RU2790566C2

RU2790566C2 - Methods for delivery of neuroprotective polypeptide to central nervous system

Info

Publication number: RU2790566C2
Application number: RU2019115110A
Authority: RU
Inventors: Донг Сеок КИМ; Хее Киунг КИМ; Найджел Х. ГРИГ
Original assignee: Пептрон, Инк.; Дзе Юнайтед Стэйтс Оф Америка, Эз Репрезентед Бай Дзе Секретэри, Департмент Оф Хелт Энд Хьюман Сервисиз
Priority date: 2016-10-20
Filing date: 2017-10-20
Publication date: 2023-02-27

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to the field of biotechnology, specifically to compositions with controllable release of neuroprotective polypeptide; it can be used in medicine for the treatment or relief of at least one symptom of a disease associated with the central nervous system (hereinafter – CNS), where the disease associated with CNS is selected from a group consisting of Parkinson’s disease (PD), traumatic brain injury (TBI), Alzheimer’s disease (AD), multiple system atrophy, Huntington’s disease, dementia with Lewy bodies (DLB), mixed dementia, frontotemporal dementia, or a combination thereof. The proposed treatment method includes the use of a composition with controllable release, which contains a microsphere including a core with neuroprotective polypeptide selected from GLP-1, exendin-4, or their therapeutically effective analogues and biodegradable polymer, as well as a coating layer consisting of basic amino acids, polypeptides, and organic nitrogen-containing compounds, which covers the core.

EFFECT: invention allows for improvement of the delivery of neuroprotective polypeptide through the blood-brain barrier, controlling its release from microspheres and reducing initial release.

16 cl, 15 dwg, 2 tbl, 15 ex

Description

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИCROSS-REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

Эта заявка притязает на приоритет предварительной заявки на патент США с № 62/410748, поданной 20 октября 2016 года, содержание которой полностью включено сюда посредством ссылки.This application claims priority to U.S. Provisional Application No. 62/410748, filed Oct. 20, 2016, the contents of which are hereby incorporated by reference in their entirety.

ПРАВИТЕЛЬСТВЕННОЕ ФИНАНСИРОВАНИЕGOVERNMENT FINANCING

Исследования в поддержку этой заявки были проведены Соединенными Штатами Америки в лице секретаря Министерства здравоохранения и социальных служб. Правительство имеет определенные права на это изобретение.Research in support of this application was conducted by the United States of America through the Secretary of the Department of Health and Human Services. The government has certain rights to this invention.

ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИINCLUSION BY LINK

В соответствии с 1.52(e)(5) 37 C.F.R., информация о последовательности, содержащаяся в электронном файле с именем: 1568390_100WO2_Sequence_Listing_ST25.txt; размером 24,4 Кбайт; созданном 3 сентября 2017 года с использованием Patent-In 3.5, и Checker 4.4.0, полностью включена сюда посредством ссылки.In accordance with 1.52(e)(5) 37 C.F.R., sequence information contained in an electronic file named: 1568390_100WO2_Sequence_Listing_ST25.txt; 24.4 KB in size; created on September 3, 2017 using Patent-In 3.5, and Checker 4.4.0, is incorporated here in its entirety by reference.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИPRIOR ART

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИFIELD OF TECHNOLOGY

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим терапевтический полипептид с нейропротективным действием (нейропротективный полипептид, полипептид-нейропротектор), такой как, например, глюкагоноподобный пептид-1 (GLP-1), эксендин-4 и/или их пептидные аналоги. В частности, настоящее изобретение относится к способам поддержания в плазме стационарного уровня нейропротективного терапевтического полипептида для облегчения доставки в головной мозг через гематоэнцефалический барьер (ВВВ) для лечения нейродегенеративного состояния.The present invention relates to compositions containing a neuroprotective therapeutic polypeptide (neuroprotective polypeptide, neuroprotective polypeptide), such as, for example, glucagon-like peptide-1 (GLP-1), exendin-4 and/or their peptide analogs. In particular, the present invention relates to methods for maintaining a steady state plasma level of a neuroprotective therapeutic polypeptide to facilitate delivery to the brain across the blood-brain barrier (BBB) for the treatment of a neurodegenerative condition.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE INVENTION

Глюкагоноподобный пептид-1 (GLP-1), гормон, обычно секретируемый нейроэндокринными клетками кишечника в ответ на пищу, был предложен в качестве нового средства лечения диабета 2 типа (Gutniak et al., 1992; Nauck et al., 1993). Он увеличивает выброс инсулина бета-клетками даже у субъектов с длительно текущим диабетом 2 типа (Nauck et al., 1993). Лечение GLP-1 имеет преимущество перед инсулинотерапией, поскольку GLP-1 стимулирует эндогенную секрецию инсулина, которая выключается при снижении уровня глюкозы в крови (Nauck et al., 1993; Elahi et al., 1994). GLP-1 способствует эугликемии путем увеличения выброса и синтеза инсулина, ингибирования выброса глюкагона и уменьшения опорожнения желудка (Nauck et al., 1993; Elahi et al., 1994; Wills et al., 1996; Nathan et al., 1992; De Ore et al., 1997). GLP-1 является продуктом посттрансляционной модификации проглюкагона. Последовательности GLP-1 и его активных фрагментов амида GLP-1 (7-37) и GLP-1 (7-36) известны в данной области техники (Fehmann et al., 1995). Хотя GLP-1 был предложен в качестве терапевтического средства при лечении диабета, он имеет короткий период полувыведения из организма (De Ore et al., 1997), даже когда он вводится болюсно подкожно (Ritzel et al., 1995). Расщепление GLP-1 (и амида GLP-1 (7-36)), частично, происходит из-за фермента дипептидилпептидазы (DPP 1V), который расщепляет полипептид между аминокислотами 8 и 9 (аланином и глутаминовой кислотой).Glucagon-like peptide-1 (GLP-1), a hormone normally secreted by intestinal neuroendocrine cells in response to food, has been proposed as a new treatment for type 2 diabetes (Gutniak et al., 1992; Nauck et al., 1993). It increases beta-cell insulin release even in subjects with long-term type 2 diabetes (Nauck et al., 1993). GLP-1 treatment has an advantage over insulin therapy because GLP-1 stimulates endogenous insulin secretion, which is turned off when blood glucose levels decrease (Nauck et al., 1993; Elahi et al., 1994). GLP-1 promotes euglycemia by increasing insulin release and synthesis, inhibiting glucagon release, and decreasing gastric emptying (Nauck et al., 1993; Elahi et al., 1994; Wills et al., 1996; Nathan et al., 1992; De Ore et al., 1997). GLP-1 is a post-translational modification of proglucagon. The sequences of GLP-1 and its active amide fragments GLP-1 (7-37) and GLP-1 (7-36) are known in the art (Fehmann et al., 1995). Although GLP-1 has been proposed as a therapeutic agent in the treatment of diabetes, it has a short half-life in the body (De Ore et al., 1997), even when administered as a subcutaneous bolus (Ritzel et al., 1995). Cleavage of GLP-1 (and GLP-1 amide (7-36)), in part, is due to the enzyme dipeptidyl peptidase (DPP 1V), which cleaves the polypeptide between amino acids 8 and 9 (alanine and glutamic acid).

Эксендин-4 представляет собой полипептид, продуцируемый в слюнных железах ящерицы Гила-монстра (Goke et al., 1993). Аминокислотная последовательность для эксендина-4 известна в данной области техники (Fehmann et al. 1995). Хотя он является продуктом уникального гена не млекопитающего и, по-видимому, экспрессируется только в слюнной железе (Chen and Drucker, 1997), эксендин-4 гомологичен по аминокислотной последовательности на 52% GLP-1, и у млекопитающих он взаимодействует с рецептором для GLP-1 (Goke et al., 1993; Thorens et al., 1993). In vitro было показано, что эксендин-4 стимулирует секрецию инсулина продуцирующими инсулин клетками, и, при введении в эквимолярных количествах, является более сильным, чем GLP-1, в плане вывоза выброса инсулина из продуцирующих инсулин клеток. Кроме того, эксендин-4 мощно стимулирует выброс инсулина для снижения уровней глюкозы в плазме как у грызунов, так и у людей и действует дольше, чем GLP-1. Однако, поскольку эксендин-4 не встречается в природе у млекопитающих, он обладает некоторыми потенциальными антигенными свойствами у млекопитающих, у которых отсутствует GLP-1.Exendin-4 is a polypeptide produced in the salivary glands of the Gila monster lizard (Goke et al., 1993). The amino acid sequence for exendin-4 is known in the art (Fehmann et al. 1995). Although it is the product of a unique non-mammalian gene and appears to be expressed only in the salivary gland (Chen and Drucker, 1997), exendin-4 is 52% homologous in amino acid sequence to GLP-1, and in mammals it interacts with the receptor for GLP -1 (Goke et al., 1993; Thorens et al., 1993). Exendin-4 has been shown in vitro to stimulate insulin secretion by insulin producing cells and, when administered in equimolar amounts, is more potent than GLP-1 in clearing insulin release from insulin producing cells. In addition, exendin-4 potently stimulates insulin release to lower plasma glucose levels in both rodents and humans and lasts longer than GLP-1. However, because exendin-4 does not occur naturally in mammals, it has some potential antigenic properties in mammals that lack GLP-1.

В дополнение к снижению продукции инсулина, которое происходит при диабете, диабет обычно сопровождается периферической нейропатией. У двадцати-тридцати процентов всех субъектов, страдающих диабетом, в конечном итоге развивается периферическая нейропатия. Кроме того, имеются сообщения о повышенном риске развития болезни Альцгеймера с заболеванием сердечнососудистой системы, инсультом, гипертонией и диабетом (Moceri et al., 2000; Ott et al., 1999). Таким образом, диабет является заболеванием, которое также сопровождается нейродегенеративными заболеваниями.In addition to the decrease in insulin production that occurs in diabetes, diabetes is usually accompanied by peripheral neuropathy. Twenty to thirty percent of all diabetic subjects eventually develop peripheral neuropathy. In addition, there are reports of an increased risk of developing Alzheimer's disease with cardiovascular disease, stroke, hypertension and diabetes (Moceri et al., 2000; Ott et al., 1999). Thus, diabetes is a disease that is also accompanied by neurodegenerative diseases.

Рецептор для GLP-1 присутствует в головном мозге как грызунов (Jin et al. 1988, Shughrue et al. 1996, Jia et al. 2015), так и человека (Wei and Mojsov 1995, Satoh et al. 2000). Хемоархитектура распределения, по-видимому, в значительной степени ограничивается гипоталамусом, таламусом, стволом головного мозга, латеральной перегородкой, субфорникальным органом и самым задним полем, всеми околожелудочковыми областями, где обычно находится большое количество рецепторов для пептидов. Однако сайты специфического связывания для GLP-1 были также обнаружены по всему дорсолатеральному отделу полосатого тела, коре головного мозга и мозжечку (Campos et al. 1994, Calvo et al. 1995 и Goke et al. 1995), хотя и в более низких плотностях. Например, Lu и др. (2014) продемонстрировали, что рецептор GLP-1 экспрессируется в миндалине, мозжечке, лобной коре, гиппокампе, гипоталамусе, среднем мозге, мозговом веществе, мостах, полосатом теле, таламусе и височной коре Mustela putorius furo (хорьков). Уровень экспрессии рецептора GLP-1 в головном мозге не зависит от старения.The receptor for GLP-1 is present in the brain of both rodents (Jin et al. 1988, Shughrue et al. 1996, Jia et al. 2015) and humans (Wei and Mojsov 1995, Satoh et al. 2000). The chemoarchitecture of distribution appears to be largely limited to the hypothalamus, thalamus, brainstem, lateral septum, subfornical organ, and posteriormost field, all periventricular regions where a large number of receptors for peptides are typically found. However, specific binding sites for GLP-1 have also been found throughout the dorsolateral striatum, cortex and cerebellum (Campos et al. 1994, Calvo et al. 1995 and Goke et al. 1995), albeit at lower densities. For example, Lu et al. (2014) demonstrated that the GLP-1 receptor is expressed in the amygdala, cerebellum, frontal cortex, hippocampus, hypothalamus, midbrain, medulla, pons, striatum, thalamus, and temporal cortex of Mustela putorius furo (ferrets) . The expression level of the GLP-1 receptor in the brain is independent of aging.

Кроме того, было установлено, что GLP-1 имеет отношение к познанию и поведению (During et al. 2003). На самом деле, в ряде исследований агонисты рецептора GLP-1 были предложены в качестве нового средства лечения нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, черепно-мозговые травмы, инсульт и периферическую нейропатию. Однако доставка лекарственных средств в центральную нервную систему (ЦНС) через гематоэнцефалический барьер (ВВВ) является существенным препятствием для лечения заболеваний, связанных с ЦНС. Например, GLP-1 имеет короткий период полужизни, равный 1-2 минутам, а слитый белок GLP-1-трансферрин (GLP-1-Tf), который был получен для противодействия инактивации и, таким образом, для увеличения периода полужизни GLP-1 до приблизительно 2 дней, неспособен пересечь BBB (Kim et al. 2010 и Martin et al. 2012).In addition, GLP-1 has been shown to be related to cognition and behavior (During et al . 2003). In fact, GLP-1 receptor agonists have been proposed in a number of studies as a novel treatment for neurodegenerative diseases, including Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Huntington's disease, traumatic brain injury, stroke, and peripheral neuropathy. However, drug delivery to the central nervous system (CNS) across the blood-brain barrier (BBB) is a significant barrier to the treatment of CNS-related diseases. For example, GLP-1 has a short half-life of 1-2 minutes, and the GLP-1-transferrin fusion protein (GLP-1-Tf), which was developed to counteract inactivation and thus increase the half-life of GLP-1 up to about 2 days, unable to cross the BBB (Kim et al . 2010 and Martin et al . 2012).

Кроме того, хотя было установлено, что эксендин-4 улучшает выполнение теста вращающегося стержня по сравнению с GLP-1-Tf (Martin et al. 2012) и, как известно, проникает в головной мозг из крови, скорость проникновения ограничена (Kastin AJ and Akeerstrom V, International Journal of Obesity (2003) 27, 313-318). Кроме того, было установлено, что эксенатид неэффективен в обеспечении нейропротекции в модели на мыши для болезни Паркинсона в результате воздействия MPTP, когда он предоставляется после воздействий, ежедневно в течение семи дней (Liu et al. 2015).In addition, while exendin-4 has been found to improve roll bar test performance compared to GLP-1-Tf (Martin et al. 2012) and is known to enter the brain from the blood, the rate of penetration is limited (Kastin AJ and Akeerstrom V, International Journal of Obesity (2003) 27, 313-318). In addition, exenatide was found to be ineffective in providing neuroprotection in a mouse model for Parkinson's disease following MPTP exposure when given post-exposure daily for seven days (Liu et al. 2015).

Таким образом, в данной области техники существует потребность в способе лечения нейродегенеративных состояний, а также в способе поддержания стационарного уровня в плазме нейропротективного агониста рецептора GLP-1, тем самым облегчая и стимулируя доставку лекарственного средства в центральную нервную систему через BBB.Thus, there is a need in the art for a method of treating neurodegenerative conditions, as well as a method for maintaining a steady state plasma level of a neuroprotective GLP-1 receptor agonist, thereby facilitating and stimulating drug delivery to the central nervous system via the BBB.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE PRESENT INVENTION

В одном аспекте настоящего изобретения предложен способ доставки нейропротективного полипептида по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) субъекта. Способ включает введение в системный кровоток субъекта терапевтически эффективного количества нейропротективного полипептида с помощью состава с контролируемым высвобождением или устройства, обеспечивающего замедленное высвобождение или долговременную доставку нейропротективного полипептида, при этом нейропротективный полипептид включает по меньшей мере один нейропротективный полипептид, выбираемый из группы, состоящей из GLP-1, эксендина-4 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина-4, причем нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина-4 или их комбинации; и причем нейропротективный состав с контролируемым высвобождением или замедленное высвобождение нейропротективного полипептида усиливает доставку и/или ввод нейропротективного полипептида через гематоэнцефалический барьер (ВВВ) субъекта по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) по сравнению с составом с быстрым высвобождением нейропротективного пептида.In one aspect, the present invention provides a method for delivering a neuroprotective polypeptide to at least a portion of the central nervous system (CNS) of a subject. The method includes administering to the subject's systemic circulation a therapeutically effective amount of a neuroprotective polypeptide using a controlled release formulation or device that provides sustained release or sustained delivery of the neuroprotective polypeptide, wherein the neuroprotective polypeptide comprises at least one neuroprotective polypeptide selected from the group consisting of GLP- 1, exendin-4 or a therapeutically effective GLP-1 analog or exendin-4, wherein the neuroprotective polypeptide binds to and activates a receptor that binds at least one of GLP-1, exendin-4, or combinations thereof; and wherein the controlled release or sustained release neuroprotective polypeptide formulation enhances delivery and/or entry of the neuroprotective polypeptide across the blood-brain barrier (BBB) of a subject to at least a portion of the central nervous system (CNS) compared to a fast release neuroprotective peptide formulation.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения субъекта с заболеванием, связанным с центральной нервной системой (ЦНС), или ослабления по меньшей мере одного симптома заболевания, связанного с ЦНС, у субъекта, нуждающегося в этом. Способ включает введение в системный кровоток субъекта терапевтически эффективного количества нейропротективного полипептида с помощью состава с контролируемым высвобождением или устройства, обеспечивающего замедленное высвобождение или долговременную доставку нейропротективного полипептида, причем нейропротективный полипептид включает по меньшей мере один нейропротективный полипептид, выбираемый из группы, состоящей из GLP-1, эксендина-4 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина-4, причем нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина-4 или их комбинации; и причем нейропротективный состав с контролируемым высвобождением или устройство усиливает доставку нейропротективного полипептида через гематоэнцефалический барьер (ВВВ) субъекта по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) по сравнению с составом с быстрым высвобождением нейропротективного пептида.In another aspect of the present invention, there is provided a method of treating a subject with a central nervous system (CNS) related disease or ameliorating at least one symptom of a CNS related disease in a subject in need thereof. The method includes administering to the subject's systemic circulation a therapeutically effective amount of a neuroprotective polypeptide using a controlled release formulation or device providing sustained release or sustained delivery of the neuroprotective polypeptide, the neuroprotective polypeptide comprising at least one neuroprotective polypeptide selected from the group consisting of GLP-1 , exendin-4, or a therapeutically effective GLP-1 analog or exendin-4, wherein the neuroprotective polypeptide binds to and activates a receptor that binds at least one of GLP-1, exendin-4, or combinations thereof; and wherein the controlled release neuroprotective formulation or device enhances delivery of the neuroprotective polypeptide across the subject's blood-brain barrier (BBB) to at least a portion of the central nervous system (CNS) compared to a fast release neuroprotective peptide formulation.

В одном аспекте настоящего изобретения предложен способ доставки нейропротективного полипептида по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) субъекта. Способ включает введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением в системный кровоток субъекта. В одном варианте осуществления нейропротективный состав с контролируемым высвобождением включает по меньшей мере один нейропротективный полипептид, выбираемый из группы, состоящей из GLP-1, эксендина (например, эксендина-4) или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина (например, аналога эксендина-4), причем нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина (такого как эксендин-4) или их комбинации, и нейропротективный состав с контролируемым высвобождением усиливает доставку нейропротективного полипептида через гематоэнцефалический барьер (ВВВ) субъекта по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) по сравнению с составом с быстрым высвобождением нейропротективного полипептида.In one aspect, the present invention provides a method for delivering a neuroprotective polypeptide to at least a portion of the central nervous system (CNS) of a subject. The method includes administering the controlled release neuroprotective formulation to the subject's systemic circulation. In one embodiment, the controlled release neuroprotective formulation comprises at least one neuroprotective polypeptide selected from the group consisting of GLP-1, exendin (e.g., exendin-4), or a therapeutically effective GLP-1 analog or exendin (e.g., exendin-4 analog). 4), wherein the neuroprotective polypeptide binds to and activates a receptor that binds at least one of GLP-1, exendin (such as exendin-4), or combinations thereof, and the controlled release neuroprotective formulation enhances delivery of the neuroprotective polypeptide across the blood-brain barrier (BBB) of the subject to at least a portion of the central nervous system (CNS) compared to a fast release neuroprotective polypeptide formulation.

В некоторых вариантах осуществления состав с контролируемым высвобождением представляет собой состав нейропротективного полипептида длительного действия.In some embodiments, the controlled release formulation is a long acting neuroprotective polypeptide formulation.

В других вариантах осуществления состав длительного действия включает депо-состав для замедленного высвобождения нейропротективного полипептида.In other embodiments, the long acting formulation comprises a depot formulation for sustained release of a neuroprotective polypeptide.

В конкретных вариантах осуществления состав длительного действия включает композицию для замедленного высвобождения нейропротективного полипептида.In specific embodiments, the long acting formulation comprises a sustained release formulation for a neuroprotective polypeptide.

В дополнительных вариантах осуществления состав с контролируемым высвобождением, кроме того, содержит биоразлагаемый полимер с определенной вязкостью и материалы покрытия, обладая биодоступностью и замедленным высвобождением нейропротективного полипептида в эффективной концентрации в течение определенного периода времени.In additional embodiments, the controlled release formulation further comprises a biodegradable polymer with a defined viscosity and coating materials, bioavailable and sustained release of the neuroprotective polypeptide at an effective concentration over a defined period of time.

В конкретных вариантах осуществления нейропротективный состав с контролируемым высвобождением включает: микросферу с контролируемым высвобождением, которая включает ядро с нейропротективным полипептидом и биоразлагаемым полимером; и слой покрытия, который покрывает ядро.In specific embodiments, the controlled release neuroprotective formulation comprises: a controlled release microsphere that includes a core with a neuroprotective polypeptide and a biodegradable polymer; and a coating layer that covers the core.

В одном варианте осуществления введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением ослабляет по меньшей мере один симптом по меньшей мере одного связанного с ЦНС состояния у субъекта.In one embodiment, administration of the controlled release neuroprotective formulation ameliorates at least one symptom of at least one CNS-related condition in a subject.

В дальнейших вариантах осуществления связанное с ЦНС состояние выбирают из группы, состоящей из болезни Паркинсона (PD), черепно-мозговой травмы (TBI), рассеянного склероза, наркомании, алкогольной зависимости, нейродегенеративных состояний, воспаления головного мозга, болезни Альцгеймера (AD), множественной системной атрофии, болезни Хантингтона, хронической травматической энцефалопатии (CTE), заболеваний двигательных нейронов (например, бокового амиотрофического склероза, повреждения спинного мозга, спиноцеребеллярной атаксии (SCA), атрофии мышц позвоночника (SMA)), сосудистой деменции, деменции с тельцами Леви (DLB), смешанной деменции, лобно-височной деменции, болезни Крейтцфельда-Якоба, гидроцефалии нормального давления или их комбинации.In further embodiments, the CNS-related condition is selected from the group consisting of Parkinson's disease (PD), traumatic brain injury (TBI), multiple sclerosis, drug addiction, alcohol addiction, neurodegenerative conditions, brain inflammation, Alzheimer's disease (AD), multiple systemic atrophy, Huntington's disease, chronic traumatic encephalopathy (CTE), motor neuron diseases (eg, amyotrophic lateral sclerosis, spinal cord injury, spinocerebellar ataxia (SCA), spinal muscle atrophy (SMA)), vascular dementia, dementia with Lewy bodies (DLB ), mixed dementia, frontotemporal dementia, Creutzfeldt-Jakob disease, normal pressure hydrocephalus, or a combination thereof.

В некотором варианте осуществления введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением включает инъекцию нейропротективного состава с контролируемым высвобождением.In some embodiment, administration of the controlled release neuroprotective formulation comprises injecting the controlled release neuroprotective formulation.

В дополнительных вариантах осуществления инъекция нейропротективного состава с контролируемым высвобождением представляет собой подкожную инъекцию. Например, введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением может включать подкожную инъекцию нейропротективного состава с контролируемым высвобождением.In further embodiments, the injection of the controlled release neuroprotective formulation is a subcutaneous injection. For example, administration of the controlled release neuroprotective formulation may include subcutaneous injection of the controlled release neuroprotective formulation.

В другом варианте осуществления введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением приводит к стационарной концентрации нейропротективного полипептида в плазме в диапазоне от приблизительно 50 до приблизительно 4500 пг/мл.In another embodiment, administration of the controlled release neuroprotective formulation results in a steady state plasma concentration of the neuroprotective polypeptide in the range of about 50 to about 4500 pg/mL.

В других вариантах осуществления введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением приводит к нарастающему увеличению концентрации нейропротективного полипептида в спинномозговой жидкости (CSF), головном мозге или их комбинации у субъекта.In other embodiments, administration of the controlled release neuroprotective formulation results in an incremental increase in the concentration of the neuroprotective polypeptide in the cerebrospinal fluid (CSF), brain, or combination thereof in the subject.

В конкретных вариантах осуществления концентрация нейропротективного полипептида в CSF находится в диапазоне от приблизительно 5 до приблизительно 400 пг/мл (например, от приблизительно 10 до приблизительно 400 пг/мл).In specific embodiments, the concentration of the neuroprotective polypeptide in CSF is in the range of from about 5 to about 400 pg/ml (eg, from about 10 to about 400 pg/ml).

В дополнительном аспекте предложен способ лечения субъекта с заболеванием, связанным с ЦНС, или ослабления по меньшей мере одного симптома заболевания, связанного с ЦНС, у субъекта, нуждающегося в этом. Способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества нейропротективного состава с контролируемым высвобождением в системный кровоток субъекта. Нейропротективный состав с контролируемым высвобождением включает по меньшей мере один нейропротективный полипептид, выбираемый из группы, состоящей из GLP-1, эксендина (такого как эксендин-4) или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина (такого как эксендин-4); нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина (например, эксендина-4) или их комбинации; и нейропротективный состав с контролируемым высвобождением усиливает доставку нейропротективного полипептида через BBB субъекта по меньшей мере в часть ЦНС по сравнению с составом с быстрым высвобождением нейропротективного полипептида.In a further aspect, a method is provided for treating a subject with a CNS related disease or for alleviating at least one symptom of a CNS related disease in a subject in need thereof. The method includes administering to a subject a therapeutically effective amount of a controlled release neuroprotective formulation into the subject's systemic circulation. The controlled release neuroprotective formulation comprises at least one neuroprotective polypeptide selected from the group consisting of GLP-1, exendin (such as exendin-4), or a therapeutically effective GLP-1 analogue or exendin (such as exendin-4); the neuroprotective polypeptide binds to and activates a receptor that binds at least one of GLP-1, exendin (eg, exendin-4), or combinations thereof; and the controlled release neuroprotective formulation enhances delivery of the neuroprotective polypeptide through the subject's BBB to at least a portion of the CNS compared to a fast release formulation of the neuroprotective polypeptide.

В дополнительных вариантах осуществления состав длительного действия включает композицию для замедленного высвобождения нейропротективного полипептида.In additional embodiments, the long acting formulation comprises a sustained release formulation for a neuroprotective polypeptide.

В конкретном варианте осуществления введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением ослабляет по меньшей мере один симптом по меньшей мере одного связанного с ЦНС состояния у субъекта.In a particular embodiment, administration of the controlled release neuroprotective formulation ameliorates at least one symptom of at least one CNS-related condition in the subject.

В одном варианте осуществления связанное с ЦНС состояние выбирают из группы, состоящей из болезни Паркинсона (PD), черепно-мозговой травмы (TBI), рассеянного склероза, наркомании, алкогольной зависимости, нейродегенеративных состояний, воспаления головного мозга, болезни Альцгеймера (AD), множественной системной атрофии, болезни Хантингтона, хронической травматической энцефалопатии, заболеваний двигательных нейронов (например, бокового амиотрофического склероза, повреждения спинного мозга, спиноцеребеллярной атаксии (SCA), атрофии мышц позвоночника (SMA)), сосудистой деменции, деменции с тельцами Леви (DLB), смешанной деменции, лобно-височной деменции, болезни Крейтцфельда-Якоба, гидроцефалии нормального давления или их комбинации.In one embodiment, the CNS-related condition is selected from the group consisting of Parkinson's disease (PD), traumatic brain injury (TBI), multiple sclerosis, drug addiction, alcohol addiction, neurodegenerative conditions, brain inflammation, Alzheimer's disease (AD), multiple systemic atrophy, Huntington's disease, chronic traumatic encephalopathy, motor neuron diseases (eg, amyotrophic lateral sclerosis, spinal cord injury, spinocerebellar ataxia (SCA), spinal muscle atrophy (SMA)), vascular dementia, dementia with Lewy bodies (DLB), mixed dementia, frontotemporal dementia, Creutzfeldt-Jakob disease, normal pressure hydrocephalus, or combinations thereof.

В дальнейших вариантах осуществления введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением включает инъекцию нейропротективного состава с контролируемым высвобождением субъекту.In further embodiments, administration of the controlled release neuroprotective formulation comprises injecting the controlled release neuroprotective formulation into a subject.

В некоторых вариантах осуществления инъекция нейропротективного состава с контролируемым высвобождением субъекту представляет собой подкожную инъекцию.In some embodiments, the injection of the controlled release neuroprotective formulation into the subject is a subcutaneous injection.

В дополнительных вариантах осуществления введение состава с контролируемым высвобождением приводит к стационарной концентрации нейропротективного полипептида в плазме, которая находится в диапазоне от приблизительно 50 до приблизительно 4500 пг/мл.In additional embodiments, administration of the controlled release formulation results in a steady state plasma concentration of the neuroprotective polypeptide that is in the range of about 50 to about 4500 pg/mL.

