RU2790685C1 - A new killer yeast strain saccharomyces cerevisiae - Google Patents

Abstract

FIELD: microbiology; biotechnology.

SUBSTANCE: group of inventions relates to the field of microbiology and biotechnology and concerns the killer strain of Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-5058, the use of the strain for obtaining dsRNA, and also the method for obtaining dsRNA.

EFFECT: enhancement of the productivity of a new strain of Saccharomyces cerevisiae.

3 cl, 4 dwg, 1 tbl, 4 ex

Description

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии, и касается нового киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, используемого в промышленности в качестве источника двуспиральных РНК.The invention relates to the field of microbiology and biotechnology, and concerns a new killer strain of Saccharomyces cerevisiae used in industry as a source of double-stranded RNA.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE INVENTION

Природные двуспиральные РНК (дсРНК) являются одними из важнейших медиаторов, обеспечивающих индукцию интерферона (IFN) (Isaque João da Silva de Faria, et al., dsRNA Sensing During Viral Infection: Lessons from Plants, Worms, Insects, and Mammals //Journal of Interferon & Cytokine Research. - 2013. - 33:5, 239-253), при этом дсРНК вызывают индукцию всех типов интерферона, включая интерферон-дельта, обладают противовирусным действием в отношении различных видов вирусов. Таким образом, с точки зрения терапевтического потенциала дсРНК являются перспективным объектом для создания на их основе противовирусных, антибактериальных, противоопухолевых препаратов, а также средств для повышения неспецифической защитной реакции и снижения восприимчивости организма к действию патогенных агентов различной природы (Yoneyama M, Fujita T. Recognition of viral nucleic acids in innate immunity. Rev Med Virol. - 2010 Jan. - 20(1). - 4-22).Natural double-stranded RNAs (dsRNAs) are among the most important mediators for interferon (IFN) induction (Isaque João da Silva de Faria, et al., dsRNA Sensing During Viral Infection: Lessons from Plants, Worms, Insects, and Mammals //Journal of Interferon & Cytokine Research. - 2013. - 33:5, 239-253), while dsRNA cause the induction of all types of interferon, including interferon-delta, have an antiviral effect against various types of viruses. Thus, from the point of view of the therapeutic potential, dsRNAs are a promising object for the creation of antiviral, antibacterial, antitumor drugs on their basis, as well as agents for increasing the nonspecific defense reaction and reducing the body's susceptibility to the action of pathogenic agents of various nature (Yoneyama M, Fujita T. Recognition of viral nucleic acids in innate immunity Rev Med Virol - 2010 Jan. - 20(1) - 4-22).

Двуспиральные РНК перспективны с точки зрения их терапевтического потенциала, поскольку могут быть использованы в качестве индукторов интерферонов при лечении и/или профилактике инфекционных заболеваний (Ершов Ф.И., и др., Использование индукторов интерферона при вирусных инфекциях // Вопросы вирусологии. - 2015. - №2.- С. 5-10).Double-stranded RNAs are promising in terms of their therapeutic potential, since they can be used as interferon inducers in the treatment and / or prevention of infectious diseases (Ershov F.I., et al., The use of interferon inducers in viral infections // Issues of Virology. - 2015 - No. 2. - S. 5-10).

Источниками природных дсРНК, помимо РНК-содержащих вирусов, вызывающих заболевания человека и животных, могут быть вирусы насекомых, растений и микроорганизмов, а также некоторые грибы. Известно несколько штаммов микроорганизмов, которые являются источниками дсРНК. Например, Escherichia coli продуцирует репликативную форму дсРНК бактериофага f2 (Логинова С.Я., и др. Изучение эффективности Ларифана® при экспериментальной форме тяжёлого острого респираторного синдрома. Антибиотики и Химиотерапия. - 2019. - 64(5-6):13-17).Sources of natural dsRNAs, in addition to RNA-containing viruses that cause diseases in humans and animals, can be viruses of insects, plants and microorganisms, as well as some fungi. Several strains of microorganisms are known to be sources of dsRNA. For example, Escherichia coli produces a replicative form of bacteriophage f2 dsRNA (Loginova S.Ya., et al. Studying the effectiveness of Larifan® in an experimental form of severe acute respiratory syndrome. Antibiotics and Chemotherapy. - 2019. - 64(5-6):13-17 ).

