RU2798085C2 - Prodrug containing a self-cleavable linker - Google Patents

Abstract

FIELD: pharmaceuticals.

SUBSTANCE: invention relates to a prodrug, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, containing a drug-linker conjugate D-L, wherein D is a nitrogen-containing polypeptide; L is a biologically inactive linker fragment L¹ represented by the structural formula (I) where the dotted line demonstrates the attachment to the nitrogen of the polypeptide through the formation of an amide bond, where R¹, R^la, R², R^2a, R³, R^3a, X, X¹, X², X³ have the meanings given in the claims, and where L¹ is substituted by 1–4 L²-Z groups, provided that the hydrogen marked with * in formula (I) cannot be substituted by a substituent; where L² represents a single chemical bond or spacer; and Z represents a carrier group such as a linear or branched poly(ethylene glycol) with a molecular weight of 2,000 to 150,000 Da.

EFFECT: obtaining a prodrug containing a self-cleavable linker.

12 cl, 3 dwg, 52 ex

Description

Настоящее изобретение относится к пролекарству, содержащему конъюгат лекарственное средство-линкер D-L, или его фармацевтически приемлемой соли. Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим указанные пролекарства, и их использованию в качестве лекарственных препаратов.The present invention relates to a prodrug containing a drug-linker conjugate D-L, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. The invention also relates to pharmaceutical compositions containing these prodrugs and their use as drugs.

Для улучшения физико-химических или фармакокинетических свойств лекарственного средства in vivo оно может быть конъюгировано с носителем.To improve the physicochemical or pharmacokinetic properties of the drug in vivo, it can be conjugated to a carrier.

Как правило, носители в системах доставки лекарственных средств используют либо в нековалентной форме, с лекарственным средством, составленным физико-химическим образом в виде смеси носителя с растворителем, либо посредством ковалентного присоединения реагента-носителя к одной из функциональных групп лекарственного средства.Typically, carriers in drug delivery systems are used either in non-covalent form, with the drug formulated physicochemically as a mixture of carrier and solvent, or by covalently attaching a carrier reagent to one of the functional groups of the drug.

Однако нековалентный метод требует инкапсулирования высоко эффективного лекарственного средства для предотвращения его неконтролируемого, внезапного высвобождения. При ограничении диффузии несвязанной водорастворимой лекарственной молекулы необходимы сильные ван-дер-ваальсовы контакты, часто опосредованные гидрофобными частями молекулы. Многие конформационно чувствительные лекарственные средства, такие как белки или пептиды, теряют свою функциональность в процессе их инкапсулирования и/или при последующем хранении инкапсулированного лекарственного средства. Кроме того, такие содержащие аминогруппы лекарственные средства легко вступают в побочные реакции с продуктами деградации носителя (см., например, работу D.H. Lee и др., J. Contr. Rel, 2003, 92, 291-299). Более того, зависимость механизма высвобождения лекарственного средства в результате биодеградации может привести к межиндивидуальной вариабельности.However, the non-covalent method requires the encapsulation of a highly effective drug to prevent its uncontrolled, sudden release. When limiting the diffusion of an unbound water-soluble drug molecule, strong van der Waals contacts are needed, often mediated by hydrophobic parts of the molecule. Many conformationally sensitive drugs, such as proteins or peptides, lose their functionality during encapsulation and/or subsequent storage of the encapsulated drug. In addition, such amine-containing drugs readily side-react with carrier degradation products (see, for example, D.H. Lee et al., J. Contr. Rel, 2003, 92, 291-299). Moreover, the dependence of the mechanism of drug release as a result of biodegradation can lead to inter-individual variability.

В альтернативном варианте лекарственные вещества могут быть конъюгарованы с носителем посредством ковалентных связей. Этот метод применим к различным классам молекул от так называемых малых молекул, включая природные продукты вплоть до более крупных белковых молекул. Ковалентно связанные конъюгаты лекарственного средства с носителем можно подразделить на две группы. Во-первых, это конъюгаты, где ковалентная связь между носителем и лекарством обычно существует во время действия лекарственного средства ("перманентная ковалентная связь"), то есть производное лекарственного средства проявляет свои фармакологические эффекты, которые известны для данного лекарства как такового. Во-вторых, ковалентная связь по большей части предварительно разорвана с высвобождением лекарства как такового, которое может проявлять свои известные фармакологические эффекты. В последнем случае ковалентный конъюгат лекарственного средства с носителем называется пролекарством, связанным с носителем, или пролекарством с носителем.Alternatively, the drugs may be conjugated to the carrier through covalent bonds. This method is applicable to various classes of molecules from the so-called small molecules, including natural products up to larger protein molecules. Covalently bonded drug-carrier conjugates can be divided into two groups. Firstly, these are conjugates, where a covalent bond between the carrier and the drug usually exists during the action of the drug ("permanent covalent bond"), that is, the drug derivative exhibits its pharmacological effects, which are known for this drug as such. Secondly, the covalent bond is largely pre-broken, releasing the drug itself, which may exhibit its known pharmacological effects. In the latter case, the covalent drug-carrier conjugate is referred to as a carrier-linked prodrug or carrier-bound prodrug.

Для обеспечения разрыва ковалентной связи между носителем и лекарственным средством необходимо легкое удаление указанной связи in vivo для высвобождения лекарственного вещества (активация пролекарства).To ensure that the covalent bond between the carrier and the drug is broken, the bond must be easily removed in vivo to release the drug (activation of the prodrug).

Активация пролекарства может являться результатом ферментативного или неферментативного расщепления указанной связи между носителем и молекулой лекарственного средства, или последовательной комбинацией обоих, т.е. через стадию ферментативной реакции, сопровождаемую неферментативной перегруппировкой.Prodrug activation may result from enzymatic or non-enzymatic cleavage of said bond between the carrier and the drug molecule, or a combination of both, ie. through an enzymatic reaction step followed by a non-enzymatic rearrangement.

Ферментативно индуцированная активация пролекарства характеризуется тем, что в безферментной in vitro среде, такой как водный буферный раствор, может происходить расщепление, например, сложного эфира или амида, но соответствующая скорость гидролиза может быть чрезвычайно мала и терапевтически непригодной. В in vivo среде обычно присутствуют эстеразы или амидазы, и указанные эстеразы и амидазы могут приводить к существенному каталитическому ускорению кинетики гидролиза в интервале от двукратного увеличения вплоть до величины в несколько порядков. Таким образом, разрыв ковалентной связи контролируется, главным образом, ферментативной реакцией.Enzymatically induced prodrug activation is characterized in that in an enzyme-free in vitro medium, such as an aqueous buffer solution, cleavage of, for example, an ester or amide can occur, but the corresponding rate of hydrolysis can be extremely slow and therapeutically unsuitable. Esterases or amidases are usually present in the in vivo environment, and these esterases and amidases can lead to significant catalytic acceleration of the hydrolysis kinetics ranging from a two-fold increase up to several orders of magnitude. Thus, the breaking of a covalent bond is controlled mainly by an enzymatic reaction.

Главным недостатком в основном ферментативного расщепления являются межиндивидуальная вариабельность. Уровни ферментов могут существенно различаться между отдельными лицами, что приводит к биологической изменчивости активации пролекарства под действием ферментативного гидролиза. Уровни ферментов также могут меняться в зависимости от места введения. Например, известно, что при подкожной инъекции в некоторых областях тела возникают более предсказуемые терапевтические эффекты, чем в других. Для уменьшения этого непредсказуемого эффекта неферментативное расщепление или внутримолекулярный катализ представляет особый интерес.The main disadvantage of mainly enzymatic digestion is inter-individual variability. Enzyme levels can vary significantly between individuals, resulting in biological variability in prodrug activation by enzymatic hydrolysis. Enzyme levels may also vary depending on the site of administration. For example, subcutaneous injection is known to produce more predictable therapeutic effects in some areas of the body than in others. To reduce this unpredictable effect, non-enzymatic cleavage or intramolecular catalysis is of particular interest.

Таким образом, ферментнезависимое автокаталитическое расщепление связи между носителем и биологически активным фрагментом является предпочтительным. В большинстве случаев это достигается посредством соответствующим образом сконструированного линкерного фрагмента между носителем и биологически активным фрагментом, который непосредственно присоединен через ковалентную связь к функциональной группе биологически активного фрагмента.Thus, enzyme-independent autocatalytic cleavage of the bond between the carrier and the biologically active moiety is preferred. In most cases, this is achieved by means of an appropriately designed linker fragment between the carrier and the biologically active fragment, which is directly attached via a covalent bond to the functional group of the biologically active fragment.

Специфические типы линкеров известны в данной области техники. Y. Sohma и др., описывают в журнале J. Med. Chem. 46 (2003), 4124-4135 пролекарства на основе сложных эфиров, в которых носитель является водорастворимым, а биологически активный фрагмент получен из ингибитора KNI-727 протеазы ВИЧ-1. Используемый линкерный фрагмент присоединен к биологически активному фрагменту через сложноэфирную группу. Механизмом этой системы пролекарства является активация реакции циклизации, приводящая к образованию циклического имида для разрыва сложноэфирных связей.Specific types of linkers are known in the art. Y. Sohma et al., describe in J. Med. Chem. 46 (2003), 4124-4135 ester prodrugs wherein the carrier is water soluble and the biologically active moiety is derived from the HIV-1 protease inhibitor KNI-727. The linker fragment used is attached to the biologically active fragment via an ester group. The mechanism of this prodrug system is the activation of the cyclization reaction, leading to the formation of a cyclic imide to break the ester bonds.

Однако имеет недостаток из-за нестабильности сложноэфирной функциональной группы. Более того, сложноэфирные функциональные группы могут представлять собой менее хемоселективно доступные группы для конъюгирования носителя или линкера с лекарством.However, it has a disadvantage due to the instability of the ester functional group. Moreover, ester functional groups may be less chemoselectively available for conjugation of the carrier or linker to the drug.

A.J. Garman др., (A J. Garman, S.B. Kalindjan, FEBS Lett. 1987, 223 (2), 361-365 1987) используют ПЭГ5000-малеиновый ангидрид для обратимой модификации аминогрупп в активаторе плазминогена тканевого типа и урокиназы. Восстановление функционального фермента из конъюгата ПЭГ и uPA при инкубации в буферном растворе с рН 7,4 посредством расщепления связи малеаминовой кислоты протекает по кинетике реакции первого порядка при периоде полужизни 6,1 часа. Недостатком связи малеаминовой кислоты является отсутствие стабильности конъюгата при более низких значениях рН. Это накладывает ограничение на применимость связи малеаминовой кислоты с биологически активными веществами, которые стабильны при щелочных (высоких) значениях рН, поскольку для предотвращения преждевременного расщепления пролекарства очистку полимерного конъюгата с биологически активным агентом необходимо осуществлять в щелочных условиях (высоких значениях рН).A.J. Garman et al. (A J. Garman, S. B. Kalindjan, FEBS Lett. 1987, 223(2), 361-365 1987) use PEG5000-maleic anhydride to reversibly modify amino groups in a tissue-type plasminogen activator and urokinase. Recovery of a functional enzyme from the PEG-uPA conjugate upon incubation in pH 7.4 buffer via cleavage of the maleamic acid bond follows first order reaction kinetics with a half-life of 6.1 hours. The disadvantage of the maleamic acid bond is the lack of stability of the conjugate at lower pH values. This imposes a limitation on the applicability of the association of maleamic acid with biologically active substances that are stable at alkaline (high) pH values, since in order to prevent premature cleavage of the prodrug, the purification of the polymeric conjugate with the biologically active agent must be carried out under alkaline conditions (high pH values).

В WO 2004/108070 описывается система пролекарства на основе линкера амидного производного N,N-бис-(2-гидроксиэтил)глицина (бицина). В этой системе две молекулы ПЭГ-носителя соединены с бициновой молекулой, соединенной с аминогруппой молекулы лекарственного средства. Первые две стадии активации пролекарства заключаются в ферментативном расщеплении первых связей, соединяющих обе молекулы ПЭГ-носителя с гидроксильными группами бициновой активирующей группы. В этом документе описаны различные связи между ПЭГ и бицином, приводящие к различной кинетике активации пролекарства. На второй стадии активации пролекарства происходит расщепление второй связи, соединяющей бицин-активирующую группу с аминогруппой молекулы лекарственного средства. Основным недостатком этой системы является присоединение полимера к бициновому линкеру, приводящее к медленной скорости гидролиза этой второй амидной связи бицина (t_1/2>3 ч в фосфатном буфере). Вследствие этого высвобождение бицин-модифицированного интермедиата пролекарства может демонстрировать различные фармакокинетические, иммуногенные, токсикологические и фармакодинамические свойства по сравнению с молекулой исходного нативного лекарственного средства.WO 2004/108070 describes a prodrug system based on an N,N-bis-(2-hydroxyethyl)glycine (bicine) amide derivative linker. In this system, two PEG carrier molecules are linked to a bicine molecule linked to the amino group of the drug molecule. The first two steps of prodrug activation involve enzymatic cleavage of the first bonds connecting both PEG carrier molecules to the hydroxyl groups of the bicine activating group. This document describes the various linkages between PEG and bicine leading to different prodrug activation kinetics. At the second stage of prodrug activation, the second bond connecting the bicine-activating group with the amino group of the drug molecule occurs. The main disadvantage of this system is the attachment of the polymer to the bicine linker, resulting in a slow rate of hydrolysis of this second bicine amide bond (t _1/2 >3 h in phosphate buffer). As a consequence, the release of the bicine-modified prodrug intermediate may exhibit different pharmacokinetic, immunogenic, toxicological, and pharmacodynamic properties compared to the parent native drug molecule.

Другая система на основе бицина описана в WO 2006/136586.Another bicine-based system is described in WO 2006/136586.

Таким образом, существует потребность в создании альтернативных связанных с носителем пролекарств, в которых линкер обеспечивал бы автокаталитическое расщепление для высвобождения лекарства в немодифицированной форме, в которой не оставалось бы остатков, происходящих из линкера.Thus, there is a need to provide alternative carrier-bound prodrugs in which the linker would provide autocatalytic cleavage to release the drug in an unmodified form that would not leave residues derived from the linker.

Таким образом объектом настоящего изобретения является обеспечение таких конъюгатов лекарственное средство-линкер, где линкер ковалентно присоединен через расщепляемую связь к биологически активному фрагменту (представляющему собой лекарственное средство после его высвобождения), и где линкер также ковалентно присоединен через постоянную связь непосредственно к носителю или через спейсер с образованием пролекарства, связанного с носителем.Thus, it is an object of the present invention to provide such drug-linker conjugates, wherein the linker is covalently attached via a cleavable bond to a biologically active moiety (which is the drug upon release), and wherein the linker is also covalently attached via a permanent bond directly to the carrier or via a spacer. to form a prodrug associated with the carrier.

Эта задача решается посредством пролекарства или его фармацевтически приемлемой соли, содержащего конъюгат лекарственное средство-линкер D-L, гдеThis problem is solved by means of a prodrug or its pharmaceutically acceptable salt containing a drug-linker conjugate D-L, where

- D представляет собой азотсодержащий биологически активный фрагмент; а- D is a nitrogen-containing biologically active fragment; A

- L представляет собой биологически неактивный линкерный фрагмент L¹, представленный формулой (I)- L is a biologically inactive linker fragment L ¹ represented by formula (I)

где пунктирная линия показывает присоединение к азоту биологически активного фрагмента посредством образования амидной связи;where the dotted line shows the accession to nitrogen of a biologically active fragment through the formation of an amide bond;

X представляет собой C(R⁴R^4a), N(R⁴), О, C(R⁴R^4a)-C(R⁵R^5a), C(R⁵R^5a)-C(R⁴R^4a), C(R⁴R^4a)-N(R⁶), N(R⁶)-C(R⁴R^4a), C(R⁴R^4a)-O или O-C(R⁴R^4a);X is C(R ⁴ R ^4a ), N(R ⁴ ), O, C(R ⁴ R ^4a )-C(R ⁵ R ^5a ), C(R ⁵ R ^5a )-C(R ⁴ R ^4a ) , C(R ⁴ R ^4a )-N(R ⁶ ), N(R ⁶ )-C(R ⁴ R ^4a ), C(R ⁴ R ^4a )-O or OC(R ⁴ R ^4a );

X¹ представляет собой С или S(O);X ¹ represents C or S(O);

X² представляет собой C(R⁷, R^7a) или C(R⁷, R^7a)-C(R⁸, R^8a);X ² is C(R ⁷ , R ^7a ) or C(R ⁷ , R ^7a )-C(R ⁸ , R ^8a );

X³ представляет собой О, S или N-CN;X ³ is O, S or N-CN;

R¹, R^1a, R², R^2a, R³, R^3a, R⁴, R^4a, R⁵, R^5a, R⁶, R⁷, R^7a, R⁸, R^8a независимо выбирают из группы, включающей Н и С_1-4 алкила;R ¹ , R ^1a , R ² , R ^2a , R ³ , R ^3a , R ⁴ , R ^4a , R ⁵ , R ^5a , R ⁶ , R ⁷ , R ^7a , R ⁸ , R ^8a are independently selected from the group consisting of H and C _1-4 alkyl;

при необходимости одна или более пар R^1a/R^4a, R^1a/R^5a, R^4a/R^5a, R^7a/R^8a образуют химическую связь;if necessary, one or more pairs of R ^1a /R ^4a , R ^1a /R ^5a , R ^4a /R ^5a , R ^7a /R ^8a form a chemical bond;

при необходимости одна или более пар R¹/R^1a, R²/R^2a, R⁴/R^4a, R⁵/R^5a, R⁷/R^7a, R⁸/R^8a вместе с атомом, к которому они присоединены, соединяются с образованием С_3-7 циклоалкила или 4-7-членного гетероциклила;optionally one or more pairs of R ¹ /R ^1a , R ² /R ^2a , R ⁴ /R ^4a , R ⁵ /R ^5a , R ⁷ /R ^7a , R ⁸ /R ^8a together with the atom to which they are attached, combine to form C _3-7 cycloalkyl or 4-7 membered heterocyclyl;

при необходимости R⁴/R⁶ вместе с атомами, к которым они присоединены, соединяются с образованием 4-7-членного гетероциклила;if necessary, R ⁴ /R ⁶ together with the atoms to which they are attached, are connected to form a 4-7-membered heterocyclyl;

при необходимости одна или более пар R¹/R⁴, R¹/R⁵, R¹/R⁶, R⁴/R⁵, R⁴/R⁶, R⁷/R⁸, R²/R³ вместе с атомами, к которым они присоединены, соединяются с образованием цикла А;optionally one or more pairs of R ¹ /R ⁴ , R ¹ /R ⁵ , R ¹ /R ⁶ , R ⁴ /R ⁵ , R ⁴ /R ⁶ , R ⁷ /R ⁸ , R ² /R ³ together with atoms , to which they are attached, are connected to form the ring A;

при необходимости R³/R^3a вместе с атомом азота, к которому они присоединены, соединяются с образованием 4-7-членного гетероцикла;if necessary, R ³ /R ^3a , together with the nitrogen atom to which they are attached, combine to form a 4-7-membered heterocycle;

А выбирают из группы, состоящей из фенила, нафтила, инденила, инданила, тетра-линила, С_3-10 циклоалкила, 4-7-членного гетероциклила и 9-11-членного гетеробициклила; иA is selected from the group consisting of phenyl, naphthyl, indenyl, indanyl, tetralinyl, C _3-10 cycloalkyl, 4-7 membered heterocyclyl and 9-11 membered heterobicyclyl; And

где L¹ замещен 1-4 группами L²-Z и при необходимости дополнительно замещен, при условии, что водород, отмеченный символом * в формуле (I), не замещен заместителем, гдеwhere L ¹ is substituted with 1-4 L ² -Z groups and optionally further substituted, provided that the hydrogen indicated by * in formula (I) is not substituted by a substituent, where

L² представляет собой одинарную химическую связь или спейсер; иL ² is a single chemical bond or spacer; And

Z представляет собой группу-носитель.Z is a carrier group.

Неожиданно было обнаружено, что область применения активации циклизации посредством образования циклического имида может быть расширена в диапазоне от производных сложных эфиров вплоть до пролекарств, связанных посредством амидной связи с носителем, несмотря на значительно большую стабильность амидной связи в водных условиях. Было отмечено, что N,N'-бискарбоксамиды, соединенные посредством одной амидной связи с нуклеофильным несущим фрагментом и молекулой лекарственного средства посредством второй амидной связи, демонстрируют способность к автогидролизу в диапазоне, который можно использовать в области применений пролекарств. Кроме того, было также обнаружено, что линкеры могут быть сконструированы так, что они включают носитель, перманентно присоединенный к N,N'-бискарбоксамидному мотиву таким образом, что образование циклического имида можно использовать в качестве основы самоактивации в конструировании пролекарств, связанных с носителем через амидную связь.Surprisingly, it has been found that the scope of cyclization activation via cyclic imide formation can be extended from ester derivatives up to prodrugs linked via an amide bond to a carrier, despite the much greater stability of the amide bond under aqueous conditions. It has been noted that N,N'-biscarboxamides linked via a single amide bond to a nucleophilic carrier moiety and a drug molecule via a second amide bond exhibit autohydrolysis capability in the range that can be used in the field of prodrug applications. In addition, it has also been found that linkers can be designed to include a carrier permanently attached to an N,N'-biscarboxamide motif such that cyclic imide formation can be used as a self-activation basis in the construction of prodrugs linked to the carrier via amide bond.

Примерами таких предпочтительных циклических продуктов с расщепляемой связью являются структуры с замещенным сукцинимидным или глутаримидным кольцом. Предварительным условием такой активации реакции циклизации является присутствие аминосодержащего нуклеофила в линкерной структуре и другой амидной связи, которая не является амидной связью в пролекарстве, а представляет собой амидную связь, замещенную атомом водорода.Examples of such preferred cleavable cyclic products are structures with a substituted succinimide or glutarimide ring. A prerequisite for such activation of the cyclization reaction is the presence of an amine-containing nucleophile in the linker structure and another amide bond, which is not an amide bond in the prodrug, but is an amide bond substituted by a hydrogen atom.

В случае расщепления сукцинимид- или глутаримид-активированного пролекарства аминосодержащий нуклеофил выступает в качестве соседней группы для усиления нуклеофильности азота, содержащегося в постоянной амидной связи, которая в свою очередь атакует амидную карбонильную группу пролекарства и, таким образом, индуцирует внутримолекулярное ацилирование постоянной амидной связи, приводящее к образованию циклического имидного кольца.In the case of cleavage of a succinimide- or glutarimide-activated prodrug, the amine-containing nucleophile acts as a neighboring group to enhance the nucleophilicity of the nitrogen contained in the permanent amide bond, which in turn attacks the amide carbonyl group of the prodrug and thus induces intramolecular acylation of the permanent amide bond, resulting in to form a cyclic imide ring.

Следовательно, предпочтительные структуры линкера включают в себя постоянную связь с носителем, аминосодержащий нуклеофил и постоянную амидную связь водородом, присоединенным к азоту амидной связи. Связанные с соответствующим носителем пролекарства содержат линкер, содержащий постоянную связей с носителем, аминосодержащий нуклеофил и указанную постоянную амидную связь, и азотсодержащий биологически активный фрагмент молекулы, образованный из лекарственного средства, конъюгированного с линкером посредством расщепляемой амидной связи.Therefore, preferred linker structures include a permanent bond to a carrier, an amine-containing nucleophile, and a permanent amide bond with a hydrogen attached to the nitrogen of the amide bond. The prodrugs associated with the appropriate carrier contain a linker containing a constant of bonds with the carrier, an amine-containing nucleophile and the indicated permanent amide bond, and a nitrogen-containing biologically active fragment of the molecule formed from a drug conjugated to the linker via a cleavable amide bond.

На Фиг. 1 показан пример расщепления, приводящего к образованию циклического имида. Азот биологически активного фрагмента представлен как водород-содержащий амин, который приводит к лекарственному средству, имеющему первичную аминную функциональную группу. При этом, также, например, вторичный амин может быть частью лекарственного средства. По соображениям упрощения не показаны от одного до четырех обязательных заместителей структуры L₂-Z, в том числе носитель.On FIG. 1 shows an example of a cleavage leading to the formation of a cyclic imide. The nitrogen of the biologically active fragment is presented as a hydrogen-containing amine, which leads to a drug having a primary amine functional group. In this case, also, for example, a secondary amine can be part of the drug. For reasons of simplification, one to four mandatory substituents of the L ₂ -Z structure, including the carrier, are not shown.

Предпочтительные свойства пролекарства настоящего изобретения приведены по периоду его полужизни при гидролизе в водном буферном растворе при рН 7,4 и 37°С в интервале от 1 часа до 3 месяцев; аналогичные скорости гидролиза в физиологических условиях в буфере и плазме крови.The preferred properties of the prodrug of the present invention are given in terms of its half-life when hydrolyzed in an aqueous buffer solution at pH 7.4 and 37°C in the range from 1 hour to 3 months; similar rates of hydrolysis under physiological conditions in buffer and blood plasma.

Пролекарство в соответствии с настоящим изобретением может демонстрировать превосходную in vivo и in vitro корреляцию данных расщепления линкера, высокую степень независимости от фермента и его можно хранить при пониженных значениях рН (рН зависимое расщепление).The prodrug of the present invention can exhibit excellent in vivo and in vitro correlation of linker cleavage data, a high degree of enzyme independence, and can be stored at reduced pH (pH dependent cleavage).

Используемые термины в объеме существа настоящего изобретения имеют следующие значения.The terms used within the scope of the essence of the present invention have the following meanings.

"Биологически активный фрагмент D" означает часть конъюгата лекарственное средство-линкер, которое после расщепления приводит к лекарственному соединению D-H известной биологической активности."Biologically active fragment D" means the portion of a drug-linker conjugate which, upon cleavage, results in a drug compound D-H of known biological activity.

"Неактивный линкер" означает линкер, который не демонстрирует фармакологического действия лекарственного средства, образованного из биологически активного агента."Inactive linker" means a linker that does not exhibit the pharmacological action of a drug derived from a biologically active agent.

"Алкил" означает прямую или разветвленную углеродную цепь. Каждый атом водорода углерода в алкильной группе может быть замещен заместителем."Alkyl" means a straight or branched carbon chain. Each carbon hydrogen atom in an alkyl group may be substituted with a substituent.

"С_1-4 алкил" означает алкильную цепь, содержащую от 1 до 4 атомов углерода, например, если присутствует на конце молекулы: метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изо-бутил, втор-бутил, трет-бутил, или, например, -СН₂-, -СН₂-СН₂-, -СН(СН₃)-, -СН₂-СН₂-СН₂-, -СН(С₂Н₅)-, -С(СН₃)₂-, если два фрагмента молекулы связаны алкильной группой. Каждый атом водорода у атома углерода в С₁-₄ алкиле может быть замещен заместителем."C _1-4 alkyl" means an alkyl chain containing from 1 to 4 carbon atoms, for example, if present at the end of the molecule: methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, iso-butyl, sec-butyl, tert -butyl, or, for example, -CH ₂ -, -CH ₂ -CH ₂ -, -CH (CH ₃ ) -, -CH ₂ -CH ₂ -CH ₂ -, -CH (C ₂ H ₅ ) -, - C(CH ₃ ) ₂ - if two fragments of the molecule are linked by an alkyl group. Each hydrogen atom on a carbon atom in C ₁ - ₄ alkyl may be substituted with a substituent.

"С_1-6 алкил" означает алкильную цепь, содержащую от 1 до 6 атомов углерода, например, если присутствует на конце молекулы: С₁-₄ алкил, метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изо-бутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил, н-гексил или, например, группу -СН₂-, -СН₂-СН₂-, -СН(СН₃)-, -СН₂-СН₂-СН₂-, -СН(С₂Н₅)-, -С(СН₃)₂-, если два фрагмента молекулы связаны алкильной группой. Каждый атом водорода у атома углерода в С_1-6 алкиле может быть замещен заместителем."C _1-6 alkyl" means an alkyl chain containing from 1 to 6 carbon atoms, for example, if present at the end of the molecule: C ₁ - ₄ alkyl, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, iso-butyl , sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, n-hexyl or, for example, a -CH ₂ -, -CH ₂ -CH ₂ -, -CH(CH ₃ )-, -CH ₂ -CH ₂ -CH group ₂ -, -CH (C ₂ H ₅ ) -, -C (CH ₃ ) ₂ -, if two fragments of the molecule are connected by an alkyl group. Each hydrogen atom on a carbon atom in C _1-6 alkyl may be substituted with a substituent.

Соответственно, "С_1-18 алкил" означает алкильную цепь, содержащую от 1 до 18 атомов углерода, a "C_8-18 алкил" означает алкильную цепь, содержащую от 8 до 18 атомов углерода. Соответственно, "С_1-50 алкил" означает алкильную цепь, содержащую от 1 до 50 атомов углерода.Accordingly, "C _1-18 alkyl" means an alkyl chain containing from 1 to 18 carbon atoms, and "C _8-18 alkyl" means an alkyl chain containing from 8 to 18 carbon atoms. Accordingly, "C _1-50 alkyl" means an alkyl chain containing from 1 to 50 carbon atoms.

"С_2-50 алкенил" означает разветвленную или неразветвленную алкенильную цепь, содержащую от 2 до 50 атомов углерода, например, если присутствует на конце молекулы: -СН=СН₂, -СН=СН-СН₃, -СН₂-СН=СН₂, -СН=СН-СН₂-СН₃, -СН=СН-СН=СН₂, или, например, -СН=СН-, если два фрагмента молекулы связаны алкенильной группой. Каждый атом водорода у атома углерода в С_2-50 алкениле может быть замещен заместителем, как дополнительно указано. Таким образом, термин "алкенил" относится к углеродной цепи с, по меньшей мере, одной двойной углерод-углеродной связью. При необходимости может встречаться одна или более тройных связей."C _2-50 alkenyl" means a branched or straight chain alkenyl chain containing from 2 to 50 carbon atoms, for example, if present at the end of the molecule: -CH=CH ₂ , -CH=CH-CH ₃ , -CH ₂ -CH= CH ₂ , -CH=CH-CH ₂ -CH ₃ , -CH=CH-CH=CH ₂ , or, for example, -CH=CH- if two fragments of the molecule are linked by an alkenyl group. Each hydrogen atom on a carbon atom in C _2-50 alkenyl may be substituted with a substituent, as further indicated. Thus, the term "alkenyl" refers to a carbon chain with at least one carbon-carbon double bond. One or more triple bonds may be present, if desired.

"С_2-50 алкинил" представляет собой разветвленную или неразветвленную алкинильную цепь, содержащую от 2 до 50 атомов углерода, например, если присутствует на конце молекулы: -С≡СН, -СН₂-С≡СН, СН₂-СН₂-С≡СН, СН₂-С≡С-СН₃, или, например, -С≡С-, в случае, когда два фрагмента молекулы связаны алкинильной группой. Каждый атом водорода у атома углерода в C_2-50 алкиниле может быть замещен заместителем, как дополнительно указано. Таким образом, термин "алкинил" относится к углеродной цепи с, по меньшей мере, одной тройной углерод-углеродной связью. При необходимости может встречаться одна или несколько двойных углерод-углеродных связей."C _2-50 alkynyl" is a branched or straight chain alkynyl chain containing from 2 to 50 carbon atoms, for example, if present at the end of the molecule: -C≡CH, -CH ₂ -C≡CH, CH ₂ -CH ₂ - C≡CH, CH ₂ -C≡C-CH ₃ , or, for example, -C≡C-, in the case when two fragments of the molecule are linked by an alkynyl group. Each hydrogen atom on a carbon atom in C _2-50 alkynyl may be substituted with a substituent, as further indicated. Thus, the term "alkynyl" refers to a carbon chain with at least one carbon-carbon triple bond. One or more carbon-carbon double bonds may be present, if desired.

"С_3-7 циклоалкил" или "С_3-7 циклоалкильное кольцо" означает циклическую алкильную цепь, содержащую от 3 до 7 атомов углерода, которая может содержать по меньшей мере частично насыщенные двойные углерод-углеродные связи, например, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил циклогексенил, циклогептил. Каждый атом водорода у атома углерода циклоалкила может быть замещен заместителем. Термин "С_3-7 циклоалкил" или "С_3-7 циклоалкильное кольцо" также включает в себя мостиковые бициклы, аналогичные норборнану или норборнену. Соответственно, "С_3-5 циклоалкил" означает циклоалкил, содержащий от 3 до 5 атомов углерода."C _3-7 cycloalkyl" or "C _3-7 cycloalkyl ring" means a cyclic alkyl chain containing from 3 to 7 carbon atoms, which may contain at least partially saturated carbon-carbon double bonds, for example, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl , cyclohexyl cyclohexenyl, cycloheptyl. Each hydrogen atom on the carbon atom of the cycloalkyl may be substituted with a substituent. The term "C _3-7 cycloalkyl" or "C _3-7 cycloalkyl ring" also includes bridged bicycles analogous to norbornane or norbornene. Accordingly, "C _3-5 cycloalkyl" means cycloalkyl containing from 3 to 5 carbon atoms.

Соответственно, "С_3-10 циклоалкил" означает циклический алкил, имеющий от 3 до 10 атомов углерода, например С_3-7 циклоалкил; циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогексенил, циклогептил, циклооктил, циклононил, циклодецил. Термин "С_3-10 циклоалкил" также включает в себя, по меньшей мере, частично насыщенные карбомоноциклы и бициклы.Accordingly, "C _3-10 cycloalkyl" means cyclic alkyl having 3 to 10 carbon atoms, for example C _3-7 cycloalkyl; cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cyclohexenyl, cycloheptyl, cyclooctyl, cyclononyl, cyclodecyl. The term "C _3-10 cycloalkyl" also includes at least partially saturated carbo monocycles and bicycles.

"Галоген" означает фтор, хлор, бром или йод. Особенно предпочтительно галоген представляет собой фтор или хлор."Halogen" means fluorine, chlorine, bromine or iodine. Especially preferably the halogen is fluorine or chlorine.

"4-7-членный гетероциклил" или " 4-7-членный гетероцикл" представляет собой кольцо, содержащее 4, 5, 6 или 7 кольцевых атомов, которое может содержать максимально возможное число двойных связей (ароматическое или неароматическое кольцо, которое полностью насыщенное, частично насыщенное или ненасыщенное), в котором, по меньшей мере, от одного до 4 кольцевых атомов заменены гетероатомом, выбранным из группы, состоящей из серы (включая -S(O)-,-S(O)₂-), кислорода и азота (включая =N(О)-), и в котором кольцо связано с остальной частью молекулы через атом углерода или азота. Примеры 4-7-членных гетероциклов включают в себя азетидин, оксетан, тиетан, фуран, тиофен, пиррол, пирролин, имидазол, имидазолин, пиразол, пиразолин, оксазол, оксазолин, изоксазол, изоксазолин, тиазол, тиазолин, изотиазол, изотиазолин, тиадиазол, тиадиазолин, тетрагидрофуран, тетрагидротиофен, пирролидин, имидазолидин, пиразолидин, оксазолидин, изоксазолидин, тиазолидин, изотиазолидин, тиадиазолидин, сульфолан, пиран, дигидропиран, тетрагидропиран, имидазолидин, пиридин, пиридазин, пиразин, пиримидин, пиперазин, пиперидин, морфолин, тетразол, триазол, триазолидин, тетразолидин, диазепан, азепин или гомопиперазин."4-7 membered heterocyclyl" or "4-7 membered heterocycle" is a ring containing 4, 5, 6 or 7 ring atoms, which may contain the maximum possible number of double bonds (aromatic or non-aromatic ring, which is fully saturated, partially saturated or unsaturated) in which at least one to 4 ring atoms are replaced by a heteroatom selected from the group consisting of sulfur (including -S(O)-, -S(O) ₂ -), oxygen and nitrogen (including =N(O)-), and in which the ring is linked to the rest of the molecule via a carbon or nitrogen atom. Examples of 4-7 membered heterocycles include azetidine, oxetane, thietane, furan, thiophene, pyrrole, pyrroline, imidazole, imidazoline, pyrazole, pyrazoline, oxazole, oxazoline, isoxazole, isoxazoline, thiazole, thiazoline, isothiazole, isothiazoline, thiadiazole, thiadiazoline, tetrahydrofuran, tetrahydrothiophene, pyrrolidine, imidazolidine, pyrazolidine, oxazolidine, isoxazolidine, thiazolidine, isothiazolidine, thiadiazolidine, sulfolane, pyran, dihydropyran, tetrahydropyran, imidazolidine, pyridine, pyridazine, pyrazine, pyrimidine, piperazine, piperidine, morpholine, tetrazole, triazole, triazolidin, tetrazolidine, diazepan, azepine or homopiperazine.

"9-11-членный гетеробициклил" или "9-11-членный гетеробицикл" представляет собой гетероциклическую систему, состоящую из двух колец с числом кольцевых атомов от 9 до 11, в которой, по меньшей мере, один атом кольца разделен обоими кольцами, и которая может содержать вплоть до максимально возможного числа двойные связи (полностью насыщенное, частично насыщенное или ненасыщенное ароматическое или неароматическое кольцо), где, по меньшей мере, от одного до 6 кольцевых атомов заменены гетероатомом, выбранным из группы, состоящей из серы (в том числе -S(O)-,-S(O)₂-), кислорода и азота (в том числе =N(O)-), и где указанное кольцо связано с остальной частью молекулы через атом углерода или азота. В качестве примера 9-11-членного гетеробицикла могут служить индол, индолин, бензофуран, бензотиофен, бензоксазол, бензизооксазол, бензотиазол, бензизотиазол, бензимидазол, бензимидазолин, хинолин, хиназолин, дигидрохиназолин, хинолин, дигидрохинолин, тетрагидрохинолин, декагидрохинолин, изохинолин, декагидроизохинолин, тетрагидроизохинолин, дигидроизохинолин, бензазепин, пурин или птеридин. Термин 9-11-членный гетеробицикл также включает в себя спиро-структуры из двух колец, например, как 1,4-диокса-8-азаспиро[4,5]декан или гетероциклы мостиковой структуры, например, как 8-аза-бицикло[3.2.1]октан."9-11 membered heterobicyclyl" or "9-11 membered heterobicycle" is a heterocyclic system consisting of two rings with 9 to 11 ring atoms, in which at least one ring atom is separated by both rings, and which may contain up to the maximum possible number of double bonds (fully saturated, partially saturated or unsaturated aromatic or non-aromatic ring), where at least one to 6 ring atoms are replaced by a heteroatom selected from the group consisting of sulfur (including -S(O)-,-S(O) ₂ -), oxygen and nitrogen (including =N(O)-), and where the specified ring is connected to the rest of the molecule through a carbon or nitrogen atom. Examples of a 9-11 membered heterobicycle are indole, indoline, benzofuran, benzothiophene, benzoxazole, benzisooxazole, benzothiazole, benzisothiazole, benzimidazole, benzimidazole, quinoline, quinazoline, dihydroquinazoline, quinoline, dihydroquinoline, tetrahydroquinoline, decahydroquinoline, isoquinoline, decahydroisoquinoline, tetrahydroisoquinoline , dihydroisoquinoline, benzazepine, purine or pteridine. The term 9-11 membered heterobicycle also includes two-ring spiro structures such as 1,4-dioxa-8-azaspiro[4,5]decane or bridged heterocycles such as 8-aza-bicyclo[ 3.2.1]octane.

В случае, когда соединения формулы (I) содержат одну или несколько кислотных групп или основных групп, настоящее изобретение также содержит их соответствующие фармацевтически или токсикологически приемлемые соли, в частности их фармацевтически пригодные соли. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением соединения формулы (I), которые содержат кислотные группы, можно использовать в соответствии с изобретением, например, в виде солей щелочных металлов, солей щелочноземельных металлов или солей аммония. В качестве конкретных примеров таких солей могут служить соли натрия, соли калия, соли кальция, соли магния или соли, полученные из аммиака или органических аминов, такие как, например, этиламин, этаноламин, триэтаноламин или аминокислоты. Соединения формулы (I), которые содержат одну или несколько основных групп, т.е. групп, которые могут быть протонированными, могут присутствовать и их можно использовать в соответствии с изобретением в форме их аддитивных солей с неорганическими или органическими кислотами. Примеры подходящих кислот включают хлористоводородную кислоту, бромистоводородную кислоту, фосфорную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, метансульфоновую кислоту, паратолуолсульфоновую кислоту, нафталиндисульфоновую кислоту, щавелевую кислоту, уксусную кислоту, винную кислоту, молочную кислоту, салициловую кислоту, бензойную кислоту, муравьиную кислоту, пропионовую кислоту, ливалиновую кислоту, диэтилуксусную кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, пимелиновую кислоту, фумаровую кислоту, малеиновую кислоту, яблочную кислоту, сульфаминовую кислоту, фенилпропионовую кислоту, глюконовую кислоту, аскорбиновую кислоту, изоникотиновую кислоту, лимонную кислоту, адипиновую кислоту и другие кислоты, известные специалистам в данной области техники. Если соединения формулы (I) одновременно содержат кислотные и основные группы в молекуле, данное изобретение также включает, кроме вышеуказанных солевых форм, внутренние соли или бетаины (цвиттер-ионы). Соответствующие соли соединений в соответствии с формулой (I) можно получать традиционными способами, которые известны специалистам в данной области техники, такими как, например, путем взаимодействия их с органической или неорганической кислотой или основанием в растворителе или диспергаторе, или посредством анионного обмена или катионного обмена с другими солями. Настоящее изобретение также включает все соли соединений формулы (I), которые в силу низкой физиологической совместимости не пригодны непосредственно для использования в фармацевтических препаратах, но которые могут быть использованы, например, в качестве промежуточных химических соединений или для получения фармацевтически приемлемых солей.Where the compounds of formula (I) contain one or more acidic or basic groups, the present invention also contains their respective pharmaceutically or toxicologically acceptable salts, in particular their pharmaceutically acceptable salts. Thus, according to the present invention, compounds of formula (I) which contain acidic groups can be used according to the invention, for example, in the form of alkali metal salts, alkaline earth metal salts or ammonium salts. Specific examples of such salts are sodium salts, potassium salts, calcium salts, magnesium salts or salts derived from ammonia or organic amines such as, for example, ethylamine, ethanolamine, triethanolamine or amino acids. Compounds of formula (I) which contain one or more basic groups, i. groups which may be protonated may be present and may be used according to the invention in the form of their addition salts with inorganic or organic acids. Examples of suitable acids include hydrochloric acid, hydrobromic acid, phosphoric acid, sulfuric acid, nitric acid, methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, naphthalene disulfonic acid, oxalic acid, acetic acid, tartaric acid, lactic acid, salicylic acid, benzoic acid, formic acid, propionic acid. acid, livalic acid, diethylacetic acid, malonic acid, succinic acid, pimelic acid, fumaric acid, maleic acid, malic acid, sulfamic acid, phenylpropionic acid, gluconic acid, ascorbic acid, isonicotinic acid, citric acid, adipic acid and other acids, known to those skilled in the art. If the compounds of formula (I) simultaneously contain acidic and basic groups in the molecule, this invention also includes, in addition to the above salt forms, internal salts or betaines (zwitterions). The corresponding salts of the compounds according to formula (I) can be obtained by conventional methods known to those skilled in the art, such as, for example, by reacting them with an organic or inorganic acid or base in a solvent or dispersant, or by anion exchange or cation exchange with other salts. The present invention also includes all salts of compounds of formula (I) which, due to low physiological compatibility, are not directly suitable for use in pharmaceutical preparations, but which can be used, for example, as chemical intermediates or for the preparation of pharmaceutically acceptable salts.

Под термином "фармацевтически приемлемый" подразумевается одобренное регулирующим органом, таким как Европейское агентство по оценке медицинской продукции (ЕМЕА) и/или Управление по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (FDA) и/или любым другим Национальным регулирующим органом использование для животных, предпочтительно для человека.The term “pharmaceutically acceptable” means approved by a regulatory body such as the European Medical Product Evaluation Agency (EMEA) and/or the US Food and Drug Administration (FDA) and/or any other National Regulatory Authority for animal use. , preferably for humans.

Под "фармацевтической композицией" подразумевается один или более активных ингредиентов в комбинации с одним или более инертными ингредиентами, а также любой продукт, который образуется прямо или косвенно в результате объединения, комплексообразования или агрегации любых двух или более указанных ингредиентов, или в результате диссоциации одного или более указанных ингредиентов, или других типов реакций или взаимодействий одного или нескольких ингредиентов. Таким образом, фармацевтические композиции настоящего изобретения охватывают любую композицию, полученную путем смешивания соединения настоящего изобретения с фармацевтически приемлемым наполнителем (фармацевтически приемлемым носителем).By "pharmaceutical composition" is meant one or more active ingredients in combination with one or more inert ingredients, as well as any product which is formed directly or indirectly as a result of the combination, complexation or aggregation of any two or more of these ingredients, or as a result of the dissociation of one or more more than the specified ingredients, or other types of reactions or interactions of one or more ingredients. Thus, the pharmaceutical compositions of the present invention encompass any composition obtained by mixing a compound of the present invention with a pharmaceutically acceptable excipient (pharmaceutically acceptable carrier).

Термин "наполнитель" относится к разбавителю, адъюванту или носителю с помощью которых вводят терапевтический препарат. В качестве примера такого фармацевтически пригодного наполнителя могут служить стерильные жидкие среды, такие как вода и масла, в том числе любое масло нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, включая, но не ограничивая их объема арахисовым маслом, соевым маслом, минеральным маслом, кунжутным маслом и тому подобные. Вода является предпочтительным наполнителем, в случае, когда фармацевтическая композиция вводится перорально. Физиологические растворы и водные растворы декстрозы являются предпочтительными наполнителями, в случае, когда фармацевтическая композиция предназначена для внутривенного введения. Физиологические растворы и водные растворы декстрозы и глицерина предпочтительно используют в качестве жидких наполнителей для приготовления инъекционных растворов. Подходящие фармацевтические наполнители включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рисовую муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, натрия хлорид, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и тому подобные. Композиция настоящего изобретения, по желанию, может также содержать незначительные количества смачивающих агентов или эмульгаторов, или буферных веществ для стабилизации рН. Эти композиции могут быть в форме растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, составов с замедленным высвобождением и тому подобное. Композиция настоящего изобретения может быть получена в форме суппозитория на основе традиционных связующих и наполнителей, таких как триглицериды. Пероральный состав может включать стандартные наполнители, такие как фармацевтические сорта маннита, лактозы, крахмала, стеарата магния, натриевой соли сахарина, целлюлозы, карбоната магния и тому подобные. Примеры подходящих фармацевтических наполнителей описаны E.W. Martin в "Remington's Pharmaceutical Sciences". Такие композиции обычно содержат терапевтически эффективное количество терапевтических средств предпочтительно в очищенном виде вместе с подходящим количеством наполнителя так, чтобы обеспечить форму для подходящего введения пациенту. Данный состав должен удовлетворять режиму его приема.The term "filler" refers to a diluent, adjuvant or carrier with which to enter a therapeutic drug. Examples of such pharmaceutically acceptable excipients include sterile liquid media such as water and oils, including any petroleum, animal, vegetable or synthetic oil, including but not limited to peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil. oil and the like. Water is the preferred vehicle when the pharmaceutical composition is administered orally. Physiological solutions and aqueous dextrose solutions are the preferred excipients when the pharmaceutical composition is intended for intravenous administration. Physiological solutions and aqueous solutions of dextrose and glycerol are preferably used as liquid excipients for the preparation of injection solutions. Suitable pharmaceutical excipients include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, skimmed milk powder, glycerin, propylene glycol, water, ethanol, and the like. The composition of the present invention, if desired, may also contain minor amounts of wetting agents or emulsifiers, or buffering agents to stabilize the pH. These compositions may be in the form of solutions, suspensions, emulsions, tablets, pills, capsules, powders, sustained release formulations, and the like. The composition of the present invention may be prepared in the form of a suppository based on conventional binders and excipients such as triglycerides. The oral formulation may include standard excipients such as pharmaceutical grades of mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharin, cellulose, magnesium carbonate, and the like. Examples of suitable pharmaceutical excipients are described by E.W. Martin in Remington's Pharmaceutical Sciences. Such compositions typically contain a therapeutically effective amount of the therapeutic agent, preferably in purified form, together with a suitable amount of excipient, so as to provide a form for appropriate administration to a patient. This composition must satisfy the mode of its reception.

Предпочтительно X³ представляет собой О.Preferably X ³ is O.

Предпочтительно X представляет собой N(R⁴), X¹ представляет С, и Х₃ представляет собой О.Preferably X is N(R ⁴ ), X ¹ is C, and X ₃ is O.

Предпочтительно X² представляет собой C(R⁷R^7a).Preferably X ² is C(R ⁷ R ^7a ).

Предпочтительно L¹ выбирают из группы, состоящей изPreferably L ¹ is selected from the group consisting of

где R представляет собой Н или С_1-4 алкил; Y представляет собой NH, О или S; и R¹, R^1a, R², R^2a, R³, R^3a, R⁴, X, X¹, X² имеют вышеуказанные значения;where R represents H or C _1-4 alkyl; Y is NH, O or S; and R ¹ , R ^1a , R ² , R ^2a , R ³ , R ^3a , R ⁴ , X, X ¹ , X ² are as defined above;

Еще в более предпочтительном варианте L¹ выбирают из группы, состоящей изEven more preferably, L ¹ is selected from the group consisting of

где R имеет вышеуказанное значение.where R has the above meaning.

По меньшей мере один (вплоть до четырех) атомов водорода заменены группой L²-Z. В случае, когда присутствует более одной группы L²-Z, каждый L² и каждый Z может быть выбран независимо друг от друга. Предпочтительно, чтобы присутствовала только одна группа L²-Z, что приводит к образованию структуры формулы D-L¹-L²-Z.At least one (up to four) hydrogen atoms are replaced by an L ² -Z group. In the case where more than one L ² -Z group is present, each L ² and each Z may be independently selected. Preferably, only one L ² -Z group is present, resulting in a structure of formula DL ¹ -L ² -Z.

Обычно L² может быть соединен с L¹ в любом положении за исключением положения замены водорода, отмеченного символом * структуры формулы (I). Предпочтительно, чтобы от одного до четырех атомов водорода, заданных непосредственно радикалами R, R¹-R⁸, или например, водород С₁-₄ алкила или дополнительных групп и колец, задаваемых радикалами R и R¹-R⁸, были заменены группой L²-Z.Typically, L ² can be connected to L ¹ in any position except for the position of the replacement of hydrogen, marked with the * symbol of the structure of formula (I). Preferably, from one to four hydrogen atoms, given directly by the radicals R, R ¹ -R ⁸ , or for example, hydrogen C ₁ - ₄ alkyl or additional groups and rings, given by the radicals R and R ¹ -R ⁸ , were replaced by a group L ² -Z.

Кроме того, L¹ может при необходимости дополнительно замещаться. Обычно можно использовать любой заместитель, поскольку он не оказывает влияния на основополагающий принцип расщепления связи.In addition, L ¹ may be further substituted if necessary. Generally, any substituent can be used as long as it does not affect the underlying principle of bond cleavage.

В предпочтительном варианте один или несколько дополнительных необязательных заместителей независимо выбирают из группы, состоящей из галогена, CN, COOR⁹, OR⁹, C(O)R⁹, C(O)N(R⁹R^9a), S(O)₂N(R⁹R^9a), S(O)N(R⁹R^9a), S(O)₂R⁹, S(O)R⁹, N(R⁹)S(O)₂N(R^9aR^9b), SR⁹, N(R⁹R^9a), NO₂, OC(O)R⁹, N(R⁹)C(O)R^9a, N(R⁹)S(O)₂R^9a, N(R⁹)S(O)R^9a, N(R⁹)C(O)OR^9a, N(R⁹)C(O)N(R^9aR^9b), OC(O)N(R⁹R^9a), T, C_1-50 алкила, C_2-50 алкенила или C_2-50 алкинила, где T, C_1-50 алкил, С_2-50 алкенил и С_2-50 алкинил при необходимости замещены одним или более R¹⁰, которые одинаковые или различные, и где С_1-50 алкил; C_2-50 алкенил; и C_2-50 алкинил при необходимости прерваны одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из Т, -С(O)О-, -О-, -С(O)-, - C(O)N(R¹¹)-, -S(O)₂N(R¹¹)-, -S(O)N(R¹¹)-, -S(O)₂-, -S(O)-, -N(R¹¹S(O)₂N(R^11a)-, -S-, -N(R¹¹)-, -OC(O)R¹¹, -N(R¹¹)C(O), -N(R¹¹)S(O)₂-, -N(R¹¹)S(O)-, -N(R¹¹)C(O)C-, -N(R¹¹)C(O)N(R^11a)- и -OC(O)N(R¹¹R^11a);In a preferred embodiment, one or more additional optional substituents are independently selected from the group consisting of halogen, CN, COOR ⁹ , OR ⁹ , C(O)R ⁹ , C(O)N(R ⁹ R ^9a ), S(O) ₂ N(R ⁹ R ^9a ), S(O)N(R ⁹ R ^9a ), S(O) ₂ R ⁹ , S(O)R ⁹ , N(R ⁹ )S(O) ₂ N(R ^9a R ^9b ), SR ⁹ , N(R ⁹ R ^9a ), NO ₂ , OC(O)R ⁹ , N(R ⁹ )C(O)R ^9a , N(R ⁹ )S(O) ₂ R ^9a , N (R ⁹ )S(O)R ^9a , N(R ⁹ )C(O)OR ^9a , N(R ⁹ )C(O)N(R ^9a R ^9b ), OC(O)N(R ⁹ R ^9a ), T, C _1-50 alkyl, C _2-50 alkenyl or C _2-50 alkynyl, where T, C _1-50 alkyl, C _2-50 alkenyl and C _2-50 alkynyl are optionally substituted with one or more R ¹⁰ , which are the same or different, and where C _1-50 alkyl; C _2-50 alkenyl; and C _2-50 alkynyl optionally interrupted by one or more groups selected from the group consisting of T, -C(O)O-, -O-, -C(O)-, -C(O)N(R ¹¹ )-, -S(O) ₂ N(R ¹¹ )-, -S(O)N(R ¹¹ )-, -S(O) ₂ -, -S(O)-, -N(R ¹¹ S( O) ₂ N(R ^11a )-, -S-, -N(R ¹¹ )-, -OC(O)R ¹¹ , -N(R ¹¹ )C(O), -N(R ¹¹ )S(O ) ₂ -, -N(R ¹¹ )S(O)-, -N(R ¹¹ )C(O)C-, -N(R ¹¹ )C(O)N(R ^11a )- and -OC(O )N(R ¹¹ R ^11a );

R⁹, R^9a, R^9b независимо выбирают из группы, состоящей из Н, Т, Z и С_1-50 алкила, С_2-50 алкенила или С_2-50 алкинила, где Т, С_1-50 алкил, С_2-50 алкенил и С_2-50 алкинил при необходимости замещены одним или несколькими заместителями из R¹⁰, которые одинаковые или различные, и где С_1-50 алкил, С_2-50 алкенил и С_2-50 алкинил при необходимости прерываются одной или несколькими группами, выбранными из группы, состоящей из Т, -С(O)O-, -О-, -С(O)-, -C(O)N(R¹¹)-, -S(O)₂N(R¹¹)-, -S(O)N(R¹¹)-, -S(O)₂-, -S(O)-, -N(R¹¹)S(O)₂N(R^11a)-, -S-, -N(R¹¹)-, -OC(O)R¹¹, -N(R¹¹)C(O)-, -N(R¹¹)S(O)₂-, -N(R¹¹)S(O)-, -N(R¹¹)C(O)O-, -N(R¹¹)C(O)N(R^11a)- и -OC(O)N(R¹¹R^11a);R ⁹ , R ^9a , R ^9b are independently selected from the group consisting of H, T, Z and C _1-50 alkyl, C _2-50 alkenyl or C _2-50 alkynyl, where T, C _1-50 alkyl, C _{2 -50} alkenyl and C _2-50 alkynyl are optionally substituted by one or more substituents from R ¹⁰ which are the same or different, and where C _1-50 alkyl, C _2-50 alkenyl and C _2-50 alkynyl are optionally interrupted by one or more groups selected from the group consisting of T, -C(O)O-, -O-, -C(O)-, -C(O)N(R ¹¹ )-, -S(O) ₂ N(R ¹¹ )-, -S(O)N(R ¹¹ )-, -S(O) ₂ -, -S(O)-, -N(R ¹¹ )S(O) ₂ N(R ^11a )-, - S-, -N(R ¹¹ )-, -OC(O)R ¹¹ , -N(R ¹¹ )C(O)-, -N(R ¹¹ )S(O) ₂ -, -N(R ¹¹ ) S(O)-, -N(R ¹¹ )C(O)O-, -N(R ¹¹ )C(O)N(R ^11a )- and -OC(O)N(R ¹¹ R ^11a );

T выбирают из группы, состоящей из фенила; нафтила; инденила; инданила; тетралинила; С_3-10 циклоалкила; 4-7-членного гетероциклила; или 9-11-членного гетеробициклила, где Т необязательно замещен одним или несколькими заместителями из R10, которые одинаковые или отличаются друг от друга;T is selected from the group consisting of phenyl; naphthyl; indenyl; indanyl; tetralinyl; C _3-10 cycloalkyl; 4-7 membered heterocyclyl; or 9-11-membered heterobicyclyl, where T is optionally substituted with one or more substituents from R10, which are the same or different from each other;

R¹⁰ представляет собой Z, галоген, CN, оксо (=O), COOR¹², OR¹², C(O)R¹², C(O)N(R¹²R^12a), S(O)₂N(R¹²R^12a), S(O)N(R¹²R^12a), S(O)₂R¹², S(O)R¹², N(R¹²)S(O)₂N(R^12aR^12b), SR¹², N(R¹²R^12a), NO₂, OC(O)R¹², N(R¹²)C(O)R^12a, N(R¹²)S(O)₂R^12a, N(R¹²)S(O)R^12a, N(R¹²)C(O)OR^12a, N(R¹²)C(O)N(R^12aR¹²b), OC(O)N(R¹²R^12a); или C_1-6 алкил, где C_1-6 алкил при необходимости замещен одним или несколькими атомами галогена, которые одинаковые или отличаются друг от друга;R ¹⁰ is Z, halogen, CN, oxo (=O), COOR ¹² , OR ¹² , C(O)R ¹² , C(O)N(R ¹² R ^12a ), S(O) ₂ N(R ¹² R ^12a ), S(O)N(R ¹² R ^12a ), S(O) ₂ R ¹² , S(O)R ¹² , N(R ¹² )S(O) ₂ N(R ^12a R ^12b ), SR ¹² , N(R ¹² R ^12a ), NO ₂ , OC(O)R ¹² , N(R ¹² )C(O)R ^12a , N(R ¹² )S(O) ₂ R ^12a , N(R ¹² ) S(O)R ^12a , N(R ¹² )C(O)OR ^12a , N(R ¹² )C(O)N(R ^12a R ¹² b), OC(O)N(R ¹² R ^12a ); or C _1-6 alkyl, where C _1-6 alkyl is optionally substituted with one or more halogen atoms that are the same or different from each other;

R¹¹, R^11a, R¹², R^12a, R^12b независимо выбирают из группы, состоящей из Н или С_1-6 алкила, где C_1-6 алкил при необходимости замещен одним или несколькими атомами галогена, которые одинаковые или различные;R ¹¹ , R ^11a , R ¹² , R ^12a , R ^12b are independently selected from the group consisting of H or C _1-6 alkyl, where C _1-6 alkyl is optionally substituted with one or more halogen atoms which are the same or different;

Термин "прерванный" означает, что между двумя атомами углерода или на конце углеродной цепи между углеродом и водородом вставлена группа.The term "interrupted" means that a group is inserted between two carbon atoms or at the end of a carbon chain between carbon and hydrogen.

L² представляет собой одинарную химическую связь или спейсер. В случае, когда L² является спейсером, предпочтительно, чтобы он представлял собой один или несколько необязательных заместителей, определенных выше, при условии, что L² замещен группой Z.L ² is a single chemical bond or spacer. Where L ² is a spacer, it is preferred that it be one or more of the optional substituents as defined above, provided that L ² is substituted with a Z group.

Соответственно, в случае когда L² не является одинарной химической связью, L²-Z представляет собой COOR⁹, OR⁹, C(O)R⁹, C(O)N(R⁹R^9a), S(O)₂N(R⁹R^9a), S(O)N(R⁹R^9a), S(O)₂R⁹, S(O)R⁹, N(R⁹)S(O)₂N(R^9aR^9b), SR⁹, N(R⁹R^9a), OC(O)R⁹, N(R⁹)C(O)R^9a, N(R⁹)S(O)₂R^9a, N(R⁹)S(O)R^9a, N(R⁹)C(O)OR^9a, N(R⁹)C(O)N(R^9aR^9b), OC(O)N(R⁹R^9a), T, C_1-50 алкил, C_2-50 алкенил или C_2-50 алкинил, где T, С_1-50 алкил, C_2-50 алкенил и С_2-50 алкинил являются при необходимости замещенными одним или несколькими радикалами R¹⁰, которые одинаковые или различные, и где С_1-50 алкил, С_2-50 алкенил и С_2-50 алкинил при необходимости прерываются одной или несколькими группами, выбранными из группы, состоящей из -Т-, -С(O)O-, -О-, -С(О)-, -C(O)N(R¹¹)-, -S(O)₂N(R¹¹)-, -S(O)N(R¹¹)-, -S(O)₂-, -S(O)-, -N(R¹¹)S(O)₂N(R^11a)-, -S-, -N(R¹¹)-, -OC(O)R¹¹, -N(R¹¹)C(O)-, -N(R¹¹)S(O)₂-, -N(R¹¹)S(O)-, -N(R¹¹)C(O)O-, - N(R¹¹)C(O)N(R^11a)- и -OC(O)N(R¹¹R^11a);Accordingly, when L ² is not a single chemical bond, L ² -Z is COOR ⁹ , OR ⁹ , C(O)R ⁹ , C(O)N(R ⁹ R ^9a ), S(O) ₂ N (R ⁹ R ^9a ), S(O)N(R ⁹ R ^9a ), S(O) ₂ R ⁹ , S(O)R ⁹ , N(R ⁹ )S(O) ₂ N(R ^9a R ^9b ), SR ⁹ , N(R ⁹ R ^9a ), OC(O)R ⁹ , N(R ⁹ )C(O)R ^9a , N(R ⁹ )S(O) ₂ R ^9a , N(R ⁹ ) S(O)R ^9a , N(R ⁹ )C(O)OR ^9a , N(R ⁹ )C(O)N(R ^9a R ^9b ), OC(O)N(R ⁹ R ^9a ), T, C _1-50 alkyl, C _2-50 alkenyl or C _2-50 alkynyl, where T, C _1-50 alkyl, C _2-50 alkenyl and C _2-50 alkynyl are optionally substituted with one or more R ¹⁰ radicals which the same or different, and where C _1-50 alkyl, C _2-50 alkenyl and C _2-50 alkynyl are optionally interrupted by one or more groups selected from the group consisting of -T-, -C(O)O-, - O-, -C(O)-, -C(O)N(R ¹¹ )-, -S(O) ₂ N(R ¹¹ )-, -S(O)N(R ¹¹ )-, -S( O) ₂ -, -S(O)-, -N(R ¹¹ )S(O) ₂ N(R ^11a )-, -S-, -N(R ¹¹ )-, -OC(O)R ¹¹ , -N(R ¹¹ )C(O)-, -N(R ¹¹ )S(O) ₂ -, -N(R ¹¹ )S(O)-, -N(R ¹¹ )C(O)O-, - N(R ¹¹ )C(O)N(R ^11a )- and -OC(O)N(R ¹¹ R ^11a );

R⁹, R^9a, R^9b независимо выбирают из группы, состоящей из Н, Т и С_1-50 алкила, C_2-50 алкенила или С_2-50 алкинила, где Т, С_1-50 алкил, C_2-50 алкенил и C_2-50 алкинил при необходимости замещены одним или несколькими R10, которые одинаковые или различные, и где С_1-50 алкил, С_2-50 алкенил и С_2-50 алкинил при необходимости прерываются одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из Т, -С(O)O-, -О-, -С(O), -C(O)N(R¹¹)-, -S(O)₂N(R¹¹)-, -S(O)N(R¹¹)-, -S(O)₂-, -S(O)-, -N(R¹¹)S(O)₂N(R^11a)-, -S-, -N(R¹¹)-, -OC(O)R¹¹, -N(R¹¹)C(O)-, -N(R¹¹)S(O)₂-, -N(R¹¹)S(O)-; -N(R¹¹)C(O)O-; -N(R¹¹)C(O)N(R^11a)- и -OC(O)N(R¹¹R^11a);R ⁹ , R ^9a , R ^9b are independently selected from the group consisting of H, T and C _1-50 alkyl, C _2-50 alkenyl or C _2-50 alkynyl, where T, C _1-50 alkyl, C _2-50 alkenyl and C _2-50 alkynyl are optionally substituted by one or more R10 which are the same or different and where C _1-50 alkyl, C _2-50 alkenyl and C _2-50 alkynyl are optionally interrupted by one or more groups selected from the group , consisting of T, -C(O)O-, -O-, -C(O), -C(O)N(R ¹¹ )-, -S(O) ₂ N(R ¹¹ )-, -S (O)N(R ¹¹ )-, -S(O) ₂ -, -S(O)-, -N(R ¹¹ )S(O) ₂ N(R ^11a )-, -S-, -N( R ¹¹ )-, -OC(O)R ¹¹ , -N(R ¹¹ )C(O)-, -N(R ¹¹ )S(O) ₂ -, -N(R ¹¹ )S(O)-; -N(R ¹¹ )C(O)O-; -N(R ¹¹ )C(O)N(R ^11a )- and -OC(O)N(R ¹¹ R ^11a );

T выбирают из группы, состоящей из фенила, нафтила, инденила, инданила, тетралинила, С_3-10 циклоалкила, 4-7-членного гетероциклила или 9-11-членного гетеробициклила, где Т при необходимости замещен одним или более R¹⁰, которые одинаковые или различные;T is selected from the group consisting of phenyl, naphthyl, indenyl, indanyl, tetralinyl, C _3-10 cycloalkyl, 4-7 membered heterocyclyl or 9-11 membered heterocyclyl, where T is optionally substituted with one or more R ¹⁰ which are the same or various;

R¹⁰ представляет собой Z, галоген, CN, оксо(=O), COOR¹²; OR¹²; C(O)R¹²; C(O)N(R¹²R^12a), S(O)₂N(R¹²R^12a), S(O)N(R¹²R^12a), S(O)₂R¹², S(O)R¹², N(R¹²)S(O)₂N(R^12aR^12b), SR¹², N(R¹²R^12a), NO₂, OC(O)R¹², N(R¹²)C(O)R^12a, N(R¹²)S(O)₂R^12a, N(R¹²)S(O)R^12a, N(R¹²)C(O)OR^12a, N(R¹²)C(O)N(R^12aR^12b); OC(O)N(R¹²R^12a) или C_1-6 алкил, где C_1-6 алкил при необходимости замещен одним или более атомами галогена, которые одинаковые или различные;R ¹⁰ is Z, halogen, CN, oxo(=O), COOR ¹² ; ^OR12 ; C(O)R ¹² ; C(O)N(R ¹² R ^12a ), S(O) ₂ N(R ¹² R ^12a ), S(O)N(R ¹² R ^12a ), S(O) ₂ R ¹² , S(O)R ¹² , N(R ¹² )S(O) ₂ N(R ^12a R ^12b ), SR ¹² , N(R ¹² R ^12a ), NO ₂ , OC(O)R ¹² , N(R ¹² )C(O) R ^12a , N(R ¹² )S(O) ₂ R ^12a , N(R ¹² )S(O)R ^12a , N(R ¹² )C(O)OR ^12a , N(R ¹² )C(O)N (R ^12a R ^12b ); OC(O)N(R ¹² R ^12a ) or C _1-6 alkyl, where C _1-6 alkyl is optionally substituted with one or more halogen atoms which are the same or different;

R¹¹, R^11a, R¹², R^12a, R^12b независимо выбирают из группы, состоящей из Н, Z или C_1-6 алкила, где C_1-6 алкил при необходимости замещен одним или несколькими атомами галогена, которые одинаковые или различные;R ¹¹ , R ^11a , R ¹² , R ^12a , R ^12b are independently selected from the group consisting of H, Z or C _1-6 alkyl, where C _1-6 alkyl is optionally substituted with one or more halogen atoms that are the same or different ;

при условии, что один из R⁹, R^9a, R^9b, R¹¹, R^11a, R¹², R^12a, R^12b представляют собой группу Z.with the proviso that one of R ⁹ , R ^9a , R ^9b , R ¹¹ , R ^11a , R ¹² , R ^12a , R ^12b represents the group Z.

