции и так широко распространились. Одна из рабочих гипотез говорит о том, что CSN2^A1, CSN2^B, CSN2^A2 и CSN2^A3 аллели, располагаются рядом с тем пулом генов, которые оказывают положительное влияние на различные продуктивные признаки современных пород крупного рогатого скота [2; 6].It is known that goat, sheep, camel, mare, partly from cows Bos indicus L. and Bos taurus L. and human breast milk, in terms of biochemistry refers to A2 beta-casein milk. The main question is why this happened, why the carriers of the CSN2 ^A1 and CSN2 ^B alleles have survived through evolution and spread so widely. One of the working hypotheses suggests that CSN2 ^A1 , CSN2 ^B , CSN2 ^A2 and CSN2 ^A3 alleles are located next to the pool of genes that have a positive effect on various productive traits of modern cattle breeds [2; 6].

Известно, что молоко с А1 белком переваривается человеческим организмом иначе, чем с А2. При расщеплении А1 варианта белка бета-казеина выделяется маленький фрагмент - пептид, состоящий из семи аминокислот, он называется бета-казоморфином-7 (БКМ-7), а из А2 белка он не образуется [1; 8; 2;].It is known that milk with A1 protein is digested by the human body differently than with A2. When the A1 variant of the beta-casein protein is cleaved, a small fragment is released - a peptide consisting of seven amino acids, it is called beta-casomorphin-7 (BCM-7), and it is not formed from the A2 protein [1; 8; 2;].

Следует отметить, бета-казеин, молочный белок состоит из цепи аминокислот.Когда организм переваривает молоко, пищеварительные ферменты разрушают эти цепи на пептиды, а затем на отдельные аминокислоты. В А1 и А2 бета-казеиновых белках их структура состоит из 209 аминокислот.Of note, beta-casein, a milk protein, is made up of a chain of amino acids. When the body digests milk, digestive enzymes break these chains down into peptides and then into individual amino acids. In A1 and A2 beta-casein proteins, their structure consists of 209 amino acids.

Единственная разница между ними - аминокислота в 67 позиции. У А1 бета-казеинового белка - это гистидин, у А2 - пролин (табл. 1). У гистидина в белке А1 бета-казеина, очень слабые связи с соседними аминокислотами в 67 позиции. В результате происходит его расщепление, образуя бета-казоморфин-7.The only difference between them is the amino acid at position 67. In A1 beta-casein protein it is histidine, in A2 it is proline (Table 1). Histidine in the A1 protein of beta-casein has very weak bonds with neighboring amino acids at position 67. As a result, it is cleaved, forming beta-casomorphin-7.

Бета-казоморфин-7 обладает опиоидными окислительными свойствами. Научные исследования и клинические испытания показывают, что БКМ 7 может негативно влиять на здоровье и самочувствие взрослых и детей. При этом у детей негативная реакция может проявляться даже сильнее. Возможно это связано со слабо сформированной иммунной системой у детей [13; 1; 8; 2].Beta-casomorphin-7 has opioid oxidizing properties. Scientific studies and clinical trials show that BCM 7 can negatively affect the health and well-being of adults and children. At the same time, in children, a negative reaction can manifest itself even more strongly. Perhaps this is due to a poorly formed immune system in children [13; 1; 8; 2].

В таблице 1 показаны принципы формирования других аллелей у крупного рогатого скота. В производственной практике обычно молоко от разных коров смешивают. Поэтому в молоке всегда есть А1, В и другие белки А1 бета-казеинового семейства. Но их количество может меняться в зависимости от страны и разводимых пород.Table 1 shows the principles of formation of other alleles in cattle. In industrial practice, milk from different cows is usually mixed. Therefore, milk always contains A1, B and other A1 proteins of the beta-casein family. But their number may vary depending on the country and the breeds bred.