Также известен штамм, который используется для получения дсРНК бактериофага ϕ6 - Pseudomonas phaseolicola (Ермолаев В.В., Клименко В.П., Гогина Я.С., Лебедев Л.Р. Особенности культивирования бактериофага ϕ6 - продуцента двуспиральной РНК // Актуальные проблемы гуманитарных и естественных наук. - 2016. - №6-1). Also known is a strain that is used to obtain dsRNA bacteriophage ϕ6 - Pseudomonas phaseolicola (Ermolaev V.V., Klimenko V.P., Gogina Ya.S., Lebedev L.R. Features of cultivation of bacteriophage ϕ6 - double-stranded RNA producer // Actual problems Humanities and Natural Sciences - 2016. - No. 6-1).

В качестве еще одного источника двуспиральных РНК могут быть использованы киллерные штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Для данных штаммов характерно содержание в цитоплазме вирусоподобных частиц, которые в свою очередь содержат дсРНК. Вирусы, обеспечивающие фенотип «киллер», принадлежат семейству миковирусов Totiviridae. Один из этих вирусов - вирус-помощник, другой - вирус-сателлит (Е.В. Самбук и др., Киллер-токсины дрожжей Saccharomyces cerevisiae: синтез, механизмы действия и практическое использование // Экологическая генетика. - 2019. - Т. 17. - № 3. - С. 59-73). Дрожжи Saccharomyces cerevisiae могут содержать одновременно несколько типов вирусов, которые относятся к семейству миковирусов (J. C. Ribas Saccharomyces cerevisiae L-BC Double-Stranded RNA Virus Replicase Recognizes the L-A Positive-Strand RNA 39 End // JOURNAL OF VIROLOGY, Jan.- 1996. - p. 292-297).As another source of double-stranded RNA, killer strains of the yeast Saccharomyces cerevisiae can be used. These strains are characterized by the presence of virus-like particles in the cytoplasm, which in turn contain dsRNA. The viruses that provide the "killer" phenotype belong to the mycovirus family Totiviridae . One of these viruses is a helper virus, the other is a satellite virus (E.V. Sambuk et al., Saccharomyces cerevisiae yeast killer toxins: synthesis, mechanisms of action and practical use // Ecological genetics. - 2019. - V. 17 . - No. 3. - S. 59-73). Yeast Saccharomyces cerevisiae can simultaneously contain several types of viruses that belong to the family of mycoviruses (JC Ribas Saccharomyces cerevisiae L-BC Double-Stranded RNA Virus Replicase Recognizes the LA Positive-Strand RNA 39 End // JOURNAL OF VIROLOGY, Jan.- 1996. - pp. 292-297).

Наиболее близким аналогом настоящего изобретения является киллерный штамм Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448 (RU2558256, опубл. 27.07.2015). The closest analogue of the present invention is the killer strain of Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-448 (RU2558256, publ. 27.07.2015).

Цель настоящего изобретения - получение нового штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae, превосходящего известные штаммы по уровню содержания вирусоподобных частиц, которые в свою очередь содержат дсРНК. The purpose of the present invention is to obtain a new strain of yeast Saccharomyces cerevisiae , superior to known strains in terms of the content of virus-like particles, which in turn contain dsRNA.

Техническим результатом заявленного изобретения является увеличение продуктивности нового штамма Saccharomyces cerevisiae, сокращение времени культивирования, снижение количества примесей в субстанции дсРНК, высокая биохимическая активность и повышенная устойчивость нового штамма к неблагоприятным факторам, в том числе, при хранении и культивировании.The technical result of the claimed invention is to increase the productivity of the new strain of Saccharomyces cerevisiae , reduce the cultivation time, reduce the amount of impurities in the dsRNA substance, high biochemical activity and increased resistance of the new strain to adverse factors, including during storage and cultivation.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION

В процессе индуцированного мутагенеза и последующего ступенчатого отбора из родительского штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448 был получен новый штамм RAD-02, источник дсРНК.In the process of induced mutagenesis and subsequent stepwise selection, a new strain RAD-02, a source of dsRNA, was obtained from the parent strain Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-448.