В некоторых вариантах осуществления введение состава с контролируемым высвобождением приводит к нарастающему увеличению концентрации нейропротективного полипептида в по меньшей мере одном из спинномозговой жидкости (CSF), головного мозга или их комбинации.In some embodiments, administration of the controlled release formulation results in progressive increases in the concentration of the neuroprotective polypeptide in at least one of the cerebrospinal fluid (CSF), the brain, or a combination thereof.

В дальнейшем аспекте предложен способ доставки нейропротективного полипептида по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) субъекта. Способ включает: обеспечение долговременной доставки в системный кровоток субъекта по меньшей мере одного нейропротективного полипептида, выбираемого из группы, состоящей из GLP-1, эксендина-4 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина-4, причем нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина-4 или их комбинации; и причем нейропротективный состав с контролируемым высвобождением усиливает доставку и/или ввод нейропротективного полипептида через гематоэнцефалический барьер (BBB) субъекта по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) по сравнению с составом с быстрым высвобождением нейропротективного пептида.In a further aspect, a method for delivering a neuroprotective polypeptide to at least a portion of the central nervous system (CNS) of a subject is provided. The method includes: providing long-term delivery to the subject's systemic circulation of at least one neuroprotective polypeptide selected from the group consisting of GLP-1, exendin-4 or a therapeutically effective analogue of GLP-1 or exendin-4, wherein the neuroprotective polypeptide binds to and activates the receptor, which binds at least one of GLP-1, exendin-4, or combinations thereof; and wherein the controlled release neuroprotective formulation enhances the delivery and/or entry of the neuroprotective polypeptide across the blood-brain barrier (BBB) of the subject to at least a portion of the central nervous system (CNS) compared to the rapid release neuroprotective peptide formulation.

В еще одном аспекте предложен способ лечения субъекта с заболеванием, связанным с центральной нервной системой (ЦНС), или ослабления по меньшей мере одного симптома заболевания, связанного с ЦНС, у субъекта, нуждающегося в этом. Способ включает: обеспечение долговременной доставки в системный кровоток субъекта по меньшей мере одного нейропротективного полипептида, выбираемого из группы, состоящей из GLP-1, эксендина-4 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина-4, причем нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина-4 или их комбинации; и причем нейропротективный состав с контролируемым высвобождением усиливает доставку нейропротективного полипептида через гематоэнцефалический барьер (ВВВ) субъекта по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) по сравнению с составом с быстрым высвобождением нейропротективного полипептида.In yet another aspect, a method is provided for treating a subject with a disease associated with the central nervous system (CNS), or alleviating at least one symptom of a disease associated with the CNS, in a subject in need thereof. The method includes: providing long-term delivery to the subject's systemic circulation of at least one neuroprotective polypeptide selected from the group consisting of GLP-1, exendin-4 or a therapeutically effective analogue of GLP-1 or exendin-4, wherein the neuroprotective polypeptide binds to and activates the receptor, which binds at least one of GLP-1, exendin-4, or combinations thereof; and wherein the controlled release neuroprotective formulation enhances delivery of the neuroprotective polypeptide across the blood-brain barrier (BBB) of the subject to at least a portion of the central nervous system (CNS) as compared to the rapid release formulation of the neuroprotective polypeptide.

В одном варианте осуществления обеспечение нейропротективного полипептида или полипептидов с замедленным высвобождением включает введение полипептида(ов) с помощью устройства (например, насоса, мини-насоса, осмотического насоса, осмотического устройства доставки, инфузионного насоса, устройство для внутривенного введения, перистальтического насоса, миниатюрного инфузионного насоса или т.п.).In one embodiment, providing the neuroprotective sustained release polypeptide or polypeptides comprises administering the polypeptide(s) using a device (e.g., pump, minipump, osmotic pump, osmotic delivery device, infusion pump, intravenous device, peristaltic pump, miniature infusion pump or the like).

В некоторых вариантах осуществления нейропротективный полипептид или полипептиды вводят со скоростью от приблизительно 1 пМ/кг/мин до приблизительно 30 пМ/кг/мин (например, от приблизительно 3 пМ/кг/мин до приблизительно 17,5 пМ/кг/мин).In some embodiments, the neuroprotective polypeptide or polypeptides are administered at a rate of from about 1 pM/kg/min to about 30 pM/kg/min (eg, from about 3 pM/kg/min to about 17.5 pM/kg/min).

В других вариантах осуществления введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением или обеспечение долговременной доставки нейропротективного полипептида ослабляет по меньшей мере один симптом по меньшей мере одного связанного с ЦНС состояния у субъекта.In other embodiments, administering a controlled release neuroprotective formulation or providing long term delivery of a neuroprotective polypeptide ameliorates at least one symptom of at least one CNS related condition in a subject.

В конкретных вариантах осуществления связанное с ЦНС состояние выбирают из группы, состоящей из болезни Паркинсона (PD), черепно-мозговой травмы (TBI), рассеянного склероза, наркомании, алкогольной зависимости, нейродегенеративных состояний, воспаления головного мозга, болезни Альцгеймера (AD), множественной системной атрофии, болезни Хантингтона, хронической травматической энцефалопатии, заболеваний двигательных нейронов (например, бокового амиотрофического склероза, повреждения спинного мозга, спиноцеребеллярной атаксии (SCA), атрофии мышц позвоночника (SMA)), сосудистой деменции, деменции с тельцами Леви (DLB), смешанной деменции, лобно-височной деменции, болезни Крейтцфельда-Якоба, гидроцефалии нормального давления или их комбинации.In specific embodiments, the CNS-related condition is selected from the group consisting of Parkinson's disease (PD), traumatic brain injury (TBI), multiple sclerosis, drug addiction, alcohol addiction, neurodegenerative conditions, brain inflammation, Alzheimer's disease (AD), multiple systemic atrophy, Huntington's disease, chronic traumatic encephalopathy, motor neuron diseases (eg, amyotrophic lateral sclerosis, spinal cord injury, spinocerebellar ataxia (SCA), spinal muscle atrophy (SMA)), vascular dementia, dementia with Lewy bodies (DLB), mixed dementia, frontotemporal dementia, Creutzfeldt-Jakob disease, normal pressure hydrocephalus, or combinations thereof.

В одном варианте осуществления введение состава с контролируемым высвобождением или обеспечение замедленного высвобождения нейропротективного полипептида приводит к стационарной концентрации нейропротективного полипептида в плазме, которая находится в диапазоне от приблизительно 50 до приблизительно 4500 пг/мл.In one embodiment, administering a controlled release formulation or providing sustained release of the neuroprotective polypeptide results in a steady state plasma concentration of the neuroprotective polypeptide that is in the range of about 50 to about 4500 pg/mL.

В некоторых вариантах осуществления введение состава с контролируемым высвобождением или обеспечение замедленного высвобождения нейропротективного полипептида приводит к нарастающему увеличению концентрации нейропротективного полипептида в по меньшей мере одном из спинномозговой жидкости (CSF), головного мозга или их комбинации.In some embodiments, administering the controlled release formulation or providing sustained release of the neuroprotective polypeptide results in progressive increases in the concentration of the neuroprotective polypeptide in at least one of the cerebrospinal fluid (CSF), the brain, or a combination thereof.

В еще одном варианте осуществления концентрация нейропротективного полипептида в CSF находится в диапазоне от приблизительно 5 до приблизительно 400 пг/мл.In yet another embodiment, the concentration of the neuroprotective polypeptide in the CSF is in the range of about 5 to about 400 pg/ml.

В некоторых вариантах осуществления отношение стационарной концентрации полипептида в CFS к таковой в плазме находится в диапазоне от приблизительно 0,1% до приблизительно 5%.In some embodiments, the ratio of the steady-state concentration of the polypeptide in CFS to that in plasma is in the range of about 0.1% to about 5%.

В дальнейших вариантах осуществления нейропротективный полипептид выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-55. Например, нейропротективный полипептид может включать аминокислотную последовательность, выбираемую из SEQ ID NO:1-55.In further embodiments, the implementation of the neuroprotective polypeptide is selected from the group consisting of SEQ ID NO:1-55. For example, a neuroprotective polypeptide may include an amino acid sequence selected from SEQ ID NO:1-55.

В других вариантах осуществления аналог эксендина-4 представлен химической формулой I или его фармацевтически приемлемой солью:In other embodiments, the exendin-4 analog is represented by the chemical formula I or a pharmaceutically acceptable salt thereof:

Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Ala Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28-Z₁, (Химическая формула I),Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Ala Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 _Xaa27

где:Where:

Xaa1 представляет собой His, Arg, Tyr, Ala, Norval, Val, Norleu или 4-имидазопропионил;Xaa1 is His, Arg, Tyr, Ala, Norval, Val, Norleu, or 4-imidazopropionyl;

Xaa2 представляет собой Ser, Gly, Ala или Thr;Xaa2 is Ser, Gly, Ala or Thr;

Xaa3 представляет собой Ala, Asp или Glu;Xaa3 is Ala, Asp or Glu;

Xaa4 представляет собой Ala, Norval, Val, Norleu или Gly;Xaa4 is Ala, Norval, Val, Norleu, or Gly;

Xaa5 представляет собой Ala или Thr;Xaa5 is Ala or Thr;

Xaa6 представляет собой Ala, Phe, Tyr или нафтилаланин;Xaa6 is Ala, Phe, Tyr or naphthylalanine;

Xaa7 представляет собой Thr или Ser;Xaa7 is Thr or Ser;

Xaa8 представляет собой Ala, Ser или Thr;Xaa8 is Ala, Ser or Thr;

Xaa9 представляет собой Ala, Norval, Val, Norleu, Asp или Glu;Xaa9 is Ala, Norval, Val, Norleu, Asp, or Glu;

Xaa10 представляет собой Ala, Leu, Ile, Val, пентилглицин или Met;Xaa10 is Ala, Leu, Ile, Val, pentylglycine, or Met;

Xaa11 представляет собой Ala или Ser;Xaa11 is Ala or Ser;

Xaa12 представляет собой Ala или Lys;Xaa12 is Ala or Lys;

Xaa13 представляет собой Ala или Gln;Xaa13 is Ala or Gln;

Xaa14 представляет собой Ala, Leu, Ile, пентилглицин, Val, или Met;Xaa14 is Ala, Leu, Ile, pentylglycine, Val, or Met;

Xaa15 представляет собой Ala или Glu;Xaa15 is Ala or Glu;

Xaa16 представляет собой Ala или Glu;Xaa16 is Ala or Glu;

Xaa17 представляет собой Ala или Glu;Xaa17 is Ala or Glu;

Xaa19 представляет собой Ala или Val;Xaa19 is Ala or Val;

Xaa20 представляет собой Ala или Arg;Xaa20 is Ala or Arg;

Xaa21 представляет собой Ala, Leu или Lys-NHε-R, где R представляет собой Lys, Arg или С1-С10 алканоил с прямой или разветвленной цепью;Xaa21 is Ala, Leu or Lys-NHε-R, where R is Lys, Arg or C1-C10 straight or branched chain alkanoyl;

Xaa22 представляет собой Ala, Phe, Tyr или нафтилаланин;Xaa22 is Ala, Phe, Tyr or naphthylalanine;

Xaa23 представляет собой Ile, Val, Leu, пентилглицин, трет-бутилглицин или Met;Xaa23 is Ile, Val, Leu, pentylglycine, t-butylglycine, or Met;

Xaa24 представляет собой Ala, Glu или Asp;Xaa24 is Ala, Glu or Asp;

Xaa25 представляет собой Ala, Trp, Phe, Tyr или нафтилаланин;Xaa25 is Ala, Trp, Phe, Tyr, or naphthylalanine;

Xaa26 представляет собой Ala или Leu;Xaa26 is Ala or Leu;

Xaa27 представляет собой Ala или Lys;Xaa27 is Ala or Lys;

Xaa28 представляет собой Ala или Asn; иXaa28 is Ala or Asn; And

Z₁ представляет собой -OH, -NH₂, Gly-Z₂, Gly Gly-Z₂, Gly Gly Xaa31-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38-Z₂ или Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38 Xaa39-Z₂,Z ₁ is -OH, -NH ₂ , Gly-Z ₂ , Gly Gly-Z ₂ , Gly Gly Xaa31-Z ₂ , Gly Gly Xaa31 Ser-Z ₂ , Gly Gly Xaa31 Ser Ser-Z ₂ , Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly-Z ₂ , Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala-Z ₂ , Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z ₂ , Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37-Z ₂ , Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38-Z ₂ or Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38 Xaa39-Z ₂ ,

Xaa31, Xaa36, Xaa37 и Xaa38 независимо выбирают из группы, состоящей из Pro, гомопролина, 3Hyp, 4Hyp, тиопролина, N-алкилглицина, N-алкилпентилглицина или N-алкилаланина, Xaa39 представляет собой Ser или Tyr (например, Ser), иXaa31, Xaa36, Xaa37 and Xaa38 are independently selected from the group consisting of Pro, homoproline, 3Hyp, 4Hyp, thioproline, N-alkylglycine, N-alkylpentylglycine or N-alkylalanine, Xaa39 is Ser or Tyr (e.g. Ser), and

Z₂ представляет собой -OH или -NH₂,Z ₂ is -OH or -NH ₂ ,

при условии, что:provided that:

не более трех из Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa8, Xaa9, Xaa10, Xaa11, Xaa12, Xaa13, Xaa14, Xaa15, Xaa16, Xaa17, Xaa19, Xaa20, Xaa21, Xaa24, Xaa25, Xaa26, Xaa27 и Xaa28 представляют собой Ala; иno more than three of Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa8, Xaa9, Xaa10, Xaa11, Xaa12, Xaa13, Xaa14, Xaa15, Xaa16, Xaa17, Xaa19, Xaa20, Xaa21, Xaa24, Xaa25, Xaa26, Xaa28 and Xaa ; And

когда Xaa1 представляет собой His, Arg или Tyr, по меньшей мере один из Xaa3, Xaa4 и Xaa9 представляет собой Ala.when Xaa1 is His, Arg or Tyr, at least one of Xaa3, Xaa4 and Xaa9 is Ala.

В других вариантах осуществления аналог эксендина-4 представлен химической формулой II или его фармацевтически приемлемой солью:In other embodiments, the exendin-4 analog is represented by the chemical formula II, or a pharmaceutically acceptable salt thereof:

Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Ala Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 X₁-Z₁, (Химическая формула II)Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 _Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 _Xaa17 Ala

где:Where:

Xaa5 представляет собой Ala или Thr;Xaa5 is Ala or Thr;

Xaa7 представляет собой Thr или Ser;Xaa7 is Thr or Ser;

Xaa11 представляет собой Ala или Ser;Xaa11 is Ala or Ser;

Xaa12 представляет собой Ala или Lys;Xaa12 is Ala or Lys;

Xaa13 представляет собой Ala или Gln;Xaa13 is Ala or Gln;

Xaa15 представляет собой Ala или Glu;Xaa15 is Ala or Glu;

Xaa16 представляет собой Ala или Glu;Xaa16 is Ala or Glu;

Xaa17 представляет собой Ala или Glu;Xaa17 is Ala or Glu;

Xaa19 представляет собой Ala или Val;Xaa19 is Ala or Val;

Xaa20 представляет собой Ala или Arg;Xaa20 is Ala or Arg;

Xaa21 представляет собой Ala, Leu или Lys-NHε-R (где R представляет собой Lys, Arg, C1-C10 алканоил с прямой или разветвленной цепью или циклоаллеил-алканоил);Xaa21 is Ala, Leu or Lys-NHε-R (wherein R is Lys, Arg, C1-C10 straight or branched alkanoyl or cycloalleyl-alkanoyl);

Xaa22 представляет собой Phe, Tyr или нафтилаланин;Xaa22 is Phe, Tyr or naphthylalanine;

Xaa26 представляет собой Ala или Leu;Xaa26 is Ala or Leu;

X₁ представляет собой Lys Asn, Asn Lys, Lys-NHε-R Asn, Asn Lys-NHε-R, Lys-NHε-R Ala, Ala Lys-NHε-R, где R представляет собой Lys, Arg, C1-C10 алканоил с прямой или разветвленной цепью или циклоалкилалканоил;X ₁ is Lys Asn, Asn Lys, Lys-NHε-R Asn, Asn Lys-NHε-R, Lys-NHε-R Ala, Ala Lys-NHε-R, where R is Lys, Arg, C1-C10 alkanoyl straight or branched chain or cycloalkylalkanoyl;

Z₁ представляет собой -OH, -NH₂, Gly-Z₂, Gly Gly-Z₂, Gly Gly Xaa31-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38-Z₂ или Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38 Xaa39-Z₂;Z ₁ is -OH, -NH ₂ , Gly-Z ₂ , Gly Gly-Z ₂ , Gly Gly Xaa31-Z ₂ , Gly Gly Xaa31 Ser-Z ₂ , Gly Gly Xaa31 Ser Ser-Z ₂ , Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly-Z ₂ , Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala-Z ₂ , Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z ₂ , Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37-Z ₂ , Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38-Z ₂ or Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38 Xaa39-Z ₂ ;

при условии, что:provided that:

не более трех из Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa8, Xaa9, Xaa10, Xaa11, Xaa12, Xaa13, Xaa14, Xaa15, Xaa16, Xaa17, Xaa19, Xaa20, Xaa21, Xaa24, Xaa25 и Xaa26 представляют собой Ala; иno more than three of Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa8, Xaa9, Xaa10, Xaa11, Xaa12, Xaa13, Xaa14, Xaa15, Xaa16, Xaa17, Xaa19, Xaa20, Xaa21, Xaa24, Xaa25 and Xaa26 are Ala; And

когда Xaa1 представляет собой His, Arg, Tyr или 4-имидазопропионил, по меньшей мере один из Xaa3, Xaa4 и Xaa9 представляет собой Ala.when Xaa1 is His, Arg, Tyr or 4-imidazopropionyl, at least one of Xaa3, Xaa4 and Xaa9 is Ala.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

Прилагаемые чертежи, которые включены в это описание и составляют его часть, иллюстрируют (один) несколько вариантов осуществления настоящего изобретения и вместе с описанием служат для объяснения принципов настоящего изобретения.The accompanying drawings, which are incorporated in and form part of this specification, illustrate (one) several embodiments of the present invention and, together with the description, serve to explain the principles of the present invention.

Фиг. 1А. График, иллюстрирующий зависимые от времени уровни эксенатида (эксендина-4) в плазме в результате однократного подкожного введения 2 мг/кг эксенатида с замедленным высвобождением (PT302) взрослым (возрастом 9 недель) самцам крыс Sprague-Dawley.Fig. 1A. Graph illustrating time-dependent plasma levels of exenatide (exendin-4) following a single subcutaneous injection of 2 mg/kg sustained release exenatide (PT302) to adult (9 weeks old) male Sprague-Dawley rats.

Фиг. 1B. График, иллюстрирующий зависимые от времени уровни эксенатида (эксендина-4) в плазме в результате однократного подкожного введения 2,4 мг/кг, 4,8 мг/кг или 9,6 мг/кг эксенатида с замедленным высвобождением (PT302) взрослым (возрастом 9 недель) самцам крыс Sprague-Dawley.Fig. 1b. Graph illustrating time-dependent plasma levels of exenatide (exendin-4) following a single subcutaneous injection of 2.4 mg/kg, 4.8 mg/kg, or 9.6 mg/kg extended-release exenatide (PT302) in adults (aged 9 weeks) to male Sprague-Dawley rats.

Фиг. 2. График, иллюстрирующий зависимые от времени уровни эксендина-4 в плазме в результате однократной подкожной инъекции эксенатида с замедленным высвобождением (PT304) в количестве 4,0 мг/кг взрослым (возрастом 9 недель) самцам крыс Sprague-Dawley.Fig. 2. Graph illustrating time-dependent plasma levels of exendin-4 following a single subcutaneous injection of 4.0 mg/kg sustained release exenatide (PT304) in adult (9 weeks old) male Sprague-Dawley rats.

Фиг. 3. График, иллюстрирующий зависимые от времени уровни эксендина-4 в плазме в течение 10-недельного периода у самцов крыс Sprague-Dawley, которым вводили либо PT302, либо PT304 в указанных количествах и периоды времени.Fig. 3. Graph illustrating time dependent plasma levels of exendin-4 over a 10 week period in male Sprague-Dawley rats treated with either PT302 or PT304 at the indicated amounts and times.

Фиг. 4А. Схема плана исследования из примера 2, в котором крысам Sprague-Dawley вводили PT302 перед односторонним поражением с помощью 6-OHDA медиального пучка переднего мозга.Fig. 4A. Schematic of the study design from Example 2 in which Sprague-Dawley rats were treated with PT302 prior to unilateral 6-OHDA medial forebrain fasciculus injury.

Фиг. 4B. График, иллюстрирующий метамфетамин-индуцированное (мет-индуцированное) вращательное поведение крыс с поражением с помощью 6-OHDA, предварительно подвергнутых лечению PT302.Fig. 4b. Graph illustrating methamphetamine-induced (meth-induced) rotational behavior in 6-OHDA-affected rats pre-treated with PT302.

Фиг. 4C. График, иллюстрирующий уровни в плазме эксендина-4 у крыс с поражением с помощью 6-OHDA, которые были предварительно подвергнутых лечению PT302.Fig. 4C. Graph illustrating plasma levels of exendin-4 in 6-OHDA-lesioned rats that were pre-treated with PT302.

Фиг. 5А. Схема плана исследования из примера 3, в котором крысам Sprague-Dawley вводили PT302 после одностороннего поражения, вызванного 6-OHDA, медиального пучка переднего мозга.Fig. 5A. Schematic of the study design from Example 3 in which PT302 was administered to Sprague-Dawley rats after a unilateral 6-OHDA injury to the medial forebrain bundle.

Фиг. 5B. График, иллюстрирующий метамфетамин-индуцированное вращательное поведение крыс с поражением с помощью 6-OHDA, которые получают последующее лечение PT302.Fig. 5b. Graph illustrating methamphetamine-induced rotational behavior in 6-OHDA-lesioned rats receiving post-treatment with PT302.

Фиг. 5С. Репрезентативные микроскопические изображения иммуногистохимического анализа тирозингидроксилазы (ТН) в полосатом теле, сделанные у крыс с односторонним поражением с помощью 6-OHDA медиального пучка переднего мозга, получающих носитель (контроль; крысы #866, #883 и #886) и PT302 (крысы #881, #875, #882). Концентрации эксендина-4 в плазме (нг/мл) отмечены для каждого животного.Fig. 5C. Representative microscopic images of immunohistochemical analysis of tyrosine hydroxylase (TH) in the striatum taken from rats with unilateral 6-OHDA lesion of the medial forebrain bundle treated with vehicle (control; rats #866, #883 and #886) and PT302 (rats #881 , #875, #882). Exendin-4 plasma concentrations (ng/ml) are noted for each animal.

Фиг. 5D. График, иллюстрирующий ТН-иммунореактивность с количественным анализом, наблюдаемую при иммуногистохимическом анализе, описанном и связанным с фиг. 5C.Fig. 5D. A graph illustrating TH-assay immunoreactivity observed in the immunohistochemical assay described and associated with FIG. 5C.

Фиг. 5Е. Репрезентативные микроскопические изображения иммуногистохимического анализа ТН в черной субстанции, сделанные у крыс с односторонним поражением с помощью 6-OHDA медиального пучка переднего мозга, получавших носитель (контроль; крысы #866, #883 и #886) и PT302 (крысы #881, #875, #882). Концентрации эксендина-4 в плазме (нг/мл) отмечены для каждого животного.Fig. 5E. Representative microscopic images of immunohistochemical analysis of TN in substantia nigra taken from rats with unilateral lesion with 6-OHDA medial forebrain bundle treated with vehicle (control; rats #866, #883 and #886) and PT302 (rats #881, #875 , #882). Plasma concentrations of exendin-4 (ng/ml) are noted for each animal.

Фиг. 5F. График, иллюстрирующий ТН-иммунореактивность с количественным анализом, наблюдаемую при иммуногистохимическом анализе, описанном и связанным с фиг. 5E.Fig. 5F. A graph illustrating TH-assay immunoreactivity observed in the immunohistochemical assay described and associated with FIG. 5E.

Фиг. 5G и 5H. Репрезентативные микроскопические изображения ТН+ нейронов, наблюдаемых на непораженной стороне головного мозга крысы.Fig. 5G and 5H. Representative microscopic images of TH+ neurons observed on the unaffected side of the rat brain.

Фиг. 5I. Репрезентативное микроскопическое изображение отсутствия ТН+ нейронов, присутствующих в черной субстанции на пораженной стороне головного мозга крысы с односторонним поражением с помощью 6-OHDA медиального пучка переднего мозга.Fig. 5I. Representative microscopic image of the absence of TH+ neurons present in the substantia nigra on the affected side of the rat brain with unilateral 6-OHDA medial forebrain fasciculus lesion.

Фиг. 5J, 5K и 5L. Репрезентативные изображения головного мозга подвергнутых лечению PT302 крыс с вызванным 6-OHDA поражением.Fig. 5J, 5K and 5L. Representative images of the brains of PT302-treated rats with 6-OHDA-induced lesion.

Фиг. 5M. График, иллюстрирующий значимую корреляцию, наблюдаемую между приведенной TH-иммунореактивностью и уровнями эксендина-4 в плазме в полосатом теле.Fig. 5M. Graph illustrating the significant correlation observed between normalized TH-immunoreactivity and plasma levels of exendin-4 in the striatum.

Фиг. 5N. График, иллюстрирующий значимую корреляцию, наблюдаемую между уровнями эксендина-4 в плазме и TH-иммунореактивностью в черной субстанции.Fig. 5N. Graph illustrating the significant correlation observed between plasma levels of exendin-4 and substantia nigra TH immunoreactivity.

Фиг. 6А. Схема плана исследования из примера 4.Fig. 6A. Outline of the study plan from example 4.

Фиг. 6B. Лечение эксендином-4 и PT302 уменьшает вращение у крыс с односторонним поражением 6-OHDA медиального пучка переднего мозга.Fig. 6b. Treatment with exendin-4 and PT302 reduces rotation in rats with unilateral 6-OHDA lesions in the medial forebrain bundle.

Фиг. 6C. Репрезентативные микроскопические изображения черной субстанции у крыс - ложных контролей, у крыс с вызванным 6-OHDA поражением, у подвергнутых лечению эксендином-4 крыс с вызванным 6-OHDA поражением и у подвергнутых лечению PT302 крыс с вызванным 6-OHDA поражением.Fig. 6C. Representative microscopic images of substantia nigra in sham control rats, 6-OHDA induced lesion rats, 6-OHDA induced exendin-4 treated rats, and PT302 treated 6-OHDA induced rats.

Фиг. 6D. График, иллюстрирующий количественные данные на фиг. 6C.Fig. 6d. A graph illustrating the quantitative data in FIG. 6C.

Фиг. 7А. Схема плана исследования из примера 5.Fig. 7A. Outline of the study plan from example 5.

Фиг. 7B. PT302 значительно снижал вращательное поведение у крыс с вызванным 6-OHDA односторонним поражением, в то время как эксендин-4 не уменьшал вращательное поведение у крыс с вызванным 6-OHDA односторонним поражением.Fig. 7B. PT302 significantly reduced rotational behavior in 6-OHDA-induced unilateral lesion rats, while exendin-4 did not reduce rotational behavior in 6-OHDA-induced unilateral lesion rats.

Фиг. 8А. Схема плана исследования из примера 6.Fig. 8A. Outline of the study plan from example 6.

Фиг 8B. График, иллюстрирующий, что PT302 значительно увеличивает время до падения с проволоки у мышей, получавших MPTP, в то время как эксендин-4 не увеличивает время до падения с проволоки.Fig 8B. Graph illustrating that PT302 significantly increases time to fall off the wire in MPTP-treated mice, while exendin-4 does not increase time to fall off the wire.

Фиг. 9А. Схема плана исследования из примера 8.Fig. 9A. Outline of the study plan from example 8.

Фиг. 9B. График, иллюстрирующий, что эксенатид с замедленным высвобождением значительно увеличивал распознавание новых объектов у мышей с легкими черепно-мозговыми травмами (mTBI).Fig. 9b. Graph illustrating that sustained release exenatide significantly increased novel object recognition in mild traumatic brain injury (mTBI) mice.

Фиг. 10А. График, иллюстрирующий, что уровни эксендина-4 в плазме поддерживаются в течение семи дней после введения PT302 и, кроме того, зависят от дозы.Fig. 10A. Graph illustrating that plasma levels of exendin-4 are maintained for seven days after administration of PT302 and furthermore are dose dependent.

Фиг. 10B. График, иллюстрирующий, что значимая разница в уровнях эксендина-4 в плазме, обусловленная введением PT302, не наблюдалась между нормальными/контрольными мышами и мышами с нанесенной mTBI.Fig. 10b. Graph illustrating that no significant difference in plasma exendin-4 levels due to PT302 administration was observed between normal/control and mTBI-coated mice.

Фиг. 10C. График, иллюстрирующий, что три разные дозы эксенатида с замедленным высвобождением (PT302: 0,024, 0,12 и 0,6 мг/кг) были способны накапливаться и поддерживаться в зависимости от времени в плазме.Fig. 10C. Graph illustrating that three different doses of sustained release exenatide (PT302: 0.024, 0.12 and 0.6 mg/kg) were able to accumulate and be maintained as a function of time in plasma.

