RU2792440C9 - Preferential pairing of antibody domain - Google Patents
Preferential pairing of antibody domain Download PDFInfo
- Publication number
- RU2792440C9 RU2792440C9 RU2019119391A RU2019119391A RU2792440C9 RU 2792440 C9 RU2792440 C9 RU 2792440C9 RU 2019119391 A RU2019119391 A RU 2019119391A RU 2019119391 A RU2019119391 A RU 2019119391A RU 2792440 C9 RU2792440 C9 RU 2792440C9
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- domain
- antibody
- domains
- amino acid
- mutations
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Настоящее изобретение относится к антигенсвязывающей молекуле (АВМ), которая содержит последовательности доменов человеческих антител, в частности, содержащие когнатный димер легкой цепи антитела, состоящей из доменов антитела VL и CL, связанной с тяжелой цепью антитела, содержащей по меньшей мере домены антитела VH и СН1, причем эта связь осуществляется за счет спаривания доменов VL и VH и доменов CL и СН1, при этом предпочтительное спаривание поддерживается определенными точечными мутациями в доменах CL и СН1.The present invention relates to an antigen-binding molecule (AVM) that contains sequences of human antibody domains, in particular, containing a cognate dimer of an antibody light chain, consisting of antibody VL and CL domains, associated with an antibody heavy chain, containing at least antibody VH and CH1 domains , and this relationship is carried out by pairing the VL and VH domains and the CL and CH1 domains, while the preferred pairing is maintained by certain point mutations in the CL and CH1 domains.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE INVENTION
Моноклональные антитела широко применяются в качестве терапевтических антигенсвязывающих молекул. Основная структура антитела будет описана в настоящем документе с использованием интактного иммуноглобулина IgG1 в качестве примера.Monoclonal antibodies are widely used as therapeutic antigen-binding molecules. The basic structure of an antibody will be described herein using an intact IgG1 immunoglobulin as an example.
Две идентичные тяжелые (Н) и две идентичные легкие (L) цепи объединяются с образованием Y-образной молекулы антитела. Каждая тяжелая цепь содержит четыре домена. Амино-концевые вариабельные домены (VH) находятся на концах Y. За ними располагаются три константных домена: CH1, СН2 и карбокси-концевой СН3, у основания стебля Y. Короткий участок, перемычка, соединяет вариабельную и константную области тяжелой цепи. Шарнирный участок соединяет СН2 и СН3 (фрагмент Fc) с остальной частью антитела (фрагменты Fab). Один фрагмент Fc и два идентичных фрагмента Fab могут быть получены с помощью протеолитического расщепления шарнирного участка в интактной молекуле антитела. Легкие цепи состоят из двух доменов: вариабельного (VL) и константного (CL), разделенных перемычкой.Two identical heavy (H) and two identical light (L) chains combine to form a Y-shaped antibody molecule. Each heavy chain contains four domains. Amino-terminal variable domains (VH) are at the ends of Y. Behind them are three constant domains: CH1, CH2 and carboxy-terminal CH3, at the base of the Y stem. A short section, a bridge, connects the variable and constant regions of the heavy chain. The hinge region connects CH2 and CH3 (Fc fragment) to the rest of the antibody (Fab fragments). One Fc fragment and two identical Fab fragments can be generated by proteolytic cleavage of the hinge region in an intact antibody molecule. Light chains consist of two domains: variable (VL) and constant (CL), separated by a jumper.
Дисульфидные связи в шарнирной области соединяют две тяжелые цепи. Легкие цепи связаны с тяжелыми цепями дополнительными дисульфидными связями. Asn-связанные углеводные фрагменты прикреплены в разных положениях в константных доменах в зависимости от класса иммуноглобулина. В случае IgG1 две дисульфидные связи в шарнирной области, между парами Cys235 и Cys238, соединяют две тяжелые цепи. Легкие цепи связаны с тяжелыми цепями двумя дополнительными дисульфидными связями, между Cys220 (нумерация в соответствии с индексом ЕС) или Cys233 (нумерация в соответствии с Kabat) в доменах СН1 и Cys214 в доменах CL (индекс ЕС и нумерация в соответствии с Kabat). Углеводные фрагменты прикреплены к Asn306 каждого СН2 с образованием значительного выпячивания в стебле Y.Disulfide bonds in the hinge region connect the two heavy chains. The light chains are linked to the heavy chains by additional disulfide bonds. Asn-linked carbohydrate moieties are attached at different positions in the constant domains depending on the immunoglobulin class. In the case of IgG1, two disulfide bonds in the hinge region, between the Cys235 and Cys238 pairs, link the two heavy chains. The light chains are linked to the heavy chains by two additional disulfide bonds, between Cys220 (EC numbering) or Cys233 (Kabat numbering) in the CH1 domains and Cys214 in the CL domains (EC numbering and Kabat numbering). Carbohydrate fragments are attached to Asn306 of each CH2 to form a significant protrusion in the Y stem.
Эти признаки имеют принципиальные функциональные последствия. Вариабельные области как тяжелой (VH), так и легкой цепей (VL) лежат в N-концевой области, т.е. на «концах» Y, где они расположены так, чтобы реагировать с антигеном. Этот конец молекулы является стороной, на которой расположен N-концевой участок аминокислотной последовательности. Стебель Y выступает таким образом, чтобы эффективно опосредовать эффекторные функции, такие как активация комплемента и взаимодействие с рецепторами Fc, или АЗКЦ (ADCC, антителозависимая клеточная цитотоксичность) и АЗКФ (ADCP, антителозависимый клеточный фагоцитоз). Его домены СН2 и СН3 выпячиваются, чтобы облегчить взаимодействие с эффекторными белками. С-концевой участок аминокислотной последовательности расположен на противоположной стороне конца, который можно назвать «основанием» Y.These features have fundamental functional implications. The variable regions of both the heavy (VH) and light chains (VL) lie in the N-terminal region, ie. at the "ends" of the Y, where they are positioned to react with the antigen. This end of the molecule is the side on which the N-terminal portion of the amino acid sequence is located. The Y stalk acts in such a way as to effectively mediate effector functions such as complement activation and interaction with Fc receptors, or ADCC (ADCC, antibody-dependent cellular cytotoxicity) and ADCP (ADCP, antibody-dependent cellular phagocytosis). Its CH2 and CH3 domains protrude to facilitate interaction with effector proteins. The C-terminal portion of the amino acid sequence is located on the opposite side of the end, which can be called the "base" of Y.
В антителах встречаются два типа легкой цепи, называемые лямбда (λ) и каппа (κ). Определенный иммуноглобулин имеет либо κ-цепи, либо λ-цепи, но никогда не имеет по одной каждого типа. Не было обнаружено функциональных различий между антителами, имеющими λ-легкую цепь или κ-легкую цепь.Two types of light chain occur in antibodies, called lambda (λ) and kappa (κ). A certain immunoglobulin has either κ chains or λ chains, but never one of each type. No functional differences were found between antibodies having a λ-light chain or a κ-light chain.
Каждый домен в молекуле антитела имеет сходную структуру из двух бета-складчатых слоев, плотно прилегающих друг к другу в сжатой антипараллельной бета-складчатой конфигурации. Эта консервативная структура называется иммуноглобулиновой укладкой цепи. Иммуноглобулиновая укладка цепи константных доменов содержит трехцепочечный слой, прилегающий к четырехцепочечному слою. Укладка цепи стабилизируется водородными связями между бета-цепями каждого складчатого слоя, гидрофобными связями между остатками противоположных складчатых слоев внутри и дисульфидной связью между слоями. Трехцепочечный складчатый слой содержит цепи С, F и G, а четырехцепочечный складчатый слой содержит цепи А, В, Е и D. Буквы от А до G обозначают последовательные положения бета-цепей вдоль аминокислотной последовательности иммуноглобулиновой укладки цепи.Each domain in an antibody molecule has a similar structure of two beta-pleated layers closely adjacent to each other in a compressed anti-parallel beta-sheet configuration. This conserved structure is called the immunoglobulin fold. The immunoglobulin fold of the constant domain chain contains a three-stranded layer adjacent to a four-stranded layer. The chain fold is stabilized by hydrogen bonds between the beta chains of each folded layer, hydrophobic bonds between the remnants of opposite folded layers within, and a disulfide bond between the layers. The 3-strand fold contains chains C, F and G, and the 4-strand fold contains chains A, B, E and D. The letters A to G denote the successive positions of the beta chains along the amino acid sequence of the immunoglobulin fold of the chain.
Укладка вариабельных доменов имеет 9 бета-цепей, расположенных в двух складчатых слоях из 4 и 5 цепей. Пятицепочечный слой структурно гомологичен трехцепочечному слою константных доменов, но содержит дополнительные цепи С и С''. Остальные цепи (А, В, С, D, Е, F, G) имеют аналогичную топологию и сходную структуру, как и их партнеры в иммуноглобулиновой укладке цепи константного домена. Дисульфидная связь соединяет цепи В и F в противоположных слоях, как и в константных доменах.The variable domain fold has 9 beta chains arranged in two folded layers of 4 and 5 chains. The five-stranded layer is structurally homologous to the three-stranded constant domain layer, but contains additional C and C'' strands. The remaining chains (A, B, C, D, E, F, G) have a similar topology and similar structure as their partners in the immunoglobulin fold of the constant domain chain. A disulfide bond connects the B and F chains in opposite layers, as in the constant domains.
Вариабельные домены как легкой, так и тяжелой цепей иммуноглобулина содержат три гипервариабельные петли или области, определяющие комплементарность (CDR). Три CDR V-домена (CDR1, CDR2, CDR3) кластеризуются на одном конце бета-складчатой конфигурации. CDR представляют собой петли, которые соединяют бета-цепи В-С, С'-С'' и F-G иммуноглобулиновой укладки цепи. Остатки в CDR варьируются в разных молекулах иммуноглобулинов, придавая каждому антителу специфичность в отношении антигена.The variable domains of both the light and heavy chains of an immunoglobulin contain three hypervariable loops or complementarity determining regions (CDRs). Three V-domain CDRs (CDR1, CDR2, CDR3) cluster at one end of the beta-fold configuration. The CDRs are loops that connect the B-C, C'-C'' and F-G beta chains of the immunoglobulin fold. The residues in the CDRs vary between different immunoglobulin molecules, making each antibody specific for the antigen.
Домены VL и VH на концах молекул антител плотно упакованы так, что 6 CDR (по 3 на каждом домене) взаимодействуют при построении поверхности (или полости) для антигенспецифичного связывания. Соответственно, природный антигенсвязывающий сайт антитела состоит из петель, которые соединяют цепи В-С, С'-С'' и F-G вариабельного домена легкой цепи и цепи В-С, С'-С'' и F-G вариабельного домена тяжелой цепи.The VL and VH domains at the ends of antibody molecules are tightly packed such that 6 CDRs (3 on each domain) interact to construct a surface (or cavity) for antigen-specific binding. Accordingly, the natural antigen-binding site of an antibody consists of loops that connect the B-C, C'-C'', and F-G chains of the light chain variable domain and the B-C, C'-C'', and F-G chains of the heavy chain variable domain.
Петли, которые не являются CDR-петлями в нативном иммуноглобулине или не являются частью антигенсвязывающего кармана, определенного петлями CDR, и необязательно не являются смежными петлями в пределах области CDR-петли, не способны к специфичному связыванию антигена или эпитопа, но вносят вклад в правильное сворачивание всей молекулы иммуноглобулина и/или ее эффекторные или другие функции и поэтому называются структурными петлями.Loops that are not CDR loops in native immunoglobulin or are not part of the antigen-binding pocket defined by CDR loops, and are not necessarily adjacent loops within the CDR loop region, are not capable of specific antigen or epitope binding but contribute to proper folding of the entire immunoglobulin molecule and/or its effector or other functions and are therefore called structural loops.
В документах предшествующего уровня техники показано, что до настоящего времени иммуноглобулиноподобный каркас применяли для манипуляций над существующим антигенсвязывающим сайтом, придавая тем самым новые свойства связывания. В большинстве случаев области CDR были модифицированы для связывания антигена, другими словами, в случае иммуноглобулиновой укладки цепи только природный антигенсвязывающий сайт был модифицирован для того чтобы изменить его аффинность или специфичность связывания. Существует огромное количество литературы, в которой описаны различные форматы таких иммуноглобулинов, подвергшихся манипуляциям, часто экспрессируемых в форме одноцепочечных фрагментов Fv (scFv) или фрагментов Fab, либо экспонируемых на поверхности частиц фага, либо экспрессируемых в растворимой форме в различных прокариотических или эукариотических системах для экспрессии.Prior art documents have shown that hitherto, an immunoglobulin-like scaffold has been used to manipulate an existing antigen-binding site, thereby conferring novel binding properties. In most cases, the CDRs have been modified to bind the antigen, in other words, in the case of the immunoglobulin fold, only the natural antigen binding site has been modified to change its binding affinity or specificity. There is a vast body of literature describing various formats of such manipulated immunoglobulins, often expressed as single chain Fv (scFv) or Fab fragments, either exposed on the surface of phage particles, or expressed in soluble form in various prokaryotic or eukaryotic expression systems. .
В настоящее время разрабатываются конструкции антител для улучшенных терапевтических средств, распознающих две различные мишени.Antibody designs are currently being developed for improved therapeutics that recognize two different targets.
В Davis et al (Protein Engineering, Design & Selection 2010, 23(4) 195-202) описана платформа гетеродимерных Fc, которая позволяет конструировать биспецифические и асимметричные гибридные белки с использованием гетеродимеров СН3, полученных с помощью технологии конструирования доменов с обменом цепей (SEED). Эти производные доменов СН3 человеческих IgG и IgA создают комплементарные гетеродимеры человеческих СН3-SEED, которые состоят из чередующихся сегментов последовательностей IgA и IgG человека. Модификация с помощью SEED дополнительно описана в WO 2007/110205 A2 и ЕР 1999154 В1. В WO 2010/136172 A1 раскрыты три- или тетраспецифические антитела, которые содержат один или два одноцепочечных Fab, соединенных с С-концом Fc части антитела.Davis et al (Protein Engineering, Design & Selection 2010, 23(4) 195-202) describe a heterodimeric Fc platform that allows the construction of bispecific and asymmetric fusion proteins using CH3 heterodimers generated by the design of chain exchange domains (SEED ). These human IgG and IgA CH3 domain derivatives create complementary human CH3-SEED heterodimers that consist of alternating segments of human IgA and IgG sequences. Modification with SEED is further described in WO 2007/110205 A2 and EP 1999154 B1. WO 2010/136172 A1 discloses tri- or tetraspecific antibodies which contain one or two single chain Fab fused to the C-terminus of the Fc portion of the antibody.
В Beck et al. (Nature Reviews Immunology, vol. 10, no. 5, 1 May 2010, pp 345-352) описаны терапевтические антитела следующего поколения и, в частности, сообщается о различных типах биспецифических антител.Beck et al. (Nature Reviews Immunology, vol. 10, no. 5, 1 May 2010, pp 345-352) describes the next generation of therapeutic antibodies, and in particular, various types of bispecific antibodies are reported.
В Ridgway et al. (Protein Engineering, vol. 9, no. 7, 1996, pp 617-621) описано конструирование типа «выступ-во-впадину» доменов СН3 антител для гетеродимеризации тяжелых цепей.Ridgway et al. (Protein Engineering, vol. 9, no. 7, 1996, pp 617-621) describes the design of the "lump-in-trough" of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization.
В Von Kreudenstein et al. (Landes Bioscience, vol. 5, no. 5, 2013, pp 646-654) описан каркас биспецифического антитела на основе гетеродимерной области Fc, модифицированной для стабильности.Von Kreudenstein et al. (Landes Bioscience, vol. 5, no. 5, 2013, pp 646-654) describes a bispecific antibody framework based on a heterodimeric Fc region modified for stability.
В Liu et al. (Journal Of Biological Chemistry 2015, 290:7535-7562) описана стратегия получения моновалентных биспецифических гетеродимерных антител IgG с помощью электростатического механизма. Гетеродимерные молекулы IgG, происходящие из антител к HER2 и к EGFR, с правильными спариваниями легкой цепи (LC) и тяжелой цепи (НС) получали с помощью кратковременно и стабильно трансфецированных клеток млекопитающих. Специфическое спаривание LC и НС инициировали путем замены полярных или гидрофобных остатков на контактных поверхностях VH-VL и CH1-CL. Каждый из модифицированных вариантов характеризовался рядом точечных мутаций, в том числе в доменах VH и VL. Кроме того, точечные мутации конструировали в домене СН1, например, K147D, и в домене CL (С-каппа или Сκ), например, Т180K (нумерация в соответствии с индексом ЕС). Некоторые варианты содержали, среди прочего, точечные мутации в положениях 147 в домене СН1 и 180 или 131 в домене С-каппа.Liu et al. (Journal Of Biological Chemistry 2015, 290:7535-7562) describes a strategy for producing monovalent bispecific heterodimeric IgG antibodies using an electrostatic mechanism. Heterodimeric IgG molecules derived from anti-HER2 and anti-EGFR antibodies with correct light chain (LC) and heavy chain (HC) pairings were generated using transiently and stably transfected mammalian cells. Specific pairing of LC and HC was initiated by changing the polar or hydrophobic residues on the contact surfaces of VH-VL and CH1-CL. Each of the modified variants was characterized by a number of point mutations, including those in the VH and VL domains. In addition, point mutations were constructed in the CH1 domain, eg K147D, and in the CL (C-kappa or Cκ) domain, eg T180K (EC numbering). Some variants contained, inter alia, point mutations at positions 147 in the CH1 domain and 180 or 131 in the C-kappa domain.
В WO 2014/081955 также раскрыты такие гетеродимерные антитела, содержащие одну или более замен в каждом из следующих доменов: первый и второй домены СН3, домен СН1, домен CL, домен VH и домен VL.WO 2014/081955 also discloses such heterodimeric antibodies containing one or more substitutions in each of the following domains: first and second CH3 domains, CH1 domain, CL domain, VH domain and VL domain.
В Lewis et al. (Nature Biotechnology 2014, 32: 191-198) описано получение биспецифических антител IgG с помощью основанного на структуре дизайна ортогональной контактной поверхности Fab. Были получены биспецифические IgG с улучшенным спариванием HC-LC. Было обнаружено, что вариабельные домены играют решающую роль в специфической сборке тяжелых цепей и легких цепей. Точечные мутации в каждом из доменов VH, VL, СН1 и CL применяли в двух различных конструкциях. Одна из конструкций содержала, среди прочего, точечные мутации в положениях 146 в домене СН1 и 129 в домене С-лямбда (нумерация в соответствии с Kabat).Lewis et al. (Nature Biotechnology 2014, 32: 191-198) describes the production of bispecific IgG antibodies using a structure-based orthogonal Fab interface design. Bispecific IgGs with improved HC-LC pairing were generated. Variable domains have been found to play a critical role in the specific assembly of heavy chains and light chains. Point mutations in each of the VH, VL, CH1 and CL domains were used in two different constructs. One of the constructs contained, inter alia, point mutations at positions 146 in the CH1 domain and 129 in the C-lambda domain (numbering according to Kabat).
В Dillon et al. (MAbs 2016; DOI: 10.1080/19420862.2016.1267089) описано получение биспецифического IgG разных изотипов и видового происхождения в отдельных клетках млекопитающих, а также конструкции, которые облегчают селективную сборку плеч Fab в сочетании с ранее описанными мутациями типа «выступы-во-впадины» для предпочтительной гетеродимеризации тяжелых цепей.Dillon et al. (MAbs 2016; DOI: 10.1080/19420862.2016.1267089) describes the production of bispecific IgG of different isotypes and species origin in single mammalian cells, as well as constructs that facilitate the selective assembly of Fab arms in combination with previously described "knob-to-trough" mutations. for preferential heterodimerization of heavy chains.
Биспецифические антитела описанных выше конструкций обязательно совмещают ряд точечных мутаций для стабилизации структуры IgG, включая преобладающие точечные мутации, расположенные в доменах VH и VL. Желательным будет конструирование биспецифических антител, в которых правильное спаривание уже поддерживается точечными мутациями только в доменах СН1 и CL.The bispecific antibodies of the constructs described above necessarily combine a number of point mutations to stabilize the IgG structure, including predominant point mutations located in the VH and VL domains. It would be desirable to design bispecific antibodies in which correct pairing is already maintained by point mutations in the CH1 and CL domains only.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯBRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION
Целью настоящего изобретения является обеспечение улучшенного спаривания тяжелой и легкой цепей антитела, которое поддерживает правильное спаривание НС и LC, оставляя при этом каркас доменов VH и VL без изменений. Такое улучшенное спаривание будет облегчать получение биспецифических антител.The aim of the present invention is to provide improved pairing of the heavy and light chains of the antibody, which maintains the correct pairing of HC and LC, while leaving the framework of the VH and VL domains unchanged. This improved pairing will facilitate the production of bispecific antibodies.
Цель достигается с помощью предмета настоящего изобретения.The goal is achieved by the subject matter of the present invention.
В соответствии с настоящим изобретением предложена антигенсвязывающая молекула (АВМ), содержащая когнатный димер LC/HC легкой цепи антитела (LC), состоящей из домена антитела VL и CL, связанной с тяжелой цепью антитела (НС), содержащей по меньшей мере домен антитела VH и СН1, причем эта связь осуществляется за счет спаривания доменов VL и VH и доменов CL и СН1, при этом аминокислоты в положении 18 в домене CL и в положении 26 в домене СН1 имеют противоположную полярность, при этом нумерация приведена в соответствии с IMGT.The present invention provides an antigen-binding molecule (AVM) comprising an LC/HC cognate dimer of an antibody light chain (LC) consisting of an antibody VL domain and a CL linked to an antibody heavy chain (HC) containing at least an antibody VH domain and CH1, and this connection is carried out due to the pairing of the VL and VH domains and the CL and CH1 domains, while the amino acids at position 18 in the CL domain and at
В частности, когнатный димер LC/HC характеризуется когнатными доменами, которые спарены с образованием когнатной пары (доменов). Следует понимать, что димер LC/HC является когнатным, поскольку мономерные домены CL и СН1 являются когнатными или совпадающими частями, предпочтительно распознающими друг друга с образованием пары доменов CL и СН1, по сравнению с доменами дикого типа. В частности, домен CL, описанный в настоящем документе, предпочтительно спаривается с когнатным доменом СН1; и домен СН1, описанный в настоящем документе, предпочтительно спаривается с когнатным доменом CL.In particular, the cognate LC/HC dimer is characterized by cognate domains that are paired to form a cognate pair(s). It should be understood that the LC/HC dimer is cognate because the monomeric CL and CH1 domains are cognate or matched portions, preferentially recognizing each other to form a pair of CL and CH1 domains, compared to wild-type domains. In particular, the CL domain described herein preferably pairs with a cognate CH1 domain; and the CH1 domain described herein preferably pairs with a cognate CL domain.
В соответствии с конкретным аспектом АВМ характеризуется когнатными доменами антитела CL и СН1, которые предпочтительно спариваются друг с другом за счет сил притяжения и предпочтительно не спариваются с другими партнерскими доменами, которые не являются когнатными или имеют дикий тип, из-за сил отталкивания. Соответственно, ошибочное спаривание партнерских доменов антитела, которые представляют собой домены антитела дикого типа или которые были превращены в некогнатные (отталкивающиеся для уменьшения вероятности сборки) за счет соответствующих точечных мутаций, значительно снижается.In a specific aspect, the AVM is characterized by CL and CH1 antibody cognate domains that preferentially pair with each other by attractive forces and preferably do not pair with other partner domains that are not cognate or wild-type due to repulsive forces. Accordingly, mismatching of antibody partner domains that are wild-type antibody domains or that have been rendered non-cognate (repelled to reduce assembly likelihood) by appropriate point mutations is significantly reduced.
В частности, когнатные домены CL и СН1 характеризуются противоположной полярностью в указанных положениях аминокислот, в частности, так, чтоIn particular, the CL and CH1 cognate domains are characterized by opposite polarity at the indicated amino acid positions, in particular so that
a) остаток аминокислоты в положении 18 в домене CL имеет положительную полярность, в частности, любой из R, Н или K; и остаток аминокислоты в положении 26 в домене СН1 имеет отрицательную полярность, в частности, любой из D или Е; илиa) the amino acid residue at position 18 in the CL domain is of positive polarity, in particular any of R, H or K; and the amino acid residue at
b) остаток аминокислоты в положении 18 в домене CL имеет отрицательную полярность, в частности, любой из D или Е; и остаток аминокислоты в положении 26 в домене СН1 имеет положительную полярность, в частности, любой из R, Н или K.b) the amino acid residue at position 18 in the CL domain is of negative polarity, in particular either D or E; and the amino acid residue at
В частности, АВМ содержит одну или две точечные мутации, которые представляют собой любую одну или обе из точечных мутаций в положении 18 в домене CL и точечных мутаций в положении 26 в домене СН1.In particular, the AVM contains one or two point mutations, which are any one or both of point mutations at position 18 in the CL domain and point mutations at
Если не указано иное, положения в настоящем документе пронумерованы в соответствии с системой IMIGT (Lefranc et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27: 209-212). Нумерация положений, указанных в формуле изобретения, соответствует нумерации в соответствии с Kabat и индексу ЕС из Kabat, как указано в следующей ниже таблице. Объяснение системы нумерации согласно Kabat можно найти в Kabat, ЕА, et al, Sequences of proteins of immunological interest (NIH publication no. 91-3242, 5th edition (1991)).Unless otherwise indicated, positions in this document are numbered according to the IMIGT system (Lefranc et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27: 209-212). The numbering of the positions indicated in the claims corresponds to the numbering according to Kabat and the EC index from Kabat, as indicated in the following table. An explanation of the Kabat numbering system can be found in Kabat, EA, et al, Sequences of proteins of immunological interest (NIH publication no. 91-3242, 5th edition (1991)).
Указанные положения неожиданно оказались доминантными при конструировании плеча Fab, причем НС и LC собираются (спариваются) с улучшенной аффинностью. Конструкции предшествующего уровня техники включали различные пары точечных мутаций СН1 и CL, расположенных в разных положениях, которые были сконструированы помимо доминантных точечных мутаций VH и VL. Когнатную пару мутированных доменов CL и СН1 (под которыми в настоящем документе понимают когнатные домены или когнатную пару) предпочтительно получают путем установления противоположных полярностей в указанных положениях CL и СН1. В то же время ошибочное когнатное спаривание или спаривание с доменами CL и СН1 дикого типа заметно снижено.These positions were unexpectedly dominant in the design of the Fab arm, with HC and LC being assembled (paired) with improved affinity. Prior art constructs included various pairs of CH1 and CL point mutations located at different positions, which were constructed in addition to the dominant VH and VL point mutations. A cognate pair of mutated CL and CH1 domains (by which we mean cognate domains or a cognate pair herein) is preferably obtained by establishing opposite polarities at the indicated positions of CL and CH1. At the same time, mismatching or mismatching with wild-type CL and CH1 domains is markedly reduced.
В частности, АВМ характеризуется, как указано далее:In particular, the AVM is characterized as follows:
АA
a) домен CL представляет собой С-каппа, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID 1, которая содержит по меньшей мере точечную мутацию Т18Х, где X представляет собой любой из R, Н или K; иa) the CL domain is a C-kappa containing an amino acid sequence that is at least 90% identical to the sequence of
b) домен СН1 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID 3, которая содержит по меньшей мере точечную мутацию K26Х, где X представляет собой любой из D или Е;b) the CH1 domain contains an amino acid sequence that is at least 90% identical to the sequence of
или Вor in
a) домен CL представляет собой С-лямбда, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID 2, которая содержит по меньшей мере точечную мутацию K18Х, где X представляет собой любой из D или Е; иa) the CL domain is a C-lambda containing an amino acid sequence that is at least 90% identical to the sequence of
b) домен СН1 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID 3, где K в положении 26 не заменен какой-либо другой аминокислотой, или которая содержит по меньшей мере точечную мутацию K26Х, где X представляет собой любой из R или Н;b) the CH1 domain contains an amino acid sequence that is at least 90% identical to the sequence of
или Сor with
a) домен CL представляет собой С-лямбда, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID 2, где K в положении 18 не заменен какой-либо другой аминокислотой, или которая содержит по меньшей мере точечную мутацию K18Х, где X представляет собой любой из R или Н; иa) the CL domain is a C-lambda containing an amino acid sequence that is at least 90% identical to the sequence of
b) домен СН1 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID 3, которая содержит по меньшей мере точечную мутацию K26Х, где X представляет собой любой из D или Е;b) the CH1 domain contains an amino acid sequence that is at least 90% identical to the sequence of
при этом нумерация приведена в соответствии с IMIGT.while the numbering is given in accordance with IMIGT.
В частности, домены CL и СН1 происходят из человека, в частности, из молекулы человеческого IgG или IgG1, в частности, представляют функционально активные варианты, характеризующиеся по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с природной человеческой последовательностью и одной или более точечными мутациями, такими как те, которые описаны в настоящем документе, и, в частности, дополнительно характеризуются структурой бета-складчатой конфигурации домена антитела, которая напоминает структуру соответствующих доменов в структуре человеческого IgG, IgM или IgE, в частности, в структуре человеческого IgG1.In particular, the CL and CH1 domains are derived from a human, in particular from a human IgG or IgG1 molecule, in particular, represent functionally active variants characterized by at least 90% sequence identity with the natural human sequence and one or more point mutations, such as those described herein, and in particular, are further characterized by the structure of the beta-fold configuration of the antibody domain, which resembles the structure of the corresponding domains in the structure of human IgG, IgM or IgE, in particular, in the structure of human IgG1.
