RU2790867C1 - Method for activating cytotoxic t-lymphocytes in a population of blood mononuclear cells using membrane vesicles obtained from genetically modified tumor cells of m14 melanoma with overexpression of interleukin 2 - Google Patents
Method for activating cytotoxic t-lymphocytes in a population of blood mononuclear cells using membrane vesicles obtained from genetically modified tumor cells of m14 melanoma with overexpression of interleukin 2 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2790867C1 RU2790867C1 RU2022115589A RU2022115589A RU2790867C1 RU 2790867 C1 RU2790867 C1 RU 2790867C1 RU 2022115589 A RU2022115589 A RU 2022115589A RU 2022115589 A RU2022115589 A RU 2022115589A RU 2790867 C1 RU2790867 C1 RU 2790867C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- lymphocytes
- membrane vesicles
- melanoma
- cancer
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Предлагаемое изобретение относится к области медицины, ветеринарии, фармакологии, клеточной биологии, более точно к способам увеличения популяции активированных цитотоксических Т-лимфоцитов в смешанной культуре мононуклеарных клеток периферической крови при помощи индуцированных цитохалазином В мембранных везикул, полученных из генетически модифицированных опухолевых клеток меланомы М14 со сверхэкспрессией IL-2 in vitro. Изобретение может быть использовано для разработки и улучшения существующих адъювантных способов терапии и противоопухолевых вакцин на основе опухолевых клеток, в том числе, производных клеток пациента.The present invention relates to the field of medicine, veterinary medicine, pharmacology, cell biology, more specifically to methods for increasing the population of activated cytotoxic T-lymphocytes in a mixed culture of peripheral blood mononuclear cells using cytochalasin B-induced membrane vesicles obtained from genetically modified M14 melanoma tumor cells with overexpression IL-2 in vitro . The invention can be used to develop and improve existing adjuvant therapies and antitumor vaccines based on tumor cells, including derivatives of patient cells.
Далее в целях исключения неоднозначного понимания текста заявителем приведены использованные в заявочном материале термины и их расшифровка:Further, in order to avoid ambiguous understanding of the text by the applicant, the terms used in the application material and their interpretation are given:
Адъювантная терапия - дополнительное лечение рака, проводимое после основного лечения, чтобы снизить риск рецидива рака, которая может включать химиотерапию, лучевую терапию, гормональную терапию, таргетную терапию или биологическую терапию. Adjuvant therapy is an additional cancer treatment given after primary treatment to reduce the risk of cancer recurrence, which may include chemotherapy, radiation therapy, hormonal therapy, targeted therapy, or biological therapy.
иМВ - индуцированные мембранные везикулы. IMV - induced membrane vesicles.
ЦТЛ - цитотоксические Т-лимфоциты. CTL - cytotoxic T-lymphocytes.
ДК - дендритные клетки. DC - dendritic cells.
МНК ПК - мононуклеарные клетки периферической крови. PBMNCs are peripheral blood mononuclear cells.
ГКГС - главный комплекс гистосовместимости. MHC is the major histocompatibility complex.
IL-2 - интерлейкин 2 человека. IL-2 -
LV - лентивирус. LV - lentivirus.
rhIL-2 - рекомбинантный человеческий интерлейкин 2. rhIL-2 is a recombinant
rhIL-7 - рекомбинантный человеческий интерлейкин 7. rhIL-7 is a recombinant human interleukin 7.
rhIL-15 - рекомбинантный человеческий интерлейкин 15. rhIL-15 is recombinant human interleukin 15.
М14-IL-2 - клетки меланомы линии М14 со сверхэкспрессией интерлейкина 2. M14-IL-2 - M14 melanoma cells with overexpression of
иМВ-М14-IL-2 - индуцированные мембранные везикулы выделенные из клеток меланомы линии М14 со сверхэкспрессией интерлейкина 2. UMB-M14-IL-2 - induced membrane vesicles isolated from M14 melanoma cells with overexpression of
На дату представления заявочных материалов в области онкологии существует объективная проблема по повышению эффективности терапии и лечения онкозаболеваний различной этиологии, в частности, при помощи иммунотерапии. Известно, что лечение консервативными способами, в число которых входит хирургия, лучевая и химиотерапия, позволяет удалить значительную массу опухолевых очагов, однако не позволяет уничтожить все диссеминированные по организму клетки, которые становятся причиной рецидива заболевания в будущем [Yang Y. Cancer immunotherapy: harnessing the immune system to battle cancer. J Clin Invest. 2015 Sep; 125(9):3335-7. doi: 10.1172/JCI83871]. Таким образом, разработка способов, способных безопасно и целенаправленно уничтожать опухолевые клетки по всему организму, является актуальной.At the date of submission of application materials in the field of oncology, there is an objective problem of improving the effectiveness of therapy and treatment of oncological diseases of various etiologies, in particular, with the help of immunotherapy. It is known that treatment with conservative methods, which include surgery, radiation and chemotherapy, allows you to remove a significant amount of tumor foci, but does not allow you to destroy all the cells disseminated throughout the body that cause a recurrence of the disease in the future [Yang Y. Cancer immunotherapy: harnessing the immune system to battle cancer. J Clin Invest. 2015 Sep; 125(9):3335-7. doi: 10.1172/JCI83871]. Thus, the development of methods capable of safely and purposefully destroying tumor cells throughout the body is relevant.
На основании вышеизложенного можно сделать вывод, что существует проблема разработки новых и улучшения существующих методов терапии онкологических заболеваний с использованием иммунотерапии. Однако большинство иммунотерапевтических подходов не показывают ожидаемой эффективности в клинических испытаниях на человеке в виду индукции слабого противоопухолевого иммунного ответа.Based on the foregoing, it can be concluded that there is a problem of developing new and improving existing methods of cancer therapy using immunotherapy. However, most immunotherapeutic approaches do not show the expected efficacy in human clinical trials due to the induction of a weak antitumor immune response.
Заявителем проведен анализ существующего уровня техники по научной и патентной информации в области активации и выявлены следующие аналоги.The applicant has analyzed the existing state of the art on scientific and patent information in the field of activation and identified the following analogues.
Известен источник «Analysis of immunomodulating properties of cytochalasin B induced membrane vesicles, isolated from human melanoma cells in vitro» [Filin I.Y. «Analysis of immunomodulating properties of cytochalasin B induced membrane vesicles, isolated from human melanoma cells in vitro» / Сборник научных трудов всероссийской конференции с международным участием «Регенеративная биология и медицина» // I. Y. Filin. - 2019. - C. 4-5], в котором показывается принципиальная возможность использования иМВ-M14-IL-2 в качестве терапевтического иммуномодулирующего агента.Known source "Analysis of immunomodulating properties of cytochalasin B induced membrane vesicles, isolated from human melanoma cells in vitro" [Filin I.Y. "Analysis of immunomodulating properties of cytochalasin B induced membrane vesicles, isolated from human melanoma cells in vitro" / Collection of scientific papers of the All-Russian conference with international participation "Regenerative biology and medicine" // I. Y. Filin. - 2019. - C. 4-5], which shows the fundamental possibility of using iMB-M14-IL-2 as a therapeutic immunomodulatory agent.
Недостатком известного технического решения является то, что приведенные результаты не могут быть использованы для разработки и улучшения существующих адъювантных способов терапии и противоопухолевых вакцин на основе опухолевых клеток, в том числе, производных клеток пациента, т.к. протокол описанного способа не позволяет достичь иммунотерапевтического эффекта необходимого и достаточного для применения в области медицины, ветеринарии, фармакологии, клеточной биологии. Таким образом, сущность способа активации цитотоксических Т-лимфоцитов в популяции мононуклеарных клеток крови при помощи мембранных везикул, полученных из генетически модифицированных опухолевых клеток со сверхэкспрессией интерлейкина 2, представленная в данной заявке, ранее не была опубликована. The disadvantage of the known technical solution is that the results presented cannot be used to develop and improve existing adjuvant therapies and antitumor vaccines based on tumor cells, including derivatives of the patient's cells, because the protocol of the described method does not allow to achieve the immunotherapeutic effect necessary and sufficient for use in the field of medicine, veterinary medicine, pharmacology, cell biology. Thus, the essence of the method for activating cytotoxic T-lymphocytes in a population of blood mononuclear cells using membrane vesicles obtained from genetically modified tumor cells with overexpression of
Известен источник [«Analysis of CD markers of immune cells after interaction with melanoma cells membrane vesicles» (тезис сборника конференции «ESGCT»]. Сущностью является способ загрузки иМВ-М14-IL-2 в дендритные клетки для использования в качестве противоопухолевой вакцины. A well-known source ["Analysis of CD markers of immune cells after interaction with melanoma cells membrane vesicles" (abstract of the collection of the conference "ESGCT"]. The essence is a method of loading iMB-M14-IL-2 into dendritic cells for use as an antitumor vaccine.