Фиг. 11А. График, иллюстрирующий, что эксенатид с замедленным высвобождением (PT302: 0,024, 0,12 и 0,6 мг/кг) приводил к высокому предпочтению новых объектов у мышей с нанесенной mTBI по сравнению с не подвергнутыми лечению мышами с нанесенной mTBI, которые страдали от дефицита зрительной памяти и проводили меньше времени возле новых объектов; как оценено через 7 дней после нанесения mTBI с помощью парадигмы распознавания новых объектов.Fig. 11A. Graph illustrating that sustained release exenatide (PT302: 0.024, 0.12, and 0.6 mg/kg) resulted in a high preference for novel targets in mTBI coated mice compared to untreated mTBI coated mice that suffered from visual memory deficits and spent less time near new objects; as assessed 7 days after mTBI application using the novel object recognition paradigm.

Фиг. 11B. График, иллюстрирующий, что эксенатид с замедленным высвобождением (PT302: 0,024, 0,12 и 0,6 мг/кг) уменьшал дефицит пространственной памяти у мышей с нанесенной mTBI, наблюдаемый у не подвергнутых лечению мышей с нанесенной mTBI; по оценкам с помощью Y-лабиринта через 7 дней после нанесения mTBI.Fig. 11b. Graph illustrating that sustained release exenatide (PT302: 0.024, 0.12 and 0.6 mg/kg) reduced the spatial memory deficit in mTBI-coated mice observed in untreated mTBI-coated mice; as assessed by Y-maze 7 days after mTBI application.

Фиг. 11C. График, иллюстрирующий, что результаты, представленные на фиг. 11А и 11В, не были результатом поведения, подобного тревоге.Fig. 11c. A graph illustrating that the results presented in FIG. 11A and 11B were not the result of anxiety-like behavior.

Фиг. 12А. График, иллюстрирующий, что эксенатид с замедленным высвобождением (PT302: 0,12 и 0,6 мг/кг) приводит к высокому предпочтению новых объектов у мышей с нанесенной mTBI по сравнению с не подвергнутыми лечению мышами с вызовом mTBI, которые страдали от дефицита зрительной памяти и проводили меньше времени возле новых объектов; как оценено через 30 дней после нанесения mTBI с помощью парадигмы распознавания новых объектов.Fig. 12A. Graph illustrating that sustained release exenatide (PT302: 0.12 and 0.6 mg/kg) resulted in a high preference for novel objects in mTBI challenged mice compared to untreated mTBI challenged mice that suffered from visual impairment. memory and spent less time near new objects; as assessed 30 days after mTBI application using the novel object recognition paradigm.

Фиг. 12B. График, иллюстрирующий, что эксенатид с замедленным высвобождением (PT302: 0,12 и 0,6 мг/кг) уменьшал дефицит пространственной памяти у мышей с mTBI, наблюдаемый у не подвергнутых лечению мышей с нанесенной mTBI; по оценкам с помощью Y-лабиринта через 30 дней после mTBI.Fig. 12b. Graph illustrating that sustained release exenatide (PT302: 0.12 and 0.6 mg/kg) reduced the spatial memory deficit in mTBI mice observed in untreated mTBI coated mice; as assessed by Y-maze 30 days after mTBI.

Фиг. 12C. График, иллюстрирующий, что результаты, представленные на фиг. 12А и 12В, не были результатом поведения, подобного тревоге.Fig. 12C. A graph illustrating that the results presented in FIG. 12A and 12B were not the result of anxiety-like behavior.

Фиг. 13А. Репрезентативные изображения, иллюстрирующие, что эксенатид с замедленным высвобождением (PT302 0,6 мг/кг) был способен предотвращать снижение нейронов, наблюдаемое в коре головного мозга, CA3 и зубчатой извилине мышей с нанесенной mTBI.Fig. 13A. Representative images illustrating that sustained release exenatide (PT302 0.6 mg/kg) was able to prevent the neuronal decline observed in the cerebral cortex, CA3 and dentate gyrus of mTBI coated mice.

Фиг. 13B. График, иллюстрирующий количественную оценку данных по коре головного мозга данных, связанных с репрезентативными изображениями на фиг. 13А, которые демонстрируют, что эксенатид с замедленным высвобождением (PT302 0,6 мг/кг) был способен предотвращать снижение нейронов, наблюдаемое в коре головного мозга мышей с нанесенной mTBI.Fig. 13b. A graph illustrating the cortical data quantification of the data associated with the representative images in FIG. 13A, which demonstrate that sustained release exenatide (PT302 0.6 mg/kg) was able to prevent the neuronal decline seen in the cerebral cortex of mTBI-coated mice.

Фиг. 13C. График, иллюстрирующий количественную оценку данных по CA3, связанных с репрезентативными изображениями на фиг. 13A, которые демонстрируют, что эксенатид с замедленным высвобождением (PT302 0,6 мг/кг) был способен предотвращать снижение нейронов, наблюдаемое в области CA3 гиппокампа у мышей с нанесенной mTBI.Fig. 13C. A graph illustrating the quantification of CA3 data associated with the representative images in FIG. 13A, which demonstrate that sustained release exenatide (PT302 0.6 mg/kg) was able to prevent the neuronal decline observed in the CA3 region of the hippocampus in mTBI-coated mice.

Фиг. 13D. График, иллюстрирующий количественную оценку данных по зубчатой извилине, связанных с репрезентативными изображениями на фиг. 13А, которые демонстрируют, что эксенатид с замедленным высвобождением был способен предотвращать снижение нейронов, наблюдаемое в области зубчатой извилины гиппокампа мышей с нанесенной mTBI.Fig. 13D. A graph illustrating the quantification of dentate gyrus data associated with the representative images in FIG. 13A, which demonstrate that sustained release exenatide was able to prevent the neuronal decline seen in the hippocampal dentate gyrus region of mTBI coated mice.

Фиг. 14А. Репрезентативные изображения окрашивания с помощью Fluoro-Jade® C в качестве маркера потери нейронов из-за повреждения головного мозга у контрольных (CTRL) мышей и мышей с нанесенной mTBI, которые получали носитель или эксенатид с замедленным высвобождением в дозе 0,6 мг/кг или 0,12 мг/кг (PT302).Fig. 14A. Representative images of staining with Fluoro-Jade® C as a marker of neuronal loss due to brain injury in control (CTRL) and mTBI-coated mice treated with vehicle or sustained release exenatide at 0.6 mg/kg or 0.12 mg/kg (PT302).

Фиг. 14B. График, иллюстрирующий количественную оценку данных по области СА1 гиппокампа, связанных с репрезентативными изображениями на фиг. 14А, и сильное увеличение потери нейронов вследствие черепно-мозговой травмы в СА1 у не подвергнутых лечению мышей с нанесенной mTBI, которое было значительно снижено при введении 0,6 мг/кг эксенатида с замедленным высвобождением (PT302).Fig. 14b. A graph illustrating the quantification of hippocampal region CA1 data associated with the representative images in FIG. 14A and a strong increase in neuronal loss due to traumatic brain injury in CA1 in untreated mTBI-coated mice, which was significantly reduced with 0.6 mg/kg sustained release exenatide (PT302).

Фиг. 14C. График, иллюстрирующий количественную оценку данных по области СА3 гиппокампа, связанных с репрезентативными изображениями на фиг. 14А, и сильное увеличение потери нейронов вследствие черепно-мозговой травмы в СА3 у не подвергнутых лечению мышей с нанесенной mTBI, которое было значительно снижено при введении 0,6 мг/кг эксенатида с замедленным высвобождением (PT302).Fig. 14C. A graph illustrating the quantification of hippocampal CA3 area data associated with the representative images in FIG. 14A and a strong increase in neuronal loss due to traumatic brain injury in CA3 in untreated mTBI-coated mice, which was significantly reduced with 0.6 mg/kg sustained release exenatide (PT302).

Фиг. 14D. График, иллюстрирующий количественную оценку данных области по зубчатой извилине, связанных с репрезентативными изображениями на фиг. 14А, и сильное увеличение потери нейронов вследствие черепно-мозговой травмы в зубчатой извилине у не подвергнутых лечению мышей с нанесенной mTBI, которое было значительно снижено при введении 0,6 мг/кг эксенатида с замедленным высвобождением (PT302).Fig. 14D. A graph illustrating the scoring of dentate gyrus area data associated with the representative images in FIG. 14A, and a strong increase in neuronal loss due to traumatic brain injury in the dentate gyrus in untreated mTBI-coated mice, which was significantly reduced by administration of 0.6 mg/kg sustained release exenatide (PT302).

Фиг. 14E. График, иллюстрирующий количественную оценку данных по коре головного мозга, связанных с репрезентативными изображениями на фиг. 14А, и сильное увеличение потери нейронов вследствие черепно-мозговой травмы в коре головного мозга у не подвергнутых лечению мышей с нанесенной mTBI, которое было значительно снижено при введении 0,6 мг/кг эксенатида с замедленным высвобождением (PT302).Fig. 14E. A graph illustrating the quantification of cortical data associated with the representative images in FIG. 14A, and a strong increase in neuronal loss due to traumatic brain injury in the cerebral cortex of untreated mTBI-coated mice, which was significantly reduced by administration of 0.6 mg/kg sustained release exenatide (PT302).

Фиг. 15А. Репрезентативные изображения окрашивания на связывающую ионизованный кальций адаптерную молекулу 1 (IBA1) в качестве маркера активации микроглии и нейровоспаления вследствие черепно-мозговой травмы у контрольных мышей и мышей с нанесенной mTBI, которые получали носитель или эксенатид с замедленным высвобождением (PT302) в дозе 0,6 мг/кг или 0,12 мг/кг.Fig. 15A. Representative images of staining for ionized calcium-binding adapter molecule 1 (IBA1) as a marker of microglial activation and neuroinflammation due to traumatic brain injury in control and mTBI-coated mice treated with vehicle or sustained release exenatide (PT302) at a dose of 0.6 mg/kg or 0.12 mg/kg.

Фиг. 15B. График, иллюстрирующий количественную оценку данных по СА1, связанных с репрезентативными изображениями на фиг. 15А, и того, что провоспалительный цитокин TNF-α был значительно увеличен в IBA1+ клетках в СА1 у не подвергнутых лечению мышей с нанесенной mTBI, который значительно уменьшался при введении 0,6 мг/кг или 0,12 мг/кг эксенатида с замедленным высвобождением (PT302).Fig. 15b. A graph illustrating the quantification of CA1 data associated with the representative images in FIG. 15A and that the pro-inflammatory cytokine TNF-α was significantly increased in IBA1+ cells in CA1 in untreated mTBI-coated mice, which was significantly reduced by 0.6 mg/kg or 0.12 mg/kg sustained release exenatide. (PT302).

Фиг. 15C. График, иллюстрирующий количественную оценку данных по СА3, связанных с репрезентативными изображениями на фиг. 15А, и того, что провоспалительный цитокин TNF-α был значительно увеличен в IBA1+ клетках в СА3 у не подвергнутых лечению мышей с нанесенной mTBI, который значительно уменьшался при введении 0,6 мг/кг или 0,12 мг/кг эксенатида с замедленным высвобождением (PT302).Fig. 15C. A graph illustrating the quantification of CA3 data associated with the representative images in FIG. 15A and that the pro-inflammatory cytokine TNF-α was significantly increased in IBA1+ cells in CA3 in untreated mTBI-coated mice, which was significantly reduced by 0.6 mg/kg or 0.12 mg/kg sustained release exenatide. (PT302).

Фиг. 15D. График, иллюстрирующий количественную оценку данных по зубчатой извилине, связанных с репрезентативными изображениями на фиг. 15А, и того, что провоспалительный цитокин TNF-α был значительно увеличен в IBA1+ клетках в зубчатой извилине у не подвергнутых лечению мышей с нанесенной mTBI, который значительно уменьшался при введении 0,6 мг/кг или 0,12 мг/кг эксенатида с замедленным высвобождением (PT302).Fig. 15D. A graph illustrating the quantification of dentate gyrus data associated with the representative images in FIG. 15A and that the pro-inflammatory cytokine TNF-α was significantly increased in IBA1+ cells in the dentate gyrus of untreated mTBI-coated mice, which was significantly decreased by administration of 0.6 mg/kg or 0.12 mg/kg of exenatide with delayed release (PT302).

Фиг. 15E. График, иллюстрирующий количественную оценку данных по коре головного мозга, связанных с репрезентативными изображениями на фиг. 15А, и того, что провоспалительный цитокин TNF-α был значительно увеличен в IBA1+ клетках в коре головного мозга у не подвергнутых лечению мышей с нанесенной mTBI, который значительно уменьшался при введении 0,6 мг/кг или 0,12 мг/кг эксенатида с замедленным высвобождением (PT302).Fig. 15E. A graph illustrating the quantification of cortical data associated with the representative images in FIG. 15A and that the pro-inflammatory cytokine TNF-α was significantly increased in IBA1+ cells in the cerebral cortex of untreated mTBI-coated mice, which was significantly decreased by administration of 0.6 mg/kg or 0.12 mg/kg of exenatide with sustained release (PT302).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE PRESENT INVENTION

Настоящее изобретение основано на поразительном и неожиданном усилении доставки активных ингредиентов, описанных здесь (например, GLP-1, эксендина и биологически активных аналогов или производных GLP-1 и эксендина). Настоящее изобретение можно легче понять при ссылке на следующее подробное описание предпочтительных вариантов осуществления настоящего описания и включенных в него примеров, а также на чертежи и их предшествующее и последующее описание.The present invention is based on a striking and unexpected enhancement in the delivery of the active ingredients described herein (eg, GLP-1, exendin and biologically active analogs or derivatives of GLP-1 and exendin). The present invention can be better understood by reference to the following detailed description of the preferred embodiments of the present description and the examples included therein, as well as to the drawings and their foregoing and following descriptions.

Прежде чем соединения, композиции, изделия, устройства и/или способы настоящего изобретения будут раскрыты и описаны, следует понять, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными способами синтеза, конкретными схемами лечения или конкретными процедурами очистки, поскольку таковые могут, конечно, меняться. Также следует понять, что используемая здесь терминология предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения.Before the compounds, compositions, articles, devices and/or methods of the present invention are disclosed and described, it should be understood that the present invention is not limited to particular synthetic methods, particular treatment regimens, or particular purification procedures, as these may, of course, vary. It should also be understood that the terminology used herein is only intended to describe specific embodiments and is not intended to be limiting.

Все публикации, заявки на патенты, патенты и другие ссылки, упомянутые здесь, включены посредством ссылки во всей их полноте, в том числе, например, каждый из патента США с № 8853160, патента США с № 8278272, патента США с № 7557050, патента США с № 9155702, публикации международной заявки на патент WO/2003/011892 и Gu et al. (Clinical Therapeutics. 36 (1): 101-114 (2014)) включен сюда посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.All publications, patent applications, patents and other references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety, including, for example, each of US Patent No. 8853160, US Patent No. 8278272, US Patent No. 7557050, US Pat. US No. 9155702, International Patent Publication WO/2003/011892 and Gu et al. (Clinical Therapeutics. 36 (1): 101-114 (2014)) is incorporated herein by reference in its entirety for all purposes.

Используемые в описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа «а», «an» и «the» включают множественные ссылки, если контекст явно не предписывает иное. Таким образом, например, ссылка на «полипептид» включает смеси полипептидов, ссылка на «фармацевтический носитель» включает смеси двух или более таких носителей и т.п.As used in the description and the appended claims, the singular forms "a", "an", and "the" include plural references unless the context clearly dictates otherwise. Thus, for example, reference to "polypeptide" includes mixtures of polypeptides, reference to "pharmaceutical carrier" includes mixtures of two or more such carriers, and the like.

Диапазоны могут быть представлены здесь как от «приблизительно» одного конкретного значения и/или до «приблизительно» другого конкретного значения. Когда такой диапазон представлен, другой вариант осуществления включает от одного конкретного значения и/или до другого конкретного значения. Так же, когда значения представлены в виде приближенных значений, с использованием предшествующего «приблизительно», будет понятно, что конкретное значение образует другой вариант осуществления. Кроме того, будет понятно, что конечные точки каждого из диапазонов являются значимыми как по отношению к другой конечной точке, так и независимо от другой конечной точки. Используемый здесь термин «приблизительно» относится к данному значению ± 10%.Ranges may be represented here as from "about" one particular value and/or to "about" another particular value. When such a range is provided, another embodiment includes from one particular value and/or to another particular value. Also, when values are presented as approximate values, using the preceding "approximately", it will be understood that a particular value constitutes another embodiment. In addition, it will be understood that the endpoints of each of the ranges are significant both with respect to the other endpoint and independently of the other endpoint. The term "approximately" as used herein refers to this value of ±10%.

В этом описании и в последующей формуле изобретения будет сделана ссылка на ряд терминов, которые должны иметь следующие значения:In this description and in the following claims, reference will be made to a number of terms which shall have the following meanings:

«Необязательный» или «необязательно» означает, что впоследствии описанное событие или обстоятельство может произойти или может не произойти, и что описание включает случаи, когда указанное событие или обстоятельство происходит, и случаи, когда оно не происходит."Optional" or "optional" means that the subsequently described event or circumstance may or may not occur, and that the description includes cases where the specified event or circumstance occurs and cases when it does not occur.

Как используется повсеместно, под «субъектом» подразумевается индивидуум. В некоторых вариантах осуществления субъектом является млекопитающее, такое как примат. В конкретном варианте субъектом является человек. Таким образом, «субъект» может включать домашних животных, таких как кошки, собаки и т.д., домашний скот (например, крупный рогатый скот, лошади, свиньи, овцы, козы и т.д.), и лабораторных животных (например, мышь, кролика, крысу, морскую свинку и т.д.).As is commonly used, "subject" refers to an individual. In some embodiments, the subject is a mammal, such as a primate. In a particular embodiment, the subject is a human. Thus, "subject" may include domestic animals such as cats, dogs, etc., livestock (e.g., cattle, horses, pigs, sheep, goats, etc.), and laboratory animals (e.g. , mouse, rabbit, rat, guinea pig, etc.).

Термины «полипептид» и «пептид», как правило, используются взаимозаменяемо, если в контексте не указано иное. Если не указано иное, как «полипептид», так и «пептид» могут относиться к встречающимся в природе или не встречающимся в природе аминокислотам, связанным пептидными связями.The terms "polypeptide" and "peptide" are generally used interchangeably unless the context indicates otherwise. Unless otherwise indicated, both "polypeptide" and "peptide" can refer to naturally occurring or non-naturally occurring amino acids linked by peptide bonds.

Термин «стационарное состояние» используется в его обычном значении в фармакокинетике. Вкратце, стационарная концентрация, например, в плазме или спинномозговой жидкости (CSF) представляет собой концентрацию в плазме и CSF, когда скорость введения нейропротективного полипептида(ов) равна скорости, с которой нейропротективный полипептид(ы) элиминируется организмом субъекта. Определение стационарной концентрации нейропротективного полипептида(ов) настоящего изобретения является обычным для специалиста со средним уровнем компетентности в данной области техники.The term "steady state" is used in its usual meaning in pharmacokinetics. Briefly, steady state concentration, for example, in plasma or cerebrospinal fluid (CSF) is the concentration in plasma and CSF when the rate of administration of the neuroprotective polypeptide(s) is equal to the rate at which the neuroprotective polypeptide(s) is eliminated by the subject's body. Determining the steady state concentration of the neuroprotective polypeptide(s) of the present invention is routine for a person of average skill in the art.

Под «выделенным полипептидом» или «очищенным полипептидом» подразумевается полипептид, который по существу не содержит веществ, с которыми полипептид обычно ассоциируется в природе или в культуре. Полипептиды настоящего изобретения могут быть получены, например, путем экстракции из природного источника, если он доступен (например, клеток млекопитающего), путем экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, (например, в клетке или в бесклеточной системе трансляции) или путем химического синтеза полипептида. Кроме того, полипептид может быть получен путем расщепления полноразмерных полипептидов. Когда полипептид представляет собой фрагмент более крупного встречающегося в природе полипептида, выделенный полипептид короче и исключает полноразмерный встречающийся в природе полипептид, фрагментом которого он является.By "isolated polypeptide" or "purified polypeptide" is meant a polypeptide that is substantially free of substances with which the polypeptide is normally associated in nature or in culture. The polypeptides of the present invention can be obtained, for example, by extraction from a natural source, if available (for example, mammalian cells), by expression of a recombinant nucleic acid encoding the polypeptide (for example, in a cell or in a cell-free translation system), or by chemical synthesis of the polypeptide . In addition, the polypeptide can be obtained by cleavage of full-length polypeptides. When a polypeptide is a fragment of a larger naturally occurring polypeptide, the isolated polypeptide is shorter and excludes the full-length naturally occurring polypeptide of which it is a fragment.

Настоящее изобретение относится к способам доставки нейропротективного полипептида по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) субъекта. Способ включает введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением в системный кровоток субъекта, причем: нейропротективный состав с контролируемым высвобождением включает по меньшей мере один нейропротективный полипептид, выбираемый из группы, состоящей из GLP-1, эксендина (например, эксендина-4) или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина (такого как аналог эксендина-4); нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина (например, эксендина-4) или их комбинации; и нейропротективный состав с контролируемым высвобождением усиливает доставку нейропротективного полипептида через гематоэнцефалический барьер (ВВВ) субъекта по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) по сравнению с составом с быстрым высвобождением нейропротективного полипептида.The present invention relates to methods for delivering a neuroprotective polypeptide to at least a portion of the central nervous system (CNS) of a subject. The method includes administering a controlled release neuroprotective formulation to the systemic circulation of a subject, wherein: the controlled release neuroprotective formulation comprises at least one neuroprotective polypeptide selected from the group consisting of GLP-1, exendin (e.g., exendin-4), or a therapeutically effective analog GLP-1 or exendin (such as an analogue of exendin-4); the neuroprotective polypeptide binds to and activates a receptor that binds at least one of GLP-1, exendin (eg, exendin-4), or combinations thereof; and the controlled release neuroprotective formulation enhances delivery of the neuroprotective polypeptide across the blood-brain barrier (BBB) of the subject to at least a portion of the central nervous system (CNS) as compared to the rapid release formulation of the neuroprotective polypeptide.

Как показано на фиг. 1А, 1В, 2 и 3, нейропротективный состав с контролируемым высвобождением приводит к большему поддержанию уровней эксенатида в плазме в модели на животном. Кроме того, фиг. 7В и 8В демонстрируют, что состав с эксенатидом с контролируемым высвобождением является более эффективным нейропротектором и более эффективным нейрорепаративным составом/терапевтическим составом, чем один эксенатид.As shown in FIG. 1A, 1B, 2 and 3, the controlled release neuroprotective formulation resulted in greater maintenance of plasma levels of exenatide in an animal model. In addition, FIG. 7B and 8B demonstrate that the controlled release exenatide formulation is a more effective neuroprotective and more effective neurorepair/therapeutic formulation than exenatide alone.

Настоящее изобретение относится к способам доставки нейропротективного полипептида по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) субъекта. Способ может включать: введение в системный кровоток субъекта терапевтически эффективного количества нейропротективного полипептида с помощью состава с контролируемым высвобождением или устройства, обеспечивающего замедленное высвобождение или долговременную доставку нейропротективного полипептида, при этом нейропротективный полипептид включает по меньшей мере один нейропротективный полипептид, выбираемый из группы, состоящей из GLP-1, эксендина-4 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина-4, причем нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина-4 или их комбинации; и причем нейропротективный состав с контролируемым высвобождением или замедленное высвобождение нейропротективного полипептида усиливает доставку и/или ввод нейропротективного полипептида через гематоэнцефалический барьер (ВВВ) субъекта по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) по сравнению с составом с быстрым высвобождением нейропротективного пептида.The present invention relates to methods for delivering a neuroprotective polypeptide to at least a portion of the central nervous system (CNS) of a subject. The method may include: administering to the subject's systemic circulation a therapeutically effective amount of a neuroprotective polypeptide using a controlled release formulation or device that provides sustained release or sustained delivery of the neuroprotective polypeptide, wherein the neuroprotective polypeptide comprises at least one neuroprotective polypeptide selected from the group consisting of GLP-1, exendin-4, or a therapeutically effective GLP-1 analog or exendin-4, wherein the neuroprotective polypeptide binds to and activates a receptor that binds at least one of GLP-1, exendin-4, or combinations thereof; and wherein the controlled release or sustained release neuroprotective polypeptide formulation enhances delivery and/or entry of the neuroprotective polypeptide across the subject's blood-brain barrier (BBB) to at least a portion of the central nervous system (CNS) compared to a fast release neuroprotective peptide formulation.

Настоящее изобретение также относится к способам лечения субъекта с заболеванием, связанным с центральной нервной системой (ЦНС), или ослабления по меньшей мере одного симптома заболевания, связанного с ЦНС, у субъекта, нуждающегося в этом. Способ может включать: введение в системный кровоток субъекта терапевтически эффективного количества нейропротективного полипептида с помощью состава с контролируемым высвобождением или устройства, обеспечивающего замедленное высвобождение или долговременную доставку нейропротективного полипептида, при этом нейропротективный полипептид включает по меньшей мере один нейропротективный полипептид, выбираемый из группы, состоящей из GLP-1, эксендина-4 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина-4, нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина-4 или их комбинации; и причем нейропротективный состав с контролируемым высвобождением или устройство усиливает доставку нейропротективного полипептида через гематоэнцефалический барьер (BBB) субъекта по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) по сравнению с составом с быстрым высвобождением нейропротективного полипептида.The present invention also relates to methods for treating a subject with a disease associated with the central nervous system (CNS), or alleviating at least one symptom of a disease associated with the CNS, in a subject in need thereof. The method may include: administering to the subject's systemic circulation a therapeutically effective amount of a neuroprotective polypeptide using a controlled release formulation or device providing sustained release or sustained delivery of the neuroprotective polypeptide, wherein the neuroprotective polypeptide comprises at least one neuroprotective polypeptide selected from the group consisting of GLP-1, exendin-4, or a therapeutically effective GLP-1 analog or exendin-4, the neuroprotective polypeptide binds to and activates a receptor that binds at least one of GLP-1, exendin-4, or combinations thereof; and wherein the controlled release neuroprotective formulation or device enhances delivery of the neuroprotective polypeptide across the subject's blood-brain barrier (BBB) to at least a portion of the central nervous system (CNS) compared to a fast release neuroprotective polypeptide formulation.

В некоторых вариантах осуществления состав с контролируемым высвобождением представляет собой состав нейропротективного полипептида длительного действия. состав длительного действия может включать депо-состав для замедленного высвобождения нейропротективного полипептида. Например, состав длительного действия может включать композицию для замедленного высвобождения нейропротективного полипептида (более подробно описанную ниже). В дополнительных вариантах осуществления состав с контролируемым высвобождением, кроме того, содержит биоразлагаемый полимер с определенной вязкостью и материалы покрытия, обладая биодоступностью и замедленным высвобождением нейропротективного полипептида в эффективной концентрации в течение определенного периода времени. В дополнительных вариантах осуществления состав с контролируемым высвобождением, кроме того, содержит биоразлагаемый полимер с определенной вязкостью и материалы покрытия, обладая биодоступностью и замедленным высвобождением нейропротективного полипептида в эффективной концентрации в течение определенного периода времени без начального выброса (например, без начального выброса, такого как вредный начальный выброс, активного ингредиента) активного ингредиента. В конкретных вариантах осуществления нейропротективный состав с контролируемым высвобождением включает: микросферу с контролируемым высвобождением, которая включает ядро с нейропротективным полипептидом и биоразлагаемым полимером; и слой покрытия, который покрывает ядро.In some embodiments, the controlled release formulation is a long acting neuroprotective polypeptide formulation. the long acting formulation may include a depot formulation for sustained release of the neuroprotective polypeptide. For example, a long acting formulation may include a sustained release formulation for a neuroprotective polypeptide (described in more detail below). In additional embodiments, the controlled release formulation further comprises a biodegradable polymer with a defined viscosity and coating materials, bioavailable and sustained release of the neuroprotective polypeptide at an effective concentration over a defined period of time. In further embodiments, the controlled release formulation further comprises a biodegradable polymer with a defined viscosity and coating materials, bioavailable and sustained release of the neuroprotective polypeptide at an effective concentration over a period of time without initial release (e.g., without initial release such as harmful initial burst, active ingredient) active ingredient. In specific embodiments, the controlled release neuroprotective formulation comprises: a controlled release microsphere that includes a core with a neuroprotective polypeptide and a biodegradable polymer; and a coating layer that covers the core.

В одном варианте осуществления введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением ослабляет по меньшей мере один симптом по меньшей мере одного связанного с ЦНС состояния у субъекта. Например, связанное с ЦНС состояние может быть выбрано из группы, состоящей из болезни Паркинсона (PD), черепно-мозговой травмы (TBI), рассеянного склероза, наркомании, алкогольной зависимости, нейродегенеративных состояний, воспаления головного мозга, болезни Альцгеймера (AD), множественной системной атрофии, болезни Хантингтона, хронической травматической энцефалопатии, заболеваний двигательных нейронов (например, бокового амиотрофического склероза, повреждения спинного мозга, спиноцеребеллярной атаксии (SCA), атрофии мышц позвоночника (SMA)), сосудистой деменции, деменции с тельцами Леви (DLB), смешанной деменции, лобно-височной деменции, болезни Крейтцфельда-Якоба, гидроцефалии нормального давления или их комбинации.In one embodiment, administration of the controlled release neuroprotective formulation ameliorates at least one symptom of at least one CNS-related condition in a subject. For example, the CNS related condition may be selected from the group consisting of Parkinson's disease (PD), traumatic brain injury (TBI), multiple sclerosis, drug addiction, alcohol addiction, neurodegenerative conditions, brain inflammation, Alzheimer's disease (AD), multiple systemic atrophy, Huntington's disease, chronic traumatic encephalopathy, motor neuron diseases (eg, amyotrophic lateral sclerosis, spinal cord injury, spinocerebellar ataxia (SCA), spinal muscle atrophy (SMA)), vascular dementia, dementia with Lewy bodies (DLB), mixed dementia, frontotemporal dementia, Creutzfeldt-Jakob disease, normal pressure hydrocephalus, or combinations thereof.

Введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением может включать инъекцию нейропротективного состава с контролируемым высвобождением. Например, нейропротективный состав с контролируемым высвобождением может быть инъецирован подкожно.Administration of the controlled release neuroprotective formulation may include injection of the controlled release neuroprotective formulation. For example, the controlled release neuroprotective formulation may be injected subcutaneously.

В другом варианте осуществления введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением приводит к стационарной концентрации нейропротективного полипептида в плазме, которая находится в диапазоне от приблизительно 50 до приблизительно 4500 пг/мл. Например, стационарная концентрация нейропротективного полипептида в плазме может находиться в диапазоне от приблизительно 50 до приблизительно 4500 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 4250 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 4000 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 3750 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 3500 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 3250 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 3000 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 2750 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 2500 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 2250 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 2000 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 1750 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 1500 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 1250 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 1000 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 750 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 500 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 250 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 4500 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 4250 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 4000 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 3750 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 3500 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 3250 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 3000 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 2750 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 2500 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 2250 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 2000 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 1750 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 1500 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 1250 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 1000 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 750 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 500 пг/мл, от приблизительно 500 до приблизительно 4500 пг/мл, от приблизительно 500 до приблизительно 4250 пг/мл, от приблизительно 500 до приблизительно 4000 пг/мл, от приблизительно 500 до приблизительно 3750 пг/мл, от приблизительно 500 до приблизительно 3500 пг/мл, от приблизительно 500 до приблизительно 3250 пг/мл, от приблизительно 500 до приблизительно 3000 пг/мл, от приблизительно 500 до приблизительно 2750 пг/мл, от приблизительно 500 до приблизительно 2500 пг/мл, от приблизительно 500 до приблизительно 2250 пг/мл, от приблизительно 500 до приблизительно 2000 пг/мл, от приблизительно 500 до приблизительно 1750 пг/мл, от приблизительно 500 до приблизительно 1500 пг/мл, от приблизительно 500 до приблизительно 1250 пг/мл, от приблизительно 500 до приблизительно 1000 пг/мл, от приблизительно 500 до приблизительно 750 пг/мл, от приблизительно 750 до приблизительно 4500 пг/мл, от приблизительно 750 до приблизительно 4250 пг/мл, от приблизительно 750 до приблизительно 4000 пг/мл, от приблизительно 750 до приблизительно 3750 пг/мл, от приблизительно 750 до приблизительно 3500 пг/мл, от приблизительно 750 до приблизительно 3250 пг/мл, от приблизительно 750 до приблизительно 3000 пг/мл, от приблизительно 750 до приблизительно 2750 пг/мл, от приблизительно 750 до приблизительно 2500 пг/мл, от приблизительно 750 до приблизительно 2250 пг/мл, от приблизительно 750 до приблизительно 2000 пг/мл, от приблизительно 750 до приблизительно 1750 пг/мл, от приблизительно 750 до приблизительно 1500 пг/мл, от приблизительно 750 до приблизительно 1250 пг/мл, от приблизительно 750 до приблизительно 1000 пг/мл, от приблизительно 1000 до приблизительно 4500 пг/мл, от приблизительно 1000 до приблизительно 4250 пг/мл, от приблизительно 1000 до приблизительно 4000 пг/мл, от приблизительно 1000 до приблизительно 3750 пг/мл, от приблизительно 1000 до приблизительно 3500 пг/мл, от приблизительно 1000 до приблизительно 3250 пг/мл, от приблизительно 1000 до приблизительно 3000 пг/мл, от приблизительно 1000 до приблизительно 2750 пг/мл, от приблизительно 1000 до приблизительно 2500 пг/мл, от приблизительно 1000 до приблизительно 2250 пг/мл, от приблизительно 1000 до приблизительно 2000 пг/мл, от приблизительно 1000 до приблизительно 1750 пг/мл, от приблизительно 1000 до приблизительно 1500 пг/мл, от приблизительно 1000 до приблизительно 1250 пг/мл, от приблизительно 1250 до приблизительно 4500 пг/мл, от приблизительно 1250 до приблизительно 4250 пг/мл, от приблизительно 1250 до приблизительно 4000 пг/мл, от приблизительно 1250 до приблизительно 3750 пг/мл, от приблизительно 1250 до приблизительно 3500 пг/мл, от приблизительно 1250 до приблизительно 3250 пг/мл, от приблизительно 1250 до приблизительно 3000 пг/мл, от приблизительно 1250 до приблизительно 2750 пг/мл, от приблизительно 1250 до приблизительно 2500 пг/мл, от приблизительно 1250 до приблизительно 2250 пг/мл, от приблизительно 1250 до приблизительно 2000 пг/мл, от приблизительно 1250 до приблизительно 1750 пг/мл, от приблизительно 1250 до приблизительно 1500 пг/мл, от приблизительно 1500 до приблизительно 4500 пг/мл, от приблизительно 1500 до приблизительно 4250 пг/мл, от приблизительно 1500 до приблизительно 4000 пг/мл, от приблизительно 1500 до приблизительно 3750 пг/мл, от приблизительно 1500 до приблизительно 3500 пг/мл, от приблизительно 1500 до приблизительно 3250 пг/мл, от приблизительно 1500 до приблизительно 3000 пг/мл, от приблизительно 1500 до приблизительно 2750 пг/мл, от приблизительно 1500 до приблизительно 2500 пг/мл, от приблизительно 1500 до приблизительно 2250 пг/мл, от приблизительно 1500 до приблизительно 2000 пг/мл, от приблизительно 1500 до приблизительно 1750 пг/мл, от приблизительно 1750 до приблизительно 4500 пг/мл, от приблизительно 1750 до приблизительно 4250 пг/мл, от приблизительно 1750 до приблизительно 4000 пг/мл, от приблизительно 1750 до приблизительно 3750 пг/мл, от приблизительно 1750 до приблизительно 3500 пг/мл, от приблизительно 1750 до приблизительно 3250 пг/мл, от приблизительно 1750 до приблизительно 3000 пг/мл, от приблизительно 1750 до приблизительно 2750 пг/мл, от приблизительно 1750 до приблизительно 2500 пг/мл, от приблизительно 1750 до приблизительно 2250 пг/мл, от приблизительно 1750 до приблизительно 2000 пг/мл, от приблизительно 2000 до приблизительно 4500 пг/мл, от приблизительно 2000 до приблизительно 4250 пг/мл, от приблизительно 2000 до приблизительно 4000 пг/мл, от приблизительно 2000 до приблизительно 3750 пг/мл, от приблизительно 2000 до приблизительно 3500 пг/мл, от приблизительно 2000 до приблизительно 3250 пг/мл, от приблизительно 2000 до приблизительно 3000 пг/мл, от приблизительно 2000 до приблизительно 2750 пг/мл, от приблизительно 2000 до приблизительно 2500 пг/мл, от приблизительно 2000 до приблизительно 2250 пг/мл, от приблизительно 2250 до приблизительно 4500 пг/мл, от приблизительно 2250 до приблизительно 4250 пг/мл, от приблизительно 2250 до приблизительно 4000 пг/мл, от приблизительно 2250 до приблизительно 3750 пг/мл, от приблизительно 2250 до приблизительно 3500 пг/мл, от приблизительно 2250 до приблизительно 3250 пг/мл, от приблизительно 2250 до приблизительно 3000 пг/мл, от приблизительно 2250 до приблизительно 2750 пг/мл, от приблизительно 2250 до приблизительно 2500 пг/мл, от приблизительно 2500 до приблизительно 4500 пг/мл, от приблизительно 2500 до приблизительно 4250 пг/мл, от приблизительно 2500 до приблизительно 4000 пг/мл, от приблизительно 2500 до приблизительно 3750 пг/мл, от приблизительно 2500 до приблизительно 3500 пг/мл, от приблизительно 2500 до приблизительно 3250 пг/мл, от приблизительно 2500 до приблизительно 3000 пг/мл, от приблизительно 2500 до приблизительно 2750 пг/мл, от приблизительно 2750 до приблизительно 4500 пг/мл, от приблизительно 2750 до приблизительно 4250 пг/мл, от приблизительно 2750 до приблизительно 4000 пг/мл, от приблизительно 2750 до приблизительно 3750 пг/мл, от приблизительно 2750 до приблизительно 3500 пг/мл, от приблизительно 2750 до приблизительно 3250 пг/мл, от приблизительно 2750 до приблизительно 3000 пг/мл, от приблизительно 3000 до приблизительно 4500 пг/мл, от приблизительно 3000 до приблизительно 4250 пг/мл, от приблизительно 3000 до приблизительно 4000 пг/мл, от приблизительно 3000 до приблизительно 3750 пг/мл, от приблизительно 3000 до приблизительно 3500 пг/мл, от приблизительно 3000 до приблизительно 3250 пг/мл, от приблизительно 3250 до приблизительно 4500 пг/мл, от приблизительно 3250 до приблизительно 4250 пг/мл, от приблизительно 3250 до приблизительно 4000 пг/мл, от приблизительно 3250 до приблизительно 3750 пг/мл, от приблизительно 3250 до приблизительно 3500 пг/мл, от приблизительно 3500 до приблизительно 4500 пг/мл, от приблизительно 3500 до приблизительно 4250 пг/мл, от приблизительно 3500 до приблизительно 4000 пг/мл или от приблизительно 3500 до приблизительно 3750 пг/мл.In another embodiment, administration of the controlled release neuroprotective formulation results in a steady state plasma concentration of the neuroprotective polypeptide that is in the range of about 50 to about 4500 pg/mL. For example, the steady state plasma concentration of the neuroprotective polypeptide may range from about 50 to about 4500 pg/mL, from about 50 to about 4250 pg/mL, from about 50 to about 4000 pg/mL, from about 50 to about 3750 pg/mL. ml, from about 50 to about 3500 pg/ml, from about 50 to about 3250 pg/ml, from about 50 to about 3000 pg/ml, from about 50 to about 2750 pg/ml, from about 50 to about 2500 pg/ml ml, from about 50 to about 2250 pg/ml, from about 50 to about 2000 pg/ml, from about 50 to about 1750 pg/ml, from about 50 to about 1500 pg/ml, from about 50 to about 1250 pg/ml ml, from about 50 to about 1000 pg/ml, from about 50 to about 750 pg/ml, from about 50 to about 500 pg/ml, from about 50 to approx. positively 250 pg/ml, about 250 to about 4500 pg/ml, about 250 to about 4250 pg/ml, about 250 to about 4000 pg/ml, about 250 to about 3750 pg/ml, from about 250 to about 3500 pg/mL, from about 250 to about 3250 pg/mL, from about 250 to about 3000 pg/mL, from about 250 to about 2750 pg/mL, from about 250 to about 2500 pg/mL, from about 250 to about 2250 pg/mL, from about 250 to about 2000 pg/mL, from about 250 to about 1750 pg/mL, from about 250 to about 1500 pg/mL, from about 250 to about 1250 pg/mL, from about 250 to about 1000 pg/ml, about 250 to about 750 pg/ml, about 250 to about 500 pg/ml, about 500 to about 4500 pg/ml, about 500 to about 4250 pg g/ml, from about 500 to about 4000 pg/ml, from about 500 to about 3750 pg/ml, from about 500 to about 3500 pg/ml, from about 500 to about 3250 pg/ml, from about 500 to about 3000 pg/ml, from about 500 to about 2750 pg/ml, from about 500 to about 2500 pg/ml, from about 500 to about 2250 pg/ml, from about 500 to about 2000 pg/ml, from about 500 to about 1750 pg/ml, from about 500 to about 1500 pg/ml, from about 500 to about 1250 pg/ml, from about 500 to about 1000 pg/ml, from about 500 to about 750 pg/ml, from about 750 to about 4500 pg/ml, from about 750 to about 4250 pg/ml, from about 750 to about 4000 pg/ml, from about 750 to about 3750 pg/ml, from about 750 to about 3500 pg/ml, from appr. about 750 to about 3250 pg/mL, from about 750 to about 3000 pg/mL, from about 750 to about 2750 pg/mL, from about 750 to about 2500 pg/mL, from about 750 to about 2250 pg/mL, from about 750 to about 2000 pg/mL, from about 750 to about 1750 pg/mL, from about 750 to about 1500 pg/mL, from about 750 to about 1250 pg/mL, from about 750 to about 1000 pg/mL, from about 1000 to about 4500 pg/ml, from about 1000 to about 4250 pg/ml, from about 1000 to about 4000 pg/ml, from about 1000 to about 3750 pg/ml, from about 1000 to about 3500 pg/ml, from about 1000 to about 3250 pg/mL, from about 1000 to about 3000 pg/mL, from about 1000 to about 2750 pg/mL, from about 1000 to about 2500 pg/mL, from approx. 1000 to about 2250 pg/mL, from about 1000 to about 2000 pg/mL, from about 1000 to about 1750 pg/mL, from about 1000 to about 1500 pg/mL, from about 1000 to about 1250 pg/mL, from about 1250 to about 4500 pg/mL, from about 1250 to about 4250 pg/mL, from about 1250 to about 4000 pg/mL, from about 1250 to about 3750 pg/mL, from about 1250 to about 3500 pg/mL, from about 1250 to about 3250 pg/ml, from about 1250 to about 3000 pg/ml, from about 1250 to about 2750 pg/ml, from about 1250 to about 2500 pg/ml, from about 1250 to about 2250 pg/ml, from about 1250 to about 2000 pg/ml, from about 1250 to about 1750 pg/ml, from about 1250 to about 1500 pg/ml, from about 1500 to about 4500 pg/ml, from about 1500 to about 4250 pg/mL, from about 1500 to about 4000 pg/mL, from about 1500 to about 3750 pg/mL, from about 1500 to about 3500 pg/mL, from about 1500 to about 3250 pg/mL, from about 1500 to about 3000 pg/ml, from about 1500 to about 2750 pg/ml, from about 1500 to about 2500 pg/ml, from about 1500 to about 2250 pg/ml, from about 1500 to about 2000 pg/ml, from about 1500 to about 1750 pg/ml, from about 1750 to about 4500 pg/ml, from about 1750 to about 4250 pg/ml, from about 1750 to about 4000 pg/ml, from about 1750 to about 3750 pg/ml, from about 1750 to about 3500 pg/ml, from about 1750 to about 3250 pg/ml, from about 1750 to about 3000 pg/ml, from about 1750 to about 2750 pg/ml ml, from about 1750 to about 2500 pg/ml, from about 1750 to about 2250 pg/ml, from about 1750 to about 2000 pg/ml, from about 2000 to about 4500 pg/ml, from about 2000 to about 4250 pg/ml ml, from about 2000 to about 4000 pg/ml, from about 2000 to about 3750 pg/ml, from about 2000 to about 3500 pg/ml, from about 2000 to about 3250 pg/ml, from about 2000 to about 3000 pg/ml ml, from about 2000 to about 2750 pg/ml, from about 2000 to about 2500 pg/ml, from about 2000 to about 2250 pg/ml, from about 2250 to about 4500 pg/ml, from about 2250 to about 4250 pg/ml ml, from about 2250 to about 4000 pg/ml, from about 2250 to about 3750 pg/ml, from about 2250 to about 3500 pg/ml, from about 2250 to about 3 250 pg/mL, about 2250 to about 3000 pg/mL, about 2250 to about 2750 pg/mL, about 2250 to about 2500 pg/mL, about 2500 to about 4500 pg/mL, from about 2500 to about 4250 pg/mL, about 2500 to about 4000 pg/mL, about 2500 to about 3750 pg/mL, about 2500 to about 3500 pg/mL, about 2500 to about 3250 pg/mL, from about 2500 to about 3000 pg/mL, about 2500 to about 2750 pg/mL, about 2750 to about 4500 pg/mL, about 2750 to about 4250 pg/mL, about 2750 to about 4000 pg/mL, from about 2750 to about 3750 pg/mL, about 2750 to about 3500 pg/mL, about 2750 to about 3250 pg/mL, about 2750 to about 3000 pg/mL, about 3000 to about 4500 pg/ml, about 3000 to about 4250 pg/ml, about 3000 to about 4000 pg/ml, about 3000 to about 3750 pg/ml, about 3000 to about 3500 pg/ml, about 3000 to about 3000 to about 3000 pg/ml about 3250 pg/mL, from about 3250 to about 4500 pg/mL, from about 3250 to about 4250 pg/mL, from about 3250 to about 4000 pg/mL, from about 3250 to about 3750 pg/mL, from about 3250 to about 3500 pg/ml, about 3500 to about 4500 pg/ml, about 3500 to about 4250 pg/ml, about 3500 to about 4000 pg/ml, or about 3500 to about 3750 pg/ml.

Устойчивая стационарная концентрация нейропротективного полипептида в плазме, как описано выше, приводит к нарастающему увеличению концентрации нейропротективного полипептида в спинномозговой жидкости (CSF), головном мозге или их комбинации у субъекта. Например, концентрация нейропротективного полипептида в CSF может находиться в диапазоне от приблизительно 5 до приблизительно 400 пг/мл или от приблизительно 10 до приблизительно 400 пг/мл. Т.е. концентрация нейропротективного полипептида в CSF может находиться в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 350 пг/мл, от приблизительно 10 до приблизительно 300 пг/мл, от приблизительно 10 до приблизительно 250 пг/мл, от приблизительно 10 до приблизительно 200 пг/мл, от приблизительно 10 до приблизительно 150 пг/мл, от приблизительно 10 до приблизительно 100 пг/мл, от приблизительно 10 до приблизительно 50 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 400 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 350 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 300 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 250 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 200 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 150 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 100 пг/мл, от приблизительно 100 до приблизительно 400 пг/мл, от приблизительно 100 до приблизительно 350 пг/мл, от приблизительно 100 до приблизительно 300 пг/мл, от приблизительно 100 до приблизительно 250 пг/мл, от приблизительно 100 до приблизительно 200 пг/мл, от приблизительно 100 до приблизительно 150 пг/мл, от приблизительно 150 до приблизительно 400 пг/мл, от приблизительно 150 до приблизительно 350 пг/мл, от приблизительно 150 до приблизительно 300 пг/мл, от приблизительно 150 до приблизительно 250 пг/мл, от приблизительно 150 до приблизительно 200 пг/мл, от приблизительно 200 до приблизительно 400 пг/мл, от приблизительно 200 до приблизительно 350 пг/мл, от приблизительно 200 до приблизительно 300 пг/мл, от приблизительно 200 до приблизительно 250 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 400 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 350 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 300 пг/мл, от приблизительно 300 до приблизительно 400 пг/мл, от приблизительно 300 до приблизительно 350 пг/мл или от приблизительно 350 до приблизительно 400 пг/мл.Sustained steady-state plasma concentration of the neuroprotective polypeptide, as described above, results in progressive increases in the concentration of the neuroprotective polypeptide in the cerebrospinal fluid (CSF), brain, or combination thereof in a subject. For example, the concentration of the neuroprotective polypeptide in the CSF may range from about 5 to about 400 pg/mL, or from about 10 to about 400 pg/mL. Those. the concentration of the neuroprotective polypeptide in the CSF may range from about 10 to about 350 pg/mL, from about 10 to about 300 pg/mL, from about 10 to about 250 pg/mL, from about 10 to about 200 pg/mL, from about 10 to about 150 pg/mL, from about 10 to about 100 pg/mL, from about 10 to about 50 pg/mL, from about 50 to about 400 pg/mL, from about 50 to about 350 pg/mL, from about 50 to about 300 pg/mL, from about 50 to about 250 pg/mL, from about 50 to about 200 pg/mL, from about 50 to about 150 pg/mL, from about 50 to about 100 pg/mL, from about 100 to about 400 pg/ml, about 100 to about 350 pg/ml, about 100 to about 300 pg/ml, about 100 to about 250 pg/ml, from about 100 to about 200 pg/mL, about 100 to about 150 pg/mL, about 150 to about 400 pg/mL, about 150 to about 350 pg/mL, about 150 to about 300 pg/mL, from about 150 to about 250 pg/ml, about 150 to about 200 pg/ml, about 200 to about 400 pg/ml, about 200 to about 350 pg/ml, about 200 to about 300 pg/ml, from about 200 to about 250 pg/ml, about 250 to about 400 pg/ml, about 250 to about 350 pg/ml, about 250 to about 300 pg/ml, about 300 to about 400 pg/ml, from about 300 to about 350 pg/ml, or about 350 to about 400 pg/ml.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, отношение стационарной концентрации полипептида в CFS к таковой в плазме может находиться в диапазоне от приблизительно 0,1% до приблизительно 5%. Например, отношение стационарной концентрации в CSF к стационарной концентрации полипептида в плазме может составлять, в любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, по меньшей мере приблизительно 0,1%, по меньшей мере приблизительно 0,3%, по меньшей мере приблизительно 0,5%, по меньшей мере приблизительно 0,7%, по меньшей мере приблизительно 0,9%, по меньшей мере приблизительно 1%, по меньшей мере приблизительно 1,1%, по меньшей мере приблизительно 1,2%, по меньшей мере приблизительно 1,5%, по меньшей мере приблизительно 2,0%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 5%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 4%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 3%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 2%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 5%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 4%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 3%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 2%, от приблизительно 1% до приблизительно 5%, от приблизительно 1% до приблизительно 4%, от приблизительно 1% до приблизительно 3%, от приблизительно 1% до приблизительно 2%, от приблизительно 2% до приблизительно 5%, от приблизительно 2% до приблизительно 4%, от приблизительно 2% до приблизительно 3%, от приблизительно 3% до приблизительно 5%, от приблизительно 3% до приблизительно 4% или от приблизительно 4% до приблизительно 5%.In any aspect or embodiment described herein, the ratio of the steady-state concentration of the polypeptide in CFS to that in plasma can range from about 0.1% to about 5%. For example, the ratio of steady-state concentration in CSF to steady-state plasma concentration of a polypeptide can be, in any aspect or embodiment described herein, at least about 0.1%, at least about 0.3%, at least about 0. 5%, at least about 0.7%, at least about 0.9%, at least about 1%, at least about 1.1%, at least about 1.2%, at least about 1.5%, at least about 2.0%, from about 0.1% to about 5%, from about 0.1% to about 4%, from about 0.1% to about 3%, from about 0 1% to about 2%, about 0.5% to about 5%, about 0.5% to about 4%, about 0.5% to about 3%, about 0.5% to about 2 %, from about 1% to about 5%, from about 1% to about 4%, from at about 1% to about 3%, about 1% to about 2%, about 2% to about 5%, about 2% to about 4%, about 2% to about 3%, about 3% to about 5%, about 3% to about 4%, or about 4% to about 5%.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, процентное изменение стационарного уровня концентрации нейропротективного полипептида в плазме (т.е., процентное изменение после достижения стационарного состояния) может составлять не более приблизительно 80% (например, не более приблизительно 50%). Например, процентное изменение концентрации нейропротективного полипептида в плазме может составлять не более приблизительно 80% (например, не более приблизительно 50%) при повторном введении после достижения стационарного уровня/концентрации в плазме (например, концентрация нейропротективного полипептида в плазме может находиться в стационарном состоянии через приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5 или приблизительно 6 недель после первого введения). Например, процентное изменение стационарной концентрации нейропротективного полипептида в плазме после достижения стационарного состояния составляет не более приблизительно 80%, приблизительно 79%, приблизительно 78%, приблизительно 77%, приблизительно 76%, приблизительно 75%, приблизительно 74%, приблизительно 73%, приблизительно 72%, приблизительно 71%, приблизительно 70%, приблизительно 69%, приблизительно 68%, приблизительно 67%, приблизительно 66%, приблизительно 65%, приблизительно 64%, приблизительно 63%, приблизительно 62%, приблизительно 61%, приблизительно 60%, приблизительно 59%, приблизительно 58%, приблизительно 57%, приблизительно 56%, приблизительно 55%, приблизительно 54%, приблизительно 53%, приблизительно 52%, приблизительно 51%, приблизительно 50%, приблизительно 49%, приблизительно 48%, приблизительно 47%, приблизительно 46%, приблизительно 45%, приблизительно 44%, приблизительно 43%, приблизительно 42%, приблизительно 41%, приблизительно 40%, приблизительно 39%, приблизительно 38%, приблизительно 37%, приблизительно 36%, приблизительно 35%, приблизительно 34%, приблизительно 33%, приблизительно 32%, приблизительно 31%, приблизительно 30%, приблизительно 29%, приблизительно 28%, приблизительно 27%, приблизительно 26%, приблизительно 25%, приблизительно 24%, приблизительно 23%, приблизительно 22%, приблизительно 21%, приблизительно 20%, приблизительно 19%, приблизительно 18%, приблизительно 17%, приблизительно 16%, приблизительно 15%, приблизительно 14%, приблизительно 13%, приблизительно 12%, приблизительно 11%, приблизительно 10%, приблизительно 9%, приблизительно 8%, приблизительно 7%, приблизительно 6% или приблизительно 5%, например, когда нейропротективный полипептид повторно вводят в пределах приблизительно 28 дней (например, в пределах приблизительно 7, 14 или приблизительно 21 дня) от предшествующего введения нейропротективного полипептида (например, вводят через приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19, приблизительно 20, приблизительно 21, приблизительно 22, приблизительно 23, приблизительно 24, приблизительно 25, приблизительно 26, приблизительно 27 или приблизительно 28 дней после предшествующего введения нейропротективного полипептида(ов)).In any aspect or embodiment described herein, the percentage change in steady state plasma concentration of the neuroprotective polypeptide (i.e., percentage change after reaching steady state) can be no more than about 80% (eg, no more than about 50%). For example, the percentage change in plasma concentration of a neuroprotective polypeptide may be no more than about 80% (e.g., no more than about 50%) upon repeated administration after reaching a steady-state plasma level/concentration (e.g., the plasma concentration of a neuroprotective polypeptide may be steady-state through about 2, about 3, about 4, about 5 or about 6 weeks after the first injection). For example, the percentage change in steady state plasma concentration of a neuroprotective polypeptide after reaching steady state is no more than about 80%, about 79%, about 78%, about 77%, about 76%, about 75%, about 74%, about 73%, about 72%, approximately 71%, approximately 70%, approximately 69%, approximately 68%, approximately 67%, approximately 66%, approximately 65%, approximately 64%, approximately 63%, approximately 62%, approximately 61%, approximately 60% , approximately 59%, approximately 58%, approximately 57%, approximately 56%, approximately 55%, approximately 54%, approximately 53%, approximately 52%, approximately 51%, approximately 50%, approximately 49%, approximately 48%, approximately 47%, approximately 46%, approximately 45%, approximately 44%, approximately 43%, approximately 42%, approximately 41%, approximately 40%, approximately 39%, etc. about 38%, about 37%, about 36%, about 35%, about 34%, about 33%, about 32%, about 31%, about 30%, about 29%, about 28%, about 27%, about 26 %, approximately 25%, approximately 24%, approximately 23%, approximately 22%, approximately 21%, approximately 20%, approximately 19%, approximately 18%, approximately 17%, approximately 16%, approximately 15%, approximately 14%, about 13%, about 12%, about 11%, about 10%, about 9%, about 8%, about 7%, about 6%, or about 5%, e.g., when the neuroprotective polypeptide is reintroduced within about 28 days (e.g., , within about 7, 14, or about 21 days) from prior administration of the neuroprotective polypeptide (e.g., about 1, about 2, about 3, about 4, approx. approximately 5, approximately 6, approximately 7, approximately 8, approximately 9, approximately 10, approximately 11, approximately 12, approximately 13, approximately 14, approximately 15, approximately 16, approximately 17, approximately 18, approximately 19, approximately 20, approximately 21 , about 22, about 23, about 24, about 25, about 26, about 27, or about 28 days after prior administration of the neuroprotective polypeptide(s)).

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, состав вводят один раз каждые приблизительно 7-28 дней (например, приблизительно 7-21 день или приблизительно 7-14 дней). Например, состав может вводиться множество раз, причем каждое введение с интервалом от приблизительно 7 до приблизительно 28 дней (например, один раз каждые приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19, приблизительно 20, приблизительно 21, приблизительно 22, приблизительно 23, приблизительно 24, приблизительно 25, приблизительно 26, приблизительно 27 или приблизительно 28 дней) друг от друга (например, последующее введение через приблизительно 7-28 дней после предшествующего введения). состав можно вводить в любом аспекте или варианте осуществления настоящего изобретения множество раз, причем состав вводят с интервалом от приблизительно 7 до приблизительно 28 дней (например, с интервалом, составляющим приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11 приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19, приблизительно 20 или приблизительно 21 дня (т.е. один раз каждые приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19, приблизительно 20, приблизительно 21, приблизительно 22, приблизительно 23, приблизительно 24, приблизительно 26, приблизительно 27 или приблизительно 28 дней).In any aspect or embodiment described herein, the formulation is administered once every about 7-28 days (eg, about 7-21 days or about 7-14 days). For example, the composition may be administered multiple times, with each administration at an interval of from about 7 to about 28 days (e.g., once every about 7, about 8, about 9, about 10, about 11, about 12, about 13, about 14, approximately 15, approximately 16, approximately 17, approximately 18, approximately 19, approximately 20, approximately 21, approximately 22, approximately 23, approximately 24, approximately 25, approximately 26, approximately 27, or approximately 28 days) apart (e.g., subsequent administration about 7-28 days after the previous administration). the composition can be administered in any aspect or embodiment of the present invention multiple times, and the composition is administered at intervals of from about 7 to about 28 days (for example, with an interval of about 7, about 8, about 9, about 10, about 11, about 12, about 13, about 14, about 15, about 16, about 17, about 18, about 19, about 20, or about 21 days (i.e. once every about 7, about 8, about 9, about 10, about 11, about 12, about 13, about 14, about 15, about 16, about 17, about 18, about 19, about 20, about 21, about 22, about 23, about 24, about 26, about 27, or about 28 days).