Функционально активные варианты любого из доменов С-каппа, С-лямбда или СН1, описанных в настоящем документе, в частности, характеризуются структурой домена антитела, способной к спариванию с соответствующим совпадающим доменом антитела, в частности, гдеFunctionally active variants of any of the C-kappa, C-lambda, or CH1 domains described herein are specifically characterized by an antibody domain structure capable of pairing with a corresponding matching antibody domain, specifically wherein
АA
a) вариант домена CL представляет собой вариант С-каппа, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID 1 и которая содержит точечную мутацию Т18Х, где X представляет собой любой из R, Н или K; и способен к спариванию сa) the CL domain variant is a C-kappa variant containing an amino acid sequence that is at least 90% identical to the sequence of
b) доменом СН1, состоящим из аминокислотной последовательности, определенной как SEQ ID 3, за исключением точечной мутации K26Х, где X представляет собой любой из D или Е;b) a CH1 domain consisting of the amino acid sequence defined as
или Вor in
a) вариант домена CL представляет собой вариант С-лямбда, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID 2 и которая содержит точечную мутацию K18Х, где X представляет собой любой из D или Е; и способен к спариванию сa) the CL domain variant is a C-lambda variant containing an amino acid sequence that is at least 90% identical to the sequence of
b) доменом СН1, состоящим из аминокислотной последовательности, определенной как любая из SEQ ID 3 или SEQ ID 3 за исключением точечной мутации K26Х, где X представляет собой любой из R или Н;b) a CH1 domain consisting of an amino acid sequence defined as any of
или Сor with
a) вариант домена CL представляет собой вариант С-лямбда, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID 2, где K в положении 18 не заменен какой-либо другой аминокислотой, или которая содержит точечную мутацию K18Х, где X представляет собой любой из R или Н; и способен к спариванию сa) the CL domain variant is a C-lambda variant containing an amino acid sequence that is at least 90% identical to the sequence of
b) доменом СН1, состоящим из аминокислотной последовательности, определенной как SEQ ID 3, за исключением точечной мутации K26Х, где X представляет собой любой из D или Е.b) a CH1 domain consisting of the amino acid sequence defined as
В частности, аминокислотная последовательность С-каппа (также упоминаемая в настоящем документе как дикий тип или исходная) определена как SEQ ID 1.In particular, the amino acid sequence of C-kappa (also referred to herein as wild type or parent) is defined as
В частности, аминокислотная последовательность С-лямбда (также упоминаемая в настоящем документе как дикий тип или исходная) определена как SEQ ID 2.In particular, the amino acid sequence of C-lambda (also referred to herein as wild type or parent) is defined as
В частности, аминокислотная последовательность СН1 (также упоминаемая в настоящем документе как дикий тип или исходная) определена как SEQ ID 3.In particular, the amino acid sequence of CH1 (also referred to herein as wild type or parent) is defined as
В частности, домен CL характеризуется последовательностью CL человеческого IgG1 или ее модифицированным функционально активным вариантом, содержащим одну или более точечных мутаций, предпочтительно до 10 точечных мутаций, в частности, любую из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 точечных мутаций.In particular, the CL domain is characterized by the CL sequence of human IgG1 or a modified functionally active variant thereof, containing one or more point mutations, preferably up to 10 point mutations, in particular any of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 , 9 or 10 point mutations.
В частности, домен СН1 характеризуется последовательностью СН1 человеческого IgG1 или ее модифицированным функционально активным вариантом, содержащим одну или более точечных мутаций, предпочтительно до 10 точечных мутаций, в частности, любую из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 точечных мутаций.In particular, the CH1 domain is characterized by the CH1 sequence of human IgG1 or a modified functionally active variant thereof containing one or more point mutations, preferably up to 10 point mutations, in particular any of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 , 9 or 10 point mutations.
В частности, любой или каждый из доменов CL и СН1 характеризуется соответствующей последовательностью человеческого IgG1 или ее модифицированным функционально активным вариантом, содержащим одну или более точечных мутаций, предпочтительно до 10 точечных мутаций, в частности, любую из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 точечных мутаций.In particular, any or each of the CL and CH1 domains is characterized by a corresponding sequence of human IgG1 or a modified functionally active variant containing one or more point mutations, preferably up to 10 point mutations, in particular any of 1, 2, 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9 or 10 point mutations.
В частности, димер содержит по меньшей мере один междоменный дисульфидный мостик между доменами CL и СН1. В частности, междоменные дисульфидные мостики соединяют Cys220 (нумерация в соответствии с индексом ЕС) или Cys233 (нумерация в соответствии с Kabat) в доменах СН1 и Cys214 в доменах CL (индекс ЕС и нумерация в соответствии с Kabat).In particular, the dimer contains at least one interdomain disulfide bridge between the CL and CH1 domains. In particular, interdomain disulfide bridges connect Cys220 (EC numbering) or Cys233 (Kabat numbering) in CH1 domains and Cys214 in CL domains (EC numbering and Kabat numbering).
В частности, домен CL дополнительно содержит точечную мутацию F7X, где X представляет собой любой из S, А или V, и домен СН1 дополнительно содержит точечную мутацию A20L, при этом нумерация приведена в соответствии с IMGT. Такие дополнительные точечные мутации дополнительно поддерживают предпочтительное спаривание когнатных доменов CL и СН1.In particular, the CL domain further contains the F7X point mutation, where X is any of S, A, or V, and the CH1 domain further contains the A20L point mutation, with the numbering being given according to IMGT. Such additional point mutations further support the preferential pairing of the CL and CH1 cognate domains.
В частности, домены VL и VH в АВМ не содержат какую-либо точечную мутацию, изменяющую полярность аминокислоты в области контактной поверхности, которая обеспечивает междоменный контакт при спаривании доменов VL и VH с образованием антигенсвязывающего сайта.In particular, the VL and VH domains in AVM do not contain any point mutation that changes the polarity of the amino acid in the area of the contact surface, which provides interdomain contact when the VL and VH domains are paired to form an antigen-binding site.
В частности, АВМ содержит функциональный антигенсвязывающий сайт, состоящий из пары доменов VH/VL, способный связывать мишень с высокой аффинностью и KD, которая меньше любого из значений 10-6 М, 10-7 М, 10-8 М, 10-9 М или 10-10 М. В частности, АВМ представляет собой биспецифическое или гетеродимерное антитело, нацеленное на два разных антигена, причем каждый из антигенов распознается антителом с KD, которая меньше любого из значений 10-6 М, 10-7 М, 10-8 М, 10-9 М или 10-10 M.In particular, the AVM contains a functional antigen-binding site, consisting of a pair of VH/VL domains, capable of binding the target with high affinity and a K D that is less than any of the values of 10 -6 M, 10 -7 M, 10 -8 M, 10 -9 M or 10 -10 M. In particular, AVM is a bispecific or heterodimeric antibody that targets two different antigens, each of the antigens being recognized by an antibody with a K D that is less than any of the values 10 -6 M, 10 -7 M, 10 -8 M, 10 -9 M or 10 -10 M.
В частности, НС дополнительно содержит по меньшей мере один домен СН2 и по меньшей мере один домен СН3. В частности, НС удлинена за счет домена СН2 и дополнительно удлинена за счет домена СН3, а именно последовательность доменов СН2-СН3 дополнительно спарена с другой цепью антитела, содержащей домен СН2-СН3, так, чтобы получить область Fc, состоящую из димера доменов СН2-СН3 и соответствующих цепей. В частности, НС удлинена за счет гибридизации домена СН2 с С-концом домена СН1 с применением линкера или шарнирной области или без них. В частности, НС дополнительно удлинена за счет гибридизации домена СН3 с С-концом домена СН2 с применением линкера или без него. В некоторых случаях НС дополнительно удлинена за счет гибридизации домена СН4 с С-концом домена СН3 с применением линкера или без него.In particular, the HC further comprises at least one CH2 domain and at least one CH3 domain. In particular, the HC is extended by a CH2 domain and further extended by a CH3 domain, namely, the sequence of CH2-CH3 domains is further paired with another antibody chain containing a CH2-CH3 domain, so as to obtain an Fc region consisting of a dimer of CH2-CH3 domains. CH3 and corresponding chains. In particular, the HC is extended by hybridization of the CH2 domain to the C-terminus of the CH1 domain with or without a linker or hinge region. In particular, the HC is further extended by hybridization of the CH3 domain to the C-terminus of the CH2 domain with or without a linker. In some cases, the HC is further extended by hybridization of the CH4 domain to the C-terminus of the CH3 domain with or without a linker.
В частности, АВМ содержит шарнирную область, предпочтительно человеческую шарнирную область, например, шарнирную область человеческого IgG1, например, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, определенной как SEQ ID 4.In particular, the AVM contains a hinge region, preferably a human hinge region, for example, a human IgG1 hinge region, for example, containing or consisting of the amino acid sequence defined as
Связь доменов, в частности, осуществляется с помощью рекомбинантной гибридизации или химической связи. Специфическая связь может быть получена за счет связывания С-конца одного домена с N-концом другого домена, например, когда один или более остатков аминокислот в концевых областях удалены, чтобы укоротить домен, или добавлены, чтобы увеличить гибкость доменов.The linkage of domains, in particular, is carried out using recombinant hybridization or chemical bonding. A specific link can be obtained by linking the C-terminus of one domain to the N-terminus of another domain, for example, when one or more amino acid residues in the terminal regions are removed to shorten the domain or added to increase the flexibility of the domains.
В частности, укороченная последовательность домена содержит делецию С-концевой и/или N-концевой области, например, для удаления по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5, до 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот.In particular, the truncated domain sequence contains a deletion of the C-terminal and/or N-terminal region, for example, to remove at least 1, 2, 3, 4 or 5, up to 6, 7, 8, 9 or 10 amino acids.
В частности, можно применять соединяющую последовательность, которая представляет собой линкер или шарнирную область или по меньшей мере часть шарнирной области иммуноглобулина, например, пептидный линкер, например, содержащий по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот, до 10, 15 или 20 аминокислот. Соединяющая последовательность также называется в настоящем документе «соединение». Домен может быть удлинен с помощью линкера, например, за счет аминокислотной последовательности, которая происходит из N- или С-концевой области домена иммуноглобулина, которая в нативных условиях будет расположена рядом с доменом, так, чтобы включать нативное соединение между доменами. Согласно другому варианту линкер может содержать аминокислотную последовательность, происходящую из шарнирной области. Однако линкер также может представлять собой искусственную последовательность, например, состоящую из последовательных аминокислот Gly и/или Ser, предпочтительно длиной от 5 до 20 аминокислот, предпочтительно от 8 до 15 аминокислот.In particular, a connecting sequence can be used which is a linker or hinge region or at least part of the hinge region of an immunoglobulin, e.g. a peptidic linker, e.g. or 20 amino acids. The connecting sequence is also referred to herein as a "connection". The domain can be extended by a linker, for example, by an amino acid sequence that is derived from the N- or C-terminal region of the immunoglobulin domain, which under native conditions would be adjacent to the domain, so as to include a native connection between the domains. In another embodiment, the linker may contain an amino acid sequence derived from the hinge region. However, the linker can also be an artificial sequence, for example consisting of consecutive Gly and/or Ser amino acids, preferably 5 to 20 amino acids in length, preferably 8 to 15 amino acids in length.
В соответствии с конкретным аспектом АВМ представляет собой антитело или иммуноглобулин, содержащий структуру природного иммуноглобулина или иммуноглобулиноподобного каркаса, причем АВМ характеризуется по меньшей мере одним (предпочтительно двумя) антигенсвязывающим(ими) сайтом(ами) и структурой, состоящей из доменов антитела, соединенных с тяжелыми и легкими цепями подходящими соединяющими последовательностями или без них, при этом НС димеризуется с LC с образованием по меньшей мере одного антигенсвязывающего сайта и при этом необязательно две НС димеризуются с образованием области Fc.In accordance with a specific aspect, the AVM is an antibody or immunoglobulin containing the structure of a natural immunoglobulin or immunoglobulin-like framework, and the AVM is characterized by at least one (preferably two) antigen-binding site(s) and a structure consisting of antibody domains connected to heavy and light chains with suitable connecting sequences or without them, while the HC dimerizes with the LC to form at least one antigen-binding site, and optionally two HC dimerize to form the Fc region.
В частности, АВМ представляет собой любой из фрагмента антитела Fab или (Fab)2 или полноразмерное антитело, содержащее часть Fc или область Fc, причем предпочтительно АВМ представляет собой полноразмерное антитело IgG, IgM или IgE, в частности, любое из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В частности, АВМ содержит один или два плеча Fab или фрагмента Fab (части Fab) в любом подходящем порядке. В соответствии с конкретными вариантами реализации АВМ даже может содержать более двух плеч Fab, например, три или четыре плеча Fab, причем по меньшей мере одно или только одно из плеч Fab содержит когнатную пару LC/HC и когнатные домены CL и СН1, описанные в настоящем документе. В соответствии с конкретным вариантом реализации другое плечо Fab содержит домены CL и СН1 дикого типа (природные).In particular, the AVM is any of a Fab or (Fab)2 antibody fragment or a full length antibody containing an Fc portion or an Fc region, preferably a full length IgG, IgM or IgE antibody, in particular any of IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4. In particular, the AVM contains one or two Fab arms or Fab fragments (Fab parts) in any suitable order. In particular embodiments, the AVM may even comprise more than two Fab arms, such as three or four Fab arms, with at least one or only one of the Fab arms comprising an LC/HC cognate pair and the CL and CH1 cognate domains described herein. document. In accordance with a specific embodiment, the other arm of the Fab contains wild-type (natural) CL and CH1 domains.
В соответствии с конкретным вариантом реализации АВМ содержит только один когнатный димер LC/HC, причем НС дополнительно димеризуется с цепью Fc, содержащей СН2-СН3, необязательно дополнительно содержащей СН4, с получением области Fc. Такая АВМ представляет собой, в частности, моновалентное моноспецифическое антитело, характеризующееся только одним плечом Fab и областью Fc.According to a particular embodiment, the AVM contains only one LC/HC cognate dimer, with the HC further dimerizing with an Fc chain containing CH2-CH3, optionally further containing CH4, to produce an Fc region. Such an AVM is, in particular, a monovalent monospecific antibody characterized by only one Fab arm and an Fc region.
В соответствии с другим конкретным вариантом реализации АВМ содержит по меньшей мере два димера LC/HC, причем только один из димеров LC/HC характеризуется когнатным димером LC/HC и когнатными доменами CL и СН1 (т.е. когнатной парой CL/CH1), описанными в настоящем документе. Согласно другому варианту АВМ состоит из первого димера LC/HC, содержащего первый когнатный димер LC/HC, содержащий первую когнатную пару CL/CH1, характеризующуюся точечными мутациями, описанными в настоящем документе, и второй когнатный димер LC/HC, содержащий вторую когнатную пару CL/CH1, характеризующуюся точечными мутациями, описанными в настоящем документе, которые отличаются от мутаций в первой когнатной паре CL/CH1, так, что первые когнатные домены CL и СН1 предпочтительно спариваются друг с другом, и вторые когнатные домены CL и СН1 предпочтительно спариваются друг с другом, однако домен CL первой когнатной пары CL/CH1 предпочтительно не спаривается (или даже отталкивается от него) с доменом СН1 второй когнатной пары CL/CH1, и домен СН1 первой когнатной пары CL/CH1 предпочтительно не спаривается (или даже отталкивается от него) с доменом CL второй когнатной пары CL/CH1.According to another specific embodiment, the AVM contains at least two LC/HC dimers, wherein only one of the LC/HC dimers is characterized by an LC/HC cognate dimer and CL and CH1 cognate domains (i.e., a CL/CH1 cognate pair), described in this document. In another embodiment, the AVM consists of a first LC/HC dimer containing a first LC/HC cognate dimer containing a first CL/CH1 cognate pair characterized by the point mutations described herein and a second LC/HC cognate dimer containing a second CL cognate pair. /CH1, characterized by the point mutations described herein, which differ from the mutations in the first CL/CH1 cognate pair such that the first CL and CH1 cognate domains preferentially pair with each other and the second CL and CH1 cognate domains preferentially pair with each other another, however, the CL domain of the first CL/CH1 cognate pair preferably does not pair (or even repel) with the CH1 domain of the second CL/CH1 cognate pair, and the CH1 domain of the first CL/CH1 cognate pair preferably does not pair (or even repels from it) with the CL domain of the second CL/CH1 cognate pair.
В соответствии с конкретным вариантом реализации АВМ содержит два разных плеча Fab, что обеспечивает две разные структуры Fv, каждая из которых имеет специфические характеристики связывания. В частности, АВМ представляет собой гетеродимерное или биспецифическое антитело, нацеленное на два разных антигена или два разных эпитопа антигена.According to a specific embodiment, the AVM contains two different Fab arms, which provides two different Fv structures, each with specific binding characteristics. In particular, AVM is a heterodimeric or bispecific antibody that targets two different antigens or two different antigen epitopes.
Согласно настоящему изобретению также предложено гетеродимерное или биспецифическое антитело, содержащее первое и второе плечи Fab, распознающие разные антигены или эпитопы, причем только одно из первого и второго плеч Fab содержит когнатный димер LC/HC АВМ, описанный в настоящем документе. В частности, гетеродимерное антитело представляет собой биспецифическое антитело или иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент, например, биспецифический полноразмерный иммуноглобулин или (Fab)2.The present invention also provides a heterodimeric or bispecific antibody comprising first and second Fab arms recognizing different antigens or epitopes, with only one of the first and second Fab arms containing the AVM LC/HC cognate dimer described herein. In particular, the heterodimeric antibody is a bispecific antibody or an immunoglobulin or an antigen-binding fragment thereof, for example, a bispecific full length immunoglobulin or (Fab)2.
В частности, АВМ представляет собой биспецифическое антитело, причем первая мишень представляет собой любой из CD3, CD16 или Her2neu, и вторая мишень представляет собой EGFR.In particular, AVM is a bispecific antibody, wherein the first target is any of CD3, CD16, or Her2neu and the second target is EGFR.
Под плечом Fab в настоящем документе понимают конкретно димер НС, состоящей из последовательности домена VH-CH1, и LC, состоящей из последовательности домена VL-CL (каппа или лямбда), с дисульфидными мостиками или без них, шарнирный домен и/или линкерные последовательности, соединяющие домены антитела. Под плечом Fab обычно понимают фрагмент Fab (или часть Fab), отщепленный от антитела. Плечо Fab, в частности, характеризуется только одним антигенсвязывающим сайтом, образованным за счет спаривания доменов VH и VL, который способен связывать мишень только моноспецифично и моновалентно.By Fab arm, herein, is meant specifically a dimer of an HC consisting of a VH-CH1 domain sequence and an LC consisting of a VL-CL (kappa or lambda) domain sequence, with or without disulfide bridges, a hinge domain and/or linker sequences, linking antibody domains. A Fab arm is usually understood to mean a Fab fragment (or part of a Fab) cleaved from an antibody. The Fab arm, in particular, is characterized by only one antigen-binding site, formed by the pairing of the VH and VL domains, which is only able to bind the target monospecifically and monovalently.
В частности, только одно из первого и второго плеч Fab в биспецифическом антителе содержит:In particular, only one of the first and second arms of the Fab in the bispecific antibody contains:
а) точечную мутацию F7X в домене CL, где X представляет собой любой из S, А илиa) an F7X point mutation in the CL domain, where X is any of S, A, or
V; иV; And
b) точечную мутацию A20L в домене СН1;b) an A20L point mutation in the CH1 domain;
при этом нумерация приведена в соответствии с IMIGT.while the numbering is given in accordance with IMIGT.
В настоящем документе под такими точечными мутациями в положениях 7 и 20, указанными выше, понимают поддерживающие точечные мутации, которые фактически не изменяют полярность остатка аминокислоты, но стерические характеристики которых соответствуют размеру эквивалентного аминокислотного остатка.As used herein, such point mutations at
В частности, домен CL, содержащий указанную выше поддерживающую точечную мутацию F7X, где X представляет собой любой из S, А или V, притягивает и предпочтительно спаривается с партнерским доменом СН1, содержащим поддерживающую точечную мутацию A20L, но непредпочтительно спаривается с доменом СН1 дикого типа или доменом СН1, который не содержит точечную мутацию A20L.In particular, a CL domain containing the F7X point mutation above, where X is any of S, A, or V, attracts and preferentially pairs with a partner CH1 domain containing the A20L point mutation maintainer, but unpreferably pairs with a wild-type CH1 domain or a CH1 domain that does not contain the A20L point mutation.
В частности, домен СН1, содержащий указанную выше поддерживающую точечную мутацию A20L, притягивает и предпочтительно спаривается с партнерским доменом CL, содержащим указанную выше поддерживающую точечную мутацию F7X, где X представляет собой любой из S, А или V, но непредпочтительно спаривается с доменом CL дикого типа или доменом CL, который не содержит точечную мутацию F7X, указанную выше, при этом X представляет собой любой из S, А или V.In particular, a CH1 domain containing the above A20L upkeep point mutation attracts and preferentially pairs with a partner CL domain containing the above F7X upkeep point mutation, where X is any of S, A, or V, but not preferably pairs with the wild CL domain. a CL type or domain that does not contain the F7X point mutation above, wherein X is any of S, A, or V.
В частности, гетеродимерное антитело характеризуется тем, что:In particular, a heterodimeric antibody is characterized in that:
АA
a) указанное первое плечо Fab содержит когнатный димер LC/HC, описанный в настоящем документе, который конкретно характеризуется точечными мутациями, определенными выше, в частности, одной или двумя точечными мутациями, обеспечивающими остаток аминокислоты в положении 18 в домене CL и остаток аминокислоты в положении 26 в домене СН1, которые имеют противоположную полярность, причем домены CL и СН1 дополнительно содержат поддерживающие точечные мутации, определенные выше, в частности, точечную мутацию F7X в домене CL, при этом X представляет собой любой из S, А или V; и точечную мутацию A20L в домене СН1; иa) said first arm of the Fab contains the LC/HC cognate dimer described herein, which is specifically characterized by the point mutations as defined above, in particular one or two point mutations providing an amino acid residue at position 18 in the CL domain and an amino acid residue at
b) указанное второе плечо Fab не содержит какую-либо из точечных мутаций а), или Вb) said second arm of the Fab does not contain any of the point mutations a) or B
а) указанное первое плечо Fab содержит когнатный димер LC/HC, описанный в настоящем документе, который конкретно характеризуется точечными мутациями, определенными выше, в частности, одной или двумя точечными мутациями, обеспечивающими остаток аминокислоты в положении 18 в домене CL и остаток аминокислоты в положении 26 в домене СН1, которые имеют противоположную полярность, причем домены CL и СН1 также не содержат поддерживающие точечные мутации, определенные выше, в частности, точечную мутацию F7X в домене CL, где X представляет собой любой из S, А или V; и точечную мутацию A20L в домене СН1; иa) said first arm of the Fab comprises the LC/HC cognate dimer described herein, which is specifically characterized by the point mutations as defined above, in particular one or two point mutations providing an amino acid residue at position 18 in the CL domain and an amino acid residue at
b) указанное второе плечо Fab содержит поддерживающие точечные мутации, определенные выше, в частности, точечную мутацию F7X в домене CL, где X представляет собой любое из S, А, или V; и точечную мутацию A20L в домене СН1.b) said second arm of the Fab contains maintenance point mutations as defined above, in particular an F7X point mutation in the CL domain, where X is any of S, A, or V; and an A20L point mutation in the CH1 domain.
Такая биспецифическая конструкция А, в частности, характеризуется точечными мутациями, описанными в настоящем документе, для предпочтительного спаривания когнатных доменов CL и СН1 когнатного димера LC/HC, которые модифицированы только в одном из двух плеч Fab (т.е. в первом плече Fab), что ведет к неблагоприятному спариванию или прикреплению к любой из НС или LC другого плеча Fab (т.е. второго плеча Fab).This bispecific construct A is specifically characterized by the point mutations described herein to preferentially pair the CL and CH1 cognate domains of the LC/HC cognate dimer, which are modified in only one of the two Fab arms (i.e., the first Fab arm) , leading to unfavorable mating or attachment to any of the HCs or LCs of the other arm of the Fab (ie, the second arm of the Fab).
Такая биспецифическая конструкция В, в частности, характеризуется первым плечом Fab, которое содержит когнатный димер LC/HC, описанный в настоящем документе, характеризующийся одной или двумя точечными мутациями в положении 18 в домене CL и в положении 26 в домене СН1, с получением остатков аминокислот в этих положениях, которые имеют противоположную полярность, и вторым плечом Fab, которое содержит поддерживающие точечные мутации, таким образом, чтоSuch a bispecific construct B is in particular characterized by a first Fab arm that contains the cognate LC/HC dimer described herein, characterized by one or two point mutations at position 18 in the CL domain and at
a) НС первого плеча Fab благоприятно спаривается с LC первого плеча Fab или прикрепляется к ней, и неблагоприятно спаривается с LC второго плеча Fab или прикрепляется к ней; иa) The HC of the first arm of the Fab pairs favorably with or attaches to the LC of the first arm of the Fab, and unfavorably pairs with or attaches to the LC of the second arm of the Fab; And
b) LC первого плеча Fab благоприятно спаривается с НС первого плеча Fab или прикрепляется к ней, и неблагоприятно спаривается с НС второго плеча Fab или прикрепляется к ней;b) the LC of the first arm of the Fab pairs favorably with or attaches to the HC of the first arm of the Fab, and unfavorably pairs with or attaches to the HC of the second arm of the Fab;
и, наоборот, это означает, чтоand conversely, this means that
c) НС второго плеча Fab благоприятно спаривается с LC второго плеча или прикрепляется к ней, и неблагоприятно спаривается с LC первого плеча Fab или прикрепляется ней; иc) The second arm HC of the Fab pairs favorably with or attaches to the second arm LC, and unfavorably pairs with or attaches to the first arm LC of the Fab; And
d) LC второго плеча Fab благоприятно спаривается с НС второго плеча Fab или прикрепляется к ней, и неблагоприятно спаривается с НС первого плеча Fab или прикрепляется к ней.d) The LC of the second arm of the Fab pairs favorably with or attaches to the HC of the second arm of the Fab, and unfavorably mates with or attaches to the HC of the first arm of the Fab.
В соответствии с конкретным вариантом реализации оба, первое и второе, плеча Fab содержат одну или две точечные мутации в положении 18 в домене CL и в положении 26 в домене СН1 с получением в этих положениях остатков аминокислот, которые имеют противоположную полярность, при этом также точечные мутации в первом и втором плечах Fab являются различными, с получениемIn accordance with a particular embodiment, both the first and second arms of the Fab contain one or two point mutations at position 18 in the CL domain and at
a) первого плеча Fab, которое содержит домен CL, в котором остаток аминокислоты в положении 18 имеет положительную полярность, специфически распознающий домен СН1, в котором остаток аминокислоты в положении 26 имеет отрицательную полярность; иa) a first arm of a Fab that contains a CL domain in which the amino acid residue at position 18 is of positive polarity, specifically recognizing a CH1 domain in which the amino acid residue at
b) второго плеча Fab, которое содержит домен CL, в котором остаток аминокислоты в положении 18 имеет отрицательную полярность, специфический распознающий домен СН1, в котором остаток аминокислоты в положении 26 имеет положительную полярность;b) a second arm of a Fab that contains a CL domain in which the amino acid residue at position 18 has a negative polarity, a CH1 specific recognition domain in which the amino acid residue at
при этом необязательно поддерживающие точечные мутации находятся как в первом плече Fab, так и во втором плече Fab.while optionally supporting point mutations are in both the first arm of the Fab and the second arm of the Fab.
Дополнительные варианты реализации относятся к биспецифическим конструкциям, в которых:Additional implementations refer to bispecific constructs in which:
a) первое плечо Fab содержит домен CL, в котором остаток аминокислоты в положении 18 имеет положительную полярность, специфически распознающий домен СН1, в котором остаток аминокислоты в положении 26 имеет отрицательную полярность; иa) the first arm of the Fab contains a CL domain in which the amino acid residue at position 18 is of positive polarity, specifically recognizing a CH1 domain in which the amino acid residue at
b) второе плечо Fab, в котором остаток аминокислоты в положении 18 в домене CL и/или остаток аминокислоты в положении 26 в домене СН1 не имеет заряда, в частности, любой из N, С, Q, G, S, Т, W или Y; или является неполярным, в частности, любой из А, I, L, М, F, Р или V;b) a second arm of a Fab in which the amino acid residue at position 18 in the CL domain and/or the amino acid residue at
при этом необязательно поддерживающие точечные мутации находятся как в первом плече Fab, так и во втором плече Fab.while optionally supporting point mutations are in both the first arm of the Fab and the second arm of the Fab.