Известно, что примерно от 16 до 20% людей имеют непереносимость, их желудочно-кишечный тракт не может переваривать обычное молоко. Существует мнение, что это связано с лактозной непереносимостью. С другой стороны, некоторые ученые считают, что во многом виноват белок коровьего молока, - бета-лактоглобулин, вызывая, например, у детей диатез. Установлено, что действительной проблемой людей чаще всего связанной с непереносимостью молока является не лактоза или бета-лактоглобулин, а А1 бета-казеиновый белок, при расщеплении которого образуется бета-казоморфин-7. Т.е., люди, которые не пили молоко вообще, могут пить А2 молоко, а не соевое, рисовое, миндальное [1; 2; 8; 15].It is known that approximately 16 to 20% of people have an intolerance, their gastrointestinal tract cannot digest regular milk. It is believed that this is due to lactose intolerance. On the other hand, some scientists believe that cow's milk protein, beta-lactoglobulin, is largely to blame, causing, for example, diathesis in children. It has been established that the real problem of people most often associated with milk intolerance is not lactose or beta-lactoglobulin, but A1 beta-casein protein, the breakdown of which produces beta-casomorphin-7. That is, people who did not drink milk at all can drink A2 milk, but not soy, rice, almond [1; 2; 8; 15].

В заявленном изобретении осуществляется идентификация полиморфизма в локусе бета-казеина с помощью ПЦР-РВ и использованием зондов TaqMan. В ближайшем аналоге, статье Lien S., Alestrom P., Klungland H., Rogne S. Detection of multiple β-casein (CASB) alleles by amplification created restriction sites (ACRS) // Animal Genetics. - 1992. - Vol. 23. - P. 333-338 диагностируют бета-казеин, с использованием ПЦР с электрофоретическим методом детекции, что является принципиально другим методом диагностики данного полиморфизма [14]. Он занимает больше времени, для реализации метода необходимо больше оборудования, реактивов и помещений. Кроме этого вероятность контаминации при постановке ПЦР с электрофоретическим методом детекции выше. Метод более трудоемкий и занимает 8-ми часовой рабочий день.In the claimed invention, the identification of polymorphisms in the beta-casein locus is carried out using real-time PCR and using TaqMan probes. In the closest analogue, the article by Lien S., Alestrom P., Klungland H., Rogne S. Detection of multiple β-casein (CASB) alleles by amplification created restriction sites (ACRS) // Animal Genetics. - 1992. - Vol. 23. - P. 333-338 diagnose beta-casein using PCR with electrophoretic detection method, which is a fundamentally different method for diagnosing this polymorphism [14]. It takes more time, more equipment, reagents and premises are needed to implement the method. In addition, the probability of contamination during PCR with electrophoretic detection method is higher. The method is more labor-intensive and takes an 8-hour working day.

Целью данного изобретения является создание набора последовательности праймеров и аллельспецифических зондов для одновременной генодиагностики четырех мутантных аллелей бета-казеина (CSN2^A2, CSN2^A3, CSN2^A1, CSN2^B) у крупного рогатого скота с помощью ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ).The aim of this invention is to create a set of primer sequences and allele-specific probes for the simultaneous gene diagnostics of four mutant beta-casein alleles (CSN2 ^A2 , CSN2 ^A3 , CSN2 ^A1 , CSN2 ^B ) in cattle using real-time PCR (RT-PCR).

В настоящем изобретении представлен способ одновременной диагностики четырех аллелей у различных пород крупного рогатого скота. Тест-система разработана для аттестации всех половозрастных групп животных: быков-производителей, быковоспроизводящих групп коров, ремонтного молодняка, а также семени из спермобанка и эмбрионов.The present invention provides a method for the simultaneous diagnosis of four alleles in different breeds of cattle. The test system was developed for certification of all age and sex groups of animals: sires, bull-reproducing groups of cows, replacement young animals, as well as semen from the sperm bank and embryos.

