RU2792435C2

RU2792435C2 - Full flow-through process for purifying recombinant proteins

Info

Publication number: RU2792435C2
Application number: RU2020131568A
Authority: RU
Inventors: Дидье ДЮТ; Селин ЭМЕ; Бенуа МОТ; Жером ПЕЦЦИНИ
Original assignee: Санофи
Priority date: 2018-03-27
Filing date: 2019-03-27
Publication date: 2023-03-22

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention presented is a protein purification method, including the following in a continuous mode: one filtration stage, including the use of at least one chelating agent, an exchange stage, characterized by the use of a diafiltration membrane, and a “polishing” stage, including the use of a combination of membrane adsorbers, where two membrane adsorbers of the specified combination are orthogonal with mechanism of action point of view. Also disclosed is a kit suitable for purifying protein from solution.

EFFECT: invention allows to obtain a new method for protein purification, mainly using only one buffer, with the possibility of obtaining a high yield of purified molecules with an excellent degree of purity, which allows to use these molecules for medical purposes.

20 cl, 5 dwg, 3 tbl, 4 ex

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИFIELD OF TECHNOLOGY

Изобретение относится к способу полностью проточной очистки для мелкомасштабной и крупномасштабной очистки белков, в частности, моноклональных антител.The invention relates to a full flow purification method for small scale and large scale purification of proteins, in particular monoclonal antibodies.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE INVENTION

Очистка антител может быть одним из самых дорогостоящих аспектов биопродукции. Моноклональные антитела (mAb) обычно очищают с использованием трехстадийной хроматографии на трех смолах, используя по меньшей мере определенную буферную систему на каждой стадии. Этот традиционный способ очистки включает стадию улавливания, за которой следует стадия промежуточной очистки, и завершается «полирующей» стадией и обычно занимает от 3 до 5 рабочих дней (включая хранение и открытые фазы). В таких традиционных способах эти три стадии выполняются в виде последовательности отдельных единичных операций, которые не могут работать в непрерывном режиме, поскольку между каждой стадией необходимы регуляция pH, молярности и концентрации белка. Соответственно, традиционные способы очистки обычно требуют множества различных буферов, а также множества единиц хранения между каждой прерванной стадией и несколькими системами. Таким образом, эти традиционные способы подвержены загрязнению, техническим сбоям и человеческим ошибкам. Кроме того, поскольку необходим перерыв между каждой стадией для концентрирования элюата, регуляции pH и проводимости и хранения элюата перед следующей стадией, и, поскольку стадия не может начаться до завершения предыдущей, такие традиционные способы очистки являются особенно длительными и дорогостоящими. Purification of antibodies can be one of the most costly aspects of bioproduction. Monoclonal antibodies (mAbs) are typically purified using three step chromatography on three resins using at least a specific buffer system at each step. This traditional cleaning process includes a capture step, followed by an intermediate cleaning step, and ends with a "polishing" step, and typically takes 3 to 5 working days (including storage and open phases). In such conventional methods, these three steps are performed as a series of separate unit operations that cannot be run continuously because adjustment of pH, molarity and protein concentration is necessary between each step. Accordingly, traditional purification methods typically require many different buffers as well as many storage units between each interrupted stage and multiple systems. Thus, these traditional methods are subject to contamination, technical failures and human error. In addition, since a break is needed between each step to concentrate the eluate, adjust the pH and conductivity, and store the eluate before the next step, and since the step cannot start until the previous one is completed, such conventional purification methods are particularly time consuming and costly.

Высокая стоимость традиционных способов также объясняется общим использованием матрицы протеина А в качестве первой стадии очистки. Действительно, исторически сложилось так, что наиболее селективную смолу обычно добавляют на ранней стадии процесса, как в случае с протеином А, чтобы удалить как можно больше примесей. Однако даже если протеин А является наиболее селективной средой для очистки моноклональных антител, в процессе все еще остаются загрязнители. Эта стадия также является самой дорогой из всего процесса, в том числе потому, что она используется в качестве первой стадии при контакте с большим количеством загрязняющих веществ. Кроме того, оставшиеся загрязнители очень трудно удалить, чтобы обеспечить соответствие фармацевтическим спецификациям.The high cost of traditional methods is also due to the general use of the protein A matrix as the first purification step. Indeed, historically, the most selective resin is usually added early in the process, as is the case with Protein A, to remove as many impurities as possible. However, even if protein A is the most selective medium for purifying monoclonal antibodies, contaminants still remain in the process. This step is also the most expensive of the entire process, also because it is used as the first step when it comes into contact with a lot of contaminants. In addition, the remaining contaminants are very difficult to remove to ensure compliance with pharmaceutical specifications.

С увеличением титров клеточных культур и увеличением объемов клеточных культур, используемых для производства, последующая переработка рассматривается как узкое место в отрасли. Это особенно актуально для производства моноклональных антител, где акцент сместился с объема партии в сторону возможностей последующей обработки. Кроме того, исследования на ранней доклинической и клинической фазах требуют большего количества антител, которые могут вырабатываться быстрее. Следовательно, в промышленности существует потребность в более дешевом процессе, который может осуществляться в непрерывном режиме, для очистки белков, в частности для очистки антител, а также в сокращении времени, необходимого для получения партий, с учетом рисков загрязнения, технических сбоев и человеческих ошибок, а также требований к масштабированию процесса.With increasing cell culture titers and increasing volumes of cell cultures used for manufacturing, downstream processing is seen as a bottleneck in the industry. This is especially true for the production of monoclonal antibodies, where the emphasis has shifted from batch size to post-processing capabilities. In addition, studies in the early preclinical and clinical phases require more antibodies, which can be produced more quickly. Therefore, there is a need in the industry for a cheaper process that can be run continuously for protein purification, in particular for antibody purification, as well as to reduce the time required to obtain batches, taking into account the risks of contamination, technical failures and human errors. and process scaling requirements.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION

Авторы изобретения нашли новый способ очистки белков, в частности, антител, причем указанный способ включает только три стадии в непрерывном полностью проточном режиме, ни одна из этих стадий не включает протеин А, и преимущественно с использованием только одного буфера, при этом с возможностью получать высокие выходы очищенных антител с отличной степенью чистоты. Таким образом, очищенные белки подходят для медицинского применения. Соответственно, способ можно использовать для очистки белков для клинических испытаний и/или для производства фармацевтической композиции, содержащей белок. Кроме того, этот способ не требует какой-либо межстадийной регуляции и, таким образом, может выполняться в закрытой системе от сбора белков, которые необходимо очистить, до конечного продукта.The inventors have found a new way to purify proteins, in particular antibodies, and this method includes only three stages in a continuous full flow mode, none of these stages includes protein A, and mainly using only one buffer, while being able to obtain high yields of purified antibodies with excellent purity. Thus, the purified proteins are suitable for medical applications. Accordingly, the method can be used to purify proteins for clinical trials and/or to manufacture a pharmaceutical composition containing the protein. In addition, this method does not require any inter-step regulation and thus can be performed in a closed system from the collection of proteins to be purified to the final product.

Вкратце, этот метод состоит только из трех последовательных стадий, причем более дешевая технология, направленная на удаление большого количества загрязняющих веществ, используется в качестве первой стадии, технологии, используемые для второй и третьей стадии, становятся все более и более селективными, чтобы удалить оставшиеся небольшие количества загрязняющих веществ и, следовательно, используется в меньших объемах по сравнению с их использованием в традиционных процессах.Briefly, this method consists of only three successive stages, with the cheaper technology aimed at removing a large amount of contaminants being used as the first stage, the technologies used for the second and third stages are becoming more and more selective in order to remove the remaining small quantities of contaminants and therefore used in smaller quantities compared to their use in traditional processes.

Таким образом, способ по изобретению включает в непрерывном режиме: одну стадию фильтрации, включающую использование по меньшей мере одного хелатирующего агента, стадию обмена, включающую использование по меньшей мере одной диафильтрационной мембраны, и «полирующую» стадию, включающую использование комбинации мембранных адсорберов, в которых два мембранных адсорбера из указанной комбинации мембранных адсорберов ортогональны по механизму действия. Способ согласно изобретению схематически изображен на Фигуре 1. Эти три стадии очистки преимущественно осуществляют в этом конкретном порядке. Кроме того, было обнаружено, что только один буфер, а именно буфер, используемый для стадии обмена, должен использоваться в течение всего процесса. Другими словами, уравновешивающий буфер, необязательно используемый на «полирующей» стадии, преимущественно идентичен буферу, используемому на стадии обмена. Этот буфер преимущественно включает бис-Tris, Tris, Tris-HCl, фосфат и/или лимонную кислоту, например, в комбинации с NaCl, уксусной кислотой и водой. В частности, можно использовать только один буфер для всего процесса, обеспечивая совместимость между всеми стадиями и позволяя экономить на производстве и контроле качества в цепочке поставок и уменьшая потребности в хранении.Thus, the process of the invention comprises in continuous mode: one filtration step comprising the use of at least one chelating agent, an exchange step comprising the use of at least one diafiltration membrane, and a "polishing" step comprising the use of a combination of membrane adsorbers in which two membrane adsorbers from the indicated combination of membrane adsorbers are orthogonal in their mechanism of action. The process according to the invention is shown schematically in Figure 1. These three purification steps are advantageously carried out in this particular order. Furthermore, it has been found that only one buffer, namely the buffer used for the exchange step, needs to be used throughout the entire process. In other words, the balancing buffer, optionally used in the "polishing" stage, is substantially identical to the buffer used in the exchange stage. This buffer advantageously comprises bis-Tris, Tris, Tris-HCl, phosphate and/or citric acid, for example in combination with NaCl, acetic acid and water. In particular, it is possible to use only one buffer for the entire process, ensuring compatibility between all stages and saving on production and quality control in the supply chain and reducing storage needs.

Способ по изобретению дополнительно позволяет отменить открытые фазы (то есть стадии, на которых система очистки открывается для выполнения ручной операции, такой как подготовка хроматографической колонки для нового буфера, разбавление образца или регуляция его pH), тем самым снижая риск загрязнения и предоставляя возможность работать в менее классифицированной окружающей среде. Кроме того, поскольку способ по изобретению преимущественно не включает использование какой-либо колонки и в основном использует мембранные адсорберы, которые являются одноразовыми и готовыми к использованию, нет необходимости в хранении или проверке повторного использования, не требуется подготовка или упаковка колонки, а также связанных элементов управления, отсутствует проверка чистоты и используется ограниченное оборудование. Таким образом, время технологического цикла сокращается, требования к масштабированию процесса сводятся к минимуму, и это позволяет сократить расходы на эксплуатацию и хранение. Следовательно, способ по изобретению позволяет как быстрое рентабельное производство партий, так и сокращение времени работы систем очистки. Таким образом, он подходит для масштабирования и очистки рекомбинантных белков от лабораторного до промышленного.The method of the invention further allows for the elimination of open phases (i.e., the steps in which the purification system is opened to perform a manual operation such as preparing a chromatographic column for new buffer, diluting a sample, or adjusting its pH), thereby reducing the risk of contamination and allowing operation in less classified environment. In addition, since the method of the invention advantageously does not involve the use of any column and mainly uses membrane adsorbers that are disposable and ready to use, there is no need for storage or verification of reuse, preparation or packaging of the column, and associated items. management, there is no cleanliness check and limited equipment is used. In this way, cycle times are shortened, process scale-up requirements are minimized, and operating and storage costs are reduced. Consequently, the method according to the invention allows both rapid cost-effective production of batches and a reduction in the operating time of cleaning systems. Thus, it is suitable for scale-up and purification of recombinant proteins from laboratory to industrial scale.

Для двух разных антител был разработан и реализован специальный протокол. В этом протоколе отфильтрованный белковый раствор, полученный в конце первой стадии фильтрации, пропускается непосредственно через по меньшей мере одну диафильтрационную мембрану, т.е. без какой-либо обработки, такой как регуляция pH, замена буфера или разбавление, а ретентат, полученный в конце стадии обмена, также проходит непосредственно через комбинацию по меньшей мере двух мембранных адсорберов, то есть без какой-либо обработки, такой как регуляция pH, замена буфера или разбавление. Преимущество этого протокола состоит в том, что он чрезвычайно быстрый (несколько часов), приводит к высокому выходу (более 70%), чистоте, совместимой со стандартами фармацевтической промышленности, и позволяет уменьшить количество используемых буферов и хранений. Более того, этот способ имеет то преимущество, что он чрезвычайно гибок и экономичен, поскольку он не включает использование матрицы протеина А, который обычно является наиболее дорогостоящим элементом традиционных процессов. Кроме того, он может быть полностью автоматизирован, работать в непрерывном режиме и не содержать открытой фазы. Более того, он был успешно выполнен для двух разных антител.A special protocol was developed and implemented for two different antibodies. In this protocol, the filtered protein solution obtained at the end of the first filtration step is passed directly through at least one diafiltration membrane, i. without any treatment such as pH adjustment, buffer exchange or dilution, and the retentate obtained at the end of the exchange step also passes directly through the combination of at least two membrane adsorbers, i.e. without any treatment such as pH adjustment, buffer exchange or dilution. The advantage of this protocol is that it is extremely fast (several hours), results in high yields (over 70%), purity compatible with pharmaceutical industry standards, and allows for reduced buffers and storages. Moreover, this method has the advantage of being extremely flexible and economical since it does not involve the use of a protein A matrix, which is usually the most expensive element of traditional processes. In addition, it can be fully automated, run continuously and contain no open phase. Moreover, it has been successfully performed for two different antibodies.

Таким образом, изобретение относится к способу очистки белка из раствора, включающему:Thus, the invention relates to a method for purifying a protein from a solution, comprising:

(a) стадию фильтрации, включающую: (a) a filtering step comprising:

пропускание указанного раствора по меньшей мере через одну матрицу хелатирующего агента в проточном режиме, passing said solution through at least one chelating agent matrix in flow mode,

извлечение отфильтрованного белкового раствора из фильтрата указанной по меньшей мере одной матрицы хелатирующего агента;extracting the filtered protein solution from the filtrate of said at least one chelating agent matrix;

(b) стадию обмена, включающую: (b) an exchange step comprising:

пропускание отфильтрованного белкового раствора, полученного в конце стадии (а), по меньшей мере через одну диафильтрационную мембрану с использованием только одного буфера для обмена, passing the filtered protein solution obtained at the end of step (a) through at least one diafiltration membrane using only one exchange buffer,

извлечение частично очищенного ретентата, содержащего белок, указанной по меньшей мере одной диафильтрационной мембраны;extracting a partially purified retentate containing protein of said at least one diafiltration membrane;

(c) «полирующую» стадию, включающую: (c) a "polishing" step comprising:

пропускание ретентата, полученного в конце стадии (b), через комбинацию мембранных адсорберов в проточном режиме, при этом два мембранных адсорбера из указанной комбинации мембранных адсорберов ортогональны с точки зрения механизмов действия, и указанная комбинация мембранных адсорберов была предварительно уравновешена уравновешивающим буфером, который идентичен одному буферу, используемому для обмена на стадии (b),passing the retentate obtained at the end of step (b) through a combination of membrane adsorbers in flow mode, wherein two membrane adsorbers from said combination of membrane adsorbers are orthogonal in terms of mechanisms of action, and said combination of membrane adsorbers has been pre-equilibrated with an equilibration buffer that is identical to one buffer used for exchange in step (b),

извлечение очищенного белка из фильтрата указанной комбинации мембранных адсорберов;recovering the purified protein from the filtrate of said combination of membrane adsorbers;

где указанный способ очистки не включает стадию хроматографии с протеином А.wherein said purification method does not include a protein A chromatography step.