Родительский штамм Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448 подвергался процессу индуцированного мутагенеза путем воздействия на него ультрафиолета при низких температурах. The parent strain Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-448 was subjected to the process of induced mutagenesis by exposure to ultraviolet light at low temperatures.

Полученный новый штамм депонирован в Национальном Биоресурсном Центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» под номером VKPM Y-5058. Новый киллерный штамм Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-5058 может применяться для промышленного производства различных форм двуспиральных рибонуклеиновых кислот.The resulting new strain was deposited at the National Bioresource Center of the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms of the National Research Center "Kurchatov Institute" under the number VKPM Y-5058. The new killer strain Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-5058 can be used for industrial production of various forms of double-stranded ribonucleic acids.

Таким образом, одним из вариантов настоящего изобретения является новый киллерный штамм Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-5058, который может быть использован для получения двуспиральной РНК. Одним из вариантов осуществления изобретения является применение штамма для Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-5058 для получения двуспиральных РНК. Другим вариантом настоящего изобретения является способ получения двуспиральной РНК, включающий культивирование штамма Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-5058, разрушение клеток и очистку дсРНК (Фиг. 3).Thus, one of the variants of the present invention is a new killer strain of Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-5058, which can be used to obtain double-stranded RNA. One of the embodiments of the invention is the use of the strain for Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-5058 to obtain double-stranded RNA. Another variant of the present invention is a method for producing double-stranded RNA, including culturing a strain of Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-5058, disrupting cells, and purifying dsRNA (Fig. 3).

ТЕРМИНЫ и ОПРЕДЕЛЕНИЯTerms and Definitions

Ниже приведены термины, которые могут использоваться при описании настоящего изобретения. Если не указано иное, все технические и специальные термины, использованные в описании, имеют общепринятое в данной области техники значение.The following are terms that may be used in describing the present invention. Unless otherwise indicated, all technical and technical terms used in the description have the meaning generally accepted in the art.

Термин «вирусоподобные частицы» в контексте настоящего изобретения являются естественными компонентами киллерных штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae, которые репродуцируются в процессе роста и деления клеток. Каждая вирусоподобная частица содержит двуспиральную рибонуклеиновую кислоту (дсРНК).The term "virus-like particles" in the context of the present invention are natural components of the killer strains of yeast Saccharomyces cerevisiae, which are reproduced in the process of growth and cell division. Each virus-like particle contains a double-stranded ribonucleic acid (dsRNA).

Термин «двуспиральная РНК» или «дсРНК» в контексте настоящего изобретения характеризует молекулу РНК, состоящую из двух комплементарных цепей. В контексте настоящего изобретения дсРНК может находиться в виде соли, например, натриевой, калиевой и тд. The term "double-stranded RNA" or "dsRNA" in the context of the present invention characterizes an RNA molecule consisting of two complementary strands. In the context of the present invention, dsRNA may be in the form of a salt such as sodium, potassium, etc.

Термин «фармацевтически приемлемые соли» по настоящему изобретению относится к нетоксичным солям, которые могут быть использованы в терапии млекопитающих.The term "pharmaceutically acceptable salts" of the present invention refers to non-toxic salts that can be used in mammalian therapy.

Термин «биомасса» в контексте настоящего изобретения относится к совокупной массе клеток киллерного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae, отделенных в процессе центрифугирования от супернатанта культуральной жидкости, полученной в результате культивирования, в том числе, в качалочных колбах или биореакторах (например, при культивировании батарейным способом).The term "biomass" in the context of the present invention refers to the total mass of cells of the killer yeast strain Saccharomyces cerevisiae , separated by centrifugation from the supernatant of the culture liquid obtained as a result of cultivation, including in shake flasks or bioreactors (for example, when culturing in a battery way) .