Предлагаемый к патентованию набор праймеров и зондов в сравнении со всеми изученными аналогами имеет следующие преимущества: специфическая структура праймеров и зондов, а так же, с помощью предлагаемого к патентованию набора праймеров и зондов можно одновременно в одной пробирке провести полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени (ПЦР-РВ), что обеспечивает быстроту проведения диагностики и получение результата сразу по четырем наиболее часто встречаемым аллелям бета-казеина (CSN2^A1, CSN2^B, CSN2^A2, CSN2^A3).The set of primers and probes proposed for patenting has the following advantages in comparison with all the analogues studied: PCR-RT), which ensures the speed of diagnosis and obtaining results immediately for the four most common beta-casein alleles (CSN2 ^A1 , CSN2 ^B , CSN2 ^A2 , CSN2 ^A3 ).

Техническим результатом заявленного изобретения является возможность диагностики одновременно четырех аллелей (CSN2^A1, CSN2^B, CSN2^A2, CSN2^A3). Сокращение времени выполнения полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) (через 3 часа получен результат); не трудоемкость; возможность выполнять повторности; проводить контроль правильности исследования.The technical result of the claimed invention is the ability to simultaneously diagnose four alleles (CSN2 ^A1 , CSN2 ^B , CSN2 ^A2 , CSN2 ^A3 ). Reduced real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) time (result obtained after 3 hours); not labor intensive; the ability to perform repetitions; to control the correctness of the study.

Указанный технический результат достигается тем, что набор последовательностей праймеров и аллель-специфических зондов для одновременной генодиагностики четырех мутантных аллелей бета-казеина у крупного рогатого скота путем проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, имеет следующую структуру:This technical result is achieved by the fact that the set of primer sequences and allele-specific probes for simultaneous gene diagnostics of four mutant beta-casein alleles in cattle by real-time polymerase chain reaction has the following structure:

Выделение ДНК проводят из биологического материала, постановку полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, с использованием реактивов.Isolation of DNA is carried out from biological material, setting up a real-time polymerase chain reaction using reagents.

Согласно заявленному изобретению для диагностики используют реактивы в виде трех комплектов. Каждый комплект состоит из компонентов (реакционная смесь, разбавитель и полимераза), которые необходимо смешать в нужном объеме непосредственно перед проведением исследования.According to the claimed invention, reagents in the form of three sets are used for diagnostics. Each kit consists of components (reaction mixture, diluent and polymerase), which must be mixed in the required volume immediately before the study.

При подготовке к проведению реакции рассчитывают необходимый объем компонентов, исходя из количества исследуемых образцов плюс 4, из которых три положительных контрольных образца и один отрицательный контрольный образец для каждой реакционной смеси. Реактивы смешивают, затем в подготовленные для ПЦР пробирки вносят по 20 мкл приготовленной ПЦР-смеси, в каждую ПЦР пробирку добавляют по 5 мкл контрольных и исследуемых образцов. Пробирки помещают в амплификатор при числе циклов амплификации равном 40. Анализ полученных данных проводят путем сравнения амплифицированных участков генов, результаты интерпретируют на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией.In preparation for the reaction, calculate the required volume of components based on the number of test samples plus 4, of which three positive controls and one negative control for each reaction mixture. The reagents are mixed, then 20 µl of the prepared PCR mixture is added to the tubes prepared for PCR, 5 µl of control and test samples are added to each PCR tube. The tubes are placed in the amplifier with the number of amplification cycles equal to 40. The analysis of the obtained data is carried out by comparing the amplified gene regions, the results are interpreted based on the presence or absence of the intersection of the fluorescence curve with the threshold line set at the appropriate level.

Тест-система содержит 3 реакционных смеси: CASB_Pro67His, CASB_His106Gln, CASB_Ser122Arg (состав каждой из смесей: 50 мМ KCl, 50 мМ TRIS-HCl, 250 нМ dNTP, 2,5 мМ MgCl₂, праймеры - в концентрации 200 нМ, аллель-специфические зонды - в концентрации 200 нМ), разбавитель -деионизированная вода 1 мл, 2,5 ед. Taq ДНК-полимеразы, и 3 положительных контрольных образца, один отрицательный контрольный образец - для каждой реакционной смеси. Праймеры и флуоресцентно-меченные олигонуклеотидные зонды имеют следующие последовательности (табл. 2):The test system contains 3 reaction mixtures: CASB_Pro67His, CASB_His106Gln, CASB_Ser122Arg (composition of each mixture: 50 mM KCl, 50 mM TRIS-HCl, 250 nM dNTP, 2.5 mM MgCl ₂ , primers at a concentration of 200 nM, allele-specific ical probes - at a concentration of 200 nM), diluent - deionized water 1 ml, 2.5 units. Taq DNA polymerase, and 3 positive controls, one negative control for each reaction mixture. Primers and fluorescently labeled oligonucleotide probes have the following sequences (Table 2):