В изобретении также предлагается способ очистки белка из раствора, включающий:The invention also provides a method for purifying a protein from a solution, comprising:

пропускание отфильтрованного белкового раствора, полученного в конце стадии (а), по меньшей мере через одну диафильтрационную мембрану с использованием только одного буфера для обмена, причем указанный только один буфер идентичен уравновешивающему буферу, используемому на «полирующей» стадии (с); passing the filtered protein solution obtained at the end of step (a) through at least one diafiltration membrane using only one exchange buffer, said only one buffer being identical to the equilibration buffer used in the "polishing" step (c);

пропускание ретентата, полученного в конце стадии (b), через комбинацию мембранных адсорберов в проточном режиме, при этом два мембранных адсорбера указанной комбинации мембранных адсорберов ортогональны с точки зрения механизмов действия, и указанная комбинация мембранных адсорберов была предварительно уравновешена уравновешивающим буфером, passing the retentate obtained at the end of step (b) through a combination of membrane adsorbers in flow mode, wherein the two membrane adsorbers of said combination of membrane adsorbers are orthogonal in terms of mechanisms of action, and said combination of membrane adsorbers has been pre-equilibrated with an equilibrating buffer,

В частности, изобретение относится к способу очистки белка из раствора, включающему:In particular, the invention relates to a method for purifying a protein from a solution, comprising:

(i) пропускание раствора через по меньшей мере одну матрицу хелатирующего агента в проточном режиме, (i) passing the solution through at least one matrix of a chelating agent in a flow mode,

(ii) извлечение отфильтрованного белкового раствора из фильтрата указанной по меньшей мере одной матрицы хелатирующего агента,(ii) recovering the filtered protein solution from the filtrate of said at least one chelating agent matrix,

(b) стадию обмена, включающую:(b) an exchange step comprising:

(i) пропускание отфильтрованного белкового раствора, полученного в конце стадии (а), по меньшей мере через одну диафильтрационную мембрану с использованием только одного буфера для обмена, (i) passing the filtered protein solution obtained at the end of step (a) through at least one diafiltration membrane using only one exchange buffer,

(ii) извлечение частично очищенного ретентата, содержащего белок, указанной по меньшей мере одной диафильтрационной мембраны;(ii) recovering a partially purified protein-containing retentate of said at least one diafiltration membrane;

иAnd

(c) «полирующую» стадию, включающую:(c) a "polishing" step comprising:

(i) пропускание уравновешивающего буфера через комбинацию мембранных адсорберов, при этом указанный уравновешивающий буфер идентичен одному буферу, используемому для обмена на стадии (b),(i) passing the equilibration buffer through a combination of membrane adsorbers, said equilibration buffer being identical to the one used for exchange in step (b),

(ii) пропускание ретентата, полученного на стадии (b), через комбинацию мембранных адсорберов в проточном режиме, (ii) passing the retentate obtained in step (b) through a combination of membrane adsorbers in flow mode,

(iii) извлечение очищенного белка из фильтрата указанной комбинации мембранных адсорберов;(iii) recovering the purified protein from the filtrate of said combination of membrane adsorbers;

В одном варианте осуществления изобретения только один буфер используется на протяжении осуществления всего метода очистки. В конкретном варианте осуществления один буфер включает Tris, Tris-HCl, Бис Tris, фосфат и/или лимонную кислоту. В другом варианте осуществления один буфер содержит или состоит из (i) бис-Tris, Tris или Tris-HCl, (ii) уксусной кислоты, (iii) воды и (iv) необязательно соли.In one embodiment of the invention, only one buffer is used throughout the entire purification method. In a particular embodiment, one buffer comprises Tris, Tris-HCl, Bis Tris, phosphate, and/or citric acid. In another embodiment, one buffer contains or consists of (i) bis-Tris, Tris or Tris-HCl, (ii) acetic acid, (iii) water and (iv) optional salt.

В одном варианте осуществления, по меньшей мере, одна матрица хелатирующего агента стадии фильтрации выбирается из активированного угля, диатомитовой земли, свободной катионообменной смолы, свободной анионообменной смолы и свободной смолы смешанного режима. В конкретном варианте осуществления по меньшей мере одна матрица хелатирующего агента представляет собой комбинацию двух различных матриц хелатирующего агента. В более конкретном варианте осуществления комбинация двух различных матриц хелатирующих агентов представляет собой комбинацию активированного угля и свободной анионообменной смолы. В другом конкретном варианте осуществления по меньшей мере одна матрица хелатирующего агента представляет собой комбинацию более чем двух различных матриц хелатирующего агента, то есть трех, четырех, пяти или более чем пяти.In one embodiment, the at least one chelating agent matrix of the filtration step is selected from activated carbon, diatomaceous earth, free cation exchange resin, free anion exchange resin, and free mixed mode resin. In a particular embodiment, the at least one chelating agent matrix is a combination of two different chelating agent matrices. In a more specific embodiment, the combination of two different matrices of chelating agents is a combination of activated carbon and a free anion exchange resin. In another particular embodiment, the at least one chelating agent matrix is a combination of more than two different chelating agent matrices, ie three, four, five, or more than five.

В одном варианте осуществления, по меньшей мере, одна диафильтрационная мембрана стадии обмена представляет собой модуль однопоточной фильтрации в тангенциальном потоке (SPTFF) или модуль фильтрации в тангенциальном потоке (TFF). В конкретном варианте осуществления по меньшей мере одна диафильтрационная мембрана стадии обмена имеет форму кассеты, половолоконную или рулонную форму. В конкретном варианте осуществления отфильтрованный белковый раствор концентрируется на стадии обмена.In one embodiment, the at least one exchange step diafiltration membrane is a single flow tangential flow filtration (SPTFF) module or a tangential flow filtration (TFF) module. In a particular embodiment, the at least one exchange step diafiltration membrane is in cassette, hollow fiber, or roll form. In a specific embodiment, the filtered protein solution is concentrated in the exchange step.

В одном варианте осуществления комбинация мембранных адсорберов «полирующей» стадии представляет собой комбинацию двух мембранных адсорберов или комбинацию по меньшей мере двух мембранных адсорберов, например трех, четырех или по меньшей мере четырех мембранных адсорберов.In one embodiment, the "polishing" stage membrane adsorber combination is a combination of two membrane adsorbers, or a combination of at least two membrane adsorbers, such as three, four, or at least four membrane adsorbers.

В одном варианте осуществления мембранные адсорберы комбинации мембранных адсорберов выбраны из группы, состоящей из катионообменного мембранного адсорбера, анионообменного мембранного адсорбера, мультимодального мембранного адсорбера, мембранного адсорбера с гидрофобным взаимодействием и их комбинаций. В конкретном варианте осуществления комбинация мембранных адсорберов «полирующей» стадии представляет собой комбинацию катионообменного мембранного адсорбера и анионообменного мембранного адсорбера.In one embodiment, the membrane adsorbers of the membrane adsorber combination are selected from the group consisting of a cation exchange membrane adsorber, an anion exchange membrane adsorber, a multimodal membrane adsorber, a hydrophobic interaction membrane adsorber, and combinations thereof. In a specific embodiment, the combination of "polishing" stage membrane adsorbers is a combination of a cation exchange membrane adsorber and an anion exchange membrane adsorber.

В одном варианте осуществления комбинация мембранных адсорберов «полирующей» стадии представляет собой комбинацию по меньшей мере двух мембранных адсорберов, выбранных из группы, состоящей из катионообменных мембранных адсорберов, анионообменных мембранных адсорберов, мультимодальных мембранных адсорберов и мембранных адсорберов с гидрофобным взаимодействием.In one embodiment, the combination of "polishing" stage membrane adsorbers is a combination of at least two membrane adsorbers selected from the group consisting of cation exchange membrane adsorbers, anion exchange membrane adsorbers, multimodal membrane adsorbers, and hydrophobic interaction membrane adsorbers.

В одном варианте осуществления изобретения способ дополнительно включает стадию нанофильтрации после стадии (с) и, необязательно, стадию конечной ультрафильтрации и/или диафильтрации после стадии нанофильтрации. В другом варианте осуществления изобретения способ дополнительно включает стадию инактивации при низком pH после стадии (c), после стадии нанофильтрации и/или после стадии конечной ультрафильтрации и/или диафильтрации. В одном варианте осуществления изобретения способ включает перед стадией (а) стадию культивирования клеток в жидкой культуральной среде, предпочтительно в биореакторе, для получения жидкой культуральной среды, содержащей белок. Культивируемые клетки могут быть клетками млекопитающих, бактериями или дрожжами. В предпочтительном варианте осуществления культивируемые клетки могут быть клеточными линиями млекопитающих (например, клетками Vero, клетками CHO, клетками 3T3, клетками COS, клетками HEK293 и т.д., включая различные подтипы этих клеточных линий), а также первичными или созданными культурами клеток млекопитающих (например, полученные из лимфобластов, фибробластов, эмбриональных клеток, эпителиальных клеток, нервных клеток, адипоцитов и т.д.). In one embodiment of the invention, the method further comprises a nanofiltration step after step (c) and optionally a final ultrafiltration and/or diafiltration step after the nanofiltration step. In another embodiment of the invention, the method further comprises a low pH inactivation step after step (c), after a nanofiltration step and/or after a final ultrafiltration and/or diafiltration step. In one embodiment of the invention, the method comprises, prior to step (a), the step of culturing the cells in a liquid culture medium, preferably in a bioreactor, to obtain a liquid culture medium containing the protein. The cultured cells may be mammalian cells, bacteria or yeast. In a preferred embodiment, the cultured cells may be mammalian cell lines (e.g., Vero cells, CHO cells, 3T3 cells, COS cells, HEK293 cells, etc., including the various subtypes of these cell lines), as well as primary or established mammalian cell cultures. (for example, derived from lymphoblasts, fibroblasts, embryonic cells, epithelial cells, nerve cells, adipocytes, etc.).

В одном варианте осуществления изобретения очищаемый белок представляет собой антитело. В другом варианте осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело.In one embodiment, the protein to be purified is an antibody. In another embodiment, the antibody is a monoclonal antibody.

Таким образом, изобретение также относится к интегрированному способу получения очищенного белка из жидкой культуральной среды.Thus, the invention also relates to an integrated method for obtaining a purified protein from a liquid culture medium.

В некоторых вариантах осуществления изобретения один буфер содержит от 5 до 40 мМ (в частности, 20 мМ) бис-Tris, от 15 до 150 мМ (в частности, 75 мМ) NaCl, с pH, доведенным до 6-9 (в частности, 7,5) с помощью уксусной кислоты. In some embodiments, one buffer contains 5 to 40 mM (particularly 20 mM) bis-Tris, 15 to 150 mM (particularly 75 mM) NaCl, with pH adjusted to 6-9 (particularly 7.5) with acetic acid.

В некоторых вариантах осуществления изобретения один буфер содержит от 5 до 40 мМ (в частности, 20 мМ) Tris или Tris-HCl, от 15 до 150 мМ (в частности, 75 мМ) NaCl, с pH, доведенным до 6-9 (в частности, 7,5) с помощью уксусной кислоты. In some embodiments, one buffer contains 5 to 40 mM (particularly 20 mM) Tris or Tris-HCl, 15 to 150 mM (particularly 75 mM) NaCl, with pH adjusted to 6-9 (in in particular 7.5) with acetic acid.

В некоторых вариантах осуществления изобретения один буфер содержит от 5 до 40 мМ (в частности, 20 мМ) Tris или Tris-HCl, от 15 до 150 мМ (в частности, 75 мМ) NaCl, с pH, доведенным до 6-9 (в частности, 7,5) с помощью лимонной кислоты. In some embodiments, one buffer contains 5 to 40 mM (particularly 20 mM) Tris or Tris-HCl, 15 to 150 mM (particularly 75 mM) NaCl, with pH adjusted to 6-9 (in in particular, 7.5) with the help of citric acid.

В некоторых вариантах осуществления изобретения один буфер содержит от 15 до 150 мМ (в частности, 75 мМ) NaCl, с pH, доведенным до 6-9 (в частности, 7,5) с помощью Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ (предпочтительно от 10 мМ/90 мМ Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ до 90 мМ/10 мМ Na₂HPO₄/NaH₂PO₄).In some embodiments, one buffer contains 15 to 150 mM (eg 75 mM) NaCl, with pH adjusted to 6-9 (eg 7.5) with Na ₂ HPO ₄ /NaH ₂ PO ₄ ( preferably from 10 mM/90 mM Na ₂ HPO ₄ /NaH ₂ PO ₄ to 90 mM/10 mM Na ₂ HPO ₄ /NaH ₂ PO ₄ ).

Изобретение относится к набору, содержащему по меньшей мере одну матрицу хелатирующего агента, по меньшей мере одну диафильтрационную мембрану и комбинацию мембранных адсорберов, причем два мембранных адсорбера указанной комбинации мембранных адсорберов являются ортогональными с точки зрения механизмов действия; и один буфер, содержащий Tris, Tris-HCl, бис-Tris, фосфат и/или лимонную кислоту, в частности, содержащий или состоящий из (i) бис-Tris, Tris или Tris-HCl, (ii) уксусной кислоты, (iii) воды и (iv) необязательно NaCl. В некоторых вариантах осуществления набор используется для очистки белка из раствора с использованием способа по изобретению. The invention relates to a kit containing at least one chelating agent matrix, at least one diafiltration membrane and a combination of membrane adsorbers, wherein the two membrane adsorbers of said combination of membrane adsorbers are orthogonal in terms of mechanisms of action; and one buffer containing Tris, Tris-HCl, bis-Tris, phosphate and/or citric acid, in particular containing or consisting of (i) bis-Tris, Tris or Tris-HCl, (ii) acetic acid, (iii) ) water and (iv) optionally NaCl. In some embodiments, the kit is used to purify a protein from solution using the method of the invention.

Изобретение также относится к набору, включающему по меньшей мере одну матрицу хелатирующего агента, по меньшей мере одну диафильтрационную мембрану и комбинацию мембранных адсорберов, причем два мембранных адсорбера указанной комбинации мембранных адсорберов являются ортогональными с точки зрения механизмов действия; и инструкции по приготовлению одного буфера, содержащего Tris, Tris-HCl, бис-Tris, фосфат и/или лимонную кислоту, в частности, содержащего или состоящий из (i) бис-Tris, Tris или Tris-HCl, (ii) уксусной кислоты, (iii) воды и (iv) необязательно NaCl. В некоторых вариантах осуществления набор используется для очистки белка из раствора с использованием способа по изобретению.The invention also relates to a kit comprising at least one chelating agent matrix, at least one diafiltration membrane and a combination of membrane adsorbers, wherein the two membrane adsorbers of said combination of membrane adsorbers are orthogonal in terms of mechanisms of action; and instructions for preparing one buffer containing Tris, Tris-HCl, bis-Tris, phosphate and/or citric acid, in particular containing or consisting of (i) bis-Tris, Tris or Tris-HCl, (ii) acetic acid , (iii) water and (iv) optionally NaCl. In some embodiments, the kit is used to purify a protein from solution using the method of the invention.

В настоящем описании также представлены выделенные белки, фармацевтические агенты и фармацевтические композиции, полученные любым из описанных в настоящем документе способов.The present description also presents isolated proteins, pharmaceutical agents and pharmaceutical compositions obtained by any of the methods described herein.

Эти и другие особенности и преимущества раскрытого способа очистки будут более понятны из следующего подробного описания вместе с прилагаемой формулой изобретения. Следует отметить, что объем формулы изобретения определяется ее изложением, а не конкретным обсуждением признаков и преимуществ, изложенных в описании. These and other features and advantages of the disclosed purification method will be better understood from the following detailed description, together with the appended claims. It should be noted that the scope of the claims is determined by its presentation, and not by a specific discussion of the features and advantages set forth in the description.

В контексте изобретения термины «содержащий», «имеющий», «включающий» следует толковать как неограниченные термины (т.е. означающие «включая, но не ограничиваясь этим»), если не указано иное. Кроме того, термин «содержащий» включает «состоящий» (например, композиция, «содержащая» X, может состоять исключительно из X или может включать что-то дополнительное, например, X+Y). In the context of the invention, the terms "comprising", "having", "including" should be construed as open-ended terms (ie, meaning "including, but not limited to"), unless otherwise indicated. In addition, the term "comprising" includes "comprising" (eg, a composition "comprising" X may consist solely of X, or may include something additional, such as X+Y).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ АСПЕКТОВ И ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF ASPECTS AND IMPLEMENTATION OPTIONS

Желая упростить процессы очистки белков и удешевить их, авторы изобретения разработали новый способ очистки, который является непрерывным, полностью проточным и не включает стадию хроматографии с протеином А. Desiring to simplify and reduce the cost of protein purification processes, the inventors have developed a new purification method that is continuous, fully flow-through and does not include a protein A chromatography step.

Изобретение относится к способу очистки белка из раствора, включающему:The invention relates to a method for purifying a protein from a solution, including:

извлечение отфильтрованного белкового раствора из фильтрата указанной по меньшей мере одной матрицы хелатирующего агента; extracting the filtered protein solution from the filtrate of said at least one chelating agent matrix;

извлечение частично очищенного ретентата, содержащего белок, указанной по меньшей мере одной диафильтрационной мембраны; extracting a partially purified retentate containing protein of said at least one diafiltration membrane;

пропускание ретентата, полученного в конце стадии (b), через комбинацию мембранных адсорберов в проточном режиме, при этом два мембранных адсорбера из указанной комбинации мембранных адсорберов ортогональны с точки зрения механизмов действия, и указанная комбинация мембранных адсорберов была предварительно уравновешена уравновешивающим буфером, который идентичен одному буферу, используемому для обмена на стадии (b), passing the retentate obtained at the end of step (b) through a combination of membrane adsorbers in flow mode, wherein two membrane adsorbers from said combination of membrane adsorbers are orthogonal in terms of mechanisms of action, and said combination of membrane adsorbers has been pre-equilibrated with an equilibration buffer that is identical to one buffer used for exchange in step (b),

извлечение очищенного белка из фильтрата указанной комбинации мембранных адсорберов; recovering the purified protein from the filtrate of said combination of membrane adsorbers;

где указанный способ очистки не включает стадию хроматографии с протеином А. wherein said purification method does not include a protein A chromatography step.

На стадии обмена (b) выражение «пропускание отфильтрованного белкового раствора, полученного в конце стадии (а), по меньшей мере через одну диафильтрационную мембрану с использованием только одного буфера для обмена» означает, что указанный фильтрованный белковый раствор и один буфер прпускаются через по меньшей мере одну диафильтрационную мембрану. In the exchange step (b), the expression "passing the filtered protein solution obtained at the end of step (a) through at least one diafiltration membrane using only one exchange buffer" means that said filtered protein solution and one buffer are passed through at least at least one diafiltration membrane.