Недостатком известного технического решения является использование дендритных клеток в качестве антиген-презентирующих клеток, что значительно усложняет процесс иммуномодуляции. The disadvantage of the known technical solution is the use of dendritic cells as antigen-presenting cells, which greatly complicates the process of immunomodulation.
Известен источник [https://link.springer.com/article/10.1007/s00432-006-0184-7] «Increased induction of antitumor response by exosomes derived from interleukin-2 gene-modified tumor cells». Сущностью является способ, заключающийся в генетической модификации опухолевых клеток линии E.G7-OVA аденовирусом, кодирующим ген IL-2 и получения опухолевых экзосом путем серийного центрифугирования и ультрацентрифугирования в градиентах сахарозы. Для демонстрации их противоопухолевого действия IL-2-содержащие экзосомы (Exo/IL-2) вводили подкожно мышам C57BL/C: либо с опухолью, либо с последующей инокуляцией опухоли. Вакцинация этими Exo/IL-2 может более эффективно индуцировать антигенспецифический T-хелперный-1-поляризованный иммунный ответ и ЦТЛ, что приводит к более значительному ингибированию роста опухоли. CD8+ T-клетки являются основными эффекторными клетками, однако CD4+ T-клетки и NK-клетки также участвуют в индукции противоопухолевого ответа при таком подходе. Показано, что генетическая модификация IL-2 опухолевых клеток может привести к тому, что выделенные из опухоли экзосомы будут содержать IL-2 с повышенными противоопухолевыми эффектами, что представляет собой многообещающий способ создания противоопухолевой вакцины на основе экзосом.Known source [https://link.springer.com/article/10.1007/s00432-006-0184-7] "Increased induction of antitumor response by exosomes derived from interleukin-2 gene-modified tumor cells". The essence is a method consisting in genetic modification of tumor cells of the E.G7-OVA line with an adenovirus encoding the IL-2 gene and obtaining tumor exosomes by serial centrifugation and ultracentrifugation in sucrose gradients. To demonstrate their antitumor activity, IL-2-containing exosomes (Exo/IL-2) were administered subcutaneously to C57BL/C mice, either with tumor or followed by tumor inoculation. Vaccination with these Exo/IL-2 can more effectively induce an antigen-specific T-helper-1 polarized immune response and CTLs, leading to more significant inhibition of tumor growth. CD8 + T cells are the main effector cells, however, CD4 + T cells and NK cells are also involved in inducing an antitumor response in this approach. It has been shown that genetic modification of tumor cells with IL-2 can lead to tumor-derived exosomes containing IL-2 with increased antitumor effects, which is a promising way to create an exosome-based antitumor vaccine.
Таким образом, в известном источнике описывается способ использования экзосом опухолевых клеток со сверхэкспрессией IL-2 в качестве противоопухолевой вакцины.Thus, the known source describes a method of using exosomes of tumor cells overexpressing IL-2 as an antitumor vaccine.
Недостатком известного технического решения является использование естественных экзосом опухолевых клеток, известный метод требует использования ультрацентрифугирования для осаждения частиц, что значительно удорожает итоговый продукт. Кроме того, сбор естественных экзосом характеризуются малым выходом, что снижает эффективность способа и его промышленную применимость. The disadvantage of the known technical solution is the use of natural exosomes of tumor cells, the known method requires the use of ultracentrifugation to precipitate particles, which significantly increases the cost of the final product. In addition, the collection of natural exosomes is characterized by a low yield, which reduces the efficiency of the method and its industrial applicability.
Известно изобретение по патенту RU 2680539 «Способ активации хелперных Т-клеток и композиция для применения в данном способе». Сущность изобретения заключается в добавлении пептида WT1 к антиген-презентирующим клеткам и, посредством этого, активации хелперных Т-клеток, где пептид WT1 способен связываться с любой из молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 и молекулы HLA-DRB1*0501, и композиции для этого, фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики рака путем активации хелперных Т-клеток и им подобных. 1. Способ активации хелперных Т-клеток, включающий приведение антиген-презентирующей клетки в контакт с пептидом WT1 и, таким образом, активацию хелперных Т-клеток, где пептид WT1 обладает способностью связываться с молекулой HLA-DRB1*1501, молекулой HLA-DPB1*0901 и молекулой HLA-DPB1*0501, и где пептид WT1 представляет собой пептид, состоящий из аминокислотной последовательности: Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His (SEQ ID NO: 2); и антиген-презентирующая клетка является положительной по меньшей мере по одной из молекул, выбранных из HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 и HLA-DPB1*0501; и хелперные Т-клетки экспрессируют комплекс TCR-CD3, который распознает комплекс пептида WT1 и молекулы HLA, выбранной из HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 и HLA-DPB1*0501. Способ по п. 1, где пептид WT1 дополнительно способен связываться с молекулой HLA-DRB1*0405 и/или молекулой HLA-DRB1*1502. Способ по п. 1, в котором стадию приведения антиген-презентирующей клетки в контакт с пептидом WT1 осуществляют путем добавления пептида WT1 к антиген-презентирующей клетке. Способ индукции иммунного ответа у субъекта, страдающего WT1-специфическим злокачественным новообразованием, включающий приведение антиген-презентирующей клетки субъекта в контакт с пептидом WT1 in vivo и, таким образом, активацию хелперных Т-клеток у субъекта, где пептид WT1 обладает способностью связываться с молекулой HLA-DRB1*1501, молекулой HLA-DPB1*0901 и молекулой HLA-DPB1*0501 и где пептид WT1 представляет собой пептид, состоящий из аминокислотной последовательности: Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His (SEQ ID NO: 2); и антиген-презентирующая клетка является положительной по меньшей мере по одной из молекул, выбранных из HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 и HLA-DPB1*0501; и хелперные Т-клетки экспрессируют комплекс TCR-CD3, который распознает комплекс пептида WT1 и молекулы HLA, выбранной из HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 и HLA-DPB1*0501. Способ по п. 4, где пептид WT1 дополнительно способен связываться с молекулой HLA-DRB1*0405 и/или молекулой HLA-DRB1*1502. Способ по п. 4, в котором стадию приведения антиген-презентирующей клетки в контакт с пептидом WT1 осуществляют путем добавления пептида WT1 к антиген-презентирующей клетке. Способ по п. 4, где WT1-специфическое злокачественное новообразование представляет собой гематопоэтическую опухоль или солидный рак. Способ по п. 7, где гемопоэтическая опухоль представляет собой лейкоз, миелодиспластический синдром, множественную миелому или злокачественную лимфому. Способ по п. 7, где солидный рак представляет собой рак желудка, рак толстой кишки, рак легких, рак молочной железы, рак клеток, рак печени, рак кожи, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак матки, рак шейки матки или рак яичников. Способ индукции иммунного ответа у субъекта, страдающего WT1-специфическим злокачественным новообразованием, включающий приведение антиген-презентирующей клетки субъекта в контакт с пептидом WT1 in vitro и, таким образом, активацию хелперных Т-клеток, и введение активированных хелперных Т-клеток субъекту, где пептид WT1 способен связываться с молекулой HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 и молекулой HLA-DPB1*0501, и где пептид WT1 представляет собой пептид, состоящий из аминокислотной последовательности: Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His (SEQ ID NO: 2); и антиген-презентирующая клетка является положительной по меньшей мере по одной из молекул, выбранных из HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 и HLA-DPB1*0501; и хелперные Т-клетки экспрессируют комплекс TCR-CD3, который распознает комплекс пептида WT1 и молекулы HLA, выбранной из HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 и HLA-DPB1*0501. Способ по п. 10, где пептид WT1 дополнительно способен связываться с молекулой HLA-DRB1*0405 и/или молекулой HLA-DRB1*1502. Способ по п. 10, где WT1-специфическое злокачественное новообразование представляет собой гематопоэтическую опухоль или солидный рак. Способ по п. 12, где гемопоэтическая опухоль представляет собой лейкоз, миелодиспластический синдром, множественную миелому или злокачественную лимфому. Способ по п. 12, где солидный рак представляет собой рак желудка, рак толстой кишки, рак легких, рак молочной железы, рак клеток, рак печени, рак кожи, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак матки, рак шейки матки или рак яичников. Способ индукции иммунного ответа у субъекта, страдающего WT1-специфическим злокачественным новообразованием, включающий введение пептида WT1 субъекту, у которого было диагностировано WT1-специфическое злокачественное новообразование, где пептид WT1 обладает способностью связываться с молекулой HLA-DRB1*1501, молекулой HLA-DPB1*0901 и молекулой HLA-DPB1*0501, и где пептид WT1 представляет собой пептид, состоящий из аминокислотной последовательности: Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His (SEQ ID NO: 2); и субъект имеет молекулу HLA, выбранную из HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 и HLA-DPB1*0501. Способ по п. 15, где пептид WT1 дополнительно способен связываться с молекулой HLA-DRB1*0405 и/или молекулой HLA-DRB1*1502. Способ по п. 15, где WT1-специфическое злокачественное новообразование представляет собой гематопоэтическую опухоль или солидный рак. Способ по п. 17, где гемопоэтическая опухоль представляет собой лейкоз, миелодиспластический синдром, множественную миелому или злокачественную лимфому. Способ по п. 17, где солидный рак представляет собой рак желудка, рак толстой кишки, рак легких, рак молочной железы, рак клеток, рак печени, рак кожи, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак матки, рак шейки матки или рак яичников.An invention is known according to patent RU 2680539 "Method of activating helper T cells and composition for use in this method". The essence of the invention lies in the addition of the WT1 peptide to antigen-presenting cells and, through this, the activation of helper T cells, where the WT1 peptide is able to bind to any of the HLA-DRB1*1501 molecule, the HLA-DRB1*0901 molecule and the HLA-DRB1* molecule 0501, and compositions therefor, a pharmaceutical composition for the treatment and/or prevention of cancer by activating helper T cells and the like. 1. A method for activating helper T cells, comprising bringing an antigen-presenting cell into contact with a WT1 peptide and thereby activating helper T cells, wherein the WT1 peptide has the ability to bind to an HLA-DRB1*1501 molecule, an HLA-DPB1* molecule 0901 and an HLA-DPB1*0501 molecule, and where the WT1 peptide is a peptide consisting of the amino acid sequence: Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His (SEQ ID NO: 2); and the antigen presenting cell is positive for at least one of HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 and HLA-DPB1*0501; and helper T cells express a TCR-CD3 complex that recognizes a complex of the WT1 peptide and an HLA molecule selected from HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 and HLA-DPB1*0501. The method of claim 1, wherein the WT1 peptide is further capable of binding to an HLA-DRB1*0405 molecule and/or an HLA-DRB1*1502 molecule. The method of claim 1 wherein the step of contacting the antigen presenting cell with the WT1 peptide is carried out by adding the WT1 peptide to the antigen presenting cell. A method for inducing an immune response in a subject suffering from a WT1-specific cancer, comprising contacting an antigen-presenting cell of the subject with a WT1 peptide in vivo and thereby activating helper T cells in the subject, wherein the WT1 peptide has the ability to bind to an HLA molecule -DRB1*1501, an HLA-DPB1*0901 molecule and an HLA-DPB1*0501 molecule, and where the WT1 peptide is a peptide consisting of the amino acid sequence: Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His (SEQ ID NO: 2); and the antigen presenting cell is positive for at least one of HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 and HLA-DPB1*0501; and helper T cells express a TCR-CD3 complex that recognizes a complex of the WT1 peptide and an HLA molecule selected from HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 and HLA-DPB1*0501. The method of claim 4, wherein the WT1 peptide is further capable of binding to an HLA-DRB1*0405 molecule and/or an HLA-DRB1*1502 molecule. The method of claim 4, wherein the step of contacting the antigen presenting cell with the WT1 peptide is carried out by adding the WT1 peptide to the antigen presenting cell. The method of claim 4 wherein the WT1-specific cancer is a hematopoietic tumor or a solid cancer. The method of claim 7, wherein the hematopoietic tumor is leukemia, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma, or malignant lymphoma. The method of claim 7 wherein the solid cancer is gastric cancer, colon cancer, lung cancer, breast cancer, cell cancer, liver cancer, skin cancer, bladder cancer, prostate cancer, uterine cancer, cervical cancer, or cancer ovaries. A method for inducing an immune response in a subject suffering from a WT1-specific malignancy, comprising bringing an antigen-presenting cell of the subject into contact with a WT1 peptide in vitro and thereby activating helper T cells, and administering activated helper T cells to the subject, wherein the peptide WT1 is able to bind to the HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 and HLA-DPB1*0501 molecule, and where the WT1 peptide is a peptide consisting of the amino acid sequence: Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His (SEQ ID NO: 2); and the antigen presenting cell is positive for at least one of HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 and HLA-DPB1*0501; and helper T cells express a TCR-CD3 complex that recognizes a complex of the WT1 peptide and an HLA molecule selected from HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 and HLA-DPB1*0501. The method of claim 10, wherein the WT1 peptide is further capable of binding to an HLA-DRB1*0405 molecule and/or an HLA-DRB1*1502 molecule. The method of claim 10, wherein the WT1-specific cancer is a hematopoietic tumor or a solid cancer. The method of claim 12, wherein the hematopoietic tumor is leukemia, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma, or malignant lymphoma. The method of claim 12, wherein the solid cancer is gastric cancer, colon cancer, lung cancer, breast cancer, cell cancer, liver cancer, skin cancer, bladder cancer, prostate cancer, uterine cancer, cervical cancer, or cancer ovaries. A method for inducing an immune response in a subject suffering from a WT1-specific malignant neoplasm, comprising administering a WT1 peptide to a subject who has been diagnosed with a WT1-specific malignant neoplasm, where the WT1 peptide has the ability to bind to the HLA-DRB1*1501 molecule, the HLA-DPB1*0901 molecule and an HLA-DPB1*0501 molecule, and wherein the WT1 peptide is a peptide consisting of the amino acid sequence: Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His (SEQ ID NO: 2); and the subject has an HLA molecule selected from HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 and HLA-DPB1*0501. The method of claim 15, wherein the WT1 peptide is further capable of binding to an HLA-DRB1*0405 molecule and/or an HLA-DRB1*1502 molecule. The method of claim 15, wherein the WT1-specific cancer is a hematopoietic tumor or a solid cancer. The method of claim 17, wherein the hematopoietic tumor is leukemia, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma, or malignant lymphoma. The method of claim 17 wherein the solid cancer is gastric cancer, colon cancer, lung cancer, breast cancer, cell cancer, liver cancer, skin cancer, bladder cancer, prostate cancer, uterine cancer, cervical cancer, or cancer ovaries.
Таким образом, в известном изобретении в целом описывается метод опосредованной антиген-презентирующими клетками активации хелперных Т-клеток при помощи добавления пептида WT1.Thus, the known invention generally describes a method for antigen-presenting cell-mediated activation of helper T cells by the addition of a WT1 peptide.
Недостатком известного технического решения является отсутствие специфичной к опухоли активации клеток, что может снижать эффективность противоопухолевого ответа.The disadvantage of the known technical solution is the lack of tumor-specific activation of cells, which can reduce the effectiveness of the antitumor response.