Экспериментально установлен оптимальный состав реакционной смеси для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, подобрано сочетание праймеров, необходимое и достаточное соотношение компонентов реакционной смеси и определен режим постановки ПЦР, что является важным при проведении ПЦР-анализа. Система рассчитана на проведение 100 реакций объемом 25 мкл (20 мкл реакционной смеси+5 мкл исследуемого образца).The optimal composition of the reaction mixture for real-time polymerase chain reaction was experimentally established, the combination of primers, the necessary and sufficient ratio of the components of the reaction mixture were selected, and the PCR setting mode was determined, which is important for PCR analysis. The system is designed to carry out 100 reactions with a volume of 25 µl (20 µl of the reaction mixture + 5 µl of the test sample).

Подбор праймеров и аллельспецифичных зондов (табл.3) проводили при помощи пакета прикладных программ «Oligo 6.0» на основании анализа нуклеотидных последовательностей локуса бета-казеина, опубликованных в базе данных Национального центра биотехнологической информации США (NCBI - National Center for Biotechnology Information USA).The selection of primers and allele-specific probes (Table 3) was carried out using the Oligo 6.0 application package based on the analysis of the nucleotide sequences of the beta-casein locus published in the database of the National Center for Biotechnology Information USA (NCBI - National Center for Biotechnology Information USA).

Источником для проведения диагностики служит предварительно выделенная ДНК из образцов биологического материала (цельной крови, спермы, эмбрионов, молока или кожи).The source for diagnostics is previously isolated DNA from samples of biological material (whole blood, semen, embryos, milk or skin).

Выделение ДНК проводили сорбентным методом (S-Сорб, компания «СИНТОЛ», Москва). Далее выделенную ДНК использовали в реакции: 5 мкл образца добавляли к реакционной смеси ПЦР.DNA isolation was performed by the sorbent method (S-Sorb, SYNTOL, Moscow). Next, the isolated DNA was used in the reaction: 5 μl of the sample was added to the PCR reaction mixture.

Набор компонентов для реакции представлен в таблице 3.The set of components for the reaction is presented in Table 3.

Условия хранения: №1-3, при температуре -16-20°СStorage conditions: No. 1-3, at a temperature of -16-20 ° C

Компоненты размораживали, перемешивали и центрифугировали. Готовили смесь компонентов, добавляя их в порядке, указанном в таблице 4.The components were thawed, mixed and centrifuged. A mixture of components was prepared by adding them in the order indicated in Table 4.

ПЦР пробирки маркировали. В подготовленные для ПЦР пробирки вносили по 20 мкл смеси компонентов. Затем в каждую ПЦР пробирку вносили по 5 мкл контрольных и исследуемых образцов в соответствии с маркировкой, перемешивали многократным пипетированием и плотно закрывали крышку. Пробирки помещали в амплификатор, затем программировали работу прибора.PCR tubes were labeled. The tubes prepared for PCR were filled with 20 µl of the mixture of components. Then, 5 µl of control and test samples were added to each PCR tube in accordance with the marking, mixed by repeated pipetting, and the lid was tightly closed. The test tubes were placed in the cycler, then the operation of the device was programmed.

Профиль реакции:Reaction profile:

1. Удержание температуры 94°С - 3 мин, один повтор.1. Hold temperature 94°C - 3 min, one repetition.

2. Циклирование 1 (без детекции)2. Cycling 1 (no detection)

94°С - 20 сек94°C - 20 sec

58°С - 20 сек58°C - 20 sec

61°С - 30 сек61°С - 30 sec

Цикл повторяли 10 раз.The cycle was repeated 10 times.