В соответствии с конкретным аспектом АВМ, описанная в настоящем документе, в частности, гетеродимерное антитело, описанное в настоящем документе, содержит две НС, каждая из которых содержит домен СН2 и СН3 и необязательно домен СН4, причем НС димеризуются с образованием области Fc.According to a specific aspect, the AVM described herein, in particular the heterodimeric antibody described herein, contains two HCs, each containing a CH2 and CH3 domain and optionally a CH4 domain, wherein the HCs dimerize to form an Fc region.
Область Fc, в частности, характеризуется димером цепей Fc, каждая из которых характеризуется тем, что содержит цепь доменов антитела СН2-СН3, причем димер может представлять собой гомодимер или гетеродимер, например, первая цепь Fc отличается от второй цепи Fc по меньшей мере одной точечной мутацией в доменах СН2 и/или СН3.The Fc region is in particular characterized by a dimer of Fc chains, each of which is characterized in that it contains a chain of CH2-CH3 antibody domains, the dimer may be a homodimer or a heterodimer, for example, the first Fc chain differs from the second Fc chain by at least one punctate mutation in the CH2 and/or CH3 domains.
В частности, область Fc содержит два домена СН3, которые модифицированы для введения и/или характеризуются одним или более из следующего:In particular, the Fc region contains two CH3 domains that are modified for introduction and/or are characterized by one or more of the following:
a) гетеродимеры СН3 с доменом, сконструированным путем обмена цепей (SEED), которые состоят из чередующихся сегментов последовательностей СН3 человеческого IgA и IgG;a) CH3 heterodimers with a chain exchange designed domain (SEED) that consist of alternating segments of human IgA and IgG CH3 sequences;
b) одна или более мутаций типа «выступ-во-впадину», предпочтительно любая из T366Y/Y407'T, F405A/T394'W, T366Y:F405A/T394'W:Y407'T, T366W/Y407'A и S354C:T366W/Y349'C:T366'S:L368A:Y407'V;b) one or more bump-to-bottom mutations, preferably any of T366Y/Y407'T, F405A/T394'W, T366Y:F405A/T394'W:Y407'T, T366W/Y407'A and S354C: T366W/Y349'C:T366'S:L368A:Y407'V;
c) остаток цистеина в первом домене СН3, который ковалентно соединен с остатком цистеина во втором домене СН3 с введением междоменного дисульфидного мостика, предпочтительно соединяющего С-конец обоих доменов СН3;c) a cysteine residue in the first CH3 domain which is covalently linked to a cysteine residue in the second CH3 domain with the introduction of an interdomain disulfide bridge, preferably connecting the C-terminus of both CH3 domains;
d) одна или более мутаций, в случае которых отталкивающий заряд подавляет образование гетеродимера, предпочтительно любая из: K409D/D399'K, K409D/D399'R, K409E/D399'K, K409E/D399'R, K409D:K392D/D399'K:E356'K или K409D:K392D:K370D/ D399'K:E356'K:E357'K; и/илиd) one or more mutations in which the repulsive charge inhibits heterodimer formation, preferably any of: K409D/D399'K, K409D/D399'R, K409E/D399'K, K409E/D399'R, K409D:K392D/D399' K:E356'K or K409D:K392D:K370D/ D399'K:E356'K:E357'K; and/or
e) одна или более мутаций, отобранных для образования гетеродимера и/или термостабильности, предпочтительно любая из:e) one or more mutations selected for heterodimer formation and/or thermal stability, preferably any of:
при этом нумерация соответствует индексу ЕС из Kabat.while the numbering corresponds to the EU index from Kabat.
Такие мутации СН3 конструируют для получения двух разных цепей Fc и НС (отличающихся по меньшей мере разной последовательностью доменов СН3), соответственно, которые предпочтительно спариваются друг с другом с получением гетеродимера цепей Fc или НС, что существенно уменьшает тенденцию к получению гомодимера НС, т.е. димера двух НС с одинаковой последовательностью.Such CH3 mutations are engineered to produce two different Fc and HC chains (distinguished by at least a different sequence of CH3 domains), respectively, which preferentially pair with each other to produce a heterodimer of the Fc or HC chains, which greatly reduces the tendency to produce an HC homodimer, i.e. e. dimer of two HCs with the same sequence.
В описании точечных мутаций СН3, описанных в настоящем документе, «косая черта» разграничивает точечные мутации на одной цепи или одном домене от точечных мутаций из другой цепи или другого домена соответствующей пары; «отступ» в нумерации положений аминокислот обозначает вторую цепь или димер гетеродимера. «Двоеточие» определяет комбинацию точечных мутаций на одной из цепей или доменов, соответственно.In the description of CH3 point mutations described herein, "slash" distinguishes point mutations on one strand or one domain from point mutations on another strand or other domain of the corresponding pair; "Indent" in the numbering of amino acid positions denotes the second strand or dimer of the heterodimer. "Colon" specifies a combination of point mutations on one of the chains or domains, respectively.
Также можно применять любую из мутаций, отобранных для образования гетеродимера и/или термостабильности, упомянутых выше, или дополнительных мутаций в соответствии с раскрытием Von Kreudenstein et al. (Landes Bioscience, vol. 5, no. 5, 2013, pp 646-654).You can also use any of the mutations selected for the formation of heterodimer and/or thermal stability mentioned above, or additional mutations in accordance with the disclosure of Von Kreudenstein et al. (Landes Bioscience, vol. 5, no. 5, 2013, pp 646-654).
Предпочтительно на одной цепи или домене конструируют мутацию (i) «выступ»; или (ii) «впадина», или (iii) мутации «выступ» и «впадина», и на другой цепи гетеродимера конструируют партнерскую мутацию (i) «впадина» или (ii) «выступ», или (iii) мутации «впадина» и «выступ».Preferably, a mutation is engineered on one strand or domain (i) a "bump"; or (ii) "trough", or (iii) "trough" and "trough" mutations, and on the other strand of the heterodimer a partner mutation is constructed (i) "trough" or (ii) "trough", or (iii) "trough" mutations ' and 'protrusion'.
В частности, пара доменов СН3, содержащая один или два модифицированных домена СН3, может содержать более одного (дополнительного) междоменного дисульфидного мостика, например, 2 или 3, соединяющих пару из двух доменов СН3.In particular, a pair of CH3 domains containing one or two modified CH3 domains may contain more than one (additional) interdomain disulfide bridge, for example 2 or 3, connecting the pair of two CH3 domains.
В частности, различные мутации (в соответствии с а) выше) конструируют в обоих доменах СН3 соответствующей пары доменов СН3 для получения когнатной (совпадающей) пары, причем один домен содержит стерическую модификацию контактной поверхности в области бета-складчатого слоя, которая предпочтительно прикреплена к соответствующей контактной поверхности другого домена за счет комплементарной стерической модификации. Такие стерические модификации в основном обусловлены различными остатками аминокислот и боковыми цепями, например, для получения структуры «выступ» или «впадина», которые комплементарны друг другу с образованием димера «выступ-во-впадину».In particular, different mutations (according to a) above) are constructed in both CH3 domains of the respective CH3 domain pair to obtain a cognate (matched) pair, with one domain containing a steric modification of the contact surface in the region of the beta-pleated layer, which is preferably attached to the corresponding contact surface of another domain due to complementary steric modification. Such steric modifications are mainly due to different amino acid residues and side chains, for example, to obtain a "trough" or "trough" structure that are complementary to each other to form a "trough-to-trough" dimer.
В соответствии с конкретным аспектом каждый из доменов СН3 в области Fc относится к типу IgG с аминокислотной последовательностью, определенной как SEQ ID 5 или функциональный вариант SEQ ID 5, который модифицирован для обмена цепей путем включения по меньшей мере одного бета-цепочечного сегмента IgA, содержащего по меньшей мере 2 аминокислоты в длину, и области Fc предпочтительно содержат когнатную пару доменов СН3 за счет спаривания сегмента IgA первого домена СН3 с сегментом IgA второго домена СН3. Такие домены СН3 после обмена цепями, в частности, могут содержать чередующиеся сегменты аминокислотных последовательностей IgA и IgG, например, могут содержать по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5 разных сегментов IgA, каждый из которых расположен в разных положениях и отделен друг от друга сегментом, отличным от сегмента IgA, например, сегментами IgG.In a specific aspect, each of the CH3 domains in the Fc region is of an IgG type with an amino acid sequence defined as
В соответствии с конкретным аспектом АВМ представляет собой компетентное по эффекторной функции антитело, содержащее сайт связывания рецептора Fc-гамма и/или сайт связывания C1q, необязательно в области Fc.In a specific aspect, an AVM is an effector function competent antibody comprising an Fc-gamma receptor binding site and/or a C1q binding site, optionally in the Fc region.
В частности, антитело характеризуется любым из таких видов активности как АЗКЦ и/или КЗЦ (CDC, комплемент-зависимая цитотоксичность).In particular, the antibody is characterized by any of the activities such as ADCC and/or CDC (CDC, complement-dependent cytotoxicity).
В соответствии с другим конкретным аспектом АВМ представляет собой отрицательное по эффекторной функции (EN) антитело, содержащее область Fc с ограниченным связыванием с рецептором Fc-гамма и/или C1q.In another specific aspect, an AVM is an effector function negative (EN) antibody containing an Fc region with limited binding to an Fc-gamma and/or C1q receptor.
В частности, антитело является дефицитным по эффекторной функции (также упоминается в настоящем документе как отрицательное по эффекторной функции) с существенно сниженным или отсутствующим связыванием с рецептором Fc-гамма или CD16а за счет области Fc.In particular, the antibody is effector function deficient (also referred to herein as effector function negative) with substantially reduced or no binding to the Fc-gamma receptor or CD16a due to the Fc region.
В частности, отрицательное по эффекторной функции антитело характеризуется последовательностью СН2 человеческого IgG2 или ее модифицированным вариантом, содержащим модифицированный домен СН2 человеческого IgG2 (F296A, N297Q), описанный в US8562986, гибридизованный с N-концом карбокси-концевого домена СН3 (нумерация в соответствии с индексом ЕС согласно Kabat).In particular, an effector-negative antibody is characterized by the CH2 sequence of human IgG2 or a modified variant thereof containing the modified human IgG2 CH2 domain (F296A, N297Q) described in US8562986 hybridized to the N-terminus of the carboxy-terminal CH3 domain (numbered according to index EU according to Kabat).
В частности, антитело EN имеет существенно сниженную или отсутствующую АЗКЦ и/или КЗЦ.In particular, the EN antibody has a significantly reduced or absent ADCC and/or CDC.
В частности, АВМ содержит часть Fc антитела, которая содержит сайт связывания FcRn в месте соединения СН2 с доменом СН3 и/или сайт связывания рецептора Fc-гамма в пределах N-концевой области домена СН2, и/или сайт связывания C1q в пределах N-концевой области домена СН2.In particular, the AVM contains an Fc portion of an antibody that contains an FcRn binding site at the junction of CH2 with the CH3 domain and/or an Fc-gamma receptor binding site within the N-terminal region of the CH2 domain, and/or a C1q binding site within the N-terminal region of the CH2 domain.
В соответствии с конкретным аспектом АВМ содержит сайт рН-зависимого связывания FcRn, расположенный в доменах СН2 и/или СН3, если таковые имеются. В частности, сайт связывания FcRn способен к рН-зависимому аффинному связыванию с FcRn с KD менее 10-4 М или менее 10-5 М, 10-6 М, 10-7 М или 10-8 М.In accordance with a specific aspect, the AVM contains a pH-dependent FcRn binding site located in the CH2 and/or CH3 domains, if any. In particular, the FcRn binding site is capable of pH-dependent affinity binding to FcRn with a K D of less than 10 -4 M or less than 10 -5 M, 10 -6 M, 10 -7 M, or 10 -8 M.
В частности, аффинность рН-зависимого связывания FcRn повышается на величину по меньшей мере 1-log, предпочтительно по меньшей мере 2-log или 3-log при рН=5-6, по сравнению с указанной аффинностью связывания при физиологическом рН (рН=7,4).In particular, the pH-dependent binding affinity of FcRn is increased by at least 1-log, preferably at least 2-log or 3-log at pH=5-6, compared to said binding affinity at physiological pH (pH=7 ,4).
В соответствии с дополнительным аспектом АВМ модифицирована для изменения рН-зависимого связывания FcRn. Например, по меньшей мере один домен СН3 модифицирован, чтобы содержать по меньшей мере одну мутацию в сайте связывания FcRn для снижения рН-зависимого связывания FcRn, в частности, по меньшей мере одну из мутаций Н433А или Н435А, или обе мутации Н433А и Н435А, причем нумерация приведена в соответствии с индексом ЕС согласно Kabat. Снижение рН-зависимого связывания FcRn может быть таким, что аффинность рН-зависимого связывания FcRn составляет менее 1-log, предпочтительно примерно сходна или меньше при рН=5-6 по сравнению с указанной аффинностью связывания при физиологическом рН (рН=7,4).According to a further aspect, the AVM is modified to alter pH dependent FcRn binding. For example, at least one CH3 domain is modified to contain at least one mutation at the FcRn binding site to reduce pH-dependent FcRn binding, in particular at least one of the H433A or H435A mutations, or both H433A and H435A mutations, wherein the numbering is in accordance with the EU index according to Kabat. The reduction in pH-dependent FcRn binding may be such that the pH-dependent FcRn binding affinity is less than 1-log, preferably about the same or less at pH=5-6 compared to said binding affinity at physiological pH (pH=7.4) .
Конкретные варианты реализации относятся к любой АВМ, приведенной в настоящем документе в качестве примера, или содержащей любую из тяжелых и легких цепей или любую из пар тяжелых и легких цепей, описанных в разделе «Примеры». В частности, АВМ, описанная в настоящем документе, может содержать или состоять из тяжелых и легких цепей, описанных в разделе «Примеры».Specific embodiments refer to any AVM given herein as an example or containing any of the heavy and light chains or any of the pairs of heavy and light chains described in the Examples section. In particular, the AVM described herein may contain or consist of the heavy and light chains described in the Examples section.
В частности, АВМ, описанная в настоящем документе, предложена для медицинского, диагностического или аналитического применения.In particular, the AVM described herein is provided for medical, diagnostic, or analytical applications.
Согласно настоящему изобретению также предложен фармацевтический препарат, содержащий АВМ, описанную в настоящем документе, предпочтительно в составе для парентерального введения или введения через слизистую оболочку, необязательно содержащий фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество.The present invention also provides a pharmaceutical preparation comprising the AVM described herein, preferably in a parenteral or transmucosal formulation, optionally containing a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
Согласно настоящему изобретению также предложена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая АВМ, описанную в настоящем документе.The present invention also provides an isolated nucleic acid encoding the AVM described herein.
Согласно настоящему изобретению также предложена кассета экспрессии или плазмида, содержащая или включающая нуклеиновую кислоту, описанную в настоящем документе, и необязательно дополнительные последовательности для экспрессии АВМ, кодируемой последовательностью нуклеиновой кислоты, такие как регуляторные последовательности.The present invention also provides an expression cassette or plasmid containing or comprising a nucleic acid as described herein and optionally additional sequences for expressing an AVM encoded by the nucleic acid sequence, such as regulatory sequences.
В частности, кассета экспрессии или плазмида содержит кодирующую последовательность для экспрессии АВМ, описанной в настоящем документе, или НС и/или LC АВМ, описанной в настоящем документе.In particular, the expression cassette or plasmid contains the coding sequence for expression of the AVM described herein or the HC and/or LC of the AVM described herein.
В соответствии с конкретным примером АВМ состоит из одной или более НС и LC, причем каждая из НС характеризуется одинаковой аминокислотной последовательностью НС, и каждая из LC характеризуется одинаковой аминокислотной последовательностью LC, и кодирующие последовательности для НС и LC применяют для получения моновалентного или гомодимерного антитела.According to a specific example, an AVM is composed of one or more HCs and LCs, each of the HCs having the same HC amino acid sequence and each of the LCs having the same LC amino acid sequence, and the coding sequences for the HC and LC are used to produce a monovalent or homodimeric antibody.
В соответствии с другим конкретным примером АВМ состоит из двух разных НС и двух разных LC, и кодирующие последовательности для двух разных НС и двух разных LC применяют для получения гетеродимерного или биспецифического антитела.According to another specific example, an AVM is composed of two different HCs and two different LCs, and the coding sequences for the two different HCs and two different LCs are used to generate a heterodimeric or bispecific antibody.
Согласно настоящему изобретению также предложена продуцирующая клетка-хозяин, содержащая по меньшей мере одну кассету экспрессии или плазмиду, содержащую одну или более молекул нуклеиновой кислоты, кодирующей АВМ, описанную в настоящем документе.The present invention also provides a production host cell comprising at least one expression cassette or plasmid containing one or more nucleic acid molecules encoding the AVM described herein.
В частности, клетка-хозяин кратковременно или стабильно экспрессирует АВМ. В соответствии с конкретными примерами клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку-хозяина, предпочтительно любую из клеток дрожжей или млекопитающих.In particular, the host cell transiently or stably expresses the AVM. According to specific examples, the host cell is a eukaryotic host cell, preferably any of a yeast or mammalian cell.
Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения АВМ, описанной в настоящем документе, в котором клетку-хозяина, описанную в настоящем документе, культивируют или поддерживают в условиях для получения указанной АВМ.The present invention also provides a method for producing the AVM described herein, wherein the host cell described herein is cultured or maintained under conditions to produce said AVM.
В частности, АВМ может быть выделена и/или очищена из супернатанта клеточной культуры. В соответствии с конкретным примером АВМ представляет собой биспецифическое полноразмерное антитело, которое является гетеродимерным и содержит две разные НС и две разные LC, и указанная АВМ имеет правильное спаривание когнатных пар HC/LC и когнатных доменов CL и СН1, соответственно, также указанная АВМ продуцируется клеткой-хозяином, причем менее 10% продуцируемых антител спарены неправильно, предпочтительно менее 5%, согласно результатам измерения методом масс-спектрометрии (LC-ESI-MS) при сравнении максимальной интенсивности пика.In particular, the AVM may be isolated and/or purified from the cell culture supernatant. According to a specific example, AVM is a bispecific full-length antibody that is heterodimeric and contains two different HCs and two different LCs, and said AVM has the correct pairing of HC/LC cognate pairs and CL and CH1 cognate domains, respectively, also said AVM is produced by the cell -host, and less than 10% of the produced antibodies are mismatched, preferably less than 5%, according to the results of the measurement by mass spectrometry (LC-ESI-MS) when comparing the maximum intensity of the peak.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
Фигура 1: Биспецифический IgG, ВхМ, был получен в результате кратковременной экспрессии в Expi293F и либо не нес мутации контактной поверхности (левая панель), либо нес мутации контактной поверхности МаВ40 (правая панель). Оба антитела дегликозилировали и исследовали с помощью LC-ESI-MS. Легкая и тяжелая цепи B10v5 показаны белым цветом, а легкая и тяжелая цепи hu225M показаны черным цветом. Относительное содержание каждого детектированного варианта спаривания цепей указано в процентах от всех детектированных полных IgG. В ВхМ дикого типа оба варианта с ошибочным спариванием в Fab детектируются в значительных количествах (каждый по 12% при сравнении максимальной интенсивности пика). Следовательно, пик правильно спаренного варианта также будет содержать вариант с ошибочным спариванием, в котором легкие цепи поменяли положения. При получении ВхМ МаВ40 продуцировался только вариант с правильным спариванием. Варианты с ошибочным спариванием устранялись благодаря модификации контактной поверхности.Figure 1: A bispecific IgG, BxM, was transiently expressed in Expi293F and either did not carry contact surface mutations (left panel) or carried MaB40 contact surface mutations (right panel). Both antibodies were deglycosylated and examined by LC-ESI-MS. The light and heavy chains of B10v5 are shown in white, and the light and heavy chains of hu225M are shown in black. The relative abundance of each strand pairing variant detected is indicated as a percentage of all total IgG detected. In wild-type VxM, both Fab mismatch variants are detected in significant amounts (12% each when comparing the maximum peak intensity). Therefore, the peak of a correctly paired variant will also contain a mismatched variant in which the light chains have changed positions. Upon receipt of BxM MaB40, only the correct mating variant was produced. Variants with erroneous pairing were eliminated due to the modification of the contact surface.
Фигура 2: Аналитическая эксклюзионная хроматография (SEC) очищенного ВхМ дикого типа и ВхМ МаВ40. Оба IgG элюируются в ожидаемое время 16,3 мин. Отрицательное влияние модификации контактной поверхности на профиль SEC не детектировалось.Figure 2: Analytical size exclusion chromatography (SEC) of purified WxM wild type and VxM MaB40. Both IgGs elute at the expected time of 16.3 minutes. No negative effect of contact surface modification on the SEC profile was detected.
Фигура 3: Биспецифический IgG ВхО был получен с помощью кратковременной экспрессии в НЕK293-6Е и либо не нес мутации контактной поверхности (ВхО дикого типа, верхняя левая панель), либо нес мутации контактной поверхности МаВ40 (ВхО МаВ40, верхняя правая панель). В Fab B10v5 были введены поддерживающие мутации, которые привели к созданию биспецифических антител ВхО МаВ5/40, ВхО МаВ21/40 и ВхО МаВ45/40 (оставшиеся нижние панели). Все антитела дегликозилировали и исследовали с помощью LC-ESI-MS. Легкая и тяжелая цепи B10v5 показаны белым цветом, а легкая и тяжелая цепи ОKТ3 показаны черным цветом. Относительное содержание каждого детектированного варианта спаривания цепи указано в процентах от всех детектированных полноразмерных IgG. В ВхО дикого типа оба варианта с ошибочным спариванием в Fab детектируются в различных количествах, что приводит к накоплению более 40% антитела с ошибочным спариванием. В ВхО МаВ40 ошибочное спаривание было значительно снижено, но все же поддавалось детектированию. ВхО, содержащий не только мутации МаВ40, но и любую из поддерживающих мутаций, проявлял улучшенное спаривание. Более 90% всех детектированных полноразмерных IgG представляли собой правильно спаренные ВхО.Figure 3: Bispecific IgG BxO was generated by transient expression in HEK293-6E and either did not carry contact surface mutations (WxO wild-type, upper left panel) or carried contact surface mutations MaB40 (BxO MaB40, upper right panel). Maintenance mutations were introduced into Fab B10v5, which led to the creation of bispecific antibodies BxO MaB5/40, BxO MaB21/40 and BxO MaB45/40 (remaining lower panels). All antibodies were deglycosylated and examined by LC-ESI-MS. The light and heavy chains of B10v5 are shown in white, and the light and heavy chains of OKT3 are shown in black. The relative abundance of each strand pairing variant detected is indicated as a percentage of all full-length IgGs detected. In wild-type VxO, both mismatched Fab variants are detected in varying amounts, resulting in an accumulation of over 40% of the mismatched antibody. In WxO MaB40, mismatch was significantly reduced, but still detectable. WxO containing not only MaB40 mutations but any of the maintenance mutations showed improved mating. More than 90% of all detected full-length IgGs were correctly paired VxOs.
Фигура 4: Аналитическая эксклюзионная хроматография очищенного ВхО дикого типа, ВхО МаВ40, ВхО МаВ5/40 и ВхО МаВ45/40. Все IgG элюируются в ожидаемое время 15,4 мин. Отрицательное влияние модификации контактной поверхности на профиль SEC не детектировалось.Figure 4: Analytical size exclusion chromatography of purified wild-type VxO, VxO MaB40, VxO MaB5/40 and VxO MaB45/40. All IgGs elute at the expected time of 15.4 minutes. No negative effect of contact surface modification on the SEC profile was detected.
Фигура 5: ПоследовательностиFigure 5: Sequences
SEQ ID 1: аминокислотная последовательность домена С-каппа человеческого IgG1SEQ ID 1: Amino acid sequence of the C-kappa domain of human IgG1
SEQID 2: аминокислотная последовательность домена С-лямбда человеческого IgG1SEQID 2: amino acid sequence of the C-lambda domain of human IgG1
SEQID 3: аминокислотная последовательность домена СН1 человеческого IgG1SEQID 3: Human IgG1 CH1 domain amino acid sequence
SEQ ID 4: аминокислотная последовательность шарнирной области человеческого IgG1SEQ ID 4: human IgG1 hinge amino acid sequence
SEQ ID 5: аминокислотная последовательность домена СН3 человеческого IgG1.SEQ ID 5: Amino acid sequence of the CH3 domain of human IgG1.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Конкретные термины, используемые в описании, имеют указанное далее значение. В настоящем документе термин «антигенсвязывающая молекула» или АВМ будет означать молекулу, содержащую связывающий домен, который представляет собой полипептид, который специфически распознает или связывается с антигеном или его эпитопом с определенной аффинностью и/или авидностью связывания. В соответствии с конкретными примерами АВМ связывающий домен представляет собой связывающую область иммуноглобулиноподобного типа, содержащую полипептид, выбранный из группы, состоящей из однодоменного антитела, одноцепочечных вариабельных доменов, фрагмента Fd, полипептида с Armadillo-повторами, фибронектинового домена типа III, домена тенасцина типа III, домена с повторяющимся мотивом анкирина, липокалина, домена Куница, Fyn-производного домена SH2, минипротеина, каркаса лектиноподобного домена С-типа, модифицированного миметика антитела и любых генетически модифицированных аналогов любого из вышеуказанных, которые сохраняют антигенсвязывающую функциональность.Specific terms used in the description have the following meaning. As used herein, the term "antigen-binding molecule" or AVM will mean a molecule containing a binding domain, which is a polypeptide that specifically recognizes or binds to an antigen or epitope thereof with a specific binding affinity and/or avidity. According to specific examples, the AVM binding domain is an immunoglobulin-like type binding region comprising a polypeptide selected from the group consisting of single domain antibody, single chain variable domains, Fd fragment, Armadillo repeat polypeptide, type III fibronectin domain, type III tenascin domain, an ankyrin repetitive motif domain, lipocalin, a Kunitz domain, a Fyn-derived SH2 domain, a miniprotein, a C-type lectin-like domain backbone, a modified antibody mimetic, and any genetically modified analogs of any of the foregoing that retain antigen-binding functionality.
Конкретные варианты реализации АВМ содержат или состоят из антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.Particular embodiments of the AVM comprise or consist of an antibody or an antigen-binding fragment thereof.
В настоящем документе термин «антитело» определяется как антигенсвязывающие полипептиды, которые представляют собой либо иммуноглобулины, либо иммуноглобулиноподобные молекулы, либо другие белки, проявляющие модульные антительные форматы, например, состоящие из одного или более доменов антител и обладающие антигенсвязывающими свойствами, сходно с иммуноглобулинами или антителами, в частности, белки, которые могут проявлять свойства моно-, би- или полиспецифического, или моно-, би- или поливалентного связывания, например, по меньшей мере два специфических сайта связывания для эпитопов, например, антигенов, эффекторных молекул или структур, в частности, происходящих из патогенов, или структуры человека, такой как аутоантигены, включая связанные с клетками или сывороточные белки. Термины «антитело» и «иммуноглобулин» используются в настоящем документе взаимозаменяемо.As used herein, the term "antibody" is defined as antigen-binding polypeptides which are either immunoglobulins or immunoglobulin-like molecules or other proteins exhibiting modular antibody formats, e.g. , in particular, proteins that can exhibit mono-, bi-, or polyspecific, or mono-, bi-, or multivalent binding properties, e.g., at least two specific binding sites for epitopes, e.g., antigens, effector molecules, or structures, in particularly those derived from pathogens, or human structures such as self-antigens, including cell-associated or serum proteins. The terms "antibody" and "immunoglobulin" are used interchangeably herein.
Антитело, как правило, состоит или содержит домены антитела, под которыми понимают константные и/или вариабельные домены тяжелых и/или легких цепей иммуноглобулинов, с одной или более линкерными последовательностями или без них. В частности, подразумевают, что антитела состоят или содержат комбинации вариабельных и/или константных доменов антитела с линкерной последовательностью или шарнирной областью или без них, включая пары вариабельных доменов антитела, такие как одна или две пары VH/VL. Под полипептидами понимают домены антитела, если они содержат структуру бета-складчатой конфигурации, состоящую из по меньшей мере двух бета-цепей доменной структуры антитела, соединенных петлевой последовательностью. Домены антитела могут иметь нативную структуру или могут быть модифицированы с помощью мутагенеза или дериватизации, например, для модификации антигенсвязывающих свойств или любого другого свойства, такого как стабильность или функциональные свойства, такие как связывание с рецепторами Fc, FcRn, и/или рецептором Fc-гамма.An antibody typically consists of or contains antibody domains, by which is meant the constant and/or variable domains of immunoglobulin heavy and/or light chains, with or without one or more linker sequences. In particular, antibodies are meant to consist of or contain combinations of antibody variable and/or constant domains with or without a linker sequence or hinge region, including pairs of antibody variable domains, such as one or two VH/VL pairs. Polypeptides are understood to be domains of an antibody if they contain a beta-fold structure consisting of at least two beta chains of the antibody domain structure connected by a loop sequence. Antibody domains may be native or may be modified by mutagenesis or derivatization, for example to modify antigen-binding properties or any other property such as stability or functional properties such as binding to Fc, FcRn, and/or Fc-gamma receptors. .
В настоящем документе термин «антитело», в частности, включает полноразмерные антитела, включая антитела иммуноглобулиноподобных структур. В частности, антитело может представлять собой полноразмерное антитело, например, антитело типа IgG (например, подтипа IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM.In this document, the term "antibody", in particular, includes full-length antibodies, including antibodies of immunoglobulin-like structures. In particular, the antibody may be a full-length antibody, for example, an IgG type antibody (eg, IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 subtype), IgA1, IgA2, IgD, IgE, or IgM.
