RU2795455C2 - Antibody against tie-2 and its use - Google Patents

Antibody against tie-2 and its use Download PDF

Info

Publication number
RU2795455C2
RU2795455C2 RU2021130448A RU2021130448A RU2795455C2 RU 2795455 C2 RU2795455 C2 RU 2795455C2 RU 2021130448 A RU2021130448 A RU 2021130448A RU 2021130448 A RU2021130448 A RU 2021130448A RU 2795455 C2 RU2795455 C2 RU 2795455C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
seq
antibody
light chain
heavy chain
region
Prior art date
Application number
RU2021130448A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2021130448A (en
Inventor
Ын-А ЛИ
Пом Ён ПАК
Ну Ли КАН
Чонхо ПАК
Юнкэ ЛИ
То-Юн КИМ
Вон Соп ЛИ
Чин-Сан Ю
Original Assignee
Фармабцин Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Фармабцин Инк. filed Critical Фармабцин Инк.
Publication of RU2021130448A publication Critical patent/RU2021130448A/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2795455C2 publication Critical patent/RU2795455C2/en

Links

Images

Abstract

FIELD: biotechnology.
SUBSTANCE: following are presented: an antibody or its antigen-binding fragment that binds to TIE-2 tyrosine-protein kinase receptor and a method for their production, a nucleic acid encoding an antibody or its antigen-binding fragment, an expression vector, a cell transformed with an expression vector to obtain an antibody or its antigen-binding fragment. Also a composition is provided for preventing or treating an angiogenesis-related disease, a composition for stabilizing blood vessels, a composition for diagnosing an angiogenesis-related disease, a composition for preventing or treating cancer, a composition for preventing or treating a tumor, and the use of a composition containing a pharmaceutically effective the amount of the antibody or antigen-binding fragment thereof.
EFFECT: invention makes it possible to obtain an antibody or its antigen-binding fragment that binds to TIE-2 tyrosine-protein kinase receptor, as well as compositions for the prevention or treatment of an angiogenesis-related disease.
16 cl, 18 dwg, 4 tbl, 13 ex

Description

Область техники, к которой относится изобретениеThe field of technology to which the invention belongs

Настоящее изобретение касается антитела, которое специфически связывается с TIE2 (тирозинпротеинкиназным рецептором) и обладает функцией нормализации и стабилизации кровеносных сосудов посредством фосфорилирования рецептора. Более конкретно, настоящее изобретение касается антитела против TIE2, кодирующих его нуклеиновых кислот, векторов, содержащих эти нуклеиновые кислоты, клеток, трансформированных этими векторами, стабилизатора сосудов и содержащих его композиций для лечения связанных с ангиогенезом заболеваний, фармацевтических композиций для лечения опухолей или рака и композиций для комбинированного применения с другими лекарственными средствами, чем антитело, связывающееся с TIE2.The present invention relates to an antibody that specifically binds to TIE2 (tyrosine protein kinase receptor) and has the function of normalizing and stabilizing blood vessels by phosphorylation of the receptor. More specifically, the present invention relates to an anti-TIE2 antibody, nucleic acids encoding it, vectors containing these nucleic acids, cells transformed with these vectors, a vascular stabilizer and compositions containing it for the treatment of angiogenesis-related diseases, pharmaceutical compositions for the treatment of tumors or cancer, and compositions for combined use with other drugs than an antibody that binds to TIE2.

Уровень техникиState of the art

Ангиогенез - это механизм, посредством которого образуются новые кровеносные сосуды из существующих кровеносных сосудов в результате роста, деления, миграции и т.п.эндотелиальных клеток, который играет ключевую роль в нормальных процессах роста, включая заживление ран и менструальный цикл женщин (Risau, Nature, 386: 671, 1997). Кроме того, известно, что аномально чрезмерный ангиогенез сильно влияет на такие заболевания, как рост опухолей и метастазирование, возрастная дегенерация желтого пятна (ARMD), диабетическая ретинопатия, псориаз, ревматоидный артрит и хроническое воспаление (Carmeliet and Jain, Nature, 407:249, 2000).Angiogenesis is the mechanism by which new blood vessels form from existing blood vessels through endothelial cell growth, division, migration, and the like, and plays a key role in normal growth processes, including wound healing and the female menstrual cycle (Risau, Nature , 386: 671, 1997). In addition, abnormally excessive angiogenesis is known to strongly influence diseases such as tumor growth and metastasis, age-related macular degeneration (ARMD), diabetic retinopathy, psoriasis, rheumatoid arthritis, and chronic inflammation (Carmeliet and Jain, Nature, 407:249, 2000).

Развитие ангиогенеза определяется общим балансом факторов, индуцирующих ангиогенез и ингибирующих ангиогенез, и происходит посредством сложного и последовательного процесса, включающего несколько стадий. Процесс ангиогенеза протекает следующим образом. Сначала различные факторы, индуцирующие ангиогенез, включая фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), секретируемые из опухолей или поврежденных тканей, связываются с соответствующими рецепторами у существующих эндотелиальных клеток сосудов, расположенных рядом с ними, активируя эндотелиальные клетки сосудов и тем самым улучшая проницаемость эндотелиальных клеток сосудов, которые секретируют протеолитические ферменты типа матриксной металлопротеиназы (MMP) для разрушения матрикса и внеклеточного матрикса вокруг эндотелиальных клеток сосудов, за счет этого обеспечивая пролиферацию эндотелиальных клеток сосудов и их миграцию из существующих капилляров к тканям, секретирующим факторы, индуцирующие ангиогенез.The development of angiogenesis is determined by the overall balance of factors inducing angiogenesis and inhibiting angiogenesis, and occurs through a complex and sequential process, including several stages. The process of angiogenesis proceeds as follows. First, various angiogenesis-inducing factors, including vascular endothelial growth factor (VEGF), secreted from tumors or damaged tissues, bind to appropriate receptors on existing vascular endothelial cells adjacent to them, activating vascular endothelial cells and thereby improving vascular endothelial cell permeability. which secrete proteolytic enzymes such as matrix metalloproteinase (MMP) to degrade the matrix and extracellular matrix around vascular endothelial cells, thereby allowing vascular endothelial cells to proliferate and migrate from existing capillaries to tissues secreting angiogenesis-inducing factors.

Мигрировавшие и пролиферировавшие эндотелиальные клетки сосудов образуют внутрисосудистые структуры, а затем появляются сосудистые перициты, которые являются структурной опорой эндотелиальных клеток сосудов, что приводит к стабильному и зрелому ангиогенезу. В это же время ангиопоэтин 1 (ANG1), секретируемый из эндотелиальных клеток сосудов, связывается со своим рецептором, TIE-2, и тем самым играет ключевую роль в появлении сосудистых перицитов и стабилизации кровеносных сосудов (Suri et al., Cell, 87:1171, 1996).The migrating and proliferating vascular endothelial cells form intravascular structures, and then vascular pericytes appear, which are the structural support of vascular endothelial cells, which leads to stable and mature angiogenesis. At the same time, angiopoietin 1 (ANG1), secreted from vascular endothelial cells, binds to its receptor, TIE-2, and thus plays a key role in the appearance of vascular pericytes and the stabilization of blood vessels (Suri et al., Cell, 87:1171 , 1996).

Между тем, ангиопоэтин 2 (ANG2) гиперэкспрессируется в раковых тканях, в которых активно протекает ангиогенез, или же в плаценте, матке и яичниках, то есть в нормальных тканях, в которых происходит активное ремоделирование кровеносных сосудов (Kong et al., Cancer Res., 61:6248, 2001; Ahmad et al., Cancer, 92:1138, 2001), а когда ANG2 присутствует в количестве, превышающем ANG1, то в результате запускается опухолевый ангиогенез (Linda et al., Cell Research, 13(5), 309-317, 2003). Все это интерпретируется так, что ANG2 действует в качестве антагониста в сигнальном механизме TIE-2, способствуя ангиогенезу, а ANG1 действует в качестве агониста для нормализации структуры сосудов.Meanwhile, angiopoietin 2 (ANG2) is overexpressed in cancer tissues that are actively undergoing angiogenesis, or in the placenta, uterus, and ovaries, i.e., in normal tissues where active remodeling of blood vessels occurs (Kong et al., Cancer Res. , 61:6248, 2001; Ahmad et al., Cancer, 92:1138, 2001), and when ANG2 is present in excess of ANG1, tumor angiogenesis is triggered as a result (Linda et al., Cell Research, 13(5) , 309-317, 2003). All of this is interpreted to mean that ANG2 acts as an antagonist in the TIE-2 signaling mechanism to promote angiogenesis, while ANG1 acts as an agonist to normalize vascular structure.

Как описано выше, процесс ангиогенеза в основном осуществляется по сигнальному механизму VEGF/VEGFR2, но для преодоления сосудистой утечки, вызванной ангиогенезом, важен сигнальный механизм ANG1-TIE2 с учетом стыковки эндотелиальных клеток сосудов и рекрутирования сосудистых перицитов.As described above, the process of angiogenesis is mainly carried out by the VEGF/VEGFR2 signaling mechanism, but ANG1-TIE2 signaling is important in order to overcome angiogenesis-induced vascular leakage, taking into account the docking of vascular endothelial cells and the recruitment of vascular pericytes.

В частности, когда интерстициальное давление возрастает вследствие сосудистой утечки, в новых кровеносных сосудах опухолей возникает гипоксия и тканевой некроз из-за сдавливания сосудов (Folkman J. et al., N. Engl. J. Med. 333:1757-63, 1995). По этой причине, даже если опухоль подвергается обработке терапевтическими средствами, терапевтический эффект снижается из-за снижения поступления препарата внутрь ткани (Gianfranco Baronzio et al., Front. Oncol. 5: 165, 2015).In particular, when interstitial pressure increases due to vascular leakage, hypoxia and tissue necrosis occurs in the new blood vessels of tumors due to vessel compression (Folkman J. et al., N. Engl. J. Med. 333:1757-63, 1995) . For this reason, even if the tumor is treated with therapeutic agents, the therapeutic effect is reduced due to reduced drug delivery into the tissue (Gianfranco Baronzio et al., Front. Oncol. 5: 165, 2015).

Таким образом, для нормализации сосудов можно справиться с утечкой из новых кровеносных сосудов в опухоли путем активации сигнального механизма фосфорилирования TIE2. В конечном счете, это должно усилить поступление препарата и тем самым обеспечить противораковое действие, превосходящее таковое при стандартной монотерапии. Кроме того, нормализация сосудов снижает интерстициальное давление в тканях и ослабляет гипоксию, поэтому она должна обладать высоким потенциалом для лечения заболеваний, вызванных сосудистой утечкой, таких как язвы на ступнях, гипертония и диабетическая ретинопатия.Thus, for vascular normalization, leakage from new blood vessels into tumors can be dealt with by activating the TIE2 phosphorylation signaling mechanism. Ultimately, this should enhance drug delivery and thereby provide an anti-cancer effect that is superior to that of standard monotherapy. In addition, vascular normalization reduces tissue interstitial pressure and alleviates hypoxia, so it should have high potential for treating diseases caused by vascular leakage such as foot ulcers, hypertension, and diabetic retinopathy.

Кроме того, поскольку микросреда в опухоли перепрограммируется из существующего иммуносупрессивного состояния в иммунотолерантное состояние по мере усиления притока иммуноэффекторных Т-клеток при нормализации сосудов после применения сосудистых стабилизаторов (Huang et al., 2013, Cancer Research), то антитела против TIE2 вызывают нормализацию сосудов и тем самым усиливают приток иммуноэффекторных Т-клеток при введении в комбинации с ингибиторами контрольных точек иммунитета и т.п., усиливая иммунную активность, а тем самым и противораковое действие.In addition, because the tumor microenvironment is reprogrammed from an existing immunosuppressive state to an immunotolerant state as the influx of immunoeffector T cells increases with vascular normalization after application of vascular stabilizers (Huang et al., 2013, Cancer Research), anti-TIE2 antibodies cause vascular normalization and thereby enhancing the influx of immune effector T cells when administered in combination with immune checkpoint inhibitors and the like, enhancing immune activity and thereby anti-cancer activity.

На этом техническом фоне авторы настоящего изобретения попытались получить антитело против TIE2. В результате они разработали антитело против TIE2, которое проявляет требуемую способность к связыванию с TIE2, и обнаружили, что это антитело против TIE2 действует в качестве стабилизатора сосудов, уменьшая утечку из сосудов, и предположили, что антитело против TIE2 будет применимо в качестве терапевтического средства для большинства видов рака и для лечения язв на ступнях и диабетической ретинопатии, связанных с аномальным ангиогенезом, наряду с раком. В частности, ожидается, что противораковое антитело к TIE2 будет способно стабилизировать кровеносные сосуды при введении вместе с традиционными терапевтическими средствами, тем самым повышая скорость доставки стандартных терапевтических средств и улучшая иммунную среду в микроокружении опухолей, проявляя при этом отличные противораковые эффекты в сочетании с иммунотерапевтическими средствами. На основе этой разработки и было совершено настоящее изобретение.Against this technical background, the authors of the present invention attempted to obtain an antibody against TIE2. As a result, they developed an anti-TIE2 antibody that exhibits the required ability to bind to TIE2, and found that this anti-TIE2 antibody acts as a vascular stabilizer to reduce vascular leakage, and suggested that an anti-TIE2 antibody would be useful as a therapeutic agent for most types of cancer and for the treatment of foot ulcers and diabetic retinopathy associated with abnormal angiogenesis, along with cancer. In particular, anti-TIE2 anti-cancer antibody is expected to be able to stabilize blood vessels when administered together with conventional therapeutic agents, thereby increasing the delivery rate of standard therapeutic agents and improving the immune environment in the tumor microenvironment, while exhibiting excellent anti-cancer effects when combined with immunotherapeutic agents. . Based on this development, the present invention was made.

Сущность изобретенияThe essence of the invention

Таким образом, одной из задач настоящего изобретения является получение нового антитела к TIE2 либо его антигенсвязывающего фрагмента.Thus, one of the objectives of the present invention is to obtain a new antibody to TIE2 or antigennegative fragment.

Другой задачей настоящего изобретения является получение нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело либо его антигенсвязывающий фрагмент.Another object of the present invention is to obtain a nucleic acid encoding an antibody or antigen-binding fragment.

Другой задачей настоящего изобретения является получение вектора, включающего нуклеиновую кислоту, клетки, трансформированной вектором, и способа их получения.Another object of the present invention is to obtain a vector comprising a nucleic acid, a cell transformed with the vector, and a method for their production.

Другой задачей настоящего изобретения является получение фармацевтических композиций для профилактики и/или лечения опухолей или заболеваний, связанных с ангиогенезом, содержащих антитело либо его антигенсвязывающий фрагмент, в качестве активного ингредиента.Another object of the present invention is to provide pharmaceutical compositions for the prevention and/or treatment of tumors or diseases associated with angiogenesis, containing an antibody or antigen-binding fragment as an active ingredient.

Другой задачей настоящего изобретения является получение фармацевтических композиций для стабилизации и/или нормализации сосудов, содержащих антитело либо его антигенсвязывающий фрагмент, в качестве активного ингредиента.Another object of the present invention is to provide pharmaceutical compositions for stabilizing and/or normalizing blood vessels containing an antibody or antigen-binding fragment as an active ingredient.

Другой задачей настоящего изобретения является получение фармацевтической композиции для монотерапии и/или для комбинированной терапии с другим терапевтическим средством, содержащей антитело либо его антигенсвязывающий фрагмент, в качестве активного ингредиента.Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for monotherapy and/or combination therapy with another therapeutic agent containing an antibody or antigen-binding fragment as an active ingredient.

В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, вышеприведенные и другие задачи могут решаться путем получения антитела либо его антигенсвязывающего фрагмента, связывающихся с TIE-2 (тирозинпротеинкиназным рецептором), которые включают:In accordance with one aspect of the present invention, the above and other objects can be solved by obtaining an antibody or antigen-binding fragment that binds to TIE-2 (tyrosine protein kinase receptor), which include:

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую участок, определяющий комплементарность связывания с антигеном (CDR1) тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 7, 13, 19, 25 и 31, CDR2 тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 8, 14, 20, 26 и 32, и CDR3 тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 9, 15, 21, 27 и 33, иa heavy chain variable region comprising a heavy chain complementarity binding antigen binding site (CDR1) selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 7, 13, 19, 25 and 31, a heavy chain CDR2 selected from the group consisting of of SEQ ID NOs: 2, 8, 14, 20, 26 and 32, and a heavy chain CDR3 selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3, 9, 15, 21, 27 and 33, and

вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 10, 16, 22, 28 и 34, CDR2 легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 11, 17, 23, 29 и 35, и CDR3 легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, 12, 18, 24, 30 и 36.a light chain variable region comprising a light chain CDR1 selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 4, 10, 16, 22, 28 and 34, a light chain CDR2 selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 5, 11, 17, 23, 29 and 35, and a light chain CDR3 selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 6, 12, 18, 24, 30 and 36.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предусмотрена нуклеиновая кислота, кодирующая антитело либо его антигенсвязывающий фрагмент.In accordance with another aspect of the present invention, a nucleic acid encoding an antibody, or an antigen-binding fragment thereof, is provided.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предусмотрен вектор, включающий нуклеиновую кислоту.In accordance with another aspect of the present invention, a vector comprising a nucleic acid is provided.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предусмотрена клетка, трансформированная вектором. В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, предусмотрен способ получения антитела, связывающегося с TIE-2, либо его антигенсвязывающего фрагмента, включающий (a) культивирование клетки и (b) выделение антитела либо его антигенсвязывающего фрагмента из культивируемой клетки.In accordance with another aspect of the present invention, a cell transformed with a vector is provided. In accordance with another aspect of the present invention, a method is provided for producing an antibody that binds to TIE-2, or an antigen-binding fragment thereof, comprising (a) culturing a cell, and (b) isolating the antibody, or an antigen-binding fragment thereof, from a cultured cell.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предусмотрен стабилизатор сосудов и/или композиция для лечения связанных с ангиогенезом заболеваний, содержащие антитело либо его антигенсвязывающий фрагмент.In accordance with another aspect of the present invention, a vascular stabilizer and/or composition for the treatment of angiogenesis-related diseases is provided, comprising an antibody or an antigen-binding fragment thereof.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предусмотрен стабилизатор сосудов и/или композиция для диагностики связанных с ангиогенезом заболеваний, содержащие антитело либо его антигенсвязывающий фрагмент.In accordance with another aspect of the present invention, there is provided a vascular stabilizer and/or composition for diagnosing angiogenesis related diseases, comprising an antibody or an antigen-binding fragment thereof.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предусмотрена композиция для профилактики или лечения опухоли или рака и/или связанных с ангиогенезом заболеваний, содержащая антитело либо его антигенсвязывающий фрагмент.In accordance with another aspect of the present invention, a composition is provided for the prevention or treatment of a tumor or cancer and/or angiogenesis-related diseases, comprising an antibody or an antigen-binding fragment thereof.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предусмотрена композиция для комбинированного введения с антителом против TIE2.In accordance with another aspect of the present invention, a composition is provided for combined administration with an anti-TIE2 antibody.

Краткое описание фигурBrief description of the figures

На фиг.1A и 1B представлены результаты проточной цитометрии по оценке связывания антител против TIE2 с клетками, экспрессирующими TIE2 человека и мыши, соответственно.On figa and 1B presents the results of flow cytometry to assess the binding of antibodies against TIE2 with cells expressing TIE2 human and mouse, respectively.

На фиг.2 представлены результаты ELISA по оценке связывания кратковременно экспрессированных и очищенных антител против TIE2 с TIE2 человека и мыши.2 shows the results of an ELISA to assess the binding of transiently expressed and purified anti-TIE2 antibodies to human and mouse TIE2.

На фиг.3A-3C представлены результаты по оценке действия антител против TIE2 на миграцию клеток с использованием клеток линии HUVEC.On figa-3C presents the results of evaluating the effect of antibodies against TIE2 on cell migration using cells of the HUVEC line.

На фиг.4 представлены результаты, показывающие, что отобранное антитело против TIE2 связывается с TIE2 неконкурентно по отношению к ANG1 или ANG2.Figure 4 presents the results showing that the selected anti-TIE2 antibody binds to TIE2 non-competitively with respect to ANG1 or ANG2.

На фиг.5A-5C представлены результаты, показывающие, что отобранное антитело против TIE2 может ингибировать индуцированную VEGF проницаемость сосудов.On figa-5C presents the results showing that the selected antibody against TIE2 can inhibit VEGF-induced vascular permeability.

На фиг.6 представлены результаты, показывающие, что отобранное антитело против TIE2 действует по механизму понижающей регуляции сигналлинга TIE2, подобно ANG1.Figure 6 presents the results showing that the selected anti-TIE2 antibody acts by a down-regulation mechanism of TIE2 signaling, similar to ANG1.

На фиг.7 представлены результаты, показывающие, что межклеточные адгезионные контакты на уровне белка в клетках определяют эффект стабилизации сосудов у отобранного антитела против TIE2.Figure 7 presents the results showing that cell-to-cell adhesion contacts at the protein level in cells determine the vascular stabilization effect of the selected anti-TIE2 antibody.

На фиг.8A и 8B представлено улучшение межклеточных адгезионных контактов под действием антитела против TIE2.On figa and 8B shows the improvement of intercellular adhesive contacts under the action of antibodies against TIE2.

На фиг.9 показано, что антитело против TIE2 может нормализировать индуцированную VEGF сосудистую утечку посредством сигналлинга TIE2 в ушах мыши.9 shows that an anti-TIE2 antibody can normalize VEGF-induced vascular leakage via TIE2 signaling in mouse ears.

На фиг.10A-10C представлены результаты по оценке ингибирующего действия антитела против TIE2 на ангиогенез в сетчатке.On figa-10C presents the results of the evaluation of the inhibitory effect of antibodies against TIE2 on angiogenesis in the retina.

На фиг.11A и 11B представлены результаты по оценке нормализирующего действия антитела против TIE2 на сосуды в опухоли.On figa and 11B presents the results of the evaluation of the normalizing effect of antibodies against TIE2 on vessels in the tumor.

На фиг.12A-12D представлены результаты по оценке противоопухолевого действия антитела против TIE2.On figa-12D presents the results of evaluating the antitumor activity of antibodies against TIE2.

На фиг.13A-13C представлены результаты по оценке эффекта ослабления гипоксии у антитела против TIE2.On figa-13C presents the results of the evaluation of the effect of attenuating hypoxia in antibodies against TIE2.

Раскрытие сущности изобретенияDisclosure of the essence of the invention

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют такие же значения, как и те, что приняты специалистами в той области, к которой относится настоящее изобретение. В целом, используемая здесь номенклатура хорошо известна в данной области и обычно она и применяется.Unless otherwise indicated, all technical and scientific terms used herein have the same meanings as those accepted by specialists in the field to which the present invention relates. In general, the nomenclature used here is well known in the art and is generally used.

Авторы настоящего изобретения отобрали новое антитело против TIE2. При активации TIE2 антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, связывающимися с TIE2, согласно настоящему изобретению, кровеносные сосуды могут нормализироваться, чтобы предотвратить усиление гипоксии внутри опухоли или ракового новообразования, повысить приток крови к опухоли или раковому новообразованию и обеспечить достаточное поступление кислорода, тем самым повышая содержание других доставляемых противораковых препаратов и проникновение их в иммунные клетки.The authors of the present invention selected a new antibody against TIE2. By activating TIE2 by an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to TIE2 according to the present invention, blood vessels can be normalized to prevent increased hypoxia within a tumor or cancer, increase blood flow to the tumor or cancer, and ensure sufficient oxygen supply, thereby increasing blood levels. other delivered anticancer drugs and their penetration into immune cells.

В одном аспекте настоящего изобретения предусмотрено антитело либо его антигенсвязывающий фрагмент, связывающиеся с TIE-2, включающие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 7, 13, 19, 25 и 31, CDR2 тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 8, 14, 20, 26 и 32, и CDR3 тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 9, 15, 21, 27 и 33, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 10, 16, 22, 28 и 34, CDR2 легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 11, 17, 23, 29 и 35, и CDR3 легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, 12, 18, 24, 30 и 36.In one aspect of the present invention, an antibody or antigen-binding fragment thereof is provided that binds to TIE-2, comprising a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR1 selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 1, 7, 13, 19, 25, and 31 , a heavy chain CDR2 selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 8, 14, 20, 26 and 32, and a heavy chain CDR3 selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3, 9, 15, 21, 27 and 33 and a light chain variable region comprising a light chain CDR1 selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 4, 10, 16, 22, 28 and 34, a light chain CDR2 selected from the group consisting of SEQ ID NOs. : 5, 11, 17, 23, 29 and 35, and a light chain CDR3 selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 6, 12, 18, 24, 30 and 36.

В настоящем изобретении термин “антитело” означает такое антитело, которое специфически связывается с TIE-2. В объем настоящего изобретения входят не только полноразмерное антитело, специфически связывающееся с TIE2, но также антигенсвязывающий фрагмент этого антитела.In the present invention, the term "antibody" means an antibody that specifically binds to TIE-2. The scope of the present invention includes not only a full-length antibody that specifically binds to TIE2, but also an antigen-binding fragment of this antibody.

Термин “полноразмерное антитело” относится к структуре, содержащей две полноразмерные легкие цепи и две полноразмерные тяжелые цепи, причем каждая легкая цепь соединяется с соответствующей тяжелой цепью дисульфидной связью. Константная область тяжелой цепи включает изотипы гамма (γ), мю (μ), альфа (α), дельта (δ) и эпсилон (ε) и подразделяется на гамма-1 (γ1), гамма-2 (γ2), гамма-3 (γ3), гамма-4 (γ4), альфа-1 (α1) и альфа-2 (α2). Константная область легкой цепи включает изотипы каппа (κ) и лямбда (λ).The term "full-length antibody" refers to a structure containing two full-length light chains and two full-length heavy chains, with each light chain connected to the corresponding heavy chain by a disulfide bond. The heavy chain constant region includes the isotypes gamma (γ), mu (μ), alpha (α), delta (δ) and epsilon (ε) and is subdivided into gamma-1 (γ1), gamma-2 (γ2), gamma-3 (γ3), gamma-4 (γ4), alpha-1 (α1) and alpha-2 (α2). The light chain constant region includes the kappa (κ) and lambda (λ) isotypes.