В дополнительном аспекте предложен способ лечения субъекта с заболеванием, связанным с центральной нервной системой (ЦНС), или ослабления по меньшей мере одного симптома заболевания, связанного с ЦНС, у субъекта, нуждающегося в этом. Способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества нейропротективного состава с контролируемым высвобождением в системный кровоток субъекта, причем: нейропротективный состав с контролируемым высвобождением включает по меньшей мере один нейропротективный полипептид, выбираемый из группы, состоящей из GLP-1, эксендина (например, эксендина-4) или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина (например, эксендина-4); нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина (например, эксендина-4) или их комбинации; и нейропротективный состав с контролируемым высвобождением усиливает доставку нейропротективного полипептида через гематоэнцефалический барьер (BBB) субъекта по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) по сравнению с одним нейропротективным полипептидом.In a further aspect, a method is provided for treating a subject with a disease associated with the central nervous system (CNS) or ameliorating at least one symptom of a disease associated with the CNS in a subject in need thereof. The method includes administering to a subject a therapeutically effective amount of a controlled release neuroprotective composition into the subject's systemic circulation, wherein: the controlled release neuroprotective composition comprises at least one neuroprotective polypeptide selected from the group consisting of GLP-1, exendin (e.g. exendin-4) or a therapeutically effective GLP-1 analog or exendin (eg, exendin-4); the neuroprotective polypeptide binds to and activates a receptor that binds at least one of GLP-1, exendin (eg, exendin-4), or combinations thereof; and the controlled release neuroprotective formulation enhances delivery of the neuroprotective polypeptide across the blood-brain barrier (BBB) of the subject to at least a portion of the central nervous system (CNS) compared to the neuroprotective polypeptide alone.

В конкретном варианте осуществления введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением ослабляет по меньшей мере один симптом по меньшей мере одного связанного с ЦНС состояния у субъекта. Например, состояние ЦНС выбирают из группы, состоящей из болезни Паркинсона (PD), черепно-мозговой травмы (TBI), рассеянного склероза, наркомании, алкогольной зависимости, нейродегенеративных состояний, воспаления головного мозга, болезни Альцгеймера (AD), множественной системной атрофии, болезни Хантингтона, хронической травматической энцефалопатии, заболеваний двигательных нейронов (например, бокового амиотрофического склероза, повреждения спинного мозга, спиноцеребеллярной атаксии (SCA), атрофии мышц позвоночника (SMA)), сосудистой деменции, деменции с тельцами Леви (DLB), смешанной деменции, лобно-височной деменции, болезни Крейтцфельда-Якоба, гидроцефалии нормального давления или их комбинации.In a specific embodiment, administration of the controlled release neuroprotective formulation ameliorates at least one symptom of at least one CNS-related condition in the subject. For example, the CNS condition is selected from the group consisting of Parkinson's disease (PD), traumatic brain injury (TBI), multiple sclerosis, drug addiction, alcohol addiction, neurodegenerative conditions, brain inflammation, Alzheimer's disease (AD), multiple system atrophy, Huntington, chronic traumatic encephalopathy, motor neuron diseases (eg, amyotrophic lateral sclerosis, spinal cord injury, spinocerebellar ataxia (SCA), spinal muscle atrophy (SMA)), vascular dementia, dementia with Lewy bodies (DLB), mixed dementia, frontal temporal dementia, Creutzfeldt-Jakob disease, normal pressure hydrocephalus, or a combination thereof.

В дальнейших вариантах осуществления введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением включает инъекцию нейропротективного состава с контролируемым высвобождением субъекту. Например, введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением включает подкожную инъекцию нейропротективного состава с контролируемым высвобождением субъекту. В дополнительных вариантах осуществления состав с контролируемым высвобождением, кроме того, содержит биоразлагаемый полимер с определенной вязкостью и материалы покрытия, обладая биодоступностью и замедленным высвобождением нейропротективного полипептида в эффективной концентрации в течение определенного периода времени. В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, состав с контролируемым высвобождением обладает биодоступностью и замедленным высвобождением нейропротективного полипептида в эффективной концентрации в течение определенного периода времени без начального выброса (например, вредного начального выброса) активного ингредиента. В конкретных вариантах осуществления нейропротективный состав с контролируемым высвобождением включает: микросферу с контролируемым высвобождением, которая включает ядро с нейропротективным полипептидом и биоразлагаемым полимером; и слой покрытия, который покрывает ядро.In further embodiments, administration of the controlled release neuroprotective formulation comprises injecting the controlled release neuroprotective formulation into a subject. For example, administering a controlled release neuroprotective formulation comprises subcutaneously injecting the controlled release neuroprotective formulation into a subject. In additional embodiments, the controlled release formulation further comprises a biodegradable polymer with a defined viscosity and coating materials, bioavailable and sustained release of the neuroprotective polypeptide at an effective concentration over a defined period of time. In any aspect or embodiment described herein, the controlled release formulation has bioavailability and sustained release of the neuroprotective polypeptide at an effective concentration for a specified period of time without an initial surge (eg, detrimental initial surge) of the active ingredient. In specific embodiments, the controlled release neuroprotective formulation comprises: a controlled release microsphere that includes a core with a neuroprotective polypeptide and a biodegradable polymer; and a coating layer that covers the core.

В дополнительных вариантах осуществления введение состава с контролируемым высвобождением приводит к стационарной концентрации в плазме нейропротективного полипептида, которая находится в диапазоне, описанном выше, например, от приблизительно 50 до приблизительно 4500 пг/мл.In additional embodiments, administration of the controlled release formulation results in a steady state plasma concentration of the neuroprotective polypeptide that is in the range described above, eg, from about 50 to about 4500 pg/mL.

В дальнейшем аспекте в настоящем описании предложен способ доставки нейропротективного полипептида по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) субъекта. Способ включает: обеспечение долговременной доставки в системный кровоток субъекта по меньшей мере одного нейропротективного полипептида, выбираемого из группы, состоящей из GLP-1, эксендина-4 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина-4, причем нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина-4 или их комбинации; и причем нейропротективный состав с контролируемым высвобождением усиливает доставку и/или ввод нейропротективного полипептида через гематоэнцефалический барьер (BBB) субъекта по меньшей мере в часть ЦНС по сравнению с составом с быстрым высвобождением нейропротективного пептида.In a further aspect, provided herein is a method for delivering a neuroprotective polypeptide to at least a portion of the central nervous system (CNS) of a subject. The method includes: providing long-term delivery to the subject's systemic circulation of at least one neuroprotective polypeptide selected from the group consisting of GLP-1, exendin-4 or a therapeutically effective analogue of GLP-1 or exendin-4, wherein the neuroprotective polypeptide binds to and activates the receptor, which binds at least one of GLP-1, exendin-4, or combinations thereof; and wherein the controlled release neuroprotective formulation enhances the delivery and/or entry of the neuroprotective polypeptide across the blood brain barrier (BBB) of the subject to at least a portion of the CNS compared to the rapid release neuroprotective peptide formulation.

В еще одном аспекте в настоящем описании предложен способ лечения субъекта с заболеванием, связанным с ЦНС, или ослабления по меньшей мере одного симптома заболевания, связанного с ЦНС, у субъекта, нуждающегося в этом. Способ включает: обеспечение долговременной доставки в системный кровоток субъекта по меньшей мере одного нейропротективного полипептида, выбираемого из группы, состоящей из GLP-1, эксендина-4 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина-4, причем нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина-4 или их комбинации; и причем нейропротективный состав с контролируемым высвобождением усиливает доставку нейропротективного полипептида через BBB субъекта по меньшей мере в часть ЦНС по сравнению с составом с быстрым высвобождением нейропротективного полипептида. В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, обеспечение замедленного высвобождения нейропротективного полипептида или полипептидов включает введение нейропротективного полипептида или полипептидов с помощью устройства (например, насоса, мини-насоса, осмотического насоса, осмотического устройства для доставки, инфузионного насоса, устройства для внутривенного введения, перистальтического насоса, миниатюрного инфузионного насоса или т.п.).In yet another aspect, provided herein is a method of treating a subject with a CNS related disease or ameliorating at least one symptom of a CNS related disease in a subject in need thereof. The method includes: providing long-term delivery to the subject's systemic circulation of at least one neuroprotective polypeptide selected from the group consisting of GLP-1, exendin-4 or a therapeutically effective analogue of GLP-1 or exendin-4, wherein the neuroprotective polypeptide binds to and activates the receptor, which binds at least one of GLP-1, exendin-4, or combinations thereof; and wherein the controlled release neuroprotective formulation enhances delivery of the neuroprotective polypeptide through the BBB of the subject to at least a portion of the CNS compared to the rapid release formulation of the neuroprotective polypeptide. In any aspect or embodiment described herein, providing a sustained release of the neuroprotective polypeptide or polypeptides comprises administering the neuroprotective polypeptide or polypeptides via a device (e.g., pump, mini-pump, osmotic pump, osmotic delivery device, infusion pump, IV device). , peristaltic pump, miniature infusion pump, or the like).

Нейропротективный полипептид или полипептиды (например, в нейропротективном составе с контролируемым высвобождением) можно вводить со скоростью от приблизительно 0,5 пМ/кг/мин до приблизительно 35 пМ/кг/мин (например, от приблизительно 3 пМ/кг/мин до приблизительно 17,5 пМ/кг/мин). Например, нейропротективный полипептид или полипептиды можно вводить со скоростью от приблизительно 0,5 пМ/кг/мин до приблизительно 35 пМ/кг/мин, от приблизительно 0,5 пМ/кг/мин до приблизительно 35 пМ/кг/мин, от приблизительно 0,5 пМ/кг/мин до приблизительно 32,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 0,5 пМ/кг/мин до приблизительно 30 пМ/кг/мин, от приблизительно 0,5 пМ/кг/мин до приблизительно 27,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 0,5 пМ/кг/мин до приблизительно 25 пМ/кг/мин, от приблизительно 0,5 пМ/кг/мин до приблизительно 22,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 0,5 пМ/кг/мин до приблизительно 20 пМ/кг/мин, от приблизительно 0,5 пМ/кг/мин до приблизительно 17,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 0,5 пМ/кг/мин до приблизительно 15 пМ/кг/мин, от приблизительно 0,5 пМ/кг/мин до приблизительно 12,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 0.5 пМ/кг/мин до приблизительно 10 пМ/кг/мин, от приблизительно 1,5 пМ/кг/мин до приблизительно 35 пМ/кг/мин, от приблизительно 1,5 пМ/кг/мин до приблизительно 35 пМ/кг/мин, от приблизительно 1,5 пМ/кг/мин до приблизительно 32,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 1,5 пМ/кг/мин до приблизительно 30 пМ/кг/мин, от приблизительно 1,5 пМ/кг/мин до приблизительно 27,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 1,5 пМ/кг/мин до приблизительно 25 пМ/кг/мин, от приблизительно 1,5 пМ/кг/мин до приблизительно 22,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 1,5 пМ/кг/мин до приблизительно 20 пМ/кг/мин, от приблизительно 1,5 пМ/кг/мин до приблизительно 17,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 1,5 пМ/кг/мин до приблизительно 15 пМ/кг/мин, от приблизительно 1,5 пМ/кг/мин до приблизительно 12,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 1,5 пМ/кг/мин до приблизительно 10 пМ/кг/мин, от приблизительно 2,5 пМ/кг/мин до приблизительно 35 пМ/кг/мин, от приблизительно 2,5 пМ/кг/мин до приблизительно 35 пМ/кг/мин, от приблизительно 2,5 пМ/кг/мин до приблизительно 32,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 2,5 пМ/кг/мин до приблизительно 30 пМ/кг/мин, от приблизительно 2,5 пМ/кг/мин до приблизительно 27,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 2,5 пМ/кг/мин до приблизительно 25 пМ/кг/мин, от приблизительно 2,5 пМ/кг/мин до приблизительно 22,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 2,5 пМ/кг/мин до приблизительно 20 пМ/кг/мин, от приблизительно 2,5 пМ/кг/мин до приблизительно 17,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 2,5 пМ/кг/мин до приблизительно 15 пМ/кг/мин, от приблизительно 2,5 пМ/кг/мин до приблизительно 12,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 2,5 пМ/кг/мин до приблизительно 10 пМ/кг/мин, от приблизительно 5 пМ/кг/мин до приблизительно 35 пМ/кг/мин, от приблизительно 5 пМ/кг/мин до приблизительно 35 пМ/кг/мин, от приблизительно 5 пМ/кг/мин до приблизительно 32,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 5 пМ/кг/мин до приблизительно 30 пМ/кг/мин, от приблизительно 5 пМ/кг/мин до приблизительно 27,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 5 пМ/кг/мин до приблизительно 25 пМ/кг/мин, от приблизительно 5 пМ/кг/мин до приблизительно 22,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 5 пМ/кг/мин до приблизительно 20 пМ/кг/мин, от приблизительно 5 пМ/кг/мин до приблизительно 17,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 5 пМ/кг/мин до приблизительно 15 пМ/кг/мин, от приблизительно 5 пМ/кг/мин до приблизительно 12,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 5 пМ/кг/мин до приблизительно 10 пМ/кг/мин, от приблизительно 10 пМ/кг/мин до приблизительно 35 пМ/кг/мин, от приблизительно 10 пМ/кг/мин до приблизительно 35 пМ/кг/мин, от приблизительно 10 пМ/кг/мин до приблизительно 32,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 10 пМ/кг/мин до приблизительно 30 пМ/кг/мин, от приблизительно 10 пМ/кг/мин до приблизительно 27,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 10 пМ/кг/мин до приблизительно 25 пМ/кг/мин, от приблизительно 10 пМ/кг/мин до приблизительно 22,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 10 пМ/кг/мин до приблизительно 20 пМ/кг/мин, от приблизительно 10 пМ/кг/мин до приблизительно 17,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 15 пМ/кг/мин до приблизительно 35 пМ/кг/мин, от приблизительно 15 пМ/кг/мин до приблизительно 35 пМ/кг/мин, от приблизительно 15 пМ/кг/мин до приблизительно 32,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 15 пМ/кг/мин до приблизительно 30 пМ/кг/мин, от приблизительно 15 пМ/кг/мин до приблизительно 27,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 15 пМ/кг/мин до приблизительно 25 пМ/кг/мин, от приблизительно 20 пМ/кг/мин до приблизительно 35 пМ/кг/мин, от приблизительно 20 пМ/кг/мин до приблизительно 35 пМ/кг/мин, от приблизительно 20 пМ/кг/мин до приблизительно 32,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 20 пМ/кг/мин до приблизительно 30 пМ/кг/мин или от приблизительно 25 пМ/кг/мин до приблизительно 35 пМ/кг/мин.The neuroprotective polypeptide or polypeptides (e.g., in a controlled release neuroprotective formulation) can be administered at a rate of about 0.5 pM/kg/min to about 35 pM/kg/min (e.g., about 3 pM/kg/min to about 17 .5 pM/kg/min). For example, the neuroprotective polypeptide or polypeptides can be administered at a rate of from about 0.5 pM/kg/min to about 35 pM/kg/min, from about 0.5 pM/kg/min to about 35 pM/kg/min, from about 0.5 pM/kg/min to about 32.5 pM/kg/min, about 0.5 pM/kg/min to about 30 pM/kg/min, about 0.5 pM/kg/min to about 27.5 pM/kg/min, from about 0.5 pM/kg/min to about 25 pM/kg/min, from about 0.5 pM/kg/min to about 22.5 pM/kg/min, from about 0.5 pM/kg/min to about 20 pM/kg/min, from about 0.5 pM/kg/min to about 17.5 pM/kg/min, from about 0.5 pM/kg/min to about 15 pM/kg/min, from about 0.5 pM/kg/min to about 12.5 pM/kg/min, from about 0.5 pM/kg/min to about 10 pM/kg/min, from about 1, 5 pM/kg/min to about 35 pM/kg/min, from about 1.5 pM/kg/min to about 35 pM/kg/min, from approx. 1.5 pM/kg/min to about 32.5 pM/kg/min, from about 1.5 pM/kg/min to about 30 pM/kg/min, from about 1.5 pM/kg/min to about 27.5 pM/kg/min, from about 1.5 pM/kg/min to about 25 pM/kg/min, from about 1.5 pM/kg/min to about 22.5 pM/kg/min, from about 1.5 pM/kg/min to about 20 pM/kg/min, from about 1.5 pM/kg/min to about 17.5 pM/kg/min, from about 1.5 pM/kg/min to about 15 pM/kg/min, from about 1.5 pM/kg/min to about 12.5 pM/kg/min, from about 1.5 pM/kg/min to about 10 pM/kg/min, from about 2.5 pM/kg/min to about 35 pM/kg/min, about 2.5 pM/kg/min to about 35 pM/kg/min, about 2.5 pM/kg/min to about 32 .5 pM/kg/min, from about 2.5 pM/kg/min to about 30 pM/kg/min, from about 2.5 pM/kg/min to about 27.5 pM/kg/min, from about 2.5 pM/kg/min up to at about 25 pM/kg/min, from about 2.5 pM/kg/min to about 22.5 pM/kg/min, from about 2.5 pM/kg/min to about 20 pM/kg/min, from about 2.5 pM/kg/min to about 17.5 pM/kg/min, about 2.5 pM/kg/min to about 15 pM/kg/min, about 2.5 pM/kg/min to about 12.5 pM/kg/min, from about 2.5 pM/kg/min to about 10 pM/kg/min, from about 5 pM/kg/min to about 35 pM/kg/min, from about 5 pM/kg/min kg/min to about 35 pM/kg/min, from about 5 pM/kg/min to about 32.5 pM/kg/min, from about 5 pM/kg/min to about 30 pM/kg/min, from about 5 pM/kg/min to about 27.5 pM/kg/min, about 5 pM/kg/min to about 25 pM/kg/min, about 5 pM/kg/min to about 22.5 pM/kg /min, from about 5 pM/kg/min to about 20 pM/kg/min, from about 5 pM/kg/min to about 17.5 pM/kg/min, from about 5 pM/kg/min to about 15 pM/kg/min, about 5 pM/kg/min to about 12.5 pM/kg/min, about 5 pM/kg/min to about 10 pM/kg/min , from about 10 pM/kg/min to about 35 pM/kg/min, from about 10 pM/kg/min to about 35 pM/kg/min, from about 10 pM/kg/min to about 32.5 pM/ kg/min, from about 10 pM/kg/min to about 30 pM/kg/min, from about 10 pM/kg/min to about 27.5 pM/kg/min, from about 10 pM/kg/min to about 25 pM/kg/min, from about 10 pM/kg/min to about 22.5 pM/kg/min, from about 10 pM/kg/min to about 20 pM/kg/min, from about 10 pM/kg/min min to about 17.5 pM/kg/min, from about 15 pM/kg/min to about 35 pM/kg/min, from about 15 pM/kg/min to about 35 pM/kg/min, from about 15 pM /kg/min to about 32.5 pM/kg/min, from about 15 pM/kg/min to about 30 pM/kg/min, about t about 15 pM/kg/min to about 27.5 pM/kg/min, from about 15 pM/kg/min to about 25 pM/kg/min, from about 20 pM/kg/min to about 35 pM/kg /min, from about 20 pM/kg/min to about 35 pM/kg/min, from about 20 pM/kg/min to about 32.5 pM/kg/min, from about 20 pM/kg/min to about 30 pM/kg/min or from about 25 pM/kg/min to about 35 pM/kg/min.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, состав с контролируемым высвобождением или нейропротективный полипептид или полипептиды можно вводить с помощью устройства. Например, устройство может представлять собой имплантируемое устройство, которое содержит и доставляет состав с контролируемым высвобождением или нейропротективный полипептид или полипептиды. Устройством может быть насос, мини-насос, осмотический насос, осмотическое устройство доставки, инфузионный насос, устройство для внутривенного введения, перистальтический насос, миниатюрный инфузионный насос или т.п. В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, устройство может представлять собой имплантируемое устройство, которое может обеспечивать постоянную подачу, регулируемую подачу или программируемую подачу состава с контролируемым высвобождением или нейропротективного полипептида или полипептидов. Например, осмотическое устройство доставки описано в патенте США с № 8298561 В2 или патенте США с № 8940316 В2, оба из которых включены сюда посредством ссылки во всей их полноте.In any aspect or embodiment described herein, the controlled release formulation or neuroprotective polypeptide or polypeptides may be administered via a device. For example, the device may be an implantable device that contains and delivers a controlled release formulation or a neuroprotective polypeptide or polypeptides. The device may be a pump, a mini-pump, an osmotic pump, an osmotic delivery device, an infusion pump, an intravenous device, a peristaltic pump, a miniature infusion pump, or the like. In any aspect or embodiment described herein, the device may be an implantable device that can provide a constant delivery, controlled delivery, or programmed delivery of a controlled release formulation or a neuroprotective polypeptide or polypeptides. For example, an osmotic delivery device is described in US Pat. No. 8,298,561 B2 or US Pat. No. 8,940,316 B2, both of which are incorporated here by reference in their entirety.

Используемый здесь термин «осмотическое средство доставки» относится к устройству, используемому для доставки одного или более полезных агентов (например, нейропротективного полипептида или полипептидов или состава с контролируемым высвобождением) субъекту, причем устройство включает, например, резервуар (изготовленный, например, из титанового сплава), имеющий полость, которая содержит суспензионный состав (например, содержащий нейропротективный полипептид или полипептиды или состав с контролируемым высвобождением) и состав осмотического агента. Поршень в сборе, расположенный в полости, отделяет суспензионный состав от состава осмотического агента. Полупроницаемая мембрана расположена на первом дистальном конце резервуара рядом с составом осмотического агента, а модулятор подачи (который определяет выпускное отверстие, через которое суспензионный состав выходит из устройства), расположен на втором дистальном конце резервуар рядом с суспензионным составом. Осмотическое устройство доставки или осмотический насос могут быть имплантированы субъекту, например, подкожно (например, внутри, снаружи или сзади плеча или в область живота).As used herein, the term "osmotic delivery device" refers to a device used to deliver one or more beneficial agents (e.g., a neuroprotective polypeptide or polypeptides or a controlled release formulation) to a subject, the device including, for example, a reservoir (made of, for example, a titanium alloy ) having a cavity that contains a suspension formulation (eg, containing a neuroprotective polypeptide or polypeptides or a controlled release formulation) and an osmotic agent formulation. A piston assembly located in the cavity separates the suspension composition from the osmotic agent composition. A semi-permeable membrane is located at the first distal end of the reservoir adjacent to the osmotic agent formulation, and a delivery modulator (which defines the outlet through which the suspension formulation exits the device) is located at the second distal end of the reservoir adjacent to the suspension formulation. The osmotic delivery device or osmotic pump may be implanted in the subject, for example, subcutaneously (eg, inside, outside, or behind the upper arm or in the abdomen).

Нейропротективный полипептид или полипептиды или состав с контролируемым высвобождением, описанный здесь, можно вводить с помощью устройства для обеспечения долговременной доставки нейропротективного полипептида или полипептида или состава с контролируемым высвобождением в течение продолжительного периода времени, например в течение нескольких недель, месяцев или до приблизительно одного года. Такое устройство, которое может представлять собой имплантируемое устройство, способно доставлять нейропротективный полипептид или полипептиды или состав с контролируемым высвобождением с желаемой скоростью подачи в течение требуемого периода времени. Нейропротективный полипептид или полипептиды или состав с контролируемым высвобождением могут быть загружены в имплантируемое устройство доставки лекарственного средства обычными способами.The neuroprotective polypeptide or polypeptides or controlled release formulation described herein can be administered using a device to provide sustained delivery of the neuroprotective controlled release polypeptide or polypeptide or formulation over an extended period of time, such as several weeks, months, or up to about one year. Such a device, which may be an implantable device, is capable of delivering the neuroprotective polypeptide or polypeptides or controlled release formulation at the desired delivery rate for the desired time period. The neuroprotective polypeptide or polypeptides or controlled release formulation can be loaded into an implantable drug delivery device by conventional methods.

Нейропротективный полипептид или полипептиды или состав с контролируемым высвобождением могут быть доставлены, например, с использованием осмотически, механически, электромеханически или химически управляемого устройства. В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, нейропротективный полипептид или полипептиды или состав с контролируемым высвобождением доставляются со скоростью подачи, которая является терапевтически эффективной для субъекта, нуждающегося в лечении, с помощью нейропротективного полипептида(ов).The neuroprotective polypeptide or polypeptides or controlled release formulation can be delivered, for example, using an osmotically, mechanically, electromechanically or chemically controlled device. In any aspect or embodiment described herein, the neuroprotective polypeptide or polypeptides or controlled release formulation is delivered at a delivery rate that is therapeutically effective for the subject in need of treatment with the neuroprotective polypeptide(s).

Нейропротективный полипептид или полипептиды или состав с контролируемым высвобождением может доставляться в течение периода времени, составляющего от более чем приблизительно одной недели до приблизительно одного года или более (например, от приблизительно одного месяца до приблизительно одного года или более или в течение от приблизительно трех месяцев до приблизительно одного года или более). Устройство может включать резервуар, имеющий по меньшей мере одно отверстие, через которое доставляется нейропротективный полипептид или полипептиды или состав с контролируемым высвобождением. Нейропротективный полипептид или полипептиды или состав с контролируемым высвобождением может храниться в резервуаре. В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, устройство представляет собой осмотическое устройство доставки, которое может быть имплантируемым устройством, причем доставка нейропротективного полипептида или полипептидов или состава с контролируемым высвобождением осуществляется осмотически. Некоторые осмотические устройства доставки или осмотические насосы и их составные части, например, устройство доставки DUROS® или аналогичные устройства, были описаны (смотрите, например, патенты США с № 5609885; 5728396; 5985305; 5997527; 6113938; 6132420; 6156331; 6217906; 6261584; 6270787; 6,287,295; 6375978; 6395292; 6508808; 6544252; 6635268; 6682522; 6923800; 6939556; 6976981; 6997922; 7014636; 7207982; 7112335; 7163688; публикацию заявки на патент США с № 2005-0175701, 2007-0281024 и 2008-0091176, все из которых включены сюда посредством ссылки во всей их полноте).The neuroprotective polypeptide or polypeptides or controlled release formulation may be delivered over a period of time from more than about one week to about one year or more (e.g., from about one month to about one year or more, or for about three months to approximately one year or more). The device may include a reservoir having at least one opening through which the neuroprotective polypeptide or polypeptides or controlled release formulation is delivered. The neuroprotective polypeptide or polypeptides or controlled release formulation may be stored in a reservoir. In any aspect or embodiment described herein, the device is an osmotic delivery device, which may be an implantable device, wherein delivery of the neuroprotective polypeptide or polypeptides or controlled release formulation is osmotically. Some osmotic delivery devices or osmotic pumps and their components, such as the DUROS® delivery device or similar devices, have been described (see, for example, US patents with No. 5609885; 5728396; 5985305; 5997527; 6113938; 6132420; ; 6270787; 6,287,295; 6375978; 6395292; 6508808; 6544252; 6635268; 6682522; 6923800; 6939556; 6976981; 6997922; 7014636; 7207982; 7112335; 7163688; публикацию заявки на патент США с № 2005-0175701, 2007-0281024 и 2008- 0091176, all of which are incorporated herein by reference in their entirety).

Устройство доставки DUROS®, как правило, состоит из цилиндрического резервуара, который содержит осмотический двигатель, поршень и лекарственный состав. Резервуар закрывается на одном конце водопроницаемой мембраной с регулируемой скоростью, а на другом конце - диффузионным замедлителем, через который лекарственный состав высвобождается из резервуара для лекарственного средства. Поршень отделяет лекарственный состав от осмотического двигателя, и в нем используется уплотнение для предотвращения попадания воды из отсека осмотического двигателя в резервуар с лекарственным средством. Диффузионный замедлитель предназначен в сочетании с лекарственным составом (например, нейропротективным полипептидом или полипептидами или составом с контролируемым высвобождением) для предотвращения попадания жидкости организма в резервуар с лекарственным средством через отверстие.The DUROS® delivery device typically consists of a cylindrical reservoir that contains an osmotic motor, piston and drug formulation. The reservoir is closed at one end with a variable rate permeable membrane and at the other end with a diffusion retardant through which the drug formulation is released from the drug reservoir. The piston separates the drug formulation from the osmotic motor and uses a seal to prevent water from entering the osmotic motor compartment into the drug reservoir. The diffusion retarder is intended in combination with a drug formulation (eg, a neuroprotective polypeptide or polypeptides or a controlled release formulation) to prevent body fluid from entering the drug reservoir through an orifice.