Термин дополнительно включает любое из производных, комбинаций или гибридов антител, доменов антител или фрагментов антител.The term further includes any of antibody derivatives, combinations, or hybrids, antibody domains, or antibody fragments.
Термин «полноразмерное антитело» используется для обозначения любой молекулы антитела, содержащей область Fc или по меньшей мере большую часть Fc антитела, которая, в частности, включает димер тяжелых цепей. Термин «полноразмерное антитело» используется в настоящем документе, чтобы подчеркнуть, что конкретная молекула антитела не является фрагментом антитела.The term "full-length antibody" is used to refer to any antibody molecule containing the Fc region or at least a large part of the Fc of the antibody, which, in particular, includes a dimer of heavy chains. The term "full-length antibody" is used herein to emphasize that a particular antibody molecule is not an antibody fragment.
В соответствии с этим под антителом обычно понимают белок (или белковый комплекс), который содержит один или более полипептидов, по существу кодируемых генами иммуноглобулинов или фрагментами генов иммуноглобулинов. Общепризнанные гены иммуноглобулинов включают гены константной области каппа, лямбда, альфа, гамма, дельта, эпсилон и мю, а также гены вариабельных областей иммуноглобулинов. Легкие цепи (LC) классифицируются как каппа (включая домен VL и С-лямбда) или лямбда (включая домен VL и С-каппа). Тяжелые цепи (НС) классифицируются как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон, которые, в свою очередь, определяют классы иммуноглобулинов, IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, соответственно.Accordingly, an antibody is generally understood to mean a protein (or protein complex) that contains one or more polypeptides substantially encoded by immunoglobulin genes or immunoglobulin gene fragments. Recognized immunoglobulin genes include the kappa, lambda, alpha, gamma, delta, epsilon and mu constant region genes, as well as immunoglobulin variable region genes. Light chains (LC) are classified as kappa (including the VL domain and C-lambda) or lambda (including the VL domain and C-kappa). Heavy chains (HC) are classified as gamma, mu, alpha, delta, or epsilon, which in turn define the immunoglobulin classes, IgG, IgM, IgA, IgD, and IgE, respectively.
Каждая из НС или LC состоит из по меньшей мере двух доменов, соединенных друг с другом с получением цепи из доменов. В частности, подразумевается, что НС антитела содержит домен антитела VH и по меньшей мере один домен антитела, связанный с С-концом VH, т.е., по меньшей мере один домен антитела соединен с С-концом домена VH с помощью линкерной последовательности или без нее. LC антитела содержит домен VL антитела и по меньшей мере один домена антитела, связанный с С-концом VL, т.е., по меньшей мере один домен антитела связан с С-концом домена VL с помощью линкерной последовательности или без нее.Each of the HC or LC consists of at least two domains connected to each other to form a chain of domains. In particular, an antibody HC is meant to comprise an antibody VH domain and at least one antibody domain linked to the C-terminus of the VH, i.e., at least one antibody domain is connected to the C-terminus of the VH domain by a linker sequence, or without her. An antibody LC contains an antibody VL domain and at least one antibody domain linked to the C-terminus of the VL, i.e., at least one antibody domain linked to the C-terminus of the VL domain with or without a linker sequence.
Определение дополнительно включает домены тяжелой и легкой цепей вариабельной области (такие как dAb, Fd, V1, Vk, Vh, VHH) и константную область или отдельные домены интактного антитела, такие как CH1, СН2, СН3, СН4, CL и Сk, а также минидомены, состоящие из по меньшей мере двух бета-цепей домена антитела, соединенных структурной петлей. Как правило, антитело, имеющее антигенсвязывающий сайт за счет специфической структуры CDR, способно связывать антиген-мишень за счет петель CDR пары доменов VH/VL.The definition further includes the heavy and light chain domains of the variable region (such as dAb, Fd, V1, Vk, Vh, VHH) and the constant region or individual domains of an intact antibody, such as CH1, CH2, CH3, CH4, CL, and Ck, as well as minidomains, consisting of at least two beta chains of the antibody domain connected by a structural loop. Typically, an antibody having an antigen-binding site through a specific CDR structure is able to bind a target antigen through the CDR loops of a VH/VL domain pair.
Термин «антитело», в частности, будет включать антитела в выделенной форме, которые по существу не содержат другие антитела, направленные против разных антигенов-мишеней и/или содержащие другую структурную группировку доменов антитела. Тем не менее, выделенное антитело может содержаться в комбинированном препарате, содержащем комбинацию выделенного антитела, например, с по меньшей мере одним другим антителом, таким как моноклональные антитела или фрагменты антител, имеющие различные виды специфичности.The term "antibody", in particular, will include antibodies in isolated form, which essentially do not contain other antibodies directed against different target antigens and/or containing a different structural grouping of antibody domains. However, the isolated antibody may be contained in a combination preparation containing a combination of the isolated antibody, for example, with at least one other antibody, such as monoclonal antibodies or antibody fragments having different types of specificity.
Термин «антитело» будет применим к антителам животного происхождения, включая человека, например, млекопитающих, включая человека, мышь, кролика, козу, верблюдового, ламу, корову и лошадь, или птиц, таких как курица, этот термин, в частности, будет включать рекомбинантные антитела, которые основаны на последовательности животного происхождения, например, человеческих последовательностях.The term "antibody" will be applicable to antibodies of animal origin, including human, for example, mammals, including humans, mice, rabbits, goats, camelids, llamas, cows and horses, or birds, such as chickens, this term will specifically include recombinant antibodies that are based on sequences of animal origin, such as human sequences.
Термин «антитело», в частности, относится к человеческим антителам.The term "antibody" specifically refers to human antibodies.
Под термином «человек», используемым в отношении антитела, понимают антитела, имеющие вариабельные и константные области, происходящие из последовательностей иммуноглобулинов человеческой зародышевой линии. Человеческое антитело может включать остатки аминокислот, не кодируемые последовательностями иммуноглобулинов человеческой зародышевой линии (например, мутации, введенные с помощью случайного или сайт-специфического мутагенеза в условиях in vitro или с помощью соматической мутации в условиях in vivo), например, в CDR. Человеческие антитела включают антитела, выделенные из библиотек человеческих иммуноглобулинов или животных, трансгенных по одному или более человеческим иммуноглобулинам.The term "human" as used with respect to an antibody is understood to mean antibodies having variable and constant regions derived from human germline immunoglobulin sequences. The human antibody may include amino acid residues not encoded by human germline immunoglobulin sequences (e.g., mutations introduced by in vitro random or site-directed mutagenesis or in vivo somatic mutation), for example, in the CDR. Human antibodies include antibodies isolated from libraries of human immunoglobulins or animals transgenic for one or more human immunoglobulins.
Человеческое антитело предпочтительно выбрано или происходит из группы, состоящей из IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и IgM.The human antibody is preferably selected from or derived from the group consisting of IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 and IgM.
Мышиное антитело предпочтительно выбрано или происходит из группы, состоящей из IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG2C, IgG3 и IgM.The mouse antibody is preferably selected from or derived from the group consisting of IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG2C, IgG3 and IgM.
Термин «антитело» также применим к химерным антителам, например, химерным антителам, последовательности которых происходят из различных видов, такие как последовательности, происходящие из мыши и человека.The term "antibody" is also applicable to chimeric antibodies, for example, chimeric antibodies whose sequences are derived from different species, such as sequences derived from mice and humans.
Термин «химерный», используемый в отношении антитела, относится к тем молекулам, в которых одна часть каждой из аминокислотных последовательностей тяжелых и легких цепей гомологична соответствующим последовательностям в иммуноглобулинах, происходящих из конкретного вида или принадлежащих к конкретному классу, тогда как оставшийся сегмент цепи гомологичен соответствующим последовательностям другого вида или класса. Как правило, вариабельная область как легкой цепи, так и тяжелой цепи имитирует вариабельные области иммуноглобулинов, происходящих из одного вида млекопитающих, тогда как константные части гомологичны последовательностям иммуноглобулинов, происходящих из другого вида. Например, вариабельная область может быть получена из известных в настоящее время источников с использованием легкодоступных В-клеток или гибридом из организмов-хозяев, не относящихся к человеку, в комбинации с константными областями, полученными, например, из препаратов клеток человека.The term "chimeric" as used in relation to an antibody refers to those molecules in which one portion of each of the amino acid sequences of the heavy and light chains is homologous to the corresponding sequences in immunoglobulins derived from a particular species or belonging to a particular class, while the remaining chain segment is homologous to the corresponding sequences of another kind or class. Typically, the variable region of both the light chain and the heavy chain mimics the variable regions of immunoglobulins derived from one mammalian species, while the constant portions are homologous to immunoglobulin sequences derived from another species. For example, the variable region can be derived from currently known sources using readily available B cells or hybridomas from non-human hosts in combination with constant regions derived from, for example, human cell preparations.
Термин «антитело» также может применяться к гуманизированным антителам.The term "antibody" can also be applied to humanized antibodies.
Термин «гуманизированный», используемый в отношении антитела, относится к молекуле, имеющей антигенсвязывающий сайт, который по существу происходит из иммуноглобулина из вида, отличного от человека, причем оставшаяся иммуноглобулиновая структура молекулы основана на структуре и/или последовательности человеческого иммуноглобулина. Антигенсвязывающий сайт может содержать как полные вариабельные домены, гибридизованные на константные домены, так и только области, определяющие комплементарность (CDR), привитые на соответствующие каркасные участки в вариабельных доменах. Антигенсвязывающие сайты могут быть дикого типа или модифицированы, например, одной или более заменами аминокислот, предпочтительно модифицированы для более близкого сходства с иммуноглобулинами человека. Некоторые формы гуманизированных иммуноглобулинов сохраняют все последовательности CDR (например, гуманизированное мышиное антитело, которое содержит все шесть CDR из мышиного антитела). Другие формы имеют один или более CDR, которые изменены относительно исходного антитела.The term "humanized" as used in relation to an antibody refers to a molecule having an antigen binding site that is essentially derived from a non-human immunoglobulin, with the remaining immunoglobulin structure of the molecule based on the structure and/or sequence of the human immunoglobulin. The antigen binding site may contain both full variable domains fused to constant domains or only complementarity determining regions (CDRs) grafted onto the appropriate framework regions in the variable domains. The antigen binding sites may be wild-type or modified, for example with one or more amino acid substitutions, preferably modified to more closely resemble human immunoglobulins. Some forms of humanized immunoglobulins retain all CDR sequences (eg, a humanized mouse antibody that contains all six CDRs from a mouse antibody). Other forms have one or more CDRs that are altered from the parent antibody.
В соответствии с конкретным вариантом реализации все домены антитела, содержащиеся в АВМ, описанной в настоящем документе, происходят из человека или являются их гуманизированными или функционально активными вариантами с по меньшей мере 60% идентичностью последовательности или по меньшей мере 70%, 80%, 90% или 95% идентичностью последовательности, предпочтительно, когда источником доменов антитела является любое из антител IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM или IgE. В частности, все домены антитела происходят из одной и той же основной иммуноглобулиновой укладки цепи, несмотря на то, что форматы бета-складчатого слоя могут различаться, и соединительные петли, безусловно, могут быть вариабельными, в частности, в V-доменах.In accordance with a specific embodiment, all antibody domains contained in the AVM described herein are human-derived or humanized or functionally active variants thereof with at least 60% sequence identity, or at least 70%, 80%, 90% or 95% sequence identity, preferably when the source of the antibody domains is any of IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, or IgE antibodies. In particular, all domains of an antibody are derived from the same basic immunoglobulin fold, although the formats of the beta sheet can vary, and the connecting loops can certainly be variable, in particular in the V domains.
Термин «антитело» также применяется к моноклональным или поликлональным антителам, в частности, к рекомбинантному антителу, причем этот термин включает все антитела и структуры антитела, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют рекомбинантными способами, такие как антитела, происходящие из животных, например, млекопитающих, включая человека, которые содержат гены или последовательности различного происхождения, например, химерные, гуманизированные антитела или антитела, полученные из гибридомы. Дополнительные примеры относятся к антителам, выделенным из клетки-хозяина, трансформированной для экспрессии антитела, или к антителам, выделенным из рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител или доменов антител, или к антителам, полученным, экспрессированным, созданным или выделенным любыми другими способами, которые включают сплайсинг последовательностей генов антител с другими последовательностями ДНК.The term "antibody" is also applied to monoclonal or polyclonal antibodies, in particular to a recombinant antibody, and this term includes all antibodies and antibody structures that are produced, expressed, created or isolated by recombinant methods, such as antibodies derived from animals, for example, mammals, including humans, that contain genes or sequences of different origin, for example, chimeric, humanized, or hybridoma-derived antibodies. Additional examples refer to antibodies isolated from a host cell transformed to express the antibody, or antibodies isolated from a recombinant combinatorial library of antibodies or antibody domains, or antibodies made, expressed, generated, or isolated by any other means that involve sequence splicing. antibody genes with other DNA sequences.
Подразумевается, что термин «антитело» включает функционально активные варианты новых или существующих, например, природных антител. Также подразумевается, что термин вариант антитела, в частности, варианты антителоподобных молекул или варианты антител, также будет включать производные таких молекул.The term "antibody" is intended to include functionally active variants of new or existing, eg natural, antibodies. The term antibody variant, in particular antibody-like molecule variants or antibody variants, is also intended to include derivatives of such molecules.
Производное представляет собой любую комбинацию одного или более антител и/или гибридный белок, в котором любой домен или минидомен антитела может быть гибридизован в любом положении с одним или более другими белками, такими как другие антитела или фрагменты антител, но также с лигандами, ферментами, токсинами и т.п. АВМ или антитело, описанные в настоящем документе, в частности, можно применять в качестве выделенных полипептидов или в виде комбинации молекул, например, с помощью методик рекомбинации, гибридизации или конъюгации, с другими пептидами или полипептидами. Пептиды предпочтительно гомологичны последовательностям доменов антител и предпочтительно имеют по меньшей мере 5 аминокислот в длину, более предпочтительно по меньшей мере 10 или даже по меньшей мере 50 или 100 аминокислот в длину, и составляют по меньшей мере частично область петли домена антитела.A derivative is any combination of one or more antibodies and/or a fusion protein in which any antibody domain or mini-domain can be hybridized at any position to one or more other proteins, such as other antibodies or antibody fragments, but also to ligands, enzymes, toxins, etc. The AVM or antibody described herein can particularly be used as isolated polypeptides or as a combination of molecules, for example, by recombination, hybridization or conjugation techniques, with other peptides or polypeptides. The peptides are preferably homologous to antibody domain sequences and are preferably at least 5 amino acids in length, more preferably at least 10 or even at least 50 or 100 amino acids in length, and constitute at least part of the antibody domain loop region.
Производное антитела также может быть получено за счет объединения или связывания с другими веществами с помощью различных химических методик, таких как ковалентное связывание, электростатическое взаимодействие, образование дисульфидных связей и т.д. Другие вещества, связанные с антителами, могут представлять собой липиды, углеводы, нуклеиновые кислоты, органические и неорганические молекулы или любые их комбинации (например, ПЭГ, пролекарства или лекарственные препараты). Производное также будет содержать антитело с аналогичной аминокислотной последовательностью, но полученное полностью или частично из неприродных или химически модифицированных аминокислот.В конкретном варианте реализации антитело представляет собой производное, содержащее дополнительную метку, обеспечивающую специфическое взаимодействие с биологически приемлемым соединением. Отсутствует конкретное ограничение в отношении используемой метки, поскольку она не оказывает или имеет переносимое отрицательное влияние на связывание антитела с его мишенью. Примеры подходящих меток включают His-метку, Мус-метку, FLAG-метку, Strep-метку, кальмодулиновую метку, GST-метку, МВР-метку и S-метку. В другом конкретном варианте реализации антитело представляет собой производное, содержащее метку. В настоящем документе термин «метка» относится к детектируемому соединению или композиции, которая непосредственно или косвенно конъюгирована с антителом так, чтобы получить «меченое» антитело. Метка может быть детектируемой сама по себе, например, радиоизотопные метки или флуоресцентные метки, или, в случае ферментативной метки, может катализировать химическое изменение соединения или композиции, которые являются субстратами, которое поддается детектированию.An antibody derivative can also be made by combining or linking with other substances using various chemical techniques such as covalent bonding, electrostatic interaction, disulfide bonding, and so on. Other substances associated with antibodies may be lipids, carbohydrates, nucleic acids, organic and inorganic molecules, or any combination thereof (eg, PEGs, prodrugs, or drugs). The derivative will also contain an antibody with a similar amino acid sequence, but derived in whole or in part from non-natural or chemically modified amino acids. In a specific embodiment, the antibody is a derivative containing an additional label that provides a specific interaction with a biologically acceptable compound. There is no particular restriction on the label used as long as it does not or has a tolerable negative effect on the binding of the antibody to its target. Examples of suitable tags include His tag, Myc tag, FLAG tag, Strep tag, calmodulin tag, GST tag, MBP tag and S tag. In another specific embodiment, the antibody is a labeled derivative. As used herein, the term "label" refers to a detectable compound or composition that is directly or indirectly conjugated to an antibody so as to produce a "labeled" antibody. The label may be itself detectable, such as radioisotope labels or fluorescent labels, or, in the case of an enzymatic label, may catalyze a detectable chemical change in the compound or composition that is the substrate.
Производное антитела, например, происходит из исходного антитела или последовательности антитела, такой как исходная антигенсвязывающая (например, CDR) или каркасная (FR) последовательность, например, мутанты или варианты, полученные, например, in silico или с помощью рекомбинантного конструирования, или иными способами с помощью химической дериватизации или синтеза.An antibody derivative, for example, is derived from the parent antibody or antibody sequence, such as the original antigen-binding (e.g., CDR) or framework (FR) sequence, e.g., mutants or variants generated, for example, in silico or by recombinant engineering, or by other means by chemical derivatization or synthesis.
В настоящем документе термин «варианты», в частности, будет включать любой «мутант», «гомолог» или «производное», описанные в настоящем документе. Термин «вариант», в частности, будет включать функционально активные варианты, которые характеризуются определенной функциональностью.As used herein, the term "variants" specifically will include any "mutant", "homolog" or "derivative" described herein. The term "variant", in particular, will include functionally active options, which are characterized by a certain functionality.
Функциональность АВМ или антитела, описанных в настоящем документе, в частности, характеризуется определенным антигенсвязывающим свойством (в частности, специфичностью в отношении эпитопа) и предпочтительным спариванием доменов CL и СН1, при этом аминокислота в положении 18 в домене CL и/или аминокислота в положении 26 в домене СН1 характеризуются противоположной полярностью (нумерация приведена в соответствии с IMGT). В настоящем документе под функциональностью функциональных вариантов константных доменов антител понимают способность к спариванию с партнерским доменом антитела для получения пары доменов антитела. В частности, функциональные варианты доменов CL и СН1, описанных в настоящем документе, содержат доминантные точечные мутации для предпочтительного спаривания, причем аминокислота в положении 18 в домене CL и/или аминокислота в положении 26 в домене СН1 характеризуются противоположной полярностью («доминантные точечные мутации»; нумерация приведена в соответствии с IMGT), и необязательно дополнительные точечные мутации, которые поддерживают предпочтительное спаривание для получения димера CL/CH1, но не уменьшают вероятность спаривания.The functionality of the AVM or antibody described herein is particularly characterized by a certain antigen-binding property (particularly epitope specificity) and a preferred pairing of CL and CH1 domains, with the amino acid at position 18 in the CL domain and/or the amino acid at
Термин «вариант», в частности, будет относиться к антителам, таким как мутантные антитела или фрагменты антител, например, полученным с помощью методов мутагенеза, в частности, для удаления, обмена, введения вставок в конкретную аминокислотную последовательность антитела или область, или химической дериватизации аминокислотной последовательности, например, в константных доменах для конструирования стабильности, эффекторной функции или периода полужизни антитела, или в вариабельных доменах для улучшения антигенсвязывающих свойств, например, с помощью методик созревания аффинности, доступных в данной области техники. Можно применять любой из известных методов мутагенеза, включая точечные мутации в желаемых положениях, например, полученные с помощью методик рандомизации. В некоторых случаях положения выбраны случайным образом, например, как с любой из возможных аминокислот, так и с помощью отбора предпочтительных аминокислот для рандомизации последовательностей антител. Термин «мутагенез» относится к любой методике, общепризнанной в данной области техники, для изменения полинуклеотидной или полипептидной последовательности. Предпочтительные типы мутагенеза включают мутагенез с помощью подверженной ошибкам ПЦР, насыщающий мутагенез или другой сайт-направленный мутагенез.The term "variant" in particular will refer to antibodies, such as mutant antibodies or antibody fragments, for example, obtained using mutagenesis methods, in particular, for removal, exchange, insertion into a specific amino acid sequence of an antibody or region, or chemical derivatization amino acid sequence, for example, in constant domains to construct stability, effector function, or half-life of an antibody, or in variable domains to improve antigen-binding properties, for example, using affinity maturation techniques available in the art. You can use any of the known methods of mutagenesis, including point mutations at desired positions, for example, obtained using randomization techniques. In some cases, positions are randomly selected, for example, either with any of the possible amino acids or by selecting preferred amino acids to randomize antibody sequences. The term "mutagenesis" refers to any technique generally recognized in the art for altering a polynucleotide or polypeptide sequence. Preferred types of mutagenesis include error-prone PCR mutagenesis, saturation mutagenesis, or other site-directed mutagenesis.
В настоящем документе термин «функциональные варианты», также упоминаемые как «функционально активный вариант», например, может включать последовательность, полученную в результате модификации исходной последовательности (например, из исходного антитела) путем вставки, делеции или замены одной или более аминокислот или химической дериватизации одного или более остатков аминокислот в аминокислотной последовательности или нуклеотидов в нуклеотидной последовательности или на одном или обоих дистальных концах последовательности, например, в последовательности CDR или FR, причем такая модификация не влияет на активность этой последовательности, в частности, не нарушает ее. В случае если связывающий сайт обладает специфичностью в отношении выбранного антигена-мишени, функционально активный вариант антитела все еще будет иметь заранее определенную специфичность связывания, несмотря на то, что она может быть изменена, например, чтобы изменить тонкую специфичность в отношении конкретного эпитопа, аффинность, авидность, Коn или Koff скорости реакции и т.д. Например, под антителом с созревшей аффинностью, в частности, понимают функционально активный вариант антитела.As used herein, the term "functional variants", also referred to as "functionally active variant", for example, may include a sequence obtained by modification of the original sequence (for example, from the original antibody) by insertion, deletion or substitution of one or more amino acids or chemical derivatization one or more amino acid residues in an amino acid sequence or nucleotides in a nucleotide sequence or at one or both distal ends of the sequence, for example, in the CDR or FR sequence, and such a modification does not affect the activity of this sequence, in particular, does not violate it. In case the binding site has specificity for the selected target antigen, the functionally active variant of the antibody will still have a predetermined binding specificity, although it can be changed, for example, to change the fine specificity for a particular epitope, affinity, avidity, Kon or Koff of the reaction rate, etc. For example, an affinity matured antibody specifically refers to a functionally active variant of an antibody.
Следовательно, под модифицированной последовательностью CDR в антителе с созревшей аффинностью понимают функционально активный вариант.Therefore, a modified CDR sequence in an affinity matured antibody is understood to mean a functionally active variant.
Функциональную активность предпочтительно определяют на основании структуры и функции варианта по сравнению с исходной молекулой, например, в количественном исследовании для определения специфичности связывания антигена-мишени и/или требуемого периода полужизни молекулы в условиях in vivo и/или связывания FcRn рН-зависимым способом, например, определенных в стандартном количественном исследовании путем измерения функциональности антитела.Functional activity is preferably determined based on the structure and function of the variant compared to the parent molecule, e.g. in a quantitative assay to determine the binding specificity of the target antigen and/or the required in vivo half-life of the molecule and/or FcRn binding in a pH dependent manner, e.g. determined in a standard quantitative study by measuring the functionality of the antibody.
Функциональную активность антитела в отношении связывания антигена, как правило, определяют в иммуноферментном анализе (ИФА), количественном исследовании BIAcore, количественном исследовании Octet ВLI или количественном исследовании на основе флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS), когда антиген экспрессируется на поверхности клетки.Antigen-binding functional activity of an antibody is typically determined in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), BIAcore assay, Octet BLI assay, or fluorescence-activated cell sorting (FACS) assay when the antigen is expressed on the cell surface.
Функционально активные варианты могут быть получены, например, путем изменения последовательности исходного антитела, например, моноклонального антитела, имеющего специфическую нативную структуру антитела, такую как структура IgG1, для получения варианта, обладающего аналогичной специфичностью при распознавании антигена-мишени, но имеющего структуру, которая отличается от исходной структуры, например, для модификации любого из доменов антитела, чтобы ввести специфические мутации, для получения биспецифических конструкций или для получения фрагмента исходной молекулы.Functionally active variants can be generated, for example, by altering the sequence of the parent antibody, e.g., a monoclonal antibody, having a specific native antibody structure, such as an IgG1 structure, to produce a variant that has similar specificity in recognizing the target antigen, but has a structure that is different. from the original structure, for example, to modify any of the antibody domains to introduce specific mutations, to obtain bispecific constructs, or to obtain a fragment of the original molecule.
Как правило, исходное антитело или последовательность могут быть модифицированы для получения вариантов, которые включают мутации в пределах области последовательности, отличной от антигенсвязывающего сайта, или в пределах сайта связывания, что не нарушает связывание антигена, и предпочтительно будут иметь биологическую активность, сходную с таковой исходного антитела, включая способность связывать антиген, например, с по существу сходной биологической активностью, определенной с помощью количественного исследования специфического связывания или функционального теста для нацеливания на антиген.In general, the parent antibody or sequence can be modified to produce variants that include mutations within a region of the sequence other than the antigen-binding site, or within the binding site that does not interfere with antigen binding, and will preferably have biological activity similar to that of the original antibodies, including the ability to bind an antigen, for example, with substantially similar biological activity, as determined by a quantitative specific binding assay or a functional antigen targeting assay.
В настоящем документе термин «по существу сходная биологическая активность» относится к активности, о которой свидетельствует по существу сходная активность, составляющая по меньшей мере 20%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 90%, например, по меньшей мере 100% или по меньшей мере 125%, или по меньшей мере 150%, или по меньшей мере 175%, или, например, до 200% от активности, определенной для сопоставимого или исходного антитела.As used herein, the term "substantially similar biological activity" refers to an activity that is evidenced by a substantially similar activity of at least 20%, at least 50%, at least 75%, at least 90%, for example, at least 100%, or at least 125%, or at least 150%, or at least 175%, or, for example, up to 200% of the activity determined for a comparable or parent antibody.
Предпочтительные варианты, описанные в настоящем документе, являются функционально активными в отношении связывания антигена, предпочтительно способны специфически связывать отдельный антиген и не связываются значительно с другими антигенами, которые не являются антигенами-мишенями, например, с разницей значений Kd по меньшей мере 2-log, желательно по меньшей мере 3-log. Связывание антигена функционально активным вариантом, как правило, не нарушается, что соответствует по существу сходной аффинности связывания, как и у исходного антитела или последовательности, или антитела, содержащего вариант последовательности, например, с разницей значений Kd менее 2-log, предпочтительно менее 3-log, однако с возможностью даже улучшенной аффинности, например, с разницей значений Kd по меньшей мере 1-log, предпочтительно по меньшей мере 2-log.Preferred variants described herein are functionally active in relation to antigen binding, preferably capable of specifically binding to a single antigen, and do not significantly bind to other antigens that are not target antigens, for example, with a difference in Kd values of at least 2-log, preferably at least 3-log. Antigen binding by the functional variant is generally unaffected, corresponding to substantially similar binding affinity as the parent antibody or sequence, or an antibody containing the sequence variant, e.g., with a Kd difference of less than 2-log, preferably less than 3- log, however with the possibility of even improved affinity, for example with a difference in Kd values of at least 1-log, preferably at least 2-log.
В предпочтительном варианте реализации функционально активный вариант исходного антитела:In a preferred embodiment, a functionally active variant of the parent antibody:
a) представляет собой биологически активный фрагмент антитела, причем фрагмент содержит по меньшей мере 50% последовательности молекулы, предпочтительно по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 97%, 98% или 99%;a) is a biologically active fragment of an antibody, the fragment containing at least 50% of the sequence of the molecule, preferably at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, or at least 95% and most preferably at least 97%, 98% or 99%;
b) происходит из антитела в результате по меньшей мере одной замены, добавления и/или делеции аминокислоты, причем последовательность функционально активного варианта идентична последовательности молекулы или ее части, такой как антитело, по меньшей мере на 50%, предпочтительно по меньшей мере на 60%, более предпочтительно по меньшей мере на 70%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 97%, 98% или 99%; и/илиb) is derived from an antibody by at least one amino acid substitution, addition and/or deletion, wherein the sequence of the functionally active variant is at least 50%, preferably at least 60% identical to the sequence of a molecule or part thereof, such as an antibody , more preferably at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, even more preferably at least 95% and most preferably at least 97%, 98% or 99%; and/or
c) состоит из антитела или его функционально активного варианта и дополнительно по меньшей мере одной аминокислоты или нуклеотида, гетерологичных по отношению к полипептиду или нуклеотидной последовательности.c) consists of an antibody or a functionally active variant thereof and additionally at least one amino acid or nucleotide that is heterologous with respect to the polypeptide or nucleotide sequence.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения функционально активный вариант АВМ или антитела, описанных в настоящем документе, по существу идентичен варианту, описанному выше, но отличается от его полипептида или кодирующей нуклеотидной последовательности, соответственно, тем, что он происходит из гомологичной последовательности другого вида. Такие варианты или аналоги называются природными.According to one embodiment of the present invention, a functionally active variant of the AVM or antibody described herein is essentially identical to the variant described above, but differs from its polypeptide or coding nucleotide sequence, respectively, in that it is derived from a homologous sequence of another species. Such variants or analogues are called natural.