Антигенсвязывающий фрагмент антитела или фрагмент антитела представляет собой такой фрагмент, который обладает способностью связываться с антигеном и включает Fab, F(ab′), F(ab′)2, Fv и др. Среди фрагментов антитела Fab означает структуру, которая включает вариабельную область каждой из тяжелых цепей и легких цепей, константную область легкой цепи и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи, причем каждый Fab-фрагмент содержит один антигенсвязывающий сайт.Fab′ отличается от Fab тем, что он также включает шарнирную область, содержащую по меньшей мере один остаток цистеина на С-конце домена CH1 тяжелой цепи. F(ab′)2 образуется за счет дисульфидной связи между остатками цистеина в шарнирной области Fab′. Fv - минимальный фрагмент антител, содержащий только вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи. Двухцепочечный Fv - это фрагмент, в котором вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи соединяются нековалентной связью, а одноцепочечный Fv (scFv) - это фрагмент, в котором вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи обычно соединяются ковалентной связью через пептидный линкер между ними или же непосредственно на C-конце, образуя структуру в форме димера типа двухцепочечного Fv. Такие фрагменты антител могут быть получены с помощью протеаз (например, Fab может быть получен при расщеплении полноразмерного антитела папаином, а F(ab′)2-фрагмент - при расщеплении полноразмерного антитела пепсином), а также методами генетической рекомбинации.An antigen-binding fragment of an antibody or an antibody fragment is one that has the ability to bind to an antigen and includes Fab, F(ab'), F(ab') 2 , Fv, etc. Among antibody fragments, Fab means a structure that includes the variable region of each of heavy chains and light chains, a light chain constant region and a first constant domain (C H1 ) of the heavy chain, with each Fab fragment containing one antigen binding site. Fab′ differs from Fab in that it also includes a hinge region containing at least one cysteine residue at the C-terminus of the C H1 domain of the heavy chain. F(ab') 2 is formed by a disulfide bond between cysteine residues in the Fab' hinge region. Fv is the minimum antibody fragment containing only the heavy chain variable region and the light chain variable region. A double chain Fv is a fragment in which a heavy chain variable region and a light chain variable region are joined by a non-covalent bond, and a single chain Fv (scFv) is a fragment in which a heavy chain variable region and a light chain variable region are normally joined by a covalent bond via a peptide linker between them or directly at the C-terminus, forming a structure in the form of a dimer type double-stranded Fv. Such antibody fragments can be obtained using proteases (for example, Fab can be obtained by cleavage of a full-length antibody with papain, and F(ab') 2 fragment by cleavage of a full-length antibody with pepsin), as well as by genetic recombination methods.

В одном воплощении антитело по настоящему изобретению представляет собой Fv (к примеру, scFv) или полноразмерное антитело. Кроме того, константная область тяжелой цепи может иметь изотип, выбранный из изотипов гамма (γ), мю (μ), альфа (α), дельта (δ) и эпсилон (ε). Например, константная область может быть гамма-1 (IgG1), гамма-3 (IgG3) или гамма-4 (IgG4), а константная область легкой цепи может иметь изотип каппа или лямбда.In one embodiment, the antibody of the present invention is an Fv (eg, scFv) or a full length antibody. In addition, the heavy chain constant region may have an isotype selected from gamma (γ), mu (μ), alpha (α), delta (δ), and epsilon (ε) isotypes. For example, the constant region may be gamma-1 (IgG1), gamma-3 (IgG3), or gamma-4 (IgG4), and the light chain constant region may be kappa or lambda isotype.

Согласно настоящему изобретению, термин “тяжелая цепь” охватывает как полноразмерную тяжелую цепь, которая включает вариабельный домен (VH), содержащий аминокислотную последовательность, достаточную для придания специфичности к антигену, и три константных домена (CH1, CH2 и CH3), так и ее фрагменты. В настоящем изобретении термин “легкая цепь” охватывает как полноразмерную легкую цепь, которая включает вариабельный домен (VL), содержащий аминокислотную последовательность, достаточную для придания специфичности к антигену, и константный домен (CL), так и ее фрагменты.According to the present invention, the term “heavy chain” encompasses both the full-length heavy chain, which includes a variable domain (V H ) containing an amino acid sequence sufficient to confer antigen specificity, and three constant domains (C H1 , C H2 and C H3 ), and its fragments. In the present invention, the term “light chain” encompasses both the full-length light chain, which includes a variable domain (V L ) containing an amino acid sequence sufficient to confer antigen specificity, and a constant domain (C L ), and fragments thereof.

Антитела по настоящему изобретению включают, без ограничения, моноклональные антитела, мультиспецифичные антитела, человеческие антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела, scFV, одноцепочечные антитела, Fab-фрагменты, F(ab′)-фрагменты, Fvs с дисульфидной связью (sdFVs), антиидиотипические (анти-Id) антитела, эпитопсвязывающие фрагменты таких антител и др.Antibodies of the present invention include, without limitation, monoclonal antibodies, multispecific antibodies, human antibodies, humanized antibodies, chimeric antibodies, scFV, single chain antibodies, Fab fragments, F(ab′) fragments, disulfide-linked Fvs (sdFVs), anti-idiotypic (anti-Id) antibodies, epitope-binding fragments of such antibodies, etc.

Термин “моноклональное антитело” относится к идентичным антителам, каждое из которых получают из популяции практически однородных антител, составляющих популяцию, за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в незначительном числе. Моноклональные антитела высокоспецифичны, так как они вырабатываются против одного антигенного сайта. В отличие от обычных (поликлональных) препаратов антител, которые, как правило, включают различные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты антигена.The term "monoclonal antibody" refers to identical antibodies, each of which is obtained from a population of substantially homogeneous antibodies that make up the population, with the exception of possible natural mutations, which may be present in small numbers. Monoclonal antibodies are highly specific because they are produced against a single antigenic site. Unlike conventional (polyclonal) antibody preparations, which typically include different antibodies directed against different determinants (epitopes), each monoclonal antibody is directed against a single antigen determinant.

Термин “эпитоп” означает такую детерминанту белка, с которой антитело может специфически связываться. Эпитопы обычно состоят из группы химически активных поверхностных молекул типа боковых цепей аминокислот или сахаров и обычно имеют не только специфические трехмерные структурные характеристики, но и специфические характеристики заряда. Трехмерные эпитопы отличаются от нетрехмерных эпитопов тем, что связь с первыми разрывается в присутствии денатурирующего растворителя, тогда как связь с последними не разрывается.The term "epitope" means a protein determinant to which an antibody can specifically bind. Epitopes usually consist of a group of reactive surface molecules such as amino acid or sugar side chains and usually have not only specific three-dimensional structural characteristics, but also specific charge characteristics. Three-dimensional epitopes differ from non-three-dimensional epitopes in that the bond to the former is broken in the presence of a denaturing solvent, while the bond to the latter is not.

Нечеловеческие (например, мышиные) антитела в “гуманизированной” форме - это химерные антитела, включающие одну или несколько аминокислотных последовательностей (например, последовательностей CDR), происходящих из одного или нескольких нечеловеческих антител (донорных или исходных антител), содержащих минимальные последовательности, полученные из нечеловеческих иммуноглобулинов. В большинстве случаев гуманизированное антитело представляет собой иммуноглобулин человека (акцепторное антитело), в котором остатки из гипервариабельного участка реципиента заменены на остатки из гипервариабельного участка другого вида (донорного антитела) типа мыши, крысы, кролика или нечеловекообразного примата, обладающего требуемой специфичностью, аффинностью и активностью. Для гуманизирования можно заменить остатки в одном или нескольких каркасных доменах (FRs) вариабельной области акцепторного антитела человека на соответствующие остатки из донорного антитела другого вида. Это способствует поддержанию правильной трехмерной конфигурации пересаженных участков CDR, тем самым улучшая аффинность и стабильность антитела. Гуманизированные антитела также могут включать и новые остатки, которые отсутствуют в акцепторных или донорных антителах, к примеру, для дальнейшего улучшения характеристик антител.Non-human (e.g., murine) antibodies in "humanized" form are chimeric antibodies comprising one or more amino acid sequences (e.g., CDR sequences) derived from one or more non-human antibodies (donor or parent antibodies) containing minimal sequences derived from non-human immunoglobulins. In most cases, a humanized antibody is a human immunoglobulin (acceptor antibody) in which residues from the hypervariable region of the recipient are replaced with residues from the hypervariable region of another species (donor antibody) such as a mouse, rat, rabbit or non-human primate, which has the required specificity, affinity and activity . For humanization, residues in one or more framework domains (FRs) of a human acceptor antibody variable region can be replaced with corresponding residues from a different species of donor antibody. This helps maintain the correct three-dimensional configuration of the CDR grafts, thereby improving the affinity and stability of the antibody. Humanized antibodies can also include new residues that are not present in the acceptor or donor antibodies, for example, to further improve the performance of the antibodies.

Согласно настоящему изобретению термин “человеческое антитело” относится к молекулам, происходящим из человеческого иммуноглобулина, в которых все аминокислотные последовательности, составляющие антитело, включая участки, определяющие комплементарность связывания с антигеном, и структурные участки, имеют принадлежность к иммуноглобулинам человека.According to the present invention, the term "human antibody" refers to molecules derived from human immunoglobulin, in which all amino acid sequences that make up the antibody, including antigen-binding complementarity-determining regions and structural regions, belong to human immunoglobulins.

Часть тяжелой цепи и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующей последовательности антител, происходящих из организма определенного вида или принадлежащих к определенному классу или подклассу антител, а остальная часть (части) “химерного” антитела (иммуноглобулина), идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител, происходящих из организма другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также их фрагментам, проявляющим требуемую биологическую активность.Part of the heavy chain and / or light chain is identical or homologous to the corresponding sequence of antibodies derived from an organism of a certain species or belonging to a certain class or subclass of antibodies, and the rest (parts) of the "chimeric" antibody (immunoglobulin) are identical or homologous to the corresponding antibody sequences, originating from an organism of another species or belonging to another class or subclass of antibodies, as well as their fragments that exhibit the desired biological activity.

В настоящем изобретении термин “вариабельная область антитела” относится к таким областям легкой и тяжелой цепи молекул антител, которые включают аминокислотные последовательности участков, определяющих комплементарность связывания с антигеном (CDR; т.е. CDR1, CDR2 и CDR3) и каркасных участков (FR). VH обозначает вариабельную область тяжелой цепи. VL обозначает вариабельную область легкой цепи.In the present invention, the term “antibody variable region” refers to those regions of the light and heavy chain of antibody molecules that include the amino acid sequences of antigen binding complementarity determining regions (CDR; i.e. CDR1, CDR2 and CDR3) and framework regions (FR) . V H denotes the variable region of the heavy chain. V L denotes the variable region of the light chain.

Термин “участок, определяющий комплементарность связывания с антигеном” (CDR; то есть CDR1, CDR2 и CDR3) относится к таким аминокислотным остаткам вариабельной области антител, которые необходимы для связывания антигена. Каждая вариабельная область обычно содержит три участка CDR, обозначаемых как CDR1, CDR2 и CDR3.The term “antigen binding complementarity determining region” (CDR; ie, CDR1, CDR2, and CDR3) refers to those amino acid residues in the variable region of an antibody that are required for antigen binding. Each variable region typically contains three CDRs, referred to as CDR1, CDR2 and CDR3.

В частности, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи SEQ ID NO: 2 и CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи SEQ ID NO: 4, CDR2 легкой цепи SEQ ID NO: 5 и CDR3 легкой цепи SEQ ID NO: 6;In particular, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 1, a heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 2, and a heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 3, and a light chain variable region comprising CDR1 light chain SEQ ID NO: 4, light chain CDR2 SEQ ID NO: 5 and light chain CDR3 SEQ ID NO: 6;

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи SEQ ID NO: 7, CDR2 тяжелой цепи SEQ ID NO: 8 и CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 9, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи SEQ ID NO: 10, CDR2 легкой цепи SEQ ID NO: 11 и CDR3 легкой цепи SEQ ID NO: 12;a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 7, a heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 8 and a heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 9, and a light chain variable region comprising a light chain CDR1 of SEQ ID NO: 10, a CDR2 light chain SEQ ID NO: 11 and light chain CDR3 SEQ ID NO: 12;

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи SEQ ID NO: 13, CDR2 тяжелой цепи SEQ ID NO: 14 и CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 15, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи SEQ ID NO: 16, CDR2 легкой цепи SEQ ID NO: 17 и CDR3 легкой цепи SEQ ID NO: 18;a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 13, a heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 14 and a heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 15, and a light chain variable region comprising a light chain CDR1 of SEQ ID NO: 16, a CDR2 light chain SEQ ID NO: 17 and light chain CDR3 SEQ ID NO: 18;

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи SEQ ID NO: 19, CDR2 тяжелой цепи SEQ ID NO: 20 и CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 21, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи SEQ ID NO: 22, CDR2 легкой цепи SEQ ID NO: 23 и CDR3 легкой цепи SEQ ID NO: 24;a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 19, a heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 20 and a heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 21, and a light chain variable region comprising a light chain CDR1 of SEQ ID NO: 22, a CDR2 light chain SEQ ID NO: 23 and light chain CDR3 SEQ ID NO: 24;

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи SEQ ID NO: 25, CDR2 тяжелой цепи SEQ ID NO: 26 и CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 27, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи SEQ ID NO: 28, CDR2 легкой цепи SEQ ID NO: 29 и CDR3 легкой цепи SEQ ID NO: 30; илиa heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 25, a heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 26 and a heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 27, and a light chain variable region comprising a light chain CDR1 of SEQ ID NO: 28, a CDR2 light chain SEQ ID NO: 29 and light chain CDR3 SEQ ID NO: 30; or

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи SEQ ID NO: 31, CDR2 тяжелой цепи SEQ ID NO: 32 и CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 33, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи SEQ ID NO: 34, CDR2 легкой цепи SEQ ID NO: 35 и CDR3 легкой цепи SEQ ID NO: 36.a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 31, a heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 32 and a heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 33, and a light chain variable region comprising a light chain CDR1 of SEQ ID NO: 34, a CDR2 light chain SEQ ID NO: 35; and light chain CDR3 SEQ ID NO: 36.

Термин “каркасный участок” (FR) обозначает другие остатки вариабельной области антител, чем остатки CDR. Каждая вариабельная обычно содержит четыре FR, обозначаемых как FR1, FR2, FR3 и FR4.The term “framework region” (FR) denotes other antibody variable region residues than CDR residues. Each variable usually contains four FRs, referred to as FR1, FR2, FR3 and FR4.

Антитело против TIE2 может быть моновалентным или бивалентным и может включать одинарные или двойные цепи. Функционально сродство связывания антител против TIE2 составляет от 10-5 М до 10-12 М. Например, сродство связывания антител против TIE2 составляет от 10-6 M до 10-12 M, от 10-7 M до 10-12 M, от 10-8 M до 10-12 M, от 10-9 M до 10-12 M, от 10-5 M до 10-11 M, от 10-6 M до 10-11 M, от 10-7 M до 10-11 M, от 10-8 M до 10-11 M, от 10-9 M до 10-11 M, от 10-10 M до 10-11 M, от 10-5 M до 10-10 M, от 10-6 M до 10-10 M, от 10-7 M до 10-10 M, от 10-8 M до 10-10 M, от 10-9 M до 10-10 M, от 10-5 M до 10-9 M, от 10-6 M до 10-9 M, от 10-7 M до 10-9 M, от 10-8 M до 10-9 M, от 10-5 M до 10-8 M, от 10-6 M до 10-8 M, от 10-7 M до 10-8 M, от 10-5 M до 10-7 M, от 10-6 M до 10-7 M или от 10-5 M до 10-6 M.The anti-TIE2 antibody may be monovalent or bivalent and may include single or double chains. Functionally, the binding affinity of antibodies against TIE2 is from 10 -5 M to 10 -12 M. For example, the binding affinity of antibodies against TIE2 is from 10 -6 M to 10 -12 M, from 10 -7 M to 10 -12 M, from 10 -8 M to 10 -12 M, 10 -9 M to 10 -12 M, 10 -5 M to 10 -11 M, 10 -6 M to 10 -11 M, 10 -7 M to 10 - 11 M, from 10 -8 M to 10 -11 M, from 10 -9 M to 10 -11 M, from 10 -10 M to 10 -11 M, from 10 -5 M to 10 -10 M, from 10 - 6 M to 10 -10 M, 10 -7 M to 10 -10 M, 10 -8 M to 10 -10 M, 10 -9 M to 10 -10 M, 10 -5 M to 10 -9 M, 10 -6 M to 10 -9 M, 10 -7 M to 10 -9 M, 10 -8 M to 10 -9 M, 10 -5 M to 10 -8 M, 10 -6 M to 10 -8 M, 10 -7 M to 10 -8 M, 10 -5 M to 10 -7 M, 10 -6 M to 10 -7 M or 10 -5 M to 10 -6 M .

Связывающееся с TIE2 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может включать вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 38, 42, 46, 50, 54 и 58. Кроме того, связывающееся с TIE2 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может включать вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 40, 44, 48, 52, 56 и 60.The TIE2-binding antibody, or antigen-binding fragment thereof, may include a heavy chain variable region selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 38, 42, 46, 50, 54, and 58. In addition, the TIE2-binding antibody, or antigen-binding fragment thereof, may include a light chain variable region selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 40, 44, 48, 52, 56 and 60.

В частности, связывающееся с TIE2 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает: вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 38 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 40;In particular, the TIE2-binding antibody or antigen-binding fragment thereof includes: the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 38 and the light chain variable region of SEQ ID NO: 40;

вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 42 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 44;the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 42 and the light chain variable region of SEQ ID NO: 44;

вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 46 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 48;the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 46 and the light chain variable region of SEQ ID NO: 48;

вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 50 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 52;the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 50 and the light chain variable region of SEQ ID NO: 52;

вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 54 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 56; илиthe variable region of the heavy chain of SEQ ID NO: 54 and the variable region of the light chain of SEQ ID NO: 56; or

вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 58 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 60.the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 58; and the light chain variable region of SEQ ID NO: 60.

“Фаговый дисплей” - это метод экспонирования мутантных полипептидов в виде слитого белка по меньшей мере с частью белка оболочки на поверхности частиц фага, к примеру, нитевидного фага. Полезность фагового дисплея заключается в быстрой и эффективной классификации последовательностей, связывающихся с антигенами- мишенями с высоким сродством в больших библиотеках рандомизированных мутантных белков. Экспонирование пептидных и белковых библиотек на поверхности фагов использовалось для скрининга миллионов полипептидов при идентификации полипептидов со свойствами специфического связывания."Phage display" is a technique for displaying mutant polypeptides as a fusion protein with at least a portion of the coat protein on the surface of phage particles, such as filamentous phage. The utility of phage display lies in the rapid and efficient classification of sequences that bind to target antigens with high affinity in large libraries of randomized mutant proteins. The exposure of peptide and protein libraries on the surface of phages has been used to screen millions of polypeptides in the identification of polypeptides with specific binding properties.

Технология фагового дисплея составила мощный инструмент для получения и скрининга новых белков, связывающихся с определенными лигандами (например, с антигенами). По технологии фагового дисплея можно создавать большие библиотеки мутантных белков и быстро классифицировать последовательности, связывающиеся с высоким сродством с целевыми антигенами. Нуклеиновую кислоту, кодирующую мутантные полипептиды, сливают с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей белок оболочки вируса, например, белок гена III или гена VIII. Была разработана монофазная система фагового дисплея, в которой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок или полипептид, сливается с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей часть белка гена III. В монофазной системе дисплея слитый ген экспрессируется на низком уровне, а белок гена III дикого типа также экспрессируется, и, таким образом, сохраняется инфекционность частиц.Phage display technology has provided a powerful tool for generating and screening novel proteins that bind to specific ligands (eg, antigens). Phage display technology can generate large libraries of mutant proteins and quickly classify sequences that bind with high affinity to target antigens. The nucleic acid encoding the mutant polypeptides is fused to a nucleic acid sequence encoding a viral envelope protein, such as a gene III or gene VIII protein. A monophasic phage display system has been developed in which a nucleic acid sequence encoding a protein or polypeptide is fused to a nucleic acid sequence encoding a portion of the gene III protein. In a monophasic display system, the fusion gene is expressed at a low level, and the wild type III gene protein is also expressed, and thus the infectivity of the particles is maintained.

Для разработки библиотек фагового дисплея антител важно продемонстрировать экспрессию пептидов на поверхности нитевидного фага и экспрессию функциональных фрагментов антител в периферической цитоплазме E.coli. Библиотеки антител или антигенсвязывающих полипептидов получают различными методами, например, методом модификации одного гена путем вставки случайной последовательности ДНК или клонирования последовательности родственного гена. Библиотеки можно подвергать скринингу на предмет экспрессии антител или антигенсвязывающих белков с нужными характеристиками.For the development of antibody phage display libraries, it is important to demonstrate the expression of peptides on the surface of filamentous phage and the expression of functional antibody fragments in the peripheral cytoplasm of E. coli. Libraries of antibodies or antigen-binding polypeptides are obtained by various methods, for example, by modifying a single gene by inserting a random DNA sequence or by cloning a related gene sequence. Libraries can be screened for the expression of antibodies or antigen-binding proteins with desired characteristics.

Технология фагового дисплея имеет несколько преимуществ по сравнению с обычными гибридомными и рекомбинантными методами получения антител с нужными характеристиками. Этот метод обеспечивает получение больших библиотек антител с различными последовательностями за короткое время без использования животных. Для получения гибридом и получения гуманизированных антител может потребоваться время в несколько месяцев. Кроме того, поскольку иммунитет не требуется, фаговые библиотеки антител могут генерировать антитела против таких антигенов, которые являются токсичными или имеют низкую антигенность. Фаговые библиотеки антител также можно использовать для получения и идентификации новых терапевтических антител.Phage display technology has several advantages over conventional hybridoma and recombinant methods for producing antibodies with desired characteristics. This method provides large libraries of antibodies with different sequences in a short time without the use of animals. It may take several months to obtain hybridomas and obtain humanized antibodies. In addition, since immunity is not required, antibody phage libraries can generate antibodies against such antigens that are toxic or have low antigenicity. Antibody phage libraries can also be used to generate and identify new therapeutic antibodies.

Можно использовать методы получения человеческих антител из иммуногенных или неиммуногенных последовательностей зародышевой линии человека либо из Ig-репертуаров наивных B-клеток с использованием библиотек фагового дисплея. Можно получать наивные или неиммуногенные антигенсвязывающие библиотеки с использованием различных лимфатических тканей.Techniques for generating human antibodies from immunogenic or non-immunogenic human germline sequences or from naïve B cell Ig repertoires using phage display libraries can be used. You can get naive or non-immunogenic antigen-binding libraries using a variety of lymphatic tissues.

Для выделения новых терапевтических антител важны методы идентификации и выделения высокоаффинных антител из библиотек фагового дисплея. Выделение высокоаффинных антител из библиотек зависит от размера библиотеки, эффективности продукции в бактериальных клетках и разнообразия библиотеки. Размер библиотек снижается при неправильной укладке антитела или антигенсвязывающего белка и неэффективной продукции из-за присутствия стоп-кодона. Экспрессия в бактериальных клетках может подавляться при неправильной укладке антитела или антигенсвязывающего домена. Экспрессия может быть улучшена путем поочередной мутации остатков на границе раздела вариабельной/константной области или выбранных остатков CDR. Последовательность каркасных участков является тем элементом, который обеспечивает правильную укладку при получении фаговых библиотек антител в бактериальных клетках.For the isolation of new therapeutic antibodies, methods for identifying and isolating high-affinity antibodies from phage display libraries are important. Isolation of high affinity antibodies from libraries depends on library size, production efficiency in bacterial cells, and library diversity. Libraries are reduced in size by misfolding of the antibody or antigen-binding protein and inefficient production due to the presence of a stop codon. Expression in bacterial cells can be downregulated by misfolding of the antibody or antigen-binding domain. Expression can be improved by alternately mutating residues at the variable/constant region interface or selected CDR residues. The sequence of the framework regions is the element that ensures the correct folding when obtaining phage libraries of antibodies in bacterial cells.

При выделении высокоаффинных антител важно создавать разнообразные библиотеки антител или антигенсвязывающих белков. Часто было отмечено, что участки CDR3 участвуют в связывании антигена. Поскольку участки CDR3 в тяжелой цепи значительно различаются по размерам, последовательности и структурной/пространственный морфологии, то с их помощью можно получать разнообразные библиотеки.When isolating high-affinity antibodies, it is important to create a variety of libraries of antibodies or antigen-binding proteins. It has often been noted that CDR3 regions are involved in antigen binding. Since the CDR3 regions in the heavy chain vary considerably in size, sequence, and structural/spatial morphology, they can be used to generate a variety of libraries.

Также можно создавать разнообразие путем рандомизации участков CDR вариабельных тяжелых и легких цепей, используя все 20 аминокислот в каждом положении. При использовании всех 20 аминокислот образуются последовательности антител с повышенным разнообразием и повышенной вероятностью идентификации новых антител.Diversity can also be created by randomizing the variable heavy and light chain CDRs using all 20 amino acids at each position. When all 20 amino acids are used, antibody sequences are generated with increased diversity and an increased likelihood of identifying new antibodies.

Антитела или фрагменты антител по настоящему изобретению могут включать последовательности упомянутых здесь антител против TIE2, а также их биологических эквивалентов, если только они могут специфически распознавать TIE2. Например, в аминокислотную последовательность антител можно вносить дополнительные вариации, чтобы еще больше улучшить сродство связывания и/или другие биологические свойства антител. Такие вариации включают, к примеру, делеции, вставки и/или замены остатков
в аминокислотной последовательности антител. Такие аминокислотные вариации основываются на относительном сходстве заместителей в боковой цепи аминокислот, например, их гидрофобности, гидрофильности, заряда и размера. При анализе размера, формы и типа заместителей в боковой цепи аминокислот видно, что аргинин, лизин и гистидин являются положительно заряженными остатками; аланин, глицин и серин имеют близкие размеры; а фенилаланин, триптофан и тирозин имеют близкие формы. Так, исходя из этих соображений, считается, что аргинин, лизин и гистидин; аланин, глицин и серин; и фенилаланин, триптофан и тирозин образуют соответствующие группы биологически функциональных эквивалентов.The antibodies or antibody fragments of the present invention may include the sequences of the anti-TIE2 antibodies mentioned herein, as well as their biological equivalents, so long as they can specifically recognize TIE2. For example, further variations can be made to the amino acid sequence of antibodies to further improve the binding affinity and/or other biological properties of the antibodies. Such variations include, for example, deletions, insertions and/or substitutions of residues
in the amino acid sequence of the antibodies. Such amino acid variations are based on the relative similarity of substituents in the amino acid side chain, for example, their hydrophobicity, hydrophilicity, charge and size. When analyzing the size, shape, and type of substituents in the side chain of amino acids, it can be seen that arginine, lysine, and histidine are positively charged residues; alanine, glycine and serine are similar in size; and phenylalanine, tryptophan and tyrosine have similar forms. So, based on these considerations, it is believed that arginine, lysine and histidine; alanine, glycine and serine; and phenylalanine, tryptophan and tyrosine form the corresponding groups of biologically functional equivalents.