3. Циклирование 2 (с детекцией)3. Cycling 2 (with detection)

94°С - 20 сек94°C - 20 sec

58°С - 20 сек58°C - 20 sec

61°С - 30 сек - детекция по каналам: Green, Yellow, Orange, Red61°С - 30 sec - detection by channels: Green, Yellow, Orange, Red

Цикл повторяли 30 раз.The cycle was repeated 30 times.

В процессе циклирования отжиг праймеров и синтез новой цепи ДНК происходил при температуре 61°С. При первом циклировании детекцию не проводили, так как данные не репрезентативны. При втором циклировании проводили 30 повторов, в результате получали стабильные данные, которые являются окончательными в плане диагностики генотипов.During cycling, the annealing of primers and the synthesis of a new DNA strand occurred at a temperature of 61°C. No detection was performed on the first cycling as the data is not representative. At the second cycling, 30 repetitions were performed, as a result, stable data were obtained, which are final in terms of the diagnosis of genotypes.

Создание шаблона ПЦР-РВ, а также анализ результатов исследования осуществляли при помощи программного обеспечения «Rotor-Gene 6000 1.8» к прибору Rotor Gene Q (Corbett Research, Австралия). Результатом анализа является определение сочетания четырех аллелей гена бета-казеина (CASB^A2, CASB^A3, CASB^AI, CASB^B) у крупного рогатого скота.The creation of a real-time PCR template, as well as analysis of the results of the study, was carried out using the Rotor-Gene 6000 1.8 software for the Rotor Gene Q device (Corbett Research, Australia). The result of the analysis is the determination of the combination of four alleles of the beta-casein gene (CASB ^A2 , CASB ^A3 , CASB ^AI , CASB ^B ) in cattle.

Принцип метода: одна пара праймеров и три пары аллель-специфических зондов были подобраны с учетом трех участков однонуклеотидных замен (полиморфизмов) в гене бета казеина (CASB) крупного рогатого скота. Для каждого полиморфизма зонды подобраны таким образом, чтобы один из них специфически гибридизовался при температуре проведения синтеза цепей с аллелем нормального (дикого) типа, а второй зонд - с аллелем мутантного типа. Зонды метят различными флуорофорами (в данном случае FAM, R6G, ROX, Су5), а результаты реакции с ними регистрируют на четырех различных каналах детекции прибора для ПЦР-РВ (в нашем случае RotorGene-6000) - Green, Yellow, Orange, Red. Общая пара праймеров и три пары зондов были скомплектованы в три реакционные смеси - каждая смесь детектирует один полиморфизм. В первой реакционной смеси происходит детекция замены аминокислоты пролин на гистидин в положении 67, что соответствует замене азотистого основания цитозин на аденин, во второй смеси - замена аминокислоты серии на аргинин в положении 122, что соответствует замене азотистого основания цитозин на гуанин, в третьей смеси - замена аминокислоты гистидина на глутамин в положении 106, что соответствует замене азотистого основания цитозина на аденин. Вывод об аллельном варианте гена бета казеина делают на основании сочетания результатов детекции для трех реакционных смесейPrinciple of the method: one pair of primers and three pairs of allele-specific probes were selected taking into account three sites of single nucleotide substitutions (polymorphisms) in the bovine beta-casein (CASB) gene. For each polymorphism, the probes were selected in such a way that one of them specifically hybridized at the temperature of chain synthesis with the normal (wild) type allele, and the second probe, with the mutant type allele. The probes are labeled with various fluorophores (in this case, FAM, R6G, ROX, Cy5), and the results of the reaction with them are recorded on four different detection channels of the real-time PCR instrument (in our case, RotorGene-6000) - Green, Yellow, Orange, Red. The total pair of primers and three pairs of probes were assembled into three reaction mixtures - each mixture detects one polymorphism. In the first reaction mixture, the substitution of the amino acid proline for histidine at position 67 is detected, which corresponds to the replacement of the nitrogenous base cytosine for adenine, in the second mixture, the amino acid of the series is replaced with arginine at position 122, which corresponds to the replacement of the nitrogenous base cytosine for guanine, in the third mixture - substitution of the amino acid histidine for glutamine at position 106, which corresponds to the replacement of the nitrogenous base of cytosine with adenine. The conclusion about the allelic variant of the beta casein gene is made on the basis of a combination of detection results for three reaction mixtures