Известно изобретение по патенту RU 2751837 «Способ активации цитотоксических лимфоцитов». Сущность изобретения Способ активации цитотоксических лимфоцитов, включающий обработку клеток крови пептидом, содержащим аминокислотный сиквенс His-Gly-Val-Ser-Gly-Trp-Gly-Gln-His-Gly-Thr-His-Gly (SEQ ID No. 1), или его фармацевтически приемлемыми солями в концентрации, усиливающей способность цитотоксических лимфоцитов лизировать трансформированные клетки организма, представляющие собой клетки рака или инфицированные вирусом клетки. Способ по п. 1, в котором клетки рака являются клетками рака легких. Способ по п. 1, в котором клетки рака являются клетками рака шейки матки. Способ по п. 1, в котором клетки рака являются клетками лейкоза. Способ по п. 1, в котором вирус является вирусом папилломы человека. Способ по п. 1, результатом которого является активация NK-лимфоцитов. Способ по п. 1, результатом которого является активация Т-лимфоцитов. Способ по п. 1, результатом которого является увеличение доли лимфоцитов, продуцирующих интерферон-гамма. Способ по п. 1, результатом которого является увеличение доли лимфоцитов, экспрессирующих активационный рецептор CD25. Способ по п. 1, результатом которого является увеличение доли лимфоцитов, экспрессирующих активационный рецептор CD69. Способ по п. 1, результатом которого является увеличение доли лимфоцитов, экспрессирующих активационный рецептор NKG2D. Способ по п. 1, результатом которого является увеличение доли лимфоцитов, экспрессирующих активационный рецептор CD226. Способ по п. 1, результатом которого является снижение доли лимфоцитов, экспрессирующих ингибирующие рецепторы семейства KIR. Способ по п. 13, в котором ингибирующий рецептор семейства KIR является KIR2DL3, KIR3DL1, KLRG1. Способ по п. 1, в котором лимфоциты обрабатывают путем введения пептида His-Gly-Val-Ser-Gly-Trp-Gly-Gln-His-Gly-Thr-His-Gly (SEQ ID No. 1) в кровь пациента. Способ по п. 1, в котором лимфоциты обрабатывают путем интратуморального введения пептида His-Gly-Val-Ser-Gly-Trp-Gly-Gln-His-Gly-Thr-His-Gly (SEQ ID No. 1). Способ по п. 1, в котором лимфоциты выделяют из периферической крови и инкубируют в питательной среде, содержащей пептид His-Gly-Val-Ser-Gly-Trp-Gly-Gln-His-Gly-Thr-His-Gly (SEQ ID No. 1). Применение способа по п. 1 для повышения чувствительности цитотоксических лимфоцитов к интерлейкину 12. Применение способа по п. 1 для повышения чувствительности цитотоксических лимфоцитов к интерлейкину 2. Применение способа по п. 1 для поддержания популяции NK-клеток в функционально активном состоянии в процессе цитотоксической реакции с трансформированными клетками организма, представляющими собой клетки рака или инфицированные вирусом клетки.Таким образом, в известном изобретении в целом описывается метод активации ЦТЛ при помощи пептида His-Gly-Val-Ser-Gly-Trp-Gly-Gln-His-Gly-Thr-His-Gly (SEQ ID No. 1).An invention is known according to patent RU 2751837 "Method of activating cytotoxic lymphocytes". SUMMARY OF THE INVENTION A method for activating cytotoxic lymphocytes, comprising treating blood cells with a peptide containing the amino acid sequence His-Gly-Val-Ser-Gly-Trp-Gly-Gln-His-Gly-Thr-His-Gly (SEQ ID No. 1), or its pharmaceutically acceptable salts at a concentration that enhances the ability of cytotoxic lymphocytes to lyse transformed body cells, which are cancer cells or virus-infected cells. The method of claim 1 wherein the cancer cells are lung cancer cells. The method of claim 1 wherein the cancer cells are cervical cancer cells. The method of claim 1 wherein the cancer cells are leukemia cells. The method of claim 1, wherein the virus is human papillomavirus. The method according to claim 1, the result of which is the activation of NK-lymphocytes. The method according to claim 1, the result of which is the activation of T-lymphocytes. The method according to claim 1, the result of which is an increase in the proportion of lymphocytes producing interferon-gamma. The method according to claim 1, which results in an increase in the proportion of lymphocytes expressing the CD25 activation receptor. The method according to claim 1, which results in an increase in the proportion of lymphocytes expressing the CD69 activation receptor. The method according to claim 1, which results in an increase in the proportion of lymphocytes expressing the NKG2D activation receptor. The method according to claim 1, which results in an increase in the proportion of lymphocytes expressing the CD226 activation receptor. The method according to claim 1, which results in a decrease in the proportion of lymphocytes expressing inhibitory receptors of the KIR family. The method of claim 13 wherein the inhibitory receptor of the KIR family is KIR2DL3, KIR3DL1, KLRG1. The method according to claim 1, wherein the lymphocytes are treated by introducing the peptide His-Gly-Val-Ser-Gly-Trp-Gly-Gln-His-Gly-Thr-His-Gly (SEQ ID No. 1) into the patient's blood. The method of claim 1 wherein the lymphocytes are treated by intratumoral administration of the peptide His-Gly-Val-Ser-Gly-Trp-Gly-Gln-His-Gly-Thr-His-Gly (SEQ ID No. 1). The method according to claim 1, wherein the lymphocytes are isolated from peripheral blood and incubated in a nutrient medium containing the peptide His-Gly-Val-Ser-Gly-Trp-Gly-Gln-His-Gly-Thr-His-Gly (SEQ ID No. . 1). Application of the method according to p. 1 to increase the sensitivity of cytotoxic lymphocytes to interleukin 12. The use of the method according to p. 1 to increase the sensitivity of cytotoxic lymphocytes to
Недостатком известного технического решения является отсутствие опухолевых антигенов при активации ЦТЛ данным способом, что может снизить противоопухолевую активность полученных ЦТЛ. The disadvantage of the known technical solution is the absence of tumor antigens when CTLs are activated by this method, which can reduce the antitumor activity of the obtained CTLs.
Известно изобретение по патенту RU 2619186 «Способ получения in vitro популяций активированных антигенспецифических противоопухолевых цитотоксических Т-лимфоцитов, специфичных к эпитопам опухоль-ассоциированного антигена». Способ получения in vitro популяций активированных антигенспецифических противоопухолевых цитотоксических Т-лимфоцитов, специфичных к эпитопам опухоль-ассоциированного антигена, включающий получение прилипающей и неприлипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК), выделенных из периферической крови человека, получение дендритных клеток (ДК) путем стимуляции их дифференцировки из прилипающей фракции МНК и антигенную активацию полученных зрелых ДК опухоль-ассоциированным антигеном, совместное культивирование клеток из неприлипающей фракции с аутологичными зрелыми антиген-активированными ДК из прилипающей фракции, последующее выделение фракции антигенспецифических Т-лимфоцитов с помощью окрашивания антигенспецифическими реагентами, стимуляцию роста выделенных цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) с использованием рекомбинантного человеческого интерлейкина 2 (rhIL-2), интерлейкина 7 (rhIL-7) и интерлейкина 15 (rhIL-15), отличающийся тем, что антигенную активацию полученных зрелых ДК осуществляют с использованием ДНК-конструкции, кодирующей эпитопы KIFGSLAFL и RLLQETELV опухоль-ассоциированного белка HER2, совместному культивированию с аутологичными зрелыми антиген-активированными ДК из прилипающей фракции подвергают все клетки неприлипающей фракции МНК, далее из совместной культуры ДК и МНК выделяют цитотоксические Т-лимфоциты, специфичные к эпитопам KIFGSLAFL и RLLQETELV белка HER2 методом магнитной сепарации с использованием антигенспецифических реагентов, обеспечивающих обратимое окрашивание выделяемых клеток, а после выделения HER2-специфических ЦТЛ производят стимуляцию их пролиферации посредством культивирования в присутствии внесенных одновременно цитокинов rhIL-2, rhIL-7, rhIL-15 в течение 14-20 суток, причем конечная концентрация каждого из цитокинов rhIL-2, rhIL-7 и rhIL-15 составляет 50 нг/мл. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве окрашивающего антигенспецифического реагента используют стрептамеры.An invention is known according to patent RU 2619186 "Method for obtaining in vitro populations of activated antigen-specific antitumor cytotoxic T-lymphocytes specific for tumor-associated antigen epitopes". A method for obtaining in vitro populations of activated antigen-specific antitumor cytotoxic T-lymphocytes specific for epitopes of a tumor-associated antigen, including obtaining adherent and non-adherent fractions of mononuclear cells (MNCs) isolated from human peripheral blood, obtaining dendritic cells (DC) by stimulating their differentiation from of the adherent fraction of MNCs and antigenic activation of the obtained mature DC with a tumor-associated antigen, co-cultivation of cells from the non-adherent fraction with autologous mature antigen-activated DC from the adherent fraction, subsequent isolation of the fraction of antigen-specific T-lymphocytes by staining with antigen-specific reagents, stimulation of the growth of isolated cytotoxic T- lymphocytes (CTL) using recombinant human interleukin 2 (rhIL-2), interleukin 7 (rhIL-7) and interleukin 15 (rhIL-15), characterized in that the antigenic activation of the resulting mature DC is carried out all cells of the nonadherent MNC fraction are subjected to co-cultivation with autologous mature antigen-activated DC from the adherent fraction using a DNA construct encoding epitopes KIFGSLAFL and RLLQETELV of the tumor-associated HER2 protein, then cytotoxic T-lymphocytes are isolated from the joint culture of DC and MNC, specific to the epitopes KIFGSLAFL and RLLQETELV of the HER2 protein by magnetic separation using antigen-specific reagents that provide reversible staining of isolated cells, and after the isolation of HER2-specific CTLs, their proliferation is stimulated by culturing in the presence of simultaneously introduced cytokines rhIL-2, rhIL-7, rhIL- 15 for 14-20 days, with the final concentration of each of the cytokines rhIL-2, rhIL-7 and rhIL-15 being 50 ng/ml. The method according to claim 1, characterized in that streptamers are used as a staining antigen-specific reagent.