Термин «сухая биомасса» в контексте настоящего изобретения характеризует биомассу с содержанием воды не более 10 мас. %.The term "dry biomass" in the context of the present invention characterizes the biomass with a water content of not more than 10 wt. %.

Термин культуральная жидкость в контексте настоящего изобретения означает двухфазную газожидкостную питательную (или ферментационную) среду с микроорганизмами.The term culture liquid in the context of the present invention means a two-phase gas-liquid nutrient (or fermentation) medium with microorganisms.

Термин «продуктивность штамма» в контексте настоящего изобретения относится к количеству дсРНК, содержащейся в вирусоподобных частицах киллерного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae, рассчитанному на единицу сухой биомассы киллерного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae, отделенной в процессе центрифугирования от супернатанта культуральной жидкости, полученной в результате культивирования, выраженному в милиграммах дсРНК на кг сухой биомассы.The term "strain productivity" in the context of the present invention refers to the amount of dsRNA contained in the virus-like particles of the killer yeast strain Saccharomyces cerevisiae, calculated per unit of dry biomass of the killer yeast strain Saccharomyces cerevisiae, separated by centrifugation from the supernatant of the culture liquid obtained as a result of cultivation, expressed as in milligrams of dsRNA per kg of dry biomass.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано посредством Фиг. 1- Фиг. 3. The present invention is further illustrated by FIG. 1- Fig. 3.

На Фиг. 1 изображены клетки Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-5058, окрашенные метиленовым синим (увеличение ×1000).On FIG. 1 shows Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-5058 cells stained with methylene blue (×1000 magnification).

На Фиг. 2 изображены клетки Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-5058 посредством световой микроскопии (прижизненно, увеличение × 400).On FIG. 2 shows Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-5058 cells by light microscopy (in vivo, ×400 magnification).

На Фиг. 3 изображены основные этапы получения дсРНК из культуры киллерного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-5058.On FIG. 3 shows the main stages of obtaining dsRNA from the culture of the killer yeast strain Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-5058.

На Фиг. 4 изображена электрофореграмма образцов дсРНК, полученных из клеток дрожжей киллерных штаммов Saccharomyces cerevisiae:On FIG. 4 shows the electrophoregram of dsRNA samples obtained from yeast cells of killer strains of Saccharomyces cerevisiae :

М - маркер молекулярной массы (маркер молекулярного веса ДНК, содержащий 13 фрагментов от 250 до 10000 п.н. (фрагменты: 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 6000, 8000, 10000 п.н.);M - molecular weight marker (molecular weight marker of DNA containing 13 fragments from 250 to 10000 bp (fragments: 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 6000, 8000, 10000 b.s.);

* - образец, полученный из клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448;* - sample obtained from yeast cells of the killer strain Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-448;

** - образец, полученный из клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-5058.** - sample obtained from yeast cells of the killer strain Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-5058.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDISCLOSURE OF THE INVENTION

Согласно настоящему изобретению предложен новый киллерный штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae, являющийся источником дсРНК - депонирован в Национальном Биоресурсном Центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» под номером VKPM Y-5058.According to the present invention, a new killer yeast strain Saccharomyces cerevisiae is proposed, which is a source of dsRNA - deposited at the National Bioresource Center of the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms of the National Research Center "Kurchatov Institute" under the number VKPM Y-5058.

Культурально-морфологические признаки штамма: Cultural and morphological features of the strain:

аэроб; при поверхностном культивировании на агаризованной среде колонии от светло-бежевого до бежевого цвета, выпуклые, округлой ровной формы, не врастающие в агар; поверхность колонии гладкая, ослизлая. Клетки имеют шаровидную или эллипсоидную форму (Фиг. 1, 2).aerobe; during surface cultivation on an agar medium, the colonies are from light beige to beige in color, convex, round, even in shape, not growing into agar; the surface of the colony is smooth, slimy. Cells are spherical or ellipsoidal (Fig. 1, 2).