Более предпочтительно L² представляет собой алкильную цепь, содержащую от 1 до 20 углеродных атомов, которая при необходимости прерывается одной или более группами, независимо выбранными из -О- и C(O)N(R^3aa); при необходимости замещенную одной или более группами, независимо выбранными из ОН и C(O)N(R^3aaR^3aaa), и где R^3aa, R^3aaa независимо выбирают из группы, состоящей из Н и С_1-4 алкила.More preferably, L ² is an alkyl chain containing from 1 to 20 carbon atoms, which is optionally interrupted by one or more groups independently selected from —O— and C(O)N(R ^3aa ); optionally substituted with one or more groups independently selected from OH and C(O)N(R ^3aa R ^3aaa ), and wherein R ^3aa , R ^3aaa are independently selected from the group consisting of H and C _1-4 alkyl.

Предпочтительно L² имеет молекулярную массу в интервале от 14 г/моль до 750 г/моль.Preferably L ² has a molecular weight in the range from 14 g/mol to 750 g/mol.

Предпочтительно L² присоединен к Z через концевую группу, выбранную из

Preferably L ² is attached to Z through an end group selected from

В случае, если L² имеет такую концевую группу, также предпочтительно, чтобы L² имел молекулярную массу в интервале от 14 г/моль до 500 г/моль, рассчитанную без учета такой концевой группы.In case L ² has such an end group, it is also preferred that L ² has a molecular weight in the range of 14 g/mol to 500 g/mol, calculated without taking into account such an end group.

L предпочтительно представлен формулой (Ia)L is preferably represented by formula (Ia)

где R⁴, L² и Z имеют значение, указанное выше, и где R^3aa, R^3aaa независимо выбирают из группы, состоящей из Н и C₁-₄ алкила? или R^3aa и R^3aaa вместе с атомом азота, к которому они присоединены, соединяются с образованием 4-7-членного гетероцикла. R⁴ предпочтительно представляет собой Н или метил.where R ⁴ , L ² and Z have the same meaning as above, and where R ^3aa , R ^3aaa independently selected from the group consisting of H and C ₁ - ₄ alkyl? or R ^3aa and R ^3aaa , together with the nitrogen atom to which they are attached, combine to form a 4-7 membered heterocycle. R ⁴ is preferably H or methyl.

L предпочтительно представлен формулой (Ib)L is preferably represented by formula (Ib)

где R¹, R^1a, R⁴, L² и Z имеют значение, указанное выше, и где R^3aa представляет собой Н или С_1-4 алкил. R⁴ предпочтительно представляет собой Н или метил.where R ¹ , R ^1a , R ⁴ , L ² and Z have the same meaning as above, and where R ^3aa represents H or C _1-4 alkyl. R ⁴ is preferably H or methyl.

R¹ в формуле (I) предпочтительно представляет собой L²-Z.R ¹ in formula (I) is preferably L ² -Z.

R³ в формуле (I) предпочтительно представляет собой L²-Z.R ³ in formula (I) is preferably L ² -Z.

R³, R^3a в формуле (I) предпочтительно вместе с атомом азота, к которому они присоединены, соединяются с образованием 4-7-членного гетероцикла, при этом указанный гетероцикл замещен L²-Z.R ³ , R ^3a in formula (I) preferably, together with the nitrogen atom to which they are attached, combine to form a 4-7 membered heterocycle, said heterocycle being substituted with L ² -Z.

D-H предпочтительно представляет собой низкомолекулярный биологически активный агент или биополимер.D-H is preferably a low molecular weight biologically active agent or biopolymer.

D-H предпочтительно представляет собой биополимер, выбранный из группы биополимеров, состоящей из белков, полипептидов, олигонуклеотидов и пептидонуклеиновых кислот.D-H is preferably a biopolymer selected from the group of biopolymers consisting of proteins, polypeptides, oligonucleotides and peptidonucleic acids.

"Олигонуклеотиды" означают ДНК, РНК, как одноцепочечные, так и двухцепочечные, siРНК (малую интерферирующую РНК), miРНК (микроРНК), аптамеры, и любые их химические модификации, которые предпочтительно имеют длину от 2 до 1000 нуклеотидов. Указанные модификации включают, но не ограничиваются теми, которые обеспечивают другие химические группы, которые придают дополнительный заряд, поляризуемость, водородное связывание, электростатическое взаимодействие и плавкость (fluxionality) основаниям нуклеиновой кислоты-лиганда или нуклеиновой кислоте-лиганду в целом. Такие модификации включают, не ограничиваются модификациями во 2'-положении сахара рибозы, модификациями в 5-положении пиримидина, модификации в 8-положении пурина, модификациями по экзоциклическим аминам, замещением 4-тиоуридина, замещением 5-бромо или 5-иодоурацила, модификациями остова, метилированиями, необычными комбинациями спаривания оснований, такими как изооснования изоцитидин и изогуанидин, и тому подобные. Модификации также могут включать в себя 3' и 5' модификации, такие как кэппирование и изменение стереохимии."Oligonucleotides" means DNA, RNA, both single and double stranded, siRNA (small interfering RNA), miRNA (microRNA), aptamers, and any chemical modifications thereof, which are preferably between 2 and 1000 nucleotides in length. These modifications include, but are not limited to, those provided by other chemical moieties that impart additional charge, polarizability, hydrogen bonding, electrostatic interaction, and fluxionality to the bases of the ligand nucleic acid or to the ligand nucleic acid as a whole. Such modifications include, but are not limited to, modifications at the 2'-position of the ribose sugar, modifications at the 5-position of pyrimidine, modifications at the 8-position of purine, modifications at exocyclic amines, 4-thiouridine substitution, 5-bromo or 5-iodouracil substitution, backbone modifications. , methylations, unusual base pairing combinations such as the isobases isocytidine and isoguanidine, and the like. Modifications may also include 3' and 5' modifications such as capping and changing the stereochemistry.

Предпочтительно D-H представляет собой полипептид, выбранный из группы полипептидов, состоящей из адренокортикотропного гормона АСТН, аденозиндезаминазы, агальзидазы, альфа-1-антитрипсина (ААТ), ингибитора альфа-1-протеиназы (API), альтеплазы, амилинов (амилина, симлина), анистреплазы, анкродсеринпротеазы, антител (моноклональных или поликлональных, и их фрагментов или продуктов слияния), антитромбина III, антитрипсинов, апротинина, аспарагиназы, атосибана, бифалина, бивалирудина, костных морфогенных белков, бычьего панкреатического трипсинового ингибитора (BPTI), фрагментов кадгерина, кальцитонина (лосося), коллагеназы, ингибитора системы комплемента с эстеразной активностью C1, конотоксинов, фрагментов цитокиновых рецепторов, ДНКазы, динорфина А, эндорфинов, энфувиртида, энкефалинов, эритропоэтинов, эксендинов, фактора VII, фактора VIIa, фактора VIII, фактора VIIIa, фактора IX, фибринолизина, фактора роста фибробластов (FGF), высвобождающего гормон роста пептида-2, (GHRP2), слитых белков, фолликулостимулирующего гормона, грамицидина, грелина, дезацилгрелина, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), галактозидазы, глюкагона, глюкагон-подобньгх пептидов, глюкоцереброзидазы, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), белков теплового шока человека (HSP), белка, активирующего фосфолипазу, (PLAP), хорионического гонадотропина человека (hCG), гемоглобинов, вакцин против гепатита В, гирудина, ингибитора серинпротеазы человека, гиалуронидаз, идуронидазы, иммунноглобулинов, вакцин против гриппа, интерлейкинов (1-альфа, 1-бета, 2, 3, 4, 6, 10, 11, 12, 13, 21), антагониста рецептора IL-1 (rhIL-lra), инсулинов, инсулиноподобных факторов роста, белка, связывающего инсулиноподобный фактор роста (rhl GFBP), интерферонов (альфа 2а, альфа 2b, альфа 2с, бета-1a, бета 1b, гамма-1a, гамма 1b), молекулы внутриклеточной адгезии, фактора роста кератиноцитов (KGF), гликопротеинового лиганда Р-селектина (PSGL), трансформирующих факторов роста, лактазы, лептина, лейпролида, левотироксина, лютеинизирующего гормона, вакцины против болезни Лайма, натрийуретических пептидов (ANP, BNP, CNP и их фрагментов), нейропептида Y, панкрелипазы, панкреатического полипептида, папаина, паратиреоидного гормона, тромбоцитарного фактора роста (PDGF), пепсина, пептида YY, ацетилгидролазы тромбоцит-активирующего фактора (PAF-AH), пролактина, С-белка, тимальфазина, октреотида, секретина, серморелина, растворимого рецептора фактора некроза опухоли (TNFR), супероксиддисмутазы (SOD), соматропинов (гормонов роста), соматоприма, соматостатина, стрептокиназы, сахаразы, терлипрессина, фрагмента столбнячного токсина, тилактазы, тромбинов, тимозина, гормона, регулирующего деятельность щитовидной железы, тиреотропина, фактора некроза опухоли (TNF), рецептора TNF, соединенного с Fc-участком IgG, тканевого активатора плазминогена (tPA), тиреотропного гормона (TSH), уродилатина, уратоксидазы, урокиназы, вакцин, фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), вазоактивного интестинального пептида, вазопрессина, циконотида, лектина и рицина.Preferably D-H is a polypeptide selected from the group of polypeptides consisting of adrenocorticotropic hormone ACTH, adenosine deaminase, agalsidase, alpha-1 antitrypsin (AAT), alpha-1-proteinase inhibitor (API), alteplase, amylins (amylin, symlin), anistreplase , ancrodserine protease, antibodies (monoclonal or polyclonal, and fragments or fusions thereof), antithrombin III, antitrypsins, aprotinin, asparaginase, atosiban, bifalin, bivalirudin, bone morphogenic proteins, bovine pancreatic trypsin inhibitor (BPTI), cadherin fragments, calcitonin (salmon ), collagenase, inhibitor of the complement system with esterase activity C1, conotoxins, fragments of cytokine receptors, DNase, dynorphin A, endorphins, enfuvirtide, enkephalins, erythropoietins, exendins, factor VII, factor VIIa, factor VIII, factor VIIIa, factor IX, fibrinolysin, fibroblast growth factor (FGF), growth hormone releasing peptide-2 (GHRP2), fusion proteins, follicle stimulating hormone, gramicidin, ghrelin, deacylghrelin, granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), galactosidase, glucagon, glucagon-like peptides, glucocerebrosidase, granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), human heat shock proteins (HSP), phospholipase activating protein (PLAP), human chorionic gonadotropin (hCG), hemoglobins, hepatitis B vaccines, hirudin, human serine protease inhibitor, hyaluronidases, iduronidase, immunoglobulins, influenza vaccines, interleukins (1-alpha, 1-beta, 2, 3, 4, 6, 10, 11, 12, 13, 21), IL-1 receptor antagonist (rhIL-lra), insulins, insulin-like growth factors, insulin-like growth factor binding protein (rhl GFBP), interferons (alpha 2a, alpha 2b, alpha 2c, beta-1a, beta 1b, gamma-1a, gamma 1b), intracellular adhesion molecule, keratinocyte growth factor (KGF ), P-selectin glycoprotein ligand (PSGL), transforming growth factors, lactase, leptin, leuprolide, levothyroxine, luteinizing hormone, Lyme disease vaccine, natriuretic peptides (ANP, BNP, CNP and their fragments), neuropeptide Y, pancrelipase, pancreatic polypeptide, papain, parathyroid hormone, platelet-derived growth factor (PDGF), pepsin, peptide YY, platelet-activating factor acetylhydrolase (PAF-AH), prolactin, C-protein, thymalfasin, octreotide, secretin, sermorelin, soluble tumor necrosis factor receptor ( TNFR), superoxide dismutase (SOD), somatropins (growth hormones), somatoprim, somatostatin, streptokinase, sucrase, terlipressin, tetanus toxin fragment, thylactase, thrombin, thymosin, thyroid-regulating hormone, thyrotropin, tumor necrosis factor (TNF), IgG Fc-linked TNF receptor, tissue plasminogen activator (tPA), thyroid stimulating hormone (TSH), urodilatin, urate oxidase, urokinase, vaccines, vascular endothelial growth factor (VEGF), vasoactive intestinal peptide, vasopressin, cyconotide, lectin, and ricin .

Предпочтительно D-H представляет собой белок, полученный технологиями рекомбинантных ДНК.Preferably D-H is a protein produced by recombinant DNA technologies.

Предпочтительно D-H представляет собой белок, выбранный из группы белков, состоящей из фрагментов антител, одноцепочечных антиген-связывающих белков, каталитических антител и слитых белков.Preferably, D-H is a protein selected from the group of proteins consisting of antibody fragments, single chain antigen binding proteins, catalytic antibodies, and fusion proteins.

Предпочтительно D-H представляет собой низкомолекулярный биологически активный агент, выбранный из группы, состоящей из агентов, воздействующих на центральную нервную систему, противоинфекционных, противоаллергических, иммуномодулирующих агентов, агентов от ожирения, антикоагулянтов, антидиабетических агентов, антиопухолевых, антибактериальных, противогрибковых, болеутоляющих, противозачаточных, противовоспалительных, стероидных, сосудорасширяющих, сосудосуживающих и сердечно-сосудистых агентов, имеющих, по меньшей мере, одну первичную или вторичную аминогруппу.Preferably, D-H is a low molecular weight biologically active agent selected from the group consisting of agents acting on the central nervous system, anti-infective, anti-allergic, immunomodulatory agents, anti-obesity agents, anticoagulants, antidiabetic agents, antitumor, antibacterial, antifungal, analgesic, contraceptive, anti-inflammatory , steroid, vasodilator, vasoconstrictor and cardiovascular agents having at least one primary or secondary amino group.

Предпочтительно D-H представляет собой низкомолекулярный биологически активный агент, выбранный из группы агентов, состоящей из акарбозы, алапроклата, алендроната, амантадина, амикацина, аминептина, аминоглютетимида, амисульприда, амлодипина, амотосалена, амоксапина, амоксициллина, амфетамина, амфотерицина В, ампициллина, ампренавира, амринона, анилеридина, апраклонидина, апрамицина, артикаина, атенолола, атомоксетина, авизафона, баклофена, беназеприла, бенсеразида, бензокаина, бетаксолола, блеомицина, бромфенака, брофаромина, карведилол, катина, катинона, карбутамида, цефалексина, клинафлоксацина, ципрофлоксацина, дефероксамина, делавирдина, дезипрамина, даунорубицина, дексметилфенидата, диафенилсульфона, дизоцилпина, допамина, добутамина, дорзоламида, доксорубицина, дулоксетина, эфлорнитина, эналаприла, адреналина, эпирубицина, эрголина, эртапенема, эсмолола, эноксацина, этамбутола, фенфлюрамина, фенолдопама, фенотерола, финголимода, флекаинида, флувоксамина, фосампренавира, фроватриптана, фуросемида, флуоксетина, габапентина, гатифлоксацина, гемифлокацина, гентамицина, грепафлоксацина, гексилкаина, гидралазина, гидрохлоротиазида, икофунгипена, идарубицина, имиквимода, инверсина, изопротеренола, исрадипина, канамицина А, кетамина, лабеталола, ламивудина, левобунолола, леводопы, левотироксина, лизиноприла, ломефлоксацина, лоракарбефа, мапротилина, мефлохина, мелфалана, мемантина, меропенема, месалазина, мескалина, метилдопы, метилендиоксиметамфетамина, метопролола, милнаципрана, митоксантрона, моксифлоксацина, норадреналина, норфлоксацина, нортриптилина, неомицина В, нистатина, осельтамивира, памидроновой кислоты, пароксетина, пазуфлоксацина, пеметрекседа, периндоприла, фенметразина, фенелзина, прегабалина, прокаина, псевдоэфедрина, протриптилина, ребоксетина, ритодрина, сабарубицина, сальбутамола, серотонина, сертралина, ситаглиптина, соталола, спектиномицина, сульфадиазина, сульфамеразина, сертралина, спректиномипина, сульфалена, сульфаметоксазола, такрина, тамсулозина, тербуталина, тимолола, тирофибана, тобрамицина, токаинида, тосульфлоксацина, трандолаприла, транексамовой кислоты, транилципромина, тримерексата, тровафлоксацина, валацикловира, валганцикловира, ванкомицина, виомицина, вилоксазина и залыгитабина.Preferably D-H is a low molecular weight biologically active agent selected from the group of agents consisting of acarbose, alaproclate, alendronate, amantadine, amikacin, amineptine, aminoglutethimide, amisulpride, amlodipine, amotosalen, amoxapine, amoxicillin, amphetamine, amphotericin B, ampicillin, amprenavir, amrinone , anileridine, apraclonidine, apramycin, articaine, atenolol, atomoxetine, avizafon, baclofen, benazepril, benserazide, benzocaine, betaxolol, bleomycin, bromfenac, brofaromine, carvedilol, cathin, cathinone, carbutamide, cephalexin, clinafloxacin, ciprofloxacin, deferoxamine, delavirdine, desipramine , daunorubicin, dexmethylphenidate, diaphenylsulfone, dizocilpine, dopamine, dobutamine, dorzolamide, doxorubicin, duloxetine, eflornithine, enalapril, epinephrine, epirubicin, ergoline, ertapenem, esmolol, enoxacin, ethambutol, fenfluramine, fenoldopam, fenoter ol, fingolimod, flecainide, fluvoxamine, fosamprenavir , frovatriptan, furosemide, fluoxetine, gabapentin, gatifloxacin, gemiflokacin, gentamicin, grepafloxacin, hexylcaine, hydralazine, hydrochlorothiazide, icofungipene, idarubicin, imiquimod, inversin, isoproterenol, isradipine, kanamycin A, ketamine, labetalol, lamivudine, levobunolol, levodopa, levothyroxine, lisinopril, lomefloxacin, loracarbef, maprotiline, mefloquine, melphalan, memantine, meropenem, mesalazine, mescaline, methyldopa, methylenedioxymethamphetamine, metoprolol, milnacipran, mitoxantrone, moxifloxacin, norepinephrine, norfloxacin, nortriptyline, neomycin B, nystatin, oseltamivir, pamidronic acid, paroxetine, pazufloxacin, pemetrexed, perindopril, phenmetrazine, phenelzine, pregabalin, procaine, pseudoephedrine, protriptyline, reboxetine, ritodrine, sabarubicin, salbutamol, serotonin, sertraline, sitagliptin, sotalol, spectinomycin, sulfadiazine, sulfamerazine, sertraline, c prectinomypine, sulfalene, sulfamethoxazole, tacrine, tamsulosin, terbutaline, timolol, tirofiban, tobramycin, tocainide, tosulfloxacin, trandolapril, tranexamic acid, tranylcypromine, trimerexate, trovafloxacin, valaciclovir, valganciclovir, vancomycin, viomycin, viloxazine, and zalygitabine.

Предпочтительно Z представляет собой полимер, имеющий молекулярную массу, по меньшей мере, 500 Да или C_8-18 алкильную группу.Preferably Z is a polymer having a molecular weight of at least 500 Da or a C _8-18 alkyl group.

В предпочтительном варианте Z выбирают из группы при необходимости сшитых полимеров, состоящей из поли(пропиленгликоля), поли(этиленгликоля), декстрана, хитозана, гиалуроновой кислоты, альгината, ксилана, маннана, каррагинана, агарозы, целлюлозы, крахмала, гидроксиалкилированного крахмала (HAS), поли(виниловых спиртов), поли(оксазолинов), поли(ангидридов), сложных полиортоэфиров, поликарбонатов), поли(уретанов), поли(акриловых кислот), поли(акриламидов), поли(акрилатов), поли(метакрилатов), поли(органофосфазенов), полиоксазолина, поли(силоксанов), поли(амидов), поли(винилпирролидона), поли(цианакрилатов), сложных полиэфиров, поли(иминокарбонатов), поли(аминокислот), коллагена, желатина, гидрогеля или белка плазмы крови, и их сополимеров.In a preferred embodiment, Z is selected from the group of optionally cross-linked polymers consisting of poly(propylene glycol), poly(ethylene glycol), dextran, chitosan, hyaluronic acid, alginate, xylan, mannan, carrageenan, agarose, cellulose, starch, hydroxyalkylated starch (HAS) , poly(vinyl alcohols), poly(oxazolines), poly(anhydrides), polyorthoesters, polycarbonates), poly(urethanes), poly(acrylic acids), poly(acrylamides), poly(acrylates), poly(methacrylates), poly (organophosphazenes), polyoxazoline, poly(siloxanes), poly(amides), poly(vinylpyrrolidone), poly(cyanoacrylates), polyesters, poly(iminocarbonates), poly(amino acids), collagen, gelatin, hydrogel or plasma protein, and their copolymers.

В предпочтительном варианте Z представляет собой белок.In a preferred embodiment, Z is a protein.

В предпочтительном варианте Z представляет собой белок, выбранный из группы, состоящей из альбумина, трансферрина, иммуноглобулина.In a preferred embodiment, Z is a protein selected from the group consisting of albumin, transferrin, immunoglobulin.

В предпочтительном варианте Z представляет собой линейный или разветвленный поли(этиленгликоль) с молекулярной массой от 2000 до 150000 Да.In a preferred embodiment, Z is a linear or branched poly(ethylene glycol) with a molecular weight of 2000 to 150,000 Da.

В еще более предпочтительном варианте предлагается пролекарство настоящего изобретения, в котором D-H представляет собой агонист рецептора глюкагон-подобного пептида GLP-1, L представляет собой L¹, представленный формулой (I), как указано выше, a Z представляет собой гидрогель. Еще в более предпочтительном варианте в формуле (I) X представляет собой N(R⁴), X¹ представляет собой С, а X³ представляет собой О. В особенно предпочтительном варианте L представлен формулой (Ia), указанной выше.In an even more preferred embodiment, a prodrug of the present invention is provided wherein DH is a GLP-1 glucagon-like peptide receptor agonist, L is L ¹ represented by formula (I) as above, and Z is a hydrogel. Even more preferably, in formula (I), X is N(R ⁴ ), X ¹ is C, and X ³ is O. In a particularly preferred embodiment, L is represented by formula (Ia) above.

GLP-1 (глюкагон-подобный пептид-1) является одним из интестинальных пептидных гормонов, который высвобождается в кровеносную систему после приема пищи. Он усиливает постпрандиальное высвобождение инсулина в случае, когда происходит усвоение нищи (особенно углеводов), и их уровень в крови постпрандиально повышен. GLP-1 связан с сайтами рецептора GLP-1, расположенными на β-клетках поджелудочной железы, и повышает уровни эндогенного цАМФ в дозозависимой манере. В изолированных островках крыс в присутствии повышенных концентраций глюкозы в нормогликемическом диапазоне GLP-1 стимулирует секрецию инсулина. Ранее высказывалась возможность применения GLP-1 в терапии больных сахарным диабетом 2 типа благодаря мощному стимулирующему действию этого инсулинотропного пептида для секреции инсулина, когда повышается уровень глюкозы в крови, и прекращению его действия при возвращении в состояние нормогликемии. Ангидиабетогенный эффект амида глюкагонподобного пептида-1 (7-36) у субъектов в норме и пациентов с сахарным диабетом описан, например, в журнале N. Engl. J. Med. 326 (20): стр. 1316-1322. В исследованиях in vitro и экспериментах на животных показано, что GLP-1 улучшает чувствительность к инсулину и оказывает анаболический эффект на панкреатические β-клетки. Также сообщалось, что у человека GLP-1 угнетает секрецию глюкагона, замедляет желудочное опустошение, и вызывает субъективное ощущение сытости, что приводит к снижению веса, если его принимают на протяжении нескольких недель и месяцев.GLP-1 (glucagon-like peptide-1) is one of the intestinal peptide hormones that is released into the bloodstream after eating. It enhances postprandial insulin release when food (especially carbohydrates) is digested and blood levels are elevated postprandially. GLP-1 binds to GLP-1 receptor sites located on pancreatic β-cells and increases endogenous cAMP levels in a dose-dependent manner. In isolated rat islets, in the presence of elevated glucose concentrations in the normoglycemic range, GLP-1 stimulates insulin secretion. Previously, the possibility of using GLP-1 in the treatment of patients with type 2 diabetes mellitus was expressed due to the powerful stimulatory effect of this insulinotropic peptide for insulin secretion when blood glucose levels rise, and the termination of its action when returning to a state of normoglycemia. The angidiabetogenic effect of glucagon-like peptide-1 amide (7-36) in normal subjects and diabetic patients is described, for example, in N. Engl. J. Med. 326(20): pp. 1316-1322. In vitro and animal studies have shown that GLP-1 improves insulin sensitivity and has an anabolic effect on pancreatic β-cells. In humans, GLP-1 has also been reported to inhibit glucagon secretion, slow gastric emptying, and induce a subjective feeling of fullness, resulting in weight loss if taken for weeks or months.

Сообщают, что эксендин-4 связан с рецепторами GLP-1, расположенными на панкреатических β-клетках, и имеет аффинность в 2,5 раза выше, чем GLP-1. В изолированных островках крыс и β-клетках в присутствии глюкозы эксендин усиливает секрецию инсулина в дозозависимой манере. Эксендин-4 является высоко активным агонистом, а усеченный эксендин 9-39-амид - антагонистом к рецептору на секретирующих β-клетках глюкагон-подобного пептид 1-(7-36) амида (см. J. Biol. Chem 268 (26): 19650-19655). В исследованиях на грызунах с диабетом 2 типа было показано, что эксендин-4 в 5530 раз более мощный агент, чем GLP-1 по снижению уровня глюкозы в крови. Кроме того, продолжительность глюкозоснижающего действия после однократного введения эксендина-4 значительно больше, по сравнению с GLP-1 (см., например, Diabetes 48(5): 1026-1034). Сообщалось, что период полужизни в плазме эксендина-4 у людей составлял только 26 минут. Эксендин-4 снижает уровни глюкозы в крови натощак и постпрандиальной глюкозы и снижает потребление энергии у здоровых людей-добровольцев (см., например, Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 281(1): E155-61).Exendin-4 is reported to bind to GLP-1 receptors located on pancreatic β-cells and has an affinity 2.5 times higher than GLP-1. In isolated rat islets and β-cells, in the presence of glucose, exendin enhances insulin secretion in a dose-dependent manner. Exendin-4 is a highly potent agonist, and the truncated exendin 9-39-amide is an antagonist at the receptor on β-secreting glucagon-like peptide 1-(7-36) amide (see J. Biol. Chem 268 (26): 19650-19655). In rodent studies with type 2 diabetes, exendin-4 has been shown to be 5530 times more potent than GLP-1 in lowering blood glucose levels. In addition, the duration of the glucose-lowering effect after a single administration of exendin-4 is significantly longer compared to GLP-1 (see, for example, Diabetes 48(5): 1026-1034). The plasma half-life of exendin-4 in humans has been reported to be only 26 minutes. Exendin-4 reduces fasting and postprandial blood glucose levels and reduces energy intake in healthy human volunteers (see, for example, Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 281(1): E155-61).

Используемые в соответствии с данным изобретением гидрогели известны специалистам в данной области. В качестве подходящих гидрогелей могут служить, такие которые используют в WO-A 2006/003014. В соответствии с этим, гидрогель может быть определен как трехмерные гидрофильные или амфифильных полимерные сетчатые структуры, способные поглощать большие количества воды. Такие сетчатые структуры состоят из гомополимеров или сополимеров, и они нерастворимы из-за наличия ковалентных химических или физических узлов-сшивок (в результате ионных, гидрофобных взаимодействий, переплетений). Узлы-сшивки обеспечивают сетчатую структуру и физическую целостность. Гидрогели демонстрируют термодинамическую совместимость с водой, которая обеспечивает их набухание в водной среде. Цепи указанной сетки связаны так, что имеются поры, и что основная фракция этих пор имеет размеры от 1 нм и 1000 нм.The hydrogels used in accordance with this invention are known to those skilled in the art. Suitable hydrogels are those used in WO-A 2006/003014. Accordingly, a hydrogel can be defined as three-dimensional hydrophilic or amphiphilic polymeric network structures capable of absorbing large amounts of water. Such network structures consist of homopolymers or copolymers, and they are insoluble due to the presence of covalent chemical or physical cross-links (as a result of ionic, hydrophobic interactions, entanglements). Knots provide mesh structure and physical integrity. Hydrogels exhibit thermodynamic compatibility with water, which allows them to swell in an aqueous environment. The chains of said network are connected in such a way that there are pores, and that the main fraction of these pores has sizes between 1 nm and 1000 nm.

Другим объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая в соответствии с настоящим изобретением пролекарство или его фармацевтическую соль в комбинации с фармацевтически приемлемым наполнителем.Another object of the present invention is a pharmaceutical composition containing, in accordance with the present invention, a prodrug or a pharmaceutical salt thereof in combination with a pharmaceutically acceptable excipient.

Еще одним объектом настоящего изобретения является в соответствии с настоящим изобретением пролекарство или фармацевтическая композиция для применения в качестве лекарственного препарата.Another object of the present invention is in accordance with the present invention a prodrug or pharmaceutical composition for use as a drug.

Еще одним объектом в соответствии с настоящим изобретением является способ лечения, регулирования, замедления или предупреждения развития у пациента-млекопитающего при необходимости лечения одного или нескольких состояний,. предусматривающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества пролекарства в соответствии с настоящим изобретением или его фармацевтической композиции или фармацевтически приемлемой соли.Another object in accordance with the present invention is a method of treating, regulating, slowing down or preventing the development of a mammalian patient in need of treatment of one or more conditions. comprising administering to said patient a therapeutically effective amount of a prodrug of the present invention, or a pharmaceutical composition or pharmaceutically acceptable salt thereof.

Еще другим объектом настоящего изобретения является химический предшественник пролекарства формулы Act-L, где L имеет значение, указанное выше, a Act представляет собой уходящую группу.Yet another object of the present invention is the chemical precursor of a prodrug of the formula Act-L, where L is as defined above and Act is a leaving group.

Act предпочтительно представляет собой хлорид, бромид, фторид, нитрофенокси, имидазолил, N-гидроксисукцинимидил, N-гидроксибензотриазолил, N-гидроксиазобензотриазолил, пентафторфенокси, 2-тиооксотиазолидинил, или N-гидроксисульфосукцинимидил.Act is preferably chloride, bromide, fluoride, nitrophenoxy, imidazolyl, N-hydroxysuccinimidyl, N-hydroxybenzotriazolyl, N-hydroxyazobenzotriazolyl, pentafluorophenoxy, 2-thiooxothiazolidinyl, or N-hydroxysulfosuccinimidyl.

ПримерыExamples

Материалы и методыMaterials and methods

Материалы: защищенный в боковой цепи эксендин-4, (J. Eng et al, J. Biol. Chem. 1992, 267, 11, 7402-7405) на амидной смоле Ринка, защищенный в боковой цепи BNP-32a, (человеческий, в котором Cys 10 и Cys 26 заменены на Ala) на хлортритильной смоле, защищенный в боковой цепи BNP-32b (человеческий, в котором Cys 10 и Cys 26 заменены на Ala), с защитной группой ivDde в боковой цепи на Lys в положении 14 на хлортритильной смоле, и амид защищенного в боковой цепи фрагмента высвобождающего фактора человеческого гормона роста 1-29 (GRF(1-29) на амидной смоле Ринка, которые синтезированы по Fmoc стратегии синтеза, получали у фирмы Peptide Specialty Laboratories GmbH, Heidelberg, Germany. В боковой цепи использовали стандартные защитные группы, за исключением того, что для Lys 27 эксендина-4 и Lys 21 соединения GRF(1-29) использовали Mmt-защитные группы боковой цепи.Materials: side chain protected exendin-4, (J. Eng et al, J. Biol. Chem. 1992, 267, 11, 7402-7405) on Rink amide resin, side chain protected BNP-32a, (human, in in which Cys 10 and Cys 26 are replaced by Ala) on chlorotrityl resin, protected in the side chain by BNP-32b (human, in which Cys 10 and Cys 26 are replaced by Ala), with the ivDde protecting group in the side chain on Lys at position 14 on chlorotrityl resin resin, and the amide of the side chain protected human growth hormone releasing factor fragment 1-29 (GRF(1-29) on Rink amide resin) which were synthesized by the Fmoc synthesis strategy were obtained from Peptide Specialty Laboratories GmbH, Heidelberg, Germany. chains used standard protecting groups, except that for Lys 27 exendin-4 and Lys 21 compounds GRF(1-29) used Mmt side chain protecting groups.

