RU2796468C2

RU2796468C2 - СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДНЫХ РАСТВОРОВ С ЗАДАННЫМ ЗНАЧЕНИЕМ pH

Info

Publication number: RU2796468C2
Application number: RU2020114780A
Authority: RU
Inventors: Тайбор НЕЙДЖИ
Original assignee: ФУДЖИФИЛМ ДИОСИНТ БАЙОТЕКНОЛОДЖИЗ ЮКей ЛИМИТЕД
Priority date: 2017-10-04
Filing date: 2018-09-21
Publication date: 2023-05-24

Abstract

Изобретение относится к способам получения водных растворов, в частности, буферных растворов. Способ получения водного раствора с заданным значением рН, содержащего кислоту, основание и необязательно одну или несколько добавок, при этом указанный способ включает следующие стадии: a) расчет теоретических концентраций кислоты и основания для раствора, в целях достижения заданного значения рН с помощью уравнения Гендерсона - Гассельбаха в комбинации с теорией Дебая - Хюккеля для по меньшей мере 5 различных концентраций добавок; b) получение образца раствора для каждой концентрации добавок и измерение фактического уровня рН для каждой концентрации добавок; c) расчет значения дельта рН (ΔpΗ), которое представляет собой разницу между теоретическим рН и фактическим рН, для каждой концентрации добавок; d) создание математической модели, описывающей взаимосвязь ΔрΗ и концентрации добавки для по меньшей мере 5 различных концентраций добавок; e) выбор заданного значения рН и концентраций добавок; f) применение математической модели, созданной на стадии d), для расчета ΔрΗ для заданного значения рН и концентрации добавки; g) расчет ΔрΗ-скорректированного значения рН путем суммирования заданного значения рН и ΔрН; h) применение ΔрΗ-скорректированного значения рН для расчета концентраций кислоты и основания с использованием уравнения Гендерсона - Гассельбаха в комбинации с теорией Дебая - Хюккеля; i) получение раствора, используя рассчитанные на стадии h) значения концентраций. Техническим результатом является увеличение точности расчета пропорций компонентов буферной композиции с заданным уровнем рН. 4 н. и 11 з.п. ф-лы, 8 табл.

Description

Настоящее изобретение относится к способам получения водных растворов, в частности, буферных растворов.

Буферные растворы широко применяются во многих отраслях, как в научных исследованиях, так и в производстве. Существует множество различных буферных растворов, при этом ключевым параметром этих растворов является уровень рН. Многие буферные растворы имеют относительно большую степень разведения, и при этом могут быть востребованы в достаточно больших объемах. В этой связи, с учетом ассортимента буферов, которые могут требоваться, хранение большого количества готовых буферных растворов по соображения логистики не является целесообразным. Соответственно, желательно иметь возможность расчета пропорции компонентов, необходимых для конкретной буферной композиции с заданным уровнем рН, чтобы при необходимости получать нужное количество желаемого буфера. В целом, это можно считать простым вопросом, но вместе с тем, обычно фактическое получаемое значение рН не соответствует теоретическому значению, даже при расчетах с помощью стандартного уравнения Гендерсона - Гассельбаха в комбинации с теорией Дебая - Хюккеля, или в случае применения многочисленных вариантов и модификаций, предложенных, например, для компенсации влияния размера ионов, заряда ионов, температуры буфера и, в особенности, влияния характеристики и концентрации буферных добавок, таких как соли, в частности, нейтральные соли, хаотропы, хелатирующие вещества, поверхностно-активные вещества и углеводы. Предпринимались многочисленные попытки разработать надежные способы получения буферных растворов, например, способы, предложенные в WO2009/131524, и способы из предшествующего уровня техники, признанные в упомянутом патентном документе.

В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения водного раствора с заданным уровнем рН, содержащего кислоту, основание и необязательно одну или несколько добавок, при этом указанный способ включает следующие стадии:

a) расчет теоретических концентраций кислоты и основания для раствора, в целях достижения заданного значения рН с помощью уравнения Гендерсона - Гассельбаха в комбинации с теорией Дебая - Хюккеля для диапазона различных концентраций добавок;

b) получение образца буфера для диапазона концентраций добавок и для измерения фактического уровня рН для каждой концентрации добавок;

c) расчет значения дельта рН (ΔpΗ), которое представляет собой разницу между теоретическим значением рН и фактическим значением рН, для каждой концентрации добавок;

d) создание математической модели, описывающей взаимосвязь ΔрΗ и концентрации добавки;

e) выбор заданного значения рН и концентраций добавок;

f) применение математической модели, созданной на стадии d), для расчета ΔрΗ для заданного значения рН и концентрации добавки;

g) расчет ΔрΗ-скорректированного значения рН путем суммирования заданного значения рН и ΔрН;

h) применение ΔрΗ-скорректированного значения рН для расчета концентрации кислоты и основания с использованием уравнения Гендерсона - Гассельбаха в комбинации с теорией Дебая - Хюккеля;

i) получение раствора, используя рассчитанные на стадии h) значения концентраций.

Следует принимать во внимание, что в способе согласно первому аспекту настоящего изобретения, в некоторых вариантах осуществления, стадия a) может предшествовать стадии b), и в других вариантах осуществления стадию b) можно проводить перед стадией a).

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу получения водного раствора с заданным уровнем рН, содержащего кислоту, основание и необязательно одну или несколько добавок, при этом указанный способ включает следующие стадии:

a) расчет теоретических концентраций кислоты и основания и добавок для раствора, для достижения заданного значения рН с помощью уравнения Гендерсона - Гассельбаха в комбинации с теорией Дебая - Хюккеля для диапазона различных концентраций добавок;

b) расчет значения ΔpΗ, которое представляет собой разницу между теоретическим значением рН и значением, предпочтительно заданным значением фактического уровня рН, для каждой концентрации добавок;

c) создание математической модели, описывающей взаимосвязь ΔрΗ и концентрации добавки;

d) выбор заданного значения рН и концентрации добавок;

e) применение математической модели, созданной на стадии c), для расчета ΔрΗ для заданного значения рН и концентрации добавки;

f) расчет ΔрΗ-скорректированного значения рН путем суммирования заданного значения рН и ΔрН;

g) применение ΔрΗ-скорректированного значения рН для расчета концентрации кислоты и основания с использованием уравнения Гендерсона - Гассельбаха в комбинации с теорией Дебая - Хюккеля;

h) получение раствора, используя рассчитанные на стадии g) значения концентраций.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения водного раствора с заданным значением рН, содержащего кислоту, основание и добавку, при этом указанный способ включает следующие стадии:

a) расчет теоретического значения рН раствора с помощью уравнения Гендерсона - Гассельбаха в комбинации с теорией Дебая - Хюккеля;

b) расчет ΔрΗ-скорректированного значения рН для водного раствора путем сравнения теоретического значения рН со значением рН, рассчитанным из уравнения, которое выведено из математической модели разницы между теоретическим значением рН и фактическим значением рН водного раствора, предпочтительно заданным значением, для диапазона концентраций добавок;

c) применение ΔpΗ-скорректированного значения рН для расчета концентрации кислоты и основания с использованием уравнения Гендерсона - Гассельбаха в комбинации с теорией Дебая - Хюккеля;

d) получение раствора, используя рассчитанные на стадии с) значения концентраций.

Водные растворы, которые могут быть получены с помощью способа по настоящему изобретению, представляют собой наиболее часто применяемые буферные растворы, в частности, буферные растворы, используемые в области химии и биотехнологии, например, при обработке биологических молекул. Буферные растворы, которые могут быть получены способом по настоящему изобретению, включают трис-буферы [(трис(гидроксиметил)аминометан («трис») в комбинации с трис-кислой солью, такой как tris.HCI); натрий-фосфатный буфер (динатрия фосфат в качестве основания и натрия дигидрофосфат в качестве кислоты); калий-фосфатный буфер (дикалий фосфат в качестве основания и калий дигидрофосфат в качестве кислоты); натрий-ацетатный буфер (ацетат натрия в качестве основания и уксусная кислота в качестве кислоты; MES-буфер (натриевая соль 4-морфолин-этансульфоновой кислоты в качестве основания и 4-морфолин-этансульфоновая кислота в качестве кислоты) и буфер HEPES (натриевая соль 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновой кислоты в качестве основания и 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновая кислота в качестве кислоты).

Выбранные значения рН раствора для обработки биологических молекул часто находятся в диапазоне от 3,5 до 9. Во многих вариантах осуществления выбранные для раствора значения рН находятся в пределах 1 единицы термодинамической величины рКа.

Добавки, которые могут присутствовать в растворах, представляют собой водорастворимые добавки, включающие соли, хаотропы, хелатирующие вещества, поверхностно-активные вещества, растворители и углеводы, и примеры таких добавок хорошо известны в области химии и биотехнологии. В растворах могут присутствовать смеси двух или нескольких добавок.

Соли, которые можно использовать в качестве добавок, включают нейтральные соли, такие как NaCl, KCl, Na₂SO₄, и не нейтральные соли, такие как (NH₄)₂SO₄ и (NH₄)₃Р)O₄. Когда в качестве добавок используются соли, их концентрация обычно достигает приблизительно 5 М, например, приблизительно до 2 М.

Хаотропы, которые можно использовать в качестве добавок, включают мочевину и гуанидина гидрохлорид.

Хелатирующие вещества, которые можно использовать в качестве добавок, включают этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA) и этиленгликольтетрауксусную кислоту (EGTA).

Поверхностно-активные вещества, которые можно использовать в качестве добавок, включают, в частности, неионные поверхностно-активные вещества, такие как алкилфенолэтоксилаты, например, октил- и нонилфенол- этоксилаты, например, Triton (R) X100, и полисорбаты, такие как полисорбат 80.

Растворители, которые можно использовать в качестве добавок, предпочтительно представляют собой смешивающиеся с водой растворители и включают короткоцепочечные спирты, такие как метанол, этанол или изопропанол, ацетонитрил, ацетон, гликоли, такие как этиленгликоль, и смешивающиеся с водой полиэтиленгликоли.

Углеводы, которые можно использовать в качестве добавок, включают моносахариды, например, глюкозу и фруктозу, и олигосахариды, например, мальтозу, лактозу и сахарозу.

Хаотропы, хелатирующие вещества, поверхностно-активные вещества, растворители и углеводы, в случае их присутствия, обычно используются при концентрациях до 1 М, например, до 500 мМ, в частности, до 250 мМ, например, от 1 до 100 мМ.

Водный раствор по изобретению можно использовать для обработки биологических молекул. Такие биомолекулы обычно представляют собой полинуклеотиды или полипептиды, в частности, полипептиды, включая рекомбинантные антитела и другие терапевтические полипептиды. Водные растворы можно использовать при культивировании рекомбинантных клеток-хозяев, экспрессирующих рекомбинантные полипептиды, в частности, для культивирования прокариотических клеток-хозяев, например, E.coli, и эукариотических клеток-хозяев, например, клеток СНО. Водные растворы особенно часто используют при очистке полипептидов, экспрессируемых в рекомбинантных клетках-хозяевах. Следует понимать, что водные растворы удобно использовать для выделения, экспрессии или очистки любых биомолекул, при необходимости применения такого водного раствора.

Диапазон концентраций добавок и количество точек данных в пределах диапазона, применяемого в способе по настоящему изобретению, выбраны по усмотрению пользователя. Во многих вариантах осуществления в отношении концентрации добавок в целевом растворе выбрана более низкая минимальная концентрация добавок и более высокая максимальная концентрация добавок. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении можно использовать водные растворы, не содержащие добавок, и в этом случае минимальная концентрация добавок или равна нулю или не превышает, например, значение концентрации 1 мМ для необходимых в целевом растворе добавок.

Во многих случаях количество точек данных в диапазоне концентраций добавок составляет менее 20, очень часто не превышает 15, например, используется от 5 до 10 точек данных.

В некоторых вариантах осуществления точки данных выбраны таким образом, что в нижней части диапазона концентраций добавок они располагаются ближе друг к другу, чем в верхней части диапазона. В некоторых случаях приблизительно до 80% точек данных расположены в нижних 25% значений в диапазоне концентраций. В некоторых случаях интервал между точками данных вычисляют следующим образом: 1) выбор самого низкого значения концентрации в диапазоне (точка A); 2) выбор следующего низкого значения концентрации в диапазоне (точка B); 3) вычитание А из В; 4) умножение полученной разности на 2; 5) вычисление интервала до третьего значения концентрации; и 6) вычисление точки C путем добавления интервала к B. Этот расчет можно повторять с использованием концентраций С и В для вычисления концентрации для четвертой точки данных (точка D), и так далее, для требуемого количества точек данных по всему выбранному диапазону.

В других вариантах осуществления точки данных равномерно распределены по всему диапазону данных.

В некоторых вариантах осуществления способ по настоящему изобретению можно выполнять повторно для диапазона различных концентраций конкретной кислоты и основания, и полученные данные также можно применять для создания математической модели изменения рН в зависимости от концентрации кислоты и основания и от концентрации добавки. Математическая модель может быть использована для расчета композиции растворов для других концентраций этих кислот, оснований и добавок, предпочтительно для концентраций в пределах диапазона, который был применен для получения данных, используемых для создания математической модели.

Уравнение Гендерсона - Гассельбаха, используемое в способе по настоящему изобретению, обычно выражено как pH=pK_a+log ([A']/[HA]), где [A'] обозначает молярную концентрацию щелочного компонента раствора, и [HА] обозначает молярную концентрацию кислотного компонента раствора.

В настоящем изобретении можно использовать любой из вариантов уравнения по теории Дебая - Хюккеля. Во многих вариантах осуществления используются приведенные ниже уравнения.

Значение рКа из уравнения Гендерсона - Гассельбаха предпочтительно используется с поправкой на значение температуры выше 25 °C, рКа_T, используя уравнение:

pK_aT=pKa + (dpKa/dT) x (T-25),

где рКа обозначает термодинамическую величину рКа, и применяемые значения dpKa/dT рассчитаны с помощью известных в данной области способов или выбраны из открытых литературных источников, и Т обозначает температуру в °C.

Значение применяемой величины рКа представляет собой модифицированную по теории Дебая - Хюккеля величину рКа (рКа'), которая рассчитывается по формулам:

где Z обозначает заряд на кислотных компонентах,

А представляет собой параметр Дебая - Хюккеля, и

I обозначает ионную силу. Во многих вариантах осуществления значение применяемой величины рКа представляет собой модифицированную по Дебаю - Хюккелю величину рКа с поправкой на температуру (рКа_Т'), которая рассчитывается с помощью того же уравнения, за исключением использования рКа, скорректированной по температуре (рКа_T), вместо теоретической величины рКа.

Параметр Дебая - Хюккеля (А) вычисляется по формуле:

A = (0,4918+0,0006614 Т+0,000004975 Т²), где Т обозначает температуру в °C.

Ионную силу I можно вычислять, учитывая только ионную силу добавок, и рассчитывать по следующей формуле:

где Ci обозначает молярную концентрацию каждого компонента в растворе, и

Z представляет собой суммарный заряд каждого компонента в растворе. В предпочтительных вариантах осуществления в ионную силу также входит вклад кислоты и основания, рассчитанный с помощью того же уравнения, как для расчета добавок.

Следует понимать, что, поскольку значение модифицированной величины рКа (рК_а' или скорректированной по температуре рКа_Т') зависит от ионной силы, и что ионная сила также зависит от концентрации кислоты и основания, использование уравнений Дебая-Хюккеля и Гендерсона - Гассельбаха при расчете концентрации для достижения заданного значения рН включает итеративный расчет значения модифицированной рК_а. Итеративное вычисление повторяют, пока значение модифицированной рК_а меньше, чем заданная разница от ранее вычисленной итерации модифицированной рК_а. Во многих случаях эта разница выбрана таким образом, чтобы она составляла <0,01, например, <0,001, и предпочтительно <0,0001. Значение модифицированной рК_а, которое соответствует этому параметру разницы, и является значением, применяемым для расчета концентрации кислот и оснований в растворе.

Пример способа итерационного расчета представлен ниже:

a) вычисление рКa, скорректированной по температуре (рКа_T) с помощью уравнения:

pKa_T = (pKa + (dpKa/dt * (T-25)));

b) вычисление ионной силы добавок, I_add, с помощью уравнения:

c) вычисление ионной силы I_b, обусловленной кислотой и основанием, для заданного значения рН, используя значение рКа_T, вычисленное на стадии а), с помощью уравнений:

и

,

где [А-] обозначает молярную концентрацию основного компонента в буфере, и [HA] обозначает молярную концентрацию кислотного компонента в буфере, и таким образом,

рН=pKaT+log10 R;

следовательно, pH - pKaT=log10 R;

таким образом, 10^pH-pKaT=R;

кислотный коэффициент=соотношение противоионов кислоты =

;

основной коэффициент=соотношение противоионов основания =

d) вычисление скорректированной по температуре величины рКа_T', модифицированной по Дебаю - Хюккелю с комбинированной ионной силой, обусловленной кислотой, основанием и добавкой, I_sum = (Ib+Iadd)

A = (0,4918+0,0006614 Т+0,000004975 T²

e) возврат к стадии с) и повторное вычисление ионной силы, но на этот раз с уточненным значением рКа_T', рассчитанным на стадии d);

f) повторное вычисление скорректированной по температуре величины рКа_T', модифицированной по Дебаю - Хюккелю, с новым значением ионной силы, полученной на стадии e);

g) повторение стадий e) и f) до сходимости величины рКа_T' с разницей на <0,0001 от значения рКа_T' в предыдущей итерации;

h) определение соотношения кислота : основание, исходя из полученного на стадии g) значения рКа_T', с помощью следующих уравнений:

10^pH-pKa=R;

;

.

Математическая модель, описывающая взаимосвязь ΔрΗ с концентрацией добавок, можно создать с помощью известных в данной области способов, такие как регрессионный анализ, машинное обучение или искусственный интеллект.

Во многих предпочтительных вариантах осуществления температура раствора выбрана из диапазона от 10 до 30 °C. В некоторых случаях температура выбрана таким образом, чтобы ее диапазон составлял от 12 до 25 °C, например, 18 +/- 5 °C.

Во многих предпочтительных вариантах осуществления концентрация кислоты и основания в растворе составляет до 1 М, например, до 0,5 M, например, до 250 мМ, предпочтительно до 150 мМ. Во многих предпочтительных вариантах осуществления раствор имеет концентрацию от 5 до 100 мМ, например, от 10 до 75 мМ, например, от 25 до 50 мМ. В других предпочтительных вариантах осуществления концентрация NaCI или KCI в растворе находится в диапазоне до 3 М, в частности, до 2 М, например, в диапазоне от 0,1 мМ до 1 М. В вариантах осуществления изобретения, в которых добавка представляет собой сульфат аммония, концентрация этой добавки может составлять приблизительно до 3 М или до 4 М. В других вариантах осуществления, где добавка представляет собой мочевину или гуанидина гидрохлорид, такая добавка может присутствовать в концентрации приблизительно до 7 М.

В одном особенно предпочтительном варианте осуществления раствор по изобретению представляет собой фосфатный буфер, в частности, натрий дигидрофосфатный/динатрий-гидрофосфатный буфер, имеющий концентрацию от 10 до 100 мМ. В другом особенно предпочтительном варианте осуществления раствор по изобретению представляет собой ацетатный буфер, в частности, буферный раствор из уксусной кислоты/ацетата натрия, с концентрацией от 10 до 250 мМ. В другом особенно предпочтительном варианте осуществления раствор по изобретению представляет собой MES-буфер, в частности, буфер из 4-морфолин-этансульфоновой кислоты/натриевой соли 4-морфолин-этансульфоновой кислоты, с концентрацией от 10 до 100 мМ. В других особенно предпочтительных вариантах осуществления этот раствор представляет собой буфер HEPES, в частности, 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновую кислоту/натриевую соль 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновой кислоты в качестве основного и в качестве кислотного буферного раствора, имеющего концентрацию от 10 до 100 мМ. В других особенно предпочтительных вариантах осуществления этот раствор представляет собой трис-буфер, в частности, трис в комбинации с буфером tris.HCI в концентрации от 10 до 250 мМ. В каждом из указанных выше особенно предпочтительных вариантов осуществления каждый раствор может дополнительно содержать до 1 М соли, выбранной из одной из солей NaCI и KCI, или обе указанные соли.

Способ по настоящему изобретению может быть использован для получения растворов с целью любого применения, для которого требуются растворы с заданной композицией, например, для высокопроизводительного скрининга, для хроматографии, ультрафильтрации, диафильтрации, вирусной фильтрации, очистки ДНК, создания рецептуры лекарственного продукта, для промышленного производства и лабораторных исследований. Способ особенно подходит для обработки биологических молекул, например, для использования в области производства и очистки биомолекул, в частности, рекомбинантных белков.

Во многих предпочтительных вариантах осуществления используют подходящие компьютерные программы для расчетов следующих параметров: концентрации кислоты и основания для получения заданного значения рН с помощью уравнения Гендерсона - Гассельбаха в комбинации с теорией Дебая - Хюккеля; ΔрΗ; регрессионный анализ ΔрΗ от концентрации добавок; скорректированное с учетом ΔрΗ значение рН; и концентрации кислоты и основания по уравнению Гендерсона - Гассельбаха в комбинации с теорией Дебая - Хюккеля с использованием ΔрΗ-скорректированного значения рН.

Во многих вариантах осуществления компьютерная программа связана с пользовательским интерфейсом, обычно с графическим пользовательским интерфейсом, представляющим собой, например, таблицы (электронные таблицы), веб-интерфейс или формы ввода данных, где оператор может вводить параметры желаемого буферного раствора. Такие входные данные могут включать выбор с помощью выпадающего меню следующих параметров: природа одного или нескольких компонентов, таких как кислоты, основания, буферные добавки, значение рН, объем буферного раствора и температура буферного раствора.

В некоторых вариантах осуществления компьютерная программа в пользовательском интерфейсе дает предупреждение, если на входе данных вводимые значения выходят за рамки одного или нескольких параметров, для которых эти значения были введены в таблицы данных. В некоторых случаях одним из предупреждений является сигнал о том, что выбранное значение рН находится за пределами выбранного диапазона термодинамической величины рКа для буфера, например, вне диапазона +/-1 термодинамической величины рКа. Могут быть предусмотрены предупреждения при выборе температуры вне заданного диапазона, например, выше, чем приблизительно 50 °C, или при выборе концентрации кислоты и основания за пределами заданного диапазона, например, при выборе слишком низкой концентрации, не позволяющей получить полноценный буферный раствор.

В предпочтительных вариантах осуществления компьютерная программа обеспечивает вывод в интерфейс пользователя, обычно в графический пользовательский интерфейс, с которого оператор может считывать данные о количествах кислоты, основания и буферной добавки, необходимых для получения желаемого раствора. В некоторых наиболее предпочтительных вариантах осуществления пользовательский интерфейс представляет собой HTML-графический интерфейс пользователя, например, HTML-форму. Примеры подходящих компьютерных программ хорошо известны в данной области, например, Python, Java, C, C++ и C#.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к устройству, например, к соответствующим образом запрограммированному компьютеру, для выполнения стадий от а) и с) до h) согласно первому аспекту настоящего изобретения; стадий от а) до g) согласно второму аспекту настоящего изобретения; или стадий от а) до с) согласно третьему аспекту настоящего изобретения.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к компьютерной программе для выполнения стадий от а) и с) до h) согласно первому аспекту настоящего изобретения; стадий от а) до g) согласно второму аспекту настоящего изобретения; или стадий от а) до с) согласно третьему аспекту настоящего изобретения.

Еще в одном аспекте изобретение относится к аппарату для получения водного раствора, и в этот аппарат входит дозирующее устройство, способное подавать в смесительное устройство кислоту и основание, одну или несколько добавок, и, необязательно, разбавитель, обычно воду, при этом пропорции кислоты, основания и добавки определяются с помощью способа в соответствии с первым, вторым или третьим аспектами настоящего изобретения. Предпочтительно, кислота, основание и добавка (добавки) подаются с помощью дозирующего устройства в виде растворов. В смесительном устройстве можно получать раствор для хранения его в емкости для использования в будущем, или можно получать раствор для немедленного использования, например, в устройстве для обработки, в частности, в устройстве для биологической обработки, в том числе для хроматографии, вирусной инактивации, фильтрации, рефолдинга, ультрафильтрации, диафильтрации, микрофильтрации, кондиционирования в потоке или рефолдинга в потоке. В некоторых вариантах осуществления дозирующее устройство функционально связано и работает под управлением такого устройства, как соответствующим образом запрограммированный компьютер, для выполнения стадий от а) и с) до h) согласно первому аспекту настоящего изобретения; стадий от а) до g) согласно второму аспекту настоящего изобретения; или стадий от а) до с) согласно третьему аспекту настоящего изобретения. В некоторых других вариантах осуществления аппарат для управления, например, соответствующим образом запрограммированный компьютер, встроен в аппарат, в который входит дозирующее устройство и, предпочтительно, также входит смесительное устройство. Измерительное устройство предпочтительно содержит впускные клапаны переменного потока, предпочтительно, прерывистого потока, которые регулируют поток через дозирующее устройство. Наиболее предпочтительно, если дозирующее устройство содержит несколько впускных регуляторов расхода, содержащих по меньшей мере 2 впускных клапанов, и часто содержит до 8 впускных клапанов, например, 3, 4, 5, 6 или 7 впускных клапанов. Эти впускные клапаны могут иметь одинаковые размеры, или один или несколько впускных клапанов могут иметь разные размеры. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления объем, измеренный от каждого впускного клапана к выпускному отверстию регулятора расхода, является одинаковым для каждого входного отверстия, и чрезвычайно предпочтительно, чтобы и объем, и длина пути, измеряемые от каждого впускного клапана к выпускному отверстию регулятора расхода, были одинаковыми для каждого входного отверстия. В дозирующее устройство предпочтительно входит насос, расположенный ниже от впускного регулятора потока с несколькими отверстиями, и наиболее предпочтительно, выше от смесительного устройства, например, от статического смесительного устройства. В некоторых вариантах осуществления выходной поток из смесительного устройства контролируется одним или несколькими датчиками, такими как датчики pH, проводимости или расходомеры.

Настоящее изобретение проиллюстрировано следующими примерами, не ограничивающими объем изобретения.

Пример 1

Получение фосфатных буферов

Были приготовлены несколько фосфатных буферов с различными концентрациями NaCI в диапазоне 0, 100, 250, 500, 1000, 2000 мМ, имеющих различные концентрации буферного раствора (10, 25, 50, 100 мМ), при этом в каждом случае целевое значение рН составляло рН 7,0, при температуре 20 °C. Были рассчитаны исходные концентрации кислоты и основания для достижения этих значений с помощью уравнения Гендерсона - Гассельбаха в комбинации с теорией Дебая - Хюккеля. Растворы готовили в соответствии с этими значениями с использованием концентрированных исходных растворов для каждого компонента буфера: 200 мМ дигидрофосфата натрия (кислота), 200 мМ гидрофосфата натрия (основание) и 5M хлорида натрия. Используемые значения концентрации (С) и количества приведены в таблице 1 ниже.

Таблица 1

	С буфера, мМ	С основания, мМ	С кислоты, мМ	С соли, мМ	Сток. основание мл	Сток. кислота, мл	Сток. 5 мМ соль, об. мл	Вода, объем, мл
1	10	4,81	5,19	0	2,4	2,6	0	95,0
2	25	13,25	11,75	0	6,6	5,9	0	87,5
3	50	28,69	21,31	0	14,3	10,7	0	75,0
4	100	61,7	38,3	0	30,9	19,2	0	50,0
5	10	5,81	4,19	100	2,9	2,1	2	93,0
6	25	14,9	10,1	100	7,5	5,1	2	85,5
7	50	30,7	19,3	100	15,4	9,7	2	73,0
8	100	63,54	36,46	100	31,8	18,2	2	48,0
9	10	6,27	3,73	250	3,1	1,9	5	90,0
10	25	15,82	9,18	250	7,9	4,6	5	82,5
11	50	31,98	18,02	250	16,0	9,0	5	70,0
12	100	64,77	35,23	250	32,4	17,6	5	45,0
13	10	6,49	3,51	500	3,2	1,8	10	85,0
14	25	16,25	8,75	500	8,1	4,4	10	77,5
15	50	32,53	17,47	500	16,3	8,7	10	65,0
16	100	64,95	35,05	500	32,5	17,5	10	40,0
17	10	6,37	3,63	1000	3,2	1,8	20	75,0
18	25	15,87	9,13	1000	7,9	4,6	20	67,5
19	50	31,55	18,45	1000	15,8	9,2	20	55,0
20	100	62,27	37,73	1000	31,1	18,9	20	30,0
21	10	5,42	4,58	2000	2,7	2,3	40	55,0
22	25	13,45	11,55	2000	6,7	5,8	40	47,5
23	50	26,59	23,41	2000	13,3	11,7	40	35,0
24	100	51,94	48,06	2000	26,0	24,0	40	10,0

Были измерены значения рН при 20 °C в полученных буферных растворах, указанных в таблице, и рассчитана разница от теоретической величины как дельта рН. Результаты приведены в таблице 2 ниже.

Таблица 2

	Измеренное значение	дельта рН
1	7,03	0,03
2	7,02	0,02
3	7,02	0,02
4	7,02	0,02
5	6,93	-0,07
6	6,95	-0,05
7	6,95	-0,05
8	6,96	-0,04
9	6,85	-0,15
10	6,87	-0,13
11	6,88	-0,12
12	6,87	-0,13
13	6,72	-0,28
14	6,74	-0,26
15	6,75	-0,25
16	6,73	-0,27
17	6,51	-0,49
18	6,5	-0,5
19	6,5	-0,5
20	6,48	-0,52
21	6,03	-0,97
22	6,03	-0,97
23	6,02	-0,98
24	5,99	-1,01

С помощью анализа линейной регрессии величины дельта рН (у) от концентрации соли (х) создано уравнение (1):

у = -0,0005X.

Уравнение (1) используется для вычисления значения дельта рН для концентрации соли для каждого из фосфатных буферов А, В, С и D из таблицы 3, ниже, а полученные значения дельта рН используются для расчета дельта-рН-скорректированного значения рН для каждого из буферов.

Дельта-рН скорректированное значение рН для каждого значения концентрации соли далее используются для расчета концентрации кислоты, основания и соли, с получением этих значений с помощью уравнения Гендерсона - Гассельбаха в комбинации с теорией Дебая - Хюккеля. Значения концентрации приведены в таблице 3.

Таблица 3

	Целевое значение рН	С буфера,	основание	кислота	С соли	Сток. основание мл	Сток. кислота, мл	5 мМ соль, объем мл	Вода, мл
A	7,0	20	11,58	8,42	50	5,8	4,2	1	89,0
B	7,0	60	48,62	11,38	750	24,3	5,7	15	55,0
C	6,5	50	25,57	24,43	500	12,8	12,2	10	65,0
D	7,5	25	21,05	3,95	100	10,5	2,0	2	85,5

Буферы были получены с использованием стоковых растворов кислоты, основания и соли, данные которых указаны в таблице 1, в количествах, приведенных в таблице 3. Полученные значения рН были измерены при 20 °C. Полученные значения рН приведены в таблице 4.

Таблица 4

	Измеренное значение	Целевое значение рН
A	7,07	7,0
B	7,03	7,0
C	6,47	6,5
D	7,52	7,5

Все значения рН были в пределах +/- 0,1 рН от показателя целевого значения, что указывает на высокую точность способа по настоящему изобретению.

Пример 2

Получение ацетатных буферов

Были приготовлены несколько ацетатных буферов с различными концентрациями NaCI в диапазоне 0, 100, 250, 500, 1000, 2000 мМ, имеющих различные концентрации буферного раствора (10, 25, 50, 100 мМ), при этом в каждом случае целевое значение рН составляло рН 4,5, при температуре 20 °C. Были рассчитаны исходные концентрации кислоты и основания для достижения этих значений с помощью уравнения Гендерсона - Гассельбаха в комбинации с теорией Дебая - Хюккеля. Растворы готовили в соответствии с этими значениями с использованием концентрированных исходных растворов для каждого компонента буфера: 200 мМ уксусной кислоты (кислота), 200 мМ ацетата натрия (основание) и 5M хлорида натрия. Используемые значения концентрации и количества приведены в таблице 5 ниже.

Таблица 5

	С буфера	С основания	С кислоты	С соли	основание	кислота	5 мМ соль, об. мл	Вода
1	10	3,69	6,31	0	1,8	3,2	0	95,0
2	25	9,44	15,56	0	4,7	7,8	0	87,5
3	50	19,31	30,69	0	9,7	15,3	0	75,0
4	100	39,75	60,25	0	19,9	30,1	0	50,0
5	10	4,16	5,84	100	2,1	2,9	2	93,0
6	25	10,42	14,58	100	5,2	7,3	2	85,5
7	50	20,94	29,06	100	10,5	14,5	2	73,0
8	100	42,21	57,79	100	21,1	28,9	2	48,0
9	10	4,33	5,67	250	2,2	2,8	5	90,0
10	25	10,85	14,15	250	5,4	7,1	5	82,5
11	50	21,73	28,27	250	10,9	14,1	5	70,0
12	100	43,58	56,42	250	21,8	28,2	5	45,0
13	10	4,42	5,58	500	2,2	2,8	10	85,0
14	25	11,06	13,94	500	5,5	7,0	10	77,5
15	50	22,12	27,88	500	11,1	13,9	10	65,0
16	100	44,26	55,74	500	22,1	27,9	10	40,0
17	10	4,38	5,62	1000	2,2	2,8	20	75,0
18	25	10,96	14,04	1000	5,5	7,0	20	67,5
19	50	21,9	28,1	1000	11,0	14,1	20	55,0
20	100	43,75	56,25	1000	21,9	28,1	20	30,0
21	10	4,07	5,93	2000	2,0	3,0	40	55,0
22	25	10,16	14,84	2000	5,1	7,4	40	47,5
23	50	20,3	29,7	2000	10,2	14,9	40	35,0
24	100	40,51	59,49	2000	20,3	29,7	40	10,0

Были измерены значения рН при 20 °C в полученных буферных растворах, указанных в таблице, и рассчитана разница от теоретической величины как дельта рН. Результаты приведены в таблице 6 ниже.

Таблица 6

	Измеренное значение рН	дельта рН
1	4,48	-0,03
2	4,48	-0,04
3	4,49	-0,03
4	4,5	-0,03
5	4,46	-0,07
6	4,45	-0,08
7	4,45	-0,07
8	4,46	-0,06
9	4,45	-0,08
10	4,42	-0,11
11	4,43	-0,1
12	4,44	-0,09
13	4,39	-0,17
14	4,38	-0,15
15	4,39	-0,14
16	4,4	-0,13
17	4,34	-0,24
18	4,32	-0,23
19	4,33	-0,23
20	4,34	-0,21
21	4,2	-0,39
22	4,2	-0,37
23	4,2	-0,36
24	4,22	-0,37

у = -0,0002X - 0,0516

Уравнение (1) используется для вычисления значения дельта рН для концентрации соли для каждого из фосфатных буферов E - H из таблицы 7, ниже, а полученные значения дельта рН используются для расчета дельта-рН-скорректированного значения рН для каждого из буферов.

Дельта-рН скорректированное значение рН для каждого значения концентрации соли далее используются для расчета концентрации кислоты, основания и соли, с получением этих значений с помощью уравнения Гендерсона - Гассельбаха в комбинации с теорией Дебая - Хюккеля. Значения концентрации приведены в таблице 7.

Таблица 7

	Целевое значение рН	С буфера	основание	кислота	С соли	основание мл	кислота, мл	5 мМ соль, объем мл	Вода, мл
E	4,5	20	8,66	11,34	50	4,3	5,7	1	89,0
F	4,5	60	32,51	27,49	750	16,3	13,7	15	55,0
G	4,0	50	12,72	37,28	500	6,4	18,6	10	65,0
H	5,0	25	18,09	6,91	100	9,0	3,5	2	85,5

Были приготовлены буферы со значениями концентрации, указанными в таблице 1, значения рН были измерены при 20 °C. Полученные значения рН приведены в таблице 8.

Таблица 8

	Измеренное значение рН	Целевое значение рН
E	4,47	4,5
F	4,44	4,5
G	3,93	4,0
H	4,98	5,0

Claims

1. Способ получения водного раствора с заданным значением рН, содержащего кислоту, основание и необязательно одну или несколько добавок, при этом указанный способ включает следующие стадии:

a) расчет теоретических концентраций кислоты и основания для раствора, в целях достижения заданного значения рН с помощью уравнения Гендерсона - Гассельбаха в комбинации с теорией Дебая - Хюккеля для по меньшей мере 5 различных концентраций добавок;

b) получение образца раствора для каждой концентрации добавок и измерение фактического уровня рН для каждой концентрации добавок;

c) расчет значения дельта рН (ΔpΗ), которое представляет собой разницу между теоретическим рН и фактическим рН, для каждой концентрации добавок;

d) создание математической модели, описывающей взаимосвязь ΔрΗ и концентрации добавки для по меньшей мере 5 различных концентраций добавок;

h) применение ΔрΗ-скорректированного значения рН для расчета концентраций кислоты и основания с использованием уравнения Гендерсона - Гассельбаха в комбинации с теорией Дебая - Хюккеля;

2. Способ получения водного раствора с заданным значением рН, содержащего кислоту, основание и необязательно одну или несколько добавок, при этом указанный способ включает следующие стадии:

a) расчет теоретических концентраций кислоты, основания и добавок для раствора для достижения заданного значения рН с помощью уравнения Гендерсона - Гассельбаха в комбинации с теорией Дебая - Хюккеля для по меньшей мере 5 различных концентраций добавок;

b) расчет значения ΔpΗ, которое представляет собой разницу между теоретическим значением рН и значением фактического уровня рН, для каждой концентрации добавок;

c) создание математической модели, описывающей взаимосвязь ΔрΗ и концентрации добавки для по меньшей мере 5 различных концентраций добавок;

d) выбор заданного значения рН и концентрации добавки;

g) применение ΔрΗ-скорректированного значения рН для расчета концентраций кислоты и основания с использованием уравнения Гендерсона - Гассельбаха в комбинации с теорией Дебая - Хюккеля;

3. Способ получения водного раствора с заданным значением рН, содержащего кислоту, основание и добавку, при этом указанный способ включает следующие стадии:

b) расчет ΔрΗ-скорректированного значения рН для водного раствора путем сравнения теоретического значения рН со значением рН, рассчитанным из уравнения, которое выведено из математической модели разницы между теоретическим значением рН и фактическим значением рН водного раствора для по меньшей мере 5 различных концентраций добавок;

c) применение ΔpΗ-скорректированного значения рН для расчета концентраций кислоты и основания с использованием уравнения Гендерсона - Гассельбаха в комбинации с теорией Дебая - Хюккеля;

4. Способ по п. 2 или 3, в котором значение фактического уровня рН водного раствора на стадии b) является заданным значением.

5. Способ по любому из пп. 1-3, в котором водный раствор представляет собой буферный раствор.

6. Способ по п. 5, в котором буферный раствор выбран из группы, состоящей из следующего: трис-буферы, натрий-фосфатные буферы, калий-фосфатные буферы, натрий-ацетатные буферы, буферы MES и буферы HEPES.

7. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором добавка представляет собой соль, выбранную из группы, состоящей из NaCI, KCl, Na₂SO₄, (NH₄)₂SO₄ и (NH₄)₃РO₄ и их смесей.

8. Способ по п. 7, в котором соль находится в концентрации до 2М.

9. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором при получении водного раствора из диапазона концентраций добавок выбрана более низкая минимальная концентрация добавки и более высокая максимальная концентрация добавки.

10. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором количество точек данных в диапазоне концентраций добавок составляет от 5 до 10.

11. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором заданное значение рН выбрано в пределах 1 единицы термодинамической величины рКа для этого раствора.

12. Аппарат для получения водного раствора с заданным значением рН, включающий в себя дозирующее устройство, способное подавать в смесительное устройство кислоту и основание, одну или несколько добавок, и, необязательно, разбавитель, при этом дозирующее устройство работает под контролем управляющего аппарата, для выполнения стадий от а) и c) до h) по п. 1; стадий от а) до g) по п. 2; или стадий от а) до с) по п. 3.

13. Аппарат по п. 12, дополнительно содержащий устройство для выполнения операции биологической обработки.

14. Аппарат по п. 13, в котором операция биологической обработки включает хроматографию, вирусную инактивацию, фильтрацию, ультрафильтрацию, рефолдинг, диафильтрацию, микрофильтрацию, кондиционирование в потоке или рефолдинг в потоке.

15. Аппарат по любому из пп. 12-14, в котором дозирующее устройство содержит насос, расположенный ниже от впускного регулятора потока с несколькими отверстиями и выше от смесительного устройства.