Физико-биохимические признаки: хорошо утилизирует сахарозу, крахмал, фруктозу, арабинозу, инозит, галактозу, манит, глюкозу. Physico-biochemical features: well utilizes sucrose, starch, fructose, arabinose, inositol, galactose, lures, glucose.

Для хранения и приготовления посевного материала используется среда следующего состава, г/л: декстрозы моногидрат - 10,0-18,0; пептон мясной - 10,0-35,0; агар бактериологический - 10,0-40,0; дрожжевой экстракт - 1,0-15,0; калий хлористый - 0,8-3,0; pH до стерилизации - 4,5-6,3.For storage and preparation of inoculum, a medium of the following composition is used, g/l: dextrose monohydrate - 10.0-18.0; meat peptone - 10.0-35.0; bacteriological agar - 10.0-40.0; yeast extract - 1.0-15.0; potassium chloride - 0.8-3.0; pH before sterilization - 4.5-6.3.

Условия поверхностного культивирования для выделения единичных колоний: 4-8 суток, при температуре 27-35°С.Surface cultivation conditions for isolation of single colonies: 4-8 days, at a temperature of 27-35°C.

ПРИМЕРЫ EXAMPLES

Изобретение поясняется следующими иллюстративными примерами, которые не ограничивают заявленный объем охраны.The invention is illustrated by the following illustrative examples, which do not limit the claimed scope of protection.

Пример 1. Получение нового штамма Saccharomyces cerevisiae. Example 1 Preparation of a new strain of Saccharomyces cerevisiae .

Путем многоступенчатой селекции с применением мутагенных факторов и направленных методов отбора модификантов родительского штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448 был получен новый киллерный штамм, являющийся источником дсРНК. A new killer strain, which is a source of dsRNA, was obtained by multistage selection using mutagenic factors and directed methods for selecting modifiers of the parent strain Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-448.

Для этого клетки Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448 ресуспендировали в стерильном 0,9 % растворе натрия хлорида в концентрации примерно 10⁷ кл/мл, воздействовали УФ с длиной волны 250 нм (лампа Mineralight) при 0°С и затем рассевали на агаризованную питательную среду. Инкубировали при температуре 27-35°С до появления видимых единичных колоний. Проводили селективные отборы и тесты в рамках процесса ферментации в биореакторах.For this, Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-448 cells were resuspended in a sterile 0.9% sodium chloride solution at a concentration of approximately 10 ⁷ cells/ml, exposed to UV at a wavelength of 250 nm (Mineralight lamp) at 0°C, and then seeded onto an agar nutrient medium. . Incubated at a temperature of 27-35°C until visible single colonies. Conducted selective selections and tests within the fermentation process in bioreactors.

Полученному штамму был присвоен внутренний номер RAD-02, после чего штамм был депонирован в Национальный Биоресурсный Центр Всероссийская коллекцию промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» под номером VKPM Y-5058. The resulting strain was assigned the internal number RAD-02, after which the strain was deposited with the National Bioresource Center All-Russian Collection of Industrial Microorganisms of the National Research Center "Kurchatov Institute" under the number VKPM Y-5058.

Пример 2. Методика культивирования. Example 2. Method of cultivation.

Проводили подготовку посевного материала киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-5058 путем посева культуры в чашках Петри для этого агаризованную среду засевали суспензией исходной посевной культуры, и выдерживали в термостате от 4 до 8 суток, при температуре 27-35°С.The inoculum of the killer strain Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-5058 was prepared by inoculating the culture in Petri dishes; for this, the agar medium was inoculated with a suspension of the initial inoculum and kept in a thermostat for 4 to 8 days at a temperature of 27-35°C.

Далее проводили наработку культуры в колбах в жидкой среде в при 27-35°С в течение 24-48 часов на термостатируемой качалочной установке при 200-300 об/мин. Next, the culture was cultivated in flasks in a liquid medium at 27-35°C for 24-48 hours on a thermostatically controlled rocking unit at 200-300 rpm.