40 кДа метокси(полиэтиленгликоль)малеимид-пропионамид (производное ПЭГ с молекулярной массой 40 кДа, содержащее малеимидную группу) получали у фирмы Chirotech Technology Ltd, Cambridge, UK.40 kDa methoxy(polyethylene glycol)maleimide-propionamide (a 40 kDa PEG derivative containing a maleimide group) was obtained from Chirotech Technology Ltd, Cambridge, UK.

2-Хлортритилхлоридную смолу, амидную смолу Зибера, и аминокислоты получали у фирмы Merck Biosciences GmbH, Schwalbach/Ts, Germany. Fmoc-D-гомоцистеин (Trt)-OH и S-тритил-3-меркаптопропионовую кислоту (TRT-MPA) получали у фирмы Bachem AG, Bubendorf, Switzerland. O-(N-Fmoc-2-аминоэтил)-O'-(2-карбоксиэтил)-ундека-этиленгликоль (Fmoc-Pop-OH) получали у фирмы Polypure AS, Oslo, Norway.The 2-chlorotrityl chloride resin, Sieber's amide resin, and amino acids were obtained from Merck Biosciences GmbH, Schwalbach/Ts, Germany. Fmoc-D-homocysteine (Trt)-OH and S-trityl-3-mercaptopropionic acid (TRT-MPA) were obtained from Bachem AG, Bubendorf, Switzerland. O-(N-Fmoc-2-aminoethyl)-O'-(2-carboxyethyl)-undeca-ethylene glycol (Fmoc-Pop-OH) was obtained from Polypure AS, Oslo, Norway.

Fmoc-4-(2-аминоэтил)-1-карбоксиметилпиперазин (Fmoc-Acp-OH) покупали у фирмы NeoMPC SA, Strasbourg, France. Цис-циклогексан-1,2-дикарбоновой кислоты ангидрид получали у фирмы Alfa Aesar GmbH & Со KG, Karlsruhe, Germany.Fmoc-4-(2-aminoethyl)-1-carboxymethylpiperazine (Fmoc-Acp-OH) was purchased from NeoMPC SA, Strasbourg, France. Cis-cyclohexane-1,2-dicarboxylic acid anhydride was obtained from Alfa Aesar GmbH & Co KG, Karlsruhe, Germany.

Все другие химические реактивы получали у фирмы Sigma-ALDRICH Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany.All other chemicals were obtained from Sigma-ALDRICH Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany.

Твердофазный синтез пептидных соединений осуществляли на 2-хлортритилхлоридной смоле с загрузкой 1,3 ммоль/г смолы или амидной смоле Зибера с загрузкой 0,55 ммоль/г смолы. В качестве реакционных сосудов использовали шприцы, оснащенные полипропиленовыми фриттами.Solid-phase synthesis of peptide compounds was carried out on 2-chlorotrityl chloride resin with a loading of 1.3 mmol/g of resin or Sieber's amide resin with a loading of 0.55 mmol/g of resin. Syringes equipped with polypropylene frits were used as reaction vessels.

Загрузку первой аминокислоты в смолы осуществляли в соответствии с инструкциями производителя.The loading of the first amino acid into the resins was carried out in accordance with the manufacturer's instructions.

Снятие Fmoc-защиты:Removing Fmoc protection:

Для удаления Fmoc-защищающей группы, используемую смолу перемешивали с 2/2/96 (об./об./об.) пиперидина/DBU/DMF (два раза по 10 мин каждый) и промывают DMF (десять раз).To remove the Fmoc protecting group, the resin used was mixed with 2/2/96 (v/v/v) piperidine/DBU/DMF (two times 10 min each) and washed with DMF (ten times).

Снятие ivDde-защиты:Removing ivDde-protection:

Для удаления ivDde-защитной группы используемую смолу перемешивали с 98/2 (об./об.) смеси DMF/гидрат гидразина (трижды по 10 мин каждый) и промывают DMF (десять раз).To remove the ivDde-protecting group, the resin used was mixed with 98/2 (v/v) of DMF/hydrazine hydrate (three times for 10 minutes each) and washed with DMF (ten times).

Вос-защита:Vos-protection:

N-конец пептида защищали Вос-группой перемешиванием смолы с 30 экв. (Вос)₂O и 60 экв. пиридина в DCM. Через 1 час смолу промывают DCM (10 раз).The N-terminus of the peptide was protected with a Boc group by stirring the resin with 30 eq. (Boc) ₂ O and 60 equiv. pyridine in DCM. After 1 hour, the resin was washed with DCM (10 times).

Стандартные условия связывания кислот:Standard acid binding conditions:

Связывание кислот (алифатических кислот, Fmoc-аминокислот) со свободными аминогруппам на смоле проводили путем перемешивания смолы с 3 экв. кислоты, 3 экв. РуВОР и 6 экв. DIEA в отношении свободных аминогрупп на смоле (рассчитываемых на основе теоретической загрузки смолы) в ДМФА при комнатной температуре. Через 1 час смолу промывают DMF (10 раз).The binding of acids (aliphatic acids, Fmoc-amino acids) with free amino groups on the resin was carried out by mixing the resin with 3 eq. acids, 3 eq. RuBOP and 6 eq. DIEA in relation to the free amino groups on the resin (calculated based on the theoretical resin load) in DMF at room temperature. After 1 hour, the resin is washed with DMF (10 times).

Связывание 3-малеимидопропионовой кислоты:Binding of 3-maleimidopropionic acid:

Связывание 3-малеимидопропионовой кислоты со свободными аминогруппами на смоле проводили путем смешивания смолы с 2 экв. кислоты, 2 экв. ОПК и 2 экв. HOBt в отношении свободных аминогрупп в ДМФА при комнатной температуре. Через 30 мин смолу промывают DMF (10 раз).Coupling of 3-maleimidopropionic acid with free amino groups on the resin was carried out by mixing the resin with 2 eq. acids, 2 eq. OPC and 2 eq. HOBt for free amino groups in DMF at room temperature. After 30 minutes, the resin was washed with DMF (10 times).

Протокол стандартного синтеза производных мочевины на смоле:Protocol for the standard synthesis of urea derivatives on resin:

Синтез производных мочевины на смоле проводили путем перемешивания смолы с 2,5 экв. бис(пентафторфенил)карбоната, 5 экв. диизопропилэтиламина (DIEA) и 0,25 экв. диметиламинопиридина (DMAP) в отношении свободных аминогрупп в смеси дихлорметана и ацетонитрила (DCM/ACN) 1/1 при комнатной температуре. Через 15 мин смолу промывают N,N-диметилформамид (DMF) (10 раз). 5 экв. амина растворяют в ДМФА. Смесь вводили в смолу и перемешивали в течение 60 мин при комнатной температуре. Смолу промывают с использованием DMF (10 раз).The synthesis of urea derivatives on the resin was carried out by mixing the resin with 2.5 eq. bis(pentafluorophenyl) carbonate, 5 eq. diisopropylethylamine (DIEA) and 0.25 eq. dimethylaminopyridine (DMAP) in relation to free amino groups in a mixture of dichloromethane and acetonitrile (DCM/ACN) 1/1 at room temperature. After 15 minutes, the resin was washed with N,N-dimethylformamide (DMF) (10 times). 5 eq. amine is dissolved in DMF. The mixture was injected into the resin and stirred for 60 minutes at room temperature. The resin is washed with DMF (10 times).

Протокол расщепления для амидной смолы Зибера:Sieber Amide Resin Digestion Protocol:

По завершении синтеза смолу промывали дихлорметаном (DCM) (10 раз), сушили под вакуумом и обрабатывали несколько раз (пять раз по 15 минут) смесью DCM/TES/TFA 97/2/1 (об./об./об.). Элюаты объединяли, летучие компоненты удаляли в потоке азота и полученный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ. Фракции ВЭЖХ, содержащие продукт, объединяли и лиофилизировали.Upon completion of the synthesis, the resin was washed with dichloromethane (DCM) (10 times), dried under vacuum and treated several times (five times for 15 minutes) with a mixture of DCM/TES/TFA 97/2/1 (v/v/v). The eluates were combined, the volatiles were removed under a stream of nitrogen, and the resulting product was purified by reverse phase HPLC. HPLC fractions containing product were pooled and lyophilized.

Протокол расщепления для 2-хлортритилхлоридной смолы:Cleavage protocol for 2-chlorotrityl chloride resin:

По завершении синтеза, смолу промывают DCM, сушили под вакуумом и обрабатывали 2 раза в течение 30 минут смесью DCM/HFIP 6/4 (об./об.). Элюаты объединяли, летучие компоненты удаляли в потоке азота и полученный продукт очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ. Фракции ВЭЖХ, содержащие продукт, объединяли и лиофилизировали.Upon completion of the synthesis, the resin was washed with DCM, dried under vacuum and treated 2 times for 30 minutes with a mixture of DCM/HFIP 6/4 (v/v). The eluates were combined, the volatiles were removed under a stream of nitrogen, and the resulting product was purified by reverse phase HPLC. HPLC fractions containing product were pooled and lyophilized.

Протокол расщепления для амидной смолы Ринка:Cleavage Protocol for Rink's Amide Resin:

По завершении синтеза смолу промывали DCM, сушили под вакуумом и обрабатывали 2 мл смеси TFA для снятия продукта (TFA/TES/H₂O/DTT 95/2/2/1) на 100 мг смолы в течение 60 минут. Летучие компоненты удаляли в потоке азота. Неполярные продукты боковой цепи и защитные группы удаляли осаждением пептида из диэтилового эфира. Осажденный продукт сушили под вакуумом и растворяли в смеси ACN с водой 1/1, а затем очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ.Upon completion of the synthesis, the resin was washed with DCM, dried under vacuum and treated with 2 ml of a mixture of TFA to remove the product (TFA/TES/H ₂ O/DTT 95/2/2/1) per 100 mg of resin for 60 minutes. Volatile components were removed in a stream of nitrogen. Non-polar side chain products and protecting groups were removed by precipitating the peptide from diethyl ether. The precipitated product was dried under vacuum and dissolved in a mixture of ACN with water 1/1, and then purified by reverse phase HPLC.

Аминосодержащие продукты, полученные в виде солей трифторуксусной кислоты, превращали в соответствующие соли HCl на ионообменной смоле (Discovery DSC-SAX, Supelco, USA). Эту стадию проводили в случае, когда ожидалось, что остаточная TFA будет мешать, например, последующим реакциям связывания.The amine containing products obtained as trifluoroacetic acid salts were converted to the corresponding HCl salts on an ion exchange resin (Discovery DSC-SAX, Supelco, USA). This step was performed when residual TFA was expected to interfere with, for example, subsequent coupling reactions.

Очистка с использованием обращенно-фазовой ВЭЖХ:Purification using reverse phase HPLC:

Обращенно-фазовую ВЭЖХ проводили на колонке с силикагелем С18 ReproSil-Pur 300 фаза ODS-3 5 мкм размером 100×20 или 100×40 мм (Dr. Maisch, Ammerbuch, Germany), подсоединенной к системе ВЭЖХ Waters 600 и детектору поглощения Waters 2487. Использовали линейные градиенты раствора А (0,1% TFA в H₂O) и раствора В (0,1% TFA в ацетонитриле). Фракции ВЭЖХ, содержащие продукт, лиофилизировали.Reverse-phase HPLC was performed on a C18 silica gel ReproSil-Pur 300 phase ODS-3 5 µm 100x20 or 100x40 mm column (Dr. Maisch, Ammerbuch, Germany) connected to a Waters 600 HPLC system and a Waters 2487 absorption detector Linear gradients of solution A (0.1% TFA in H ₂ O) and solution B (0.1% TFA in acetonitrile) were used. The HPLC fractions containing the product were lyophilized.

Анализ образцов: масс-спектрометрию с ионизацией электрораспылением (ESI-MS) осуществляли на измерительной системе Waters ZQ 4000 ESI и, при необходимости, масс-спектры расшифровывали с использованием программного обеспечения Waters MaxEnt.Sample analysis: Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) was performed on a Waters ZQ 4000 ESI measuring system and, if necessary, mass spectra were interpreted using Waters MaxEnt software.

Эксклюзионную хроматографию (SEC) проводили с использованием системы Amersham Bioscience AEKTAbasic, оснащенную колонкой Superdex200 10/300 (Amersham Bioscience/GE Healthcare), если не указано иное. В качестве подвижной фазы использовали 10 мМ фосфата натрия, 140 мМ NaCl, рН 7,4, 3 мМ EDTA.Size exclusion chromatography (SEC) was performed using an Amersham Bioscience AEKTAbasic system equipped with a Superdex200 10/300 column (Amersham Bioscience/GE Healthcare) unless otherwise noted. The mobile phase was 10 mM sodium phosphate, 140 mM NaCl, pH 7.4, 3 mM EDTA.

Катионнобменную хроматографию проводили с использованием системы Amersham Bioscience AEKTAbasic, оснащенную колонкой Source 15S, заполненную HR16/10 (Amersham Bioscience / GE Healthcare).Cation exchange chromatography was performed using an Amersham Bioscience AEKTAbasic system equipped with a Source 15S column packed with HR16/10 (Amersham Bioscience / GE Healthcare).

Обессоливание проводили с использованием системы Amersham Bioscience AEKTAbasic, оснащенной колонкой для обессоливания HiPrep 26/10, и 0,1% уксусной кислоты в воде в качестве подвижной фазы.Desalting was performed using an Amersham Bioscience AEKTAbasic system equipped with a HiPrep 26/10 desalting column and 0.1% acetic acid in water as the mobile phase.

Гидролиз линкера in vitro и высвобождение лекарственного средства: соединения растворяли в буфере А (10 мМ натрия фосфата, 140 мМ NaCl, рН 7,4, 3 мМ EDTA) или буфере В (0,1 мМ ацетата и 3 мМ EDTA, рН 4,0), и затем раствор фильтровали через фильтр 0,2 мкм и инкубировали при 37°С. Отбирали пробы с задержкой по времени и анализировали обращенно-фазовой ВЭЖХ при 215 нм и ESI-MS. УФ сигналы, коррелирующие с освобожденной молекулой лекарственного средства, объединяли и изображали на графике в зависимости от времени инкубации. В случае одинакового времени удержания пролекарства и лекарственного средства соотношение сигналов масс использовали для определения кинетики высвобождения.In vitro linker hydrolysis and drug release: compounds were dissolved in buffer A (10 mM sodium phosphate, 140 mM NaCl, pH 7.4, 3 mM EDTA) or buffer B (0.1 mM acetate and 3 mM EDTA, pH 4, 0), and then the solution was filtered through a 0.2 μm filter and incubated at 37°C. Samples were taken with a time delay and analyzed by reverse phase HPLC at 215 nm and ESI-MS. UV signals correlated with the released drug molecule were pooled and plotted against incubation time. In the case of the same retention time of the prodrug and drug, the ratio of the mass signals was used to determine the release kinetics.

В случае гидрогелевых конъюгатов соединения суспендировали в буфере А и инкубировали при температуре 37°С. Аналиты отбирали после центрифугирования суспензии и анализировали методом обращенно-фазовой ВЭЖХ при 215 нм. УФ сигналы, коррелирующие с освобожденной молекулой лекарственного средства, объединяли и изображали на графике в зависимости от времени инкубации.In the case of hydrogel conjugates, the compounds were suspended in buffer A and incubated at 37°C. Analytes were taken after centrifugation of the suspension and analyzed by reverse phase HPLC at 215 nm. UV signals correlated with the released drug molecule were pooled and plotted against incubation time.

Для оценки соответствующего периода полужизни при высвобождении использовали программное обеспечение для обработки кривых.Curve processing software was used to evaluate the corresponding release half-life.

Пример 1Example 1

Синтез носителя на основе жирных кислот (1)Synthesis of carrier based on fatty acids (1)

1 синтезируют на амидной смоле Зибера (477 мг, 0,262 ммоль), путем связывания Fmoc-Lys(ivDde)-OH, снятия Fmoc-защиты, связывания додекановой кислоты, снятия ivDde-защиты, связывания Fmoc-Pop-OH, снятия Fmoc-защиты, связывания 3-малеимидопропионовой кислоты, отщепления от смолы и последующую очистку, как показано выше и описано в разделе "Материалы и методы". Выход: 128 мг (0,119 ммоль).1 synthesized on Sieber amide resin (477 mg, 0.262 mmol), by Fmoc-Lys(ivDde)-OH coupling, Fmoc deprotection, dodecanoic acid coupling, ivDde deprotection, Fmoc-Pop-OH coupling, Fmoc deprotection , binding of 3-maleimidopropionic acid, cleavage from the resin and subsequent purification as described above and described in the Materials and Methods section. Yield: 128 mg (0.119 mmol).

МС: м/з 1101,0 = [M+Na]⁺ (Расчетная Мм = 1078,4 г/моль).MS: m/z 1101.0 = [M+Na] ⁺ (calculated Mm = 1078.4 g/mol).

Пример 2Example 2

Синтез линкерного реагента (2)Linker Reagent Synthesis (2)

Линкерный реагент 2 синтезируют на 3-хлортритилхлоридной смоле (300 мг, 0,39 ммоль) путем нагружения смолы Fmoc-Cys (Trt)-OH, снятия Fmoc-защиты и образования на смоле производного мочевины, используя N,N-диметилэтилендиамин в качестве амина, отщепления продукта от смолы, как показано выше и описано в разделе "Материалы и методы". Для разделения методом обращенно-фазовой ВЭЖХ использовали 0,01% HCl в воде в качестве раствора А и 0,01% HCl в ацетонитриле в качестве раствора В.Linker reagent 2 was synthesized on 3-chlorotrityl chloride resin (300 mg, 0.39 mmol) by loading the resin with Fmoc-Cys(Trt)-OH, deprotecting the Fmoc, and forming a urea derivative on the resin using N,N-dimethylethylenediamine as the amine , cleavage of the product from the resin as shown above and described in the Materials and Methods section. For reverse phase HPLC separation, 0.01% HCl in water was used as solution A and 0.01% HCl in acetonitrile as solution B.

Выход: 82 мг продукта в виде HCl-соли (0,16 ммоль).Yield: 82 mg of product as HCl salt (0.16 mmol).

МС: м/з 478,2 = [М+Н]⁺ (Расчетная Мм = 477,6 г/моль).MS: m/z 478.2 = [M+H] ⁺ (calculated Mm = 477.6 g/mol).

Пример 3Example 3

Синтез интермедиата линкера, связанного с эксендином-4 (3)Synthesis of exendin-4 linked linker intermediate (3)

2 (14 мг, 0,027 ммоль), РуВОР (14 мг, 0,027 ммоль) и DIEA (17 мкл, 0,10 ммоль) растворяют в 0,2 мл безводного DMF. Полученную смесь добавляют к 22 мг защищенному в боковой цепи эксендину-4 на смоле (0,1 ммоль/г, 2,2 мкмоль) и интенсивно перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Смолу промывают DMF (10 раз) и DCM (10 раз). 3 отщепляют от смолы и очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ по методике, описанной в разделе "Материалы и Методы".2 (14 mg, 0.027 mmol), PyBOP (14 mg, 0.027 mmol) and DIEA (17 μl, 0.10 mmol) are dissolved in 0.2 ml anhydrous DMF. The resulting mixture was added to 22 mg side chain protected exendin-4 resin (0.1 mmol/g, 2.2 µmol) and stirred vigorously for 30 minutes at room temperature. The resin was washed with DMF (10 times) and DCM (10 times). 3 was cleaved from the resin and purified by reverse phase HPLC as described in the Materials and Methods section.

Выход: 1,7 мг 3 в виде трифторацетатной соли (0,38 мкмоль).Yield: 1.7 mg 3 as trifluoroacetate salt (0.38 µmol).

МС: м/з 1468,7 = [М+3Н]³+ (Расчетная Мм = 4403 г/моль).MS: m/z 1468.7 = [M+3H] ³ + (Calculated Mm = 4403 g/mol).

Пример 4Example 4

Синтез конъюгата жирная кислота-ПЭГ-линкер-эксендин-4 (Соединение 4)Synthesis of fatty acid-PEG-linker-exendin-4 conjugate (Compound 4)

3 (1,7 мг, 0,38 ммоль) и 1 (0,6 мг, 0,58 ммоль) растворяют в 500 мкл смеси ацетонитрил/вода 7/3 (об./об.). Прибавляют 40 мкл 0,5 М фосфатного буфера (рН 7,4), и смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин. Конъюгат 4 очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.3 (1.7 mg, 0.38 mmol) and 1 (0.6 mg, 0.58 mmol) are dissolved in 500 μl of acetonitrile/water 7/3 (v/v). 40 µl of 0.5 M phosphate buffer (pH 7.4) is added and the mixture is incubated at room temperature for 10 minutes. Conjugate 4 was purified by reverse phase HPLC.

МС: м/з 1828,7 = [М+3Н]³⁺ (Расчетная Мм = 5480 г/моль).MS: m/z 1828.7 = [M+3H] ³⁺ (calculated Mm = 5480 g/mol).

Пример 5Example 5

Синтез линкерного интермедиата (5а)Synthesis of linker intermediate (5а)

Fmoc-Acp-OH⋅2HCl (100 мг, 0,21 ммоль) суспендируют в 400 мкл DMF/DMSO 1/1 (об./об.). Добавляют S-тритилцистеамина гидрохлорид (75 мг, 0,21 ммоль), РуВОР (109 мг, 0,21 ммоль) и DIEA (146 мкл, 0,86 ммоль) и смесь перемешивают в течение 60 мин при комнатной температуре. Fmoc-группу снимают путем добавления 75 мкл пиперидина и 25 мкл DBU. Через 15 минут смесь подвергают гидролизу и подкисляют уксусной кислотой (АсОН) и полученное соединение очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. После лиофилизации получают 98 мг продукта (0,14 ммоль, в виде двойной трифторацетатной соли).Fmoc-Acp-OH.2HCl (100 mg, 0.21 mmol) is suspended in 400 μl DMF/DMSO 1/1 (v/v). S-tritylcysteamine hydrochloride (75 mg, 0.21 mmol), PyBOP (109 mg, 0.21 mmol) and DIEA (146 μl, 0.86 mmol) are added and the mixture is stirred for 60 min at room temperature. The Fmoc group is removed by adding 75 µl of piperidine and 25 µl of DBU. After 15 minutes, the mixture is hydrolysed and acidified with acetic acid (AcOH) and the resulting compound is purified by reverse phase HPLC. After lyophilization, 98 mg of product (0.14 mmol, as double trifluoroacetate salt) is obtained.

МС: м/з 511,6 = [М+Na]⁺ (Расчетная Мм = 488,7 г/моль).MS: m/z 511.6 = [M+Na] ⁺ (calculated Mm = 488.7 g/mol).

Синтез цис-циклогексан-дикарбоновой кислоты амоксапина моноамида (5b)Synthesis of cis-cyclohexane-dicarboxylic acid amoxapine monoamide (5b)

Амоксапин (200 мг, 0,64 ммоль) и цис-циклогексан-1,2-дикарбоновый ангидрид (108 мг, 0,70 ммоль) растворяют в 700 мкл сухого DMF. Добавляют пиридин (130 мкл, 1,6 ммоль) и смесь перемешивают в течение 60 мин при комнатной температуре. Смесь гасят 2 мл смеси ацетонитрил/уксусная кислота/вода (1/1/1) и очищают обращенно-фазовой ВЭЖХ. После лиофилизации получают 344 мг 5b (0,49 ммоль, в виде двойной трифторацетатной соли).Amoxapine (200 mg, 0.64 mmol) and cis-cyclohexane-1,2-dicarboxylic anhydride (108 mg, 0.70 mmol) are dissolved in 700 μl of dry DMF. Pyridine (130 μl, 1.6 mmol) is added and the mixture is stirred for 60 minutes at room temperature. The mixture was quenched with 2 ml of acetonitrile/acetic acid/water (1/1/1) and purified by reverse phase HPLC. After lyophilization, 344 mg of 5b (0.49 mmol, as double trifluoroacetate salt) are obtained.

МС: м/з 468,5 = [М+Н]⁺ (Расчетная Мм = 468,0 г/моль).MS: m/z 468.5 = [M+H] ⁺ (calculated Mm = 468.0 g/mol).

Синтез конъюгата линкер-амоксапин (5с)Synthesis of the linker-amoxapine conjugate (5c)

5b (7 мг, 0,010 ммоль) предварительно активируют инкубацией с использованием РуВОР (12,5 мг, 0,024 ммоль) и DIEA (5 мкл, 0,03 ммоль) в 200 мкл безводного DMF в течение 45 мин при комнатной температуре. Добавляют 5а (20 мг, 0,028 ммоль) и DIEA (15 мкл, 0,09 ммоль) и смесь инкубируют еще 60 мин. Смесь гасят 0,5 мл смеси ацетонитрил/уксусная кислота/вода (1/1/1) и очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. После лиофилизации получают 3 мг 5 с (0,0026 ммоль, в виде двойной трифторацетатной соли).5b (7 mg, 0.010 mmol) is pre-activated by incubation with PyBOP (12.5 mg, 0.024 mmol) and DIEA (5 μl, 0.03 mmol) in 200 μl anhydrous DMF for 45 min at room temperature. 5a (20 mg, 0.028 mmol) and DIEA (15 µl, 0.09 mmol) are added and the mixture is incubated for another 60 minutes. The mixture was quenched with 0.5 ml of acetonitrile/acetic acid/water (1/1/1) and purified by reverse phase HPLC. After lyophilization, 3 mg 5 s (0.0026 mmol, as double trifluoroacetate salt) is obtained.

МС: м/з 939,3 = [М+Н]⁺ (Расчетная Мм = 938,6 г/моль).MS: m/z 939.3 = [M+H] ⁺ (calculated Mm = 938.6 g/mol).

Для снятия тритильной защиты лиофилизат инкубируют в 1 мл HFIP и 3 мкл TES в течение 30 мин. Смесь упаривают и полученный тиол очищают обращенно-фазовой ВЭЖХ. После лиофилизации получают 2 мг (2,2 мкмоль, в виде двойной трифторацетатной соли) конъюгата амоксапин-линкер 5с.To remove the trityl protection, the lyophilisate is incubated in 1 ml of HFIP and 3 µl of TES for 30 min. The mixture is evaporated and the resulting thiol is purified by reverse phase HPLC. After lyophilization, 2 mg (2.2 μmol, as double trifluoroacetate salt) of the amoxapine-linker 5c conjugate is obtained.

МС: м/з 697,1 = [М+Н]⁺ (=[М+Н]⁺ (Расчетная Mw = 696,3 г/моль).MS: m/z 697.1 = [M+H] ⁺ (=[M+H] ⁺ (Estimated Mw = 696.3 g/mol).

Синтез конъюгата жирная кислота-ПЭГ-амоксапин (5)Synthesis of fatty acid-PEG-amoxapine conjugate (5)

Конъюгат амоксапин-линкер 5с (2 мг, 2,2 мкмоль) и 1 (3,5 мг, 3,2 мкмоль) растворяют в 900 мкл смеси ацетонитрил/вода 7/3 (об./об.). Прибавляют 60 мкл 0,5 М фосфатного буфера (рН 7,4), и смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин. 5 очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. МС:Amoxapine-linker conjugate 5c (2 mg, 2.2 µmol) and 1 (3.5 mg, 3.2 µmol) is dissolved in 900 µl of acetonitrile/water 7/3 (v/v). 60 µl of 0.5 M phosphate buffer (pH 7.4) is added and the mixture is incubated at room temperature for 10 minutes. 5 was purified by reverse phase HPLC. MS:

м/з 1774,9 = [М+Н]⁺ (Расчетная Мм = 1774,7 г/моль).m / s 1774.9 \u003d [M + H] ⁺ (Calculated Mm \u003d 1774.7 g / mol).

Пример 6Example 6

Синтез линкерного реагента (Соединение 6)Synthesis of the linker reagent (Compound 6)

Fmoc-Asp (t-Bu)-OH (411 мг, 1 ммоль), HOBt (153 мг, 1 ммоль) и DIC (160 мкл, 1 ммоль) растворяют в 2 мл DMF и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре. Прибавляют N,N-диметилэтилендиамин (160 мкл, 1,5 ммоль) и перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин. Прибавляют уксусную кислоту (300 мкл) и Fmoc-Asp(t-Bu)-NH-(CH₂)₂-N(CH3)₂ очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.Fmoc-Asp (t-Bu)-OH (411 mg, 1 mmol), HOBt (153 mg, 1 mmol) and DIC (160 μl, 1 mmol) are dissolved in 2 ml DMF and incubated for 10 min at room temperature. Add N,N-dimethylethylenediamine (160 µl, 1.5 mmol) and stir at room temperature for 30 minutes. Acetic acid (300 µl) is added and Fmoc-Asp(t-Bu)-NH-(CH ₂ ) ₂ -N(CH3) ₂ is purified by reverse phase HPLC.

Выход: 220 мг (0,46 ммоль)Yield: 220 mg (0.46 mmol)

МС Fmoc-Asp(t-Bu)-NH-(CH₂)₂-N(CH3)₂: м/з 504,6 = [М+Na]⁺ (Расчетная Мм = 481,6 г/моль).MS Fmoc-Asp(t-Bu)-NH-(CH ₂ ) ₂ -N(CH3) ₂ : m/z 504.6 = [M+Na] ⁺ (Calculated Mm = 481.6 g/mol).

Fmoc-Asp (t-Bu)-NH-(CH₂)₂-N(CH3)₂ (220 мг, 0,46 ммоль) растворяют в 3 мл смеси TFA/TES 98/2 (об./об.). Через 30 мин растворитель удаляют в потоке азота и 6 очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с использованием 0,01% HCl в воде в качестве растворителя А и 0,01% HCl в ацетонитриле в качестве растворителя В.Fmoc-Asp (t-Bu)-NH-(CH ₂ ) ₂ -N(CH3) ₂ (220 mg, 0.46 mmol) is dissolved in 3 ml TFA/TES 98/2 (v/v). After 30 minutes, the solvent was removed under a stream of nitrogen and 6 purified by reverse phase HPLC using 0.01% HCl in water as solvent A and 0.01% HCl in acetonitrile as solvent B.

Выход: 146 мг (0,32 ммоль, в виде HCl-соли).Yield: 146 mg (0.32 mmol, as HCl salt).

МС: м/з 426,5 = [М+Н]⁺ (Расчетная Мм = 425,5 г/моль).MS: m/z 426.5 = [M+H] ⁺ (calculated Mm = 425.5 g/mol).

Пример 7Example 7

Синтез линкерных реагентов 7а и 7bSynthesis of linker reagents 7а and 7b

7a:R=H7a:R=H

7b:CH₃ 7b: CH ₃

Синтез 7а:Synthesis 7a:

Fmoc-Asp (t-Bu)-OH (300 мг, 0,73 ммоль), HOBt (1112 мг, 0,73 ммоль) и DIC (117 мкл, 0,73 ммоль) растворяют в 2 мл DMF и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре. Прибавляют Вос-этилендиамин (230 мг, 1,44 ммоль) и полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин. Прибавляют уксусную кислоту (300 мкл) и Fmoc-Asp(t-Bu)-NH-(CH₂)₂-NH-Boc очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.Fmoc-Asp (t-Bu)-OH (300 mg, 0.73 mmol), HOBt (1112 mg, 0.73 mmol) and DIC (117 μl, 0.73 mmol) are dissolved in 2 ml DMF and incubated for 10 min at room temperature. Boc-ethylenediamine (230 mg, 1.44 mmol) is added and the resulting mixture is stirred at room temperature for 30 minutes. Acetic acid (300 μl) is added and Fmoc-Asp(t-Bu)-NH-(CH ₂ ) ₂ -NH-Boc is purified by reverse phase HPLC.

Выход: 205 мг (0,37 ммоль)Yield: 205 mg (0.37 mmol)

МС промежуточного соединения: м/з 576,6 = [M+Na]⁺ (Расчетная Мм = 553,7 г/моль).MS intermediate: m/z 576.6 = [M+Na] ⁺ (calculated Mm = 553.7 g/mol).

Fmoc-Asp (t-Bu)-NH-(CH₂)₂-NH-Boc (205 мг, 0,37 ммоль) растворяют в 3 мл 98/2 (об./об.) TFA/TES. Через 30 мин растворитель удаляют в потоке азота и полученный Fmoc-Asp(H)-NH-(CH₂)₂-NH₂ очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.Fmoc-Asp (t-Bu)-NH-(CH ₂ ) ₂ -NH-Boc (205 mg, 0.37 mmol) was dissolved in 3 ml of 98/2 (v/v) TFA/TES. After 30 minutes the solvent was removed under nitrogen flow and the resulting Fmoc-Asp(H)-NH-(CH ₂ ) ₂ -NH ₂ was purified by reverse phase HPLC.

Выход: 140 мг (0,27 ммоль, в виде трифторацетатной соли)Yield: 140 mg (0.27 mmol, as trifluoroacetate salt)

МС промежуточного соединения: м/з 398,8 = [М+Н]⁺ (Расчетная Мм = 397,4 г/моль).MS intermediate: m/z 398.8 = [M+H] ⁺ (calculated Mm = 397.4 g/mol).

Fmoc-Asp(H)-NH-(CH₂)₂-NH₂ (140 мг, 0,27 ммоль, в виде трифторацетатной соли) растворяют в 1 мл DMF и DIEA (140 мкл, 0,81 ммоль) и прибавляют boc₂O (100 мг, 0,46 ммоль). Раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 15 минут, а затем подкисляют уксусной кислотой (300 мкл). 7а очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.Fmoc-Asp(H)-NH-(CH ₂ ) ₂ -NH ₂ (140 mg, 0.27 mmol, as trifluoroacetate salt) is dissolved in 1 ml of DMF and DIEA (140 μl, 0.81 mmol) and boc is added ₂ O (100 mg, 0.46 mmol). The solution is stirred at room temperature for 15 minutes and then acidified with acetic acid (300 μl). 7a was purified by reverse phase HPLC.

Выход 7а: 120 мг (0,24 ммоль)Yield 7a: 120 mg (0.24 mmol)

МС 7а: м/з 520,5 = [M+Na]⁺ (Расчетная Мм = 497,6 г/моль).MS 7a: m/z 520.5 = [M+Na] ⁺ (calculated Mm = 497.6 g/mol).

7b получают по методике, описанной выше за исключением того, что на первой стадии синтеза используют H₂N-(CH₂)₂-N(CH₃)-boc вместо Вос-этилендиамина в качестве амина.7b is prepared as described above except that H ₂ N-(CH ₂ ) ₂ -N(CH ₃ )-boc is used in the first step of the synthesis instead of Boc-ethylenediamine as the amine.

Выход 7b: 115 мгYield 7b: 115 mg

МС 7b: м/з 534,5 = [M+Na]⁺ (Расчетная Мм = 511,6 г/моль).MS 7b: m/z 534.5 = [M+Na] ⁺ (calculated Mm = 511.6 g/mol).

Пример 8Example 8

Синтез конъюгатов эксендин-линкер (8а, 8b и 8с)Synthesis of exendin-linker conjugates (8a, 8b and 8c)

8а: R¹ = Н, R² = Н8a: R ¹ = H, R ² = H

8b: R¹ = H, R² = CH₃ 8b: R ¹ = H, R ² = CH ₃

8с: R¹ = СН₃, R² = СН₃ 8s: R ¹ = CH ₃ , R ² = CH ₃

Синтез соединения 8а:Synthesis of compound 8a:

7а (30 мг, 60 мкмоль), HOBt (9 мг, 60 мкмоль), DIEA (12 мкл, 70 мкмоль) и DIC (10 мкл, 63 мкмоль) растворяют в 200 мкл DMF, и сразу же вводят в смолу, несущую защищенный в боковой цепи эксендин-4, (40 мг, 4 мкмоль), и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре. Смолу промывают десять раз DMF, а затем инкубируют в течение 5 мин в 500 мкл 1/1/2 уксусного ангидрида/пиридина/DMF. Смолу промывают 10 раз DMF и fmoc-группу удаляют. Присоединяют trt-меркаптопропионовую кислоту и 8а отщепляют от смолы и очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.7a (30 mg, 60 µmol), HOBt (9 mg, 60 µmol), DIEA (12 µl, 70 µmol) and DIC (10 µl, 63 µmol) are dissolved in 200 µl DMF, and immediately injected into the resin bearing the protected in the side chain of exendin-4, (40 mg, 4 µmol), and incubated for 1 hour at room temperature. The resin was washed ten times with DMF and then incubated for 5 min in 500 µl of 1/1/2 acetic anhydride/pyridine/DMF. The resin is washed 10 times with DMF and the fmoc group is removed. Trt-mercaptopropionic acid is attached and 8a is cleaved from the resin and purified by reverse phase HPLC.

Выход: 3,6 мгYield: 3.6 mg

МС 8а: м/з 1108,5 = [М+4Н]⁴⁺, 1477,8 = [М+3Н]³⁺ (Расчетная Мм = 4432 г/моль).MS 8a: m/z 1108.5 = [M+4H] ⁴⁺ , 1477.8 = [M+3H] ³⁺ (Calculated Mm = 4432 g/mol).

8b получают по методике синтеза 8а за исключением того, что вместо 7а используют 7b.8b is prepared according to the synthesis procedure 8a, except that 7b is used instead of 7a.

Выход: 3,5 мгYield: 3.5 mg

МС 8b: м/з 1112,5 = [М+4Н]⁴⁺, 1482,5 = [М+3Н]³⁺; (Расчетная Мм = 4446 г/моль).MS 8b: m/z 1112.5 = [M+4H] ⁴⁺ , 1482.5 = [M+3H] ³⁺ ; (Calculated Mm = 4446 g/mol).

8с получают по методике синтеза 8а за исключением того, что вместо 7а используют 6.8c is prepared according to the synthesis procedure 8a, except that 6 is used instead of 7a.

Выход: 3,2 мгYield: 3.2 mg

МС 8с: м/з 1116,2 = [М+4Н]⁴⁺, 1487,8 = [М+3Н]³⁺ (Расчетная Мм = 4460 г/моль).MS 8s: m/z 1116.2 = [M+4H] ⁴⁺ , 1487.8 = [M+3H] ³⁺ (Calculated Mm = 4460 g/mol).

Пример 9Example 9

Синтез конъюгатов ПЭГ40кДа -линкер -эксендин (9а, 9b и 9с)Synthesis of PEG40kDa-linker-exendin conjugates (9a, 9b and 9c)

9а: R¹ = H, R² = H9a: R ¹ = H, R ² = H

9b: R¹ = H, R² = CH₃ 9b: R ¹ = H, R ² = CH ₃

9с: R¹ = СН₃, R² = СН₃ 9c: R ¹ = CH ₃ , R ² = CH ₃

Синтез 9а:Synthesis 9a:

8а (3,6 мг) растворяют в 300 мкл смеси вода/ацетонитрил 2/1 и прибавляют 50 мг ПЭГ40кДа-малеимида. Прибавляют 100 мкл 0,25 М натрий-фосфатного буфера, рН 7 и через 5 минут раствор подкисляют 50 мкл уксусной кислоты.8a (3.6 mg) is dissolved in 300 μl of a 2/1 water/acetonitrile mixture and 50 mg of PEG40kDa-maleimide are added. Add 100 µl of 0.25 M sodium phosphate buffer, pH 7, and after 5 minutes the solution is acidified with 50 µl of acetic acid.

9а очищают ионообменной хроматографией с использованием 10 мМ натрий-цитратного буфера рН3 в качестве растворителя А и 10 мМ натрий-цитратного буфера, рН 3 и 1М NaCl в качестве растворителя В и ступенчатого градиента (от 0 до 40% растворителя В). Фракции, содержащие 9а, высаливают и лиофилизируют.9a was purified by ion exchange chromatography using 10 mM sodium citrate buffer pH 3 as solvent A and 10 mM sodium citrate buffer pH 3 and 1 M NaCl as solvent B and a stepwise gradient (from 0 to 40% solvent B). Fractions containing 9a are salted out and lyophilized.

Выход: 14 мгYield: 14 mg

9b синтезируют как описано выше за исключением того, что используют 8b.9b was synthesized as described above except that 8b was used.

Выход: 15 мгYield: 15 mg

9с синтезируют как описано выше за исключением того, что используют 8с.9c was synthesized as described above except that 8c was used.

Выход: 13 мгYield: 13 mg

Пример 10Example 10

Синтез конъюгата жирная кислота-линкер-эксендин (10)Synthesis of fatty acid-linker-exendin conjugate (10)

8с (1 мг) растворяют в 100 мкл смеси ацетонитрил/вода, 1/1 и добавляют 1 (1 мг) в 100 мкл смеси 3/1 ацетонитрил/вода. Добавляют 100 мкл 0,25 М натрий-фосфатного буфера, реакционную смесь перемешивают в течение 5 мин, и полученное 10 очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.8c (1 mg) is dissolved in 100 µl of acetonitrile/water, 1/1 and 1 (1 mg) in 100 µl of 3/1 acetonitrile/water is added. Add 100 μl of 0.25 M sodium phosphate buffer, the reaction mixture is stirred for 5 min, and the resulting 10 is purified by reverse phase HPLC.

Выход: 1,3 мгYield: 1.3 mg

МС 10: м/з 1385,9 = [М+4Н]⁴⁺, 1846,3 = [М+3Н]³⁺ (Расчетная Мм = 5528,3 г/моль).MS 10: m/z 1385.9 = [M+4H] ⁴⁺ , 1846.3 = [M+3H] ³⁺ (Calculated Mm = 5528.3 g/mol).

Пример 11Example 11

Синтез NHS-активированного линкерного реагента (11)Synthesis of NHS-activated linker reagent (11)

7b (20 мг, 40 мкмоль), N,N'-дициклогексилкарбодиимид (10 мг, 48 мкмоль) и N-гидроксисукцинимид (NHS) (8 мг, 70 мкмоль) растворяют в 300 мкл безводного DCM и перемешивают при комнатной температуре в течение 1 часа. Растворитель удаляют в потоке азота и 11 очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ и лиофилизируют.7b (20 mg, 40 µmol), N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (10 mg, 48 µmol) and N-hydroxysuccinimide (NHS) (8 mg, 70 µmol) are dissolved in 300 µl anhydrous DCM and stirred at room temperature for 1 hours. The solvent was removed under a stream of nitrogen and 11 purified by reverse phase HPLC and lyophilized.

Выход: 22 мг (36 мкмоль)Yield: 22 mg (36 µmol)

МС: м/з 631,5 = [M+Na]⁺ (Расчетная Мм = 608,7 г/моль).MS: m/z 631.5 = [M+Na] ⁺ (calculated Mm = 608.7 g/mol).

Пример 12Example 12

Синтез конъюгата линкер-эксендин (флуоресцеин) (12а) и конъюгата линкер-GRF (1-29) (флуоресцеин) (12b)Synthesis of the conjugate linker-exendin (fluorescein) (12a) and the conjugate linker-GRF (1-29) (fluorescein) (12b)

12а: R = эксендин (εK27-флуоресцеин)12a: R = exendin (εK27-fluorescein)

12b: R = GRF (1-29) (εK21-флуоресцеин)12b: R = GRF (1-29) (εK21-fluorescein)

6 (60 мг, 130 мкмоль HCl-соль), HOBt (20 мг, 130 мкмоль), DIEA (40 мкл, 230 мкмоль) и DIC (20 мкл, 126 мкмоль) растворяют в 700 мкл DMF и сразу же вводят в защищенный в боковой цепи эксендин-4 на полимерной смоле (120 мг, 12 мкмоль), и полученную реакционную смесь инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре. Смолу промывают десять раз DMF, а затем инкубируют в течение 5 мин в 1 мл смеси уксусный ангидрид/пиридин/DMF (1/1/2, об./об./об.). Смолу промывают десять раз DMF и защитную группу Fmoc удаляют. Trt-меркаптопропионовую кислоту связывают по стандартной методике реакции сочетания и полученную смолу промывают пять раз DMF и затем еще десять раз DCM. Mmt-защитную группу лизина в положении 27 (Lys 27) удаляют при инкубации смолы пять раз в 2 мл смеси DCM/HFIP 9/1 (об./об.) в течение 5 мин. Смолу промывают пять раз DCM и затем еще десять раз DMF, после чего в смолу вводят 5,6-карбокси-флуоресцеин-NHS-сложный эфир (20 мг, 42 мкмоль) и DIEA (20 мкл, 115 мкл) в 300 мкл DMF и инкубируют в течение 30 мин. Полученное 12а отделяют от смолы и очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.6 (60 mg, 130 µmol HCl salt), HOBt (20 mg, 130 µmol), DIEA (40 µl, 230 µmol) and DIC (20 µl, 126 µmol) are dissolved in 700 µl DMF and immediately injected into the protected side chain exendin-4 on polymer resin (120 mg, 12 μmol), and the resulting reaction mixture is incubated for 1 hour at room temperature. The resin was washed ten times with DMF and then incubated for 5 minutes in 1 ml of acetic anhydride/pyridine/DMF (1/1/2, v/v/v). The resin is washed ten times with DMF and the Fmoc protecting group is removed. The Trt-mercaptopropionic acid was coupled by standard coupling reaction procedure and the resulting resin was washed five times with DMF and then ten more times with DCM. The lysine Mmt protecting group at position 27 (Lys 27) was removed by incubating the resin five times in 2 ml DCM/HFIP 9/1 (v/v) for 5 minutes. The resin was washed five times with DCM and then another ten times with DMF, after which 5,6-carboxy-fluorescein-NHS-ester (20 mg, 42 μmol) and DIEA (20 μl, 115 μl) were added to the resin in 300 μl of DMF and incubated for 30 min. The resulting 12a is separated from the resin and purified by reverse phase HPLC.

Выход: 12 мгYield: 12 mg

МС 12а: м/з 1205,9 = [М+4Н]⁴⁺, 1607,0 = [М+3Н]³⁺ (Расчетная Мм = 4818,3 г/моль).MS 12a: m/z 1205.9 = [M+4H] ⁴⁺ , 1607.0 = [M+3H] ³⁺ (calculated Mm = 4818.3 g/mol).

12b синтезируют по методике синтеза соединения 12а за исключением того, что используют GRF (1-29) на полимерной смоле (120 мг, 12 мкмоль).12b was synthesized following the procedure for the synthesis of compound 12a, except that GRF (1-29) on polymer resin (120 mg, 12 μmol) was used.

Выход: 11 мгYield: 11 mg

МС 12b: м/з = 998,6 = [М+4Н]⁴⁺, 1330,5 = [М+3Н]³⁺ (Расчетная Мм = 3989,6 г/моль).MS 12b: m/z = 998.6 = [M+4H] ⁴⁺ , 1330.5 = [M+3H] ³⁺ (calculated Mm = 3989.6 g/mol).

Синтез меркаптопропионил-эксендина(флуоресцеин) (12с) и меркаптопропионил- GRF (1-29) (флуоресцеин) (12d)Synthesis of mercaptopropionyl-exendin (fluorescein) (12c) and mercaptopropionyl-GRF (1-29) (fluorescein) (12d)

12с: R = Эксендин (εK27-флуоресцеин)12s: R = Exendin (εK27-fluorescein)

12d: R = GRF (1 -29) (εK27-флуоресцеин)12d: R = GRF (1 -29) (εK27-fluorescein)

Trt-меркаптопропионовую кислоту связывают по стандартной методике реакции сочетания с защищенным в боковой цепи фрагментом эксендина-4 на полимерной смоле (120 мг, 12 мкмоль). Удаление Mmt-защитной группы Lys27 удаляют и реакцию сочетания 5,6-карбокси-флуоресцеин-NHS-сложного эфира проводят по методике синтеза 12а. 12с отщепляют от смолы и очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.Trt-mercaptopropionic acid is coupled by standard coupling reaction to a side chain protected fragment of exendin-4 on a polymer resin (120 mg, 12 μmol). Removal of the Mmt-protecting group of Lys27 is removed and the 5,6-carboxy-fluorescein-NHS-ester coupling reaction is carried out according to the method of synthesis 12a. 12c is cleaved from the resin and purified by reverse phase HPLC.

Выход: 13 мгYield: 13 mg

МС 12с: м/з 1545,6 = [М+3Н]³⁺ (Расчетная Мм = 4633 г/моль).MS 12s: m/z 1545.6 = [M+3H] ³⁺ (Calculated Mm = 4633 g/mol).

12d получают по методике синтеза 12с, за исключением того, что используют GRF (1-29) на смоле (120 мг, 12 мкмоль).12d was prepared according to the synthesis of 12c, except that GRF (1-29) on resin (120 mg, 12 μmol) was used.

Выход: 11 мгYield: 11 mg

МС 12d: м/з 1269,1 = [М+3Н]³⁺ (Расчетная Мм = 3804,3 г/моль).MS 12d: m/z 1269.1 = [M+3H] ³⁺ (calculated Mm = 3804.3 g/mol).

Пример 13Example 13

Синтез обратимого ПЭГ40кДа-линкер-эксендин (флуоресцеин) конъюгата (13а) и обратимый PEG40kDa-линкер-GRF (1-29) (флуоресцеин) конъюгат (13b)Synthesis of reversible PEG40kDa-linker-exendin (fluorescein) conjugate (13a) and reversible PEG40kDa-linker-GRF (1-29) (fluorescein) conjugate (13b)

13a: R = эксендин (ε K27-флуоресцеин)13a: R = exendin (ε K27-fluorescein)

13b: R = GRF(1-29) (εK21-флуоресцеин)13b: R = GRF(1-29) (εK21-fluorescein)

12a (12 мг) растворяют в 500 мкл смеси ацетонитрил/вода, 1/1 и добавляют 120 мг ПЭГ40кДа-малеимида в 1 мл смеси 1/1 ацетонитрил/вода. Затем прибавляют 300 мкл 0,25 М натрий-фосфатного буфера рН 7,0 и через 10 мин реакционный раствор подкисляют 300 мкл уксусной кислоты. 13а очищают методом катионообменной хроматографии, высаливают из раствора и лиофилизируют.12a (12 mg) is dissolved in 500 μl of acetonitrile/water, 1/1, and 120 mg of PEG40kDa-maleimide in 1 ml of 1/1 acetonitrile/water is added. Then 300 µl of 0.25 M sodium phosphate buffer pH 7.0 is added and after 10 minutes the reaction solution is acidified with 300 µl of acetic acid. 13a was purified by cation exchange chromatography, salted out of solution, and lyophilized.

Выход: 51 мгYield: 51 mg

13b получают по методике синтеза 13а за исключением того, что вместо 12а используют 12b.13b is prepared according to the synthesis procedure 13a, except that 12b is used instead of 12a.

Выход: 46 мгYield: 46 mg

Синтез постоянного ПЭГ40кДа-эксендин (флуоресцеин) конъюгата (13с) и постоянного ПЭГ40кДа-GRF(1-29) (флуоресцеин) конъюгата (13 d)Synthesis of permanent PEG40kDa-exendin (fluorescein) conjugate (13c) and permanent PEG40kDa-GRF(1-29) (fluorescein) conjugate (13d)

13с: R = эксендин (εK27-флуоресцеина)13c: R = exendin (εK27-fluorescein)

13d: R = GRF (1-29) (εK21-флуоресцеина)13d: R=GRF(1-29) (εK21-fluorescein)

13с получают по методике синтеза 13а за исключением того, что вместо 12а используют 12с.13c is prepared according to the synthesis of 13a, except that 12c is used instead of 12a.

Выход: 55 мгYield: 55 mg

Соединение 13d получают по методике синтеза 13а за исключением того, что используют 12d вместо 12а.Compound 13d is prepared according to the synthesis procedure 13a, except that 12d is used instead of 12a.

Выход: 45 мгYield: 45 mg

Пример 14Example 14

Синтез конъюгата линкер-GRF-(1-29) (14)Synthesis of conjugate linker-GRF-(1-29) (14)

14 получают по методике синтеза 8с за исключением того, что используют защищенный в боковой GRF (1-29) на смоле.14 was prepared according to the synthesis procedure 8c, except that side-protected GRF (1-29) on resin was used.

Выход: 10 мгYield: 10 mg

МС 14: м/з 908,2 = [М+4Н]⁴⁺, 1211,2 = [М+3Н]³⁺ (Расчетная Мм = 3631,3 г/моль).MS 14: m/z 908.2 = [M+4H] ⁴⁺ , 1211.2 = [M+3H] ³⁺ (Calculated Mm = 3631.3 g/mol).

Пример 15Example 15

Синтез конъюгата ПЭГ40кДа -линкер-GRF (1-29) (15)Synthesis of PEG40kDa-linker-GRF conjugate (1-29) (15)

15 получают по методике синтеза 9с за исключением того, что используют 14, а для осуществления катионообменной хроматографии используют 10 мМ цитрат натрия, рН 4 в качестве растворителя А и 10 мМ цитрат натрия рН 4 и 1 М хлорид натрия в качестве растворителя В.15 was prepared according to the 9c synthesis except that 14 was used, and 10 mM sodium citrate pH 4 as solvent A and 10 mM sodium citrate pH 4 and 1 M sodium chloride as solvent B were used for cation exchange chromatography.

Выход: 11 мгYield: 11 mg

Пример 16Example 16

Синтез линкерного интермедиата (16)Synthesis of linker intermediate (16)

N,N-диметилэтилендиамин (198 мкл, 1,8 ммоль) и NaCNBH₃ (58 мг, 0,9 ммоль) растворяют в метаноле (5 мл) и раствор доводят до рН 5,5 прибавлением уксусной кислоты (250 мкл). Прибавляют суспензию 2,4,6-триметоксибензальдегида (294 мг, 1,5 ммоль) в этаноле (5 мл) и реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 часа. Добавляют 5 н HCl (0,5 мл) и смесь перемешивают в течение еще 12 часов. Растворитель упаривают при пониженном давлении, остаток растворяют в насыщенном растворе NaHCO₃ и трижды экстрагируют в DCM. Объединенные органические фазы сушат над NaSO₄ и растворитель упаривают при пониженном давлении.N,N-dimethylethylenediamine (198 μl, 1.8 mmol) and NaCNBH ₃ (58 mg, 0.9 mmol) are dissolved in methanol (5 ml) and the solution is adjusted to pH 5.5 by adding acetic acid (250 μl). A suspension of 2,4,6-trimethoxybenzaldehyde (294 mg, 1.5 mmol) in ethanol (5 ml) was added and the reaction mixture was stirred at room temperature for 1 hour. Add 5 N HCl (0.5 ml) and the mixture is stirred for another 12 hours. The solvent is evaporated under reduced pressure, the residue is taken up in saturated NaHCO ₃ solution and extracted three times with DCM. The combined organic phases are dried over NaSO ₄ and the solvent is evaporated off under reduced pressure.

Выход: 303 мг (1,13 ммоль)Yield: 303 mg (1.13 mmol)

МС: м/з 269,3 = [М+Н]⁺ (Расчетная Мм = 268,4 г/моль)MS: m/z 269.3 = [M+H] ⁺ (calculated Mm = 268.4 g/mol)

Пример 17Example 17

Синтез линкера 17а и 17bSynthesis of linker 17a and 17b

Синтез 17а:Synthesis 17a:

Fmoc-Asp(OtBu)-OH (322 мг, 0,78 ммоль), Tmob-защищенный диамин (соединение 16) (150 мг, 0,56 ммоль), HATU (O-7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат) (255 мг, 0,67 ммоль) и DIEA (290 мкл, 1,68 ммоль) растворяют в DMF (1,5 мл). Смесь перемешивают в течение 30 мин, подкисляют уксусной кислотой и очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.Fmoc-Asp(OtBu)-OH (322 mg, 0.78 mmol), Tmob-protected diamine (compound 16) (150 mg, 0.56 mmol), HATU (O-7-azabenzotriazol-1-yl)-N ,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate) (255 mg, 0.67 mmol) and DIEA (290 μl, 1.68 mmol) are dissolved in DMF (1.5 ml). The mixture is stirred for 30 minutes, acidified with acetic acid and purified by reverse phase HPLC.

Выход: 463 мг (5,97 ммоль, в виде трифторацетатной соли, чистота около 90%.)Yield: 463 mg (5.97 mmol, as trifluoroacetate salt, about 90% purity)

МС Fmoc-Asp(OtBu)-N(TMOB)CH₂CH₂N(CH₃)₂:м/з 662,5 = [М+Н]⁺ (Расчетная Мм = 661,8 г/моль)MS Fmoc-Asp(OtBu)-N(TMOB)CH ₂ CH ₂ N(CH ₃ ) ₂ : m/s 662.5 = [M+H] ⁺ (Calculated Mm = 661.8 g/mol)

Fmoc-Asp(OtBu)-N(TMOB)CH₂CH₂N(CH₃)₂ (225 мг, 0,29 ммоль) растворяют в растворе пиперидина (50 мкл) и DBU (15 мкл) в DMF (1,5 мл). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1,5 часов. Прибавляют АсОН и полученное соединение H-Asp(OtBu)-N(TMOB)CH₂CH₂N(CH₃)₂ очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.Fmoc-Asp(OtBu)-N(TMOB)CH ₂ CH ₂ N(CH ₃ ) ₂ (225 mg, 0.29 mmol) is dissolved in a solution of piperidine (50 μl) and DBU (15 μl) in DMF (1.5 ml). The reaction mixture was stirred at room temperature for 1.5 hours. AcOH is added and the resulting compound H-Asp(OtBu)-N(TMOB)CH ₂ CH ₂ N(CH ₃ ) ₂ is purified by reverse phase HPLC.

Выход: 114 мг (0,21 ммоль, в виде трифторацетатной соли)Yield: 114 mg (0.21 mmol, as trifluoroacetate salt)

МС H-Asp(OtBu)-N(TMOB)CH₂CH₂N(CH₃)₂: м/з 462,4 = [М+Н]⁺ (Расчетная Mw = 439,6 г/моль)MS H-Asp(OtBu)-N(TMOB)CH ₂ CH ₂ N(CH ₃ ) ₂ : m/z 462.4 = [M+H] ⁺ (Calculated Mw = 439.6 g/mol)

Трифторацетатную соль H-Asp(OtBu)-N(Tmob)CH₂CH₂N(CH₃)₂ (114 мг, 0,21 ммоль) растворяют в насыщенном растворе NaHCO₃ (10 мл) и экстрагируют DCM (3×10 мл). Объединенные органические слои сушат над NaSO₄ и растворитель упаривают при пониженном давлении. Остаток растворяют в DMF (1,0 мл), и к полученному раствору прибавляют 6-тритилметилмеркаптогексановую кислоту (121 мг, 0,31 ммоль), HATU (118 мг, 0,31 ммоль) и DIEA (108 мкл, 0,62 ммоль). Смесь перемешивают в течение 30 мин. Прибавляют АсОН (200 мкл) и TrtS(CH₂)₅CONH-Asp(OtBu)-N(TmOb)CH₂CH₂N(CH₃)₂ очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.H-Asp(OtBu ₎ -N(Tmob)CH ₂ CH ₂ N(CH ₃ ) 2 trifluoroacetate salt (114 mg, 0.21 mmol) was dissolved in saturated NaHCO ₃ solution (10 ml) and extracted with DCM (3×10 ml ). The combined organic layers are dried over NaSO ₄ and the solvent is evaporated under reduced pressure. The residue was dissolved in DMF (1.0 ml) and 6-tritylmethylmercaptohexanoic acid (121 mg, 0.31 mmol), HATU (118 mg, 0.31 mmol) and DIEA (108 μl, 0.62 mmol) were added to the resulting solution. ). The mixture is stirred for 30 minutes. Add AcOH (200 μl) and TrtS(CH ₂ ) ₅ CONH-Asp(OtBu)-N(TmOb)CH ₂ CH ₂ N(CH ₃ ) ₂ purified by reverse phase HPLC.

Выход: 95 мг (0,10 ммоль, в виде трифторацетатной соли)Yield: 95 mg (0.10 mmol, as trifluoroacetate salt)

МС TrtS(CH₂)₅CONH-Asp(OtBu)-N(Tmob)CH₂CH₂N(CH₃)₂: м/з 812,64 = [М+Н]⁺ (Расчетная Мм = 812,1 г/моль)MS TrtS(CH ₂ ) ₅ CONH-Asp(OtBu)-N(Tmob)CH ₂ CH ₂ N(CH ₃ ) ₂ : m/z 812.64 = [M+H] ⁺ (Calculated Mm = 812.1 g /mol)

TrtS(CH₂)₅CONH-Asp(OtBu)-N(Tmob)CH₂CH₂N(CH₃)₂ (95 мг, 0,10 ммоль) растворяют в смеси МеОН/H₂O 3:1 (1,0 мл), прибавляют LiOH (7,4 мг, 0,31 ммоль) и реакционную смесь встряхивают в течение 5 часов при 60°С. Прибавляют АсОН (100 мкл) и 17а очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.TrtS(CH ₂ ) ₅ CONH-Asp(OtBu)-N(Tmob)CH ₂ CH ₂ N(CH ₃ ) ₂ (95 mg, 0.10 mmol) is dissolved in MeOH/H ₂ O 3:1 (1, 0 ml), LiOH (7.4 mg, 0.31 mmol) is added and the reaction mixture is shaken for 5 hours at 60°C. AcOH (100 µl) is added and 17a is purified by reverse phase HPLC.

Выход: 64 мг (0,07 ммоль, в виде трифторацетатной соли)Yield: 64 mg (0.07 mmol, as trifluoroacetate salt)

МС 17а: м/з 756,5 = [М+Н]⁺ (Расчетная Мм = 756,0 г/моль)MS 17a: m/z 756.5 = [M+H] ⁺ (calculated Mm = 756.0 g/mol)

17b синтезируют по методике, описанной выше за исключением того, что на первой стадии вместо Fmoc-Asp(OtBu)-OH используют Fmoc-NMe-Asp(OtBu)-OH.17b was synthesized as described above, except that Fmoc-NMe-Asp(OtBu)-OH was used instead of Fmoc-Asp(OtBu)-OH in the first step.

Выход 17b: 16 мг (18 мкмоль, в виде трифторацетатной соли)Yield 17b: 16 mg (18 µmol, as trifluoroacetate salt)

МС 17b: м/з 770,5 = [М+Н]⁺ (Расчетная Мм = 770,0 г/моль)MS 17b: m/z 770.5 = [M+H] ⁺ (calculated Mm = 770.0 g/mol)

Пример 18Example 18

Синтез конъюгатов линкер-BNP (18а и 18b)Synthesis of linker-BNP conjugates (18a and 18b)

Синтез 18а:Synthesis 18a:

17а (8,0 мг, 0,01 ммоль), РуВОР (5,2 мг, 10 мкмоль) и DIEA (7 мкл, 40 мкмоль) растворяют в DMF (400 мкл) и полученный раствор сразу же добавляют к смоле, связанной с защищенным в боковой цепи BNP-32a (50 мг, 5 мкмоль). После инкубации в течение 2 часов при комнатной температуре, смолу промывают десять раз DMF, затем еще 10 раз DCM и сушат под вакуумом. Полученный продукт отщепляют от смолы и очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.17a (8.0 mg, 0.01 mmol), PyBOP (5.2 mg, 10 µmol) and DIEA (7 µl, 40 µmol) are dissolved in DMF (400 µl) and the resulting solution is immediately added to the resin associated with protected in the side chain BNP-32a (50 mg, 5 µmol). After incubation for 2 hours at room temperature, the resin is washed ten times with DMF, then another 10 times with DCM and dried under vacuum. The resulting product is cleaved from the resin and purified by reverse phase HPLC.

Выход: 10,6 мгYield: 10.6 mg

МС 18а: м/з 930,4 = [М+4Н]⁴⁺, 1240,1 = [М+3Н]³⁺ (Расчетная Мм = 3717,2 г/моль)MS 18a: m/z 930.4 = [M+4H] ⁴⁺ , 1240.1 = [M+3H] ³⁺ (Calculated Mm = 3717.2 g/mol)

18b синтезируют по методике, описанной выше за исключением того, что 17b используют вместо 17а.18b was synthesized as described above except that 17b was used instead of 17a.

Выход: 4,7 мгYield: 4.7 mg

МС 18b: м/з 933,9 = [М+4Н]⁴⁺, 1244,7 = [М+3Н]³⁺ (Расчетная Мм = 3731,0 г/моль)MS 18b: m/z 933.9 = [M+4H] ⁴⁺ , 1244.7 = [M+3H] ³⁺ (Calculated Mm = 3731.0 g/mol)

Пример 19Example 19

Синтез конъюгатов ПЭГ40кДа-линкер- BNP (19а и 19b)Synthesis of PEG40kDa-linker-BNP conjugates (19a and 19b)

18а (5,2 мг) растворяют в смеси Н₂О/ацетонитрил 1:1, содержащей 0,1% TFA (200 мкл). Прибавляют раствор, содержащий ПЭГ40кДа-малеимид, (70 мг) в смеси 1:1 Н₂О/ацетонитрил (1,5 мл) и фосфатный буфер (30 мкл, рН 7,4, 0,5 М). Раствор инкубируют при комнатной температуре, и через 5 мин прибавляют АсОН (30 мкл). 19а очищают методом катионообменной хроматографии, высаливают из раствора и лиофилизируют.18a (5.2 mg) was dissolved in H ₂ O/acetonitrile 1:1 containing 0.1% TFA (200 μl). Add a solution containing PEG40kDa-maleimide (70 mg) in a mixture of 1:1 H ₂ O/acetonitrile (1.5 ml) and phosphate buffer (30 μl, pH 7.4, 0.5 M). The solution is incubated at room temperature and AcOH (30 µl) is added after 5 minutes. 19a was purified by cation exchange chromatography, salted out from solution, and lyophilized.

Выход: 19,2 мгYield: 19.2 mg

19b получают по методике синтеза 19а за исключением того, что вместо 18а используют 18b.19b is prepared according to the synthesis procedure 19a, except that 18b is used instead of 18a.

Пример 20Example 20

Синтез линкера 20Synthesis of linker 20

Fmoc-Asp(OH)OtBu (100 мг, 0,24 ммоль), H₂N-(CH₂)₂-N(CH₃)-boc (36 мкл, 0,20 ммоль), HATU (92 мг, 0,24 ммоль) и DIEA (105 мкл, 0,60 ммоль) растворяют в 1 мл DMF. Смесь перемешивают в течение 1 часа при комнатной температуре, подкисляют уксусной кислотой (100 мкл) и очищают методом ВЭЖХ.Fmoc-Asp(OH)OtBu (100 mg, 0.24 mmol), H ₂ N-(CH ₂ ) ₂ -N(CH ₃ )-boc (36 µl, 0.20 mmol), HATU (92 mg, 0 .24 mmol) and DIEA (105 μl, 0.60 mmol) are dissolved in 1 ml of DMF. The mixture is stirred for 1 hour at room temperature, acidified with acetic acid (100 μl) and purified by HPLC.

Выход: 91 мг (0,13 ммоль)Yield: 91 mg (0.13 mmol)

МС Fmoc-Asp(NH(CH₂)₂N(CH₃)-boc)OtBu: 590,3 = [M+Na]⁺ (Расчетная Мм = 567,7 г/моль)MS Fmoc-Asp(NH(CH ₂ ) ₂ N(CH ₃ )-boc)OtBu: 590.3 = [M+Na] ⁺ (Calculated Mm = 567.7 g/mol)

Fmoc-Asp(NH(CH₂)₂N(CH₃)-boc)OtBu (91 мг, 0,13 ммоль) растворяют в DMF (1,0 мл), прибавляют пиперидин (50 мкл) и DBU (15 мкл) и полученную смесь перемешивают в течение 45 мин при комнатной температуре. Добавляют уксусную кислоту (100 мкл) и полученный NH₂-Asp(NH(CH₂)₂N(CH₃)-boc)OtBu очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.Fmoc-Asp(NH(CH ₂ ) ₂ N(CH ₃ )-boc)OtBu (91 mg, 0.13 mmol) is dissolved in DMF (1.0 ml), piperidine (50 μl) and DBU (15 μl) are added and the resulting mixture was stirred for 45 minutes at room temperature. Acetic acid (100 μl) is added and the resulting NH ₂ -Asp(NH(CH ₂ ) ₂ N(CH ₃ )-boc)OtBu is purified by reverse phase HPLC.

Выход: 39 мг (0,09 ммоль, в виде трифторацетатной соли)Yield: 39 mg (0.09 mmol, as trifluoroacetate salt)

МС NH₂-Asp(NH(CH₂)₂N(CH₃)-boc)OtBu: м/з 368,1 = [M+Na]⁺ (Расчетная Мм = 345,4 г/моль)MS NH ₂ -Asp (NH (CH ₂ ) ₂ N (CH ₃ ) -boc) OtBu: m / s 368.1 \u003d [M + Na] ⁺ (Calculated Mm \u003d 345.4 g / mol)

NH₂-Asp(NH(CH₂)₂N(CH₃)-boc)OtBu (36 мг, 0,09 ммоль) растворяют в DMF (0,5 мл), к полученному раствору прибавляют 6-тритилметилмеркаптогексановую кислоту (55 мг, 0,14 ммоль), HATU (53 мг, 0,14 ммоль) и DIEA (49 мкл, 0,28 ммоль). Смесь перемешивают в течение 45 мин. Прибавляют АсОН (100 мкл) и TrtS(CH₂)₅CONH-Asp(NH(CH₂)₂N(CH₃)-boc)OtBu очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.NH ₂ -Asp (NH (CH ₂ ) ₂ N (CH ₃ ) -boc) OtBu (36 mg, 0.09 mmol) was dissolved in DMF (0.5 ml), 6-tritylmethylmercaptohexanoic acid (55 mg , 0.14 mmol), HATU (53 mg, 0.14 mmol) and DIEA (49 µl, 0.28 mmol). The mixture is stirred for 45 minutes. AcOH (100 μl) was added and TrtS(CH ₂ ) ₅ CONH-Asp(NH(CH ₂ ) ₂ N(CH ₃ )-boc)OtBu was purified by reverse phase HPLC.

Выход: 41 мг (0,06 ммоль)Yield: 41 mg (0.06 mmol)

МС TrtS(CH₂)₅CONH-Asp(NH(CH₂)₂N(CH₃)-boc)OtBu: м/з 740,6 = [M+Na]⁺ (Расчетная Мм = 718,0 г/моль)MS TrtS(CH ₂ ) ₅ CONH-Asp(NH(CH ₂ ) ₂ N(CH ₃ )-boc)OtBu: m/z 740.6 = [M+Na] ⁺ (Calculated Mm = 718.0 g/mol )

TrtS(CH₂)₅CONH-Asp(NH(CH₂)₂N(CH₃)-boc)OtBu (41 мг, 0,06 ммоль) растворяют в смеси 1:1 диоксан/Н₂О (1,0 мл), прибавляют LiOH (4,1 мг, 0,17 ммоль) и смесь перемешивают при 60°С в течение 1 часа. Прибавляют АсОН (50 мкл) и 20 очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.TrtS(CH ₂ ) ₅ CONH-Asp(NH(CH ₂ ) ₂ N(CH ₃ )-boc)OtBu (41 mg, 0.06 mmol) was dissolved in 1:1 dioxane/H ₂ O (1.0 ml ), add LiOH (4.1 mg, 0.17 mmol) and the mixture is stirred at 60°C for 1 hour. Add AcOH (50 µl) and 20 purified by reverse phase HPLC.

Выход: 31 мг (0,05 ммоль)Yield: 31 mg (0.05 mmol)

МС 20: м/з 684,5 = [M+Na]⁺ (Расчетная Мм = 661,9 г/моль)MS 20: m/z 684.5 = [M+Na] ⁺ (calculated Mm = 661.9 g/mol)

Пример 21Example 21

Синтез конъюгата линкер-эксендин (21)Synthesis of the linker-exendin conjugate (21)

Связанный с полимерной смолой защищенный в боковой цепи эксендин (50 мг, 5 мкмоль) с Mmt-защитной группой по Lys27 сначала защищают на N-конце Вос-группой (см. Материалы и методы), а затем инкубируют пять раз (по 5 мин) 2 мл смеси DCM/HFIP 9/1 (об./об.) для снятия Mmt защитной группы с Lys27. Соединение 20 (6,6 мг, 10 мкмоль), РуВОР (5,2 мг, 10 мкмоль) и DIEA (7 мкл, 40 мкмоль) растворяют в DMF (400 мкл) и сразу же добавляют к смоле. После инкубации в течение 3 часов при комнатной температуре смолу промывают десять раз DMF и десять раз DCM и сушат под вакуумом. Полученный продукт отщепляют от смолы и очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.Resin-bound, side-chain protected exendin (50 mg, 5 µmol) with a Mmt protecting group at Lys27 is first N-terminally protected with a Boc group (see Materials and Methods) and then incubated five times (5 min each) 2 ml DCM/HFIP 9/1 (v/v) to deprotect Mmt from Lys27. Compound 20 (6.6 mg, 10 µmol), PyBOP (5.2 mg, 10 µmol) and DIEA (7 µl, 40 µmol) are dissolved in DMF (400 µl) and immediately added to the resin. After incubation for 3 hours at room temperature, the resin is washed ten times with DMF and ten times with DCM and dried under vacuum. The resulting product is cleaved from the resin and purified by reverse phase HPLC.

Выход: 2,4 мгYield: 2.4 mg

МС 21: м/з 1497,2 = [М+3Н]³⁺ (Расчетная Мм = 4488,0 г/моль)MS 21: m/z 1497.2 = [M+3H] ³⁺ (Calculated Mm = 4488.0 g/mol)

Пример 22Example 22

Синтез конъюгата жирная кислота-линкер-эксендин (22)Synthesis of fatty acid-linker-exendin conjugate (22)

21 (2,6 мг) растворяют в 200 мкл смеси ацетонитрил/вода, 1/1 и прибавляют соединение 1 (0,8 мг) в 400 мкл смеси ацетонитрил/вода, 7/3. Прибавляют 100 мкл 0,25 М натрий-фосфатного буфера, реакционную смесь перемешивают в течение 5 мин, после чего 22 очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.21 (2.6 mg) is dissolved in 200 μl of acetonitrile/water, 1/1, and compound 1 (0.8 mg) in 400 μl of acetonitrile/water, 7/3 is added. Add 100 μl of 0.25 M sodium phosphate buffer, the reaction mixture is stirred for 5 min, after which 22 purified by reverse phase HPLC.

Выход: 2,4 мгYield: 2.4 mg

МС 22: м/з 1388,3 = [М+4Н]⁴⁺; 1857,1 = [М+3Н]³⁺ (Расчетная Мм = 5566,4 г/моль).MS 22: m/z 1388.3 = [M+4H] ⁴⁺ ; 1857.1 \u003d [M + 3H] ³⁺ (Calculated Mm \u003d 5566.4 g / mol).

Пример 23Example 23

Синтез предшественника 23Synthesis of precursor 23

6-Тритилмеркаптогексановую кислоту (200 мг, 0,51 ммоль), (PfpO)₂СО (202 мг, 0,51 ммоль) и колли дин (340 мкл, 2,65 ммоль) растворяют в DMSO (1 мл) и перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Смесь прибавляют к раствору Fmoc-Lys-OH (170 мг, 0,46 ммоль) в смеси Н₂О/пиридине/tBuOH (3:03:01, 6 мл). Реакционную смесь затем нагревают при 60°С в течение 2 часов, затем разбавляют EtOAc, экстрагируют дважды 0,1 М H₂SO₄, обрабатывают дважды солевым раствором и сушат на Na₂SO₄. Растворитель отгоняют при пониженном давлении и остаток очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.6-Tritylmercaptohexanoic acid (200 mg, 0.51 mmol), (PfpO) ₂ CO (202 mg, 0.51 mmol) and collidine (340 μl, 2.65 mmol) are dissolved in DMSO (1 ml) and stirred in for 30 min at room temperature. The mixture was added to a solution of Fmoc-Lys-OH (170 mg, 0.46 mmol) in H ₂ O/pyridine/tBuOH (3:03:01, 6 ml). The reaction mixture is then heated at 60°C for 2 hours, then diluted with EtOAc, extracted twice with 0.1 M H ₂ SO ₄ , treated twice with brine and dried over Na ₂ SO ₄ . The solvent is distilled off under reduced pressure, and the residue is purified by reverse phase HPLC.

Выход: 109 мгYield: 109 mg

МС 23: м/г 741,3 = [М+Н]⁺ (Расчетная Мм = 741,0 г/моль)MS 23: m/g 741.3 = [M+H] ⁺ (calculated Mm = 741.0 g/mol)

Пример 24Example 24

Синтез линкера (24а -24с)Linker synthesis (24a -24c)

24а: R1 = H, R2 = boc24a: R1 = H, R2 = boc

24b: R1 = Me, R2 = boc24b: R1 = Me, R2 = boc

24c: R1 = R2 = Me24c: R1=R2=Me

23 (186 мг, 0,25 ммоль) и DIEA (160 мкл, 0,92 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), вводят в 2-хлортритилхлоридую смолу (312 мг, 1,3 ммоль/г) и перемешивают в течение 45 мин при комнатной температуре. Добавляют метанол (0,6 мл) и смолу инкубируют еще 15 мин. Смолу промывают DCM (10 раз) и ДМФ (10 раз). Снятие Fmoc-защиты и образование мочевины осуществляют в соответствии с общими методами синтеза (см. Материалы и методы) путем проведения взаимодействия с N-boc-этилендиамином (57 мкл, 0,34 ммоль), Полученный продукт отщепляют от смолы и очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.23 (186 mg, 0.25 mmol) and DIEA (160 μl, 0.92 mmol) are dissolved in DCM (2 ml), injected into 2-chlorotrityl chloride resin (312 mg, 1.3 mmol/g) and stirred for 45 min at room temperature. Methanol (0.6 ml) was added and the resin was incubated for an additional 15 minutes. The resin was washed with DCM (10 times) and DMF (10 times). Deprotection of the Fmoc protection and formation of urea is carried out in accordance with the general methods of synthesis (see Materials and Methods) by reacting with N-boc-ethylenediamine (57 μl, 0.34 mmol). The resulting product is cleaved from the resin and purified by reverse phase HPLC.

Выход: 14 мгYield: 14 mg

МС 24а: м/з 705,4 = [М+Н]⁺, 727,3 = [M+Na]⁺ (Расчетная Мм = 704,9 г/моль)MS 24a: m/z 705.4 = [M+H] ⁺ , 727.3 = [M+Na] ⁺ (Calculated Mm = 704.9 g/mol)

Соединение 24b получают по методике синтеза 24а за исключением того, что используют N-boc-N-метилэтилендиамин вместо N-boc-этилендиамина.Compound 24b is prepared according to the synthesis procedure 24a, except that N-boc-N-methylethylenediamine is used instead of N-boc-ethylenediamine.

Выход: 21 мгYield: 21 mg

МС 24b: м/з 719,3 = [М+Н]⁺, 741,4 = [M+Na]⁺ (Расчетная Мм = 719,0 г/моль)MS 24b: m/z 719.3 = [M+H] ⁺ , 741.4 = [M+Na] ⁺ (calculated Mm = 719.0 g/mol)

24 с получают по методике синтеза 24а за исключением того, что используют N,N-диметилэтилендиамин вместо N-boc-этилендиамина.24 s was prepared according to the synthesis procedure 24a except that N,N-dimethylethylenediamine was used instead of N-boc-ethylenediamine.

Выход: 10 мгYield: 10 mg

МС 24с: м/з 633,2 = [М+Н]⁺ (Расчетная Мм = 632,9 г/моль)MS 24s: m/z 633.2 = [M+H] ⁺ (Calculated Mm = 632.9 g/mol)

Пример 25Example 25

Синтез конъюгатов эксендин-линкер (25а-25с)Synthesis of exendin-linker conjugates (25a-25c)

24а (7,0 мг, 0,01 ммоль), РуВОР (5,2 мг, 10 мкмоль) и DIEA (7 мкл, 40 мкмоль) растворяют в DMF (250 мкл), полученный раствор сразу же добавляют к смоле, связанной с защищенным в боковой цепи эксендином (50 мг, 5 мкмоль), и инкубируют в течение 2 часов при комнатной температуре. Смолу промывают DMF (10 раз), DCM (10 раз) и сушат под вакуумом. Полученный продукт отщепляют от смолы и очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.24a (7.0 mg, 0.01 mmol), PyBOP (5.2 mg, 10 µmol) and DIEA (7 µl, 40 µmol) are dissolved in DMF (250 µl), the resulting solution is immediately added to the resin associated with side chain protected with exendin (50 mg, 5 µmol) and incubated for 2 hours at room temperature. The resin was washed with DMF (10 times), DCM (10 times) and dried under vacuum. The resulting product is cleaved from the resin and purified by reverse phase HPLC.

Выход: 1,6 мгYield: 1.6 mg

МС 25а: м/з 1511,8 = [М+3Н]³⁺ (Расчетная Мм = 4530,8 г/моль)MS 25a: m / z 1511.8 \u003d [M + 3H] ³⁺ (Calculated Mm \u003d 4530.8 g / mol)

25b получают по методике синтеза 25а за исключением того, что вместо 24а используют 24b.25b is prepared according to the synthesis procedure 25a, except that 24b is used instead of 24a.

Выход: 4,3 мгYield: 4.3 mg

МС 25b: м/з 1516,3 = [М+3Н]³⁺ (Расчетная Мм = 4544,8 г/моль)MS 25b: m/z 1516.3 = [M+3H] ³⁺ (calculated Mm = 4544.8 g/mol)

25с получают по методике синтеза 25а за исключением того, что используют 24 с вместо 24а.25c was prepared according to the synthesis procedure 25a, except that 24c was used instead of 24a.

Выход: 1,3 мгYield: 1.3 mg

МС 25с: м/з 1520,4 = [М+3Н]³⁺ (Расчетная Мм = 4558,8 г/моль)MS 25s: m/z 1520.4 = [M+3H] ³⁺ (Calculated Mm = 4558.8 g/mol)

Пример 26Example 26

Синтез конъюгатов жирная кислота-линкер (26а-26с)Synthesis of fatty acid-linker conjugates (26a-26c)

25а (1,6 мг) растворяют в 200 мкл смеси ацетонитрил/вода, 1/1 и добавляют соединение 1 (0,11 мг) в 200 мкл ацетонитрил/вода, 7/3. В реакционную смесь добавляют 30 мкл 0,25 М натрий-фосфатного буфера, реакционную смесь перемешивают в течение 5 мин, после чего 26а очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.25a (1.6 mg) was dissolved in 200 µl acetonitrile/water 1/1 and compound 1 (0.11 mg) in 200 µl acetonitrile/water 7/3 was added. 30 μl of 0.25 M sodium phosphate buffer was added to the reaction mixture, the reaction mixture was stirred for 5 minutes, after which 26a was purified by reverse phase HPLC.

МС соединения 26а: м/з 1870,0 = [М+3Н]³⁺ (Расчетная Мм = 5609,2 г/моль).MS compound 26a: m/z 1870.0 = [M+3H] ³⁺ (calculated Mm = 5609.2 g/mol).

26b получают по методике синтеза 26а за исключением того, что используют 25b вместо 25а.26b is prepared according to the synthesis method 26a, except that 25b is used instead of 25a.

МС 26b: м/з 1875,9 = [М+3Н]³⁺, 1406,7 = [М+4Н]⁴⁺, (Расчетная Мм = 5623,2 г/моль)MS 26b: m/z 1875.9 = [M+3H] ³⁺ , 1406.7 = [M+4H] ⁴⁺ , (calculated Mm = 5623.2 g/mol)

26 с получают по методике синтеза 26а за исключением того, что вместо 25а используют 25с.26 s is prepared according to the synthesis procedure 26a, except that 25c is used instead of 25a.

МС 26с: м/з 1879,4 = [М+3Н]³⁺, 1410,5 = [М+4Н]⁴⁺, (Расчетная Мм = 5637,2 г/моль)MS 26s: m/z 1879.4 = [M+3H] ³⁺ , 1410.5 = [M+4H] ⁴⁺ , (Calculated Mm = 5637.2 g/mol)

Пример 27Example 27

Синтез конъюгатов ПЭГ20кДа-линкер-эксендин (Соединение 27а-27с)Synthesis of PEG20kDa-linker-exendin conjugates (Compound 27a-27c)

25а (2,0 мг) растворяют в смеси Н₂О /MeCN, 1:1, содержащей 0,1% TFA (200 мкл). Добавляют раствор ПЭГ40кДа-малеимида (18 мг) в смеси 1:1 H₂O/MeCN (1 мл) и фосфатный буфер (15 мкл, рН 7,4, 0,5 М). Раствор инкубируют при комнатной температуре, через 5 мин прибавляют АсОН (20 мкл) и 27а очищают методом катионо-обменной хроматографии, высаливают и лиофилизируют.25a (2.0 mg) was dissolved in H ₂ O/MeCN 1:1 containing 0.1% TFA (200 μl). Add a solution of PEG40kDa-maleimide (18 mg) in a mixture of 1:1 H ₂ O/MeCN (1 ml) and phosphate buffer (15 μl, pH 7.4, 0.5 M). The solution is incubated at room temperature, AcOH (20 μl) is added after 5 min, and 27a is purified by cation exchange chromatography, salted out and lyophilized.

27b получают по методике синтеза 27а за исключением того, что используют 25b вместо 25а.27b is prepared according to the synthesis of 27a, except that 25b is used instead of 25a.

27с получают по методике синтеза 27а за исключением того, что используют 25с вместо 25а.27c is prepared according to the synthesis of 27a, except that 25c is used instead of 25a.

Пример 28Example 28

Синтез линкера 28Synthesis of linker 28

6-Бромгексаноилхлорид (46 мкл, 0,31 ммоль) растворяют в 0,2 мл CH₂Cl₂ и вводят в раствор, содержащий H₂N-CH₂-CH₂-STrt (100 мг, 0,28 ммоль), DIEA (97 мкл, 0,56 ммоль) в CH₂Cl₂ (0,8 мл). Смесь перемешивают в течение 2 часа при комнатной температуре. Реакционную смесь подкисляют АсОН (50 мкл) и растворитель отгоняют под вакуумом. После очистки остатка на силикагеле (гептан/EtOAc = 1:1) получают соединение Br-(CH₂)₅-CONH-(CH₂)₂-STrt.6-Bromohexanoyl chloride (46 μl, 0.31 mmol) is dissolved in 0.2 ml CH ₂ Cl ₂ and introduced into a solution containing H ₂ N-CH ₂ -CH ₂ -STrt (100 mg, 0.28 mmol), DIEA (97 μl, 0.56 mmol) in CH ₂ Cl ₂ (0.8 ml). The mixture is stirred for 2 hours at room temperature. The reaction mixture was acidified with AcOH (50 μl) and the solvent was distilled off under vacuum. After purification of the residue on silica gel (heptane/EtOAc = 1:1), the compound Br-(CH ₂ ) ₅ -CONH-(CH ₂ ) ₂ -STrt is obtained.

Выход: 137 мг (0,276 ммоль, 98%)Yield: 137 mg (0.276 mmol, 98%)

МС Br-(CH₂)₅-CONH-(CH₂)₂-STrt: 518,9 = [M+Na]⁺, (Расчетная Мм = 496,5 г/моль)MS Br-(CH ₂ ) ₅ -CONH-(CH ₂ ) ₂ -STrt: 518.9 = [M+Na] ⁺ , (Calculated Mm = 496.5 g/mol)

N-boc-этилендиамин (81 мкл, 0,51 ммоль) добавляют к раствору, содержащему Br-(CH₂)₅-CONH-(CH₂)₂-STrt (230 мг, 0,46 ммоль) и Na₂CO₃ (196 мг, 1,85 ммоль) в ДМФ (0,8 мл). Реакционную смесь перемешивают в течение 10 часов при 70°С. После охлаждения до комнатной температуры смесь разбавляют 4 мл смеси MeCN/H₂O, 25:75 в присутствии 1% TFA и после очистки методом обращенно-фазовой ВЭЖХ получают Boc-NH-(CH₂)₂-NH-(CH₂)₅-CONH-(CH₂)₂-STrt.N-boc-ethylenediamine (81 μl, 0.51 mmol) is added to a solution containing Br-(CH ₂ ) ₅ -CONH-(CH ₂ ) ₂ -STrt (230 mg, 0.46 mmol) and Na ₂ CO ₃ (196 mg, 1.85 mmol) in DMF (0.8 ml). The reaction mixture is stirred for 10 hours at 70°C. After cooling to room temperature, the mixture was diluted with 4 ml of MeCN/H ₂ O, 25:75 in the presence of 1% TFA and after purification by reverse phase HPLC, Boc-NH-(CH ₂ ) ₂ -NH-(CH ₂ ) ₅ was obtained -CONH-(CH ₂ ) ₂ -STrt.

Выход: 189 мг (0,27 ммоль, 59%, в виде трифторацетатной соли)Yield: 189 mg (0.27 mmol, 59%, as trifluoroacetate salt)

МС соединения Boc-NH-(CH₂)₂-NH-(CH₂)₅CONH-(CH₂)₂-STrt: 576,5 = [М+Н]⁺, (Расчетная Мм = 575,5 г/моль)MS compound Boc-NH-(CH ₂ ) ₂ -NH-(CH ₂ ) ₅ CONH-(CH ₂ ) ₂ -STrt: 576.5 = [M+H] ⁺ , (Calculated Mm = 575.5 g/mol )

Boc-NH-(CH₂)₂-NH-(CH₂)₅-CONH-(CH₂)₂-STrt (189 мг, 0,27 ммоль) и НСНО (35% водный раствор, 113 мкл) растворяют в MeCN (1,5 мл) и к полученной смеси добавляют CNBH₃ (34 мг, 0,54 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение 5 часов при комнатной температуре. После завершения реакции (при мониторинге масс-спектрометрией) раствор разбавляют H₂O (5 мл) и экстрагируют CH₂Cl₂ (трижды по 5 мл). Объединенные органические слои сушат над MgSO₄, фильтруют и растворитель отгоняют под вакуумом. После очистки остатка методом обращенно-фазовой ВЭЖХ получают Boc-NH-(CH₂)₂-N(CH₃)-(CH₂)₅-CONH-(CH₂)₂-STrt.Boc-NH-(CH ₂ ) ₂ -NH-(CH ₂ ) ₅ -CONH-(CH ₂ ) ₂ -STrt (189 mg, 0.27 mmol) and HCHO (35% aqueous solution, 113 μl) are dissolved in MeCN (1.5 ml) and CNBH ₃ (34 mg, 0.54 mmol) was added to the resulting mixture. The reaction mixture is stirred for 5 hours at room temperature. After completion of the reaction (monitored by mass spectrometry), the solution was diluted with H ₂ O (5 ml) and extracted with CH ₂ Cl ₂ (three times 5 ml). The combined organic layers are dried over MgSO ₄ , filtered and the solvent is distilled off under vacuum. After purification of the residue by reverse phase HPLC, Boc-NH-(CH ₂ ) ₂ -N(CH ₃ )-(CH ₂ ) ₅ -CONH-(CH ₂ ) ₂ -STrt is obtained.

Выход: 62,8 мг (0,11 ммоль, 39%)Yield: 62.8 mg (0.11 mmol, 39%)

МС Boc-NH-(CH₂)₂-N(CH₃)-(CH₂)₅-CONH-(CH₂)₂-STrt: 590,6 = [М+Н]⁺, (Расчетная Мм = 589,0 г/моль)MS Boc-NH-(CH ₂ ) ₂ -N(CH ₃ )-(CH ₂ ) ₅ -CONH-(CH ₂ ) ₂ -STrt: 590.6 = [M+H] ⁺ , (Calculated Mm = 589, 0 g/mol)

Boc-NH-(CH₂)₂-N(CH₃)-(CH₂)₅-CONH-(CH₂)₂-STrt (62,8 мг, 0,11 ммоль) растворяют в THF (6 мл) и прибавляют раствор HCl в диоксане (130 мкл, 4 М раствор). Реакционную смесь перемешивают в течение 12 часов при комнатной температуре. Прибавляют 200 мкл HCl в диоксане и растворитель отгоняют под вакуумом. После очистки остатка методом обращенно-фазовой ВЭЖХ получают смесь H₂N-(CH2)₂-N(CH₃-(CH₂)₅-CONH-(CH₂)₂-STrt и не прореагировавшее исходное соединение Boc-NH-(CH₂)₂-N(CH₃)-(CH₂)₅-CONH-(CH₂)₂-STrtBoc-NH-(CH ₂ ) ₂ -N(CH ₃ )-(CH ₂ ) ₅ -CONH-(CH ₂ ) ₂ -STrt (62.8 mg, 0.11 mmol) was dissolved in THF (6 ml) and add a solution of HCl in dioxane (130 μl, 4 M solution). The reaction mixture is stirred for 12 hours at room temperature. Add 200 μl of HCl in dioxane and the solvent is distilled off under vacuum. After purification of the residue by reverse phase HPLC, a mixture of H ₂ N-(CH2) ₂ -N(CH ₃ -(CH ₂ ) ₅ -CONH-(CH ₂ ) ₂ -STrt and unreacted starting compound Boc-NH-(CH ₂ ) ₂ -N(CH ₃ )-(CH ₂ ) ₅ -CONH-(CH ₂ ) ₂ -STrt

Выход: 32,8 мг (0,062 ммоль, 44%, в виде гидрохлоридной соли) соединения 28 и 14,7 мг (0,025 ммоль, 23%, в виде трифторацетатной соли) исходного соединенияYield: 32.8 mg (0.062 mmol, 44%, as hydrochloride salt) of compound 28 and 14.7 mg (0.025 mmol, 23%, as trifluoroacetate salt) of starting compound

МС 28: 490,5 = [М+Н]⁺, (Расчетная Мм = 489,0 г/моль)MS 28: 490.5 = [M+H] ⁺ , (Calculated Mm = 489.0 g/mol)

Пример 29Example 29

Общая методика синтеза замещенных карболовыми кислотами предшественников BNP (29а и 29b)General procedure for the synthesis of carbolic acid-substituted BNP precursors (29a and 29b)

Цис-циклогексан-1,2-дикарбоновой кислоты ангидрид (231 мг, 1,5 ммоль) и пиридин (271 мкл, 2 ммоль) растворяют в DCM (2 мл) и полученный раствор сразу же добавляют к смоле, связанной с защищенным в боковой цепи BNP-32a (300 мг). После инкубации в течение 1 часа при комнатной температуре полученный продукт промывают 10 раз DCM и высушивают под вакуумом.Cis-cyclohexane-1,2-dicarboxylic acid anhydride (231 mg, 1.5 mmol) and pyridine (271 μl, 2 mmol) are dissolved in DCM (2 ml) and the resulting solution is immediately added to the resin bound to the protected side BNP-32a chains (300 mg). After incubation for 1 hour at room temperature, the resulting product is washed 10 times with DCM and dried under vacuum.

Защищенный в боковой цепи фрагмент BNP-32, связанный со смолой, несущий ivDde-защитную группу у Lys 14, вначале защищают Вос-группой на N-конце, снимают защиту в положении Lys14 (см. Материалы и методы), а затем подвергают взаимодействию с цис-циклогексан-1,2-дикарбоновой кислоты ангидридом, как описано выше для 29а.The side chain-protected resin-bound fragment of BNP-32 bearing the ivDde protecting group at Lys 14 is first protected with the Boc group at the N-terminus, deprotected at the Lys14 position (see Materials and Methods), and then reacted with cis-cyclohexane-1,2-dicarboxylic acid anhydride as described above for 29a.

Пример 30Example 30

Синтез BNP-линкер-тиолов (30а и 30b).Synthesis of BNP linker thiols (30a and 30b).

Соединение 28 H₂N-(CH₂)₂-N(CH₃)-(CH₂)₅-CONH-(CH₂)₂-STrt (5,2 мг, 0,01 ммоль), РуВОР (5,2 мг, 0,01 ммоль) и DIEA (7,0 мкл, 0,04 ммоль) растворяют в DMF (300 мкл) и полученный раствор добавляют к защищенному в боковой цепи BNP, связанному со смолой, 29а (50 мг, 0,005 ммоль). После инкубации в течение 2 часов при комнатной температуре смолу промывают DMF (10 раз), DCM (10 раз) и высушивают под вакуумом. Полученный продукт отщепляют от смолы и очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.Compound 28 H ₂ N-(CH ₂ ) ₂ -N(CH ₃ )-(CH ₂ ) ₅ -CONH-(CH ₂ ) ₂ -STrt (5.2 mg, 0.01 mmol), PyBOP (5.2 mg, 0.01 mmol) and DIEA (7.0 μl, 0.04 mmol) are dissolved in DMF (300 μl) and the resulting solution is added to side chain protected resin-bound BNP 29a (50 mg, 0.005 mmol) . After incubation for 2 hours at room temperature, the resin was washed with DMF (10 times), DCM (10 times) and dried under vacuum. The resulting product is cleaved from the resin and purified by reverse phase HPLC.

Выход: 9,8 мгYield: 9.8 mg

МС 30а: м/з 947,6 = [М+4Н]⁴⁺, 1263,1 = [М+3Н]³⁺ (Расчетная Мм = 3786,3 г/моль)MS 30a: m/z 947.6 = [M+4H] ⁴⁺ , 1263.1 = [M+3H] ³⁺ (Calculated Mm = 3786.3 g/mol)

30b получают по методике описанной выше за исключением того, что вместо 29а используют связанное со смолой производное BNP 29b.30b was prepared as described above, except that the resin-bound BNP derivative 29b was used in place of 29a.

Выход: 7,4 мгYield: 7.4 mg

МС соединения 30b: м/з 947,5 = [М+4Н]⁴⁺, 1263,0 = [М+3Н]³⁺ (Расчетная Мм = 3786,3 г/моль)MS compound 30b: m/z 947.5 = [M+4H] ⁴⁺ , 1263.0 = [M+3H] ³⁺ (calculated Mm = 3786.3 g/mol)

Пример 31Example 31

Синтез конъюгатов ПЭГ40кДа-линкер-BNP (31а и 31b)Synthesis of PEG40kDa-linker-BNP conjugates (31a and 31b)

30а (4 мг) растворяют в смеси Н₂О/MeCN, 1:1, содержащей 0,1% TFA (200 мкл). Добавляют раствор ПЭГ40кДа-малеимида (42,2 мг) в смеси Н₂О/MeCN, 1:1 (1 мл) и фосфатный буфер (15 мкл, рН 7,4, 0,5 М). Полученный раствор инкубируют при комнатной температуре, через 5 мин прибавляют АсОН (20 мкл) и 31а очищают методом катионообменной хроматографии, высаливают и лиофилизируют.30a (4 mg) was dissolved in a 1:1 H ₂ O/MeCN mixture containing 0.1% TFA (200 μl). Add a solution of PEG40kDa-maleimide (42.2 mg) in a mixture of H ₂ O/MeCN, 1:1 (1 ml) and phosphate buffer (15 μl, pH 7.4, 0.5 M). The resulting solution was incubated at room temperature, AcOH (20 μl) was added after 5 min, and 31a was purified by cation exchange chromatography, salted out, and lyophilized.

Выход: 2,0 мгYield: 2.0 mg

31b получают по методике синтеза 31а за исключением того, что вместо 30а используют 30b.31b is prepared according to the synthesis procedure 31a, except that 30b is used instead of 30a.

Выход: 16,8 мгYield: 16.8 mg

Пример 32Example 32

Синтез линкера 32Synthesis of linker 32

3-Бромпропионилхлорид (62,5 мкл, 0,62 ммоль) растворяют в 0,5 мл CH₂Cl₂ и добавляют в раствор H₂N-CH₂-CH₂-STrt (200 мг, 0,56 ммоль), DIEA (196 мкл, 1,1 ммоль) в CH₂Cl₂ (1 мл). Смесь перемешивают в течение 1 часа при комнатной температуре. Реакционную смесь подкисляют АсОН (100 мкл) и растворитель удаляют под вакуумом. После очистки остатка на силикагеле (гептан/EtOAc = . 1:1) получают Br-(CH₂)₂CONH-(CH₂)₂-STrt.3-Bromopropionyl chloride (62.5 µl, 0.62 mmol) is dissolved in 0.5 ml CH ₂ Cl ₂ and added to a solution of H ₂ N-CH ₂ -CH ₂ -STrt (200 mg, 0.56 mmol), DIEA (196 μl, 1.1 mmol) in CH ₂ Cl ₂ (1 ml). The mixture is stirred for 1 hour at room temperature. The reaction mixture was acidified with AcOH (100 μl) and the solvent was removed in vacuo. After purification of the residue on silica gel (heptane/EtOAc=.1:1), Br-(CH ₂ ) ₂ CONH-(CH ₂ ) ₂ -STrt is obtained.

Выход: 223 мг (0,49 ммоль, 87%)Yield: 223 mg (0.49 mmol, 87%)

МС Br-(CH₂)₂CONH-(CH₂)₂-STrt: 478,7 = [M+Na]⁺, (Расчетная Мм = 454,7 г/моль)MS Br-(CH ₂ ) ₂ CONH-(CH ₂ ) ₂ -STrt: 478.7 = [M+Na] ⁺ , (Calculated Mm = 454.7 g/mol)

N-Alloc-этилендиамина гидрохлоридную соль (43,5 мг, 0,24 ммоль) и DIEA (38 мкл, 0,22 ммоль) прибавляют к раствору, содержащему Br-(CH₂)₂CONH-(CH₂)₂-STrt (100 мг, 0,22 ммоль) и Na₂CO₃ (93 мг, 0,87 ммоль) в DMF (1 мл). Реакционную смесь перемешивают в течение 10 часов при температуре 70°С. После охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь разбавляют 4 мл (MeCNZH₂O = 25:75 в присутствии 0,1% TFA) и очищают ВЭЖХ с получением Alloc-NH-(CH₂)₂-NH-(CH₂)₂-CONH-(CH₂)₂-STrt.N-Alloc-ethylenediamine hydrochloride salt (43.5 mg, 0.24 mmol) and DIEA (38 μl, 0.22 mmol) are added to a solution containing Br-(CH ₂ ) ₂ CONH-(CH ₂ ) ₂ -STrt (100 mg, 0.22 mmol) and Na ₂ CO ₃ (93 mg, 0.87 mmol) in DMF (1 ml). The reaction mixture is stirred for 10 hours at 70°C. After cooling to room temperature, the reaction mixture was diluted with 4 ml (MeCNZH ₂ O = 25:75 in the presence of 0.1% TFA) and purified by HPLC to give Alloc-NH-(CH ₂ ) ₂ -NH-(CH ₂ ) ₂ -CONH -(CH ₂ ) ₂ -STrt.

Выход: 61 мг (0,096 ммоль, 44%, в виде трифторацетатной соли)Yield: 61 mg (0.096 mmol, 44%, as trifluoroacetate salt)

МС Alloc-NH-(CH₂)₂-NH-(CH₂)₂-CONH-(CH₂)₂-STrt: 540,8 = [M+Na]⁺, (Расчетная Мм = 517,8 г/моль)MS Alloc-NH-(CH ₂ ) ₂ -NH-(CH ₂ ) ₂ -CONH-(CH ₂ ) ₂ -STrt: 540.8 = [M+Na] ⁺ , (Calculated Mm = 517.8 g/mol )

Alloc-NH-(CH₂)₂-NH-(CH₂)₂-CONH-(CH₂)₂-STrt (60,9 мг, 0,096 ммоль) растворяют в CH₂Cl₂ и Boc₂O (42 мг, 0,19 ммоль). Раствор перемешивают в течение 20 часов при комнатной температуре. По завершения взаимодействия реакционную смесь гасят добавлением 70 мкл АСОН и растворитель упаривают под вакуумом. Остаток разбавляют 4 мл MeCNZH₂O (25:75, в присутствии 0,1% TFA) и после очистки методом обращенно-фазовой ВЭЖХ получают Alloc-NH-(CH₂)₂-N(Boc)-(CH₂)₂-CONH-(CH₂)₂-STrt.Alloc-NH-(CH ₂ ) ₂ -NH-(CH ₂ ) ₂ -CONH-(CH ₂ ) ₂ -STrt (60.9 mg, 0.096 mmol) is dissolved in CH ₂ Cl ₂ and Boc ₂ O (42 mg, 0.19 mmol). The solution is stirred for 20 hours at room temperature. Upon completion of the interaction, the reaction mixture was quenched by adding 70 μl of ASON and the solvent was evaporated under vacuum. The residue was diluted with 4 ml MeCNZH ₂ O (25:75, in the presence of 0.1% TFA) and after purification by reverse phase HPLC, Alloc-NH-(CH ₂ ) ₂ -N(Boc)-(CH ₂ ) ₂ - CONH-(CH ₂ ) ₂ -STrt.

Выход: 53,3 мг (0,086 ммоль, 89%)Yield: 53.3 mg (0.086 mmol, 89%)

МС Alloc-NH-(CH₂)₂-N(Boc)-(CH₂)₂-CONH-(CH₂)₂-STrt: 640,6 = [M+Na]⁺, (Расчетная Мм = 617,9, г/моль)MS Alloc-NH-(CH ₂ ) ₂ -N(Boc)-(CH ₂ ) ₂ -CONH-(CH ₂ ) ₂ -STrt: 640.6 = [M+Na] ⁺ , (Calculated Mm = 617.9 , g/mol)

Alloc-NH-(CH₂)₂-N(Boc)-(CH₂)₂-CONH-(CH₂)₂-STrt (48,3 мг, 0,078 ммоль) растворяют в THF, прибавляют формиат триэтиламмония (62 мкл) и Pd (PPh₃)₄ (16 мг). Раствор перемешивают в течение 12 часов при комнатной температуре с осуществлением масс-спектрометрического мониторинга протекания реакции. По завершении реакции растворитель упаривают под вакуумом. Остаток растворяют в MeCN/H₂O (50:50, с 0,1% TFA) и после очистки методом обращенно-фазовой ВЭЖХ получают H₂N-(CH₂)₂-N(Boc)-(CH₂)₂-CONH-(CH₂)₂-STrt (31).Alloc-NH-(CH ₂ ) ₂ -N(Boc)-(CH ₂ ) ₂ -CONH-(CH ₂ ) ₂ -STrt (48.3 mg, 0.078 mmol) is dissolved in THF, triethylammonium formate (62 μl) is added and Pd (PPh ₃ ) ₄ (16 mg). The solution is stirred for 12 hours at room temperature with the implementation of the mass spectrometric monitoring of the reaction. After completion of the reaction, the solvent is evaporated under vacuum. The residue was dissolved in MeCN/H ₂ O (50:50, with 0.1% TFA) and after purification by reverse phase HPLC, H ₂ N-(CH ₂ ) ₂ -N(Boc)-(CH ₂ ) ₂ - CONH-(CH ₂ ) ₂ -STrt (31).

Выход: 20,1 мг (0,031 ммоль, 40%, в виде трифторацетатной соли)Yield: 20.1 mg (0.031 mmol, 40%, as trifluoroacetate salt)

МС 31: 534,6 = [М+Н]⁺, 556,6 = [M+Na]⁺, (Расчетная Мм = 533,5 г/моль)MS 31: 534.6 = [M+H] ⁺ , 556.6 = [M+Na] ⁺ , (Calculated Mm = 533.5 g/mol)

Пример 33Example 33

Синтез BNP-линкер-тиолов (Соединение 33а и 33b)Synthesis of BNP linker thiols (Compound 33a and 33b)

Соединение 33а получают по методике синтеза соединения 30а за исключением того, что вместо соединения 28 используют 32.Compound 33a was obtained according to the procedure for the synthesis of compound 30a, except that 32 was used instead of compound 28.

Выход: 8,0 мгYield: 8.0 mg

МС 33а: м/з 933,5 = [М+4Н]⁴⁺, 1244,3 = [М+3Н]³⁺ (Расчетная Мм - 3729,9 г/моль)MS 33a: m/z 933.5 = [M+4H] ⁴⁺ , 1244.3 = [M+3H] ³⁺ (Calculated Mm - 3729.9 g/mol)

33b получают по методике синтеза 30b за исключением того, что вместо 28 используют 32.33b is prepared by the same procedure as 30b, except that 32 is used instead of 28.

Выход: 5,0 мгYield: 5.0 mg

МС 33b: м/з 933,5 = [М+4Н]⁴⁺, 1244,3 = [М+3Н]³⁺ (Расчетная Мм = 3715,9 г/моль)MS 33b: m/z 933.5 = [M+4H] ⁴⁺ , 1244.3 = [M+3H] ³⁺ (Calculated Mm = 3715.9 g/mol)

Пример 34Example 34

Синтез конъюгатов ПЭГ40кДа-линкер-BNP (34а н 34b)Synthesis of PEG40kDa-linker-BNP conjugates (34a and 34b)

33а (4,3 мг) растворяют в смеси Н₂О/MeCN, 1:1, содержащей 0,1% TFA (200 мкл). Добавляют раствор ПЭГ40кДа-малеимида (42,2 мг) в смеси Н₂О/MeCN, 1:1 (1 мл) и фосфатный буфер (20 мкл, рН 7,4, 0,5 М). Полученный раствор инкубируют при комнатной температуре, через 5 мин прибавляют АсОН (20 мкл) и 34а очищают методом катионообменной хроматографии, высаливают и лиофилизируют.33a (4.3 mg) was dissolved in H ₂ O/MeCN 1:1 containing 0.1% TFA (200 μl). Add a solution of PEG40kDa-maleimide (42.2 mg) in a mixture of H ₂ O/MeCN, 1:1 (1 ml) and phosphate buffer (20 μl, pH 7.4, 0.5 M). The resulting solution was incubated at room temperature, AcOH (20 µl) was added after 5 min, and 34a was purified by cation exchange chromatography, salted out, and lyophilized.

Выход: 9,7 мгYield: 9.7 mg

34b получают по методике синтеза 34а за исключением того, что вместо 33а используют 33b.34b is prepared according to the synthesis procedure 34a, except that 33b is used instead of 33a.

Выход: 11,5 мгYield: 11.5 mg

Пример 35Example 35

Синтез линкера 35Synthesis of linker 35

Бромацетилбромид (54 мкл, 0,62 ммоль) растворяют в 0,5 мл CH₂Cl₂ и добавляют к раствору, содержащему H₂N-CH₂-CH₂-STrt (200 мг, 0,56 ммоль) и DIEA (196 мкл, 1,1 ммоль) в CH₂Cl₂ (1 мл). Смесь перемешивают в течение 1 часа при комнатной температуре. Реакционную смесь подкисляют уксусной кислотой (100 мкл) и растворитель упаривают под вакуумом. После очистки остатка очищают на силикагеле (гептан/EtOAc = 1:), получая Br-CH₂-CONH-(CH₂)₂-STrt.Bromoacetyl bromide (54 µl, 0.62 mmol) is dissolved in 0.5 ml CH ₂ Cl ₂ and added to a solution containing H ₂ N-CH ₂ -CH ₂ -STrt (200 mg, 0.56 mmol) and DIEA (196 μl, 1.1 mmol) in CH ₂ Cl ₂ (1 ml). The mixture is stirred for 1 hour at room temperature. The reaction mixture was acidified with acetic acid (100 μl) and the solvent was evaporated in vacuo. After purification, the residue was purified on silica gel (heptane/EtOAc=1:) to give Br-CH ₂ -CONH-(CH ₂ ) ₂ -STrt.

Выход: 245 мг (0,55 ммоль, 99%)Yield: 245 mg (0.55 mmol, 99%)

МС Br-CH₂-CONH-(CH₂)₂-STrt: 462,4 = [M+Na]⁺, (Расчетная Мм = 440,4 г/моль)MS Br-CH ₂ -CONH-(CH ₂ ) ₂ -STrt: 462.4 = [M+Na] ⁺ , (Calculated Mm = 440.4 g/mol)

N-Alloc-этилендиамина гидрохлоридную соль (45 мг, 0,25 ммоль) и DIEA (79 мкл, 0,45 ммоль) прибавляют к раствору, содержащему Br-CH₂-CONH-(CH₂)₂-STrt (100 мг, 0,23 ммоль) в DMF (1 мл). Реакционную смесь перемешивают в течение 10 часов при температуре 70°С. После охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь разбавляют H₂O/Et₂O (1:1, 40 мл) и образованные слои разделяют. Водный слой экстрагируют несколько раз Et₂O. Объединенные органические слои сушат над MgSO₄, фильтруют и растворитель упаривают под вакуумом. Остаток очищают на силикагеле (DCM/MeOH = 95:5), давая Alloc-NH-(CH₂)₂-NH-CH₂-CONH-(CH₂)₂-STrt.N-Alloc-ethylenediamine hydrochloride salt (45 mg, 0.25 mmol) and DIEA (79 μl, 0.45 mmol) are added to a solution containing Br-CH ₂ -CONH-(CH ₂ ) ₂ -STrt (100 mg, 0.23 mmol) in DMF (1 ml). The reaction mixture is stirred for 10 hours at 70°C. After cooling to room temperature, the reaction mixture was diluted with H ₂ O/Et ₂ O (1:1, 40 ml) and the layers formed were separated. The aqueous layer is extracted several times with Et ₂ O. The combined organic layers are dried over MgSO ₄ , filtered and the solvent is evaporated under vacuum. The residue is purified on silica gel (DCM/MeOH=95:5) to give Alloc-NH-(CH ₂ ) ₂ -NH-CH ₂ -CONH-(CH ₂ ) ₂ -STrt.

Выход: 94 мг (0,186 ммоль, 82%, содержит остаточный DMF)Yield: 94 mg (0.186 mmol, 82%, contains residual DMF)

МС Alloc-NH-(CH₂)₂-NH-CH₂-CONH-(CH₂)₂-STrt: 526,8 = [M+Na]⁺, (Расчетная Мм = 503,8 г/моль)MS Alloc-NH-(CH ₂ ) ₂ -NH-CH ₂ -CONH-(CH ₂ ) ₂ -STrt: 526.8 = [M+Na] ⁺ , (Calculated Mm = 503.8 g/mol)

Alloc-NH-(CH₂)₂-NH-CH₂-CONH-(CH₂)₂-STrt (94 мг, 0,186 ммоль, с остатком DMF) растворяют в CH₂CI₂ и к полученному раствору прибавляют Boc₂O (81 мг, 0,37 ммоль). Раствор перемешивают в течение 20 часов при комнатной температуре. По завершения взаимодействия реакционную смесь гасят добавлением 100 мкл АсОН и растворитель упаривают под вакуумом. Остаток разбавляют 4 мл MeCN/H₂O (25:75, в присутствии 0,1% TFA) и после очистки методом обращенно-фазовой ВЭЖХ получают Alloc-NH-(CH₂)₂-N(Boc)-CH₂-CONH-(CH₂)₂-STrt.Alloc-NH-(CH ₂ ) ₂ -NH-CH ₂ -CONH-(CH ₂ ) ₂ -STrt (94 mg, 0.186 mmol, with DMF residue) was dissolved in CH ₂ CI ₂ and Boc ₂ O ( 81 mg, 0.37 mmol). The solution is stirred for 20 hours at room temperature. Upon completion of the interaction, the reaction mixture was quenched by the addition of 100 μl AcOH and the solvent was evaporated under vacuum. The residue was diluted with 4 ml MeCN/H ₂ O (25:75, in the presence of 0.1% TFA) and after purification by reverse phase HPLC, Alloc-NH-(CH ₂ ) ₂ -N(Boc)-CH ₂ -CONH -(CH ₂ ) ₂ -STrt.

Выход: 34,7 мг (0,057 ммоль, 26%)Yield: 34.7 mg (0.057 mmol, 26%)

МС Alloc-NH-(CH₂)₂-N(Boc)-CH₂-CONH-(CH₂)₂-STrt: 603,9 = [M+Na]⁺ (Расчетная Мм = 603,9 г/моль)MS Alloc-NH-(CH ₂ ) ₂ -N(Boc)-CH ₂ -CONH-(CH ₂ ) ₂ -STrt: 603.9 = [M+Na] ⁺ (Calculated Mm = 603.9 g/mol)

Alloc-NH-(CH₂)₂-N(Boc)-CH₂-CONH-(CH₂)₂-STrt (34,7 мг, 0,048 ммоль) растворяют в THF, прибавляют формиат триэтиламмония (38 мкл) и Pd (PPh₃)₄ (5 мг). Раствор перемешивают в течение 12 часов при комнатной температуре с осуществлением масс-спектрометрического мониторинга протекания реакции. По завершении реакции растворитель упаривают под вакуумом. Остаток растворяют в MeCN/H₂O (50:50, с 0,1% TFA) и после очистки методом обращенно-фазовой ВЭЖХ получают H₂N-(CH₂)₂-N(Boc)-CH₂-CONH-(CH₂)₂-STrt соединения 35.Alloc-NH-(CH ₂ ) ₂ -N(Boc)-CH ₂ -CONH-(CH ₂ ) ₂ -STrt (34.7 mg, 0.048 mmol) is dissolved in THF, triethylammonium formate (38 μl) and Pd ( PPh ₃ ) ₄ (5 mg). The solution is stirred for 12 hours at room temperature with the implementation of the mass spectrometric monitoring of the reaction. After completion of the reaction, the solvent is evaporated under vacuum. The residue was dissolved in MeCN/H ₂ O (50:50, with 0.1% TFA) and after purification by reverse phase HPLC, H ₂ N-(CH ₂ ) ₂ -N(Boc)-CH ₂ -CONH-( CH ₂ ) ₂ -STrt of compound 35.

Выход: 12,6 мг (0,019 ммоль, 42%, в виде трифторацетатной соли)Yield: 12.6 mg (0.019 mmol, 42%, as trifluoroacetate salt)

МС 35: 520,1 = [М+Н]⁺, 542,2 = [М+Na]⁺, (Расчетная Мм = 519,2 г/моль)MS 35: 520.1 = [M + H] ⁺ , 542.2 = [M + Na] ⁺ , (Calculated Mm = 519.2 g / mol)

Пример 36Example 36

Синтез BNP-линкер-тиолов (36а и 36b)Synthesis of BNP linker thiols (36a and 36b)

36а получают по методике синтеза 30а за исключением того, что вместо 28 используют 35.36a is obtained according to the synthesis procedure 30a, except that 35 is used instead of 28.

Выход: 9,1 мгYield: 9.1 mg

МС 36а: м/з 930,0 = [М+4Н]⁴⁺, 1239,6 = [М+3Н]³⁺ (Расчетная Мм = 3715,9 г/моль)MS 36a: m/z 930.0 = [M+4H] ⁴⁺ , 1239.6 = [M+3H] ³⁺ (Calculated Mm = 3715.9 g/mol)

36b получают по методике синтеза 30b за исключением того, что вместо соединения 28 используют соединение 35.36b was prepared by the same procedure as 30b, except that compound 35 was used instead of compound 28.

Выход: 8,0 мгYield: 8.0 mg

МС 36b: м/з 929,5 = [М+4Н]⁴⁺, 1239,5 = [М+3Н]³⁺ (Расчетная Мм = 3715,9 г/моль)MS 36b: m/z 929.5 = [M+4H] ⁴⁺ , 1239.5 = [M+3H] ³⁺ (Calculated Mm = 3715.9 g/mol)

Пример 37Example 37

Синтез конъюгатов ПЭГ40кДа-линкер-BNP (31а и 31b)Synthesis of PEG40kDa-linker-BNP conjugates (31a and 31b)

Соединение 36а (4,2 мг) растворяют в смеси Н₂О/MeCN, 1:1, содержащей 0,1% TFA (200 мкл). Добавляют раствор ПЭГ40кДа-малеимида (68 мг) в смеси Н₂О/MeCN, 1:1 (1 мл) и фосфатный буфер (20 мкл, рН 7,4, 0,5 М). Полученный раствор инкубируют при комнатной температуре, через 5 мин прибавляют АсОН (20 мкл) и 37а очищают методом ионнообменной хроматографии, высаливают и лиофилизируют.Compound 36a (4.2 mg) was dissolved in H ₂ O/MeCN 1:1 containing 0.1% TFA (200 μl). Add a solution of PEG40kDa-maleimide (68 mg) in a mixture of H ₂ O/MeCN, 1:1 (1 ml) and phosphate buffer (20 μl, pH 7.4, 0.5 M). The resulting solution was incubated at room temperature, AcOH (20 μl) was added after 5 min, and 37a was purified by ion-exchange chromatography, salted out, and lyophilized.

Выход: 16 мгYield: 16 mg

37b синтезируют по методике получения 37а, за исключением того, что вместо 36а используют 36b.37b was synthesized as in the preparation of 37a, except that 36b was used instead of 36a.

Выход: 18,5 мгYield: 18.5 mg

Пример 38Example 38

Синтез конъюгатов линкер-эксендинSynthesis of linker-exendin conjugates

Конъюгаты линкер-эксендин получают в соответствии с общим методами синтеза С, D, Е или F.Linker-exendin conjugates are prepared according to general synthetic methods C, D, E, or F.

Метод АMethod A

Синтез: Ангидрид дикислоты (0,2 ммоль) и пиридин (0,2 ммоль) растворяют в 0,3 мл сухого DMF. Полученную смесь добавляют к защищенному в боковой цепи эксендину-4 на смоле (2 мкмоль) и перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Смолу промывают DMF (10 раз). РуВОР (0,1 ммоль) и диамин (0,1 ммоль) растворяют в 0,3 мл сухого DMF. Полученную смесь вводят в смолу и перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Смолу промывают DMF (10 раз). Полученные конъюгаты эксендина с линкером отщепляют от смолы и очищают методом обращенно-фазовой хроматографии по методике, описанной в разделе "Материалы и методы".Synthesis: Diacid anhydride (0.2 mmol) and pyridine (0.2 mmol) are dissolved in 0.3 ml of dry DMF. The resulting mixture was added to side chain protected exendin-4 resin (2 μmol) and stirred for 30 minutes at room temperature. The resin was washed with DMF (10 times). PyBOP (0.1 mmol) and diamine (0.1 mmol) are dissolved in 0.3 ml of dry DMF. The resulting mixture is injected into the resin and stirred for 30 minutes at room temperature. The resin was washed with DMF (10 times). The resulting exendin-linker conjugates are cleaved from the resin and purified by reverse phase chromatography as described in the Materials and Methods section.

Метод ВMethod B

Синтез проводят по методике Метода А исключением того, что вместо ангидрида дикислоты и пиридина используют дикислоту (0,2 ммоль), HOBt (0,2 ммоль), DIC (0,2 ммоль), и коллидин (0,4 ммоль).The synthesis is carried out according to Method A except that diacid (0.2 mmol), HOBt (0.2 mmol), DIC (0.2 mmol), and collidine (0.4 mmol) are used instead of diacid anhydride and pyridine.

Метод СMethod C

Синтез: диамин (0,6 ммоль) растворяют в 1 мл сухого DCM и к полученному раствору прибавляют ангидрид дикислоты (0,4 ммоль). Смесь перемешивают в течение 60 мин при комнатной температуре. DCM упаривают, остаток растворяют в смеси ACN/вода/АсОН, полученную аминокислоту очищают методом обращенно-фазовой хроматографии и лиофилизируют.Synthesis: diamine (0.6 mmol) is dissolved in 1 ml of dry DCM and diacid anhydride (0.4 mmol) is added to the resulting solution. The mixture is stirred for 60 minutes at room temperature. The DCM is evaporated, the residue is dissolved in ACN/water/AcOH, the resulting amino acid is purified by reverse phase chromatography and lyophilized.

Полученную аминокислоту (0,1 ммоль), HOBt (0,1 ммоль), DIC (0,1 ммоль) и коллидин (0,2 ммоль) растворяют в 0,3 мл сухого DMF. Полученную смесь прибавляют к эксендину-4 на смоле (2 мкмоль) и перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Смолу промывают DMF (10 раз). Полученные конъюгаты эксендина с линкером отщепляют от смолы и очищают методом обращенно-фазовой хроматографии по методике, описанной в разделе "Материалы и методы".The obtained amino acid (0.1 mmol), HOBt (0.1 mmol), DIC (0.1 mmol) and collidine (0.2 mmol) are dissolved in 0.3 ml of dry DMF. The resulting mixture was added to exendin-4 resin (2 μmol) and stirred for 30 minutes at room temperature. The resin was washed with DMF (10 times). The resulting exendin-linker conjugates are cleaved from the resin and purified by reverse phase chromatography as described in the Materials and Methods section.

Метод DMethod D

Синтез: Ангидрид дикислоты (0,2 ммоль) и пиридин (0,2 ммоль) растворяют в 0,3 мл сухого DMF. Полученную смесь добавляют к эксендину-4 на смоле (2 мкмоль) и перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Смолу промывают DMF (10 раз). РуВОР (0,1 ммоль), HOBt (0,1 ммоль) и коллидин (0,4 ммоль) растворяют в 0,3 мл сухого DMF. Полученную смесь вводят в смолу и интенсивно перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Смолу промывают DMF (10 раз). Диамин (0,1 ммоль) и DIEA (0,3 ммоль) растворяют в смеси 0,4 мл DMF и 0,4 мл этанола. Полученную смесь добавляют к смоле и перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Смолу промывают DMF (10 раз). Полученные конъюгаты эксендина с линкером отщепляют от смолы и очищают методом обращенно-фазовой хроматографии по методике, описанной в разделе "Материалы и методы".Synthesis: Diacid anhydride (0.2 mmol) and pyridine (0.2 mmol) are dissolved in 0.3 ml of dry DMF. The resulting mixture was added to exendin-4 on resin (2 μmol) and stirred for 30 minutes at room temperature. The resin was washed with DMF (10 times). PyBOP (0.1 mmol), HOBt (0.1 mmol) and collidine (0.4 mmol) are dissolved in 0.3 ml dry DMF. The resulting mixture is injected into the resin and stirred vigorously for 30 min at room temperature. The resin was washed with DMF (10 times). Diamine (0.1 mmol) and DIEA (0.3 mmol) are dissolved in a mixture of 0.4 ml DMF and 0.4 ml ethanol. The resulting mixture was added to the resin and stirred for 30 minutes at room temperature. The resin was washed with DMF (10 times). The resulting exendin-linker conjugates are cleaved from the resin and purified by reverse phase chromatography as described in the Materials and Methods section.

Метод ЕMethod E

Синтез: Fmoc-аминокислоту (0,1 ммоль), РуВОР (0,1 ммоль) и DIEA (0,2 ммоль) растворяют в 0,3 мл сухого DMF. Полученную смесь добавляют к эксендину-4 на смоле (2 мкмоль) и перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Fmoc защитную группу удаляют путем инкубации смолы в смеси DMF/пиперидин, 4/1 (об./об.) 2 раза по 10 мин. Смолу промывают DMF (10 раз) и DCM (10 раз). Паранитрофенилхлорформиат (0,1 ммоль) растворяют в 0,3 мл сухого THF и DIEA (0,2 ммоль). Полученную смесь добавляют к смоле и перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Смолу промывают DCM (10 раз). Диамин (0,1 ммоль) растворяют в 0,3 мл DMF. Смесь добавляют к смоле и перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Смолу промывают DMF (10 раз). Полученные конъюгаты эксендина с линкером отщепляют от смолы и очищают методом обращенно-фазовой хроматографии по методике, описанной в разделе "Материалы и методы".Synthesis: Fmoc-amino acid (0.1 mmol), PyBOP (0.1 mmol) and DIEA (0.2 mmol) are dissolved in 0.3 ml of dry DMF. The resulting mixture was added to exendin-4 on resin (2 μmol) and stirred for 30 minutes at room temperature. The Fmoc protecting group is removed by incubating the resin in DMF/piperidine, 4/1 (v/v) for 2 x 10 minutes. The resin was washed with DMF (10 times) and DCM (10 times). Para-nitrophenyl chloroformate (0.1 mmol) is dissolved in 0.3 ml dry THF and DIEA (0.2 mmol). The resulting mixture was added to the resin and stirred for 30 minutes at room temperature. The resin was washed with DCM (10 times). Diamine (0.1 mmol) is dissolved in 0.3 ml of DMF. The mixture is added to the resin and stirred for 30 minutes at room temperature. The resin was washed with DMF (10 times). The resulting exendin-linker conjugates are cleaved from the resin and purified by reverse phase chromatography as described in the Materials and Methods section.

Метод FMethod F

Синтез проводят по методике Метода А с последующим снятием Fmoc-защиты и ацетилированием: Fmoc защитную группу удаляют посредством инкубации смолы в смеси DMF/пиперидин, 4/1 (об./об.) 2 раза по 10 мин. Смолу промывают DMF (10 раз). Ацетилирование осуществляют инкубацией смолы в смеси ангидрид уксусной кислоты/пиридин/DMF(1/1/2, (об./об./об.) в течение 30 мин. Полученную смолу промывают DMF (10 раз).The synthesis is carried out according to Method A followed by Fmoc deprotection and acetylation: The Fmoc protecting group is removed by incubating the resin in DMF/piperidine, 4/1 (v/v) 2 x 10 min. The resin was washed with DMF (10 times). Acetylation is carried out by incubating the resin in a mixture of acetic anhydride/pyridine/DMF(1/1/2, (v/v/v) for 30 min. The resulting resin was washed with DMF (10 times).

Полученные конъюгаты эксендина с линкером отщепляют от смолы и очищают методом обращенно-фазовой хроматографии по методике, описанной в разделе "Материалы и методы".The resulting exendin-linker conjugates are cleaved from the resin and purified by reverse phase chromatography as described in the Materials and Methods section.

Более подробная информация, касающаяся синтезированных соединений, исходных материалов, методе синтеза, молекулярной массе (Мм) и данные масс-спектрометрии приведены на Фиг. 2.More detailed information regarding synthesized compounds, starting materials, synthetic method, molecular weight (Mm) and mass spectrometry data are shown in FIG. 2.

Пример 39Example 39

Синтез конъюгатов гидрогель-линкер-эксендин (39)Synthesis of hydrogel-linker-exendin conjugates (39)

Функционализированные малеиимидом гидрогелевые микрочастицы синтезируют методом, описанным в ЕР 1625856 А1.Maleimide-functionalized hydrogel microparticles are synthesized by the method described in EP 1625856 A1.

30 мг микрочастиц малеимид-модифицированного гидрогеля (загрузка 40 мкмоль/г, 1,2 мкмоль) подвергают взаимодействию с 6 мг соединения 25а (1,32 мкмоль, 1,1 экв) в 600 мкл смеси ацетонитрил/50 Мм фосфатный буфер (рН 7,4), 20/80 (об./об.) в течение 10 минут с образованием микрочастиц гидрогеля 39, нагруженного конъюгатом эксендина с линкером. Нагруженный гидрогель 39 промывают 5 раз смесью ацетонитрил/вода 50/50 (об./об.) и три раза водой.30 mg of maleimide-modified hydrogel microparticles (load 40 µmol/g, 1.2 µmol) are reacted with 6 mg of compound 25a (1.32 µmol, 1.1 eq) in 600 µl of acetonitrile/50 Mm phosphate buffer (pH 7 ,4), 20/80 (v/v) for 10 minutes to form hydrogel microparticles 39 loaded with exendin-linker conjugate. The loaded hydrogel 39 is washed 5 times with acetonitrile/water 50/50 (v/v) and three times with water.

Пример 40Example 40

Синтез линкера 40Synthesis of linker 40

Fmoc-Ala-OH (250 мг, 0,8 ммоль) и DIEA (170 мкл, 1,0 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), полученную смесь добавляют 2-хлортритилхлоридной смоле (312 мг, 1,3 ммоль/г) и перемешивают в течение 45 мин при комнатной температуре. Прибавляют метанол (0,6 мл) и смолу инкубируют еще 15 мин. Смолу промывают DCM (10 раз) и DMF (10 раз). Снятие Fmoc-защиты и образование мочевины обеспечивают в соответствии с общей методикой проведения синтеза (см. раздел "Материалы и методы") путем проведения взаимодействия с линкерным промежуточным соединением 5а, полученный продукт отщепляют от смолы и очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.Fmoc-Ala-OH (250 mg, 0.8 mmol) and DIEA (170 μl, 1.0 mmol) are dissolved in DCM (2 ml), the resulting mixture is added to 2-chlorotrityl chloride resin (312 mg, 1.3 mmol/g ) and stirred for 45 minutes at room temperature. Methanol (0.6 ml) is added and the resin is incubated for an additional 15 minutes. The resin was washed with DCM (10 times) and DMF (10 times). Deprotection of Fmoc and formation of urea is carried out in accordance with the general procedure for carrying out the synthesis (see section "Materials and Methods") by reacting with the linker intermediate 5a, the resulting product is cleaved from the resin and purified by reverse phase HPLC.

Выход: 53 мгYield: 53 mg

МС соединения 40: м/з 604,4 [М+Н]⁺ (Расчетная Мм = 603,8 г/моль)Compound 40 MS: m/z 604.4 [M+H] ⁺ (calculated Mm = 603.8 g/mol)

Пример 41Example 41

Синтез конъюгата эксендин-линкер (41)Synthesis of exendin-linker conjugate (41)

Соединение 40 (в виде гидрохлоридной соли, 14,0 мг, 0,02 ммоль), РуВОР (10,2 мг, 0,02 ммоль) и DIEA (17 мкл, 0,1 ммоль) растворяют в DMF (300 мкл), полученный раствор сразу же добавляют к защищенному в боковой цепи эксендину-4, связанному со смолой, (100 мг, 10 мкмоль) и инкубируют в течение 4 часов при комнатной температуре. Смолу промывают DMF (10х), DCM (10х) и высушивают под вакуумом. Полученный продукт отщепляют от смолы и очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.Compound 40 (as hydrochloride salt, 14.0 mg, 0.02 mmol), PyBOP (10.2 mg, 0.02 mmol) and DIEA (17 μl, 0.1 mmol) are dissolved in DMF (300 μl), the resulting solution was immediately added to side chain protected resin-bound exendin-4 (100 mg, 10 μmol) and incubated for 4 hours at room temperature. The resin was washed with DMF (10x), DCM (10x) and dried under vacuum. The resulting product is cleaved from the resin and purified by reverse phase HPLC.

Выход: 5,4 мгYield: 5.4 mg

МС 40: м/з 1510,9 = [М+3Н]³⁺ (Расчетная Мм = 4530,1 г/моль)MS 40: m / s 1510.9 \u003d [M + 3H] ³⁺ (Calculated Mm \u003d 4530.1 g / mol)

Пример 42Example 42

Синтез конъюгата жирная кислота-линкер (42)Synthesis of fatty acid-linker conjugate (42)

41 (1,6 мг) растворяют в 200 мкл смеси ацетонитрил/вода, 3/1 и к полученному раствору прибавляют соединение 1 (0,11 мг) в 200 мкл смеси ацетонитрил/вода, 3/1. Затем прибавляют 30 мкл 0,25 М натрий-фосфатного буфера, реакционную смесь перемешивают в течение 5 минут, после чего 42 очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.41 (1.6 mg) was dissolved in 200 μl of acetonitrile/water, 3/1, and compound 1 (0.11 mg) in 200 μl of acetonitrile/water, 3/1 was added to the resulting solution. Then add 30 μl of 0.25 M sodium phosphate buffer, the reaction mixture is stirred for 5 minutes, after which 42 purified by reverse phase HPLC.

МС 42: м/з 1870,2 = [М+3Н]³⁺ (Расчетная Мм = 5608,4 г/моль).MS 42: m/z 1870.2 = [M+3H] ³⁺ (Calculated Mm = 5608.4 g/mol).

Пример 43Example 43

Синтез конъюгата гидрогель-линкер-эксендин (43)Synthesis of hydrogel-linker-exendin conjugate (43)

43 получают по методике синтеза 39 за исключением того, вместо 25 используют 41.43 is obtained by the method of synthesis 39 except that 41 is used instead of 25.

Пример 44Example 44

Синтез линкера (44)Linker synthesis (44)

44 получают по методике синтеза 40 за исключением того, вместо 5а используют 28.44 is obtained by the method of synthesis 40 except that 28 is used instead of 5a.

Выход: 74 мгYield: 74 mg

МС 44: м/з 605,4 = [М+3Н]³⁺ (Расчетная Мм = 604,8 г/моль)MS 44: m/z 605.4 = [M+3H] ³⁺ (Calculated Mm = 604.8 g/mol)

Пример 45Example 45

Синтез конъюгата эксендин-линкер (45)Synthesis of exendin-linker conjugate (45)

45 получают по методике синтеза 41 за исключением того, вместо 40 используют 44.45 is obtained by the method of synthesis 41 except that 44 is used instead of 40.

Выход: 6,0 мгYield: 6.0 mg

МС 45: м/з 1511,3 = [М+3Н]³⁺ (Расчетная Мм = 4531,1 г/моль)MS 45: m / s 1511.3 \u003d [M + 3H] ³⁺ (Calculated Mm \u003d 4531.1 g / mol)

Пример 46Example 46

Синтез конъюгата жирная кислота-линкер (46)Synthesis of fatty acid-linker conjugate (46)

46 получают по методике синтеза 42 за исключением того, вместо 41 используют 45.46 is obtained by the method of synthesis 42 except that 45 is used instead of 41.

МС соединения 46: м/з 1870,5 3 = (Расчетная Мм = 5609,5 г/моль).Compound 46 MS: m/z 1870.5 3 = (Calculated Mm = 5609.5 g/mol).

Пример 47Example 47

Синтез промежуточного линкерного соединения 47Synthesis of intermediate linker compound 47

Тритилсульфид (247 мг, 0,89 ммоль) суспендируют в 1 мл DMSO. Добавляют DBU (152 мкл, 1,02 ммоль) и 6-бромегексан-1-ол (173 мг, 0,96) и полученную смесь перемешивают в течение 5 мин при комнатной температуре. Реакционную смесь растворяют в 20 мл этилацетата и промывают 1 н H₂SO₄ (2х) и солевым раствором (3х). Органический слой сушат (Na₂SO₄) и летучие компоненты упаривают в вакууме. Полученный продукт очищают флэш-хроматографией на силикагеле (гептан/AcOEt, 1/1).Trityl sulfide (247 mg, 0.89 mmol) is suspended in 1 ml DMSO. DBU (152 µl, 1.02 mmol) and 6-bromohexan-1-ol (173 mg, 0.96) are added and the resulting mixture is stirred for 5 minutes at room temperature. The reaction mixture was dissolved in 20 ml of ethyl acetate and washed with 1 N H ₂ SO ₄ (2x) and brine (3x). The organic layer is dried (Na ₂ SO ₄ ) and the volatiles are evaporated in vacuo. The product obtained is purified by flash chromatography on silica gel (heptane/AcOEt, 1/1).

Выход: 283 мг (S-тритил)-6-меркаптогексан-1-ола.Yield: 283 mg (S-trityl)-6-mercaptohexan-1-ol.

(S-тритил)-6-меркаптогексан-1-ол (466 мг, 1,24 ммоль) растворяют в смеси растворителей, содержащей 3,5 мл DCM, 0,5 мл ДМСО и 0,6 мл NEt₃, и затем реакционную смесь охлаждают на ледяной бане. SO₃-пиридин (408 мг, 2,57 ммоль) суспендируют в 0,5 мл DMSO и добавляют к реакционной смеси. Убирают ледяную баню и реакционную смесь перемешивают в течение 60 мин при комнатной температуре. Затем реакционную смесь растворяют в 20 мл Et₂O и экстрагируют с использованием 1 н H₂SO₄ (2х) и солевого раствора (3х). Органический слой сушат (Na₂SO₄) и летучие компоненты упаривают в вакууме. Полученный продукт очищают флэш-хроматографией на силикагеле (гептан /AcOEt 1/1).(S-trityl)-6-mercaptohexan-1-ol (466 mg, 1.24 mmol) is dissolved in a solvent mixture containing 3.5 ml DCM, 0.5 ml DMSO and 0.6 ml NEt ₃ , and then the reaction the mixture is cooled in an ice bath. SO ₃ -pyridine (408 mg, 2.57 mmol) is suspended in 0.5 ml DMSO and added to the reaction mixture. The ice bath is removed and the reaction mixture is stirred for 60 minutes at room temperature. Then the reaction mixture was dissolved in 20 ml of Et ₂ O and extracted using 1 n H ₂ SO ₄ (2x) and saline (3x). The organic layer is dried (Na ₂ SO ₄ ) and the volatiles are evaporated in vacuo. The resulting product is purified by silica gel flash chromatography (heptane/AcOEt 1/1).

Выход: 390 мг соединения 47 в форме (S-тритил)-6-меркаптогексан-1-аля.Yield: 390 mg of compound 47 in the form of (S-trityl)-6-mercaptohexane-1-ala.

МС 47: м/з 243,1 = [Trt]⁺ 413,1 = [М+K]⁺ (Расчетная Мм = 374,4 г/моль)MS 47: m/z 243.1 = [Trt] ⁺ 413.1 = [M+K] ⁺ (calculated Mm = 374.4 g/mol)

Пример 48Example 48

Синтез линкера (48)Linker Synthesis (48)

Fmoc-Ala-OH (250 мг, 0,8 ммоль) и DIEA (170 мкл, 1,0 ммоль) растворяют в DCM (2 мл), полученную смесь добавляют к 2-хлортритилхлоридной смоле (312 мг, 1,3 ммоль/г) и перемешивают в течение 45 мин при комнатной температуре. Прибавляют метанол (0,6 мл) и смолу инкубируют еще 15 мин. Смолу промывают DCM (10х) и DMF (10х). Снятие Fmoc-защиты и образование мочевины обеспечивают в соответствии с общей методикой проведения синтеза (см. раздел "Материалы и методы") посредством проведения взаимодействия смолы с этилендиамином. Для восстановительного алкилирования соединение 47 (299 мг, 0,8 ммоль) и Na(OAC)₃BH (340 мг, 1,6 ммоль) растворяют в 0,5 мл DMF, 0,5 мл метанола и 10 мкл АсОН, добавляют к смоле и перемешивают в течение 2 часов при комнатной температуре. Смолу промывают DMF (10х) и DCM (10х). Защиту Вос-ангидридом осуществляют интенсивным перемешиванием смолы в растворе, содержащем Вос-ангидрид (218 мг, 1,0 ммоль) и DIEA (170 мкл, 1,0 ммоль) в DCM. Смолу промывают DCM (10х) и образованный продукт отщепляют от смолы и очищают методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.Fmoc-Ala-OH (250 mg, 0.8 mmol) and DIEA (170 μl, 1.0 mmol) are dissolved in DCM (2 ml), the resulting mixture is added to 2-chlorotrityl chloride resin (312 mg, 1.3 mmol/ d) and stirred for 45 minutes at room temperature. Methanol (0.6 ml) is added and the resin is incubated for an additional 15 minutes. The resin was washed with DCM (10x) and DMF (10x). Fmoc deprotection and urea formation is achieved in accordance with the general synthesis procedure (see Materials and Methods section) by reacting the resin with ethylenediamine. For reductive alkylation, compound 47 (299 mg, 0.8 mmol) and Na(OAC) ₃ BH (340 mg, 1.6 mmol) are dissolved in 0.5 ml DMF, 0.5 ml methanol and 10 μl AcOH, added to resin and stirred for 2 hours at room temperature. The resin was washed with DMF (10x) and DCM (10x). Protection with Boc anhydride is carried out by vigorously agitating the resin in a solution containing Boc anhydride (218 mg, 1.0 mmol) and DIEA (170 μl, 1.0 mmol) in DCM. The resin was washed with DCM (10x) and the resulting product was cleaved from the resin and purified by reverse phase HPLC.

Выход: 34 мгYield: 34 mg

МС 48: м/з 634,2 [М+Н]⁺ (Расчетная Мм = 633,9 г/моль)MS 48: m/z 634.2 [M+H] ⁺ (calculated Mm = 633.9 g/mol)

Пример 49Example 49

Синтез конъюгата эксендин-линкер (49)Synthesis of exendin-linker conjugate (49)

49 получают по методике синтеза 41 за исключением того, вместо 40 используют 48.49 is obtained by the method of synthesis 41 except that 48 is used instead of 40.

Выход: 4,8 мгYield: 4.8 mg

МС 49: м/з 1487,3 = [М+3Н]³⁺ (Расчетная Мм = 4460,0 г/моль)MS 49: m/z 1487.3 = [M+3H] ³⁺ (Calculated Mm = 4460.0 g/mol)

Пример 50Example 50

Синтез конъюгата гидрогель-линкер-эксендин (50)Synthesis of hydrogel-linker-exendin conjugate (50)

50 получают по методике синтеза 39 за исключением того, вместо 25а используют 49.50 is obtained by the method of synthesis 39 except that 49 is used instead of 25a.

Пример 51Example 51

Кинетика высвобождения in vitroIn vitro release kinetics

Высвобождение молекулы лекарственного средства из 38a-38z, 38aa-38ab, 4, 5, 9а, 9b, 9с, 10, 13а, 15, 19а, 19b, 22, 26а-26с, 31а, 31b, 34а, 34b, 37а, 37b, 42, 43, 46 и 50 осуществляется в результате гидролиза в буферном растворе при рН 7,4 и температуре 37°С или рН 4 и температуре 37°С, как описано в разделе "Материалы и методы".Release of the drug molecule from 38a-38z, 38aa-38ab, 4, 5, 9a, 9b, 9c, 10, 13a, 15, 19a, 19b, 22, 26a-26c, 31a, 31b, 34a, 34b, 37a, 37b , 42, 43, 46 and 50 is carried out by hydrolysis in a buffer solution at pH 7.4 and a temperature of 37°C or pH 4 and a temperature of 37°C, as described in the "Materials and Methods" section.

Пример 52Example 52

Корреляционный анализ кинетики высвобождения in vivo - in vitro/in vivoCorrelation analysis of release kinetics in vivo - in vitro/in vivo

Кинетику высвобождения in vivo определяли путем сравнения фармакокинетических параметров соединения 13а с фармакокинетическими параметрами соединения 13с и соединения 13b с соединением 13d, соответственно, после внутривенного их введения в крысу. Исследования на животных проводили в Heidelberg Pharma AG, Heidelberg, Germany.The in vivo release kinetics were determined by comparing the pharmacokinetic parameters of compound 13a with the pharmacokinetic parameters of compound 13c and compound 13b with compound 13d, respectively, after their intravenous administration to the rat. Animal studies were performed at Heidelberg Pharma AG, Heidelberg, Germany.

Соединение 13a (27 мг) растворяли в 3,5 мл PBS и 500 мкл полученного раствора вводили внутривенно каждой из шести испытуемых крыс. Использовали мужские особи крыс линии SD с массой примерно 270 г. Забор образцов крови производили при Т = 0, 2 ч, 24 ч, 32 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч, 120 ч и 168 ч, после чего получали образцы плазмы крови, которые анализировали по флуоресценции флуоресцеина на спектрометре Perkin- Elmer LS 50В.Compound 13a (27 mg) was dissolved in 3.5 ml PBS and 500 μl of the resulting solution was injected intravenously into each of the six test rats. Male SD rats weighing approximately 270 g were used. Blood sampling was performed at T = 0, 2 h, 24 h, 32 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h and 168 h, after which plasma samples were obtained. blood, which were analyzed by fluorescein fluorescence on a Perkin-Elmer LS 50B spectrometer.

Фармакокинетику соединения 13 с определяли по методике, описанной для соединения 13а. Фармакокинетику соединений 13b и 13d определяли, как описано для соединения 13а, за исключением того, что использовали 20 мг соединения 13b и 13d, каждое в 2,5 мл PBS, и четыре крысы.The pharmacokinetics of compound 13c was determined according to the procedure described for compound 13a. The pharmacokinetics of compounds 13b and 13d were determined as described for compound 13a, except that 20 mg of compounds 13b and 13d, each in 2.5 ml PBS, and four rats were used.

Период полужизни линкера при гидролизе рассчитывали на основе данных отношения флуоресценции соединения 13а по сравнению с флуоресценцией 13с и 13b по сравнению с 13d, соответственно, в соответствующие моменты времени.The hydrolysis half-life of the linker was calculated based on the ratio of fluorescence of compound 13a versus fluorescence of 13c and 13b versus 13d, respectively, at the respective time points.

Было определено, что период полужизни линкера при гидролизе in vivo составлял 115 и 160 часов для соединений 13а и 13b, соответственно, что является превосходной корреляцией с результатами, полученными в отношении периода полужизни линкера при гидролизе in vitro, составляющем 120 и 160 часов для соединений 13а и 13b, соответственно.The in vivo hydrolysis half-life of the linker was determined to be 115 and 160 hours for compounds 13a and 13b, respectively, which is an excellent correlation with the results obtained for the linker hydrolysis half-life in vitro of 120 and 160 hours for compounds 13a and 13b, respectively.

Фиг. 3 представляет данные расщепления связи линкера с соединением 13b in vivo и in vitro, где в полулогарифмическом виде показана in vivo (треугольниками) и in vitro (ромбами) кинетика расщепления.Fig. 3 represents in vivo and in vitro linker bond cleavage data with compound 13b, showing in vivo (triangles) and in vitro (diamonds) cleavage kinetics in semi-log form.

Сокращения:Abbreviations:

Аср - 4-(2-аминоэтил) - 1-карбоксиметил-пиперазин;Asp - 4-(2-aminoethyl) - 1-carboxymethyl-piperazine;

АсОН - уксусная кислота;AcOH - acetic acid;

Вос - трет-бутоксикарбонил;Boc - tert-butoxycarbonyl;

Dab - 2,4-диаминомасляная кислота;Dab - 2,4-diaminobutyric acid;

DBU - 1,3-диазабицикло [5.4.0] ундецен;DBU - 1,3-diazabicyclo[5.4.0]undecene;

DCM - дихлорметан;DCM - dichloromethane;

Dda - додекановая кислота;Dda - dodecanoic acid;

DIC - диизопропилкарбодиимид;DIC - diisopropylcarbodiimide;

DIEA - диизопропилэтиламин;DIEA - diisopropylethylamine;

DMAP - диметиламинопиридин;DMAP - dimethylaminopyridine;

DMF - N,N-диметилформамид;DMF - N,N-dimethylformamide;

DMSO - диметилсульфоксид;DMSO - dimethyl sulfoxide;

EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота;EDTA - ethylenediaminetetraacetic acid;

Eq - стехиометрический эквивалент;Eq - stoichiometric equivalent;

Fmoc - 9-флуоренилметоксикарбонил;Fmoc - 9-fluorenylmethoxycarbonyl;

HATU O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат;HATU O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate;

HFIP - гексафторизопропанол;HFIP - hexafluoroisopropanol;

HEPES - N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота;HEPES - N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N'-2-ethanesulfonic acid;

HOBt - N-гидроксибензотриазол;HOBt - N-hydroxybenzotriazole;

ivDde - 1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогексилиден)-3-метилбутил;ivDde - 1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)-3-methylbutyl;

LCMS - жидкостная хроматография в сочетании с масс-спектрометрией;LCMS - liquid chromatography combined with mass spectrometry;

Mal 3-малеимидопропионил;Mal 3-maleimidopropionyl;

Mmt - 4-метокситритил;Mmt - 4-methoxytrityl;

МС - масс-спектр;MS - mass spectrum;

MW - молекулярная масса;MW - molecular weight;

n.d. - не установлено;n.d. - not installed;

PfpOH - пентафторфенол;PfpOH - pentafluorophenol;

РуВОР-бензотриазол-1-ил-окси-Трис-пирролидино-фосфония гексафторфосфат;RuBOP-benzotriazol-1-yl-oxy-Tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate;

RP-HPLC - обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ-ВЭЖХ);RP-HPLC - reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC);

RT - комнатная температура;RT - room temperature;

SEC - эксклюзионная хроматография молекул по размеру;SEC - size exclusion chromatography of molecules by size;

Suc - сукцинимидопропионил;Suc - succinimidopropionyl;

TCP - 2-хлортитилхлоридная смола;TCP - 2-chlorothityl chloride resin;

TES - триэтилсилан;TES - triethylsilane;

ТМОВ - 2,4,6-триметоксибензил;TMOV - 2,4,6-trimethoxybenzyl;

TFA - трифторуксусная кислота;TFA - trifluoroacetic acid;

THF - тетрагидрофуран;THF - tetrahydrofuran;

UV - ультрафиолетовый;UV - ultraviolet;

VIS- визуальный.VIS - visual.

Claims (51)

1. Пролекарство или его фармацевтически приемлемая соль, состоящие из конъюгата лекарственное средство-линкер D-L, где1. A prodrug or a pharmaceutically acceptable salt thereof, consisting of a drug-linker conjugate D-L, where -D представляет собой азотсодержащий полипептид; а-D is a nitrogen-containing polypeptide; A -L представляет собой - L¹, представленный формулой (I)-L is -L ¹ represented by formula (I)

где пунктирная линия показывает присоединение к азоту полипептида посредством образования амидной связи;where the dotted line shows the accession to the nitrogen of the polypeptide through the formation of an amide bond; X представляет собой C(R⁴R^4a), N(R⁴), О, C(R⁴R^4a)-C(R⁵R^5a), C(R⁵R^5a)-C(R⁴R^4a), C(R⁴R^4a)-N(R⁶), N(R⁶)-C(R⁴R^4a), C(R⁴R^4a)-O или O-C(R⁴R^4a);X is C(R ⁴ R ^4a ), N(R ⁴ ), O, C(R ⁴ R ^4a )-C(R ⁵ R ^5a ), C(R ⁵ R ^5a )-C(R ⁴ R ^4a ) , C(R ⁴ R ^4a )-N(R ⁶ ), N(R ⁶ )-C(R ⁴ R ^4a ), C(R ⁴ R ^4a )-O or OC(R ⁴ R ^4a ); X¹ представляет собой С;X ¹ is C; X² представляет собой C(R⁷R^7a) или C(R⁷R^7a)-C(R⁸R^8a);X ² is C(R ⁷ R ^7a ) or C(R ⁷ R ^7a )-C(R ⁸ R ^8a ); X³ представляет собой О;X ³ is O; R¹, R^1a, R², R^2a, R³, R^3a, R⁴, R^4a, R⁵, R^5a, R⁶, R⁷, R^7a, R⁸, R^8a независимо выбирают из группы, состоящей из Н и С_1-4 алкила;R ¹ , R ^1a , R ² , R ^2a , R ³ , R ^3a , R ⁴ , R ^4a , R ⁵ , R ^5a , R ⁶ , R ⁷ , R ^7a , R ⁸ , R ^8a are independently selected from the group consisting of from H and C _1-4 alkyl; альтернативно одна или более пар R^1a/R^4a, R^1a/R^5a, R^4a/R^5a, R^7a/R^8a образуют химическую связь;alternatively, one or more pairs of R ^1a /R ^4a , R ^1a /R ^5a , R ^4a /R ^5a , R ^7a /R ^8a form a chemical bond; альтернативно одна или более пар R¹/R^1a, R²/R^2a, R⁴/R^4a, R⁵/R^5a, R⁷/R^7a, R⁸/R^8a вместе с атомом, к которому они присоединены, соединяются с образованием С_3-7 циклоалкила или 4-7-членного гетероциклила;alternatively, one or more pairs of R ¹ /R ^1a , R ² /R ^2a , R ⁴ /R ^4a , R ⁵ /R ^5a , R ⁷ /R ^7a , R ⁸ /R ^8a together with the atom to which they are attached are connected to form C _3-7 cycloalkyl or 4-7 membered heterocyclyl; альтернативно одна или более пар R¹/R⁴, R¹/R⁵, R¹/R⁶, R⁴/R⁵, R⁴/R⁶, R⁷/R⁸, R²/R³ вместе с атомами, к которым они присоединены, соединяются с образованием кольца А;alternatively one or more pairs of R ¹ /R ⁴ , R ¹ /R ⁵ , R ¹ /R ⁶ , R ⁴ /R ⁵ , R ⁴ /R ⁶ , R ⁷ /R ⁸ , R ² /R ³ together with atoms, to which they are attached, combine to form ring A; альтернативно R³/R^3a вместе с атомом азота, к которому они присоединены, соединяются с образованием 4-7-членного гетероцикла;alternatively, R ³ /R ^3a , together with the nitrogen atom to which they are attached, combine to form a 4-7 membered heterocycle; А выбирают из группы, состоящей из фенила, нафтила, инденила, инданила, тетралинила, С_3-10 циклоалкила, 4-7-членного гетероциклила и 9-11-членного гетеробициклила; иA is selected from the group consisting of phenyl, naphthyl, indenyl, indanyl, tetralinyl, C _3-10 cycloalkyl, 4-7 membered heterocyclyl and 9-11 membered heterobicyclyl; And где L¹ замещен 1-4 группами L²-Z, при условии, что водород, отмеченный символом * в формуле (I), не может быть замещен заместителем, гдеwhere L ¹ is substituted by 1-4 L ² -Z groups, provided that the hydrogen marked with * in formula (I) cannot be substituted by a substituent, where L² представляет собой одинарную химическую связь или алкильную цепь, имеющую от 1 до 20 углеродных атомов, которая возможно прерывается одной или более группами, независимо выбранными из -О- и C(O)N(R^3aa); при необходимости замещенную одной или несколькими группами, независимо выбранными из ОН и C(O)N(R^3aaR^3aaa), и причем R^3aa, R^3aaa независимо выбраны из группы, состоящей из Н и C_1-4 алкила; иL ² is a single chemical bond or an alkyl chain having from 1 to 20 carbon atoms, which is optionally interrupted by one or more groups independently selected from —O— and C(O)N(R ^3aa ); optionally substituted with one or more groups independently selected from OH and C(O)N(R ^3aa R ^3aaa ), wherein R ^3aa , R ^3aaa are independently selected from the group consisting of H and C _1-4 alkyl; And L² присоединен к Z через концевую группу,L ² is attached to Z through an end group, выбранную из

иselected from

And Z представляет собой линейный или разветвленный поли(этиленгликоль) с молекулярной массой от 2000 до 150000 Да.Z is a linear or branched poly(ethylene glycol) with a molecular weight of 2,000 to 150,000 Da. 2. Пролекарство по п. 1, в котором X представляет собой N(R⁴).2. The prodrug of claim 1 wherein X is N(R ⁴ ). 3. Пролекарство по п. 1, где X² представляет собой C(R⁷, R^7a).3. A prodrug according to claim 1 wherein X ² is C(R ⁷ , R ^7a ). 4. Пролекарство по п. 1, где L¹ выбирают из группы, состоящей из:4. The prodrug according to claim 1, where L ¹ is selected from the group consisting of:

где R представляет собой Н или С_1-4 алкил; Y представляет собой NH, О или S; a R¹, R^1a, R², R^2a, R³, R^3a, R⁴, X, X¹, X² имеют значение, указанное в п. 1.where R represents H or C _1-4 alkyl; Y is NH, O or S; a R ¹ , R ^1a , R ² , R ^2a , R ³ , R ^3a , R ⁴ , X, X ¹ , X ² have the meaning specified in paragraph 1. 5. Пролекарство по п. 1, где L¹ выбирают из группы, состоящей из:5. Prodrug according to claim 1, where L ¹ is selected from the group consisting of:

где R имеет значение, указанное в п. 4.where R has the meaning given in clause 4. 6. Пролекарство по п. 1, где L² имеет молекулярную массу в интервале от 14 до 750 г/моль.6. Prodrug according to claim 1, wherein L ² has a molecular weight in the range from 14 to 750 g/mol. 7. Пролекарство по п. 1, где L представлен формулой (Ia)7. The prodrug of claim 1 wherein L is represented by formula (Ia)

где R⁴, L² и Z имеют значение, указанное в п. 1, и где R^3aa, R^3aaa независимо выбирают из группы, состоящей из Н и С_1-4 алкила, или R^3aa и R^3aaa вместе с атомом азота, к которому они присоединены, соединяются с образованием 4-7-членного гетероцикла.where R ⁴ , L ² and Z have the meaning specified in paragraph 1, and where R ^3aa , R ^3aaa independently selected from the group consisting of H and C _1-4 alkyl, or R ^3aa and R ^3aaa together with a nitrogen atom, to which they are attached, combine to form a 4-7-membered heterocycle. 8. Пролекарство по п. 1, где L представлен формулой (Ib)8. The prodrug of claim 1 wherein L is represented by formula (Ib)

где R¹, R^1a, R⁴, L² и Z имеют значение, указанное в п. 1, и где R^3aa представляет собой Н или С_1-4 алкил.where R ¹ , R ^1a , R ⁴ , L ² and Z have the meaning specified in paragraph 1, and where R ^3aa represents H or C _1-4 alkyl. 9. Пролекарство по п. 1, где R¹ в формуле (I) представляет собой L²-Z.9. The prodrug of claim 1 wherein R ¹ in formula (I) is L ² -Z. 10. Пролекарство по п. 1, где R³ в формуле (I) представляет собой L²-Z.10. The prodrug of claim 1 wherein R ³ in formula (I) is L ² -Z. 11. Пролекарство по п. 1, где R³, R^3a в формуле (I) вместе с атомом азота, к которому они присоединены, соединяются с образованием 4-7-членного гетероцикла и где указанный гетероцикл замещен L²-Z.11. A prodrug according to claim 1, wherein R ³ , R ^3a in formula (I), together with the nitrogen atom to which they are attached, combine to form a 4-7 membered heterocycle and wherein said heterocycle is substituted with L ² -Z. 12. Пролекарство по п. 1, где D-H представляет собой полипептид, выбранный из группы, состоящей из адренокортикотропного гормона АСТН, аденозиндезаминазы, агальзидазы, альфа-1-антитрипсина (ААТ), ингибитора альфа-1-протеиназы (API), альтеплазы, амилинов, анистреплазы, анкрод-серинпротеазы, антител, антитромбина III, антитрипсинов, апротинина, аспарагиназы, атосибана, бифалина, бивалирудина, костных морфогенных белков, бычьего панкреатического трипсинового ингибитора (BPTI), фрагментов кадгерина, кальцитонина, коллагеназы, ингибитора системы комплемента с эстеразной активностью С1, конотоксинов, фрагментов цитокиновых рецепторов, ДНКазы, динорфина А, эндорфинов, энфувиртида, энкефалинов, эритропоэтинов, эксендинов, фактора VII, фактора VIIa, фактора VIII, фактора VIIIa, фактора IX, фибринолизина, фактора роста фибробластов (FGF), высвобождающего гормон роста пептида-2 (GHRP2), слитых белков, фолликулостимулирующих гормонов, грамицидина, грелина, дезацилгрелина, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), галактозидазы, глюкагона, глюкагон-подобных пептидов, глюкоцереброзидазы, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), белков теплового шока человека (HSP), белка, активирующего фосфолипазу, (PLAP), хорионического гонадотропина человека (hCG), гемоглобинов, вакцин против гепатита В, гирудина, ингибитора серинпротеазы человека, гиалуронидаз, идуронидазы, иммунноглобулинов, вакцин против гриппа, интерлейкинов, антагониста рецептора IL-1 (rhIL-Ira), инсулинов, инсулиноподобных факторов роста, белка, связывающего инсулиноподобный фактор роста (rhIGFBP), интерферонов, молекулы внутриклеточной адгезии, фактора роста кератиноцитов (KGF), гликопротеинового лиганда Р-селектина (PSGL), трансформирующих факторов роста, лактазы, лептина, лейпролида, левотироксина, лютеинизирующего гормона, вакцины против болезни Лайма, натрийуретических пептидов, нейропептида Y, панкрелипазы, панкреатического полипептида, папаина, паратиреоидного гормона, тромбоцитарного фактора роста (PDGF), пепсина, пептида YY, ацетилгидролазы тромбоцит-активирующего фактора (PAF-AH), пролактина, С-белка, тимальфазина, октреотида, секретина, серморелина, растворимого рецептора фактора некроза опухоли (TNFR), супероксиддисмутазы (SOD), соматропина, соматоприма, соматостатина, стрептокиназы, сахаразы, терлипрессина, фрагмента столбнячного токсина, тилактазы, тромбинов, тимозина, гормона, регулирующего деятельность щитовидной железы, тиреотропина, фактора некроза опухоли (TNF), рецептора TNF, соединенного с Fc-участком IgG, тканевого активатора плазминогена (tPA), тиреотропного гормона (TSH), уродилатина, уратоксидазы, урокиназы, вакцин, фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), вазоактивного интестинального пептида, вазопрессина, циконотида, лектина и рицина.12. The prodrug of claim 1, wherein D-H is a polypeptide selected from the group consisting of adrenocorticotropic hormone ACTH, adenosine deaminase, agalsidase, alpha-1 antitrypsin (AAT), alpha-1-proteinase inhibitor (API), alteplase, amylins , anistreplase, ancrod-serine protease, antibodies, antithrombin III, antitrypsins, aprotinin, asparaginase, atosiban, bifalin, bivalirudin, bone morphogenic proteins, bovine pancreatic trypsin inhibitor (BPTI), cadherin fragments, calcitonin, collagenase, inhibitor of the complement system with C1 esterase activity , conotoxins, cytokine receptor fragments, DNase, dynorphin A, endorphins, enfuvirtide, enkephalins, erythropoietins, exendins, factor VII, factor VIIa, factor VIII, factor VIIIa, factor IX, fibrinolysin, fibroblast growth factor (FGF), growth hormone-releasing peptide -2 (GHRP2), fusion proteins, follicle-stimulating hormones, gramicidin, ghrelin, deacylghrelin, granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), galactosidase, glucagon, glucagon-like peptides, glucocerebrosidase, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), proteins human heat shock (HSP), phospholipase activating protein (PLAP), human chorionic gonadotropin (hCG), hemoglobins, hepatitis B vaccines, hirudin, human serine protease inhibitor, hyaluronidases, iduronidase, immunoglobulins, influenza vaccines, interleukins, receptor antagonist IL-1 (rhIL-Ira), insulins, insulin-like growth factors, insulin-like growth factor binding protein (rhIGFBP), interferons, intracellular adhesion molecule, keratinocyte growth factor (KGF), P-selectin glycoprotein ligand (PSGL), transforming growth factors , lactase, leptin, leuprolide, levothyroxine, luteinizing hormone, Lyme disease vaccine, natriuretic peptides, neuropeptide Y, pancrelipase, pancreatic polypeptide, papain, parathyroid hormone, platelet-derived growth factor (PD), pepsin, GF YY peptide, platelet-activating factor acetylhydrolase (PAF-AH), prolactin, C-protein, thymalfasin, octreotide, secretin, sermorelin, soluble tumor necrosis factor receptor (TNFR), superoxide dismutase (SOD), somatropin, somatoprim, somatostatin, streptokinase, sucrase, terlipressin, tetanus toxin fragment, tilactase, thrombin, thymosin, thyroid-regulating hormone, thyrotropin, tumor necrosis factor (TNF), TNF receptor coupled to the Fc region of IgG, tissue plasminogen activator (tPA), thyroid-stimulating hormone (TSH), urodilatin, urate oxidase, urokinase , vaccines, vascular endothelial growth factor (VEGF), vasoactive intestinal peptide, vasopressin, cyconotide, lectin and ricin. 13. Пролекарство по п. 12, где13. Prodrug according to claim 12, where амилины выбраны из амилина и симлина; и/илиamylins are selected from amylin and symlin; and/or антитела выбраны из моноклональных или поликлональных антител и их фрагментов или продуктов слияния; и/или the antibodies are selected from monoclonal or polyclonal antibodies and fragments or fusions thereof; and/or кальцитонин представляет собой кальцитонин лосося; и/илиcalcitonin is salmon calcitonin; and/or интерлейкины выбраны из интерлейкина 1-альфа, 1-бета, 2, 3, 4, 6, 10, 11, 12, 13 и 21; и/илиinterleukins are selected from interleukin 1-alpha, 1-beta, 2, 3, 4, 6, 10, 11, 12, 13 and 21; and/or интерфероны выбраны из интерферона альфа 2а, альфа 2b, альфа 2с, бета 1а, бета 1b, гамма 1а и гамма 1b); и/илиinterferons are selected from interferon alpha 2a, alpha 2b, alpha 2c, beta 1a, beta 1b, gamma 1a and gamma 1b); and/or натрийуретические пептиды выбраны из ANP, BNP, CNP и их фрагментов.Natriuretic peptides are selected from ANP, BNP, CNP and fragments thereof.

Images