Термин «функционально активный вариант» также включает природные аллельные варианты, а также мутанты или любые другие неприродные варианты. Как известно в данной области техники, аллельный вариант представляет собой альтернативную форму (поли)пептида, которая характеризуется тем, что содержит замену, делецию или добавление одной или более аминокислот, которые по существу не изменяют биологическую функцию полипептида.The term "functionally active variant" also includes natural allelic variants, as well as mutants or any other non-natural variants. As known in the art, an allelic variant is an alternative form of a (poly)peptide that is characterized by containing a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids that does not substantially alter the biological function of the polypeptide.
Функционально активные варианты могут быть получены путем изменений последовательности в полипептиде или нуклеотидной последовательности, например, с помощью одной или более точечных мутаций, причем изменения последовательности сохраняют или улучшают функцию неизмененного полипептида или нуклеотидной последовательности при применении, описанном в настоящем документе. Такие изменения последовательности могут включать, но не ограничиваются этим, (консервативные) замены, добавления, делеции, мутации и вставки.Functionally active variants can be obtained by sequence changes in the polypeptide or nucleotide sequence, for example, using one or more point mutations, and the sequence changes retain or improve the function of the unchanged polypeptide or nucleotide sequence when used as described herein. Such sequence changes may include, but are not limited to, (conservative) substitutions, additions, deletions, mutations, and insertions.
Конкретными функционально активными вариантами являются варианты CDR. Вариант CDR включает аминокислотную последовательность, модифицированную по меньшей мере одной аминокислотой в области CDR, при этом указанная модификация может представлять собой химическое или частичное изменение аминокислотной последовательности, причем эта модификация позволяет варианту сохранять биологические характеристики немодифицированной последовательности. Частичное изменение аминокислотной последовательности CDR может происходить за счет делеции или замены одной или более аминокислот, например, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот, или за счет добавления или вставки одной или более аминокислот, например, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот, или за счет химической дериватизации одной или более аминокислот, например, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот, или их комбинации. Замены аминокислотных остатков могут представлять собой консервативные замены, например, замену одной гидрофобной аминокислоты альтернативной гидрофобной аминокислотой.Particular functionally active variants are CDR variants. The CDR variant includes an amino acid sequence modified with at least one amino acid in the CDR region, said modification being a chemical or partial amino acid sequence change, the modification allowing the variant to retain the biological characteristics of the unmodified sequence. A partial change in the amino acid sequence of a CDR may be by deletion or substitution of one or more amino acids, such as 1, 2, 3, 4, or 5 amino acids, or by the addition or insertion of one or more amino acids, such as 1, 2, 3, 4 or 5 amino acids, or by chemical derivatization of one or more amino acids, for example 1, 2, 3, 4 or 5 amino acids, or combinations thereof. Substitutions of amino acid residues can be conservative substitutions, for example, the replacement of one hydrophobic amino acid with an alternative hydrophobic amino acid.
Консервативные замены представляют собой замены, которые происходят в пределах семейства аминокислот, которые имеют сходные боковые цепи и химические свойства. Примерами таких семейств являются аминокислоты с основными боковыми цепями, с кислыми боковыми цепями, с неполярными алифатическими боковыми цепями, с неполярными ароматическими боковыми цепями, с незаряженными полярными боковыми цепями, с небольшими боковыми цепями, с большими боковыми цепями и т.д.Conservative substitutions are substitutions that occur within a family of amino acids that have similar side chains and chemical properties. Examples of such families are amino acids with basic side chains, with acidic side chains, with non-polar aliphatic side chains, with non-polar aromatic side chains, with uncharged polar side chains, with small side chains, with large side chains, etc.
Под точечной мутацией, в частности, понимают модификацию полинуклеотида, что приводит к экспрессии аминокислотной последовательности, которая отличается от немодифицированной аминокислотной последовательности заменой или обменом, делецией или вставкой одной или более отдельных (не последовательных) или дуплетных аминокислот для разных аминокислот.By point mutation, in particular, is understood the modification of a polynucleotide, which leads to the expression of an amino acid sequence that differs from the unmodified amino acid sequence by substitution or exchange, deletion or insertion of one or more single (non-consecutive) or doublet amino acids for different amino acids.
В соответствии с определенным аспектом точечные мутации домена CL и СН1, описанные в настоящем документе для предпочтительного спаривания доменов антитела CL и СН1, изменяют полярность остатков аминокислот в положении 18 в домене CL и/или аминокислоты в положении 26 в домене СН1 на противоположную полярность, при этом нумерация приведена в соответствии с IMGT. Конкретные варианты реализации относятся к следующему:In a certain aspect, the CL and CH1 domain point mutations described herein for preferential pairing of the CL and CH1 antibody domains reverse the polarity of the amino acid residues at position 18 in the CL domain and/or the amino acid at
a) если остаток аминокислоты в положении 18 в домене CL имеет положительную полярность, остаток аминокислоты в положении 26 в домене СН1 имеет отрицательную полярность; илиa) if the amino acid residue at position 18 in the CL domain has positive polarity, the amino acid residue at
b) если остаток аминокислоты в положении 18 в домене CL имеет отрицательную полярность, остаток аминокислоты в положении 26 в домене СН1 имеет положительную полярность.b) if the amino acid residue at position 18 in the CL domain has negative polarity, the amino acid residue at
В настоящем документе точечные мутации, описанные выше, называются «доминантными» точечными мутациями, поскольку с помощью таких точечных мутаций противоположной полярности в указанных положениях могут быть получены АВМ или антитела, которые характеризуются предпочтительным спариванием доменов CL и СН1, несущих такие точечные мутации, даже если в доменах CL или СН1 или в любом из соседних доменов VL или VH отсутствуют дополнительные точечные мутации.In this document, the point mutations described above are referred to as "dominant" point mutations, since such point mutations of opposite polarity at the indicated positions can produce AVMs or antibodies that have a preferential pairing of the CL and CH1 domains carrying such point mutations, even if there are no additional point mutations in the CL or CH1 domains or in any of the adjacent VL or VH domains.
Помимо доминантных точечных мутаций могут присутствовать дополнительные точечные мутации, которые даже улучшают предпочтительное спаривание LC и НС, например, точечные мутации, которые называются в настоящем документе «поддерживающими» точечными мутациями. Такие поддерживающие точечные мутации могут быть сконструированы в любом из доменов CL и/или партнерском домене СН1 или в домене VL и/или партнерском домене VH. Примерные поддерживающие точечные мутации включают следующие: точечная мутация F7X в домене CL, где X представляет собой любой из S, А или V; и точечная мутация A20L в партнерском домене СН1, причем нумерация приведена в соответствии с FMGT. Как правило, поддерживающие точечные мутации представляют собой консервативные точечные мутации, характеризующиеся заменой остатков аминокислот, причем такая замена не изменяет полярность остатков аминокислот.In addition to dominant point mutations, additional point mutations may be present that even improve the preferred pairing of LC and HC, such as point mutations that are referred to herein as "maintenance" point mutations. Such maintenance point mutations can be engineered in any of the CL domains and/or partner CH1 domain or in the VL domain and/or partner VH domain. Exemplary maintenance point mutations include the following: F7X point mutation in the CL domain, where X is any of S, A, or V; and an A20L point mutation in the CH1 partner domain, numbering according to the FMGT. In general, maintenance point mutations are conservative point mutations characterized by substitution of amino acid residues, such substitution does not change the polarity of the amino acid residues.
Варианты АВМ или антитела, описанных в настоящем документе, могут включать точечные мутации, которые относятся к обмену аминокислот с одинаковой полярностью и/или зарядом. В связи с этим аминокислоты относятся к 20 природным аминокислотам, кодируемым шестьюдесятью четырьмя триплетными кодонами. Эти 20 аминокислот можно разделить на те, которые имеют нейтральные заряды, положительные заряды и отрицательные заряды:Variants of the AVM or antibody described herein may include point mutations that refer to the exchange of amino acids with the same polarity and/or charge. In this regard, amino acids refer to the 20 natural amino acids encoded by sixty-four triplet codons. These 20 amino acids can be divided into those that have neutral charges, positive charges, and negative charges:
20 природных аминокислот представлены в таблице ниже вместе с соответствующим им трехбуквенным и однобуквенным кодом и полярностью:The 20 naturally occurring amino acids are listed in the table below, along with their respective three-letter and single-letter codes and polarities:
«Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности» по отношению к полипептидным последовательностям определяется как процент остатков аминокислот в последовательности-кандидате, которые идентичны остаткам аминокислот в конкретной полипептидной последовательности после выравнивания последовательности и введения пробелов, при необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательности и без учета каких-либо консервативных замен как части идентичности последовательности. Специалисты в данной области техники смогут определить соответствующие параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей."Percentage (%) Amino Acid Sequence Identity" in relation to polypeptide sequences is defined as the percentage of amino acid residues in a candidate sequence that are identical to amino acid residues in a particular polypeptide sequence after sequence alignment and gaps, if necessary, to achieve the maximum percent sequence identity and without taking into account any conservative substitutions as part of the sequence identity. Those skilled in the art will be able to determine the appropriate parameters for measuring alignment, including any algorithms necessary to achieve maximum alignment over the entire length of the compared sequences.
В частности, подразумевается, что АВМ или вариант антитела включают гомологи, аналоги, фрагменты, модификации или варианты с конкретным профилем гликозилирования, например, полученным с помощью гликоконструирования, которые являются функциональными и могут служить в качестве функциональных эквивалентов, например, связывание с конкретными мишенями и наличие функциональных свойств. АВМ или антитело могут быть гликозилированными или негликозилированными. Например, рекомбинантная АВМ или антитело, описанные в настоящем документе, могут быть экспрессированы в подходящей клетке млекопитающего, чтобы обеспечить специфическое гликозилирование молекулы, определяемое клеткой-хозяином, экспрессирующей антитело.In particular, an AVM or antibody variant is intended to include homologues, analogs, fragments, modifications, or variants with a specific glycosylation profile, e.g., obtained by glycoconstruction, that are functional and can serve as functional equivalents, e.g., binding to specific targets and the presence of functional properties. The AVM or antibody may be glycosylated or non-glycosylated. For example, a recombinant AVM or an antibody described herein can be expressed in a suitable mammalian cell to provide specific glycosylation of the molecule as determined by the host cell expressing the antibody.
В настоящем документе термин «бета-складчатый слой» или «бета-цепь» домена антитела, в частности, константного домена антитела, такого как домен CL или СН1, понимают следующим образом. Домен антитела, как правило, состоит из по меньшей мере двух бета-цепей, соединенных латерально по меньшей мере двумя или тремя водородными связями остова, образуя в основном скрученный складчатый лист. Бета-цепь представляет собой отдельный непрерывный участок аминокислот, как правило, длиной от 3 до 10 аминокислот, принимающий такую удлиненную конформацию и участвующий в образовании водородных связей остова с по меньшей мере одной другой цепью так, что они образуют бета-складчатый слой. В бета-слое большинство бета-цепей расположены рядом с другими цепями и образуют обширную сеть водородных связей со своими соседями, в которой группы N-H в остове одной цепи образуют водородные связи с группами С=O в остове соседних цепей.As used herein, the term "beta sheet" or "beta chain" of an antibody domain, in particular an antibody constant domain such as a CL or CH1 domain, is understood as follows. An antibody domain typically consists of at least two beta chains linked laterally by at least two or three backbone hydrogen bonds, forming a generally coiled folded sheet. The beta chain is a single, contiguous stretch of amino acids, typically 3 to 10 amino acids in length, adopting this elongated conformation and engaging in hydrogen bonding of the backbone with at least one other chain such that they form a beta sheet. In the beta layer, most beta chains are located next to other chains and form an extensive network of hydrogen bonds with their neighbors, in which the N-H groups in the backbone of one chain form hydrogen bonds with the C=O groups in the backbone of neighboring chains.
Структура константных доменов антител, таких как домены CL или СН1, сходна со структурой вариабельных доменов, состоящих из бета-цепей, соединенных петлями, некоторые из которых содержат короткие альфа-спиральные участки. Каркас в основном является жестким, но петли сравнительно более гибкие, о чем свидетельствуют b-факторы различных кристаллических структур Fc. Домен антитела CL или СН1, как правило, имеет семь бета-цепей, образующих бета-складчатый слой (A-B-C-D-E-F-G), причем бета-цепи соединены за счет петель, при этом три петли расположены в N-концевой части домена (А-В, C-D, E-F), и другие три петли расположены в N-концевой части домена (В-С, D-E, F-G). «Область петли» домена относится к части белка, расположенной между областями бета-цепей (например, каждый из доменов CL или СН1 содержит семь бета-складчатых слоев, от А до G, ориентированных от N- к С-концу).The structure of the constant domains of antibodies, such as the CL or CH1 domains, is similar to the structure of the variable domains, consisting of beta chains connected by loops, some of which contain short alpha helical regions. The framework is generally rigid, but the loops are comparatively more flexible, as evidenced by the b-factors of the various Fc crystal structures. A CL or CH1 antibody domain typically has seven beta chains forming a beta sheet (A-B-C-D-E-F-G), with the beta chains connected by loops, with three loops located at the N-terminal portion of the domain (A-B, C-D , E-F), and the other three loops are located in the N-terminal part of the domain (B-C, D-E, F-G). The "loop region" of a domain refers to the portion of the protein located between the regions of the beta chains (for example, each of the CL or CH1 domains contains seven beta-sheets, from A to G, oriented from the N- to the C-terminus).
Предпочтительно пара доменов антитела, такая как пара доменов CL и СН1, образует (гетеро)димер за счет соединения связывающей поверхности, включая цепи А, В и/или Е, каждого из доменов (называемой в настоящем документе связывающей контактной поверхностью). Димер (обозначенный CL/CH1) образуется за счет такого контакта области бета-складчатого слоя домена CL с областью бета-складчатого слоя домена СН1.Preferably, an antibody domain pair, such as a CL and CH1 domain pair, forms a (hetero)dimer by joining the binding surface, including the A, B and/or E chains, of each of the domains (herein referred to as the binding contact surface). A dimer (designated CL/CH1) is formed by such contact of the beta sheet region of the CL domain with the beta sheet region of the CH1 domain.
В частности, домены CL и СН1, описанные в настоящем документе, содержат или состоят из аминокислотной последовательности человеческого антитела IgG1.In particular, the CL and CH1 domains described herein comprise or consist of the amino acid sequence of a human IgG1 antibody.
В частности, домен С-каппа характеризуется аминокислотной последовательностью, определенной как SEQ ID 1, или ее функциональным вариантом, например, с определенной идентичностью последовательности.In particular, the C-kappa domain is characterized by an amino acid sequence defined as
В частности, домен С-лямбда характеризуется аминокислотной последовательностью, определенной как SEQ ID 2, или ее функциональным вариантом, например, с определенной идентичностью последовательности.In particular, the C-lambda domain is characterized by an amino acid sequence defined as
В частности, домен СН1 характеризуется аминокислотной последовательностью, определенной как SEQ ID 3, или ее функциональным вариантом, например, с определенной идентичностью последовательности.In particular, the CH1 domain is characterized by an amino acid sequence defined as
Согласно другому варианту домены антитела CL и СН1, описанные в настоящем документе, содержат или состоят из аминокислотной последовательности любого из человеческого IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, IgD или их функционального варианта, например, с определенной идентичностью последовательности.In another embodiment, the CL and CH1 antibody domains described herein comprise or consist of the amino acid sequence of any of human IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, IgD, or a functional variant thereof, e.g., with a specific sequence identity.
Под частью Fv антитела, как правило, понимают пару доменов VL и VH, которая образует (гетеро)димер за счет соединения связывающей поверхности, включая цепи С, С и F, каждого из доменов (связывающая контактная поверхность). Димер (обозначенный VL/VH) образуется за счет такого контакта области бета-складчатых слоев домена VL с областью бета-слоев домена VH.The Fv portion of an antibody is generally understood to mean a pair of VL and VH domains that forms a (hetero)dimer by joining the binding surface, including the C, C and F chains, of each of the domains (the binding interface). A dimer (denoted VL/VH) is formed by such contact of the beta sheet region of the VL domain with the beta sheet region of the VH domain.
В настоящем документе под плечом Fab понимают пару первой и второй цепей антитела, причем первая цепь содержит или состоит из домена VL и домена CL, который соединен с С-концом домена VL (легкой цепи, LC), и вторая цепь содержит или состоит из домена VH и домена СН1, который соединен с С-концом домена VH (тяжелая цепь, НС), при этом VL соединяется с VH (спаривается) за счет связывающей поверхности, и CL соединяется с СН1 (спаривается) за счет связывающей поверхности с получением (гетеро)димера LC и НС (также обозначенного LC/HC).As used herein, a Fab arm refers to a pair of first and second chains of an antibody, wherein the first chain contains or consists of a VL domain and a CL domain that is connected to the C-terminus of the VL (light chain, LC) domain, and the second chain contains or consists of a VH and a CH1 domain that is connected to the C-terminus of the VH (heavy chain, HC) domain, whereby VL is connected to VH (paired) by the binding surface, and CL is connected to CH1 (paired) by the binding surface to obtain (hetero ) dimer of LC and HC (also designated LC/HC).
В настоящем документе под частью Fc антитела понимают пару цепей антитела, каждая из которых содержит домен СН2 и домен СН3, который соединен с С-концом домена СН2 (цепи Fc), причем домены СН2 каждой из цепей антитела соединяются друг с другом за счет связывающей поверхности, включая цепи А, В и/или Е, каждого из доменов СН2 (связывающая контактная поверхность), и при этом домены СН3 каждой из цепей антитела соединяются (спариваются) друг с другом за счет связывающей поверхности, включая цепи А, В и/или Е, каждого из доменов СН3 (связывающая контактная поверхность) с получением (гомо)димера цепей Fc. Описанная в настоящем документе часть Fc может быть получена из IgG, IgA, IgD, IgE или IgM.In this document, the Fc part of an antibody is understood to mean a pair of antibody chains, each of which contains a CH2 domain and a CH3 domain, which is connected to the C-terminus of the CH2 domain (Fc chains), and the CH2 domains of each of the antibody chains are connected to each other due to the binding surface , including chains A, B and / or E, each of the CH2 domains (binding contact surface), and while the CH3 domains of each of the chains of the antibody are connected (paired) with each other due to the binding surface, including chains A, B and / or E, each of the CH3 domains (binding contact surface) to obtain a (homo)dimer of Fc chains. The Fc portion described herein can be derived from IgG, IgA, IgD, IgE, or IgM.
Согласно одному варианту реализации, описанному в настоящем документе, часть Fc содержит мутантные домены СН3, например, в которых по меньшей мере часть одной или более бета-цепей заменена гетерологичными последовательностями так, чтобы включить одну или более точечных мутаций, или мутаций типа «выступ» или «впадина». В этом случае область Fc содержит гетеродимер из цепей Fc, характеризующийся соединением двух разных доменов СН3.In one embodiment described herein, the Fc portion contains mutant CH3 domains, e.g., in which at least a portion of one or more beta chains are replaced with heterologous sequences so as to include one or more point, or "bump" mutations. or "trough". In this case, the Fc region contains a heterodimer of Fc chains characterized by the joining of two different CH3 domains.
Конкретные мутации типа «выступ» представляют собой одну или более аминокислотных замен для увеличения контактной поверхности между двумя доменами путем включения одной или более аминокислот, которые обеспечивают дополнительную выпуклость структуры бета-цепи, например, одну или более мутаций типа «выступ» СН3, выбранных из группы, состоящий из T366Y, T366W, T394W, F405A. Конкретная модификация типа «выступ» обозначает мутацию T366W в домене антитела СН3 (нумерация в соответствии с индексом ЕС согласно Kabat). Мутации типа «выступ», в частности, обеспечивают совпадающую (когнатную) поверхность для связывания другого домена антитела, например, который модифицирован для включения мутаций типа «впадина».Particular overhang mutations are one or more amino acid substitutions to increase the contact surface between two domains by including one or more amino acids that provide additional bulge to the beta chain structure, e.g., one or more CH3 overhang mutations selected from group consisting of T366Y, T366W, T394W, F405A. A particular "protrusion" modification refers to the T366W mutation in the domain of the CH3 antibody (numbered according to Kabat's EU index). In particular, bump type mutations provide a matching (cognate) surface for binding another antibody domain, for example, which is modified to include pit type mutations.
Конкретные мутации типа «впадина» представляют собой одну или более аминокислотных замен для увеличения контактной поверхности между двумя доменами путем включения одной или более аминокислот, которые обеспечивают дополнительную полость структуры бета-цепи, например, одну или более мутаций типа «впадина» СН3, выбранных из группы, состоящей из T366S, L368A и Y407V. Конкретная модификация типа «впадина» обозначает любую из мутаций T366S, L368A, Y407V, Y407T в домене СН3 антитела (нумерация в соответствии с индексом ЕС согласно Kabat). Мутации типа «впадина», в частности, обеспечивают совпадающую (когнатную) поверхность для связывания другого домена антитела, например, который модифицирован для включения мутаций типа «выступ».Specific pocket mutations are one or more amino acid substitutions to increase the contact surface between two domains by including one or more amino acids that provide an additional cavity in the beta chain structure, e.g., one or more CH3 pocket mutations selected from group consisting of T366S, L368A and Y407V. A specific dimple modification refers to any of the mutations T366S, L368A, Y407V, Y407T in the CH3 domain of an antibody (numbered according to Kabat's EU index). Cavity mutations in particular provide a matching (cognate) surface for binding another antibody domain, for example, which is modified to include bump mutations.
Совпадающие мутации типа «выступ-во-впадину» представляют собой, например, T366Y на одном домене СН3 и совпадающую Y407'T на втором домене СН3 пары доменов СН3, называемые в настоящем документе T366Y/Y407'T. Другие совпадающие мутации представляют собойTab-to-pit matched mutations are, for example, T366Y on one CH3 domain and Y407'T on the second CH3 domain of the CH3 domain pair, referred to herein as T366Y/Y407'T. Other matching mutations are
Конкретные мутации СН3 включают межмолекулярную перестановку бета-цепей, например, когда один или более сегментов или последовательностей в пределах бета-цепи СН3 мутируют для включения сегментов или последовательностей из доменов антител, которые отличаются от исходного домена СН3, например, доменов антител другого типа или подтипа. Специфических мутантов получают с помощью обмена цепями, причем домен СН3 типа IgG включает один или более сегментов или последовательностей домена СН3 типа IgA. Если два домена СН3 после обмена цепями подвергают мутагенезу с образованием когнатной пары, сегменты или последовательности IgA каждого из доменов СН3 образуют междоменную контактную поверхность, которая является когнатной, так, что мутированные домены СН3 преимущественно спариваются друг с другом, в сравнении с доменом СН3 дикого типа. Конкретными примерами таких модификаций доменов антител для включения перестановки сегментов могут быть домены, сконструированные с помощью технологии обмена цепями (SEED). Такие модификации можно применять для получения асимметричных или биспецифических антител путем предпочтительного спаривания SEED-модифицированных доменов СН3 тяжелых цепей. Этот способ основан на обмене структурно родственных последовательностей в пределах консервативных доменов СН3. Чередующиеся последовательности из человеческих IgA и IgG в доменах SEED-CH3 образуют два асимметричных, но комплементарных домена, обозначенных AG и GA. Дизайн с помощью SEED позволяет эффективно получать гетеродимеры AG/GA, в то же время препятствует гомодимеризации доменов AG и GA SEED-CH3.Specific CH3 mutations include intermolecular permutation of the beta chains, for example, where one or more segments or sequences within the beta chain of CH3 are mutated to include segments or sequences from antibody domains that differ from the original CH3 domain, for example, antibody domains of a different type or subtype . Specific mutants are generated by chain exchange, wherein the IgG CH3 domain includes one or more IgA CH3 domain segments or sequences. If two CH3 domains are mutated to form a cognate pair after chain exchange, the IgA segments or sequences of each of the CH3 domains form an interdomain contact surface that is cognate such that the mutated CH3 domains preferentially pair with each other as compared to the wild-type CH3 domain. . Specific examples of such modifications of antibody domains to include segment shuffling may be domains designed using chain exchange technology (SEED). Such modifications can be used to generate asymmetric or bispecific antibodies by preferentially pairing SEED-modified heavy chain CH3 domains. This method is based on the exchange of structurally related sequences within conserved CH3 domains. The alternating sequences from human IgA and IgG in the SEED-CH3 domains form two asymmetric but complementary domains, designated AG and GA. SEED-assisted design allows efficient production of AG/GA heterodimers while preventing homodimerization of AG and GA domains of SEED-CH3.
Соединение доменов антител или LC/HC, или цепей Fc может дополнительно поддерживаться с помощью внутридоменных или междоменных дисульфидных мостиков. Дисульфидные связи обычно образуются в результате окисления тиольных групп двух цистеинов, что соединяет S-атомы с образованием дисульфидного мостика между двумя остатками цистеина.Connection of antibody or LC/HC domains or Fc chains can be further supported by intradomain or interdomain disulfide bridges. Disulfide bonds are usually formed by oxidation of the thiol groups of two cysteines, which connects the S atoms to form a disulfide bridge between the two cysteine residues.
В соответствии с конкретным вариантом реализации домены антитела содержат мутации, включающие остатки цистеина, которые способны образовывать дисульфидные мостики для стабилизации домена антитела с помощью дополнительного внутридоменного дисульфидного мостика или пары доменов антитела с помощью дополнительного междоменного дисульфидного мостика. В частности, цистеин может быть вставлен (с помощью вставки дополнительной аминокислоты или замены аминокислоты) в С-концевой области или на С-конце домена СН3. Пара СН3, которая несет дополнительную цистеиновую модификацию, может быть стабилизирована за счет образования дисульфидной связи между парой СН3 с получением димера СН3/СН3. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения дисульфидсоединенные домены антитела представляют собой гомодимеры или гетеродимеры, следовательно, пары одинаковых или разных доменов.In a particular embodiment, the antibody domains contain mutations comprising cysteine residues that are capable of forming disulfide bridges to stabilize the antibody domain with an additional intradomain disulfide bridge, or the antibody domain pair with an additional interdomain disulfide bridge. In particular, cysteine can be inserted (by inserting an additional amino acid or amino acid substitution) at the C-terminal region or at the C-terminus of the CH3 domain. A CH3 pair that carries an additional cysteine modification can be stabilized by the formation of a disulfide bond between the CH3 pair to form a CH3/CH3 dimer. According to some embodiments of the present invention, the disulfide-linked antibody domains are homodimers or heterodimers, hence pairs of the same or different domains.
Чтобы обеспечить правильное спаривание цепей или доменов антител, в частности, можно применять любые из мутаций СН3, например, технологию ««выступ-во-впадину», технологию SEED, технологию отталкивания заряда, дисульфидную связь или технологию кросс-МАТ, чтобы уменьшить количество неправильно связанных молекул.In order to ensure proper pairing of antibody chains or domains, in particular, any of the CH3 mutations can be used, for example, ridge-to-trough technology, SEED technology, charge repulsion technology, disulfide bonding, or cross-MAT technology, to reduce the number of mismatches. related molecules.
В настоящем документе под «парой» доменов антитела понимают набор из двух доменов антитела, когда один домен имеет область на своей поверхности или полость, которая специфически связывается с областью на другом домене и, следовательно, комплементарна ей. Домены антитела могут связываться или объединяться с образованием пары доменов антитела за счет контакта области бета-складчатого слоя. Такая пара доменов также упоминается как димер, который, например, связан за счет электростатического взаимодействия, рекомбинантной гибридизации или ковалентной связи, что приводит к непосредственной физической связи двух доменов, например, как в твердой, так и в жидкой форме. В настоящем документе, в частности, описан димер CL/CH1, который может представлять собой предпочтительную пару когнатных доменов антитела за счет определенных точечных мутаций в положениях, определенных в настоящем документе.As used herein, an "pair" of antibody domains refers to a set of two antibody domains where one domain has a region on its surface or cavity that specifically binds to and is therefore complementary to a region on the other domain. The antibody domains can bind or combine to form an antibody domain pair by contacting the beta sheet region. Such a domain pair is also referred to as a dimer, which, for example, is linked by electrostatic interaction, recombinant hybridization, or covalent bonding, resulting in a direct physical bond between the two domains, for example, in both solid and liquid form. Specifically described herein is a CL/CH1 dimer that may represent a preferred pair of antibody cognate domains through certain point mutations at the positions defined herein.