В конкретном варианте осуществления способ изобретения включает:In a specific embodiment, the method of the invention includes:

(i) пропускание отфильтрованного белкового раствора, полученного на стадии (а), по меньшей мере через одну диафильтрационную мембрану с использованием только одного буфера, (i) passing the filtered protein solution obtained in step (a) through at least one diafiltration membrane using only one buffer,

иAnd

(iii) извлечение очищенного белка из фильтрата указанной комбинации мембранных адсорберов,(iii) recovering the purified protein from the filtrate of said combination of membrane adsorbers,

Как указано выше, вышеуказанный способ изобретения включает только три стадии, ни одна из которых не является стадией хроматографии с протеином А. Несмотря на то, что способ согласно изобретению включает только три стадии и не содержит стадии хроматографии с протеином А, он позволяет получать очищенные белки, которые подходят для фармацевтических целей и, в частности, для введения людям.As stated above, the above method of the invention includes only three steps, none of which is a protein A chromatography step. Although the method according to the invention has only three steps and does not contain a protein A chromatography step, it allows obtaining purified proteins which are suitable for pharmaceutical purposes and in particular for administration to humans.

В дополнение к отсутствию участия человека в процессе очистки (и, как следствие, сокращению общего времени, необходимого для завершения процесса очистки), раскрытый способ снижает количество буферов, используемых для очистки, а отсутствие стадии хроматографии с протеином А снижает затраты. Раскрытый способ очистки также упрощает очистку mAb, улучшает общий выход и уменьшает сырье, возможности для хранения, стоимость товаров и время процесса в дополнение к возможности очистки множества mAb. In addition to eliminating human intervention in the purification process (and thus reducing the overall time required to complete the purification process), the disclosed method reduces the amount of buffers used for purification, and the absence of a protein A chromatography step reduces costs. The disclosed purification method also simplifies mAb purification, improves overall yield, and reduces raw material, storage capacity, product cost, and process time, in addition to the ability to purify multiple mAbs.

В отличие от обычных способов очистки белков, как указано выше, в способе, описанном в настоящем документе, используется один уникальный буфер, этот уникальный буфер используется на стадии обмена и для уравновешивания мембранных адсорберов на полирующей стадии. Unlike conventional protein purification methods as discussed above, the method described herein uses a single unique buffer, this unique buffer is used in the exchange step and to equilibrate the membrane adsorbers in the polishing step.

Используемый в настоящем описании термин «буферы согласно изобретению» относится к буферам, содержащим бис-Tris, Tris, Tris-HCl, фосфат и/или лимонную кислоту. Бис-Tris, Tris или Tris-HCl представляют собой соединения, хорошо известные специалистам в данной области:Used in the present description, the term "buffers according to the invention" refers to buffers containing bis-Tris, Tris, Tris-HCl, phosphate and/or citric acid. Bis-Tris, Tris or Tris-HCl are compounds well known to those skilled in the art:

название IUPAC: 2-[бис(2-гидроксиэтил)амино]-2-(гидроксиметил)пропан-1,3-диол, а номер CAS 6976-37-0 для Bis Tris, IUPAC name: 2-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol and CAS number 6976-37-0 for Bis Tris,

2-амино-2-(гидроксиметил)пропан-1,3-диол и номер CAS 77-86-1 для Trisа, и2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol and CAS number 77-86-1 for Trisa, and

2-амино-2-(гидроксиметил)пропан-1,3-диол гидрохлорид и номер CAS 1185-53-1 для Tris-HCl. 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol hydrochloride and CAS number 1185-53-1 for Tris-HCl.

Такой буфер согласно изобретению может соответствовать буферу обмена и уравновешивающему буферу. Such a buffer according to the invention may correspond to an exchange buffer and an equilibration buffer.

Более конкретно, такой буфер согласно изобретению может содержать или состоять из различных концентраций одних и тех же химических веществ (одним из них является бис-Tris, Tris, Tris-HCl, фосфат и/или лимонная кислота). В конкретном варианте осуществления буфер включает бис-Tris, Tris, Tris-HCl, фосфат и/или лимонную кислоту. В конкретном варианте осуществления буфер включает или состоит из (i) бис-Tris, Tris или Tris-HCl, (ii) уксусной кислоты и (iii) воды. В более конкретном варианте осуществления буфер содержит или состоит из (i) бис-Tris, Tris или Tris-HCl, (ii) уксусной кислоты, (iii) NaCl и (iv) воды. Другими словами, такой буфер включает или состоит из различных концентраций (i) бис-Tris, Tris или Tris-HCl, (ii) уксусной кислоты, (iii) NaCl и (iv) воды.More specifically, such a buffer according to the invention may contain or consist of different concentrations of the same chemicals (one of them is bis-Tris, Tris, Tris-HCl, phosphate and/or citric acid). In a specific embodiment, the buffer includes bis-Tris, Tris, Tris-HCl, phosphate, and/or citric acid. In a particular embodiment, the buffer comprises or consists of (i) bis-Tris, Tris, or Tris-HCl, (ii) acetic acid, and (iii) water. In a more specific embodiment, the buffer contains or consists of (i) bis-Tris, Tris or Tris-HCl, (ii) acetic acid, (iii) NaCl and (iv) water. In other words, such a buffer includes or consists of various concentrations of (i) bis-Tris, Tris or Tris-HCl, (ii) acetic acid, (iii) NaCl and (iv) water.

Буфер обмена может, например, содержать или состоять из 5-40 мМ (например, 20 мМ) бис-Tris и от 15 до 150 мМ (например, 75 мМ) NaCl, с pH, доведенным до 6-9 (например, 7,5) с помощью уксусной кислоты. The exchange buffer may, for example, contain or consist of 5-40 mM (e.g. 20 mM) bis-Tris and 15 to 150 mM (e.g. 75 mM) NaCl, with the pH adjusted to 6-9 (e.g. 7, 5) using acetic acid.

В качестве альтернативы буфер обмена может содержать или состоять из 5-40 мМ (в частности, 20 мМ) Tris или Tris-HCl, от 15 до 150 мМ (в частности, 75 мМ) NaCl, с pH, доведенным до 6-9 (в частности, 7,5) с помощью уксусной кислоты. Alternatively, the exchange buffer may contain or consist of 5-40 mM (particularly 20 mM) Tris or Tris-HCl, 15 to 150 mM (particularly 75 mM) NaCl, with the pH adjusted to 6-9 ( in particular 7,5) with acetic acid.

В качестве альтернативы буфер обмена может содержать или состоять из 5-40 мМ (в частности, 20 мМ) Tris или Tris-HCl, от 15 до 150 мМ (в частности, 75 мМ) NaCl, с pH, доведенным до 6-9 (в частности, 7,5), с помощью лимонной кислоты. Alternatively, the exchange buffer may contain or consist of 5-40 mM (particularly 20 mM) Tris or Tris-HCl, 15 to 150 mM (particularly 75 mM) NaCl, with the pH adjusted to 6-9 ( in particular 7.5), with the help of citric acid.

В качестве альтернативы буфер обмена может содержать или состоять из 15-150 мМ (в частности, 75 мМ) NaCl, с pH, доведенным до 6-9 (в частности, 7,5) с помощью Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ (предпочтительно от 10 мМ/90 мМ Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ до 90 мМ/10 мМ Na₂HPO₄/NaH₂PO₄).Alternatively, the exchange buffer may contain or consist of 15-150 mM (in particular 75 mM) NaCl, pH adjusted to 6-9 (in particular 7.5) with Na ₂ HPO ₄ /NaH ₂ PO ₄ (preferably from 10 mM/90 mM Na ₂ HPO ₄ /NaH ₂ PO ₄ to 90 mM/10 mM Na ₂ HPO ₄ /NaH ₂ PO ₄ ).

Такие обменные буферы особенно подходят для использования на стадии обмена, в частности, с кассетами TFF, но также подходят для уравновешивания мембранных адсорберов, в частности уравновешивания комбинации катионообменного мембранного адсорбера и анионообменного мембранного адсорбера.Such exchange buffers are particularly suitable for use in the exchange step, in particular with TFF cassettes, but are also suitable for equilibrating membrane adsorbers, in particular equilibrating a combination of a cation exchange membrane adsorber and an anion exchange membrane adsorber.

Преимущества вышеупомянутых буферных составов включают способность продукта mAb проходить через три стадии способа, в частности стадию обмена и «полирующую» стадию, с большей совместимостью, минимизируя нежелательные взаимодействия, ограничивая падение pH и проводимости и способствуя повышению выхода по сравнению с традиционными методами очистки. Использование такого буферного состава позволяет реализовать метод без какого-либо промежуточного хранения между тремя стадиями (a), (b) и (c).Advantages of the aforementioned buffer formulations include the ability of the mAb product to pass through the three process steps, specifically the exchange step and the "polishing" step, with greater compatibility, minimizing unwanted interactions, limiting pH and conductivity drops, and improving yield compared to traditional purification methods. The use of such a buffer composition allows the method to be implemented without any intermediate storage between the three steps (a), (b) and (c).

Соответственно, в конкретном варианте осуществления способ не содержит какого-либо промежуточного хранения между тремя стадиями (а), (b) и (с).Accordingly, in a specific embodiment, the method does not contain any intermediate storage between the three stages (a), (b) and (c).

При повторном использовании мембранных адсорберов полирующей стадии необязательно можно использовать дезинфицирующий буфер. Такой дезинфицирующий буфер может содержать или состоять, по меньшей мере, из NaOH, более предпочтительно от 0,05 Н до 1 Н (например, 0,5 Н) NaOH. If the membrane adsorbers of the polishing step are reused, a sanitizing buffer can optionally be used. Such disinfectant buffer may contain or consist of at least NaOH, more preferably 0.05 N to 1 N (eg 0.5 N) NaOH.

Используемые в настоящем описании термины «полипептид» или «белок» относятся к:As used herein, the terms "polypeptide" or "protein" refer to:

1) молекулам, имеющим последовательность нативных белков, то есть к а) белкам, продуцируемым природными и специфически нерекомбинантными клетками, или b) генно-инженерным или рекомбинантным клеткам, или1) molecules having a sequence of native proteins, i.e. a) proteins produced by natural and specifically non-recombinant cells, or b) genetically engineered or recombinant cells, or

2) молекулам, отличающимся от последовательности нативных белков делециями, добавлениями и/или заменами одной или более аминокислот и/или по меньшей мере одной посттрансляционной модификацией (например, гликозилированием).2) molecules that differ from the sequence of native proteins by deletions, additions and/or substitutions of one or more amino acids and/or at least one post-translational modification (eg, glycosylation).

Молекулы, упомянутые в пункте 1) выше, можно назвать нативными белками.The molecules mentioned in point 1) above can be called native proteins.

Молекулы, упомянутые в пункте 2) выше, не являются природными белками.The molecules mentioned in point 2) above are not naturally occurring proteins.

В определенных аспектах очищаемый белок представляет собой антитело.In certain aspects, the protein to be purified is an antibody.

Используемый в настоящем описании термин «антитело» относится к интактному антителу или его связывающему фрагменту, который конкурирует с интактным антителом за специфическое связывание. Связывающие фрагменты включают, но не ограничиваются ими, F(ab), F(ab'), F(ab')2, Fv, однодоменные антитела, такие как антитела VHH (нанотела) и одноцепочечные антитела. Термин «тяжелая цепь» включает любой полипептид иммуноглобулина, имеющий последовательность вариабельной области, достаточную для придания специфичности антигену.As used herein, the term "antibody" refers to an intact antibody, or binding fragment thereof, that competes with an intact antibody for specific binding. Binding fragments include, but are not limited to, F(ab), F(ab'), F(ab')2, Fv, single domain antibodies such as VHH antibodies (nanobodies) and single chain antibodies. The term "heavy chain" includes any immunoglobulin polypeptide having a variable region sequence sufficient to confer antigen specificity.

Термин «тяжелая цепь», используемый в настоящем описании, охватывает полноразмерную тяжелую цепь и ее фрагменты. Полноразмерная тяжелая цепь включает домен вариабельной области, VH, и три домена константной области, CH1, CH2 и CH3. Домен VH находится на аминоконце полипептида, а домен CH3 находится на карбоксильном конце.The term "heavy chain" as used herein embraces the full length heavy chain and fragments thereof. The full length heavy chain includes a variable region domain, VH, and three constant region domains, CH1, CH2 and CH3. The VH domain is at the amino terminus of the polypeptide and the CH3 domain is at the carboxyl terminus.

Используемый в настоящем описании термин «легкая цепь» охватывает полноразмерную легкую цепь и ее фрагменты. Полноразмерная легкая цепь включает домен вариабельной области, VL, и домен константной области, CL. Подобно тяжелой цепи, домен вариабельной области легкой цепи находится на аминоконце полипептида. Используемый в настоящем описании термин «легкая цепь» включает любой полипептид иммуноглобулина, имеющий последовательность вариабельной области, достаточную для придания специфичности антигену.As used herein, the term "light chain" encompasses the full length light chain and fragments thereof. The full length light chain includes a variable region domain, VL, and a constant region domain, CL. Like the heavy chain, the light chain variable region domain is located at the amino terminus of the polypeptide. As used herein, the term "light chain" includes any immunoglobulin polypeptide having a variable region sequence sufficient to confer antigen specificity.

Встречающиеся в природе структурные единицы антитела обычно содержат тетрамер. Каждый такой тетрамер обычно состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, каждая пара имеет одну полноразмерную легкую цепь (обычно с молекулярной массой примерно 25 кДа) и одну полноразмерную тяжелую цепь (обычно с молекулярной массой примерно 50 кДа - 70 кДа). Аминоконцевая часть каждой легкой и тяжелой цепи обычно включает вариабельную область из примерно 100-110 или более аминокислот, которая обычно отвечает за распознавание антигена. Карбоксиконцевая часть каждой цепи обычно определяет константную область, отвечающую за эффекторную функцию. Легкие цепи человека обычно классифицируются как легкие цепи каппа и лямбда. Тяжелые цепи обычно классифицируются как мю, дельта, гамма, альфа или эпсилон и определяют изотип антитела как IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, соответственно. IgG имеет несколько подклассов, включая, помимо прочего, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. IgM имеет подклассы, включая, помимо прочего, IgM1 и IgM2. IgA аналогично подразделяется на подклассы, включая, помимо прочего, IgA1 и IgA2. В полноразмерных легких и тяжелых цепях, как правило, вариабельные и константные области соединены областью «J» из примерно 12 или более аминокислот, при этом тяжелая цепь также включает область «D» из примерно 10 дополнительных аминокислот. Naturally occurring structural units of an antibody usually contain a tetramer. Each such tetramer typically consists of two identical pairs of polypeptide chains, each pair having one full length light chain (typically about 25 kDa molecular weight) and one full length heavy chain (typically about 50 kDa to 70 kDa molecular weight). The amino terminal portion of each light and heavy chain typically includes a variable region of about 100-110 or more amino acids, which is usually responsible for antigen recognition. The carboxy-terminal portion of each chain typically defines a constant region responsible for effector function. Human light chains are commonly classified as kappa and lambda light chains. Heavy chains are usually classified as mu, delta, gamma, alpha or epsilon and define the isotype of an antibody as IgM, IgD, IgG, IgA and IgE, respectively. IgG has several subclasses including but not limited to IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4. IgM has subclasses including but not limited to IgM1 and IgM2. IgA is similarly divided into subclasses including but not limited to IgA1 and IgA2. In full-length light and heavy chains, the variable and constant regions are typically connected by a "J" region of about 12 or more amino acids, with the heavy chain also including a "D" region of about 10 additional amino acids.

Вариабельные области каждой пары легкой/тяжелой цепи обычно образуют антигенсвязывающий сайт. Вариабельные области обычно обладают одинаковой общей структурой относительно консервативных каркасных областей (FR), соединенных тремя гипервариабельными областями, также называемыми областями, определяющими комплементарность, или CDR. CDR из двух цепей каждой пары обычно выравниваются по каркасным областям, что может способствовать связыванию со специфическим эпитопом. От N-конца до C-конца вариабельные области как легкой, так и тяжелой цепи обычно включают домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Присвоение аминокислот к каждому домену обычно соответствует определениям Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242. Биспецифическое или бифункциональное антитело обычно представляет собой искусственное гибридное антитело, имеющее две разные пары тяжелая цепь/легкая цепь и два разных сайта связывания.The variable regions of each light/heavy chain pair typically form an antigen-binding site. Variable regions generally share the same general structure with respect to conserved framework regions (FRs) connected by three hypervariable regions, also referred to as complementarity determining regions or CDRs. The CDRs of the two strands of each pair are typically aligned to the framework regions, which can facilitate binding to a specific epitope. From the N-terminus to the C-terminus, both the light and heavy chain variable regions typically include the FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, and FR4 domains. The assignment of amino acids to each domain generally follows the definitions of Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242. A bispecific or bifunctional antibody is typically an artificial hybrid antibody having two different heavy chain/light chain pairs and two different binding sites.