Интерпретацию результатов анализа исследуемых образцов проводили в соответствии с таблицей 5:The interpretation of the results of the analysis of the studied samples was carried out in accordance with Table 5:

Основными преимуществами заявляемого изобретения являются:The main advantages of the claimed invention are:

1. Аттестация элитных животных различных пород крупного рогатого скота по четырем аллелям бета-казеина (CSN2^A1, CSN2^B, CSN2^A2, CSN2^A3) с помощью заявленного набора последовательности праймеров и аллельспецифических зондов позволит целенаправленно формировать аллелофонд быков-производителей, быковоспроизводящих групп коров, ремонтный молодняк, а также накапливать племенной материал (банк семени и эмбрионов).1. Certification of elite animals of various breeds of cattle for four alleles of beta-casein (CSN2 ^A1 , CSN2 ^B , CSN2 ^A2 , CSN2 ^A3 ) using the declared set of primer sequences and allele-specific probes will make it possible to purposefully form the allele pool of sires, bull-reproducing groups of cows, replacement young animals, as well as to accumulate breeding material (seed and embryo bank).

2. Наличие генетического паспорта по четырем аллелям бета-казеина (CSN2^A1, CSN2^B, CSN2^A2, CSN2^A3), а также тест-системы для его осуществления, позволит эффективно вести селекционно-племенную работу в племенных стадах крупного рогатого скота Российской Федерации.2. The presence of a genetic passport for four alleles of beta-casein (CSN2 ^A1 , CSN2 ^B , CSN2 ^A2 , CSN2 ^A3 ), as well as a test system for its implementation, will allow effective selection and breeding work in the breeding herds of cattle of the Russian Federation.

3. При завозе племенного материала в Россию из-за рубежа обязательно наличие генетического паспорта по четырем аллелям бета-казеина (CSN2^A1, CSN2^B, CSN2^A2, CSN2^A3). С целью подтверждения генотипа по бета-казеину, закупленные животные после карантина должны пройти повторную аттестацию.3. When importing breeding material to Russia from abroad, it is mandatory to have a genetic passport for four beta-casein alleles (CSN2 ^A1 , CSN2 ^B , CSN2 ^A2 , CSN2 ^A3 ). In order to confirm the beta-casein genotype, purchased animals after quarantine must be re-certified.

ЛитератураLiterature

1. Дубынин В.А., Каменский А.А. Бета-казоморфины и их роль в регуляции поведения. Место издания Товарищество научных изданий КМК Москва, 2010. - 306 с.1. Dubynin V.A., Kamensky A.A. Beta-casomorphins and their role in the regulation of behavior. Place of publication Partnership of scientific publications KMK Moscow, 2010. - 306 p.

2. Вудфорд К. Дьявол в молоке. Болезнь, здоровье и политика. Молоко А1 и А2. Издательство РАМН. - Москва, 2018. - 320 с.2. Woodford K. Devil in milk. Illness, health and politics. Milk A1 and A2. RAMN publishing house. - Moscow, 2018. - 320 p.

3. Марзанов Н.С., Девришов Д.А., Абылкасымов Д.А., Марзанова С.Н., Коновалова Н.В., Либет И.С., Новикова Л.Ф., Попов А.Н., Турбина И.С., Марзанова Л.К. Встречаемость β-CN^A2 и β-CN^A1 аллелей в локусе бета-казеина у пород крупного рогатого скота. В сборнике: повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения, материалы XXV международной научно-практической конференции. Российская академия менеджмента в животноводстве. Г.о. Подольск, пос. Быково, 2019а. - С. 134-143.3. N. S. Marzanov, D. A. Devrishov, D. A. Abylkasymov, S. N. Marzanova, N. V. Konovalova, I. S. Libet, L. F. Novikova, and A. N. Popov, Turbina I.S., Marzanova L.K. Occurrence of β-CN ^A2 and β-CN ^A1 alleles at the beta-casein locus in cattle breeds. In the collection: increasing the competitiveness of animal husbandry and the tasks of staffing, materials of the XXV international scientific and practical conference. Russian Academy of Management in Animal Husbandry. G.o. Podolsk, pos. Bykovo, 2019a. - S. 134-143.