Принимая во внимание варианты, обладающие биологически эквивалентной активностью, аминокислотные последовательности антител или кодирующих их молекул нуклеотидов по настоящему изобретению интерпретируются как включающие последовательности, которые по существу идентичны последовательностям, приведенным под их порядковыми номерами. Термин “по существу идентичны” означает, что последовательности гомологичны по меньшей мере на 90%, наиболее предпочтительно гомологичны по меньшей мере на 95%, на 96%, на 97%, на 98% или на 99% при совмещении последовательности по настоящему изобретению с любой другой последовательностью так, чтобы они соответствовали друг другу настолько близко, насколько это возможно, при анализе совмещенных последовательностей с помощью алгоритмов, обычно используемых в данной области. Методы совмещения для сравнения последовательностей хорошо известны в данной области. Базовый инструмент поиска локального совмещения NCBI (BLAST) доступен через NCBI и т.п.и может использоваться в сочетании с программами анализа последовательностей типа BLASTP, BLASTM, BLASTX, TBLASTN и TBLASTX через Интернет.BLAST доступен на www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Метод сравнения гомологичных последовательностей с помощью этой программы находится на сайте www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html.In view of variants having biologically equivalent activity, the amino acid sequences of the antibodies or nucleotide molecules encoding them of the present invention are interpreted to include sequences that are substantially identical to the sequences given under their serial numbers. The term "substantially identical" means that the sequences are at least 90% homologous, most preferably at least 95%, 96%, 97%, 98% or 99% homologous when the sequence of the present invention is aligned with any other sequence so that they match each other as closely as possible when analyzing the aligned sequences using algorithms commonly used in this field. Alignment techniques for sequence comparison are well known in the art. The NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) is available through NCBI and the like and can be used in conjunction with sequence analysis programs such as BLASTP, BLASTM, BLASTX, TBLASTN and TBLASTX via the Internet. BLAST is available at www.ncbi.nlm.nih. gov/BLAST/. A method for comparing homologous sequences using this program is available at www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html.

Исходя из этого, антитело либо его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению могут иметь гомологию в 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% и более с приведенной здесь последовательностью или же полностью совпадать с ней. Гомология может определяться путем сравнения и/или совмещения последовательностей известными в данной области методами. Например, степень гомологии последовательностей нуклеиновых кислот или белков по настоящему изобретению можно определить с помощью алгоритма сравнения последовательностей (т.е. BLAST или BLAST 2.0), совмещения вручную или визуального осмотра.Based on this, the antibody or antigen-binding fragment of the present invention may have a homology of 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more with the one shown here sequence or completely coincide with it. Homology can be determined by comparing and/or matching sequences by methods known in the art. For example, the degree of homology of the nucleic acid or protein sequences of the present invention can be determined using a sequence comparison algorithm (ie, BLAST or BLAST 2.0), manual alignment, or visual inspection.

В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрена нуклеиновая кислота, кодирующая антитело либо его антигенсвязывающий фрагмент.In another aspect of the present invention, a nucleic acid encoding an antibody or antigen-binding fragment thereof is provided.

Нуклеиновая кислота может кодировать вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 37, 41, 45, 49, 53 и 57. С другой стороны, нуклеиновая кислота может кодировать вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 39, 43, 47, 51, 55 и 59.The nucleic acid may encode a heavy chain variable region selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 37, 41, 45, 49, 53, and 57. On the other hand, the nucleic acid may encode a light chain variable region selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 39, 43, 47, 51, 55 and 59.

При выделении нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, можно получить антитело или его антигенсвязывающий фрагмент рекомбинантным способом. Нуклеиновую кислоту выделяют и вставляют в реплицирующийся вектор с последующим клонированием (амплификацией ДНК) или дальнейшей экспрессией. На основе изложенного в следующем аспекте настоящего изобретения предусмотрены векторы, включающие нуклеиновую кислоту.By isolating a nucleic acid encoding an antibody or antigen-binding fragment of the present invention, the antibody or antigen-binding fragment thereof can be obtained by a recombinant method. The nucleic acid is isolated and inserted into a replicating vector, followed by cloning (DNA amplification) or further expression. Based on the above, in the following aspect of the present invention, vectors comprising a nucleic acid are provided.

Термин “нуклеиновая кислота” используется для обозначения молекул как ДНК (гДНК и кДНК), так и РНК, а нуклеотиды, которые являются основной составляющей нуклеиновых кислот, включают нуклеотиды природного происхождения, а также их аналоги, в которых модифицированы молекулы сахара или основания. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельные области тяжелой и легкой цепи по настоящему изобретению, могут варьировать. Такие вариации включают вставки, делеции, либо неконсервативные или консервативные замены нуклеотидов.The term "nucleic acid" is used to refer to both DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules, and nucleotides, which are the main constituent of nucleic acids, include naturally occurring nucleotides, as well as their analogues, in which sugar molecules or bases are modified. The nucleic acid sequences encoding the heavy and light chain variable regions of the present invention may vary. Such variations include insertions, deletions, or non-conservative or conservative nucleotide substitutions.

ДНК, кодирующую антитело, можно легко выделить или синтезировать по стандартным методикам (например, с помощью олигонуклеотидного зонда, способного специфически связываться с ДНК, кодирующей тяжелую и легкую цепь антитела). Доступны различные векторы. Компоненты вектора обычно включают, без ограничения, один или несколько из следующих компонентов: сигнальные последовательности, точки начала репликации, один или несколько маркерных генов, энхансерные элементы, промоторы и последовательности терминации транскрипции.The DNA encoding the antibody can be easily isolated or synthesized by standard techniques (eg, using an oligonucleotide probe capable of specifically binding to the DNA encoding the heavy and light chain of the antibody). Various vectors are available. Vector components typically include, without limitation, one or more of the following: signal sequences, origins of replication, one or more marker genes, enhancer elements, promoters, and transcription termination sequences.

В настоящем изобретении термин “вектор” означает средство экспрессии целевых генов в клетках-хозяевах и включает плазмидные векторы, космидные векторы и вирусные векторы типа векторов-бактериофагов, аденовирусных векторов, ретровирусных векторов и аденоассоциированных вирусных векторов. Нуклеиновая кислота, кодирующая антитело, в векторе функционально связана с промотором.In the present invention, the term “vector” means a means of expressing target genes in host cells and includes plasmid vectors, cosmid vectors, and viral vectors such as bacteriophage vectors, adenovirus vectors, retroviral vectors, and adeno-associated viral vectors. The nucleic acid encoding the antibody is operably linked to a promoter in the vector.

Термин “функционально связана” означает функциональную связь между последовательностью, регулирующей экспрессию нуклеиновой кислоты (например, комплексом сайта связывания промотора, сигнальной последовательности или регулятора транскрипции), и другой последовательностью нуклеиновой кислоты, которая позволяет регулирующей последовательности направлять транскрипцию и/или трансляцию другой последовательности нуклеиновой кислоты.The term “operably linked” means a functional relationship between a sequence that regulates the expression of a nucleic acid (e.g., a complex of a promoter binding site, a signal sequence, or a transcriptional regulator) and another nucleic acid sequence that allows the regulatory sequence to direct transcription and/or translation of another nucleic acid sequence .

При использовании прокариотических клеток в качестве хозяев они обычно содержат сильный промотор, способный обеспечивать транскрипцию (например, промотор tac, промотор lac, промотор lacUV5, промотор lpp, промотор pLλ, промотор pRλ, промотор rac5, промотор amp, промотор recA, промотор SP6, промотор trp или промотор Т7), сайт связывания с рибосомой для инициации трансляции и последовательность терминации транскрипции/трансляции. Кроме того, к примеру, при использовании эукариотических клеток в качестве хозяев, они включают промотор, происходящий из генома клеток млекопитающих (например, промотор металлотионеина, промотор β-актина, промотор гемоглобина человека или промотор мышечного креатина человека), или промотор, происходящий из вируса млекопитающих (например, поздний промотор аденовируса, промотор 7.5K вируса коровьей оспы, промотор SV40, промотор цитомегаловируса (CMV), промотор tk HSV, промотор вируса опухолей молочной железы мыши (MMTV), промотор LTR HIV, промотор вируса Молони, промотор вируса Эпштейна-Барр (EBV) или промотор вируса саркомы Рауса (RSV)), и обычно содержит последовательность полиаденилирования в качестве последовательности терминации транскрипции.When prokaryotic cells are used as hosts, they usually contain a strong promoter capable of mediating transcription (e.g., tac promoter, lac promoter, lacUV5 promoter, lpp promoter, pLλ promoter, pRλ promoter, rac5 promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp or T7 promoter), a ribosome binding site for translation initiation, and a transcription/translation termination sequence. In addition, for example, when using eukaryotic cells as hosts, they include a promoter derived from the genome of mammalian cells (for example, a metallothionein promoter, a β-actin promoter, a human hemoglobin promoter, or a human muscle creatine promoter), or a promoter derived from a virus. mammalian adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus (CMV) promoter, HSV tk promoter, mouse mammary tumor virus (MMTV) promoter, HIV LTR promoter, Moloney virus promoter, Epstein- Barr (EBV) or Rous sarcoma virus (RSV) promoter) and usually contains a polyadenylation sequence as a transcription termination sequence.

Необязательно, вектор может быть слит с другой последовательностью с тем, чтобы облегчить очистку экспрессируемого им антитела. Последовательность для слияния может включать, к примеру, глутатион-S-трансферазу (Pharmacia, USA), мальтозосвязывающий белок (NEB, США), FLAG (IBI, США), 6xHis (гексагистидин; Qiagen, США) и др.Optionally, the vector may be fused to another sequence in order to facilitate purification of the antibody it expresses. The fusion sequence may include, for example, glutathione S-transferase (Pharmacia, USA), maltose binding protein (NEB, USA), FLAG (IBI, USA), 6xHis (hexahistidine; Qiagen, USA), etc.

Векторы содержат гены устойчивости к антибиотикам, которые обычно используются в данной области в качестве селективных маркеров, а их примеры включают гены, придающие устойчивость к ампициллину, гентамицину, карбенициллину, хлорамфениколу, стрептомицину, канамицину, генетицину, неомицину и тетрациклину.The vectors contain antibiotic resistance genes commonly used in the art as selectable markers, and examples include genes conferring resistance to ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neomycin, and tetracycline.

В следующем аспекте настоящего изобретения предусмотрена клетка, содержащая вышеприведенные векторы, которые трансформированы указанными выше векторами. Клетка, используемая для получения антитела по настоящему изобретению, может быть прокариотической, дрожжевой или высшей эукариотической клеткой, без ограничения.In another aspect of the present invention, there is provided a cell containing the above vectors which are transformed with the above vectors. The cell used to produce the antibody of the present invention may be a prokaryotic, yeast or higher eukaryotic cell, without limitation.

Можно использовать прокариотические клетки-хозяева типа Escherichia coli, штаммы рода Bacillus типа Bacillus subtilis и Bacillus thuringiensis, Streptomyces spp., Pseudomonas spp.(к примеру, Pseudomonas putida), Proteus mirabilis и Staphylococcus spp.(к примеру, Staphylococcus carnosus).Prokaryotic host cells such as Escherichia coli, strains of the genus Bacillus such as Bacillus subtilis and Bacillus thuringiensis, Streptomyces spp., Pseudomonas spp. (for example, Pseudomonas putida), Proteus mirabilis and Staphylococcus spp. (for example, Staphylococcus carnosus) can be used.

Наибольший интерес представляют клетки животных, а примеры полезных линий клеток-хозяев включают, без ограничения, COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S и HT1080.Animal cells are of most interest, and examples of useful host cell lines include, but are not limited to, COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0 , U20S and HT1080.

В следующем аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ получения антитела либо его антигенсвязывающего фрагмента, включающий: (a) культивирование клетки; и (b) выделение антитела либо его антигенсвязывающего фрагмента из культивируемой клетки.In a further aspect of the present invention, a method for producing an antibody or antigen-binding fragment thereof is provided, comprising: (a) culturing a cell; and (b) isolating the antibody or antigen-binding fragment thereof from the cultured cell.

Клетки можно культивировать в различных средах. В качестве культуральной среды можно использовать любые коммерчески доступные среды, без ограничений. Можно вносить в среды и все другие необходимые добавки, хорошо известные специалистам в данной области, в соответствующих концентрациях. Используются условия культивирования при определенных температуре и pH, обычные для клеток- хозяев, выбранных для экспрессии, как должно быть ясно специалистам в данной области.Cells can be cultured in various media. Any commercially available media can be used as the culture medium, without limitation. All other necessary additives well known to those skilled in the art can be added to the media at appropriate concentrations. Culture conditions at specific temperature and pH are used, which are customary for the host cells selected for expression, as will be appreciated by those skilled in the art.

Выделение антитела либо его антигенсвязывающего фрагмента может осуществляться, к примеру, посредством центрифугирования или ультрафильтрации для удаления примесей и очистки полученного продукта при использовании, скажем, методов аффинной хроматографии. Можно использовать и другие методы очистки, такие, как анионо- или катионообменная хроматография, хроматография гидрофобных взаимодействий и хроматография на гидроксиапатите (ГА).Isolation of an antibody or antigen-binding fragment thereof can be accomplished, for example, by centrifugation or ultrafiltration to remove impurities and purify the resulting product using, say, affinity chromatography techniques. Other purification methods can be used, such as anion or cation exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, and hydroxyapatite (HA) chromatography.

В следующем аспекте настоящего изобретения предусмотрена композиция для профилактики или лечения связанных с ангиогенезом заболеваний, содержащая антитело либо его антигенсвязывающий фрагмент в качестве активного ингредиента.In another aspect of the present invention, there is provided a composition for the prevention or treatment of angiogenesis-related diseases, comprising an antibody, or an antigen-binding fragment thereof, as an active ingredient.

Ангиогенез - это явление, при котором образуются или растут новые кровеносные сосуды из уже существующих кровеносных сосудов, а термин “связанные с ангиогенезом заболевания” относится к заболеваниям, связанным с возникновением или прогрессированием ангиогенеза. В число связанных с ангиогенезом заболеваний могут попадать любые заболевания, без ограничения, если только их можно лечить с помощью антитела. Примеры связанных с ангиогенезом заболеваний включают, без ограничения, рак, метастазы рака, диабетическую ретинопатию, ретинопатию недоношенных, отторжение трансплантата роговицы, дегенерацию желтого пятна, неоваскулярную глаукому, эритроз, пролиферативную ретинопатию, псориаз, гемофилический артрит, образование атеросклеротических бляшек в капиллярах, келоиды, грануляцию ран, сосудистые спайки, ревматоидный артрит, остеоартрит, аутоиммунные заболевания, болезнь Крона, рестеноз, атеросклероз, кишечные спайки, болезни от кошачьих царапин, язвы, цирроз печени, нефрит, диабетическую нефропатию, диабетические язвы стопы, хроническую почечную недостаточность, сахарный диабет, воспалительные заболевания, идиопатический фиброз легких, сепсис, острый респираторный дистресс-синдром и нейродегенеративные заболевания.Angiogenesis is a phenomenon in which new blood vessels are formed or grow from already existing blood vessels, and the term "angiogenesis-related diseases" refers to diseases associated with the occurrence or progression of angiogenesis. Angiogenesis-related diseases can include any diseases, without limitation, as long as they can be treated with an antibody. Examples of angiogenesis-related diseases include, but are not limited to, cancer, cancer metastases, diabetic retinopathy, retinopathy of prematurity, corneal transplant rejection, macular degeneration, neovascular glaucoma, erythrosis, proliferative retinopathy, psoriasis, hemophilic arthritis, capillary atherosclerotic plaque formation, keloids, wound granulation, vascular adhesions, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, autoimmune diseases, Crohn's disease, restenosis, atherosclerosis, intestinal adhesions, cat scratch disease, ulcers, liver cirrhosis, nephritis, diabetic nephropathy, diabetic foot ulcers, chronic renal failure, diabetes mellitus, inflammatory diseases, idiopathic pulmonary fibrosis, sepsis, acute respiratory distress syndrome and neurodegenerative diseases.

Кроме того, рак выбирают из группы, состоящей из рака пищевода, рака желудка, рака толстого кишечника, рака прямой кишки, рака полости рта, рака глотки, рака гортани, рака легких, рака толстой кишки, рака груди, рака шейки матки, рака эндометрия, рака яичников, рака простаты, рака яичек, рака мочевого пузыря, рака почек, рака печени, рака поджелудочной железы, рака костей, рака соединительной ткани, рака кожи, рака головного мозга, рака щитовидной железы, лейкемии, Ходжкинской лимфомы, лимфомы и множественного миелоидного рака крови, без ограничения указанным.In addition, the cancer is selected from the group consisting of esophageal cancer, gastric cancer, colon cancer, rectal cancer, oral cavity cancer, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, lung cancer, colon cancer, breast cancer, cervical cancer, endometrial cancer. , ovarian cancer, prostate cancer, testicular cancer, bladder cancer, kidney cancer, liver cancer, pancreatic cancer, bone cancer, connective tissue cancer, skin cancer, brain cancer, thyroid cancer, leukemia, Hodgkin's lymphoma, lymphoma, and multiple myeloid blood cancer, without limitation.

В настоящем изобретении термин “предотвращение или профилактика” означает такое действие, которое подавляет или замедляет возникновение данного заболевания посредством введения антитела или композиции по настоящему изобретению. Термин “лечение или терапия” означает такое действие, которое облегчает или положительно изменяет симптомы данного заболевания посредством введения антитела или композиции.In the present invention, the term "prevention or prophylaxis" means such an action that suppresses or slows down the occurrence of a given disease through the introduction of an antibody or composition of the present invention. The term "treatment or therapy" means such an action that alleviates or positively changes the symptoms of a given disease through the introduction of an antibody or composition.

В следующем аспекте настоящего изобретения предусмотрена композиция для стабилизации кровеносных сосудов, содержащая антитело либо его антигенсвязывающий фрагмент в качестве активного ингредиента.In a further aspect of the present invention, a composition for stabilizing blood vessels is provided, comprising an antibody, or an antigen-binding fragment thereof, as an active ingredient.

В настоящем изобретении термин “стабилизация сосудов” означает свойство кровеносных сосудов поддерживать свою функцию посредством облегчения или ослабления действия, или устранения факторов, которые могут нарушить целостность кровеносных сосудов, либо замедления, ослабления или устранения повреждений кровеносных сосудов. В частности, “стабилизация сосудов” может включать ингибирование проницаемости кровеносных сосудов, замедление повреждения кровеносных сосудов и/или восстановление целостности поврежденных кровеносных сосудов.In the present invention, the term “vascular stabilization” refers to the property of blood vessels to maintain their function by alleviating or reducing the action, or eliminating factors that can compromise the integrity of blood vessels, or slowing down, weakening or eliminating damage to blood vessels. In particular, “vascular stabilization” may include inhibiting blood vessel permeability, slowing down damage to blood vessels, and/or restoring the integrity of damaged blood vessels.

Композиция, содержащая антитело по настоящему изобретению, предпочтительно является фармацевтической композицией и может дополнительно содержать подходящие носители, эксципиенты или разбавители, обычно используемые в данной области.The composition containing the antibody of the present invention is preferably a pharmaceutical composition and may additionally contain suitable carriers, excipients or diluents commonly used in this field.

Фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемые носители, может представлять собой различные пероральные или парентеральные дозированные формы, как-то таблетки, пилюли, порошки, гранулы, капсулы, суспензии, пероральные растворы, эмульсии, сиропы, стерильные водные растворы, неводные растворы, суспензии, лиофилизаты и свечи. В этом отношении фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть скомбинирована с такими разбавителями или эксципиентами, как наполнители, загустители, связующие, смачивающие вещества, разрыхлители, поверхностно-активные вещества и др. Твердые препараты для перорального введения могут быть в виде таблеток, пилюль, порошков, гранул, капсул и др. Такие твердые формы могут быть получены путем объединения вещества по настоящему изобретению по меньшей мере с одним эксципиентом типа крахмала, карбоната кальция, сахарозы, лактозы или желатина. Также можно использовать простые эксципиенты, смазывающие вещества типа стеарата магния, талька и др. Жидкие формы для перорального введения могут представлять собой суспензии, пероральные растворы, эмульсии, сиропы и т.п.Жидкие формы могут быть получены путем включения различных эксципиентов типа простых разбавителей, к примеру, воды или вазелинового масла, смачивающих средств, подсластителей, ароматизаторов, консервантов и пр. Кроме того, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может представлять собой парентеральные формы, как-то стерильные водные растворы, неводные растворы, суспензии, эмульсии, лиофилизаты, свечи и т.п.Для инъекций неводных растворов и суспензий можно использовать пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла типа оливкового масла и сложные эфиры типа этилолеата. Основа свечей может включать витепсол, макрогол, Твин 61, масло какао, лауриновое масло и глицерожелатин.The pharmaceutical composition containing pharmaceutically acceptable carriers may be in various oral or parenteral dosage forms such as tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, oral solutions, emulsions, syrups, sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, lyophilisates. and candles. In this regard, the pharmaceutical composition of the present invention may be combined with diluents or excipients such as fillers, thickeners, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, etc. Solid preparations for oral administration may be in the form of tablets, pills, powders. , granules, capsules, etc. Such solid forms can be obtained by combining the substance of the present invention with at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, or gelatin. Plain excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc, etc., may also be used. Liquid forms for oral administration may be suspensions, oral solutions, emulsions, syrups, and the like. Liquid forms may be prepared by incorporating various excipients such as simple diluents, for example, water or liquid paraffin, wetting agents, sweeteners, flavors, preservatives, etc. In addition, the pharmaceutical composition of the present invention may be parenteral forms, such as sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilisates, suppositories and the like. For injection of non-aqueous solutions and suspensions, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and esters such as ethyl oleate can be used. The suppository base may include witepsol, macrogol, Tween 61, cocoa butter, lauric oil, and glycerogelatin.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить в фармацевтически эффективном количестве, причем термин “фармацевтически эффективное количество” означает количество, достаточное для лечения заболеваний при разумном соотношении польза/риск, применимом ко всем медицинским методам лечения. Эффективное количество может варьировать в зависимости от различных факторов, в том числе тяжести подлежащего лечению заболевания, возраста и пола пациента, типа заболевания, активности препарата, чувствительности пациента к препарату, времени введения, способа введения, скорости выведения, продолжительности лечения, совместного введения лекарств и других факторов, хорошо известных в области фармацевтики. Кроме того, композицию по настоящему изобретению можно вводить саму по себе или в сочетании с другими терапевтическими средствами. В этом случае композицию можно вводить последовательно или одновременно с обычными терапевтическими средствами. Кроме того, композицию можно вводить в разовых или множественных дозах. Принимая во внимание эти факторы, следует вводить композицию в минимальном количестве, достаточном для достижения максимальной эффективности без побочных эффектов. Кроме того, количество вводимой композиции может определяться специалистами в данной области. Дозировка фармацевтической композиции по настоящему изобретению ничем особо не ограничивается и изменяется в зависимости от различных факторов, включая состояние здоровья и вес пациента, тяжесть заболевания, тип препарата, способ введения и время введения. Композицию можно вводить млекопитающим, включая мышей, крыс, домашний скот, человека и т.п., в разовых или множественных дозах каждый день, традиционно приемлемым способом, например, перорально, ректально, внутривенно, подкожно, внутриматочно или интрацереброваскулярно.The pharmaceutical composition of the present invention may be administered in a pharmaceutically effective amount, whereby the term "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to treat diseases with a reasonable benefit/risk ratio applicable to all medical treatments. The effective amount may vary depending on various factors, including the severity of the disease being treated, the age and sex of the patient, the type of disease, the activity of the drug, the sensitivity of the patient to the drug, the time of administration, the route of administration, the rate of elimination, the duration of treatment, the co-administration of drugs and other factors well known in the pharmaceutical field. In addition, the composition of the present invention can be administered alone or in combination with other therapeutic agents. In this case, the composition can be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. In addition, the composition can be administered in single or multiple doses. Taking into account these factors, the composition should be administered in the minimum amount sufficient to achieve maximum efficacy without side effects. Moreover, the amount of composition to be administered can be determined by those skilled in the art. The dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited and varies depending on various factors, including the health and weight of the patient, the severity of the disease, the type of drug, the route of administration and the time of administration. The composition can be administered to mammals, including mice, rats, livestock, humans, and the like, in single or multiple doses each day, in a conventionally acceptable manner, for example, orally, rectally, intravenously, subcutaneously, intrauterine, or intracerebrovascular.

В следующем аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ ингибирования ангиогенеза и способ предотвращения или лечения связанных с ангиогенезом заболеваний, включающий введение антитела или композиции нуждающемуся в этом субъекту.In another aspect of the present invention, there is provided a method for inhibiting angiogenesis and a method for preventing or treating angiogenesis-related diseases, comprising administering an antibody or composition to a subject in need thereof.

Способ по настоящему изобретению включает введение фармацевтически эффективного количества фармацевтической композиции субъекту, нуждающемуся в ингибировании ангиогенеза. Субъектами могут быть млекопитающие, как-то собаки, коровы, лошади, кролики, мыши, крысы, куры или люди, без ограничения. Фармацевтическую композицию можно вводить любым подходящим способом, включая парентеральное, подкожное, внутрибрюшинное, внутрилегочное или интраназальное введение, в том числе, при необходимости, внутриочаговое введение для местного лечения. Предпочтительные дозировки фармацевтической композиции по настоящему изобретению могут варьировать в зависимости от различных факторов, включая состояние здоровья и вес субъекта, тяжесть заболевания, тип препарата, способ введения и время введения, и они легко определяются специалистами в данной области.The method of the present invention includes administering a pharmaceutically effective amount of a pharmaceutical composition to a subject in need of angiogenesis inhibition. Subjects can be mammals such as dogs, cows, horses, rabbits, mice, rats, chickens, or humans, without limitation. The pharmaceutical composition can be administered by any suitable route, including parenteral, subcutaneous, intraperitoneal, intrapulmonary or intranasal administration, including, if necessary, intralesional administration for topical treatment. Preferred dosages of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on various factors, including the subject's health and weight, disease severity, drug type, route of administration, and time of administration, and are readily determined by those skilled in the art.

В следующем аспекте настоящего изобретения предусмотрена фармацевтическая композиция для профилактики или лечения рака, содержащая антитело, либо способ профилактики или лечения рака, включающий введение антитела или композиции нуждающемуся в этом субъекту. Термины “антитело”, “профилактика” и “лечение” уже определены выше.In another aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising an antibody, or a method for preventing or treating cancer, comprising administering the antibody or composition to a subject in need thereof. The terms "antibody", "prevention" and "treatment" have already been defined above.

Любой рак может быть мишенью для лечения, без ограничения, если только его можно лечить с помощью антитела. В частности, антитело по настоящему изобретению может предотвращать возникновение или прогрессирование рака путем ингибирования ангиогенеза. Примеры рака включают, без ограничения, рак пищевода, рак желудка, рак толстого кишечника, рак прямой кишки, рак полости рта, рак глотки, рак гортани, рак легких, рак толстой кишки, рак груди, рак шейки матки, рак эндометрия, рак яичников, рак простаты, рак яичек, рак мочевого пузыря, рак почек, рак печени, рак поджелудочной железы, рак костей, рак соединительной ткани, рак кожи, рак головного мозга, рак щитовидной железы, лейкемию, Ходжкинскую лимфому, лимфому и множественный миелоидный рак крови.Any cancer may be a target for treatment, without limitation, as long as it can be treated with an antibody. In particular, the antibody of the present invention can prevent the occurrence or progression of cancer by inhibiting angiogenesis. Examples of cancers include, without limitation, esophageal cancer, gastric cancer, colon cancer, rectal cancer, oral cancer, pharyngeal cancer, larynx cancer, lung cancer, colon cancer, breast cancer, cervical cancer, endometrial cancer, ovarian cancer , prostate cancer, testicular cancer, bladder cancer, kidney cancer, liver cancer, pancreatic cancer, bone cancer, connective tissue cancer, skin cancer, brain cancer, thyroid cancer, leukemia, Hodgkin's lymphoma, lymphoma, and multiple myeloid blood cancer .

Кроме того, антитело по настоящему изобретению может применяться в комбинации с другими антителами или биологически активными средствами или веществами для различных целей. В этом аспекте настоящего изобретения предусмотрена композиция для комбинированного введения с другим терапевтическим средством от ангиогенеза, причем композиция содержат антитело либо его антигенсвязывающий фрагмент.In addition, the antibody of the present invention can be used in combination with other antibodies or biologically active agents or substances for various purposes. In this aspect of the present invention, a composition is provided for combined administration with another angiogenesis therapeutic agent, the composition comprising an antibody or an antigen-binding fragment thereof.

Другие терапевтические средства от ангиогенеза включают антиангиогенные средства, противовоспалительные средства и/или противоопухолевые средства. Эти терапевтические средства могут преодолевать устойчивость к ним и повышать их эффективность.Other therapeutic agents for angiogenesis include anti-angiogenic agents, anti-inflammatory agents and/or antitumor agents. These therapeutic agents can overcome resistance to them and increase their effectiveness.

При введении композиции по настоящему изобретению в комбинации с другими терапевтическими средствами от связанных с ангиогенезом заболеваний антитело к TIE2 и другие терапевтические средства для лечения связанных с ангиогенезом заболеваний можно вводить последовательно или одновременно. Например, субъекту вводят антиангиогенное средство, противовоспалительное средство и/или противораковое средство, а затем ему вводят композицию, содержащую антитело против TIE2 или его антигенсвязывающий фрагмент в качестве активного ингредиента, или же субъекту вводят композицию, а затем ему вводят антиангиогенное средство, противовоспалительное средство и/или противораковое средство. В некоторых случаях композицию можно вводить субъектам одновременно вместе с антиангиогенным средством, противовоспалительным средством и/или противораковым средством.When the composition of the present invention is administered in combination with other therapeutic agents for angiogenesis-related diseases, the anti-TIE2 antibody and other therapeutic agents for the treatment of angiogenesis-related diseases may be administered sequentially or simultaneously. For example, a subject is administered an anti-angiogenic agent, an anti-inflammatory agent, and/or an anti-cancer agent, and then is administered a composition containing an anti-TIE2 antibody or an antigen-binding fragment thereof as an active ingredient, or the composition is administered to a subject, and then the anti-angiogenic agent, anti-inflammatory agent, and /or an anticancer agent. In some instances, the composition may be administered to subjects simultaneously with an anti-angiogenic agent, an anti-inflammatory agent, and/or an anti-cancer agent.

В следующем аспекте настоящего изобретения предусмотрена композиция для диагностики связанных с ангиогенезом заболеваний, содержащая антитело либо его антигенсвязывающий фрагмент в качестве активного ингредиента. Настоящим изобретением предусмотрен способ диагностики связанных с ангиогенезом заболеваний у субъектов путем введения им антитела либо его антигенсвязывающего фрагмента.In another aspect of the present invention, there is provided a composition for diagnosing angiogenesis-related diseases, comprising an antibody, or an antigen-binding fragment thereof, as an active ingredient. The present invention provides a method for diagnosing angiogenesis-related diseases in subjects by administering to them an antibody, or an antigen-binding fragment thereof.

Связанные с ангиогенезом заболевания можно диагностировать путем измерения уровня экспрессии TIE2 в образцах при помощи антитела либо его антигенсвязывающего фрагмента. Уровень экспрессии можно измерить с помощью антитела стандартным методом иммуноанализа типа радиоиммуноанализа, радиоиммунопреципитации, иммунопреципитации, иммуногистохимического окрашивания, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), ELISA с захватом антигена, анализа ингибирования или конкуренции, “сэндвич”-анализа, проточной цитометрии, иммунофлуоресцентного окрашивания и иммуноаффинной очистки, без ограничения указаннымAngiogenesis-related diseases can be diagnosed by measuring the level of TIE2 expression in samples with an antibody or antigen-binding fragment thereof. The level of expression can be measured with an antibody by a standard immunoassay method such as radioimmunoassay, radioimmunoprecipitation, immunoprecipitation, immunohistochemical staining, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), antigen capture ELISA, inhibition or competition assay, sandwich assay, flow cytometry, immunofluorescence staining, and immunoaffinity cleaning, without limitation specified

Рак можно диагностировать путем анализа интенсивности конечного сигнала в процессе иммуноанализа. А именно, когда маркерный белок, согласно настоящему изобретению, высоко экспрессируется в биологическом образце и генерирует более сильный сигнал, чем в нормальном биологическом образце (например, в нормальной ткани желудка, крови, плазме или сыворотке), то ставится диагноз рака.Cancer can be diagnosed by analyzing the intensity of the end signal in an immunoassay process. Namely, when the marker protein of the present invention is highly expressed in a biological sample and generates a stronger signal than in a normal biological sample (e.g., normal stomach tissue, blood, plasma, or serum), a diagnosis of cancer is made.

В следующем аспекте настоящего изобретения предусмотрен набор для диагностики рака, содержащий композицию для диагностики рака. Набор по настоящему изобретению включает антитело против TIE2 и может диагностировать рак по сигналам, генерируемым во время реакции между образцом и антителом. В этом случае сигнал может включать фермент, связанный с антителом, типа щелочной фосфатазы, β-галактозидазы, пероксидазы хрена, люциферазы или цитохрома P450, без ограничения. При этом, если в качестве фермента используется щелочная фосфатаза, то в качестве субстрата для цветной реакции используется бромхлориндолилфосфат (BCIP), нитросиний тетразолий (NBT), нафтол-AS-B1-фосфат или усилитель хемифлуоресценции (ECF), а если в качестве фермента используется пероксидаза хрена, то в качестве субстрата может использоваться хлорнафтол, аминоэтилкарбазол, диаминобензидин, D-люциферин, люцигенин (бис-N-метилакридиний нитрат), бензиловый эфир резоруфина, люминол, реагент Amplex Red (10-ацетил-3,7-дигидроксифеноксазин), HYR (п-фенилендиамин⋅HCl и пирокатехол), TMB (тетраметилбензидин), ABTS (2,2′-азин-ди[3-этилбензтиазолинсульфонат]), o-фенилендиамин (OPD), нафтол/пиронин, глюкозоксидаза, t-NBT (нитросиний тетразолий) и m-PMS (феназинметосульфат), но настоящее изобретение этим не ограничивается.In another aspect of the present invention, a cancer diagnostic kit is provided, comprising a cancer diagnostic composition. The kit of the present invention includes an anti-TIE2 antibody and can diagnose cancer from the signals generated during the reaction between the sample and the antibody. In this case, the signal may include an enzyme associated with the antibody, such as alkaline phosphatase, β-galactosidase, horseradish peroxidase, luciferase, or cytochrome P450, without limitation. In this case, if alkaline phosphatase is used as an enzyme, then bromochlorindolyl phosphate (BCIP), nitrosine tetrazolium (NBT), naphthol-AS-B1-phosphate or a chemifluorescence enhancer (ECF) is used as a substrate for a color reaction, and if horseradish peroxidase, then chloronaphthol, aminoethylcarbazole, diaminobenzidine, D-luciferin, lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate), resorufin benzyl ether, luminol, Amplex Red reagent (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine), can be used as a substrate, HYR (p-phenylenediamine⋅HCl and pyrocatechol), TMB (tetramethylbenzidine), ABTS (2,2′-azine-di[3-ethylbenzthiazolinesulfonate]), o-phenylenediamine (OPD), naphthol/pyronine, glucose oxidase, t-NBT ( nitrosine tetrazolium) and m-PMS (phenazine methosulfate), but the present invention is not limited to this.

Кроме того, набор по настоящему изобретению также может включать и метку для генерирования детектируемого сигнала, причем метка может представлять собой химическое вещество (например, биотин), фермент (щелочную фосфатазу, β-галактозидазу, пероксидазу хрена и цитохром P450), радиоактивное вещество (типа C14, I125, P32 и S35), флуоресцентное вещество (например, флуоресцеин), люминесцентное вещество, хемилюминесцентное вещество и FRET (флуоресцентно-резонансный перенос энергии), без ограничения указанным.In addition, the kit of the present invention may also include a label for generating a detectable signal, and the label may be a chemical (for example, biotin), an enzyme (alkaline phosphatase, β-galactosidase, horseradish peroxidase and cytochrome P450), a radioactive substance (such as C 14 , I 125 , P 32 and S 35 ), fluorescent substance (eg, fluorescein), luminescent substance, chemiluminescent substance and FRET (fluorescent resonance energy transfer), without limitation.

Измерение активности фермента, используемого для диагностики ангиогенеза, или измерение сигнала может проводиться различными способами, известными в данной области. Таким образом, можно качественно или количественно анализировать экспрессию TIE2.The measurement of the activity of an enzyme used to diagnose angiogenesis or the measurement of a signal can be carried out by various methods known in the art. Thus, TIE2 expression can be analyzed qualitatively or quantitatively.

ПримерыExamples

Далее настоящее изобретение будет раскрыто более подробно с помощью примеров. Однако специалистам в данной области должно быть ясно, что эти примеры приводятся только для иллюстрации настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения.Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples. However, it should be clear to those skilled in the art that these examples are provided to illustrate the present invention only and should not be construed as limiting the scope of the present invention.

Пример 1. Скрининг антител, связывающихся с TIE2Example 1 Screening for Antibodies Binding to TIE2

Для скрининга антител, связывающихся с TIE2, и получения библиотек использовали библиотеки наивных scFv человека (scFv), раскрытые в Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-2008-0109417. В 96-луночный Ni+планшет вносили по 100 мкл на лунку антигена (hTIE2-his: Sino Biological, 10700-H08H) с концентрацией 2 мкг/мл и инкубировали при 4°C в течение ночи. На следующий день покрытый антигеном планшет трижды промывали 0,1% TBST, а затем инкубировали с 200 мкл блокирующего буфера с 2% BSA при комнатной температуре в течение 2 часов. К 2 мл ростовой среды 2xYT-TET (тетрациклин 10 мкг/мл) добавляли 50 мкл исходного раствора XL1-Blue и инкубировали при 37°C в течение 2 ч при 200 об/мин, а затем добавляли еще 13 мл и инкубировали до достижения OD600=0,5. После блокирования в течение 2 часов промывали лунки 3 раза 1xPBS. В каждую промытую лунку вносили порцию фаговой библиотеки, причем фаговую библиотеку смешивали с 4% BSA в равных количествах, а затем вносили по 200 мкл смеси, после чего проводили реакцию при комнатной температуре в течение 2,5 часов. По завершении реакции с фаговой библиотекой отбрасывали супернатанты, а остатки промывали 5 раз 0,1% TBST и 3 раза TBS, добавляли в каждую лунку 100 мкл 100 мМ TEA (триметиламина) и встряхивали полученную смесь при комнатной температуре в течение 10 мин. Через 10 минут в каждую лунку добавляли 50 мкл 1M Триса (pH 7,5), а затем перемешивали. К 10 мл XL1-Blue с OD600=0,5 добавляли супернатанты для индукции инфицирования при 37°C в течение 30 мин. По завершении инфицирования использовали 100 мкл для итогового титра, а остаток центрифугировали при 6000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали, а осадок наносили шпателем на большую квадратную чашку (CM 34 мкг/мл+1% глюкозы) и инкубировали при 30°C в течение ночи. Оставленные для итогового титра 100 мкл разводили 1/10, 1/100 и 1/1000, наносили на чашки с CM и инкубировали при 37°C в течение ночи. На следующий день выросшие на квадратной чашке колонии соскребали с помощью петли после добавления туда 50 мл среды 2xYT и центрифугировали при 6000 об/мин в течение 10 мин, после чего супернатант отбрасывали, а осадок использовали для получения первичного материала для пэннинга. В коническую колбу на 500 мл помещали 100 мл культуральной среды 2xYT (ростовая среда: CM 34 мкг/мл+1% глюкозы), туда же добавляли клетки до получения OD600=0,2 и культивировали при 200 об/мин и 37°C до достижения OD600=0,5. После культивирования клеток до достижения OD600=0,5 добавляли фаг-помощник (мутант M13KO7) в количестве, в 20 раз превышающем количество клеток. После заражения фагом-помощником при 37°C в течение 30 мин проводили центрифугирование при 6000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали, а клетки инкубировали в течение ночи в 100 мл свежей среды 2xYT (CM 34 мкг/мл+Kan. 70 мкг/мл+1 мМ IPTG+5 мМ MgCl2) при 200 об/мин и 30°C. На следующий день выращенные клетки центрифугировали при 7000 об/мин в течение 10 мин и еще раз таким же образом, как и выше. Собранный супернатант осаждали на льду в присутствии 20% ПЭГ/2,5 М NaCl в количестве 1/5 (об/об) от количества супернатанта в течение 1 часа. После осаждения проводили центрифугирование при 9000 об/мин в течение 1 часа. Супернатант отбрасывали, а осадок суспендировали в 3 мл TBS, фильтровали через фильтр на 0,45 мкм, хранили при 4°C и использовали в следующем раунде пэннинга. Этот процесс повторяли 3-4 раза, а связывание антител с антигеном определяли методом ELISA.Naive human scFv (scFv) libraries disclosed in Korean Patent Laid-Open Publication No. were used to screen for antibodies binding to TIE2 and obtain libraries. 10-2008-0109417. In a 96-well Ni + plate, 100 μl per well of antigen (hTIE2-his: Sino Biological, 10700-H08H) was added at a concentration of 2 μg/ml and incubated at 4°C overnight. The next day, the antigen-coated plate was washed three times with 0.1% TBST and then incubated with 200 μl of 2% BSA blocking buffer at room temperature for 2 hours. To 2 ml of 2xYT-TET growth medium (tetracycline 10 μg/ml) was added 50 μl of XL1-Blue stock solution and incubated at 37°C for 2 h at 200 rpm, and then another 13 ml was added and incubated until OD was reached. 600 =0.5. After blocking for 2 hours, the wells were washed 3 times with 1xPBS. A portion of the phage library was added to each washed well, and the phage library was mixed with 4% BSA in equal amounts, and then 200 μl of the mixture was added, after which the reaction was carried out at room temperature for 2.5 hours. Upon completion of the reaction with the phage library, the supernatants were discarded, and the residues were washed 5 times with 0.1% TBST and 3 times with TBS, 100 μl of 100 mM TEA (trimethylamine) was added to each well, and the resulting mixture was shaken at room temperature for 10 min. After 10 minutes, 50 μl of 1M Tris (pH 7.5) was added to each well, followed by mixing. Supernatants were added to 10 ml of XL1-Blue with OD 600 =0.5 to induce infection at 37°C for 30 min. At the end of the infection, 100 µl was used for the final titer and the residue was centrifuged at 6000 rpm for 10 minutes. The supernatant was discarded and the pellet was spread with a spatula onto a large square dish (CM 34 μg/ml+1% glucose) and incubated at 30° C. overnight. The 100 µl remaining for the final titer were diluted 1/10, 1/100 and 1/1000, applied to CM plates and incubated at 37° C. overnight. The next day, colonies that grew on a square dish were scraped off with a loop after adding 50 ml of 2xYT medium there and centrifuged at 6000 rpm for 10 min, after which the supernatant was discarded, and the pellet was used to obtain primary material for panning. 100 ml of 2xYT culture medium (growth medium: CM 34 μg/ml + 1% glucose) was placed in a 500 ml conical flask, cells were added there until OD 600 = 0.2 was obtained and cultured at 200 rpm and 37°C until reaching OD 600 =0.5. After culturing the cells until OD 600 =0.5 was reached, helper phage (M13KO7 mutant) was added in an amount 20 times the number of cells. After infection with helper phage at 37°C for 30 min, centrifugation was performed at 6000 rpm for 10 min. The supernatant was discarded and the cells were incubated overnight in 100 ml of fresh 2xYT medium (CM 34 μg/ml + Kan. 70 μg/ml + 1 mM IPTG + 5 mM MgCl 2 ) at 200 rpm and 30°C. The next day, the grown cells were centrifuged at 7000 rpm for 10 min and again in the same manner as above. The collected supernatant was precipitated on ice in the presence of 20% PEG/2.5 M NaCl in an amount of 1/5 (v/v) of the amount of the supernatant for 1 hour. After sedimentation, centrifugation was performed at 9000 rpm for 1 hour. The supernatant was discarded and the pellet was suspended in 3 ml TBS, filtered through a 0.45 µm filter, stored at 4° C. and used in the next round of panning. This process was repeated 3-4 times, and the binding of antibodies to the antigen was determined by ELISA.

Пример 2. Скрининг несущих моноклональные scFv фагов на специфическое связывание с TIE2 и нейтрализацию связывания с TIE2 (связывающий ELISA)Example 2 Screening of monoclonal scFv-bearing phages for specific binding to TIE2 and neutralization of binding to TIE2 (binding ELISA)

По завершении процесса пэннинга клетки из последнего раунда разводили до получения 200-500 колоний, наносили шпателем на чашку с агаром CM, а затем инкубировали в течение ночи при 37°C. На следующий день, когда выросли колонии, в 96-луночный глубокий планшет добавляли по 200 мкл среды 2xYT (CM 34 мкг/мл+1% глюкозы), в каждую лунку вносили по одной колонии, а затем инкубировали планшет в течение ночи при 37°C и 3000 об/мин. На следующий день в свежий 96-луночный глубокий планшет добавляли по 200 мкл среды 2xYT (CM 34 мкг/мл+1% глюкозы), в каждую лунку вносили по 20 мкл выращенных накануне клеток и культивировали при 37°C и 3000 об/мин в течение 1 часа 10 минут.Оставшиеся клетки хранили при -70°C в 100 мкл 50% глицерина. Когда клетки подросли, смешивали 1 мкл фага-помощника с 19 мкл среды 2xYT, вносили по 20 мкл полученной смеси в каждую лунку и инкубировали 30 минут при 37°C. После инкубации проводили центрифугирование при 3000 об/мин в течение 10 мин. Супернатанты отбрасывали, а к остаткам добавляли по 200 мкл среды 2xYT (CM 34 мкг/мл+Kan. 70 мкг/мл+1 мМ IPTG+5 мМ MgCl2), а затем инкубировали в MegaGrow при 30°C и 3000 об/мин в течение ночи.At the end of the panning process, cells from the last round were diluted to 200-500 colonies, spread with a spatula on a CM agar plate, and then incubated overnight at 37°C. The next day, when colonies grew, 200 µl of 2xYT medium (CM 34 µg/ml + 1% glucose) was added to a 96-well deep plate, one colony was added to each well, and then the plate was incubated overnight at 37° C and 3000 rpm. The next day, 200 μl of 2xYT medium (CM 34 μg/ml + 1% glucose) was added to a fresh 96-well deep plate, 20 μl of cells grown the day before were added to each well and cultured at 37°C and 3000 rpm in for 1 hour 10 minutes. The remaining cells were stored at -70°C in 100 μl of 50% glycerol. When the cells grew up, 1 μl of helper phage was mixed with 19 μl of 2xYT medium, 20 μl of the resulting mixture was added to each well, and incubated for 30 minutes at 37°C. After incubation, centrifugation was performed at 3000 rpm for 10 min. Supernatants were discarded, and 200 μl of 2xYT medium (CM 34 μg/ml + Kan. 70 μg/ml + 1 mM IPTG + 5 mM MgCl 2 ) were added to the residues, and then incubated in MegaGrow at 30°C and 3000 rpm during the night.

Для отбора фагов, специфически связывающихся с TIE2, сначала в 96-луночный планшет с Ni+вносили 2 мкг/мл антигена (hTIE2-his: Sino Biological, 10700-H08H) по 100 мкл на лунку, а затем инкубировали при 4°C в течение ночи. На следующий день выращенные накануне клетки центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут и хранили при 4°C. Покрытый антигеном планшет промывали 3 раза 0,1% TBST, а затем туда же добавляли 200 мкл блокирующего буфера с 2% BSA и инкубировали при 25°C в течение 2 часов. По завершении блокирования планшет отмывали 3 раза 0,1% TBST. В каждой лунке смешивали 50 мкл 4% BSA с 50 мкл фага, хранившегося при пониженной температуре 4°C, и инкубировали со встряхиванием при комнатной температуре в течение 1 часа. По завершении связывания фага продукт реакции трижды промывали 0,1% TBST, добавляли 100 мкл конъюгированного с HRP мышиного антитела против M13 (1:3000, Sino, 11973-MM05) и инкубировали при 25°C в течение 1 часа. По завершении реакции полученный продукт промывали 3 раза 0,1% TBST, добавляли 100 мкл TMB (из набора реагентов для субстрата TMB #BD 555214), проявляли окраску в течение 3-5 мин и добавляли 50 мкл стоп-раствора, а затем проводили анализ на считывающем устройстве для ELISA.To select phages specifically binding to TIE2, 2 μg/ml of antigen (hTIE2-his: Sino Biological, 10700-H08H) was first added to a 96-well Ni + plate at 100 μl per well, and then incubated at 4°C for during the night. The next day, the cells grown the day before were centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes and stored at 4°C. The plate coated with antigen was washed 3 times with 0.1% TBST, and then 200 μl of blocking buffer with 2% BSA was added thereto and incubated at 25°C for 2 hours. After blocking was complete, the plate was washed 3 times with 0.1% TBST. In each well, 50 μl of 4% BSA was mixed with 50 μl of phage stored at a reduced temperature of 4°C and incubated with shaking at room temperature for 1 hour. Upon completion of phage binding, the reaction product was washed three times with 0.1% TBST, 100 μl of HRP-conjugated mouse anti-M13 antibody (1:3000, Sino, 11973-MM05) was added and incubated at 25°C for 1 hour. Upon completion of the reaction, the resulting product was washed 3 times with 0.1% TBST, 100 µl of TMB (from TMB Substrate Reagent Kit #BD 555214) was added, the color was developed for 3-5 min, and 50 µl of stop solution was added, and then analyzed on the ELISA reader.

В таблице 1 представлены результаты измерения специфического связывания экспонирующих моноклональные scFv фагов с антигеном TIE2 методом ELISA, а в следующих таблицах 2 и 3 представлены нуклеотидные последовательности отобранных антител.Table 1 shows the results of measuring the specific binding of phages displaying monoclonal scFv to the TIE2 antigen by ELISA, and the following tables 2 and 3 show the nucleotide sequences of the selected antibodies.

Таблица 1. Результаты измерения специфического связывания экспонирующих моноклональные scFv фагов с антигеном TIE2 методом ELISATable 1. Results of measurement of specific binding of phages exhibiting monoclonal scFvs to the TIE2 antigen by ELISA method

№No. Номер клонаclone number ELISA для человекаELISA for humans ELISA для мышиmouse ELISA 11 1A61A6 2,12.1 0,10.1 22 1A91A9 2,42.4 0,00.0 33 2F22F2 1,91.9 0,10.1 44 3D63D6 2,12.1 0,10.1 55 4E24E2 1,21.2 0,40.4

Таблица 2. Последовательности CDR антител, специфически связывающихся с антигеном TIE2Table 2. CDR sequences of antibodies specifically binding to the TIE2 antigen

Название последовательностиSequence name Аминокислотная последовательностьAmino acid sequence №1#1 1A61A6 CDR1 тяжелой цепиheavy chain CDR1 GFTFSSYAGFTFSSYA 11 CDR2 тяжелой цепиheavy chain CDR2 ISGSGGSTISGSGGST 22 CDR3 тяжелой цепиheavy chain CDR3 ARGVDSSMVTGFDHARGVDSSMVTGFDH 33 CDR1 легкой цепиLight chain CDR1 QSISRWQSISRW 44 CDR2 легкой цепиlight chain CDR2 EASEAS 55 CDR3 легкой цепиlight chain CDR3 QQYEDYPLTQQYEDYPLT 66 №2#2 1A91A9 CDR1 тяжелой цепиheavy chain CDR1 GYTFNSYDGYTFNSYD 77 CDR2 тяжелой цепиheavy chain CDR2 VNPPGGTGSTVNPPGGTGST 88 CDR3 тяжелой цепиheavy chain CDR3 ARDYNRAPPTLDVARDYNRAPPTLDV 99 CDR1 легкой цепиLight chain CDR1 SSSDVGGYNYSSSDVGGYNY 1010 CDR2 легкой цепиlight chain CDR2 DVTDVT 11eleven CDR3 легкой цепиlight chain CDR3 SSYSSSTFYVSSYSSSTFYV 1212 №3No. 3 2F22F2 CDR1 тяжелой цепиheavy chain CDR1 GFTFSSYAGFTFSSYA 1313 CDR2 тяжелой цепиheavy chain CDR2 ISGSGGSTISGSGGST 1414 CDR3 тяжелой цепиheavy chain CDR3 ARGGLHHGFDIARGGLHHGFDI 1515 CDR1 легкой цепиLight chain CDR1 NIESKSNIESKS 1616 CDR2 легкой цепиlight chain CDR2 YDNYDN 1717 CDR3 легкой цепиlight chain CDR3 QVWDTYTDQPVQVWDTYTDQPV 1818 №4#4 3D63D6 CDR1 тяжелой цепиheavy chain CDR1 GFTFSRYNGFTFSRYN 1919 CDR2 тяжелой цепиheavy chain CDR2 ISSSGRFIISSSGRFI 2020 CDR3 тяжелой цепиheavy chain CDR3 ARDSPTQGPYYYYGMDVARDSPTQGPYYYYGMDV 2121 CDR1 легкой цепиLight chain CDR1 KIGSKSKIGSKS 2222 CDR2 легкой цепиlight chain CDR2 YDSYDS 2323 CDR3 легкой цепиlight chain CDR3 QVWDSSSDRPVQVWDSSSDRPV 2424 №5#5 4E24E2 CDR1 тяжелой цепиheavy chain CDR1 GFTFSDYAGFTFSDYA 2525 CDR2 тяжелой цепиheavy chain CDR2 ISFDGNNQISFDGNNQ 2626 CDR3 тяжелой цепиheavy chain CDR3 TTDTMSGYDWEDAFDITTDTMSGYDWEDAFDI 2727 CDR1 легкой цепиLight chain CDR1 QSIGRWQSIGRW 2828 CDR2 легкой цепиlight chain CDR2 ASSASS 2929 CDR3 легкой цепиlight chain CDR3 QQSYSTPYTQQSYSTPYT 30thirty №6#6 11F11F CDR1 тяжелой цепиheavy chain CDR1 GFSFSDHAGFSFSDHA 3131 CDR2 тяжелой цепиheavy chain CDR2 VWPDGSNKVWPDGSNK 3232 CDR3 тяжелой цепиheavy chain CDR3 ARDSGPISRGDLTYARDSGPISRGDLTY 3333 CDR1 легкой цепиLight chain CDR1 GGSIASNYGGSIASNY 3434 CDR2 легкой цепиlight chain CDR2 EDDEDD 3535 CDR3 легкой цепиlight chain CDR3 QSYDDTNVVQSYDDTNVV 3636

Таблица 3. Последовательности вариабельной области антител, специфически связывающихся с антигеном TIE2Table 3. Variable region sequences of antibodies specifically binding to the TIE2 antigen

Figure 00000001
Figure 00000001

Figure 00000002
Figure 00000002

Figure 00000003
Figure 00000003

Figure 00000004
Figure 00000004

Figure 00000005
Figure 00000005

Пример 3. Отбор антител, способных связываться с клетками, экспрессирующими TIE2Example 3 Selection of antibodies capable of binding to cells expressing TIE2

Для того, чтобы определить связывание с клетками, экспрессирующими TIE2, измеряли связывание с гиперэкспрессирующими TIE2 клетками установленных линий CHO-K1 человека/мыши (hTIE2/CHO-K1, mTIE2/CHO-K1) методом проточной цитометрии. Каждую линию клеток поддерживали и культивировали, а клетки hTIE2/CHO-K1 промывали PBS, добавляли 5 мМ EDTA для получения клеточной суспензии и выделяли клетки центрифугированием. Готовили клеточную суспензию в 5×106 клеток/мл в буфере для FACS (PBS, содержащий 2% FBS, 0,05% азида натрия) и в каждую пробирку вносили по 100 мкл суспензии клеток. В каждую пробирку добавляли по 100 мкл клонов при 2 мкг/мл и выдерживали при 4°C в течение 30 мин, индуцируя связывание с клетками. Клетки отмывали 2 мл буфера для FACS, добавляли 100 мкл разведения второго антитела (1/500, конъюгированный с PE Fc-фрагмент поликлонального антитела против IgG человека, #A80-248PE, Bethyl Laboratories Inc., США) и полученную смесь инкубировали при 4°C в течение 20 мин для введения флуоресцентной метки. Клетки отмывали 2 мл буфера FACS, а затем суспендировали в 200 мкл буфера FACS. В качестве положительного контроля на TIE2 использовали помеченное флуоресцентной меткой PE антитело против CD202b (Tie-2, CD202) мыши (124007, Biolegend), антитело с PE против CD202b (Tie2/Tek) человека (334205, Biolegend), конъюгированное с PE поликлональное антитело против IgG мыши (A90-139PE, Bethyl Laboratories Inc.) и конъюгированное с PE поликлональное антитело против IgG человека (A80-248PE, Bethyl Laboratories Inc.). Проводили анализ на установке FACSCalibur фирмы BD Bioscience.In order to determine binding to cells expressing TIE2, binding to TIE2 overexpressing cells of established human/mouse CHO-K1 lines (hTIE2/CHO-K1, mTIE2/CHO-K1) was measured by flow cytometry. Each cell line was maintained and cultured, and the hTIE2/CHO-K1 cells were washed with PBS, 5 mM EDTA was added to obtain a cell suspension, and the cells were isolated by centrifugation. A cell suspension was prepared at 5×10 6 cells/ml in FACS buffer (PBS containing 2% FBS, 0.05% sodium azide) and 100 μl of the cell suspension was added to each tube. 100 μl clones were added to each tube at 2 μg/ml and kept at 4°C for 30 min to induce cell binding. The cells were washed with 2 ml of FACS buffer, 100 µl of a dilution of the second antibody (1/500, PE-conjugated Fc fragment of a polyclonal antibody against human IgG, #A80-248PE, Bethyl Laboratories Inc., USA) was added, and the resulting mixture was incubated at 4°C. C for 20 min to introduce a fluorescent label. Cells were washed with 2 ml of FACS buffer and then suspended in 200 μl of FACS buffer. As a positive control for TIE2, a PE-labeled anti-mouse CD202b (Tie-2, CD202) antibody (124007, Biolegend), a PE anti-human CD202b (Tie2/Tek) antibody (334205, Biolegend), a PE-conjugated polyclonal antibody anti-mouse IgG (A90-139PE, Bethyl Laboratories Inc.); and a PE-conjugated anti-human IgG polyclonal antibody (A80-248PE, Bethyl Laboratories Inc.). The analysis was carried out on a FACSCalibur from BD Bioscience.

Как показывают результаты исследований, все клоны обладают превосходным связыванием с TIE2 человека, который экспрессирован в клетках линии CHO-K1, а клон 4E2 обладает способностью к связыванию с TIE2 как человека, так и мыши (фиг.1A и 1B).All clones showed excellent binding to human TIE2, which is expressed in the CHO-K1 cell line, and clone 4E2 was able to bind to both human and mouse TIE2 (FIGS. 1A and 1B).

Пример 4. Экспрессия антител против TIE2Example 4 Expression of anti-TIE2 antibodies

Проводили конверсию scFv, экспрессированных в прошедших скрининг фагах, в молекулы IgG методами молекулярной биологии. Выделяли фагемиды из прошедших скрининг клонов E.coli и амплифицировали вариабельные области методом ПЦР. Амплифицированные вариабельные области тяжелой цепи вставляли в экспрессирующий вектор (Invivogen, pfusess-hchg1), содержащий константную область тяжелой цепи, а амплифицированные вариабельные области легкой цепи вставляли в экспрессирующий вектор (Invivogen, pfuse2ss-hclk), содержащий константную область легкой цепи, завершая клонирование ДНК в форме IgG.The scFv expressed in the screened phages were converted to IgG molecules by molecular biology methods. Phagemids were isolated from the screened E. coli clones and the variable regions were amplified by PCR. The amplified heavy chain variable regions were inserted into an expression vector (Invivogen, pfusess-hchg1) containing the heavy chain constant region, and the amplified light chain variable regions were inserted into an expression vector (Invivogen, pfuse2ss-hclk) containing the light chain constant region, completing DNA cloning in the form of IgG.

Краткосрочную экспрессию IgG осуществляли с помощью набора для системы экспрессии Expi293F (Thermo Fisher Scientific, США). Клетки Expi293, входящие в набор, культивировали в суспензии на круговой качалке при 125 об/мин при 37°C и 5% CO2 в специальной среде. Каждые 3 дня клетки пассировали до количества 3×105 клеток/мл, а при введении экспрессирующего вектора количество клеток доводили до 3×106 клеток/мл перед использованием. Введение генов проводили с помощью специального реагента ExpiFectamine, причем готовили комплекс липид-ДНК, содержащий 1 мкг ДНК экспрессирующего вектора и 2,7 мкл ExpiFectamine на 1 мл суспензии клеток, который добавляли в суспензию клеток. Через 16-18 часов после введения добавляли 1/2 усилителя для запуска экспрессии. Затем клетки культивировали в тех же условиях, что описаны выше, в течение 3-4 дней и центрифугировали, получая супернатанты, содержащие IgG.Short-term expression of IgG was performed using the Expi293F expression system kit (Thermo Fisher Scientific, USA). The Expi293 cells included in the kit were cultured in suspension on a circular shaker at 125 rpm at 37°C and 5% CO 2 in a special medium. Every 3 days, cells were passaged to 3×10 5 cells/ml, and with the introduction of the expression vector, the number of cells was adjusted to 3×10 6 cells/ml before use. The introduction of genes was carried out using a special reagent ExpiFectamine, and a lipid-DNA complex was prepared containing 1 μg of the expression vector DNA and 2.7 μl of ExpiFectamine per 1 ml of cell suspension, which was added to the cell suspension. 16-18 hours after administration, 1/2 booster was added to start expression. The cells were then cultured under the same conditions as described above for 3-4 days and centrifuged to obtain supernatants containing IgG.

Пример 5. Очистка антител против TIE2Example 5 Purification of Anti-TIE2 Antibodies

Полученные супернатанты наносили на колонки с протеином A (GE Healthcare) и очищали IgG методом аффинной хроматографии. После уравновешивания колонки смесью 20 мМ Трис-HCl, 50 мМ NaCl и 5 мМ EDTA (pH 7,0) наносили супернатант, промывали раствором, содержащим 50 мМ Трис-HCl, 500 мМ NaCl, 5 мМ EDTA и 0,2% полисорбата 20 (pH 7,0), элюировали раствором, содержащим 50 мМ NaCl и 0,1 М глицин-HCl (pH 3,5), и нейтрализировали 1 М раствором Триса. Элюированный белок диализовали через мембрану Spectra/Por с отсечением по молекулярной массе 10000 (Spectrum Labs, США), заменяя растворитель на PBS. Затем белок концентрировали до требуемой концентрации с помощью Vivaspin (Sartorius, DE), разливали и хранили при -80°C.The resulting supernatants were applied to Protein A columns (GE Healthcare) and purified for IgG by affinity chromatography. After the column was equilibrated with a mixture of 20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, and 5 mM EDTA (pH 7.0), the supernatant was applied, washed with a solution containing 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 5 mM EDTA, and 0.2% polysorbate 20 (pH 7.0), eluted with a solution containing 50 mM NaCl and 0.1 M glycine-HCl (pH 3.5) and neutralized with 1 M Tris. The eluted protein was dialyzed through a Spectra/Por membrane with a molecular weight cutoff of 10,000 (Spectrum Labs, USA), replacing the solvent with PBS. The protein was then concentrated to the desired concentration using Vivaspin (Sartorius, DE), bottled and stored at -80°C.

После очистки каждое антитело обрабатывали невосстанавливающим и восстанавливающим LDS буфером для образцов (Thermo Fisher Scientific) и подвергали электрофорезу на установке NuPAGE (Thermo Fisher Scientific). В результате получали IgG с общей молекулярной массой около 150 кДа, содержащие тяжелую цепь 50 кДа и легкую цепь 25 кДа.After purification, each antibody was treated with non-reducing and reducing LDS sample buffer (Thermo Fisher Scientific) and subjected to NuPAGE electrophoresis (Thermo Fisher Scientific). The result was IgG with a total molecular weight of about 150 kDa, containing a heavy chain of 50 kDa and a light chain of 25 kDa.

Пример 6. Определение перекрестной реактивности антитела против TIE2 к VISTA человека и мышиExample 6 Determination of the cross-reactivity of anti-TIE2 antibody to human and mouse VISTA

Определяли методом ELISA, сохраняется ли у IgG способность scFv фаговых клонов связываться с TIE2. В лунки 96-луночного планшета вносили по 100 мкл на лунку антигена в концентрации 1 мкг/мл (hTIE2-his: Sino Biological, 10700-H08H; mTIE2-his: Sino Biological, 51087-M08H) и инкубировали при 4°C в течение ночи. На следующий день выращенные накануне клетки центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин и хранили при 4°C. Покрытый антигеном планшет промывали 3 раза 0,1% TBST и в каждую лунку добавляли по 200 мкл блокирующего буфера с 2% BSA, а затем инкубировали при 25°C в течение 2 часов. По завершении блокирования планшет промывали 3 раза 0,1% TBST. В каждой лунке смешивали 50 мкл 4% BSA с 50 мкл фага, хранившегося при пониженной температуре 4°C, и инкубировали для протекания реакции со встряхиванием при комнатной температуре в течение 1 часа. После связывания фага продукт реакции трижды промывали 0,1% TBST, в каждую лунку добавляли по 100 мкл конъюгированного с HRP антитела козы к антителу человека (1:3000, Sino, 11973-MM05) и инкубировали при 25°C в течение 1 часа. После завершения реакции полученный продукт 3 раза промывали 0,1% TBST, добавляли в каждую лунку по 100 мкл TMB (из набора реагентов для субстрата TMB #BD 555214), выявляли окрашивание в течение 3-5 мин и добавляли 50 мкл стоп-раствора, а затем проводили анализ на считывающем устройстве для ELISA.It was determined by ELISA whether IgG retained the ability of scFv phage clones to bind to TIE2. 100 μl per well of antigen at a concentration of 1 μg/ml (hTIE2-his: Sino Biological, 10700-H08H; mTIE2-his: Sino Biological, 51087-M08H) was added to the wells of a 96-well plate and incubated at 4°C for night. The next day, the cells grown the day before were centrifuged at 3000 rpm for 10 min and stored at 4°C. The antigen-coated plate was washed 3 times with 0.1% TBST and 200 μl of blocking buffer with 2% BSA was added to each well, and then incubated at 25°C for 2 hours. After blocking was complete, the plate was washed 3 times with 0.1% TBST. In each well, 50 μl of 4% BSA was mixed with 50 μl of phage stored at a reduced temperature of 4°C, and incubated for the reaction with shaking at room temperature for 1 hour. After phage binding, the reaction product was washed three times with 0.1% TBST, 100 µl of HRP-conjugated goat anti-human antibody (1:3000, Sino, 11973-MM05) was added to each well and incubated at 25°C for 1 hour. After completion of the reaction, the resulting product was washed 3 times with 0.1% TBST, 100 µl of TMB (from the TMB Substrate Reagent Kit #BD 555214) was added to each well, staining was detected for 3-5 min, and 50 µl of stop solution was added, and then analyzed on an ELISA reader.

В результате видно, что, аналогично scFv, клоны 1A6, 1A9, 2F2, 4E2 и 3D6 связывались с TIE2 человека, в частности, клон 4E2 связывался как с TIE2 мыши, так и с TIE2 человека (фиг.2).As a result, it can be seen that, similar to scFv, clones 1A6, 1A9, 2F2, 4E2 and 3D6 associated with human TIE2, in particular, clone 4E2 associated with both mouse TIE2 and human TIE2 (figure 2).

Пример 7. Измерение миграционной активности антитела против TIE2Example 7 Measurement of the migratory activity of an anti-TIE2 antibody

Для того, чтобы выявить, действующий как наилучший стабилизатор сосудов среди антител против TIE2, проводили скрининг по миграционным характеристикам эндотелиальных клеток сосудов, которые ответственны за раннюю стадию механизма нормализации сосудов. Соответственно, проводили анализ миграции при использовании клеток HUVEC (эндотелиальные клетки пупочной вены человека).In order to identify which acts as the best vascular stabilizer among anti-TIE2 antibodies, screening was performed for the migratory characteristics of vascular endothelial cells, which are responsible for the early stage of the vascular normalization mechanism. Accordingly, a migration assay was performed using HUVEC (human umbilical vein endothelial cells).

24-луночную поликарбонатную вставку Transwell (размер пор 8,0 мкм, Corning) покрывали 0,1% раствором желатина и высушивали при комнатной температуре в течение примерно 10 мин. Каждый препарат разводили в 600 мкл основной среды и вносили в нижнюю камеру. Затем в нижнюю камеру, содержащую среду, помещали вставочную камеру и инокулировали в нее клетки HUVEC из расчета 1×105 клеток/100 мкл. После инкубации при 37°C в течение 4 часов вставочную камеру трижды промывали дистиллированной водой и окрашивали клетки, прикрепившиеся к вставочной камере, 0,5%-м кристаллическим фиолетовым при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем немигрировавшие клетки внутри вставки смывали ватным тампоном, а клетки, мигрировавшие из вставочной камеры наружу, визуализировали при увеличении в 200 раз с помощью оптического микроскопа, а затем проводили количественную оценку с помощью программы Image-J (NIH).A 24-well Transwell polycarbonate insert (pore size 8.0 µm, Corning) was coated with 0.1% gelatin solution and dried at room temperature for about 10 minutes. Each preparation was diluted in 600 μl of the main medium and introduced into the lower chamber. Then, an insert chamber was placed in the lower chamber containing the medium and HUVEC cells were inoculated into it at the rate of 1×10 5 cells/100 μl. After incubation at 37°C for 4 hours, the insert chamber was washed three times with distilled water, and the cells attached to the insert chamber were stained with 0.5% crystal violet at room temperature for 10 min. Then, non-migrating cells inside the insert were washed off with a cotton swab, and cells that migrated out of the insert chamber were visualized at a magnification of 200 times using an optical microscope, and then quantified using the Image-J (NIH) program.

Результаты исследования показывают, что положительный контроль, т.е. группа, полученная при кластеризации 500 нг/мл ANG1 (R&D System, 923-AN-025), проявляла лучшую миграцию, чем некластеризованная группа, а отрицательный контроль, т.е. 500 нг/мл ANG2 (R&D System, 623-AN-025), не проявлял миграции вне зависимости от кластеризации. В частности, видно, что среди опытных групп клоны 4E2 и 2F2 при 30 мкг/мл проявляли усиление миграции. Клоны 1A6, 1A9 и 11F проявляли базовый уровень миграции, а 3D6 проявлял снижение миграции (фиг.3A).The results of the study show that the positive control, i.e. the 500 ng/mL ANG1 clustering group (R&D System, 923-AN-025) migrated better than the non-clustered group, and the negative control, ie. 500 ng/ml ANG2 (R&D System, 623-AN-025) showed no migration regardless of clustering. In particular, it can be seen that among the experimental groups, clones 4E2 and 2F2 at 30 μg/ml showed an increase in migration. Clones 1A6, 1A9 and 11F showed a base level of migration, and 3D6 showed a decrease in migration (FIG. 3A).

Для того, чтобы установить концентрационную зависимость активности клонов 4E2 и 2F2 и синергический эффект обработки в комбинации с ANG1 на основе результатов исследования миграции, измеряли миграционную активность вышеприведенным способом. Результаты показали, что клоны 4E2 и 2F2 обнаруживают зависимую от концентрации активность и проявляют синергический эффект при обработке в комбинации с ANG1 (фиг.3B и 3C). Таким образом, клоны 4E2 и 2F2 обладают синергическим эффектом в комбинации с ANG1 и быстро вызывают миграцию, происходящую на ранней стадии нормализации сосудов, что свидетельствует об отличной стабилизации сосудов.In order to establish the concentration dependence of the activity of clones 4E2 and 2F2 and the synergistic effect of the treatment in combination with ANG1 based on the results of the migration study, the migration activity was measured by the above method. The results showed that clones 4E2 and 2F2 showed concentration-dependent activity and showed a synergistic effect when treated in combination with ANG1 (FIGS. 3B and 3C). Thus, clones 4E2 and 2F2 have a synergistic effect in combination with ANG1 and quickly induce migration that occurs at an early stage of vascular normalization, indicating excellent vascular stabilization.

Пример 8. Сравнение характеристик связывания между антителами против TIE2 и конкурирующими веществами (ANG1 и ANG2)Example 8 Comparison of Binding Characteristics Between Anti-TIE2 Antibodies and Competitors (ANG1 and ANG2)

Определяли, будут ли 2F2 и 4E2, то есть антитела, отобранные в качестве стабилизаторов сосудов при анализе миграции, конкурировать с ANG1 и ANG2 за связывание с TIE2 и выполнение своих функций, конкурентным методом ELISA. В лунки 96-луночного иммунологического планшета вносили 1 мкг/мл hTIE2 (Sino Biological, 10700-H08H) из расчета 100 мкл на лунку и инкубировали при 4°C в течение ночи. Покрытый hTIE2 планшет два раза промывали PBS, а затем в каждую лунку добавляли по 200 мкл 2% BSA (блокирующего буфера) и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. После блокирования клетки дважды промывали 0,1% PBST. Проводили связывание антител-кандидатов против TIE2 и белков ANG1 и ANG2 с TIE2 в 10-кратных серийных разведениях при концентрации 2 мкг/мл и наивысшей концентрации 50 мкг/мл, соответственно. После трехкратного промывания PBST в лунки добавляли по 100 мкл конъюгированного с HRP антитела козы к антителу человека (1:3000, Sino, 11973-MM05), разведенного в отношении 1:2000, и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 1 часа для индукции связывания, а полученный продукт 3 раза промывали TBST и выявляли окрашивание с помощью субстратного реагента TBM. Проявление окраски останавливали добавлением 50 мкл 2N H2SO4 и измеряли специфическое поглощение OD450−630 на считывающем устройстве для микропланшетов Sunrise (Tecan, CH).It was determined whether 2F2 and 4E2, ie the antibodies selected as vascular stabilizers in the migration assay, compete with ANG1 and ANG2 for binding to TIE2 and performing their functions by competitive ELISA. 1 μg/ml hTIE2 (Sino Biological, 10700-H08H) was added to the wells of a 96-well immunological plate at a rate of 100 μl per well and incubated at 4°C overnight. The hTIE2-coated plate was washed twice with PBS, and then 200 μl of 2% BSA (blocking buffer) was added to each well and incubated at room temperature for 2 hours. After blocking, the cells were washed twice with 0.1% PBST. Anti-TIE2 candidate antibodies and ANG1 and ANG2 proteins were coupled to TIE2 in 10-fold serial dilutions at a concentration of 2 μg/ml and the highest concentration of 50 μg/ml, respectively. After washing three times with PBST, 100 µl of HRP-conjugated goat anti-human antibody (1:3000, Sino, 11973-MM05) diluted 1:2000 was added to the wells and reacted at room temperature for 1 hour to induce binding , and the resulting product was washed 3 times with TBST and staining was detected using the TBM substrate reagent. Color development was stopped by adding 50 μl of 2N H 2 SO 4 and the specific absorbance OD 450-630 was measured on a Sunrise microplate reader (Tecan, CH).

Как видно из фиг.2, отобранные антитела (2F2 и 4E2) связываются с TIE2, не конкурируя с ANG1 и ANG2 человека (фиг.4).As shown in Figure 2, the selected antibodies (2F2 and 4E2) bind to TIE2 without competing with human ANG1 and ANG2 (Figure 4).

Пример 9. Оценка связывающей аффинности антител против TIE2Example 9 Binding Affinity Evaluation of Anti-TIE2 Antibodies

Анализировали аффинность отобранных выбранных антител против TIE2, а именно 4E2, 2F2 и 11F, к TIE2-his человека (Sino Biological, 10700-H08H) и Tie2-his мыши (Sino Biological, 51087-M08H), на установке Octet (ForteBio Inc., США). Антитела против TIE2 фиксировали на биосенсоре и тестировали согласно руководству производителя. Измеряли кинетику связывания при каждой концентрации TIE2 человека и TIE2 мыши и рассчитывали константы скорости связывания (kon), константы скорости диссоциации (koff) и константы связывания (KD) (табл.4).The affinity of selected selected anti-TIE2 antibodies, namely 4E2, 2F2 and 11F, for human TIE2-his (Sino Biological, 10700-H08H) and mouse Tie2-his (Sino Biological, 51087-M08H) was analyzed on an Octet setup (ForteBio Inc. , USA). Anti-TIE2 antibodies were fixed on the biosensor and tested according to the manufacturer's instructions. Binding kinetics were measured at each concentration of human TIE2 and mouse TIE2 and binding rate constants (k on ), dissociation rate constants (k off ) and binding constants (K D ) were calculated (Table 4).

Было обнаружено, что антитело 11F обладает перекрестной реактивностью между TIE2 человека и TIE22 мыши, а результаты ELISA показали, что антитело 11F обладает очень слабой аффинностью (KD=2,09×10−5 M) к TIE2 мыши. Точно так же и 4E2 связывается с TIE2 и человека, и мыши и обладает высокой аффинностью к TIE2 человека, которое соответствует значению KD=1,0×10−12 M, а также аффинностью к TIE2 мыши (1,38×10−8 M). 2F2 проявляет высокую специфическую аффинность только к TIE2 человека, которая соответствует значению KD=7,94×10−10 M.Antibody 11F was found to have cross-reactivity between human TIE2 and mouse TIE22, and ELISA results showed that antibody 11F had very low affinity (K D =2.09×10 −5 M) for mouse TIE2. Similarly, 4E2 binds to both human and mouse TIE2 and has a high affinity for human TIE2, which corresponds to a K D value of 1.0 × 10 −12 M, as well as an affinity for mouse TIE2 (1.38 × 10 −8 M). 2F2 shows a high specific affinity only for human TIE2, which corresponds to a K D value of 7.94×10 −10 M.

Таблица 4Table 4

ОбразецSample KD (M)K D (M) Kon (1/Ms)K on (1/Ms) Koff (1/s)K off (1/s) Полный R2 Full R 2 11F11F hTIE2-hishTIE2-his 2,76×10−9 2.76×10 −9 5,53×104 5.53×10 4 1,52×10−4 1.52×10 −4 0,99860.9986 mTie2-hismTie2-his 2,09×10−5 2.09×10 −5 1,87×102 1.87× 102 3,90×10−3 3.90×10 −3 0,89970.8997 2F22F2 hTIE2-hishTIE2-his 7,94×10−10 7.94×10 −10 1,46×105 1.46×10 5 1,16×10−4 1.16×10 −4 0,99940.9994 mTie2-hismTie2-his -- -- -- -- 4E24E2 hTIE2-hishTIE2-his <1,0×10−12 <1.0×10 −12 1,06×105 1.06×10 5 <1,0×10−7 <1.0×10 −7 0,99490.9949 mTie2-hismTie2-his 1,38×10−8 1.38×10 −8 2,12×105 2.12×10 5 2,91×10−3 2.91×10 −3 0,92150.9215

Пример 10. Измерение активности по возмещению сосудистой утечки антитела против TIE2Example 10 Measurement of vascular leakage repair activity of anti-TIE2 antibody

Для того, чтобы определить активность антитела против TIE2 в качестве стабилизаторов сосудов, проводили тест на возмещение сосудистой утечки на эндотелиальных клетках сосудов. Ангиогенез вызывает разрыв контактов в сосудах вследствие гиперэкспрессии VEGF, что приводит к сосудистой утечке. Для проведения этого теста in vitro осуществляли анализ проницаемости сосудов на клетках линии HUVEC.In order to determine the activity of an anti-TIE2 antibody as vascular stabilizers, a vascular leak repair test was performed on vascular endothelial cells. Angiogenesis causes rupture of contacts in vessels due to overexpression of VEGF, which leads to vascular leakage. For this in vitro test, a vascular permeability assay was performed on HUVEC cells.

24-луночную поликарбонатную вставку Transwell (размер пор 0,4 мкм, Merck Millipore) покрывали 0,1% раствором желатина (Sigma Aldrich, G1890), а затем высушивали при комнатной температуре в течение примерно 10 мин. Затем в нижнюю камеру, содержащую среду, помещали вставочную камеру и инокулировали в нее клетки HUVEC из расчета 6×104 клеток/200 мкл. Затем клетки культивировали в течение 72 часов без замены среды в термостате с 5% CO2 при 37°C. После удаления среды из вставочной камеры обрабатывали основную среду каждым препаратом. Клетки инкубировали при 37°C в течение 30 минут, добавляли VEGF в концентрации 100 нг/мл (R&D System, 293-VE-050) и инкубировали 150 минут.Затем во вставочную камеру добавляли 0,5 мг/мл FITC-декстрана (70 кДа, Sigma) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 30 мин. Собирали 50 мкл FITC-декстрана, просочившегося в нижнюю камеру, и разбавляли 1:20 в PBS. Затем в разведенных образцах измеряли флуоресценцию при длине волны 492 нм/520 нм (возбуждение/испускание) на считывающем устройстве для микропланшетов (Hidex Chameleon).A 24-well Transwell polycarbonate insert (pore size 0.4 µm, Merck Millipore) was coated with 0.1% gelatin solution (Sigma Aldrich, G1890) and then dried at room temperature for about 10 minutes. Then, an insert chamber was placed in the lower chamber containing the medium and HUVEC cells were inoculated into it at a rate of 6×10 4 cells/200 μl. The cells were then cultured for 72 hours without changing the medium in an incubator with 5% CO 2 at 37°C. After removal of the medium from the insertion chamber, the main medium was treated with each preparation. Cells were incubated at 37°C for 30 minutes, VEGF was added at a concentration of 100 ng/ml (R&D System, 293-VE-050) and incubated for 150 minutes. Then 0.5 mg/ml FITC-dextran (70 kDa, Sigma) and reacted at room temperature for 30 min. Collected 50 μl of FITC-dextran leaked into the lower chamber, and diluted 1:20 in PBS. The diluted samples were then measured for fluorescence at 492 nm/520 nm (excitation/emission) on a microplate reader (Hidex Chameleon).

Результаты исследования показывают, что в группе, получавшей только VEGF, обнаруживалось повышение количества просочившегося FITC-декстрана при разрыве плотных контактов в эндотелиальных клетках сосудов. Однако видно, что количество такого FITC-декстрана снижалось при обработке ANG1, положительным контролем. С другой стороны, ANG2, отрицательный контроль, обнаруживал проницаемость, близкую к таковой в группе, получавшей лишь VEGF, а в группах, получавших 2F2 и 4E2, отмечалось снижение проницаемости. Кроме того, проверяли активность 11F тем же экспериментальным способом, что и выше. Результат показал, что 11F также снижает проницаемость сосудов (фиг.5A и 5B).The results of the study show that in the VEGF-only group, an increase in the amount of leaked FITC-dextran was found when tight junctions in vascular endothelial cells were broken. However, it can be seen that the amount of such FITC-dextran was reduced by treatment with ANG1, the positive control. On the other hand, ANG2, the negative control, showed a permeability close to that of the VEGF-only group, and a decrease in permeability was observed in the 2F2 and 4E2 groups. In addition, the activity of 11F was tested by the same experimental method as above. The result showed that 11F also reduced vascular permeability (FIGS. 5A and 5B).

Вышеприведенные результаты свидетельствуют о том, что антитело против TIE2 обладает активностью по ослаблению сосудистой утечки, вызванной VEGF. Кроме того, определяли, способно ли антитело против TIE2 возмещать сосудистую утечку даже в условиях культивирования, аналогичных условиям модели заболевания в группе, получавшей и VEGF, и ANG2.The above results indicate that the anti-TIE2 antibody has the activity of attenuating vascular leakage caused by VEGF. In addition, it was determined whether the anti-TIE2 antibody was able to repair vascular leakage even under culture conditions similar to those of the disease model in the VEGF and ANG2 treated group.

Результаты показывают, что 2F2 снижает проницаемость сосудов до базового уровня, а 4E2 также снижает проницаемость сосудов до базового уровня. Из результатов теста на проницаемость сосудов следует, что клоны 2F2 и 4E2 могут нормализировать сосудистую утечку, вызванную VEGF и ANG2 (фиг.5C).The results show that 2F2 reduces vascular permeability to baseline and 4E2 also reduces vascular permeability to baseline. From the results of the vascular permeability test, clones 2F2 and 4E2 can normalize vascular leakage caused by VEGF and ANG2 (FIG. 5C).

Пример 11. Исследование механизма нормализации сосудов антител против TIE2Example 11 Investigation of the mechanism of vascular normalization of anti-TIE2 antibodies

Исследовали механизм понижающей регуляции сигнала в отношении TIE2, чтобы определить, реализуется ли эффект уменьшения сосудистой утечки у отобранных антител против TIE2 по сигнальному механизму нормализации сосудов. Для этого обрабатывали препаратами клетки HUVEC, а затем определяли экспрессию белков, связанных с нормализацией сосудов, методом вестерн-блоттинга.The down-regulation mechanism of the TIE2 signal was investigated to determine whether the effect of reducing vascular leakage in selected anti-TIE2 antibodies is mediated through the vascular normalization signaling mechanism. For this, HUVEC cells were treated with preparations, and then the expression of proteins associated with the normalization of blood vessels was determined by Western blotting.

Для вестерн-блоттинга каждую из линий клеток HUVEC, подвергавшихся взаимодействию с препаратами, дважды промывали PBS и затем инкубировали в буфере для лизиса (Thermo Scientific, буфер RIPA с ингибиторами фосфатаз) на льду в течение 20 мин, получая клеточные экстракты. Затем клетки центрифугировали при 13000 об/мин и 4°C и собирали только супернатанты. После определения белка с помощью BCA наносили лизаты на 10% гель SDS-PAGE и проводили электрофорез. Переносили белки на нитроцеллюлозную мембрану (Bio-Rad) и блокировали 5% обезжиренным молоком в буфере TBST с 0,1% Твин 20 при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем разводили 1:1000 первые антитела (p-TIE2, TIE2, p-AKT, AKT, p-ERK, ERK, p-VEGF, p-VE-кадгерин, VE-кадгерин и гистоны; клеточный сигналлинг) и встряхивали в течение ночи при 4°C, а затем проводили реакцию со вторым конъюгированным с пероксидазой антителом (Santa Cruz), разведенным 1:5000, при комнатной температуре в течение 1 часа. Проводили реакцию с раствором ECL (Pierce) и обнаруживали требуемые полосы белков. Важно, что в каждый момент времени наблюдался сигнальный механизм TIE2. Результаты исследования показывают, что антитело 2F2 против TIE2 вызывает фосфорилирование TIE2, подобно ANG1, а также фосфорилирование AKT, сигнала нормализации сосудов. Антитела 4E2 и 11F против TIE2 давали аналогичные результаты. Соответственно, антитела 2F2, 4E2 и 11F, как оказалось, обладают способностью действовать в качестве средств, нормализующих сосуды посредством фосфорилирования TIE2 (фиг.6).For Western blotting, each of the drug-reacted HUVEC cell lines was washed twice with PBS and then incubated in lysis buffer (Thermo Scientific, RIPA buffer with phosphatase inhibitors) on ice for 20 min to obtain cell extracts. The cells were then centrifuged at 13,000 rpm and 4°C and only the supernatants were collected. After protein determination with BCA, the lysates were applied to a 10% SDS-PAGE gel and electrophoresis was performed. The proteins were transferred to a nitrocellulose membrane (Bio-Rad) and blocked with 5% skim milk in TBST buffer with 0.1% Tween 20 at room temperature for 1 hour. The first antibodies (p-TIE2, TIE2, p-AKT, AKT, p-ERK, ERK, p-VEGF, p-VE-cadherin, VE-cadherin and histones; cell signaling) were then diluted 1:1000 and shaken overnight at 4°C, and then reacted with a second peroxidase-conjugated antibody (Santa Cruz) diluted 1:5000 at room temperature for 1 hour. The reaction was carried out with an ECL solution (Pierce) and the desired protein bands were found. It is important that the TIE2 signaling mechanism was observed at each time point. The results of the study show that the anti-TIE2 antibody 2F2 induces phosphorylation of TIE2, similar to ANG1, as well as phosphorylation of AKT, a vascular normalization signal. Anti-TIE2 antibodies 4E2 and 11F gave similar results. Accordingly, antibodies 2F2, 4E2 and 11F appeared to have the ability to act as vascular normalizers through TIE2 phosphorylation (FIG. 6).

Таким образом, чтобы определить, возмещает ли антитело против TIE2 сосудистую утечку посредством стабилизирующих сосуды сигналов даже в условиях сосудистой утечки, среду, содержащую VEGF, обрабатывали антителом 2F2 против TIE2 и измеряли сигналы фосфорилирования VEGFR и VE-кадгерина, которые отвечают за восстановление плотных контактов в эндотелиальных клетках сосудов, таким же методом вестерн-блоттинга, как и выше (фиг.7).Thus, to determine whether anti-TIE2 antibody compensates for vascular leakage with vascular-stabilizing signals even under conditions of vascular leakage, VEGF-containing medium was treated with anti-TIE2 antibody 2F2 and the phosphorylation signals of VEGFR and VE-cadherin, which are responsible for re-establishing tight junctions in vascular endothelial cells by the same western blotting method as above (FIG. 7).

Результаты исследования показывают, что фосфорилирование VEGFR повышается, и фосфорилирование VE-кадгерина, который составляет межклеточные плотные контакты, повышается в группе VEGF, ответственного за ангиогенез. С другой стороны, ANG1, положительный контроль, ингибировал фосфорилирование VEGFR и VE-кадгерина. Точно так же и антитело 2F2 тоже ингибировало фосфорилирование VEGFR и VE-кадгерина. В этом сигнальном механизме антитело против TIE2 ингибировало активацию VEGFR посредством фосфорилирования TIE2, а ингибированный VEGFR ингибировал фосфорилирование VE-кадгерина, ответственного за межклеточные плотные контакты в клеточной мембране, что приводило к восстановлению межклеточных плотных контактов. Результаты исследования свидетельствуют, что антитело против TIE2 может действовать в качестве стабилизатора сосудов, выполняющего функции возмещения сосудистой утечки и передачи сигналов.The results of the study show that VEGFR phosphorylation is increased and VE-cadherin phosphorylation, which constitutes intercellular tight junctions, is increased in the VEGF group responsible for angiogenesis. On the other hand, ANG1, a positive control, inhibited VEGFR and VE-cadherin phosphorylation. Similarly, the 2F2 antibody also inhibited VEGFR and VE-cadherin phosphorylation. In this signaling mechanism, anti-TIE2 antibody inhibited VEGFR activation via TIE2 phosphorylation, and inhibited VEGFR inhibited phosphorylation of VE-cadherin responsible for intercellular tight junctions in the cell membrane, resulting in restoration of intercellular tight junctions. The results of the study indicate that the anti-TIE2 antibody can act as a vascular stabilizer, performing the functions of repairing vascular leakage and signaling.

Пример 12. Поддержание межклеточных плотных контактов антителом против TIE2Example 12 Maintenance of Intercellular Tight Contacts with Anti-TIE2 Antibody

Чтобы определить, влияют ли антитела против TIE2 на нормализацию сосудов, проводили иммуноцитохимический тест на клетках линии HUVEC. Клетки линии HUVEC высевали по 8×105 клеток на лунку на 4-луночное предметное стекло для ICC. Через 24 часа вносили 100 нг/мл VEGF, ANG1, ANG2, 10 мкг/мл антител против TIE2 (2F2, 4E2) и инкубировали в течение 24 часов. После фиксации в 4% PFA в течение 15 мин пермеабилизировали клеточные мембраны с помощью Тритона X-100 и блокировали 10% козьей сывороткой. После отмывания в PBS проводили связывание с конъюгированным с Alexa-488 антителом против VE-кадгерина (Thermo) в разведении 1:200 в течение ночи и инкубировали с 1 нг/мл DAPI в течение 10 мин. После отмывания PBS препараты фиксировали заливочным раствором и визуализировали под флуоресцентным микроскопом.To determine whether anti-TIE2 antibodies affect vascular normalization, an immunocytochemical test was performed on HUVEC cells. HUVEC cells were plated at 8×10 5 cells per well on a 4-well ICC glass slide. After 24 hours, 100 ng/ml VEGF, ANG1, ANG2, 10 μg/ml anti-TIE2 antibodies (2F2, 4E2) were added and incubated for 24 hours. After fixation in 4% PFA for 15 min, cell membranes were permeabilized with Triton X-100 and blocked with 10% goat serum. After washing in PBS, binding was performed with Alexa-488 conjugated anti-VE-cadherin antibody (Thermo) at a dilution of 1:200 overnight and incubated with 1 ng/ml DAPI for 10 min. After washing with PBS, the preparations were fixed with the embedding solution and visualized under a fluorescent microscope.

Наблюдалась экспрессия VE-кадгерина. Результаты исследования показывают, что экспрессия VE-кадгерина, молекулы межклеточных плотных контактов, снижалась в группе, обработанной и VEGF, и ANG2, причем контакты восстанавливались после обработки ANG1, положительным контролем. После обработки антителом против TIE2 (2F2) экспрессия VE-кадгерина значительно повышалась, как и в случае положительного контроля. При обработке в комбинации с ANG2 экспрессия VE-кадгерина также повышалась. Другое антитело против TIE2 (4E2) также обнаруживало заметное повышение экспрессии VE-кадгерина, как и с положительным контролем, причем 4E2 при обработке в комбинации с ANG2 также повышало экспрессию VE-кадгерина со значением, близким к таковому в группе, обработанной только препаратом (фиг.8). Результаты исследования свидетельствуют, что антитела против TIE2 (2F2, 4E2) усиливают экспрессию VE-кадгерина, приводя к нормализации сосудов.Expression of VE-cadherin was observed. The results of the study show that the expression of VE-cadherin, a cell-cell tight junction molecule, was reduced in the VEGF and ANG2 treated group, with contacts restored after treatment with ANG1, the positive control. After treatment with anti-TIE2 antibody (2F2), VE-cadherin expression was significantly increased, as was the case with the positive control. When treated in combination with ANG2, VE-cadherin expression was also increased. Another anti-TIE2 antibody (4E2) also showed a marked upregulation of VE-cadherin expression, as with the positive control, with 4E2 when treated in combination with ANG2 also upregulated VE-cadherin with a value close to that of the drug-only treated group (Fig. .8). The results of the study indicate that antibodies against TIE2 (2F2, 4E2) enhance the expression of VE-cadherin, leading to the normalization of blood vessels.

Пример 13. Тест на нормализацию сосудов in vivo под действием антитела против TIE2Example 13 In vivo vascular normalization test with anti-TIE2 antibody

Чтобы определить, проявляется ли функция нормализации сосудов у антитела против TIE2 in vivo, определяли активность антитела против TIE2, используя антитело 4E2, которое обладает способностью к связыванию с TIE2 мыши на модели индуцированной VEGF сосудистой утечки в ушах.To determine whether an anti-TIE2 antibody exhibits vascular normalization function in vivo, the activity of an anti-TIE2 antibody was determined using the 4E2 antibody, which has the ability to bind to mouse TIE2 in a VEGF-induced tinnitus vascular leak model.

В хвостовую вену 7-недельных самцов мышей Balb/c вводили 1% раствор красителя Evans blue и выжидали 10 минут, пока кровь не окрасится в синий цвет.Затем в кровеносные сосуды правого уха мышей в опытной группе вводили 10 мг/кг 4E2, а в кровеносные сосуды левого уха вводили PBS. Через 30 минут в кровеносные сосуды обоих ушей вводили VEGF (R&D System, 293-VE-050). В контрольной группе вводили PBS в кровеносные сосуды левого уха и VEGF в сосуды правого уха. Через 30 минут уши отрезали и экстрагировали краситель Evans blue этанолом в течение 24 часов. Затем измеряли значения OD на считывающем устройстве для микропланшетов.A 1% solution of Evans blue was injected into the tail vein of 7-week-old male Balb/c mice and waited 10 minutes until the blood turned blue. Then, 10 mg/kg 4E2 was injected into the blood vessels of the right ear of mice in the experimental group, and blood vessels of the left ear were injected with PBS. 30 minutes later, VEGF was injected into the blood vessels of both ears (R&D System, 293-VE-050). In the control group, PBS was injected into the blood vessels of the left ear and VEGF into the vessels of the right ear. After 30 minutes, the ears were cut off and Evans blue was extracted with ethanol for 24 hours. The OD values were then measured on a microplate reader.

В результате отмечалась утечка красителя Evans blue под действием VEGF в группе отрицательного контроля, которая примерно в два раза превышала уровень утечки по сравнению с группой PBS. Среди опытных групп в группе, обработанной 4E2, утечка красителя Evans blue снижалась примерно на 30% по сравнению с группой VEGF. Таким образом, из результатов этого эксперимента следует, что антитело против TIE2 способно в достаточной степени нормализировать кровеносные сосуды, проявляющие сосудистую утечку, вызванную VEGF, за счет передачи сигналов посредством TIE2 (фиг.9).As a result, leakage of Evans blue dye from VEGF was noted in the negative control group, which was approximately twice the leakage rate compared to the PBS group. Among the experimental groups in the 4E2 treated group, Evans blue dye leakage was reduced by about 30% compared to the VEGF group. Thus, from the results of this experiment, it appears that the anti-TIE2 antibody is able to sufficiently normalize blood vessels exhibiting VEGF-induced vascular leakage by signaling through TIE2 (FIG. 9).

Пример 14. Оценка действия антитела против TIE2 по ингибированию ангиогенеза в сетчаткеExample 14 Evaluation of the effect of an anti-TIE2 antibody on inhibition of angiogenesis in the retina

Чтобы определить, обладает ли антитело против TIE2 ингибирующим действием на ангиогенез, проводили тест на его эффективность на модели индуцированной лазером хориоидальной неоваскуляризации (CNV) у мышей. Эффективность действия антитела тестировали в сравнении с коммерческим препаратом афлиберцепт в качестве контроля. После общей анестезии мышей кетамином им в глаза по каплям добавляли анестезирующие капли, чтобы вызвать дополнительную местную анестезию, а также по каплям добавляли мидриатическое средство, чтобы вызвать расширение зрачков. Мышей помещали на операционный стол и разрушали оболочку Бруха, индуцируя лазерный ожог в соответствии с условиями индукции CNV (длина волны 532 нм, диаметр 50 мкм, продолжительность 80 мс, уровень мощности 200 мВт) с помощью Micron-IV. Очаги, в которых не наблюдались пузырьки во время индукции лазерного ожога, классифицировали как неудачные лазерные ожоги и исключали из процесса анализа результатов и статистической обработки на основании критериев исключения по модифицированным критериям, предложенным Gong Y. et al. (Plos One, 1:15, 2015).To determine whether an anti-TIE2 antibody has an angiogenesis inhibitory effect, its efficacy was tested in a laser-induced choroidal neovascularization (CNV) mouse model. The effectiveness of the antibody was tested in comparison with the commercial drug aflibercept as a control. After general anesthesia of mice with ketamine, anesthetic drops were added to their eyes to induce additional local anesthesia, and a mydriatic agent was also added dropwise to induce pupillary dilation. Mice were placed on the operating table and the Bruch's membrane was destroyed by inducing laser burn according to CNV induction conditions (wavelength 532 nm, diameter 50 μm, duration 80 ms, power level 200 mW) with Micron-IV. Lesions in which no bubbles were observed during laser burn induction were classified as failed laser burns and excluded from the analysis of results and statistical processing based on the exclusion criteria according to the modified criteria proposed by Gong Y. et al. (Plos One, 1:15, 2015).

Через 24 часа после индукции CNV вводили антитело против TIE2 (20, 40 мкг/глаз) или контрольный препарат афлиберцепт (20 мкг/глаз). Для того, чтобы обнаружить эффект ингибирования ангиогенеза, мышей анестезировали кетамином через 10 дней после индукции CNV, а затем внутрибрюшинно вводили флуоресцентное контрастное вещество. В глаза по каплям вводили анестезирующие капли, чтобы вызвать дополнительную местную анестезию, а также по каплям добавляли мидриатическое средство, чтобы вызвать расширение зрачков. Мышей помещали на операционный стол, фокусировали изображение на глазном дне с помощью камеры для визуализации Micron-IV, в глаза по каплям добавляли смазывающий гель и приводили линзу OCT в контакт с роговицей глаза. Осуществляли запись изображений FFA/OCT, а затем в глаза мышей вводили глазные капли с антибиотиком. Анализ изображений FFA и OCT проводили с помощью программы Image-J. Однако очаги CNV, соответствующие критериям исключения, предложенным Gong Y. et al., исключали из окончательных результатов и процесса статистического анализа.24 hours after CNV induction, anti-TIE2 antibody (20, 40 μg/eye) or control drug aflibercept (20 μg/eye) was administered. In order to detect the effect of angiogenesis inhibition, mice were anesthetized with ketamine 10 days after CNV induction, and then intraperitoneally injected with a fluorescent contrast agent. Anesthetic drops were dropped into the eyes to induce additional local anesthesia, and a mydriatic agent was also added dropwise to induce pupillary dilation. Mice were placed on the operating table, the image was focused on the fundus using a Micron-IV imaging camera, lubricating gel was added dropwise into the eyes, and the OCT lens was brought into contact with the cornea of the eye. FFA/OCT images were recorded and then antibiotic eye drops were injected into the eyes of mice. FFA and OCT images were analyzed using Image-J software. However, CNV lesions meeting the exclusion criteria proposed by Gong Y. et al. were excluded from the final results and statistical analysis process.

Чтобы определить эффект восстановления зрительного нерва, проводили электроретинографию (ЭРГ). У мышей индуцировали адаптацию к темноте в темной комнате за 12 часов до проведения ЭРГ. В день проведения ЭРГ (через 11 дней после индукции CNV) мышей подвергали общей анестезии с помощью Rompun® и кетамина и в глаза по каплям вводили Alcaine®, чтобы вызвать дополнительную местную анестезию, а также по каплям добавляли мидриатическое средство, чтобы вызвать расширение зрачков. Мышей помещали на столик для ЭРГ и ставили зонды для ЭРГ на хвост, голову и роговицу. ЭРГ определяли по изменению потенциала сетчатки после однократной импульсной стимуляции (0,9 log cds/m2 (10 ответов/интенсивность)). По завершении ЭРГ в глаза мышей вводили каплю Tobrex. Анализ ЭРграмм проводили с помощью программы LabScribeERG (iWorx DataAcquisition Software). Однако глаза, удовлетворяющие критериям исключения, предложенным Gong Y. et al., исключали из окончательных результатов и процесса статистического анализа.Electroretinography (ERG) was performed to determine the effect of optic nerve repair. Mice were induced to adapt to darkness in a dark room 12 hours before the ERG. On the day of the ERG (11 days after CNV induction), mice were subjected to general anesthesia with Rompun® and ketamine, and Alcaine® was dropped into the eyes to induce additional local anesthesia, and a mydriatic agent was added dropwise to induce pupillary dilation. Mice were placed on an ERG table and ERG probes were placed on the tail, head, and cornea. ERG was determined by the change in retinal potential after a single impulse stimulation (0.9 log cds/m 2 (10 responses/intensity)). At the end of the ERG, a drop of Tobrex was injected into the eyes of the mice. ERgrams were analyzed using the LabScribeERG program (iWorx DataAcquisition Software). However, eyes that met the exclusion criteria proposed by Gong Y. et al. were excluded from the final results and the statistical analysis process.

Результаты оценки действия антитела против TIE2 по снижению ангиогенеза на модели CNV у мышей представлены на фиг.10. Все опытные группы, получавшие антитело против TIE2, проявляли статистически значимое снижение размера очагов CNV по данным FFA по сравнению с CNV в контрольной группе (p<0,0001 для каждой группы) и проявляли гораздо большее снижение даже по сравнению с опытной группой, получавшей афлиберцепт.Как видно из фиг.10B, все опытные группы, получавшие антитело против TIE2, проявляли статистически значимое уменьшение объема очагов по данным OCT по сравнению с CNV в контрольной группе (p<0,0001, p<0,001 для каждой группы). Кроме того, при сравнении потенциала сетчатки по скотопической ЭРГ с контрольной группой CNV на фиг.10C наблюдалось статистически значимое увеличение амплитуды волны B, сравнимое с группой, получавшей афлиберцепт (p<0,0001). Результаты свидетельствуют, что антитело против TIE2 на модели CNV у мышей обладает ингибирующим действием на ангиогенез и сосудистую утечку.The results of the evaluation of the effect of antibodies against TIE2 to reduce angiogenesis in the CNV model in mice are shown in Fig.10. All anti-TIE2 antibody treated treatment groups showed a statistically significant reduction in FFA CNV lesion size compared to control CNV (p<0.0001 for each group) and showed a much greater reduction even compared to the aflibercept treatment group 10B, all treatment groups treated with anti-TIE2 showed a statistically significant decrease in OCT lesion volume compared to CNV in the control group (p<0.0001, p<0.001 for each group). In addition, when comparing the scotopic ERG retinal potential with the CNV control group in FIG. 10C, there was a statistically significant increase in B wave amplitude comparable to the aflibercept group (p<0.0001). The results indicate that the anti-TIE2 antibody in the CNV mouse model has an inhibitory effect on angiogenesis and vascular leakage.

Пример 15. Оценка действия антитела против TIE2 на нормализацию раковых кровеносных сосудовExample 15 Evaluation of the effect of an anti-TIE2 antibody on the normalization of cancerous blood vessels

Для оценки действия антитела против TIE2 на нормализацию раковых сосудов проводили тестирование на модели спонтанной глиобластомы у мышей, используя антитело DC101 против VEGFR в качестве контрольного препарата. Степень индукции опухолей при спонтанной глиобластоме измеряли по визуализации IVIS у 6-7-недельных мышей EGFRviii/viii Luciferasefl/+tdTomatofl/+один раз в неделю. Образование опухолей определяли, как случай, когда яркость сигнала IVIS составляла 3,0×104 фотонов/сек/см2/ср или больше и в головном мозге мышей выявлялся локально концентрированный сигнал. Мышей с опухолями группировали и проводили визуализацию IVIS три раза, в частности, один раз перед введением препарата, один раз во время введения и один раз по окончании введения, каждый раз регистрируя яркость сигнала при визуализации. Препараты антитела против TIE2 (1 мг на мышь) и антитела против VEGFR (1 мг на мышь) вводили внутривенно в общей сложности 4 дозы по два раза в неделю на протяжении 2 недель. Перед введением препаратов мышей тщательно анестезировали путем респираторной анестезии изофлураном. Мышей также тщательно анестезировали путем внутрибрюшинной инъекции смешанного раствора, содержащего 52,5 мкл кетамина, 22,5 мкл Rompun и 75 мкл PBS. Через 10 минут мышей опять анестезировали посредством внутривенной инъекции 200 мкл лектина-649 в ретроорбитальную вену, а затем извлекали мозг.В извлеченном мозге мышей определяли изменения в структуре сосудов и покрытии сосудистых перицитов путем окрашивания на CD31 и PDGFRβ.To evaluate the effect of the anti-TIE2 antibody on normalization of cancer vessels, testing was performed in a spontaneous glioblastoma mouse model using the anti-VEGFR antibody DC101 as a control drug. The degree of tumor induction in spontaneous glioblastoma was measured by IVIS imaging in 6-7 week old mice EGFR viii/viii Luciferase fl/+ tdTomato fl/+ once a week. Tumor formation was defined as the case where the intensity of the IVIS signal was 3.0×10 4 photons/sec/cm 2 /sr or more and a locally concentrated signal was detected in the brain of mice. Mice with tumors were grouped and IVIS imaging was performed three times, in particular, once before the administration of the drug, once during the administration, and once after the end of the administration, each time recording the brightness of the signal during the imaging. Anti-TIE2 antibody (1 mg/mouse) and anti-VEGFR antibody (1 mg/mouse) preparations were administered intravenously for a total of 4 doses twice a week for 2 weeks. Prior to drug administration, mice were thoroughly anesthetized by isoflurane respiratory anesthesia. Mice were also thoroughly anesthetized by intraperitoneal injection of a mixed solution containing 52.5 µl of ketamine, 22.5 µl of Rompun and 75 µl of PBS. After 10 minutes, the mice were again anesthetized with an intravenous injection of 200 μl of lectin-649 into the retroorbital vein, and then the brain was removed. In the extracted mouse brain, changes in vascular structure and vascular pericyte coverage were determined by staining for CD31 and PDGFRβ.

По результатам наблюдения сигналов PECAM (CD31), сосредоточенных на канцерогенном участке, где сильно экспрессируется Td-tomato, такие характеристики внешнего вида раковых сосудов, как увеличение диаметра, изогнутая форма и заметное уменьшение ветвей, были ослаблены в группе, получавшей 4E2, по сравнению с группами, получавшими IgG человека и DC101 (фиг.11A). Кроме того, по результатам наблюдения сигналов PDGFRβ оказалось, что большая часть белка PDGFRβ, маркера сосудистых адгезированных клеток, хорошо прикреплялась к участку, окрашенному PECAM, в группе, получавшей антитело против TIE2. Это означает, что антитело против TIE2 обладает свойством нормализации внешнего вида раковых сосудов, ингибируя аномальную пролиферацию эндотелиальных клеток сосудов и улучшая адгезию сосудистых перицитов к эндотелиальным клеткам сосудов (фиг.11B).Based on the observation of PECAM (CD31) signals focused on the carcinogenic site where Td-tomato is highly expressed, the characteristics of the appearance of cancer vessels, such as increase in diameter, curved shape and marked decrease in branches, were attenuated in the 4E2 treated group compared with groups treated with human IgG and DC101 (FIG. 11A). In addition, by observing PDGFRβ signals, most of the PDGFRβ protein, a marker of vascular adherent cells, adhered well to the PECAM-stained site in the anti-TIE2 antibody group. This means that the anti-TIE2 antibody has the property of normalizing the appearance of cancer vessels by inhibiting the abnormal proliferation of vascular endothelial cells and improving the adhesion of vascular pericytes to vascular endothelial cells (FIG. 11B).

Пример 16. Оценка противоопухолевого действия антитела против TIE2Example 16 Evaluation of antitumor activity of an anti-TIE2 antibody

Чтобы определить противоопухолевое действие и эффект усиления внутриопухолевой миграции иммунных клеток за счет нормализации раковых сосудов антителом против TIE2, мышам BALB/c трансплантировали клетки раковой линии CT26 толстой кишки мыши и вводили только антитело против TIE2 или это антитело в комбинации с антителом против PD-1 мыши. У мышей измеряли длину, ширину и толщину трансплантатов колоректальных раковых клеток линии CT26 с помощью штангенциркуля. В то же самое время опухоли взвешивали. Размер опухолей определяли как (длина × ширина × толщина)/2, и мышей с опухолями группировали на основе среднего значения 27,5 мм3. Затем мышам вводили препараты антитела против TIE2 (30 мг/кг) или против PD-1 мыши (10 мг/кг) как сами по себе, так и в комбинации, один раз в неделю и два раза в неделю, соответственно. На 10-й день после введения препаратов всех мышей умерщвляли с помощью газообразного СО2, проводили лапаротомию, проверяли органы визуально на наличие аномалий невооруженным глазом и извлекали опухоли. Каждую извлеченную опухоль взвешивали на химических весах, делали снимки и измеряли иммунные клетки типа Т-клеток CD4+, Т-клеток CD8+и MDSC в опухолях методом проточной цитометрии. Опухоли фиксировали в формалине и проводили окрашивание Т-клеток CD8+и MDSC методами иммуногистохимии.To determine the antitumor effect and the effect of enhancing intratumoral migration of immune cells by normalizing cancer vessels with anti-TIE2 antibody, BALB/c mice were transplanted with mouse colon cancer cell line CT26 and injected with anti-TIE2 antibody alone or in combination with mouse anti-PD-1 antibody. . In mice, the length, width, and thickness of CT26 colorectal cancer cell grafts were measured using calipers. At the same time, the tumors were weighed. The size of the tumors was defined as (length×width×thickness)/2, and mice with tumors were grouped based on an average value of 27.5 mm 3 . Mice were then treated with anti-TIE2 (30 mg/kg) or anti-mouse PD-1 (10 mg/kg) antibody preparations alone or in combination, once a week and twice a week, respectively. On day 10 post-drug administration, all mice were sacrificed with CO 2 gas, laparotomy performed, organs visually examined for abnormalities with the naked eye, and tumors removed. Each recovered tumor was weighed on a chemical balance, photographed, and immune cells such as CD4 + T cells, CD8 + T cells, and MDSCs in the tumors were measured by flow cytometry. Tumors were fixed in formalin and stained with CD8 + and MDSC T cells by immunohistochemistry.

В результате в группе, получавшей только антитело против TIE2 (10 мг/кг), проявлялся эффект подавления опухолей примерно на 40%, причем снижение было значимым по сравнению с группой, получавшей антитело против PD-1 мыши (10 мг/кг) (фиг.12A и 12B). В частности, совместное введение антитела против TIE2 и антитела против PD-1 мыши вызывало эффект подавления опухолей на величину примерно на 64% (фиг.12A и 12B). При измерении количества иммунных клеток, мигрировавших в опухоли, по данным проточной цитометрии и иммуногистохимии, в группе, получавшей антитело против TIE2, отмечалось повышение примерно в 3 раза содержания Т-клеток CD8+, известных как цитотоксические клетки, по сравнению с группой отрицательного контроля. Даже при совместном введении с антителом к PD-1 проявлялся эквивалентный уровень миграции (фиг.12C и 12D). Таким образом, антитело против TIE2 проявляет противоопухолевый эффект за счет усиления миграции иммунных клеток в опухоли за счет действия, нормализирующего раковые сосуды.As a result, the group receiving only anti-TIE2 antibody (10 mg/kg) showed a tumor suppression effect of about 40%, and the reduction was significant compared with the group receiving anti-mouse PD-1 antibody (10 mg/kg) (Fig. .12A and 12B). In particular, the co-administration of anti-TIE2 antibody and anti-mouse PD-1 antibody produced a tumor suppression effect of about 64% (FIGS. 12A and 12B). When measuring the number of immune cells migrating into tumors by flow cytometry and immunohistochemistry, the anti-TIE2 antibody group showed an approximately 3-fold increase in CD8 + T cells, known as cytotoxic cells, compared to the negative control group. Even when co-administered with an anti-PD-1 antibody, an equivalent level of migration was shown (FIGS. 12C and 12D). Thus, the anti-TIE2 antibody exhibits an antitumor effect by enhancing the migration of immune cells into tumors through an action that normalizes cancer vessels.

Пример 17. Оценка уменьшения гипоксии под действием антитела против TIE2Example 17 Evaluation of Hypoxia Reduction by Anti-TIE2 Antibody

Для того, чтобы определить противоопухолевое действие и ослабление внутриопухолевой гипоксии под действием антитела против TIE2 посредством нормализации раковых сосудов, препарат антитела вводили мышам BALB/c, которым были трансплантированы клетки раковой линии CT26 толстой кишки мыши. У мышей измеряли длину, ширину и толщину трансплантатов колоректальных раковых клеток линии CT26 с помощью штангенциркуля. В то же самое время опухоли взвешивали. Размер опухолей определяли, как (длина × ширина × толщина)/2, и мышей с опухолями группировали на основе среднего значения 24,6 мм3. Затем мышам вводили антитело против TIE2 (10 мг/кг) или антитело DC101 против VEGFR (20 мг/кг, контрольный препарат) один раз в неделю или два раза в неделю, соответственно. На 10-й день после введения препаратов двум животным в каждой группе внутривенно (IV) вводили пимонидазол. Через 90 минут всех мышей умерщвляли с помощью газообразного СО2, проводили лапаротомию, проверяли органы на наличие аномалий невооруженным глазом и извлекали опухоли. Каждую извлеченную опухоль взвешивали на химических весах, делали снимки и определяли лимфоциты (Т-клетки CD4+, Т-клетки CD8+) в качестве иммунных клеток в опухолях методом проточной цитометрии. Опухоли со введением пимонидазола фиксировали в 4% PFA и проводили иммуногистохимическое окрашивание с помощью набора Hypoxyprobe.In order to determine the antitumor effect and attenuation of intratumoral hypoxia by anti-TIE2 antibody by normalizing cancer vessels, the antibody preparation was administered to BALB/c mice transplanted with mouse colon cancer line CT26 cells. In mice, the length, width, and thickness of CT26 colorectal cancer cell grafts were measured using calipers. At the same time, the tumors were weighed. The size of the tumors was determined as (length×width×thickness)/2, and mice with tumors were grouped based on an average value of 24.6 mm 3 . Mice were then injected with anti-TIE2 antibody (10 mg/kg) or anti-VEGFR antibody DC101 (20 mg/kg, control preparation) once a week or twice a week, respectively. On the 10th day after the administration of the drugs, two animals in each group received intravenous (IV) pimonidazole. After 90 minutes, all mice were sacrificed with CO 2 gas, laparotomy performed, organs examined for abnormalities with the naked eye, and tumors removed. Each recovered tumor was weighed on a chemical balance, photographed, and lymphocytes (CD4 + T cells, CD8 + T cells) were identified as immune cells in the tumors by flow cytometry. Pimonidazole-treated tumors were fixed in 4% PFA and immunohistochemical staining was performed using the Hypoxyprobe kit.

В группах, получавших антитело против TIE2 или контрольный препарат DC101, обнаруживалось сходное подавление опухолей примерно на 30% (фиг.13A, p<0,01, p<0,001). В группе, получавшей антитело против TIE2, отмечалось примерно 2-кратное повышение количества лимфоцитов, то есть внутриопухолевых иммунных клеток, по сравнению с контрольной группой (фиг.13B, p<0,01). Контрольный препарат, а именно антитело против VEGFR2, не вызывал внутриопухолевую миграцию иммунных клеток, так же, как это наблюдалось в группе отрицательного контроля. Кроме того, результаты по оценке снижения гипоксии методом окрашивания с помощью Hypoxyprobe показали, что интенсивность флуоресцентной окраски в группе, получавшей антитело против TIE2, снижалась примерно в 4 раза по сравнению с группой отрицательного контроля (фиг.13C, p<0,01) и примерно в 2,5 раза по сравнению с группой, получавшей контрольный препарат, антитело против VEGFR (фиг.13C, p<0,01). Таким образом, антитело против TIE2 усиливает миграцию иммунных клеток в опухоли и уменьшает гипоксию за счет действия, нормализующего раковые сосуды.Anti-TIE2 antibody or control drug DC101 showed similar tumor suppression of about 30% (FIG. 13A, p<0.01, p<0.001). In the group treated with antibody against TIE2, there was an approximately 2-fold increase in the number of lymphocytes, ie, intratumoral immune cells, compared with the control group (Fig.13B, p<0.01). The control preparation, namely the anti-VEGFR2 antibody, did not cause intratumoral migration of immune cells, as was observed in the negative control group. In addition, the hypoxia reduction results of Hypoxyprobe staining showed that the intensity of fluorescent staining in the anti-TIE2 antibody group decreased by approximately 4-fold compared to the negative control group (Fig. 13C, p<0.01) and about 2.5-fold compared to the anti-VEGFR antibody control group (Figure 13C, p<0.01). Thus, the anti-TIE2 antibody enhances the migration of immune cells in tumors and reduces hypoxia through the action of normalizing cancer vessels.

Промышленная применимостьIndustrial Applicability

Антитело против TIE2 либо его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению проявляет желательную способность к связыванию с TIE2 и может применяться для профилактики или лечения раковой/опухолевой мишени, в качестве стабилизатора сосудов и для профилактики или лечения заболеваний, связанных с ангиогенезом. За счет разработки терапевтических средств, мишени которых отличаются от мишеней для стандартных терапевтических средств, нацеленных на TIE2, в соответствии с настоящим изобретением можно обеспечить комбинированную терапию со стандартными терапевтическими средствами и монотерапию для лечения опухолей и связанных с ангиогенезом заболеваний.The anti-TIE2 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention exhibits a desirable ability to bind to TIE2 and can be used to prevent or treat a cancer/tumor target, as a vascular stabilizer, and to prevent or treat diseases associated with angiogenesis. By developing therapeutic agents whose targets are different from those of standard therapeutic agents targeting TIE2, the present invention can provide combination therapy with standard therapeutic agents and monotherapy for the treatment of tumors and angiogenesis-related diseases.

Хотя конкретные варианты настоящего изобретения и были описаны подробно, однако специалистам в данной области должно быть ясно, что настоящее описание приводится для изложения предпочтительных воплощений в целях иллюстрации и не должно рассматриваться как ограничивающее объем настоящего изобретения. Таким образом, объем настоящего изобретения, по существу, определяется прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.While specific embodiments of the present invention have been described in detail, it should be clear to those skilled in the art that the present description is for the purpose of presenting preferred embodiments for purposes of illustration and should not be construed as limiting the scope of the present invention. Thus, the scope of the present invention is essentially defined by the appended claims and their equivalents.

--->--->

<130> 2428<130> 2428

<150> KR 19/099,491<150> KR 19/099.491

<151> 2019-08-14<151> 2019-08-14

<160> 60<160> 60

<170> PatentIn version 3.2<170> PatentIn version 3.2

<210> 1<210> 1

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Heavy-chain CDR1<223> Heavy chain CDR1

<400> 1<400> 1

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr AlaGly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala

1 5 15

<210> 2<210> 2

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Heavy-chain CDR2<223> Heavy chain CDR2

<400> 2<400> 2

Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser ThrIle Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr

1 5 15

<210> 3<210> 3

<211> 14<211> 14

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Heavy-chain CDR3<223> Heavy chain CDR3

<400> 3<400> 3

Ala Arg Gly Val Asp Ser Ser Met Val Thr Gly Phe Asp HisAla Arg Gly Val Asp Ser Ser Met Val Thr Gly Phe Asp His

1 5 10 1 5 10

<210> 4<210> 4

<211> 6<211> 6

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Light-chain CDR1<223> Light chain CDR1

<400> 4<400> 4

Gln Ser Ile Ser Arg TrpGln Ser Ile Ser Arg Trp

1 5 15

<210> 5<210> 5

<211> 3<211> 3

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Light-chain CDR2<223> Light chain CDR2

<400> 5<400> 5

Glu Ala SerGlu Ala Ser

1 1

<210> 6<210> 6

<211> 9<211> 9

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Light-chain CDR3<223> Light chain CDR3

<400> 6<400> 6

Gln Gln Tyr Glu Asp Tyr Pro Leu ThrGln Gln Tyr Glu Asp Tyr Pro Leu Thr

1 5 15

<210> 7<210> 7

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Heavy-chain CDR1<223> Heavy chain CDR1

<400> 7<400> 7

Gly Tyr Thr Phe Asn Ser Tyr AspGly Tyr Thr Phe Asn Ser Tyr Asp

1 5 15

<210> 8<210> 8

<211> 10<211> 10

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Heavy-chain CDR2<223> Heavy chain CDR2

<400> 8<400> 8

Val Asn Pro Pro Gly Gly Thr Gly Ser ThrVal Asn Pro Pro Gly Gly Thr Gly Ser Thr

1 5 10 1 5 10

<210> 9<210> 9

<211> 13<211> 13

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Heavy-chain CDR3<223> Heavy-chain CDR3

<400> 9<400> 9

Ala Arg Asp Tyr Asn Arg Ala Pro Pro Thr Leu Asp ValAla Arg Asp Tyr Asn Arg Ala Pro Pro Thr Leu Asp Val

1 5 10 1 5 10

<210> 10<210> 10

<211> 10<211> 10

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Light-chain CDR1<223> Light chain CDR1

<400> 10<400> 10

Ser Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn TyrSer Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr

1 5 10 1 5 10

<210> 11<210> 11

<211> 3<211> 3

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Light-chain CDR2<223> Light chain CDR2

<400> 11<400> 11

Asp Val ThrAsp Val Thr

1 1

<210> 12<210> 12

<211> 10<211> 10

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Light-chain CDR3<223> Light chain CDR3

<400> 12<400> 12

Ser Ser Tyr Ser Ser Ser Thr Phe Tyr ValSer Ser Tyr Ser Ser Ser Thr Phe Tyr Val

1 5 10 1 5 10

<210> 13<210> 13

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Heavy-chain CDR1<223> Heavy chain CDR1

<400> 13<400> 13

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr AlaGly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala

1 5 15

<210> 14<210> 14

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Heavy-chain CDR2<223> Heavy chain CDR2

<400> 14<400> 14

Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser ThrIle Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr

1 5 15

<210> 15<210> 15

<211> 11<211> 11

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Heavy-chain CDR3<223> Heavy-chain CDR3

<400> 15<400> 15

Ala Arg Gly Gly Leu His His Gly Phe Asp IleAla Arg Gly Gly Leu His His Gly Phe Asp Ile

1 5 10 1 5 10

<210> 16<210> 16

<211> 6<211> 6

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Light-chain CDR1<223> Light chain CDR1

<400> 16<400> 16

Asn Ile Glu Ser Lys SerAsn Ile Glu Ser Lys Ser

1 5 15

<210> 17<210> 17

<211> 3<211> 3

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Light-chain CDR2<223> Light chain CDR2

<400> 17<400> 17

Tyr Asp AsnTyr Asp Asn

1 1

<210> 18<210> 18

<211> 11<211> 11

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Light-chain CDR3<223> Light chain CDR3

<400> 18<400> 18

Gln Val Trp Asp Thr Tyr Thr Asp Gln Pro ValGln Val Trp Asp Thr Tyr Thr Asp Gln Pro Val

1 5 10 1 5 10

<210> 19<210> 19

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Heavy-chain CDR1<223> Heavy chain CDR1

<400> 19<400> 19

Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr AsnGly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Asn

1 5 15

<210> 20<210> 20

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Heavy-chain CDR2<223> Heavy chain CDR2

<400> 20<400> 20

Ile Ser Ser Ser Gly Arg Phe IleIle Ser Ser Ser Gly Arg Phe Ile

1 5 15

<210> 21<210> 21

<211> 17<211> 17

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Heavy-chain CDR3<223> Heavy-chain CDR3

<400> 21<400> 21

Ala Arg Asp Ser Pro Thr Gln Gly Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met AspAla Arg Asp Ser Pro Thr Gln Gly Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp

1 5 10 15 1 5 10 15

ValVal

<210> 22<210> 22

<211> 6<211> 6

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Light-chain CDR1<223> Light chain CDR1

<400> 22<400> 22

Lys Ile Gly Ser Lys SerLys Ile Gly Ser Lys Ser

1 5 15

<210> 23<210> 23

<211> 3<211> 3

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Light-chain CDR2<223> Light chain CDR2

<400> 23<400> 23

Tyr Asp SerTyr Asp Ser

1 1

<210> 24<210> 24

<211> 11<211> 11

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Light-chain CDR3<223> Light chain CDR3

<400> 24<400> 24

Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Arg Pro ValGln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Arg Pro Val

1 5 10 1 5 10

<210> 25<210> 25

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Heavy-chain CDR1<223> Heavy chain CDR1

<400> 25<400> 25

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr AlaGly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Ala

1 5 15

<210> 26<210> 26

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Heavy-chain CDR2<223> Heavy chain CDR2

<400> 26<400> 26

Ile Ser Phe Asp Gly Asn Asn GlnIle Ser Phe Asp Gly Asn Asn Gln

1 5 15

<210> 27<210> 27

<211> 16<211> 16

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Heavy-chain CDR3<223> Heavy-chain CDR3

<400> 27<400> 27

Thr Thr Asp Thr Met Ser Gly Tyr Asp Trp Glu Asp Ala Phe Asp IleThr Thr Asp Thr Met Ser Gly Tyr Asp Trp Glu Asp Ala Phe Asp Ile

1 5 10 15 1 5 10 15

<210> 28<210> 28

<211> 6<211> 6

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Light-chain CDR1<223> Light chain CDR1

<400> 28<400> 28

Gln Ser Ile Gly Arg TrpGln Ser Ile Gly Arg Trp

1 5 15

<210> 29<210> 29

<211> 3<211> 3

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Light-chain CDR2<223> Light chain CDR2

<400> 29<400> 29

Ala Ser SerAla Ser Ser

1 1

<210> 30<210> 30

<211> 9<211> 9

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Light-chain CDR3<223> Light chain CDR3

<400> 30<400> 30

Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr ThrGln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr

1 5 15

<210> 31<210> 31

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Heavy-chain CDR1<223> Heavy chain CDR1

<400> 31<400> 31

Gly Phe Ser Phe Ser Asp His AlaGly Phe Ser Phe Ser Asp His Ala

1 5 15

<210> 32<210> 32

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Heavy-chain CDR2<223> Heavy chain CDR2

<400> 32<400> 32

Val Trp Pro Asp Gly Ser Asn LysVal Trp Pro Asp Gly Ser Asn Lys

1 5 15

<210> 33<210> 33

<211> 14<211> 14

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Heavy-chain CDR3<223> Heavy-chain CDR3

<400> 33<400> 33

Ala Arg Asp Ser Gly Pro Ile Ser Arg Gly Asp Leu Thr TyrAla Arg Asp Ser Gly Pro Ile Ser Arg Gly Asp Leu Thr Tyr

1 5 10 1 5 10

<210> 34<210> 34

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Light-chain CDR1<223> Light chain CDR1

<400> 34<400> 34

Gly Gly Ser Ile Ala Ser Asn TyrGly Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr

1 5 15

<210> 35<210> 35

<211> 3<211> 3

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Light-chain CDR2<223> Light chain CDR2

<400> 35<400> 35

Glu Asp AspGlu Asp Asp

1 1

<210> 36<210> 36

<211> 9<211> 9

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Light-chain CDR3<223> Light chain CDR3

<400> 36<400> 36

Gln Ser Tyr Asp Asp Thr Asn Val ValGln Ser Tyr Asp Asp Thr Asn Val Val

1 5 15

<210> 37<210> 37

<211> 363<211> 363

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> VH<223> VH

<400> 37<400> 37

caggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc ttggttcagc ctggggggtc cctgagactc 60caggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc ttggttcagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagtctgag agccgaagac acggccgtgt attactgtgc gagaggcgtg 300ctgcaaatga acagtctgag agccgaagac acggccgtgt attactgtgc gagaggcgtg 300

gattcttcta tggtaaccgg atttgatcac tggggccagg gaactttgat caccgtctcc 360gattcttcta tggtaaccgg atttgatcac tggggccagg gaactttgat caccgtctcc 360

tca 363tca 363

<210> 38<210> 38

<211> 121<211> 121

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> VH<223> VH

<400> 38<400> 38

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30 20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValAla Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45 35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser ValSer Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Arg Gly Val Asp Ser Ser Met Val Thr Gly Phe Asp His Trp GlyAla Arg Gly Val Asp Ser Ser Met Val Thr Gly Phe Asp His Trp Gly

100 105 110 100 105 110

Gln Gly Thr Leu Ile Thr Val Ser SerGln Gly Thr Leu Ile Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 39<210> 39

<211> 324<211> 324

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> VL<223> VL

<400> 39<400> 39

gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggccagtca gagtattagt aggtggttgg cctggtatca gcagaaacca 120atcacttgcc gggccagtca gagtattagt aggtggttgg cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagttcct gatctatgag gcatctactt tagaaagtgg ggtcccatca 180gggaaagccc ctaagttcct gatctatgag gcatctactt tagaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggaac tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240aggttcagcg gcagtggaac tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gatgattttg ctacttatta ctgtcaacag tatgaggact acccgctcac cttcggccaa 300gatgattttg ctacttatta ctgtcaacag tatgaggact acccgctcac cttcggccaa 300

gggacacgac tggaaatcaa acgt 324gggacacgac tggaaatcaa acgt 324

<210> 40<210> 40

<211> 108<211> 108

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> VL<223> VL

<400> 40<400> 40

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val GlyAsp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg TrpAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Trp

20 25 30 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu IleLeu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile

35 40 45 35 40 45

Tyr Glu Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser GlyTyr Glu Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60 50 55 60

Ser Gly Thr Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln ProSer Gly Thr Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80 65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Asp Tyr Pro LeuAsp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Asp Tyr Pro Leu

85 90 95 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys ArgThr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 100 105

<210> 41<210> 41

<211> 366<211> 366

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> VH<223> VH

<400> 41<400> 41

cagatgcagc tggtacagtc tgaggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60cagatgcagc tggtacagtc tgaggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60

tcctgtaagg catctggata cacctttaac agttacgata tacactgggt gcgacaggcc 120tcctgtaagg catctggata cacctttaac agttacgata tacactgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggagta gtcaacccac ctggtggaac cggaagcact 180cctggacaag ggcttgagtg gatgggagta gtcaacccac ctggtggaac cggaagcact 180

gtttacgcac agaagttcga ggacagactc accctgacca cggacatgtc cacaagcaca 240gtttacgcac agaagttcga ggacagactc accctgacca cggacatgtc cacaagcaca 240

gcctacatgg agctgagcag cctgagatct gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcaaga 300gcctacatgg agctgagcag cctgagatct gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcaaga 300

gactataata gggccccgcc tactttggac gtctggggcc aagggaccac gatcaccgtc 360gactataata gggccccgcc tactttggac gtctggggcc aagggaccac gatcaccgtc 360

tcctca 366tcctca 366

<210> 42<210> 42

<211> 122<211> 122

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> VH<223> VH

<400> 42<400> 42

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Glu Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly AlaGln Met Gln Leu Val Gln Ser Glu Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Ser TyrSer Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Ser Tyr

20 25 30 20 25 30

Asp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp MetAsp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45 35 40 45

Gly Val Val Asn Pro Pro Gly Gly Thr Gly Ser Thr Val Tyr Ala GlnGly Val Val Asn Pro Pro Gly Gly Thr Gly Ser Thr Val Tyr Ala Gln

50 55 60 50 55 60

Lys Phe Glu Asp Arg Leu Thr Leu Thr Thr Asp Met Ser Thr Ser ThrLys Phe Glu Asp Arg Leu Thr Leu Thr Thr Asp Met Ser Thr Ser Thr

65 70 75 80 65 70 75 80

Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val TyrAla Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95 85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Asn Arg Ala Pro Pro Thr Leu Asp Val TrpTyr Cys Ala Arg Asp Tyr Asn Arg Ala Pro Pro Thr Leu Asp Val Trp

100 105 110 100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Ile Thr Val Ser SerGly Glyn Gly Thr Thr Ile Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 43<210> 43

<211> 333<211> 333

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> VL<223> VL

<400> 43<400> 43

aattttatgc tgactcagcc cgcctccgtg tctgggtccc ctggacagtc gatcaccatc 60aattttatgc tgactcagcc cgcctccgtg tctgggtccc ctggacagtc gatcaccatc 60

tcctgcactg gaagcagcag cgacgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacag 120tcctgcactg gaagcagcag cgacgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacag 120

cacccaggca aagcccccca actcatcatt tatgatgtca ctaagcggcc ctcaggggtt 180cacccaggca aagcccccca actcatcatt tatgatgtca ctaagcggcc ctcaggggtt 180

tctaatcgct tctccggctc caagtctggc aactcggcct ccctgaccat ctctggactc 240tctaatcgct tctccggctc caagtctggc aactcggcct ccctgaccat ctctggactc 240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcataca gcagcagcac tttttacgtc 300caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcataca gcagcagcac tttttacgtc 300

ttcggaactg ggaccaaggt caccgtccta ggt 333ttcggaactg ggaccaaggt caccgtccta ggt 333

<210> 44<210> 44

<211> 111<211> 111

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> VL<223> VL

<400> 44<400> 44

Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly GlnAsn Phe Met Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asp Val Gly Gly TyrSer Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30 20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Gln LeuAsn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu

35 40 45 35 40 45

Ile Ile Tyr Asp Val Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg PheIle Ile Tyr Asp Val Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60 50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly LeuSer Gly Ser Lys Ser Gly Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80 65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ser Ser SerGln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ser Ser Ser

85 90 95 85 90 95

Thr Phe Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu GlyThr Phe Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly

100 105 110 100 105 110

<210> 45<210> 45

<211> 354<211> 354

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> VH<223> VH

<400> 45<400> 45

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgacctgggt ccgccaggct 120tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgacctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcacgt atcagtggta gtggtgggag cacaaactac 180ccagggaagg ggctggagtg ggtctcacgt atcagtggta gtggtgggag cacaaactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc aagagggggt 300ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc aagagggggt 300

ctccatcatg gttttgatat ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc ctca 354ctccatcatg gttttgatat ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc ctca 354

<210> 46<210> 46

<211> 118<211> 118

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> VH<223> VH

<400> 46<400> 46

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30 20 25 30

Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValAla Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45 35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser ValSer Arg Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Arg Gly Gly Leu His His Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly ThrAla Arg Gly Gly Leu His His Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110 100 105 110

Met Val Thr Val Ser SerMet Val Thr Val Ser Ser

115 115

<210> 47<210> 47

<211> 327<211> 327

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> VL<223> VL

<400> 47<400> 47

tcctatgagc tgacacagcc accctcactg tcagtggccc cagggaagac ggccaggatt 60tcctatgagc tgacacagcc accctcactg tcagtggccc cagggaagac ggccaggatt 60

acatgtgacg gggacaacat tgaaagtaaa agtgtccact ggtaccagca gaagccaggc 120acatgtgacg gggacaacat tgaaagtaaa agtgtccact ggtaccagca gaagccaggc 120

caggcccctg tgctagtcat ctattatgat aatgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180caggcccctg tgctagtcat ctattatgat aatgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180

ttctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaagccgga 240ttctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaagccgga 240

gatgaggccg actattactg tcaggtgtgg gacacttata ccgatcagcc ggtattcggc 300gatgaggccg actattactg tcaggtgtgg gacacttata ccgatcagcc ggtattcggc 300

ggagggacca agctgaccgt cctaggt 327ggagggacca agctgaccgt cctagggt 327

<210> 48<210> 48

<211> 109<211> 109

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> VL<223> VL

<400> 48<400> 48

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Leu Ser Val Ala Pro Gly LysSer Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Ser Leu Ser Val Ala Pro Gly Lys

1 5 10 15 1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Asp Gly Asp Asn Ile Glu Ser Lys Ser ValThr Ala Arg Ile Thr Cys Asp Gly Asp Asn Ile Glu Ser Lys Ser Val

20 25 30 20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile TyrHis Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45 35 40 45

Tyr Asp Asn Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly SerTyr Asp Asn Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala GlyAsn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Thr Tyr Thr Asp GlnAsp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Thr Tyr Thr Asp Gln

85 90 95 85 90 95

Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu GlyPro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 100 105

<210> 49<210> 49

<211> 372<211> 372

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> VH<223> VH

<400> 49<400> 49

caggtgcagc tggtagagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60caggtgcagc tggtagagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtatag gctctggctt caccttcagt cgctataaca taaattgggt ccgccaggct 120tcctgtatag gctctggctt caccttcagt cgctataaca taaattgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gcctggagtg ggtctcatcc attagtagta gtggaaggtt catccactac 180ccagggaagg gcctggagtg ggtctcatcc attagtagta gtggaaggtt catccactac 180

gcaggctcag tgaagggccg attcaccgtc tccagagaca acaccaagaa ctcagtgtct 240gcaggctcag tgaagggccg attcaccgtc tccagagaca acaccaagaa ctcagtgtct 240

ctacaaatga acagtctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagactct 300ctacaaatga acagtctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagactct 300

ccaacacagg gcccctacta ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacgatc 360ccaacacagg gcccctacta ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacgatc 360

accgtctcct ca 372accgtctcct ca 372

<210> 50<210> 50

<211> 124<211> 124

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> VH<223> VH

<400> 50<400> 50

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ile Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ile Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30 20 25 30

Asn Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValAsn Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45 35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Gly Arg Phe Ile His Tyr Ala Gly Ser ValSer Ser Ile Ser Ser Ser Gly Arg Phe Ile His Tyr Ala Gly Ser Val

50 55 60 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Ser Val SerLys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Ser Val Ser

65 70 75 80 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Arg Asp Ser Pro Thr Gln Gly Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met AspAla Arg Asp Ser Pro Thr Gln Gly Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp

100 105 110 100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Ile Thr Val Ser SerVal Trp Gly Gln Gly Thr Thr Ile Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 51<210> 51

<211> 327<211> 327

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> VL<223> VL

<400> 51<400> 51

tcctatgagc tgacacagcc accctcagag tcagtggccc caggaaagac ggccacaatt 60tcctatgagc tgacacagcc accctcagag tcagtggccc caggaaagac ggccacaatt 60

acttgtgggg gaaataaaat tggaagtaaa agtgtgcact ggtaccaaca gaagccaggc 120acttgtgggg gaaataaaat tggaagtaaa agtgtgcact ggtaccaaca gaagccaggc 120

caggcccctc taatggtcat ctattatgat agcgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180caggcccctc taatggtcat ctattatgat agcgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180

ttctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaggtcggg 240ttctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaggtcggg 240

gatgaggccg actattactg tcaggtgtgg gatagtagta gcgatcgtcc ggtgttcggc 300gatgaggccg actattactg tcaggtgtgg gatagtagta gcgatcgtcc ggtgttcggc 300

ggagggacca agctgaccgt cctaggt 327ggagggacca agctgaccgt cctagggt 327

<210> 52<210> 52

<211> 109<211> 109

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> VL<223> VL

<400> 52<400> 52

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Glu Ser Val Ala Pro Gly LysSer Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Ser Glu Ser Val Ala Pro Gly Lys

1 5 10 15 1 5 10 15

Thr Ala Thr Ile Thr Cys Gly Gly Asn Lys Ile Gly Ser Lys Ser ValThr Ala Thr Ile Thr Cys Gly Gly Asn Lys Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30 20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Leu Met Val Ile TyrHis Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Leu Met Val Ile Tyr

35 40 45 35 40 45

Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly SerTyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Val GlyAsn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Val Gly

65 70 75 80 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp ArgAsp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Arg

85 90 95 85 90 95

Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu GlyPro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 100 105

<210> 53<210> 53

<211> 369<211> 369

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> VH<223> VH

<400> 53<400> 53

caggtgcagc tggtgcagtc tggaggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60caggtgcagc tggtgcagtc tggaggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gactatgcta tgcactgggt ccgccaggct 120tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gactatgcta tgcactgggt ccgccaggct 120

cctggcaagg ggctggagtg ggtggcactc atatcttttg atgggaataa tcaatactac 180cctggcaagg ggctggagtg ggtggcactc atatcttttg atgggaataa tcaatactac 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attcgaagaa cacaatatat 240gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attcgaagaa cacaatatat 240

ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccgtgt actactgtac cacagatacg 300ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccgtgt actactgtac cacagatacg 300

atgagtggct acgattggga agatgctttt gatatctggg gccaagggac aatgatcacc 360atgagtggct acgattggga agatgctttt gatatctggg gccaagggac aatgatcacc 360

gtctcctca 369gtctcctca 369

<210> 54<210> 54

<211> 123<211> 123

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> VH<223> VH

<400> 54<400> 54

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly GlyGln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30 20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValAla Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Glu Trp Val

35 40 45 35 40 45

Ala Leu Ile Ser Phe Asp Gly Asn Asn Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser ValAla Leu Ile Ser Phe Asp Gly Asn Asn Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ile TyrLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ile Tyr

65 70 75 80 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Thr Thr Asp Thr Met Ser Gly Tyr Asp Trp Glu Asp Ala Phe Asp IleThr Thr Asp Thr Met Ser Gly Tyr Asp Trp Glu Asp Ala Phe Asp Ile

100 105 110 100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Met Ile Thr Val Ser SerTrp Gly Gln Gly Thr Met Ile Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 55<210> 55

<211> 342<211> 342

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> VL<223> VL

<400> 55<400> 55

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctatcggcga cagagtcacc 60gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctatcggcga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggccagtca gagtattggt aggtggttgg cctggtatca gcagaaacca 120atcacttgcc gggccagtca gagtattggt aggtggttgg cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta ccccgtacac ttttggccaa 300gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta ccccgtacac ttttggccaa 300

gggaccaagg tggagatcaa acgtggagga gccagcctcg tg 342gggaccaagg tggagatcaa acgtggagga gccagcctcg tg 342

<210> 56<210> 56

<211> 108<211> 108

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> VL<223> VL

<400> 56<400> 56

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ile GlyAsp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ile Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Arg TrpAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Arg Trp

20 25 30 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu IleLeu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45 35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser GlyTyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln ProSer Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro TyrGlu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr

85 90 95 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys ArgThr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 100 105

<210> 57<210> 57

<211> 363<211> 363

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> VH<223> VH

<400> 57<400> 57

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ccgggaggtc ccttagactc 60caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ccgggaggtc ccttagactc 60

tcctgttcag cgtctggatt ctccttcagt gatcatgcca tgcactgggt ccgccaggct 120tcctgttcag cgtctggatt ctccttcagt gatcatgcca tgcactggggt ccgccaggct 120

ccaggcaggg gcctagaatg ggtggcaact gtttggcctg atggaagtaa taaatattat 180ccaggcaggg gcctagaatg ggtggcaact gtttggcctg atggaagtaa taaatattat 180

gtagattctg tgaacggtcg attcagcatt tccagagaca attccaagaa cacagtgtct 240gtagattctg tgaacggtcg attcagcatt tccagagaca attccaagaa cacagtgtct 240

ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc acgagattcg 300ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc acgagattcg 300

ggacctatca gccgcggaga tttgacttac tggggcccgg gagtcctggt caccgtctcc 360ggacctatca gccgcggaga tttgacttac tggggcccgg gagtcctggt caccgtctcc 360

tca 363tca 363

<210> 58<210> 58

<211> 121<211> 121

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> VH<223> VH

<400> 58<400> 58

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly ArgGln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asp HisSer Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asp His

20 25 30 20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp ValAla Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45 35 40 45

Ala Thr Val Trp Pro Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser ValAla Thr Val Trp Pro Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60 50 55 60

Asn Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val SerAsn Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Ser

65 70 75 80 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Arg Asp Ser Gly Pro Ile Ser Arg Gly Asp Leu Thr Tyr Trp GlyAla Arg Asp Ser Gly Pro Ile Ser Arg Gly Asp Leu Thr Tyr Trp Gly

100 105 110 100 105 110

Pro Gly Val Leu Val Thr Val Ser SerPro Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 59<210> 59

<211> 351<211> 351

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> VL<223> VL

<400> 59<400> 59

aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac tgtaatcatc 60aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac tgtaatcatc 60

tcctgcaccg gcagcggtgg cagcattgcc agcaactatg tgcagtggta ccagcagcgc 120tcctgcaccg gcagcggtgg cagcattgcc agcaactatg tgcagtggta ccagcagcgc 120

ccgggcagtg cccccaccat tgtgatctat gaagatgatc agagaccctc tggggtccct 180ccggggcagtg cccccaccat tgtgatctat gaagatgatc agagaccctc tggggtccct 180

gatcggtact ctggctccac cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240gatcggtact ctggctccac cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240

ctgagggctg aggacgaggc tgactactac tgtcagtctt atgacgatac caatgtggtg 300ctgagggctg aggacgaggc tgactactac tgtcagtctt atgacgatac caatgtggtg 300

ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggtggaggag ccagcctcgt g 351g 351

<210> 60<210> 60

<211> 111<211> 111

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> VL<223> VL

<400> 60<400> 60

Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly LysAsn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys

1 5 10 15 1 5 10 15

Thr Val Ile Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Gly Ser Ile Ala Ser AsnThr Val Ile Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Gly Ser Ile Ala Ser Asn

20 25 30 20 25 30

Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr Ile ValTyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr Ile Val

35 40 45 35 40 45

Ile Tyr Glu Asp Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Tyr SerIle Tyr Glu Asp Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Tyr Ser

50 55 60 50 55 60

Gly Ser Thr Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser GlyGly Ser Thr Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly

65 70 75 80 65 70 75 80

Leu Arg Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp AspLeu Arg Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Asp

85 90 95 85 90 95

Thr Asn Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu GlyThr Asn Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110 100 105 110

<---<---

Claims (30)

1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, связывающиеся с TIE-2 рецептором тирозин-протеинкиназы, включающие:1. An antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to the TIE-2 tyrosine protein kinase receptor, including: вариабельную область тяжелой цепи, содержащую участок CDR1 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 1, участок CDR2 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 2, и участок CDR3 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 3, и a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR1 region having SEQ ID NO: 1, a heavy chain CDR2 region having SEQ ID NO: 2, and a heavy chain CDR3 region having SEQ ID NO: 3, and вариабельную область легкой цепи, содержащую участок CDR1 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 4, участок CDR2 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 5, и участок CDR3 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 6;a light chain variable region comprising a light chain CDR1 region having SEQ ID NO: 4, a light chain CDR2 region having SEQ ID NO: 5, and a light chain CDR3 region having SEQ ID NO: 6; вариабельную область тяжелой цепи, содержащую участок CDR1 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 7, участок CDR2 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 8, и участок CDR3 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 9, и a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR1 region having SEQ ID NO: 7, a heavy chain CDR2 region having SEQ ID NO: 8, and a heavy chain CDR3 region having SEQ ID NO: 9, and вариабельную область легкой цепи, содержащую участок CDR1 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 10, участок CDR2 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 11, и участок CDR3 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 12;a light chain variable region comprising a light chain CDR1 region having SEQ ID NO: 10, a light chain CDR2 region having SEQ ID NO: 11, and a light chain CDR3 region having SEQ ID NO: 12; вариабельную область тяжелой цепи, содержащую участок CDR1 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 13, участок CDR2 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 14, и участок CDR3 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO:15, и a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR1 region having SEQ ID NO: 13, a heavy chain CDR2 region having SEQ ID NO: 14, and a heavy chain CDR3 region having SEQ ID NO: 15, and вариабельную область легкой цепи, содержащую участок CDR1 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 16, участок CDR2 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 17, и участок CDR3 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 18;a light chain variable region comprising a light chain CDR1 region having SEQ ID NO: 16, a light chain CDR2 region having SEQ ID NO: 17, and a light chain CDR3 region having SEQ ID NO: 18; вариабельную область тяжелой цепи, содержащую участок CDR1 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 19, участок CDR2 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 20, и участок CDR3 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 21, и a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR1 region having SEQ ID NO: 19, a heavy chain CDR2 region having SEQ ID NO: 20, and a heavy chain CDR3 region having SEQ ID NO: 21, and вариабельную область легкой цепи, содержащую участок CDR1 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 22, участок CDR2 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 23, и участок CDR3 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 24;a light chain variable region comprising a light chain CDR1 region having SEQ ID NO: 22, a light chain CDR2 region having SEQ ID NO: 23, and a light chain CDR3 region having SEQ ID NO: 24; вариабельную область тяжелой цепи, содержащую участок CDR1 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 25, участок CDR2 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 26, и участок CDR3 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 27, и a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR1 region having SEQ ID NO: 25, a heavy chain CDR2 region having SEQ ID NO: 26, and a heavy chain CDR3 region having SEQ ID NO: 27, and вариабельную область легкой цепи, содержащую участок CDR1 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 28, участок CDR2 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 29, и участок CDR3 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 30; или a light chain variable region comprising a light chain CDR1 region having SEQ ID NO: 28, a light chain CDR2 region having SEQ ID NO: 29, and a light chain CDR3 region having SEQ ID NO: 30; or вариабельную область тяжелой цепи, содержащую участок CDR1 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 31, участок CDR2 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 32, и участок CDR3 тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 33, и a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR1 region having SEQ ID NO: 31, a heavy chain CDR2 region having SEQ ID NO: 32, and a heavy chain CDR3 region having SEQ ID NO: 33, and вариабельную область легкой цепи, содержащую участок CDR1 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 34, участок CDR2 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 35, и участок CDR3 легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 36.a light chain variable region comprising a light chain CDR1 region having SEQ ID NO: 34, a light chain CDR2 region having SEQ ID NO: 35, and a light chain CDR3 region having SEQ ID NO: 36. 2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, включающие вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 38, 42, 46, 50, 54 и 58.2. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1, comprising a heavy chain variable region selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 38, 42, 46, 50, 54 and 58. 3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, включающие вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 40, 44, 48, 52, 56 и 60.3. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1, comprising a light chain variable region selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 40, 44, 48, 52, 56 and 60. 4. Нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-3.4. A nucleic acid encoding an antibody or antigen-binding fragment according to any one of paragraphs. 1-3. 5. Нуклеиновая кислота по п. 4, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 37, 41, 45, 49, 53 и 57.5. A nucleic acid according to claim 4 encoding a heavy chain variable region selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 37, 41, 45, 49, 53 and 57. 6. Нуклеиновая кислота по п. 4, кодирующая вариабельную область легкой цепи, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO: 39, 43, 47, 51, 55 и 59.6. A nucleic acid according to claim 4 encoding a light chain variable region selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 39, 43, 47, 51, 55 and 59. 7. Экспрессирующий вектор, включающий нуклеиновую кислоту по п. 4.7. An expression vector comprising the nucleic acid according to claim 4. 8. Клетка, трансформированная экспрессирующим вектором по п. 7, для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-3.8. A cell transformed with an expression vector according to claim 7 to obtain an antibody or antigen-binding fragment according to any one of claims. 1-3. 9. Способ получения антитела, связывающегося с TIE-2, или его антигенсвязывающего фрагмента, включающий:9. A method for producing an antibody that binds to TIE-2, or its antigen-binding fragment, comprising: (a) культивирование клетки по п. 8; и (a) culturing the cell according to claim 8; And (b) выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из культивируемой клетки.(b) isolating the antibody or antigen-binding fragment thereof from the cultured cell. 10. Композиция для профилактики или лечения связанного с ангиогенезом заболевания, содержащая фармацевтически эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-3 в качестве активного ингредиента.10. Composition for the prevention or treatment associated with angiogenesis diseases, containing a pharmaceutically effective amount of an antibody or antigen-binding fragment according to any one of paragraphs. 1-3 as an active ingredient. 11. Композиция по п. 10, где связанное с ангиогенезом заболевание выбрано из группы, состоящей из опухолей, рака, метастазов опухолей или рака, диабетической ретинопатии, ретинопатии недоношенных, отторжения трансплантата роговицы, дегенерации желтого пятна, неоваскулярной глаукомы, эритроза, пролиферативной ретинопатии, псориаза, гемофилического артрита, образования атеросклеротических бляшек в капиллярах, келоидов, грануляции ран, сосудистых спайков, ревматоидного артрита, остеоартрита, аутоиммунных заболеваний, болезни Крона, рестеноза, атеросклероза, кишечных спаек, болезней от кошачьих царапин, язв, диабетических язв стопы, цирроза печени, нефрита, диабетической нефропатии, хронической почечной недостаточности, сахарного диабета, воспалительных заболеваний, идиопатического фиброза легких, сепсиса, острого респираторного дистресс-синдрома и нейродегенеративных заболеваний.11. The composition of claim 10, wherein the angiogenesis-related disease is selected from the group consisting of tumors, cancer, tumor metastases or cancer, diabetic retinopathy, retinopathy of prematurity, corneal transplant rejection, macular degeneration, neovascular glaucoma, erythrosis, proliferative retinopathy, psoriasis, hemophilic arthritis, atherosclerotic plaque formation in capillaries, keloids, wound granulation, vascular adhesions, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, autoimmune diseases, Crohn's disease, restenosis, atherosclerosis, intestinal adhesions, cat scratch diseases, ulcers, diabetic foot ulcers, liver cirrhosis , nephritis, diabetic nephropathy, chronic renal failure, diabetes mellitus, inflammatory diseases, idiopathic pulmonary fibrosis, sepsis, acute respiratory distress syndrome and neurodegenerative diseases. 12. Композиция для стабилизации кровеносных сосудов, содержащая фармацевтически эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-3 в качестве активного ингредиента.12. Composition for stabilizing blood vessels, containing a pharmaceutically effective amount of an antibody or antigen-binding fragment according to any one of paragraphs. 1-3 as an active ingredient. 13. Композиция для диагностики связанного с ангиогенезом заболевания, содержащая фармацевтически эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-3 в качестве активного ингредиента.13. Composition for the diagnosis of angiogenesis-related disease, containing a pharmaceutically effective amount of an antibody or antigen-binding fragment according to any one of paragraphs. 1-3 as an active ingredient. 14. Композиция для профилактики или лечения рака, содержащая фармацевтически эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-3 в качестве активного ингредиента.14. Composition for the prevention or treatment of cancer, containing a pharmaceutically effective amount of an antibody or antigen-binding fragment according to any one of paragraphs. 1-3 as an active ingredient. 15. Композиция для профилактики или лечения опухоли, содержащая фармацевтически эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-3 в качестве активного ингредиента.15. Composition for the prevention or treatment of tumors, containing a pharmaceutically effective amount of an antibody or antigen-binding fragment according to any one of paragraphs. 1-3 as an active ingredient. 16. Применение композиции, содержащей фармацевтически эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-3 в качестве активного ингредиента, для комбинированного введения вместе с другими терапевтическими средствами для профилактики или лечения связанного с ангиогенезом заболевания.16. The use of a composition containing a pharmaceutically effective amount of an antibody or antigen-binding fragment according to any one of paragraphs. 1-3 as an active ingredient, for combined administration with other therapeutic agents for the prevention or treatment of an angiogenesis-related disease.
RU2021130448A 2019-08-14 2020-08-14 Antibody against tie-2 and its use RU2795455C2 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2019-0099491 2019-08-14

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2021130448A RU2021130448A (en) 2023-04-19
RU2795455C2 true RU2795455C2 (en) 2023-05-03

Family

ID=

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2232812C2 (en) * 1994-10-07 2004-07-20 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Isolated nucleic acid molecule encoding ligand tie-2, ligand tie-2 and method for preparing, plasmid (variants), antibody, conjugate, ligand body, pharmaceutical composition, method for stimulating neo-vascularization, method for cell maintenance, method for identifying tie-2 receptor antagonist
WO2013028442A1 (en) * 2011-08-19 2013-02-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc Anti-tie2 antibodies uses thereof
WO2016010014A1 (en) * 2014-07-15 2016-01-21 アステラス製薬株式会社 NOVEL ANTI-HUMAN Tie2 ANTIBODY

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2232812C2 (en) * 1994-10-07 2004-07-20 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Isolated nucleic acid molecule encoding ligand tie-2, ligand tie-2 and method for preparing, plasmid (variants), antibody, conjugate, ligand body, pharmaceutical composition, method for stimulating neo-vascularization, method for cell maintenance, method for identifying tie-2 receptor antagonist
WO2013028442A1 (en) * 2011-08-19 2013-02-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc Anti-tie2 antibodies uses thereof
WO2016010014A1 (en) * 2014-07-15 2016-01-21 アステラス製薬株式会社 NOVEL ANTI-HUMAN Tie2 ANTIBODY

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HWANG B. et al., Stimulation of angiogenesis and survival of endothelial cells by human monoclonal Tie2 receptor antibody. Biomaterials. 2015. Vol. 51. Pp. 119-128. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6010241B2 (en) DLL3 modulator and method of use
CN109369808B (en) Antibodies and vaccines for treating ROR1 cancer and inhibiting metastasis
RU2659094C2 (en) Antigen binding protein and use thereof as addressing product for treatment of cancer
JP4606739B2 (en) Novel anti-IGF-IR antibodies and uses thereof
KR102017070B1 (en) Therapeutic peptides
CN113166257B (en) CD47 antibody and preparation method and application thereof
RU2746413C1 (en) Antibody specifically binding with muc1 and its application
JP2018138034A (en) Anti-her2 antibody and conjugate thereof
US20220235123A1 (en) Synthetic antibodies against vegf and their uses
US20220073608A1 (en) Sema4d antibody, preparation method therefor and use thereof
US20240148893A1 (en) Anti-tmem-180 antibody, anticancer agent, and test method for cancer
WO2011004837A1 (en) Antibody having anti-cancer activity
RU2725950C1 (en) Programmed cell death (pd-1) protein-1 antibodies and use thereof
JP2018513141A (en) Agents that specifically bind to RGD motifs of human cadherin-17, human cadherin-5, human cadherin-6 and human cadherin-20
US20230235047A1 (en) Anti-claudin18.2 antibody and use thereof
CN113166252B (en) Fully human anti-GITR antibodies and methods of making same
RU2795455C2 (en) Antibody against tie-2 and its use
KR102527315B1 (en) Anti- Ang2 antibody and Use Thereof
CN113993897B (en) Anti-TIE 2 antibodies and uses thereof
US20220213201A1 (en) Anti-tie2 antibody and use thereof
RU2788088C1 (en) Antibody against ang2 and its use
WO2011052753A1 (en) Antibody binding to mansc1 protein and having anticancer activity
US20240043568A1 (en) Development of new tumor engager therapeutic drug and use thereof
WO2023173393A1 (en) B7-h3-binding antibody and use thereof
KR20180101968A (en) Methods of inhibiting pathological angiogenesis with doppel-targeting molecules