Далее осуществляли культивирование посевной культуры в ферментере объемом 15/100 л - для этого проводили засев ферментера путем инокуляции посевной культурой в количестве 5-15% от объема среды в ферментере, при непрерывной подаче стерильного воздуха во время культивирования при постоянном перемешивании в течении 24-96 часов.Next, the seed culture was cultivated in a fermenter with a volume of 15/100 l - for this, the fermenter was seeded by inoculation with a seed culture in an amount of 5-15% of the volume of the medium in the fermenter, with a continuous supply of sterile air during cultivation with constant stirring for 24-96 hours.

Пример 3. Получение вирусоподобных частиц из клеток киллерных штаммов Saccharomyces cerevisiae. Example 3. Obtaining virus-like particles from cells of killer strains of Saccharomyces cerevisiae .

Для выделения вирусоподобных частиц биомассу дрожжей киллерных штаммов Saccharomyces cerevisia VKPM Y-5058 и Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448 гомогенизировали в трис-солянокислом буфере с добавлением ферментного препарата, полученного из культуральной жидкости Arthrobacter luteus, из расчета 40 ед. активности (100 мкл) на 1 г клеток. To isolate virus-like particles, the biomass of killer yeast strains Saccharomyces cerevisia VKPM Y-5058 and Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-448 was homogenized in Tris-hydrochloric acid buffer with the addition of an enzyme preparation obtained from the culture liquid of Arthrobacter luteus, at a rate of 40 units. activity (100 μl) per 1 g of cells.

Полученную суспензию при перемешивании инкубировали при температуре 36° в течение 1,5 ч. После этого проводили замораживание (до - 17-19°С, 30-40 мин) и оттаивание (до 28-32°С, 30-40 мин) препарата. Далее проводили центрифугирование с последующей фильтрацией. После чего, вирусоподобные частицы осаждали 10-12 % раствором полиэтиленгликоля. Осадок растворяли в изотоническом растворе и проводили очистку и концентрирование вирусоподобных частиц методом гель - фильтрации. Состав образцов вирусоподобных частиц исследовали электрофоретическим методом. The resulting suspension was incubated with stirring at a temperature of 36°C for 1.5 hours. After that, the preparation was frozen (up to -17-19°C, 30-40 min) and thawed (up to 28-32°C, 30-40 min) . Next, centrifugation followed by filtration was performed. After that, virus-like particles were precipitated with a 10-12% solution of polyethylene glycol. The precipitate was dissolved in an isotonic solution, and the virus-like particles were purified and concentrated by gel filtration. The composition of samples of virus-like particles was studied by the electrophoretic method.

При анализе с помощью электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях было установлено, что в составе препаратов, полученных из клеток киллерных штаммов Saccharomyces cerevisia VKPM Y-5058 и Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448, преимущественно присутствуют белки с молекулярной массой 70,0 ± 10,0 кДа, что соответствует молекулярной массе капсидного белка и РНК-полимеразы в вирусоподобных частицах. При этом высокая степень интенсивности окрашивания Coumassi данных участков, соответствующих вирусоподобным частицам, на электрофореграммах препаратов вирусоподобных частиц клеток киллерного штамма Saccharomyces cerevisia VKPM Y-5058, в отличие от электрофореграмм препаратов вирусоподобных частиц клеток киллерного штамма Saccharomyces cerevisia ВКПМ Y-448 (где интенсивность окрашивания соответствующих участков на электрофореграммах была значительно меньше), говорит о высоком содержании вирусоподобных частиц в клетках киллерного штамма Saccharomyces cerevisia VKPM Y-5058, в отличие от клеток киллерного штамма Saccharomyces cerevisia ВКПМ Y-448.When analyzed by electrophoresis in PAAG under denaturing conditions, it was found that the preparations obtained from cells of the killer strains Saccharomyces cerevisia VKPM Y-5058 and Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-448 predominantly contain proteins with a molecular weight of 70.0 ± 10.0 kDa, which corresponds to the molecular weight of the capsid protein and RNA polymerase in virus-like particles. At the same time, a high degree of intensity of Coumassi staining of these areas corresponding to virus-like particles, on electropherograms of preparations of virus-like particles of cells of the killer strain Saccharomyces cerevisia VKPM Y-5058, in contrast to the electrophoregrams of preparations of virus-like particles of cells of the killer strain Saccharomyces cerevisia VKPM Y-448 (where the staining intensity of the corresponding there were significantly fewer areas on electrophoregrams), indicates a high content of virus-like particles in the cells of the killer strain Saccharomyces cerevisia VKPM Y-5058, in contrast to the cells of the killer strain Saccharomyces cerevisia VKPM Y-448.