4. Марзанов Н.С., Девришов Д.А., Марзанова С.Н. Генетический груз мутаций в породах крупного рогатого скота. Материалы Международной научно-практической конференции: «Молекулярно-генетические технологии для анализа экспрессии генов продуктивности и устойчивости к заболеваниям животных». - М.: Издательство «Сельскохозяйственные технологии». - Москва, 20196.-С. 124-130.4. Marzanov N.S., Devrishov D.A., Marzanova S.N. Genetic load of mutations in cattle breeds. Proceedings of the International scientific-practical conference: "Molecular genetic technologies for the analysis of gene expression of productivity and resistance to animal diseases". - M.: Publishing house "Agricultural technologies". - Moscow, 20196.-p. 124-130.

5. Марзанов Н.С., Девришов Д.А., Марзанова С.Н., Абылкасымов Д.А., Коновалова Н.В., Либет И.С. Характеристика российских молочных пород крупного рогатого скота по встречаемости генотипов и аллелей в локусе бета-казеина. // Ветеринария Зоотехния Биотехнология. - 2020а. - №1. - С. 47-52. DOI: 10.26155/vet.zoo.bio.202001007.5. Marzanov N.S., Devrishov D.A., Marzanova S.N., Abylkasymov D.A., Konovalova N.V., Libet I.S. Characteristics of Russian dairy breeds of cattle according to the occurrence of genotypes and alleles in the beta-casein locus. // Veterinary Medicine Zootechnics Biotechnology. - 2020a. - No. 1. - S. 47-52. DOI: 10.26155/vet.zoo.bio.202001007.

6. Марзанов Н.С., Абылкасымов Д.А., Либет И.С, Девришов Д.А., Марзанова С.Н. Характеристика аллелотипа у коров черно-пестрой породы по локусам бета- и каппа-казеина и качественные показатели молока. Сборник трудов ФГАНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности» (ФГАНУ «ВНИМИ»), под общей редакцией академика РАН Галстяна Арама Генриховича. - Москва, 2020в. - С. 368-376.6. Marzanov N.S., Abylkasymov D.A., Libet I.S., Devrishov D.A., Marzanova S.N. Characteristics of the allelotype in black-and-white cows by loci of beta- and kappa-casein and quality indicators of milk. Proceedings of the All-Russian Scientific Research Institute of the Dairy Industry (FGANU VNIMI), under the general editorship of Academician Aram Genrikhovich Galstyan. - Moscow, 2020v. - S. 368-376.

DOI 10.37442/978-5-6043854-1-8-2020-1-368-376.DOI 10.37442/978-5-6043854-1-8-2020-1-368-376.

7. Турбина И.С.Характеристика быков-производителей по различным генетическим маркерам. Дис. канд. биол. наук. - Москва, 2006. - 112 с.7. Turbina I.S. Characterization of sires by various genetic markers. Dis. cand. biol. Sciences. - Moscow, 2006. - 112 p.

8. Соколов О.Ю. Опиоидные пептиды и психомоторное развитие детей: автореф. дисс. д.б.н. - Москва, 2012. - 48 с.8. Sokolov O.Yu. Opioid peptides and psychomotor development of children: Ph.D. diss. d.b.n. - Moscow, 2012. - 48 p.