В настоящем документе под «предпочтительным спариванием» понимают образование димеров из доменов антитела или цепей антитела с получением пары доменов антитела или цепей антитела, причем пара образуется за счет повышенной аффинности или авидности связывающих поверхностей доменов антитела и повышенной (термо-) стабильность пары доменов или пары HC/LC. Когнатные домены антитела могут быть получены с помощью модификаций в области контактной поверхности, таких как описанные в настоящем документе, которые предпочтительно спариваются друг с другом, в сравнении с любым доменом дикого типа, относящимся к аналогичному типу.As used herein, "preferred pairing" refers to the formation of dimers from antibody domains or antibody chains to produce a pair of antibody domains or antibody chains, the pair being formed by increased affinity or avidity of the binding surfaces of the antibody domains and increased (thermo-)stability of the domain pair or antibody pair. HC/LC. Antibody cognate domains can be generated by contact surface modifications, such as those described herein, that preferentially pair with each other over any wild-type domain of the same type.
В паре доменов антитела в настоящем документе домены антитела называются «партнерскими» доменами. В антителе, описанном в настоящем документе, следующие домены считаются партнерами, приемлемо образующими пару доменов антитела (партнеры, разделенные косой чертой (/)):Within an antibody domain pair, the antibody domains are referred to herein as "partner" domains. In an antibody described herein, the following domains are considered partners that suitably form an antibody domain pair (partners separated by a slash (/)):
VL/VH;VL/VH;
CL (С-лямбда или С-каппа)/СН1;CL (C-lambda or C-kappa)/CH1;
СН2/СН2;CH2/CH2;
СН3/СН3.CH3/CH3.
Под термином «когнатный» в отношении пары доменов или димера доменов понимают домены, которые имеют совпадающую точку связывания или структуру для получения контактной поверхности на каждом из доменов, чтобы предпочтительно образовывать пару таких доменов. Подразумевается, что конкретные домены являются «когнатными» или когнатной парой доменов, если по меньшей мере один из доменов модифицирован для предпочтительного связывания своего когнатного (партнерского) партнера по связыванию для получения пары доменов. Предпочтительно оба когнатных домена модифицированы для включения совпадающих мутаций, например, мутаций для введения остатков аминокислот противоположных полярностей, мутаций типа «выступ-во-впадину», мутаций SEED, дополнительных остатков цистеина для образования дисульфидного мостика или модификаций, в которых применяется технология отталкивания зарядов.The term "cognate" in relation to a pair of domains or a dimer of domains refers to domains that have the same binding point or structure to obtain a contact surface on each of the domains, to preferably form a pair of such domains. Specific domains are meant to be a "cognate" or cognate pair of domains if at least one of the domains is modified to preferentially bind its cognate (partner) binding partner to produce the domain pair. Preferably, both cognate domains are modified to include matching mutations, e.g., mutations to introduce amino acid residues of opposite polarities, bump-in-trough mutations, SEED mutations, additional cysteine residues to form a disulfide bridge, or modifications that use charge repulsion technology.
Термин «поливалентный» по отношению к АВМ или антителу, описанным в настоящем документе, относится к молекуле, имеющей по меньшей мере два сайта связывания для связывания одного и того же антигена-мишени, специфически связывающих одни и те же или разные эпитопы такого антигена-мишени. Термин будет включать двухвалентные антитела или молекулы с 2 или более валентностями для связывания антигена-мишени, например, за счет по меньшей мере 2, 3, 4 или даже более сайтов связывания. Например, двухвалентное антитело может иметь два антигенсвязывающих сайта за счет двух пар доменов VH/VL, обе из которых связывают один и тот же антиген-мишень.The term "polyvalent" with respect to an AVM or an antibody described herein refers to a molecule having at least two binding sites for binding to the same target antigen specifically binding to the same or different epitopes of that target antigen. . The term will include divalent antibodies or molecules with 2 or more valences for binding to a target antigen, for example, through at least 2, 3, 4 or even more binding sites. For example, a divalent antibody may have two antigen-binding sites due to two pairs of VH/VL domains, both of which bind the same target antigen.
Термин «полиспецифичный» в отношении АВМ или антитела, описанных в настоящем документе, относится к молекуле, имеющей по меньшей мере два сайта связывания, специфически связывающих по меньшей мере два разных антигена-мишени. Термин будет включать биспецифические антитела или молекулы с 2 или более видами специфичности для связывания более чем одного антигена-мишени, например, за счет по меньшей мере 2, 3, 4 или даже более сайтов связывания.The term "multispecific" in relation to an AVM or an antibody described herein refers to a molecule having at least two binding sites that specifically bind at least two different target antigens. The term will include bispecific antibodies or molecules with 2 or more specificities for binding to more than one target antigen, for example, at least 2, 3, 4 or even more binding sites.
Например, биспецифическое антитело может связывать один антиген-мишень за счет одной пары доменов VH/VL (область Fv) и другой антиген-мишень за счет второй пары доменов VH/VL (область Fv). Биспецифическое антитело, как правило, состоит из четырех различных цепей антитела, т.е. двух НС и двух LC, так, что два разных CDR-сайта связывания образуются путем гетеродимеризации (спаривания) первой НС с первой LC и второй НС со второй LC.For example, a bispecific antibody can bind one target antigen through one pair of VH/VL domains (Fv region) and another target antigen through a second pair of VH/VL domains (Fv region). A bispecific antibody typically consists of four different antibody chains, i. two HC and two LC, so that two different CDR binding sites are formed by heterodimerization (pairing) of the first HC with the first LC and the second HC with the second LC.
В настоящем документе термин «антиген» или «мишень», в частности, будет включать все антигены и молекулы-мишени, которые распознаются сайтом связывания антитела (также называемым паратопом). В частности, предпочтительные антигены, на которые нацелена связывающая молекула, описанная в настоящем документе, представляют собой те антигены, которые, как уже было доказано, являются или способны быть иммунологически или терапевтически целесообразными, в частности, те, для которых была испытана клиническая эффективность. В настоящем документе термин «мишень» или «антиген», в частности, будет включать молекулы, выбранные из группы, состоящей из рецепторов, ассоциированных с опухолью (человека или другого животного), и растворимых антигенов, ассоциированных с опухолью, которые являются аутоантигенами, таких как рецепторы, расположенные на поверхности опухолевых клеток, или цитокинов, или факторов роста, которые повсеместно присутствуют в кровотоке онкопациентов и связаны с такой опухолью. Другие антигены могут происходить из патогенов, например, микробных или вирусных патогенов.As used herein, the term "antigen" or "target" specifically will include all antigens and target molecules that are recognized by an antibody binding site (also referred to as a paratope). In particular, the preferred antigens targeted by the binding molecule described herein are those antigens that have already been shown to be or are capable of being immunologically or therapeutically useful, in particular those for which clinical efficacy has been tested. As used herein, the term "target" or "antigen" specifically will include molecules selected from the group consisting of tumor-associated receptors (human or other animal) and soluble tumor-associated antigens that are self-antigens, such as receptors located on the surface of tumor cells, or cytokines, or growth factors that are ubiquitous in the bloodstream of cancer patients and are associated with such a tumor. Other antigens may be derived from pathogens, such as microbial or viral pathogens.
Антиген-мишень распознается либо как целая молекула-мишень, либо как фрагмент такой молекулы, в частности, субструктуры, например, полипептидная или углеводная структуры мишеней, обычно называемые «эпитопы», например, В-клеточные эпитопы, Т-клеточный эпитоп), которые являются иммунологически целесообразными, т.е. также распознаются природными или моноклональными антителами. В настоящем документе термин «эпитоп», в частности, будет относиться к молекулярной структуре, которая может полностью представлять собой партнера по специфическому связыванию или быть частью партнера по специфическому связыванию с сайтом связывания АВМ или антитела, описанных в настоящем документе. Термин эпитоп также может относиться к гаптенам. Химически эпитоп может состоять из углевода, пептида, алифатической кислоты, органического, биохимического или неорганического вещества, или их производных и любых их комбинаций. Если эпитоп представляет собой полипептид, он обычно включает по меньшей мере 3 аминокислоты, предпочтительно от 8 до 50 аминокислот, и более предпочтительно от 10 до 20 аминокислот в пептиде. Не существует критического верхнего предела длины пептида, который может составлять почти всю длину полипептидной последовательности белка. Эпитопы могут быть как линейными, так и конформационными. Линейный эпитоп состоит из одного сегмента первичной последовательности полипептидной или углеводной цепи. Линейные эпитопы могут быть смежными или перекрывающимися. Конформационные эпитопы состоят из аминокислот или углеводов, сближенных за счет сворачивания полипептида с образованием третичной структуры, и аминокислоты необязательно являются смежными в линейной последовательности. В частности, эпитопы являются по меньшей мере частью диагностически целесообразных молекул, т.е. отсутствие или присутствие эпитопа в образце качественно или количественно коррелирует либо с заболеванием, либо с состоянием здоровья пациента, либо со статусом способа при изготовлении, либо со статусом окружающей среды и статусом питания. Эпитопы также могут представлять собой по меньшей мере часть терапевтически целесообразных молекул, т.е. молекул, на которые может быть нацелен специфический связывающий домен, который изменяет течение заболевания.A target antigen is recognized either as a whole target molecule or as a fragment of such a molecule, in particular a substructure, e.g. polypeptide or carbohydrate structures of targets, commonly referred to as "epitopes", e.g. B-cell epitopes, T-cell epitope) that are immunologically appropriate, ie. also recognized by natural or monoclonal antibodies. In this document, the term "epitope", in particular, will refer to a molecular structure that can be wholly a specific binding partner or be part of a specific binding partner with the binding site of the AVM or antibody described herein. The term epitope can also refer to haptens. Chemically, an epitope may consist of a carbohydrate, a peptide, an aliphatic acid, an organic, biochemical, or inorganic substance, or derivatives thereof, and any combination thereof. If the epitope is a polypeptide, it usually comprises at least 3 amino acids, preferably 8 to 50 amino acids, and more preferably 10 to 20 amino acids per peptide. There is no critical upper limit to the length of a peptide, which can be almost the entire length of a protein's polypeptide sequence. Epitopes can be either linear or conformational. A linear epitope consists of a single segment of the primary sequence of a polypeptide or carbohydrate chain. Linear epitopes may be contiguous or overlapping. Conformational epitopes consist of amino acids or carbohydrates brought together by folding the polypeptide to form a tertiary structure, and the amino acids are not necessarily contiguous in a linear sequence. In particular, epitopes are at least part of the diagnostically useful molecules, ie. the absence or presence of an epitope in a sample correlates qualitatively or quantitatively with either the disease or health status of the patient, or with the status of the method in manufacture, or with environmental and nutritional status. Epitopes may also be at least a portion of therapeutically useful molecules, ie. molecules that can be targeted by a specific binding domain that alters the course of the disease.
Конкретные варианты реализации относятся к природным антигенам или эпитопам или синтетическим (искусственным) антигенам или эпитопам. Преимуществом искусственных антигенов, которые являются производными природных антигенов, может быть повышенная антигенность или стабильность, что имеет значение для распознавания в качестве партнера по связыванию для конкретной АВМ или антитела.Specific implementation options refer to natural antigens or epitopes or synthetic (artificial) antigens or epitopes. The advantage of artificial antigens, which are derived from natural antigens, may be increased antigenicity or stability, which is important for recognition as a binding partner for a particular AVM or antibody.
В настоящем документе термин «специфичность» или «специфическое связывание» относится к реакции связывания, которая является определяющей для представляющего интерес когнатного лиганда в гетерогенной популяции молекул. Соответственно, в указанных условиях (например, в условиях иммуноанализа) АВМ или антитело, описанное в настоящем документе, связывается со своей конкретной мишенью и не связывается в значительном количестве с другими молекулами, присутствующими в образце. Специфическое связывание означает, что связывание является селективным касательно идентичности мишени, высокой, средней или низкой аффинности или авидности связывания, в соответствии с выбором. Селективное связывание обычно достигается, если константа связывания или динамика связывания различается по меньшей мере в 10 раз, предпочтительно различается по меньшей мере в 100 раз и более предпочтительно по меньшей мере в 1000 раз.As used herein, the term "specificity" or "specific binding" refers to a binding reaction that is critical for a cognate ligand of interest in a heterogeneous population of molecules. Accordingly, under the specified conditions (eg, immunoassay conditions), the AVM or antibody described herein binds to its specific target and does not bind in significant amounts to other molecules present in the sample. Specific binding means that the binding is selective for target identity, high, medium or low binding affinity or avidity, as selected. Selective binding is usually achieved if the binding constant or binding dynamics differ by at least 10-fold, preferably by at least 100-fold, and more preferably by at least 1000-fold.
В настоящем документе термин «вариабельная связывающая область», также называемая «область CDR», относится к молекулам с изменяющимися структурами, способным к связывающим взаимодействиям с антигенами. Эти молекулы можно применять сами по себе или интегрировать в более крупный белок с образованием специфической области такого белка, имеющей функцию связывания. Изменяющиеся структуры могут происходить из природных репертуаров связывающих белков, таких как иммуноглобулины или антитела. Изменяющиеся структуры также могут быть получены с помощью методик рандомизации, в частности, описанных в настоящем документе. Они включают мутированные CDR или области, отличные от CDR (например, области структурных петель константных доменов антител), области петель вариабельных доменов или константных доменов антител, в частности, петли CDR антител. Как правило, связывающие структуры АВМ или антитела, описанных в настоящем документе, образованы такими вариабельными связывающими областями.As used herein, the term "variable binding region", also referred to as "CDR region", refers to molecules with variable structures capable of binding interactions with antigens. These molecules can be used alone or integrated into a larger protein to form a specific region of that protein that has a binding function. The changing structures may be derived from natural repertoires of binding proteins such as immunoglobulins or antibodies. Variable structures can also be generated using randomization techniques such as those described herein. These include mutated CDRs or non-CDR regions (eg structural loop regions of antibody constant domains), variable domain loop regions or antibody constant domain loops, in particular antibody CDR loops. Typically, the binding structures of the AVMs or antibodies described herein are formed by such variable binding regions.
Термин «цитотоксический» или «цитотоксическая активность», используемый для целей АВМ или антитела, описанных в настоящем документе, будет относиться к любой специфической молекуле, направленной против клеточных антигенов, которая, в связанном с антигеном состоянии, активирует запрограммированную гибель клеток и запускает апоптоз. Специфические антитела эффективны благодаря своему действию на эффекторные клетки, что приводит к активации цитотоксических Т-клеток или клеток, которые опосредуют антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЗКЦ), комплементзависимую цитотоксичность (КЗЦ) и/или клеточный фагоцитоз (АЗКФ). Специфические антитела уничтожают покрытые антителом клетки-мишени с помощью апоптоза, индуцирующего запрограммированную гибель клеток, и/или с помощью связывания с рецепторами Fc эффекторных клеток, опосредующих активность АЗКЦ и/или КЗЦ.The term "cytotoxic" or "cytotoxic activity" as used for the purposes of an AVM or antibody described herein, will refer to any specific molecule directed against cellular antigens that, when bound to the antigen, activates programmed cell death and triggers apoptosis. Specific antibodies are effective due to their action on effector cells, resulting in the activation of cytotoxic T cells or cells that mediate antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), complement-dependent cytotoxicity (CCC), and/or cellular phagocytosis (ADCP). Specific antibodies destroy antibody-coated target cells by apoptosis inducing programmed cell death and/or by binding to Fc receptors on effector cells mediating ADCC and/or CDC activity.
АВМ или антитело, описанные в настоящем документе, могут проявлять эффекторную функцию Fc или могут не проявлять ее. Fc может привлекать комплемент и способствовать устранению антигена-мишени или клетки-мишени за счет связывания поверхностного антигена путем образования иммунных комплексов.The AVM or antibody described herein may or may not exhibit an Fc effector function. Fc can attract complement and promote elimination of the target antigen or target cell by binding the surface antigen through immune complex formation.
Специфические антитела могут быть лишены активного фрагмента Fc или эффекторной функции Fc, соответственно, они либо состоят из доменов антитела, которые не содержат часть Fc антитела, либо не содержат сайт связывания рецептора Fc-гамма, либо содержат домены антитела, лишенные эффекторной функции Fc, например, за счет модификации для снижения эффекторных функций Fc, в частности, для отмены или снижения активности АЗКЦ и/или КЗЦ. Альтернативные антитела могут быть сконструированы с включением модификаций для увеличения эффекторных функций Fc, в частности, для усиления активности АЗКЦ и/или КЗЦ.Specific antibodies may lack active Fc fragment or Fc effector function, respectively, they either consist of antibody domains that do not contain the Fc portion of the antibody, or do not contain the Fc-gamma receptor binding site, or contain antibody domains that lack Fc effector function, e.g. , due to modification to reduce the effector functions of Fc, in particular, to cancel or reduce the activity of ADCC and/or CDC. Alternative antibodies can be designed to include modifications to increase Fc effector functions, in particular to enhance ADCC and/or CDC activity.
Такие модификации можно осуществлять с помощью мутагенеза, например, мутаций в сайте связывания рецептора Fc-гамма, или с помощью производных или агентов, которые препятствуют активности АЗКЦ и/или КЗЦ формата антитела так, чтобы достичь снижения или увеличения эффекторной функции Fc.Such modifications can be made by mutagenesis, for example, mutations in the binding site of the Fc-gamma receptor, or by derivatives or agents that interfere with the activity of the ADCC and/or CDC format of the antibody so as to achieve a decrease or increase in Fc effector function.
Термин «антигенсвязывающий сайт» или «связывающий сайт» относится к части АВМ или антитела, которая участвует в связывании антигена. Антигенсвязывающий сайт антитела, как правило, образуется аминокислотными остатками N-концевых вариабельных («V») областей тяжелой («Н») и/или легкой («L») цепей или их вариабельных доменов. Три сильно различающихся участка в пределах V-областей тяжелой и легкой цепей, называемые «гипервариабельные участки», расположены между более консервативными фланкирующими участками, известными как каркасные участки. Антигенсвязывающий сайт обеспечивает поверхность, которая комплементарна трехмерной поверхности связанного эпитопа или антигена, и гипервариабельные участки называются «области, определяющие комплементарность» или «CDR». Связывающий сайт, включенный в CDR в настоящем документе, также называют «CDR-сайт связывания».The term "antigen-binding site" or "binding site" refers to the portion of an AVM or antibody that is involved in antigen binding. The antigen-binding site of an antibody is typically formed by the amino acid residues of the N-terminal variable ("V") regions of the heavy ("H") and/or light ("L") chains or their variable domains. Three very different regions within the V regions of the heavy and light chains, called "hypervariable regions", are located between the more conserved flanking regions, known as framework regions. The antigen binding site provides a surface that is complementary to the three-dimensional surface of the associated epitope or antigen, and the hypervariable regions are referred to as "complementarity determining regions" or "CDRs". The binding site included in the CDR in this document is also referred to as the "binding CDR site".
Термин «экспрессия» понимают следующим образом. Молекулы нуклеиновых кислот, содержащие желательную кодирующую последовательность продукта экспрессии, такого как, например, АВМ или антитело, описанные в настоящем документе, и управляющие последовательности, такие как, например, функционально соединенный промотор, можно применять для целей экспрессии. Хозяева, трансформированные или трансфецированные этими последовательностями, способны вырабатывать кодируемые белки. Для осуществления трансформации система экспрессии может быть включена в вектор; однако соответствующая ДНК также может быть интегрирована в хромосому хозяина. В частности, термин относится к клетке-хозяину и совместимому вектору в условиях, например, подходящих для экспрессии белка, кодируемого чужеродной ДНК, переносимой вектором и вводимой в клетку-хозяина.The term "expression" is understood as follows. Nucleic acid molecules containing the desired coding sequence for an expression product, such as, for example, an AVM or an antibody described herein, and control sequences, such as, for example, an operably linked promoter, can be used for expression purposes. Hosts transformed or transfected with these sequences are capable of producing the encoded proteins. To effect transformation, an expression system can be included in a vector; however, the corresponding DNA can also be integrated into the host chromosome. In particular, the term refers to a host cell and a compatible vector under conditions, for example, suitable for the expression of a protein encoded by foreign DNA carried by the vector and introduced into the host cell.
Кодирующая ДНК представляет собой последовательность ДНК, которая кодирует конкретную аминокислотную последовательность для конкретного полипептида или белка, такого как, например, антитело. Промоторная ДНК представляет собой последовательность ДНК, которая инициирует, регулирует или иным образом опосредует или контролирует экспрессию кодирующей ДНК. Промоторная ДНК и кодирующая ДНК могут быть из одного и того же гена или из разных генов и могут быть из одного и того же или из разных организмов. Рекомбинантные векторы для клонирования часто будут включать одну или более систем репликации для клонирования или экспрессии, один или более маркеров для отбора у хозяина, например, устойчивость к антибиотикам, и одну или более кассет экспрессии.A coding DNA is a DNA sequence that encodes a specific amino acid sequence for a specific polypeptide or protein, such as, for example, an antibody. A promoter DNA is a DNA sequence that initiates, regulates, or otherwise mediates or controls the expression of a coding DNA. The promoter DNA and the coding DNA may be from the same gene or from different genes, and may be from the same or different organisms. Recombinant cloning vectors will often include one or more replication systems for cloning or expression, one or more markers for host selection, such as antibiotic resistance, and one or more expression cassettes.
В настоящем документе «векторы» определяют как последовательности ДНК, которые необходимы для транскрипции клонированных рекомбинантных нуклеотидных последовательностей, т.е. рекомбинантных генов и трансляции их мРНК в подходящем организме-хозяине.As used herein, "vectors" are defined as DNA sequences that are necessary for the transcription of cloned recombinant nucleotide sequences, i.e. recombinant genes and translation of their mRNA in a suitable host organism.
«Кассета экспрессии» относится к кодирующей последовательности ДНК или сегменту ДНК, который кодирует продукт экспрессии, которые могут быть вставлены в вектор в определенных сайтах рестрикции. Кассетные сайты рестрикции предназначены для обеспечения вставки кассеты в правильную рамку считывания. Обычно чужеродная ДНК вставлена в один или более сайтов рестрикции векторной ДНК и затем переносится вектором в клетку-хозяина вместе с переносимой векторной ДНК. Сегмент или последовательность ДНК, имеющие вставленную или добавленную ДНК, например, вектор экспрессии, также можно назвать «конструкция ДНК»."Expression cassette" refers to a DNA coding sequence or DNA segment that encodes an expression product that can be inserted into a vector at certain restriction sites. The cassette restriction sites are designed to ensure that the cassette is inserted into the correct reading frame. Typically, the foreign DNA is inserted into one or more restriction sites of the vector DNA and then carried by the vector into the host cell along with the carried vector DNA. A segment or sequence of DNA having inserted or added DNA, such as an expression vector, may also be referred to as a "DNA construct".
Векторы экспрессии содержат кассету экспрессии и помимо этого обычно содержат точку инициации для автономной репликации в клетках-хозяевах или сайт интеграции в геном, один или более селективных маркеров (например, ген синтеза аминокислот или ген, придающий устойчивость к антибиотикам, таким как зеоцин, канамицин, G418 или гигромицин), ряд сайтов расщепления рестриктазами, подходящую промоторную последовательность и терминатор транскрипции, компоненты которых функционально соединены друг с другом. В настоящем документе термин «вектор» включает автономно реплицирующиеся нуклеотидные последовательности, а также нуклеотидные последовательности, интегрирующиеся в геном. Распространенным типом вектора является «плазмида», которая обычно представляет собой автономную молекулу двухцепочечной ДНК, которая может легко принимать дополнительную (чужеродную) ДНК и которая может быть легко введена в подходящую клетку хозяина. Плазмидный вектор часто содержит кодирующую ДНК и промоторную ДНК и имеет один или более сайтов рестрикции, подходящих для вставки чужеродной ДНК. В частности, термин «вектор» или «плазмида» относится к носителю, с помощью которого последовательность ДНК или РНК (например, чужеродный ген) может быть введена в клетку хозяина так, чтобы трансформировать хозяина и стимулировать экспрессию (например, транскрипцию и трансляцию) введенной последовательности.Expression vectors contain an expression cassette and in addition usually contain an origin for autonomous replication in host cells or an integration site into the genome, one or more selectable markers (for example, an amino acid synthesis gene or a gene conferring resistance to antibiotics such as zeocin, kanamycin, G418 or hygromycin), a number of restriction enzyme cleavage sites, a suitable promoter sequence and a transcription terminator, the components of which are operably linked to each other. As used herein, the term "vector" includes autonomously replicating nucleotide sequences as well as nucleotide sequences that integrate into the genome. A common type of vector is the "plasmid", which is usually a self-contained double-stranded DNA molecule that can easily accept additional (foreign) DNA and that can be easily introduced into a suitable host cell. The plasmid vector often contains coding DNA and promoter DNA and has one or more restriction sites suitable for insertion of foreign DNA. In particular, the term "vector" or "plasmid" refers to a vehicle by which a DNA or RNA sequence (e.g., a foreign gene) can be introduced into a host cell so as to transform the host and stimulate expression (e.g., transcription and translation) of the introduced sequences.
В настоящем документе термин «клетка-хозяин» относится к первичным рассматриваемым клеткам, трансформированным для получения конкретного рекомбинантного белка, такого как АВМ или антитело, описанные в настоящем документе, и любому их потомству. Следует понимать, что не все потомство абсолютно идентично родительской клетке (вследствие преднамеренных или случайных мутаций или различий в окружении), однако такое измененное потомство включено в эти термины, если потомство сохраняет ту же функциональность, что и первоначально трансформированная клетка. Термин «линия клеток-хозяев» относится к линии клеток из клеток-хозяев, используемой для экспрессии рекомбинантного гена для получения рекомбинантных полипептидов, таких как рекомбинантные антитела. В настоящем документе термин «клеточная линия» относится к установленному клону конкретного типа клеток, который приобрел способность к пролиферации в течение продолжительного периода времени. Такая клетка-хозяин или линия клеток-хозяев может поддерживаться в культуре клеток и/или культивироваться для получения рекомбинантного полипептида.As used herein, the term "host cell" refers to the primary cells in question transformed to produce a particular recombinant protein, such as the AVM or antibody described herein, and any progeny thereof. It should be understood that not all progeny are absolutely identical to the parent cell (due to intentional or accidental mutations or environmental differences), however, such altered progeny are included in these terms if the progeny retains the same functionality as the originally transformed cell. The term "host cell line" refers to a host cell line used to express a recombinant gene to produce recombinant polypeptides such as recombinant antibodies. As used herein, the term "cell line" refers to an established clone of a particular cell type that has acquired the ability to proliferate over an extended period of time. Such a host cell or host cell line may be maintained in cell culture and/or cultured to produce a recombinant polypeptide.
Термин «выделенный» или «выделение», используемый в настоящем документе в отношении нуклеиновой кислоты, антитела или другого соединения, будет относиться к такому соединению, которое было в достаточной степени отделено от окружения, с которым оно было бы связано в природных условиях, так, чтобы существовать в «по существу чистой» форме. «Выделенный» не обязательно означает исключение искусственных или синтетических смесей с другими соединениями или материалами или присутствие примесей, которые не нарушают основную активность и которые могут присутствовать, например, из-за неполной очистки. В частности, подразумевается, что выделенные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие АВМ или антитело, описанные в настоящем документе, также включают оптимизированные по кодонам варианты природных последовательностей нуклеиновых кислот для улучшения экспрессии в определенной клетке-хозяине или химически синтезированные варианты.The term "isolated" or "isolation" as used herein in relation to a nucleic acid, antibody or other compound, will refer to such a compound that has been sufficiently separated from the environment with which it would be associated in nature, so, to exist in an "essentially pure" form. "Isolated" does not necessarily mean the exclusion of artificial or synthetic mixtures with other compounds or materials, or the presence of impurities that do not interfere with the basic activity and which may be present, for example, due to incomplete purification. In particular, the isolated nucleic acid molecules encoding the AVM or antibody described herein are also intended to include codon-optimized variants of naturally occurring nucleic acid sequences to enhance expression in a particular host cell, or chemically synthesized variants.
Термин «выделенная нуклеиновая кислота» иногда используется в отношении нуклеиновых кислот. Этот термин, применительно к ДНК, относится к молекуле ДНК, которая отделена от последовательностей, которые являются непосредственно смежными с ней в природном геноме организма, из которого она изначально происходит. Например, «выделенная нуклеиновая кислота» может содержать молекулу ДНК, вставленную в вектор, такой как плазмидный или вирусный вектор, или интегрированную в геномную ДНК прокариотической или эукариотической клетки или организма-хозяина. Применительно к РНК термин «выделенная нуклеиновая кислота» относится главным образом к молекуле РНК, кодируемой выделенной молекулой ДНК, определенной выше. Согласно другому варианту термин может относиться к молекуле РНК, которая была в достаточной степени отделена от других нуклеиновых кислот, с которыми она была бы связана в своем природном состоянии (т.е. в клетках или тканях). «Выделенная нуклеиновая кислота» (ДНК или РНК) может дополнительно представлять собой молекулу, полученную непосредственно с помощью биологических или синтетических способов и отделенную от других компонентов, присутствующих во время ее получения.The term "isolated nucleic acid" is sometimes used in relation to nucleic acids. This term, when applied to DNA, refers to a DNA molecule that is separated from sequences that are immediately adjacent to it in the natural genome of the organism from which it originally originates. For example, an "isolated nucleic acid" may comprise a DNA molecule inserted into a vector, such as a plasmid or viral vector, or integrated into the genomic DNA of a prokaryotic or eukaryotic cell or host organism. With respect to RNA, the term "isolated nucleic acid" refers primarily to an RNA molecule encoded by an isolated DNA molecule as defined above. Alternatively, the term may refer to an RNA molecule that has been sufficiently separated from other nucleic acids to which it would be associated in its natural state (ie, in cells or tissues). An "isolated nucleic acid" (DNA or RNA) may further be a molecule obtained directly by biological or synthetic methods and separated from other components present at the time of its production.