Фрагмент F(ab) состоит из одной легкой цепи, а также CH1 и вариабельной области одной тяжелой цепи. Тяжелая цепь молекулы F (ab) не может образовывать дисульфидную связь с другой молекулой тяжелой цепи. Фрагмент F(ab') содержит одну легкую цепь и одну тяжелую цепь, которая содержит больше константной области между доменами CH1 и CH2, так что межцепочечная дисульфидная связь может быть образована между двумя тяжелыми цепями с образованием F(ab')2 молекулы. Область Fv включает вариабельные области как тяжелой, так и легкой цепей, но не имеет константных областей. Одноцепочечные антитела - это молекулы Fv, в которых вариабельные области тяжелой и легкой цепи соединены гибким линкером с образованием единой полипептидной цепи, которая образует антигенсвязывающую область. Под бивалентным антителом, отличным от «полиспецифического» или «многофункционального» антитела, в некоторых вариантах осуществления понимаются сайты связывания, имеющие идентичную антигенную специфичность.The F(ab) fragment consists of one light chain, as well as CH1 and the variable region of one heavy chain. The heavy chain of the F(ab) molecule cannot form a disulfide bond with another heavy chain molecule. The F(ab') fragment contains one light chain and one heavy chain, which contains more of the constant region between the CH1 and CH2 domains, so that an interchain disulfide bond can be formed between the two heavy chains to form the F(ab')2 molecule. The Fv region includes both heavy and light chain variable regions, but no constant regions. Single chain antibodies are Fv molecules in which the heavy and light chain variable regions are connected by a flexible linker to form a single polypeptide chain that forms the antigen binding region. A bivalent antibody, other than a "multispecific" or "multifunctional" antibody, is in some embodiments understood to mean binding sites having identical antigenic specificity.

Моноклональные антитела (mAb), которые могут быть очищены описанным способом, могут быть получены различными способами, включая традиционную методологию моноклональных антител, например, стандартную методику гибридизации соматических клеток, хорошо известную в данной области. Хотя процедуры гибридизации соматических клеток являются предпочтительными, в принципе могут быть использованы другие методы получения моноклональных антител, например вирусная или онкогенная трансформация В-лимфоцитов. Моноклональное антитело может, например, соответствовать мышиному, химерному, гуманизированному или полностью человеческому антителу.Monoclonal antibodies (mAbs) that can be purified by the described method can be prepared by a variety of methods, including conventional monoclonal antibody methodology, such as standard somatic cell hybridization techniques well known in the art. Although somatic cell hybridization procedures are preferred, other methods for producing monoclonal antibodies can in principle be used, such as viral or oncogenic transformation of B lymphocytes. The monoclonal antibody may, for example, correspond to a murine, chimeric, humanized, or fully human antibody.

Неограничивающие примеры антител, которые могут быть очищены способом по изобретению, также включают: панитумумаб, омализумаб, абаговомаб, абциксимаб, актоксумаб, адалимумаб, адекатумумаб, афелимомаб, афутузумаб, алацизумаб, алемтузумаб, алимуромабатол, альтумомабатол, алтумомабатол , атинумаб, тоцилизумаб, базилизимаб, бектумомаб, белимумаб, бевацизумаб, бициромаб, канакинумаб, цетуксимаб, даклизумаб, денсумаб, экулизумаб, эдреколомаб, эфализумаб, эфунгумаб, эртумаксомаб, этарацизумаб, этанерцепт, голимумаб, инфликсимаб, натализумаб, паливизумаб, панитумумаб, пертузумаб, ранибизумаб , ритуксимаб, тоцилизумаб, трастузумаб, дупилумаб, сарилумаб или фрезолимумаб.Non-limiting examples of antibodies that can be purified by the method of the invention also include: panitumumab, omalizumab, abagovomab, abciximab, actoxumab, adalimumab, adecatumumab, afelimomab, afutuzumab, alacizumab, alemtuzumab, alimuromabatol, altumomabatol, altumomabec, bazimumabatol, tocyatinumab , белимумаб, бевацизумаб, бициромаб, канакинумаб, цетуксимаб, даклизумаб, денсумаб, экулизумаб, эдреколомаб, эфализумаб, эфунгумаб, эртумаксомаб, этарацизумаб, этанерцепт, голимумаб, инфликсимаб, натализумаб, паливизумаб, панитумумаб, пертузумаб, ранибизумаб , ритуксимаб, тоцилизумаб, трастузумаб, дупилумаб , sarilumab, or frezolimumab.

В определенных аспектах очищаемый белок представляет собой фермент.In certain aspects, the protein to be purified is an enzyme.

Неограничивающие примеры ферментов, которые можно очистить способом по изобретению, включают кислую α-глюкозидазу, α-L-идуронидазу, идуронатсульфатазу, гепаран N-сульфатазу, галактозо-6-сульфатазу, кислую β-галактозидазу, β-глюкуронидазу, N-ацетилглюкозамин-1-фосфотрансферазу, α-N-ацетилгалактозаминидазу (α-галактозидазу B), кислую липазу, лизосомную кислую церамидазу, кислую сфингомиелиназу, β-глюкозидазу, галактозилцерамидазу, α-галактозидазу А, кислую β-галактозидазу, β-галактозидазу, нейраминидазу, гексозаминидазу A или гексозаминидазу B.Non-limiting examples of enzymes that can be purified by the method of the invention include acid α-glucosidase, α-L-iduronidase, iduronate sulfatase, heparan N-sulfatase, galactose-6-sulfatase, acid β-galactosidase, β-glucuronidase, N-acetylglucosamine-1 -phosphotransferase, α-N-acetylgalactosaminidase (α-galactosidase B), acid lipase, lysosomal acid ceramidase, acid sphingomyelinase, β-glucosidase, galactosylceramidase, α-galactosidase A, acid β-galactosidase, β-galactosidase, neuraminidase, hexosaminidase A, or hexosaminidase B.

Другие неограничивающие примеры белков, которые могут быть очищены способом по настоящему изобретению, включают человеческий эритропоэтин, фактор некроза опухоли (например, TNF-α, TNF-β или TNF-K), интерферон альфа или интерферон бета.Other non-limiting examples of proteins that can be purified by the method of the present invention include human erythropoietin, tumor necrosis factor (eg, TNF-α, TNF-β or TNF-K), interferon alpha or interferon beta.

Раствор, содержащий очищаемый белок, может быть культуральной средой, предпочтительно осветленной культуральной средой. Раствор, содержащий очищаемый белок, представляет собой, например, культуральную среду, полученную в перфузионном биореакторе или биореакторе периодического действия с подпиткой.The solution containing the protein to be purified may be a culture medium, preferably a clarified culture medium. The solution containing the protein to be purified is, for example, a culture medium prepared in a perfusion or fed-batch bioreactor.

Примеры перфузионных биореакторов или биореакторов периодического действия с подпиткой раскрыты в патентных заявках US 2014/255994, US 2015/232505, US 2015/183821 и US 2017/218012, а также международной заявке WO2014/137903 (полностью включенной в настоящий документ посредством ссылки).Examples of perfusion or fed-batch bioreactors are disclosed in patent applications US 2014/255994, US 2015/232505, US 2015/183821 and US 2017/218012, as well as international application WO2014/137903 (incorporated herein by reference in its entirety).

Термин «осветленная культуральная среда» означает жидкую культуральную среду, полученную из культуры клеток млекопитающих, бактерий или дрожжей, которая практически не содержит (например, по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% или 99%) клеток млекопитающих, бактерий или дрожжей.The term "clarified culture medium" means a liquid culture medium obtained from a culture of mammalian, bacterial or yeast cells that is substantially free (e.g., at least 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98 % or 99%) of mammalian, bacterial or yeast cells.

В конкретном варианте осуществления первая стадия фильтрации способа по изобретению может быть интегрирована в стадию осветления, используемую для получения осветленной культуральной среды во время выделения культуры клеток, указанная стадия фильтрации, таким образом, становится частью стадии осветления.In a specific embodiment, the first filtration step of the method of the invention can be integrated into the clarification step used to obtain a clarified culture medium during cell culture isolation, said filtration step thus becoming part of the clarification step.

Выражение «извлечение белка» в контексте настоящего описания относится к сбору белка после применения раскрытого метода очистки. The expression "protein recovery" in the context of the present description refers to the collection of protein after applying the disclosed purification method.

В контексте изобретения выражение «хелатирующий агент» относится к любому типу сорбирующей среды в виде частиц или иммобилизованного лиганда, такого как активированный уголь, диатомитовая земля, гранулированная смола, которая в процессе очистки действует как абсорбент для отделения молекулы загрязняющих веществ, присутствующие в смеси, от целевой молекулы, подлежащей очистке. Выражение «матрица хелатирующего агента» не включает матрицу Протеина А.In the context of the invention, the expression "chelating agent" refers to any type of sorption medium in the form of particles or immobilized ligand, such as activated carbon, diatomaceous earth, granular resin, which, during purification, acts as an absorbent to separate the contaminant molecules present in the mixture from the target molecule to be purified. The expression "chelating agent matrix" does not include the Protein A matrix.

В некоторых вариантах осуществления способа изобретения по меньшей мере одна матрица хелатирующего агента представляет собой сорбирующую среду в виде частиц. In some embodiments of the method of the invention, at least one chelating agent matrix is a particulate sorbent medium.

По меньшей мере, одна матрица хелатирующего агента может быть в форме колонок, фильтров или может быть добавлена в виде порошка в очищаемый продукт. В конкретном варианте осуществления по меньшей мере одну матрицу хелатирующего агента, используемую в контексте изобретения, добавляют в виде порошка в очищаемый продукт.The at least one chelating agent matrix may be in the form of columns, filters, or may be added as a powder to the product to be purified. In a particular embodiment, at least one chelating agent matrix used in the context of the invention is added as a powder to the product to be purified.

В конкретных вариантах осуществления раскрытого способа по меньшей мере одна матрица хелатирующего агента представляет собой фильтр с активированным углем. В других конкретных вариантах осуществления раскрытого способа по меньшей мере один хелатирующий агент представляет собой смолу.In particular embodiments of the disclosed method, at least one chelating agent matrix is an activated carbon filter. In other specific embodiments of the disclosed method, at least one chelating agent is a resin.

По меньшей мере, одна матрица хелатирующего агента, в частности, фильтр с активированным углем или смоляная среда, взаимодействует с загрязняющими веществами, что приводит к высокой эффективности удаления примесей. Другим преимуществом использования матрицы хелатирующего агента, в частности, использования активированного угля или смолы, является низкая аффинность к моноклональным антителам.At least one chelating agent matrix, in particular an activated carbon filter or tar medium, interacts with contaminants, resulting in high impurity removal efficiency. Another advantage of using a chelating agent matrix, in particular the use of activated charcoal or resin, is the low affinity for monoclonal antibodies.

В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения, по меньшей мере, одна матрица хелатирующего агента стадии фильтрации выбирается из группы, состоящей из активированного угля, диатомитовой земли, свободной катионообменной смолы, свободной анионообменной смолы и свободной смолы смешанного режима. В конкретном варианте осуществления по меньшей мере одна матрица хелатирующего агента представляет собой комбинацию двух различных матриц хелатирующего агента. В более конкретном варианте осуществления комбинация двух различных матриц хелатирующих агентов представляет собой комбинацию активированного угля, в частности, фильтров с активированным углем, и свободной анионообменной смолы.In particular embodiments of the present invention, the at least one filtration stage chelating agent matrix is selected from the group consisting of activated carbon, diatomaceous earth, free cation exchange resin, free anion exchange resin, and free mixed mode resin. In a particular embodiment, the at least one chelating agent matrix is a combination of two different chelating agent matrices. In a more specific embodiment, the combination of two different matrices of chelating agents is a combination of activated carbon, in particular activated carbon filters, and a free anion exchange resin.

В конкретном варианте осуществления раскрытого способа фильтр с активированным углем представляет собой фильтр с активированным углем Zeta Plus 35SP (выпускается 3М), Zeta Plus 53SP (выпускается 3М), Millistak CR40 (выпускается Millipore) или Zeta Plus 55SP (выпускается 3М). In a specific embodiment of the disclosed method, the activated carbon filter is a Zeta Plus 35SP (available from 3M), Zeta Plus 53SP (available from 3M), Millistak CR40 (available from Millipore) or Zeta Plus 55SP (available from 3M) activated carbon filter.

В другом конкретном варианте осуществления описанного способа свободная анионообменная смола представляет собой NH2-750F (выпускается Tosoh) или Emphaze AEX (выпускается 3M). Характеристики смолы NH2-750F приведены ниже.In another specific embodiment of the described method, the free anion exchange resin is NH2-750F (available from Tosoh) or Emphaze AEX (available from 3M). The characteristics of NH2-750F resin are shown below.

Размер пор (средний)Pore size (medium) > 100 нм> 100 nm Размер частиц (средний)Particle size (medium) 45 мкм (F-класс)45 µm (F-class) Номинальное давлениеRated pressure 0,3 МПа0.3 MPa стабильность pHpH stability 2-132-13 Срок годностиBest before date 10 лет (ориентировочно)10 years (estimated)

В контексте изобретения выражение «диафильтрация» относится к методике, в которой используются ультрафильтрационные мембраны для полного удаления, замены или снижения концентрации солей или растворителей из растворов.In the context of the invention, the term "diafiltration" refers to a technique in which ultrafiltration membranes are used to completely remove, replace or reduce the concentration of salts or solvents from solutions.

Используемый в настоящем описании термин «ультрафильтрация» или «УФ» относится к методике фильтрации с использованием полупроницаемой мембраны для физического и селективного удаления частиц и/или ионов из раствора в зависимости от размера частиц и размера пор в УФ-мембране.As used herein, the term "ultrafiltration" or "UV" refers to a filtration technique using a semi-permeable membrane to physically and selectively remove particles and/or ions from solution, depending on particle size and pore size in the UV membrane.

В одном варианте осуществления, по меньшей мере, одна диафильтрационная мембрана стадии обмена представляет собой модуль однопоточной фильтрации в тангенциальном потоке (SPTFF) или модуль фильтрации в тангенциальном потоке (TFF). В конкретном варианте осуществления по меньшей мере одна диафильтрационная мембрана стадии обмена имеет форму кассеты, половолоконную или рулонную форму. In one embodiment, the at least one exchange step diafiltration membrane is a single flow tangential flow filtration (SPTFF) module or a tangential flow filtration (TFF) module. In a particular embodiment, the at least one exchange step diafiltration membrane is in cassette, hollow fiber, or roll form.

В конкретном варианте осуществления раскрытого способа, по меньшей мере, одна диафильтрационная мембрана на стадии обмена представляет собой готовый к обработке половолоконный картридж 30 кДа (выпускается GE).In a specific embodiment of the disclosed method, at least one diafiltration membrane in the exchange step is a ready-to-process 30 kDa hollow fiber cartridge (available from GE).

В конкретном варианте осуществления раскрытого способа, по меньшей мере, одна диафильтрационная мембрана на стадии обмена представляет собой встроенную диафильтрацию Cadence (выпускается Pall).In a specific embodiment of the disclosed method, at least one diafiltration membrane in the exchange step is a Cadence inline diafiltration (available from Pall).

В одном варианте осуществления, по меньшей мере, одной диафильтрационной мембране на стадии обмена предшествует или за ней следует встроенный концентратор Cadence (выпускается Pall).In one embodiment, at least one diafiltration membrane is preceded or followed by an inline Cadence concentrator (available from Pall) in the exchange step.

В другом конкретном варианте осуществления описанного способа по меньшей мере одна диафильтрационная мембрана на стадии обмена представляет собой кассету Pellicon (выпускается Millipore) или кассету Sartocon (выпускается Sartorius).In another particular embodiment of the described method, at least one diafiltration membrane in the exchange step is a Pellicon cassette (available from Millipore) or a Sartocon cassette (available from Sartorius).

Стадия обмена преимущественно позволяет очищать и концентрировать отфильтрованный белковый раствор. Под выражением «концентрирование отфильтрованного белкового раствора» в настоящем описании подразумевается, что концентрация белка в частично очищенном ретентате увеличивается по сравнению с его концентрацией в отфильтрованном белковом растворе.The exchange step advantageously allows the filtered protein solution to be purified and concentrated. The expression "concentration of the filtered protein solution" in the present description means that the concentration of the protein in the partially purified retentate is increased compared to its concentration in the filtered protein solution.

В контексте изобретения «мембранный адсорбер» относится к плоскому листу полимера, в частности акрилового полимера, или волокна или нетканого материала, несущего функциональные группы, такие как аффинные группы и ионообменные группы. Одно из различий между смолой и мембраной заключается в распределении потока: за счет диффузии смолы и за счет конвекции в мембранах.In the context of the invention "membrane adsorber" refers to a flat sheet of a polymer, in particular an acrylic polymer, or a fiber or nonwoven material, bearing functional groups such as affinity groups and ion exchange groups. One of the differences between resin and membrane is the flow distribution: by resin diffusion and by convection in the membranes.

Комбинация мембранных адсорберов, используемых на полирующей стадии, включает использование по меньшей мере двух видов мембранных адсорберов, которые являются ортогональными с точки зрения механизмов действия.The combination of membrane adsorbers used in the polishing step involves the use of at least two types of membrane adsorbers that are orthogonal in terms of mechanisms of action.

В контексте изобретения выражение «мембранные абсорберы, которые являются ортогональными с точки зрения механизмов действия» означает, что используемые мембранные адсорберы имеют противоположные или различные механизмы действия, такие как катионообменные и анионообменные взаимодействия, мультимодальные и анионообменные взаимодействия, катионообменные и гидрофобные взаимодействия или анионообменные и гидрофобные взаимодействия и действуют как единственная интегрированная стадия, т.е. когда они процессируются вместе, как если бы это была единственная стадия фильтрации.In the context of the invention, the expression "membrane absorbers that are orthogonal in terms of mechanisms of action" means that the membrane adsorbers used have opposite or different mechanisms of action, such as cation exchange and anion exchange interactions, multimodal and anion exchange interactions, cation exchange and hydrophobic interactions, or anion exchange and hydrophobic interactions and act as a single integrated stage, i.e. when they are processed together as if it were the only filtration step.

Действительно, авторы изобретения показали, что использование такой комбинации мембранных адсорберов позволяет улавливать примеси, сводя к минимуму адсорбцию интересующего продукта.Indeed, the inventors have shown that the use of such a combination of membrane adsorbers allows the capture of impurities, minimizing the adsorption of the product of interest.

В предпочтительном варианте осуществления, где используются более двух мембранных адсорберов в комбинации мембранных адсорберов «полирующей» стадии, то есть по меньшей мере один дополнительный мембранный адсорбер для суммарно трех, четырех или более четырех мембранных адсорберов, указанный по меньшей мере один дополнительный мембранный адсорбер представляет собой мембрану, имеющую другой механизм действия по сравнению с двумя мембранными адсорберами, которые являются ортогональными с точки зрения механизмов действия; суммарно эти более чем два мембранных адсорбера все еще рассматривается как единая интегрированная стадия. In a preferred embodiment where more than two membrane adsorbers are used in a "polishing" stage membrane adsorber combination, i.e. at least one additional membrane adsorber for a total of three, four or more than four membrane adsorbers, said at least one additional membrane adsorber is a membrane having a different mechanism of action compared to two membrane adsorbers that are orthogonal in terms of mechanisms of action; in total, these more than two membrane adsorbers are still considered as a single integrated stage.

В качестве неограничивающего примера указанный по меньшей мере один дополнительный мембранный адсорбер имеет гидрофобные взаимодействия или мультимодальные взаимодействия, если два мембранных адсорбера, которые являются ортогональными с точки зрения механизмов действия, обладают катионообменным и анионообменным взаимодействиями, соответственно.As a non-limiting example, said at least one additional membrane adsorber has hydrophobic interactions or multimodal interactions if two membrane adsorbers that are orthogonal in terms of mechanisms of action have cation exchange and anion exchange interactions, respectively.

В контексте изобретения мембранные адсорберы, в частности, объединены в единую интегрированную стадию. Таким образом, количество стадий и буферов резко сокращается. Корректировки и манипуляции также удаляются, что глобально упрощает процесс. В частности, отсутствуют стадии элюирования, регуляции или хранения между одним мембранным адсорбером из комбинации мембранных адсорберов и другим(другими) мембранным(и) адсорбером(ами) такой комбинации мембранных адсорберов.In the context of the invention, membrane adsorbers, in particular, are combined into a single integrated stage. Thus, the number of stages and buffers is drastically reduced. Adjustments and manipulations are also removed, which globally simplifies the process. In particular, there are no elution, adjustment or storage steps between one membrane adsorber of a membrane adsorber combination and the other membrane adsorber(s) of that membrane adsorber combination.

В конкретных вариантах осуществления конкретная комбинация мембранных адсорберов «полирующей» стадии и условия работы (в частности, pH, проводимость и/или буфер) определяются в соответствии с физико-химическими свойствами очищаемого белка (например, pI, молекулярная масса, …). In particular embodiments, the particular combination of "polishing" stage membrane adsorbers and operating conditions (eg pH, conductivity and/or buffer) are determined according to the physicochemical properties of the protein to be purified (e.g., pI, molecular weight, ...).

Как будет понятно квалифицированному специалисту, оптимальные условия «полирующей» стадии должны позволить получить максимальный выход интересующего белка, то есть должны обеспечивать наименьшее взаимодействие интересующего белка с комбинацией мембранных адсорберов, в то же время позволяя максимально удаление загрязняющих веществ, то есть при максимально возможном взаимодействии загрязняющих веществ с комбинацией мембранных адсорберов без какой-либо регуляции или стадии элюирования между мембранными адсорберами из комбинации мембранных адсорберов.As the skilled artisan will appreciate, optimal conditions for the "polishing" step should allow for the maximum yield of the protein of interest, i.e., should allow for the least possible interaction of the protein of interest with the combination of membrane adsorbers, while allowing maximum removal of contaminants, i.e., with the greatest possible interaction of contaminants. substances with a combination of membrane adsorbers without any regulation or elution step between membrane adsorbers from a combination of membrane adsorbers.

Пример определения оптимальной комбинации двух мембранных адсорберов для полирующей стадии показан на Фигуре 3. В этом примере наилучшие характеристики очистки достигаются при использовании комбинации мембранных адсорберов Sartobind S и Sartobind STIC с более высоким очищением от загрязняющих веществ (более низким HCP и HMW) при максимальном выходе антител. На этой Фигуре также показано влияние загрузки на выход и удаление загрязняющих веществ.An example of determining the optimal combination of two membrane adsorbers for a polishing step is shown in Figure 3. In this example, the best cleaning performance is achieved using a combination of Sartobind S and Sartobind STIC membrane adsorbers with higher contaminant clearance (lower HCP and HMW) while maximizing antibody recovery . This Figure also shows the effect of loading on the output and removal of contaminants.

В контексте изобретения, чтобы определить эти оптимальные условия, мембранные адсорберы из комбинации мембранных адсорберов следует рассматривать как единый объект или единственную интегрированную стадию, то есть где они процессируются вместе, как если бы это была единственная стадия фильтрации. Например, в случае двух мембранных адсорберов, тогда как традиционный способ определения оптимальных условий при использовании двух мембранных адсорберов включает определение наилучших условий на первом мембранном адсорбере, затем определение наилучших условий на втором мембранном адсорбере и затем регуляция продукта (например, регуляция pH, регуляция проводимости или регуляция буфера) между обоими наилучшими условиями, в контексте изобретения два мембранных адсорбера рассматриваются только как один, и следует определить компромисс в отношении стратегии разделения двух мембранных адсорберов, позволяющей добиться хорошей очистки.In the context of the invention, to determine these optimal conditions, membrane adsorbers from a combination of membrane adsorbers should be considered as a single entity or a single integrated stage, i.e. where they are processed together as if it were a single filtration stage. For example, in the case of two membrane adsorbers, while the traditional way to determine the optimal conditions using two membrane adsorbers is to determine the best conditions on the first membrane adsorber, then determine the best conditions on the second membrane adsorber, and then adjust the product (for example, pH control, conductivity control, or buffer regulation) between both best conditions, in the context of the invention, two membrane adsorbers are considered only as one, and a compromise must be made on the separation strategy of the two membrane adsorbers to achieve good purification.

Как правило, при определении оптимизированного буфера, который будет использоваться для очистки данного белка, стадия обмена может быть выполнена с нейтральным буфером, а pH и проводимость раствора, содержащего ретентат, могут быть отрегулированы вручную, чтобы определить оптимальные условия очистки на «полирующей» стадии. Когда оптимальные условия определены, процесс может быть выполнен снова с использованием соответствующего буфера для стадии обмена, который будет соответствовать уравновешивающему буферу, используемому на полирующей стадии.Typically, when determining an optimized buffer to be used to purify a given protein, the exchange step can be performed with a neutral buffer, and the pH and conductivity of the solution containing the retentate can be manually adjusted to determine the optimal purification conditions in the "polishing" step. When optimal conditions are determined, the process can be carried out again using an appropriate buffer for the exchange step, which will match the equilibration buffer used in the polishing step.

Пример определения оптимальных буферов (таких как проводимость или pH буфера) в соответствии с комбинацией двух мембранных адсорберов, используемых на полирующей стадии, и pI интересующего белка проиллюстрирован на Фигуре 4. В этом примере условия pH и проводимости, позволяющие получить благоприятную очистку (соответствующую уровню HCP, составляющему от 50 до 500 нг/мл), соответствуют черным областям каждого графика.An example of determining optimal buffers (such as conductivity or buffer pH) according to the combination of two membrane adsorbers used in the polishing step and the pI of the protein of interest is illustrated in Figure 4. In this example, the pH and conductivity conditions to obtain favorable purification (corresponding to the level of HCP , ranging from 50 to 500 ng/ml) correspond to the black areas of each graph.

В контексте изобретения один буфер, используемый для уравновешивания по меньшей мере двух мембранных адсорберов, является таким же, как буфер, используемый на стадии обмена. Это позволяет очищать белок напрямую, чтобы максимизировать выход при сохранении большей части загрязняющих веществ. In the context of the invention, one buffer used to balance the at least two membrane adsorbers is the same as the buffer used in the exchange step. This allows the protein to be purified directly to maximize yield while retaining most of the contaminants.

В конкретных вариантах осуществления полирующая стадия оптимизируется изменением pH и проводимости буфера, используемого для кондиционирования белка во время стадии обмена.In specific embodiments, the polishing step is optimized by changing the pH and conductivity of the buffer used to condition the protein during the exchange step.

В конкретных вариантах осуществления «полирующая» стадия включает использование матрицы катионообменного мембранного адсорбера в сочетании с матрицей анионообменного мембранного адсорбера. В других вариантах осуществления «полирующая» стадия включает использование мультимодальной (смешанной) матрицы мембранного адсорбера в сочетании с матрицей анионообменного мембранного адсорбера.In specific embodiments, the "polishing" step comprises using a cation exchange membrane adsorber matrix in combination with an anion exchange membrane adsorber matrix. In other embodiments, the "polishing" step comprises using a multimodal (mixed) membrane adsorber matrix in combination with an anion exchange membrane adsorber matrix.

Комбинация матриц мембранных адсорберов, в частности, комбинация катионообменных мембранных адсорберов и анионообменных мембранных адсорберов, функционирует посредством взаимодействия между мембранным адсорбером и загрязняющими веществами, что приводит к высокоэффективному удалению примесей. Взаимодействие с загрязняющими веществами обусловлено несколькими механизмами: ионным, гидрофобным, ван-дер-ваальсовым и взаимодействиями водородных связей.The combination of membrane adsorber matrices, in particular the combination of cation exchange membrane adsorbers and anion exchange membrane adsorbers, functions through the interaction between the membrane adsorber and contaminants, resulting in highly efficient removal of impurities. Interaction with pollutants is due to several mechanisms: ionic, hydrophobic, van der Waals and hydrogen bond interactions.

В конкретных вариантах осуществления катионообменный мембранный адсорбер представляет собой мембранный адсорбер Sartobind S (Sartorius), мембранный адсорбер HD-C (Natrix). В конкретных вариантах осуществления катионообменный мембранный адсорбер представляет собой мембранный адсорбер Sartobind S (Sartorius). В конкретных вариантах осуществления анионообменный мембранный адсорбер представляет собой мембранный адсорбер Sartobind STIC (Sartorius), мембранный адсорбер Sartobind Q (Sartorius) или мембранный адсорбер HD-Q (Natrix). В конкретных вариантах осуществления анионообменный мембранный адсорбер представляет собой мембранный адсорбер Sartobind STIC (Sartorius) или мембранный адсорбер Sartobind Q (Sartorius). В других вариантах осуществления мультимодальный мембранный адсорбер представляет собой мембранный адсорбер HD-Sb (Natrix). В других вариантах осуществления мембранный адсорбер с гидрофобным взаимодействием представляет собой мембранный адсорбер Sartobind Phenyl (Sartorius).In particular embodiments, the cation exchange membrane adsorber is a Sartobind S membrane adsorber (Sartorius), HD-C membrane adsorber (Natrix). In particular embodiments, the cation exchange membrane adsorber is a Sartobind S membrane adsorber (Sartorius). In specific embodiments, the anion exchange membrane adsorber is a Sartobind STIC membrane adsorber (Sartorius), a Sartobind Q membrane adsorber (Sartorius), or an HD-Q membrane adsorber (Natrix). In specific embodiments, the anion exchange membrane adsorber is a Sartobind STIC membrane adsorber (Sartorius) or a Sartobind Q membrane adsorber (Sartorius). In other embodiments, the multimodal membrane adsorber is an HD-Sb (Natrix) membrane adsorber. In other embodiments, the hydrophobic interaction membrane adsorber is a Sartobind Phenyl membrane adsorber (Sartorius).

В конкретном варианте осуществления комбинация мембранных адсорберов представляет собой комбинацию мембранного адсорбера Sartobind S (Sartorius) и мембранного адсорбера Sartobind STIC (Sartorius).In a particular embodiment, the combination of membrane adsorbers is a combination of a Sartobind S membrane adsorber (Sartorius) and a Sartobind STIC membrane adsorber (Sartorius).

Основное преимущество использования мембранных адсорберов, а не колонок на «полирующей» стадии способа по изобретению, кратко изложено ниже:The main advantage of using membrane adsorbers rather than columns in the "polishing" step of the process of the invention is summarized below:

- при сопоставимых масштабах мембранные адсорберы можно использовать при скорости потока в 10 раз выше, чем у колонки, тем самым резко сокращая продолжительность процесса. Например, колонка на 5 мл, заполненная смолой, будет использоваться при скорости потока 1 мл/мин, тогда как соответствующий 5-миллилитровый мембранный адсорбер будет использоваться при минимальной скорости потока 10 мл/мин. Соответственно, когда классический процесс, использующий две хроматографические полирующие стадии, выполняется за 2 часа 30 минут с использованием двух колонок, заполненных смолой, он может быть завершен менее чем за 15 минут с использованием мембранных адсорберов.- At a comparable scale, membrane adsorbers can be used at flow rates 10 times higher than those of a column, thereby drastically reducing the process time. For example, a 5 ml column filled with resin would be used at a flow rate of 1 ml/min, while a corresponding 5 ml membrane adsorber would be used at a minimum flow rate of 10 ml/min. Accordingly, when a classic process using two chromatographic polishing steps is completed in 2 hours and 30 minutes using two resin-packed columns, it can be completed in less than 15 minutes using membrane adsorbers.

- даже если они многоразовые, мембранные адсорберы представляют собой устройства одноразового использования, которые, таким образом, можно выбросить после партии, и его не нужно хранить в течение длительного времени. Поэтому нет необходимости проверять их, чтобы гарантировать долгосрочную стабильность.- even though they are reusable, membrane adsorbers are single-use devices, which can thus be discarded after a batch and do not need to be stored for a long time. Therefore, there is no need to test them to ensure long-term stability.

- использование мембранных адсорберов дешевле, поскольку позволяет избежать затрат на колонку, набивки колонки и хранения колонки.- The use of membrane adsorbers is cheaper because it avoids the cost of the column, column packing and column storage.

В конкретном варианте осуществления, когда комбинация мембранных адсорберов представляет собой комбинацию мембранного адсорбера Sartobind S (Sartorius) и мембранного адсорбера Startobind STIC (Sartorius), один буфер имеет pH и проводимость в диапазонах, указанных на черных областях верхних панелей Фигуры 4. In a particular embodiment, when the combination of membrane adsorbers is a combination of a Sartobind S membrane adsorber (Sartorius) and a Startobind STIC membrane adsorber (Sartorius), one buffer has pH and conductivity in the ranges indicated in the black areas of the top panels of Figure 4.

В другом конкретном варианте осуществления, когда комбинация мембранных адсорберов представляет собой комбинацию мембранного адсорбера Sartobind S (Sartorius) и мембранного адсорбера Startobind Q (Sartorius), один буфер имеет pH и проводимость в диапазонах, указанных на черных областях нижних панелей Фигуры 4.In another specific embodiment, when the combination of membrane adsorbers is a combination of a Sartobind S membrane adsorber (Sartorius) and a Startobind Q membrane adsorber (Sartorius), one buffer has pH and conductivity in the ranges indicated in the black areas of the bottom panels of Figure 4.

Способ очистки согласно изобретению является способом полностью проточной очистки.The cleaning process according to the invention is a full flow cleaning process.

Под «способом полностью проточной очистки» здесь подразумевается, что все различные стадии очистки данного способа подразумевают связывание примесей только при пропускании интересующего белка через стадии очистки.By "all-through purification process" is meant here that all the various purification steps of the method involve the binding of impurities only by passing the protein of interest through the purification steps.

В одном варианте осуществления способ согласно изобретению не включает регуляцию pH отфильтрованного белкового раствора в конце стадии фильтрации и/или ретентата в конце стадии обмена.In one embodiment, the method of the invention does not include adjusting the pH of the filtered protein solution at the end of the filtration step and/or the retentate at the end of the exchange step.

В конкретном варианте осуществления отфильтрованный белковый раствор, полученный в конце стадии фильтрации, непосредственно пропускают через диафильтрационную мембрану. Более конкретно, тогда между двумя стадиями не проводят никакой обработки (такой как регуляция pH, замена буфера или разбавление). В таком способе диафильтрационная мембрана может, например, соответствовать готовому к обработке половолоконному модулю 30 кДа или встроенному модулю диафильтрации Cadence, которому предшествует или за которым, например, следует встроенный концентратор Cadence. Кроме того, в конкретном варианте осуществления ретентат, полученный в конце стадии обмена, непосредственно пропускают через комбинацию мембранных адсорберов «полирующей» стадии. Более конкретно, тогда между двумя стадиями не проводят никакой обработки (такой как регуляция pH, замена буфера или разбавление). В таком способе диафильтрационная мембрана может, например, соответствовать готовому к обработке половолоконному модулю 30 кДа, и/или комбинация мембранных адсорберов может, например, соответствовать комбинации мембранного адсорбера Sartobind S и мембранного адсорбера Sartobind STIC. In a specific embodiment, the filtered protein solution obtained at the end of the filtration step is passed directly through the diafiltration membrane. More specifically, no treatment (such as pH adjustment, buffer exchange or dilution) is then carried out between the two steps. In such a process, the diafiltration membrane may, for example, correspond to a ready-to-process 30 kDa hollow fiber module or an inline Cadence diafiltration module preceded or followed by, for example, an inline Cadence concentrator. In addition, in a specific embodiment, the retentate obtained at the end of the exchange stage is directly passed through a combination of membrane adsorbers "polishing" stage. More specifically, no treatment (such as pH adjustment, buffer exchange or dilution) is then carried out between the two steps. In such a process, the diafiltration membrane may, for example, correspond to a ready-to-treat 30 kDa hollow fiber module, and/or the combination of membrane adsorbers may, for example, correspond to a combination of a Sartobind S membrane adsorber and a Sartobind STIC membrane adsorber.

В таком способе полностью отсутствуют межстадийные обработки, требующие ручного вмешательства и открытия системы очистки (например, разбавление, регуляция проводимости и регуляция pH).Such a process completely eliminates inter-stage treatments requiring manual intervention and opening of the purification system (eg, dilution, conductivity control and pH adjustment).

Таким образом, способ по настоящему изобретению может быть реализован в гибкой автоматизированной хроматографической системе, включающей несколько насосов и датчиков с соединительными и переключающими клапанами для работы последовательно или непрерывно 3 стадий очистки.Thus, the method of the present invention can be implemented in a flexible automated chromatographic system, including several pumps and sensors with connecting and switching valves to operate sequentially or continuously 3 stages of purification.

Неограничивающим примером многооперационной системы является многоколоночная хроматографическая система MCCS с соответствующей адаптацией.A non-limiting example of a multi-operational system is the MCCS multi-column chromatography system, with appropriate adaptations.

Способ согласно изобретению может выполняться в непрерывном режиме. Другими словами, способ по изобретению может быть непрерывным способом очистки белка из раствора.The method according to the invention can be carried out continuously. In other words, the process of the invention may be a continuous process for purifying a protein from solution.

Термин «непрерывный способ» или «способ в непрерывном режиме» означает способ, при котором происходит непрерывная подача текучей среды через по меньшей мере часть системы. The term "continuous method" or "continuous mode" means a method in which there is a continuous supply of fluid through at least part of the system.

Под термином «текучая среда» здесь подразумевается любая жидкость, такая как раствор, содержащий очищаемый белок, буфер или раствор с низким или кислым pH для инактивации вирусов.The term "fluid" here means any liquid, such as a solution containing a protein to be purified, a buffer, or a solution with a low or acidic pH to inactivate viruses.

В конкретном варианте осуществления на первую, вторую и третью стадии очистки непрерывно подается текучая среда.In a specific embodiment, fluid is continuously supplied to the first, second, and third purification steps.

Термин «интегрированный процесс» означает процесс, который выполняется с использованием структурных элементов, которые функционируют совместно для достижения определенного результата (например, получение очищенного белка из жидкой культуральной среды).The term "integrated process" means a process that is performed using structural elements that function together to achieve a certain result (for example, obtaining a purified protein from a liquid culture medium).

Кроме того, способ согласно изобретению может выполняться в замкнутой системе от первой стадии способа до последней. Другими словами, способ согласно изобретению предпочтительно имеет функционально закрытый путь потока. В частности, три стадии очистки и необязательная стадия(и) фильтрации (например, стадия нанофильтрации и/или стадия конечной ультрафильтрации и/или диафильтрации) могут выполняться в закрытой системе. В конкретном варианте осуществления способа по настоящему изобретению раствор, содержащий белки, пропускают по частям через три стадии очистки, причем каждый проход части раствора соответствует циклу. Белки, извлеченные в конце каждого цикла, затем собираются и объединяются. В таком способе мембранный адсорбер стадии очистки используется несколько раз и необязательно дезинфицируется с использованием, например, дезинфицирующего буфера, как определено выше, что позволяет уменьшить объем устройств мембранных адсорберов и необходимый буфер. Например, последовательность от 3 до 50 циклов (например, от 3 до 30 циклов, от 5 до 25 циклов, от 10 до 20 циклов или 15 циклов) может выполняться непрерывно. Более конкретно, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 циклов могут выполняться в непрерывном режиме с последующей дезинфекцией мембранных адсорберов (например, с использованием дезинфицирующего буфера). Это может повторяться, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более раз, как показано на Фигуре 2.In addition, the method according to the invention can be carried out in a closed system from the first stage of the method to the last. In other words, the process according to the invention preferably has a closed flow path. In particular, the three purification steps and the optional filtration step(s) (eg, the nanofiltration step and/or the final ultrafiltration and/or diafiltration step) can be performed in a closed system. In a particular embodiment of the method of the present invention, the protein-containing solution is passed piecemeal through three purification steps, with each passage of a portion of the solution corresponding to a cycle. The proteins extracted at the end of each cycle are then collected and combined. In such a method, the membrane adsorber of the purification step is used several times and optionally disinfected using, for example, a disinfectant buffer as defined above, thus reducing the size of the membrane adsorber devices and the required buffer. For example, a sequence of 3 to 50 cycles (eg, 3 to 30 cycles, 5 to 25 cycles, 10 to 20 cycles, or 15 cycles) may be performed continuously. More specifically, 3, 4, 5, 6, 7, or 8 cycles may be performed continuously, followed by disinfection of the membrane adsorbers (eg, using a disinfection buffer). This may be repeated, for example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more times, as shown in Figure 2.

Раскрытый в настоящем описании способ можно использовать для извлечения очищенных белков. Используемый в настоящем описании термин «очищенный» относится к чистоте, которая позволяет эффективно использовать белок in vitro, ex vivo или in vivo. Чтобы белок можно было использовать в приложениях in vitro, ex vivo или in vivo, он должен быть практически свободен от загрязняющих веществ, других белков и/или химикатов, которые могут помешать использованию этого белка в таких применениях или которые, по меньшей мере, были бы нежелательными для включения с интересующим белком. Такие применения включают приготовление терапевтических композиций, введение белка в терапевтической композиции и другие способы, раскрытые в настоящем описании. Предпочтительно, «очищенный» белок, как упоминается в настоящем описании, представляет собой белок, который может быть получен любым способом (т.е. путем прямой очистки из природного источника, рекомбинантно или синтетически) и который был очищен от других белковых компонентов, так что белок составляет, по меньшей мере, примерно 70% масс/масс от общего белка в данной композиции, и более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 80% или, по меньшей мере, примерно 85%, и более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 90%, и более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 91%, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 92%, и более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 93%, и более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 94%, и более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 95%, и более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 96%, и более предпочтительно по меньшей мере примерно 97%, более предпочтительно по меньшей мере примерно 98% и более предпочтительно по меньшей мере примерно 99% масс/масс от суммарного белка в данной композиции.The method disclosed herein can be used to recover purified proteins. Used in the present description, the term "purified" refers to the purity, which allows the effective use of the protein in vitro, ex vivo or in vivo. For a protein to be useful in in vitro, ex vivo, or in vivo applications, it must be substantially free of contaminants, other proteins, and/or chemicals that could interfere with the use of the protein in such applications, or that would at least be undesirable for inclusion with the protein of interest. Such applications include the preparation of therapeutic compositions, the introduction of a protein in a therapeutic composition, and other methods disclosed in the present description. Preferably, a "purified" protein as referred to herein is a protein that can be obtained by any means (i.e., direct purification from a natural source, recombinantly, or synthetically) and that has been purified from other protein components such that the protein makes up at least about 70% w/w of the total protein in the composition, and more preferably at least about 80% or at least about 85%, and more preferably at least about 90%, and more preferably at least about 91%, more preferably at least about 92%, and more preferably at least about 93%, and more preferably at least about 94%, and more preferably at least about 95%, and more preferably at least about 96%, and more preferably at least about 97%, more preferably at least about 98%, and more preferably at least at least about 99% w/w of the total protein in the composition.

(i) пропускание отфильтрованного белкового раствора, полученного на стадии (а), и одного буфера через по меньшей мере одну диафильтрационную мембрану, (i) passing the filtered protein solution obtained in step (a) and one buffer through at least one diafiltration membrane,

иAnd

при этом один буфер содержит или состоит из:whereby one buffer contains or consists of:

- от 5 до 40 мМ (например, 20 мМ) бис-Tris и от 15 до 150 мМ (например, 75 мМ) NaCl, с pH, доведенным до 6-9 (например, 7,5) с помощью уксусной кислоты,- 5 to 40 mM (eg 20 mM) bis-Tris and 15 to 150 mM (eg 75 mM) NaCl, pH adjusted to 6-9 (eg 7.5) with acetic acid,

- от 5 до 40 мМ (например, 20 мМ) Tris или Tris-HCl, от 15 до 150 мМ (например, 75 мМ) NaCl, с pH, доведенным до 6-9 (например, 7,5) с помощью уксусной кислоты, - 5 to 40 mM (eg 20 mM) Tris or Tris-HCl, 15 to 150 mM (eg 75 mM) NaCl, pH adjusted to 6-9 (eg 7.5) with acetic acid ,

- от 5 до 40 мМ (например, 20 мМ) Tris или Tris-HCl, от 15 до 150 мМ (например, 75 мМ) NaCl, с pH, доведенным до 6-9 (например, 7,5) с помощью лимонной кислоты, или- 5 to 40 mM (eg 20 mM) Tris or Tris-HCl, 15 to 150 mM (eg 75 mM) NaCl, pH adjusted to 6-9 (eg 7.5) with citric acid , or

- от 15 до 150 мМ (например, 75 мМ) NaCl, с pH, доведенным до 6-9 (например, 7,5) с помощью Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ (предпочтительно от 10 мМ/90 мМ Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ до 90 мМ/10 мМ Na₂HPO₄/NaH₂PO₄) .- 15 to 150 mM (eg 75 mM) NaCl, with pH adjusted to 6-9 (eg 7.5) with Na ₂ HPO ₄ /NaH ₂ PO ₄ (preferably from 10 mM/90 mM Na ₂ HPO ₄ /NaH ₂ PO ₄ up to 90 mM/10 mM Na ₂ HPO ₄ /NaH ₂ PO ₄ ) .

Способ очистки белка из раствора может включать, по меньшей мере, дополнительную стадию конечной фильтрации после «полирующей» стадии, такую как стадия нанофильтрации, стадия ультрафильтрации и/или стадия диафильтрации. При очистке рекомбинантных белков для фармацевтических целей полирующая стадия обычно сопровождается дополнительными стадиями конечной фильтрации. Следовательно, способ изобретения может дополнительно включать стадию нанофильтрации после стадии (с). После стадии нанофильтрации могут быть дополнительно проведены стадии ультрафильтрации и диафильтрации. Используемый в настоящем описании термин «ультрафильтрация» или «УФ» относится к методике фильтрации с использованием полупроницаемой мембраны для физического и селективного удаления частиц и/или ионов из раствора в зависимости от размера частиц и размера пор в УФ-мембране. Используемый в настоящем описании термин «нанофильтрация» относится к фильтрации раствора через нанофильтр, который используется для удаления, например, вирусных частиц. Используемый в настоящем описании термин «диафильтрация» относится к методике, в которой используются ультрафильтрационные мембраны для полного удаления, замены или снижения концентрации солей или растворителей из растворов.The method for purifying a protein from solution may include at least an additional final filtration step after a "polishing" step, such as a nanofiltration step, an ultrafiltration step, and/or a diafiltration step. When purifying recombinant proteins for pharmaceutical purposes, the polishing step is usually followed by additional final filtration steps. Therefore, the method of the invention may further include a nanofiltration step after step (c). After the nanofiltration step, ultrafiltration and diafiltration steps can be additionally carried out. As used herein, the term "ultrafiltration" or "UV" refers to a filtration technique using a semi-permeable membrane to physically and selectively remove particles and/or ions from solution, depending on particle size and pore size in the UV membrane. Used in the present description, the term "nanofiltration" refers to the filtration of a solution through a nanofilter, which is used to remove, for example, viral particles. Used in the present description, the term "diafiltration" refers to a technique that uses ultrafiltration membranes to completely remove, replace or reduce the concentration of salts or solvents from solutions.

Способ по настоящему изобретению может также дополнительно включать по меньшей мере одну стадию инактивации вируса. Указанная по меньшей мере одна стадия инактивации вирусов может быть выполнена на любом этапе способа по изобретению, например, перед стадией (а), после стадии (а), после стадии (b), после стадии (с), после стадии нанофильтрации и/или после стадии ультрафильтрации и/или диафильтрации. Такая стадия инактивации вирусов обычно может быть стадией инактивации при низком или кислом pH. Используемый в настоящем описании термин «инактивация при низком или кислом pH» относится к методике вирусной инактивации с использованием кислого pH для денатурации вирусов, в частности, оболочечных вирусов Обычно стадию инактивации при низком или кислом pH проводят путем инкубации извлеченных белков при pH от примерно 3 до 5 (например, от примерно 3,5 до примерно 4,5, от примерно 3,5 до примерно 4,25, от примерно 3,5 до примерно 4, например 4) в течение периода по меньшей мере 15 минут (например, периода от 15 минут до 1 часа, периода от примерно 30 минут до 2 часов или периода от примерно 45 минут до 2 часов). Например, стадия инактивации при низком или кислом pH выполняется путем инкубации выделенных белков при pH 4 в течение, например, от 30 минут до 2 часов. The method of the present invention may also further include at least one step of inactivating the virus. Said at least one virus inactivation step can be performed at any step of the method according to the invention, for example, before step (a), after step (a), after step (b), after step (c), after the nanofiltration step and/or after the ultrafiltration and/or diafiltration step. Such a viral inactivation step may typically be a low or acidic pH inactivation step. As used herein, the term "low or acidic pH inactivation" refers to a viral inactivation technique using acidic pH to denature viruses, particularly enveloped viruses. Typically, the low or acidic pH inactivation step is carried out by incubating the recovered proteins at a pH of from about 3 to 5 (for example, from about 3.5 to about 4.5, from about 3.5 to about 4.25, from about 3.5 to about 4, for example 4) for a period of at least 15 minutes (for example, a period 15 minutes to 1 hour, a period of about 30 minutes to 2 hours, or a period of about 45 minutes to 2 hours). For example, the low or acidic pH inactivation step is performed by incubating the isolated proteins at pH 4 for, for example, 30 minutes to 2 hours.

Способ по настоящему изобретению может также включать перед стадией (а) стадию предоставления жидкой культуральной среды, содержащей очищаемый белок, которая была очищена для удаления клеток и по существу не содержит клеток, при этом указанная жидкая культуральная среда подается по меньшей мере на одну матрицу хелатирующего агента.The method of the present invention may also include, prior to step (a), the step of providing a liquid culture medium containing the protein to be purified that has been purified to remove cells and is substantially free of cells, said liquid culture medium being supplied to at least one matrix of chelating agent .

Например, способ очистки белка из раствора по настоящему изобретению может включать:For example, a method for purifying a protein from a solution of the present invention may include:

(пре-а) стадию предоставления жидкой культуральной среды, содержащей очищаемый белок, которая была очищена для удаления клеток и по существу не содержит клеток,(pre-a) the step of providing a liquid culture medium containing the protein to be purified, which has been purified to remove cells and is substantially free of cells,

(a) стадию фильтрации, включающую:(a) a filtering step comprising:

- пропускание указанной жидкой культуральной среды стадии (пре-a) по меньшей мере через одну матрицу хелатирующего агента в проточном режиме;passing said liquid culture medium of step (pre-a) through at least one chelating agent matrix in flow mode;

- извлечение отфильтрованного белкового раствора из фильтрата указанной по меньшей мере одной матрицы хелатирующего агента; - extracting the filtered protein solution from the filtrate of said at least one chelating agent matrix;

- пропускание отфильтрованного белкового раствора, полученного в конце стадии (а), по меньшей мере через одну диафильтрационную мембрану с использованием только одного буфера для обмена;passing the filtered protein solution obtained at the end of step (a) through at least one diafiltration membrane using only one exchange buffer;

- извлечение частично очищенного ретентата, содержащего белок, указанной по меньшей мере одной диафильтрационной мембраны; и- extracting a partially purified retentate containing protein, the specified at least one diafiltration membrane; And

- пропускание ретентата, полученного в конце стадии (b), через комбинацию мембранных адсорберов в проточном режиме, при этом два мембранных адсорбера указанной комбинации мембранных адсорберов являются ортогональными с точки зрения механизма действия, и указанная комбинация мембранных адсорберов была предварительно уравновешена уравновешивающим буфером, который идентичен одному буферу, используемому для замены на стадии (b);- passing the retentate obtained at the end of step (b) through a combination of membrane adsorbers in flow mode, wherein the two membrane adsorbers of said combination of membrane adsorbers are orthogonal in terms of the mechanism of action, and said combination of membrane adsorbers has been pre-equilibrated with an equilibration buffer which is identical one buffer used for replacement in step (b);

- извлечение очищенного белка из фильтрата указанной комбинации мембранных адсорберов;- extracting the purified protein from the filtrate of the specified combination of membrane adsorbers;

Наконец, очищенный белок может быть включен в композицию, подходящую для хранения, и/или в фармацевтическую композицию, в частности, подходящую для введения животным и/или людям.Finally, the purified protein may be included in a composition suitable for storage and/or in a pharmaceutical composition, particularly suitable for administration to animals and/or humans.

Одним из многочисленных преимуществ описанного способа является то, что он позволяет получать хорошие выходы белка высокой степени чистоты. Очищенный белок, который получают способом по настоящему изобретению, может, например, иметь чистоту по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%. , 99,2%, 99,5% или 99,9%. Более конкретно, одно из многочисленных преимуществ раскрытого способа состоит в том, что он позволяет получать растворы белка высокой степени чистоты, содержащего пониженные количества загрязняющей ДНК, высокомолекулярных (HMW) соединений (которые соответствуют белковым агрегатам) и/или белки клетки-хозяина (HCP). Раствор, содержащий очищенный белок, который получают способом по настоящему изобретению, может, например, демонстрировать количество загрязняющей ДНК менее 0,4 частей на миллиард, менее 0,3 частей на миллиард, менее 0,2 частей на миллиард или менее 0,1 частей на миллиард. Раствор, содержащий очищенный белок, который получают способом по настоящему изобретению, также может, например, демонстрировать концентрацию HMW-соединений, составляющую менее чем 0,6%, менее чем 0,5%, менее чем 0,4%, менее чем 0,3%, менее чем 0,2% или менее чем 0,1%. Раствор, содержащий очищенный белок, который получают способом по настоящему изобретению, также может, например, демонстрировать концентрацию HCP менее чем 500 нг/мл, менее чем 100 нг/мл, менее чем 90 нг/мл, менее чем 85 нг/мл, менее чем 80 нг/мл, менее чем 75 нг/мл или менее чем 70 нг/мл. Кроме того, способ по настоящему изобретению позволяет извлекать очищенный белок с выходом по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%. One of the many advantages of the described process is that it allows good yields of high purity protein. The purified protein which is obtained by the method of the present invention may, for example, be at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% pure. , 99.2%, 99.5% or 99.9%. More specifically, one of the many advantages of the disclosed method is that it allows the preparation of high purity protein solutions containing reduced amounts of contaminating DNA, high molecular weight (HMW) compounds (which correspond to protein aggregates) and/or host cell proteins (HCP) . A solution containing a purified protein that is produced by the method of the present invention may, for example, exhibit an amount of contaminating DNA of less than 0.4 ppb, less than 0.3 ppb, less than 0.2 ppb, or less than 0.1 ppb per billion. The solution containing the purified protein that is obtained by the method of the present invention may also, for example, exhibit a concentration of HMW compounds of less than 0.6%, less than 0.5%, less than 0.4%, less than 0. 3%, less than 0.2% or less than 0.1%. The solution containing the purified protein, which is obtained by the method of the present invention, can also, for example, exhibit an HCP concentration of less than 500 ng/ml, less than 100 ng/ml, less than 90 ng/ml, less than 85 ng/ml, less than 80 ng/ml, less than 75 ng/ml, or less than 70 ng/ml. In addition, the method of the present invention allows you to recover the purified protein with a yield of at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99%.

Изобретение также относится к набору, включающему или состоящему из: The invention also relates to a kit comprising or consisting of:

(a) по меньшей мере, одной матрицы хелатирующего агента, по меньшей мере, одной диафильтрационной мембраны и комбинации мембранных адсорберов, где два мембранных адсорбера указанной комбинации мембранных адсорберов являются ортогональными с точки зрения механизмов действия; и (a) at least one chelating agent matrix, at least one diafiltration membrane, and a combination of membrane adsorbers, wherein the two membrane adsorbers of said combination of membrane adsorbers are orthogonal in terms of mechanisms of action; And

(b) одного буфера, содержащего Tris, Tris-HCl, бис-Tris, фосфат и/или лимонную кислоту, в частности, содержащего или состоящего из (i) бис-Tris, Tris или Tris-HCl, (ii) уксусной кислоты, (iii) воды и (iv) необязательно NaCl; и/или инструкции по приготовлению одного буфера, содержащего Tris, Tris-HCl, бис-Tris, фосфат и/или лимонную кислоту, в частности, содержащего или состоящего из (i) бис-Tris, Tris или Tris-HCl, (ii) уксусной кислоты, (iii) воды и (iv) необязательно NaCl. (b) one buffer containing Tris, Tris-HCl, bis-Tris, phosphate and/or citric acid, in particular containing or consisting of (i) bis-Tris, Tris or Tris-HCl, (ii) acetic acid, (iii) water and (iv) optionally NaCl; and/or instructions for preparing one buffer containing Tris, Tris-HCl, bis-Tris, phosphate and/or citric acid, in particular containing or consisting of (i) bis-Tris, Tris or Tris-HCl, (ii) acetic acid, (iii) water and (iv) optionally NaCl.

Настоящее изобретение будет дополнительно проиллюстрировано приведенными ниже фигурами и примерами.The present invention will be further illustrated by the following figures and examples.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

На Фигуре 1 показана схема, представляющая трехстадийный полностью проточный способ согласно изобретению.Figure 1 shows a diagram representing a three-stage fully flow process according to the invention.

На Фигуре 2 показана схема, представляющая непрерывную версию трехстадийного полностью проточного способа по изобретению, используемого в Примере 4.Figure 2 is a diagram representing a continuous version of the three-stage all-flow process of the invention used in Example 4.

На Фигуре 3 показаны гистограммы, представляющие сравнение выхода (%), HMW (%) и HCP (нг/мл), полученных с 4 комбинациями мембранных адсорберов (HD-C+HD-Q; HD-Sb+HD-Q; Sartobind. S+Q; Sartobind S+STIC) в зависимости от емкости (мг/мл) мембран.Figure 3 shows bar graphs representing a comparison of yield (%), HMW (%) and HCP (ng/ml) obtained with 4 combinations of membrane adsorbers (HD-C+HD-Q; HD-Sb+HD-Q; Sartobind. S+Q; Sartobind S+STIC) depending on the capacity (mg/ml) of the membranes.

На Фигуре 4 показан график зоны наилучшего восприятия для двух комбинаций мембранных адсорберов (верхняя панель: Sartobind S+STIC; нижняя панель: Sartobind S+Q) и 3 мкл очищаемого белка (6; 7,5 и 9) в зависимости от pH и проводимости (мСм/см) уравновешивающего буфера. Условия pH и проводимости, позволяющие получить благоприятную очистку (соответствующую уровню HCP, составляющему от 50 до 500 нг/мл), соответствуют черным областям каждого графика.Figure 4 shows a plot of the sweet spot for two combinations of membrane adsorbers (top panel: Sartobind S+STIC; bottom panel: Sartobind S+Q) and 3 µl of purified protein (6; 7.5 and 9) as a function of pH and conductivity (mS/cm) balancing buffer. The pH and conductivity conditions for obtaining favorable purification (corresponding to an HCP level of 50 to 500 ng/mL) correspond to the black areas of each graph.

На Фигуре 5 представлена частичная хроматограмма очистки (УФ 280 нм) на мембране во время непрерывного технологического эксперимента в лабораторных условиях.Figure 5 shows a partial purification chromatogram (UV 280 nm) on a membrane during a continuous process experiment in the laboratory.

ПРИМЕРЫEXAMPLES

Пример 1: Способ по изобретению в лабораторном масштабеExample 1 Method according to the invention on a laboratory scale

Способ по изобретению использовали для периодической очистки в лабораторном масштабе гуманизированного моноклонального антитела mAb1.The method of the invention was used to periodically purify the humanized monoclonal antibody mAb1 on a laboratory scale.

Этот эксперимент показывает результаты удаления примесей, полученные в лабораторном масштабе после трех стадий. Целью было удалить агрегаты (HMW) и белок клеток-хозяев (HCP) ниже 1% для HMW и 500 нг/мл для HCP. This experiment shows the results of impurity removal obtained on a laboratory scale after three steps. The goal was to remove aggregates (HMW) and host cell protein (HCP) below 1% for HMW and 500 ng/ml for HCP.

Авторам изобретения удалось использовать 2 различных хелатирующих агента, одну стадию обмена и пару мембран (Sartobind S и STIC или Sartobind S и Q). The inventors have succeeded in using 2 different chelating agents, one exchange step and a pair of membranes (Sartobind S and STIC or Sartobind S and Q).

СтадияStage Условия (pH/проводимость)Conditions (pH/conductivity) HMW (%)HMW (%) HCP (нг/мл)HCP (ng/ml) Стадия фильтрацииFiltration stage Сбор массыMass collection Исходный материалRaw material 5,65.6 822 039822 039 NH₂-750F смолаNH ₂ -750F resin Добавляли в массу и перемешивалиAdded to the mixture and mixed 22 519 516519 516 Активированный уголь CA1Activated carbon CA1 Добавляли в массу и перемешивалиAdded to the mixture and mixed 1,91.9 179 002179 002 Активированный уголь CA2Activated carbon CA2 Добавляли в массу и перемешивалиAdded to the mixture and mixed 22 143 765143 765 Стадия обменаexchange stage UF/DF 30 кДа концентрацияUF/DF 30 kDa concentration 2,22.2 474 742474 742 UF/DF 30 кДа диафильтрацияUF/DF 30 kDa diafiltration 2,72.7 488 279488 279 Фильтрация 0,2 µмFiltration 0.2 µm -- -- «Полирующая» стадия"Polishing" stage Sartobind S+Q мембраныSartobind S+Q membranes pH 8,5-3мС/смpH 8.5-3mS/cm 00 15821582 Sartobind S+STIC мембраныSartobind S+STIC membranes pH 8,5-3 мС/смpH 8.5-3 mS/cm 00 348348 Sartobind S+Q мембраныSartobind S+Q membranes pH 7,5-3 мС/смpH 7.5-3 mS/cm 00 20232023 Sartobind S+STIC мембраныSartobind S+STIC membranes pH 7,5-3 мС/смpH 7.5-3 mS/cm 00 604604 Sartobind S+Q мембраныSartobind S+Q membranes pH 6,5-3мС/смpH 6.5-3mS/cm 00 79687968 Sartobind S+STIC мембраныSartobind S+STIC membranes pH 6,5-3 мС/смpH 6.5-3 mS/cm 00 656656 Sartobind S+Q мембраныSartobind S+Q membranes pH 8,5-12 мС/смpH 8.5-12 mS/cm 0,80.8 1159111591 Sartobind S+STIC мембраныSartobind S+STIC membranes pH 8,5-12 мС/смpH 8.5-12 mS/cm 00 32973297 Sartobind S+Q мембраныSartobind S+Q membranes pH 7,5-12 мС/смpH 7.5-12 mS/cm 2,42.4 3472734727 Sartobind S+STIC мембраныSartobind S+STIC membranes pH 7,5-12 мС/смpH 7.5-12 mS/cm 00 36393639 Sartobind S+Q мембраныSartobind S+Q membranes pH 6,5-12 мС/смpH 6.5-12 mS/cm 33 6348463484 Sartobind S+STIC мембраныSartobind S+STIC membranes pH 6,5-12 мС/смpH 6.5-12 mS/cm 00 55895589

Пример 2: Способ по изобретению в лабораторном масштабеExample 2 Method according to the invention on a laboratory scale

Способ по настоящему изобретению использовали для периодического процесса очистки гуманизированного моноклонального антитела mAb2 в лабораторном масштабе.The method of the present invention was used for a laboratory scale humanized mAb2 purification batch process.

Этот эксперимент показывает результаты удаления примесей, полученные в лабораторном масштабе после трех стадий. Целью было удалить агрегаты (HMW) и белки клеток-хозяев (HCP) ниже 1% для HMW и 500 нг/мл для HCP. Авторам изобретения удалось использовать 2 вида хелатирующих агентов, одну стадию обмена и пару мембран (Sartobind S и STIC или Sartobind S и Q). Наилучший результат достигается с парой Sartobind S+STIC при условиях нагрузки, установленных на уровне pH 8,5 и 3 мС/см.This experiment shows the results of impurity removal obtained on a laboratory scale after three steps. The goal was to remove aggregates (HMW) and host cell proteins (HCP) below 1% for HMW and 500 ng/ml for HCP. The inventors managed to use 2 types of chelating agents, one exchange stage and a pair of membranes (Sartobind S and STIC or Sartobind S and Q). Best results are achieved with a pair of Sartobind S+STICs under load conditions set at pH 8.5 and 3 mS/cm.

СтадияStage Условия (pH/проводимость)Conditions (pH/conductivity) HMW (%)HMW (%) HCP (нг/мл)HCP (ng/ml) Стадия фильтрацииFiltration stage Сбор массыMass collection Исходный материалRaw material 8,88.8 644 359644 359 NH₂-750F смолаNH ₂ -750F resin Добавляли в массу и перемешивалиAdded to the mixture and mixed 22 320 476320 476 Активированный уголь CA1Activated carbon CA1 Добавляли в массу и перемешивалиAdded to the mixture and mixed 1,61.6 73 28173 281 Активированный уголь CA2Activated carbon CA2 Добавляли в массу и перемешивалиAdded to the mixture and mixed 0,50.5 43 15343 153 Стадия обменаexchange stage UF/DF 50 кДа концентрацияUF/DF 50 kDa concentration UF/DF 50 кДа концентрацияUF/DF 50 kDa concentration Фильтрация 0,2 µмFiltration 0.2 µm 0,70.7 333 573333 573 «Полирующая» стадия"Polishing" stage Sartobind S+Q мембраныSartobind S+Q membranes pH 8,5-3мС/смpH 8.5-3mS/cm 0,10.1 882882 Sartobind S+STIC мембраныSartobind S+STIC membranes pH 8,5-3 мС/смpH 8.5-3 mS/cm 0,20.2 182182 Sartobind S+Q мембраныSartobind S+Q membranes pH 7,5-3 мС/смpH 7.5-3 mS/cm 0,10.1 743743 Sartobind S+STIC мембраныSartobind S+STIC membranes pH 7,5-3 мС/смpH 7.5-3 mS/cm 00 262262 Sartobind S+Q мембраныSartobind S+Q membranes pH 6,5-3 мС/смpH 6.5-3 mS/cm 00 55225522 Sartobind S+STIC мембраныSartobind S+STIC membranes pH 6,5-3 мС/смpH 6.5-3 mS/cm 00 11171117 Sartobind S+Q мембраныSartobind S+Q membranes pH 8,5-12 мС/смpH 8.5-12 mS/cm 0,60.6 11 00111 001 Sartobind S+STIC мембраныSartobind S+STIC membranes pH 8,5-12 мС/смpH 8.5-12 mS/cm 00 27102710 Sartobind S+Q мембраныSartobind S+Q membranes pH 7,5-12 мС/смpH 7.5-12 mS/cm 0,60.6 12 96112 961 Sartobind S+STIC мембраныSartobind S+STIC membranes pH 7,5-12 мС/смpH 7.5-12 mS/cm 0,10.1 64636463 Sartobind S+Q мембраныSartobind S+Q membranes pH 6,5-12 мС/смpH 6.5-12 mS/cm 0,60.6 6355363553 Sartobind S+STIC мембраныSartobind S+STIC membranes pH 6,5-12 мС/смpH 6.5-12 mS/cm 0,20.2 --

Пример 3: Способ согласно изобретению в полупромышленном масштабеExample 3 Process according to the invention on a semi-industrial scale

Способ по настоящему изобретению использовали для процесса периодической очистки mAb1 в полупромышленном масштабе.The method of the present invention was used for a pilot scale mAb1 batch purification process.

Тот же процесс, что и описанный в Примере 2, был увеличен до полупромышленного масштаба. Цель состояла в том, чтобы очистить 10 г с помощью трех стадий, за которыми следовала стадия нанофильтрации. The same process as described in Example 2 was scaled up to a semi-industrial scale. The goal was to purify 10 g using three steps followed by a nanofiltration step.

8 л осветленного супернатанта клеточной культуры очищали с помощью трех стадий способа по настоящему изобретению и нанофильтрации. 8 л были последовательно помещены в смеситель на 20 л: 250 мл смолы Tosoh NH2-750F, затем перемешивали 13 мин, 160 г активированного угля (марки Norit SA2), затем перемешивали 14 минут и 30 г активированного угля (марки Norit SA2), затем перемешивали 10 мин. 8 L of the clarified cell culture supernatant was purified using the three steps of the method of the present invention and nanofiltration. 8 L were successively placed in a 20 L mixer: 250 ml of Tosoh NH2-750F resin, then stirred for 13 minutes, 160 g of activated carbon (Norit SA2 brand), then mixed for 14 minutes and 30 g of activated carbon (Norit SA2 brand), then stirred for 10 min.

Продукт фильтровали (фильтр Filtrox) перед началом стадии обмена. После фильтрации извлекали примерно 9 л продукта (продукт выталкивали из фильтра с помощью 1 л стерильной воды). UF/DF выполняли с использованием полого волокна (790 см² - 50 кД - Spectrumlabs) на GE Uniflux. Буфер, используемый для диафильтрации продукта через полое волокно, представлял собой 20 мМ Bis Tris Q.S. до буфера уксусной кислоты pH 7,2. The product was filtered (Filtrox filter) before starting the exchange step. After filtration, approximately 9 L of product was recovered (product was pushed out of the filter with 1 L of sterile water). UF/DF was performed using hollow fiber (790 cm² - 50 kD - Spectrumlabs) on GE Uniflux. The buffer used to diafilter the product through the hollow fiber was 20 mM Bis Tris Q.S. to acetic acid buffer pH 7.2.

Было получено 2,64 кг с концентрацией 6,9 г/л (18,2 г моноклонального антитела). Затем 2 л (14 г) выделенного продукта пропускали через два мембранных адсорбера: 75 мл Sartobind S 200 мл Sartobind Q. Две мембраны последовательно соединяли и использовали в проточном режиме с использованием GE AktaProcess. 2.64 kg was obtained at a concentration of 6.9 g/l (18.2 g of monoclonal antibody). Then 2 L (14 g) of the isolated product was passed through two membrane adsorbers: 75 ml Sartobind S 200 ml Sartobind Q. Two membranes were connected in series and used in flow mode using GE AktaProcess.

Наконец, продукт подвергали нанофильтрации через предварительный фильтр (XOHC - Millipore) и фильтр Viresolve Pro (Millipore) для получения конечного качества. Finally, the product was nanofiltered through a pre-filter (XOHC - Millipore) and a Viresolve Pro filter (Millipore) to obtain final quality.

В приведенной ниже таблице показано сравнение традиционного способа и способа согласно изобретению.The table below shows a comparison between the traditional method and the method according to the invention.

Традиционный способThe traditional way Способ по изобретениюMethod according to the invention Сравнение способовComparison of methods Стадииstages Протеин A+смешанный режим+AEX смолыProtein A+mixed mode+AEX resin Хелатирующие агенты+стадия обмена + «полирующая» стадияChelating agents + exchange stage + "polishing" stage Количество колонокNumber of columns 33 00 Количество буферовNumber of buffers 7 (за исключением дезинфицирующих буферов)7 (excluding disinfectant buffers) 1 (за исключением дезинфицирующих буферов)1 (excluding disinfectant buffers) ПродолжительностьDuration 13 ч13 h 8 ч 308 h 30 ВыходExit 80%80% 70%70% Конечное качествоfinal quality HMW (%)HMW (%) 0,40.4 0,10.1 HCP (нг/мл)HCP (ng/ml) 100100 7070 ДНК (частей на миллион)DNA (ppm) <1<1 <1<1

Пример 4: Полностью непрерывный процесс согласно изобретению в лабораторном масштабеExample 4 Fully Continuous Process According to the Invention on a Laboratory Scale

Способ по настоящему изобретению использовали для процесса периодической очистки гуманизированного моноклонального антитела mAb1 в лабораторном масштабе в непрерывном режиме.The method of the present invention was used for batch purification process of humanized mAb1 monoclonal antibody in a laboratory scale in a continuous mode.

Целью эксперимента было очистить mAb1 из осветленного массового сбора с использованием непрерывного режима, что означает отсутствие прерывания, хранения или регуляции между каждой стадией. Авторам изобретения удалось использовать фильтрацию на хелатирующем агенте (иммобилизованный AEX, активированный уголь CA), одну стадию обмена (прямоточная диафильтрация) и пару мембран (Sartobind S и STIC). The goal of the experiment was to purify mAb1 from a clarified bulk harvest using continuous mode, which means no interruption, storage, or regulation between each step. The inventors were able to use chelating agent filtration (immobilized AEX, activated carbon CA), one exchange step (co-current diafiltration) and a pair of membranes (Sartobind S and STIC).

3 л осветленного супернатанта клеточной культуры очищали с помощью трех стадий способа по изобретению. Продукт фильтровали через иммобилизованный анионообменник (Emphaze AEX BV120), а затем через фильтр с активированным углем (Millipore CR40 270 см²). Затем продукт поступал непосредственно в прямоточную диафильтрационную мембрану (0,2 м²) для концентрирования и диафильтрации (стадия обмена). Буфер, используемый для диафильтрации продукта, представлял собой 20 мМ Bis Tris, 20 мМ NaCl Q.S. до буфера уксусной кислоты pH 7,5. 3 L of the clarified cell culture supernatant was purified using the three steps of the method of the invention. The product was filtered through an immobilized anion exchanger (Emphaze AEX BV120) and then through an activated carbon filter (Millipore CR40 270 cm ² ). The product then went directly to the once-through diafiltration membrane (0.2 m ² ) for concentration and diafiltration (exchange step). The buffer used to diafilter the product was 20 mM Bis Tris, 20 mM NaCl QS to pH 7.5 acetic acid buffer.

Диафильтрованный продукт, извлеченный непосредственно со стороны ретентата, пропускали через промежуточный буферный мешок для компенсации разницы потоков на следующей стадии. Затем продукт пропускали через два полирующих мембранных адсорбера; 1 мл Sartobind S и 1 мл Sartobind STIC. Две мембраны были соединены последовательно и использованы в проточном режиме с использованием GE Akta Pure. Каждая единичная стадия напрямую связана с другой или через буферный мешок и обрабатывается непрерывно. The diafiltered product recovered directly from the retentate side was passed through an intermediate buffer bag to compensate for the flow difference in the next stage. The product was then passed through two polishing membrane adsorbers; 1 ml Sartobind S and 1 ml Sartobind STIC. Two membranes were connected in series and used in flow mode using GE Akta Pure. Each single stage is directly connected to another or through a buffer bag and is processed continuously.

Множество циклов очистки было выполнено на мембранных адсорберах для обработки всего объема продукта, как показано на Фигуре 5 (экстракт из 50 циклов очистки на мембранах). В конце процесса весь пул продукта был восстановлен через стерильный фильтр. 40 мг mAb очищали каждые 5 минут, что приводило к продуктивности 240 г mAb1 на литр мембраны в час (240 г/л/час).Multiple purification cycles were performed on membrane adsorbers to process the entire product volume as shown in Figure 5 (extract from 50 membrane purification cycles). At the end of the process, the entire product pool was recovered through a sterile filter. 40 mg mAb was purified every 5 minutes resulting in a productivity of 240 g mAb1 per liter of membrane per hour (240 g/l/h).

Claims

1. Способ очистки белка из раствора, включающий:1. A method for purifying a protein from a solution, including:

- пропускание указанного раствора по меньшей мере через одну матрицу хелатирующего агента в проточном режиме, где указанная матрица хелатирующего агента выбрана из группы, состоящей из активированного угля, диатомитовой земли, свободной катионообменной смолы, свободной анионообменной смолы и свободной смолы смешанного режима,- passing said solution through at least one chelating agent matrix in flow mode, where said chelating agent matrix is selected from the group consisting of activated carbon, diatomaceous earth, free cation exchange resin, free anion exchange resin and mixed mode free resin,

- извлечение отфильтрованного белкового раствора из фильтрата указанной по меньшей мере одной матрицы хелатирующего агента;- extracting the filtered protein solution from the filtrate of said at least one chelating agent matrix;

- пропускание отфильтрованного белкового раствора, полученного в конце стадии (а), по меньшей мере через одну диафильтрационную мембрану с использованием только одного буфера для обмена, passing the filtered protein solution obtained at the end of step (a) through at least one diafiltration membrane using only one exchange buffer,

- извлечение частично очищенного ретентата, содержащего белок, указанной по меньшей мере одной диафильтрационной мембраны;- extracting a partially purified retentate containing protein, the specified at least one diafiltration membrane;

(c) полирующую стадию, включающую: (c) a polishing step comprising:

- пропускание ретентата, полученного в конце стадии (b), через комбинацию мембранных адсорберов в проточном режиме, при этом два мембранных адсорбера из указанной комбинации мембранных адсорберов ортогональны с точки зрения механизмов действия, и указанная комбинация мембранных адсорберов была предварительно уравновешена уравновешивающим буфером, который идентичен одному буферу, используемому для обмена на стадии (b),- passing the retentate obtained at the end of step (b) through a combination of membrane adsorbers in flow mode, wherein two membrane adsorbers from said combination of membrane adsorbers are orthogonal in terms of mechanisms of action, and said combination of membrane adsorbers has been pre-equilibrated with an equilibration buffer that is identical one buffer used for exchange in step (b),

2. Способ по п. 1, где отфильтрованный белковый раствор, полученный в конце стадии (а), пропускают непосредственно через по меньшей мере одну диафильтрационную мембрану без какой-либо обработки, такой как регуляция pH, замена буфера или разбавление.2. The method of claim 1 wherein the filtered protein solution obtained at the end of step (a) is passed directly through at least one diafiltration membrane without any treatment such as pH adjustment, buffer change or dilution.

3. Способ по п. 1 или 2, где ретентат, полученный в конце стадии (b), пропускают непосредственно через указанную комбинацию мембранных адсорберов без какой-либо обработки, такой как регуляция pH, замена буфера или разбавление.3. The method according to claim 1 or 2, wherein the retentate obtained at the end of step (b) is passed directly through said combination of membrane adsorbers without any treatment such as pH adjustment, buffer exchange or dilution.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где способ не содержит промежуточного хранения между тремя стадиями (а), (b) и (с).4. The method according to any one of paragraphs. 1-3, where the method does not contain intermediate storage between the three stages (a), (b) and (c).

5. Способ по любому из пп. 1-4, где способ включает функционально закрытую поточную линию.5. The method according to any one of paragraphs. 1-4, where the method includes a functionally closed production line.

6. Способ по любому из пп. 1-5, где для всего способа очистки используется только один буфер.6. The method according to any one of paragraphs. 1-5, where only one buffer is used for the entire cleaning method.

7. Способ по любому из пп. 1-6, где один буфер содержит Tris, Tris-HCl, бис-Tris, фосфат и/или лимонную кислоту, в частности содержит или состоит из (i) бис-Tris, Tris или Tris-HCl, (ii) уксусной кислоты, (iii) воды и (iv) необязательно соли.7. The method according to any one of paragraphs. 1-6, where one buffer contains Tris, Tris-HCl, bis-Tris, phosphate and/or citric acid, in particular contains or consists of (i) bis-Tris, Tris or Tris-HCl, (ii) acetic acid, (iii) water; and (iv) optionally salt.

8. Способ по любому из пп. 1-7, где по меньшей мере одна матрица хелатирующего агента представляет собой комбинацию двух различных матриц хелатирующего агента.8. The method according to any one of paragraphs. 1-7, wherein at least one chelating agent matrix is a combination of two different chelating agent matrices.

9. Способ по п. 8, где комбинация двух различных матриц хелатирующих агентов представляет собой комбинацию активированного угля и свободной анионообменной смолы.9. The method of claim 8, wherein the combination of two different matrices of chelating agents is a combination of activated carbon and a free anion exchange resin.

10. Способ по любому из пп. 1-9, где по меньшей мере одна диафильтрационная мембрана на стадии обмена представляет собой модуль однопоточной фильтрации в тангенциальном потоке (SPTFF) или модуль фильтрации в тангенциальном потоке (TFF).10. The method according to any one of paragraphs. 1-9, wherein at least one diafiltration membrane in the exchange step is a single flow tangential flow filtration (SPTFF) module or a tangential flow filtration (TFF) module.

11. Способ по любому из пп. 1-10, где по меньшей мере одна диафильтрационная мембрана стадии обмена имеет форму кассеты, половолоконную или рулонную форму. 11. The method according to any one of paragraphs. 1-10, where at least one diafiltration membrane of the exchange stage is in the form of a cassette, hollow fiber or roll form.

12. Способ по любому из пп. 1-11, где отфильтрованный белковый раствор концентрируют на стадии обмена.12. The method according to any one of paragraphs. 1-11 where the filtered protein solution is concentrated in the exchange step.

13. Способ по любому из пп. 1-12, где комбинация мембранных адсорберов на «полирующей» стадии представляет собой комбинацию по меньшей мере двух мембранных адсорберов, выбранных из группы, состоящей из катионообменных мембранных адсорберов, анионообменных мембранных адсорберов, мультимодальных мембранных адсорберов и мембранных адсорберов гидрофобного взаимодействия.13. The method according to any one of paragraphs. 1-12, wherein the combination of membrane adsorbers in the "polishing" step is a combination of at least two membrane adsorbers selected from the group consisting of cation exchange membrane adsorbers, anion exchange membrane adsorbers, multimodal membrane adsorbers, and hydrophobic interaction membrane adsorbers.

14. Способ по любому из пп. 1-13, где комбинация мембранных адсорберов на полирующей стадии представляет собой комбинацию катионообменного мембранного адсорбера и анионообменного мембранного адсорбера.14. The method according to any one of paragraphs. 1-13, where the combination of membrane adsorbers in the polishing stage is a combination of a cation exchange membrane adsorber and an anion exchange membrane adsorber.

15. Способ по любому из пп. 1-14, дополнительно включающий стадию нанофильтрации после стадии (с).15. The method according to any one of paragraphs. 1-14 further comprising a nanofiltration step after step (c).

16. Способ по п. 15, дополнительно включающий стадию конечной ультрафильтрации и/или диафильтрации после стадии нанофильтрации.16. The method of claim 15, further comprising a final ultrafiltration and/or diafiltration step after the nanofiltration step.

17. Способ по любому из пп. 1-16, где белок представляет собой моноклональное антитело.17. The method according to any one of paragraphs. 1-16, where the protein is a monoclonal antibody.

18. Способ по любому из пп. 1-17, где один буфер содержит: 18. The method according to any one of paragraphs. 1-17 where one buffer contains:

- от 5 до 40 мМ бис-Tris, от 15 до 150 мМ NaCl, с pH, доведенным до 6-9 с помощью уксусной кислоты,- 5 to 40 mM bis-Tris, 15 to 150 mM NaCl, pH adjusted to 6-9 with acetic acid,

- от 5 до 40 мМ Tris или Tris-HCl, от 15 до 150 мМ NaCl, с pH, доведенным до 6-9 с помощью уксусной кислоты, - 5 to 40 mM Tris or Tris-HCl, 15 to 150 mM NaCl, pH adjusted to 6-9 with acetic acid,

- от 5 до 40 мМ Tris или Tris-HCl, от 15 до 150 мМ NaCl, с pH, доведенным до 6-9 с помощью лимонной кислоты, или- 5 to 40 mM Tris or Tris-HCl, 15 to 150 mM NaCl, pH adjusted to 6-9 with citric acid, or

- от 15 до 150 мМ NaCl, с pH, доведенным до 6-9 с помощью Na₂HPO₄/NaH₂PO₄.- from 15 to 150 mm NaCl, with pH adjusted to 6-9 with Na ₂ HPO ₄ /NaH ₂ PO ₄ .

19. Способ по любому из пп. 1-18, дополнительно включающий стадию включения выделенного очищенного белка в фармацевтическую композицию.19. The method according to any one of paragraphs. 1-18, further comprising the step of incorporating the isolated purified protein into the pharmaceutical composition.

20. Набор, пригодный для очистки белка из раствора в соответствии со способом по любому из пп. 1-19, содержащий или состоящий из: 20. A set suitable for purifying a protein from a solution in accordance with the method according to any one of paragraphs. 1-19, containing or consisting of:

(a) по меньшей мере одной матрицы хелатирующего агента, по меньшей мере одной диафильтрационной мембраны и комбинации мембранных адсорберов, где два мембранных адсорбера указанной комбинации мембранных адсорберов являются ортогональными с точки зрения механизмов действия, и где указанная матрица хелатирующего агента выбрана из группы, состоящей из активированного угля, диатомитовой земли, свободной катионообменной смолы, свободной анионообменной смолы и свободной смолы смешанного режима; и (a) at least one chelating agent matrix, at least one diafiltration membrane, and a combination of membrane adsorbers, wherein the two membrane adsorbers of said membrane adsorber combination are orthogonal in terms of mechanisms of action, and wherein said chelating agent matrix is selected from the group consisting of activated carbon, diatomaceous earth, free cation exchange resin, free anion exchange resin, and mixed mode free resin; And

(b) одного буфера, содержащего Tris, Tris-HCl, бис Tris, фосфат и/или лимонную кислоту. (b) one buffer containing Tris, Tris-HCl, bis Tris, phosphate and/or citric acid.