Устройство DUROS® выпускает терапевтический агент с заранее определенной скоростью, основанной на принципе осмоса. Экстраклеточная жидкость поступает в устройство DUROS® через полупроницаемую мембрану непосредственно в солевой двигатель, который расширяется с приведением поршня в движение с низкой и равномерной скоростью доставки. Движение поршня заставляет лекарственный состав (например, нейропротективный полипептид или полипептиды или состав с контролируемым высвобождением) высвобождаться через отверстие или выходное отверстие с заданной скоростью сдвига. В любом аспекте или варианте осуществления настоящего изобретения резервуар устройства DUROS® загружают нейропротективным полипептидом(ами) или составом с контролируемым высвобождением, причем устройство способно доставлять нейропротективный полипептид(ы) или состав с контролируемым высвобождением субъекту в течение длительного периода времени (например, приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11 или приблизительно 12 месяцев) с заранее определенной, терапевтически эффективной скоростью доставки.The DUROS® device releases the therapeutic agent at a predetermined rate based on the principle of osmosis. The extracellular fluid enters the DUROS® device through a semi-permeable membrane directly into the saline engine, which expands to drive the piston at a low and uniform delivery rate. The movement of the piston causes the drug formulation (eg, the neuroprotective polypeptide or polypeptides or controlled release formulation) to be released through the orifice or outlet at a predetermined shear rate. In any aspect or embodiment of the present invention, the reservoir of the DUROS® device is loaded with the neuroprotective polypeptide(s) or controlled release formulation, wherein the device is capable of delivering the neuroprotective polypeptide(s) or controlled release formulation to a subject over an extended period of time (e.g., about 1, about 2, about 3, about 4, about 5, about 6, about 7, about 8, about 9, about 10, about 11, or about 12 months) at a predetermined, therapeutically effective delivery rate.

Любое имплантируемое устройство может использоваться при осуществлении на практике настоящего раскрытия и может включать имплантируемые насосы регуляторного типа, которые обеспечивают постоянную подачу, регулируемую подачу или программируемую подачу соединения.Any implantable device may be used in the practice of the present disclosure and may include regulator-type implantable pumps that provide constant delivery, variable delivery, or programmable delivery of the compound.

Количество нейропротективного полипептида(ов) или состава с контролируемым высвобождением, применяемое в устройстве для доставки настоящего изобретения, является таким количеством, которое необходимо для доставки терапевтически эффективного количества агента для достижения желаемого терапевтического результата. На практике оно будет варьировать в зависимости от таких переменных, например, как конкретный агент, место доставки, тяжесть состояния и желаемый терапевтический эффект. Как правило, в случае осмотического устройства доставки объем камеры для полезного агента, содержащей нейропротективный полипептид(ы) или состав с контролируемым высвобождением, составляет от приблизительно 100 мкл до приблизительно 1000 мкл (например, от приблизительно 120 мкл до приблизительно 500 мкл или от приблизительно 150 мкл до приблизительно 200 мкл).The amount of neuroprotective polypeptide(s) or controlled release formulation used in the delivery device of the present invention is that amount necessary to deliver a therapeutically effective amount of the agent to achieve the desired therapeutic result. In practice, this will vary depending on such variables as, for example, the particular agent, the site of delivery, the severity of the condition, and the desired therapeutic effect. Typically, in the case of an osmotic delivery device, the volume of the beneficial agent chamber containing the neuroprotective polypeptide(s) or controlled release formulation is from about 100 µl to about 1000 µl (e.g., from about 120 µl to about 500 µl, or from about 150 µl to about 200 µl).

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, осмотическое устройство доставки имплантируется субъекту, например, подкожно. Устройство(а) может быть вставлено в одно или оба плеча (например, внутрь, снаружи или сзади плеча) или в брюшную полость. Например, устройство может быть имплантировано под кожу живота в области, простирающейся ниже ребер и выше линии пояса. Чтобы обеспечить ряд мест для вставки одного или более осмотических устройств доставки в брюшную полость, брюшную стенку можно разделить на 4 квадрата следующим образом: верхний правый квадрат, простирающийся на 5-8 сантиметров ниже правых ребер и приблизительно на 5-8 сантиметров правее срединной линии, нижний правый квадрат простирается на 5-8 сантиметров выше линии пояса и на 5-8 сантиметров правее срединной линии, верхний левый квадрат простирается на 5-8 сантиметров ниже левых ребер и приблизительно на 5-8 сантиметров левее срединной линии, а нижний левый квадрат простирается на 5-8 сантиметров выше линии пояса и на 5-8 сантиметров левее срединной линии. Это обеспечивает множество доступных мест для имплантации одного или более устройств в одном или более случаях.In any aspect or embodiment described herein, the osmotic delivery device is implanted in a subject, such as subcutaneously. The device(s) may be inserted into one or both upper arms (eg, inside, outside, or behind the upper arm) or into the abdominal cavity. For example, the device may be implanted under the skin of the abdomen in an area extending below the ribs and above the waistline. To provide a range of sites for insertion of one or more osmotic delivery devices into the abdominal cavity, the abdominal wall can be divided into 4 squares as follows: upper right square, extending 5-8 centimeters below the right ribs and approximately 5-8 centimeters to the right of the midline, the lower right square extends 5-8 cm above the waist line and 5-8 cm to the right of the midline, the upper left square extends 5-8 cm below the left ribs and approximately 5-8 cm to the left of the midline, and the lower left square extends 5-8 centimeters above the belt line and 5-8 centimeters to the left of the midline. This provides a plurality of available sites for one or more devices to be implanted in one or more cases.

В других вариантах осуществления введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением или обеспечение долговременной доставки нейропротективного полипептида ослабляет у субъекта по меньшей мере один симптом по меньшей мере одного связанного с ЦНС состояния, выбираемого из группы, состоящей из болезни Паркинсона (PD), черепно-мозговой травмы (TBI), рассеянного склероза, наркомании, алкогольной зависимости, нейродегенеративных состояний, воспаления головного мозга, болезни Альцгеймера (AD), множественной системной атрофии, болезни Хантингтона, хронической травматической энцефалопатии, заболеваний двигательных нейронов (например, бокового амиотрофического склероза, повреждения спинного мозга, спиноцеребеллярной атаксии (SCA), атрофии мышц позвоночника (SMA)), сосудистой деменции, деменции с тельцами Леви (DLB), смешанной деменции, лобно-височной деменции, болезни Крейтцфельда-Якоба, гидроцефалии нормального давления или их комбинации.In other embodiments, administering a controlled release neuroprotective formulation or providing sustained delivery of a neuroprotective polypeptide ameliorates at least one symptom of at least one CNS-related condition selected from the group consisting of Parkinson's disease (PD), traumatic brain injury ( TBI), multiple sclerosis, drug addiction, alcohol dependence, neurodegenerative conditions, brain inflammation, Alzheimer's disease (AD), multiple system atrophy, Huntington's disease, chronic traumatic encephalopathy, motor neuron diseases (eg, amyotrophic lateral sclerosis, spinal cord injury, spinocerebellar ataxia (SCA), spinal muscle atrophy (SMA)), vascular dementia, Lewy body dementia (DLB), mixed dementia, frontotemporal dementia, Creutzfeldt-Jakob disease, normal pressure hydrocephalus, or a combination thereof.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, введение состава с контролируемым высвобождением или обеспечение замедленного высвобождения нейропротективного полипептида приводит к стационарной концентрации нейропротективного полипептида в плазме, которая находится в диапазоне от приблизительно 50 до приблизительно 4500 пг/мл.In any aspect or embodiment described herein, administering a controlled release formulation or providing sustained release of a neuroprotective polypeptide results in a steady state plasma concentration of the neuroprotective polypeptide that is in the range of about 50 to about 4500 pg/mL.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, введение состава с контролируемым высвобождением или обеспечение замедленного высвобождения нейропротективного полипептида приводит к нарастающему увеличению концентрации нейропротективного полипептида в по меньшей мере одном из спинномозговой жидкости (CSF), головного мозга или их комбинации.In any aspect or embodiment described herein, administering a controlled release formulation or providing sustained release of a neuroprotective polypeptide results in an incremental increase in the concentration of the neuroprotective polypeptide in at least one of the cerebrospinal fluid (CSF), the brain, or a combination thereof.

НЕЙРОПРОТЕКТИВНЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫNEUROPROTECTIVE POLYPEPTIDES

Нейропротективный полипептид может иметь аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50,. SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54 или SEQ ID NO:55. Нейропротективный полипептид может включать аминокислотную последовательность, выбираемую из SEQ ID NO:1-55. Кроме того, нейропротективный полипептид может состоять из аминокислотной последовательности, выбираемой из SEQ ID NO:1-55.The neuroprotective polypeptide may have an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 , SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO :40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48 , SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50,. SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, or SEQ ID NO:55. The neuroprotective polypeptide may include an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs:1-55. In addition, the neuroprotective polypeptide may consist of an amino acid sequence selected from SEQ ID NO:1-55.

Под «аналогом GLP-1 или эксендина-4» подразумеваются модифицированные аминокислотные последовательности GLP-1 и/или эксендина, которые проявляют свойства агониста (т.е. проявляют одну или более биологических активностей GLP-1 или эксендина-4). Такие модификации включают химерные полипептиды, которые включают один или более аминокислотных остатков, присутствующих в GLP-1, и один или более аминокислотных остатков, присутствующих в эксендине-4. Модификации также включают усечения либо GLP-1, либо эксендина-4, либо химерных полипептидов. Например, укороченный химерный полипептид представляет собой эксендин-4 7-36, где G в положении 36 заменен на R в положении 36 GLP-1. Полипептиды настоящего изобретения включают одну или более дополнительных аминокислот (т.е. вставок или добавлений), делеции аминокислот или замены в аминокислотной последовательности GLP-1 или эксендина-4 без заметной потери функциональной активности по сравнению с GLP-1 или эксендином-4. Например, делеция может состоять из аминокислот, которые не являются необходимыми для определяемой в настоящее время дифференцирующей активности, и замена(ы) может быть консервативной (т.е. основной, гидрофильной или гидрофобной аминокислотой, замещенной такой же аминокислотой) или неконсервативной. Консервативная замена представляет собой замену, в которой замещенная аминокислота имеет сходные структурные или химические свойства с соответствующей аминокислотой в контрольной последовательности. В качестве примера, консервативные аминокислотные замены включают замену одной алифатической или гидрофобной аминокислоты, например аланина, валина, лейцина и изолейцина, другой; замену одной гидроксилсодержащей аминокислоты, например, серина и треонина, другой; замену одного кислотного остатка, например глютаминовой кислоты или аспарагиновой кислоты, другим; замену одного амидсодержащего остатка, например, аспарагина и глютамина, другим; замену одного ароматического остатка, например фенилаланина и тирозина, другим; замену одного основного остатка, например лизина, аргинина и гистидина, другим; и замену одной небольшой аминокислоты, например аланина, серина, треонина, метионина и глицина, другой. Таким образом, следует понимать, что при желании могут быть сделаны модификации и изменения в аминокислотной последовательности GLP-1 и эксендина-4, и все еще может быть получен белок, имеющий сходные характеристики. Различные изменения могут быть сделаны в аминокислотной последовательности GLP-1 или аминокислотной последовательности эксендина-4 (или исходной последовательности нуклеиновой кислоты) без заметной потери биологической полезности или активности и, возможно, с увеличением такой полезности или активности.By "analogue of GLP-1 or exendin-4" is meant modified amino acid sequences of GLP-1 and/or exendin that exhibit agonist properties (ie exhibit one or more of the biological activities of GLP-1 or exendin-4). Such modifications include chimeric polypeptides that include one or more amino acid residues present in GLP-1 and one or more amino acid residues present in exendin-4. Modifications also include truncations of either GLP-1 or exendin-4 or chimeric polypeptides. For example, a truncated chimeric polypeptide is exendin-4 7-36, where G at position 36 is replaced by R at position 36 of GLP-1. The polypeptides of the present invention include one or more additional amino acids (i.e., insertions or additions), amino acid deletions, or substitutions in the amino acid sequence of GLP-1 or exendin-4 without a noticeable loss of functional activity compared to GLP-1 or exendin-4. For example, a deletion may consist of amino acids that are not necessary for the currently determined differentiating activity, and the substitution(s) may be conservative (ie, a basic, hydrophilic, or hydrophobic amino acid substituted by the same amino acid) or non-conservative. A conservative substitution is one in which the substituted amino acid has similar structural or chemical properties to the corresponding amino acid in the control sequence. By way of example, conservative amino acid substitutions include replacing one aliphatic or hydrophobic amino acid, such as alanine, valine, leucine, and isoleucine, with another; replacement of one hydroxyl-containing amino acid, for example, serine and threonine, with another; replacing one acid residue, such as glutamic acid or aspartic acid, with another; replacing one amide-containing residue, such as asparagine and glutamine, with another; replacing one aromatic residue, such as phenylalanine and tyrosine, with another; replacing one basic residue, such as lysine, arginine and histidine, with another; and replacing one small amino acid, such as alanine, serine, threonine, methionine, and glycine, with another. Thus, it should be understood that modifications and changes in the amino acid sequence of GLP-1 and exendin-4 can be made if desired, and a protein having similar characteristics can still be obtained. Various changes can be made to the GLP-1 amino acid sequence or exendin-4 amino acid sequence (or parent nucleic acid sequence) without appreciable loss of biological utility or activity, and possibly with an increase in such utility or activity.

Термин «фрагменты» или «усечения», как он используется здесь в отношении GLP-1 или эксендина-4, или полипептидов, имеющих аминокислотные последовательности, по существу, гомологичные им, означает полипептидную последовательность из по меньшей мере 5 следующих друг за другом аминокислот либо GLP-1, эксендина-4, либо полипептидов, имеющих аминокислотные последовательности, по существу, гомологичные им, причем полипептидная последовательность обладает инсулинотропной функцией.The term "fragments" or "truncations" as used herein in relation to GLP-1 or exendin-4, or polypeptides having amino acid sequences substantially homologous to them, means a polypeptide sequence of at least 5 consecutive amino acids, or GLP-1, exendin-4, or polypeptides having amino acid sequences substantially homologous to them, and the polypeptide sequence has an insulinotropic function.

Другие модификации включают D-энантиомеры, в которых по меньшей мере одна встречающаяся в природе L-конфигурация аминокислотного остатка заменена D-конфигурацией аминокислотного остатка.Other modifications include D-enantiomers in which at least one naturally occurring L-configuration of an amino acid residue is replaced by a D-configuration of an amino acid residue.

В настоящем изобретении предусматривается использование спейсера, такого как латеральный спейсер. Термин «латеральный спейсер» определяется как соединение, которое включено в аминокислотную последовательность с помощью химических связей, в результате чего соединение увеличивает расстояние между двумя или более аминокислотными остатками, чтобы уменьшить или исключить расщепление (например, с помощью DPP 1V) аминокислотной последовательности в этом положении или вблизи него. Например, в последовательности A-X-B, где A и B представляют собой аминокислотные остатки, а X представляет собой латеральный спейсер, расщепление последовательности ферментом уменьшается или исключается по сравнению с последовательностью в отсутствие латерального спейсера (A-B). Например, от 1 до 4 соединений могут быть включены в аминокислотную последовательность в качестве латерального спейсера. Таким образом, 1, 2, 3 или 4 соединения вставляются в различных вариантах.The present invention provides for the use of a spacer, such as a lateral spacer. The term "lateral spacer" is defined as a compound that is incorporated into an amino acid sequence by chemical bonds, whereby the compound increases the distance between two or more amino acid residues to reduce or eliminate cleavage (e.g., by DPP 1V) of the amino acid sequence at that position. or near it. For example, in an A-X-B sequence where A and B are amino acid residues and X is a lateral spacer, enzyme cleavage of the sequence is reduced or eliminated compared to a sequence without a lateral spacer (A-B). For example, 1 to 4 compounds may be included in the amino acid sequence as a lateral spacer. Thus, 1, 2, 3 or 4 connections are inserted in various ways.

В общем, латеральный спейсер представляет собой любое соединение, которое может образовывать пептидную связь с аминокислотой, т.е. содержит по меньшей мере одну аминогруппу и по меньшей мере одну карбоксильную группу (CO₂), где карбоксильная группа может представлять собой карбоновую кислоту или ее сложный эфир или соль. В одном варианте осуществления латеральный спейсер имеет формулу H₂N-R¹-CO₂H (I), где R¹ включает замещенную или незамещенную C₁-C₂₀ алкильную группу, алкенильную группу или алкинильную группу с разветвленной или неразветвленной цепью; замещенную или незамещенную С₃-С₈ циклоалкильную группу; замещенную или незамещенную С₆-С₂₀ арильную группу; или замещенную или незамещенную С₄-С₂₀ гетероарильную группу. В другом варианте осуществления R¹ может быть представлен формулой (CH₂)_n, где n равно от 1 до 10. В одном варианте осуществления R¹ представляет собой (CH₂)³(3-аминопропионовую кислоту) или (CH₂)₅(6-аминокапроновую кислоту)).In general, a lateral spacer is any compound that can form a peptide bond with an amino acid, i.e. contains at least one amino group and at least one carboxyl group (CO ₂ ), where the carboxyl group may be a carboxylic acid or its ester or salt. In one embodiment, the lateral spacer has the formula H ₂ NR ¹ -CO ₂ H (I), where R ¹ includes a substituted or unsubstituted C ₁ -C ₂₀ alkyl group, a branched or straight chain alkenyl group or alkynyl group; a substituted or unsubstituted C ₃ -C ₈ cycloalkyl group; a substituted or unsubstituted C ₆ -C ₂₀ aryl group; or a substituted or unsubstituted C ₄ -C ₂₀ heteroaryl group. In another embodiment, R ¹ may be represented by the formula (CH ₂ ) _n where n is 1 to 10. In one embodiment, R ¹ is (CH ₂ ) ³ (3-aminopropionic acid) or (CH ₂ ) ₅ ( 6-aminocaproic acid)).

В настоящем описании предложен способ, который включает введение состава с контролируемым высвобождением, содержащего по меньшей мере один нейропротективный полипептид. Полипептид может включать модифицированную последовательность GLP-1 или эксендина (например, эксендина-4), или его аналог или производное, со спейсером между аминокислотными остатками, сравнимыми с остатками 7 и 8 (согласно обозначению в случае GLP-1 со спейсером Aha, например, «GLP-1Aha⁸») или остатками 8 и 9 (согласно обозначению в случае GLP-1 со спейсером Aha, например, «GLP-1Aha⁹») GLP-1. Латеральный спейсер, в одном варианте осуществления, представляет собой один или более остатков аминопропионовой кислоты. В одном варианте осуществления спейсер представляет собой спейсер в виде 6-аминокапроновой кислоты, и спейсер в виде 6-аминокапроновой кислоты включает менее четырех остатков 6-аминокапроновой кислоты. Полипептид, например, может включать GLP-1 7-36 с одним или более остатками 6-аминокапроновой кислоты между остатками 7 и 8 (т.е. GLP-1 Aha⁸) или может включать GLP-1 7-36 с одним или более остатками 6- аминокапроновой кислоты между остатками 8 и 9. Полипептид может включать GLP-1 7-36 с двумя или более остатками 6-аминокапроновой кислоты между остатками 7 и 8 (т.е. GLP-1 Aha⁸) или может включать GLP-1 7- 36 с двумя или более остатками 6- аминокапроновой кислоты между остатками 8 и 9. Например, полипептид может включать GLP-1 7-36 с тремя или более остатками 6-аминокапроновой кислоты между остатками 7 и 8 (т.е. GLP-1 Aha⁸) или может включать GLP-1 7-36 с тремя или более остатками 6- аминокапроновой кислоты между остатками 8 и 9.Provided herein is a method that includes administering a controlled release formulation comprising at least one neuroprotective polypeptide. The polypeptide may include a modified sequence of GLP-1 or an exendin (e.g., exendin-4), or an analog or derivative thereof, with a spacer between amino acid residues comparable to residues 7 and 8 (as designated in the case of GLP-1 with an Aha spacer, e.g., "GLP-1Aha ⁸ ") or residues 8 and 9 (according to the designation in the case of GLP-1 with an Aha spacer, for example, "GLP-1Aha ⁹ ") GLP-1. The lateral spacer, in one embodiment, is one or more aminopropionic acid residues. In one embodiment, the spacer is a 6-aminocaproic acid spacer and the 6-aminocaproic acid spacer comprises less than four 6-aminocaproic acid residues. The polypeptide, for example, may include GLP-1 7-36 with one or more 6-aminocaproic acid residues between residues 7 and 8 (i.e. GLP-1 Aha ⁸ ) or may include GLP-1 7-36 with one or more 6-aminocaproic acid residues between residues 8 and 9. The polypeptide may include GLP-1 7-36 with two or more 6-aminocaproic acid residues between residues 7 and 8 (i.e., GLP-1 Aha ⁸ ) or may include GLP- 1 7-36 with two or more 6-aminocaproic acid residues between residues 8 and 9. For example, a polypeptide may include GLP-1 7-36 with three or more 6-aminocaproic acid residues between residues 7 and 8 (i.e. GLP -1 Aha ⁸ ) or may include GLP-1 7-36 with three or more 6-aminocaproic acid residues between residues 8 and 9.

В других вариантах осуществления полипептид настоящего изобретения обладает инсулинотропным эффектом, сравнимым с эффектом эквимолярного количества GLP-1, или, в одном варианте осуществления, инсулинотропным эффектом, сравнимым с эффектом эквимолярного количества эксендина-4. Под «сравнимым с эффектом» подразумевается эффект, который находится в пределах приблизительно 10-15% от эффекта GLP-1 или эксендина-4. В другом варианте осуществления полипептид обладает инсулинотропным эффектом, который превышает инсулинотропный эффект как GLP-1, так и эксендина-4. Под «превышением эффекта» GLP-1 или эксендина-4 подразумевается увеличение инсулинотропного эффекта по сравнению с GLP-1 или эксендином-4, такое как увеличение, превышающее приблизительно 10% от GLP-1 или эксендина-4. Таким образом, в одном варианте осуществления полипептид настоящего изобретения является таким же сильным, как GLP-1 или эксендин-4, а в другом варианте осуществления полипептид настоящего изобретения является более сильным, чем GLP-1, и, необязательно, более сильным, чем эксендин-4. В других вариантах осуществления полипептид настоящего изобретения действует дольше, чем GLP-1. В дальнейшем варианте осуществления полипептид действует по меньшей мере так же долго, как и эксендин-4. В других вариантах осуществления полипептид действует дольше, чем эксендин-4. Под «более длительным действием» подразумевается, что полипептид является более устойчивым, чем GLP-1 или эксендин-4, к по меньшей мере одному расщепляющему ферменту. Например, полипептид настоящего изобретения является более устойчивым к расщеплению ферментом дипептидилпептидазой-4 (DPPIV), чем GLP-1, и, необязательно, более устойчивым, чем эксендин-4. Такая устойчивость к одному или более расщепляющих ферментов может быть оценена непосредственно путем определения количества продуктов расщепления (например, количества продуктов N-концевого отщепления) или количества нерасщепленного полипептида. Альтернативно, устойчивость к одному или более расщепляющих ферментов может быть обнаружена косвенно путем оценки снижения инсулинотропного эффекта с течением времени после введения полипептида настоящего изобретения. Например, когда расщепляющие ферменты расщепляют полипептиды настоящего изобретения, уровни инсулина в плазме должны снижаться после однократного введения. В дополнительных вариантах осуществления это снижение будет медленнее, чем в случае GLP-1, и/или, возможно, даже медленнее, чем в случае эксендина-4.In other embodiments, the polypeptide of the present invention has an insulinotropic effect comparable to that of an equimolar amount of GLP-1, or, in one embodiment, an insulinotropic effect comparable to that of an equimolar amount of exendin-4. By "comparable to effect" is meant an effect that is in the range of approximately 10-15% of that of GLP-1 or exendin-4. In another embodiment, the polypeptide has an insulinotropic effect that exceeds the insulinotropic effect of both GLP-1 and exendin-4. By "excess effect" of GLP-1 or exendin-4 is meant an increase in insulinotropic effect compared to GLP-1 or exendin-4, such as an increase greater than about 10% of GLP-1 or exendin-4. Thus, in one embodiment, the polypeptide of the present invention is as potent as GLP-1 or exendin-4, and in another embodiment, the polypeptide of the present invention is more potent than GLP-1, and optionally, more potent than exendin. -4. In other embodiments, the implementation of the polypeptide of the present invention acts longer than GLP-1. In a further embodiment, the polypeptide acts at least as long as exendin-4. In other embodiments, the implementation of the polypeptide is longer than exendin-4. By "more durable" is meant that the polypeptide is more resistant than GLP-1 or exendin-4 to at least one degrading enzyme. For example, a polypeptide of the present invention is more resistant to dipeptidyl peptidase-4 (DPPIV) digestion than GLP-1, and optionally more resistant than exendin-4. Such resistance to one or more cleaving enzymes can be assessed directly by determining the amount of cleavage products (eg, the amount of N-terminal cleavage products) or the amount of uncleaved polypeptide. Alternatively, resistance to one or more degrading enzymes can be detected indirectly by assessing the decrease in insulinotropic effect over time after administration of the polypeptide of the present invention. For example, when degrading enzymes degrade the polypeptides of the present invention, plasma insulin levels should decrease after a single dose. In additional embodiments, this decline will be slower than for GLP-1 and/or possibly even slower than for exendin-4.

Полипептиды настоящего изобретения могут быть получены с использованием любого из ряда методов химического синтеза полипептидов, хорошо известных специалистам со средним уровнем компетентности в данной области техники, включая методы получения в растворе и твердофазные методы. Твердофазный синтез, в котором С-концевая аминокислота полипептидной последовательности присоединяется к нерастворимому носителю с последующим последовательным добавлением оставшихся аминокислот в последовательности, является одним из синтетических способов получения полипептидов. Методы твердофазного синтеза описаны в Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156 (1963). Многие автоматизированные системы для проведения твердофазного пептидного синтеза являются коммерчески доступными.The polypeptides of the present invention can be prepared using any of a number of methods for the chemical synthesis of polypeptides well known to those of ordinary skill in the art, including solution methods and solid phase methods. Solid phase synthesis, in which the C-terminal amino acid of a polypeptide sequence is attached to an insoluble carrier, followed by sequential addition of the remaining amino acids in the sequence, is one of the synthetic methods for producing polypeptides. Solid phase synthesis methods are described in Merrifield et al., J. Am. Chem. soc. 85:2149-2156 (1963). Many automated systems for performing solid phase peptide synthesis are commercially available.

Твердофазный синтез начинают с карбоксильного конца (т.е. C-конца) полипептида путем присоединения защищенной аминокислоты через ее карбоксильную группу к подходящему твердому носителю. Используемый твердый носитель не является критической характеристикой при условии, что он способен связываться с карбоксильной группой, оставаясь по существу инертным по отношению к реагентам, используемым в процедуре синтеза пептидов. Например, исходный материал может быть получен путем присоединения аминозащищенной аминокислоты через бензилэфирную связь к хлорметилированной смоле или гидроксиметиловой смоле или через амидную связь к бензгидриламинной смоле (ВНА) или к пара-метилбензгидриламинной смоле (MBHA). Материалы, подходящие для использования в качестве твердых носителей, хорошо известны специалистам в данной области техники и включают, но без ограничения ими, следующие: галогенметиловые смолы, такие как хлорметиловая смола или бромметиловая смола; гидроксиметиловые смолы; фенольные смолы, такие как 4-(a-[2,4-диметоксифенил]-Fmoc-аминометил)фенокси-смола; трет-алкилоксикарбонилгидразидированные смолы; и т.п. Такие смолы являются коммерчески доступными, и способы их получения известны специалистам со средним уровнем компетентности в данной области техники.Solid phase synthesis is initiated from the carboxyl terminus (ie C-terminus) of the polypeptide by attaching the protected amino acid via its carboxyl group to a suitable solid support. The solid support used is not critical, provided that it is capable of binding to the carboxyl group while remaining substantially inert to the reagents used in the peptide synthesis procedure. For example, the starting material can be obtained by attaching an amino-protected amino acid through a benzyl ether bond to a chloromethyl resin or hydroxymethyl resin, or through an amide bond to a benzhydrylamine resin (BHA) or para-methylbenzhydrylamine resin (MBHA). Materials suitable for use as solid supports are well known to those skilled in the art and include, but are not limited to, the following: halomethyl resins such as chloromethyl resin or bromomethyl resin; hydroxymethyl resins; phenolic resins such as 4-(a-[2,4-dimethoxyphenyl]-Fmoc-aminomethyl)phenoxy resin; tert-alkyloxycarbonyl hydrazide resins; and so on. Such resins are commercially available and methods for their preparation are known to those of ordinary skill in the art.

Кислотная форма пептидов может быть получена с помощью процедуры твердофазного синтеза пептидов с использованием смолы на основе бензилового эфира в качестве твердого носителя. Соответствующие амиды могут быть получены с использованием бензгидриламинной или метилбензгидриламинной смолы в качестве твердого носителя. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что при использовании смолы ВНА или МВНА обработка безводной фтористоводородной кислотой для отщепления пептида от твердого носителя дает пептид, имеющий концевую амидную группу.The acid form of the peptides can be obtained by a solid phase peptide synthesis procedure using a benzyl ester resin as a solid support. The corresponding amides can be prepared using benzhydrylamine or methylbenzhydrylamine resin as the solid support. Those skilled in the art will appreciate that when using a BHA or MBHA resin, treatment with anhydrous hydrofluoric acid to cleave the peptide from the solid support produces a peptide having an amide end group.