Пример 4. Технологический процесс получения дсРНК из клеток киллерных штаммов Saccharomyces cerevisiae. Example 4. Technological process for obtaining dsRNA from cells of killer strains of Saccharomyces cerevisiae .

За счет увеличенного количества вирусоподобных частиц в клетках нового киллерного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-5058 по настоящему изобретению, увеличивается и количество дсРНК, что показано в настоящем примере.Due to the increased number of virus-like particles in the cells of the new killer yeast strain Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-5058 according to the present invention, the amount of dsRNA also increases, as shown in this example.

Клетки дрожжей киллерных штаммов Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-5058 и Saccharomyces cerevisia ВКПМ Y-448 подвергали разрушению, центрифугировали, отделяли надосадочную жидкость и прецепитировали суммарную РНК. Полученный осадок отделяли и при перемешивании добавляли воду и хлорид натрия. Образовавшуюся суспензию отстаивали и центрифугировали. В полученный супернатант добавляли этиловый спирт, чтобы его концентрация составила 40 об. % в целевом растворе, инкубировали и центрифугировали.Yeast cells of killer strains Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-5058 and Saccharomyces cerevisia VKPM Y-448 were destroyed, centrifuged, the supernatant was separated, and total RNA was precipitated. The resulting precipitate was separated and water and sodium chloride were added with stirring. The resulting suspension was settled and centrifuged. Ethyl alcohol was added to the resulting supernatant so that its concentration was 40 vol. % in the target solution, incubated and centrifuged.

После чего к осадку при перемешивании добавляли буферный раствор и фракционировали раствором лития хлорида в две последовательные стадии.After that, a buffer solution was added to the precipitate with stirring, and it was fractionated with a solution of lithium chloride in two successive stages.

В приготовленный раствор дсРНК приливали 8 М раствор хлорида лития до достижения его концентрации в полученной суспензии 2 М. Полученную суспензию перемешивали в течение 15 мин, охлаждали до 4±1°С и отстаивали при установленной температуре 12 часов. Полученную суспензию центрифугировали при 8000 об/мин для отделения супернатанта.An 8 M lithium chloride solution was added to the prepared dsRNA solution until its concentration in the resulting suspension reached 2 M. The resulting suspension was stirred for 15 min, cooled to 4±1°C, and settled at the set temperature for 12 hours. The resulting suspension was centrifuged at 8000 rpm to separate the supernatant.

К супернатанту, полученному на предыдущей стадии, загружали 8 М раствор хлорида лития до достижения его концентрации в полученной суспензии 4 М. Полученный раствор перемешивали до получения однородной суспензии в течение 15 минут, охлаждали до 4±1°С и отстаивали при установленной температуре в течение 12 часов. Далее суспензию центрифугировали при 8000 об/мин для отделения осадка. Супернатант утилизировали.An 8 M solution of lithium chloride was added to the supernatant obtained at the previous stage until its concentration in the resulting suspension reached 4 M. The resulting solution was stirred until a homogeneous suspension was obtained for 15 minutes, cooled to 4 ± 1 12 hours. Next, the suspension was centrifuged at 8000 rpm to separate the precipitate. The supernatant was discarded.

Полученный осадок отправляли на повторные стадии фракционирования 2 М и 4 М хлоридом лития. The precipitate obtained was sent to repeated fractionation steps with 2 M and 4 M lithium chloride.