Применительно к полипептидам или белкам, таким как выделенные антитела, термин «выделенный», в частности, будет относиться к соединениям, которые не содержат или по существу не содержат материал, с которым они связаны в природе, такой как другие соединения, с которыми они обнаруживаются в их природном окружении, или окружении, в котором их получают (например, клеточная культура), когда такой препарат получают с помощью технологии рекомбинантной ДНК, осуществляемой в условиях in vitro или in vivo. Выделенные соединения могут быть изготовлены с разбавителями или адъювантами, но для практических целей, тем не менее, являются выделенными, например, полипептиды или полинуклеотиды могут быть смешаны с фармацевтически приемлемыми носителями или вспомогательными веществами при применении в диагностике или терапии.When applied to polypeptides or proteins, such as isolated antibodies, the term "isolated" in particular will refer to compounds that do not or substantially do not contain the material with which they are naturally associated, such as other compounds with which they are found. in their natural environment, or the environment in which they are obtained (for example, cell culture), when such a preparation is obtained using recombinant DNA technology, carried out in vitro or in vivo. Isolated compounds may be formulated with diluents or adjuvants, but for practical purposes are nonetheless isolated, for example, polypeptides or polynucleotides may be mixed with pharmaceutically acceptable carriers or excipients for use in diagnosis or therapy.
В настоящем документе термин «рекомбинантный» будет означать «получаемый с помощью генной модификации или полученный в результате генной модификации». В другом варианте используется термин «модифицированный». Например, антитело или домен антитела могут быть модифицированы для получения варианта с помощью модификации соответствующей исходной последовательности для получения модифицированного антитела или домена. Рекомбинантный хозяин, в частности, содержит вектор экспрессии или вектор для клонирования, или он был генетически модифицирован так, чтобы содержать последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты, в частности, с применением нуклеотидной последовательности, чужеродной для хозяина. Рекомбинантный белок получают путем экспрессии соответствующей рекомбинантной нуклеиновой кислоты у хозяина. В настоящем документе термин «рекомбинантное антитело» включает антитела, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют с помощью рекомбинантных способов, такие как (а) антитела, выделенные из животного (например, мыши), которое является трансгенным или трансхромосомным по генам человеческого иммуноглобулина, или гибридомы, полученной из него, (b) антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной для экспрессии антитела, например, из трансфектомы, (с) антитела, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки человеческих антител, и (d) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любым другим способом, который включает сплайсинг последовательностей генов человеческих иммуноглобулинов с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные антитела включают антитела, модифицированные для включения перегруппировок и мутаций, которые происходят, например, во время созревания антитела.In this document, the term "recombinant" will mean "obtained by genetic modification or obtained as a result of gene modification." In another embodiment, the term "modified" is used. For example, an antibody or antibody domain can be modified to produce a variant by modifying the appropriate parent sequence to produce the modified antibody or domain. The recombinant host, in particular, contains an expression vector or a cloning vector, or it has been genetically modified to contain a recombinant nucleic acid sequence, in particular using a nucleotide sequence foreign to the host. The recombinant protein is produced by expression of the appropriate recombinant nucleic acid in the host. As used herein, the term "recombinant antibody" includes antibodies that are produced, expressed, generated, or isolated by recombinant methods, such as (a) antibodies isolated from an animal (e.g., mouse) that is transgenic or transchromosomal for human immunoglobulin genes, or a hybridoma derived from it, (b) antibodies isolated from a host cell transformed to express the antibody, e.g. from a transfectoma, (c) antibodies isolated from a recombinant combinatorial human antibody library, and created or isolated by any other method that involves splicing human immunoglobulin gene sequences with other DNA sequences. Such recombinant antibodies include antibodies modified to include rearrangements and mutations that occur, for example, during antibody maturation.
После выявления антител с желательной структурой такие антитела могут быть получены способами, хорошо известными в данной области техники, включая, например, методы гибридомы или технологию рекомбинантной ДНК.Once antibodies with the desired structure have been identified, such antibodies can be generated by methods well known in the art, including, for example, hybridoma techniques or recombinant DNA technology.
В гибридомном способе мышь или другое подходящее животное-хозяина, такое как хомяк, иммунизируют, чтобы вызвать выработку лимфоцитов, которые вырабатывают или способны вырабатывать антитела, которые будут специфически связываться с белком, применявшимся для иммунизации. Согласно другому варианту лимфоциты могут быть иммунизированы в условиях in vitro. Затем лимфоциты сливают с клетками миеломы с использованием подходящего агента для слияния, такого как полиэтиленгликоль, с образованием клетки гибридомы.In the hybridoma method, a mouse or other suitable host animal, such as a hamster, is immunized to induce the production of lymphocytes that produce or are capable of producing antibodies that will specifically bind to the protein used for the immunization. In another embodiment, the lymphocytes may be immunized in vitro. The lymphocytes are then fused with myeloma cells using a suitable fusion agent such as polyethylene glycol to form a hybridoma cell.
Культуральную среду, в которой размножаются клетки гибридомы, количественно исследуют, чтобы определить выработку моноклональных антител, направленных против антигена. Предпочтительно специфичность связывания моноклональных антител, вырабатываемых клетками гибридомы, определяют с помощью иммунопреципитации или количественного исследования связывания в условиях in vitro, такого как радиоиммуноанализ (RIA) или твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА).The culture medium in which the hybridoma cells propagate is quantitatively examined to determine the production of monoclonal antibodies directed against the antigen. Preferably, the binding specificity of the monoclonal antibodies produced by the hybridoma cells is determined by immunoprecipitation or an in vitro quantitative binding assay, such as radioimmunoassay (RIA) or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
Рекомбинантные моноклональные антитела можно получить, например, путем выделения ДНК, кодирующей требуемые цепи антитела, и трансфекции рекомбинантной клетки-хозяина кодирующими последовательностями для экспрессии, используя хорошо известные рекомбинантные векторы экспрессии, например, плазмиды или кассету (кассеты) экспрессии, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие АВМ или антитело, описанные в настоящем документе. Рекомбинантные клетки-хозяева могут представлять собой прокариотические и эукариотические клетки, такие как клетки, описанные выше.Recombinant monoclonal antibodies can be obtained, for example, by isolating DNA encoding the desired antibody chains and transfecting a recombinant host cell with coding sequences for expression using well-known recombinant expression vectors, for example, plasmids or expression cassette(s) containing nucleotide sequences encoding AVM or antibody as described herein. Recombinant host cells can be prokaryotic and eukaryotic cells, such as those described above.
В соответствии с конкретным аспектом нуклеотидную последовательность можно применять для генетической манипуляции, чтобы гуманизировать антитело или улучшить аффинность или другие характеристики антитела. Например, константная область может быть модифицирована так, чтобы придать ей сходство с человеческими константными областями, чтобы избежать иммунного ответа, если антитело применяют в клинических исследованиях и лечении человека. Желательной может быть генетическая манипуляция над последовательностью антитела для получения большей аффинности в отношении антигена-мишени. Для специалиста в данной области техники будет очевидно, что одно или более полинуклеотидных изменений могут быть внесены в антитело, при сохранении его способности к связыванию с антигеном-мишенью.In accordance with a specific aspect, the nucleotide sequence can be used for genetic manipulation to humanize the antibody or improve the affinity or other characteristics of the antibody. For example, the constant region may be modified to resemble human constant regions in order to avoid an immune response if the antibody is used in human clinical trials and treatment. It may be desirable to genetically manipulate the sequence of an antibody to obtain greater affinity for the target antigen. One of skill in the art will appreciate that one or more polynucleotide changes can be made to an antibody while maintaining its ability to bind to the target antigen.
Получение молекул антител различными способами, в целом хорошо изучено. В патенте США №6331415 (Cabilly et al.), например, описан способ рекомбинантного получения антител, в котором тяжелые и легкие цепи одновременно экспрессируются из одного вектора или из двух отдельных векторов в одной клетке. В Wibbenmeyer et al., (1999, Biochim Biophys Acta 1430(2): 191-202) и Lee and Kwak (2003, J. Biotechnology 101:189-198) описано получение моноклональных антител из вырабатываемых по отдельности тяжелых и легких цепей с использованием плазмид, экспрессируемых в отдельных культурах Е. coli. Различные другие методики, относящиеся к получению антител, представлены, например, в Harlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988).Obtaining antibody molecules by various methods is generally well studied. US Pat. No. 6,331,415 (Cabilly et al.), for example, describes a method for recombinant production of antibodies in which heavy and light chains are simultaneously expressed from a single vector or from two separate vectors in the same cell. Wibbenmeyer et al., (1999, Biochim Biophys Acta 1430(2): 191-202) and Lee and Kwak (2003, J. Biotechnology 101:189-198) describe the production of monoclonal antibodies from separately produced heavy and light chains with using plasmids expressed in individual cultures of E. coli. Various other techniques related to the production of antibodies are presented, for example, in Harlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988).
Моноклональные антитела получают с применением любого способа, который позволяет получать молекулы антител с помощью непрерывных клеточных линий в культуре. Примеры подходящих способов получения моноклональных антител включают гибридомные способы, описанные Kohler et al. (1975, Nature 256:495-497), и способ гибридомы на основе В-клеток человека (Kozbor, 1984, J. Immunol. 133:3001; и Brodeur et al., 1987, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, (Marcel Dekker, Inc., New York), pp. 51-63).Monoclonal antibodies are obtained using any method that allows the production of antibody molecules using continuous cell lines in culture. Examples of suitable methods for producing monoclonal antibodies include the hybridoma methods described by Kohler et al. (1975, Nature 256:495-497), and the human B cell hybridoma method (Kozbor, 1984, J. Immunol. 133:3001; and Brodeur et al., 1987, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, (Marcel Dekker, Inc., New York), pp. 51-63).
ABM или антитело, описанные в настоящем документе, можно применять для введения для лечения субъекта, нуждающегося в этом.The ABM or antibody described herein can be used for administration to treat a subject in need thereof.
В настоящем документе термин «субъект» будет относиться к теплокровному млекопитающему, в частности, к человеку или животному, отличному от человека. Соответственно, термин «субъект» также может относиться, в частности, к животным, включая собак, кошек, кроликов, лошадей, крупный рогатый скот, свиней и домашнюю птицу. В частности, АВМ или антитело, описанные в настоящем документе, предложены для медицинского применения для лечения субъекта или пациента, нуждающегося в профилактике или лечении патологического состояния. Термин «пациент» включает человека и других млекопитающих-субъектов, которые получают либо профилактическое, либо терапевтическое лечение. Соответственно, термин «лечение» включает как профилактическое, так и терапевтическое лечение.As used herein, the term "subject" will refer to a warm-blooded mammal, in particular a human or non-human animal. Accordingly, the term "subject" may also refer, in particular, to animals, including dogs, cats, rabbits, horses, cattle, pigs and poultry. In particular, the AVM or antibody described herein is provided for medical use in the treatment of a subject or patient in need of prevention or treatment of a disease state. The term "patient" includes human and other mammalian subjects who are receiving either prophylactic or therapeutic treatment. Accordingly, the term "treatment" includes both prophylactic and therapeutic treatment.
В частности, АВМ или антитело, описанные в настоящем документе, предложены в по существу чистой форме. В настоящем документе термин «по существу чистый» или «очищенный» будет относиться к препарату, содержащему по меньшей мере 50% (масс/масс), предпочтительно по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 90% или 95% соединения, такого как молекула нуклеиновой кислоты или антитело. Степень чистоты измеряют способами, подходящими для соединения (например, хроматографические способы, электрофорез в полиакриламидном геле, ВЭЖХ и т.п.).In particular, the AVM or antibody described herein is provided in a substantially pure form. As used herein, the term "substantially pure" or "purified" will refer to a formulation containing at least 50% (w/w), preferably at least 60%, 70%, 80%, 90%, or 95% of a compound, such as a nucleic acid molecule or an antibody. Purity is measured by methods appropriate to the compound (eg, chromatographic methods, polyacrylamide gel electrophoresis, HPLC, and the like).
Термин «терапевтически эффективное количество», используемый в настоящем документе взаимозаменяемо с любым из терминов «эффективное количество» или «достаточное количество» соединения, например, АВМ или антитела, описанных в настоящем документе, представляет собой количество или активность, достаточные, при введении субъекту, для оказания благоприятных или желательных результатов, включая клинические результаты, и, как таковое, эффективное количество или равнозначное ему зависит от ситуации, в которой его применяют.The term "therapeutically effective amount" as used herein interchangeably with any of the terms "effective amount" or "sufficient amount" of a compound, such as an AVM or an antibody described herein, is an amount or activity sufficient, when administered to a subject, to produce beneficial or desirable results, including clinical results, and as such, the effective amount, or its equivalent, depends on the situation in which it is used.
Под эффективным количеством подразумевают такое количество соединения, которое достаточно для лечения, предотвращения или ингибирования таких заболеваний или нарушений. Применительно к заболеванию терапевтически эффективные количества АВМ или антитела, описанных в настоящем документе, в частности, применяют для лечения, модуляции, ослабления, обращения или воздействия на заболевание или состояние, в отношении которого получают благоприятный эффект в результате взаимодействия антитела с его антигеном-мишенью.By an effective amount is meant that amount of a compound which is sufficient to treat, prevent or inhibit such diseases or disorders. When applied to a disease, therapeutically effective amounts of the AVM or antibody described herein are particularly useful in treating, modulating, attenuating, reversing or affecting the disease or condition that is benefited by the interaction of the antibody with its target antigen.
Количество соединения, которое будет соответствовать такому эффективному количеству, будет варьироваться в зависимости от различных факторов, таких как конкретный лекарственный препарат или соединение, фармацевтический состав, путь введения, тип заболевания или нарушения, особенности субъекта или хозяина, которого лечат, и т.п., но тем не менее может быть определено обычным специалистом в данной области техники.The amount of compound that will correspond to such an effective amount will vary depending on various factors such as the particular drug or compound, pharmaceutical composition, route of administration, type of disease or disorder, the particular subject or host being treated, and the like. , but can nevertheless be determined by one of ordinary skill in the art.
АВМ или антитело, описанные в настоящем документе, в частности, можно применять в фармацевтической композиции. Следовательно, предложена фармацевтическая композиция, которая содержит АВМ или антитело, описанные в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество, например, искусственный носитель или вспомогательное вещество, которое не встречается в природе вместе с иммуноглобулином в жидкости организма, или которое встречается в природе вместе с иммуноглобулином, однако обеспечено в препарате, содержащем носитель или вспомогательное вещество в другом количестве или соотношении.The AVM or antibody described herein, in particular, can be used in a pharmaceutical composition. Therefore, a pharmaceutical composition is provided that contains an AVM or an antibody as described herein and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient, e.g., an artificial carrier or excipient, which does not occur naturally with immunoglobulin in body fluid, or which occurs naturally together with an immunoglobulin, however, provided in a preparation containing a carrier or excipient in a different amount or ratio.
Фармацевтические композиции, описанные в настоящем документе, могут быть введены в виде болюсной инъекции или инфузии или путем непрерывной инфузии. Фармацевтические носители, подходящие для облегчения таких способов введения, хорошо известны в данной области техники.The pharmaceutical compositions described herein may be administered as a bolus injection or infusion, or by continuous infusion. Pharmaceutical carriers suitable for facilitating such routes of administration are well known in the art.
Фармацевтически приемлемые носители обычно включают любые и все подходящие твердые или жидкие вещества, растворители, дисперсионные среды, покрытия, изотонические агенты и агенты, замедляющие всасывание, и тому подобное, которые физиологически совместимы с АВМ или антителом, описанными в настоящем документе. Дополнительные примеры фармацевтически приемлемых носителей включают стерильную воду, физиологический солевой раствор, забуференный фосфатом физиологический раствор, декстрозу, глицерин, этанол и тому подобное, а также комбинации любых из них.Pharmaceutically acceptable carriers generally include any and all suitable solids or liquids, diluents, dispersion media, coatings, isotonic and absorption delaying agents, and the like, which are physiologically compatible with the AVM or antibody described herein. Additional examples of pharmaceutically acceptable carriers include sterile water, physiological saline, phosphate buffered saline, dextrose, glycerol, ethanol, and the like, as well as combinations of any of them.
Согласно одному такому аспекту АВМ или антитело можно комбинировать с одним или более носителями, подходящими для желательного пути введения. Антитела можно смешивать, например, с любым из лактозы, сахарозы, крахмала, сложных эфиров целлюлозы и алкановых кислот, стеариновой кислоты, талька, стеарата магния, оксида магния, натриевых и кальциевых солей фосфорной и серной кислот, гуммиарабика, желатина, альгината натрия, поливинилпирролидина, поливинилового спирта и необязательно дополнительно таблетировать или инкапсулировать для обычного введения. Согласно другому варианту АВМ или антитело могут быть растворены в физиологическом солевом растворе, воде, полиэтиленгликоле, пропиленгликоле, коллоидных растворах карбоксиметилцеллюлозы, этаноле, кукурузном масле, арахисовом масле, хлопковом масле, кунжутном масле, трагакантовой камеди и/или различных буферах. Другие носители, адъюванты и способы введения хорошо известны в фармацевтической области. Носитель может включать материал с контролируемым высвобождением или материал, замедляющий высвобождение, такой как моностеарат глицерина или дистеарат глицерина, по отдельности или с воском, или другие материалы, хорошо известные в данной области техники.In one such aspect, the AVM or antibody may be combined with one or more carriers suitable for the desired route of administration. The antibodies can be mixed with, for example, any of lactose, sucrose, starch, cellulose esters of alkanoic acids, stearic acid, talc, magnesium stearate, magnesium oxide, sodium and calcium salts of phosphoric and sulfuric acids, gum arabic, gelatin, sodium alginate, polyvinylpyrrolidine , polyvinyl alcohol, and optionally further tableted or encapsulated for conventional administration. Alternatively, the AVM or antibody may be dissolved in physiological saline, water, polyethylene glycol, propylene glycol, carboxymethyl cellulose colloids, ethanol, corn oil, peanut oil, cottonseed oil, sesame oil, tragacanth gum, and/or various buffers. Other carriers, adjuvants and routes of administration are well known in the pharmaceutical art. The carrier may include a controlled release material or a slow release material such as glycerol monostearate or glycerol distearate, alone or with a wax, or other materials well known in the art.
Дополнительные фармацевтически приемлемые носители известны в данной области техники и описаны, например, в REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES. Жидкие составы могут представлять собой растворы, эмульсии или суспензии и могут включать вспомогательные вещества, такие как суспендирующие агенты, солюбилизаторы, поверхностно-активные вещества, консерванты и хелатирующие агенты.Additional pharmaceutically acceptable carriers are known in the art and are described, for example, in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES. Liquid formulations may be solutions, emulsions or suspensions and may include adjuvants such as suspending agents, solubilizers, surfactants, preservatives and chelating agents.
Предусмотрены фармацевтические композиции, в состав которых входят АВМ или антитело, описанные в настоящем документе, и один или более терапевтически активных агентов. Стабильные составы получают для хранения путем смешивания указанной АВМ или антитела, имеющих желаемую степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, вспомогательными веществами или стабилизаторами в форме лиофилизированных составов или водных растворов. Составы для применения для введения в условиях in vivo, в частности, являются стерильными, предпочтительно в форме стерильного водного раствора. Это может быть легко достигнуто с помощью фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны или других способов. АВМ или антитело и другие терапевтически активные агенты, описанные в настоящем документе, могут быть также изготовлены в виде иммунолипосом и/или заключены в микрокапсулы.Pharmaceutical compositions are contemplated comprising the AVM or antibody described herein and one or more therapeutically active agents. Stable formulations are prepared for storage by mixing said AVM or antibody, having the desired purity, with optional pharmaceutically acceptable carriers, excipients, or stabilizers in the form of lyophilized formulations or aqueous solutions. Formulations for use for in vivo administration are particularly sterile, preferably in the form of a sterile aqueous solution. This can be easily achieved by filtration through sterile filter membranes or other means. The AVM or antibody and other therapeutically active agents described herein may also be formulated into immunoliposomes and/or microencapsulated.
Введение фармацевтической композиции, содержащей АВМ или антитело, описанные в настоящем документе, может быть выполнено различными способами, включая пероральное, подкожное, внутривенное, интраназальное, интраоптическое, трансдермальное, через слизистую оболочку, местное, например, гели, мази, лосьоны, кремы и т.д, внутрибрюшинное, внутримышечное, внутрилегочное, вагинальное, парентеральное, ректальное или внутриглазное введение.Administration of a pharmaceutical composition comprising an AVM or an antibody described herein may be by various means, including oral, subcutaneous, intravenous, intranasal, intraoptical, transdermal, transmucosal, topical, e.g., gels, ointments, lotions, creams, etc. .d, intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonary, vaginal, parenteral, rectal or intraocular administration.
Примеры составов, применяемых для парентерального введения, включают составы, подходящие для подкожных, внутримышечных или внутривенных инъекций, такие как, например, стерильный раствор, эмульсия или суспензия.Examples of formulations suitable for parenteral administration include formulations suitable for subcutaneous, intramuscular or intravenous injection such as, for example, a sterile solution, emulsion or suspension.
Согласно настоящему изобретению, в частности, предложены примерные АВМ и антитела, подробно описанные в приведенных в настоящем документе примерах. Возможны и другие варианты антител, например, включающие функциональные варианты приведенных в качестве примеров антител, например, в которых Fc дополнительно модифицирована для улучшения структуры и функции молекулы или в которых, в частности, получают антитела, содержащие разные CDR-сайты связывания или имеющие различную специфичность, в частности, в которых получены две разные области Fv.The present invention specifically provides exemplary AVMs and antibodies as detailed in the examples provided herein. Other variants of antibodies are possible, for example, including functional variants of the exemplary antibodies, for example, in which the Fc is further modified to improve the structure and function of the molecule, or in which, in particular, antibodies are obtained containing different CDR binding sites or having different specificities. , in particular, in which two different Fv regions are obtained.
Вышеизложенное описание будет в более полной мере понято со ссылкой на следующие примеры. Однако такие примеры являются только типичными для способов осуществления одного или более вариантов реализации настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения.The foregoing description will be more fully understood with reference to the following examples. However, such examples are only representative of the methods for implementing one or more embodiments of the present invention and should not be construed as limiting the scope of the present invention.
ПРИМЕРЫEXAMPLES
Пример 1: B10v5 х hu225M SEEDExample 1: B10v5 x hu225M SEED
Описано биспецифическое антитело со структурой IgG. B10v5-Fab связывается с человеческим с-МЕТ, тогда как hu225M-Fab связывается с человеческим EGFR (рецептор эпидермального фактора роста). Контактная поверхность между легкой цепью hu225M и тяжелой цепью hu225M содержит мутации, которые направляют обе легкие цепи биспецифического IgG к их когнатным тяжелым цепям. Домены СН3 антитела заменяли доменами SEED (также называемыми SEED-AG или SEED-GA, Davis et al. 2010 и US 20070287170 A1), чтобы обеспечить гетеродимеризацию тяжелых цепей. Исследование методом LC-ESI-MS применяли для подтверждения правильности сборки всех четырех цепей. В дальнейшем для описания этого биспецифического IgG будет использован термин ВхМ.A bispecific antibody with an IgG structure is described. B10v5-Fab binds to human c-MET while hu225M-Fab binds to human EGFR (epidermal growth factor receptor). The contact surface between the hu225M light chain and the hu225M heavy chain contains mutations that direct both bispecific IgG light chains to their cognate heavy chains. The CH3 domains of the antibody were replaced with SEED domains (also referred to as SEED-AG or SEED-GA, Davis et al. 2010 and US 20070287170 A1) to allow heavy chain heterodimerization. An LC-ESI-MS study was used to confirm the correct assembly of all four strands. In the following, the term VxM will be used to describe this bispecific IgG.
Все указанные далее цепи клонировали по отдельности в вектор рТТ5 (Национальный исследовательский совет Канады) для экспрессии в системе млекопитающих.All of the following chains were cloned individually into the pTT5 vector (National Research Council of Canada) for expression in a mammalian system.
Тяжелая цепь hu225M с SEED-GA была названа hu225M_HC_GA (SEQ ID 6):The hu225M heavy chain with SEED-GA was named hu225M_HC_GA (SEQ ID 6):
подчеркнуто: сигнальный пептид 
Легкая цепь hu225M была названа hu225M_LC (SEQ ID 8):The hu225M light chain was named hu225M_LC (SEQ ID 8):
подчеркнуто: сигнальный пептид 
Тяжелая цепь B10v5 с SEED-AG была названа В 10v5_HC_AG (SEQ ID 9):The B10v5 heavy chain with SEED-AG was named B 10v5_HC_AG (SEQ ID 9):
подчеркнуто: сигнальный пептид 
Легкая цепь B10v5 была названа В 10v5_LC (SEQ ID 11):The B10v5 light chain was named B 10v5_LC (SEQ ID 11):
подчеркнуто: сигнальный пептид 
Введение мутаций контактной поверхности в hu225MIntroduction of contact surface mutations in hu225M
Мутации вводили с помощью сайт-направленного мутагенеза с использованием набора для направленного мутагенеза QuikChange Lightning (каталожный номер 210519, Agilent Technologies) в соответствии с протоколом производителя. Мутацию K26D вводили в CH1 hu225M_HC_AG, и мутацию T18R вводили в CL hu225M_LC. Успешное введение мутации подтверждали секвенированием гена, представляющего интерес.Mutations were introduced by site-directed mutagenesis using the QuikChange Lightning site-directed mutagenesis kit (catalog number 210519, Agilent Technologies) according to the manufacturer's protocol. A K26D mutation was introduced into hu225M_HC_AG CH1 and a T18R mutation was introduced into hu225M_LC CL. Successful introduction of the mutation was confirmed by sequencing the gene of interest.
Тяжелая цепь hu225M с мутацией K26D была названа hu225M_HC_resQ28_GA (SEQ ID 12):The hu225M heavy chain with the K26D mutation was named hu225M_HC_resQ28_GA (SEQ ID 12):
подчеркнуто: сигнальный пептид 
Легкая цепь hu225M с мутацией T18R была названа hu225M_LC_MB40 (SEQ ID 13)The hu225M light chain with the T18R mutation was named hu225M_LC_MB40 (SEQ ID 13)
подчеркнуто: сигнальный пептид 
Экспрессия и очистка ВхМ дикого типа и мутантного ВхМ МаВ40 в клетках Expi293F™Expression and purification of wild-type and mutant BxM MaB40 in Expi293F™ cells
ВхМ экспрессировали с использованием клеток Expi293F™ и набора для трансфекции ExpiFectamine™ 293 (ThermoFisher, А14525) в соответствии с протоколом производителя. Были запланированы две различные трансфекции:VCM was expressed using Expi293F™ cells and ExpiFectamine™ 293 transfection kit (ThermoFisher, A14525) according to the manufacturer's protocol. Two different transfections were planned:
ДНК, кодирующая каждую цепь, была на четырех различных плазмидах. Молярное соотношение плазмид во время трансфекции составило 2:1:1:1 (тяжелая цепь В10v5:легкая цепь В10v5:тяжелая цепь hu225М:легкая цепь hu225M).The DNA encoding each strand was on four different plasmids. The molar ratio of plasmids during transfection was 2:1:1:1 (B10v5 heavy chain: B10v5 light chain: hu225M heavy chain: hu225M light chain).
Мутант ВхМ МаВ40 содержал мутацию K26D на СН1 из hu225M (hu225M_HC_resQ28_GA, SEQ ID 12) и T18R на CL из hu225M (hu225M_LC_MB40, SEQ ID 13), тогда как ВхМ дикого типа не содержал мутацию. Культуры центрифугировали, и супернатанты, содержащие представляющий интерес белок, фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм и очищали с использованием набора для очистки антител Montage и колонок для центрифугирования со средами PROSEP-A (Merck-Millipore, LSK2ABA20) в соответствии с инструкциями производителя. Очищенный ВхМ дикого типа и ВхМ МаВ40 концентрировали с использованием Amicon ultra-15, НОММ 10 кДа, и затем подвергали диализу с использованием диализных кассет Slide-A-Lyser 0,5-3 мл с НОММ 7000 (ThermoFisher, каталожный номер 66370) против фосфатно-солевого буфера (ФСБ). В общей сложности ВхМ дикого типа и ВхМ МаВ40 дважды независимо экспрессировали, очищали и исследовали. Оба параллельных опыта привели к сходным результатам.The BxM MaB40 mutant contained the K26D mutation on CH1 from hu225M (hu225M_HC_resQ28_GA, SEQ ID 12) and T18R on CL from hu225M (hu225M_LC_MB40, SEQ ID 13), while wild-type BxM did not contain the mutation. Cultures were centrifuged and supernatants containing the protein of interest were filtered through a 0.22 µm filter and purified using the Montage Antibody Purification Kit and PROSEP-A Media Centrifugation Columns (Merck-Millipore, LSK2ABA20) as instructed. manufacturer. Purified wild-type VxM and MaB40 VxM were concentrated using Amicon ultra-15, HOMM 10 kDa, and then dialyzed using Slide-A-Lyser 0.5-3 ml dialysis cassettes with HOMM 7000 (ThermoFisher, catalog number 66370) against phosphate -salt buffer (FSB). A total of wild-type VxM and MaB40 VxM were twice independently expressed, purified and tested. Both parallel experiments led to similar results.