Таким образом, в известном изобретении в целом описывается способ активации ЦТЛ, специфичных к HER2, опосредованный активацией ДК.Thus, the known invention generally describes a method for activating HER2-specific CTLs mediated by DC activation.
Недостатком известного технического решения является узкая направленность иммунного ответа - против HER2-экспрессирующих опухолевых клеток, а также сложность активации ЦТЛ опосредованно через ДК. Кроме того, описанный способ предполагает использование дополнительное использование rhIL-2, что усложняет использование изобретения. The disadvantage of the known technical solution is the narrow focus of the immune response against HER2-expressing tumor cells, as well as the complexity of CTL activation indirectly through DC. In addition, the described method involves the use of the additional use of rhIL-2, which complicates the use of the invention.
Известно изобретение по патенту RU 2745319 «Получение антигенспецифических T-клеток». Сущность способа заключается в получении популяции антигенспецифических ЦТЛ, обладающих фенотипом центральной памяти и эффекторной памяти, включает предоставление образца, содержащего наивные T-клетки от пациента или подходящего донора; обогащение образца CD8+ Т-клетками; приведение образца в контакт с парамагнитными наночастицами, содержащими на своей поверхности: способ по п. 1 антигенпрезентирующий комплекс главный комплекс гистосовместимости (ГКГС) класса I-пептид, полученный при помощи пассивной нагрузки наночастиц, конъюгированных с главным комплексом гистосовместимости ГКГС класса I; и способ по п. 2 анти-CD28 костимулирующий лиганд, которые находятся в одной или разных популяциях наночастиц.An invention is known according to patent RU 2745319 "Obtaining antigen-specific T-cells". The essence of the method is to obtain a population of antigen-specific CTLs with a central memory and effector memory phenotype, includes providing a sample containing naive T cells from a patient or a suitable donor; enrichment of the sample with CD8 + T cells; bringing the sample into contact with paramagnetic nanoparticles containing on their surface: the method according to p. and the method of
Таким образом, в известном изобретении в целом описывается метод получения популяции антигенспецифических ЦТЛ с помощью парамагнитных наночастиц, содержащих ГКГС пептид-1 и анти-CD28 костимулирующий лиганд.Thus, the known invention generally describes a method for obtaining a population of antigen-specific CTLs using paramagnetic nanoparticles containing MHC peptide-1 and an anti-CD28 costimulatory ligand.
Недостатком известного технического решения является использование искусственных матриц - наночастиц - для активации ЦТЛ увеличивает стоимость использования данного способа.The disadvantage of the known technical solution is the use of artificial matrices - nanoparticles - to activate CTL increases the cost of using this method.
Техническим результатом заявленного технического решения является разработка способа увеличения количества активированных цитотоксических Т-лимфоцитов при помощи мембранных везикул из генетически модифицированных опухолевых клеток меланомы М14 со сверхэкспрессией интерлейкина 2 человека in vitro, что дает усиление противоопухолевого иммунного ответа путем повышения количества активированных ЦТЛ в культуре клеток. The technical result of the claimed technical solution is the development of a method for increasing the number of activated cytotoxic T-lymphocytes using membrane vesicles from genetically modified M14 melanoma tumor cells with overexpression of
Сущностью заявленного технического решения является способ увеличения количества активированных цитотоксических Т-лимфоцитов в популяции мононуклеарных клеток крови при помощи индуцированных мембранных везикул из генетически модифицированных опухолевых клеток меланомы М14 со сверхэкспрессией интерлейкина 2 человека in vitro заключающийся в том, что культивируют опухолевые клетки меланомы М14, после чего получают репликативно дефектный лентивирус, кодирующий ген IL-2 и генетически модифицируют опухолевые клетки меланомы М14, далее анализируют экспрессию функционально активного белка IL-2, получают индуцированные мембранные везикулы из М14-IL-2 при помощи цитохалазина В, добавляют мембранные везикулы, выделенные из М14-IL-2, к мононуклеарам периферической крови, затем проводят анализ популяции активированных цитотоксических Т-лимфоцитов. The essence of the claimed technical solution is a method for increasing the number of activated cytotoxic T-lymphocytes in a population of blood mononuclear cells using induced membrane vesicles from genetically modified M14 melanoma tumor cells with overexpression of
Заявленное техническое решение поясняется Фиг. 1 и Фиг. 2.The claimed technical solution is illustrated in Fig. 1 and FIG. 2.
На Фиг. 1 показан вестерн-блот-анализ секреции белков IL-2 в иМВ, выделенных из нативных опухолевых клеток М14 (иМВ-М14 нативные) и иМВ, выделенных из клеток М14, генетически модифицированных лентивирусом, кодирующим ген IL-2 (иМВ-М14-IL-2). Нативные М14 - не модифицированные клетки меланомы человека и использованы в качестве контрольного образца, где: On FIG. 1 shows Western blot analysis of IL-2 protein secretion in uMB isolated from native M14 tumor cells (uMB-M14 native) and uMB isolated from M14 cells genetically modified with a lentivirus encoding the IL-2 gene (uMB-M14-IL -2). Native M14 - unmodified human melanoma cells and used as a control sample, where:
16 кДа - молекуярная масса белка IL-2,16 kDa - molecular weight of the IL-2 protein,
42 кДа - молекуярная масса белка β-актина,42 kDa - molecular weight of the β-actin protein,
IL-2 - искомый белок IL-2,IL-2 - the desired IL-2 protein,
β-актин - белок β-актин, используемый в качестве контроля реакции.β-actin - β-actin protein used as a reaction control.
На Фиг. 2 показаны результаты анализа числа активированных иммунных клеток здорового человека, в частности CD3+CD4-CD8+ T-киллеров после культивирования с иМВ, выделенных из М14-IL-2 (иМВ-М14-IL-2). Нативные МКПК - образец мононуклеарных клеток из периферической крови человека, культивировавшихся без иМВ, где ** - статистическая достоверная разница. On FIG. 2 shows the results of an analysis of the number of activated immune cells in a healthy person, in particular CD3 + CD4 - CD8 + T-killers after cultivation with uMB isolated from M14-IL-2 (uMB-M14-IL-2). Native PBMCs are a sample of mononuclear cells from human peripheral blood cultured without UMB, where ** is a statistically significant difference.
Далее заявителем приведено описание заявленного технического решения.Further, the applicant provides a description of the claimed technical solution.
Заявленное техническое решение основывается на том, что иммуномодулирующий цитокин IL-2 связывается с рецепторами IL-2 на поверхности Т-лимфоцитов, активируя внутриклеточные сигнальные пути, которые включают гены, помогающие Т-лимфоцитам пролиферировать и дифференцироваться в активированные ЦТЛ. А мембранные везикулы, выделенные из опухолевых клеток, например, клеток меланомы линии М14, несут на своей поверхности антигены опухоли, которые способствуют нацеливанию активированных ЦТЛ против опухоли, которое происходит за счёт распознавания Т-лимфоцитами опухолевых антигенов на поверхности иМВ. Таким образом, использование индуцированных мембранных везикул, выделенных из генетически модифицированных геном иммуномодулирующего цитокина IL-2 опухолевых клеток, например, меланомы М14, оказывает комбинированный эффект на увеличение количества активированных ЦТЛ.The claimed technical solution is based on the fact that the immunomodulatory cytokine IL-2 binds to IL-2 receptors on the surface of T-lymphocytes, activating intracellular signaling pathways that include genes that help T-lymphocytes proliferate and differentiate into activated CTLs. And membrane vesicles isolated from tumor cells, for example, M14 melanoma cells, carry tumor antigens on their surface, which contribute to the targeting of activated CTLs against the tumor, which occurs due to the recognition of tumor antigens by T-lymphocytes on the surface of iMB. Thus, the use of induced membrane vesicles isolated from tumor cells genetically modified with the gene of the immunomodulatory cytokine IL-2, for example, M14 melanoma, has a combined effect on increasing the number of activated CTLs.
Указанный технический результат становится возможным вследствие использования комбинации индуцированных мембранных везикул, выделенных из опухолевых клеток, например, меланомы М14, которые содержат на поверхности мембраны антигены опухолевых клеток и дополнительного иммуномодулирующего фактора - цитокина IL-2, который способствует дифференцировке Т-лимфоцитов в активированные ЦТЛ.This technical result becomes possible due to the use of a combination of induced membrane vesicles isolated from tumor cells, for example, M14 melanoma, which contain tumor cell antigens on the membrane surface and an additional immunomodulatory factor - cytokine IL-2, which promotes the differentiation of T-lymphocytes into activated CTLs.
Указанный подход основан на том, что индуцированные мембранные везикулы, выделенные из опухолевых клеток, несут антигенный материал опухоли, который позволяет эффективно генерировать специфический противоопухолевый иммунный ответ, основанный на активации ЦТЛ, а присутствие иммуномодулирующего цитокина IL-2 активирует внутриклеточные сигнальные пути пролиферации и дифференцировки в активированные ЦТЛ.This approach is based on the fact that induced membrane vesicles isolated from tumor cells carry the antigenic material of the tumor, which makes it possible to effectively generate a specific antitumor immune response based on CTL activation, and the presence of the immunomodulatory cytokine IL-2 activates intracellular signaling pathways for proliferation and differentiation in activated CTLs.
Заявленное техническое решение предоставляет возможность решить проблему недостаточной активации ЦТЛ при проведении противоопухолевой терапии у пациентов, например, при использовании противоопухолевых вакцин, что позволит повысить терапевтический эффект по сравнению с аналогами.The claimed technical solution provides an opportunity to solve the problem of insufficient CTL activation during antitumor therapy in patients, for example, when using antitumor vaccines, which will increase the therapeutic effect compared to analogues.
Таким образом, краткая сущность заявленного технического решения заключается в разработке способа увеличения количества активированных цитотоксических Т-лимфоцитов в популяции мононуклеарных клеток при помощи индуцированных мембранных везикул из генетически модифицированных опухолевых клеток меланомы М14 in vitro, для улучшения существующих адъювантных способов терапии и противоопухолевых вакцин с использованием опухолевых клеток меланомы М14, в том числе на основе производных клеток пациента.Thus, the brief essence of the claimed technical solution is to develop a method for increasing the number of activated cytotoxic T-lymphocytes in a population of mononuclear cells using induced membrane vesicles from genetically modified M14 melanoma tumor cells in vitro , to improve existing adjuvant therapies and antitumor vaccines using tumor M14 melanoma cells, including those based on derived patient cells.
Заявленное техническое решение осуществляется в 5 этапов:The claimed technical solution is carried out in 5 stages:
1 этап: культивируют опухолевые клетки меланомы М14; Stage 1: M14 melanoma tumor cells are cultured;
2 этап: получают репликативно-дефектный лентивирус, кодирующий ген IL-2 и проводят генетическую модификацию опухолевых клеток, Stage 2: a replication-defective lentivirus encoding the IL-2 gene is obtained and genetic modification of tumor cells is carried out,
3 этап: проводят анализ экспрессии функционально активного белка IL-2, Stage 3: analyze the expression of the functionally active protein IL-2,
4 этап: выделяют индуцированные мембранные везикулы из М14-IL-2 при помощи цитохалазина В; 4th step: isolated induced membrane vesicles from M14-IL-2 using cytochalasin B;
5 этап: добавляют индуцированные мембранные везикулы, выделенные из М14-IL-2, к мононуклеарам периферической крови, проводят анализ популяции активированных цитотоксических Т-лимфоцитов. Step 5: add induced membrane vesicles isolated from M14-IL-2 to peripheral blood mononuclear cells, analyze the population of activated cytotoxic T-lymphocytes.
Далее заявителем приведен пример осуществления заявленного технического решения.Further, the applicant gives an example of the implementation of the claimed technical solution .
ПримерExample
. Активация цитотоксических Т-лимфоцитов в популяции мононуклеарных клеток крови при помощи мембранных везикул, полученных из генетически модифицированных опухолевых клеток меланомы М14 со сверхэкспрессией интерлейкина 2.. Activation of cytotoxic T-lymphocytes in a population of blood mononuclear cells using membrane vesicles obtained from genetically modified tumor cells of M14 melanoma with overexpression of
Первый этап - культивирование опухолевых клетокThe first stage is the cultivation of tumor cells
Берут опухолевые клетки меланомы М14, культивируют их на питательной среде RPMI-1640 (производства фирмы ПанЭко, Россия) содержащей 10 % фетальной телячьей сыворотки (производства фирмы Invitrogen, США), L-глутамин (ПанЭко, Россия) и смесь антибиотиков пенициллин-стрептомицин (производства фирмы ПанЭко, Россия) при температуре 37°C, во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2.M14 melanoma tumor cells are taken, cultivated on a nutrient medium RPMI-1640 (manufactured by PanEco, Russia) containing 10% fetal calf serum (manufactured by Invitrogen, USA), L-glutamine (PanEco, Russia) and a mixture of antibiotics penicillin-streptomycin ( manufactured by PanEco, Russia) at a temperature of 37°C, in a humid atmosphere containing 5% CO 2 .
Второй этап - получение репликативно дефектного лентивируса, кодирующий ген The second stage is the production of a replication defective lentivirus encoding the gene IL-2IL-2 и генетическая модификация опухолевых клеток and genetic modification of tumor cells
Репликативно дефектные лентивирусы (LV) получают путем трансфекции клеток HEK293T кальций фосфатым методом тремя кодирующими плазмидами: генетической конструкцией pLX304-IL-2; упаковочной плазмидой (pCMV-dR8.2 dvpr, Addgene #8455, США); оболочечной плазмидой (pCMV-VSV-G, Addgene #8454, США). Полученные LV-IL-2 концентрируют ультрацентрифугированием в течение 2 часов при 26000 об/мин.Replication defective lentiviruses (LV) are obtained by transfection of HEK293T cells with the calcium phosphate method with three coding plasmids: genetic construct pLX304-IL-2; packaging plasmid (pCMV-dR8.2 dvpr, Addgene #8455, USA); enveloped plasmid (pCMV-VSV-G, Addgene #8454, USA). Received LV-IL-2 concentrate by ultracentrifugation for 2 hours at 26,000 rpm.
Полученный LV-IL-2 используют для генетической модификации опухолевых клеток, например линии меланомы М14. Для этого клетки меланомы высевают на 6-луночный планшет в количестве 10000 клеток на лунку. На следующий день добавляют LV-IL-2 с множественностью инфекции (MOI) 10 и культивируют в бессывороточной среде RPMI-1640 в течение 6 часов. В конце инкубации клетки отмывают от вируса и добавляют свежую полную среду RPMI-1640. Чтобы отобрать генетически модифицированнные клетки, М14-IL-2 культивируют в присутствии селективного антибиотика бластицидин S (5 мкг/мл, Invitrogen, США) в течение 10 дней. Полученные клетки М14-IL-2 используют для дальнейшей работы. The resulting LV-IL-2 is used to genetically modify tumor cells, such as the M14 melanoma line. To do this, melanoma cells are seeded on a 6-well plate in the amount of 10,000 cells per well. The next day, LV-IL-2 with a MOI of 10 is added and cultured in RPMI-1640 serum-free medium for 6 hours. At the end of the incubation, cells are washed free of virus and fresh complete RPMI-1640 medium is added. To select genetically modified cells, M14-IL-2 is cultured in the presence of the selective antibiotic blasticidin S (5 μg/ml, Invitrogen, USA) for 10 days. The obtained M14-IL-2 cells are used for further work.
Третий этап - анализ экспрессии функционально активного белка IL-2The third stage - analysis of the expression of functionally active protein IL-2
Анализ экспрессии белка IL-2 в генетически модифицированных М14-IL-2 проводят с помощью вестерн-блот-анализа. Для выделения общего белка образцы нативных и генетически модифицированных клеток М14 (1×106 клеток) лизируют в RIPA буфере, содержащем ингибитор протеаз, затем центрифугируют при 12000 об/мин в течение 30 минут. Равные объемы лизатов разделяют в 4-12% градиентных гелях и переносят на нитроцеллюлозную мембрану с размером пор 0,2 мкм (#162-0112, BioRad, США) с использованием транс-блот-системы для полусухого электрофоретического переноса (BioRad, США). Мембраны с белками инкубируют в течение ночи с первичными антителами. Используемые в работе первичные антитела: anti-IL-2 (#ab180780, Abcam, разведение 1:100). Затем мембраны инкубируют со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (#8a0467j, American Qualex Antibodies, США) в разведении 1:2000 в течение 2 часов. Белки визуализируют с использованием субстрата Clarity™ Western ECL (#1705061, BioRad, США) в системе ChemiDoc XRS+ (BioRad, США). Analysis of IL-2 protein expression in genetically modified M14-IL-2 is performed using Western blot analysis. To isolate the total protein, samples of native and genetically modified M14 cells (1×10 6 cells) are lysed in RIPA buffer containing a protease inhibitor, then centrifuged at 12,000 rpm for 30 minutes. Equal volumes of lysates were separated on 4-12% gradient gels and transferred to a 0.2 µm nitrocellulose membrane (#162-0112, BioRad, USA) using a semi-dry electrophoretic trans-blot system (BioRad, USA). Protein membranes are incubated overnight with primary antibodies. Primary antibodies used in the work: anti-IL-2 (#ab180780, Abcam, dilution 1:100). The membranes are then incubated with secondary antibodies conjugated with horseradish peroxidase (#8a0467j, American Qualex Antibodies, USA) at a 1:2000 dilution for 2 hours. Proteins are visualized using Clarity™ Western ECL substrate (#1705061, BioRad, USA) on a ChemiDoc XRS+ system (BioRad, USA).
По результатам анализа заявителем была подтверждена секреция белка IL-2 в М14-IL-2 (Фиг. 1).According to the results of the analysis, the secretion of the IL-2 protein in M14-IL-2 was confirmed by the applicant (Fig. 1).
Четвертый этап - выделение индуцированных мембранных везикул из М14-IL-2Fourth step - isolation of induced membrane vesicles from M14-IL-2 при помощи цитохалазина В.with cytochalasin B.
Для выделения мембранных везикул берут 10*106 клеток М14-IL-2, разбавляют в 5 мл бессывороточной среды RPMI-1640 и добавляют цитохалазин B (Sigma- Aldrich, США) в соотношении 1:6000. После 30 минут инкубации при 37°C во влажной атмосфере с поддержанием 5% уровня СО2, клеточную суспензию необходимо энергично встряхивать в течение минуты, после чего осадить клетки при 500 g в течение 10 минут. Супернатант необходимо дважды отцентрифугировать (700 g в течение 10 минут и 12000 g в течение 15 минут). Полученный осадок содержит индуцированные цитохалазином В мембранные везикулы клеток М14-IL-2.To isolate membrane vesicles, 10*10 6 M14-IL-2 cells are taken, diluted in 5 ml of serum-free RPMI-1640 medium, and cytochalasin B (Sigma-Aldrich, USA) is added at a ratio of 1:6000. After 30 minutes of incubation at 37° C. in a humid atmosphere with a 5% CO 2 level maintained, the cell suspension should be shaken vigorously for one minute, after which the cells should be pelleted at 500 g for 10 minutes. The supernatant must be centrifuged twice (700 g for 10 minutes and 12,000 g for 15 minutes). The resulting pellet contains cytochalasin B-induced membrane vesicles of M14-IL-2 cells.
Пятый этап - добавление индуцированных мембранных везикулы, выделенных из М14-IL-2, к мононуклеарам периферической крови, проведение анализа популяции активированных цитотоксических Т-лимфоцитов.The fifth stage is the addition of induced membrane vesicles isolated from M14-IL-2 to peripheral blood mononuclear cells, and analysis of the population of activated cytotoxic T-lymphocytes.
Для анализа популяции активированных цитотоксических Т-лимфоцитов получают иммунные клетки, например мононуклеарные клетки (ядросодержащие клетки крови) из крови человека или животных с применением стандартных культуральных методов. Например, выделение мононуклеарных клеток из крови осуществляют посредством центрифугирования крови в градиенте плотности фиколла (плотность 1,077 г/мл, производства фирмы ПанЭко, Россия). Мононуклеарные клетки культивируют на культуральном пластике в питательной среде, например RPMI-1640 (производства фирмы ПанЭко, Россия), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (производства фирмы Invitrogen, США), L-глутамин (производства фирмы ПанЭко, Россия) и смесь антибиотиков пенициллин-стрептомицин (производства фирмы Биолот, Россия) при температуре 37°C, во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2.To analyze the population of activated cytotoxic T-lymphocytes receive immune cells, such as mononuclear cells (nucleated blood cells) from human or animal blood using standard culture methods. For example, the isolation of mononuclear cells from the blood is carried out by centrifuging the blood in a ficoll density gradient (density 1.077 g/ml, manufactured by PanEco, Russia). Mononuclear cells are cultivated on cultural plastic in a nutrient medium, for example, RPMI-1640 (manufactured by PanEco, Russia) containing 10% fetal calf serum (manufactured by Invitrogen, USA), L-glutamine (manufactured by PanEco, Russia) and a mixture of antibiotics penicillin -streptomycin (manufactured by Biolot, Russia) at a temperature of 37°C, in a humid atmosphere containing 5% CO2.
К свежевыделенным мононуоклеарным клеткам добавляют полученные индуцированные цитохалазином В мембранные везикулы клеток М14-IL-2 в концентрации 300 мкг/мл (в пересчете на концентрацию белка). Культивируют в течение 24 часов, после проводят окрашивание, согласно инструкции производителя, на активированные ЦТЛ при помощи панели антител: анти-CD4 антитело (например, Pacific Blue anti-human CD4 antibody, #317429 BioLegend, США), анти-CD8 антитело (например, FITC anti-human CD8a anti-body, #300906, BioLegend, США), анти-HLA-DR антитело (например, PE anti-human HLA-DR antibody, #307605, BioLegend, США) и анализируют полученные результаты при помощи проточной цитофлуориметрии по известной методике (например, на приборе FACS Aria III, BD, США).To freshly isolated mononuclear cells, the resulting cytochalasin B-induced membrane vesicles of M14-IL-2 cells are added at a concentration of 300 μg/ml (based on protein concentration). Cultivated for 24 hours, after staining, according to the manufacturer's instructions, for activated CTLs using an antibody panel: anti-CD4 antibody (for example, Pacific Blue anti-human CD4 antibody, #317429 BioLegend, USA), anti-CD8 antibody (for example , FITC anti-human CD8a anti-body, #300906, BioLegend, USA), an anti-HLA-DR antibody (e.g. PE anti-human HLA-DR antibody, #307605, BioLegend, USA) and analyze the results using a flow cytofluorimetry according to a known method (for example, on a FACS Aria III instrument, BD, USA).
По результатам анализа заявителем было подтверждено увеличение количества активированных ЦТЛ (Фиг. 2).According to the results of the analysis by the applicant, an increase in the number of activated CTLs was confirmed (Fig. 2).
Из данных, приведенных на Фиг. 1 видно, что в М14-IL-2, а также в иМВ, выделенных из М14-IL-2, синтезируется белок IL-2. Такие данные показывают, что генетическая модификация клеток М14 лентивирусом, кодирующим ген IL-2, привела к способности данных клеток синтезировать соответствующий белок и указывает на наличие данного белка в иМВ, выделенных из М14-IL-2.From the data shown in Fig. 1 shows that in M14-IL-2, as well as in iMB isolated from M14-IL-2, the IL-2 protein is synthesized. These data show that the genetic modification of M14 cells with a lentivirus encoding the IL-2 gene led to the ability of these cells to synthesize the corresponding protein and indicates the presence of this protein in iMBs isolated from M14-IL-2.
Из данных, приведенных на Фиг. 2, видно, что обнаружено увеличение числа CD3+CD4-CD8+ T-киллеров (ЦТЛ) после культивирования с иМВ, выделенными из М14-IL-2, (133,3 ± 3,4 %) по сравнению с МКПК, культивировавшихся отдельно (100,0 ± 0,16%). Такие данные показывают, что иМВ, выделенные из М14-IL-2, обладают иммуномодулирующей активностью и приводят к увеличению количества ЦТЛ.From the data shown in Fig. 2, it can be seen that an increase in the number of CD3 + CD4 - CD8 + T-killers (CTLs) was found after cultivation with iMBs isolated from M14-IL-2 (133.3 ± 3.4%) compared with PBMCs cultivated separately (100.0 ± 0.16%). These data show that uMBs isolated from M14-IL-2 have immunomodulatory activity and lead to an increase in CTLs.
Таким образом, графические материалы, иллюстрирующие примеры конкретного выполнения заявленного технического решения, доказывают возможность достижения заявленного технического результата, а именно:Thus, graphic materials illustrating examples of the specific implementation of the claimed technical solution prove the possibility of achieving the claimed technical result, namely:
- экспрессия белка IL-2 в М14-IL-2 подтверждается вестерн-блот-анализом с использованием специфичных антител;- expression of the IL-2 protein in M14-IL-2 is confirmed by Western blot analysis using specific antibodies;
- число CD3+CD4-CD8+ T-киллеров (ЦТЛ) увеличивается на 33% в образце МКПК после культивирования с иМВ-М14-IL-2 по сравнению с образцами нативных МКПК и на 28% по сравнению с образцами МКПК после культивирования с иМВ-М14.- the number of CD3 + CD4 - CD8 + T-killers (CTLs) increased by 33% in the PBMC sample after cultivation with iMB-M14-IL-2 compared with native PBMC samples and by 28% compared with PBMC samples after cultivation with iMB -M14.
Таким образом, в примере экспериментально доказано, что использование заявленного технического решения на основе мембранных везикул из генетически модифицированных опухолевых клеток со сверхэкспрессией интерлейкина 2 человека позволяет стимулировать увеличение активированных иммунных клеток.Thus, in the example, it has been experimentally proven that the use of the claimed technical solution based on membrane vesicles from genetically modified tumor cells with overexpression of
Основываясь на приведенных экспериментальных данных, приведенных на Фиг. 1 - Фиг. 2 соответственно, представляется возможным сделать логический вывод о том, что иМВ, выделенные из опухолевых клеток, например, линии М14, со сверхэкспрессией интерлейкина 2 могут быть использованы для усиления иммунного ответа путем увеличения количества ЦТЛ в популяции мононуклеарных клеток периферической крови.Based on the above experimental data shown in FIG. 1 - Fig. 2, respectively, it seems possible to draw a logical conclusion that uMB isolated from tumor cells, for example, line M14, with overexpression of
Таким образом, из вышеизложенного можно сделать общий вывод, что заявителем достигнут заявленный технический результат, а именно: разработан способ увеличения количества активированных цитотоксических Т-лимфоцитов при помощи мембранных везикул из генетически модифицированных опухолевых клеток со сверхэкспрессией интерлейкина 2 человека in vitro, что дает усиление противоопухолевого иммунного ответа путем повышения количества активированных ЦТЛ в культуре клеток.Thus, from the foregoing, we can make a general conclusion that the applicant has achieved the claimed technical result , namely: a method has been developed to increase the number of activated cytotoxic T-lymphocytes using membrane vesicles from genetically modified tumor cells with overexpression of
Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как из исследованного уровня техники не выявлены источники, в которых описаны признаки, совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков, перечисленные в формуле изобретения, включая характеристику назначения.The claimed technical solution complies with the “novelty” patentability condition for inventions, since no sources have been identified from the studied prior art that describe features that match in terms of the function they perform and the form of execution of these features listed in the claims, including the purpose characteristic.
Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, поскольку из исследованного уровня техники заявителем не выявлены технические решения, характеризующиеся использованием иМВ, выделенных из опухолевых клеток, анпример, линии М14, со сверхэкспрессией интерлейкина 2 для иммунологической модуляции путем увеличения количества ЦТЛ в популяции мононуклеарных клеток периферической крови The claimed technical solution complies with the "inventive step" patentability condition for inventions, since from the studied state of the art the applicant has not identified technical solutions characterized by the use of iMBs isolated from tumor cells, for example, the M14 line, with overexpression of
Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям, так как оно может быть использовано в промышленных масштабах для создания препаратов, предназначенных для лечения широкого спектра онкологических заболеваний человека.The claimed technical solution complies with the "industrial applicability" patentability condition for inventions, since it can be used on an industrial scale to create drugs intended for the treatment of a wide range of human cancers.
Claims (1)
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2790867C1 true RU2790867C1 (en) | 2023-02-28 |
Family
ID=
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2595872C2 (en) * | 2010-03-19 | 2016-08-27 | Массачусетс Интитут Оф Текнолоджи | Composition of lipid vesicles and methods of application |
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2595872C2 (en) * | 2010-03-19 | 2016-08-27 | Массачусетс Интитут Оф Текнолоджи | Composition of lipid vesicles and methods of application |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
FILIN I.Y., Analysis of immunomodulating properties of cytochalasin B induced membrane vesicles, isolated from human melanoma cells in vitro, Сборник научных трудов всероссийской конференции с международным участием "Регенеративная биология и медицина", 2021, сс. 4-5. COPPOLA C. et al., Investigation of the Impact from IL-2, IL-7, and IL-15 on the Growth and Signaling of Activated CD4+ T Cells, Int J Mol Sci., 2020, vol. 21, N. 21, 7814. KUGERATSKI F.G., KALLURI R., Exosomes as mediators of immune regulation and immunotherapy in cancer, FEBS J., 2021, vol. 288, N. 1, pp. 10-35. LIU X. et al., IL-2 Restores T-Cell Dysfunction Induced by Persistent Mycobacterium tuberculosis Antigen Stimulation, Front Immunol, 2019, vol. 10, 2350. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6612963B2 (en) | Compositions and methods for using recombinant T cell receptors to directly recognize tumor antigens | |
JP6884423B2 (en) | Immunocyte cells expressing immune function regulators and expression vectors | |
TWI752930B (en) | Novel generation of antigen-specific tcrs | |
KR20180063841A (en) | Exosome for stimulating T cell and pharmaceutical use thereof | |
WO2019096115A1 (en) | Isolated t-cell receptor, cell modified by same, coding nucleic acids, expression vector, preparation method, pharmaceutical composition, and applications | |
AU2002365291A1 (en) | Pharmaceutical composition for inducing an immune response in a human or animal | |
EP2305796A1 (en) | Process for producing cytotoxic lymphocytes | |
US20100303868A1 (en) | Ex vivo, fast and efficient process to obtain activated antigen-presenting cells that are useful for therapies against cancer and immune system-related diseases | |
US9072690B2 (en) | Tumor antigen proteins or genes of polo-like kinase 1 | |
CN113677352A (en) | T cell modification | |
KR20210057750A (en) | MR1 restricted T cell receptor for cancer immunotherapy | |
JP6903866B2 (en) | Method for inducing proliferation of blood-derived monocytes | |
US20180078627A1 (en) | Method for antigen loading of dendritic cells and vaccine | |
WO2016093350A1 (en) | Modified immunocyte, method for producing modified immunocyte and utilization thereof | |
CA2476143A1 (en) | Method for inducing cytotoxic t lymphocyte | |
RU2790867C1 (en) | Method for activating cytotoxic t-lymphocytes in a population of blood mononuclear cells using membrane vesicles obtained from genetically modified tumor cells of m14 melanoma with overexpression of interleukin 2 | |
US11612643B2 (en) | Col14A1-derived tumor antigen polypeptide and use thereof | |
RU2619186C1 (en) | Method for production of in vitro populations of activated antigenspecific antitumor-tumor cytotoxic t-lymphocytes specific to tumor-associated antigen epitopes | |
Borgmann et al. | Immunotherapy of acute lymphoblastic leukemia by vaccination with autologous leukemic cells transfected with a cDNA expression plasmid coding for an allogeneic HLA class I antigen combined with interleukin-2 treatment | |
Koide et al. | Efficient CTL productivity of modified fusion cells by increase of heat shock protein 70 | |
WO2018032619A1 (en) | Applications of soluble protein baff in b cell in-vitro culture and proliferation | |
CN116970562B (en) | Preparation method of antigen-specific T cells and application of antigen-specific T cells in immunotherapy | |
US20240002465A1 (en) | Mr1 restricted t cell receptors for cancer immunotherapy | |
US20230348561A1 (en) | Dominant negative tgfbeta receptor polypeptides, cd8 polypeptides, cells, compositions, and methods of using thereof | |
BEXTEN et al. | A. Mackensen; T. Theobald |