α-аминогруппа каждой аминокислоты, используемой в синтезе, должна быть защищена во время реакции конденсации, чтобы предотвратить побочные реакции, вовлекающие реакционноспособную функциональную α-аминогруппу. Некоторые аминокислоты также содержат реакционноспособные функциональные группы боковых цепей (например, сульфгидрильную, аминогруппу, карбоксильную, гидроксильную и т.д.), которые также должны быть защищены соответствующими защитными группами, чтобы предотвратить протекание химических реакций в этих сайтах во время синтеза пептида. Защитные группы хорошо известны специалистам в данной области техники. Смотрите, например, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 3: Protection of Functional Groups in Peptide Synthesis (Gross and Meienhofer (eds.), Academic Press, N.Y. (1981)).The α-amino group of each amino acid used in the synthesis must be protected during the condensation reaction to prevent side reactions involving the reactive α-amino functional group. Some amino acids also contain reactive side chain functional groups (eg, sulfhydryl, amino, carboxyl, hydroxyl, etc.) which must also be protected by appropriate protecting groups to prevent chemical reactions from occurring at these sites during peptide synthesis. Protecting groups are well known to those skilled in the art. See, for example, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 3: Protection of Functional Groups in Peptide Synthesis (Gross and Meienhofer (eds.), Academic Press, NY (1981)).

Правильно выбранная α-аминозащитная группа сделает функциональную α-аминогруппу инертной во время реакции конденсации, будет легко удаляться после конденсации в условиях, которые не удаляют защитные группы боковых цепей, не будет изменять структуру пептидного фрагмента и предотвратит рацемизацию при активации непосредственно перед конденсацией. Аналогично, защитные группы для боковой цепи должны быть выбраны для придания функциональной группе боковой цепи инертности во время синтеза, они должны быть стабильными в условиях, используемых для удаления α-аминозащитной группы, и должны быть удаляемыми после завершения пептидного синтеза в условиях, которые не будут изменять структуру пептида.A properly chosen α-amino protecting group will make the α-amino functional group inert during the condensation reaction, will be easily removed after condensation under conditions that do not remove side chain protecting groups, will not alter the structure of the peptide fragment, and will prevent racemization if activated immediately prior to condensation. Similarly, side chain protecting groups must be chosen to render the side chain functional group inert during synthesis, must be stable under the conditions used to remove the α-amino protecting group, and must be removable after completion of peptide synthesis under conditions that will not change the structure of the peptide.

Конденсация аминокислот может быть осуществлена различными способами, известными специалистам в данной области техники. Типичные подходы включают либо превращение аминокислоты в производное, которое сделает карбоксильную группу более чувствительной к реакции со свободной N-концевой аминогруппой пептидного фрагмента, либо использование подходящего связующего средства, такого как, например, N,N'-дициклогексилкарбодимид (DCC) или N,N'-диизопропилкарбодиимид (DIPCDI). Часто гидроксибензотриазол (HOBt) используют в качестве катализатора в этих реакциях конденсации.Amino acid condensation can be carried out in a variety of ways known to those skilled in the art. Typical approaches include either converting the amino acid to a derivative that will make the carboxyl group more susceptible to reaction with the free N-terminal amino group of the peptide moiety, or using a suitable coupling agent such as, for example, N,N'-dicyclohexylcarbodimide (DCC) or N,N '-diisopropylcarbodiimide (DIPCDI). Often hydroxybenzotriazole (HOBt) is used as a catalyst in these condensation reactions.

Как правило, синтез пептида начинается с первого присоединения С-концевой аминокислоты, которая защищена в положении N-аминогруппы защитной группой, такой как флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc), к твердому носителю. Перед присоединением Fmoc-Asn остаток Fmoc должен быть удален из полимера. Fmoc-Asn может, например, быть присоединен к 4-(a-[2,4-диметоксифенил-1]-Fmoc-аминометил)фенокси-смоле с использованием N,N'-дициклогексилкарбодимида (DCC) и гидроксибензотриазола (HOBt) при приблизительно 25°С в течение приблизительно двух часов при перемешивании. После присоединения Fmoc-защищенной аминокислоты к носителю в виде смолы α-аминозащитную группу удаляют с использованием 20% пиперидина в DMF при комнатной температуре.Generally, peptide synthesis begins with the first attachment of a C-terminal amino acid that is protected at the N-amino position by a protecting group such as fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) to a solid support. Before the addition of Fmoc-Asn, the Fmoc residue must be removed from the polymer. Fmoc-Asn can, for example, be attached to a 4-(a-[2,4-dimethoxyphenyl-1]-Fmoc-aminomethyl)phenoxy resin using N,N'-dicyclohexylcarbodimide (DCC) and hydroxybenzotriazole (HOBt) at about 25°C for approximately two hours with stirring. After the Fmoc-protected amino acid has been attached to the resin carrier, the α-amino protecting group is removed using 20% piperidine in DMF at room temperature.

После удаления α-аминозащитной группы оставшиеся аминокислоты, защищенные Fmoc, поэтапно присоединяют в желаемом порядке. Подходящим образом защищенные аминокислоты коммерчески доступны от ряда поставщиков (например, Novartis (Швейцария) или Bachem (Torrance, CA)). В качестве альтернативы поэтапному добавлению отдельных аминокислот, соответствующим образом защищенные пептидные фрагменты, состоящие из более чем одной аминокислоты, также могут быть присоединены к «растущему» пептиду. Выбор подходящего связующего реагента, как объяснено выше, хорошо известен специалистам в данной области техники.After removal of the α-amino protecting group, the remaining Fmoc-protected amino acids are added stepwise in the desired order. Suitably protected amino acids are commercially available from a number of vendors (eg Novartis (Switzerland) or Bachem (Torrance, CA)). As an alternative to the stepwise addition of individual amino acids, appropriately protected peptide fragments consisting of more than one amino acid can also be attached to a "growing" peptide. The choice of a suitable binding agent, as explained above, is well known to those skilled in the art.

Каждая защищенная аминокислота или аминокислотная последовательность вводится в твердофазный реактор в избытке, и конденсация проводится в среде диметилформамида (DMF), метиленхлорида (CH₂Cl₂) или их смесей. Если конденсация является неполной, реакцию конденсации можно повторить перед снятием защиты с N-аминогруппы и добавлением следующей аминокислоты. Эффективность конденсации можно контролировать с помощью ряда средств, хорошо известных специалистам в данной области техники. Методом контроля эффективности конденсации может быть нингидриновая реакция. Реакции синтеза пептидов могут выполняться автоматически с использованием ряда коммерчески доступных пептидных синтезаторов, таких как синтезатор Biosearch 9500™ (Biosearch, San Raphael, CA).Each protected amino acid or amino acid sequence is introduced into the solid phase reactor in excess and the condensation is carried out in dimethylformamide (DMF), methylene chloride (CH ₂ Cl ₂ ) or mixtures thereof. If the condensation is incomplete, the condensation reaction may be repeated before the N-amino group is deprotected and the next amino acid is added. The efficiency of the condensation can be controlled by a number of means well known to those skilled in the art. The ninhydrin reaction can be used to control the efficiency of condensation. Peptide synthesis reactions can be performed automatically using a number of commercially available peptide synthesizers such as the Biosearch 9500™ synthesizer (Biosearch, San Raphael, CA).

Пептид может быть отщеплен, и защитные группы могут быть удалены путем перемешивании нерастворимого носителя или твердого носителя в безводном жидком фторводороде (HF) в присутствии анизола и диметилсульфида при температуре приблизительно 0°C в течение приблизительно 20-90 минут, например, 60 минут; путем непрерывного барботирования бромистого водорода (HBr) через 1 мг/10 мл суспензию смолы в трифторуксусной кислоте (TFA) в течение 60-360 минут при комнатной температуре, в зависимости от выбранных защитных групп; или путем инкубирования твердого носителя внутри реакционной колонки, используемой для твердофазного синтеза, с 90% трифторуксусной кислоты, 5% воды и 5% триэтилсилана в течение приблизительно 30-60 минут. Также могут использоваться другие способы снятия защиты, хорошо известные специалистам в данной области техники.The peptide may be cleaved and the protecting groups may be removed by stirring the insoluble carrier or solid carrier in anhydrous liquid hydrogen fluoride (HF) in the presence of anisole and dimethyl sulfide at a temperature of about 0° C. for about 20-90 minutes, for example 60 minutes; by continuously bubbling hydrogen bromide (HBr) through a 1 mg/10 ml suspension of the resin in trifluoroacetic acid (TFA) for 60-360 minutes at room temperature, depending on the selected protecting groups; or by incubating the solid support inside a reaction column used for solid phase synthesis with 90% trifluoroacetic acid, 5% water and 5% triethylsilane for about 30-60 minutes. Other deprotection techniques well known to those skilled in the art may also be used.

Пептиды могут быть выделены и очищены из реакционной смеси с помощью очистки пептидов, хорошо известной специалистам в данной области техники. Например, пептиды могут быть очищены с использованием известных хроматографических процедур, таких как HPLC c обращенной фазой, гель-хроматография, ионноообменная, эксклюзионная, аффинная, распределительная хроматография или противоточное распределение.Peptides can be isolated and purified from the reaction mixture using peptide purification well known to those skilled in the art. For example, peptides can be purified using known chromatographic procedures such as reverse phase HPLC, gel chromatography, ion exchange, size exclusion, affinity, partition chromatography, or countercurrent distribution.

Нейропротективные полипептиды также могут быть получены другими способами, включая, например, рекомбинантные методы. Примеры подходящих методов клонирования и секвенирования, а также инструкции, достаточные для того, чтобы направить специалистов по множеству действий по клонированию, можно найти в Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd ed.) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, (Sambrook).Neuroprotective polypeptides can also be obtained by other methods, including, for example, recombinant methods. Examples of suitable cloning and sequencing methods, as well as instructions sufficient to guide professionals through a variety of cloning activities, can be found in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd ed.) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, (Sambrook).

Например, производное или производные эксендина, используемые в составе с контролируемым высвобождением, может представлять собой соединение, представленное химической формулой I, или его фармацевтически приемлемую соль:For example, the exendin derivative or derivatives used in the controlled release formulation may be a compound represented by the chemical formula I, or a pharmaceutically acceptable salt thereof:

где:Where:

Xaa5 представляет собой Ala или Thr;Xaa5 is Ala or Thr;

Xaa7 представляет собой Thr или Ser;Xaa7 is Thr or Ser;

Xaa11 представляет собой Ala или Ser;Xaa11 is Ala or Ser;

Xaa12 представляет собой Ala или Lys;Xaa12 is Ala or Lys;

Xaa13 представляет собой Ala или Gln;Xaa13 is Ala or Gln;

Xaa15 представляет собой Ala или Glu;Xaa15 is Ala or Glu;

Xaa16 представляет собой Ala или Glu;Xaa16 is Ala or Glu;

Xaa17 представляет собой Ala или Glu;Xaa17 is Ala or Glu;

Xaa19 представляет собой Ala или Val;Xaa19 is Ala or Val;

Xaa20 представляет собой Ala или Arg;Xaa20 is Ala or Arg;

Xaa26 представляет собой Ala или Leu;Xaa26 is Ala or Leu;

Xaa27 представляет собой Ala или Lys;Xaa27 is Ala or Lys;

при условии, что:provided that:

В некоторых вариантах осуществления N-алкильные группы для N-алкилглицина, N-алкилпентилглицина и N-алкилаланина могут включать низшие алкильные группы, такие как состоящие из от 1 до приблизительно 6 атомов углерода или от 1 до 4 атомов углерода. Соединение, представленное химической формулой I, может включать соединения, указанные в примерах 1-89 (соединения 1-89 соответственно), и соответствующие соединения, указанные в примерах 104 и 105 в PCT-заявке с серийным № PCT/US98/24273, поданной 13 ноября 1998, озаглавленный «Novel Exendin Agonist Compounds», которая тем самым включена посредством ссылки во всей своей полноте для любых целей.In some embodiments, the N-alkyl groups for N-alkylglycine, N-alkylpentylglycine, and N-alkylalanine may include lower alkyl groups such as those of 1 to about 6 carbon atoms or 1 to 4 carbon atoms. The compound represented by the chemical formula I may include the compounds shown in Examples 1-89 (compounds 1-89, respectively) and the corresponding compounds shown in Examples 104 and 105 in PCT Application Serial No. PCT/US98/24273 filed on 13 November 1998 entitled "Novel Exendin Agonist Compounds", which is hereby incorporated by reference in its entirety for any purpose.

В конкретном варианте осуществления производные эксендина химической формулы I могут включать те, в которых Xaa1 в химической формуле I представляет собой His, Ala, Norval или 4-имидазопропионил. В другом варианте Xaa1 в химической формуле I представляет собой His, Ala или 4-имидазопропионил. В дополнительном варианте осуществления Xaa1 в химической формуле I представляет собой His или 4-имидазопропионил.In a specific embodiment, the exendin derivatives of formula I may include those wherein Xaa1 in chemical formula I is His, Ala, Norval, or 4-imidazopropionyl. In another embodiment, Xaa1 in chemical formula I is His, Ala, or 4-imidazopropionyl. In a further embodiment, Xaa1 in chemical formula I is His or 4-imidazopropionyl.

Производные эксендина химической формулы I могут быть такими, в которых Xaa2 представляет собой Gly.Exendin derivatives of chemical formula I may be those in which Xaa2 is Gly.

Производные эксендина химической формулы I могут быть такими, в которых Xaa3 представляет собой Ala.The exendin derivatives of the chemical formula I may be those in which Xaa3 is Ala.

Производные эксендина химической формулы I могут быть такими, в которых Xaa4 представляет собой Ala.Exendin derivatives of chemical formula I may be those in which Xaa4 is Ala.

Производные эксендина химической формулы I могут быть такими, в которых Xaa9 представляет собой Ala.Exendin derivatives of chemical formula I may be those in which Xaa9 is Ala.

Производные эксендина химической формулы I могут быть такими, в которых Xaa14 представляет собой Leu, пентилглицин или Met.Exendin derivatives of chemical formula I may be those in which Xaa14 is Leu, pentylglycine or Met.

Производными эксендина химической формулы I могут быть такими, в которых Xaa21 представляет собой Lys-NHε-R, где R представляет собой Lys, Arg или C₁-C₁₀ алканоил с прямой или разветвленной цепью.Exendin derivatives of chemical formula I may be those in which Xaa21 is Lys-NHε-R, where R is Lys, Arg or C ₁ -C ₁₀ straight or branched chain alkanoyl.

В одном варианте осуществления производные эксендина химической формулы I могут быть такими, в которых Xaa25 представляет собой Trp или Phe.In one embodiment, the exendin derivatives of chemical formula I may be those in which Xaa25 is Trp or Phe.

В другом варианте осуществления производные эксендина химической формулы I могут быть такими, в которых Xaa6 представляет собой Ala, Phe или нафтилаланин, Xaa22 представляет собой Phe или нафтилаланин, и Xaa23 представляет собой Ile или Val. Кроме того, производные эксендина химической формулы I могут быть такими, в которых: Хаа31, Хаа36, Хаа37 и Хаа38 независимо выбирают из группы, состоящей из Pro, гомопролина, тиопролина и N-алкилаланина; Z₁ может представлять собой -NH₂; и Z₂ может представлять собой -NH₂.In another embodiment, the exendin derivatives of chemical formula I may be those in which Xaa6 is Ala, Phe or naphthylalanine, Xaa22 is Phe or naphthylalanine, and Xaa23 is Ile or Val. In addition, exendin derivatives of the chemical formula I may be those in which: Xaa31, Xaa36, Xaa37 and Xaa38 are independently selected from the group consisting of Pro, homoproline, thioproline and N-alkylalanine; Z ₁ may be -NH ₂ ; and Z ₂ may be -NH ₂ .

В других вариантах осуществления производные эксендина химической формулы I могут быть такими, в которых Xaa1 представляет собой Ala, His или Tyr (например, Ala или His); Xaa2 представляет собой Ala или Gly; Xaa6 представляет собой Phe или нафтилаланин; Xaa14 представляет собой Ala, Leu, пентилглицин или Met; Xaa22 представляет собой Phe или нафтилаланин; Xaa23 представляет собой Ile или Val; Xaa31, Xaa36, Xaa37 и Xaa38 независимо выбирают из группы, состоящей из Pro, гомопролина, тиопролина и N-алкилаланина; Xaa39 представляет собой Ser или Tyr (например, Ser); и Z₁ может представлять собой -NH₂.In other embodiments, the exendin derivatives of chemical formula I may be where Xaa1 is Ala, His, or Tyr (eg, Ala or His); Xaa2 is Ala or Gly; Xaa6 is Phe or naphthylalanine; Xaa14 is Ala, Leu, pentylglycine or Met; Xaa22 is Phe or naphthylalanine; Xaa23 is Ile or Val; Xaa31, Xaa36, Xaa37 and Xaa38 are independently selected from the group consisting of Pro, homoproline, thioproline and N-alkylalanine; Xaa39 is Ser or Tyr (eg Ser); and Z ₁ may be -NH ₂ .

В соответствии с одним вариантом осуществления, производные эксендина химической формулы I могут быть такими, в которых Xaa1 представляет собой His или Ala; Xaa2 представляет собой Gly или Ala; Xaa3 представляет собой Ala, Asp или Glu; Xaa4 представляет собой Ala или Gly; Xaa5 представляет собой Ala или Thr; Xaa6 представляет собой Phe или нафтилаланин; Xaa7 представляет собой Thr или Ser; Xaa8 представляет собой Ala, Ser или Thr; Xaa9 представляет собой Ala, Asp или Glu; Xaa10 представляет собой Ala, Leu или пентилглицин; Xaa11 представляет собой Ala или Ser; Xaa12 представляет собой Ala или Lys; Xaa13 представляет собой Ala или Gln; Xaa14 представляет собой Ala, Leu, Met или пентилглицин; Xaa15 представляет собой Ala или Glu; Xaa16 представляет собой Ala или Glu; Xaa17 представляет собой Ala или Glu; Xaa19 представляет собой Ala или Val; Xaa20 представляет собой Ala или Arg; Xaa21 представляет собой Ala или Leu; Xaa22 представляет собой Phe или нафтилаланин; Xaa23 представляет собой Ile, Val или трет-бутилглицин; Xaa24 представляет собой Ala, Glu или Asp; Xaa25 представляет собой Ala, Trp или Phe; Xaa26 представляет собой Ala или Leu; Xaa27 представляет собой Ala или Lys; и Xaa28 представляет собой Ala или Asn; Z₁ представляет собой -OH, -NH₂, Gly-Z₂, Gly Gly-Z₂, Gly Gly Xaa31-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38-Z₂ или Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38 Xaa39-Z₂; Xaa31, Xaa36, Xaa37 и Xaa38 независимо представляют собой Pro, гомопролин, тиопролин или N-метилаланин; Xaa39 представляет собой Ser или Tyr (например, Ser); и Z₂ представляет собой -OH или -NH₂, при условии, что не более трех из Xaa3, Xaa5, Xaa6, Xaa8, Xaa10, Xaa11, Xaa12, Xaa13, Xaa14, Xaa15, Xaa16, Xaa17, Xaa19, Xaa20, Xaa21, Xaa24, Xaa25, Xaa26, Xaa27 и Xaa28 представляют собой Ala, и когда Xaa1 представляет собой His, Arg или Tyr, по меньшей мере один из Xaa3, Xaa4 и Xaa9 может быть Ala.According to one embodiment, the exendin derivatives of chemical formula I may be those in which Xaa1 is His or Ala; Xaa2 is Gly or Ala; Xaa3 is Ala, Asp or Glu; Xaa4 is Ala or Gly; Xaa5 is Ala or Thr; Xaa6 is Phe or naphthylalanine; Xaa7 is Thr or Ser; Xaa8 is Ala, Ser or Thr; Xaa9 is Ala, Asp or Glu; Xaa10 is Ala, Leu, or pentylglycine; Xaa11 is Ala or Ser; Xaa12 is Ala or Lys; Xaa13 is Ala or Gln; Xaa14 is Ala, Leu, Met or pentylglycine; Xaa15 is Ala or Glu; Xaa16 is Ala or Glu; Xaa17 is Ala or Glu; Xaa19 is Ala or Val; Xaa20 is Ala or Arg; Xaa21 is Ala or Leu; Xaa22 is Phe or naphthylalanine; Xaa23 is Ile, Val or t-butylglycine; Xaa24 is Ala, Glu or Asp; Xaa25 is Ala, Trp or Phe; Xaa26 is Ala or Leu; Xaa27 is Ala or Lys; and Xaa28 is Ala or Asn; Z ₁ is -OH, -NH ₂ , Gly-Z ₂ , Gly Gly-Z ₂ , Gly Gly Xaa31-Z ₂ , Gly Gly Xaa31 Ser-Z ₂ , Gly Gly Xaa31 Ser Ser-Z ₂ , Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly-Z ₂ , Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala-Z ₂ , Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z ₂ , Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37-Z ₂ , Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38-Z ₂ or Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38 Xaa39-Z ₂ ; Xaa31, Xaa36, Xaa37 and Xaa38 are independently Pro, homoproline, thioproline, or N-methylalanine; Xaa39 is Ser or Tyr (eg Ser); and Z ₂ is -OH or -NH ₂ , with the proviso that not more than three of Xaa3, Xaa5, Xaa6, Xaa8, Xaa10, Xaa11, Xaa12, Xaa13, Xaa14, Xaa15, Xaa16, Xaa17, Xaa19, Xaa20, Xaa21, Xaa24, Xaa25, Xaa26, Xaa27 and Xaa28 are Ala, and when Xaa1 is His, Arg or Tyr, at least one of Xaa3, Xaa4 and Xaa9 may be Ala.

В дальнейших вариантах осуществления соединения химической формулы I могут включать соединения, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:5-93, указанные в PCT-заявке с серийным номером PCT/US98/25728, или соединения, указанные в предварительной заявке на патент США 60/066,029, которая тем самым включена посредством ссылки.In further embodiments, the compounds of chemical formula I may include compounds having the amino acid sequences of SEQ ID NO:5-93 as set forth in PCT Application Serial No. PCT/US98/25728 or compounds as set forth in US Provisional Application 60/066,029 , which is hereby incorporated by reference.

В соответствии с одним вариантом осуществления предоставлены соединения, в которых Xaa14 представляет собой Leu, Ile, Val или пентилглицин (например, Leu или пентилглицин); и Xaa25 представляет собой Ala, Phe, Tyr или нафтилаланин (например, Phe или нафтилаланин). Эти соединения будут менее подвержены окислительному расщеплению, как in vitro, так и in vivo, а также во время синтеза соединения.According to one embodiment, compounds are provided wherein Xaa14 is Leu, Ile, Val or pentylglycine (eg Leu or pentylglycine); and Xaa25 is Ala, Phe, Tyr or naphthylalanine (eg Phe or naphthylalanine). These compounds will be less susceptible to oxidative degradation, both in vitro and in vivo, as well as during compound synthesis.

В другом аспекте производные эксендина могут включать соединения, представленные химической формулой II, или их фармацевтически приемлемые соли:In another aspect, exendin derivatives may include compounds represented by the chemical formula II, or pharmaceutically acceptable salts thereof:

где:Where:

Xaa5 представляет собой Ala или Thr;Xaa5 is Ala or Thr;

Xaa7 представляет собой Thr или Ser;Xaa7 is Thr or Ser;

Xaa11 представляет собой Ala или Ser;Xaa11 is Ala or Ser;

Xaa12 представляет собой Ala или Lys;Xaa12 is Ala or Lys;

Xaa13 представляет собой Ala или Gln;Xaa13 is Ala or Gln;

Xaa15 представляет собой Ala или Glu;Xaa15 is Ala or Glu;

Xaa16 представляет собой Ala или Glu;Xaa16 is Ala or Glu;

Xaa17 представляет собой Ala или Glu;Xaa17 is Ala or Glu;

Xaa19 представляет собой Ala или Val;Xaa19 is Ala or Val;

Xaa20 представляет собой Ala или Arg;Xaa20 is Ala or Arg;

Xaa26 представляет собой Ala или Leu;Xaa26 is Ala or Leu;

при условии, что:provided that:

В некоторых вариантах осуществления производные эксендина химической формулы II могут включать те, в которых Xaa1 представляет собой His, Ala, Norval или 4-имидазопропионил (например, Xaa1 включает His, 4-имидазопропионил или Ala, или Xaa1 включает His или 4-имидазопропионил).In some embodiments, exendin derivatives of formula II may include those wherein Xaa1 is His, Ala, Norval, or 4-imidazopropionyl (e.g., Xaa1 includes His, 4-imidazopropionyl, or Ala, or Xaa1 includes His or 4-imidazopropionyl).

Производные эксендина химической формулы II могут быть такими, в которых Xaa2 представляет собой Gly.Exendin derivatives of chemical formula II may be those in which Xaa2 is Gly.

Производные эксендина химической формулы II могут быть такими, в которых Xaa4 представляет собой Ala.Exendin derivatives of chemical formula II may be those in which Xaa4 is Ala.

Производные эксендина химической формулы II могут быть такими, в которых Xaa9 представляет собой Ala.Exendin derivatives of chemical formula II may be those in which Xaa9 is Ala.

Производные эксендина химической формулы II могут быть такими, в которых Xaa14 представляет собой Leu, пентилглицин или Met.Exendin derivatives of chemical formula II may be those in which Xaa14 is Leu, pentylglycine or Met.

Производные эксендина химической формулы II могут быть такими, в которых Xaa25 представляет собой Trp или Phe.Exendin derivatives of chemical formula II may be those in which Xaa25 is Trp or Phe.

Производные эксендина химической формулы II могут быть такими, в которых Xaa6 представляет собой Ala, Phe или нафтилаланин, Xaa22 представляет собой Phe или нафтилаланин, и Xaa23 представляет собой Ile или Val.Exendin derivatives of chemical formula II may be those in which Xaa6 is Ala, Phe or naphthylalanine, Xaa22 is Phe or naphthylalanine, and Xaa23 is Ile or Val.

Производные эксендина химической формулы II могут быть такими, в которых Z₁ представляет собой -NH₂.Exendin derivatives of chemical formula II may be those in which Z ₁ is -NH ₂ .

Производные эксендина химической формулы II могут быть такими, в которых Хаа31, Хаа36, Хаа37 и Хаа38 независимо выбирают из группы, состоящей из Pro, гомопролина, тиопролина и N-алкилаланина.Exendin derivatives of chemical formula II may be those in which Xaa31, Xaa36, Xaa37 and Xaa38 are independently selected from the group consisting of Pro, homoproline, thioproline and N-alkylalanine.

Производные эксендина химической формулы II могут быть такими, в которых Xaa39 представляет собой Ser или Tyr (например, Ser). Производные эксендина химической формулы II могут быть такими, в которых Z₂ представляет собой -NH₂.Exendin derivatives of chemical formula II may be those in which Xaa39 is Ser or Tyr (eg Ser). Exendin derivatives of chemical formula II may be those in which Z ₂ is -NH ₂ .

Производные эксендина химической формулы II могут быть такими, в которых Xaa21 представляет собой Lys-NHε-R, где R представляет собой Lys, Arg или C₁-C₁₀ алканоил с прямой или разветвленной цепью.Exendin derivatives of chemical formula II may be those in which Xaa21 is Lys-NHε-R, where R is Lys, Arg or C ₁ -C ₁₀ straight or branched chain alkanoyl.

Производные эксендина химической формулы II могут быть такими, в которых X1 представляет собой Lys Asn, Lys-NHε-R Asn или Lys-NHε-R Ala, где R представляет собой Lys, Arg или C₁-C₁₀ алканоил с прямой или разветвленной цепью.Exendin derivatives of chemical formula II may be those in which X1 is Lys Asn, Lys-NHε-R Asn or Lys-NHε-R Ala, where R is Lys, Arg or C ₁ -C ₁₀ straight or branched chain alkanoyl .

В дальнейших вариантах осуществления производные эксендина химической формулы II могут включать соединения, имеющие аминокислотные последовательности, идентифицированные как SEQ ID NO:95-110, указанные в WO 99/025728. Производные эксендина химической формулы II могут включать соединения, имеющие аминокислотные последовательности, идентифицированные как SEQ ID NO:5-93, как описано в PCT-заявке PCT/US98/24210, поданной 13 ноября 1998 г., под названием «Novel Exendin Agonist Compounds». В другом аспекте производные эксендина химической формулы II могут включать соединения, имеющие аминокислотные последовательности, идентифицированные как SEQ ID NO:37-40, указанные в WO 99/007404. Указанные документы тем самым включены посредством ссылки.In further embodiments, exendin derivatives of chemical formula II may include compounds having the amino acid sequences identified as SEQ ID NO:95-110 as set forth in WO 99/025728. Exendin derivatives of chemical formula II may include compounds having the amino acid sequences identified as SEQ ID NOs: 5-93 as described in PCT Application PCT/US98/24210, filed November 13, 1998, titled "Novel Exendin Agonist Compounds" . In another aspect, exendin derivatives of chemical formula II may include compounds having the amino acid sequences identified as SEQ ID NO:37-40 as set forth in WO 99/007404. Said documents are hereby incorporated by reference.

Сокращения, используемые в химической формуле I и II, обозначают следующее.The abbreviations used in the chemical formula I and II mean the following.

«ACN» и «CH₃CN» относятся к ацетонитрилу."ACN" and "CH ₃ CN" refer to acetonitrile.

«Boc», «tBoc» и «Tboc» относятся к трет-бутоксикарбонилу."Boc", "tBoc" and "Tboc" refer to t-butoxycarbonyl.

«DCC» относится к N,N'-дициклогексилкарбодиимиду."DCC" refers to N,N'-dicyclohexylcarbodiimide.

«Fmoc» относится к флуоренилметоксикарбонилу."Fmoc" refers to fluorenylmethoxycarbonyl.