9. Dar А.Н., Kumar S., Kumari P., Mukesh M., Singh D.V., Sharma R.K., Ghosh A.K., Singh В., Panwar V.A., Sodhi M. Distribution of allelic and genotyping frequency of A1/A2 allele of beta casein in Badri cattle. // Journal Livestock Diversity. - 2018. - Vol.8. -No.2. - P. 115-119.9. Dar A.N., Kumar S., Kumari P., Mukesh M., Singh D.V., Sharma R.K., Ghosh A.K., Singh B., Panwar V.A., Sodhi M. Distribution of allelic and genotyping frequency of A1/A2 allele of beta casein in Badri cattle. // Journal Livestock Diversity. - 2018. - Vol.8. -No.2. - P. 115-119.

10. Dinc H. Genotyping of beta-casein, kappa-casein and beta-lactoglobulin genes in Turkish native cattle breeds and efforts to delineate BCM-7 on human PBMC. In partial fulfillment of the requirements for the degree of doctor of philosophy in biology. September. Turkey, 2009. - 187 p.10. Dinc H. Genotyping of beta-casein, kappa-casein native and beta-lactoglobulin genes in Turkish cattle breeds and efforts to delineate BCM-7 on human PBMC. In partial fulfillment of the requirements for the degree of doctor of philosophy in biology. September. Turkey, 2009. - 187 p.

11. Chung E.R., Han S.K., Rhim T.J. Milk protein polymorphisms as genetic marker in Korean native cattle. // Asian-Australian Journal of Animal Sciences. -1995. - Vol.8(2). -P. 187-194. DOI: https://doi.org/10.5713/ajas.1995.18711. Chung E.R., Han S.K., Rhim T.J. Milk protein polymorphisms as a genetic marker in Korean native cattle. // Asian-Australian Journal of Animal Sciences. -1995. - Vol.8(2). -P. 187-194. DOI: https://doi.org/10.5713/ajas.1995.187

12. Farrell H.M.Jr., Jimenez-Florez R., Bleck G.T., Brown E.M., Butler J.E., Creamer L.K., Hicks C.L., Hollar СМ., Ng-Kwai-Hang K.F., Swaisgood H.E. Nomenclature of the proteins of cows' milk - sixth revision // J Dairy Sci. - 2004. -Vol. 87. - P. 1641-1674.12. Farrell H.M.Jr., Jimenez-Florez R., Bleck G.T., Brown E.M., Butler J.E., Creamer L.K., Hicks C.L., Hollar CM., Ng-Kwai-Hang K.F., Swaisgood H.E. Nomenclature of the proteins of cows' milk - sixth revision // J Dairy Sci. - 2004. -Vol. 87. - P. 1641-1674.

13. Kaminski S., Cieslinska A., Kostyra E. Polymorphism of bovine beta-casein and its potential effect on human health // Journal of Applied Genetics. - 2007. - Vol.48(3). - P. 189-198.13. Kaminski S., Cieslinska A., Kostyra E. Polymorphism of bovine beta-casein and its potential effect on human health // Journal of Applied Genetics. - 2007. - Vol.48(3). - P. 189-198.

14. Lien S., Alestrom P., Klungland H., Rogne S. Detection of multiple β-casein (CASB) alleles by amplification created restriction sites (ACRS) // Animal Genetics. - 1992. - Vol. 23. - P. 333-338.14. Lien S., Alestrom P., Klungland H., Rogne S. Detection of multiple β-casein (CASB) alleles by amplification created restriction sites (ACRS) // Animal Genetics. - 1992. - Vol. 23. - P. 333-338.

15. Pal S., Woodford K., Kukuljan S., Ho S. Milk Intolerance, Beta-Casein and Lactose // Nutrients. - 2015. - Vol.7(9). - P.7285-7297. DOI: 10.3390/nu7095339.15. Pal S., Woodford K., Kukuljan S., Ho S. Milk Intolerance, Beta-Casein and Lactose // Nutrients. - 2015. - Vol.7(9). - P.7285-7297. DOI: 10.3390/nu7095339.

Claims (2)

Набор последовательностей праймеров и аллель-специфических зондов для одновременной генодиагностики четырех аллелей бета-казеина у крупного рогатого скота путем проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, имеющих следующую структуру:A set of primer sequences and allele-specific probes for the simultaneous gene diagnostics of four alleles of beta-casein in cattle by real-time polymerase chain reaction, having the following structure: