RU2797724C2 - Anti-hla-g antibodies and their use - Google Patents
Anti-hla-g antibodies and their use Download PDFInfo
- Publication number
- RU2797724C2 RU2797724C2 RU2020137068A RU2020137068A RU2797724C2 RU 2797724 C2 RU2797724 C2 RU 2797724C2 RU 2020137068 A RU2020137068 A RU 2020137068A RU 2020137068 A RU2020137068 A RU 2020137068A RU 2797724 C2 RU2797724 C2 RU 2797724C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hla
- seq
- antibody
- amino acid
- hvr
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Настоящее изобретение относится к анти-HLA-G антителам, их получению, составам и способам их применения.The present invention relates to anti-HLA-G antibodies, their production, compositions and methods of their use.
Предпосылки создания настоящего изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION
Главный комплекс гистосовместимости человека, класса I, 6, известный также как лейкоцитарный антиген G человека (HLA-G), представляет собой белок, который у человека кодируется геном HLA-G. Ген HLA-G принадлежит к паралогам тяжелой цепи HLA неклассического класса I. Это соединение класса I является гетеродимером, состоящим из тяжелой цепи и легкой цепи (β-2 микроглобулин). Тяжелая цепь заякорена в мембране, но может также высвобождаться/секретироваться.Human major histocompatibility complex, class I, 6, also known as human leukocyte antigen G (HLA-G), is a protein encoded in humans by the HLA-G gene. The HLA-G gene belongs to the non-classical class I HLA heavy chain paralogs. This class I compound is a heavy chain-light chain heterodimer (β-2 microglobulin). The heavy chain is membrane anchored but can also be released/secreted.
- Тяжелая цепь состоит из трех доменов: α 1, α 2 и α 3. Домены α 1 и α 2 образуют бороздку для связывания пептида, фланкированную двумя α-спиралями. Небольшие пептиды (приблизительно 9-членные) могут связываться с этой бороздкой, как и другие белки МНС I.- The heavy chain consists of three domains:
- Вторая цепь является β-2 микроглобулином, который связывается с тяжелой цепью, как и другие белки МНС I.- The second chain is a β-2 microglobulin that binds to the heavy chain like other MHC I proteins.
HLA-G существует в семи изоформах, 3 из которых представляют собой секретируемые формы, а остальные 4 представляют собой связанные с мембраной формы (как показано на схеме, фиг. 1).HLA-G exists in seven isoforms, 3 of which are secreted forms and the remaining 4 are membrane-bound forms (as shown in the diagram, Fig. 1).
HLA-G может формировать олигомерные структуры функционально активного комплекса (Kuroki, K и др., Eur J Immunol. 37 1727-1729 (2007)). Связанные дисульфидной связью димеры образуются за счет дисульфидной связи между остатками Cys 42 двух молекул HLA-G (Shiroishi М и др., J Biol Chem 281 10439-10447 (2006)). Тримерные и тетрамерные комплексы описаны также в статьях Kuroki К и др. Eur J Immunol. 37 1727-1729 (2007), Allan D.S., и др. J Immunol Methods, 268 43-50 (2002) и T Gonen-Gross и др., J Immunol 171 1343-1351 (2003).HLA-G can form oligomeric structures of a functional complex (Kuroki, K et al., Eur J Immunol. 37 1727-1729 (2007)). Disulfide-linked dimers are formed by a disulfide bond between Cys 42 residues of two HLA-G molecules (Shiroishi M et al., J Biol Chem 281 10439-10447 (2006)). Trimeric and tetrameric complexes are also described in the articles by Kuroki K et al. Eur J Immunol. 37 1727-1729 (2007), Allan D.S., et al. J Immunol Methods, 268 43-50 (2002) and T Gonen-Gross et al., J Immunol 171 1343-1351 (2003).
HLA-G преимущественно экспрессируется на цитотрофобластах в плаценте. Некоторые опухоли (включая рак поджелудочной железы, молочной железы, кожи, колоректальный рак, рак желудка и яичников) экспрессируют HLA-G (Lin А. и др., Mol Med. 21 782-791 (2015), Amiot L. и др., Cell Mol Life Sci. 68 417-431 (2011)). Описано также, что экспрессия связана с патологическими состояниями, такими как воспалительные заболевания, реакция «трансплантат против хозяина» (GvHD) и рак. Описано так же, что экспрессия HLA-G связана с неблагоприятным прогнозом при раке. Раковые клетки уклоняются от иммунного надзора хозяина за счет индукции иммунной толерантности/подавления благодаря экспрессии HLA-G.HLA-G is predominantly expressed on cytotrophoblasts in the placenta. Some tumors (including pancreatic, breast, skin, colorectal, gastric and ovarian cancers) express HLA-G (Lin A. et al., Mol Med. 21 782-791 (2015), Amiot L. et al. , Cell Mol Life Sci 68 417-431 (2011)). Expression has also been described to be associated with pathological conditions such as inflammatory diseases, graft-versus-host disease (GvHD), and cancer. It has also been described that HLA-G expression is associated with a poor prognosis in cancer. Cancer cells evade host immune surveillance by induction of immune tolerance/suppression due to HLA-G expression.
HLA-G характеризуется высокой гомологией (>98%) с другими молекулами МНС I, поэтому возникают проблемы с получением действительно HLA-G специфических антител без перекрестной реактивности с другими молекулами МНС I.HLA-G has a high homology (>98%) with other MHC I molecules, so there are problems in obtaining truly HLA-G specific antibodies without cross-reactivity with other MHC I molecules.
Ранее были описаны определенные антитела, которые различным образом взаимодействуют с HLA-G: антитела, описанные в статье Tissue Antigens, 55 (2000) 510-518, относятся к моноклональным антителам, например, 87G и МЕМ-G/9; антитела, описанные в статье Neoplasma 50 (2003) 331-338, относятся к определенным моноклональным антителам, распознающим как олигомерный комплекс полноразмерного HLA-G (например, 87G и MEM-G9), так и HLA-G, не-содержащий тяжелую цепь (например, 4Н84, MEM-G/1 и MEM-G/2); антитела, описанные в статье Hum Immunol. 64 (2003) 315-326, относятся к некоторым антителам, тестированным на опухолевых клетках JEG3, которые экспрессируют HLA-G (например, MEM-G/09 и -G/13, которые взаимодействуют исключительно с природными молекулами HLA-G1. MEM-G/01 распознают (аналогично антителам 4Н84 mAb) денатурированную тяжелую цепь HLA-G всех изоформ, в то время как MEM-G/04 селективно распознают денатурированные изоформы HLA-G1, -G2 h-G5; антитела, описанные в статье Wiendl и др. Brain 2003 176-85, относятся к различным моноклональным антителам HLA-G, например, 87G, 4Н84, MEM-G/9.Certain antibodies have previously been described that interact with HLA-G in various ways: the antibodies described in Tissue Antigens, 55 (2000) 510-518 refer to monoclonal antibodies,
В указанных выше публикациях сообщается об антителах, которые связываются с HLA-G человека или с комплексом HLA-G/β2M МНС человека. Однако в связи с высоким полиморфизмом и высокой гомологией семейства HLA, большинство антител не обладают действительно специфичными свойствами связывания с HLA-G, и в большинстве случаев связываются также с другими членами семейства HLA или проявляют перекрестную реактивность к ним (либо в виде комплекса МСН с формой, содержащей В2М, или с формой, не содержащей β2М) или они просто не ингибируют связывание комплекса HLA-G В2М МНС с его рецепторами ILT2 и/или ILT4 (и рассматриваются как неантагонистические антитела).The above publications report antibodies that bind to human HLA-G or to the HLA-G/β2M human MHC complex. However, due to the high polymorphism and high homology of the HLA family, most antibodies do not have truly specific HLA-G binding properties, and in most cases also bind to or cross-react with other members of the HLA family (either as an MCH complex with the form containing B2M, or with a form not containing β2M) or they simply do not inhibit the binding of the HLA-G B2M MHC complex to its ILT2 and/or ILT4 receptors (and are considered non-antagonistic antibodies).
Следовательно, существует необходимость создать и/или выбрать дополнительно улучшенные, действительно специфические к HLA-G антитела, которые проявляют ингибирующие свойства в отношении рецепторов.Therefore, there is a need to develop and/or select further improved, truly HLA-G specific antibodies that exhibit receptor inhibitory properties.
Краткое описание настоящего изобретенияBrief description of the present invention
В объекте настоящего изобретения предлагается антитело, которое связывается с HLA-G (и которое ингибирует связывание ILT2 с HLAG на клетках JEG-3 (АТСС НТВ36) и восстанавливает HLA-G специфичное сниженное высвобождение TNF-α моноцитами, совместно культивируемыми с клетками JEG-3.An object of the present invention is an antibody that binds to HLA-G (and that inhibits ILT2 binding to HLAG on JEG-3 cells (ATCC HTB36) and restores HLA-G specific reduced release of TNF-α by monocytes co-cultured with JEG-3 cells .
В одном варианте осуществления настоящего изобретения выделяют антитело, которое связывается с HLA-G человека (в одном варианте антитело связывается с комплексом HLA-G β2М МНС I, включающим последовательность SEQ ID NO: 43), где антитело включаетIn one embodiment of the present invention, an antibody is isolated that binds to human HLA-G (in one embodiment, the antibody binds to an HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 43), wherein the antibody comprises
А) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и (iii) HVR-H3, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из последовательности SEQ ID NO: 3, и (b) домен VL, включающий (i) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; (ii) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 и (iii) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, илиA) (a) a VH domain comprising (i) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and (iii) HVR-H3 comprising an amino acid sequence selected from the sequence of SEQ ID NO: 3, and (b) a VL domain comprising (i) an HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; (ii) an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5; and (iii) an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, or
B) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, (ii) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и (iii) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из последовательности SEQ ID NO: 11, и (b) домен VL, включающий (i) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (ii) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13 и (iii) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, илиB) (a) a VH domain comprising (i) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, (ii) HVR-H2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, and (iii) HVR-H3 containing an amino acid sequence selected from the sequence of SEQ ID NO: 11, and (b) a VL domain comprising (i) an HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12; (ii) an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13; and (iii) an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, or
C) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, (ii) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и (iii) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из последовательности SEQ ID NO: 19, и (b) домен VL, включающий (i) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (ii) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21 и (iii) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, илиC) (a) a VH domain comprising (i) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, (ii) HVR-H2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and (iii) HVR-H3 containing an amino acid sequence selected from the sequence of SEQ ID NO: 19, and (b) a VL domain comprising (i) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; (ii) an HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21; and (iii) an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, or
D) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, (ii) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и (iii) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из последовательности SEQ ID NO: 27, и (b) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28; (ii) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29 и (iii) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30.D) (a) a VH domain comprising (i) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, (ii) HVR-H2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and (iii) HVR-H3 containing an amino acid sequence selected from the sequence of SEQ ID NO: 27, and (b) a VL domain comprising (i) an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; (ii) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29; and (iii) HVR-L3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения выделяют антитело, которое связывается с HLA-G человека (в одном варианте антитело связывается с комплексом HLA-G β2М МНС I, включающим последовательность SEQ ID NO: 43), где антитело включаетIn another embodiment of the present invention, an antibody is isolated that binds to human HLA-G (in one embodiment, the antibody binds to an HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 43), wherein the antibody comprises
А)A)
(i) включает последовательность VH SEQ ID NO: 7 и последовательность VL SEQ ID NO: 8,(i) includes a VH sequence of SEQ ID NO: 7 and a VL sequence of SEQ ID NO: 8,
(ii) или гуманизированный вариант доменов VH и VL антитела по п. i), или(ii) or a humanized variant of the VH and VL domains of the antibody of i), or
В)IN)
(i) включает последовательность VH SEQ ID NO: 15 и последовательность VL SEQ ID NO: 16,(i) includes a VH sequence of SEQ ID NO: 15 and a VL sequence of SEQ ID NO: 16,
(ii) или гуманизированный вариант доменов VH и VL антитела по п. i), или(ii) or a humanized variant of the VH and VL domains of the antibody of i), or
С)WITH)
(i) включает последовательность VH SEQ ID NO: 23 и последовательность VL SEQ ID NO: 24,(i) includes a VH sequence of SEQ ID NO: 23 and a VL sequence of SEQ ID NO: 24,
(ii) или гуманизированный вариант доменов VH и VL антитела по п. i), или(ii) or a humanized variant of the VH and VL domains of the antibody of i), or
D)D)
(i) включает последовательность VH SEQ ID NO: 31 и последовательность VL SEQ ID NO: 32,(i) includes a VH sequence of SEQ ID NO: 31 and a VL sequence of SEQ ID NO: 32,
(ii) или гуманизированный вариант доменов VH и VL антитела по п. i).(ii) or a humanized variant of the VH and VL domains of the antibody of i).
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения описанное в данном контексте анти-HLA-G антителоIn yet another embodiment of the present invention, an anti-HLA-G antibody described herein
а) не проявляет перекрестную реактивность с модифицированным комплексом HLA-G β2М МНС I человека, включающим последовательность SEQ ID NO: 44, и/илиa) does not cross-react with a modified human HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 44, and/or
в) не проявляет перекрестную реактивность с комплексом HLA-A2 β2М МНС I человека, включающим последовательность SEQ ID NO: 39 и последовательность SEQ ID NO: 37, и/илиc) does not cross-react with the HLA-A2 β2M human MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 39 and the sequence of SEQ ID NO: 37, and/or
c) не проявляет перекрестную реактивность с комплексом H2Kd β2М МНС I мыши, включающим последовательность SEQ ID NO: 45, и/илиc) does not cross-react with the H2Kd β2M mouse MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 45, and/or
d) не проявляет перекрестную реактивность с комплексом RT1A β2М МНС I крысы, включающим последовательность SEQ ID NO: 47, и/илиd) does not cross-react with the rat RT1A β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 47, and/or
e) ингибирует связывание ILT2 с мономерным комплексом HLA-G β2М МНС I (включающим последовательность SEQ ID NO: 43), и/илиe) inhibits ILT2 binding to the HLA-G β2M MHC I monomeric complex (comprising the sequence of SEQ ID NO: 43), and/or
f) ингибирует связывание ILT2 с тримерным комплексом HLA-G β2М МНС I (включающим последовательность SEQ ID NO: 43), более чем на 50% (в одном варианте более чем на 60%) (по сравнению со связыванием без антитела) (см. пример 4b), и/илиf) inhibits ILT2 binding to the HLA-G β2M MHC I trimeric complex (comprising the sequence of SEQ ID NO: 43) by more than 50% (in one embodiment, more than 60%) (compared to binding without antibody) (see example 4b), and/or
g) ингибирует связывание ILT2 с мономерным и/или димерным и/или тримерным комплексом HLA-G β2М МНС I (включающим последовательность SEQ ID NO: 43), более чем на 50% (в одном варианте более чем на 80%) (по сравнению со связыванием без антитела) (см. пример 4b), и/илиg) inhibits ILT2 binding to the monomeric and/or dimeric and/or trimeric HLA-G β2M MHC I complex (comprising the sequence of SEQ ID NO: 43) by more than 50% (in one embodiment, more than 80%) (versus with binding without antibody) (see example 4b), and/or
h) ингибирует связывание (с HLA-G) с клетками JEG3 (АТСС No. НТВ36), и/илиh) inhibits binding (to HLA-G) to JEG3 cells (ATCC No. HTB36), and/or
i) связывается (с HLA-G) на клетках JEG3 (АТСС No. НТВ36) (см. пример 5), и ингибирует связывание ILT2 (с HLA-G) на клетках JEG3 (АТСС No. НТВ36) (более чем на 50% (в одном варианте более чем на 80%)) (по сравнению со связыванием без антитела) (см. пример 6), и/илиi) binds (to HLA-G) on JEG3 cells (ATCC No. HTB36) (see example 5), and inhibits ILT2 binding (to HLA-G) on JEG3 cells (ATCC No. HTB36) (greater than 50% (in one embodiment, more than 80%)) (compared to binding without antibody) (see example 6), and/or
j) ингибирует связывание CD8a с HLAG более чем на 80% (по сравнению со связыванием без антитела) (см. пример 4с).j) inhibits CD8a binding to HLAG by more than 80% (compared to binding without antibody) (see example 4c).
В одном варианте анти-HLA-G антитело представляет собой изотип IgG1.In one embodiment, the anti-HLA-G antibody is an IgG1 isotype.
В другом варианте антитело представляет собой изотип IgG1 с мутациями L234A, L235A и P329G (нумерация согласно EU индексу Кабата).In another embodiment, the antibody is an IgG1 isotype with mutations L234A, L235A and P329G (numbering according to Kabat's EU index).
В еще одном варианте анти-HLA-G антитело ингибирует связывание ILT2 с мономерным комплексом HLA-G β2М МНС I.In yet another embodiment, the anti-HLA-G antibody inhibits ILT2 binding to the HLA-G β2M MHC I monomeric complex.
В одном варианте анти-HLA-G антитело по настоящему изобретению представляет собой моноклональное антитело.In one embodiment, the anti-HLA-G antibody of the present invention is a monoclonal antibody.
В другом варианте анти-HLA-G антитело по настоящему изобретению представляет собой гуманизированное или гибридное антитело человека.In another embodiment, the anti-HLA-G antibody of the present invention is a humanized or hybrid human antibody.
В еще одном варианте анти-HLA-G антитело по настоящему изобретению, которое является фрагментом антитела, который связывается с HLA-G.In yet another embodiment, an anti-HLA-G antibody of the present invention, which is an antibody fragment that binds to HLA-G.
В одном варианте анти-HLA-G антитело по настоящему изобретению представляет собой Fab фрагмент.In one embodiment, the anti-HLA-G antibody of the present invention is a Fab fragment.
В изобретении предлагается выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по любому из предшествующих пунктов.The invention provides an isolated nucleic acid encoding an antibody according to any one of the preceding claims.
В изобретении предлагается клетка хозяина, включающая указанную нуклеиновую кислоту.The invention provides a host cell comprising said nucleic acid.
В изобретении предлагается способ продуцирования антител, включающий культивирование клетки хозяина таким образом, чтобы клетки продуцировали антитело.The invention provides a method for producing antibodies, comprising culturing a host cell such that the cells produce an antibody.
В изобретении предлагается указанный способ получения антитела, дополнительно включающий выделение антитела из клетки хозяина.The invention provides said method for producing an antibody, further comprising isolating the antibody from a host cell.
В изобретении предлагается фармацевтический состав, включающий антитело, описанное в данном контексте, и фармацевтически приемлемый носитель.The invention provides a pharmaceutical composition comprising an antibody as described herein and a pharmaceutically acceptable carrier.
В изобретении предлагается антитело, описанное в данном контексте, для применения в качестве лекарственного средства.The invention provides an antibody described in this context for use as a drug.
В изобретении предлагается антитело, описанное в данном контексте, для применения при лечении рака.The invention provides an antibody as described herein for use in the treatment of cancer.
В изобретении предлагается применение антитела, описанного в данном контексте, при получении лекарственного средства. В одном варианте лекарственное средство предназначено для лечения рака.The invention proposes the use of an antibody described in this context in the preparation of a medicinal product. In one embodiment, the drug is for the treatment of cancer.
В изобретении предлагается способ лечения индивидуума, страдающего от рака, включающий введение индивидууму эффективного количества антитела, описанного в данном контексте.The invention provides a method of treating a subject suffering from cancer, comprising administering to the subject an effective amount of an antibody as described herein.
В настоящем изобретении используют специально разработанные гибридные антигены и/или строгие скрининговые анализы для идентификации HLA-G-специфических антител среди множества кандидатов (исключая перекрестную реактивность к другим соединениям комплекса МНС класса I и в то же время выбирая антитела, блокирующие рецептор HLA-G (такой как ILT2), которые проявляют HLA-G-специфичную индукцию (восстановление) TNF-α в совместно культивируемых культурах экспрессирующих HLA-G клетках JEG-3 и моноцитах. В результате использования таких скрининговых методов, описанных в данном контексте, были выбраны новые анти-HLA-G антитела. Эти антитела проявляют высоко вариабельные свойства, такие как значительное ингибирование связывания ILT2 с HLA-G, который экспрессируется на клетках JEG-3, или ингибирование связывания ILT2 с мономерным и/или димерным и/или тримерным комплексом ILT2 ВβМ МНС I.The present invention uses specially designed fusion antigens and/or stringent screening assays to identify HLA-G specific antibodies from a variety of candidates (eliminating cross-reactivity to other MHC class I complex compounds while still selecting antibodies that block the HLA-G receptor ( such as ILT2) that exhibit HLA-G-specific induction (reduction) of TNF-α in co-cultured cultures of HLA-G expressing JEG-3 cells and monocytes. -HLA-G Antibodies These antibodies exhibit highly variable properties such as significant inhibition of ILT2 binding to HLA-G, which is expressed on JEG-3 cells, or inhibition of ILT2 binding to the ILT2 monomeric and/or dimeric and/or trimeric ILT2 BβM MHC complex. I.
В изобретении предлагаются антитела, которые специфически связываются с HLA-G человека, ингибируют связывание ILT2 с HLAG, и восстанавливают HLA-G-специфичный пониженный иммунный ответ, восстанавливают индуцированные липополисахаридом (LPS) продуцирование/секрецию TNF-α моноцитами в совместно культивируемых культурах экспрессирующих HLA-G клеток (например, клетки JEG-3). Восстановление действительно HLA-G-специфичного подавления иммунного ответа моноцитов HLA-G-экспрессирующими клетками, такими как клетки JEG-3, можно оценивать по сравнению с HLA-G нокаутными клетками JEG-3.The invention provides antibodies that specifically bind to human HLA-G, inhibit ILT2 binding to HLAG, and restore an HLA-G-specific reduced immune response, restore lipopolysaccharide (LPS)-induced TNF-α production/secretion by monocytes in co-cultured cultures expressing HLA -G cells (eg, JEG-3 cells). Restoration of truly HLA-G-specific suppression of the monocyte immune response by HLA-G expressing cells, such as JEG-3 cells, can be assessed in comparison to HLA-G knockout JEG-3 cells.
Таким образом, антитела по изобретению восстанавливают HLA-G-специфичное высвобождение TNF-α в стимулированных липополисахаридом (LPS) совместно культивируемых культурах, экспрессирующих HLA-G клетках JEG-3 и моноцитах по сравнению с необработанными совместно культивируемыми клетками JEG-3 (в качестве отрицательного контроля использовали необработанные клетки, 0%, в качестве положительного контроля использовали культуры только моноцитов, 100%, в которых высвобождение TNF-альфа не подавляется любыми HLA-G/IL-Т2-специфичными эффектами (см. пример 7).Thus, the antibodies of the invention restore HLA-G-specific TNF-α release in lipopolysaccharide (LPS) stimulated co-cultures, HLA-G-expressing JEG-3 cells and monocytes compared to untreated co-cultured JEG-3 cells (as negative untreated cells, 0% were used as controls, monocyte cultures only, 100%, in which TNF-alpha release is not suppressed by any HLA-G/IL-T2-specific effects, were used as a positive control (see example 7).
Кроме того антитела являются высоко специфичными и не проявляют перекрестную реактивность в отношении комплексов HLA-A МНС I или МНС I мыши или крысы.In addition, the antibodies are highly specific and do not cross-react with mouse or rat MHC I or MHC I HLA-A complexes.
Описание фигурDescription of figures
На фигуре 1 представлены различные изоформы HLA-G.The figure 1 shows the various isoforms of HLA-G.
На фигуре 2А представлено схематическое изображение структуры HLA-G, связанного с β2М.Figure 2A is a schematic representation of the structure of HLA-G associated with β2M.
На фигуре 2Б представлена структура молекулы HLA-G, связанного с определенными рецепторами: структура HLA-G в комплексе с данными рецепторами, такими как ILT4 и KIR2DL1. Структура ILT4 (код PDB: 2DYP). Структура KIR2DL1 соответствует коду PDB 1IM9 (структура комплекса KIR2DL1: HLA-Cw4) и расположена на структуре HLA-G при наложении структур HLA-Cw4 и HLA-G. Рецепторы показаны с использованием ленточного представления, HLA-G показан с использованием представления молекулярной поверхности. Остатки HLA-G, которые являются уникальными или консервативными в других паралогах HLA, окрашены белым и серым цветом, соответственно. Уникальные поверхностные остатки замещены на консенсусную последовательность HLA в гибридном контрантигене.The figure 2B shows the structure of the HLA-G molecule associated with certain receptors: the structure of HLA-G in complex with these receptors, such as ILT4 and KIR2DL1. ILT4 structure (PDB code: 2DYP). The KIR2DL1 structure corresponds to the PDB 1IM9 code (the structure of the KIR2DL1 complex: HLA-Cw4) and is located on the HLA-G structure when the HLA-Cw4 and HLA-G structures are superimposed. Receptors are shown using ribbon representation, HLA-G is shown using molecular surface representation. HLA-G residues that are unique or conserved across other HLA paralogs are colored white and gray, respectively. The unique surface residues are replaced by the HLA consensus sequence in the hybrid counterantigen.
На фигуре 3 представлены антитела HLA-G, которые ингибируют (или стимулируют) взаимодействие/связывание HLA-G с ILT2 и ILT4, а также с CD8:Figure 3 shows HLA-G antibodies that inhibit (or stimulate) HLA-G interaction/binding with ILT2 and ILT4 as well as CD8:
Фиг. 3А: ингибирование ILT2Fig. 3A: ILT2 inhibition
Фиг. 3Б: ингибирование ILT4Fig. 3B: ILT4 inhibition
Фиг. 3В: ингибирование CD8.Fig. 3B: CD8 inhibition.
На фигуре 4 представлен анализ проточной цитометрией экспрессии HLA-G на поверхности клетки с использованием антител HLA-G на клетках JEG-3 (клетки, природно экспрессирующие HLA-G), клетках SKOV-3 (клетки дикого типа (wt) по сравнению с HLA-G-трансфектированными клетками (HLAG+)), и клетки PA-TU-8902 (дикого типа (wt) по сравнению HLA-G-трансфектированными клетками (HLAG+)):Figure 4 shows flow cytometry analysis of cell surface HLA-G expression using HLA-G antibodies on JEG-3 cells (cells naturally expressing HLA-G), SKOV-3 cells (wild type (wt) cells compared to HLA -G-transfected cells (HLAG+)), and PA-TU-8902 cells (wild-type (wt) vs. HLA-G-transfected (HLAG+) cells):
фиг. 4А: HLA-G-0031 (#0031), фиг. 4Б: HLA-G-0039 (#0039),fig. 4A: HLA-G-0031 (#0031), FIG. 4B: HLA-G-0039 (#0039),
фиг. 4В: HLA-G-0041 (#0041), фиг. 4Г: HLA-G-0090 (#0090).fig. 4B: HLA-G-0041 (#0041), FIG. 4D: HLA-G-0090 (#0090).
Фиг. 5Fig. 5
Фиг. 5А: анти-HLA-G антитела (0031, 0039, 0041 и 0090) блокируют/модулируют взаимодействие гибридного ILT2 Fc с HLA-G, экспрессируемым на клетках JEG3:Fig. 5A: Anti-HLA-G antibodies (0031, 0039, 0041 and 0090) block/modulate the interaction of the hybrid ILT2 Fc with HLA-G expressed on JEG3 cells:
Окрашивание HLA-G на клеточной поверхности новыми анти-HLA-G антителами оценивали с использованием антикрысиных вторичных антител IgG, конъюгированных с Alexa488 (верхний ряд). На гистограммах FACS показаны клетки, окрашенные только вторичным антителом (серые пунктирные линии), и клетки, окрашенные анти-HLA-G антителами (черные сплошные линии). В нижнем ряду изображен ILT2-Fc человека, связанный с HLA-G на клетках JEG3 (черная пунктирная линия) по сравнению с клетками, окрашенными только вторичными антителами (серая пунктирная линия). Можно увидеть влияние предварительной инкубации клеток JEG3 с на связывание с гибридным ILT2-Fc (черная сплошная линия): HLA-G-0031 и HLA-G-0090 характеризуются почти полным ингибированием связывания гибридного ILT2-Fc с клетками JEG3. Интересно отметить, что два антитела 0039 и 0041 даже повышают связывание ILT2:fc с клетками.Cell surface HLA-G staining with novel anti-HLA-G antibodies was assessed using Alexa488-conjugated anti-rat IgG secondary antibodies (top row). FACS histograms show cells stained with secondary antibody only (gray dotted lines) and cells stained with anti-HLA-G antibodies (solid black lines). The bottom row depicts human ILT2-Fc bound to HLA-G on JEG3 cells (black dotted line) compared to cells stained with secondary antibodies alone (gray dotted line). The effect of preincubation of JEG3 cells on binding to fusion ILT2-Fc can be seen (solid black line): HLA-G-0031 and HLA-G-0090 show almost complete inhibition of fusion ILT2-Fc binding to JEG3 cells. Interestingly, the two
Фиг. 5Б: Влияние коммерческих/стандартных анти-HLA-G антител на связывание гибридного ILT2-Fc с HLA-G на клетках JEG3:Fig. 5B: Effect of commercial/standard anti-HLA-G antibodies on fusion ILT2-Fc binding to HLA-G on JEG3 cells:
Окрашивание HLA-G на клеточной поверхности коммерческими/стандартными анти-HLA-G антителами оценивали с использованием видоспецифичных вторичных антител, конъюгированных с Alexa488 (верхний ряд). На гистограммах FACS показаны клетки, окрашенные только вторичным антителом (серые пунктирные линии), и клетки, окрашенные анти-HLA-G антителами(черные сплошные линии). В нижнем ряду изображен гибридный ILT2-Fc человека, связанный с HLA-G на клетках JEG3 (черная пунктирная линия) по сравнению с клетками, окрашенными только вторичным антителом (серая пунктирная линия). Можно увидеть влияние предварительной инкубации клеток JEG3 со стандартными антителами на связывание с гибридным ILT2-Fc (черная сплошная линия). Ни одно из исследованных стандартных антител не блокировало взаимодействие гибридного ILT2-Fc с HLA-G на клеточной поверхности JEG3.Cell surface HLA-G staining with commercial/standard anti-HLA-G antibodies was assessed using Alexa488-conjugated species-specific secondary antibodies (top row). FACS histograms show cells stained with secondary antibody only (gray dotted lines) and cells stained with anti-HLA-G antibodies (solid black lines). Bottom row depicts human ILT2-Fc fusion bound to HLA-G on JEG3 cells (black dotted line) compared to cells stained with secondary antibody alone (gray dotted line). You can see the effect of pre-incubation of JEG3 cells with standard antibodies on binding to hybrid ILT2-Fc (solid black line). None of the tested standard antibodies blocked the interaction of hybrid ILT2-Fc with HLA-G on the JEG3 cell surface.
Фиг. 6Fig. 6
Влияние блокировки HLA-G ингибирующими анти-HLA-G антителами на восстановление продуцирования TNFα, которое оценивали на различных донорах.The effect of blocking HLA-G by inhibitory anti-HLA-G antibodies on the recovery of TNFα production, which was evaluated in various donors.
Фиг. 6А: анти-HLA-G антитела, HLA-G-0031 (#0031), HLA-G-0039 (#0039), и HLA-G-0041 (#0041), оценивали на репрезентативном доноре моноцитов.Fig. 6A: Anti-HLA-G antibodies, HLA-G-0031 (#0031), HLA-G-0039 (#0039), and HLA-G-0041 (#0041), were evaluated on a representative monocyte donor.
Фиг. 6Б: анти-HLA-G антитела, HLA-G-0090 (#0090)], оценивали на различных донорах моноцитов.Fig. 6B: anti-HLA-G antibodies, HLA-G-0090 (#0090)], were evaluated in various monocyte donors.
Фиг. 6В: Анализ экспрессии HLAG в клетках JEG3 дикого типа и нокдаун-вариантов с использованием метода вестерн-блота.Fig. 6B: Analysis of HLAG expression in JEG3 cells of wild type and knockdown variants using Western blot method.
Подробное описание настоящего изобретенияDetailed description of the present invention
Использованные в данном контексте термины "HLA-G", " HLA-G человека" относятся к главному комплексу гистосовместимости человека, класса I, G, известному также как лейкоцитарный антиген G (HLA-G) (например, последовательность SEQ ID NO: 35). Обычно HLA-G образует комплекс МНС класса I совместно с β2 микроглобулином (В2М или β2m). В одном варианте осуществления HLA-G относится к комплексу МНС класса I HLA-G и β2 микроглобулина.As used herein, the terms "HLA-G", "Human HLA-G" refer to human major histocompatibility complex, class I, G, also known as leukocyte antigen G (HLA-G) (e.g., sequence SEQ ID NO: 35) . Typically, HLA-G forms an MHC class I complex with β2 microglobulin (B2M or β2m). In one embodiment, HLA-G refers to a class I MHC complex of HLA-G and β2 microglobulin.
Использованные в данном контексте термины антитело, "связывающееся с HLA-G человека", "специфически связывающееся с HLA-G человека", «которое связывается с HLA-G человека» или «анти-HLA-G антитело» относятся к антителу, специфически связывающемуся с антигеном HLA-G человека или его внеклеточным доменом (ECD), причем связывающая аффинность, то есть значение KD составляет 5,0×10-8 моль/л или менее, в одном варианте значение KD составляет 1,0×10-9 моль/л или менее, в другом варианте значение KD составляет от 5,0×10-8 моль/л до 1,0×10-13 моль/л. В еще одном варианте антитело связывается с комплексом HLA-G β2М МНС I, включающим последовательность SEQ ID NO: 43).As used herein, the terms "antibody that binds to human HLA-G", "specifically binds to human HLA-G", "which binds to human HLA-G", or "anti-HLA-G antibody" refer to an antibody that specifically binds with the human HLA-G antigen or its extracellular domain (ECD), and the binding affinity, that is, the K D value is 5.0×10 -8 mol/l or less, in one embodiment, the K D value is 1.0×10 - 9 mol/l or less, in another embodiment, the value of K D is from 5.0×10 -8 mol/l to 1.0×10 -13 mol/l. In yet another embodiment, the antibody binds to the HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 43).
Связывающую аффинность определяют стандартным методом анализа связывания, таким как поверхностный плазмонный резонанс (BIAcore®, GE-Healthcare Uppsala, Швеция), например, с использованием конструктов, включающих внеклеточный домен HLA-G (например, в составе его природной тримерной структуры). В одном варианте связывающую аффинность определяют стандартным методом анализа связывания с использованием типичного растворимого комплекса HLA-G, включающего комплекс МНС класса I, включающий последовательность SEQ ID NO: 43.Binding affinity is determined by a standard binding assay, such as surface plasmon resonance (BIAcore®, GE-Healthcare Uppsala, Sweden), for example, using constructs that include the extracellular domain of HLA-G (for example, as part of its natural trimeric structure). In one embodiment, binding affinity is determined by a standard binding assay using a typical soluble HLA-G complex comprising an MHC class I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 43.
HLA-G характеризуется повторяющимся изгибом МНС I и состоит из двух цепей: цепь 1 состоит из трех доменов: α 1, α 2 и α 3. Домены α 1 и α 2 образуют бороздку для связывания пептида, фланкированную двумя α-спиралями. Небольшие пептиды (приблизительно 9-членные) могут связываться с этой бороздкой, как и другие белки МНС I. Цепь 2 является β-2 микроглобулином, сходным с другими белками МНС I.HLA-G is characterized by a repetitive MHC I fold and consists of two strands:
HLA-G может формировать олигомерные структуры функционально активного комплекса (Kuroki, К и др., Eur J Immunol. 37, 1727-1729 (2007)). Связанные дисульфидной связью димеры образуются за счет дисульфидной связи между остатками Cys 42 двух молекул HLA-G (Shiroishi М и др., J Biol Chem 281, 10439-10447 (2006)). Тримерные и тетрамерные комплексы описаны также в статьях Kuroki К и др. Eur J Immunol. 37 1727-1729 (2007), Allan D.S. и др. J Immunol Methods, 268, 43-50 (2002) и T Gonen-Gross и др., J Immunol 171 1343-1351 (2003). В статье Boyson и др., Proc Nat Acad Sci USA, 99: 16180 (2002) указано, что рекомбинантная растворимая форма HLA-G5 может образовывать связанный дисульфидной связью димер, а именно содержащий межмолекулярную дисульфидную связь Cys42-Cys42. Кроме того, связанная с мембраной форма HLA-G1 также может образовывать связанный дисульфидной связью димер на клеточной поверхности линии клеток Jeg3, которые эндогенно экспрессируют HLA-G. Связанные дисульфидной связью формы HLA-G1 и HLA-G5 можно также обнаружить на клеточной поверхности трофобластов (Apps, R., Tissue Antigens, 68:359 (2006)).HLA-G can form oligomeric structures of a functionally active complex (Kuroki, K et al., Eur J Immunol. 37, 1727-1729 (2007)). Disulfide-linked dimers are formed by a disulfide bond between Cys 42 residues of two HLA-G molecules (Shiroishi M et al., J Biol Chem 281, 10439-10447 (2006)). Trimeric and tetrameric complexes are also described in the articles by Kuroki K et al. Eur J Immunol. 37 1727-1729 (2007), Allan D.S. et al. J Immunol Methods, 268, 43-50 (2002) and T Gonen-Gross et al., J Immunol 171 1343-1351 (2003). Boyson et al., Proc Nat Acad Sci USA, 99: 16180 (2002) indicate that a recombinant soluble form of HLA-G5 can form a disulfide-linked dimer, namely a Cys42-Cys42 intermolecular disulfide bond. In addition, the membrane-bound form of HLA-G1 can also form a disulfide-linked dimer on the cell surface of the Jeg3 cell line, which endogenously express HLA-G. Disulfide-linked forms of HLA-G1 and HLA-G5 can also be found on the cell surface of trophoblasts (Apps, R., Tissue Antigens, 68:359 (2006)).
HLA-G преимущественно экспрессируется на цитотрофобластах в плаценте. Некоторые опухоли (включая рак поджелудочной железы, молочной железы, кожи, колоректальный рак, рак желудка и яичников) экспрессируют HLA-G (Lin А. и др., Mol Med. 21, 782-791 (2015), Amiot L. и др., Cell Mol Life Sci. 68, 417-431 (2011)). Описано также, что экспрессия связана с патологическими состояниями, такими как воспалительные заболевания, реакция «трансплантат против хозяина» (GvHD) и рак. Описано так же, что экспрессия HLA-G связана с неблагоприятным прогнозом при раке. Раковые клетки уклоняются от иммунного надзора хозяина за счет индукции толерантности/подавления иммунного ответа благодаря экспрессии HLA-G.HLA-G is predominantly expressed on cytotrophoblasts in the placenta. Some tumors (including pancreatic, breast, skin, colorectal, gastric and ovarian cancers) express HLA-G (Lin A. et al., Mol Med. 21, 782-791 (2015), Amiot L. et al. ., Cell Mol Life Sci 68, 417-431 (2011)). Expression has also been described to be associated with pathological conditions such as inflammatory diseases, graft-versus-host disease (GvHD), and cancer. It has also been described that HLA-G expression is associated with a poor prognosis in cancer. Cancer cells evade the host's immune surveillance by inducing tolerance/suppressing the immune response through HLA-G expression.
HLA-G существует в семи изоформах, 3 из которых представляют собой секретируемые формы, а остальные 4 представляют собой связанные с мембраной формы (как показано на схеме, фиг. 1). Наиболее функциональные изоформы HLA-G включают HLA-G1 и HLA-G5, ассоциированные с β-2 микроглобулином. Однако толерогенный иммунный эффект (вызывающий иммунную толерантность) этих изоформ различается и зависит от формы лиганда (мономер, димер) и от аффинности взаимодействия лигандов с рецептором.HLA-G exists in seven isoforms, 3 of which are secreted forms and the remaining 4 are membrane-bound forms (as shown in the diagram, Fig. 1). The most functional isoforms of HLA-G include HLA-G1 and HLA-G5 associated with β-2 microglobulin. However, the tolerogenic immune effect (causing immune tolerance) of these isoforms differs and depends on the form of the ligand (monomer, dimer) and on the affinity of the interaction of the ligands with the receptor.
Белок HLA-G можно получить с использованием стандартных технологий молекулярной биологии. Нуклеотидная последовательность изоформ HLA-G известна в данной области техники. См., например, GENBANK Accession No. AY359818.The HLA-G protein can be obtained using standard molecular biology techniques. The nucleotide sequence of HLA-G isoforms is known in the art. See, for example, GENBANK Accession No. AY359818.
Изомерные формы HLA-G ускоряют передачу сигнала через рецепторы ILT, прежде всего ILT2, ILT4 или их комбинации.Isomeric forms of HLA-G accelerate signal transduction through ILT receptors, primarily ILT2, ILT4, or combinations thereof.
Рецепторы ILT: ILT представляют собой активирующие и ингибирующие рецепторы типа Ig, которые принимают участие в регуляции активации иммунных клеток и контроле функции иммунных клеток (Borges L., и др., Curr Top Microbial Immunol, 244:123-136 (1999)). ILT разделяют на три группы категорий: (i) ингибирующие, то есть содержащие ингибирующий мотив на основе тирозина (ITIM) цитоплазматического иммунорецептора, и трансдуцирующий ингибирующий сигнал (ILT2, ILT3, ILT4, ILT5 и LIR8); (ii) активирующие, то есть содержащие короткий цитоплазматический хвост и заряженный аминокислотный остаток в трансмембранном домене (ILT1, ILT7, ILT8 и LIR6α), и доставляющий активирующий сигнал через активирующий мотив на основе тирозина (ITAM) цитоплазматического иммунорецептора в составе ассоциированной общей γ-цепи Fc рецептора, и (iii) растворимое соединение ILT6 с отсутствующим трансмембранным доменом. В результате ряда недавних исследований была выявлена иммунорегуляторная роль ILT на поверхности антигенпрезентирующих клеток (АРС). Рецепторы ILT2, ILT3 и ILT4, наиболее характерные рецепторы ингибирования иммунного ответа, экспрессируются преимущественно на миелоидных и плазмоцитоидных DC (дендритных клетках). Уровень экспрессии ILT3 и ILT4 повышается при воздействии на незрелые DC известных иммунодепрессивных факторов, включая IL-10, витамин D3, или супрессивные CD8 Т клетки (Chang С.С. и др., Nat Immunol, 3:237-243 (2002)). Экспрессия ILT на DC строго контролируется воспалительными стимулами, цитокинами и факторами роста, а также регулируется с понижением активности после активации DC (Ju X.S., и др., Gene, 331:159-164 (2004)). Экспрессия рецепторов ILT2 и ILT4 в значительной степени регулируется активацией гистонов, что вносит вклад в строго контролируемую экспрессию генов исключительно в клетках миелоидной линии (Nakajima Н., J Immunol, 171:6611-6620 (2003)).ILT receptors: ILT are activating and inhibitory Ig type receptors that are involved in the regulation of immune cell activation and control of immune cell function (Borges L., et al., Curr Top Microbial Immunol, 244:123-136 (1999)). ILTs are divided into three groups of categories: (i) inhibitory, ie containing an inhibitory motif based on tyrosine (ITIM) of the cytoplasmic immunoreceptor, and a transducing inhibitory signal (ILT2, ILT3, ILT4, ILT5 and LIR8); (ii) activating, i.e. containing a short cytoplasmic tail and a charged amino acid residue in the transmembrane domain (ILT1, ILT7, ILT8 and LIR6α), and delivering an activating signal through the tyrosine-based activating motif (ITAM) of the cytoplasmic immunoreceptor as part of the associated common γ-chain receptor Fc, and (iii) a soluble ILT6 compound lacking the transmembrane domain. As a result of a number of recent studies, the immunoregulatory role of ILT on the surface of antigen-presenting cells (APC) has been identified. The ILT2, ILT3 and ILT4 receptors, the most characteristic immune response inhibition receptors, are predominantly expressed on myeloid and plasmacytoid DCs (dendritic cells). Expression levels of ILT3 and ILT4 are increased when immature DCs are exposed to known immunosuppressive factors, including IL-10, vitamin D3, or suppressive CD8 T cells (Chang C.C. et al., Nat Immunol, 3:237-243 (2002)) . ILT expression on DCs is tightly controlled by inflammatory stimuli, cytokines, and growth factors, and is downregulated upon DC activation (Ju X.S., et al., Gene, 331:159-164 (2004)). The expression of ILT2 and ILT4 receptors is largely regulated by histone activation, which contributes to tightly controlled gene expression exclusively in myeloid cells (Nakajima H., J Immunol, 171:6611-6620 (2003)).
Занятость ингибирующих рецепторов ILT2 и ILT4 изменяет профиль секреции/высвобождения цитокинов и хемокинов из моноцитов и может ингибировать передачу сигнала рецептором Fc (Colonna М., и др. J Leukoc Biol, 66:375-381 (1999)). Роль и функция ILT3 на клетках DC подробно описана группой авторов (Suciu-Foca N., Int Immunopharmacol, 5:7-11 (2005)). Хотя лиганд для ILT3 не известен, в отношении ILT4 известно, что он связывается с третьим доменом молекул HLA класса I (HLA-A, HLA-B, HLA-C и HLA-G), конкурируя с CD8 для связывания МНС класса I (Shiroishi М., Proc Natl Acad Sci USA, 100:8856-8861 (2003)). Предпочтительным лигандом для нескольких ингибирующих рецепторов ILT является HLA-G. HLA-G играет потенциальную роль в переносимости системы мать-плод и в механизмах уклонения опухолевых клеток от распознавания и разрушения в ходе иммунного ответа (Hunt J.S. и др., Faseb J, 19:681-693 (2005)). Наиболее вероятно, что регуляция функции DC за счет взаимодействий HLA-G- ILT является важным путем в биологии DC. Было установлено, что DC, полученные из моноцитов человека, которые в значительной степени экспрессируют рецепторы ILT2 и ILT, при обработке комплексом HLA-G и стимуляции аллогенными Т клетками, все еще восстанавливают устойчивый толерогенно-подобный фенотип (CD80low, CD86low, HLA-DRlow) со способностью индуцировать толерантность Т клеток (Ristich V. и др., Eur J Immunol, 35:1133-1142 (2005)). Более того, взаимодействие HLA-G с DC, которые в значительной степени экспрессируют рецепторы ILT2 и ILT4, приводит к регуляции с понижением активности некоторых генов, включенных в путь презентации комплекса МНС класса II. Активность лизосомальной тиолредуктазы, γ-IFN-индуцируемой лизосомальной тиолредуктазы (GILT), обильно экспрессируемой профессиональными АРС, в значительной степени снижается в HLA-G-модифицированных DC. На репертуар первичных CD4+ Т клеток может влиять экспрессия GILT клетками DC, так как ответ Т клеток in vivo для выбора антигенов снижается у животных, у которых отсутствует GILT после разрушения генов-мишеней (Marie М. и др., Science, 294:1361-1365 (2001)). Взаимодействие HLA-G/ILT на DC нарушает сборку на клеточной поверхности и транспорт комплексов МНС класса II к клеточной поверхности, что может привести к менее эффективной презентации или экспрессии структурно аномальных комплексов МНС класса II. Было установлено, что HLA-G заметно снижает транскрипцию инвариантной цепи (CD74), генов HLA-DMA, и HLA-DMB на полученных из моноцитов человека DC, в значительной степени экспрессирующих ингибирующие рецепторы ILT (Ristich V. и др., Eur J Immunol 35:1133-1142 (2005)).Occupancy of inhibitory ILT2 and ILT4 receptors alters the secretion/release profile of cytokines and chemokines from monocytes and can inhibit Fc receptor signaling (Colonna, M., et al., J Leukoc Biol, 66:375-381 (1999)). The role and function of ILT3 on DC cells has been described in detail by a group of authors (Suciu-Foca N., Int Immunopharmacol, 5:7-11 (2005)). Although a ligand for ILT3 is not known, for ILT4 it is known to bind to the third domain of HLA class I molecules (HLA-A, HLA-B, HLA-C and HLA-G), competing with CD8 to bind MHC class I (Shiroishi M., Proc Natl Acad Sci USA, 100:8856-8861 (2003)). The preferred ligand for several ILT inhibitory receptors is HLA-G. HLA-G plays a potential role in the tolerance of the mother-fetus system and in the mechanisms of tumor cell evasion from recognition and destruction during the immune response (Hunt J.S. and others, Faseb J, 19:681-693 (2005)). It is most likely that the regulation of DC function through HLA-G-ILT interactions is an important pathway in DC biology. It has been found that human monocyte-derived DCs that heavily express both ILT2 and ILT receptors, when treated with the HLA-G complex and stimulated with allogeneic T cells, still restore a robust tolerogenic-like phenotype (CD80low, CD86low, HLA-DRlow) with the ability to induce T cell tolerance (Ristich V. et al., Eur J Immunol, 35:1133-1142 (2005)). Moreover, the interaction of HLA-G with DCs, which heavily express the ILT2 and ILT4 receptors, results in down-regulation of the activity of several genes involved in the class II MHC complex presentation pathway. The activity of the lysosomal thiol reductase, γ-IFN-induced lysosomal thiol reductase (GILT), abundantly expressed by professional APCs, is significantly reduced in HLA-G-modified DCs. The repertoire of primary CD4+ T cells can be affected by GILT expression by DCs, as the in vivo T cell response to antigen selection is reduced in animals lacking GILT after disruption of target genes (Marie M. et al., Science, 294:1361- 1365 (2001)). HLA-G/ILT interaction on DC impairs cell surface assembly and transport of MHC class II complexes to the cell surface, which may result in less efficient presentation or expression of structurally abnormal MHC class II complexes. HLA-G has been found to markedly downregulate transcription of the invariant chain (CD74), HLA-DMA, and HLA-DMB genes on human monocyte-derived DCs that heavily express inhibitory ILT receptors (Ristich V. et al., Eur J Immunol 35:1133-1142 (2005)).
Другим рецептором HLA-G является KIR2DL4, так как KIR2DL4 связывается с клетками, экспрессирующими HLA-G (US2003232051; Cantoni С.и др., Eur J Immunol 28 (1998) 1980; Rajagopalan S. и E. О. Long, [список опечаток опубликован в журнале J Exp Med 191 2027 (2000), J Exp Med 189 1093 (1999); Ponte M. и др. PNAS USA 96 5674 (1999)). KIR2DL4 (так же называемый 2DL4) является членом семейства KIR (также обозначаемый CD158d), причем этот рецептор характеризуется сходством структурных признаков как с активирующими, так и с ингибирующими рецепторами (Selvakumar А. и др. Tissue Antigens 48 285 (1996)). 2DL4 содержит цитоплазматический ITIM, что свидетельствует об ингибирующей функции, и положительно заряженную аминокислоту в трансмембранной области, то есть признак, типичный для активации KIR. В отличии от других клонально распределенных KIR, 2DL4 транскрибируется всеми клетками NK (Valiante N.М. и др., Immunity 7 739 (1997); Cantoni С. и др., Eur J Immunol 28 1980 (1998), Rajagopalan S. и E.О. Long, [список опечаток опубликован в журнале J Exp Med 191 2027 (2000)] J Exp Med 189 1093 (1999)).Another HLA-G receptor is KIR2DL4, since KIR2DL4 binds to cells expressing HLA-G (US2003232051; Cantoni C. et al., Eur J Immunol 28 (1998) 1980; Rajagopalan S. and E. O. Long, [list Errata published in J Exp Med 191 2027 (2000), J Exp Med 189 1093 (1999), Ponte M. et al. PNAS USA 96 5674 (1999)). KIR2DL4 (also referred to as 2DL4) is a member of the KIR family (also referred to as CD158d), with this receptor sharing structural features with both activating and inhibitory receptors (Selvakumar A. et al. Tissue Antigens 48 285 (1996)). 2DL4 contains the cytoplasmic ITIM, indicative of an inhibitory function, and a positively charged amino acid in the transmembrane region, a feature typical of KIR activation. Unlike other clonally distributed KIRs, 2DL4 is transcribed by all NK cells (Valiante N.M. et al.,
Было также установлено, что HLA-G взаимодействует с CD8 (Sanders и др., J. Exp. Med., 1991) на цитотоксичных Т клетках и индуцирует CD95-опосредованный апоптоз в активированных CD8, положительных цитотоксических Т клетках (Fournel и др., J. Immun., 2000). Об этом механизме удаления цитотоксических Т клеток сообщалось как об одном из механизмов уклонения от иммунного ответа и индукции толерантности при беременности, воспалительных заболеваниях и раке (Amodio G. и др., Tissue Antigens, 2014).It has also been found that HLA-G interacts with CD8 (Sanders et al., J. Exp. Med., 1991) on cytotoxic T cells and induces CD95-mediated apoptosis in activated CD8, positive cytotoxic T cells (Fournel et al., J. Immun., 2000). This mechanism for the removal of cytotoxic T cells has been reported as one of the mechanisms for immune response evasion and tolerance induction in pregnancy, inflammatory diseases, and cancer (Amodio G. et al., Tissue Antigens, 2014).
Использованный в данном контексте термин анти-HLA-G антитело, которое «не проявляет перекрестную реактивность с» или «специфически не связывается с» модифицированным комплексом HLA-G β2М МНС I человека, включающим SEQ ID NO: 44; комплексом H2Kd β2М МНС I мыши, включающим SEQ ID NO: 45, комплексом RT1A β2М МНС I крысы, включающим SEQ ID NO: 47, комплексом HLA-A2 β2М МНС I человека, включающим SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 37, означает, что анти-HLA-G антитело в основном не связывается с любым из этих ков. В одном варианте термин анти-HLA-G антитело, которое «не проявляет перекрестную реактивность с» или «специфически не связывается с» модифицированным комплексом HLA-G β2М МНС I человека, включающим SEQ ID NO: 44; комплексом H2Kd β2М МНС I мыши, включающим SEQ ID NO: 45, комплексом RT1A β2М МНС I крысы, включающим SEQ ID NO: 47, и/или комплексом HLA-A2 β2М МНС I человека, включающим SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 37, относится к анти-HLA-G антителу, которое характеризуется только неспецифическим связыванием, то есть связывающая аффинность, значение KD составляет 5,0×10-6 моль/л или более (до отсутствия детектирования связывающей активности). Связывающую аффинность определяют стандартным методом анализа связывания, таким как метод поверхностного плазмонного резонанса) (BIAcore®, GE-Healthcare Uppsala, Швеция), с использованием соответствующего антигена: модифицированный комплекс HLA-G β2М МНС I человека, включающий SEQ ID NO: 44; комплекс H2Kd β2М МНС I мыши, включающий SEQ ID NO: 45, комплекс RT1A β2М МНС I крысы, включающий SEQ ID NO: 47, и/или комплекс HLA-A2 β2М МНС I человека, включающий SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 37. Постановка анализа, а также конструкция/получение антигенов описаны в разделе Примеры.As used herein, the term anti-HLA-G antibody that "does not cross-react with" or "does not specifically bind to" a modified human HLA-G β2M MHC I complex comprising SEQ ID NO: 44; mouse H2Kd β2M MHC I complex comprising SEQ ID NO: 45, rat RT1A β2M MHC I complex comprising SEQ ID NO: 47, human HLA-A2 β2M MHC I complex comprising SEQ ID NO: 39 and SEQ ID NO: 37, means that the anti-HLA-G antibody does not substantially bind to any of these coves. In one embodiment, the term anti-HLA-G antibody that "does not cross-react with" or "does not specifically bind to" a modified human HLA-G β2M MHC I complex comprising SEQ ID NO: 44; mouse H2Kd β2M MHC I complex comprising SEQ ID NO: 45, rat RT1A β2M MHC I complex comprising SEQ ID NO: 47, and/or human HLA-A2 β2M MHC I complex comprising SEQ ID NO: 39 and SEQ ID NO : 37, refers to an anti-HLA-G antibody that is characterized only by non-specific binding, that is, binding affinity, the K D value is 5.0×10 -6 mol/l or more (before no detection of binding activity). Binding affinity is determined by a standard binding assay method such as surface plasmon resonance (BIAcore®, GE-Healthcare Uppsala, Sweden) using the appropriate antigen: modified human HLA-G β2M MHC I complex comprising SEQ ID NO: 44; mouse H2Kd β2M MHC I complex comprising SEQ ID NO: 45, rat RT1A β2M MHC I complex comprising SEQ ID NO: 47, and/or human HLA-A2 β2M MHC I complex comprising SEQ ID NO: 39 and SEQ ID NO : 37. Assay setup and antigen construction/preparation are described in the Examples section.
Термин «ингибирует связывание ILT2 с HLAG на клетках JEG-3 (АТСС НТВ36)" относится к ингибированию связывающего взаимодействия рекомбинантного ILT2 в ходе анализа, как описано, например, в примере 6.The term "inhibits binding of ILT2 to HLAG on JEG-3 cells (ATCC HTB36)" refers to the inhibition of the binding interaction of recombinant ILT2 during the assay, as described, for example, in example 6.
Термины «восстановление HLA-G-специфичного пониженного иммунного ответа» или «восстанавливают HLA-G-специфичный пониженный иммунный ответ» относятся к восстановлению индуцированного липополисахаридом (LPS) продуцирования TNF-α моноцитами в совместно культивируемых культурах экспрессирующих HLA-G клеток, прежде всего клеток JEG-3. Таким образом, антитела по изобретению восстанавливают HLA-G-специфичное высвобождение TNF-α в стимулированных липополисахаридом (LPS) совместно культивируемых культурах экспрессирующих HLA-G клеток JEG-3 (АТСС НТВ36) и моноцитов, по сравнению с необработанными совместно культивируемыми клетками JEG-3 (в качестве отрицательного контроля использовали необработанные клетки, 0%, в качестве положительного контроля использовали культуры только моноцитов, 100%, в которых высвобождение TNF-α не подавляется любыми HLA-G/IL-Т2-специфичными эффектами (см. пример 7). В этом контексте «HLA-G-специфичное подавление иммунного ответа» относится к подавлению иммунного ответа моноцитов за счет экспрессии HLA-G на клетках JEG-3. И наоборот, анти-HLA-G антитела по настоящему изобретению не способны восстанавливать иммунный ответ моноцитов в совместно культивируемых культурах клеток JEG-3 и нокаутных в отношении HLA-G. Так как другие коммерческие анти-HLA-G антитела способны индуцировать высвобождение TNF-α моноцитами в совместно культивируемых культурах клеток JEG-3, нокаутных в отношении HLA-G, эти антитела являются не-специфичными в отношении HLA-G-специфичного высвобождения TNF-α.The terms "restoration of an HLA-G-specific reduced immune response" or "restoration of an HLA-G-specific reduced immune response" refers to the restoration of lipopolysaccharide (LPS)-induced TNF-α production by monocytes in co-cultured cultures of HLA-G expressing cells, especially cells JEG-3. Thus, the antibodies of the invention restore HLA-G-specific TNF-α release in lipopolysaccharide (LPS) stimulated co-cultures of HLA-G-expressing JEG-3 cells (ATCC HTB36) and monocytes, compared to untreated co-cultured JEG-3 cells. (negative control was untreated cells, 0%, positive control was cultures of monocytes only, 100%, in which TNF-α release is not suppressed by any HLA-G/IL-T2-specific effects (see example 7). In this context, "HLA-G-specific suppression of the immune response" refers to the suppression of the immune response of monocytes by the expression of HLA-G on JEG-3 cells Conversely, the anti-HLA-G antibodies of the present invention are unable to restore the immune response of monocytes in co-cultured JEG-3 cell cultures and HLA-G knockout cells Since other commercial anti-HLA-G antibodies are able to induce the release of TNF-α by monocytes in co-cultured cultures of HLA-G knockout JEG-3 cells, these antibodies are non-specific for HLA-G specific TNF-α release.
Использованный в данном контексте термин «акцепторный каркасный участок (иммуноглобулина) человека» означает каркасный участок, включающий аминокислотную последовательность каркасной структуры вариабельного домена легкой цепи (VL) или каркасной структуры вариабельного домена тяжелой цепи (VH), полученные из каркасного участка иммуноглобулина человека или консенсусного каркасного участка человека, как описано ниже. Акцепторный каркасный участок человека, «полученный из» каркасного участка иммуноглобулина человека или консенсусного каркасного участка человека, может включать идентичную этим последовательностям аминокислотную последовательность, или может включать измененную аминокислотную последовательность. В некоторых вариантах осуществления изобретения число аминокислотных изменений составляет 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее, или 2 или менее. В других вариантах акцепторный каркасный участок VL человека идентичен последовательности каркасного участка VL человека или консенсусной последовательности акцепторным каркасного участка иммуноглобулина человека. Предпочтительным каркасным участком VH человека для гуманизированного варианта полученного антитела HLAG-0031 является вариант HUMAN_IGHV1-3. Предпочтительным акцепторным каркасным участком VL человека для гуманизированного варианта полученного антитела HLAG-0031 являются варианты HUMAN_IGKV1-17 (V домен, с одной дополнительной обратной мутацией в положении R46F, нумерация по Кабату).As used herein, "human (immunoglobulin) acceptor framework" means a framework comprising the amino acid sequence of a light chain variable domain (VL) framework or a heavy chain variable domain (VH) framework derived from a human immunoglobulin framework or a consensus framework. human site, as described below. A human acceptor framework region "derived from" a human immunoglobulin framework region or a human consensus framework region may include an amino acid sequence identical to these sequences, or may include an altered amino acid sequence. In some embodiments, the number of amino acid changes is 10 or less, 9 or less, 8 or less, 7 or less, 6 or less, 5 or less, 4 or less, 3 or less, or 2 or less. In other embodiments, the human VL acceptor framework is identical to the human VL framework sequence or the consensus sequence of the human immunoglobulin acceptor framework. The preferred human VH framework for the humanized variant of the resulting HLAG-0031 antibody is the HUMAN_IGHV1-3 variant. The preferred human VL acceptor framework for the humanized variant of the resulting HLAG-0031 antibody are the HUMAN_IGKV1-17 variants (V domain, with one additional backmutation at position R46F, Kabat numbering).
Термин «антитело» в данном контексте используется в самом широком смысле и включает различные структуры антител, включая, но, не ограничиваясь только ими, моноклональные антитела, поликлональные антитела мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела) и фрагменты антител, при условии, что они проявляют требуемую антигенсвязывающую активность.The term "antibody" in this context is used in the broadest sense and includes various antibody structures, including, but not limited to, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, multispecific antibodies (for example, bispecific antibodies) and antibody fragments, provided that they exhibit the desired antigen-binding activity.
Термин «фрагмент антитела» означает молекулу, отличающуюся от интактного антитела, включающую часть интактного антитела, которая связывается с антигеном, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антитела включают, но, не ограничиваясь только ими, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, диатела, линейные антитела, одноцепочечные антитела (например, scFv), и мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител.The term "antibody fragment" means a molecule other than an intact antibody, comprising a portion of the intact antibody that binds to the antigen to which the intact antibody binds. Examples of antibody fragments include, but are not limited to, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab') 2 , diabodies, linear antibodies, single chain antibodies (eg scFv), and multispecific antibodies derived from fragments of antibodies.
Термин «антитело, которое связывается с одним и тем же эпитопом», что и эталонное антитело, означает антитело, которое блокирует связывание эталонного антитела со своим антигеном по данным конкурентного анализа на 50% или более, и наоборот, эталонное антитело блокирует связывание антитела со своим антигеном по данным конкурентного анализа на 50% или более. Типичный конкурентный анализ описан в данном контексте.The term "antibody that binds to the same epitope" as a reference antibody means an antibody that blocks the binding of the reference antibody to its antigen by 50% or more, as determined by a competitive assay, and conversely, the reference antibody blocks the binding of the antibody to its own antigen. antigen according to competitive analysis by 50% or more. A typical competitive analysis is described in this context.
Термин «гибридный» означает антитело, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи получена из конкретного источника или видов, в то время как остальная часть тяжелой и/или легкой цепи получена из другого источника или видов.The term "hybrid" means an antibody in which part of the heavy and/or light chain is derived from a particular source or species, while the remainder of the heavy and/or light chain is derived from a different source or species.
Термин «класс» антитела означает тип консервативного домена или консервативной области, характерный для тяжелой цепи антитела. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно подразделены на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgG2. Консервативные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, называются α, δ, ε, γ и μ, соответственно.The term "class" of an antibody means the type of conserved domain or conserved region characteristic of the heavy chain of an antibody. There are five major classes of antibodies: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, and some of these can be further subdivided into subclasses (isotypes), such as IgG 1 , IgG 2 , IgG 3 , IgG 4 , IgA 1 and IgG 2 . Conservative heavy chain domains that correspond to different classes of immunoglobulins are called α, δ, ε, γ and μ, respectively.
Термин «цитотоксический агент», использованный в данном контексте, означает вещество, которое ингибирует или предотвращает клеточную функцию и/или вызывает гибель или разрушение клетка. Цитотоксические агенты включают, но, не ограничиваясь только ими, радиоактивные изотопы (например, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 и радиоактивные изотопы Lu), химиотерапевтические агенты или лекарственные средства (например, метотрексат, адриамицин, алкалоиды барвинка розового (винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мелфалан, митомицин С, хлорамбуцил, даунорубицин или другие интеркалирующие агенты), ингибиторы факторов роста, ферменты и их фрагменты, такие как нуклеолитические ферменты, антибиотики, токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, включая их фрагменты и/или варианты, а также различные противоопухолевые или противораковые агенты, описанные ниже.The term "cytotoxic agent" as used herein means a substance that inhibits or prevents cellular function and/or causes cell death or destruction. Cytotoxic agents include, but are not limited to, radioactive isotopes (e.g., At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, and Lu radioactive isotopes), chemotherapeutic agents, or drugs (e.g., methotrexate , adriamycin, vinca alkaloids rosea (vincristine, vinblastine, etoposide), doxorubicin, melphalan, mitomycin C, chlorambucil, daunorubicin or other intercalating agents), growth factor inhibitors, enzymes and fragments thereof such as nucleolytic enzymes, antibiotics, toxins such as low molecular weight toxins or enzymatically active toxins of bacterial, fungal, plant or animal origin, including fragments and/or variants thereof, as well as various antitumor or anticancer agents described below.
Термин «эффективное количество» агента, например, фармацевтического состава, относится к количеству, эффективному в дозировках в течение необходимых периодов времени, для достижения требуемого терапевтического или профилактического результата.The term "effective amount" of an agent, such as a pharmaceutical composition, refers to an amount effective in dosages for the necessary periods of time to achieve the desired therapeutic or prophylactic result.
Термин "Fc область", использованный в данном контексте, означает С-концевую область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую по меньшей мере часть консервативной области. Термин включает природные последовательности Fc областей и варианты последовательностей Fc областей. В одном варианте Fc область тяжелой цепи IgG человека расположена от Cys226, или от Pro230, до С-концевого остатка тяжелой цепи. Однако С-концевой лизин (Lys447) Fc области или С-концевой глицин (Gly446) и С-концевой лизин (Lys447) Fc области могут как присутствовать, так и отсутствовать. В одном варианте анти-HLA-G антитело, как описано в данном контексте, представляет собой изотип IgG1 и включает консервативный домен тяжелой цепи SEQ ID NO: 53 или SEQ ID NO: 54. В одном варианте оно дополнительно включает С-концевой глицин (Gly446). В другом варианте указанное антитело дополнительно включает С-концевой глицин (Gly446) и С-концевой лизин (Lys447). В одном варианте анти-HLA-G антитело, как описано в данном контексте, представляет собой изотип IgG4 и включает консервативный домен тяжелой цепи SEQ ID NO: 55. В другом варианте оно дополнительно включает С-концевой глицин (Gly446). В одном варианте указанное антитело дополнительно включает С-концевой глицин (Gly446) и С-концевой лизин (Lys447). Если не указано иное, нумерация аминокислотных остатков в Fc области или консервативной области соответствует нумерации согласно системе нумерации EU, также называемому EU индексу, как описано в статье Kabat Е.А. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, NIH Publication 91-3242 (1991).The term "Fc region" as used herein means the C-terminal region of an immunoglobulin heavy chain containing at least a portion of a conserved region. The term includes natural sequences of Fc regions and sequence variants of Fc regions. In one embodiment, the human IgG heavy chain Fc region is located from Cys226, or Pro230, to the C-terminal residue of the heavy chain. However, the C-terminal lysine (Lys447) Fc region or the C-terminal glycine (Gly446) and C-terminal lysine (Lys447) Fc region may or may not be present. In one embodiment, the anti-HLA-G antibody, as described herein, is an IgG1 isotype and comprises the conserved heavy chain domain of SEQ ID NO: 53 or SEQ ID NO: 54. In one embodiment, it further comprises a C-terminal glycine (Gly446 ). In another embodiment, said antibody further comprises a C-terminal glycine (Gly446) and a C-terminal lysine (Lys447). In one embodiment, the anti-HLA-G antibody, as described herein, is an IgG4 isotype and includes the conserved heavy chain domain of SEQ ID NO: 55. In another embodiment, it further comprises a C-terminal glycine (Gly446). In one embodiment, said antibody further comprises a C-terminal glycine (Gly446) and a C-terminal lysine (Lys447). Unless otherwise indicated, the numbering of amino acid residues in the Fc region or conserved region corresponds to the numbering according to the EU numbering system, also referred to as the EU index, as described in Kabat E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, NIH Publication 91-3242 (1991).
Термин «каркасный участок» или «FR» означает остатки вариабельного домена, отличающиеся от остатков гипервариабельной области (HVR). Участок FR вариабельного домена в основном состоит из четырех FR доменов: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно, последовательности HVR и FR в основном присутствуют в следующей последовательности в VH (или VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.The term "framework region" or "FR" refers to variable domain residues other than hypervariable region (HVR) residues. The FR region of the variable domain mainly consists of four FR domains: FR1, FR2, FR3, and FR4. Accordingly, the HVR and FR sequences are mainly present in the following sequence in VH (or VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Термины "полноразмерное антитело", "интактное антитело" и "целое антитело", использованные в настоящем контексте, являются взаимозаменяемыми и означают антитело, структура которого в основном аналогична структуре природного антитела, или содержащее тяжелые цепи, которые содержат Fc область, описанную в данном контексте.The terms "full-length antibody", "intact antibody", and "whole antibody" as used herein are interchangeable and refer to an antibody whose structure is substantially similar to that of a natural antibody, or containing heavy chains that contain the Fc region described in this context. .
Термины «клетка хозяина», «линия клетки хозяина» и «культура клетки хозяина» используют взаимозаменяемо и они означают клетки, в которые включена экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство таких клеток. Клетки хозяина включают «транформанты» и «трансформированные клетки», которые включают первичные трансформированные клетки и их потомство без учета числа пересевов. Потомство может быть не полностью идентичным исходной клетке по содержанию нуклеиновых кислот, но и может содержать мутации. В объем изобретения включено мутантное потомство, которое проявляет ту же самую функцию или биологическую активность по данным скрининга или селекции для исходной трансформированной клетки.The terms "host cell", "host cell line" and "host cell culture" are used interchangeably and refer to cells into which exogenous nucleic acid is incorporated, including the progeny of such cells. Host cells include "transformants" and "transformed cells", which include primary transformed cells and their progeny without regard to the number of passages. The offspring may not be completely identical to the original cell in terms of nucleic acid content, but may also contain mutations. Included within the scope of the invention are mutant progeny that exhibit the same function or biological activity as screened or selected for the original transformed cell.
Термин «антитело человека» означает антитело, которое включает аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности антитела, продуцируемого человеком или клеткой человека, или полученную из не относящегося к человеку источника, использующего антитела человека, или последовательностей, кодирующих другие антитела человека. Данное определение антитела человека не включает гуманизированные антитела, содержащие антигенсвязывающие остатки, не относящиеся к человеку.The term "human antibody" means an antibody that includes an amino acid sequence corresponding to that of an antibody produced by a human or human cell, or derived from a non-human source using human antibodies or sequences encoding other human antibodies. This definition of a human antibody does not include humanized antibodies containing non-human antigen-binding residues.
Термин «консенсусный каркасный участок человека» означает каркасный участок, который представляет собой наиболее часто встречающиеся аминокислотные остатки в селекции каркасных последовательностей VL или VH иммуноглобулина человека. В основном, селекция каркасных последовательностей VL или VH иммуноглобулина человека включена в подгруппу последовательностей вариабельного домена. В основном подгруппа последовательностей представляет собой подгруппу, описанную в статье Kabat Е.А. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD, NIH Publication 91-3242, V. 1-3 (1991). В одном варианте в случае VL, подгруппой является подгруппа каппа I, как описано в статье Kabat и др., см. выше. В другом варианте в случае VH, подгруппой является подгруппа III, как описано в статье Kabat и др., см. выше.The term “human consensus framework region” means a framework region that is the most frequently occurring amino acid residues in the selection of human immunoglobulin VL or VH framework sequences. In general, selection of human immunoglobulin VL or VH framework sequences is included in a subset of variable domain sequences. Basically, the sequence subgroup is the subgroup described in the Kabat E.A. article. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD, NIH Publication 91-3242, V. 1-3 (1991). In one embodiment, in the case of VL, the subgroup is the kappa I subgroup as described in Kabat et al., supra. Alternatively, in the case of VH, the subgroup is subgroup III, as described in Kabat et al., supra.
Термин "гуманизированное антитело" означает гибридное антитело, включающее аминокислотные остатки из HVR областей, не относящиеся к человеку, и аминокислотные остатки из FR областей человека. В определенных вариантах гуманизированное антитело включает в основном по меньшей мере все из одного, и обычно из двух вариабельных доменов, в которых все или практически все HVR области (например, CDR области) соответствуют областям антитела, не относящегося к человеку, а также все или практически все FR области соответствуют областям антитела человека. Гуманизированное антитело необязательно может включать по меньшей мере часть консервативной области, полученной из антитела, не относящегося к человеку. Термин "гуманизированная форма» антитела, например, антитела, не относящегося к человеку, означает антитело, которое подвергалось гуманизации.The term "humanized antibody" means a hybrid antibody comprising amino acid residues from non-human HVR regions and amino acid residues from human FR regions. In certain embodiments, a humanized antibody comprises substantially all of at least one, and typically two, variable domains, in which all or substantially all of the HVR regions (e.g., CDR regions) correspond to regions of the non-human antibody, and all or substantially all FR regions correspond to human antibody regions. The humanized antibody may optionally include at least a portion of a conserved region derived from a non-human antibody. The term "humanized form" of an antibody, such as a non-human antibody, means an antibody that has been humanized.
Термин "гипервариабельная область" или "HVR," использованный в данном контексте, означает каждую из областей вариабельного домена антитела, которые характеризуются гипервариабельной последовательностью (определяющие комплементарность области или «CDR») и/или образуют структурно определенные петли ("гипервариабельные петли") и/или содержат антиген-контактирующие остатки («антигенные контакты»). В основном, антитела содержат шесть HVR, три в VH домене (H1, Н2, Н3) и три в VL домене (L1, L2, L3). Примеры HVR, описанные в данном контексте, включают:The term "hypervariable region" or "HVR," as used herein, means each of the regions of the variable domain of an antibody that are characterized by a hypervariable sequence (complementarity determining regions or "CDRs") and/or form structurally defined loops ("hypervariable loops") and /or contain antigen-contacting residues ("antigenic contacts"). In general, antibodies contain six HVRs, three in the VH domain (H1, H2, H3) and three in the VL domain (L1, L2, L3). Examples of HVRs described in this context include:
(a) гипервариабельные петли в положениях аминокислотных остатков 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) (Chothia и Lesk, J. Mol. Biol., 196, cc. 901-917 (1987)),(a) hypervariable loops at amino acid residue positions 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), and 96-101 (H3) (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196, pp. 901-917 (1987)),
(b) CDR расположены в следующих положениях аминокислотных остатков 24-34 (L1), 50-56 L2, 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) (Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5е изд., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)),(b) CDRs are located at amino acid residue positions 24-34 (L1), 50-56 L2, 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) and 95-102 (H3) ( Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed ., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)),
(c) антигенные контакты расположены в следующих положениях аминокислотных остатков 27 с-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (HI), 47-58 (Н2) и 93-101 (Н3) (MacCallum и др. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)),(c) antigenic contacts are located at the following positions of amino acid residues 27 c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (HI), 47-58 (H2) and 93-101 (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)),
(d) комбинации (a), (b) и/или (с), включающие аминокислотные остатки HVR 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35 (H1), 50-63 (Н2) и 95-102 (Н3).(d) combinations of (a), (b) and/or (c) comprising HVR amino acid residues 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35 (H1), 50-63 (H2) and 95-102 (H3).
Если не указано иное, нумерация аминокислотных остатков в HVR и других остатков в вариабельном домене (например, остатки FR) соответствует нумерации согласно системе нумерации EU, как описано в статье Kabat Е.А. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).Unless otherwise indicated, the numbering of amino acid residues in HVR and other residues in the variable domain (eg, FR residues) follows the EU numbering system as described in Kabat E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).
«Иммуноконъюгат» означает антитело, образующее конъюгат с одним или более гетерологичным веществом (веществами), включая, но, не ограничиваясь перечисленным, цитотоксический агент."Immunoconjugate" means an antibody that forms a conjugate with one or more heterologous substance(s), including, but not limited to, a cytotoxic agent.
Термины «индивидуум» или «субъект» означают млекопитающее. Млекопитающие включают, но, не ограничиваясь только ими, домашних животных (например, крупный рогатый скот, овцы, собаки, кошки и лошади), приматов (например, человек и приматы, не относящиеся к человеку, такие как нечеловекообразные обезьяны), кроликов и грызунов (например, мыши и крысы). Прежде всего, индивидуумом или субъектом является человек.The terms "individual" or "subject" mean a mammal. Mammals include, but are not limited to, domestic animals (e.g., cattle, sheep, dogs, cats, and horses), primates (e.g., humans and non-human primates such as non-human apes), rabbits, and rodents (e.g. mice and rats). First of all, the individual or subject is a person.
Термин «выделенное» антитело означает антитело, отделенное от компонента его природной окружающей среды. В некоторых вариантах степень очистки антитела составляет более 95% или 99% по данным анализа электрофорезом (например, SDS-PAAGE, изоэлектрофокусирование (IEF), капиллярный электрофорез), или хроматографии (например, ионообменная или обращенно-фазная HPLC). Подробное описание методов определения степени очистки см., например, в статье Flatman S. и др., J. Chromatogr. В 848 79-87 (2007).The term "isolated" antibody means an antibody separated from a component of its natural environment. In some embodiments, the antibody is more than 95% or 99% pure as determined by electrophoresis (eg, SDS-PAAGE, isoelectrofocusing (IEF), capillary electrophoresis) or chromatography (eg, ion exchange or reverse phase HPLC) analysis. For a detailed description of methods for determining the degree of purification, see, for example, Flatman S. et al., J. Chromatogr. In 848 79-87 (2007).
Термин «выделенная» нуклеиновая кислота» означает молекулу нуклеиновой кислоты, которая была отделена от ее компонента из своей природной окружающей среды. Выделенная нуклеиновая кислота включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно содержат молекулу нуклеиновой кислоты, но молекула нуклеиновой кислоты присутствует вне хромосомы или расположена в хромосоме, но в положении, которое отличается от природного расположения в хромосоме.The term "isolated" nucleic acid means a nucleic acid molecule that has been separated from its component from its natural environment. An isolated nucleic acid includes a nucleic acid molecule contained in cells that normally contain the nucleic acid molecule, but the nucleic acid molecule is present outside the chromosome or is located on the chromosome but in a position that differs from the natural location on the chromosome.
«Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая анти-HLA-G антитело» означает одну или более молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих тяжелую и легкую цепи антитела (или их фрагменты), включая такие молекулу (молекулы) нуклеиновой кислоты в едином векторе или в отдельных векторах, и такие молекула (молекулы) нуклеиновой кислоты присутствуют в одном или более участков в клетке хозяина."An isolated nucleic acid encoding an anti-HLA-G antibody" means one or more nucleic acid molecules encoding the heavy and light chains of an antibody (or fragments thereof), including such nucleic acid molecule(s) in a single vector or in separate vectors, and such nucleic acid molecule(s) are present at one or more sites in the host cell.
Термин «моноклональное антитело», использованный в данном контексте, означает антитело, полученное из популяции в основном гомогенных антител, то есть индивидуальных антител, включающих популяцию, которая идентична и/или связывается с одним и тем же эпитопом, за исключением возможного варианта антител, например, содержащих природные мутации или сформировавшиеся в ходе продуцирования препарата моноклонального антитела, причем такие варианты в основном присутствуют в незначительных количествах. И наоборот, препараты поликлональных антител, которые обычно включают различные антитела, направленные на различные детерминанты (эпитопы), и каждое моноклональное антитело в препарате моноклональных антител направлено на единую детерминанту на антигене. Таким образом определение «моноклональное» указывает на характеристику антитела, которое получено из в основном гомогенной популяции антител, и при этом не требуется конструировать препарат, как требующий продуцирования антитела каким-либо конкретным методом. Например, моноклональные антитела, предназначенные для применения по настоящему изобретению, можно получить различными методами, включая, но, не ограничиваясь перечисленным, метод гибридом, методы рекомбинантных ДНК, методы фагового дисплея и методы с использованием трансгенных животных, содержащих все или часть локусов иммуноглобулинов человека, и такие методы и другие типичные методы получения моноклональных антител описаны в данном контексте.The term "monoclonal antibody" as used herein means an antibody derived from a population of substantially homogeneous antibodies, i.e., individual antibodies comprising a population that is identical to and/or binds to the same epitope, with the exception of an antibody variant, e.g. containing natural mutations or formed during the production of a monoclonal antibody preparation, and such variants are mainly present in small quantities. Conversely, polyclonal antibody preparations, which typically include different antibodies directed to different determinants (epitopes), and each monoclonal antibody in a monoclonal antibody preparation is directed to a single determinant on the antigen. Thus, the term "monoclonal" indicates the characterization of an antibody that is derived from a substantially homogeneous population of antibodies, and does not require the formulation to be designed as requiring the production of the antibody by any particular method. For example, monoclonal antibodies for use in the present invention can be obtained by various methods, including, but not limited to, the hybridoma method, recombinant DNA methods, phage display methods, and methods using transgenic animals containing all or part of the human immunoglobulin loci, and such methods and other typical methods for obtaining monoclonal antibodies are described in this context.
«Природные антитела» относятся к встречающимся в природе молекулам иммуноглобулина с различными структурами. Например, природные антитела IgG представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с молекулярной массой приблизительно 150000 Да, состоящие из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, связанных дисульфидной связью. В направлении от N-конца до С-конца, каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область (VH), так называемый вариабельный тяжелый домен или вариабельный домен тяжелой цепи, а затем три консервативных домена (СН1, СН2 и СН3). Аналогичным образом, в направлении от N-конца до С-конца, каждая легкая цепь содержит вариабельную область (VL), так называемый вариабельный легкий домен или вариабельный домен легкой цепи, а затем консервативный домен легкой цепи (CL). Легкую цепь антитела можно отнести к одному из двух типов, называемых каппа (κ) и лямбда (λ), на основе аминокислотной последовательности ее консервативного домена."Natural antibodies" refers to naturally occurring immunoglobulin molecules with various structures. For example, natural IgG antibodies are heterotetrameric glycoproteins with a molecular weight of approximately 150,000 Da, consisting of two identical light chains and two identical heavy chains linked by a disulfide bond. In the direction from the N-terminus to the C-terminus, each heavy chain contains a variable region (VH), the so-called variable heavy domain or heavy chain variable domain, and then three conserved domains (CH1, CH2 and CH3). Similarly, in the direction from the N-terminus to the C-terminus, each light chain contains a variable region (VL), the so-called variable light domain or light chain variable domain, and then a conserved light chain domain (CL). An antibody light chain can be assigned to one of two types, called kappa (κ) and lambda (λ), based on the amino acid sequence of its conserved domain.
Термин «вкладыш в упаковке» означает инструкции, обычно содержащиеся в коммерческих упаковках терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозировке, введении, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или предупреждения в отношении применения таких терапевтических продуктов.The term "package insert" means the instructions usually contained in commercial packages of therapeutic products, which contain information about the indications, use, dosage, administration, combination therapy, contraindications and/or warnings regarding the use of such therapeutic products.
«Идентичность аминокислотной последовательности в процентах (%)» в отношении эталонной полипептидной последовательности определяют как процентное содержание аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам в эталонной полипептидной последовательности после выравнивания последовательностей и при необходимости включении гэпов для обеспечения максимальной идентичности последовательностей в процентах и без учета любых консервативных замен в качестве части идентичности последовательностей. Выравнивание с целью определения идентичности аминокислотных последовательностей в % можно осуществлять различными способами, известными в данной области техники, например, с использованием общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области техники могут определить соответствующие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, которые требуются для достижения максимального выравнивания вдоль всей длины сравниваемых последовательностей. Однако согласно настоящему изобретению значения идентичности аминокислотных последовательностей в % определяют с использованием компьютерной программы для сравнения последовательностей ALIGN-2. Компьютерная программа для сравнения последовательностей ALIGN-2 создана фирмой Genentech Inc., и пользователь может найти исходный код в документации пользователей U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, где он зарегистрирован под номером U.S. Copyright Registration №TXU510087. Программа ALIGN-2 является общедоступной на фирме Genentech, Inc., South San Francisco, Калифорния, или ее можно скомпилировать по исходному коду. Программу ALIGN-2 можно также скомпилировать для использования в операционной системе UNIX, включая управляющую программу UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей установлены в программе ALIGN-2 и не изменяются."Percent amino acid sequence identity (%)" in relation to a reference polypeptide sequence is defined as the percentage of amino acid residues in a candidate sequence that are identical to amino acid residues in the reference polypeptide sequence after sequence alignment and, if necessary, the inclusion of gaps to ensure maximum sequence identity in percent and without regard to any conservative substitutions as part of the sequence identity. Alignment to determine % amino acid sequence identity can be performed by various methods known in the art, for example using publicly available computer software such as BLAST, BLAST-2, ALIGN or Megalign (DNASTAR) software. Those skilled in the art can determine the appropriate parameters for sequence alignment, including any algorithms that are required to achieve maximum alignment along the entire length of the compared sequences. However, according to the present invention, % amino acid sequence identity values are determined using the ALIGN-2 sequence comparison computer program. The ALIGN-2 sequence comparison computer program is from Genentech Inc. and the user can find the source code in the U.S. user documentation. Copyright Office, Washington D.C., 20559, where it is registered under U.S. Copyright Registration No. TXU510087. The ALIGN-2 program is publicly available from Genentech, Inc., South San Francisco, California, or can be compiled from source code. The ALIGN-2 program can also be compiled for use on the UNIX operating system, including the UNIX V4.0D daemon. All sequence comparison parameters are set in the ALIGN-2 program and do not change.
В случаях, когда для сравнения аминокислотных последовательностей используют программу ALIGN-2, идентичность данной аминокислотной последовательности А в % с данной аминокислотной последовательностью В (которую в другом варианте можно назвать как данная аминокислотная последовательность А, которая имеет или включает определенную идентичность аминокислотной последовательности в % по сравнению с данной аминокислотной последовательностью В) рассчитывают по формуле:In cases where the ALIGN-2 program is used to compare amino acid sequences, the % identity of a given amino acid sequence A with a given amino acid sequence B (which may alternatively be referred to as a given amino acid sequence A that has or includes a certain % amino acid sequence identity by compared with a given amino acid sequence B) is calculated by the formula:
где X означает число аминокислотных остатков, рассчитанных как идентичные совпадения при сравнении последовательностей А и В в программе ALIGN-2, и где Y означает общее число аминокислотных остатков в последовательности В. Следует понимать, что если длина аминокислотной последовательности А не равна длине аминокислотной последовательности В, то идентичность в % при сравнении А с В не равна идентичности аминокислотной последовательности в % при сравнении В с А. Если специально не указано иное, все значения идентичности аминокислотных последовательностей в %, использованные в данном контексте, получены, как описано в предыдущем абзаце с использованием компьютерной программы ALIGN-2.where X is the number of amino acid residues calculated as identical matches when comparing sequences A and B in the ALIGN-2 program, and where Y is the total number of amino acid residues in sequence B. It should be understood that if the length of the amino acid sequence A is not equal to the length of the amino acid sequence B , then the % identity when comparing A to B is not equal to the % amino acid sequence identity when comparing B to A. Unless otherwise noted, all % amino acid sequence identities used in this context are derived as described in the preceding paragraph c. using the computer program ALIGN-2.
Термин «фармацевтическая композиция» означает препарат, который в указанной форме обеспечивает биологическую активность активного ингредиента, содержащегося в этом препарате и проявляющего эффективность, и который не содержит никаких дополнительных компонентов, оказывающих неприемлемую токсичность на организм субъекта, которому вводят этот препарат.The term "pharmaceutical composition" means a preparation which, in the specified form, provides the biological activity of the active ingredient contained in this preparation and exhibits effectiveness, and which does not contain any additional components that cause unacceptable toxicity to the body of the subject to which this preparation is administered.
«Фармацевтически приемлемый носитель» означает ингредиент в фармацевтической композиции, который не является активным ингредиентом и который не оказывает токсическое действие на субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает, но, не ограничиваясь только ими, буферное вещество, эксципиент, стабилизатор или консервант.A "pharmaceutically acceptable carrier" means an ingredient in a pharmaceutical composition that is not an active ingredient and that does not have a toxic effect on a subject. A pharmaceutically acceptable carrier includes, but is not limited to, a buffer, excipient, stabilizer, or preservative.
Использованный в данном контексте термин «лечение» (и его грамматические варианты, такие как «лечебный» или «терапия») означает клиническое вмешательство с целью изменить природный ход заболевания у индивидуума, нуждающегося в лечении, которое можно осуществлять либо для профилактики, либо в ходе клинической патологии. Требуемые действия лечения включают, но, не ограничиваясь только ими, профилактику возникновения или рецидива заболевания, снижение интенсивности симптомов, снижение любых прямых или косвенных патологических последствий заболевания, профилактику метастазирования, снижение скорости прогрессирования заболевания, смягчение или облегчение патологического состояния, а также ремиссию или улучшенный прогноз. В некоторых вариантах антитела по настоящему изобретению используют для замедления прогрессирования заболевания.As used herein, the term "treatment" (and its grammatical variants such as "therapeutic" or "therapy") means a clinical intervention to alter the natural course of a disease in an individual in need of treatment, which can be done either for prophylaxis or during clinical pathology. The desired treatment actions include, but are not limited to, prevention of the onset or recurrence of a disease, reduction in the intensity of symptoms, reduction in any direct or indirect pathological consequences of the disease, prevention of metastasis, reduction in the rate of disease progression, mitigation or alleviation of the disease state, and remission or improved forecast. In some embodiments, the antibodies of the present invention are used to slow the progression of a disease.
Термин «вариабельная область» или «вариабельный домен» означает домен тяжелой цепи или легкой цепи антитела, который принимает участие в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой и легкой цепей (VH и VL, соответственно) природного антитела в основном характеризуются аналогичной структурой, причем каждый домен включает четыре консервативные каркасные области (FR) и три гипервариабельные области (HVR). См., например, статью Kindt и др., Kuby Immunology, 6ое изд., W.H. Freeman and Co., с. 91 (2007). Для проявления антигенсвязывающей специфичности может быть достаточно одного VH или VL домена. Более того антитела, которые связываются с конкретным антигеном, можно выделять с использованием VH или VL домена из антитела, которое связывается с антигеном для скрининга библиотеки комплементарных VL или VH доменов, соответственно. См., например, статьи Portolano S. и др., J. Immunol. 150 880-887 (1993); Clackson Т. и др., Nature 352 624-628 (1991)).The term "variable region" or "variable domain" means the heavy chain or light chain domain of an antibody that is involved in the binding of an antibody to an antigen. The variable domains of the heavy and light chains (VH and VL, respectively) of natural antibodies are generally characterized by a similar structure, with each domain including four conserved framework regions (FR) and three hypervariable regions (HVR). See, for example, Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., WH Freeman and Co., p. 91 (2007). A single VH or VL domain may be sufficient to exhibit antigen-binding specificity. Moreover, antibodies that bind to a particular antigen can be isolated using a VH or VL domain from an antibody that binds to an antigen to screen for a library of complementary VL or VH domains, respectively. See, for example, Portolano S. et al., J. Immunol. 150 880-887 (1993); Clackson, T. et al., Nature 352 624-628 (1991)).
Термин «вектор», использованный в данном контексте, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной к размножению другой нуклеиновой кислоты, к которой она присоединена. Термин включает вектор в виде самореплицирующейся структуры нуклеиновой кислоты, а также вектор, включенный в геном клетки хозяина, в которую он включен. Определенные векторы способны направлять экспрессию нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Такие векторы в данном контексте названы «экспрессионными векторами».The term "vector" as used herein refers to a nucleic acid molecule capable of replicating another nucleic acid to which it is attached. The term includes a vector in the form of a self-replicating nucleic acid structure, as well as a vector included in the genome of the host cell in which it is included. Certain vectors are capable of directing the expression of nucleic acids to which they are operably linked. Such vectors are referred to in this context as "expression vectors".
I. Композиции и методыI. Compositions and Methods
В одном объекте настоящее изобретение основано на открытии того, что выбранные анти-HLA-G антитела по изобретению связываются с определенными эпитопами HLA-G с высокой специфичностью (не проявляют перекрестной реактивности к другим видам и консенсусным последовательностям HLA-A человека) и обладает способностью специфично ингибировать связывание ILT2 и или ILT4 с HLA-G. Они ингибируют, например, связывание ILT2 с HLA-G и специфично обращают HLA-G-опосредованное подавление иммунного ответа за счет увеличения высвобождения иммуномодуляторных цитокинов, таких как TNF-α после соответствующей стимуляции, и они характеризуются отсутствием действия на HLAG-нокаунтные клетки.In one aspect, the present invention is based on the discovery that selected anti-HLA-G antibodies of the invention bind to certain HLA-G epitopes with high specificity (show no cross-reactivity to other species and human HLA-A consensus sequences) and have the ability to specifically inhibit the binding of ILT2 and or ILT4 to HLA-G. They inhibit, for example, ILT2 binding to HLA-G and specifically reverse HLA-G mediated suppression of the immune response by increasing the release of immunomodulatory cytokines such as TNF-α after appropriate stimulation, and they are characterized by no effect on HLAG knockout cells.
В некоторых вариантах предлагаются антитела, которые связываются с HLA-G. Антитела по изобретению можно использовать, например, для диагностики или лечения рака.In some embodiments, antibodies are provided that bind to HLA-G. The antibodies of the invention can be used, for example, in the diagnosis or treatment of cancer.
А. Типичные анти-HLA-G антителаA. Exemplary anti-HLA-G antibodies
В объекте настоящего изобретения предлагается (выделенное) антитело, которое связывается с HLA-G (анти- HLA-G антитело) и которое ингибирует связывание ILT2 с HLAG на клетках JEG-3 (АТСС НТВ36) и восстанавливает HLA-G-специфичный сниженный иммунный ответ (например, сниженное высвобождение фактора некроза опухоли (TNF-α)) из моноцитов, совместно культивируемых с клетками JEG-3 (АТСС НТВ36). Таким образом антитела по изобретению восстанавливают HLA-G-специфичное высвобождение TNF-α в стимулированных липополисахаридом (LPS) совместно культивируемых культурах, экспрессирующих HLA-G клетках JEG-3 (АТСС НТВ36) и моноцитах по сравнению с необработанными совместно культивируемыми клетками JEG-3 (в качестве отрицательного контроля использовали необработанные культуры клеток, 0%, в качестве положительного контроля использовали культуры только моноцитов, 100%, в которых высвобождение TNF-α не подавляется любыми HLA-G/IL-Т2-специфичными эффектами (см. пример 7). И наоборот, антитела по настоящему изобретению не способны восстанавливать иммунный ответ в моноцитах, стимулированных липополисахаридом (LPS) в совместно культивируемых HLA-G нокаунтных культурах.An object of the present invention is an (isolated) antibody that binds to HLA-G (anti-HLA-G antibody) and that inhibits ILT2 binding to HLAG on JEG-3 cells (ATCC HTB36) and restores an HLA-G-specific reduced immune response. (eg, reduced release of tumor necrosis factor (TNF-α)) from monocytes co-cultured with JEG-3 cells (ATCC HTB36). Thus, the antibodies of the invention restore HLA-G-specific TNF-α release in lipopolysaccharide (LPS) stimulated cocultures, HLA-G expressing JEG-3 cells (ATCC HTB36) and monocytes compared to untreated cocultured JEG-3 cells ( untreated cell cultures, 0%, were used as a negative control, cultures of only monocytes, 100%, in which the release of TNF-α is not suppressed by any HLA-G/IL-T2-specific effects, were used as a positive control (see example 7). Conversely, the antibodies of the present invention are unable to restore the immune response in lipopolysaccharide (LPS) stimulated monocytes in co-cultured HLA-G knockout cultures.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается (выделенное) антитело, которое связывается с HLA-G человека (в одном варианте антитело связывается с комплексом HLA-G β2М МНС I, включающим последовательность SEQ ID NO: 43), где антитело включаетIn one embodiment, the present invention provides an (isolated) antibody that binds to human HLA-G (in one embodiment, the antibody binds to an HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 43), wherein the antibody comprises
A) (а) домен HVR-H1, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (b) HVR-H2, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, (с) HVR-H3, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (d) HVR-L1, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; (е) HVR-L2, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 и (f) HVR-L3, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, илиA) (a) HVR-H1 domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, (c) HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 , (d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; (e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and (f) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, or
B) (а) HVR-H1, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, (b) HVR-H2, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и (с) HVR-H3, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, (d) HVR-L1, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (е) HVR-L2, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13 и (f) HVR-L3, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, илиB) (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, and (c) HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 , (d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12; (e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 and (f) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, or
C) (a) HVR-H1, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, (b) HVR-H2, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и (с) HVR-H3, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, (d) HVR-L1, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (е) HVR-L2, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21 и (f) HVR-L3, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, илиC) (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and (c) HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 , (d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; (e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 and (f) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, or
D) (a) HVR-H1, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, (b) HVR-H2, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и (с) HVR-H3, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, (d) HVR-L1, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28; (е) HVR-L2, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29 и (f) HVR-L3, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30.D) (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and (c) HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 , (d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; (e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29; and (f) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается (выделенное) антитело, которое связывается с HLA-G человека (в одном варианте антитело связывается с комплексом HLA-G β2М МНС I, включающим последовательность SEQ ID NO: 43), где антитело включаетIn another embodiment, the present invention provides an (isolated) antibody that binds to human HLA-G (in one embodiment, the antibody binds to an HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 43), wherein the antibody comprises
A) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и (iii) HVR-H3, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из последовательности SEQ ID NO: 3, и (b) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; (ii) HVR-L2, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 и (iii) HVR-L3, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, илиA) (a) a VH domain comprising (i) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, (ii) an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and (iii) an HVR-H3 comprising an amino acid sequence selected from the sequence of SEQ ID NO: 3, and (b) a VL domain comprising (i) an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; (ii) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and (iii) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, or
B) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, (ii) HVR-H2, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и (iii) HVR-H3, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из последовательности SEQ ID NO: 11, и (b) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (ii) HVR-L2, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13 и (iii) HVR-L3, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, илиB) (a) a VH domain comprising (i) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, (ii) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, and (iii) HVR-H3 comprising an amino acid sequence selected from the sequence of SEQ ID NO: 11, and (b) a VL domain comprising (i) an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12; (ii) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 and (iii) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, or
C) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, (ii) HVR-H2, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и (iii) HVR-H3, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из последовательности SEQ ID NO: 19, и (b) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (ii) HVR-L2, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21 и (iii) HVR-L3, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, илиC) (a) a VH domain comprising (i) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, (ii) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and (iii) HVR-H3 comprising an amino acid sequence selected from the sequence of SEQ ID NO: 19, and (b) a VL domain comprising (i) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; (ii) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 and (iii) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, or
D) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, (ii) HVR-H2, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и (iii) HVR-H3, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из последовательности SEQ ID NO: 27, и (b) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28; (ii) HVR-L2, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29 и (iii) HVR-L3, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30.D) (a) a VH domain comprising (i) an HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, (ii) an HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and (iii) an HVR-H3 comprising an amino acid sequence selected from the sequence of SEQ ID NO: 27, and (b) a VL domain comprising (i) an HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; (ii) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29; and (iii) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается выделенное антитело, которое связывается с HLA-G человека (в одном варианте антитело связывается с комплексом HLA-G β2М МНС I, включающим последовательность SEQ ID NO: 43), где антитело включаетIn yet another embodiment, the present invention provides an isolated antibody that binds to human HLA-G (in one embodiment, the antibody binds to an HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 43), wherein the antibody comprises
А)A)
(i) включает последовательность VH SEQ ID NO: 7 и последовательность VL SEQ ID NO: 8,(i) includes a VH sequence of SEQ ID NO: 7 and a VL sequence of SEQ ID NO: 8,
(ii) или гуманизированный вариант доменов VH и VL антитела по п. i), или(ii) or a humanized variant of the VH and VL domains of the antibody of i), or
(iii) включает последовательность VH SEQ ID NO: 33 и последовательность VL SEQ ID NO: 34, или(iii) includes a VH sequence of SEQ ID NO: 33 and a VL sequence of SEQ ID NO: 34, or
В)IN)
(i) включает последовательность VH SEQ ID NO: 15 и последовательность VL SEQ ID NO: 16, или(i) includes a VH sequence of SEQ ID NO: 15 and a VL sequence of SEQ ID NO: 16, or
С)WITH)
(i) включает последовательность VH SEQ ID NO: 23 и последовательность VL SEQ ID NO: 24, или D)(i) includes a VH sequence of SEQ ID NO: 23 and a VL sequence of SEQ ID NO: 24, or D)
(i) включает последовательность VH SEQ ID NO: 31 и последовательность VL SEQ ID NO: 32.(i) includes the VH sequence of SEQ ID NO: 31 and the VL sequence of SEQ ID NO: 32.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается (выделенное) антитело, которое связывается с HLA-G человека (в одном варианте антитело связывается с комплексом HLA-G β2М МНС I, включающим последовательность SEQ ID NO: 43), где антитело включаетIn one embodiment, the present invention provides an (isolated) antibody that binds to human HLA-G (in one embodiment, the antibody binds to an HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 43), wherein the antibody comprises
(а) домен HVR-H1, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (b) HVR-H2, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, (с) HVR-H3, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (d) HVR-L1, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; (е) HVR-L2, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 и (f) HVR-L3, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.(a) HVR-H1 domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, (c) HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, ( d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; (e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and (f) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается (выделенное) антитело, которое связывается с HLA-G человека (в одном варианте антитело связывается с комплексом HLA-G β2М МНС I, включающим последовательность SEQ ID NO: 43), где антитело включаетIn another embodiment, the present invention provides an (isolated) antibody that binds to human HLA-G (in one embodiment, the antibody binds to an HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 43), wherein the antibody comprises
(a) HVR-H1, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, (b) HVR-H2, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и (с) HVR-H3, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, (d) HVR-L1, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (е) HVR-L2, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13 and (f) HVR-L3, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.(a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, and (c) HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, ( d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12; (e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 and (f) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается (выделенное) антитело, которое связывается с HLA-G человека (в одном варианте антитело связывается с комплексом HLA-G β2М МНС I, включающим последовательность SEQ ID NO: 43), где антитело включаетIn yet another embodiment, the present invention provides an (isolated) antibody that binds to human HLA-G (in one embodiment, the antibody binds to an HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 43), wherein the antibody comprises
(a) HVR-H1, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, (b) HVR-H2, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и (с) HVR-H3, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, (d) HVR-L1, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (е) HVR-L2, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21 и (f) HVR-L3, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.(a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and (c) HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, ( d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; (e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21; and (f) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается (выделенное) антитело, которое связывается с HLA-G человека (в одном варианте антитело связывается с комплексом HLA-G β2М МНС I, включающим последовательность SEQ ID NO: 43), где антитело включаетIn another embodiment, the present invention provides an (isolated) antibody that binds to human HLA-G (in one embodiment, the antibody binds to an HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 43), wherein the antibody comprises
(a) HVR-H1, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, (b) HVR-H2, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и (с) HVR-H3, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, (d) HVR-L1, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28; (е) HVR-L2, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29 и (f) HVR-L3, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30.(a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, (b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and (c) HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, ( d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; (e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29; and (f) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается (выделенное) антитело, которое связывается с HLA-G человека (в одном варианте антитело связывается с комплексом HLA-G β2М МНС I, включающим последовательность SEQ ID NO: 43), где антитело включаетIn yet another embodiment, the present invention provides an (isolated) antibody that binds to human HLA-G (in one embodiment, the antibody binds to an HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 43), wherein the antibody comprises
(i) последовательность VH SEQ ID NO: 7 и последовательность VL SEQ ID NO: 8,(i) a VH sequence of SEQ ID NO: 7 and a VL sequence of SEQ ID NO: 8,
(ii) или гуманизированный вариант доменов VH и VL антитела по п. i). В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается(ii) or a humanized variant of the VH and VL domains of the antibody of i). In one embodiment, the present invention provides
(выделенное) антитело, которое связывается с HLA-G человека (в одном варианте антитело связывается с комплексом HLA-G β2М МНС I, включающим последовательность SEQ ID NO: 43), где антитело включает(isolated) antibody that binds to human HLA-G (in one embodiment, the antibody binds to an HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 43), wherein the antibody comprises
(i) последовательность VH SEQ ID NO: 33 и последовательность VL SEQ ID NO: 34.(i) VH sequence SEQ ID NO: 33 and VL sequence SEQ ID NO: 34.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается (выделенное) антитело, которое связывается с HLA-G человека (в одном варианте антитело связывается с комплексом HLA-G β2М МНС I, включающим последовательность SEQ ID NO: 43), где антитело включаетIn another embodiment, the present invention provides an (isolated) antibody that binds to human HLA-G (in one embodiment, the antibody binds to an HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 43), wherein the antibody comprises
последовательность VH SEQ ID NO: 15 и последовательность VL SEQ ID NO: 16.a VH sequence of SEQ ID NO: 15; and a VL sequence of SEQ ID NO: 16.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается (выделенное) антитело, которое связывается с HLA-G человека (в одном варианте антитело связывается с комплексом HLA-G β2М МНС I, включающим последовательность SEQ ID NO: 43), где антитело включаетIn yet another embodiment, the present invention provides an (isolated) antibody that binds to human HLA-G (in one embodiment, the antibody binds to an HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 43), wherein the antibody comprises
последовательность VH SEQ ID NO: 23 и последовательность VL SEQ ID NO: 24.a VH sequence of SEQ ID NO: 23; and a VL sequence of SEQ ID NO: 24.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается (выделенное) антитело, которое связывается с HLA-G человека (в одном варианте антитело связывается с комплексом HLA-G β2М МНС I, включающим последовательность SEQ ID NO: 43), где антитело включаетIn another embodiment, the present invention provides an (isolated) antibody that binds to human HLA-G (in one embodiment, the antibody binds to an HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 43), wherein the antibody comprises
последовательность VH SEQ ID NO: 31 и последовательность VL SEQ ID NO: 32.a VH sequence of SEQ ID NO: 31; and a VL sequence of SEQ ID NO: 32.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается (выделенное) антитело, которое связывается с HLA-G человека (в одном варианте антитело связывается с комплексом HLA-G β2М МНС I, включающим последовательность SEQ ID NO: 43), где антитело включаетIn yet another embodiment, the present invention provides an (isolated) antibody that binds to human HLA-G (in one embodiment, the antibody binds to an HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 43), wherein the antibody comprises
A) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и (iii) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и где VH домен включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или на 100% (в одном предпочтительном варианте на 98%, 99% или на 100%) идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 33, и (b) домен VL, включающий (i) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; (ii) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 and (iii) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, где VL домен включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или на 100% (в одном предпочтительном варианте на 98%, 99% или на 100%) идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34, илиA) (a) a VH domain comprising (i) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and (iii) HVR-H3 containing amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and wherein the VH domain comprises an amino acid sequence that is at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% (in one preferred embodiment, 98%, 99% or 100%) identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, and (b) a VL domain comprising (i) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; (ii) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and (iii) HVR-L3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, where the VL domain includes an amino acid sequence that is at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% (in one preferred embodiment, 98%, 99%, or 100%) identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, or
B) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, (ii) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и (iii) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, где VH домен включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или на 100% (в одном предпочтительном варианте на 98%, 99% или на 100%) идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15, и (b) домен VL, включающий (i) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (ii) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13 and (iii) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, где (b) VL домен включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или на 100% (в одном предпочтительном варианте на 98%, 99% или на 100%) идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16 илиB) (a) a VH domain comprising (i) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, (ii) HVR-H2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, and (iii) HVR-H3 containing amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, wherein the VH domain comprises an amino acid sequence that is at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% (in one preferred embodiment, 98%, 99%, or 100%) identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and (b) a VL domain comprising (i) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12; (ii) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 and (iii) HVR-L3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, where (b) the VL domain includes an amino acid sequence that is at least 95% 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% (in one preferred embodiment, 98%, 99%, or 100%) identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 or
C) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, (ii) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и (iii) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из последовательности SEQ ID NO: 19, и где VH домен включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или на 100% (в одном предпочтительном варианте на 98%, 99% или на 100%) идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 23, и (b) домен VL, включающий (i) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (ii) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21 и (iii) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, где VL домен включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или на 100% (в одном предпочтительном варианте на 98%, 99% или на 100%) идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14, илиC) (a) a VH domain comprising (i) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, (ii) HVR-H2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and (iii) HVR-H3 containing amino acid sequence selected from the sequence of SEQ ID NO: 19, and where the VH domain includes an amino acid sequence that is at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% (in one preferred embodiment, 98 %, 99% or 100%) identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, and (b) a VL domain comprising (i) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; (ii) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 and (iii) HVR-L3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, where the VL domain includes an amino acid sequence that is at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% (in one preferred embodiment, 98%, 99%, or 100%) identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, or
D) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, (ii) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и (iii) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из последовательности SEQ ID NO: 27, и (b) где VH домен включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или на 100% (в одном предпочтительном варианте на 98%, 99% или на 100%) идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31, и (b) домен VL, включающий (i) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28; (ii) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29 and (iii) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, где VL домен включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или на 100% (в одном предпочтительном варианте на 98%, 99% или на 100%) идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32.D) (a) a VH domain comprising (i) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, (ii) HVR-H2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and (iii) HVR-H3 containing amino acid sequence selected from the sequence of SEQ ID NO: 27, and (b) where the VH domain includes an amino acid sequence that is at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% (in one preferred variant is 98%, 99% or 100%) identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31, and (b) a VL domain comprising (i) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; (ii) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29 and (iii) HVR-L3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, where the VL domain includes an amino acid sequence that is at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% (in one preferred embodiment, 98%, 99%, or 100%) identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается (выделенное) антитело, которое связывается с HLA-G человека (в одном варианте антитело связывается с комплексом HLA-G β2М МНС I, включающим последовательность SEQ ID NO: 43), где антитело включаетIn one embodiment, the present invention provides an (isolated) antibody that binds to human HLA-G (in one embodiment, the antibody binds to an HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 43), wherein the antibody comprises
(а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и (iii) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и (b) домен VL, включающий (i) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; (ii) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 and (iii) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и(a) a VH domain comprising (i) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and (iii) HVR-H3 containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 3, and (b) a VL domain comprising (i) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; (ii) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and (iii) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and
и где антитело связывается с комплексом HLA-G β2М МНС I, включающим последовательность SEQ ID NO: 43, связывающая аффинность которого в основном идентична (в одном варианте связывающая аффинность, то есть значение KD, снижается не более, чем в 10 раз по сравнению с антителом, включающим последовательность VH SEQ ID NO: 33 и последовательность VL SEQ ID NO: 34, в другом варианте значение KD снижается не более, чем в 5 раз по сравнению с указанным антителом) (измеренное методом поверхностного плазмонного резонанса).and where the antibody binds to the HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 43, the binding affinity of which is substantially identical (in one embodiment, the binding affinity, i.e., KD value, is reduced by no more than 10 times compared to an antibody comprising the VH sequence of SEQ ID NO: 33 and the VL sequence of SEQ ID NO: 34, in another embodiment, the KD value is reduced by no more than 5 times compared to the specified antibody) (measured by surface plasmon resonance).
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается (выделенное) антитело, которое связывается с HLA-G человека (в одном варианте антитело связывается с комплексом HLA-G β2М МНС I, включающим последовательность SEQ ID NO: 43), где антитело включаетIn another embodiment, the present invention provides an (isolated) antibody that binds to human HLA-G (in one embodiment, the antibody binds to an HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 43), wherein the antibody comprises
(а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и (iii) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из последовательности SEQ ID NO: 3, и где VH домен включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или на 100% (в одном предпочтительном варианте на 98%, 99% или на 100%) идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 33, и (b) домен VL, включающий (i) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; (ii) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 и (iii) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и где VL домен включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или на 100% (в одном предпочтительном варианте на 98%, 99% или на 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34,(a) a VH domain comprising (i) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and (iii) HVR-H3 containing the amino acid sequence , selected from the sequence of SEQ ID NO: 3, and where the VH domain includes an amino acid sequence that is at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% (in one preferred embodiment, 98%, 99% or 100%) identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, and (b) a VL domain comprising (i) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; (ii) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and (iii) HVR-L3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and where the VL domain includes an amino acid sequence that is at least 95%, 96% , 97%, 98%, 99%, or 100% (in one preferred embodiment, 98%, 99%, or 100% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34,
и где антитело связывается с комплексом HLA-G β2М МНС I, включающим последовательность SEQ ID NO: 43, связывающая аффинность которого в основном идентична (в одном варианте связывающая аффинность, то есть значение KD, снижается не более, чем в 10 раз по сравнению с антителом, включающим последовательность VH SEQ ID NO: 33 и последовательность VL SEQ ID NO: 34, в другом варианте значение KD снижается не более, чем в 5 раз по сравнению с указанным антителом) (измеренное методом поверхностного плазмонного резонанса), и/илиand where the antibody binds to the HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 43, the binding affinity of which is substantially identical (in one embodiment, the binding affinity, i.e., KD value, is reduced by no more than 10 times compared to an antibody comprising the VH sequence of SEQ ID NO: 33 and the VL sequence of SEQ ID NO: 34, in another embodiment, the KD value is reduced by no more than 5 times compared to the specified antibody) (measured by surface plasmon resonance), and / or
где антитело независимо характеризуется следующими свойствами: анти-HLA-G антителоwhere the antibody is independently characterized by the following properties: anti-HLA-G antibody
а) не проявляет перекрестную реактивность с модифицированным комплексом HLA-G β2М МНС I человека, включающим последовательность SEQ ID NO: 44, и/илиa) does not cross-react with a modified human HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 44, and/or
в) не проявляет перекрестную реактивность с комплексом HLA-A2 β2М МНС I человека, включающим последовательность SEQ ID NO: 39 и последовательность SEQ ID NO: 37, и/илиc) does not cross-react with the HLA-A2 β2M human MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 39 and the sequence of SEQ ID NO: 37, and/or
c) не проявляет перекрестную реактивность с комплексом H2Kd β2М МНС I мыши, включающим последовательность SEQ ID NO: 45, и/илиc) does not cross-react with the H2Kd β2M mouse MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 45, and/or
d) не проявляет перекрестную реактивность с комплексом RT1A β2М МНС I крысы, включающим последовательность SEQ ID NO: 47, и/илиd) does not cross-react with the rat RT1A β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 47, and/or
e) ингибирует связывание ILT2 с мономерным комплексом HLA-G β2М МНС I (включающим последовательность SEQ ID NO: 43), и/илиe) inhibits ILT2 binding to the HLA-G β2M MHC I monomeric complex (comprising the sequence of SEQ ID NO: 43), and/or
f) ингибирует связывание ILT2 с тримерным комплексом HLA-G β2М МНС I (включающим последовательность SEQ ID NO: 43), более чем на 50% (в одном варианте более чем на 60%) (по сравнению со связыванием без антитела) (см. пример 4b), и/илиf) inhibits ILT2 binding to the HLA-G β2M MHC I trimeric complex (comprising the sequence of SEQ ID NO: 43) by more than 50% (in one embodiment, more than 60%) (compared to binding without antibody) (see example 4b), and/or
g) ингибирует связывание ILT2 с мономерным и/или димерным и/или тримерным комплексом HLA-G β2М МНС I (включающим последовательность SEQ ID NO: 43), более чем на 50% (в одном варианте более чем на 80%) (по сравнению со связыванием без антитела) (см. пример 4б), и/илиg) inhibits ILT2 binding to the monomeric and/or dimeric and/or trimeric HLA-G β2M MHC I complex (comprising the sequence of SEQ ID NO: 43) by more than 50% (in one embodiment, more than 80%) (versus with binding without antibody) (see example 4b), and/or
h) ингибирует связывание (с HLA-G) на клетках JEG3 (АТСС No. НТВ36) (более чем на 50% (в одном варианте более чем на 80%)) (по сравнению со связыванием без антитела) (см. пример 6), и/илиh) inhibits binding (to HLA-G) on JEG3 cells (ATCC No. HTB36) (more than 50% (in one embodiment more than 80%)) (compared to binding without antibody) (see example 6) , and/or
i) связывается (с HLA-G) на клетках JEG3 (АТСС No. НТВ36) (см. пример 5), и ингибирует связывание ILT2 с HLA-G на клетках JEG3 (АТСС No. НТВ36) (более чем на 50% (в одном варианте более чем на 80%)) (по сравнению со связыванием без антитела) (см. пример 6), и/илиi) binds (to HLA-G) on JEG3 cells (ATCC No. HTB36) (see example 5), and inhibits ILT2 binding to HLA-G on JEG3 cells (ATCC No. HTB36) (more than 50% (in more than 80% in one embodiment) (compared to binding without antibody) (see Example 6), and/or
j) ингибирует связывание CD8 с HLAG более чем на 80% (по сравнению со связыванием без антитела) (см. пример 4с), и/илиj) inhibits CD8 binding to HLAG by more than 80% (compared to binding without antibody) (see Example 4c), and/or
k) восстанавливает HLA-G-специфичный сниженный иммунный ответ (например, сниженное высвобождение TNF-α) в моноцитах, совместно культивируемых с клетками JEG-3 (АТСС НТВ36).k) restores an HLA-G-specific reduced immune response (eg reduced TNF-α release) in monocytes co-cultured with JEG-3 cells (ATCC HTB36).
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается (выделенное) антитело, которое связывается с HLA-G человека (в одном варианте антитело связывается с комплексом HLA-G β2М МНС I, включающим последовательность SEQ ID NO: 43), где антитело связывается с одним и тем же эпитопом, что и антитело, включающее VH домен SEQ ID NO: 33 и VL домен SEQ ID NO: 34.In another embodiment, the present invention provides an (isolated) antibody that binds to human HLA-G (in one embodiment, the antibody binds to an HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 43), wherein the antibody binds to one and the same epitope as an antibody comprising the VH domain of SEQ ID NO: 33 and the VL domain of SEQ ID NO: 34.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается (выделенное) антитело, которое связывается с HLA-G человека (в одном варианте антитело связывается с комплексом HLA-G β2М МНС I, включающим последовательность SEQ ID NO: 43), где антитело включаетIn one embodiment, the present invention provides an (isolated) antibody that binds to human HLA-G (in one embodiment, the antibody binds to an HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 43), wherein the antibody comprises
(а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, (ii) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и (iii) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и (b) домен VL,(a) a VH domain comprising (i) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, (ii) HVR-H2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, and (iii) HVR-H3 containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 11, and (b) a VL domain,
включающий (i) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (ii) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13 and (iii) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, иcomprising (i) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12; (ii) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 and (iii) HVR-L3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, and
где антитело связывается с комплексом HLA-G β2М МНС I, включающим последовательность SEQ ID NO: 43, связывающая аффинность которого в основном идентична (в одном варианте связывающая аффинность, то есть значение KD, снижается не более, чем в 10 раз по сравнению с антителом, включающим последовательность VH SEQ ID NO: 15 и последовательность VL SEQ ID NO: 16, в другом варианте значение KD снижается не более, чем в 5 раз по сравнению с указанным антителом (измеренное методом поверхностного плазмонного резонанса).where the antibody binds to the HLA-G β2M MHC I complex, comprising the sequence of SEQ ID NO: 43, the binding affinity of which is basically identical (in one embodiment, the binding affinity, that is, the KD value, is reduced by no more than 10 times compared to the antibody , including the sequence of VH SEQ ID NO: 15 and the sequence of VL SEQ ID NO: 16, in another embodiment, the KD value is reduced by no more than 5 times compared with the specified antibody (measured by surface plasmon resonance).
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается (выделенное) антитело, которое связывается с HLA-G человека (в одном варианте антитело связывается с комплексом HLA-G β2М МНС I, включающим последовательность SEQ ID NO: 43), где антитело включаетIn yet another embodiment, the present invention provides an (isolated) antibody that binds to human HLA-G (in one embodiment, the antibody binds to an HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 43), wherein the antibody comprises
а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, (ii) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и (iii) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и где домен VH включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или на 100% (в одном предпочтительном варианте на 98% или на 99% или на 100%) идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15, и (b) домен VL, включающий (i) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, (ii) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и (iii) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и где домен VL включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или на 100% (в одном предпочтительном варианте на 98% или на 99% или на 100%) идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16,a) a VH domain comprising (i) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, (ii) HVR-H2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, and (iii) HVR-H3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, and wherein the VH domain comprises an amino acid sequence that is at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% (in one preferred embodiment, 98% or 99% or 100%) identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and (b) a VL domain comprising (i) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, (ii) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, and (iii) an HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, and wherein the VL domain includes an amino acid sequence that is at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% (in one preferred embodiment, 98% or 99% or 100%) identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16,
и где антитело связывается с комплексом HLA-G β2М МНС I, включающим последовательность SEQ ID NO: 43, связывающая аффинность которого в основном идентична (в одном варианте связывающая аффинность, то есть значение KD, снижается не более, чем в 10 раз по сравнению с антителом, включающим последовательность VH SEQ ID NO: 15 и последовательность VL SEQ ID NO: 16, в другом варианте значение KD снижается не более, чем в 5 раз по сравнению с указанным антителом) (измеренное методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или,and where the antibody binds to the HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 43, the binding affinity of which is substantially identical (in one embodiment, the binding affinity, i.e., KD value, is reduced by no more than 10 times compared to an antibody comprising the VH sequence of SEQ ID NO: 15 and the VL sequence of SEQ ID NO: 16, in another embodiment, the KD value is reduced by no more than 5 times compared to the specified antibody) (measured by surface plasmon resonance), and/or,
где антитело независимо характеризуется следующими свойствами:where the antibody is independently characterized by the following properties:
анти-HLA-G антителоanti-HLA-G antibody
a) не проявляет перекрестную реактивность с модифицированным комплексом HLA-G β2М МНС I человека, включающим последовательность SEQ ID NO: 44, и/илиa) does not cross-react with a modified human HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 44, and/or
b) не проявляет перекрестную реактивность с комплексом HLA-A2 β2М МНС I человека, включающим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39 и последовательность SEQ ID NO: 37, и/илиb) does not cross-react with the human HLA-A2 β2M MHC I complex comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39 and the sequence of SEQ ID NO: 37, and/or
c) не проявляет перекрестную реактивность с комплексом H2Kd β2М МНС I мыши, включающим последовательность SEQ ID NO: 45, и/илиc) does not cross-react with the H2Kd β2M mouse MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 45, and/or
d) не проявляет перекрестную реактивность с комплексом RT1A β2М МНС I крысы, включающим последовательность SEQ ID NO: 47, и/илиd) does not cross-react with the rat RT1A β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 47, and/or
e) ингибирует связывание ILT2 с мономерным комплексом HLA-G β2М МНС I (включающим последовательность SEQ ID NO: 43), и/илиe) inhibits ILT2 binding to the HLA-G β2M MHC I monomeric complex (comprising the sequence of SEQ ID NO: 43), and/or
f) ингибирует связывание ILT2 с тримерным комплексом HLA-G β2М МНС I (включающим последовательность SEQ ID NO: 43) более чем на 50% (в одном варианте более чем на 60%) (по сравнению со связыванием без антитела) (см. пример 4b), и/илиf) inhibits ILT2 binding to the HLA-G β2M MHC I trimeric complex (comprising the sequence of SEQ ID NO: 43) by more than 50% (in one embodiment, more than 60%) (compared to binding without antibody) (see example 4b), and/or
g) ингибирует связывание ILT2 с мономерным и/или димерным и/или тримерным комплексом HLA-G β2М МНС I (включающим последовательность SEQ ID NO: 43) более чем на 50% (в одном варианте более чем на 80%) (по сравнению со связыванием без антитела) (см. пример 4b), и/илиg) inhibits ILT2 binding to the monomeric and/or dimeric and/or trimeric HLA-G β2M MHC I complex (comprising the sequence of SEQ ID NO: 43) by more than 50% (in one embodiment, more than 80%) (compared to binding without antibody) (see example 4b), and/or
h) ингибирует связывание ILT2 (с HLA-G) на клетках JEG3 (АТСС No. НТВ36) (более чем на 50% (в одном варианте более чем на 80%)) (по сравнению со связыванием без антитела) (см. пример 6), и/илиh) inhibits ILT2 binding (to HLA-G) on JEG3 cells (ATCC No. HTB36) (more than 50% (in one embodiment more than 80%)) (compared to binding without antibody) (see example 6 ), and/or
i) связывается (с HLA-G) на клетках JEG3 (АТСС No. НТВ36) (см. пример 5) и ингибирует связывание ILT2 (с HLA-G) на клетках JEG3 (АТСС No. НТВ36) (более чем на 50% (в одном варианте более чем на 80%)) (по сравнению со связыванием без антитела) (см. пример 6), и/илиi) binds (to HLA-G) on JEG3 cells (ATCC No. HTB36) (see Example 5) and inhibits ILT2 binding (to HLA-G) on JEG3 cells (ATCC No. HTB36) (greater than 50% ( in one embodiment, more than 80%)) (compared to binding without antibody) (see example 6), and/or
j) ингибирует связывание CD8a с HLAG более чем на 80% (по сравнению со связыванием без антитела) (см., например, пример 4с), и/илиj) inhibits CD8a binding to HLAG by more than 80% (compared to binding without antibody) (see, for example, example 4c), and/or
k) восстанавливает HLA-G-специфичный пониженный иммунный ответ (например, сниженное высвобождение фактора некроза опухоли альфа (TNF-α)) в моноцитах, совместно культивируемых с клетками JEG-3 (АТСС НТВ36).k) restores an HLA-G-specific reduced immune response (eg, reduced release of tumor necrosis factor alpha (TNF-α)) in monocytes co-cultured with JEG-3 cells (ATCC HTB36).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается (выделенное) антитело, которое связывается с HLA-G человека (в одном варианте антитело связывается с комплексом HLA-G β2М МНС I, включающим последовательность SEQ ID NO: 43), где антитело связывается с одним и тем же эпитопом, что и антитело, включающее последовательность VH SEQ ID NO: 15 и последовательность VL SEQ ID NO: 16.In one embodiment, the present invention provides an (isolated) antibody that binds to human HLA-G (in one embodiment, the antibody binds to an HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 43), wherein the antibody binds to one and the same the same epitope as an antibody comprising the VH sequence of SEQ ID NO: 15 and the VL sequence of SEQ ID NO: 16.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается (выделенное) антитело, которое связывается с HLA-G человека (в одном варианте антитело связывается с комплексом HLA-G β2М МНС I, включающим последовательность SEQ ID NO: 43), где антитело включает:In another embodiment, the present invention provides an (isolated) antibody that binds to human HLA-G (in one embodiment, the antibody binds to an HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 43), wherein the antibody comprises:
а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, (ii) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и (iii) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и (b) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, (ii) HVR-L2, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (iii) HVR-L3, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, иa) a VH domain comprising (i) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, (ii) HVR-H2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and (iii) HVR-H3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, and (b) a VL domain comprising (i) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, (ii) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and (iii) HVR -L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, and
где антитело связывается с комплексом HLA-G β2М МНС I, включающим последовательность SEQ ID NO: 43, связывающая аффинность которого в основном идентична (в одном варианте связывающая аффинность, то есть значение KD, снижается не более, чем в 10 раз по сравнению с антителом, включающим последовательность VH SEQ ID NO: 23 и последовательность VL SEQ ID NO: 24, в другом варианте значение KD снижается не более, чем в 5 раз по сравнению с указанным антителом) (измеренное методом поверхностного плазмонного резонанса).where the antibody binds to the HLA-G β2M MHC I complex, comprising the sequence of SEQ ID NO: 43, the binding affinity of which is basically identical (in one embodiment, the binding affinity, that is, the KD value, is reduced by no more than 10 times compared to the antibody , including the VH sequence of SEQ ID NO: 23 and the VL sequence of SEQ ID NO: 24, in another embodiment, the KD value is reduced by no more than 5 times compared to the specified antibody) (measured by surface plasmon resonance).
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается (выделенное) антитело, которое связывается с HLA-G человека (в одном варианте антитело связывается с комплексом HLA-G β2М МНС I, включающим последовательность SEQ ID NO: 43), где антитело включает:In yet another embodiment, the present invention provides an (isolated) antibody that binds to human HLA-G (in one embodiment, the antibody binds to an HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 43), wherein the antibody comprises:
а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, (ii) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и (iii) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и где домен VH содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или на 100% (в одном предпочтительном варианте на 98% или на 99% или на 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 23, и (b) домен VL, включающий (i) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, (ii) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (iii) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, и где домен VL содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или на 100% (в одном предпочтительном варианте на 98% или на 99% или на 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24,a) a VH domain comprising (i) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, (ii) HVR-H2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and (iii) HVR-H3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, and wherein the VH domain contains an amino acid sequence that is at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% (in one preferred embodiment, 98% or 99% or 100% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, and (b) a VL domain comprising (i) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, (ii) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 , and (iii) an HVR-L3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, and wherein the VL domain contains an amino acid sequence that is at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% ( in one preferred embodiment, 98% or 99% or 100% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24,
и где антитело связывается с комплексом HLA-G β2М МНС I, включающим последовательность SEQ ID NO: 43, связывающая аффинность которого в основном идентична (в одном варианте связывающая аффинность, то есть значение KD, снижается не более, чем в 10 раз по сравнению с антителом, включающим последовательность VH SEQ ID NO: 23 и последовательность VL SEQ ID NO: 24, в другом варианте значение KD снижается не более, чем в 5 раз по сравнению с указанным антителом) (измеренное методом поверхностного плазмонного резонанса), и/или,and where the antibody binds to the HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 43, the binding affinity of which is substantially identical (in one embodiment, the binding affinity, i.e., KD value, is reduced by no more than 10 times compared to an antibody comprising the VH sequence of SEQ ID NO: 23 and the VL sequence of SEQ ID NO: 24, in another embodiment, the KD value is reduced by no more than 5 times compared to the specified antibody) (measured by surface plasmon resonance), and/or,
где антитело независимо характеризуется следующими свойствами:where the antibody is independently characterized by the following properties:
анти-HLA-G антителоanti-HLA-G antibody
a) не проявляет перекрестную реактивность с модифицированным комплексом HLA-G β2М МНС I человека, включающим последовательность SEQ ID NO: 44, и/илиa) does not cross-react with a modified human HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 44, and/or
b) не проявляет перекрестную реактивность с комплексом HLA-A2 β2М МНС I человека, включающим последовательность SEQ ID NO: 39 и последовательность SEQ ID NO: 37, и/илиb) does not cross-react with the human HLA-A2 β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 39 and the sequence of SEQ ID NO: 37, and/or
с) не проявляет перекрестную реактивность с комплексом H2Kd β2М МНС I мыши, включающим последовательность SEQ ID NO: 45, и/илиc) does not cross-react with the H2Kd β2M mouse MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 45, and/or
e) не проявляет перекрестную реактивность с комплексом RT1A β2М МНС I крысы, включающим последовательность SEQ ID NO: 47, и/илиe) does not cross-react with the rat RT1A β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 47, and/or
f) ингибирует связывание ILT2 с мономерным комплексом HLA-G β2М МНС I (включающим последовательность SEQ ID NO: 43), и/илиf) inhibits ILT2 binding to the HLA-G β2M MHC I monomeric complex (comprising the sequence of SEQ ID NO: 43), and/or
g) ингибирует связывание ILT2 с тримерным комплексом HLA-G β2М МНС I (включающим последовательность SEQ ID NO: 43), более чем на 50% (в одном варианте более чем на 60%) (по сравнению со связыванием без антитела) (см. пример 4b), и/илиg) inhibits ILT2 binding to the HLA-G β2M MHC I trimeric complex (comprising the sequence of SEQ ID NO: 43) by more than 50% (in one embodiment, more than 60%) (compared to binding without antibody) (see example 4b), and/or
h) ингибирует связывание ILT2 с мономерным и/или димерным и/или тримерным комплексом HLA-G β2М МНС I (включающим последовательность SEQ ID NO: 43), более чем на 50% (в одном варианте более чем на 80%) (по сравнению со связыванием без антитела) (см. пример 4b), и/илиh) inhibits ILT2 binding to the monomeric and/or dimeric and/or trimeric HLA-G β2M MHC I complex (comprising the sequence of SEQ ID NO: 43) by more than 50% (in one embodiment, more than 80%) (vs. with binding without antibody) (see example 4b), and/or
i) ингибирует связывание ILT2 (с HLA-G) на клетках JEG3 (АТСС No. НТВ36) (более чем на 50% (в одном варианте более чем на 80%)) (по сравнению со связыванием без антитела) (см. пример 6), и/илиi) inhibits ILT2 binding (to HLA-G) on JEG3 cells (ATCC No. HTB36) (more than 50% (in one embodiment more than 80%)) (compared to binding without antibody) (see example 6 ), and/or
j) связывается (с HLA-G) на клетках JEG3 (АТСС No. НТВ36) (см. пример 5), и ингибирует связывание ILT2 (с HLA-G) на клетках JEG3 (АТСС No. НТВ36) (более чем на 50% (в одном варианте более чем на 80%)) (по сравнению со связыванием без антитела) (см. пример 6), и/илиj) binds (to HLA-G) on JEG3 cells (ATCC No. HTB36) (see Example 5), and inhibits ILT2 binding (to HLA-G) on JEG3 cells (ATCC No. HTB36) (greater than 50% (in one embodiment, more than 80%)) (compared to binding without antibody) (see example 6), and/or
k) ингибирует связывание CD8a с HLAG более чем на 80% (по сравнению со связыванием без антитела) (см., например, пример 4 с), и/илиk) inhibits CD8a binding to HLAG by more than 80% (compared to binding without antibody) (see, for example, example 4 c), and/or
l) восстанавливает HLA-G-специфичный пониженный иммунный ответ (например, сниженное высвобождение фактора некроза опухоли альфа (TNFα)) в моноцитах, совместно культивируемых с клетками JEG-3 (АТСС НТВ36).l) restores an HLA-G-specific reduced immune response (eg, reduced release of tumor necrosis factor alpha (TNFα)) in monocytes co-cultured with JEG-3 cells (ATCC HTB36).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается (выделенное) антитело, которое связывается с HLA-G человека (в одном варианте антитело связывается с комплексом HLA-G β2М МНС I, включающим последовательность SEQ ID NO: 43), где антитело связывается с одним и тем же эпитопом, что и антитело, включающее последовательность VH SEQ ID NO: 23 и последовательность VL SEQ ID NO: 24.In one embodiment, the present invention provides an (isolated) antibody that binds to human HLA-G (in one embodiment, the antibody binds to an HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 43), wherein the antibody binds to one and the same the same epitope as an antibody comprising the VH sequence of SEQ ID NO: 23 and the VL sequence of SEQ ID NO: 24.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается (выделенное) антитело, которое связывается с HLA-G человека (в одном варианте антитело связывается с комплексом HLA-G β2М МНС I, включающим последовательность SEQ ID NO: 43), где антитело включает:In another embodiment, the present invention provides an (isolated) antibody that binds to human HLA-G (in one embodiment, the antibody binds to an HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 43), wherein the antibody comprises:
а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, (ii) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и (iii) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и (b) домен VL, включающий (i) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, (ii) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, и (iii) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, иa) a VH domain comprising (i) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, (ii) HVR-H2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and (iii) HVR-H3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and (b) a VL domain comprising (i) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, (ii) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, and (iii) HVR -L3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, and
и где антитело связывается с комплексом HLA-G β2М МНС I, включающим последовательность SEQ ID NO: 43, связывающая аффинность которого в основном идентична (в одном варианте связывающая аффинность, то есть значение KD, снижается не более, чем в 10 раз по сравнению с антителом, включающим последовательность VH SEQ ID NO: 31 и последовательность VL SEQ ID NO: 32, в другом варианте значение KD снижается не более, чем в 5 раз по сравнению с указанным антителом) (измеренное методом поверхностного плазмонного резонанса).and where the antibody binds to the HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 43, the binding affinity of which is substantially identical (in one embodiment, the binding affinity, i.e., KD value, is reduced by no more than 10 times compared to an antibody comprising the VH sequence of SEQ ID NO: 31 and the VL sequence of SEQ ID NO: 32, in another embodiment, the KD value is reduced by no more than 5 times compared to the specified antibody) (measured by surface plasmon resonance).
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается (выделенное) антитело, которое связывается с HLA-G человека (в одном варианте антитело связывается с комплексом HLA-G β2М МНС I, включающим последовательность SEQ ID NO: 43), где антитело включает:In yet another embodiment, the present invention provides an (isolated) antibody that binds to human HLA-G (in one embodiment, the antibody binds to an HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 43), wherein the antibody comprises:
а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, (ii) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и (iii) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и где домен VH включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или на 100% (в одном предпочтительном варианте на 98% или на 99% или на 100%) идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31, и (b) домен VL, включающий (i) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, (ii) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, и (iii) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и где домен VL содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или на 100% (в одном предпочтительном варианте на 98% или на 99% или на 100%) идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32,a) a VH domain comprising (i) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, (ii) HVR-H2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and (iii) HVR-H3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and wherein the VH domain comprises an amino acid sequence that is at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% (in one preferred embodiment, 98% or 99% or 100%) identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31, and (b) a VL domain comprising (i) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, (ii) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, and (iii) an HVR-L3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, and wherein the VL domain contains an amino acid sequence that is at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% (in one preferred embodiment, 98% or 99% or 100%) identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32,
и где антитело связывается с комплексом HLA-G β2М МНС I, включающим последовательность SEQ ID NO: 43, связывающая аффинность которого в основном идентична (в одном варианте связывающая аффинность, то есть значение KD, снижается не более, чем в 10 раз по сравнению с антителом, включающим последовательность VH SEQ ID NO: 31 и последовательность VL SEQ ID NO: 32, в другом варианте значение KD снижается не более, чем в 5 раз по сравнению с указанным антителом) (измеренное методом поверхностного плазмонного резонанса), и/илиand where the antibody binds to the HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 43, the binding affinity of which is substantially identical (in one embodiment, the binding affinity, i.e., KD value, is reduced by no more than 10 times compared to an antibody comprising the VH sequence of SEQ ID NO: 31 and the VL sequence of SEQ ID NO: 32, in another embodiment, the KD value is reduced by no more than 5 times compared to the specified antibody) (measured by surface plasmon resonance), and / or
где антитело независимо характеризуется следующими свойствами:where the antibody is independently characterized by the following properties:
анти-HLA-G антителоanti-HLA-G antibody
a) не проявляет перекрестную реактивность с модифицированным комплексом HLA-G β2М МНС I человека, включающим последовательность SEQ ID NO: 44, и/илиa) does not cross-react with a modified human HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 44, and/or
b) не проявляет перекрестную реактивность с комплексом HLA-A2 β2М МНС I человека, включающим последовательность SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 37, и/илиb) does not cross-react with the human HLA-A2 β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 39 and SEQ ID NO: 37, and/or
c) не проявляет перекрестную реактивность с комплексом H2Kd β2М МНС I мыши, включающим последовательность SEQ ID NO: 45, и/илиc) does not cross-react with the H2Kd β2M mouse MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 45, and/or
d) не проявляет перекрестную реактивность с комплексом RT1A β2М МНС I крысы, включающим последовательность SEQ ID NO: 47, и/илиd) does not cross-react with the rat RT1A β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 47, and/or
e) ингибирует связывание ILT2 с мономерным комплексом HLA-G β2М МНС I (включающим последовательность SEQ ID NO: 43), и/илиe) inhibits ILT2 binding to the HLA-G β2M MHC I monomeric complex (comprising the sequence of SEQ ID NO: 43), and/or
f) ингибирует связывание ILT2 с тримерным комплексом HLA-G β2М МНС I (включающим последовательность SEQ ID NO: 43), более чем на 50% (в одном варианте более чем на 60%) (по сравнению со связыванием без антитела) (см. пример 4b), и/илиf) inhibits ILT2 binding to the HLA-G β2M MHC I trimeric complex (comprising the sequence of SEQ ID NO: 43) by more than 50% (in one embodiment, more than 60%) (compared to binding without antibody) (see example 4b), and/or
g) ингибирует связывание ILT2 с мономерным и/или димерным и/или тримерным комплексом HLA-G β2М МНС I (включающим последовательность SEQ ID NO: 43), более чем на 50% (в одном варианте более чем на 80%) (по сравнению со связыванием без антитела) (см. пример 4b), и/илиg) inhibits ILT2 binding to the monomeric and/or dimeric and/or trimeric HLA-G β2M MHC I complex (comprising the sequence of SEQ ID NO: 43) by more than 50% (in one embodiment, more than 80%) (versus with binding without antibody) (see example 4b), and/or
h) ингибирует связывание ILT2 (с HLA-G) на клетках JEG3 (АТСС No. НТВ36) (более чем на 50% (в одном варианте более чем на 80%)) (по сравнению со связыванием без антитела) (см. пример 6), и/илиh) inhibits ILT2 binding (to HLA-G) on JEG3 cells (ATCC No. HTB36) (more than 50% (in one embodiment more than 80%)) (compared to binding without antibody) (see example 6 ), and/or
i) связывается (с HLA-G) на клетках JEG3 (АТСС No. НТВ36) (см. пример 5) и ингибирует связывание ILT2 (с HLA-G) на клетках JEG3 (АТСС No. НТВ36) (более чем на 50% (в одном варианте более чем на 80%)) (по сравнению со связыванием без антитела) (см. пример 6), и/илиi) binds (to HLA-G) on JEG3 cells (ATCC No. HTB36) (see Example 5) and inhibits ILT2 binding (to HLA-G) on JEG3 cells (ATCC No. HTB36) (greater than 50% ( in one embodiment, more than 80%)) (compared to binding without antibody) (see example 6), and/or
j) ингибирует связывание CD8a с HLAG более чем на 80% (по сравнению со связыванием без антитела) (см., например, пример 4с), и/илиj) inhibits CD8a binding to HLAG by more than 80% (compared to binding without antibody) (see, for example, example 4c), and/or
k) восстанавливает HLA-G-специфичный пониженный иммунный ответ (например, сниженное высвобождение фактора некроза опухоли альфа (TNFα)) в моноцитах, совместно культивируемых с клетками JEG-3 (АТСС НТВ36).k) restores an HLA-G-specific reduced immune response (eg, reduced release of tumor necrosis factor alpha (TNFα)) in monocytes co-cultured with JEG-3 cells (ATCC HTB36).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается (выделенное) антитело, которое связывается с HLA-G человека (в одном варианте антитело связывается с комплексом HLA-G β2М МНС I, включающим последовательность SEQ ID NO: 43), где антитело связывается с одним и тем же эпитопом, что и антитело, включающее VH с последовательностью SEQ ID NO: 31 и VL с последовательностью SEQ ID NO: 32.In one embodiment, the present invention provides an (isolated) antibody that binds to human HLA-G (in one embodiment, the antibody binds to an HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 43), wherein the antibody binds to one and the same the same epitope as an antibody comprising a VH of SEQ ID NO: 31 and a VL of SEQ ID NO: 32.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело представляет собой изотип IgG1. В одном варианте антитело представляет собой изотип IgG1, включающий мутации L234A, L235A и P329G (нумерация согласно EU индексу Кабата).In one embodiment of the present invention, the antibody is an IgG1 isotype. In one embodiment, the antibody is an IgG1 isotype comprising mutations L234A, L235A, and P329G (numbered according to Kabat's EU index).
В другом объекте анти-HLA-G антитело в соответствии с любым из описанных выше вариантов может включать любой из признаков, в отдельности или в комбинации, как описано ниже в разделах 1-7.In another aspect, an anti-HLA-G antibody according to any of the embodiments described above may include any of the features, alone or in combination, as described in sections 1-7 below.
1. Аффинность антител1. Antibody affinity
В определенных вариантах антитело, как описано в данном контексте, характеризуется константой диссоциации (KD) ≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ, ≤0,1 нМ, ≤0,01 нМ или ≤0,001 нМ (например, 10-8 М или менее, например, от 10-8 М до 10-13 М, например, от 10-9 М до 10-13 М).In certain embodiments, an antibody as described herein has a dissociation constant (K D ) of ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM, or ≤0.001 nM ( eg 10 -8 M or less, eg 10 -8 M to 10 -13 M, eg 10 -9 M to 10 -13 M).
В одном предпочтительном варианте величину определяли методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием установки BIACORE® при 25°С с использованием антигена, иммобилизованного на чипы СМ5 (уровень иммобилизации составлял приблизительно 10 условных единиц ответа (RU)). Краткое описание анализа: карбоксиметилированные декстрановые биосенсорные чипы (СМ5, фирмы BIACORE, Inc.) активировали гидрохлоридом N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями фирм-поставщиков. Антиген разбавляли 10 мМ раствором ацетата натрия, рН 4,8, до концентрации 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) и затем его пропускали со скоростью потока 5 мкл/мин до достижения уровня приблизительно 10 условных единиц ответа (RU) связанного белка. После пропускания антигена вводили 1 М раствор этаноламина для блокировки непрореагировавших групп.Для измерения кинетических параметров вводили 2-кратные серийные разведения Fab (от 0,78 нМ до 500 нМ) в буферном растворе PBST (буферный раствор ФСБ, включающий 0,05% ПАВ, полисорбат 20 (TWEEN-20™)) при 25°С со скоростью потока приблизительно 25 мкл/мин. Скорость ассоциации (kon или ka) и скорость диссоциации (koff или kd) рассчитывали с использованием простой модели связывания Ленгмюра один к одному (программное обеспечение BIACORE® Evaluation, версия 3.2) с помощью одновременной апроксимации сенсограмм ассоциации и диссоциации. Равновесную константу диссоциации (KD) рассчитывали в виде отношения kd/ka (koff/kon), см., например, статью Chen и др., J. Mol. Biol., 293, 865-881 (1999). Если по данным метода поверхностного плазмонного резонанса, как описано выше, скорость ассоциации превышает 106 М-1 с-1, то ее можно определять методом тушения флуоресценции, который позволяет измерять увеличение или уменьшение интенсивности испускания флуоресценции (возбуждение = 295 нм, испускание = 340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25°С 20 нМ раствора антитела против антигена (Fab форма) в буферном растворе ФСБ, рН 7.2, в присутствии увеличивающихся концентраций антигена, измеряемых спектрофотометрически, например, с использованием спектрофотометра остановленного потока (фирмы Aviv Instruments) или спектрофотометра SLM-AMINCO™ (фирмы ThermoSpectronie) серии 8000, оборудованный кюветой с перемешиванием.In one preferred embodiment, the value was determined by the method of surface plasmon resonance using a BIACORE ® setup at 25°C using antigen immobilized on CM5 chips (immobilization level was approximately 10 conventional response units (RU)). Brief description of the assay: Carboxymethylated dextran biosensor chips (CM5, BIACORE, Inc.) were activated with N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) according to the supplier's instructions. The antigen was diluted with 10 mM sodium acetate pH 4.8 to a concentration of 5 μg/ml (~0.2 μM) and then passed at a flow rate of 5 μl/min until a level of approximately 10 response units (RU) of bound protein was reached. . After passing the antigen, a 1 M solution of ethanolamine was injected to block unreacted groups. To measure the kinetic parameters, 2-fold serial dilutions of Fab (from 0.78 nM to 500 nM) in PBST buffer solution (PBS buffer solution containing 0.05% surfactant, polysorbate 20 (TWEEN-20™)) at 25° C. with a flow rate of approximately 25 μl/min. Association rate (k on or ka) and dissociation rate (k off or kd) were calculated using a simple one-to-one Langmuir binding model ( BIACORE® Evaluation software version 3.2) by simultaneous fit of association and dissociation sensorgrams. The equilibrium dissociation constant (K D ) was calculated as the ratio kd/ka (k off /k on ), see, for example, Chen et al., J. Mol. Biol., 293, 865-881 (1999). If, according to the surface plasmon resonance method as described above, the association rate exceeds 10 6 M -1 s -1 , then it can be determined by the fluorescence quenching method, which allows you to measure the increase or decrease in the intensity of fluorescence emission (excitation = 295 nm, emission = 340 nm, bandwidth 16 nm) at 25°
2. Фрагменты антитела2. Antibody fragments
В определенных вариантах антитело, как описано в данном контексте, представляет собой фрагмент антитела. Фрагменты антитела включают, но, не ограничиваясь только ими, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv и scFv фрагменты, a также другие фрагменты, описанные ниже. См. обзор, в котором описаны определенные фрагменты антител (Hudson P. J. и др., Nat. Med., 9, сс. 129-134 (2003)). Обзорная характеристика scFv фрагментов приведен, например, в статье Pliickthun, в книге The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, т. 113, Rosenburg и Moore изд., Springer-Verlag, New York, cc. 269-315 (1994), см. также заявку WO 93/16185 и патенты US 5571894 и US 5587458. Обсуждение свойств Fab и F(ab')2 фрагментов, содержащих остатки эпитопа связывания рецептора реутилизации, и характеризующихся повышенным периодом полураспада in vivo, приведено в патенте US 5869046.In certain embodiments, an antibody, as described herein, is an antibody fragment. Antibody fragments include, but are not limited to, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab') 2 , Fv, and scFv fragments, as well as other fragments described below. See review for specific antibody fragments (Hudson PJ et al., Nat. Med., 9, pp. 129-134 (2003)). For an overview characterization of scFv fragments, see, for example, Pliickthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore ed., Springer-Verlag, New York, cc. 269-315 ( 1994 ), see also WO 93/16185 and US Pat. shown in US Pat. No. 5,869,046.
Диатела представляют собой фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими участками, которые могут быть бивалентными или биспецифичными. См., например, патент ЕР 0404097, заявку WO 1993/01161, статьи Hudson P.J. и др., Nat. Med., 9, сс. 129-134 (2003) и Hollinger Р. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, сс. 6444-6448 (1993). Тритела и тетратела описаны также в статье Hudson P.J. и др., Nat. Med., 9, сс. 129-134 (2003).Diabodies are antibody fragments with two antigen-binding sites, which can be bivalent or bispecific. See, for example, EP 0404097, WO 1993/01161, Hudson P.J. and others, Nat. Med., 9, ss. 129-134 (2003) and Hollinger, R. et al., Proc. Natl. Acad. sci. USA, 90, ss. 6444-6448 (1993). Tribodies and tetrabodies are also described in Hudson P.J. and others, Nat. Med., 9, ss. 129-134 (2003).
Однодоменные антитела представляют собой фрагменты антител, включающие весь вариабельный домен тяжелой цепи или часть вариабельного домена тяжелой цепи или весь вариабельный домен легкой цепи или часть вариабельного домена легкой цепи антитела. В определенных вариантах однодоменное антитело представляет собой однодоменное антитело человека (Domantis, Inc., Waltham, MA, см., например, патент US 6248516 B1).Single domain antibodies are antibody fragments comprising all or part of the heavy chain variable domain or all of the light chain variable domain or part of the light chain variable domain of an antibody. In certain embodiments, the single domain antibody is a human single domain antibody (Domantis, Inc., Waltham, MA, see, for example, US Pat. No. 6,248,516 B1).
Фрагменты антител можно получить различными методами, включая, но, не ограничиваясь только ими, расщепление протеолитическими ферментами интактного антитела, а также продуцирование рекомбинантными клетками-хозяина (например, Е. coli или фаг), как описано в данном контексте.Antibody fragments can be obtained by various methods, including, but not limited to, cleavage of intact antibodies with proteolytic enzymes, as well as production by recombinant host cells (eg, E. coli or phage), as described in this context.
3. Гибридные и гуманизированные антитела3. Hybrid and humanized antibodies
В определенных вариантах антитело, как описано в данном контексте, представляет собой гибридное антитело. Определенные гибридные антитела описаны, например, в патенте US 4816567 и статье Morrison S.L. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855 (1984)). В одном примере гибридное антитело включает вариабельную область антител, не относящихся к антителу человека (например, вариабельную область получают из антител мыши, крысы, хомяка, кролика или нечеловекообразного примата, такого как обезьяна), и консервативную область антитела человека. В другом примере гибридное антитело представляет собой антитело "переключенного класса", в котором класс или подкласс был изменен (относительно) по сравнению с исходным антителом. Гибридные антитела включают их антигенсвязывающие фрагменты.In certain embodiments, an antibody as described herein is a hybrid antibody. Certain hybrid antibodies are described in, for example, US Pat. No. 4,816,567 and Morrison S.L. and others, Proc. Natl. Acad. sci. USA, 81, 6851-6855 (1984)). In one example, a fusion antibody includes a non-human antibody variable region (e.g., the variable region is derived from a mouse, rat, hamster, rabbit, or non-human primate such as a monkey) and a conserved region of a human antibody. In another example, a hybrid antibody is a "class-switched" antibody in which the class or subclass has been (relatively) changed from the parent antibody. Hybrid antibodies include their antigen-binding fragments.
В определенных вариантах гибридное антитело представляет собой гуманизированное антитело. Обычно антитело, не относящееся к антителу человека, гуманизируют для снижения их иммуногенности для человека, сохраняя при этом специфичность и аффинность исходного антитела не относящееся к антителу человека. В основном гуманизированное антитело включает один или более вариабельных доменов, в которых HVR, например, CDR (или их части) получены из антитела, не относящегося к антителу человека, a FR (или их части) получены из последовательностей антител человека. Гуманизированное антитело необязательно также может включать по меньшей мере часть консервативной области человека. В некоторых вариантах, некоторые аминокислотные остатки FR в гуманизированном антителе заменены на соответствующие остатки антитела, не относящегося к антителу человека (например, антитела, из которого получены остатки HVR), например, для восстановления или повышения специфичности или аффинности антитела.In certain embodiments, the hybrid antibody is a humanized antibody. Typically, a non-human antibody is humanized to reduce their immunogenicity in humans while retaining the specificity and affinity of the parent non-human antibody. In general, a humanized antibody comprises one or more variable domains in which the HVRs, e.g., CDRs (or portions thereof) are derived from a non-human antibody, and FRs (or portions thereof) are derived from human antibody sequences. The humanized antibody may optionally also include at least a portion of a human conserved region. In some embodiments, some FR amino acid residues in a humanized antibody are replaced with the corresponding non-human antibody residues (e.g., the antibody from which the HVR residues are derived), e.g., to restore or increase the specificity or affinity of the antibody.
Гуманизированные антитела и способы их получения представлены, например, в статье Almagro J.С. и Fransson J., Front. Biosci., 13, 1619-1633 (2008), а также описаны, например, в статьях Riechmann I. и др., Nature, 332, 323-329 (1988), Queen С. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 10029-10033 (1989), патентах US 5821337, US 7527791, US 6982321 и US 7087409, статьях Kashmiri S.V. и др., Methods, 36, 25-34 (2005) (описана прививка SDR (a-CDR)), Padlan E.A., Mol. Immunol., 28, 489-498 (1991) (описана "перекладка доменов"), Dall'Acqua, W.F. и др., Methods, 36, 43-60 (2005) (описана "перестановка FR") и Osbourn J. и др., Methods, 36, 61-68 (2005), а также Klimka А. и др., Br. J. Cancer, 83, 252-260 (2000) (описана методика "направленной селекции" при перестановке FR).Humanized antibodies and methods for their production are presented, for example, in the article Almagro J.C. and Fransson, J., Front. Biosci., 13, 1619-1633 (2008) and also described, for example, in Riechmann I. et al., Nature, 332, 323-329 (1988), Queen C. et al., Proc. Natl. Acad. sci. USA, 86, 10029-10033 (1989), US Pat. et al., Methods, 36, 25-34 (2005) (SDR (a-CDR) grafting is described), Padlan E.A., Mol. Immunol., 28, 489-498 (1991) (domain flipping is described), Dall'Acqua, W.F. et al., Methods, 36, 43-60 (2005) (described "FR permutation") and Osbourn J. et al., Methods, 36, 61-68 (2005) and Klimka A. et al., Br . J. Cancer, 83, 252-260 (2000) (describes "directed selection" technique in FR permutation).
Каркасные области антител человека, которые можно использовать для гуманизации, включают, но, не ограничиваясь только ими: каркасные области, выбранные с использованием метода "наилучшего соответствия (наилучшей подгонки)" (см., например, статью Sims M.J. и др., J. Immunol., 151, 2296-2308 (1993), каркасные области, полученные из консенсусной последовательности антител человека конкретной подгруппы вариабельных областей легкой и тяжелой цепи (см., например, статьи Carter Р. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 4285-4289 (1992) и Presta L.G. и др., J. Immunol., 151 2623-2632 (1993)), зрелые (соматически мутированные) каркасные области антител человека или каркасные области эмбриональной линии человека (см., например, статью Almagro J.С. и Fransson J., Front. Biosci., 13, 1619-1633 (2008)) и каркасные области, полученные при скрининге FR-библиотек (см., например, статьи Васа М. и др., J. Biol. Chem., 272 10678-10684 (1997) и Rosok M.J. и др., J. Biol. Chem., 271, 22611-22618 (1996).Framework regions of human antibodies that can be used for humanization include, but are not limited to: framework regions selected using the "best fit (best fit)" method (see, for example, Sims M.J. et al., J. Immunol., 151, 2296-2308 (1993), framework regions derived from the consensus sequence of human antibodies of a particular subgroup of light and heavy chain variable regions (see, for example, Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89 4285-4289 (1992) and Presta L. G. et al., J. Immunol., 151 2623-2632 (1993)), mature (somatically mutated) human antibody framework regions or human embryonic lineage framework regions (see for example, Almagro J. C. and Fransson J., Front Biosci., 13, 1619-1633 (2008)) and framework regions obtained from screening FR libraries (see, for example, Vasa M. et al. , J. Biol. Chem., 272 10678-10684 (1997) and Rosok, M. J. et al., J. Biol. Chem., 271, 22611-22618 (1996).
4. Антитела человека4. Human antibodies
В определенных вариантах антитело, как описано в данном контексте, представляет собой антитело человека. Антитела человека можно получить с использованием различных методов, известных специалисту в данной области техники. Антитела человека в основном описаны в статьях van Dijk М.А. и van de Winkel J.G., Curr. Opin. Pharmacol., 5, 368-374 (2001) и Lonberg N., Curr. Opin. Immunol., 20, 450-459 (2008).In certain embodiments, the antibody, as described herein, is a human antibody. Human antibodies can be obtained using various methods known to the person skilled in the art. Human antibodies are mainly described in articles by M.A. van Dijk. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol., 5, 368-374 (2001) and Lonberg N., Curr. Opin. Immunol., 20, 450-459 (2008).
Антитела человека можно получить при введении иммуногена трансгенному животному, которое было модифицировано для продуцирования интактных антител человека или интактных антител с вариабельными областями человека в ответ на сенсибилизацию антигеном. Указанные животные обычно содержат все или часть локусов иммуноглобулина человека, которые заменяют эндогенные локусы иммуноглобулина или которые присутствуют вне хромосом или интегрированы случайным образом в хромосомы животного. У таких трансгенных мышей локусы эндогенного иммуноглобулина обычно инактивированы. Подробное описание методов получения антител человека в трансгенных животных см. в статье Lonberg N., Nat. Biotech., 23, 1117-1125 (2005). См. также, например, патенты US 6075181 и US 6150584, где описана технология XENOMOUSE™, патент US 5770429, где описана технология HUMAB ®, патент US 7041870, где описана технология K-М MOUSE®, а также заявку US 2007/0061900, где описана технология VELOCIMOUSE. Вариабельные области интактных антител человека, полученные в указанных животных, можно дополнительно модифицировать, например, комбинируя с другой консервативной областью антитела человека.Human antibodies can be generated by administering an immunogen to a transgenic animal that has been modified to produce intact human antibodies or intact human variable region antibodies in response to antigen sensitization. These animals typically contain all or part of the human immunoglobulin loci that replace endogenous immunoglobulin loci or that are present outside the chromosomes or are integrated randomly into the chromosomes of the animal. In such transgenic mice, endogenous immunoglobulin loci are usually inactivated. For a detailed description of methods for obtaining human antibodies in transgenic animals, see Lonberg N., Nat. Biotech., 23, 1117-1125 (2005). See also , for example, US Pat . /0061900, which describes V ELOCI M OUSE technology. Variable regions of intact human antibodies obtained in these animals can be further modified, for example by combining with another conserved region of a human antibody.
Антитела человека также можно получить методами на основе гибридом. В литературе описаны клеточные линии миеломы человека и гетеромиеломы мыши-человека для продуцирования моноклональных антител человека (см., например, статью Kozbor D., J. Immunol., 133 3001-3005 (1984), работу Brodeur B.R. и др., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 51-63 (1987), и статью Boerner P. и др., J. Immunol., 147, 86-95 (1991)). Антитела человека, полученные по технологии гибридом В-клеток человека, также описаны в статье Li, J. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103 3557-3562 (2006). Дополнительные способы, включают способы, описанные, например, в патенте US 7189826 (где описано получение моноклональных IgM антител человека с использованием клеточных линий гибридом) и статье Ni J., Xiandai Mianyixue, 26, 265-268 (2006) (где описаны гибридомы человек-человек). Технология гибридом человека (технология Trioma) описана также в статье Vollmers Н.Р. и Brandlein S., Histology and Histopathology, 20, 927-937 (2005) и работе Vollmers Н.Р. и Brandlein S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27, 185-191 (2005).Human antibodies can also be obtained by hybridoma-based methods. Human myeloma and mouse-human heteromyeloma cell lines for the production of human monoclonal antibodies have been described in the literature (see, for example, Kozbor D., J. Immunol., 133 3001-3005 (1984), Brodeur B.R. et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 51-63 (1987), and Boerner P. et al., J. Immunol., 147, 86-95 (1991)). Human B cell hybridoma antibodies are also described in Li, J. et al., Proc. Natl. Acad. sci. USA, 103 3557-3562 (2006). Additional methods include those described in, for example, US Pat. -Human). Human hybridoma technology (Trioma technology) is also described in Vollmers H.R. and Brandlein S., Histology and Histopathology, 20, 927-937 (2005) and Vollmers H.R. and Brandlein S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27, 185-191 (2005).
Антитела человека можно также получить при выделении последовательностей вариабельных доменов Fv-клонов, выбранных из библиотек фагового дисплея антител человека. Указанные последовательности вариабельных доменов затем можно объединить с требуемым консервативным доменом антитела человека. Методики выбора антител человека из библиотек антител описаны ниже.Human antibodies can also be obtained by isolating the variable domain sequences of Fv clones selected from human antibody phage display libraries. These variable domain sequences can then be combined with the desired conserved human antibody domain. Methods for selecting human antibodies from antibody libraries are described below.
5. Антитела, полученные с использованием библиотек5. Antibodies obtained using libraries
Антитела по настоящему изобретению можно выделить с использованием скрининга комбинаторных библиотек для антител с требуемой активностью или активностями. Например, в данной области техники известно множество способов создания библиотек фагового дисплея и скрининга таких библиотек для антител, обладающих требуемыми характеристиками связывания. Указанные способы описаны, например, в обзоре Hoogenboom H.R. и др., Methods in Molecular Biology, 178, 1-37 (2001), и дополнительно описаны, например, в статьях McCafferty J. и др., Nature, 348, 552-554 (1990), Clackson Т. и др., Nature, 352, 624-628 (1991), Marks J.D. и др., J. Mol. Biol., 222, 581-597 (1992), Marks J.D. и Bradbury A., Methods in Molecular Biology, 248, 161-175 (2003), Sidhu S.S. и др., J. Mol. Biol., 338, 299-310 (2004), Lee C.V. и др., J. Mol. Biol., 340, 1073-1093 (2004), Fellouse F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 12467-12472 (2004) и Lee C.V. и др., J. Immunol. Methods, 284, 119-132 (2004).The antibodies of the present invention can be isolated by screening combinatorial libraries for antibodies with the desired activity or activities. For example, many methods are known in the art for creating phage display libraries and screening such libraries for antibodies having the desired binding characteristics. These methods are described, for example, in the review Hoogenboom H.R. et al., Methods in Molecular Biology, 178, 1-37 (2001), and are further described, for example, in McCafferty J. et al., Nature, 348, 552-554 (1990), Clackson T. et al. , Nature, 352, 624-628 (1991), Marks J.D. et al., J. Mol. Biol., 222, 581-597 (1992), Marks J.D. and Bradbury A., Methods in Molecular Biology, 248, 161-175 (2003), Sidhu S.S. et al., J. Mol. Biol., 338, 299-310 (2004), Lee C.V. et al., J. Mol. Biol., 340, 1073-1093 (2004), Fellouse F.A., Proc. Natl. Acad. sci. USA, 101, 12467-12472 (2004) and Lee C.V. et al., J. Immunol. Methods, 284, 119-132 (2004).
В определенных способах фагового дисплея репертуары генов VH и VL раздельно клонируют с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) и произвольным образом рекомбинируют в фаговых библиотеках, и затем проводят их скрининг для антигенсвязывающего фага, как описано в статье Winter G. и др., Ann. Rev. Immunol., 12, 433-455 (1994). Как правило, фаги отображают фрагменты антител либо в виде одноцепочечных Fv (scFv) фрагментов, либо в виде Fab фрагментов. Библиотеки из иммунизированных источников предоставляют высокоаффинные антитела в отношении иммуногена без необходимости конструирования гибридом. В другом варианте можно клонировать "наивный" репертуар (например, человека), чтобы обеспечить единый источник антител к широкому диапазону "чужеродных", а также "собственных" антигенов без какой-либо иммунизации, как описано в статье Griffiths A.D. и др., EMBO J., 12, 725-734 (1993). Наконец, наивные библиотеки также можно получить синтетическим методом при клонировании сегментов неперегруппированного V-гена из стволовых клеток, а также с использованием ПЦР-праймеров, содержащих случайную последовательность, с тем, чтобы кодировать высоковариабельные CDR3 области и осуществить перегруппировку in vitro, как описано в статье Hoogenboom H.R. и Winter G., J. Mol. Biol., 227, 381-388 (1992). Фаговые библиотеки антител человека описаны, например, в патенте US 5750373 и заявках US 2005/0079574, US 2005/0119455, US 2005/0266000, US 2007/0117126, US 2007/0160598, US 2007/0237764, US 2007/0292936 и US 2009/0002360.In certain phage display methods, the VH and VL gene repertoires are separately cloned using polymerase chain reaction (PCR) and randomly recombined in phage libraries and then screened for antigen-binding phage as described in Winter G. et al., Ann. Rev. Immunol., 12, 433-455 (1994). Typically, phages display antibody fragments either as single chain Fv (scFv) fragments or as Fab fragments. Libraries from immunized sources provide high affinity antibodies for the immunogen without the need for hybridoma construction. Alternatively, a "naive" repertoire (e.g., human) can be cloned to provide a single source of antibodies to a wide range of "foreign" as well as "self" antigens without any immunization, as described in Griffiths A.D. et al., EMBO J., 12, 725-734 (1993). Finally, naive libraries can also be generated synthetically by cloning non-rearranged V-gene segments from stem cells, and by using PCR primers containing a random sequence to encode highly variable CDR3 regions and perform in vitro rearrangement as described in the article. Hoogenboom H.R. and Winter G., J. Mol. Biol., 227, 381-388 (1992). Human antibody phage libraries are described, for example, in US 5750373 and US 2005/0079574; US 2005/0119455; US 2005/0266000; /0292936 and US 2009/0002360.
Антитела или фрагменты антитела, выделенные из библиотек антител человека, рассматриваются в данном контексте, как антитела человека или фрагменты антител человека.Antibodies or antibody fragments isolated from human antibody libraries are referred to herein as human antibodies or human antibody fragments.
6. Мультиспецифичные антитела6. Multispecific antibodies
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения антитело, как описано в данном контексте, представляет собой мультиспецифичное антитело, например, биспецифичное антитело. Мультиспецифичные антитела представляют собой моноклональные антитела, которые характеризуются связывающимися специфичностями в отношении по меньшей мере двух различных сайтов. В определенных вариантах одна связывающая специфичность относится к связыванию с HLA-G, а другая специфичность относится к любому другому антигену. Биспецифичные антитела можно получить в виде полноразмерных антител или фрагментов антител.In certain embodiments, the implementation of the present invention, the antibody, as described in this context, is a multispecific antibody, for example, bispecific antibody. Multispecific antibodies are monoclonal antibodies that have binding specificities for at least two different sites. In certain embodiments, one binding specificity is for binding to HLA-G and the other specificity is for any other antigen. Bispecific antibodies can be obtained as full length antibodies or antibody fragments.
Методики получения мультиспецифичных антител включают, но, не ограничиваясь только ими, рекомбинантную совместную экспрессию двух пар тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулина, которые характеризуются различающимися специфичностями (см. статью Milstein С.и Cuello А.С, Nature, 305, 537-540 (1983), заявку WO 93/08829 и статью Traunecker А. и др., EMBO J., 10, 3655-3659 (1991)), а также создание конструкций типа "выступ-во-впадину" ("knob-in-hole", см., например, патент US 5731168). Мультиспецифичные антитела также можно получить при конструировании с использованием эффектов электростатического взаимодействия для создания Fc-гетеродимерных молекул антител (см. заявку WO 2009/089004), с использованием перекрестной сшивки двух или более антител или фрагментов (см., например, патент US 4676980 и статью Brennan М. и др., Science, 229, 81-83 (1985)), с использованием "лейциновых молний" для получения биспецифичных антител (см., например, статью Kostelny S.A. и др., J. Immunol., 148, 1547-1553 (1992)), при использовании технологии "диател" для получения биспецифичных фрагментов антител (см., например, статью Hollinger Р. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 6444-6448 (1993)), а также при использовании димеров одноцепочечных Fv (scFv) (см., например, статью Gruber М. и др., J. Immunol., 152, 5368-5374 (1994)), и получении триспецифичных антител, как описано, например, в статье Tutt А. и др., J. Immunol., 147, 60-69 (1991)).Techniques for producing multispecific antibodies include, but are not limited to, recombinant coexpression of two immunoglobulin heavy chain-light chain pairs that have differing specificities (see Milstein C. and Cuello A.C., Nature, 305, 537-540 ( 1983), WO 93/08829 and Traunecker, A. et al. ", see, for example, US patent 5731168). Multispecific antibodies can also be generated by design using electrostatic interaction effects to create Fc-heterodimeric antibody molecules (see WO 2009/089004), using cross-linking of two or more antibodies or fragments (see, for example, US patent 4676980 and article Brennan M. et al., Science, 229, 81-83 (1985)), using "leucine zippers" to generate bispecific antibodies (see, for example, Kostelny S. A. et al., J. Immunol., 148, 1547 -1553 (1992)), using diabody technology to generate bispecific antibody fragments (see, for example, Hollinger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 6444-6448 (1993) ), as well as when using dimers of single-chain Fv (scFv) (see, for example, Gruber M. and others, J. Immunol., 152, 5368-5374 (1994)), and obtaining trispecific antibodies, as described, for example , in Tutt A. et al., J. Immunol., 147, 60-69 (1991)).
Сконструированные антитела с тремя или более функциональными антигенсвязывающими сайтами, включая "антитела-осьминоги (octopus antibodies)", также включены в настоящее описание (см., например, заявку US 2006/0025576).Engineered antibodies with three or more functional antigen-binding sites, including "octopus antibodies", are also included in the present description (see, for example, US application 2006/0025576).
Антитело или фрагмент, как описано в данном контексте, также включает "FAb двойного действия" или "DAF", включающий антигенсвязывающий сайт, который связывается с HLA-G, а также с другим отличающимся антигеном (см., например, заявку US 2008/0069820).An antibody or fragment as described herein also includes a "dual acting FAb" or "DAF" comprising an antigen-binding site that binds to HLA-G as well as another distinct antigen (see, for example, US 2008/0069820 ).
Антитело или фрагмент, как описано в данном контексте, также включают мультиспецифичные антитела, описанные в заявках WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 и WO 2010/145793, WO 2011/117330, WO 2012/025525, WO 2012/025530, WO 2013/026835, WO 2013/026831, WO 2013/164325 или WO 2013/174873.An antibody or fragment as described herein also includes the multispecific antibodies described in WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 20 10 /136172, WO 2010/145792 and WO 2010/145793, WO 2011/117330, WO 2012/025525, WO 2012/025530, WO 2013/026835, WO 2013/026831, WO 2013/1 64325 or WO 2013/174873.
7. Варианты антител7. Antibody variants
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения предполагаются варианты аминокислотной последовательности антител, описанных в данном контексте. Например, может потребоваться улучшить связывающую аффинность и/или другие биологические свойства антитела. Варианты аминокислотной последовательности антитела можно получить за счет осуществления соответствующих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, или в результате пептидного синтеза. Такие модификации включают, например, делеции и/или вставки и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Любую комбинацию делеции, вставки и замены можно использовать для получения конечной конструкции при условии, что конечная конструкция обладает требуемыми характеристиками, например, антигенсвязывающими свойствами. а) Варианты замены, вставки и делеции аминокислот В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются варианты антитела, содержащие одну или более аминокислотных замен. Исследуемые сайты для заместительного мутагенеза, включают HVR и FR. Типичные изменения приведены в таблице 1 в столбце "Типичные замены", и описаны ниже с указанием типов боковых групп в составе аминокислоты. Консервативные замены приведены в таблице 1 в столбце "Предпочтительные замены". Аминокислотные замены можно вводить в исследуемое антитело, и продукты можно подвергать скринингу в отношении требуемой активности, например, сохраненного/улучшенного связывания с антигеном, сниженной иммуногенностью или улучшенной ADCC или CDC.In certain embodiments of the present invention, amino acid sequence variants of the antibodies described herein are contemplated. For example, it may be desirable to improve the binding affinity and/or other biological properties of an antibody. Variants of the amino acid sequence of an antibody can be obtained by making appropriate modifications to the nucleotide sequence encoding the antibody, or by peptide synthesis. Such modifications include, for example, deletions and/or insertions and/or substitutions of residues in the amino acid sequences of the antibody. Any combination of deletion, insertion, and substitution can be used to produce the final construct, provided that the final construct has the desired characteristics, such as antigen-binding properties. a) Amino acid substitution, insertion, and deletion variants In certain embodiments, the present invention provides antibody variants containing one or more amino acid substitutions. Sites of interest for substitutional mutagenesis include HVR and FR. Typical changes are shown in Table 1 in the "Typical Substitutions" column, and are described below with an indication of the types of side groups in the amino acid composition. Conservative substitutions are shown in Table 1 in the "Preferred Substitutions" column. Amino acid substitutions can be introduced into the antibody of interest and products can be screened for desired activity, eg, retained/improved antigen binding, reduced immunogenicity, or improved ADCC or CDC.
Аминокислоты можно сгруппировать в соответствии с общими свойствами боковой группы:Amino acids can be grouped according to the general properties of the side group:
(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile,(1) Hydrophobic: Norleucine, Met, Ala, Val, Leu, Ile,
(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln,(2) neutral hydrophilic: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln,
(3) кислотные: Asp, Glu,(3) acidic: Asp, Glu,
(4) основные: His, Lys, Arg,(4) main: His, Lys, Arg,
(5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: Gly, Pro,(5) residues affecting chain orientation: Gly, Pro,
(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.(6) aromatic: Trp, Tyr, Phe.
Неконсервативные замены приводят к замене члена одного из этих классов на члена другого класса.Non-conservative substitutions result in replacing a member of one of these classes with a member of another class.
Один из типов варианта с заменами включает замену одного или более остатков в гипервариабельных участках исходного антитела (например, гуманизированного антитела или антитела человека). Как правило, полученный вариант (варианты), выбранный для последующего изучения, будет характеризоваться модификациями (например, улучшением) некоторых биологических свойств (например, характеризоваться повышенной аффинностью, пониженной иммуногенностью) по сравнению с исходным антителом и/или в значительной степени сохранит определенные биологические свойства исходного антитела. Типичным вариантом с заменой является антитело с "созревшей аффинностью", которое можно получить простым методом, например, с использованием методов "созревания аффинности", основанных на применении фагового дисплея, как описано в данном контексте. Краткое описание: один или более остатков HVR подвергают мутации и проводят скрининг вариантов антитела, отображаемых фагом, для выявления антител с определенной биологической активностью (например, связывающей аффинностью).One type of variant with substitutions involves replacing one or more residues in the hypervariable regions of the parent antibody (eg, a humanized or human antibody). Typically, the resulting variant(s) selected for further study will have modifications (e.g., improvement) in certain biological properties (e.g., increased affinity, reduced immunogenicity) compared to the parent antibody and/or will largely retain certain biological properties. original antibody. An exemplary substitution variant is an affinity matured antibody that can be generated by a simple method, for example, using phage display based affinity maturation methods as described herein. Briefly, one or more HVR residues are mutated and phage-displayed antibody variants are screened for antibodies with a particular biological activity (eg, binding affinity).
Изменения (например, замены) можно выполнять в HVR, например, для улучшения аффинности антитела. Указанные изменения можно проводить в "горячих точках мутагенеза" HVR, т.е. в остатках, кодируемых кодонами, которые в процессе соматического созревания с высокой частотой подвергаются мутациям (см., например, статью Chowdhury P.S., Methods Mol. Biol., 207, 179-196 (2008)), и/или SDR (a-CDR), при этом полученный вариант VH или VL тестируют в отношении связывающей аффинности. Осуществление аффинного созревания с помощью конструирования и повторного отбора из вторичных библиотек описано, например, в статье Hoogenboom H.R. и др. в книге Methods in Molecular Biology, 178, 1-37 (2002). В некоторых вариантах метода созревания аффинности в вариабельные гены, выбранные для созревания, вносят разнообразно любым из ряда способов (например, ПЦР сниженной точности, перестановки цепей или олигонуклеотид-направленного мутагенеза). Затем создают вторичную библиотеку. Затем проводят скрининг данной библиотеки для идентификации любых вариантов антитела с требуемой аффинностью. Другой способ внесения разнообразия включает HVR-направленные подходы, при которых рандомизируют несколько остатков HVR (например, 4-6 остатков одновременно). Остатки HVR, участвующие в связывании антигена, можно специфически идентифицировать, например, используя аланин-сканирующий мутагенез или моделирование. Особенно часто мишенью становятся CDR-H3 и CDR-L3.Changes (eg, substitutions) can be made in the HVR, eg, to improve the affinity of the antibody. These changes can be carried out at the "hot spots of mutagenesis" HVR, ie. in residues encoded by codons that undergo mutations at a high frequency during somatic maturation (see, for example, Chowdhury P.S., Methods Mol. Biol., 207, 179-196 (2008)), and/or SDR (a-CDR ), while the resulting VH or VL variant is tested for binding affinity. The implementation of affinity maturation by constructing and reselecting from secondary libraries is described, for example, in an article by Hoogenboom H.R. and others in Methods in Molecular Biology, 178, 1-37 (2002). In some embodiments of the affinity maturation method, the variable genes selected for maturation are varied in any of a number of ways (eg, reduced precision PCR, strand shuffling, or oligonucleotide directed mutagenesis). Then a secondary library is created. This library is then screened to identify any antibody variants with the desired affinity. Another mode of diversity includes HVR-directed approaches, in which several HVR residues are randomized (eg, 4-6 residues at a time). HVR residues involved in antigen binding can be specifically identified, for example, using alanine-scanning mutagenesis or modeling. CDR-H3 and CDR-L3 are especially often targeted.
В определенных вариантах замены, вставки или делеции можно осуществлять в пределах одного или более HVR при условии, что такие изменения существенно не снижают способность антитела связываться с антигеном. Например, в HVR можно вносить консервативные изменения (например, консервативные замены, как описано в данном контексте), которые существенно не снижают связывающую аффинность. Указанные изменения можно располагать за пределами "горячих точек" HVR или SDR. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения в составе вариантов последовательностей VH и VL, приведенных выше, каждый HVR либо остается без изменений, либо содержит не более одной, двух или трех аминокислотных замен.In certain embodiments, substitutions, insertions, or deletions can be made within one or more HVRs, provided that such changes do not significantly reduce the ability of the antibody to bind to the antigen. For example, conservative changes (eg, conservative substitutions as described herein) can be made to the HVR that do not significantly reduce binding affinity. These changes can be placed outside of HVR or SDR hotspots. In certain embodiments, within the VH and VL sequence variants above, each HVR either remains unchanged or contains no more than one, two, or three amino acid substitutions.
Пригодным способом определения остатков или участков антитела, которые могут служить в качестве мишеней мутагенеза, является "аланин-сканирующий мутагенез", описанный в статье Cunningham B.C. и Wells J.А., Science, 244, 1081-1085 (1989). В указанном способе идентифицируют остаток или группу остатков-мишеней (например, заряженные остатки, такие как остатки arg, asp, his, lys и glu) и заменяют на остатки нейтральной или отрицательно заряженной аминокислоты (например, аланин или полиаланин), чтобы определить, повлияет ли такая замена на взаимодействие антитела с антигеном. В положениях аминокислот, проявляющих функциональную чувствительность к первоначальным заменам, можно осуществлять дальнейшие замены. В другом варианте или дополнительно можно провести анализ кристаллической структуры комплекса антиген-антитело для выявления точек контакта между антителом и антигеном. Такие контактирующие остатки и соседние с ними остатки можно выбрать в качестве кандидатов на замену или исключить их. Варианты можно подвергать скринингу, чтобы определить, характеризуются ли они требуемыми свойствами.A useful method for identifying antibody residues or regions that can serve as targets for mutagenesis is "alanine-scanning mutagenesis" as described in Cunningham B.C. and Wells J.A., Science, 244, 1081-1085 (1989). In said method, a residue or group of target residues (e.g., charged residues such as arg, asp, his, lys, and glu residues) are identified and replaced with neutral or negatively charged amino acid residues (e.g., alanine or polyalanine) to determine if whether such a replacement for the interaction of an antibody with an antigen. At amino acid positions that are functionally sensitive to the initial substitutions, further substitutions can be made. Alternatively, or additionally, the crystal structure of the antigen-antibody complex can be analyzed to identify points of contact between the antibody and antigen. Such contact residues and adjacent residues can be selected as replacement candidates or eliminated. Variants can be screened to determine if they have the desired properties.
Вставки аминокислотной последовательности включают присоединяемые к N- и/или С-концевому остатку вставки длиной от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также вставки одного или нескольких аминокислотных остатков внутри последовательности. Примеры концевых вставок включают антитело с N-концевым остатком метионина. Другие варианты молекулы антитела со вставками включают молекулы, где к N-или С-концевому остатку антитела присоединен фермент (например, для ADEPT) или полипептид, который увеличивает период полураспада антитела в сыворотке.Amino acid sequence inserts include N- and/or C-terminal residue inserts ranging in length from one residue to polypeptides containing one hundred or more residues, as well as insertions of one or more amino acid residues within the sequence. Examples of end inserts include an antibody with an N-terminal methionine residue. Other variants of the insert antibody molecule include those where an enzyme (eg, for ADEPT) or a polypeptide is attached to the N- or C-terminal residue of the antibody, which increases the serum half-life of the antibody.
b) Варианты Fc областиb) Fc region options
В определенных вариантах одну или более модификаций аминокислот можно осуществить в Fc-области антитела, как описано в данном контексте, создавая тем самым вариант Fc-области. Вариант Fc-области может включать последовательность Fc-области антитела человека (например, Fc-область IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека), содержащую модификацию аминокислоты (например, замену) в одном или нескольких положениях аминокислот.In certain embodiments, one or more amino acid modifications can be made to the Fc region of an antibody, as described herein, thereby creating a variant Fc region. An Fc region variant may include a human antibody Fc region sequence (eg, a human IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 Fc region) containing an amino acid modification (eg, substitution) at one or more amino acid positions.
Антитела, характеризующиеся сниженной эффекторной функцией, включают антитела с заменой одного или более остатков в положениях 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 в Fc-области (см. патент US 6737056). Такие мутированные Fc включают мутированные Fc с заменами двух или более остатков в положениях аминокислот 265, 269, 270, 297 и 327, включая так называемый "DANA" мутированный Fc, в котором аминокислотные остатки в положении 265 и 297 заменены на аланин (см. патент US 7332581).Antibodies with reduced effector function include those with one or more substitutions at positions 238, 265, 269, 270, 297, 327 and 329 in the Fc region (see US Pat. No. 6,737,056). Such mutated Fcs include mutated Fcs with two or more residue substitutions at amino acid positions 265, 269, 270, 297 and 327, including the so-called "DANA" mutated Fc in which amino acid residues at positions 265 and 297 are changed to alanine (see patent US 7332581).
Определенные варианты антител, характеризующиеся повышенным или уменьшенным связыванием с FcR, описаны в литературе (см., например, патент US 6737056, заявку WO 2004/056312 и статью Shields R.L. и др., J. Biol. Chem., 276, 6591-6604 (2001)).Certain antibody variants characterized by increased or decreased FcR binding are described in the literature (see, for example, US Pat. (2001)).
В одном варианте изобретения указанное антитело представляет собой IgG1, которое содержит мутации L234A и L235A или мутации L234A, L235A и P329G. В другом варианте антитело представляет собой IgG4, которое содержит мутации S228P и L235E или S228P, L235E или/и P329G (нумерация согласно EU индексу Кабата, как описано в статье Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5oe изд., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).In one embodiment, said antibody is an IgG1 that contains L234A and L235A mutations or L234A, L235A and P329G mutations. In another embodiment, the antibody is an IgG4 that contains the S228P and L235E or S228P, L235E or/and P329G mutations (numbered according to Kabat's EU index as described in Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).
Антитела с увеличенным периодом полураспада и улучшенным связыванием с неонатальным Fc рецептором (FcRn), который отвечает за перенос материнских IgG к плоду (см. статьи Guyer R.L. и др., J. Immunol., 117, 587-593 (1976), и Kim J.K. и др., J. Immunol., 24, 2429-2434 (1994)), описаны в заявке US 2005/0014934. Указанные антитела содержат Fc область с одной или несколькими заменами, которые приводят к улучшению связывания Fc области с FcRn. Указанные варианты Fc включают варианты с заменами одного или более остатков Fc области в положениях: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 или 434, например, с заменой в Fc области остатка в положении 434 (см. патент US 7371826).Antibodies with extended half-life and improved binding to the neonatal Fc receptor (FcRn), which is responsible for the transfer of maternal IgG to the fetus (see Guyer R.L. et al., J. Immunol., 117, 587-593 (1976), and Kim J. K. et al., J. Immunol., 24, 2429-2434 (1994)), are described in US 2005/0014934. Said antibodies contain an Fc region with one or more substitutions that result in improved binding of the Fc region to FcRn. These Fc variants include those with substitutions of one or more Fc region residues at positions: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, or 434, for example, with a substitution in the Fc region of the residue at position 434 (see US Pat. No. 7,371,826).
Описание других примеров вариантов Fc области смотри также в статье Duncan A.R. и Winter G., Nature, 322, 738-740 (1988), патентах US 5648260, US 5624821 и заявке WO 94/29351.For a description of other examples of Fc region variants, see also Duncan A.R. and Winter G., Nature, 322, 738-740 (1988), US Pat. Nos. 5,648,260, US 5,624,821 and WO 94/29351.
c) Варианты сконструированных антител, содержащие цистеинc) Cysteine engineered antibody variants
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения целесообразным является конструирование модифицированных цистеином антител, например, "thioMAbs", в которых один или несколько остатков антитела заменены на остатки цистеина. В конкретных вариантах осуществления изобретения заменяемые остатки располагаются в доступных сайтах антитела. При замене этих остатков на цистеин реакционно-способные тиоловые группы расположены в доступных сайтах антитела и их можно использовать для конъюгирования антитела с другими фрагментами, например, такими как фрагменты в виде лекарственного средства или фрагменты в виде лекарственного средства, соединенного с линкером, для создания иммуноконъюгата, как описано ниже в данном контексте. В определенных вариантах на цистеин можно заменить любой один или более из следующих остатков: V205 (по системе нумерации Кабата) в легкой цепи, А118 (по системе EU нумерации) в тяжелой цепи и S400 (по системе EU нумерации) в Fc-области тяжелой цепи. Сконструированные антитела, содержащие цистеин, можно получить, как описано, например, в патенте US 7521541.In certain embodiments of the present invention, it is advantageous to design cysteine-modified antibodies, for example, "thioMAbs", in which one or more antibody residues are replaced with cysteine residues. In specific embodiments of the invention, the residues to be replaced are located at accessible sites on the antibody. By replacing these residues with cysteine, reactive thiol groups are located at accessible sites on the antibody and can be used to conjugate the antibody to other moieties, such as drug moieties or drug moieties linked to a linker, to create an immunoconjugate. , as described below in this context. In certain embodiments, cysteine may be substituted for any one or more of the following residues: V205 (Kabat numbering system) in the light chain, A118 (EU numbering system) in the heavy chain, and S400 (EU numbering system) in the heavy chain Fc region . Cysteine engineered antibodies can be prepared as described, for example, in US Pat. No. 7,521,541.
d) Производные антителd) Antibody derivatives
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения антитело, описанное в данном контексте, можно дополнительно модифицировать с тем, чтобы оно содержало дополнительные небелковые фрагменты, которые известны в данной области техники и легко доступны. Компоненты, пригодные для получения производных антитела, включают водорастворимые полимеры, но не ограничиваясь только ими. Неограничивающие примеры водорастворимых полимеров включают, но, не ограничиваясь только ими, полиэтиленгликоль (PEG), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена и малеинового ангидрида, полиаминокислоты (как гомополимеры, так и статистические сополимеры) и декстран или поли(N-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропропиленгликоля, сополимеры пролипропиленоксида и этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси. Полиэтиленгликольпропиональдегид может иметь преимущества при получении ввиду его стабильности в воде. Полимер может характеризоваться любой молекулярной массой и может представлять собой разветвленный или неразветвленный полимер. Число полимеров, присоединяемых к антителу, можно изменять, и если присоединяется больше одного полимера, они могут представлять собой одинаковые или различные соединения. В общем случае число и/или тип полимеров, используемых для получения производных, можно определить исходя из соображений, включающих, но, не ограничиваясь только ими, конкретные свойства или функции антитела, которые нуждаются в улучшении и с учетом применения производного антитела в терапии при определенных условиях, и т.д.In certain embodiments, an antibody described herein can be further modified to contain additional non-protein fragments that are known in the art and readily available. Components suitable for the preparation of antibody derivatives include, but are not limited to, water-soluble polymers. Non-limiting examples of water-soluble polymers include, but are not limited to, polyethylene glycol (PEG), ethylene glycol-propylene glycol copolymers, carboxymethylcellulose, dextran, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, poly-1,3-dioxolane, poly-1,3,6-trioxane, copolymer of ethylene and maleic anhydride, polyamino acids (both homopolymers and random copolymers) and dextran or poly(N-vinylpyrrolidone)polyethylene glycol, propylene glycol homopolymers, copolymers of propropylene oxide and ethylene oxide, polyoxyethylated polyols (for example, glycerol), polyvinyl alcohol and mixtures thereof. Polyethylene glycol propionaldehyde may be advantageous in preparation due to its stability in water. The polymer may be of any molecular weight and may be a branched or straight polymer. The number of polymers attached to an antibody can be changed, and if more than one polymer is attached, they can be the same or different compounds. In general, the number and/or type of polymers used to derivatize can be determined based on considerations including, but not limited to, the specific properties or functions of the antibody that need to be improved, and taking into account the use of the antibody derivative in therapy under certain conditions, etc.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагаются конъюгаты антитела и фрагментов небелковой природы, которые можно селективно нагреть при воздействии излучения. В одном варианте фрагмент небелковой природы представляет собой углеродную нанотрубку (см. статью Kam N.W. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 11600-11605 (2005)). Излучение может иметь любую длину волны и включает, но, не ограничиваясь только ими, длины волн, которые не повреждают обычные клетки, но которые нагревают фрагмент небелковой природы до температуры, при которой клетки, расположенные в непосредственной близости от фрагмента небелковой природы в составе антитела, погибают.In another embodiment, the present invention provides conjugates of antibodies and fragments of non-protein nature, which can be selectively heated when exposed to radiation. In one embodiment, the non-protein fragment is a carbon nanotube (see Kam N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 11600-11605 (2005)). The radiation can be of any wavelength and includes, but is not limited to, wavelengths that do not damage normal cells, but that heat the non-protein fragment to a temperature at which cells located in close proximity to the non-protein fragment in the antibody, are dying.
В. Рекомбинантные способы и композицииB. Recombinant Methods and Compositions
Антитела можно получать с использованием рекомбинантных способов и композиций, например, как описано в патенте US 4816567. В одном варианте предлагается выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая анти-HLA-G антитело, как описано в данном контексте. Указанная нуклеиновая кислота может кодировать аминокислотную последовательность, включающую VL, и/или аминокислотную последовательность, включающую VH антитела (например, легкую и/или тяжелую цепи антитела). В другом варианте предлагается один или более векторов (например, экспрессионные векторы), включающих указанную нуклеиновую кислоту. В еще одном варианте предлагается клетка хозяина, которая включает указанную нуклеиновую кислоту. В одном указанном варианте клетка хозяина включает, например, клетку, трансформированную с использованием: (1) вектора, включающего нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, включающую VL антитела, и аминокислотную последовательность, включающую VH антитела, или (2) первого вектора, включающего нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, включающую VL антитела, и второго вектора, включающего нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, включающую VH антитела. В одном варианте клетка хозяина представляет собой эукариотическую клетку, например, клетку яичника китайского хомячка (СНО), клетку клеточной линии HEK293 или лимфоидную клетку (например, клетку клеточных линий Y0, NS0, Sp20). В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается способ получения анти-HLA-G антитела, где способ включает культивирование клетки хозяина, включающей нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, как описано выше, в условиях, пригодных для экспрессии антитела, и необязательно выделение антитела из клетки хозяина (или среды культивирования клетки хозяина).Antibodies can be generated using recombinant methods and compositions, for example, as described in US Pat. No. 4,816,567. In one embodiment, an isolated nucleic acid encoding an anti-HLA-G antibody is provided, as described herein. Said nucleic acid may encode an amino acid sequence comprising the VL and/or an amino acid sequence comprising the VH of an antibody (eg, an antibody light and/or heavy chain). In another embodiment, one or more vectors (eg, expression vectors) are provided that include the specified nucleic acid. In yet another embodiment, a host cell is provided that includes said nucleic acid. In one specified embodiment, the host cell includes, for example, a cell transformed using: (1) a vector comprising a nucleic acid that encodes an amino acid sequence comprising an antibody VL and an amino acid sequence comprising an antibody VH, or (2) a first vector comprising a nucleic acid encoding an amino acid sequence comprising an antibody VL, and a second vector comprising a nucleic acid encoding an amino acid sequence comprising an antibody VH. In one embodiment, the host cell is a eukaryotic cell, eg, a Chinese Hamster Ovary (CHO) cell, a HEK293 cell line, or a lymphoid cell (eg, a Y0, NS0, Sp20 cell line). In one embodiment, the present invention provides a method for producing an anti-HLA-G antibody, wherein the method comprises culturing a host cell comprising a nucleic acid encoding the antibody as described above under conditions suitable for expression of the antibody, and optionally isolating the antibody from the host cell ( or host cell culture medium).
Для продуцирования рекомбинантного анти-HLA-G антитела, нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, например, описанное выше в данном контексте, выделяют и встраивают в один или более векторов для последующего клонирования и/или экспрессии в клетке хозяина. Указанную нуклеиновую кислоту можно выделить простым методом и секвенировать с использованием стандартных методик (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи антитела).To produce a recombinant anti-HLA-G antibody, a nucleic acid encoding an antibody, for example as described hereinabove, is isolated and inserted into one or more vectors for subsequent cloning and/or expression in a host cell. The specified nucleic acid can be isolated by a simple method and sequenced using standard techniques (for example, using oligonucleotide probes that are able to specifically bind to the genes encoding the heavy and light chains of the antibody).
Клетки хозяина, пригодные для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитела, включают прокариотические или эукариотические клетки, как описано в данном контексте. Например, антитела могут продуцироваться в бактериях, прежде всего, когда нет необходимости в гликозилировании и Fc-эффекторной функции. Информацию об экспрессии фрагментов антител и полипептидов в бактериях см., например, патенты US 5648237, US 5789199 и US 5840523 (см. также работу Charlton K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, 245-254 (2003) (изд. В.K.С. Lo, Humana Press, Totowa, NJ), где описана экспрессия фрагментов антител в Е. coli). После экспрессии антитело можно выделить из биомассы бактериальных клеток в растворимой фракции и в дальнейшем можно очистить.Host cells suitable for cloning or expression of antibody-encoding vectors include prokaryotic or eukaryotic cells, as described herein. For example, antibodies can be produced in bacteria primarily when there is no need for glycosylation and Fc effector function. For information on the expression of antibody fragments and polypeptides in bacteria, see, for example, US Pat. (B.K.C. Lo, Humana Press, Totowa, NJ), which describes the expression of antibody fragments in E. coli). After expression, the antibody can be isolated from the biomass of bacterial cells in a soluble fraction and can be further purified.
Помимо прокариот, пригодными хозяевами для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитела, являются эукариотические микроорганизмы, такие как мицелиальные грибы или дрожжи, включая штаммы грибов и дрожжей, пути гликозилирования которых были «гуманизированы», что позволяло получить антитело с частично или полностью человеческим профилем гликозилирования. См. статьи Gerngross T.U., Nat. Biotech., 22, 1409-1414 (2004) и Li Н. и др., Nat. Biotech., 24, 210-215 (2006).In addition to prokaryotes, suitable hosts for cloning or expression of vectors encoding antibodies are eukaryotic microorganisms such as filamentous fungi or yeasts, including strains of fungi and yeasts whose glycosylation pathways have been "humanized" to produce an antibody with a partially or fully human glycosylation profile. . See Gerngross T.U., Nat. Biotech., 22, 1409-1414 (2004) and Li H. et al., Nat. Biotech., 24, 210-215 (2006).
Клетки хозяина, пригодные для экспрессии гликозилированного антитела, также получены из многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных). Примеры клеток беспозвоночных включают клетки растений и насекомых. Идентифицированы многочисленные штаммы бакуловирусов, которые можно использовать совместно с клетками насекомых, прежде всего, для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.Host cells suitable for expression of the glycosylated antibody are also derived from multicellular organisms (invertebrates and vertebrates). Examples of invertebrate cells include plant and insect cells. Numerous baculovirus strains have been identified that can be used in conjunction with insect cells, primarily for transfection of Spodoptera frugiperda cells.
Культуры растительных клеток также можно использовать в качестве хозяев. См., например, патенты US 5959177, US 6040498, US 6420548, US 7125978 и US 6417429 (где описана технология PLANTIBODIES™ для получения антител в трансгенных растениях).Plant cell cultures can also be used as hosts. See, for example, US Pat. Nos. 5,959,177; US 6,040,498; US 6,420,548;
Клетки позвоночных также можно использовать в качестве хозяев. Например, можно использовать линии клеток млекопитающих, которые адаптированы к росту в суспензии. Другими примерами используемых линий клеток хозяев млекопитающих являются линия CV1 клеток почки обезьяны, трансформированных SV40 (COS-7), линия клеток эмбриональной почки человека (293 или клетки 293, описанные, например, в статье Graham F.L. и др., J. Gen Virol., 36, 59-74 (1977)), клетки почки новорожденного хомяка (ВНК), клетки опухоли Сертоли мыши (клетки ТМ4, описанные, например, в статье Mather J.P., Biol. Reprod., 23, 243-252 (1980)), клетки почки обезьяны (CV1), клетки почки африканской зеленой обезьяны (VERO-76), клетки карциномы шейки матки человека (HELA), клетки почки собаки (MDCK), клетки печени крысы Buffalo (BRL 3А), клетки легкого человека (W138), клетки печени человека (Hep G2), клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562), клетки TRI, описанные, например, в статье Mather J.Р. и др., Annals N.Y. Acad. Sci., 383, 44-68 (1982), клетки MRC 5 и клетки FS4. Другие клеточные линии млекопитающих, используемые в качестве хозяев, включают клетки яичников китайского хомяка (СНО), включая клетки DHFR-CHO (Urlaub G. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220 (1980)), и линии клеток миеломы, такие как Y0, NS0 и Sp2/0. Подробное описание некоторых линий клеток хозяина млекопитающих, пригодных для получения антител, см., например, в работе Yazaki Р. и Wu A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, 255-268 (2004) (изд. Lo, B.K.C., Humana Press, Totowa, NJ).Vertebrate cells can also be used as hosts. For example, mammalian cell lines that are adapted to growth in suspension can be used. Other examples of useful mammalian host cell lines are the SV40-transformed monkey kidney cell line CV1 (COS-7), the human embryonic kidney cell line (293 or 293 cells described, for example, in Graham F. L. et al., J. Gen Virol. , 36, 59-74 (1977)), neonatal hamster kidney (BHK) cells, mouse Sertoli tumor cells (TM4 cells described, for example, in Mather J.P., Biol. Reprod., 23, 243-252 (1980)) , monkey kidney cells (CV1), African green monkey kidney cells (VERO-76), human cervical carcinoma cells (HELA), dog kidney cells (MDCK), Buffalo rat liver cells (BRL 3A), human lung cells (W138) , human liver cells (Hep G2), mouse mammary tumor cells (MMT 060562), TRI cells, as described, for example, in Mather J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383, 44-68 (1982),
С. АнализыC. Analyzes
Анти-HLA-G антитела, описанные в данном контексте, можно идентифицировать, подвергать скринингу или характеризовать в отношении их физико-химических свойств и/или биологических активностей с использованием различных методов анализа, известных в данной области техники.Anti-HLA-G antibodies described herein can be identified, screened, or characterized for their physicochemical properties and/or biological activities using various assays known in the art.
1. Анализы связывания и другие анализы1. Binding assays and other assays
В одном объекте оценивают антигенсвязывающую активность антитела по настоящему изобретению, например, с помощью известных методов, таких как (твердофазный иммуноферментный анализ) ИФА, вестерн-блоттинг и т.д.In one aspect, the antigen-binding activity of an antibody of the present invention is assessed, for example, by known methods such as ELISA, Western blot, etc.
В другом объекте можно использовать конкурентные анализы для идентификации антитела, которое конкурирует с HLA-G-0031 (включающим VH с последовательностью SEQ ID NO: 7 и VL с последовательностью SEQ ID NO: 8) за связывание с HLA-G. В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается антитело, которое конкурирует за связывание с HLA-G человека с анти-HLA-G антителом, включающим все 3 HVR последовательности VH SEQ ID NO: 7 и все 3 HVR последовательности VL SEQ ID NO: 8. В определенных вариантах указанное конкурирующее антитело связывается с одним и тем же эпитопом (например, линейным или конформационным эпитопом), который связывается с анти-HLA-G антителом HLA-G-0031. В одном варианте предлагается анти-HLA-G антитело, которое связывается с одним и тем же эпитопом на HLA-G, что и антитело, включающее VH с последовательностью SEQ ID NO: 7 и VL с последовательностью SEQ ID NO: 8. В другом объекте конкурентные анализы можно использовать для идентификации антитела, которое конкурирует с HLA-G-0090 (содержащим VH с последовательностью SEQ ID NO: 31 и VL с последовательностью SEQ ID NO: 32) за связывание с HLA-G. В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается антитело, которое конкурирует за связывание с HLA-G человека с анти-HLA-G антителом, которое включает все 3 HVR последовательности VH SEQ ID NO: 31 и все 3 HVR последовательности VL SEQ ID NO: 32. В определенных вариантах указанное конкурирующее антитело связывается с одним и тем же эпитопом (например, линейным или конформационным эпитопом), который связывается с анти-HLA-G антителом HLA-G-0090. В одном варианте предлагается анти-HLA-G антитело, которое связывается с одним и тем же эпитопом на HLA-G, что и антитело, включающее VH с последовательностью SEQ ID NO: 31 и VL с последовательностью SEQ ID NO: 32. Подробное описание типичных методов картирования эпитопа, с которым связывается антитело, представлено в работе Morris G.E. (ред.), Epitope Mapping Protocols, в: Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Humana Press, Totowa, NJ (1996).In another aspect, competition assays can be used to identify an antibody that competes with HLA-G-0031 (comprising VH of SEQ ID NO: 7 and VL of SEQ ID NO: 8) for binding to HLA-G. In one embodiment, the present invention provides an antibody that competes for binding to human HLA-G with an anti-HLA-G antibody comprising all 3 HVR sequences of VH SEQ ID NO: 7 and all 3 HVR sequences of VL SEQ ID NO: 8. B In certain embodiments, said competing antibody binds to the same epitope (eg, linear or conformational epitope) that binds to the anti-HLA-G antibody HLA-G-0031. In one embodiment, an anti-HLA-G antibody is provided that binds to the same epitope on HLA-G as an antibody comprising a VH of SEQ ID NO: 7 and a VL of SEQ ID NO: 8. In another aspect, competitive assays can be used to identify an antibody that competes with HLA-G-0090 (comprising VH of SEQ ID NO: 31 and VL of SEQ ID NO: 32) for binding to HLA-G. In one embodiment, the present invention provides an antibody that competes for binding to human HLA-G with an anti-HLA-G antibody that includes all 3 HVR sequences of VH SEQ ID NO: 31 and all 3 HVR sequences of VL SEQ ID NO: 32. In certain embodiments, said competing antibody binds to the same epitope (eg, linear or conformational epitope) that binds to the anti-HLA-G antibody HLA-G-0090. In one embodiment, an anti-HLA-G antibody is provided that binds to the same epitope on HLA-G as an antibody comprising a VH of SEQ ID NO: 31 and a VL of SEQ ID NO: 32. Detailed description of exemplary methods for mapping the epitope to which the antibody binds is presented in the work of Morris G.E. (ed.), Epitope Mapping Protocols, in: Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Humana Press, Totowa, NJ (1996).
В типичном способе конкурентного анализа иммобилизованный HLA-G инкубируют в растворе, который содержит первое меченое антитело, которое связывается с HLA-G (например, анти-HLA-G антитело HLA-G-0090), и второе немеченое антитело, которое исследуют на его способность конкурировать с первым антителом за связывание с HLA-G. Второе антитело может присутствовать в супернатанте гибридомы. В качестве контроля используют иммобилизованный HLA-G, который инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, но не содержит второе немеченое антитело. После инкубации в условиях, обеспечивающих связывание первого антитела с HLA-G, избыток несвязавшегося антитела удаляют и измеряют количество меченого антитела, связавшегося с иммобилизованным HLA-G. Если количество меченого антитела, связавшегося с иммобилизованным HLA-G, существенно снижается в исследуемом образце по сравнению с контрольным образцом, то это указывает на то, что второе антитело конкурирует с первым антителом за связывание с HLA-G. См. руководство Harlow Е. и Lane D., Antibodies: A Laboratory Manual, глава 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988). Описание другого типичного конкурентного анализа см. в примере 2 (ИФА для картирования эпитопа/конкурентный анализ связывания).In a typical competitive assay method, immobilized HLA-G is incubated in a solution that contains a first labeled antibody that binds to HLA-G (e.g., anti-HLA-G antibody HLA-G-0090) and a second unlabeled antibody that is tested for it. the ability to compete with the first antibody for binding to HLA-G. The second antibody may be present in the hybridoma supernatant. As a control, immobilized HLA-G is used, which is incubated in a solution containing the first labeled antibody, but does not contain the second unlabeled antibody. After incubation under conditions allowing the first antibody to bind to HLA-G, the excess unbound antibody is removed and the amount of labeled antibody bound to the immobilized HLA-G is measured. If the amount of labeled antibody bound to the immobilized HLA-G is significantly reduced in the test sample compared to the control sample, this indicates that the second antibody is competing with the first antibody for binding to HLA-G. See Harlow E. and Lane D., Antibodies: A Laboratory Manual,
2. Методы анализа активности2. Activity analysis methods
В одном объекте предлагаются методы анализа для идентификации анти-HLA-G антител, обладающих биологической активностью. Биологическая активность может включать, например, способность усиливать активацию и/или пролиферацию различных иммунных клеток, включая Т-клетки. Например, они усиливают высвобождение иммуномодулирующих цитокинов (например, интерферона-гамма (IFN-γ) и/или фактора некроза опухоли альфа (TNF-α)). Другими иммуномодулирующими цитокинами, которые усиливают или могут усиливать связывание с разными типами клеток, являются, например, IL1β, IL6, IL12, гранзим В и т.п. Предлагаются также антитела, проявляющие указанную биологическую активность in vivo и/или in vitro.In one aspect, assay methods are provided for identifying anti-HLA-G antibodies with biological activity. Biological activity may include, for example, the ability to enhance the activation and/or proliferation of various immune cells, including T cells. For example, they increase the release of immunomodulatory cytokines (eg interferon-gamma (IFN-γ) and/or tumor necrosis factor alpha (TNF-α)). Other immunomodulatory cytokines that enhance or may enhance binding to different cell types are, for example, IL1β, IL6, IL12, granzyme B, and the like. Also provided are antibodies exhibiting said biological activity in vivo and/or in vitro.
В определенных вариантах антитело по настоящему изобретению исследуют в отношении указанной биологической активности, например, как описано ниже в разделе "Примеры".In certain embodiments, an antibody of the present invention is tested for a specified biological activity, for example, as described below in the Examples section.
D. Иммуноконъюгаты (только для терапии рака или модификации мишени)D. Immunoconjugates (only for cancer therapy or target modification)
В изобретении также предлагаются иммуноконъюгаты, содержащие анти-HLA-G антитело, конъюгированное с одним или несколькими цитотоксическими агентами, такими как химиотерапевтические агенты или лекарственные препараты, агенты, ингибирующие рост (клеток), токсины (например, токсины белковой природы, ферментативно активные токсины бактерий, грибов, растений или животного происхождения или их фрагменты) или радиоактивные изотопы.The invention also provides immunoconjugates comprising an anti-HLA-G antibody conjugated to one or more cytotoxic agents, such as chemotherapeutic agents or drugs, (cell) growth inhibitory agents, toxins (e.g. proteinaceous toxins, enzymatically active bacterial toxins). , fungi, plants or animals or their fragments) or radioactive isotopes.
В одном варианте иммуноконъюгат представляет собой конъюгат антитела и лекарственного средства (ADC), в котором антитело конъюгировано с одним или более лекарственными средствами, включая, но, не ограничиваясь только ими, майтанзиноид (см. патенты US 5208020, US 5416064 и ЕР 0425235 В1), ауристатин, например, лекарственные фрагменты DE и DF монометилауристатина (ММАЕ и MMAF) (см. патенты US 5635483, US 5780588 и US 7498298), доластатин, калихеамицин или их производные (см. патенты US 5712374, US 5714586, US 5739116, US 5767285, US 5770701, US 5770710, US 5773001 и US 5877296, статьи Hinman L.M. и др., Cancer Res., 53, 3336-3342 (1993) и Lode H.N. и др., Cancer Res., 58, 2925-2928 (1998)), антрациклин такой, как дауномицин или доксорубицин (см. статьи Kratz F. и др., Curr. Med. Chem., 13, 477-523 (2006), Jeffrey S.C. и др., Bioorg. Med. Chem. Lett., 16, 358-362 (2006), Torgov MY. и др., Bioconjug. Chem., 16, 717-721 (2005), Nagy А. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 829-834 (2000), Dubowchik G.M. и др., Bioorg. & Med. Chem. Letters, 12, 1529-1532 (2002), King H.D. и др., J. Med. Chem., 45, 4336-4343 (2002), а также патент US 6630579), метотрексат, виндезин, таксан, такой, как доцетаксел, паклитаксел, ларотаксел, тезетаксел и ортатаксел, трихотецен и СС1065.In one embodiment, the immunoconjugate is an antibody-drug conjugate (ADC) in which the antibody is conjugated to one or more drugs, including but not limited to maytansinoid (see US 5208020, US 5416064 and EP 0425235 B1) , auristatin, e.g., drug moieties DE and DF of monomethylauristatin (MMAE and MMAF) (see US Pat. 5767285, US 5770701, US 5770710, US 5773001 and US 5877296, Hinman L.M. et al., Cancer Res., 53, 3336-3342 (1993) and Lode H.N. et al., Cancer Res., 58, 2925-2928 ( 1998)), an anthracycline such as daunomycin or doxorubicin (see Kratz F. et al., Curr. Med. Chem., 13, 477-523 (2006), Jeffrey S. C. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 16, 358-362 (2006), Torgov, MY et al., Bioconjug. Chem., 16, 717-721 (2005), Nagy, A. et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 97, 829-834 (2000), Dubowchik G.M. et al., Bioorg. &Med. Chem. Letters, 12, 1529-1532 (2002), King H.D. et al., J. Med. Chem., 45, 4336-4343 (2002) and US Pat. No. 6,630,579), methotrexate, vindesine, taxane such as docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tezetaxel and orthotaxel, trichothecene and CC1065.
В другом варианте иммуноконъюгат включает антитело, как описано в данном контексте, конъюгированное с ферментативно активным токсином или его фрагментом, включая, но, не ограничиваясь только ими, А-цепь дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, А-цепь экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), А-цепь рицина, А-цепь абрина, А-цепь модецина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантины, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, ретстриктоцин, феномицин, эномицин и трихотецены.In another embodiment, the immunoconjugate comprises an antibody, as described herein, conjugated to an enzymatically active toxin or fragment thereof, including, but not limited to, diphtheria toxin A chain, non-binding active diphtheria toxin fragments, exotoxin A chain (from Pseudomonas aeruginosa), ricin A-chain, abrin A-chain, modecin A-chain, alpha-sarcin, Aleurites fordii proteins, diantina proteins, Phytolaca americana proteins (PAPI, PAPII and PAP-S), Momordica charantia inhibitor, curcin, crotin, Sapaonaria officinalis inhibitor, gelonin, mitogellin, retstrictocin, fenomycin, enomycin and trichothecenes.
В другом варианте иммуноконъюгат включает антитело, как описано в данном контексте, конъюгированное с радиоактивным атомом, с образованием радиоактивного конъюгата. Для получения радиоактивных конъюгатов можно использовать различные радиоактивные изотопы. Примеры изотопов включают Ai211 , I131, I125, Y.90, R186 , R188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 и радиоактивный изотоп Lu. Если радиоконъюгат применяется для детекции, он может содержать радиоактивный изотоп для проведения сцинтиграфического исследования, например, TC99m или I123, или спиновую метку для проведения исследования методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (также известного под названием магниторезонансная томография, МРТ, например, иод-123, иод-131, индий-111, фтор-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганец или железо.In another embodiment, the immunoconjugate comprises an antibody, as described herein, conjugated to a radioactive atom to form a radioactive conjugate. Various radioactive isotopes can be used to obtain radioactive conjugates. Examples of isotopes include Ai 211 , I 131 , I 125 , Y .90 , R 186 , R 188 , Sm 153 , Bi 212 , P 32 , Pb 212 and the radioactive isotope Lu. If the radioconjugate is used for detection, it may contain a radioactive isotope for scintigraphic examination, such as TC 99m or I 123 , or a spin label for nuclear magnetic resonance (NMR) examination (also known as magnetic resonance imaging, MRI, for example, iodine -123, iodine-131, indium-111, fluorine-19, carbon-13, nitrogen-15, oxygen-17, gadolinium, manganese or iron.
Конъюгаты антитела с цитотоксическим агентом можно получать с применением различных бифункциональных белок-связывающих агентов, таких как N-сукцинимидил-3(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие, как диметиладипимидат HCI), активированные эфиры (такие, как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие, как глутаровый альдегид), бис-азидосоединения (такие, как бис(пара-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие, как бис(пара-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие, как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активированные соединения фтора (такие, как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин рицина можно получить, как описано в статье Vitetta E.S. и др., Science, 238, 1098-1104 (1987). Меченная углеродом-14 1-изотиоцианатобензил-3-метилд иэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA) представляет собой типичный хелатирующий агент для конъюгации радионуклеотида с антителом. См. заявку WO 94/11026. Линкер может представлять собой "отщепляемый линкер", который обеспечивает высвобождение цитотоксического лекарственного средства в клетке. Например, можно использовать кислотолабильный линкер, линкер, отщепляемый пептидазой, фотолабильный линкер, диметиловый линкер или линкер, включающий дисульфидную группу (см. статью Chari R.V. и др., Cancer Res., 52, 127-131 (1992), патент US 5208020).Antibody-cytotoxic agent conjugates can be prepared using various bifunctional protein binding agents such as N-succinimidyl-3(2-pyridyldithio)propionate (SPDP), succinimidyl-4(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), iminothiolane (IT), bifunctional imidoester derivatives (such as dimethyl adipimidate HCI), activated esters (such as disuccinimidyl suberate), aldehydes (such as glutaraldehyde), bis-azido compounds (such as bis(p-azidobenzoyl)hexanediamine), bis-diazonium derivatives (such as bis(p-diazoniumbenzoyl)ethylenediamine), diisocyanates (such as toluene-2,6-diisocyanate), and bis-activated fluorine compounds (such as 1,5-difluoro-2,4- dinitrobenzene). For example, a ricin immunotoxin can be prepared as described in Vitetta E.S. et al., Science, 238, 1098-1104 (1987). Carbon-14 labeled 1-isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylenetriaminepentaacetic acid (MX-DTPA) is a typical chelating agent for conjugating a radionucleotide to an antibody. See application WO 94/11026. The linker may be a "cleavable linker" that allows the cytotoxic drug to be released into the cell. For example, an acid labile linker, a peptidase cleavable linker, a photolabile linker, a dimethyl linker, or a linker containing a disulfide group can be used (see Chari R.V. et al., Cancer Res., 52, 127-131 (1992), US Pat. No. 5,208,020) .
Иммуноконъюгаты или ADC, как описано в данном контексте, включают, но не ограничиваясь только ими, конъюгаты, полученные с использованием сшивающих реагентов, включающих, но не ограничиваясь только ими, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, МРВН, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC и сульфо-SMPB, а также SVSB (сукцинимидил(4-винилсульфон)бензоат), являющихся коммерчески доступными препаратами (например, фирмы Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., США).Immunoconjugates or ADCs as described herein include, but are not limited to, conjugates made using cross-linking reagents including, but not limited to, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC and sulfo-SMPB, and SVSB (succinimidyl(4-vinyl sulfone) benzoate), which are commercially available preparations (for example, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., USA).
E. Способы и композиции для диагностики и детекцииE. Methods and compositions for diagnosis and detection
В определенных вариантах любое из анти-HLA-G антител, предложенных в данном контексте, можно использовать для обнаружения HLA-G в биологическом образце. Термин "детекция", использованный в данном контексте, включает количественное или качественное определение. В определенных вариантах биологический образец включает клетку или ткань, такие, как инфильтраты иммунных клеток или Т-клеток и/или опухолевые клетки.In certain embodiments, any of the anti-HLA-G antibodies provided herein can be used to detect HLA-G in a biological sample. The term "detection", used in this context, includes a quantitative or qualitative determination. In certain embodiments, the biological sample includes a cell or tissue, such as immune cell or T cell infiltrates and/or tumor cells.
В одном варианте предлагается анти-HLA-G антитело для применения в способе диагностики или детекции. В другом объекте предлагается способ обнаружения HLA-G в биологическом образце. В определенных вариантах способ включает контактирование биологического образца с анти-HLA-G антителом, как описано в данном контексте, в условиях, обеспечивающих связывание анти-HLA-G антитела с HLA-G, и детекцию образования комплекса между анти-HLA-G антителом и HLA-G. Указанный способ может представлять собой способ для применения in vitro или in vivo. В одном варианте анти-HLA-G антитело используют для отбора субъектов, пригодных для лечения анти-HLA-G антителом, например, где HLA-G представляет собой биомаркер для отбора пациентов.In one embodiment, an anti-HLA-G antibody is provided for use in a diagnostic or detection method. In another aspect, a method for detecting HLA-G in a biological sample is provided. In certain embodiments, the method includes contacting a biological sample with an anti-HLA-G antibody, as described herein, under conditions that allow the anti-HLA-G antibody to bind to HLA-G, and detecting the formation of a complex between the anti-HLA-G antibody and HLA-G. Said method may be an in vitro or in vivo method. In one embodiment, an anti-HLA-G antibody is used to select subjects suitable for treatment with an anti-HLA-G antibody, eg, wherein HLA-G is a biomarker for patient selection.
В определенных вариантах предлагаются меченые анти-HLA-G антитела. Метки включают, но не ограничиваясь только ими, детектируемые напрямую метки или фрагменты (такие как флуоресцентные, хромофорные, электронно-плотные, хемилюминесцентные и радиоактивные метки), а также фрагменты, такие, как ферменты или лиганды, которые детектируют опосредовано, например, с использованием ферментативной реакции или молекулярного взаимодействия. Типичные метки включают, но не ограничиваясь только ими, радиоизотопы 32Р, 14С, 125I, 3Н и 131I, флуорофоры, такие как редкоземельные хелаты или флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, умбеллиферон, люциферазы, например, люциферазу светлячков и бактериальную люциферазу (см. патент US 4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, пероксидазу хрена (HRP), щелочную фосфатазу, β-галактозидазу, глюкоамилазу, лизоцим, сахарид-оксидазы, например, глюкозо-оксидазу, галактозо-оксидазу и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, гетероциклические оксидазы, такие как уриказа и ксантин-оксидаза, связанные с ферментом, использующим пероксид водорода для окисления предшественника красителя, таким как HRP, лактопероксидаза или микропероксидаза, биотин/авидин, спиновые метки, бактериофаговые метки, стабильные свободные радикалы и т.п.In certain embodiments, labeled anti-HLA-G antibodies are provided. Labels include, but are not limited to, directly detectable labels or moieties (such as fluorescent, chromophoric, electron dense, chemiluminescent, and radioactive labels) as well as moieties such as enzymes or ligands that are indirectly detected, for example, using enzymatic reaction or molecular interaction. Representative labels include, but are not limited to, the radioisotopes 32 P, 14 C, 125 I, 3 H, and 131 I, fluorophores such as rare earth chelates or fluorescein and its derivatives, rhodamine and its derivatives, dansyl, umbelliferone, luciferases, for example , firefly luciferase and bacterial luciferase (see US patent 4737456), luciferin, 2,3-dihydrophthalazinediones, horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase, β-galactosidase, glucoamylase, lysozyme, saccharide oxidases, for example, glucose oxidase, galactose -oxidase and glucose-6-phosphate dehydrogenase, heterocyclic oxidases such as uricase and xanthine oxidase associated with an enzyme that uses hydrogen peroxide to oxidize a dye precursor such as HRP, lactoperoxidase or microperoxidase, biotin/avidin, spin labels, bacteriophage labels, stable free radicals, and the like.
F. Фармацевтические составыF. Pharmaceutical formulations
Фармацевтические составы анти-HLA-G антитела, как описано в данном контексте, получают смешивая указанное антитело, характеризующееся требуемой степенью чистоты, с одним или более необязательных фармацевтически приемлемых носителей (см. Remington's Pharmaceutical Sciences, 16-е изд. под ред. A. Osol (1980)) в форме лиофилизированных составов или водных растворов. Фармацевтически приемлемые носители, как правило, являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и включают, но не ограничиваясь только ими: буферные растворы, такие как фосфатный, цитратный буферные растворы, а также буферные растворы на основе других органических кислот, антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин, консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония, хлорид гексаметония, хлорид бензалкония, хлорид бензетония, фенол, бутиловый или бензиловый спирт, алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен, катехол, резорцинол, циклогексанол, 3-пентанол и жедаа-крезол), низкомолекулярные полипептиды (содержащие менее приблизительно 10 остатков), белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины, гидрофильные полимеры, такие как поли(винилпирролидон), аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин, моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины, хелатирующие агенты, такие как EDTA, сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит, солеобразующие противоионы, такие как натрий, содержащие металл комплексы (например, Zn-белковые комплексы), и/или неионогенные ПАВ, такие как полиэтиленгликоль (PEG). Типичные фармацевтически приемлемые носители по настоящему изобретению дополнительно включают средства диспергирования лекарственных средств в интерстициальном пространстве, такие как растворимые нейтрально-активированные гликопротеины гиалуронидазы (sHASEGP), например, растворимые гликопротеины гиалуронидазы РН-20 человека, такие как rHuPH20 (HYLENEX®, фирмы Baxter International, Inc.). Определенные типичные sHASEGP и методы их применения, включая rhuPH20, описаны в заявках US 2005/0260186 и US 2006/0104968. В одном объекте изобретения sHASEGP объединяют с одной или более дополнительных гликозаминогликаназ, такими как хондроитиназы.Pharmaceutical formulations of an anti-HLA-G antibody, as described herein, are prepared by mixing said antibody of the desired purity with one or more optional pharmaceutically acceptable carriers (see Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed. Ed. A. Osol (1980)) in the form of lyophilized formulations or aqueous solutions. Pharmaceutically acceptable carriers are generally non-toxic to recipients at the doses and concentrations employed and include, but are not limited to: buffer solutions such as phosphate, citrate, and other organic acid buffers, antioxidants, including ascorbic acid and methionine, preservatives (such as octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride, hexamethonium chloride, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, phenol, butyl or benzyl alcohol, alkyl parabens such as methyl or propyl paraben, catechol, resorcinol, cyclohexanol, 3-pentanol, and jedaa-cresol) , low molecular weight polypeptides (containing less than about 10 residues), proteins such as serum albumin, gelatin or immunoglobulins, hydrophilic polymers such as poly(vinylpyrrolidone), amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine or lysine, monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates, including glucose, mannose or dextrins, chelating agents such as EDTA, sugars such as sucrose, mannitol, trehalose or sorbitol, salt-forming counterions such as sodium, metal-containing complexes (e.g. Zn-protein complexes), and/or nonionic surfactants such as polyethylene glycol (PEG). Exemplary pharmaceutically acceptable carriers of the present invention further include interstitial drug dispersion agents such as soluble neutrally activated hyaluronidase glycoproteins (sHASEGP), for example soluble human hyaluronidase glycoproteins PH-20, such as rHuPH20 ( HYLENEX® , Baxter International, Inc.). Certain exemplary sHASEGPs and methods for their use, including rhuPH20, are described in US 2005/0260186 and US 2006/0104968. In one aspect of the invention, sHASEGP is combined with one or more additional glycosaminoglycanases, such as chondroitinases.
Типичные лиофилизированные составы антител описаны в патенте US 6267958. Водные составы антител включают составы, описанные в патенте US 6171586 и заявке WO 2006/044908, при этом последние включают гистидин-ацетатный буферный раствор.Typical lyophilized antibody formulations are described in US Pat. No. 6,267,958. Aqueous antibody formulations include those described in US Pat.
Состав, как описано в данном контексте, также может содержать более одного активного ингредиента, если это необходимо для конкретного подлежащего лечению состояния, предпочтительно вещества с взаимодополняющими активностями, которые не оказывают отрицательного воздействия друг на друга. Например, может потребоваться дополнительное введение. Указанные активные ингредиенты предпочтительно присутствуют в комбинации в количествах, эффективных для решения поставленной задачи.The formulation as described herein may also contain more than one active ingredient if necessary for the particular condition being treated, preferably substances with complementary activities that do not adversely affect each other. For example, additional administration may be required. These active ingredients are preferably present in combination in amounts effective for the task at hand.
Активные ингредиенты можно включать в микрокапсулы, например, полученные с помощью способов коацервации или межфазной полимеризации, например, в гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и полиметилметакрилатные микрокапсулы, соответственно, в коллоидные системы введения лекарственного средства (например в липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Указанные способы описаны в Remington''s Pharmaceutical Sciences, 16-е изд., под ред. A. Osol (1980).The active ingredients can be incorporated into microcapsules, for example, obtained by coacervation or interfacial polymerization processes, for example, hydroxymethylcellulose or gelatin microcapsules and polymethyl methacrylate microcapsules, respectively, in colloidal drug delivery systems (for example, liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles and nanocapsules ) or in a macroemulsion. These methods are described in Remington''s Pharmaceutical Sciences, 16th ed., ed. A. Osol (1980).
Можно получить препараты с замедленным (пролонгированным) высвобождением. Пригодные примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, включающие антитело, причем матрицы представляют собой изделия определенной формы, например, пленки или микрокапсулы.You can get drugs with a slow (prolonged) release. Suitable examples of sustained release formulations include semi-permeable matrices of solid hydrophobic polymers incorporating the antibody, the matrices being shaped articles such as films or microcapsules.
Композиции, предназначенные для применения in vivo, как правило, являются стерильными. Стерильность можно обеспечивать простым способом, например, при фильтрации через стерильные мембраны для фильтрации.Compositions intended for use in vivo, as a rule, are sterile. Sterility can be achieved in a simple manner, for example by filtration through sterile filtration membranes.
G. Методы лечения и терапевтические композицииG. Methods of treatment and therapeutic compositions
Любое из анти-HLA-G антител (или антигенсвязывающий белков), описанное в данном контексте, можно использовать в способах лечения.Any of the anti-HLA-G antibodies (or antigen-binding proteins) described herein can be used in methods of treatment.
В одном объекте настоящего изобретения предлагается анти-HLA-G антитело для применения в качестве лекарственного средства. В других объектах предлагается анти-HLA-G антитело для применения при лечении рака. В определенных вариантах предлагается анти-HLA-G антитело для применения в способе лечения. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения предлагается анти-HLA-G антитело для применения в способе лечения индивидуума, страдающего от рака, который включает введение индивидууму эффективного количества анти-HLA-G антитела.In one aspect of the present invention, an anti-HLA-G antibody is provided for use as a drug. Other entities provide an anti-HLA-G antibody for use in the treatment of cancer. In certain embodiments, an anti-HLA-G antibody is provided for use in a method of treatment. In certain embodiments, the present invention provides an anti-HLA-G antibody for use in a method of treating a subject suffering from cancer, which comprises administering to the subject an effective amount of the anti-HLA-G antibody.
В других вариантах изобретения предлагается анти-HLA-G антитело для применения в качестве иммуномодулятора для прямой или опосредованной индукции пролиферации, активации иммунных клеток (например, за счет высвобождения иммуностимулирующих цитокинов, таких как TNF-альфа (TNFα) и IFN-гамма (IFNγ), или дополнительной миграции иммунных клеток). В определенных вариантах настоящего изобретения предлагается анти-HLA-G антитело для применения в способе иммуномодуляции для прямой или опосредованной индукции пролиферации, активации иммунных клеток, например, за счет высвобождения иммуностимулирующих цитокинов, таких как TNFα и IFN-γ, или дополнительной миграции иммунных клеток у индивидуума, и способ включает введение индивидууму эффективного анти-HLA-G антитела для иммуномодуляции/ для прямой или опосредованной индукции пролиферации, активации иммунных клеток, например, за счет высвобождения иммуностимулирующих цитокинов, таких как TNFα и IFN-γ, или дополнительной миграции иммунных клеток.In other embodiments, the invention provides an anti-HLA-G antibody for use as an immunomodulator for direct or indirect induction of proliferation, activation of immune cells (for example, through the release of immunostimulatory cytokines such as TNF-alpha (TNFα) and IFN-gamma (IFNγ) , or additional migration of immune cells). In certain embodiments, the present invention provides an anti-HLA-G antibody for use in an immunomodulatory method for direct or indirect induction of proliferation, activation of immune cells, e.g. the subject, and the method includes administering to the subject an effective anti-HLA-G antibody for immunomodulation/for direct or indirect induction of proliferation, activation of immune cells, for example, through the release of immunostimulatory cytokines such as TNFα and IFN-γ, or additional migration of immune cells.
В других вариантах изобретения предлагается анти-HLA-G антитело для применения в качестве иммуностимулирующего агента или агента, стимулирующего высвобождение фактора некроза опухоли альфа (TNF-α). В определенных вариантах изобретения предлагается анти-HLA-G антитело для применения в способе иммуномодуляции для прямой или опосредованной индукции пролиферации, активации клеток, например, за счет высвобождения иммуностимулирующих цитокинов, таких как TNFα и IFN-γ или дополнительной миграции иммунных клеток у индивидуума, и способ включает введение индивидууму эффективного анти-HLA-G антитела для иммуномодуляции для прямой или опосредованной индукции пролиферации, активации клеток, например, за счет высвобождения иммуностимулирующих цитокинов, таких как TNFα и IFN-γ или дополнительной миграции иммунных клеток.In other embodiments, the invention provides an anti-HLA-G antibody for use as an immunostimulatory agent or an agent that stimulates the release of tumor necrosis factor alpha (TNF-α). In certain embodiments, an anti-HLA-G antibody is provided for use in an immunomodulatory method to directly or indirectly induce proliferation, activate cells, e.g., by releasing immunostimulatory cytokines such as TNFα and IFN-γ, or further migrating immune cells in an individual, and the method comprises administering to the individual an effective anti-HLA-G antibody for immunomodulation to directly or indirectly induce proliferation, activate cells, for example, by releasing immunostimulatory cytokines such as TNFα and IFN-γ, or additional migration of immune cells.
В других вариантах изобретения предлагается анти-HLA-G антитело для применения для ингибирования иммуносупрессии в опухолях (опухолевых клетках). В других вариантах изобретения предлагается анти-HLA-G антитело для применения для восстановления HLA-G-специфичного сниженного иммунного ответа (например, высвобождение цитокина иммунными клетками (например, TNF-α моноцитами)).In other embodiments, the invention provides an anti-HLA-G antibody for use in inhibiting immunosuppression in tumors (tumor cells). In other embodiments, an anti-HLA-G antibody is provided for use in restoring an HLA-G-specific reduced immune response (eg, cytokine release by immune cells (eg, TNF-α monocytes)).
Термин "индивидуум" в соответствии с любым из описанных выше вариантов предпочтительно обозначает человека. В другом объекте настоящего изобретения предлагается применение анти-HLA-G антитела при производстве или получении лекарственного средства. В одном варианте лекарственное средство предназначено для лечения рака. В другом варианте лекарственное средство предназначено для применения в способе лечения рака, включающем введение индивидууму, страдающему от рака, эффективного количества лекарственного средства. В другом варианте лекарственное средство предназначено для индукции клеточно-опосредованного лизиса раковых клеток. В другом варианте лекарственное средство предназначено для применения в способе индукции клеточно-опосредованного лизиса раковых клеток у индивидуума, страдающего от рака, и указанный способ включает введение индивидууму эффективного количества лекарственного средства для индукции апоптоза раковой клетки или для ингибирования пролиферации раковых клеток. Термин "индивидуум" в соответствии с любым из описанных выше вариантов может обозначать человека.The term "individual" in accordance with any of the options described above preferably means a human. In another aspect of the present invention, the use of an anti-HLA-G antibody in the manufacture or preparation of a medicament is provided. In one embodiment, the drug is for the treatment of cancer. In another embodiment, the drug is for use in a method of treating cancer comprising administering to an individual suffering from cancer an effective amount of the drug. In another embodiment, the drug is for inducing cell-mediated lysis of cancer cells. In another embodiment, the drug is for use in a method of inducing cell-mediated cancer cell lysis in an individual suffering from cancer, and said method comprises administering to the individual an effective amount of the drug to induce apoptosis of the cancer cell or to inhibit cancer cell proliferation. The term "individual" in accordance with any of the options described above may refer to a person.
В другом объекте настоящего изобретения предлагается способ лечения рака. В одном варианте способ включает введение индивидууму, страдающему от рака, эффективного количества анти-HLA-G антитела. Термин "индивидуум" в соответствии с любым из описанных выше вариантов может обозначать человека.In another aspect of the present invention, a method for treating cancer is provided. In one embodiment, the method includes administering to an individual suffering from cancer an effective amount of an anti-HLA-G antibody. The term "individual" in accordance with any of the options described above may refer to a person.
В другом объекте настоящего изобретения предлагается способ индукции клеточно-опосредованного лизиса раковых клеток у индивидуума, страдающего от рака. В одном варианте способ включает введение индивидууму эффективного количества анти-HLA-G антитела для индукции клеточно-опосредованного лизиса раковых клеток у индивидуума, страдающего от рака. Термин "индивидуум" в одном варианте обозначает человека.In another aspect, the present invention provides a method for inducing cell-mediated lysis of cancer cells in an individual suffering from cancer. In one embodiment, the method includes administering to an individual an effective amount of an anti-HLA-G antibody to induce cell-mediated lysis of cancer cells in an individual suffering from cancer. The term "individual" in one embodiment means a human.
В другом объекте настоящего изобретения предлагается фармацевтические составы, включающие любые анти-HLA-G антитела, предложенные в данном контексте, например, для применения в любых описанных выше способах лечения. В одном варианте фармацевтический состав включает любые анти-HLA-G антитела, предложенные в данном контексте, и фармацевтически приемлемый носитель.In another aspect, the present invention provides pharmaceutical compositions comprising any anti-HLA-G antibodies provided herein, for example, for use in any of the treatments described above. In one embodiment, the pharmaceutical composition includes any anti-HLA-G antibodies provided herein and a pharmaceutically acceptable carrier.
Антитело по изобретению (а также любой дополнительный терапевтический агент) можно вводить любыми пригодными способами, включающими парентеральное, внутрилегочное и интраназальное введение, а при необходимости местное лечение, внутриочаговое введение. Парентеральные вливания включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Введение препаратов можно осуществлять любым пригодным способом, например, в виде инъекций, таких как внутривенные или подкожные инъекции, частично в зависимости от того, является ли введение краткосрочным или длительным. В настоящем описании предлагаются различные схемы введения препаратов, включая, но не ограничиваясь только ими, однократное или многократное введение через различные периоды времени, струйное и импульсное вливание.The antibody of the invention (as well as any additional therapeutic agent) can be administered by any suitable means, including parenteral, intrapulmonary and intranasal administration, and, if necessary, topical treatment, intralesional administration. Parenteral infusions include intramuscular, intravenous, intra-arterial, intraperitoneal or subcutaneous administration. The introduction of drugs can be carried out by any suitable method, for example, in the form of injections, such as intravenous or subcutaneous injections, depending in part on whether the introduction is short-term or long-term. In the present description, various schemes for administering drugs are proposed, including, but not limited to, single or multiple administration at various time periods, jet and pulse infusion.
Антитела по изобретению можно перерабатывать, дозировать и вводить в соответствии с правилами надлежащей медицинской практики (GMP). Факторы, рассматриваемые в данном контексте, включают конкретное расстройство, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, нуждающееся в лечении, клиническое состояние отдельного пациента, причину расстройства, участок, в который необходимо доставить агент, способ введения, схему введения и другие факторы, известные практикующим врачам. Антитело можно, но не обязательно, включать в состав, в сочетании с одним или более агентов, которые в настоящее время применяют для профилактики или лечения рассматриваемого расстройства. Эффективное количество указанных других агентов зависит от количества антитела, присутствующего в составе, типа расстройства или способа лечения, а также других факторов, описанных выше. Их обычно используют в тех же дозах и вводят теми же способами, как описано в данном контексте, или в дозах, составляющих приблизительно от 1 до 99% дозировок, описанных в данном контексте, или в любой дозе и любым способом, которые по данным эмпирических/клинических испытаний являются приемлемыми.The antibodies of the invention can be processed, dosed and administered in accordance with good medical practice (GMP). Factors considered herein include the particular disorder being treated, the particular mammal in need of treatment, the clinical condition of the individual patient, the cause of the disorder, the site to which the agent is to be delivered, the route of administration, the schedule of administration, and other factors known to practitioners. The antibody may, but need not, be formulated in combination with one or more agents currently used to prevent or treat the disorder in question. The effective amount of these other agents depends on the amount of antibody present in the composition, the type of disorder or treatment, and other factors described above. They are generally used at the same dosages and administered by the same routes as described herein, or at doses ranging from about 1% to about 99% of the dosages described herein, or at any dose and by any route that empirical evidence suggests. clinical trials are acceptable.
Для профилактики или лечения заболевания соответствующая доза антитела по изобретению (при использовании в отдельности или в комбинации с одним или более другими дополнительными терапевтическими агентами) зависит от типа заболевания, подлежащего лечению, типа антитела, тяжести и течения заболевания, при этом антитело вводят для профилактических или терапевтических целей, в зависимости от предшествующих способов лечения, истории болезни пациента и ответной реакции на антитело и от мнения лечащего врача. Антитело вводят пациенту пригодным способом введения с использованием однократного или многократного введения. В зависимости от типа и тяжести заболевания антитело можно вводить в начальной дозе, рекомендованной для введения пациентам, которая находится в диапазоне от приблизительно 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,5 мг/кг-10 мг/кг), например, с использованием однократного введения или нескольких раздельных введений или с использованием непрерывного вливания. Обычно суточная доза может составлять приблизительно от 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более, в зависимости от указанных выше факторов. Повторные введения в течение нескольких дней или более осуществляют в зависимости от состояния, при этом лечение, как правило, продолжают до тех пор, пока не достигается требуемое подавление симптомов заболевания. Типичная доза антитела находится в диапазоне от приблизительно 0,05 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг. Таким образом, пациенту можно вводить одну или более доз, составляющих приблизительно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг или 10 мг/кг (или любую их комбинацию). Указанные дозы можно вводить с определенной периодичностью, например, каждую неделю или каждые три недели (например, чтобы пациент получал от приблизительно двух до приблизительно двадцати или, например, приблизительно шесть доз антитела). Сначала можно вводить более высокую дозу, а затем вводить одну или более доз с более низким содержанием антитела. Типичная схема введения доз включает введение начальной высокой дозы антитела, приблизительно 4 мг/кг, с последующим введением еженедельной поддерживающей дозы антитела, приблизительно 2 мг/кг. Однако можно использовать другие схемы введения препаратов. Эффективность указанного лечения можно легко контролировать с помощью стандартных методов и анализов.For the prevention or treatment of a disease, the appropriate dose of an antibody of the invention (when used alone or in combination with one or more other additional therapeutic agents) will depend on the type of disease being treated, the type of antibody, the severity and course of the disease, and the antibody is administered for prophylactic or therapeutic goals, depending on prior treatments, the patient's medical history and antibody response, and the judgment of the attending physician. The antibody is administered to the patient by a suitable route of administration using a single or multiple administration. Depending on the type and severity of the disease, the antibody may be administered at an initial dose recommended for administration to patients, which ranges from about 1 μg/kg to 15 mg/kg (e.g., 0.5 mg/kg-10 mg/kg), for example, using a single injection or multiple separate injections or using a continuous infusion. Typically, the daily dose may be from about 1 μg/kg to 100 mg/kg or more, depending on the above factors. Repeated administrations over a period of several days or more are carried out depending on the condition, with treatment generally being continued until the desired suppression of the symptoms of the disease is achieved. A typical antibody dose is in the range of about 0.05 mg/kg to about 10 mg/kg. Thus, one or more doses of approximately 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg, or 10 mg/kg (or any combination thereof) may be administered to a patient. These doses can be administered at regular intervals, such as every week or every three weeks (eg, so that the patient receives from about two to about twenty or, for example, about six doses of the antibody). You can first enter a higher dose, and then enter one or more doses with a lower content of antibodies. A typical dosing regimen involves administering an initial high dose of the antibody, approximately 4 mg/kg, followed by a weekly maintenance dose of the antibody, approximately 2 mg/kg. However, other drug regimens can be used. The effectiveness of this treatment can be easily monitored using standard methods and assays.
Следует понимать, что любые составы или методы лечения, описанные выше, можно проводить с использованием иммуноконъюгата по настоящему изобретению вместо или дополнительно к анти-HLA-G антителуIt should be understood that any of the formulations or treatments described above may be carried out using the immunoconjugate of the present invention in place of, or in addition to, an anti-HLA-G antibody.
II. ИзделияII. Products
В другом объекте настоящего изобретения предлагается изделие, содержащее материалы, пригодные для лечения, профилактики и/или диагностики расстройств, описанных выше. Изделие содержит контейнер и этикетку или вкладыш-инструкцию, вложенную в упаковку или распечатанную на контейнере. Пригодные контейнеры включают, например, бутылочки, флаконы, шприцы, пакеты для растворов для внутривенного вливания и т.д. Контейнеры можно изготовить из множества материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию, которая сама по себе или в комбинации с другой композицией проявляет эффективность при лечении, профилактике и/или диагностике состояния, а также может быть снабжен зоной доступа (например, контейнер может представлять собой пакет для раствора для внутривенного введения или флакон с пробкой, прокалываемой иглой для подкожной инъекции). По меньшей мере, один активный агент в композиции представляет собой антитело по изобретению. На этикетке или вкладыше-инструкции указано, что композицию можно использовать для лечения выбранных состояний. Кроме того, изделие может содержать (а) первый контейнер, включающий композицию, которая содержит антитело по изобретению, и (б) второй контейнер, включающий композицию, которая содержит дополнительный цитотоксический агент или иное лекарственное средство. Изделие в указанном варианте осуществления настоящего изобретения может дополнительно содержать вкладыш-инструкцию, в которой указано, что композиции можно использовать для лечения конкретного состояния. В другом варианте или дополнительно изделие может дополнительно содержать второй (или третий) контейнер, включающий фармацевтически приемлемый буферный раствор, такой как бактериостатическая вода для инъекций (BWFI), фосфатно-солевой буферный раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Изделие может также включать другие материалы, необходимые с коммерческой точки зрения или для удобства пользователя, включая другие буферные растворы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.In another aspect of the present invention, there is provided an article of manufacture containing materials useful in the treatment, prevention and/or diagnosis of the disorders described above. The product contains a container and a label or instruction leaflet enclosed in the package or printed on the container. Suitable containers include, for example, bottles, vials, syringes, IV solution bags, and the like. Containers can be made from a variety of materials such as glass or plastic. The container contains a composition that, alone or in combination with another composition, is effective in treating, preventing, and/or diagnosing a condition, and may also be provided with an access zone (for example, the container may be an intravenous solution bag or vial with stopper pierced by a hypodermic needle). At least one active agent in the composition is an antibody of the invention. The label or package insert indicates that the composition can be used to treat selected conditions. In addition, the article may contain (a) a first container comprising a composition that contains an antibody of the invention, and (b) a second container comprising a composition that contains an additional cytotoxic agent or other drug. The article of manufacture in this embodiment of the present invention may further comprise an instruction leaflet stating that the compositions may be used to treat a particular condition. Alternatively or additionally, the article may further comprise a second (or third) container comprising a pharmaceutically acceptable buffer solution such as bacteriostatic water for injection (BWFI), phosphate buffered saline, Ringer's solution and dextrose solution. The product may also include other materials required commercially or for the convenience of the user, including other buffers, diluents, filters, needles, and syringes.
Следующие ниже примеры и фигуры предоставлены для облегчения понимания настоящего изобретения, истинный объем которого изложен в прилагаемой формуле изобретения. Следует понимать, что в изложенные процедуры могут быть внесены модификации, не выходящие за пределы сущности настоящего изобретения.The following examples and figures are provided to facilitate understanding of the present invention, the true scope of which is set forth in the appended claims. It should be understood that modifications can be made to the procedures outlined without departing from the spirit of the present invention.
Описание аминокислотных последовательностейDescription of amino acid sequences
Антитела анти-HLA-G (вариабельные области и гипервариабельные области (HVRs)):Anti-HLA-G antibodies (variable regions and hypervariable regions (HVRs)):
SEQ ID NO: 1 тяжелая цепь HVR-H1, HLA-G-0031,SEQ ID NO: 1 heavy chain HVR-H1, HLA-G-0031,
SEQ ID NO: 2 тяжелая цепь HVR-H2, HLA-G-0031,SEQ ID NO: 2 heavy chain HVR-H2, HLA-G-0031,
SEQ ID NO: 3 тяжелая цепь HVR-H3, HLA-G-0031,SEQ ID NO: 3 heavy chain HVR-H3, HLA-G-0031,
SEQ ID NO: 4 легкая цепь HVR-L1, HLA-G-0031,SEQ ID NO: 4 light chain HVR-L1, HLA-G-0031,
SEQ ID NO: 5 легкая цепь HVR-L2, HLA-G-0031,SEQ ID NO: 5 light chain HVR-L2, HLA-G-0031,
SEQ ID NO: 6 легкая цепь HVR-L3, HLA-G-0031,SEQ ID NO: 6 light chain HVR-L3, HLA-G-0031,
SEQ ID NO: 7 вариабельный домен тяжелой цепи VH, HLA-G-0031,SEQ ID NO: 7 VH heavy chain variable domain, HLA-G-0031,
SEQ ID NO: 8 вариабельный домен легкой цепи VL, HLA-G-0031,SEQ ID NO: 8 VL light chain variable domain, HLA-G-0031,
SEQ ID NO: 9 тяжелая цепь HVR-H1, HLA-G-0039,SEQ ID NO: 9 heavy chain HVR-H1, HLA-G-0039,
SEQ ID NO: 10 тяжелая цепь HVR-H2, HLA-G-0039,SEQ ID NO: 10 heavy chain HVR-H2, HLA-G-0039,
SEQ ID NO: 11 тяжелая цепь HVR-H3, HLA-G-0039,SEQ ID NO: 11 heavy chain HVR-H3, HLA-G-0039,
SEQ ID NO: 12 легкая цепь HVR-L1, HLA-G-0039,SEQ ID NO: 12 light chain HVR-L1, HLA-G-0039,
SEQ ID NO: 13 легкая цепь HVR-L2, HLA-G-0039,SEQ ID NO: 13 light chain HVR-L2, HLA-G-0039,
SEQ ID NO: 14 легкая цепь HVR-L3, HLA-G-0039,SEQ ID NO: 14 light chain HVR-L3, HLA-G-0039,
SEQ ID NO: 15 вариабельный домен тяжелой цепи VH, HLA-G-0039,SEQ ID NO: 15 VH heavy chain variable domain, HLA-G-0039,
SEQ ID NO: 16 вариабельный домен легкой цепи VL, HLA-G-0039,SEQ ID NO: 16 VL light chain variable domain, HLA-G-0039,
SEQ ID NO: 17 тяжелая цепь HVR-H1, HLA-G-0041,SEQ ID NO: 17 heavy chain HVR-H1, HLA-G-0041,
SEQ ID NO: 18 тяжелая цепь HVR-H2, HLA-G-0041,SEQ ID NO: 18 heavy chain HVR-H2, HLA-G-0041,
SEQ ID NO: 19 тяжелая цепь HVR-H3, HLA-G-0041,SEQ ID NO: 19 heavy chain HVR-H3, HLA-G-0041,
SEQ ID NO: 20 легкая цепь HVR-L1, HLA-G-0041,SEQ ID NO: 20 light chain HVR-L1, HLA-G-0041,
SEQ ID NO: 21 легкая цепь HVR-L2, HLA-G-0041,SEQ ID NO: 21 light chain HVR-L2, HLA-G-0041,
SEQ ID NO: 22 легкая цепь HVR-L3, HLA-G-0041,SEQ ID NO: 22 light chain HVR-L3, HLA-G-0041,
SEQ ID NO: 23 вариабельный домен тяжелой цепи VH, HLA-G-0041,SEQ ID NO: 23 VH heavy chain variable domain, HLA-G-0041,
SEQ ID NO: 24 вариабельный домен легкой цепи VL, HLA-G-0041,SEQ ID NO: 24 VL light chain variable domain, HLA-G-0041,
SEQ ID NO: 25 тяжелая цепь HVR-H1, HLA-G-0090,SEQ ID NO: 25 heavy chain HVR-H1, HLA-G-0090,
SEQ ID NO: 26 тяжелая цепь HVR-H2, HLA-G-0090,SEQ ID NO: 26 heavy chain HVR-H2, HLA-G-0090,
SEQ ID NO: 27 тяжелая цепь HVR-H3, HLA-G-0090,SEQ ID NO: 27 heavy chain HVR-H3, HLA-G-0090,
SEQ ID NO: 28 легкая цепь HVR-L1, HLA-G-0090,SEQ ID NO: 28 light chain HVR-L1, HLA-G-0090,
SEQ ID NO: 29 легкая цепь HVR-L2, HLA-G-0090,SEQ ID NO: 29 light chain HVR-L2, HLA-G-0090,
SEQ ID NO: 30 легкая цепь HVR-L3, HLA-G-0090,SEQ ID NO: 30 light chain HVR-L3, HLA-G-0090,
SEQ ID NO: 31 вариабельный домен тяжелой цепи VH, HLA-G-0090,SEQ ID NO: 31 VH heavy chain variable domain, HLA-G-0090,
SEQ ID NO: 32 вариабельный домен легкой цепи VL, HLA-G-0090,SEQ ID NO: 32 VL light chain variable domain, HLA-G-0090,
SEQ ID NO: 33 гуманизированный вариант вариабельного домена тяжелой цепи VH, HLA-G-0031-0104 (HLA-G-0104),SEQ ID NO: 33 humanized VH heavy chain variable domain variant, HLA-G-0031-0104 (HLA-G-0104),
SEQ ID NO: 34 гуманизированный вариант вариабельного домена легкой цепи VL, HLA-G-0031-0104 (HLA-G-0104).SEQ ID NO: 34 humanized variant of VL light chain variable domain, HLA-G-0031-0104 (HLA-G-0104).
Другие последовательностиOther sequences
SEQ ID NO: 35: типичный HLA-G человека,SEQ ID NO: 35: exemplary human HLA-G,
SEQ ID NO: 36: типичный внеклеточный домен (ECD) HLA-G человека,SEQ ID NO: 36: exemplary extracellular domain (ECD) of human HLA-G,
SEQ ID NO: 37: типичный β2М человека,SEQ ID NO: 37: exemplary human β2M,
SEQ ID NO: 38: модифицированный ECD HLA-G человека (где специфические аминокислоты HLA-G заменены на консенсусные аминокислоты HLA-A (= непривитой (degrafted) HLA-G, см. также фиг. 1)),SEQ ID NO: 38: Modified human HLA-G ECD (where HLA-G specific amino acids are replaced with HLA-A consensus amino acids (=degrafted HLA-G, see also FIG. 1)),
SEQ ID NO: 39: типичный HLA-A2 человека,SEQ ID NO: 39: exemplary human HLA-A2,
SEQ ID NO: 40: типичный ECD HLA-A2 человека,SEQ ID NO: 40: typical human HLA-A2 ECD,
SEQ ID NO: 41: типичный ECD H2Kd мыши,SEQ ID NO: 41: typical H2Kd mouse ECD,
SEQ ID NO: 42: типичный ECD RT1A крысы,SEQ ID NO: 42: typical rat RT1A ECD,
SEQ ID NO: 43: типичный комплекс МНС класса I HLA-G человека и β2М,SEQ ID NO: 43: exemplary complex of MHC class I human HLA-G and β2M,
SEQ ID NO: 44: типичный модифицированный комплекс МНС класса I HLA-G человека и β2М (где специфические аминокислоты HLA-G заменены консенсусными аминокислотами HLA-A (= непривитой (degrafted) HLA-G), см. также фиг. 1),SEQ ID NO: 44: exemplary modified MHC class I human HLA-G and β2M complex (where HLA-G specific amino acids are replaced by HLA-A consensus amino acids (=degrafted HLA-G), see also FIG. 1),
SEQ ID NO: 45: типичный комплекс МНС класса I H2Kd мыши и β2М,SEQ ID NO: 45: exemplary MHC class I mouse H2Kd and β2M complex,
SEQ ID NO: 46: типичный комплекс МНС класса I HLA-G человека/H2Kd мыши и β2М, где аминокислотные остатки в положениях, специфичных для HLA-G человека, привиты (grafted) на каркасный участок H2Kd мыши,SEQ ID NO: 46: exemplary MHC class I human HLA-G/mouse H2Kd complex and β2M, wherein amino acid residues at human HLA-G specific positions are grafted onto the mouse H2Kd framework,
SEQ ID NO: 47: типичный комплекс МНС класса I RT1A крысы и β2М,SEQ ID NO: 47: representative MHC class I complex of rat RT1A and β2M,
SEQ ID NO: 48: типичный комплекс МНС класса I HLA-G человека/RT1A крысы и β2М, где аминокислотные остатки в положениях, специфичных для HLA-G человека, привиты (grafted) на каркасный участок RT1A крысы,SEQ ID NO: 48: exemplary MHC class I human HLA-G/rat RT1A complex and β2M, wherein amino acid residues at human HLA-G specific positions are grafted onto the rat RT1A framework,
SEQ ID NO: 49 линкер и his-Tag,SEQ ID NO: 49 linker and his-Tag,
SEQ ID NO: 50 пептид,SEQ ID NO: 50 peptide,
SEQ ID NO: 51 консервативная область легкой цепи каппа антитела человека,SEQ ID NO: 51 human antibody kappa light chain conserved region,
SEQ ID NO: 52 консервативная область легкой цепи лямбда антитела человека,SEQ ID NO: 52 human lambda antibody conserved light chain region,
SEQ ID NO: 53 консервативная область тяжелой цепи антитела человека, полученной из IgG1,SEQ ID NO: 53 conserved heavy chain region of a human antibody derived from IgG1,
SEQ ID NO: 54 консервативная область тяжелой цепи антитела человека, полученной из IgG1, содержащая мутации L234A, L235A и P329G,SEQ ID NO: 54 Conserved IgG1 derived human heavy chain region containing mutations L234A, L235A and P329G,
SEQ ID NO: 55 консервативная область тяжелой цепи антитела человека, полученной из IgG4.SEQ ID NO: 55 conserved heavy chain region of a human antibody derived from IgG4.
Аминокислотные последовательности анти-HLA-G антител (вариабельные области подчеркнуты и гипервариабельные области (HVR) выделены жирным шрифтом)Amino acid sequences of anti-HLA-G antibodies (variable regions underlined and hypervariable regions (HVR) in bold)
SEQ ID NO: 7: вариабельный домен тяжелой цепи VH, HLA-G-0031: 
SEQ ID NO: 8: вариабельный домен легкой цепи VL, HLA-G-0031: 
SEQ ID NO: 33: гуманизированный вариант вариабельного домена тяжелой цепи VH, HLA-G-0031-0104 (HLA-G-0104): 
SEQ ID NO: 34: гуманизированный вариант вариабельного домена легкой цепи VL, HLA-G-0031-0104 (HLA-G-0104): 
SEQ ID NO: 15: вариабельный домен тяжелой цепи VH, HLA-G-0039: 
SEQ ID NO: 16: вариабельный домен легкой цепи VL, HLA-G-0039 
SEQ ID NO: 23: вариабельный домен тяжелой цепи VH, HLA-G-0041: 
SEQ ID NO: 24: вариабельный домен легкой цепи VL, HLA-G-0041 
SEQ ID NO: 31: вариабельный домен тяжелой цепи VH, HLA-G-0090: 
SEQ ID NO: 32: вариабельный домен легкой цепи VL, HLA-G-0090 
Специфические варианты осуществления настоящего изобретения перечислены ниже:Specific embodiments of the present invention are listed below:
1. Выделенное антитело, которое специфически связывается с HLA-человека, где антитело включает1. An isolated antibody that specifically binds to human HLA, wherein the antibody comprises
A) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и (iii) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из последовательности SEQ ID NO: 3, и (b) домен VL, включающий (i) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, (ii) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и (iii) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, илиA) (a) a VH domain comprising (i) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and (iii) HVR-H3 containing an amino acid sequence selected from the sequence of SEQ ID NO: 3, and (b) a VL domain comprising (i) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, (ii) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and (iii) an HVR-L3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, or
B) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, (ii) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и (iii) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из последовательности SEQ ID NO: 11, и (b) домен VL, включающий (i) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, (ii) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и (iii) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, илиB) (a) a VH domain comprising (i) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, (ii) HVR-H2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, and (iii) HVR-H3 containing an amino acid sequence selected from the sequence of SEQ ID NO: 11, and (b) a VL domain comprising (i) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, (ii) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, and (iii) an HVR-L3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, or
C) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, (ii) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и (iii) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из последовательности SEQ ID NO: 19, и (b) домен VL, включающий (i) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, (ii) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (iii) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, илиC) (a) a VH domain comprising (i) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, (ii) HVR-H2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and (iii) HVR-H3 containing an amino acid sequence selected from the sequence of SEQ ID NO: 19, and (b) a VL domain comprising (i) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, (ii) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and (iii) an HVR-L3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, or
D) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, (ii) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и (iii) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из последовательности SEQ ID NO: 27, и (b) домен VL, включающий (i) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, (ii) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, и (iii) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30.D) (a) a VH domain comprising (i) HVR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, (ii) HVR-H2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and (iii) HVR-H3 containing an amino acid sequence selected from the sequence of SEQ ID NO: 27, and (b) a VL domain comprising (i) HVR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, (ii) HVR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, and (iii) HVR-L3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30.
2. Антитело по варианту 1, где антитело включает2. The antibody according to
А)A)
i) включает последовательность VH SEQ ID NO: 7 и последовательность VL SEQ ID NO: 8,i) includes a VH sequence of SEQ ID NO: 7 and a VL sequence of SEQ ID NO: 8,
ii) или гуманизированный вариант VH и VL антитела по п. i), илиii) or a humanized VH and VL variant of the antibody of i), or
iii) включает последовательность VH SEQ ID NO: 33 и последовательность VL SEQ ID NO: 34, илиiii) includes a VH sequence of SEQ ID NO: 33 and a VL sequence of SEQ ID NO: 34, or
В)IN)
включает последовательность VH SEQ ID NO: 15 и последовательность VL SEQ ID NO: 16, илиincludes a VH sequence of SEQ ID NO: 15 and a VL sequence of SEQ ID NO: 16, or
С)WITH)
включает последовательность VH SEQ ID NO: 23 и последовательность VL SEQ ID NO: 24, илиincludes a VH sequence of SEQ ID NO: 23 and a VL sequence of SEQ ID NO: 24, or
D)D)
включает последовательность VH SEQ ID NO: 31 и последовательность VL SEQ ID NO: 32.includes the VH sequence SEQ ID NO: 31 and the VL sequence SEQ ID NO: 32.
3. Выделенное антитело, которое связывается с HLA-G человека, где антитело3. An isolated antibody that binds to human HLA-G, wherein the antibody
а) связывается с одним и тем же эпитопом, что и антитело, которое включает последовательность VH SEQ ID NO: 7 и последовательность VL SEQ ID NO: 8,a) binds to the same epitope as an antibody that includes the VH sequence of SEQ ID NO: 7 and the VL sequence of SEQ ID NO: 8,
или b) связывается с одним и тем же эпитопом, что и антитело, которое включает последовательность VH SEQ ID NO: 31 и последовательность VL SEQ ID NO: 32.or b) binds to the same epitope as an antibody that includes the VH sequence of SEQ ID NO: 31 and the VL sequence of SEQ ID NO: 32.
4. Анти-HLA-G антитело по любому из вариантов 1-4, где антитело4. Anti-HLA-G antibody according to any one of options 1-4, where the antibody
a) не проявляет перекрестную реактивность с модифицированным комплексом HLA-G β2М МНС I человека, включающим последовательность SEQ ID NO: 44, и/илиa) does not cross-react with a modified human HLA-G β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 44, and/or
b) не проявляет перекрестную реактивность с комплексом HLA-A2 β2М МНС I человека, включающим последовательность SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 37, и/илиb) does not cross-react with the human HLA-A2 β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 39 and SEQ ID NO: 37, and/or
c) не проявляет перекрестную реактивность с комплексом H2Kd β2М МНС I мыши, включающим последовательность SEQ ID NO: 45, и/илиc) does not cross-react with the H2Kd β2M mouse MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 45, and/or
e) не проявляет перекрестную реактивность с комплексом RT1A β2М МНС I крысы, включающим последовательность SEQ ID NO: 47, и/илиe) does not cross-react with the rat RT1A β2M MHC I complex comprising the sequence of SEQ ID NO: 47, and/or
f) ингибирует связывание ILT2 с мономерным комплексом HLA-G β2М МНС I (включающим последовательность SEQ ID NO: 43), и/илиf) inhibits ILT2 binding to the HLA-G β2M MHC I monomeric complex (comprising the sequence of SEQ ID NO: 43), and/or
g) ингибирует связывание ILT2 с тримерным комплексом HLA-G β2М МНС I (включающим последовательность SEQ ID NO: 43) более чем на 50% (в одном варианте более чем на 60%) (по сравнению со связыванием без антитела) (см. пример 4b), и/илиg) inhibits ILT2 binding to the HLA-G β2M MHC I trimeric complex (comprising the sequence of SEQ ID NO: 43) by more than 50% (in one embodiment, more than 60%) (compared to binding without antibody) (see example 4b), and/or
h) ингибирует связывание ILT2 с мономерным и/или димерным и/или тримерным комплексом HLA-G β2М МНС I (включающим последовательность SEQ ID NO: 43) более чем на 50% (в одном варианте более чем на 80%) (по сравнению со связыванием без антитела) (см. пример 4b), и/илиh) inhibits ILT2 binding to the monomeric and/or dimeric and/or trimeric HLA-G β2M MHC I complex (comprising the sequence of SEQ ID NO: 43) by more than 50% (in one embodiment, more than 80%) (compared to binding without antibody) (see example 4b), and/or
i) ингибирует связывание ILT2 (с HLA-G) на клетках JEG3 (АТСС No. НТВ36) (более чем на 50% (в одном варианте более чем на 80%)) (по сравнению со связыванием без антитела) (см. пример 6), и/илиi) inhibits ILT2 binding (to HLA-G) on JEG3 cells (ATCC No. HTB36) (more than 50% (in one embodiment more than 80%)) (compared to binding without antibody) (see example 6 ), and/or
j) связывается (с HLA-G) на клетках JEG3 (АТСС No. НТВ36) (см. пример 5) и ингибирует связывание ILT2 (с HLA-G) на клетках JEG3 (АТСС No. НТВ36) (более чем на 50% (в одном варианте более чем на 80%)) (по сравнению со связыванием без антитела) (см. пример 6), и/илиj) binds (to HLA-G) on JEG3 cells (ATCC No. HTB36) (see example 5) and inhibits ILT2 binding (to HLA-G) on JEG3 cells (ATCC No. HTB36) (more than 50% ( in one embodiment, more than 80%)) (compared to binding without antibody) (see example 6), and/or
k) ингибирует связывание CD8a с HLAG более чем на 80% (по сравнению со связыванием без антитела) (см., например, пример 4 с), и/илиk) inhibits CD8a binding to HLAG by more than 80% (compared to binding without antibody) (see, for example, example 4 c), and/or
1) восстанавливает HLA-G-специфичный пониженный иммунный ответ (например, сниженное высвобождение фактора некроза опухоли альфа (TNFα)) в моноцитах, совместно культивируемых с клетками JEG-3 (ATCC HTB36).1) restores an HLA-G-specific reduced immune response (eg, reduced release of tumor necrosis factor alpha (TNFα)) in monocytes co-cultured with JEG-3 cells (ATCC HTB36).
5. Антитело по любому из предшествующих вариантов, где антитело представляет собой изотип IgG1.5. An antibody according to any of the preceding embodiments, wherein the antibody is an IgG1 isotype.
6. Антитело по варианту 5, где антитело представляет собой изотип IgG1 с мутациями L234A, L235A и P329G (нумерация согласно EU индексу Кабата).6. Antibody according to
7. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по любому из предшествующих вариантов.7. An isolated nucleic acid encoding an antibody according to any of the preceding embodiments.
8. Клетка хозяина, включающая нуклеиновую кислоту по варианту 7.8. Host cell containing nucleic acid according to
9. Способ продуцирования антитела, который включает культивирование клеток хозяина по варианту 7 таким образом, чтобы продуцировать антитело.9. A method for producing an antibody, which comprises culturing the host cells of
10. Способ по варианту 9, который дополнительно включает выделение антитела из клетки хозяина.10. The method of
11. Фармацевтический состав, включающий антитело по любому из вариантов 1 - 6 и фармацевтически приемлемый носитель.11. A pharmaceutical composition comprising an antibody according to any one of options 1-6 and a pharmaceutically acceptable carrier.
12. Антитело по любому из вариантов 1 - 6 для применения в качестве лекарственного средства.12. An antibody according to any of options 1-6 for use as a drug.
13. Антитело по любому из вариантов 1 - 6 для применения при лечении рака.13. Antibody according to any one of options 1-6 for use in the treatment of cancer.
14. Применение антитела по любому из вариантов 1 - 6 для получения лекарственного средства.14. The use of an antibody according to any of options 1-6 to obtain a medicinal product.
15. Применение по варианту 14, где лекарственное средство предназначено для лечения рака.15. Use according to
16. Способ лечения индивидуума, страдающего от рака, включающий введение индивидууму эффективного количества антитела по вариантам 1 - 6.16. A method of treating an individual suffering from cancer, comprising administering to the individual an effective amount of an antibody according to
17. Способ выбора анти-HLA-G антител (например, по вариантам 1 - 6), включающий следующие стадии:17. A method for selecting anti-HLA-G antibodies (for example, according to
a) определение (оценка) уровня связывания анти-HLA-G антител с комплексом HLA-G β2M МНС I человека, включающим последовательность SEQ ID NO:43, по данным метода поверхностного плазменного резонанса,a) determination (assessment) of the level of binding of anti-HLA-G antibodies to the HLA-G β2M MHC I complex of a person, including the sequence of SEQ ID NO: 43, according to the method of surface plasma resonance,
b) определение уровня ингибирования связывания ILT2 с мономерным и/или димерным и/или тримерным комплексом HLA-G β2M МНС I соответствующими анти-HLAG антителами, иb) determining the level of inhibition of ILT2 binding to monomeric and/or dimeric and/or trimeric complex HLA-G β2M MHC I corresponding anti-HLAG antibodies, and
c) выбор анти-HLA-G антител, которые ингибируют связывание ILT2 с мономерным комплексом HLA-G β2M МНС I более чем на 50% (в одном варианте более чем на 80%) (по сравнению со связыванием без антитела), или выбор анти-HLA-G антител, которые ингибируют связывание ILT2 с мономерным и/или димерным и/или тримерным комплексом HLA-G β2M МНС I более чем на 50% (в одном варианте более чем на 70%) (по сравнению со связыванием без антитела),c) selection of anti-HLA-G antibodies that inhibit ILT2 binding to the HLA-G β2M MHC I monomeric complex by more than 50% (in one embodiment, more than 80%) (compared to binding without antibody), or selection of anti -HLA-G antibodies that inhibit ILT2 binding to the monomeric and/or dimeric and/or trimeric HLA-G β2M MHC I complex by more than 50% (in one embodiment, more than 70%) (compared to binding without antibody) ,
d) восстанавливает HLA-G-специфичный пониженный иммунный ответ (например, сниженное высвобождение фактора некроза опухоли альфа (TNFα)) в моноцитах, совместно культивируемых с клетками JEG-3 (ATCC HTB36).d) restores an HLA-G-specific reduced immune response (eg, reduced release of tumor necrosis factor alpha (TNFα)) in monocytes co-cultured with JEG-3 cells (ATCC HTB36).
18. Способ выбора анти-HLA-G антител (например, по варианту 6), включающий следующие стадии:18. A method for selecting anti-HLA-G antibodies (for example, according to option 6), including the following steps:
a) определение уровня связывания анти-HLA-G антител с клетками JEG3 ((ATCC No. HTB36) методом проточной цитометрии (используя сортировку флуоресцентно-активированных клеток) (анализ FACS),a) determining the level of binding of anti-HLA-G antibodies to JEG3 cells ((ATCC No. HTB36) by flow cytometry (using fluorescent activated cell sorting) (FACS analysis),
b) определение уровня ингибирования связывания ILT2 с клетками JEG3 ((ATCC No. HTB36) соответствующими анти-HLA-G антителами методом проточной цитометрии (используя сортировку флуоресцентно-активированных клеток) (анализ FACS), иb) determining the level of inhibition of ILT2 binding to JEG3 cells ((ATCC No. HTB36) by the corresponding anti-HLA-G antibodies by flow cytometry (using fluorescent activated cell sorting) (FACS analysis), and
c) выбор анти-HLA-G антител, которые связываются с клетками JEG3 (ATCC No. HTB36) и ингибируют связывание ILT2 с клетками JEG3 (ATCC No. HTB36) более чем на 50% (в одном варианте более чем на 80%) по сравнению со связыванием без антитела.c) selecting anti-HLA-G antibodies that bind to JEG3 cells (ATCC No. HTB36) and inhibit ILT2 binding to JEG3 cells (ATCC No. HTB36) by more than 50% (in one embodiment, more than 80%) by compared to binding without antibody.
ПримерыExamples
Методы рекомбинантных ДНКRecombinant DNA methods
Для работы с ДНК использовали стандартные методики, как описано в книге Sambrook J. и др., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989). Молекулярно-биологические реагенты использовали согласно инструкциям фирм-изготовителей.Standard techniques were used to work with DNA as described in Sambrook J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989). Molecular biological reagents were used according to the manufacturer's instructions.
Синтез генов и олигонуклеотидовSynthesis of genes and oligonucleotides
Требуемые сегменты гена получали химическим синтезом на фирме Geneart GmbH (Regensburg, Germany). Синтезированные фрагменты генов клонировали в плазмиды Е. coli для размножения/амплификации. Последовательности ДНК субклонированных фрагментов гена подтверждали секвенированием ДНК. В другом варианте короткие фрагменты синтезированных ДНК получали при отжиге полученных химическим синтезом олигонуклеотидов или с использованием ПНР. Соответствующие олигонуклеотиды получали на фирме metabion GmbH (Planegg-Martinsried, Germany).The required gene segments were obtained by chemical synthesis at Geneart GmbH (Regensburg, Germany). The synthesized gene fragments were cloned into E. coli plasmids for propagation/amplification. The DNA sequences of the subcloned gene fragments were confirmed by DNA sequencing. In another variant, short fragments of the synthesized DNA were obtained by annealing the oligonucleotides obtained by chemical synthesis or by using PCR. The corresponding oligonucleotides were obtained from metabion GmbH (Planegg-Martinsried, Germany).
Описание основной/стандартной экспрессионной плазмиды млекопитающихDescription of Mammalian Basic/Standard Expression Plasmid
Для экспрессии требуемого гена/белка (например, полноразмерной тяжелой цепи антитела, полноразмерной легкой цепи антитела или соединения МНС (главного комплекса гистосовместимости) класса I, например, HLA-G, или соединения МНС класса I, гибридизованного с пептидом и β-2 микроглобулином, например, HLA-G, гибридизованного с HLA-G связывающим пептидом и/или β-2 микроглобулином) использовали единицу транскрипции, содержащую следующие функциональные элементы:To express the desired gene/protein (e.g., full-length antibody heavy chain, full-length antibody light chain, or an MHC (major histocompatibility complex) class I compound, such as HLA-G, or an MHC class I compound hybridized to a peptide and β-2 microglobulin, for example, HLA-G hybridized to an HLA-G binding peptide and/or β-2 microglobulin) a transcription unit containing the following functional elements was used:
- Немедленно-ранний энхансер и немедленно ранний промотер цитомегаловируса человека (P-CMV), включающие интрон А,- Immediate early enhancer and immediate early promoter of human cytomegalovirus (P-CMV), including intron A,
- 5'-нетранслируемую область тяжелой цепи иммуноглобулина человека (5'UTR),- human immunoglobulin heavy chain 5'-untranslated region (5'UTR),
- сигнальную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина мыши,- mouse immunoglobulin heavy chain signal sequence,
- ген/белок для экспрессии (например, полноразмерная тяжелая цепь антитела или соединение МНС класса I), и- a gene/protein to be expressed (for example, a full-length antibody heavy chain or an MHC class I compound), and
- последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста (BGH рА).- bovine growth hormone polyadenylation sequence (BGH pA).
Кроме единицы/кассеты экспрессии, включающих требуемый ген, предназначенный для экспрессии, основная/стандартная плазмида экспрессии человека включаетIn addition to the expression unit/cassette containing the desired gene to be expressed, the basic/standard human expression plasmid includes
- источник репликации из вектора pUC18, который обеспечивает репликацию данной плазмиды в Е. coli,- a source of replication from the pUC18 vector, which ensures the replication of this plasmid in E. coli,
- ген бета-лактамазы, который придает Е. coli устойчивость к ампицилину.- gene beta-lactamase, which gives E. coli resistance to ampicillin.
Определение белкаProtein definition
Концентрацию белка очищенных полипептидов определяли по оптической плотности (OD) при 280 нм с использованием коэффициента молярной экстинкции, рассчитанного на основе аминокислотной последовательности полипептида.The protein concentration of the purified polypeptides was determined by optical density (OD) at 280 nm using a molar extinction coefficient calculated from the amino acid sequence of the polypeptide.
Пример 1Example 1
Получение гибридных соединений HLA-G для скрининга и контрскринингаPreparation of HLA-G hybrid compounds for screening and counter-screening
Вследствие высокой гомологичности (>98%) с другими соединениями МНС I иммунизация соединениями HLA-G приводит к получению поликлональной сыворотки, состоящей из перекрестнореактивных антител MHC-I и действительно специфичных антител HLA-G.Due to high homology (>98%) with other MHC I compounds, immunization with HLA-G compounds results in a polyclonal sera consisting of cross-reactive MHC-I antibodies and truly specific HLA-G antibodies.
К настоящему времени отсутствуют средства выбора действительно специфичных антител HLA-G без перекрестной реактивности с другими MHC-I (например, HLA-A) и дополнительного выбора антител с функцией блокирования рецептора.To date, there is no means of selecting truly specific HLA-G antibodies without cross-reactivity with other MHC-Is (eg HLA-A) and additionally selecting antibodies with a receptor blocking function.
Мы идентифицировали уникальные положения HLA-G в комбинации с положениями, необходимыми для структурного соответствия и взаимодействия с рецептором (ILT2/4 и KIR2DL4.)We have identified unique HLA-G positions in combination with positions required for structural matching and interaction with the receptor (ILT2/4 and KIR2DL4.)
Уникальные и близкие положения HLA-G человека затем "прививали" на комплексные соединения МНС класса I от грызунов различных видов (такие как RT1A крысы и H2kd мыши), при этом получали "гибридные" иммуногенные/скрининговые антигены.The unique and close positions of human HLA-G were then "grafted" onto MHC class I complex compounds from various rodent species (such as rat RT1A and mouse H2kd) to generate "hybrid" immunogenic/screening antigens.
Полученные антигены подвергали строгому скринингу на связывание/специфичность (и на отсутствие связывания/специфичности в отношении контрантигенов, соответственно).The resulting antigens were subjected to stringent screening for binding/specificity (and lack of binding/specificity for counterantigens, respectively).
Скрининг антигеновAntigen screening
- рекомбинантный HLA-G, экспрессированный как соединение МНС HLA-G β2M человека, включающий последовательность SEQ ID NO: 43- recombinant HLA-G expressed as MHC compound HLA-G β2M human, comprising the sequence of SEQ ID NO: 43
- специфичные к HLA-G последовательности, привитые на RT-1 крысы и H2kd мыши (SEQ ID NO: 46: комплекс МНС класса I HLA-G человека/H2Kd β2M мыши, где положения, специфичные к HLA-G человека, прививают на каркасную область H2Kd мыши, и SEQ ID NO: 48: комплекс МНС класса I HLA-G человека/RT1A β2М крысы, где положения, специфичные к HLA-G, прививают на каркасную область RT1A крысы)- HLA-G specific sequences grafted onto rat RT-1 and mouse H2kd (SEQ ID NO: 46: human HLA-G MHC class I/mouse H2Kd β2M complex, where positions specific to human HLA-G are grafted onto the scaffold mouse H2Kd region, and SEQ ID NO: 48: MHC class I human HLA-G/rat RT1A β2M complex, where the HLA-G specific positions are grafted onto the rat RT1A framework region)
- Клетки (например, клетки Jeg3), экспрессирующие природный комплекс МНС класса I HLA-G, или трансфектированные клеточные линии HLA-G человека SKOV3 HLA-G+ и PA-TU-8902 HLA-G+- Cells (e.g. Jeg3 cells) expressing HLA-G natural MHC class I complex or transfected human HLA-G cell lines SKOV3 HLA-G+ and PA-TU-8902 HLA-G+
Скрининг контрантигеновScreening for counterantigens
- Контрантигены (комплексы МНС класса I) с другими последовательностями HLA-A (HLA-A2 и HLA-G, к которым не привита консенсусная последовательность Н1А-А) в комбинации с различными пептидами) (см., например, SEQ ID NO 40 (HLA-A2) и SEQ ID NO: 44 консенсусная последовательность HLA-A на каркасной области HLA-G)- Counterantigens (MHC class I complexes) with other HLA-A sequences (HLA-A2 and HLA-G to which the H1A-A consensus sequence is not grafted) in combination with various peptides) (see, for example, SEQ ID NO 40 ( HLA-A2) and SEQ ID NO: 44 HLA-A consensus sequence on HLA-G framework)
- Контрантигены (комплексы МНС класса I) из других видов, такие как RT-1 крысы и H2kd мыши (SEQ ID NO: 45 и SEQ ID NO: 47)- Counterantigens (MHC class I complexes) from other species such as rat RT-1 and mouse H2kd (SEQ ID NO: 45 and SEQ ID NO: 47)
- Немодифицированные клеточные линии опухолевых клеток SKOV3 и PA-TU-8902, которые характеризуются отсутствием экспрессии HLA-G.- Unmodified tumor cell lines SKOV3 and PA-TU-8902, which are characterized by the absence of HLA-G expression.
Дизайн гибридных антигенов HLA-G для применения при иммунизации и скрининге для получения специфичных к HLA антител (см. фиг. 1):Design of hybrid HLA-G antigens for use in immunization and screening to obtain HLA-specific antibodies (see Fig. 1):
Дизайн гибридного соединения МНС I крысы (RT1-A), несущего уникальные положения HLA-G (SEQ ID NO: 48) для применения при иммунизации трансгенных крыс или кроликов или мышей и т.п. и крыс, кроликов и мышей и т.п. дикого типа (wt) и/или для применения скрининговых исследований.Design of a hybrid rat MHC I compound (RT1-A) carrying unique HLA-G positions (SEQ ID NO: 48) for use in immunizing transgenic rats or rabbits or mice, etc. and rats, rabbits and mice, and the like. wild type (wt) and/or for use in screening studies.
Уникальные положения HLA-G идентифицировали выравниванием последовательностей 2579 HLA-A, 3283 HLA-B, 2133 HLA-C, 15 HLA-E, 22 HLA-F и 50 HLA-G из IMGT (доступного 6 февраля 2014). Те остатки HLA-G, которые встречаются реже 1% (обычно -0%) среди последовательностей из любого из трех наборов последовательностей HLA-A, HLA-B и объединенного набора последовательностей HLA-C + HLA-E + HLA-F, были названы уникальными последовательностями HLA-G.Unique HLA-G positions were identified by aligning HLA-A 2579, HLA-B 3283, HLA-C 2133, HLA-E 15, HLA-F 22, and HLA-
Четыре основных уникальных положения HLA-G (2 в α-1 и 2 в α-3) не проявляют полиморфизм в наборе последовательностей HLA-G и ни один из других генов HLA не содержит специфичные остатки HLA-G в указанных положениях (за исключением 1x HLA-A для М100, 1x HLA-B для Q103 и 1х HLA-C для Q103).The four major unique positions of HLA-G (2 at α-1 and 2 at α-3) do not show polymorphism in the HLA-G sequence set and none of the other HLA genes contain specific HLA-G residues at these positions (with the exception of 1x HLA-A for M100, 1x HLA-B for Q103 and 1x HLA-C for Q103).
Кристаллическую структуру RT1-A крысы (Rudolph M.G. и др., J.Mol.Biol., т. 324, cc. 975-990 (2002), код PDB: 1KJM) совмещали с кристаллической структурой HLA-G человека (Clements C.S. и др., PROC.NATL.ACAD.SCI.USA, т. 102, cc. 3360-3365 (2005), код PDB: 1YDP). Общая структура α-цепи и связанного (β-микроглобулина являлась консервативной.The crystal structure of rat RT1-A (Rudolph M. G. et al., J. Mol. Biol., vol. 324, pp. 975-990 (2002), PDB code: 1KJM) was matched with the crystal structure of human HLA-G (Clements C. S. and et al., PROC.NATL.ACAD.SCI.USA, vol.102, pp. 3360-3365 (2005), PDB code: 1YDP). The overall structure of the α-chain and associated (β-microglobulin) was conserved.
Уникальные положения HLA-G идентифицировали в структуре RT1-A при сравнении последовательности и структурных выравниваниях. На первой стадии идентифицировали уникальные положения HLA-G, расположенные на молекулярной поверхности HLA-G и RT1-A и, таким образом, доступные для антитела. Уникальные положения, которые расположены внутри укладки белка, были исключены для инженерии. На второй стадии идентифицировали структурно соседние остатки, которые также необходимо изменить для получения соответствующей области „HLA-G-like", т.е. для получения реальных эпитопов HLA-G, скорее содержащие уникальные положения, а не гибридные эпитопы HLA-G/RT1-A крысы, которые являются искусственными. Все положения, которые таким образом были выбраны для мутации, анализировали на структурное соответствие соответствующему остатку из HLA-G для исключения возможных местных нарушений молекулярной структуры после мутации.Unique HLA-G positions were identified within the RT1-A structure by sequence comparison and structural alignments. In the first step, the unique positions of HLA-G located on the molecular surface of HLA-G and RT1-A and thus accessible to the antibody were identified. Unique positions that are located within the protein fold have been excluded from engineering. In the second step, structurally neighboring residues were identified, which also need to be changed to obtain the corresponding “HLA-G-like” region, i.e. to obtain real HLA-G epitopes containing unique positions rather than HLA-G/RT1 hybrid epitopes -A rats that are artificial All positions thus chosen for mutation were analyzed for structural correspondence to the corresponding residue from HLA-G to rule out possible local disturbances in the molecular structure after mutation.
Гибридное соединение МНС I мыши (H2Kd), содержащее уникальные положения HLA-G (SEQ ID NO: 46), для применения при иммунизации и/или для применения скрининговых анализов, получали аналогичным образом.A murine MHC I fusion compound (H2Kd) containing unique HLA-G positions (SEQ ID NO: 46) for use in immunization and/or for use in screening assays was prepared in a similar manner.
Дизайн контрантигенов на основе HLA-A "в отсутствии прививки" уникальных положений HLA-G в отношении консенсусной последовательности HLA-A для применения в качестве контрантигена при скрининге (SEQ ID NO:44).Design of counterantigens based on HLA-A "ungrafted" unique positions of HLA-G in relation to the consensus HLA-A sequence for use as a counterantigen in screening (SEQ ID NO:44).
Уникальные положения, полученные с помощью множественного выравнивания последовательностей, анализировали в кристаллической структуре HLA-G человека (код PDB: 1YDP). Сначала из инженерии исключали положения, не расположенные на поверхности HLA-G и, таким образом, недоступные для антитела. Затем расположенные на поверхности остатки анализировали на возможность аминокислотного обмена (т.е. исключение возможных локальных нарушений молекулярной структуры при мутации соответствующего положения). Всего пригодными для обмена были признаны 14 положений. Аминокислоты в признанных положениях мутировали в отношении консенсусной последовательности HLA-A, полученной после множественного выравнивания последовательностей 2579 HLA-A, загруженных из IMGT (как было доступно 6 февраля 2014 г.).Unique positions obtained by multiple sequence alignment were analyzed in the crystal structure of human HLA-G (PDB code: 1YDP). First, positions not located on the surface of HLA-G and thus inaccessible to the antibody were excluded from engineering. Then, the residues located on the surface were analyzed for the possibility of amino acid exchange (ie, the exclusion of possible local disturbances in the molecular structure during mutation of the corresponding position). In total, 14 provisions were recognized as suitable for exchange. Amino acids at recognized positions were mutated against the HLA-A consensus sequence obtained after multiple alignment of the 2579 HLA-A sequences downloaded from IMGT (as accessed Feb. 6, 2014).
Получение экспрессионных плазмид для растворимых классических и неклассических соединений МНС класса IObtaining expression plasmids for soluble classical and non-classical MHC class I compounds
Рекомбинантные гены МНС класса I кодируют удлиненные с N-конца гибридные соединения, состоящие из пептида, который, как известно, связан с соответствующим соединением МНС класса I, β-2 микроглобулином, и соответствующим соединением МНС класса I.Recombinant class I MHC genes encode N-terminally extended fusion compounds consisting of a peptide known to be linked to the corresponding class I MHC compound, β-2 microglobulin, and the corresponding class I MHC compound.
Экспрессионные плазмиды для временной экспрессии растворимых соединений МНС класса I, кроме экспрессионной кассеты растворимых соединений МНС класса I, содержат источник репликации из вектора pUC18, который обеспечивает репликацию этой плазмиды в Е. coli, и ген β-лактамазы, который придает Е. coli резистентность к ампицилину.Expression plasmids for transient expression of soluble MHC class I compounds, in addition to the expression cassette of soluble MHC class I compounds, contain a source of replication from the pUC18 vector, which ensures the replication of this plasmid in E. coli, and a β-lactamase gene, which confers resistance to E. coli ampicillin.
Единица транскрипции растворимого соединения МНС класса I включает следующие функциональные элементы:The transcription unit of a soluble MHC class I compound includes the following functional units:
- немедленно-ранние энхансер и промотер из цитомегаловируса человека (P-CMV), включая интрон А,- immediate early enhancer and promoter from human cytomegalovirus (P-CMV), including intron A,
- 5'-нетранслированную область тяжелой цепи иммуноглобулина человека (5'UTR),- 5'-untranslated region of the heavy chain of human immunoglobulin (5'UTR),
- сигнальную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина мыши,- mouse immunoglobulin heavy chain signal sequence,
- нуклеиновую кислоту, кодирующую укороченную с N-конца сортазу S. aureus, иa nucleic acid encoding an N-terminally truncated S. aureus sortase, and
- последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста (BGH рА).- bovine growth hormone polyadenylation sequence (BGH pA).
Аминокислотные последовательности зрелых растворимых соединений МНС класса I, полученных из различных источников, включают:The amino acid sequences of mature soluble class I MHC compounds obtained from various sources include:
SEQ ID NO: 43: типичный комплекс HLA-G β2M МНС класса I человекаSEQ ID NO: 43: exemplary human HLA-G β2M MHC class I complex
SEQ ID NO: 44: типичный модифицированный комплекс HLA-G β2M МНС класса I человека (где специфические аминокислоты HLA-G были заменены на консенсусные аминокислоты HLA (= в отсутствии прививки HLA-G, см. также фиг. 1)SEQ ID NO: 44: exemplary modified human HLA-G β2M MHC class I complex (where HLA-G specific amino acids have been replaced with HLA consensus amino acids (= in the absence of HLA-G grafting, see also FIG. 1)
SEQ ID NO: 45: типичный комплекс H2Kd β2M МНС класса I мышиSEQ ID NO: 45: exemplary mouse MHC class I H2Kd β2M complex
SEQ ID NO: 46: типичный комплекс HLA-G человека/H2Kd β2M МНС мыши, где положения, специфичные для HLA-G человека, были привиты на каркасную область H2Kd мышиSEQ ID NO: 46: exemplary human HLA-G/H2Kd β2M mouse MHC complex, where positions specific for human HLA-G were grafted onto the mouse H2Kd framework
SEQ ID NO: 47: типичный комплекс RT1A β2M МНС класса I крысыSEQ ID NO: 47: exemplary rat RT1A β2M MHC class I complex
SEQ ID NO: 48: типичный комплекс HLA-G человека/RT1A β2M МНС крысы, где положения, специфичные для HLA-G человека, были привиты на каркасную область RT1A крысы.SEQ ID NO: 48: exemplary human HLA-G/rat RT1A β2M MHC complex, where positions specific for human HLA-G were grafted onto a rat RT1A framework.
Для типичного комплекса HLA-A2 β2M МНС класса I, использованного при скрининге, использовали следующие компоненты и комплекс экспрессировали в E.coli, а затем очищали.For a typical HLA-A2 β2M MHC class I complex used in screening, the following components were used and the complex was expressed in E. coli and then purified.
Комплекс MHCI HLA-A2 / β2M (SEQ ID NOs 40 и 37) (оба с дополнительным N-концевым метионином)+пептид VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 50) + линкер и his-Tag (SEQ ID NO: 49).MHCI HLA-A2/β2M complex (
Пример 2Example 2
Кампания иммунизацииImmunization Campaign
А) Иммунизация мышей и крысA) Immunization of mice and rats
а. Гибридные белки (для резистентности к неспецифичным MHC-I/HLA и направленности к уникальным положениям HLA-G)A. Fusion proteins (for non-specific MHC-I/HLA resistance and targeting unique HLA-G positions)
Для иммунизации использовали мышей Balb/C фирмы Charles River Laboratories International, Inc. Животных размещали согласно Приложению А "Guidelines for accommodation and care of animals" в аккредитованном AAALACi виварии. Все протоколы и эксперименты по иммунизации животных были утверждены правительством Верхней Баварии (номер разрешения 55.2-1-54-2531-19-10 и 55.2-1-54-2532-51-11) и осуществлены согласно акту German Animal Welfare Act и директивы Directive 2010/63 Европейского парламента и суда.Balb/C mice from Charles River Laboratories International, Inc. were used for immunization. Animals were housed according to Appendix A "Guidelines for accommodation and care of animals" in an AAALACi accredited vivarium. All animal immunization protocols and experiments were approved by the government of Upper Bavaria (approval number 55.2-1-54-2531-19-10 and 55.2-1-54-2532-51-11) and carried out in accordance with the German Animal Welfare Act and Directive 2010/63 European Parliament and Court of Justice.
Мышей Balb/C (n=5) возрастом 6-8 недель иммунизовали в течение 5 курсов иммунизации с использованием гибридного соединения H2Kd/HLA-G (SEQ ID NO: 46 ("HLA-G-0006")) в течение 4 недель. Перед каждой иммунизацией мышь анестезировали газообразной смесью кислорода и изофлурана. Для первой иммунизации 15 мкг белка растворяли в 20 мМ буферном растворе His/HisCl, 140 мМ Nad, pH 6,0, смешивали с равным объемом полного адъюванта Фрейнда CFA (BD Difco, #263810) и вводили подкожно (s.c.) в 6 участков, соседних с дренирующими лимфоузлами, вдоль спины мыши, при этом в 2 участка на затылке и 2 участка с двух сторон от паха и голени. Другие 15 мкг белка, эмульгированного в адъюванте RIBI (фирмы Sigma-Aldrich, номер по каталогу S6322), вводили в 6 смежных участков брюшной полости, то есть по 2 участка по обе стороны от подмышечной впадины, паха и бедра. Уменьшающиеся дозы бустерной иммунизвации вводили в день 7 (10 мкг), 14 (5 мкг), 21 (5 мкг) и 28 (5 мкг) аналогичным образом, за исключением того, что во всех случаях использовали адъювант RIBI и дозы вводили только в брюшную полость. Через три дня после конечной иммунизации мышей умерщвляли и в асептических условиях удаляли двусторонние подколенные, поверхностные паховые, подмышечные и бронхиальные лимфоузлы и готовили для получения гибридомы. Сыворотку тестировали на продуцирование рекомбинантных антител HLA-G человека и иммуноген-специфических общих антител IgG с использованием ИФА после третьей и пятой иммунизации.Balb/C mice (n=5), 6-8 weeks old, were immunized for 5 immunization courses with the H2Kd/HLA-G hybrid compound (SEQ ID NO: 46 ("HLA-G-0006")) for 4 weeks. Before each immunization, the mouse was anesthetized with a gaseous mixture of oxygen and isoflurane. For the first immunization, 15 µg of protein was dissolved in 20 mM His/HisCl buffer, 140 mM Nad, pH 6.0, mixed with an equal volume of Freund's Complete Adjuvant CFA (BD Difco, #263810) and injected subcutaneously (s.c.) at 6 sites, adjacent to the draining lymph nodes, along the back of the mouse, while in 2 areas on the back of the head and 2 areas on both sides of the groin and lower leg. Another 15 µg of protein emulsified in RIBI adjuvant (Sigma-Aldrich, catalog number S6322) was injected into 6 contiguous abdominal sites,
Другую группу мышей Balb/C (n=5) возрастом 6-8 недель иммунизировали в течение трех курсов гибридным соединением H2Kd/HLA-G (HLA-G-0006) в течение 3 месяцев. Для первой иммунизации 100 мкг белка, растворенного в 20 мМ буферном растворе His/HisCl, 140 мМ Nad, pH 6,0, смешивали с равным объемом CFA (BD Difco, #263810) и вводили внутрибрюшинно (i.p.). Бустерную иммунизацию проводили в дни 28 и 56 аналогичным образом, за исключением того, что использовали неполный адъювант Фрейнда (IFA, BD Difco, #DIFC263910). В период от 4 до 5 недель после конечной иммунизации мышам вводили приблизительно 25 мкг иммуногена внутривенно (i.v.) в стерильном PBS и через 72 ч у мышей в асептических условиях удаляли селезенки и готовили их для получения гибридом. Сыворотку тестировали на рекомбинантный HLA-G человека (SEQ ID NO: 43 ("HLA-G-0003") и иммуноген-специфичную гибридную молекулу H2Kd/HLA-G (SEQ ID NO: 46 ("HLA-G-0006")) и подвергали контрскринингу с "непривитым" HLA-G человека со специфическими положениями консенсусной HLA-A (SEQ ID NO: 44 ("HLA-G-0007")) и белка H2kd мыши (SEQ ID NO: 45 "HLA-G-0009")) продуцированных общих антител IgG с использованием ИФА после третьей и пятой иммунизации.Another group of Balb/C mice (n=5) aged 6-8 weeks were immunized for three courses with the hybrid compound H2Kd/HLA-G (HLA-G-0006) for 3 months. For the first immunization, 100 μg of protein dissolved in 20 mM His/HisCl buffer, 140 mM Nad, pH 6.0 was mixed with an equal volume of CFA (BD Difco, #263810) and administered intraperitoneally (i.p.). Booster immunizations were performed on days 28 and 56 in a similar manner, except that incomplete Freund's adjuvant (IFA, BD Difco, #DIFC263910) was used. Between 4 and 5 weeks after the final immunization, mice were injected with approximately 25 μg of the immunogen intravenously (i.v.) in sterile PBS, and 72 hours later, the spleens were removed from the mice under aseptic conditions and prepared for hybridoma production. Serum was tested for recombinant human HLA-G (SEQ ID NO: 43 ("HLA-G-0003") and immunogen-specific hybrid molecule H2Kd/HLA-G (SEQ ID NO: 46 ("HLA-G-0006")) and counter-screened with "ungrafted" human HLA-G with specific positions of consensus HLA-A (SEQ ID NO: 44 ("HLA-G-0007")) and mouse H2kd protein (SEQ ID NO: 45 "HLA-G-0009 ")) produced total IgG antibodies using ELISA after the third and fifth immunizations.
в. Белок wt (дикого типа) HLA-GV. wt protein (wild type) HLA-G
Для иммунизации использовали крыс CD rats фирмы Charles River Laboratories International, Inc. Животных размещали согласно Приложению А "Guidelines for accommodation and care of animals" в аккредитованном AAALACi виварии. Все протоколы и эксперименты по иммунизации животных были утверждены правительством Верхней Баварии (номер разрешения 55.2-1-54-2532-51-11) и осуществлены согласно акту German Animal Welfare Act и директивы Directive 2010/63 Европейского парламента и суда.CD rats from Charles River Laboratories International, Inc. were used for immunization. Animals were housed according to Appendix A "Guidelines for accommodation and care of animals" in an AAALACi accredited vivarium. All animal immunization protocols and experiments were approved by the government of Upper Bavaria (approval number 55.2-1-54-2532-51-11) and carried out in accordance with the German Animal Welfare Act and Directive 2010/63 of the European Parliament and the Court of Justice.
Крыс CD (n=4) возрастом 6-8 недель иммунизовали в течение 4 курсов иммунизации рекомбинантным белком HLA-G человека (SEQ ID NO: 43 ("HLA-G-0003")) в течение 4 месяцев. Для первой иммунизации 100 мкг белка, растворенного в 20 мМ буферном растворе His/HisCI, 140 мМ Nad, pH 6,0, смешивали с равным объемом CFA (BD Difco, #263810) и вводили внутрибрюшинно. Бустерную иммунизацию проводили в дни 28, 56 и 84 аналогичным образом, за исключением того, что использовали неполный адъювант Фрейнда (IFA from BD Difco, #DIFC263910). В период от 3 до 5 недель после конечной иммунизации мышам вводили приблизительно 75 мкг иммуногена внутривенно (i.v.) в стерильном PBS и через 72 ч у мышей в асептических условиях удаляли селезенки и готовили их для получения гибридом. Сыворотку тестировали на продуцирование рекомбинантных антител HLA-G (SEQ ID NO: 43 ("HLA-G-0003")), специфичных к IgG1, IgG1a, IgG2b и IgG2c, после третьей и четвертой иммунизации, и подвергали контрскринингу с "непривитой" HLA-G человека со специфическими положениями консенсусной HLA-A (SEQ ID NO: 44 ("HLA-G-0007")).CD rats (n=4) aged 6-8 weeks were immunized for 4 courses of immunization with recombinant human HLA-G protein (SEQ ID NO: 43 ("HLA-G-0003")) for 4 months. For the first immunization, 100 μg of protein dissolved in 20 mM His/HisCI buffer, 140 mM Nad, pH 6.0 was mixed with an equal volume of CFA (BD Difco, #263810) and administered ip. Booster immunizations were performed on days 28, 56 and 84 in a similar manner, except that incomplete Freund's adjuvant (IFA from BD Difco, #DIFC263910) was used. Between 3 and 5 weeks after the final immunization, mice were injected with approximately 75 μg of the immunogen intravenously (i.v.) in sterile PBS, and 72 hours later, the spleens were removed from the mice under aseptic conditions and prepared for hybridoma production. Serum was tested for the production of recombinant HLA-G antibodies (SEQ ID NO: 43 ("HLA-G-0003")) specific for IgG1, IgG1a, IgG2b and IgG2c after the third and fourth immunizations and counter-screened with "naive" HLA -G human with specific provisions of the consensus HLA-A (SEQ ID NO: 44 ("HLA-G-0007")).
в. Клетки JEG3 (АТСС No. HTB36) (экспрессирующие природный HLA-G)V. JEG3 cells (ATCC No. HTB36) (expressing natural HLA-G)
Для иммунизации использовали крыс CD фирмы Charles River Laboratories International, Inc. Животных размещали согласно Приложению A "Guidelines for accommodation and care of animals" в аккредитованном AAALACi виварии. Все протоколы и эксперименты по иммунизации животных были утверждены правительством Верхней Баварии (номер разрешения 55.2-1-54- 2531-83-13) и осуществлены согласно акту German Animal Welfare Act и директивы Directive 2010/63 Европейского парламента и суда.CD rats from Charles River Laboratories International, Inc. were used for immunization. Animals were housed according to Appendix A "Guidelines for accommodation and care of animals" in an AAALACi accredited vivarium. All animal immunization protocols and experiments were approved by the government of Upper Bavaria (approval number 55.2-1-54-2531-83-13) and carried out in accordance with the German Animal Welfare Act and Directive 2010/63 of the European Parliament and the Court of Justice.
Две группы крыс CD (n=2) возрастом 6-8 недель иммунизировали с использованием либо 5 (группа А) либо 7 (группа В) курсов иммунизации клетками JEG-3 (ATCC HTB36) в течение 5 (А) и 7 (В) месяцев, соответственно. Для первой иммунизации 1х107 клеток, растворенных в стерильном PBS, смешивали с равным объемом стерильного CFA (BD Difco, #263810) и вводили внутрибрюшинно. Бустерные иммунизации проводили в группах А и В в дни 28, 56, 84, 112, 140 (только в группе В) и 168 (только в группе В) аналогичным образом, за исключением того, что использовали неполный адъювант Фрейнда (IFA from BD Difco, #DIFC263910). Через 3 недели после конечной иммунизации крысам вводили 100 мкг рекомбинантного белка HLA-G человека (SEQ ID NO: 43 ("HLA-G-0003")) i.v. в стерильном PBS, и через 72 ч у крыс в асептических условиях удаляли селезенки и готовили их для получения гибридом. Сыворотку тестировали на продуцирование рекомбинантных антител HLA-G (SEQ ID NO: 43 ("HLA-G-0003")), специфичных к IgG1, IgG1a, IgG2b и IgG2c с использованием ИФА после третьей, пятой и седьмой иммунизации, соответственно, и подвергали контрскринингу с "непривитым" HLA-G человека со специфическими положениями консенсусной HLA-A (SEQ ID NO: 44 ("HLA-G-0007")).Two groups of CD rats (n=2) 6-8 weeks old were immunized using either 5 (group A) or 7 (group B) immunizations with JEG-3 cells (ATCC HTB36) for 5 (A) and 7 (B) months, respectively. For the first immunization, 1x10 7 cells dissolved in sterile PBS were mixed with an equal volume of sterile CFA (BD Difco, #263810) and injected intraperitoneally. Booster immunizations were performed in groups A and B on days 28, 56, 84, 112, 140 (only in group B) and 168 (only in group B) in a similar manner, except that incomplete Freund's adjuvant (IFA from BD Difco) was used. , #DIFC263910). 3 weeks after the final immunization, rats were injected with 100 μg of recombinant human HLA-G protein (SEQ ID NO: 43 ("HLA-G-0003")) iv in sterile PBS, and after 72 h, spleens were removed from rats under aseptic conditions and prepared them to get a hybrid. Serum was tested for the production of recombinant HLA-G antibodies (SEQ ID NO: 43 ("HLA-G-0003")) specific for IgG1, IgG1a, IgG2b and IgG2c using ELISA after the third, fifth and seventh immunizations, respectively, and subjected to counter-screening with "unvaccinated" human HLA-G with specific provisions of the consensus HLA-A (SEQ ID NO: 44 ("HLA-G-0007")).
d. JEG3/DNA IMS (для бустерного эффекта)d. JEG3/DNA IMS (for booster effect)
Для иммунизации использовали крыс CD rats фирмы Charles River Laboratories International, Inc. Животных размещали согласно Приложению А "Guidelines for accommodation and care of animals" в аккредитованном AAALACi виварии. Все протоколы и эксперименты по иммунизации животных были утверждены правительством Верхней Баварии (номер разрешения 55.2-1-54-2531-83-13) и осуществлены согласно акту German Animal Welfare Act и директивы Directive 2010/63 Европейского парламента и суда.CD rats from Charles River Laboratories International, Inc. were used for immunization. Animals were housed according to Appendix A "Guidelines for accommodation and care of animals" in an AAALACi accredited vivarium. All animal immunization protocols and experiments were approved by the government of Upper Bavaria (approval number 55.2-1-54-2531-83-13) and carried out in accordance with the German Animal Welfare Act and Directive 2010/63 of the European Parliament and Court of Justice.
Крыс CD (n=5) возрастом 6-8 недель иммунизировали плазмидной ДНК и клетками в чередующемся режиме в течение 3 месяцев. Для данной цели использовали плазмидную ДНК HLA-G-0030 (р 17747), кодирующую HLA-G человека в виде одноцепочечной молекулы, и экспрессирующие природный HLA-G клетки JEG-3 (ATCC HTB36), соответственно.Rats CD (n=5) aged 6-8 weeks were immunized with plasmid DNA and cells in an alternating mode for 3 months. For this purpose, plasmid DNA HLA-G-0030 (p 17747) encoding human HLA-G as a single-stranded molecule and native HLA-G-expressing JEG-3 cells (ATCC HTB36), respectively, was used.
Для первой иммунизации животных анестезировали изофлураном и иммунизировали 100 мкг плазмидной ДНК в стерильной воде чрескожно (i.d.), которую вводили в один участок на выбритой спине, соседний с хвостом животного. После введения i.d. участок электропорировали с использованием следующих параметров и системы для электропорации ЕСМ 830 (ВТХ Harvard Apparatus): два раза 1000 В/см каждый по 0,1 мс с интервалом 125 мс и затем четыре раза 287,5 В/см в течение 10 мс также с интервалами по 125 мс. Во время второй иммунизации в день 14 животным вводили 1х107 клеток, растворенных в стерильном PBS, который был смешан с равным объемом CFA (BD Difco, #263810), и которые, после получения стабильной эмульсии вводили внутрибрюшинно. Бустерные иммунизации проводили в дни 28 (ДНК), 42 (клетки), 56 (ДНК), 70 (клетки) аналогичным образом, за исключением того, что для иммунизации клетками использовали неполный адъювант Фрейнда (IFA from BD Difco, #DIFC263910). Через 4 недели после конечной иммунизации крысам вводили 100 мкг растворимого рекомбинантного белка HLA-G МНС человека класса I (SEQ ID NO: 43 ("HLA-G-0003")) i.v. в стерильном PBS, и через 72 ч селезенки удаляли в асептических условиях и готовили для получения гибридомы. Сыворотку тестировали на растворимый рекомбинантный белок HLA-G МНС человека класса I (SEQ ID NO: 43 ("HLA-G-0003")), специфичный к продуцированию антител IgG1, IgG2a, IgG2b и IgG2c, с использованием ИФА после третьей, пятой и шестой иммунизации, соответственно, и подвергали контрскринингу "непривитым" HLA-G человека со специфичными положениями консенсусного HLA-A (SEQ ID NO: 44 ("HLA-G-0007")).For the first immunization, animals were anesthetized with isoflurane and immunized with 100 μg of plasmid DNA in sterile water percutaneously (id) which was injected into one site on the shaved back adjacent to the tail of the animal. After id injection, the site was electroporated using the following parameters and an ECM 830 electroporation system (BTX Harvard Apparatus): two times 1000 V/cm each for 0.1 ms at 125 ms intervals and then four times 287.5 V/cm for 10 ms also in 125 ms intervals. During the second immunization on
Во всех схемах иммунизации был индуцирован высокий гуморальный полиреактивный иммунный ответ, распознающий HLA-G и белки, использованные для контрскрининга (например, рекомбинантный "непривитой" белок HLA-G человека, гибридное соединение H2Kd/HLA-G или родственные соединения HLA-A2 человека), по данным анализа в формате ИФА с использованием поликлональных сывороток от иммунизованных животных (данные не показаны).In all immunization regimens, a high humoral polyreactive immune response was induced, recognizing HLA-G and proteins used for counter-screening (e.g., recombinant "unvaccinated" human HLA-G protein, H2Kd/HLA-G fusion, or related human HLA-A2 compounds) , according to ELISA analysis using polyclonal sera from immunized animals (data not shown).
В) Иммунизация гуманизованных крыс OMNIRAT линии 7C) Immunization of humanized OMNIRAT rats of
Крысы OmniRat линии 7 предоставлены фирмой Open Monoclonal Technology, Inc. (2747 Ross Road, Palo Alto, CA 94303, США) и были выведены и получены на фирме Charles River Laboratories International, Inc. Животных размещали согласно Приложению A "Guidelines for accommodation and care of animals" в аккредитованном AAALACi виварии. Все протоколы и эксперименты по иммунизации животных были утверждены правительством Верхней Баварии (номера разрешения 55.2-1-54-2532-51-11 и 55.2-1-54- 2531-83-13) и осуществлены согласно акту German Animal Welfare Act и директивы Directive 2010/63 Европейского парламента и суда.
Крыс OmniRat линии 7 (n=4) возрастом 6-8 недель иммунизовали в течение 4 недель с использованием рекомбинантного гибридного белка HLA-G (SEQ ID NO: 48 ("HLA-G-0011")) в течение 4 месяцев. Для первой иммунизации 100 мкг белка, растворенного в 20 мМ буферном растворе His/HisC1, 140 мМ NaCl, pH 6,0, смешивали с равным объемом CFA (BD Difco, #263810) и вводили внутрибрюшинно. Бустерные иммунизации проводили в дни 28, 56 и 84 аналогичным образом, за исключением того, что во всех случаях использовали неполный адьювант Фрейнда (IFA, BD Difco, #DIFC263910). Через период 3-4 недели после бустерной иммунизации крысам вводили приблизительно 50 мкг иммуногена i.v. и 25 мкг иммуногена i.p.в стерильном PBS и через 72 ч селезенки извлекали в стерильных условиях и готовили для получения гибридом. Сыворотку тетстировали на рекомбинантный белок HLA-G MHC человека класса I (SEQ ID NO: 48 ("HLA-G-0011")), специфичный к продуцированию антител IgG1, IgG2a, IgG2b и IgG2c, с использованием ИФА после третьей и четвертой иммунизации, соответственно, и подвергали контрскринингу "непривитым" HLA-G человека со специфичными положениями консенсусного HLA-A (SEQ ID NO: 44 ("HLA-G-0007")).Rats OmniRat line 7 (n=4) aged 6-8 weeks were immunized for 4 weeks using recombinant HLA-G fusion protein (SEQ ID NO: 48 ("HLA-G-0011")) for 4 months. For the first immunization, 100 μg of protein dissolved in 20 mM His/HisCl buffer, 140 mM NaCl, pH 6.0 was mixed with an equal volume of CFA (BD Difco, #263810) and administered ip. Booster immunizations were performed on days 28, 56 and 84 in a similar manner, except that incomplete Freund's adjuvant (IFA, BD Difco, #DIFC263910) was used in all cases. A period of 3-4 weeks after booster immunization, rats were injected with approximately 50 μg of immunogen i.v. and 25 μg of the immunogen i.p. in sterile PBS and 72 h later the spleens were removed under sterile conditions and prepared for the preparation of hybridomas. Serum was tested for recombinant human MHC class I HLA-G protein (SEQ ID NO: 48 ("HLA-G-0011")) specific for the production of IgG1, IgG2a, IgG2b and IgG2c antibodies using ELISA after the third and fourth immunizations, respectively, and were counter-screened with "naive" human HLA-G with specific positions of the consensus HLA-A (SEQ ID NO: 44 ("HLA-G-0007")).
В другом варианте крыс OmniRat линии 7 (n=5) возрастом 6-8 недель иммунизировали плазмидной ДНК и клетками в чередующемся режиме в течение 3 месяцев. Для данной цели использовали плазмидную ДНК, кодирующую HLA-G в виде одноцепочечной молекулы (белок HLA-G MHC класса I (SEQ ID NO: 43 ("HLA-G-0003")), а также, экспрессирующие природный HLA-G клетки JEG-3 (ATCC HTB36), соответственно.In another variant, OmniRat rats of line 7 (n=5), aged 6-8 weeks, were immunized with plasmid DNA and cells in alternating mode for 3 months. For this purpose, plasmid DNA encoding HLA-G as a single-stranded molecule (HLA-G MHC class I protein (SEQ ID NO: 43 ("HLA-G-0003")), as well as JEG cells expressing native HLA-G -3 (ATCC HTB36), respectively.
Для первой иммунизации животных анестезировали изофлураном и чрескожно иммунизовали (i.d.) 100 мкг плазмидной ДНК в стерильной воде, вводимых в один участок на выбритой спине, близкий к хвосту животного. После введения i.d. участок электропорировали с использованием следующих параметров на системе для электропорации ЕСМ 830 (фирмы ВТХ Harvard Apparatus): два раза 1000 В/см каждый по 0,1 мс с интервалом 125 мс, а затем 4 раза 287,5 В/см в течение 10 мс также с интервалами по 125 мс. Во время второй иммунизации в день 14 животным вводили 1х107 клеток, растворенных в стерильном PBS, который был смешан с равным объемом CFA (BD Difco, #263810), и которые, после получения стабильной эмульсии вводили внутрибрюшинно. Бустерные иммунизации проводили в дни 28 (ДНК), 42 (клетки), 56 (ДНК), 70 (клетки) аналогичным образом, за исключением того, что для иммунизации клетками использовали неполный адьювант Фрейнда (IFA, BD Difco, #DIFC263910). Через 4 недели после конечной иммунизации крысам вводили 100 мкг растворимого рекомбинантного белка HLA-G МНС человека класса I (SEQ ID NO: 43 ("HLA-G-0003")) i.v. в стерильном PBS, и через 72 ч селезенки удаляли в стерильных условиях и готовили для получения гибридом. Сыворотку тетстировали на растворимый рекомбинантный белок HLA-G MHC человека класса I (SEQ ID NO: 43 ("HLA-G-0003")), специфичный к продуцированию антител IgG1, IgG2a, IgG2b и IgG2c, с использованием ИФА после третьей, пятой и шестой иммунизации, соответственно, и подвергали контрскринингу "непривитым" HLA-G человека со специфичными положениями консенсусного HLA-A (SEQ ID NO: 44 ("HLA-G-0007")).For the first immunization, the animals were anesthetized with isoflurane and percutaneously immunized with (id) 100 μg of plasmid DNA in sterile water injected into one site on the shaved back close to the tail of the animal. After id injection, the site was electroporated using the following settings on an ECM 830 electroporation system (BTX Harvard Apparatus): two times 1000 V/cm each at 0.1 ms with an interval of 125 ms, and then 4 times 287.5 V/cm in for 10 ms also at intervals of 125 ms. During the second immunization on
Во всех схемах иммунизации был индуцирован высокий гуморальный полиреактивный иммунный ответ, распознающий HLA-G и белки, использованные для контрскрининга (например, рекомбинантный "непривитой" белок HLA-G человека, гибридное соединение H2Kd/HLA-G или родственные соединения HLA-A2 человека), по данным анализа в формате ИФА с использованием поликлональных сывороток от иммунизованных животных (данные не показаны).In all immunization regimens, a high humoral polyreactive immune response was induced, recognizing HLA-G and proteins used for counter-screening (e.g., recombinant "unvaccinated" human HLA-G protein, H2Kd/HLA-G fusion, or related human HLA-A2 compounds) , according to ELISA analysis using polyclonal sera from immunized animals (data not shown).
Полученные антителаObtained antibodies
С использованием описанных выше методов были получены следующие антитела, специфически связывающиеся с анти-HLA-G человека: HLA-G 0031 крысы от крыс CD, HLAG 0039 человека, HLA-G 0041 и HLA-G 0090 от гуманизированных крыс.Using the methods described above, the following antibodies specifically binding to human anti-HLA-G were generated: rat HLA-
Связывающие свойства полученных специфичных анти-HLA-G антител и биологические активности определяли, как описано в соответствующих примерах, и сравнивали с известными эталонными антителами. Антитело HLA-G-0031 гуманизировали с использованием его домена HVR и каркасного акцепторного участка VH человека HUMAN_IGHV1-3 и каркасных акцепторных участков VL человека HUMAN_IGKV1-17 (V-домен, с одной дополнительной обратной мутацией в положении R46F, нумерация по Кабату).The binding properties of the obtained specific anti-HLA-G antibodies and biological activities were determined as described in the respective examples and compared with known reference antibodies. The HLA-G-0031 antibody was humanized using its HVR domain and the HUMAN_IGHV1-3 human VH framework acceptor and HUMAN_IGKV1-17 human VL framework acceptors (V domain, with one additional backmutation at position R46F, Kabat numbering).
Для идентификации пригодного каркасного акцепторного участка человека в процессе гуманизации HLAG-0031, связывающегося с HLAG, использовали комбинацию двух методологий. С одной стороны использовали классический подход поиска каркасного акцепторного участка с высокой гомологией последовательностей с исходным антителом и последующей прививки in silico областей CDR на указанный каркасный акцепторный участок. Каждое различие в аминокислотах в составе идентифицированного каркасного участка от исходного антитела оценивали по влиянию на структурную целостность связующего соединения и при необходимости учитывали обратные мутации по отношению к исходной последовательности.A combination of two methodologies was used to identify a suitable human acceptor framework for humanization of HLAG-0031 binding to HLAG. On the one hand, the classical approach was used to search for a framework acceptor region with high sequence homology with the original antibody and subsequent in silico grafting of CDR regions onto the indicated framework acceptor region. Each amino acid difference in the composition of the identified framework region from the original antibody was evaluated for its effect on the structural integrity of the linker and, if necessary, backmutations relative to the original sequence were taken into account.
С другой стороны, для предсказания ориентации доменов VH и VL гуманизированных версий по отношению друг к другу использовали компьютерное моделирование in silico, описанное в заявке WO 2016/062734. Его осуществляли для виртуальной прививки CDR на все возможные комбинации зародышевой линии человека. Результаты сравнивали с ориентацией доменов VH VL исходного связующего соединения для выбора каркасных комбинаций, близких по геометрии к исходному антителу.On the other hand, the in silico computer modeling described in WO 2016/062734 was used to predict the orientation of the VH and VL domains of the humanized versions with respect to each other. It was carried out for virtual inoculation of CDRs on all possible combinations of the human germ line. The results were compared with the orientation of the VH VL domains of the original binding compound to select framework combinations similar in geometry to the original antibody.
Антитела anti-HLAG (SEQ ID NO вариабельных областей и гипервариабельных областей (HVR)):Anti-HLAG antibodies (SEQ ID NO variable regions and hypervariable regions (HVR)):
Пример 3Example 3
А) Связывание анти-HLA-G антител с растворимым HLA-G человека, растворимым непривитым HLA-G человека со специфичной последовательностью HLA-A, HLA-A2 человека и H2-Kd крысы/мышиA) Binding of anti-HLA-G antibodies to soluble human HLA-G, soluble ungrafted human HLA-G sequence-specific HLA-A, human HLA-A2 and rat/mouse H2-Kd
Антитела, полученные после иммунизации, подвергали скринингу по их способности связываться с HLA-G человека, гибридным непривитым HLA-G, HLA-A2 и H2-Kd крысы/мыши. Соответствующие исследования описаны ниже. Для тестирования HLA-G человека использовали как мономерную, так и димерную и тримерную формы (получение см. ниже).Antibodies obtained after immunization were screened for their ability to bind to human HLA-G, hybrid unvaccinated HLA-G, HLA-A2 and rat/mouse H2-Kd. Relevant studies are described below. Both monomeric, dimeric and trimeric forms were used for human HLA-G testing (see below for preparation).
Димеризация/тримеризация белка HLA-G MHC класса IDimerization/trimerization of HLA-G protein MHC class I
Супернатант, включающий мономерный растворимый белок HLA-G MHC человека класса I (SEQ ID NO: 23) с меткой His-tag наносили на колонку HisTrap HP (GE Healthcare #17-5248-02), заполненную 5 мл Ni-Sepharose, со скоростью потока 0,2 мл/мин в течение ночи при комнатной температуре с использованием системы AKTA-FPLC. Колонку промывали 2% DPBS, содержащим 0,5 М имидазол (Merck #8.14223.025), до достижения базовой линии. Затем колонку уравновешивали 10 мМ DTT в 2% DPBS, содержащем 0,5 М имидазол, и выдерживали в течение 30 мин при комнатной температуре. Для удаления DTT колонку промывали смесью PBS/10 мМ имидазол и белок элюировали в градиенте 2 - 100% DPBS, содержащем 0,5 мМ имидазол. После концентрирования элюата с использованием ячейки для ультрафильтрации Amicon-Ultra 15 М /Ultracel 10K, белок инкубировали в течение 24 ч при комнатной температуре с последующим инкубацией в течение 48 ч при 4°С для проведения димеризации/мультимеризации. Затем проводили разделение димеров и тримеров с использованием хроматографии SEC на колонке Superdex 200 HiLoad 16/60 (GE Healthcare #17-5175-01) и промывали 0,5 М NaOH в течение ночи. Колонку уравновешивали PBS с последующим насыщением раствором 10 мг/мл BSA. Димеры (фракция А9) и тримеры (фракция А8) собирали, разделяли на аликвотные части и хранили при -80°С до последующего использования.A supernatant comprising monomeric soluble human HLA-G MHC class I protein (SEQ ID NO: 23) with a His-tag was applied to a HisTrap HP column (GE Healthcare #17-5248-02) packed with 5 ml Ni-Sepharose at a rate of flow 0.2 ml/min overnight at room temperature using the AKTA-FPLC system. The column was washed with 2% DPBS containing 0.5 M imidazole (Merck #8.14223.025) until baseline was reached. The column was then equilibrated with 10 mM DTT in 2% DPBS containing 0.5 M imidazole and incubated for 30 min at room temperature. To remove DTT, the column was washed with PBS/10 mM imidazole and the protein was eluted with a 2-100% DPBS gradient containing 0.5 mM imidazole. After concentrating the eluate using an Amicon-Ultra 15 M/Ultracel 10K ultrafiltration cell, the protein was incubated for 24 h at room temperature followed by 48 h at 4° C. to perform dimerization/multimerization. Dimers and trimers were then separated using SEC chromatography on a
Связывание с wt HLA-G человека по данным ИФАBinding to human wt HLA-G according to ELISA
На планшеты, покрытые стрептавидином (Nunc, MicroCoat #11974998001), наносили биотинилированный wt HLA-G человека при концентрации 250 нг/мл по 25 мкл/в лунке и инкубировали при 4°С в течение ночи. После промывки (3×90 мкл/лунка буферным раствором PBST) добавляли 25 мкл образцов анти-HLA-G (разбавление 1:3 в буферном растворе OSEP) или эталонных антител (G233, Thermo/Pierce #МА1-19449, 500 нг/мл) и инкубировали в течение 1 ч при КТ. После промывки (3×90 мкл/лунка буферным раствором PBST) добавляли 25 мкл/лунка козьих антимышиных антител H+L-POD (Biorad #170-6561, 1:2000 в OSEP) или обезьяньих антикроличьих антител IgG POD (GE #NA9340V, 1:5000 в OSE) и инкубировали при КТ в течение 1 ч на качалке. Для детектирования IgG крысы добавляли смесь козьих антикрысиных антител IgGl-POD (Bethyl #A110-106Р), козьих антикрысиных антител IgG2a-POD (Bethyl #A110-109P) и козьих антикрысиных антител IgG2b-POD (Bethyl #A110-111P) 1:10000 в OSEP и инкубировали при КТ в течение 1 ч на качалке. После промывки (6×90 мкл/лунка буферным раствором PBST) добавляли 25 мкл/лунка субстрата ТМВ (Roche, 11835033001) и инкубировали до величины поглощения OD 2-3. Измерения проводили на приборе Tecan Safire 2 при длине волны 370/492 нм.Streptavidin coated plates (Nunc, MicroCoat #11974998001) were coated with biotinylated human wt HLA-G at 250 ng/ml at 25 μl/well and incubated at 4° C. overnight. After washing (3×90 µl/well with PBST buffer), 25 µl of anti-HLA-G samples (1:3 dilution in OSEP buffer) or reference antibodies (G233, Thermo/Pierce #MA1-19449, 500 ng/ml) were added. ) and incubated for 1 h at RT. After washing (3×90 µl/well with PBST buffer), 25 µl/well goat anti-mouse H+L-POD (Biorad #170-6561, 1:2000 in OSEP) or monkey anti-rabbit IgG POD (GE #NA9340V, 1:5000 in OSE) and incubated at RT for 1 h on a shaker. For detection of rat IgG, a mixture of goat anti-rat IgGl-POD (Bethyl #A110-106P), goat anti-rat IgG2a-POD (Bethyl #A110-109P) and goat anti-rat IgG2b-POD (Bethyl #A110-111P) 1:10000 was added. in OSEP and incubated at RT for 1 h on a shaker. After washing (6×90 μl/well with PBST buffer), 25 μl/well TMB substrate (Roche, 11835033001) was added and incubated until an absorbance of OD 2-3. The measurements were carried out on a
Связывание с непривитым HLA-G человека со специфичными последовательностями HLA-A по данным ИФАBinding to ungrafted human HLA-G with specific HLA-A sequences as determined by ELISA
На планшеты, покрытые стрептавидином (Nunc, MicroCoat #11974998001), наносили биотинилированный непривитой HLA-G человека при концентрации 250 нг/мл по 25 мкл в лунке и инкубировали при 4°С в течение ночи. После промывки (3×90 мкл/лунка буферным раствором PBST) добавляли 25 мкл образцов анти-HLA-G (разбавление 1:3 в буферном растворе OSEP) или сыворотку крысы (разбавление 1:600 в OSEP) и инкубировали в течение 1 ч при КТ. После промывки (3×90 мкл/лунка буферным раствором PBST) добавляли смесь козьих антикрысиных антител IgGl-POD (Bethyl #A110-106P), козьих антикрысиных антител IgG2a-POD (Bethyl #A110-109P) и козьих антикрысиных антител IgG2b-POD (Bethyl #A110-111P) в разбавлении 1:10000 в OSEP по 25 мкл в лунке и инкубировали в течение 1 ч на качалке при КТ. После промывки (6×90 мкл/лунка буферным раствором PBST) добавляли 25 мкл/лунка субстрата ТМВ (Roche, 11835033001) и инкубировали до величины поглощения OD 2-3. Измерения проводили на приборе Tecan Safire 2 при длине волны 370/492 нм.Streptavidin coated plates (Nunc, MicroCoat #11974998001) were coated with biotinylated ungrafted human HLA-G at 250 ng/ml at 25 μl per well and incubated at 4° C. overnight. After washing (3×90 µl/well with PBST buffer), 25 µl of anti-HLA-G samples (1:3 dilution in OSEP buffer) or rat serum (1:600 dilution in OSEP) were added and incubated for 1 h at CT. After washing (3x90 µl/well with PBST buffer), a mixture of goat anti-rat IgGl-POD (Bethyl #A110-106P), goat anti-rat IgG2a-POD (Bethyl #A110-109P) and goat anti-rat IgG2b-POD ( Bethyl #A110-111P) at a 1:10000 dilution in OSEP at 25 µl per well and incubated for 1 hour on a shaker at RT. After washing (6×90 μl/well with PBST buffer), 25 μl/well TMB substrate (Roche, 11835033001) was added and incubated until an absorbance of OD 2-3. The measurements were carried out on a
Связывание с МНС I крысы (RT1-A) по данным ИФАBinding to rat MHC I (RT1-A) by ELISA
На планшеты, покрытые стрептавидином (Nunc, MicroCoat #11974998001), наносили биотинилированный МНС I (RT1-A) крысы при концентрации 250 нг/мл по 25 мкл в лунке и инкубировали при 4°С в течение ночи. После промывки (3×90 мкл/лунка буферным раствором PBST) добавляли 25 мкл образцов анти-HLA-G (разбавление 1:3 в буферном растворе OSEP) или сыворотку крысы (разбавление 1:600 в OSEP) и инкубировали в течение 1 ч при КТ. После промывки (3×90 мкл/лунка буферным раствором PBST) добавляли смесь козьих антикрысиных антител IgG1-POD (Bethyl #А110-106Р), козьих антикрысиных антител IgG2a-POD (Bethyl #А110-109Р), козьих антикрысиных антител IgG2b-POD (Bethyl #А110-111Р) в разбавлении 1:10000 в OSEP и инкубировали в течение 1 ч на качалке при КТ. После промывки (6×90 мкл/лунка буферным раствором PBST) добавляли 25 мкл/лунка субстрата ТМВ (Roche, 11835033001) и инкубировали до величины поглощения OD 2-3. Измерения проводили на приборе Tecan Safire 2 при длине волны 370/492 нм.Streptavidin coated plates (Nunc, MicroCoat #11974998001) were coated with biotinylated rat MHC I (RT1-A) at 250 ng/ml at 25 μl per well and incubated at 4° C. overnight. After washing (3×90 µl/well with PBST buffer), 25 µl of anti-HLA-G samples (1:3 dilution in OSEP buffer) or rat serum (1:600 dilution in OSEP) were added and incubated for 1 h at CT. After washing (3×90 µl/well with PBST buffer), a mixture of goat anti-rat IgG1-POD (Bethyl #A110-106P), goat anti-rat IgG2a-POD (Bethyl #A110-109P), goat anti-rat IgG2b-POD ( Bethyl #A110-111P) at a 1:10,000 dilution in OSEP and incubated for 1 hour on a shaker at RT. After washing (6×90 μl/well with PBST buffer), 25 μl/well TMB substrate (Roche, 11835033001) was added and incubated until an absorbance of OD 2-3. The measurements were carried out on a
Связывание с HLA-A2 по данным ИФАBinding to HLA-A2 according to ELISA
На планшеты, покрытые стрептавидином (Nunc, MicroCoat #11974998001), наносили биотинилированный HLA-A2 человека по 25 мкл в лунке при концентрации 250 нг/мл и инкубировали при 4°С в течение ночи. После промывки (3×90 мкл/лунка буферным раствором PBST) добавляли 25 мкл образцов анти-HLA-G (разбавление 1:3 в буферном растворе OSEP) или сыворотку крысы (разбавление 1:600 в OSEP) и инкубировали в течение 1 ч при КТ. После промывки (3×90 мкл/лунка буферным раствором PBST) в количестве 25 мкл/лунка добавляли смесь козьих антикрысиных антител IgGl-POD (Bethyl #А110-106Р), козьих антикрысиных антител IgG2a-POD (Bethyl #А110-109Р), козьих антикрысиных антител IgG2b-POD (Bethyl #A110-111P) в разбавлении 1:10000 в OSEP по 25 мкл в лунке и инкубировали в течение 1 ч на качалке при КТ. После промывки (6×90 мкл/лунка буферным раствором PBST) добавляли 25 мкл/лунка субстрата ТМВ (Roche, 11835033001) и инкубировали до величины поглощения OD 2-3. Измерения проводили на приборе Tecan Safire 2 при длине волны 370/492 нм.Streptavidin coated plates (Nunc, MicroCoat #11974998001) were coated with biotinylated human HLA-A2 at 25 μl per well at 250 ng/ml and incubated at 4° C. overnight. After washing (3×90 µl/well with PBST buffer), 25 µl of anti-HLA-G samples (1:3 dilution in OSEP buffer) or rat serum (1:600 dilution in OSEP) were added and incubated for 1 h at CT. After washing (3×90 µl/well with PBST buffer), a mixture of goat anti-rat IgGl-POD (Bethyl #A110-106P), goat anti-rat IgG2a-POD (Bethyl #A110-109P), goat anti-rat antibodies IgG2b-POD (Bethyl #A110-111P) diluted 1:10000 in OSEP, 25 µl per well and incubated for 1 h on a shaker at RT. After washing (6×90 μl/well with PBST buffer), 25 μl/well TMB substrate (Roche, 11835033001) was added and incubated until an absorbance of OD 2-3. The measurements were carried out on a
Кинетика связывания анти-HLA-G антителBinding Kinetics of Anti-HLA-G Antibodies
Кинетику связывания анти-HLA-G антител с HLA-G человека, с непривитым HLA-G человека и HLA-A2 человека исследовали методом поверхностного плазменного резонанса на приборе BIACORE T200 (GE Healthcare). Все эксперименты проводили при 25°С с использованием буферного раствора PBS (рН 7,4+0,05% Tween20) в качестве рабочего буферного раствора и буферного раствора PBS (+0,1% BSA) в качестве буферного раствора для разбавления. Антитела к Fc человека (JIR009-005-098, Jackson) или антитела к Fc крысы (JIR112-005-071, Jackson) или антитела к Fc мыши (JIR115-005-071, Jackson) иммобилизовали на сенсорном чипе Series S CM5 (фирмы GE Healthcare) при рН 5,0 с использованием набора для иммобилизации по аминогруппе фирмы GE Healthcare. Анти-HLA-G антитела удерживались на поверхности, что приводило к отклику на удерживание на уровне 50 - 200 RU. На поверхность вводили Соединения HLA-G в течение 180 с со скоростью 30 мкл/мин при концентрациях от 2,5 до 800 нМ (серийные разбавления 2×1:2 и 4×1:3) (фаза ассоциации). Фазу диссоциации наблюдали в течение 300-600 с при промывке рабочим буферным раствором. Поверхность регенерировали при добавлении H3PO4 (0,85%) в течение 60+30 с для антител, удерживающих Fc человека, глицина, рН 1,5, в течение 60 с, и глицина, рН 2,0 в течение 60 с для антител удерживающих Fc крысы, H3PO4 (0,85%) в течение 80+60 с для антител, удерживающих Fc мыши. Отличия показателей преломления в объеме корректировали при вычитании отклика, полученного от имитационной поверхности. Контрольные введения вычитали (двойное сравнение). Полученные кривые аппроксимировали с использованием модели связывания Лэнгмюра 1:1 и программного обеспечения BIAevaluation.The binding kinetics of anti-HLA-G antibodies to human HLA-G, ungrafted human HLA-G, and human HLA-A2 was studied by surface plasma resonance on a BIACORE T200 instrument (GE Healthcare). All experiments were performed at 25°C using PBS buffer (pH 7.4+0.05% Tween20) as working buffer and PBS buffer (+0.1% BSA) as dilution buffer. Anti-human Fc antibodies (JIR009-005-098, Jackson) or anti-rat Fc antibodies (JIR112-005-071, Jackson) or anti-mouse Fc antibodies (JIR115-005-071, Jackson) were immobilized on a Series S CM5 sensor chip (manufactured by GE Healthcare) at pH 5.0 using the GE Healthcare Amino Immobilization Kit. Anti-HLA-G antibodies were retained on the surface resulting in a retention response of 50-200 RU. HLA-G Compounds were injected onto the surface for 180 seconds at a rate of 30 μl/min at concentrations from 2.5 to 800 nM (
Эпитоп-перекрестный конкурентный анализ анти-HLA-G антителEpitope-cross-competitive analysis of anti-HLA-G antibodies
Эксперименты по эпитоп-перекрестному конкурентному связыванию анти-HLA-G антител с HLA-G человека исследовали методом поверхностного плазменного резонанса с использованием прибора BIACORE T200 или В4000 (GE Healthcare). Все эксперименты проводили при 25°С с использованием буферного раствора PBS (рН 7,4+0,05% Tween20) в качестве рабочего буферного раствора.Epitope-cross-competitive binding experiments of anti-HLA-G antibodies with human HLA-G were investigated by surface plasma resonance using a BIACORE T200 or B4000 instrument (GE Healthcare). All experiments were carried out at 25°C using PBS buffer solution (pH 7.4 + 0.05% Tween20) as working buffer solution.
Антитела к Fab человека (GE-Healthcare, 28-9583-25) иммобилизовали на сенсорном чипе Series S CM5 (GE Healthcare) согласно протоколу фирмы-производителя для удерживания антител крыс ОМТ, содержащих домен Ck человека. Анти-HLA-G антитела удерживали в течение 70 с при концентрации 15 мкг/мл. Wt HLA-G вводили (30 мкл/мин) при концентрации 500 или 1000 нМ в течение 60 с. Wt антитела крысы вводили в течение 90 с при концентрации 30 мкг/мл. Фазу диссоциации наблюдали в течение 60 или 240 с при промывке рабочим буферным раствором. Поверхность регенерировали при добавлении глицина, рН 1,5, в течение 60 с и при дополнительном периоде стабилизации в течение 90 с. Anti-human Fab antibodies (GE-Healthcare, 28-9583-25) were immobilized on a Series S CM5 sensor chip (GE Healthcare) according to the manufacturer's protocol for retaining OMT rat antibodies containing the human Ck domain. Anti-HLA-G antibodies were retained for 70 s at a concentration of 15 μg/ml. Wt HLA-G was injected (30 μl/min) at a concentration of 500 or 1000 nM for 60 s. Wt rat antibodies were administered over 90 s at a concentration of 30 μg/ml. The dissociation phase was observed for 60 or 240 s while washing with the working buffer solution. The surface was regenerated with the addition of glycine, pH 1.5, for 60 s and an additional stabilization period of 90 s.
В другом варианте анализа антитела к Fab человека (GE-Healthcare, 28-9583-25) иммобилизовали на сенсорном чипе Series S CM5 (GE Healthcare) согласно протоколу фирмы изготовителя для удерживания антител крыс ОМТ, содержащих домен Ck человека. Анти-HLA-G антитела удерживали в течение 90 с при концентрации 30 мкг/мл. Незанятые участки связывания на удерживаемых антителах блокировали при введении в течение 4 × 120 с IgG человека (JIR009-000-003) при концентрации 500 мкг/мл и скорости потока 30 мкл/мин. Wt HLA-G вводили (30 мкл/мин) при концентрации 500 нМ в течение 90 с. Второе антитело крыс ОМТ (домен Ck человека) вводили в течение 90 с при концентрации 30 мкг/мл. Фазу диссоциации наблюдали в течение 240 с при промывке рабочим буферным раствором. Поверхность регенерировали при введении глицина, рН 1,5, в течение 60 с и при дополнительном периоде стабилизации в течении 90 с.In another assay, anti-human Fab antibodies (GE-Healthcare, 28-9583-25) were immobilized on a Series S CM5 sensor chip (GE Healthcare) according to the manufacturer's protocol for retaining OMT rat antibodies containing the human Ck domain. Anti-HLA-G antibodies were retained for 90 seconds at a concentration of 30 μg/ml. Unoccupied binding sites on retained antibodies were blocked by 4 x 120 s injection of human IgG (JIR009-000-003) at a concentration of 500 μg/ml and a flow rate of 30 μl/min. Wt HLA-G was injected (30 μl/min) at a concentration of 500 nM for 90 s. The second antibody of OMT rats (human Ck domain) was injected for 90 s at a concentration of 30 μg/ml. The dissociation phase was observed for 240 s while washing with the working buffer solution. The surface was regenerated with the introduction of glycine, pH 1.5, for 60 s and with an additional stabilization period of 90 s.
ТаблицаTable
Связывание анти-HLA-G антител с рекомбинантным растворимым комплексом HLA-G МНС класса I в его мономерной, димерной и тримерной формах (ИФА)Binding of anti-HLA-G antibodies to recombinant soluble HLA-G MHC class I complex in its monomeric, dimeric and trimeric forms (ELISA)
н/о - не определялиn/a - not determined
В приведенной выше таблице представлено связывание различных моноклональных крысиных анти-HLA-G антител человека, полученных из белка wt IMS. Представлены относительные величины ЕС50 [нг/мл] соответствующего связывания с рекомбинантными мономерными, димерными и тримерными белками wt HLA-G по данным ИФА. ИФА проводили при нанесении биотинилированного антигена wt HLA-G на планшеты, покрытые стрептавидином. После стадий инкубации и промывки соответствующие антитела связывались в концентрационном интервале от 10 до 0 мкг в формате двухкратных разведении. Детектировали связанных антител проводили с использованием конъюгатов anti-Fc-антитело-POD. Величины ЕС50 определяли по полученным кривым связывания при концентрациях антитела, генерирующих половину максимального сигнала. В случае небиотинилированных димерного и тримерного антигенов HLA-G иммобилизацию осуществляли при случайном нанесении покрытия на планшеты для анализа.The table above shows the binding of various human monoclonal rat anti-HLA-G antibodies derived from wt IMS protein. The relative values of EC50 [ng/ml] of the corresponding binding to recombinant monomeric, dimeric and trimeric proteins of wt HLA-G according to ELISA are shown. ELISA was performed by applying the biotinylated wt HLA-G antigen to streptavidin-coated plates. After the incubation and washing steps, the corresponding antibodies were bound in the concentration range from 10 to 0 μg in a two-fold dilution format. Bound antibodies were detected using anti-Fc-antibody-POD conjugates. EC50 values were determined from the resulting binding curves at antibody concentrations generating half of the maximum signal. For non-biotinylated dimeric and trimeric HLA-G antigens, immobilization was performed by random coating of assay plates.
Связывание с HLA-G wt по сравнению с непривитым HLA-G по данным ИФАBinding to HLA-G wt compared to unvaccinated HLA-G by ELISA
В приведенной выше таблице представлено связывание различных крысиных моноклональных анти-HLA-G антител человека, полученных из wt белка IMS как от крыс wt, так и крыс ОМТ. Представлены относительные величины ЕС50 [нг/мл] и максимальные OD соответствующего связывания с рекомбинантным мономерным белком wt HLA-G или с так называемым непривитым белком HLA-G (консенсусная последовательность HLA-A на цепи HLA-G) по данным ИФА. ИФА проводили при нанесении биотинилированного антигена wt HLA-G или консенсусного антигена на планшеты, покрытые стрептавидином. После стадий инкубации и промывки соответствующие антитела связывались в концентрационном интервале от 10 до 0 мкг в формате двукратных разведении. Определение связанных антител проводили с использованием конъюгатов anti-Fc-антитело-POD. Величины ЕС50 определяли по полученным кривым связывания при концентрациях антитела, генерирующих половину максимального сигнала.The table above shows the binding of various rat human monoclonal anti-HLA-G antibodies derived from the wt IMS protein from both wt and OMT rats. Relative EC50 values [ng/ml] and maximum ODs of the corresponding binding to the recombinant monomeric wt HLA-G protein or to the so-called non-grafted HLA-G protein (HLA-A consensus sequence on the HLA-G chain) according to ELISA are shown. ELISA was performed by applying biotinylated wt HLA-G antigen or consensus antigen to streptavidin-coated plates. After the incubation and washing steps, the corresponding antibodies were bound in the concentration range from 10 to 0 μg in a two-fold dilution format. Bound antibody detection was performed using anti-Fc-antibody-POD conjugates. EC50 values were determined from the resulting binding curves at antibody concentrations generating half of the maximum signal.
Связывание HLA-G wt по сравнению с непривитым HLA-G -поверхностный плазменный резонансHLA-G binding wt versus ungrafted HLA-G - surface plasma resonance
Связывающие аффинности антител HLA-G с рекомбинантным HLA-G (SEQ ID NO:43) и контрольным модифицированным комплексом HLA-G β2M МНС человека класса I (где специфические аминокислоты HLA-G были заменены на консенсусные аминокислоты HLA-A (=непривитой HLA-G SEQ ID NO: 44:) ("-" означает отсутствие детектируемого связывания)Binding affinities of HLA-G antibodies to recombinant HLA-G (SEQ ID NO:43) and a control modified HLA-G β2M human MHC class I complex (where HLA-G specific amino acids have been replaced by HLA-A consensus amino acids (=non-grafted HLA- G SEQ ID NO: 44:) ("-" means no detectable binding)
В приведенной выше таблице представлены аффинности антител и величины t1/2 по сравнению с wt и непривитым HLA-G по данным поверхностного плазменного резонанса (Biacore). Кинетику связывания анти-HLA-G антител с HLA-G человека и с непривитым HLA-G человека исследовали методом поверхностного плазменного резонанса на приборе BIACORE T200 (GE Healthcare). Все эксперименты проводили при 25°С с использованием буферного раствора PBS (рН 7,4+0,05% Tween20) в качестве рабочего буферного раствора и буферного раствора PBS (+0,1% BSA) в качестве раствора для разбавления. Антитела к Fc человека (JIR009-005-098, Jackson) или Fc крысы (JIR112-005-071, Jackson) или Fc мыши (JIR115-005-071, Jackson) иммобилизовали на сенсорном чипе Series S CM5 (GE Healthcare) при рН 5,0 с использованием набора связывания по аминогруппе фирмы GE Healthcare. Анти-HLA-G антитела удерживались на поверхности, что приводило к отклику на удерживание 50 - 200 RU. Небиотинилированные соединения HLA-G наносили в течение 180 с со скоростью 30 мкл/мин при концентрации от 2,5 до 800 нМ (серийные разбавления 2×1:2 и 4×1:3) на поверхность (фаза ассоциации). Фазу диссоциации наблюдали в течение 300-600 с при промывке рабочим буферным раствором.The table above shows antibody affinities and t1/2 values compared to wt and unvaccinated HLA-G as measured by surface plasma resonance (Biacore). The binding kinetics of anti-HLA-G antibodies to human HLA-G and to ungrafted human HLA-G was studied by surface plasma resonance on a BIACORE T200 instrument (GE Healthcare). All experiments were performed at 25° C. using PBS buffer (pH 7.4+0.05% Tween20) as working buffer and PBS buffer (+0.1% BSA) as diluent. Antibodies to human Fc (JIR009-005-098, Jackson) or rat Fc (JIR112-005-071, Jackson) or mouse Fc (JIR115-005-071, Jackson) were immobilized on a Series S CM5 sensor chip (GE Healthcare) at pH 5.0 using GE Healthcare Amino Coupling Kit. Anti-HLA-G antibodies were retained on the surface resulting in a retention response of 50-200 RU. Non-biotinylated HLA-G compounds were applied for 180 seconds at a rate of 30 μl/min at a concentration of 2.5 to 800 nM (serial dilutions of 2x1:2 and 4x1:3) to the surface (association phase). The dissociation phase was observed for 300–600 s while washing with a working buffer solution.
Поверхность регенерировали при введении H3PO4 (0,85%) в течение 60+30 с для удерживающих Fc человека антител, глицина рН 1,5 в течение 60 с и глицина рН 2,0 в течение 60 с для удерживающих Fc крысы антител, H3PO4 (0,85%) в течение 80+60 с для удерживающих антител Fc мыши. Различия показателей преломления в объеме корректировали при вычитании отклика, полученного с имитационной поверхности. Контрольные введения вычитали (двойное сравнение). Полученные кривые аппроксимировали с использованием модели связывания Лэнгмюра 1:1 и программного обеспечения BIAevaluation (- в приведенной выше таблице означает, что связывание не детектируется).The surface was regenerated by injecting H 3 PO 4 (0.85%) for 60+30 s for human Fc-retaining antibodies, glycine pH 1.5 for 60 s, and glycine pH 2.0 for 60 s for rat Fc-retaining antibodies. , H 3 PO 4 (0.85%) for 80+60 s for retaining mouse Fc antibodies. Differences in the refractive indices in the volume were corrected by subtracting the response obtained from the simulated surface. Control injections were subtracted (double comparison). The resulting curves were fitted using a 1:1 Langmuir binding model and BIAevaluation software (- in the table above means no binding was detected).
В следующих экспериментах следующие эталонные антитела (полученные из разных коммерческих источников) сравнивали по связыванию с мономерным HLA-G МНС I человека (SEQ ID NO: 43 ("HLA-G-0003")) и с "непривитым" HLA-G человека с консенсусными специфичными положениями HLA-A (SEQ ID NO: 44 ("HLA-G-0007")):In the following experiments, the following reference antibodies (obtained from various commercial sources) were compared for binding to monomeric human MHC I HLA-G (SEQ ID NO: 43 ("HLA-G-0003")) and to "ungrafted" human HLA-G with HLA-A consensus specific positions (SEQ ID NO: 44 ("HLA-G-0007")):
MEM/G9, 87G, G233, 2A12, 4H84, 5A6G7, 6D463, 9-1F10, MEM-G/1, MEM-G/11, MEM-G/2 и MEM-G/4 ("-" означает отсутствие детектируемого связывания).MEM/G9, 87G, G233, 2A12, 4H84, 5A6G7, 6D463, 9-1F10, MEM-G/1, MEM-G/11, MEM-G/2 and MEM-G/4 ("-" means no detectable binding).
Следует отметить, что большинство исследованных антител не проявляет никакого специфического связывания с мономерным HLA-G МНС I человека (SEQ ID NO: 43 ("HLA-G-0003")), включая также антитело 87G. Связывание с олигомерными формами HLA-G, как описано в литературе, может быть обусловлено авидностью из-за увеличения участков связывания олигомерных форм.It should be noted that most of the antibodies tested did not show any specific binding to monomeric human MHC I HLA-G (SEQ ID NO: 43 ("HLA-G-0003")), including also the 87G antibody. Binding to oligomeric forms of HLA-G, as described in the literature, may be due to avidity due to the increase in binding sites of oligomeric forms.
Только для антитела MEM/G9, величина связывающей аффинности которого составляет KD 7,7Е-09 М, антитела G233, величина связывающей аффинности которого составляет KD 2,ОЕ-08 М, и MEM-G/11, величина связывающей аффинности которого составляет 1,2Е М, наблюдалось связывание с мономерным комплексом wt HLA-G MHC I человека. Однако, одно из этих антител, MEM-G/11, также характеризуется некоторым связыванием/кроссреактивностью с консенсусным HLA-A на непривитом HLA-G (SEQ ID NO:44). Кроме того, другое антитело (MEM/G9) также характеризуется сильным неспецифичным связыванием с консенсусным HLA-A на непривитом HLA-G t (SEQ ID NO:44).Only for antibody MEM/G9 with a binding affinity value of KD 7.7E -09 M, antibody G233 with a binding affinity value of KD 2.OE -08 M, and MEM-G/11 with a binding affinity value of 1, 2E M, binding to the human wt HLA-G MHC I monomeric complex was observed. However, one of these antibodies, MEM-G/11, also has some binding/cross-reactivity with consensus HLA-A on ungrafted HLA-G (SEQ ID NO:44). In addition, another antibody (MEM/G9) is also characterized by strong non-specific binding to consensus HLA-A on ungrafted HLA-G t (SEQ ID NO:44).
Пример 4Example 4
а) Ингибирование связывания с рецептором (мономерным, ди- и тримерным HLA-G): ИФА. блокировка ILT-2 и ILT-4a) Inhibition of binding to the receptor (monomeric, di- and trimeric HLA-G): ELISA. blocking ILT-2 and ILT-4
На планшеты, покрытые стрептавидином (Nunc, MicroCoat #11974998001), наносили биотинилированный wt HLA-G человека при концентрации 500-1000 нг/мл по 25 мкл в лунке и инкубировали при 4°С в течение ночи. После промывки (3×90 мкл/лунка буферным раствором PBST) добавляли 25 мкл образцов анти-HLA-G при уменьшающихся концентрациях? начиная от 10 или 3 мкг/мл, затем готовили серийные разбавления 1:3 или 1:2 и инкубировали в течение 1 ч при КТ. После промывки (3×90 мкл/лунка буферным раствором PBST) в количестве 25 мкл/лунка добавляли с-myc-меченный рекомбинантный рецептор ILT-2 при концентрации 200 нг/мл и инкубировали в течение 1 ч при КТ. После промывки (3×90 мкл/лунка буферным раствором PBST) в количестве 25 мкл/лунка добавляли козьи антитела anti-c-myc-POD (Bethyl #А190-104Р 1:7000 in PBST+0.5% BSA) или anti-FcgPOD человека (JIR, 109-036-098, 1:8000 в PBST+0,5% BSA) и инкубировали при КТ в течение 1 ч на качалке. После промывки (3×90 мкл/лунка буферным раствором PBST) в количестве 25 мкл/лунка добавляли субстрат ТМВ (Roche, 11835033001) и инкубировали до поглощения OD 2-3. Измерения проводили на приборе Tecan Safire 2 при длине волны 370/492 нм.Streptavidin-coated plates (Nunc, MicroCoat #11974998001) were coated with biotinylated human wt HLA-G at 500-1000 ng/mL at 25 μl per well and incubated at 4° C. overnight. After washing (3 x 90 µl/well with PBST buffer), 25 µl of anti-HLA-G samples were added at decreasing concentrations? starting at 10 or 3 μg/ml, serial dilutions of 1:3 or 1:2 were then prepared and incubated for 1 h at RT. After washing (3 x 90 μl/well with PBST buffer), c-myc-labeled recombinant ILT-2 receptor at 200 ng/ml was added at 25 μl/well and incubated for 1 hour at RT. After washing (3×90 µl/well with PBST buffer), goat anti-c-myc-POD (Bethyl #A190-104P 1:7000 in PBST+0.5% BSA) or human anti-FcgPOD was added at 25 µl/well (JIR, 109-036-098, 1:8000 in PBST+0.5% BSA) and incubated at RT for 1 hour on a shaker. After washing (3 x 90 μl/well with PBST buffer), TMB substrate (Roche, 11835033001) was added at 25 μl/well and incubated until OD 2-3 was taken up. The measurements were carried out on a
В приведенной выше таблице представлен уровень блокировки ILT-2 и ILT-4 различными антителами, связанными с HLA-G при концентрации 3 мкг/мл, по сравнению с взаимодействием HLA-G/рецептор, которое не было блокировано. HLA-G-0090 исследовали в отдельном эксперименте блокировки ILT2, при этом блокировку ILT4 не оценивали.The table above shows the level of blocking of ILT-2 and ILT-4 by various antibodies bound to HLA-G at a concentration of 3 μg/ml compared to the HLA-G/receptor interaction that was not blocked. HLA-G-0090 was investigated in a separate ILT2 blocking experiment, while ILT4 blocking was not evaluated.
b) Биохимическое сравнение анти-HLA-G антител в отношении их ингибирующих свойств связывания ILT2 и ILT4 различными методами анализаb) Biochemical comparison of anti-HLA-G antibodies with respect to their inhibitory properties of ILT2 and ILT4 binding by various assay methods
ИФА проводили при нанесении Fc-меченных ILT2 и ILT4, соответственно, на микротитрационные планшеты Maxisorp.После стадий инкубации и промывки добавляли соответствующие антитела при концентрации 100 нМ. В лунки добавляли растворимые мономерный, димерный или тримерный HLA-G с меткой His-tag. После стадий инкубации и промывки осуществляли детектирование связанного рецептора с использованием конъюгатов anti-His-антитело-POD. Ингибирование в процентах (%) рассчитывали в сравнении с величинами, полученными из лунок ILT2/4+HLA-G (мономер, димер или тример), не содержащих анти-HLA-G антител или ILT2/4 (связывание 100% = ингибирование 0%).ELISA was performed by applying Fc-labeled ILT2 and ILT4, respectively, to Maxisorp microtiter plates. After the incubation and washing steps, the appropriate antibodies were added at a concentration of 100 nM. Soluble monomeric, dimeric or trimeric His-tag HLA-G was added to the wells. Following the incubation and washing steps, bound receptor detection was performed using anti-His-antibody-POD conjugates. Percent (%) inhibition was calculated compared to values obtained from ILT2/4+HLA-G (monomer, dimer or trimer) wells containing no anti-HLA-G antibodies or ILT2/4 (100% binding = 0% inhibition). ).
В представленных выше таблицах указана блокировка взаимодействия между рекомбинантными белками HLA-G (мономер и олигомеры) и их рецепторами ILT2 и ILT4 описанными антителами HLAG при концентрации 110 нМ (*HLAG-0090 исследовали при концентрации 44 нМ) по данным ИФА. Показано 100% ингибирование взаимодействия HLA-G/рецептор (для ILT2 и ILT4). Менее выраженное ингибирование ILT4 в основном зависит от основного В2М-зависимого взаимодействия этого рецептора.The above tables indicate the blocking of the interaction between recombinant HLA-G proteins (monomer and oligomers) and their ILT2 and ILT4 receptors by the described HLAG antibodies at a concentration of 110 nM (*HLAG-0090 tested at a concentration of 44 nM) according to ELISA. 100% inhibition of HLA-G/receptor interaction (for ILT2 and ILT4) was shown. Less pronounced inhibition of ILT4 mainly depends on the main B2M-dependent interaction of this receptor.
Гистограммы на фиг. 4а и 4б свидетельствуют об ингибировании в процентах, которое проявляют описанные анти-HLA-G антитела, по сравнению с коммерческими антителами. Коммерческие антитела HLA-G 87G, MEM/G09 и G233 не блокируют взаимодействие HLA-G/ILT2 или ILT4 с такой же эффективностью, как описанные антитела. Кроме того, коммерческие антитела приводят к повышенному связыванию HLA-G с ILT2 или ILT4, в некоторых случаях после связывания.The histograms in Fig. 4a and 4b show the percentage inhibition that the described anti-HLA-G antibodies exhibit compared to commercial antibodies. Commercial antibodies HLA-
с) Ингибирование связывания CD8a с HLAG антителами anti-HLAG 384-луночные планшеты, покрытые стрептавидином, блокировали при добавлении блокирующего раствора в количестве 30 мкл/лунка. Блокирующий раствор получали разбавлением 5% поливинилового спирта (PVA, Sigma #Р8136) и 8% поливинилпирролидона (PVP, Sigma #PVP360) 1:10 в растворе Starting Block T20 (Thermo Scientific #37543) при добавлении 3,5 мл PVA+3,5 мл и PVP в 35 мл раствора Starting Block T20. 30 мкл биотинилированного HLAG (3 мкг/мл), разбавленного в блокирующем растворе, добавляли в каждую лунку и инкубировали при КТ в течение 1 ч на качалке. Лунки промывали 3 раза 100 мкл буферного раствора PBS (PAN Biotech # P04-36500), содержащего 0,1% Tween-20 (Merck #8.22184.500). Затем лунки инкубировали с 30 мкл антител anti-HLAG, разбавленных в блокирующем буферном растворе, в трех повторах в течение 1 ч при КТ на качалке, и затем 3 раза промывали 100 мкл буферного раствора PBS, содержащего 0,1% Tween-20. Рекомбинантный CD8a (Sino Biological #10980-H08H, восстановленный при хранении в течение 1 недели при 4°С) разбавляли в блокирующем растворе (1,25 мкг/мл), и во все лунки добавляли по 30 мкл, затем инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре на качалке. Лунки промывали 3 раза по 100 мкл PBS, содержащего 0,1% Tween-20. HRP-конъюгированное поликлональное антитело anti-CD8a IgG крысы (USBiological #033547-HRP) разбавляли в 3% бычьем сывороточном альбумине, фракция V (Roche #10735086001)/PBS 0,2% Tween20, и в каждую лунку добавляли по 30 мкл полученного раствора. Затем планшет инкубировали в течение 1 ч при КТ на качалке и промывали 3 раза по 100 мкл PBS, содержащего 0,1% Tween-20. Затем в каждую лунку добавляли по 30 мкл субстрата ТМВ (BM-Blue, растворимый субстрат HRP, Roche #11484281001) с последующей инкубацией в течение 25 мин при КТ на качалке. Затем реакцию останавливали при добавлении в каждую лунку 25 мкл серной кислоты и измеряли поглощение при 450 нм в ридере для планшетов. Специфическое связывание CD8a с HLAG рассчитывали при вычитании средних величин фона из средних величин связывания. Общее связывание CD8 с HLAG в отсутствие антител рассматривали как 100% связывание или 0% ингибирование.c) Inhibition of CD8a binding to HLAG by anti-HLAG antibodies Streptavidin-coated 384-well plates were blocked by adding a blocking solution at 30 μl/well. A blocking solution was prepared by diluting 5% polyvinyl alcohol (PVA, Sigma #P8136) and 8% polyvinylpyrrolidone (PVP, Sigma #PVP360) 1:10 in Starting Block T20 solution (Thermo Scientific #37543) with the addition of 3.5 ml PVA+3, 5 ml and PVP in 35 ml Starting Block T20 solution. 30 μl of biotinylated HLAG (3 μg/ml) diluted in blocking solution was added to each well and incubated at RT for 1 hour on a shaker. The wells were washed 3 times with 100 μl of PBS buffer (PAN Biotech # P04-36500) containing 0.1% Tween-20 (Merck #8.22184.500). The wells were then incubated with 30 µl of anti-HLAG antibodies diluted in blocking buffer in triplicate for 1 h at shaking RT and then washed 3 times with 100 µl of PBS buffer containing 0.1% Tween-20. Recombinant CD8a (Sino Biological #10980-H08H, reconstituted for 1 week at 4°C) was diluted in blocking solution (1.25 μg/ml) and 30 μl was added to all wells, then incubated for 2 h at room temperature on a shaker. The wells were washed 3 times with 100 μl of PBS containing 0.1% Tween-20. HRP-conjugated rat anti-CD8a IgG polyclonal antibody (USBiological #033547-HRP) was diluted in 3% bovine serum albumin, fraction V (Roche #10735086001)/PBS 0.2% Tween20, and 30 µl of the resulting solution was added to each well . Then the plate was incubated for 1 h at RT on a shaker and washed 3 times with 100 μl of PBS containing 0.1% Tween-20. Then, 30 µl of TMB substrate (BM-Blue, soluble HRP substrate, Roche #11484281001) was added to each well, followed by incubation for 25 min at RT on a shaker. The reaction was then stopped by adding 25 μl of sulfuric acid to each well and absorbance at 450 nm was measured in a plate reader. Specific binding of CD8a to HLAG was calculated by subtracting the mean background values from the mean binding values. The total binding of CD8 to HLAG in the absence of antibodies was considered as 100% binding or 0% inhibition.
На гистограммах на фиг. 4 с представлено ингибирование в процентах, которое достигается описанными антителами к HLA-G, по сравнению с коммерческими антителами. Коммерческие антитела HLA-G 87G не блокируют взаимодействие HLA-G/CD8a, в то время как MEM/G09 и G233 частично ингибируют взаимодействие HLAG с CD8a по сравнению с описанными антителами в данном формате анализа.On the histograms in Fig. 4c shows the percentage inhibition achieved by the described anti-HLA-G antibodies compared to commercial antibodies. Commercial antibodies HLA-
Пример 5Example 5
Связывание анти-HLA-G антител с клеткамиBinding of anti-HLA-G antibodies to cells
а) Связывание HLA-G с поверхностью клеток по данным ИФА Клетки JEG3 (экспрессирующие природный HLA-G, 20000 клеток/лунка), клетки Skov-3 или клетки Skov-3, экспрессирующие рекомбинантный HLA-G на поверхности клеток (оба типа клеток по 10000 клеток/лунка) в количестве 25 мкл/лунка высевали в 384-луночные планшеты, обработанные культурой ткани (Corning, 3701), и инкубировали при 37°С в течение ночи. На следующий день добавляли 12,5 мкл образцов анти-HLA-G (конечное разбавление 1:3) и инкубировали в течение 2 ч при 4°С. Клетки фиксировали при добавлении 50 мкл/лунка глутарового альдегида до конечной концентрации 0,05% (Sigma Cat.No: G5882; Lot No.: 056K5318). После промывки (3×90 мкл/лунка буферным раствором PBST) добавляли 25 мкл/лунка козьих антител к H+L-POD мыши (Biorad #170-6561 1:2000 в OSEP) или антител обезьяны к IgG POD кролика (GE #NA9340V, 1:5000 в OSE) и инкубировали при КТ в течение 1 ч на качалке. Для детектирования IgG крысы, смесь козьих антител к IgGl-POD крысы (Bethyl #А110-106Р), козьих антител к IgG2a-POD крысы (Bethyl #А110-109Р) и козьих антител к IgG2b-POD крысы (Bethyl #А110-111P) добавляли в разбавлении 1:10000 в OSEP и инкубировали при КТ в течение 1 ч на качалке. После промывки (4×90 мкл/лунка буферным раствором PBST) добавляли 25 мкл/лунка субстрата ТМВ (Roche, 11835033001) и инкубировали до поглощения OD 2-3. Измерения проводили на приборе Tecan Safire 2 при длине волны 370/492 нм.a) HLA-G binding to cell surface as determined by ELISA JEG3 cells (expressing natural HLA-G, 20,000 cells/well), Skov-3 cells or Skov-3 cells expressing recombinant HLA-G on the cell surface (both cell types according to 10,000 cells/well) at 25 μl/well were plated in 384-well tissue culture-treated plates (Corning, 3701) and incubated at 37° C. overnight. The next day, 12.5 μl of anti-HLA-G samples (final dilution 1:3) were added and incubated for 2 hours at 4°C. Cells were fixed by adding 50 μl/well of glutaraldehyde to a final concentration of 0.05% (Sigma Cat. No: G5882; Lot No.: 056K5318). After washing (3×90 µl/well with PBST buffer), 25 µl/well of goat anti-mouse H+L-POD antibody (Biorad #170-6561 1:2000 in OSEP) or monkey anti-rabbit IgG POD antibody (GE #NA9340V , 1:5000 in OSE) and incubated at RT for 1 h on a shaker. For rat IgG detection, mixture of goat anti-rat IgGl-POD (Bethyl #A110-106P), goat anti-rat IgG2a-POD (Bethyl #A110-109P), and goat anti-rat IgG2b-POD (Bethyl #A110-111P) was added at a 1:10,000 dilution to OSEP and incubated at RT for 1 h on a shaker. After washing (4×90 μl/well with PBST buffer), 25 μl/well TMB substrate (Roche, 11835033001) was added and incubated until OD 2-3 uptake. The measurements were carried out on a
В приведенной выше таблице указано связывание различных моноклональных антител крысы анти-HLA-G к HLA-G человека, экспрессируемым на различных клетках, и клеточных линиях, по данным анализа FACS. Описано либо связывание с природным HLA-G, экспрессируемым опухолевыми клетками JEG3 или Skov3 или трансфектированными клетками РА-TU-8902 и соответствующими родительскими нетрасфектированными клетками.The above table shows the binding of various rat anti-HLA-G monoclonal antibodies to human HLA-G expressed on various cells and cell lines, according to FACS analysis. Either binding to natural HLA-G expressed by JEG3 or Skov3 tumor cells or transfected PA-TU-8902 cells and corresponding parental untransfected cells is described.
b) Связывание анти-HLA-G антител с природным или рекомбинантным HLA-G, экспрессируемым на поверхности клеток (по данным анализа FACS)b) Binding of anti-HLA-G antibodies to natural or recombinant HLA-G expressed on the cell surface (according to FACS analysis)
Для анализа методом проточной цитометрии клетки окрашивали моноклональным анти-HLA-G антителом mAb при 4°С. Краткое описание анализа: по 25 мкл/лунка каждой клеточной суспензии (5×104 клеток/лунка) переносили в полипропиленовый 96-луночный планшет с V-образным дном и предварительно охлаждали в холодильнике при 5°С в течение 10 мин. Образцы анти-HLA-G антител разбавляли в окрашивающем буферном растворе до двукратной исходной концентрации 80 мкг/мл. Затем готовили серию 4-кратных разбавлений антител и раствор антитела в количестве 25 мкл/лунка добавляли в полученные клетки и затем инкубировали в течение 1 ч при 5°С. Клетки промывали дважды окрашивающим буферным раствором в количестве 200 мкл/лунка и центрифугировали при 300 g в течение 3 мин. Для детектирования флуоресцентно меченных антивидовых антител (козьи антитела к IgG крысы (H+L), конъюгированные с Alexa 488, Life technologies # A11006, или козьи антитела к IgG мыши (H+L), Life technologies # A11001) или козьи антитела к IgG человека (H+L), конъюгированные с Alexa 488, Life technologies # A11013) их разбавляли до 20 мкг/мл в окрашивающем буферном растворе и клеточные осадки ресуспендировали в 50 мкл/лунка раствора детектируемого антитела. После инкубации в течение 1 ч при 5°С клетки снова дважды промывали окрашивающим буферным раствором, ресуспендировали в 70 мкл окрашивающего буферного раствора и связывание оценивали методом FACS Canto II.For analysis by flow cytometry, cells were stained with monoclonal anti-HLA-G antibody mAb at 4°C. Brief description of the assay: 25 µl/well of each cell suspension (5×10 4 cells/well) was transferred to a polypropylene 96-well V-bottomed plate and pre-chilled in a refrigerator at 5°C for 10 minutes. Samples of anti-HLA-G antibodies were diluted in staining buffer solution to two times the original concentration of 80 μg/ml. A series of 4-fold dilutions of antibodies was then prepared, and an antibody solution in an amount of 25 μl/well was added to the obtained cells and then incubated for 1 hour at 5°C. Cells were washed twice with 200 µl/well staining buffer and centrifuged at 300 g for 3 min. For detection of fluorescently labeled anti-species antibodies (goat anti-rat IgG (H+L) conjugated to
Пример окрашивания FACS для анти-HLA-G антител HLA-G 0031, HLAG 0039, HLA-G 0041 и HLA-G 0090 приведен на графиках совмещения FACS, фиг. 4.An example of FACS staining for anti-HLA-G antibodies HLA-
Пример 6Example 6
Анти-HLA-G антитела ингибируют/модулируют связывание ILT2 с HLA-G, который экспрессируется на клетках JEG3Anti-HLA-G antibodies inhibit/modulate ILT2 binding to HLA-G, which is expressed on JEG3 cells
Для анализа клетки JEG3 (АТСС НТВ36) окрашивали гибридными белками ILT2-Fc (контроль = отсутствие ингибирования) в присутствии или в отсутствии предварительной инкубации с различными анти-HLA-G антителами. Для предварительной инкубации с антителами anti-HLA-G, 25 мкл/лунка клеточной суспензии переносили в полипропиленовый 96-луночный планшет с V-образным дном и предварительно охлаждали при 4°С в течение 10 мин. Анти-HLA-G антитела или эталонные антитела (G233, MEM-G/9 или 87G) разбавляли в окрашивающем буферном растворе до двукратной концентрации 80 мкг/мл и в полученные клетки добавляли 25 мкл/лунка раствора антитела и инкубировали в течение 1 ч при 5°С. Клетки дважды промывали 200 мкл/лунка окрашивающего буферного раствора, центрифугировали при 300 g в течение 3 мин и затем ресуспендировали в 25 мкл/лунка окрашивающего буферного раствора.For analysis, JEG3 cells (ATCC HTB36) were stained with ILT2-Fc fusion proteins (control = no inhibition) with or without pre-incubation with various anti-HLA-G antibodies. For pre-incubation with anti-HLA-G antibodies, 25 µl/well of the cell suspension was transferred into a polypropylene 96-well V-bottom plate and pre-cooled at 4° C. for 10 min. Anti-HLA-G antibodies or reference antibodies (G233, MEM-G/9, or 87G) were diluted in staining buffer to a 2-fold concentration of 80 µg/ml, and 25 µl/well of the antibody solution was added to the resulting cells and incubated for 1 hour at 5°C. Cells were washed twice with 200 µl/well staining buffer, centrifuged at 300 g for 3 min and then resuspended in 25 µl/well staining buffer.
Определение гибридного белка ILT2-Fc Chimera человека (RD #2017-Т2-050) на а) клетках JEG3, предварительно инкубированных в присутствии анти-HLA-G антител mAb или b) на необработанных клетках JEG3 в качестве сравнения проводили следующим образом. Краткое описание анализа: ILT2-Fc или контрольный IgG человека (Jackson-Immuno-Research # 009-000-003) разбавляли в окрашивающем буферном растворе до двукратной концентрации 20 мкг/лунка (ILT2) и в полученные клетки добавляли 25 мкл/лунка раствора белка ILT2-Fc, и затем инкубировали в течение 2 ч при 5°С. Клетки снова промывали дважды 200 мкл/лунка окрашивающего буферного раствора, и белок ILT2-Fc человека определяли с использованием флуоресцентно меченого антитела, специфичного к IgG Fc-γ человека (фрагмент (F(ab')2 козьего антитела к IgG человека, Fcγ-специфичный фрагмент FITC (Jackson-Immuno-Research # 109-096-008) при разбавлении 10 мкг/мл в окрашивающем буферном растворе. Осадок клеток ресуспендировали в 50 мкл/лунка детектируемого антитела. После инкубации в течение 1 ч при 5°С клетки дважды промывали окрашивающим буферным раствором, ресуспендировали в 70 мкл и связывание ILT2 с клетками JEG 3 оценивали на приборе FACS Canto II.Determination of human Chimera ILT2-Fc fusion protein (RD #2017-T2-050) on a) JEG3 cells pre-incubated in the presence of anti-HLA-G mAbs or b) on untreated JEG3 cells as a comparison was performed as follows. Brief description of the assay: ILT2-Fc or control human IgG (Jackson-Immuno-Research # 009-000-003) was diluted in staining buffer solution to a 2-fold concentration of 20 µg/well (ILT2) and 25 µl/well of protein solution was added to the obtained cells ILT2-Fc, and then incubated for 2 h at 5°C. Cells were again washed twice with 200 μl/well staining buffer and human ILT2-Fc protein was detected using a fluorescently labeled anti-human IgG Fc-γ fragment (F(ab') 2 goat anti-human IgG, Fcγ-specific FITC fragment (Jackson-Immuno-Research # 109-096-008) when diluted 10 μg/ml in staining buffer Cell pellet was resuspended in 50 μl/well of detectable antibody After incubation for 1 h at 5°C, cells were washed twice staining buffer solution, resuspended in 70 μl and ILT2 binding to
В качестве контроля анти-HLA-G антитела, связанные с предварительно инкубированными клетками JEG-3, определяли с использованием антивидовых антител: козье антитело к IgG крысы (H+L), конъюгированное с Alexa 488 (Life technologies # A11006), или козье антитело к IgG мыши (H+L)-Alexa 488, (Life technologies, # A11001) при концентрации 10 мкг/мл.As a control, anti-HLA-G antibodies bound to pre-incubated JEG-3 cells were detected using anti-species antibodies: goat anti-rat IgG (H+L) conjugated to Alexa 488 (Life technologies # A11006) or goat anti-rat IgG (Life technologies # A11006) to mouse IgG (H+L)-
На графике (фиг. 5) представлена соответствующая способность различных антител HLA-G изменять взаимодействие и связывание рекомбинантного ILT2 с HLA-G, экспрессируемым на опухолевых клетках JEG3.The graph (FIG. 5) shows the respective ability of various HLA-G antibodies to alter the interaction and binding of recombinant ILT2 with HLA-G expressed on JEG3 tumor cells.
В приведенной ниже таблице суммированы результаты экспериментов. Связывание анти-HLA-G антител с клетками JEG3, обозначенное как +, означает слабое связывание, +++ означает сильное связывание. Способность анти-HLA-G антител либо ингибировать/блокировать либо усиливать связывание ILT2 с HLA-G, экспрессируемым клетки JEG3. В последнем столбце показано/количественно оценено связывание рекомбинантного ILT2 с клетками или ингибирование/блокирование (окрашивание ILT2-Fc в отсутствии анти-HLA-G антител означает 100% связывание, то есть 0% ингибирование, отрицательная величина указывает на еще более увеличенное связывание, различие в сигналах окрашивания менее 5% означает отсутствие эффекта).The table below summarizes the experimental results. Binding of anti-HLA-G antibodies to JEG3 cells, indicated as + means weak binding, +++ means strong binding. The ability of anti-HLA-G antibodies to either inhibit/block or enhance ILT2 binding to HLA-G expressed by JEG3 cells. The last column shows/quantifies recombinant ILT2 binding to cells or inhibition/blocking (ILT2-Fc staining in the absence of anti-HLA-G antibodies means 100% binding, i.e. 0% inhibition, a negative value indicates even more increased binding, difference less than 5% in staining signals means no effect).
Пример 7Example 7
Анализ восстановления моноцитов-цитокинов (после HLA-G-опосредованного подавления)Monocyte-cytokine recovery assay (after HLA-G-mediated suppression)
В описанном ниже анализе совместного культивирования для функциональной характеристики различных моноклональных антител крысы к HLA-G человека использовали HLA-G-экспрессирующие клетки с моноцитами. Периферические моноциты человека выделяли из крови здоровых доноров. Краткое описание анализа: кровь отбирали в пробирки, содержащие антикоагуляционный агент, и разбавляли в соотношении 1:2 в PBS. Для выделения периферических мононуклеарных клеток (РВМС) по 30 мл смеси переносили в пробирки Leucosep, уже содержащие среду для разделения. После центрифугирования в течение 12 мин (1200xg без торможения) собирали специфическую полосу РВМС, которую промывали 3 раза PBS и центрифугировали в течение 10 мин при 300xg. И наконец, клеточные осадки ресуспендировали в буферном растворе MACS фирмы Miltenyi и моноциты человека выделяли из РВМС с использованием магнитного разделения и набора II для выделения моноцитов человека фирмы Miltenyi (#130-091-153) согласно инструкции фирмы-изготовителя (отрицательная селекция). Выделенные моноциты ресуспендировали в культуральной среде первичных клеток (RPMI 1640, PAN #Р04-17500, дополненной 10% FCS, Gibco #10500, 2 мМ L-глутамин, Sigma #G7513, 1 мМ пируват натрия, Gibco #11360, заменимые аминокислоты MEM, Gibco #11140, 0,1 мМ 2-меркаптоэтанол, Gibco #31350, MEM витамины, Gibco #11120, пенициллин-стрептомицин, Gibco #15140) с плотностью 5х10е5 клеток/мл. Обогащение клетками CD 14+ CD 16+ контролировали проточной цитометрией и анализировали экспрессию ILT2 и ILT4 клетками. Для анализа совместного культивирования моноцитов, обогащенных клетками, экспрессирующими HLA-G, клетки JEG-3 ((АТСС НТВ36) высевали за 1 день до анализа в 96-луночный плоскодонный культуральный планшет в количестве 8x10e3 клеток/лунка в 100 мкл культуральной среды JEG-3 (среда MEM Eagle, содержащая EBSS и L-глутамин, PAN #P04-00509, дополненная 10% FCS, Gibco #10500, 1 мМ пируват натрия, Gibco #11360, заменяемые аминокислоты MEM Gibco #11140), при этом в день анализа формировался непрерывный слой. В некоторых экспериментах использовали клеточную линию JEG-3, нокаунтную в отношении HLAG, которую высевали аналогично тому, как описано выше для клеток JEG-3 wt. Адгезивные клетки JEG-3 предварительно инкубировали в формате 4-кратного серийного разведения анти-HLA-G антител в первичной клеточной культуре. Затем удаляли супернатант из адгезивных клеток JEG-3 и полученный раствор антител добавляли в количестве 50 мкл/лунка и инкубировали при 37°С и 5% CO2 в увлажненной атмосфере в течение 1 ч. Моноциты человека добавляли в анти-HLA-G антитела, предварительно инкубированные клетки JEG-3 (в количестве 2,5х10е4 моноцитов человека/лунка в 50 мкл первичной культуральной среды) и совместную культуру инкубировали при 37°С и 5% CO2 в увлажненной атмосфере в течение ночи (приблизительно 18-20 ч). На следующий день проводили стимуляцию LPS с использованием 50 нг/мл LPS в течение 7 ч и затем собирали супернатант совместной культуры. Концентрацию TNFα, в супернатанте совместной культуры определяли с использованием ИФА (набор Human TNF alpha Ready-SET-Go!® фирмы eBioscience (#88-7346-88)).In the co-culture assay described below, HLA-G-expressing cells with monocytes were used to functionally characterize various anti-human HLA-G rat monoclonal antibodies. Human peripheral monocytes were isolated from the blood of healthy donors. Brief description of the assay: Blood was drawn into tubes containing an anticoagulant agent and diluted 1:2 in PBS. For the isolation of peripheral mononuclear cells (PBMCs), 30 ml of the mixture was transferred into Leucosep tubes already containing separation medium. After centrifugation for 12 min (1200xg without braking), a specific PBMC band was collected, which was washed 3 times with PBS and centrifuged for 10 min at 300xg. Finally, cell pellets were resuspended in Miltenyi MACS buffer and human monocytes were isolated from PBMCs using magnetic separation and Miltenyi Human Monocyte Isolation Kit II (#130-091-153) according to the manufacturer's instructions (negative selection). Isolated monocytes were resuspended in primary cell culture medium (RPMI 1640, PAN #P04-17500, supplemented with 10% FCS,
В приведенных ниже таблицах представлены функциональные характеристики указанных антител HLA-G для конкретного донора при различных характеристиках антитела.The following tables present the performance of the indicated HLA-G antibodies for a particular donor with different antibody characteristics.
Таблицыtables
Функциональные анти-HLA-G антитела способны восстанавливать подавленный специфический иммунный ответ HLA-G, т.е. восстановление LPS-опосредованного продуцирования TNFα моноцитами в совместной культуре с HLA-G-экспрессирующими клетками: Высвобождение TNF (восстановление) (%) функциональными анти-HLA-G антителамиFunctional anti-HLA-G antibodies are capable of restoring suppressed HLA-G specific immune response, ie. recovery of LPS-mediated TNFα production by monocytes in co-culture with HLA-G expressing cells: TNF release (recovery) (%) by functional anti-HLA-G antibodies
Функциональные анти-HLA-G антитела способны индуцировать (восстанавливать подавленный) иммунный ответ, т.е. восстановление LPS-опосредованного продуцирования TNFa моноцитами в совместной культуре с HLA-G-экспрессирующими клетками (в качестве отрицательного контроля специфичного к HLAG индуцирования TNF использовали клеточную линию, нокаунтную в отношении HLAG, чтобы различить, какие антитела индуцируют или не индуцируют TNF (действительно специфичные к HLA-G) или индуцируют TNF на клеточной линии, нокаунтной в отношении HLAG (которые не могут быть специфичными в отношении HLAG).Functional anti-HLA-G antibodies are capable of inducing (restoring suppressed) immune response, ie. restoration of LPS-mediated TNFa production by monocytes in co-culture with HLA-G-expressing cells (a HLAG knockout cell line was used as a negative control for HLAG-specific TNF induction to distinguish which antibodies did or did not induce TNF (indeed specific to HLA-G) or induce TNF in an HLAG knockout cell line (which may not be specific for HLAG).
Величины индукции TNF (%) анти-HLA-G антител рассчитывали с использованием следующего условия: необработанная совместная культура клеток JEG3 и моноцитов = 0%, культура только моноцитов (в отсутствии подавления, индуцированного HLA-G) = 100%.TNF induction values (%) of anti-HLA-G antibodies were calculated using the following condition: untreated co-culture of JEG3 cells and monocytes = 0%, culture of monocytes only (in the absence of suppression induced by HLA-G) = 100%.
Данные, представленный выше в таблице, свидетельствуют о том, что антитела по настоящему изобретению способны индуцировать высвобождение TNFα, в совместной культуре моноцитов с клетками JEG-3, экспрессирующими HLA-G, в то время как они не способны индуцировать высвобождение TNFα, в совместной культуре моноцитов с клетками JEG-3, нокаунтными в отношении HLA-G.The data presented in the table above indicate that the antibodies of the present invention are able to induce TNFα release in co-culture of monocytes with JEG-3 cells expressing HLA-G, while they are not able to induce TNFα release in co-culture monocytes with JEG-3 cells knocked out for HLA-G.
Данные, представленные в таблице, явно свидетельствуют о том, что эталонные антитела не являются действительно специфичными к HLA-G, поскольку они индуцируют сильное высвобождение TNFα также и в клеточных линиях, нокаунтных в отношении HLA-G.The data presented in the table clearly indicate that the reference antibodies are not truly specific for HLA-G, as they induce a strong release of TNFα also in HLA-G knockout cell lines.
Высвобождение TNF (восстановленное) (%) изменяется в зависимости от донора (ниже приведены различные доноры).The release of TNF (recovered) (%) varies depending on the donor (below are various donors).
--->--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕОЛЬНОСТЕЙSEQUENCE LIST
<110> Ф.ХОФФМАНН-ЛЯ РОЩ АГ <110> F.HOFFMANN-LA GROVE AG
<120> АНТИТЕЛА ANTI-HLA-G И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ<120> ANTI-HLA-G ANTIBODIES AND THEIR USE
<130> P34773-WO <130> P34773-WO
<150> EP18168011.7 <150>EP18168011.7
<151> 2018-04-18 <151> 2018-04-18
<160> 55 <160> 55
<170> PatentIn version 3.5 <170>PatentIn version 3.5
<210> 1 <210> 1
<211> 5 <211> 5
<212> PRT <212> PRT
<213> rat <213> rat
<400> 1 <400> 1
Asp Tyr Trp Val Ser Asp Tyr Trp Val Ser
1 5 15
<210> 2 <210> 2
<211> 15 <211> 15
<212> PRT <212> PRT
<213> rat <213> rat
<400> 2 <400> 2
Glu Ile Ser Pro Asn Ser Gly Ala Ser Asn Phe Asp Glu Asn Phe Glu Ile Ser Pro Asn Ser Gly Ala Ser Asn Phe Asp Glu Asn Phe
1 5 10 15 1 5 10 15
<210> 3 <210> 3
<211> 11 <211> 11
<212> PRT <212> PRT
<213> rat <213> rat
<400> 3 <400> 3
Ser Ser His Gly Ser Phe Arg Trp Phe Ala Tyr Ser Ser His Gly Ser Phe Arg Trp Phe Ala Tyr
1 5 10 1 5 10
<210> 4 <210> 4
<211> 12 <211> 12
<212> PRT <212> PRT
<213> rat <213> rat
<400> 4 <400> 4
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Asn His Leu His Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Asn His Leu His
1 5 10 1 5 10
<210> 5 <210> 5
<211> 7 <211> 7
<212> PRT <212> PRT
<213> rat <213> rat
<400> 5 <400> 5
Ser Thr Ser Gln Arg Ala Ser Ser Thr Ser Gln Arg Ala Ser
1 5 15
<210> 6 <210> 6
<211> 9 <211> 9
<212> PRT <212> PRT
<213> rat <213> rat
<400> 6 <400> 6
Gln Gln Gly Ser Ser Asn Pro Tyr Thr Gln Gln Gly Ser Ser Asn Pro Tyr Thr
1 5 15
<210> 7 <210> 7
<211> 120 <211> 120
<212> PRT <212> PRT
<213> rat <213> rat
<400> 7 <400> 7
Gln Val Lys Leu Met Gln Ser Gly Ala Ala Leu Val Lys Pro Gly Thr Gln Val Lys Leu Met Gln Ser Gly Ala Ala Leu Val Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Asn Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Val Lys Met Ser Cys Asn Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Trp Val Ser Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val Trp Val Ser Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Gly Glu Ile Ser Pro Asn Ser Gly Ala Ser Asn Phe Asp Glu Asn Phe Gly Glu Ile Ser Pro Asn Ser Gly Ala Ser Asn Phe Asp Glu Asn Phe
50 55 60 50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Thr Arg Ser Ser His Gly Ser Phe Arg Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Thr Arg Ser Ser His Gly Ser Phe Arg Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 115 120
<210> 8 <210> 8
<211> 108 <211> 108
<212> PRT <212> PRT
<213> rat <213> rat
<400> 8 <400> 8
Ala Ile Val Leu Asn Gln Ser Pro Ser Ser Ile Val Ala Ser Gln Gly Ala Ile Val Leu Asn Gln Ser Pro Ser Ser Ile Val Ala Ser Gln Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Asn Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30 20 25 30
His Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ala Phe Pro Lys Phe Val His Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ala Phe Pro Lys Phe Val
35 40 45 35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Gln Arg Ala Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Ile Tyr Ser Thr Ser Gln Arg Ala Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Phe Thr Ile Ser Arg Val Glu Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Phe Thr Ile Ser Arg Val Glu
65 70 75 80 65 70 75 80
Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ser Asn Pro Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ser Asn Pro
85 90 95 85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 100 105
<210> 9 <210> 9
<211> 5 <211> 5
<212> PRT <212> PRT
<213> human <213> human
<400> 9 <400> 9
Ser Tyr Ala Met Asn Ser Tyr Ala Met Asn
1 5 15
<210> 10 <210> 10
<211> 17 <211> 17
<212> PRT <212> PRT
<213> human <213> human
<400> 10 <400> 10
Val Ile Ser Gly Ser Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Val Ile Ser Gly Ser Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15 1 5 10 15
Gly gly
< <
210> 11 210>11
<211> 14 <211> 14
<212> PRT <212> PRT
<213> human <213> human
<400> 11 <400> 11
Asp Gly Ser Tyr Asn Tyr Gly Tyr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Asp Gly Ser Tyr Asn Tyr Gly Tyr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10 1 5 10
<210> 12 <210> 12
<211> 17 <211> 17
<212> PRT <212> PRT
<213> human <213> human
<400> 12 <400> 12
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Lys Asn Lys Asn Tyr Leu Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Lys Asn Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15 1 5 10 15
Ala Ala
<210> 13 <210> 13
<211> 7 <211> 7
<212> PRT <212> PRT
<213> human <213> human
<400> 13 <400> 13
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5 15
<210> 14 <210> 14
<211> 9 <211> 9
<212> PRT <212> PRT
<213> human <213> human
<400> 14 <400> 14
Gln Gln Tyr Tyr Asn Thr Pro Arg Thr Gln Gln Tyr Tyr Asn Thr Pro Arg Thr
1 5 15
<210> 15 <210> 15
<211> 123 <211> 123
<212> PRT <212> PRT
<213> human <213> human
<400> 15 <400> 15
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30 20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ser Val Ile Ser Gly Ser Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Ser Val Ile Ser Gly Ser Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Ser Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Ser
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Lys Asp Gly Ser Tyr Asn Tyr Gly Tyr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Ala Lys Asp Gly Ser Tyr Asn Tyr Gly Tyr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110 100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 115 120
<210> 16 <210> 16
<211> 113 <211> 113
<212> PRT <212> PRT
<213> human <213> human
<400> 16 <400> 16
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30 20 25 30
Ser Lys Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Lys Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45 35 40 45
Pro Pro Lys Leu Phe Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Pro Lys Leu Phe Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80 65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95 85 90 95
Tyr Tyr Asn Thr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Tyr Tyr Asn Thr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110 100 105 110
Lys Lys
<210> 17 <210> 17
<211> 5 <211> 5
<212> PRT <212> PRT
<213> human <213> human
<400> 17 <400> 17
Thr Tyr Gly Met Ser Thr Tyr Gly Met Ser
1 5 15
<210> 18 <210> 18
<211> 17 <211> 17
<212> PRT <212> PRT
<213> human <213> human
<400> 18 <400> 18
Val Ile Ser Gly Gly Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Val Ile Ser Gly Gly Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15 1 5 10 15
Gly gly
<210> 19 <210> 19
<211> 14 <211> 14
<212> PRT <212> PRT
<213> human <213> human
<400> 19 <400> 19
Asp Gly Ser Tyr Asn Tyr Gly Tyr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Asp Gly Ser Tyr Asn Tyr Gly Tyr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10 1 5 10
<210> 20 <210> 20
<211> 17 <211> 17
<212> PRT <212> PRT
<213> human <213> human
<400> 20 <400> 20
Lys Ser Ser Gln Asn Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Lys Ser Ser Gln Asn Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15 1 5 10 15
Ala Ala
<210> 21 <210> 21
<211> 7 <211> 7
<212> PRT <212> PRT
<213> human <213> human
<400> 21 <400> 21
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5 15
<210> 22 <210> 22
<211> 9 <211> 9
<212> PRT <212> PRT
<213> human <213> human
<400> 22 <400> 22
Gln Gln Tyr Tyr Asn Thr Pro Arg Thr Gln Gln Tyr Tyr Asn Thr Pro Arg Thr
1 5 15
<210> 23 <210> 23
<211> 123 <211> 123
<212> PRT <212> PRT
<213> human <213> human
<400> 23 <400> 23
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30 20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ser Val Ile Ser Gly Gly Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Ser Val Ile Ser Gly Gly Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Lys Asp Gly Ser Tyr Asn Tyr Gly Tyr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Ala Lys Asp Gly Ser Tyr Asn Tyr Gly Tyr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110 100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 115 120
<210> 24 <210> 24
<211> 113 <211> 113
<212> PRT <212> PRT
<213> human <213> human
<400> 24 <400> 24
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
G G
lu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Asn Val Leu Tyr Ser lu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Asn Val Leu Tyr Ser
20 25 30 20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45 35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80 65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95 85 90 95
Tyr Tyr Asn Thr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Tyr Tyr Asn Thr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110 100 105 110
Lys Lys
<210> 25 <210> 25
<211> 7 <211> 7
<212> PRT <212> PRT
<213> human <213> human
<400> 25 <400> 25
Ser Asn Arg Ala Ala Trp Asn Ser Asn Arg Ala Ala Trp Asn
1 5 15
<210> 26 <210> 26
<211> 18 <211> 18
<212> PRT <212> PRT
<213> human <213> human
<400> 26 <400> 26
Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val
1 5 10 15 1 5 10 15
Gln Gly Gln Gly
<210> 27 <210> 27
<211> 9 <211> 9
<212> PRT <212> PRT
<213> human <213> human
<400> 27 <400> 27
Val Arg Ala Val Ala Pro Phe Asp Tyr Val Arg Ala Val Ala Pro Phe Asp Tyr
1 5 15
<210> 28 <210> 28
<211> 17 <211> 17
<212> PRT <212> PRT
<213> human <213> human
<400> 28 <400> 28
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asn Ser Ser Asn Asn Lys Asn Asn Leu Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asn Ser Ser Asn Asn Lys Asn Asn Leu
1 5 10 15 1 5 10 15
Ala Ala
<210> 29 <210> 29
<211> 7 <211> 7
<212> PRT <212> PRT
<213> human <213> human
<400> 29 <400> 29
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5 15
<210> 30 <210> 30
<211> 9 <211> 9
<212> PRT <212> PRT
<213> human <213> human
<400> 30 <400> 30
Gln Gln Tyr Tyr Arg Thr Pro Trp Thr Gln Gln Tyr Tyr Arg Thr Pro Trp Thr
1 5 15
<210> 31 <210> 31
<211> 121 <211> 121
<212> PRT <212> PRT
<213> human <213> human
<400> 31 <400> 31
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gln Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30 20 25 30
Arg Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Arg Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45 35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60 50 55 60
Val Ser Val Gln Gly Arg Ile Thr Leu Ile Pro Asp Thr Ser Lys Asn Val Ser Val Gln Gly Arg Ile Thr Leu Ile Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80 65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Arg Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Gln Phe Ser Leu Arg Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95 85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Ser Val Arg Ala Val Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Tyr Tyr Cys Ala Ser Val Arg Ala Val Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110 100 105 110
Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 115 120
<210> 32 <210> 32
<211> 113 <211> 113
<212> PRT <212> PRT
<213> human <213> human
<400> 32 <400> 32
A A
sp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly sp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asn Ser Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asn Ser
20 25 30 20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Gly Gln Ser Asn Asn Lys Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Gly Gln
35 40 45 35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80 65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95 85 90 95
Tyr Tyr Arg Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Tyr Tyr Arg Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110 100 105 110
Lys Lys
<210> 33 <210> 33
<211> 120 <211> 120
<212> PRT <212> PRT
<213> artificial <213> artificial
<220> <220>
<223> humanized variant heavy chain variable domain VH, HLA-G-0031-0104 <223> humanized variant heavy chain variable domain VH, HLA-G-0031-0104
(HLA-G-0104) (HLA-G-0104)
<400> 33 <400> 33
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Trp Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Trp Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Glu Trp Met
35 40 45 35 40 45
Gly Glu Ile Ser Pro Asn Ser Gly Ala Ser Asn Phe Asp Glu Asn Phe Gly Glu Ile Ser Pro Asn Ser Gly Ala Ser Asn Phe Asp Glu Asn Phe
50 55 60 50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Thr Arg Ser Ser His Gly Ser Phe Arg Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Thr Arg Ser Ser His Gly Ser Phe Arg Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 115 120
<210> 34 <210> 34
<211> 108 <211> 108
<212> PRT <212> PRT
<213> artificial <213> artificial
<220> <220>
<223> humanized variant light chain variable domain VL, HLA-G-0031-0104 <223> humanized variant light chain variable domain VL, HLA-G-0031-0104
(HLA-G-0104) (HLA-G-0104)
<400> 34 <400> 34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Asn Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30 20 25 30
His Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu His Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu
35 40 45 35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Gln Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ile Tyr Ser Thr Ser Gln Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ser Asn Pro Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ser Asn Pro
85 90 95 85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Tyr Thr Phe Gly Glyn Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 100 105
<210> 35 <210> 35
<211> 314 <211> 314
<212> PRT <212> PRT
<213> homo sapiens <213> homo sapiens
<400> 35 <400> 35
Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Gly Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln
20 25 30 20 25 30
Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser Ala Cys Pro Arg Met Glu Pro Arg Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser Ala Cys Pro Arg Met Glu Pro Arg
35 40 45 35 40 45
Ala Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Glu Thr Ala Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Glu Thr
50 55 60 50 55 60
Arg Asn Thr Lys Ala His Ala Gln Thr Asp Arg Met Asn Leu Gln Thr Arg Asn Thr Lys Ala His Ala Gln Thr Asp Arg Met Asn Leu Gln Thr
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Ser Ser His Thr Leu Gln Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Ser Ser His Thr Leu Gln
85 90 95 85 90 95
Trp Met Ile Gly Cys Asp Leu Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Trp Met Ile Gly Cys Asp Leu Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly
100 105 110 100 105 110
Tyr Glu Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Ala Leu Asn Glu Tyr Glu Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Ala Leu Asn Glu
115 120 125 115 120 125
Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Lys Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Lys
130 135 140 130 135 140
Arg Lys Cys Glu Ala Ala Asn Val Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr Leu Arg Lys Cys Glu Ala Ala Asn Val Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr Leu
145 150 155 160 145 150 155 160
Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu His Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu His Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys
165 170 175 165 170 175
Glu Met Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His Glu Met Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His
180 185 190 180 185 190
Pro Val Phe Asp Tyr Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Pro Val Phe Asp Tyr Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe
195 200 205 195 200 205
Tyr Pro Ala Glu Ile Ile Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Tyr Pro Ala Glu Ile Ile Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln
210 215 220 210 215 220
Thr Gln Asp Val Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Thr Gln Asp Val Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr
225 230 235 240 225 230 235 240
Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg
245 250 255 245 250 255
Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Met Leu Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Met Leu
260 265 270 260 265 270
Arg Trp Lys Gln Ser Ser Leu Pro Thr Ile Pro Ile Met Gly Ile Val Arg Trp Lys Gln Ser Ser Leu Pro Thr Ile Pro Ile Met Gly Ile Val
275 280 285 275 280 285
Ala Gly Leu Val Val Leu Ala Ala Val Val Thr Gly Ala Ala Val Ala Ala Gly Leu Val Val Leu Ala Ala Val Val Thr Gly Ala Ala Val Ala
290 295 300 290 295 300
Ala Val Leu Trp Arg Lys Lys Ser Ser Asp Ala Val Leu Trp Arg Lys Lys Ser Ser Asp
305 310 305 310
<210> 36 <210> 36
<211> 274 <211> 274
<212> PRT <212> PRT
<213> homo sapiens <213> homo sapiens
<400> 36 <400> 36
Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Gly Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln
20 25 30 20 25 30
Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser Ala Cys Pro Arg Met Glu Pro Arg Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser Ala Cys Pro Arg Met Glu Pro Arg
35 40 45 35 40 45
Ala Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Glu Thr Ala Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Glu Thr
50 55 60 50 55 60
Arg Asn Thr Lys Ala His Ala Gln Thr Asp Arg Met Asn Leu Gln Thr Arg Asn Thr Lys Ala His Ala Gln Thr Asp Arg Met Asn Leu Gln Thr
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Ser Ser His Thr Leu Gln Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Ser Ser His Thr Leu Gln
85 90 95 85 90 95
Trp Met Ile Gly Cys Asp Leu Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Trp Met Ile Gly Cys Asp Leu Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly
100 105 110 100 105 110
Tyr Glu Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Ala Leu Asn Glu Tyr Glu Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Ala Leu Asn Glu
115 120 125 115 120 125
Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Lys Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Lys
130 135 140 130 135 140
Arg Lys Cys Glu Ala Ala Asn Val Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr Leu Arg Lys Cys Glu Ala Ala Asn Val Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr Leu
145 150 155 160 145 150 155 160
Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu His Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu His Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys
165 170 175 165 170 175
Glu Met Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His Glu Met Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His
180 185 190 180 185 190
Pro Val Phe Asp Tyr Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Pro Val Phe Asp Tyr Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe
195 200 205 195 200 205
Tyr Pro Ala Glu Ile Ile Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Tyr Pro Ala Glu Ile Ile Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln
210 215 220 210 215 220
Thr Gln Asp Val Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Thr Gln Asp Val Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr
225 230 235 240 225 230 235 240
Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg
245 250 255 245 250 255
Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Met Leu Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Met Leu
260 265 270 260 265 270
Arg Trp Arg Trp
<210> 37 <210> 37
<211> 99 <211> 99
<212> PRT <212> PRT
<213> homo sapiens <213> homo sapiens
<400> 37 <400> 37
I I
le Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu le Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu
1 5 10 15 1 5 10 15
Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro
20 25 30 20 25 30
Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys
35 40 45 35 40 45
Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu
50 55 60 50 55 60
Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys
65 70 75 80 65 70 75 80
Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp
85 90 95 85 90 95
Arg Asp Met Arg Asp Met
<210> 38 <210> 38
<211> 275 <211> 275
<212> PRT <212> PRT
<213> Artificial <213> Artificial
<220> <220>
<223> modified human HLA-G (wherein the HLA-G specific amino acids have <223> modified human HLA-G (wherein the HLA-G specific amino acids have
been replaced by HLA-A consensus amino acids (= degrafted HLA-G) been replaced by HLA-A consensus amino acids (= degrafted HLA-G)
ECD ECD
<400> 38 <400> 38
Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Gly Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln
20 25 30 20 25 30
Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Pro Arg Met Glu Pro Arg Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Pro Arg Met Glu Pro Arg
35 40 45 35 40 45
Ala Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Glu Glu Thr Ala Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Glu Glu Thr
50 55 60 50 55 60
Arg Asn Thr Lys Ala His Ala Gln Thr Asp Arg Val Asn Leu Gly Thr Arg Asn Thr Lys Ala His Ala Gln Thr Asp Arg Val Asn Leu Gly Thr
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Leu Gln Leu Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Leu Gln
85 90 95 85 90 95
Trp Met Ile Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Trp Met Ile Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly
100 105 110 100 105 110
Tyr Glu Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Ala Leu Asn Glu Tyr Glu Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Ala Leu Asn Glu
115 120 125 115 120 125
Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Lys Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Lys
130 135 140 130 135 140
Arg Lys Cys Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr Leu Arg Lys Cys Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr Leu
145 150 155 160 145 150 155 160
Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys
165 170 175 165 170 175
Glu Thr Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His Glu Thr Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His
180 185 190 180 185 190
Pro Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Pro Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe
195 200 205 195 200 205
Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln
210 215 220 210 215 220
Thr Gln Asp Val Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Thr Gln Asp Val Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr
225 230 235 240 225 230 235 240
Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg
245 250 255 245 250 255
Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Thr Leu Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Thr Leu
260 265 270 260 265 270
Arg Trp Lys Arg Trp Lys
275 275
<210> 39 <210> 39
<211> 341 <211> 341
<212> PRT <212> PRT
<213> homo sapiens <213> homo sapiens
<400> 39 <400> 39
Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln
20 25 30 20 25 30
Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg
35 40 45 35 40 45
Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr
50 55 60 50 55 60
Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln
85 90 95 85 90 95
Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly
100 105 110 100 105 110
Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu
115 120 125 115 120 125
Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys
130 135 140 130 135 140
His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu
145 150 155 160 145 150 155 160
Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys
165 170 175 165 170 175
Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His
180 185 190 180 185 190
Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe
195 200 205 195 200 205
Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln
210 215 220 210 215 220
Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr
225 230 235 240 225 230 235 240
Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg
245 250 255 245 250 255
Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu
260 265 270 260 265 270
Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro Thr Ile Pro Ile Val Gly Ile Ile Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro Thr Ile Pro Ile Val Gly Ile Ile
275 280 285 275 280 285
Ala Gly Leu Val Leu Phe Gly Ala Val Ile Thr Gly Ala Val Val Ala Ala Gly Leu Val Leu Phe Gly Ala Val Ile Thr Gly Ala Val Val Ala
290 295 300 290 295 300
Ala Val Met Trp Arg Arg Lys Ser Ser Asp Arg Lys Gly Gly Ser Tyr Ala Val Met Trp Arg Arg Lys Ser Ser Asp Arg Lys Gly Gly Ser Tyr
305 310 315 320 305 310 315 320
Ser Gln Ala Ala Ser Ser Asp Ser Ala Gln Gly Ser Asp Val Ser Leu Ser Gln Ala Ala Ser Ser Asp Ser Ala Gln Gly Ser Asp Val Ser Leu
325 330 335 325 330 335
Thr Ala Cys Lys Val Thr Ala Cys Lys Val
340 340
<210> 40 <210> 40
<211> 275 <211> 275
<212> PRT <212> PRT
<213> homo sapiens <213> homo sapiens
<400> 40 <400> 40
Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln
20 25 30 20 25 30
Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg
35 40 45 35 40 45
Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr
50 55 60 50 55 60
Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln
85 90 95 85 90 95
Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly
100 105 110 100 105 110
Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu
115 120 125 115 120 125
Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys
130 135 140 130 135 140
His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu
145 150 155 160 145 150 155 160
Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys
165 170 175 165 170 175
Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His
180 185 190 180 185 190
Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe
195 200 205 195 200 205
Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln
210 215 220 210 215 220
Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr
225 230 235 240 225 230 235 240
Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg
245 250 255 245 250 255
Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu
260 265 270 260 265 270
Arg Trp Glu Arg Trp Glu
275 275
<210> 41 <210> 41
<211> 275 <211> 275
<212> PRT <212> PRT
<213> mus musculus <213> mus musculus
<400> 41 <400> 41
Gly Pro His Ser Leu Arg Tyr Phe Val Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly Gly Pro His Ser Leu Arg Tyr Phe Val Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Leu Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Leu Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln
20 25 30 20 25 30
Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Asp Asn Pro Arg Phe Glu Pro Arg Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Asp Asn Pro Arg Phe Glu Pro Arg
35 40 45 35 40 45
Ala Pro Trp Met Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Gln Thr Ala Pro Trp Met Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Gln Thr
50 55 60 50 55 60
Gln Arg Ala Lys Ser Asp Glu Gln Trp Phe Arg Val Ser Leu Arg Thr Gln Arg Ala Lys Ser Asp Glu Gln Trp Phe Arg Val Ser Leu Arg Thr
65 70 75 80 65 70 75 80
Ala Gln Arg Cys Tyr Asn Gln Ser Lys Gly Gly Ser His Thr Phe Gln Ala Gln Arg Cys Tyr Asn Gln Ser Lys Gly Gly Ser His Thr Phe Gln
85 90 95 85 90 95
Arg Met Phe Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Leu Leu Arg Gly Arg Met Phe Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Leu Leu Arg Gly
100 105 110 100 105 110
Tyr Gln Gln Phe Ala Tyr Asp Gly Arg Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Tyr Gln Gln Phe Ala Tyr Asp Gly Arg Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu
115 120 125 115 120 125
Asp Leu Lys Thr Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Leu Ile Thr Arg Asp Leu Lys Thr Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Leu Ile Thr Arg
130 135 140 130 135 140
Arg Lys Trp Glu Gln Ala Gly Asp Ala Glu Tyr Tyr Arg Ala Tyr Leu Arg Lys Trp Glu Gln Ala Gly Asp Ala Glu Tyr Tyr Arg Ala Tyr Leu
145 150 155 160 145 150 155 160
Glu Gly Glu Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Leu Gly Asn Glu Gly Glu Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Leu Gly Asn
165 170 175 165 170 175
Glu Thr Leu Leu Arg Thr Asp Ser Pro Lys Ala His Val Thr Tyr His Glu Thr Leu Leu Arg Thr Asp Ser Pro Lys Ala His Val Thr Tyr His
180 185 190 180 185 190
Pro Arg Ser Gln Val Asp Val Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Pro Arg Ser Gln Val Asp Val Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe
195 200 205 195 200 205
Tyr Pro Ala Asp Ile Thr Leu Thr Trp Gln Leu Asn Gly Glu Asp Leu Tyr Pro Ala Asp Ile Thr Leu Thr Trp Gln Leu Asn Gly Glu Asp Leu
210 215 220 210 215 220
Thr Gln Asp Met Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Thr Gln Asp Met Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr
225 230 235 240 225 230 235 240
Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Leu Gly Lys Glu Gln Asn Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Leu Gly Lys Glu Gln Asn
245 250 255 245 250 255
Tyr Thr Cys His Val His His Lys Gly Leu Pro Glu Pro Leu Thr Leu Tyr Thr Cys His Val His His Lys Gly Leu Pro Glu Pro Leu Thr Leu
260 265 270 260 265 270
Arg Trp Lys Arg Trp Lys
275 275
<210> 42 <210> 42
<211> 274 <211> 274
<212> PRT <212> PRT
<213> rat <213> rat
<400> 42 <400> 42
Gly Ser His Ser Leu Arg Tyr Phe Tyr Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly Gly Ser His Ser Leu Arg Tyr Phe Tyr Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Leu Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Glu Leu Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Glu
20 25 30 20 25 30
Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Glu Asn Pro Arg Met Glu Pro Arg Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Glu Asn Pro Arg Met Glu Pro Arg
35 40 45 35 40 45
Ala Arg Trp Met Glu Arg Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Gln Gln Thr Ala Arg Trp Met Glu Arg Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Gln Gln Thr
50 55 60 50 55 60
Arg Ile Ala Lys Glu Trp Glu Gln Ile Tyr Arg Val Asp Leu Arg Thr Arg Ile Ala Lys Glu Trp Glu Gln Ile Tyr Arg Val Asp Leu Arg Thr
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Gly Gly Ser His Thr Ile Gln Leu Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Gly Gly Ser His Thr Ile Gln
85 90 95 85 90 95
Glu Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Gly Ser Leu Leu Arg Gly Glu Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Gly Ser Leu Leu Arg Gly
100 105 110 100 105 110
Tyr Arg Gln Asp Ala Tyr Asp Gly Arg Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Tyr Arg Gln Asp Ala Tyr Asp Gly Arg Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu
115 120 125 115 120 125
Asp Leu Lys Thr Trp Thr Ala Ala Asp Phe Ala Ala Gln Ile Thr Arg Asp Leu Lys Thr Trp Thr Ala Ala Asp Phe Ala Ala Gln Ile Thr Arg
130 135 140 130 135 140
Asn Lys Trp Glu Arg Ala Arg Tyr Ala Glu Arg Leu Arg Ala Tyr Leu Asn Lys Trp Glu Arg Ala Arg Tyr Ala Glu Arg Leu Arg Ala Tyr Leu
145 150 155 160 145 150 155 160
Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Ser Arg Tyr Leu Glu Leu Gly Lys Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Ser Arg Tyr Leu Glu Leu Gly Lys
165 170 175 165 170 175
Glu Thr Leu Leu Arg Ser Asp Pro Pro Glu Ala His Val Thr Leu His Glu Thr Leu Leu Arg Ser Asp Pro Pro Glu Ala His Val Thr Leu His
180 185 190 180 185 190
Pro Arg Pro Glu Gly Asp Val Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Pro Arg Pro Glu Gly Asp Val Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe
195 200 205 195 200 205
Tyr Pro Ala Asp Ile Thr Leu Thr Trp Gln Leu Asn Gly Glu Asp Leu Tyr Pro Ala Asp Ile Thr Leu Thr Trp Gln Leu Asn Gly Glu Asp Leu
210 215 220 210 215 220
Thr Gln Asp Met Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Thr Gln Asp Met Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr
225 230 235 240 225 230 235 240
Phe Gln Lys Trp Ala Ser Val Val Val Pro Leu Gly Lys Glu Gln Asn Phe Gln Lys Trp Ala Ser Val Val Val Pro Leu Gly Lys Glu Gln Asn
245 250 255 245 250 255
Tyr Thr Cys Arg Val Glu His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Ser Gln Tyr Thr Cys Arg Val Glu His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Ser Gln
260 265 270 260 265 270
Arg Trp Arg Trp
<210> 43 <210> 43
<211> 440 <211> 440
<212> PRT <212> PRT
<213> homo sapiens <213> homo sapiens
<400> 43 <400> 43
Arg Ile Ile Pro Arg His Leu Gln Leu Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly Arg Ile Ile Pro Arg His Leu Gln Leu Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln
20 25 30 20 25 30
Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn
35 40 45 35 40 45
Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu
50 55 60 50 55 60
Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe
65 70 75 80 65 70 75 80
Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro
85 90 95 85 90 95
Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser
100 105 110 100 105 110
Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125 115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140 130 135 140
Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Gly Arg Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Gly Arg
145 150 155 160 145 150 155 160
Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe
165 170 175 165 170 175
Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser Ala Cys Pro Arg Met Glu Pro Arg Ala Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser Ala Cys Pro Arg Met Glu Pro Arg Ala
180 185 190 180 185 190
Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Glu Thr Arg Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Glu Thr Arg
195 200 205 195 200 205
Asn Thr Lys Ala His Ala Gln Thr Asp Arg Met Asn Leu Gln Thr Leu Asn Thr Lys Ala His Ala Gln Thr Asp Arg Met Asn Leu Gln Thr Leu
210 215 220 210 215 220
Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Ser Ser His Thr Leu Gln Trp Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Ser Ser His Thr Leu Gln Trp
225 230 235 240 225 230 235 240
Met Ile Gly Cys Asp Leu Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr Met Ile Gly Cys Asp Leu Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr
245 250 255 245 250 255
Glu Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Ala Leu Asn Glu Asp Glu Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Ala Leu Asn Glu Asp
260 265 270 260 265 270
Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Lys Arg Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Lys Arg
275 280 285 275 280 285
Lys Cys Glu Ala Ala Asn Val Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr Leu Glu Lys Cys Glu Ala Ala Asn Val Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr Leu Glu
290 295 300 290 295 300
Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu His Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu His Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320 305 310 315 320
Met Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro Met Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro
325 330 335 325 330 335
Val Phe Asp Tyr Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Val Phe Asp Tyr Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr
340 345 350 340 345 350
Pro Ala Glu Ile Ile Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Pro Ala Glu Ile Ile Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr
355 360 365 355 360 365
Gln Asp Val Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Asp Val Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe
370 375 380 370 375 380
Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr
385 390 395 400 385 390 395 400
Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Met Leu Arg Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Met Leu Arg
405 410 415 405 410 415
Trp Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp Trp Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp
420 425 430 420 425 430
His Glu His His His His His His His Glu His His His His His His His
435 440 435 440
<210> 44 <210> 44
<211> 441 <211> 441
<212> PRT <212> PRT
<213> Artificial <213> Artificial
<220> <220>
<223> exemplary modified human HLA-G β2M MHC class I complex (wherein <223> exemplary modified human HLA-G β2M MHC class I complex (wherein
the HLA-G specific amino acids have been replaced by HLA-A the HLA-G specific amino acids have been replaced by HLA-A
consensus amino acids (= degrafted HLA-G) consensus amino acids (= degrafted HLA-G)
<400> 44 <400> 44
Arg Ile Ile Pro Arg His Leu Gln Leu Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly Arg Ile Ile Pro Arg His Leu Gln Leu Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln
20 25 30 20 25 30
Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn
35 40 45 35 40 45
Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu
50 55 60 50 55 60
Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe
65 70 75 80 65 70 75 80
Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro
85 90 95 85 90 95
Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser
100 105 110 100 105 110
Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125 115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140 130 135 140
Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Gly Arg Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Gly Arg
145 150 155 160 145 150 155 160
Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe
165 170 175 165 170 175
Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Pro Arg Met Glu Pro Arg Ala Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Pro Arg Met Glu Pro Arg Ala
180 185 190 180 185 190
Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Glu Glu Thr Arg Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Glu Glu Thr Arg
195 200 205 195 200 205
Asn Thr Lys Ala His Ala Gln Thr Asp Arg Val Asn Leu Gly Thr Leu Asn Thr Lys Ala His Ala Gln Thr Asp Arg Val Asn Leu Gly Thr Leu
210 215 220 210 215 220
Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Leu Gln Trp Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Leu Gln Trp
225 230 235 240 225 230 235 240
Met Ile Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr Met Ile Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr
245 250 255 245 250 255
Glu Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Ala Leu Asn Glu Asp Glu Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Ala Leu Asn Glu Asp
260 265 270 260 265 270
Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Lys Arg Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Lys Arg
275 280 285 275 280 285
Lys Cys Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr Leu Glu Lys Cys Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr Leu Glu
290 295 300 290 295 300
Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320 305 310 315 320
Thr Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro Thr Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro
325 330 335 325 330 335
Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr
340 345 350 340 345 350
Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr
355 360 365 355 360 365
Gln Asp Val Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Asp Val Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe
370 375 380 370 375 380
Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr
385 390 395 400 385 390 395 400
Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Thr Leu Arg Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Thr Leu Arg
405 410 415 405 410 415
Trp Lys Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp Lys Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu
420 425 430 420 425 430
Trp His Glu His His His His His His Trp His Glu His His His His His His His
435 440 435 440
<210> 45 <210> 45
<211> 441 <211> 441
<212> PRT <212> PRT
<213> mus musculus <213> mus musculus
<400> 45 <400> 45
Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Lys Thr Pro Gln Ile Gln Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Lys Thr Pro Gln Ile Gln
20 25 30 20 25 30
Val Tyr Ser Arg His Pro Pro Glu Asn Gly Lys Pro Asn Ile Leu Asn Val Tyr Ser Arg His Pro Pro Glu Asn Gly Lys Pro Asn Ile Leu Asn
35 40 45 35 40 45
Cys Tyr Val Thr Gln Phe His Pro Pro His Ile Glu Ile Gln Met Leu Cys Tyr Val Thr Gln Phe His Pro Pro His Ile Glu Ile Gln Met Leu
50 55 60 50 55 60
Lys Asn Gly Lys Lys Ile Pro Lys Val Glu Met Ser Asp Met Ser Phe Lys Asn Gly Lys Lys Ile Pro Lys Val Glu Met Ser Asp Met Ser Phe
65 70 75 80 65 70 75 80
Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Ile Leu Ala His Thr Glu Phe Thr Pro Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Ile Leu Ala His Thr Glu Phe Thr Pro
85 90 95 85 90 95
Thr Glu Thr Asp Thr Tyr Ala Cys Arg Val Lys His Asp Ser Met Ala Thr Glu Thr Asp Thr Tyr Ala Cys Arg Val Lys His Asp Ser Met Ala
100 105 110 100 105 110
Glu Pro Lys Thr Val Tyr Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Thr Val Tyr Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125 115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140 130 135 140
Pro His Ser Leu Arg Tyr Phe Val Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly Leu Pro His Ser Leu Arg Tyr Phe Val Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly Leu
145 150 155 160 145 150 155 160
Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe
165 170 175 165 170 175
Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Asp Asn Pro Arg Phe Glu Pro Arg Ala Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Asp Asn Pro Arg Phe Glu Pro Arg Ala
180 185 190 180 185 190
Pro Trp Met Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Gln Thr Gln Pro Trp Met Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Gln Thr Gln
195 200 205 195 200 205
Arg Ala Lys Ser Asp Glu Gln Trp Phe Arg Val Ser Leu Arg Thr Ala Arg Ala Lys Ser Asp Glu Gln Trp Phe Arg Val Ser Leu Arg Thr Ala
210 215 220 210 215 220
Gln Arg Cys Tyr Asn Gln Ser Lys Gly Gly Ser His Thr Phe Gln Arg Gln Arg Cys Tyr Asn Gln Ser Lys Gly Gly Ser His Thr Phe Gln Arg
225 230 235 240 225 230 235 240
Met Phe Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Leu Leu Arg Gly Tyr Met Phe Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Leu Leu Arg Gly Tyr
245 250 255 245 250 255
Gln Gln Phe Ala Tyr Asp Gly Arg Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp Gln Gln Phe Ala Tyr Asp Gly Arg Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp
260 265 270 260 265 270
Leu Lys Thr Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Leu Ile Thr Arg Arg Leu Lys Thr Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Leu Ile Thr Arg Arg
275 280 285 275 280 285
Lys Trp Glu Gln Ala Gly Asp Ala Glu Tyr Tyr Arg Ala Tyr Leu Glu Lys Trp Glu Gln Ala Gly Asp Ala Glu Tyr Tyr Arg Ala Tyr Leu Glu
290 295 300 290 295 300
Gly Glu Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Leu Gly Asn Glu Gly Glu Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Leu Gly Asn Glu
305 310 315 320 305 310 315 320
Thr Leu Leu Arg Thr Asp Ser Pro Lys Ala His Val Thr Tyr His Pro Thr Leu Leu Arg Thr Asp Ser Pro Lys Ala His Val Thr Tyr His Pro
325 330 335 325 330 335
Arg Ser Gln Val Asp Val Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Arg Ser Gln Val Asp Val Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr
340 345 350 340 345 350
Pro Ala Asp Ile Thr Leu Thr Trp Gln Leu Asn Gly Glu Asp Leu Thr Pro Ala Asp Ile Thr Leu Thr Trp Gln Leu Asn Gly Glu Asp Leu Thr
355 360 365 355 360 365
Gln Asp Met Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Asp Met Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe
370 375 380 370 375 380
Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Leu Gly Lys Glu Gln Asn Tyr Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Leu Gly Lys Glu Gln Asn Tyr
385 390 395 400 385 390 395 400
Thr Cys His Val His His Lys Gly Leu Pro Glu Pro Leu Thr Leu Arg Thr Cys His Val His His Lys Gly Leu Pro Glu Pro Leu Thr Leu Arg
405 410 415 405 410 415
Trp Lys Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp Lys Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu
420 425 430 420 425 430
Trp His Glu His His His His His His Trp His Glu His His His His His His His
435 440 435 440
<210> 46 <210> 46
<211> 441 <211> 441
<212> PRT <212> PRT
<213> Artificial <213> Artificial
<220> <220>
<223> exemplary human HLA-G/ mouse H2Kd β2M MHC class I complex wherein <223> exemplary human HLA-G/ mouse H2Kd β2M MHC class I complex condition
the positions specific for human HLA-G are grafted onto the mouse the positions specific for human HLA-G are grafted onto the mouse
H2Kd framework H2Kd framework
<400> 46 <400> 46
Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Lys Thr Pro Gln Ile Gln Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Lys Thr Pro Gln Ile Gln
20 25 30 20 25 30
Val Tyr Ser Arg His Pro Pro Glu Asn Gly Lys Pro Asn Ile Leu Asn Val Tyr Ser Arg His Pro Pro Glu Asn Gly Lys Pro Asn Ile Leu Asn
35 40 45 35 40 45
Cys Tyr Val Thr Gln Phe His Pro Pro His Ile Glu Ile Gln Met Leu Cys Tyr Val Thr Gln Phe His Pro Pro His Ile Glu Ile Gln Met Leu
50 55 60 50 55 60
Lys Asn Gly Lys Lys Ile Pro Lys Val Glu Met Ser Asp Met Ser Phe Lys Asn Gly Lys Lys Ile Pro Lys Val Glu Met Ser Asp Met Ser Phe
65 70 75 80 65 70 75 80
Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Ile Leu Ala His Thr Glu Phe Thr Pro Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Ile Leu Ala His Thr Glu Phe Thr Pro
85 90 95 85 90 95
Thr Glu Thr Asp Thr Tyr Ala Cys Arg Val Lys His Asp Ser Met Ala Thr Glu Thr Asp Thr Tyr Ala Cys Arg Val Lys His Asp Ser Met Ala
100 105 110 100 105 110
Glu Pro Lys Thr Val Tyr Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Thr Val Tyr Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125 115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140 130 135 140
Pro His Ser Leu Arg Tyr Phe Val Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly Leu Pro His Ser Leu Arg Tyr Phe Val Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly Leu
145 150 155 160 145 150 155 160
Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe
165 170 175 165 170 175
Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser Ala Ser Pro Arg Phe Glu Pro Arg Ala Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser Ala Ser Pro Arg Phe Glu Pro Arg Ala
180 185 190 180 185 190
Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Gln Thr Gln Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Gln Thr Gln
195 200 205 195 200 205
Arg Ala Lys Ser Asp Glu Gln Trp Phe Arg Met Ser Leu Gln Thr Ala Arg Ala Lys Ser Asp Glu Gln Trp Phe Arg Met Ser Leu Gln Thr Ala
210 215 220 210 215 220
Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Ser Ser His Thr Phe Gln Arg Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Ser Ser His Thr Phe Gln Arg
225 230 235 240 225 230 235 240
Met Phe Gly Cys Asp Leu Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr Met Phe Gly Cys Asp Leu Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr
245 250 255 245 250 255
Gln Gln Phe Ala Tyr Asp Gly Arg Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp Gln Gln Phe Ala Tyr Asp Gly Arg Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp
260 265 270 260 265 270
Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Leu Ile Thr Lys Arg Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Leu Ile Thr Lys Arg
275 280 285 275 280 285
Lys Trp Glu Ala Ala Asn Asp Ala Glu Tyr Tyr Arg Ala Tyr Leu Glu Lys Trp Glu Ala Ala Asn Asp Ala Glu Tyr Tyr Arg Ala Tyr Leu Glu
290 295 300 290 295 300
Gly Glu Cys Val Glu Trp Leu His Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Gly Glu Cys Val Glu Trp Leu His Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320 305 310 315 320
Met Leu Gln Arg Thr Asp Ser Pro Lys Ala His Val Thr His His Pro Met Leu Gln Arg Thr Asp Ser Pro Lys Ala His Val Thr His His Pro
325 330 335 325 330 335
Val Phe Asp Tyr Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Val Phe Asp Tyr Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr
340 345 350 340 345 350
Pro Ala Glu Ile Ile Leu Thr Trp Gln Leu Asn Gly Glu Asp Leu Thr Pro Ala Glu Ile Ile Leu Thr Trp Gln Leu Asn Gly Glu Asp Leu Thr
355 360 365 355 360 365
Gln Asp Val Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Asp Val Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe
370 375 380 370 375 380
Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Lys Glu Gln Asn Tyr Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Lys Glu Gln Asn Tyr
385 390 395 400 385 390 395 400
Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Met Leu Arg Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Met Leu Arg
405 410 415 405 410 415
Trp Lys Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp Lys Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu
420 425 430 420 425 430
Trp His Glu His His His His His His Trp His Glu His His His His His His His
435 440 435 440
<210> 47 <210> 47
<211> 440 <211> 440
<212> PRT <212> PRT
<213> rat <213> rat
<400> 47 <400> 47
Ala Gln Phe Ser Ala Ser Ala Ser Arg Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly Ala Gln Phe Ser Ala Ser Ala Ser Arg Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Lys Thr Pro Gln Ile Gln Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Lys Thr Pro Gln Ile Gln
20 25 30 20 25 30
Val Tyr Ser Arg His Pro Pro Glu Asn Gly Lys Pro Asn Phe Leu Asn Val Tyr Ser Arg His Pro Pro Glu Asn Gly Lys Pro Asn Phe Leu Asn
35 40 45 35 40 45
Cys Tyr Val Ser Gln Phe His Pro Pro Gln Ile Glu Ile Glu Leu Leu Cys Tyr Val Ser Gln Phe His Pro Pro Gln Ile Glu Ile Glu Leu Leu
50 55 60 50 55 60
Lys Asn Gly Lys Lys Ile Pro Asn Ile Glu Met Ser Asp Leu Ser Phe Lys Asn Gly Lys Lys Ile Pro Asn Ile Glu Met Ser Asp Leu Ser Phe
65 70 75 80 65 70 75 80
Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Ile Leu Ala His Thr Glu Phe Thr Pro Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Ile Leu Ala His Thr Glu Phe Thr Pro
85 90 95 85 90 95
Thr Glu Thr Asp Val Tyr Ala Cys Arg Val Lys His Val Thr Leu Lys Thr Glu Thr Asp Val Tyr Ala Cys Arg Val Lys His Val Thr Leu Lys
100 105 110 100 105 110
Glu Pro Lys Thr Val Thr Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Thr Val Thr Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125 115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140 130 135 140
Ser His Ser Leu Arg Tyr Phe Tyr Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly Leu Ser His Ser Leu Arg Tyr Phe Tyr Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly Leu
145 150 155 160 145 150 155 160
Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Glu Phe Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Glu Phe
165 170 175 165 170 175
Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Glu Asn Pro Arg Met Glu Pro Arg Ala Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Glu Asn Pro Arg Met Glu Pro Arg Ala
180 185 190 180 185 190
Arg Trp Met Glu Arg Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Gln Gln Thr Arg Arg Trp Met Glu Arg Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Gln Gln Thr Arg
195 200 205 195 200 205
Ile Ala Lys Glu Trp Glu Gln Ile Tyr Arg Val Asp Leu Arg Thr Leu Ile Ala Lys Glu Trp Glu Gln Ile Tyr Arg Val Asp Leu Arg Thr Leu
210 215 220 210 215 220
Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Gly Gly Ser His Thr Ile Gln Glu Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Gly Gly Ser His Thr Ile Gln Glu
225 230 235 240 225 230 235 240
Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Gly Ser Leu Leu Arg Gly Tyr Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Gly Ser Leu Leu Arg Gly Tyr
245 250 255 245 250 255
Arg Gln Asp Ala Tyr Asp Gly Arg Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp Arg Gln Asp Ala Tyr Asp Gly Arg Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp
260 265 270 260 265 270
Leu Lys Thr Trp Thr Ala Ala Asp Phe Ala Ala Gln Ile Thr Arg Asn Leu Lys Thr Trp Thr Ala Ala Asp Phe Ala Ala Gln Ile Thr Arg Asn
275 280 285 275 280 285
Lys Trp Glu Arg Ala Arg Tyr Ala Glu Arg Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Lys Trp Glu Arg Ala Arg Tyr Ala Glu Arg Leu Arg Ala Tyr Leu Glu
290 295 300 290 295 300
Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Ser Arg Tyr Leu Glu Leu Gly Lys Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Ser Arg Tyr Leu Glu Leu Gly Lys Glu
305 310 315 320 305 310 315 320
Thr Leu Leu Arg Ser Asp Pro Pro Glu Ala His Val Thr Leu His Pro Thr Leu Leu Arg Ser Asp Pro Glu Ala His Val Thr Leu His Pro
325 330 335 325 330 335
Arg Pro Glu Gly Asp Val Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Arg Pro Glu Gly Asp Val Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr
340 345 350 340 345 350
Pro Ala Asp Ile Thr Leu Thr Trp Gln Leu Asn Gly Glu Asp Leu Thr Pro Ala Asp Ile Thr Leu Thr Trp Gln Leu Asn Gly Glu Asp Leu Thr
355 360 365 355 360 365
Gln Asp Met Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Asp Met Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe
370 375 380 370 375 380
Gln Lys Trp Ala Ser Val Val Val Pro Leu Gly Lys Glu Gln Asn Tyr Gln Lys Trp Ala Ser Val Val Val Pro Leu Gly Lys Glu Gln Asn Tyr
385 390 395 400 385 390 395 400
Thr Cys Arg Val Glu His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Ser Gln Arg Thr Cys Arg Val Glu His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Ser Gln Arg
405 410 415 405 410 415
Trp Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp Trp Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp
420 425 430 420 425 430
His Glu His His His His His His His Glu His His His His His His His
435 440 435 440
<210> 48 <210> 48
<211> 440 <211> 440
<212> PRT <212> PRT
<213> Artificial <213> Artificial
<220> <220>
<223> exemplary human HLA-G/ rat RT1A β2M MHC class I complex wherein <223> exemplary human HLA-G/ rat RT1A β2M MHC class I complex condition
the positions specific for human HLA-G are grafted onto the rat the positions specific for human HLA-G are grafted onto the rat
RT1A framework RT1A framework
<400> 48 <400> 48
Ala Gln Phe Ser Ala Ser Ala Ser Arg Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly Ala Gln Phe Ser Ala Ser Ala Ser Arg Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Lys Thr Pro Gln Ile Gln Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Lys Thr Pro Gln Ile Gln
20 25 30 20 25 30
Val Tyr Ser Arg His Pro Pro Glu Asn Gly Lys Pro Asn Phe Leu Asn Val Tyr Ser Arg His Pro Pro Glu Asn Gly Lys Pro Asn Phe Leu Asn
35 40 45 35 40 45
Cys Tyr Val Ser Gln Phe His Pro Pro Gln Ile Glu Ile Glu Leu Leu Cys Tyr Val Ser Gln Phe His Pro Pro Gln Ile Glu Ile Glu Leu Leu
50 55 60 50 55 60
Lys Asn Gly Lys Lys Ile Pro Asn Ile Glu Met Ser Asp Leu Ser Phe Lys Asn Gly Lys Lys Ile Pro Asn Ile Glu Met Ser Asp Leu Ser Phe
65 70 75 80 65 70 75 80
Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Ile Leu Ala His Thr Glu Phe Thr Pro Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Ile Leu Ala His Thr Glu Phe Thr Pro
85 90 95 85 90 95
Thr Glu Thr Asp Val Tyr Ala Cys Arg Val Lys His Val Thr Leu Lys Thr Glu Thr Asp Val Tyr Ala Cys Arg Val Lys His Val Thr Leu Lys
100 105 110 100 105 110
Glu Pro Lys Thr Val Thr Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Thr Val Thr Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125 115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140 130 135 140
Ser His Ser Leu Arg Tyr Phe Tyr Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly Leu Ser His Ser Leu Arg Tyr Phe Tyr Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly Leu
145 150 155 160 145 150 155 160
Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Glu Phe Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Glu Phe
165 170 175 165 170 175
Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser Ala Ser Pro Arg Met Glu Pro Arg Ala Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser Ala Ser Pro Arg Met Glu Pro Arg Ala
180 185 190 180 185 190
Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Gln Gln Thr Arg Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Gln Gln Thr Arg
195 200 205 195 200 205
Ile Ala Lys Glu Trp Glu Gln Ile Tyr Arg Met Asp Leu Gln Thr Leu Ile Ala Lys Glu Trp Glu Gln Ile Tyr Arg Met Asp Leu Gln Thr Leu
210 215 220 210 215 220
Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Ser Ser His Thr Ile Gln Glu Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Ser Ser His Thr Ile Gln Glu
225 230 235 240 225 230 235 240
Met Tyr Gly Cys Asp Leu Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr Met Tyr Gly Cys Asp Leu Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr
245 250 255 245 250 255
Arg Gln Asp Ala Tyr Asp Gly Arg Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp Arg Gln Asp Ala Tyr Asp Gly Arg Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp
260 265 270 260 265 270
Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Phe Ala Ala Gln Ile Thr Lys Arg Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Phe Ala Ala Gln Ile Thr Lys Arg
275 280 285 275 280 285
Lys Trp Glu Ala Ala Asn Tyr Ala Glu Arg Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Lys Trp Glu Ala Ala Asn Tyr Ala Glu Arg Leu Arg Ala Tyr Leu Glu
290 295 300 290 295 300
Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu His Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu His Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320 305 310 315 320
Met Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Glu Ala His Val Thr His His Pro Met Leu Gln Arg Ala Asp Pro Glu Ala His Val Thr His His Pro
325 330 335 325 330 335
Val Phe Asp Tyr Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Val Phe Asp Tyr Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr
340 345 350 340 345 350
Pro Ala Glu Ile Ile Leu Thr Trp Gln Leu Asn Gly Glu Asp Leu Thr Pro Ala Glu Ile Ile Leu Thr Trp Gln Leu Asn Gly Glu Asp Leu Thr
355 360 365 355 360 365
Gln Asp Val Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Asp Val Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe
370 375 380 370 375 380
Gln Lys Trp Ala Ser Val Val Val Pro Ser Gly Lys Glu Gln Asn Tyr Gln Lys Trp Ala Ser Val Val Val Pro Ser Gly Lys Glu Gln Asn Tyr
385 390 395 400 385 390 395 400
Thr Cys Arg Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Met Leu Arg Thr Cys Arg Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Met Leu Arg
405 410 415 405 410 415
Trp Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp Trp Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp
420 425 430 420 425 430
His Glu His His His His His His His Glu His His His His His His His
435 440 435 440
<210> 49 <210> 49
<211> 33 <211> 33
<212> PRT <212> PRT
<213> Artificial <213> Artificial
<220> <220>
<223> linker and his-Tag <223> linker and his-Tag
<400> 49 <400> 49
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Leu Asn Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Leu Asn Asp
1 5 10 15 1 5 10 15
Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu His His His His His Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu His His His His His His
20 25 30 20 25 30
His His
<210> 50 <210> 50
<211> 9 <211> 9
<212> PRT <212> PRT
<213> Artificial <213> Artificial
<220> <220>
<223> peptide <223> peptide
<400> 50 <400> 50
Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala
1 5 15
<210> 51 <210> 51
<211> 107 <211> 107
<212> PRT <212> PRT
<213> Homo Sapiens <213> Homo sapiens
<400> 51 <400> 51
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15 1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30 20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45 35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60 50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80 65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95 85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105 100 105
<210> 52 <210> 52
<211> 105 <211> 105
<212> PRT <212> PRT
<213> Homo Sapiens <213> Homo sapiens
<400> 52 <400> 52
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30 20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
35 40 45 35 40 45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50 55 60 50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
65 70 75 80 65 70 75 80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85 90 95 85 90 95
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105 100 105
<210> 53 <210> 53
<211> 328 <211> 328
<212> PRT <212> PRT
<213> Homo Sapiens <213> Homo sapiens
<400> 53 <400> 53
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60 50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80 65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95 85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110 100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125 115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140 130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160 145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175 165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190 180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205 195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220 210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240 225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255 245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270 260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285 275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300 290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320 305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325 325
<210> 54 <210> 54
<211> 328 <211> 328
<212> PRT <212> PRT
<213> homo sapiens <213> homo sapiens
<400> 54 <400> 54
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60 50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80 65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95 85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110 100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125 115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140 130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160 145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175 165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190 180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205 195 200 205
Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220 210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240 225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255 245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270 260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285 275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300 290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320 305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325 325
<210> 55 <210> 55
<211> 325 <211> 325
<212> PRT <212> PRT
<213> Homo Sapiens <213> Homo sapiens
<400> 55 <400> 55
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60 50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80 65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95 85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110 100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125 115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140 130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160 145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175 165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190 180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205 195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220 210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240 225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255 245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270 260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285 275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300 290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320 305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Leu Ser Leu Ser Leu
325 325
<---<---
Claims (37)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP18168011.7 | 2018-04-18 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2020137068A RU2020137068A (en) | 2022-05-18 |
| RU2797724C2 true RU2797724C2 (en) | 2023-06-08 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2635537C2 (en) * | 2010-09-29 | 2017-11-13 | Ютиай Лимитед Партнершип | Method for treating autoimmune disease using biocompatible bioabsorbable nanosphere |
| WO2017207775A1 (en) * | 2016-06-03 | 2017-12-07 | Invectys | Anti hla-g specific antibodies |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2635537C2 (en) * | 2010-09-29 | 2017-11-13 | Ютиай Лимитед Партнершип | Method for treating autoimmune disease using biocompatible bioabsorbable nanosphere |
| WO2017207775A1 (en) * | 2016-06-03 | 2017-12-07 | Invectys | Anti hla-g specific antibodies |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| DANLI WU et al. "Rescuing lymphocytes from HLA-G immunosuppressive effects mediated by the tumor microenvironment", ONCOTARGET, vol. 6, no. 35, 10.11.2015. * |
| RUI WAN et al. "Human Leukocyte Antigen-G Inhibits the Anti-Tumor Effect of Natural Killer Cells via Immunoglobulin-Like Transcript 2 in Gastric Cancer", CELLULAR PHYSIOLOGY AND BIOCHEMISTRY, vol. 44, no. 5, 01.01.2017. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3541840B1 (en) | Anti-hla-g antibodies and use thereof | |
| US20220363755A1 (en) | Anti-tim3 antibodies and methods of use | |
| CN112004831B (en) | Anti-HLA-G antibodies and uses thereof | |
| CN108368173B (en) | anti-PD 1 antibodies and methods of use | |
| JP6738285B2 (en) | Antibody binding to human and cynomolgus monkey CD3 epsilon | |
| CN111989343B (en) | Multispecific antibodies and uses thereof | |
| CN117801115A (en) | anti-HLA-DQ 2.5 antibodies and their use in the treatment of celiac disease | |
| RU2797724C2 (en) | Anti-hla-g antibodies and their use |