После полученную суспензию центрифугировали и ресуспендировали в буферном растворе и далее дважды проводили депротеинизацию хлороформом в соотношении целевой раствор: хлороформ от 1:5 по объему. Полученную суспензию отстаивали.After the resulting suspension was centrifuged and resuspended in a buffer solution, and then deproteinization was carried out twice with chloroform in the ratio of the target solution: chloroform from 1:5 by volume. The resulting suspension was defended.

Далее проводили осаждение дсРНК из суспензии раствором этилового спирта до достижения его концентрации в целевом растворе 75 об. %. Полученную суспензию центрифугировали, полученный осадок промывали 96 % раствором этилового спирта и растворяли в воде инъекционной до полного растворения осадка. Next, dsRNA was precipitated from the suspension with a solution of ethanol until its concentration in the target solution was 75 vol. %. The resulting suspension was centrifuged, the resulting precipitate was washed with 96% ethanol solution and dissolved in injection water until the precipitate was completely dissolved.

Полученный водный раствор дсРНК с предыдущей стадии подвергали фильтрации с целью удаления взвешенных частиц и мутности, и лиофильно высушивали.The resulting dsRNA aqueous solution from the previous step was filtered to remove suspended particles and turbidity, and freeze-dried.

Идентификацию дсРНК проводили методами электрофореза в агарозном геле (Фиг. 4). На электрофореграммах фиксировались полосы с четко очерченными границами. Высокая контрастность полос была обусловлена высокой степенью взаимодействия дсРНК с интеркалирующим агентом - бромистым этидием. Высокая степень интеркалирования прямо свидетельствует о двуспиральной структуре молекулы. dsRNA identification was performed by agarose gel electrophoresis (Fig. 4). On the electropherograms, bands with clearly defined boundaries were recorded. The high contrast of the bands was due to the high degree of interaction between dsRNA and the intercalating agent, ethidium bromide. A high degree of intercalation directly indicates the double helix structure of the molecule.

Для проведения описанных экспериментов, использовали сухую биомассу киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448 и Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-5058. Для оценки сходимости результатов эксперименты проводили по 3 раза. Все целевые продукты, полученные по завершении экспериментов, лиофилизировали при одинаковых условиях. Количественное содержание и чистоту дсРНК в лиофилизатах оценивали методом эксклюзионной ВЭЖХ в пересчете на безводный и свободный от остаточных органических растворителей лиофилизат.To carry out the described experiments, dry biomass of killer yeast Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-448 and Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-5058 was used. To assess the convergence of the results, the experiments were carried out 3 times. All target products obtained at the end of the experiments were lyophilized under the same conditions. Quantitative content and purity of dsRNA in lyophilisates were evaluated by size exclusion HPLC in terms of anhydrous lyophilisate free from residual organic solvents.

Полученные данные представлены в таблице 1.The data obtained are presented in table 1.

Таблица 1. Продуктивность киллерных штаммов Saccharomyces cerevisiae.Table 1. Productivity of killer strains of Saccharomyces cerevisiae . ШтаммStrain Продуктивность штаммов (дсРНК мг/кг сухой биомассы)Strain productivity (dsRNA mg/kg dry biomass) в ферментере объемом 15 литров in a 15 liter fermenter в ферментере объемом 100 литров in a 100 liter fermenter Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-5058Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-5058 1500±451500±45 1470°351470°35 Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-448 870±17870±17 940±25940±25

Результаты исследований позволяют сделать вывод о том, что новый штамм Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-5058 обладает высоким биотехнологическим потенциалом и может применяться для промышленного производства дсРНК.The research results allow us to conclude that the new strain of Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-5058 has a high biotechnological potential and can be used for the industrial production of dsRNA.

Claims (3)

1. Киллерный штамм Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-5058 для получения дсРНК.1. Killer strain of Saccharomyces cerevisiae VKPM Y-5058 to obtain dsRNA. 2. Применение штамма по п.1 для получения дсРНК.2. Use of the strain according to claim 1 to obtain dsRNA. 3. Способ получения дсРНК, включающий культивирование штамма по п.1, разрушение клеток и очистку дсРНК.3. A method for producing dsRNA, including cultivating the strain according to claim 1, destroying cells, and purifying dsRNA.

Images