Исследование методом LC-ESI-MS для анализа спаривания цепейLC-ESI-MS study for strand pairing analysis
N-гликаны обоих образцов высвобождали с использованием PNGaзы F перед измерением с помощью системы LC-ESI-MS. Рассчитывали массы всех десяти возможных вариантов спаривания цепей, и масс-спектры исследовали для определения их присутствия. Вариант с ошибочным спариванием, который содержал четыре разные цепи, но обе легкие цепи были связаны с некогнатными для них тяжелыми цепями (т.е. ВхМ с переставленными легкими цепями), имеет такую же массу, как и правильно собранный ВхМ, и, следовательно, не отличим от правильно спаренного ВхМ. Однако если ошибочное спаривание одной или обеих легких цепей с некогнатными для них тяжелыми цепями не поддается детектированию, то можно статистически исключить присутствие ВхМ с переставленными легкими цепями. Аналогичным образом, если ошибочное спаривание обеих легких цепей детектируется только в небольших количествах (относительное содержание <5%), тогда указанный вариант с ошибочным спариванием будет присутствовать только в незначительных количествах (<1%).The N-glycans of both samples were released using PNGase F before being measured with the LC-ESI-MS system. The masses of all ten possible chain pairings were calculated and the mass spectra were examined to determine their presence. A mismatched variant that contained four different chains, but both light chains were linked to their non-cognate heavy chains (i.e., BxM with rearranged light chains), has the same mass as a correctly assembled BxM, and therefore indistinguishable from a correctly paired VxM. However, if the mismatch of one or both light chains with non-cognate heavy chains cannot be detected, then the presence of BxM with rearranged light chains can be statistically excluded. Similarly, if the mismatch of both light chains is only detected in small amounts (<5% relative abundance), then the mismatched variant will only be present in small amounts (<1%).
Гомодимеры тяжелых цепей не детектировали ни в одном из образцов (Фигура 1). В ВхМ дикого типа обе легкие цепи были способны связываться с некогнатной для них тяжелой цепью в одинаковых количествах (относительное содержание 12% в обоих случаях), что привело лишь к 76% правильно спаренного ВхМ (не учитывая ВхМ с переставленными легкими цепями). В ВхМ МаВ40 ошибочное спаривание не поддавалось детектированию, и детектировали только правильно спаренный биспецифический IgG.Heavy chain homodimers were not detected in any of the samples (Figure 1). In wild-type VxM, both light chains were able to bind to their non-cognate heavy chain in equal amounts (
В заключение следует отметить, что введение мутаций контактной поверхности привело к полному исчезновению ошибочного спаривания легкой цепи с тяжелой цепью.In conclusion, it should be noted that the introduction of contact surface mutations led to the complete disappearance of the mismatch of the light chain with the heavy chain.
Эксклюзионная ВЭЖХ (HPLC-SEC)Size Exclusion HPLC (HPLC-SEC)
ВхМ дикого типа и ВхМ МаВ40 исследовали с использованием эксклюзионной хроматографии (SEC). Обе хроматограммы показали основной пик через 15,6 мин, который ожидался для IgG. Признаки агрегации детектировали как у мутанта, так и у дикого типа (Фигура 2).Wild-type VxM and VxM MaB40 were examined using size exclusion chromatography (SEC). Both chromatograms showed the main peak at 15.6 min, which was expected for IgG. Signs of aggregation were detected in both the mutant and the wild type (Figure 2).
Количественное исследование термического сдвига для определения термостабильностиQuantitative study of thermal shift to determine thermal stability
Количественное исследование термического сдвига проводили с использованием системы для ПЦР в режиме реального времени Step One Plus. Концентрация ВхМ дикого типа и ВхМ МаВ40 составила 1 мкМ в ФСБ, также использовали краситель Sypro Orange (Invitrogen) в конечной концентрации 20×. Оба образца измеряли с тремя повторами. Термограмма ВхМ дикого типа выявила два события разворачивания при 64,8°С и 74,5°С. Термограмма ВхМ МаВ40 выявила два события разворачивания при 64,6°С и 74,6°С. Соответственно, мутации контактной поверхности не нарушают термостабильность белка.Thermal shift was quantified using the Step One Plus real-time PCR system. The concentration of wild-type VxM and VxM MaB40 was 1 μM in PBS, Sypro Orange dye (Invitrogen) was also used at a final concentration of 20x. Both samples were measured in triplicate. The wild-type VCM thermogram revealed two unfolding events at 64.8°C and 74.5°C. The BxM MaB40 thermogram revealed two unfolding events at 64.6°C and 74.6°C. Accordingly, contact surface mutations do not impair protein thermal stability.
Аффинность ВхМ в отношении его антигеновAffinity of VxM for its antigens
Аффинность ВхМ дикого типа и МаВ40 исследовали с использованием системы Octet с биосенсорами, покрытыми белком А. В качестве антигенов использовали внеклеточные домены сМЕТ и EGFR. Для определения аффинности испытывали три различные концентрации антител. KD ВхМ дикого типа в отношении сМЕТ составила 0,35 нМ, и 5,3 нМ в отношении EGFR. KD ВхМ МаВ40 в отношении сМЕТ составила 0,42 нМ и 2,9 нМ в отношении EGFR, это подтверждает то, что мутации контактной поверхности не нарушают аффинность антитела.The affinity of wild-type BxM and MaB40 was studied using the Octet system with biosensors coated with protein A. The extracellular domains of cMET and EGFR were used as antigens. Three different antibody concentrations were tested to determine affinity. The wild-type K D VxM for cMET was 0.35 nM, and 5.3 nM for EGFR. The K D VxM of MaB40 for cMET was 0.42 nM and 2.9 nM for EGFR, confirming that contact surface mutations do not impair antibody affinity.
Одновременное связывание обоих антигеновSimultaneous binding of both antigens
Способность ВхМ одновременно связываться с обоими своими антигенами подтверждали с использованием системы Octet с биосенсорами, покрытыми стрептавидином. Сначала биосенсоры погружали в раствор, содержащий биотинилированный сМЕТ. После гашения и замены буфера биосенсоры погружали в растворы, содержащие ВхМ дикого типа или ВхМ МаВ40. В обоих случаях детектировали связывание антитела с его первым антигеном. После этого биосенсоры погружали в раствор, содержащий EGFR, и детектировали связывание дикого типа и МаВ40 со вторым антигеном.The ability of VxM to simultaneously bind to both of its antigens was confirmed using the Octet system with streptavidin-coated biosensors. First, the biosensors were immersed in a solution containing biotinylated CMET. After quenching and buffer replacement, the biosensors were immersed in solutions containing wild-type VxM or MaB40 VxM. In both cases, binding of the antibody to its first antigen was detected. After that, the biosensors were immersed in a solution containing EGFR, and the binding of wild type and MaB40 to the second antigen was detected.
Влияние мутаций контактной поверхности на выход в НЕK293-6ЕEffect of Contact Surface Mutations on Yield in HEK293-6E
ВхМ дикого типа и ВхМ МаВ40 экспрессировали в клетках НЕK293-6Е (Национальный исследовательский совет Канады) с использованием кратковременной трансфекции полиэтиленимином (ПЭИ) в соответствии со стандартными методиками. Экспрессированные IgG очищали с помощью аффинной хроматографии с белком А и подвергали диализу против ФСБ. Поглощение образцов обоих белков измеряли при 280 нм для определения концентрации. В общей сложности оба белка трижды независимо экспрессировали, очищали и измеряли, и рассчитывали средний выход. Выход ВхМ дикого типа составил 57,3 мг/л (±13,7 стандартного отклонения), и выход ВхМ МаВ40 составил 58,9 мг/л (±7,3 стандартного отклонения), это указывает на то, что модификация контактной поверхности не оказывает неблагоприятного влияния на выход белка.Wild-type VxM and VxM MaB40 were expressed in HEK293-6E cells (National Research Council of Canada) using transient polyethyleneimine (PEI) transfection according to standard procedures. Expressed IgGs were purified by protein A affinity chromatography and dialyzed against PBS. The absorbance of both protein samples was measured at 280 nm to determine the concentration. In total, both proteins were independently expressed, purified and measured three times, and the average yield was calculated. The wild type VxM yield was 57.3 mg/L (±13.7 SD) and the MaB40 VCM yield was 58.9 mg/L (±7.3 SD), indicating that the contact surface modification was not has an adverse effect on protein yield.
Пример 2: B10v5xOKT3 SEEDExample 2: B10v5xOKT3 SEED
Описано биспецифическое антитело IgG, структура которого аналогична той, которая описана в примере 1. B10v5-Fab связывается с человеческим с-МЕТ, тогда как ОKТ3-Fab связывается с человеческим CD3. Контактная поверхность между легкой цепью ОKТ3 и тяжелой цепью ОKТ3 содержит те же мутации, что описаны в примере 1. Помимо этого в B10v5-Fab вводили мутации, чтобы дополнительно обеспечить правильное спаривание легкой и тяжелой цепей. Как указано выше, технологию SEED применяли для гетеродимеризации тяжелых цепей. Исследование методом LC-ESI-MS применяли для подтверждения правильности сборки всех четырех цепей. В дальнейшем для описания этого биспецифического IgG будет использован термин ВхО.A bispecific IgG antibody is described with a structure similar to that described in Example 1. B10v5-Fab binds to human c-MET, while OKT3-Fab binds to human CD3. The contact surface between the OKT3 light chain and the OKT3 heavy chain contains the same mutations as described in Example 1. In addition, mutations were introduced into B10v5-Fab to further ensure correct pairing of the light and heavy chains. As noted above, SEED technology has been used to heterodimerize heavy chains. An LC-ESI-MS study was used to confirm the correct assembly of all four strands. In the following, the term WxO will be used to describe this bispecific IgG.
Клонирование конструкцийCloning designs
Тяжелая цепь B10v5 (SEQ ID 9) и легкая цепь (SEQ ID 11) описаны в примере 1.The B10v5 heavy chain (SEQ ID 9) and light chain (SEQ ID 11) are described in Example 1.
Все указанные далее цепи клонировали по отдельности в вектор рТТ5 (Национальный исследовательский совет Канады) для экспрессии в системе млекопитающих.All of the following chains were cloned individually into the pTT5 vector (National Research Council of Canada) for expression in a mammalian system.
Тяжелая цепь ОKТ3 была названа OKT3_HC_GA (SEQ ID 14)The heavy chain of OKT3 has been named OKT3_HC_GA (SEQ ID 14)
подчеркнуто: сигнальный пептид 
Легкая цепь ОKТ3 была названа OKT3_LC (SEQ ID 15)The OKT3 light chain has been named OKT3_LC (SEQ ID 15)
подчеркнуто: сигнальный пептид 
Введение мутаций контактной поверхности в ОKТ3 и B10v5Introduction of contact surface mutations in OKT3 and B10v5
Мутации вводили с помощью сайт-направленного мутагенеза с использованием набора для направленного мутагенеза QuikChange Lightning (каталожный номер 210519, Agilent Technologies) в соответствии с протоколом производителя, как описано выше. В ОKТ3 вводили мутации K26D в СН1 и T18R в CL. В B10v5 вводили мутации A20L в СН1 и либо F7S, F7A либо F7V в CL. Успешное введение мутаций подтверждали секвенированием гена, представляющего интерес.Mutations were introduced by site-directed mutagenesis using the QuikChange Lightning site-directed mutagenesis kit (catalog number 210519, Agilent Technologies) according to the manufacturer's protocol as described above. In OKT3, mutations K26D in CH1 and T18R in CL were introduced. B10v5 introduced mutations A20L in CH1 and either F7S, F7A or F7V in CL. Successful introduction of mutations was confirmed by sequencing of the gene of interest.
Тяжелая цепь ОKТ3 с мутацией K26D была названа OKT3_HC_resQ28_GA (SEQ ID 16)The OKT3 heavy chain with the K26D mutation was named OKT3_HC_resQ28_GA (SEQ ID 16)
подчеркнуто: сигнальный пептид 
Легкая цепь ОKТ3 с мутацией T18R была названа OKT3_LC_MB40 (SEQ ID 17)The OKT3 light chain with the T18R mutation was named OKT3_LC_MB40 (SEQ ID 17)
подчеркнуто: сигнальный пептид
Тяжелая цепь B10v5 с мутацией A20L была названа В 10v5_HC_resQ203_AG (SEQ ID 18)The B10v5 heavy chain with the A20L mutation was named B 10v5_HC_resQ203_AG (SEQ ID 18)
подчеркнуто: сигнальный пептид 
Легкая цепь B10v5 с мутацией F7S была названа В 10v5_LC_MB9 (SEQ ID 19)The B10v5 light chain with the F7S mutation was named B 10v5_LC_MB9 (SEQ ID 19)
подчеркнуто: сигнальный пептид 
Легкая цепь B10v5 с мутацией F7A была названа В 10v5_LC_MB21 (SEQ ID 20)The B10v5 light chain with the F7A mutation was named B 10v5_LC_MB21 (SEQ ID 20)
подчеркнуто: сигнальный пептид
Легкая цепь B10v5 с мутацией F7V была названа В 10v5_LC_MB45 (SEQ ID 21)The B10v5 light chain with the F7V mutation was named B 10v5_LC_MB45 (SEQ ID 21)
подчеркнуто: сигнальный пептид 
Экспрессия и очистка ВхО дикого типа и мутантов ВхО МаВ40, ВхО МаВ5/40, ВхО МаВ 21/40 и ВхО МаВ45/40 в клетках НЕK293-6ЕExpression and purification of wild-type VxO and BxO MaB40, VxO MaB5/40, VxO MaB21/40, and VxO MaB45/40 mutants in HEK293-6E cells
Биспецифические антитела экспрессировали в клетках FIEK293-6E с использованием кратковременной трансфекции полиэтиленимином (ПЭИ) в соответствии со стандартными методиками. Были запланированы четыре различные трансфекции:Bispecific antibodies were expressed in FIEK293-6E cells using transient polyethyleneimine (PEI) transfection according to standard procedures. Four different transfections were planned:
ДНК, кодирующая каждую цепь, была на четырех разных плазмидах. Молярное соотношение плазмид во время трансфекции составило 2:1:1:1 (тяжелая цепь В10v5:легкая цепь В10v5:тяжелая цепь ОKТ3:легкая цепь ОKТ3). Культуры собирали через 5 дней после трансфекции с помощью центрифугирования, и супернатанты очищали с помощью аффинной хроматографии с белком А. Все образцы подвергали диализу против ФСБ.The DNA encoding each strand was on four different plasmids. The molar ratio of plasmids during transfection was 2:1:1:1 (B10v5 heavy chain:B10v5 light chain:OKT3 heavy chain:OKT3 light chain). Cultures were harvested 5 days after transfection by centrifugation and supernatants were purified by protein A affinity chromatography. All samples were dialyzed against PBS.
Исследование методом LC-ESI-MS для анализа спаривания цепейLC-ESI-MS study for strand pairing analysis
N-гликаны обоих образцов высвобождали с использованием PNGaзы F перед измерением. Исследование проводили, как описано в примере 1. Введение мутаций контактной поверхности привело к заметному уменьшению детектируемого ошибочного спаривания легкой цепи с тяжелой цепью (Фигура 3).The N-glycans of both samples were released using PNGase F prior to measurement. The study was carried out as described in Example 1. The introduction of contact surface mutations resulted in a marked reduction in detectable light chain-heavy chain mismatch (Figure 3).
Эксклюзионная хроматография ВЭЖХ (HPLC-SEC)Size Exclusion Chromatography HPLC (HPLC-SEC)
ВхО дикого типа, ВхО МаВ5/40 и ВХО МаВ45/40 исследовали с использованием SEC. Все хроматограммы показали основной пик через 15,5 мин, который ожидался для IgG (Фигура 4). Признаки агрегации детектировали у мутантов, а также дикого типа в сходных количествах.WxO wild-type, WxO MaB5/40 and WxO MaB45/40 were examined using SEC. All chromatograms showed the main peak at 15.5 min, which was expected for IgG (Figure 4). Signs of aggregation were detected in mutants, as well as wild type in similar amounts.
ОбсуждениеDiscussion
В примере 1 описано получение биспецифического антитела со структурой IgG, названного ВхМ, с мутациями в Fab hu225M или без них. Исследование ВхМ дикого типа с помощью LC-ESI-MS демонстрирует проблему получения биспецифического IgG без какой-либо модификации, чтобы обеспечить правильное спаривание легких цепей с их когнатными тяжелыми цепями. Обе легкие цепи были способны связываться с некогнатной для них тяжелой цепью до суммарного количества 24%, что, в свою очередь, означает, что правильно спаренный биспецифический IgG составлял только 76% образца очищенного белка.Example 1 describes the preparation of a bispecific IgG antibody called BxM with or without mutations in Fab hu225M. Examination of wild-type VxM by LC-ESI-MS demonstrates the problem of obtaining bispecific IgG without any modification to ensure the correct pairing of light chains with their cognate heavy chains. Both light chains were able to bind to their non-cognate heavy chain up to a total of 24%, which in turn means that correctly paired bispecific IgG made up only 76% of the purified protein sample.
Для создания мутанта ВхМ МаВ40 вводили только две точечные мутации: K26D в СН1 и T18R в CL, обе в hu225M Fab. Этих мутаций было достаточно, чтобы полностью ингибировать неправильное спаривание легкой цепи с тяжелой цепью. В отличие от предыдущих сообщений (Lewis er al. 2014, Liu et al. 2015), модификация вариабельных доменов не требовалась. Следовательно, мутации согласно настоящему изобретению потенциально могут широко применяться в различных других биспецифических антителах. Кроме того, исключение любой мутации в вариабельных доменах ограничивает риск нежелательного влияния на аффинность антитела в отношении его антигена.Only two point mutations were introduced to create the BxM MaB40 mutant: K26D in CH1 and T18R in CL, both in hu225M Fab. These mutations were sufficient to completely inhibit light chain-heavy chain mismatch. Contrary to previous reports (Lewis er al. 2014, Liu et al. 2015), modification of the variable domains was not required. Therefore, the mutations of the present invention have the potential to be widely used in various other bispecific antibodies. In addition, the exclusion of any mutation in the variable domains limits the risk of adversely affecting the affinity of an antibody for its antigen.
Дальнейшее изучение выявило, что мутации, введенные в ВхМ МаВ40, не оказывали неблагоприятного влияния на термическую стабильность, а также на выход белка. Кроме того, ВхМ МаВ40 обладал аффинностью в отношении обоих своих антигенов, сходной с таковой для ВхМ дикого типа, и был способен одновременно связываться с обоими антигенами, что было продемонстрировано с помощью интерферометрии биослоев. Эксклюзионная хроматография не выявила различий между ВхМ МаВ40 и ВхМ дикого типа, это доказывает, что мутации не приводят к повышенной агрегации или разрушению антитела.Further study revealed that mutations introduced into BxM MaB40 did not adversely affect thermal stability as well as protein yield. In addition, MaB40 BxM had an affinity for both of its antigens similar to that of wild-type BxM and was able to simultaneously bind to both antigens, as demonstrated by biolayer interferometry. Size exclusion chromatography showed no difference between MaB40 VxM and wild-type VxM, proving that the mutations do not lead to increased aggregation or degradation of the antibody.
Чтобы оценить, имеют ли идентифицированные мутации общее применение, конструировали другое биспецифическое антитело, ВхО, как показано в примере 2. Аналогично примеру 1, ВхО без мутаций (дикого типа) сравнивали с ВхО с мутациями K26D в СН1 и T18R в CL из Fab ОKТ3 (называемый ВхО МаВ40). Исследование ВхО дикого типа с помощью LC-ESI-MS выявило, что ошибочное спаривание легких цепей с некогнатными для них тяжелыми цепями было более распространенным, чем ошибочное спаривание, детектированное в ВхМ дикого типа. В целом более 40% детектированных IgG проявили ошибочное спаривание в Fab, что привело к менее чем 60% правильно спаренного ВхО. Исследование ВхО МаВ40 показало, что введение вышеупомянутых мутаций снова оказало значительное влияние на спаривание легких цепей. 74% детектированных IgG в ВхО МаВ40 были правильно спарены. Чтобы дополнительно обеспечить правильную сборку цепей, поддерживающие мутации вводили в другой Fab ВхО, т.е. B10v5 Fab, что привело к созданию ВхО МаВ5/40, ВхО МаВ21/40 и ВхО МаВ45/40. Во всех трех мутантах, содержащих поддерживающие мутации, количество правильно спаренных биспецифических IgG было значительно улучшено (относительное содержание >90% по данным LC-ESI-MS).To assess whether the identified mutations are of general utility, another bispecific antibody, VxO, was constructed as shown in Example 2. Similarly to Example 1, VxO without mutations (wild-type) was compared to VxO with K26D mutations in CH1 and T18R in CL from Fab OKT3 ( called WxO MaV40). LC-ESI-MS examination of wild-type VxO revealed that mismatches between light chains and non-cognate heavy chains were more common than mismatches detected in wild-type VxM. Overall, more than 40% of the detected IgGs mismatched in Fab, resulting in less than 60% of correctly matched WxO. The VxO MaB40 study showed that the introduction of the aforementioned mutations again had a significant effect on light chain pairing. 74% of the detected IgG in the WxO MaB40 were correctly paired. To further ensure correct chain assembly, maintenance mutations were introduced into another Fab VxO, i.e. B10v5 Fab, which led to the creation of VxO MaV5/40, VxO MaV21/40 and VxO MaV45/40. In all three maintenance mutants, the number of correctly paired bispecific IgGs was significantly improved (>90% relative content by LC-ESI-MS).
Исследование ВхО дикого типа, ВхО МаВ5/40 и ВХО МаВ45/40 методом эксклюзионной хроматографии продемонстрировало, что данные мутации не оказывают неблагоприятного влияния на антитело в отношении агрегации или разрушения.Examination of wild-type VxO, VxO MaB5/40 and VxO MaB45/40 by size exclusion chromatography demonstrated that these mutations do not adversely affect the antibody in terms of aggregation or degradation.
Пример 3: Поверхностное экспонирование боковых цепей аминокислот в положениях на контактной поверхности между СН1 и CLExample 3: Surface exposure of amino acid side chains at positions on the contact surface between CH1 and CL
Для расчета доступной для растворителя площади поверхности или энергии сольватации белков применяли программу GETAREA (Fraczkiewicz et al. 1998, J. Соmр. Chem., 19, 319-333). Атомные координаты фрагмента Fab человеческого IgG1, 1DFB.pdb, который представляет собой фрагмент Fab человеческого моноклонального антитела против gp41 вируса иммунодефицита человека типа 1 с доменами СН1 и CL дикого типа (Не et al. 1992, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89: 7154-7158), вводили в программу в качестве входных данных. Применяли радиус зонда 1,4 Ангстрем. Выходные данные программы для остатков ALA20 и LYS26 в домене СН1, а также РНЕ7 и THR18 в домене CL показаны в таблице I ниже.The GETAREA program (Fraczkiewicz et al. 1998, J. Comp. Chem., 19, 319-333) was used to calculate solvent accessible surface area or protein solvation energy. Atomic coordinates of a human IgG1 Fab fragment, 1DFB.pdb, which is a Fab fragment of a human anti-human
Вклады атомов остова и боковых цепей перечислены в 4 и 5 колонках, соответственно. В следующем столбце перечислено соотношение площади поверхности боковой цепи и значения «случайной спирали» на остаток. Значение «случайной спирали» остатка X представляет собой среднюю доступную для растворителя площадь поверхности X в трипептиде Gly-X-Gly в группе из 30 случайных конформаций. Остатки считаются подверженными воздействию растворителя, если значение соотношения превышает 50%, скрытыми, если соотношение меньше 20%, и не скрытыми, если соотношение составляет не менее 20%. Значения «случайной спирали» для 20 аминокислот приведены в таблице II ниже.The contributions of backbone and side chain atoms are listed in
Из результатов, показанных в таблице I выше, следует, что три из четырех остатков скрыты (значение соотношения (%) менее 5%), тогда как остаток THR18 в домене CL имеет значение соотношения (%) 38,3 и поэтому не скрыт.From the results shown in Table I above, three of the four residues are hidden (ratio (%) value less than 5%), while the THR18 residue in the CL domain has a ratio (%) value of 38.3 and is therefore not hidden.
Неожиданно было обнаружено, что мутантное положение THR18 в домене CL, которое не скрыто внутри контактной поверхности СН/СН1, приводит к улучшенному спариванию доменов CL/CH1. В частности, улучшенное спаривание было обнаружено при спаривании домена CL с доменом СН1, где остаток аминокислоты в положении 18 в домене CL имеет полярность, противоположную остатку аминокислоты в положении 26 в домене СН1, как подробно описано в настоящем документе.Surprisingly, it has been found that a mutant position of THR18 in the CL domain that is not hidden within the CH/CH1 contact surface results in improved CL/CH1 domain pairing. In particular, improved pairing has been found when a CL domain is paired with a CH1 domain where the amino acid residue at position 18 in the CL domain is in opposite polarity to the amino acid residue at
Этот факт был еще более неожиданным, поскольку в подходах к модификации в предшествующем уровне техники применяли определенные критерии для отбора пар остатков вдоль контактной поверхности тяжелой и легкой цепей, которые должны быть заменены заряженными остатками с противоположной полярностью. Согласно такими критериями в соответствии с предшествующим уровнем техники (например, Liu et al. Journal Of Biological Chemistry 2015, 290:7535-7562; и WO2014/081955A1) полагали принципиально важным, что все положения скрыты.This fact was even more surprising because prior art modification approaches used certain criteria to select pairs of residues along the contact surface of the heavy and light chains to be replaced with charged residues of opposite polarity. According to such prior art criteria (eg, Liu et al. Journal Of Biological Chemistry 2015, 290:7535-7562; and WO2014/081955A1), it has been considered essential that all provisions are hidden.
Соответственно, положение 18 в домене CL является исключением из этого правила предшествующего уровня техники и неожиданно способствует стабильности пары доменов CL/CH1, несмотря на то, что оно не скрыто внутри контактной поверхности СН1 и CL.Accordingly, position 18 in the CL domain is an exception to this prior art rule and unexpectedly contributes to the stability of the CL/CH1 domain pair despite not being hidden within the contact surface of CH1 and CL.
Claims (40)
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP17154388.7 | 2017-02-02 | ||
| EP17154388 | 2017-02-02 | ||
| PCT/EP2018/052624 WO2018141894A1 (en) | 2017-02-02 | 2018-02-02 | Preferred pairing of antibody domains |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2019119391A RU2019119391A (en) | 2021-03-02 |
| RU2019119391A3 RU2019119391A3 (en) | 2021-05-25 |
| RU2792440C2 RU2792440C2 (en) | 2023-03-22 |
| RU2792440C9 true RU2792440C9 (en) | 2023-06-08 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014081955A1 (en) * | 2012-11-21 | 2014-05-30 | Amgen Inc. | Heterodimeric immunoglobulins |
| RU2532832C2 (en) * | 2008-05-07 | 2014-11-10 | Аргос Терапьютикс, Инк. | Humanised antibodies against human alpha interferon |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2532832C2 (en) * | 2008-05-07 | 2014-11-10 | Аргос Терапьютикс, Инк. | Humanised antibodies against human alpha interferon |
| WO2014081955A1 (en) * | 2012-11-21 | 2014-05-30 | Amgen Inc. | Heterodimeric immunoglobulins |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ZHI L. et al., A Novel Antibody Engineering Strategy forMaking Monovalent Bispecific Heterodimeric IgG Antibodies by Electrostatic Steering Mechanism, 2015, Journal of Biological Chemistry, v. 290, n. 12, pp.7535-7562. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10982008B2 (en) | Domain-exchanged antibody | |
| JP2021524249A (en) | Anti-CD3 antibody and its use | |
| CN102239182B (en) | Muc1* antibodies | |
| WO2022174813A1 (en) | Anti-gprc5d×bcma×cd3 trispecific antibody and use thereof | |
| CN111683963B (en) | Cysteine engineered antigen binding molecules | |
| CN113056486A (en) | Improved anti-FLT3Antigen binding proteins | |
| US10836833B2 (en) | Cell engaging binding molecules | |
| CN110382537B (en) | Preferential pairing of antibody domains | |
| RU2792440C9 (en) | Preferential pairing of antibody domain | |
| RU2792440C2 (en) | Preferential pairing of antibody domain | |
| GB2576914A (en) | Antigen-binding molecules comprising unpaired variable domains produced in mammals | |
| JP6996825B2 (en) | Modified Cκ and CH1 domains | |
| WO2024094151A1 (en) | Multi-specific antibody and medical use thereof | |
| TW202346337A (en) | Ilt3 and cd3 binding agents and methods of use thereof | |
| TW202214705A (en) | Anti-tigit antibody and double antibody and their application |