«HBTU» относится к гексафторфосфату 2-(1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония."HBTU" refers to 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate.

«HOBt» относится к моногидрату 1-гидроксибензотриазола."HOBt" refers to 1-hydroxybenzotriazole monohydrate.

«homoP» и «hPro» относятся к гомопролину."homoP" and "hPro" refer to homoproline.

«MeAla» и «Nme» относятся к N-метилаланину."MeAla" and "Nme" refer to N-methylalanine.

«naph» относится к нафтилаланину."naph" refers to naphthylalanine.

«pG» и «pGly» относятся к пентилглицину."pG" and "pGly" refer to pentylglycine.

«tBuG» относится к трет-бутилглицину."tBuG" refers to tert-butylglycine.

«ThioP» и «tPro» относятся к тиопролину."ThioP" and "tPro" refer to thioproline.

«3Hyp» относится к 3-гидроксипролину."3Hyp" refers to 3-hydroxyproline.

«4Hyp» относится к 4-гидроксипролину."4Hyp" refers to 4-hydroxyproline.

«NAG» относится к N-алкилглицину."NAG" refers to N-alkylglycine.

«NAPG» относится к N-алкилпентилглицину."NAPG" refers to N-alkylpentylglycine.

«Norval» относится к норвалину."Norval" refers to norvaline.

В одном варианте осуществления фрагменты или производные эксендина могут иметь С-конец, замещенный или незамещенный амидной группой, и могут быть выбраны из группы, состоящей из эксендина-4 (1-28) (SEQ ID NO:15), амида эксендина-4 (1-28), эксендина-4 (1-30) (SEQ ID NO:7), амида эксендина-4 (1-30), эксендина-4 (1-31) (SEQ ID NO:54), амида эксендина-4 (1-31), ¹⁴Leu²⁵Phe-эксендина-4 (SEQ ID NO: 55), амида ¹⁴Leu²⁵Phe-эксендина-4 и их фармацевтически приемлемых солей.In one embodiment, fragments or derivatives of exendin may have a C-terminus substituted or unsubstituted with an amide group and may be selected from the group consisting of exendin-4 (1-28) (SEQ ID NO:15), exendin-4 amide ( 1-28), exendin-4 (1-30) (SEQ ID NO:7), exendin-4 amide (1-30), exendin-4 (1-31) (SEQ ID NO:54), exendin-4 amide 4 (1-31), ¹⁴ Leu ²⁵ Phe-exendin-4 (SEQ ID NO: 55), ¹⁴ Leu ²⁵ Phe-exendin-4 amide, and pharmaceutically acceptable salts thereof.

СОСТАВ С КОНТРОЛИРУЕМЫМ ВЫСВОБОЖДЕНИЕМ COMPOSITION WITH CONTROLLED RELEASE

В соответствии с другими вариантами осуществления композиция или микросферы с контролируемым высвобождением могут содержать эксендин, GLP-1 или терапевтически эффективный аналог GLP-1 или эксендина в качестве активного ингредиента в количестве от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 весовых частей (вес.ч.) (например, от приблизительно 0,8 до приблизительно 6 вес.ч.) в расчете на 100 вес.ч. композиции или микросферы, содержащей: эксендин (такой как эксендин-4), GLP-1 или терапевтически эффективный аналог GLP-1 или эксендина (такой как аналог эксендина-4); биоразлагаемые полимеры; и материалы для покрытия. Например, композиция или микросферы с контролируемым высвобождением могут включать от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 частей, от приблизительно 0,1 до приблизительно 9 частей, от приблизительно 0,1 до приблизительно 8 частей, от приблизительно 0,1 до приблизительно 7 частей, от приблизительно 0,1 до приблизительно 6 частей, от приблизительно 0,1 до приблизительно 6 частей, от приблизительно 0,1 до приблизительно 5 частей, от приблизительно 0,1 до приблизительно 4 частей, от приблизительно 0,1 до приблизительно 3 частей, от приблизительно 0,5 до приблизительно 10 частей, от приблизительно 0,5 до приблизительно 9 частей, от приблизительно 0,5 до приблизительно 8 частей, от приблизительно 0,5 до приблизительно 7 частей, от приблизительно 0,5 до приблизительно 6 частей, от приблизительно 0,5 до приблизительно 6 частей, от приблизительно 0,5 до приблизительно 5 частей, от приблизительно 0,5 до приблизительно 4 частей, от приблизительно 0,5 до приблизительно 3 частей, от приблизительно 1 до приблизительно 10 частей, от приблизительно 1 до приблизительно 9 частей, от приблизительно 1 до приблизительно 8 частей, от приблизительно 1 до приблизительно 7 частей, от приблизительно 1 до приблизительно 6 частей, от приблизительно 1 до приблизительно 6 частей, от приблизительно 1 до приблизительно 5 частей, от приблизительно 1 до приблизительно 4 частей, от приблизительно 1 до приблизительно 3 частей, от приблизительно 2 до приблизительно 10 частей, от приблизительно 2 до приблизительно 9 частей, от приблизительно 2 до приблизительно 8 частей, от приблизительно 2 до приблизительно 7 частей, от приблизительно 2 до приблизительно 6 частей, от приблизительно 2 до приблизительно 6 частей, от приблизительно 2 до приблизительно 5 частей, от приблизительно 2 до приблизительно 4 частей, от приблизительно 3 до приблизительно 10 частей, от приблизительно 3 до приблизительно 9 частей, от приблизительно 3 до приблизительно 8 частей, от приблизительно 3 до приблизительно 7 частей, от приблизительно 3 до приблизительно 6 частей, от приблизительно 4 до приблизительно 10 частей, от приблизительно 4 до приблизительно 9 частей, от приблизительно 4 до приблизительно 8 частей, от приблизительно 4 до приблизительно 7 частей, от приблизительно 5 до приблизительно 10 частей, от приблизительно 5 до приблизительно 9 частей, от приблизительно 5 до приблизительно 8 частей, от приблизительно 6 до приблизительно 10 частей, приблизительно 6 до приблизительно 9 частей или от приблизительно 7 до приблизительно 10 частей эксендина или терапевтически эффективного аналога и/или GLP-1 или его терапевтически эффективного аналога в весовом отношении, в расчете на 100 весовых частей композиции или микросферы, содержащей эксендин, GLP-1 или терапевтически эффективный аналог GLP-1 или эксендина; биоразлагаемые полимеры; и материалы для покрытия. Когда количество эксендина, GLP-1 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина, содержащегося в композиции или микросферах в соответствии с настоящим изобретением, ниже вышеуказанного диапазона, эффективное действие эксендина, GLP-1 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина не может быть достигнуто, а когда количество эксендина, GLP-1 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина выше указанного диапазона, начальный выброс эксендина, GLP-1 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина увеличивается, вызывая тем самым побочные эффекты вследствие начального выброса, и, таким образом, предпочтительно, чтобы количество эксендина, GLP-1 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина находилось в вышеуказанном диапазоне.In accordance with other embodiments, the controlled release composition or microspheres may contain exendin, GLP-1, or a therapeutically effective GLP-1 analog or exendin as the active ingredient in an amount of from about 0.1 to about 10 parts by weight (wt.h.) (for example, from about 0.8 to about 6 wt.h.) per 100 wt.h. a composition or microsphere containing: exendin (such as exendin-4), GLP-1, or a therapeutically effective analogue of GLP-1 or exendin (such as an analogue of exendin-4); biodegradable polymers; and coating materials. For example, the controlled release composition or microspheres may include from about 0.1 to about 10 parts, from about 0.1 to about 9 parts, from about 0.1 to about 8 parts, from about 0.1 to about 7 parts, about 0.1 to about 6 parts, about 0.1 to about 6 parts, about 0.1 to about 5 parts, about 0.1 to about 4 parts, about 0.1 to about 3 parts, about 0.5 to about 10 parts, about 0.5 to about 9 parts, about 0.5 to about 8 parts, about 0.5 to about 7 parts, about 0.5 to about 6 parts, from about 0.5 to about 6 parts, from about 0.5 to about 5 parts, from about 0.5 to about 4 parts, from about 0.5 to about 3 parts, from approx. but 1 to about 10 parts, about 1 to about 9 parts, about 1 to about 8 parts, about 1 to about 7 parts, about 1 to about 6 parts, about 1 to about 6 parts, about 1 to about 5 parts, from about 1 to about 4 parts, from about 1 to about 3 parts, from about 2 to about 10 parts, from about 2 to about 9 parts, from about 2 to about 8 parts, from about 2 to about 7 parts, about 2 to about 6 parts, about 2 to about 6 parts, about 2 to about 5 parts, about 2 to about 4 parts, about 3 to about 10 parts, about 3 to about 9 parts , from about 3 to about 8 parts, from about 3 to about 7 parts, from n about 3 to about 6 parts, about 4 to about 10 parts, about 4 to about 9 parts, about 4 to about 8 parts, about 4 to about 7 parts, about 5 to about 10 parts, about 5 up to about 9 parts, about 5 to about 8 parts, about 6 to about 10 parts, about 6 to about 9 parts, or about 7 to about 10 parts of exendin or a therapeutically effective analogue and/or GLP-1 or a therapeutically effective thereof analogue in a weight ratio, based on 100 weight parts of the composition or microsphere containing exendin, GLP-1 or a therapeutically effective analogue of GLP-1 or exendin; biodegradable polymers; and coating materials. When the amount of exendin, GLP-1 or a therapeutically effective GLP-1 analog or exendin contained in a composition or microspheres according to the present invention is below the above range, the effective action of the exendin, GLP-1 or a therapeutically effective GLP-1 analog or exendin cannot be achieved, and when the amount of exendin, GLP-1 or a therapeutically effective GLP-1 analog or exendin is above the specified range, the initial surge of exendin, GLP-1 or a therapeutically effective GLP-1 analog or exendin increases, thereby causing side effects due to the initial surge , and thus it is preferable that the amount of exendin, GLP-1 or a therapeutically effective GLP-1 analog or exendin is in the above range.

Биоразлагаемый полимер относится ко всем полимерам, которые не наносят вреда человеку, поскольку при его введении в организм он может медленно разлагаться и выводиться из организма. Биоразлагаемый полимер может включать один или более (например, один, два, три, четыре, пять, шесть или более), выбираемых из группы, состоящей из полилактида (PLA), полигликолида (PGA), сополимера лактида и гликолида (PLGA), полиортоэфира, полиангидрида, полигидроксимасляной кислоты, поликапролактона и полиалкилкарбоната, и сополимеров одного или нескольких полимеров и полиэтиленгликоля (PEG), причем один или несколько полимеров могут быть в форме сополимера или простой смеси.A biodegradable polymer refers to all polymers that do not cause harm to humans, since when it is introduced into the body, it can slowly degrade and be excreted from the body. The biodegradable polymer may include one or more (e.g., one, two, three, four, five, six or more) selected from the group consisting of polylactide (PLA), polyglycolide (PGA), lactide-glycolide copolymer (PLGA), polyorthoester , polyanhydride, polyhydroxybutyric acid, polycaprolactone and polyalkyl carbonate, and copolymers of one or more polymers and polyethylene glycol (PEG), where one or more polymers may be in the form of a copolymer or a simple mixture.

Например, биоразлагаемый полимер может быть одним или несколькими, выбираемыми из группы, состоящей из сополимеров лактида и гликолида (PLGA), состоящих из RG502H (IV (характеристическая вязкость)=0,16-0,24 дл/г), RG503H (IV=0,32-0,44 дл/г) и RG504H (IV=0,45-0,60 дл/г) с соотношением лактид:гликолид 1:1 и RG752H (IV=0,14-0,22 дл/г) с соотношением лактид:гликолид 75:25, полилактидов (PLA), R202H (IV=0,16-0,24 дл/г) и R203H (IV=0,25-0,35 дл/г), которые предоставляются Evnik, Германия; сополимеров лактида и гликолида, 5050DL 2A (IV=0,15-0,25 дл/г), 5050DL 3A (IV=0,25-0,43 дл/г) и 5050DL 4A (IV=0,38-0,48 дл/г), которые представляют собой сополимеры, предоставляемые Evonik (Parsippany, NJ), США, с отношением лактид:гликолид 1:1; и т.п., но эквивалентные полимеры могут быть предоставлены/получены из любого подходящего источника.For example, the biodegradable polymer may be one or more selected from the group consisting of lactide and glycolide copolymers (PLGA) consisting of RG502H (IV (intrinsic viscosity)=0.16-0.24 dl/g), RG503H (IV= 0.32-0.44 dl/g) and RG504H (IV=0.45-0.60 dl/g) with lactide:glycolide ratio 1:1 and RG752H (IV=0.14-0.22 dl/g ) with a ratio of lactide:glycolide 75:25, polylactides (PLA), R202H (IV=0.16-0.24 dl/g) and R203H (IV=0.25-0.35 dl/g) provided by Evnik , Germany; copolymers of lactide and glycolide, 5050DL 2A (IV=0.15-0.25 dl/g), 5050DL 3A (IV=0.25-0.43 dl/g) and 5050DL 4A (IV=0.38-0, 48 dl/g), which are copolymers available from Evonik (Parsippany, NJ), USA, with a lactide:glycolide ratio of 1:1; and the like, but equivalent polymers may be provided/obtained from any suitable source.

В дальнейших вариантах осуществления биоразлагаемый полимер может представлять собой комплекс полимер-сахар, в котором сахар связан с: (1) полимером, выбираемым из группы, состоящей из полилактидов (PLA), полигликолидов (PGA), сополимеров лактида и гликолида (PLGA), полиортоэфиров, полиангидридов, полигидрокси-масляных кислот, поликапролактонов и полиалкилкарбонатов; (2) сополимером по меньшей мере двух полимерных групп; или (3) сополимером полиэтиленгликоля (ПЭГ) и одной полимерной группы.In further embodiments, the biodegradable polymer may be a polymer-sugar complex wherein the sugar is associated with: (1) a polymer selected from the group consisting of polylactides (PLA), polyglycolides (PGA), lactide-glycolide copolymers (PLGA), polyorthoesters , polyanhydrides, polyhydroxybutyric acids, polycaprolactones and polyalkyl carbonates; (2) a copolymer of at least two polymer groups; or (3) a copolymer of polyethylene glycol (PEG) and one polymer group.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения комплекс полимер-сахар может относиться к комплексу, в котором полимер является замещенным гидроксильной группой сахара. Сахар может включать моносахариды и полисахариды, которые включают от 1 до 8 сахаридных звеньев, причем каждое сахаридное звено включает от 3 до 6 гидроксильных групп, и сахароспирты с прямой цепью, включающие от 3 до 6 гидроксильных групп и имеющие молекулярную массу 20000 или менее. Сахароспирты могут включать маннит, пентаэритрит, сорбит, рибит и ксилит. Полимер соединяется с сахаром по трем или более гидроксильным группам, присутствующим в сахаре.In another embodiment of the present invention, a polymer-sugar complex may refer to a complex in which the polymer is substituted with a sugar hydroxyl group. The sugar may include monosaccharides and polysaccharides that include 1 to 8 saccharide units, each saccharide unit having 3 to 6 hydroxyl groups, and straight chain sugar alcohols having 3 to 6 hydroxyl groups and having a molecular weight of 20,000 or less. Sugar alcohols may include mannitol, pentaerythritol, sorbitol, ribitol, and xylitol. The polymer is linked to the sugar by three or more hydroxyl groups present in the sugar.

Комплекс полимер-сахар в соответствии с вышеуказанным вариантом осуществления обладает свойствами in vivo, подобными таковым полимера, который связан с сахаром, имеет различные скорости разложения в зависимости от типа используемого полимера и разлагается на безвредный полимер и сахар в организме, и, следовательно, он может быть подходящим для биоразлагаемого полимера. В одном варианте осуществления комплекс полимер-сахар может представлять собой комплекс PLA-глюкоза, комплекс PGA-глюкоза или комплекс PLGA-глюкоза, где комплекс PLGA-глюкоза может представлять собой комплекс, имеющий следующую структуру:The polymer-sugar complex according to the above embodiment has in vivo properties similar to those of a polymer that is bonded to sugar, has different degradation rates depending on the type of polymer used, and decomposes into a harmless polymer and sugar in the body, and therefore it can be suitable for biodegradable polymer. In one embodiment, the polymer-sugar complex may be a PLA-glucose complex, a PGA-glucose complex, or a PLGA-glucose complex, where the PLGA-glucose complex may be a complex having the following structure:

В микросферах с контролируемым высвобождением в соответствии с настоящим изобретением слой покрытия, сформированный на их поверхности, позволяет эффективно контролировать начальный выброс эксендина или GLP-1 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина, предотвращая тем самым побочные эффекты, вызываемые чрезмерным начальным выбросом. Биоразлагаемый полимер может использоваться без какого-либо ограничения вязкости.In the controlled release microspheres of the present invention, the coating layer formed on their surface allows effective control of the initial burst of exendin or GLP-1 or a therapeutically effective GLP-1 analogue or exendin, thereby preventing side effects caused by excessive initial burst. The biodegradable polymer can be used without any viscosity limitation.

В композиции/ составе с контролируемым высвобождением в соответствии с настоящим изобретением биоразлагаемый полимер играет роль матрицы для сохранения активного ингредиента (эксендина, GLP-1 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина), причем недостаточно низкая вязкость полимера не позволяет эффективно сохранять активный ингредиент, тем самым увеличивая начальный выброс, а чрезмерно высокая вязкость полимера вызывает уменьшение общего высвобождаемого количества активного ингредиента, тем самым уменьшая его биодоступность. В настоящем изобретении не только биоразлагаемый полимер, но также материалы покрытия, содержащиеся в композиции, играют роль контроля высвобождения лекарственного средства, и, таким образом, можно использовать биоразлагаемый полимер, имеющий относительно низкую вязкость. Следовательно, чтобы эффективно контролировать начальный выброс лекарственного средства и улучшить биодоступность, характеристическая вязкость (IV) биоразлагаемого полимера, которая измеряется для биоразлагаемого полимера, растворенного в хлороформе в концентрации 1% (в отношении веса к объему) при 25°С±0,1°C с использованием вискозиметра Уббелоде, может составлять от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,6 дл/г (например, от приблизительно 0,15 до приблизительно 0,31 дл/г или от приблизительно 0,16 до приблизительно 0,24 дл/г).In the controlled release composition/formulation according to the present invention, the biodegradable polymer acts as a matrix for the retention of the active ingredient (exendin, GLP-1 or a therapeutically effective GLP-1 analogue or exendin), and the insufficiently low viscosity of the polymer does not allow effective storage of the active ingredient, thereby increasing the initial release, and excessively high polymer viscosity causes a decrease in the total amount of active ingredient released, thereby reducing its bioavailability. In the present invention, not only the biodegradable polymer but also the coating materials contained in the composition play the role of drug release control, and thus a biodegradable polymer having a relatively low viscosity can be used. Therefore, in order to effectively control the initial release of the drug and improve the bioavailability, the intrinsic viscosity (IV) of the biodegradable polymer, which is measured for the biodegradable polymer dissolved in chloroform at a concentration of 1% (w/v) at 25°C ± 0.1° C using an Ubbelohde viscometer may be from about 0.1 to about 0.6 dl/g (e.g., from about 0.15 to about 0.31 dl/g or from about 0.16 to about 0.24 dl/g). G).

В композиции, составе или микросферах настоящего изобретения биоразлагаемый полимер играет роль матрицы для сохранения активного ингредиента во время высвобождения и контроля скорости высвобождения, причем его содержание в композиции или микросферах может составлять от приблизительно 85 до приблизительно 99,89 вес.ч. (например, от приблизительно 91 до приблизительно 99 вес.ч.) в расчете на 100 вес.ч. композиции/ состава или микросфер, содержащих активный ингредиент (эксендин, GLP-1 или терапевтически эффективный аналог GLP-1 или эксендина), биоразлагаемый полимер(ы) и материал(ы) покрытия.In the composition, composition, or microspheres of the present invention, the biodegradable polymer acts as a matrix to retain the active ingredient during release and control the release rate, and its content in the composition or microspheres can be from about 85 to about 99.89 wt.h. (for example, from about 91 to about 99 weight.h.) per 100 weight.h. compositions/formulations or microspheres containing the active ingredient (exendin, GLP-1 or a therapeutically effective analogue of GLP-1 or exendin), biodegradable polymer(s) and coating material(s).

Материал покрытия используется для предотвращения чрезмерного начального выброса и увеличения биодоступности активного ингредиента, и в микросферах настоящего изобретения он может быть в форме слоя покрытия на их поверхности. Материал покрытия может быть одним или несколькими (например, одним, двумя или тремя), выбираемыми из основных аминокислот, полипептидов и органических азотсодержащих соединений. Основная аминокислота может включать аргинин, лизин, гистидин и их производные. Полипептид может включать от 2 до 10 аминокислот (например, от 2 до 5 аминокислот), включая одну или более (например, одну, две или три), выбираемых из аргинина, лизина и гистидина. Полипептид может включать больше основных аминокислот, чем кислых аминокислот, тем самым проявляя основное свойство. Например, полипептид может представлять собой L-Ala-L-His-L-Lys, L-Arg-L-Phe, Gly-L-His, Gly-L-His-Gly, Gly-L-His-L-Lys L-His-Gly, L-His-Leu, L-Lys-L-Tyr-L-Lys, L-His-L-Val, L-Lys-L-Lys, L-Lys-L-Lys-L-Lys, L-Lys-L-Thr-L-Thr-L-Lys-L-Ser и т.п. Кроме того, органическое азотсодержащее соединение может представлять собой креатин, креатинин, мочевину и т.п.The coating material is used to prevent excessive initial release and increase the bioavailability of the active ingredient, and in the microspheres of the present invention it may be in the form of a coating layer on their surface. The coating material may be one or more (eg, one, two, or three) selected from basic amino acids, polypeptides, and organic nitrogen compounds. The basic amino acid may include arginine, lysine, histidine, and derivatives thereof. The polypeptide may comprise 2 to 10 amino acids (eg, 2 to 5 amino acids), including one or more (eg, one, two, or three) selected from arginine, lysine, and histidine. The polypeptide may include more basic amino acids than acidic amino acids, thereby exhibiting a basic property. For example, the polypeptide may be L-Ala-L-His-L-Lys, L-Arg-L-Phe, Gly-L-His, Gly-L-His-Gly, Gly-L-His-L-Lys L -His-Gly, L-His-Leu, L-Lys-L-Tyr-L-Lys, L-His-L-Val, L-Lys-L-Lys, L-Lys-L-Lys-L-Lys , L-Lys-L-Thr-L-Thr-L-Lys-L-Ser etc. In addition, the organic nitrogen-containing compound may be creatine, creatinine, urea, and the like.

Содержание материала покрытия, содержащегося в композиции настоящего изобретения или нанесенного на микросферы, может составлять от приблизительно 0,01 до приблизительно 5 весовых частей (например, от приблизительно 0,015 до приблизительно 3 частей, от приблизительно 0,01 до приблизительно 4, от приблизительно 0,01 до приблизительно 3, от приблизительно 0,01 до приблизительно 2, от приблизительно 0,01 до приблизительно 4, от приблизительно 0,01 до приблизительно 2, от приблизительно 0,015 до приблизительно 5, от приблизительно 0,015 до приблизительно 4, от приблизительно 0,015 до приблизительно 2, от приблизительно 0,05 до приблизительно 5, от приблизительно 0,05 до приблизительно 4, от приблизительно 0,05 до приблизительно 3, от приблизительно 0,05 до приблизительно 2, от приблизительно 0,1 до приблизительно 5, от приблизительно 0,1 до приблизительно 4, от приблизительно 0,1 до приблизительно 3, от приблизительно 0,1 до приблизительно 2, от приблизительно 0,5 до приблизительно 5, от приблизительно 0,05 до приблизительно 4, от приблизительно 0,05 до приблизительно 3, от приблизительно 0,05 до приблизительно 2, от приблизительно 1 до приблизительно 5, от приблизительно 1 до приблизительно 4, от приблизительно 1 до приблизительно 3, от приблизительно 1,5 до приблизительно 5, от приблизительно 1,5 до приблизительно 4, от приблизительно 1,5 до приблизительно 3, от приблизительно 2 до приблизительно 5, от приблизительно 2 до приблизительно 4, от приблизительно 3 до приблизительно 5, от приблизительно 3 до приблизительно 4 или от приблизительно 4 до приблизительно 5) по весу, в расчете на 100 вес.ч. композиции или микросфер, содержащих эксендин, GLP-1 или терапевтически эффективный аналог GLP-1 или эксендина, биоразлагаемый полимер(ы) и материал(ы) покрытия. Эффективный контроль высвобождения лекарственного средства не может быть достигнут, если содержание материала покрытия ниже вышеуказанного диапазона, тогда как эффект контроля начального выброса дополнительно не увеличивается, даже если содержание материала покрытия увеличивается до более высокого значения, чем вышеуказанный диапазон.The content of the coating material contained in the composition of the present invention or applied to the microspheres may be from about 0.01 to about 5 parts by weight (for example, from about 0.015 to about 3 parts, from about 0.01 to about 4, from about 0, 01 to about 3, about 0.01 to about 2, about 0.01 to about 4, about 0.01 to about 2, about 0.015 to about 5, about 0.015 to about 4, about 0.015 to about 2, about 0.05 to about 5, about 0.05 to about 4, about 0.05 to about 3, about 0.05 to about 2, about 0.1 to about 5, about 0.1 to about 4, about 0.1 to about 3, about 0.1 to about 2, about 0.5 to about 5, n about 0.05 to about 4, about 0.05 to about 3, about 0.05 to about 2, about 1 to about 5, about 1 to about 4, about 1 to about 3, about 1 .5 to about 5, about 1.5 to about 4, about 1.5 to about 3, about 2 to about 5, about 2 to about 4, about 3 to about 5, about 3 to about 4 or from about 4 to about 5) by weight, based on 100 wt.h. compositions or microspheres containing exendin, GLP-1 or a therapeutically effective analogue of GLP-1 or exendin, biodegradable polymer(s) and coating material(s). Effective drug release control cannot be achieved if the content of the coating material is lower than the above range, while the initial burst control effect is not further increased even if the content of the coating material is increased to a value higher than the above range.

Каждая микросфера с контролируемым высвобождением в соответствии с настоящим изобретением может иметь гладкую поверхность, покрытую материалом покрытия, и средний размер от приблизительно 1 до приблизительно 50 мкм (например, от приблизительно 5 до приблизительно 30 мкм, от приблизительно 1 до приблизительно 40 мкм, от приблизительно 1 до приблизительно 30 мкм, от приблизительно 1 до приблизительно 20 мкм, от приблизительно 1 до приблизительно 10 мкм, от приблизительно 5 до приблизительно 50 мкм, от приблизительно 5 до приблизительно 40 мкм, от приблизительно 5 до приблизительно 30 мкм, от приблизительно 5 до приблизительно 20 мкм, от приблизительно 5 до приблизительно 10 мкм, от приблизительно 10 до приблизительно 50 мкм, от приблизительно 10 до приблизительно 40 мкм, от приблизительно 10 до приблизительно 30 мкм, от приблизительно 10 до приблизительно 20 мкм, от приблизительно 20 до приблизительно 50 мкм, от приблизительно 20 до приблизительно 40 мкм, от приблизительно 20 до приблизительно 30 мкм, от приблизительно 30 до приблизительно 50 мкм, от приблизительно 30 до приблизительно 40 мкм или от приблизительно 40 до приблизительно 50 мкм). Гладкая поверхность микросферы позволяет достичь эффективного контроля начального выброса и превосходной биодоступности.Each controlled release microsphere of the present invention may have a smooth surface coated with a coating material and an average size of from about 1 to about 50 µm (e.g., from about 5 to about 30 µm, from about 1 to about 40 µm, from about 1 to about 30 µm, about 1 to about 20 µm, about 1 to about 10 µm, about 5 to about 50 µm, about 5 to about 40 µm, about 5 to about 30 µm, about 5 to about 20 µm, about 5 to about 10 µm, about 10 to about 50 µm, about 10 to about 40 µm, about 10 to about 30 µm, about 10 to about 20 µm, about 20 to about 50 µm, from about 20 to about 40 µm, from about 20 to approx. 30 µm, about 30 to about 50 µm, about 30 to about 40 µm, or about 40 to about 50 µm). The smooth surface of the microsphere allows for effective initial burst control and excellent bioavailability.

В отличие от традиционной формы, микросфера с контролируемым высвобождением или микросфера, приготовленная из композиции/ состава настоящего изобретения, покрыта материалом покрытия, что позволяет предотвратить чрезмерный/вредный начальный выброс и увеличение биодоступности, что не может быть достигнуто в случае традиционной микросферы, содержащей эксендин, GLP-1 или терапевтически эффективный аналог GLP-1 или эксендина. В частности, чрезмерный/вредный начальный выброс эксендина, GLP-1 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина вызывает различные побочные эффекты, такие как рвота, тошнота, головная боль и т.п., и, таким образом, очень важно снизить начальную величину выброса до 5% или ниже. Микросфера с контролируемым высвобождением или микросфера, приготовленная из композиции (или состава) настоящего изобретения, снижает высвобождаемое количество в течение первых 24 часов до 5% или ниже. Чтобы уменьшить побочные эффекты, вызываемые введением содержащей эксендин, GLP-1 или терапевтически эффективный аналог GLP-1 или эксендина микросферы с контролируемым высвобождением, начальная величина выброса в течение первого часа может составлять приблизительно 5% или ниже (например, приблизительно 4% или ниже, приблизительно 3% или ниже, приблизительно 2% или ниже, или приблизительно 1% или ниже. Микросферы настоящего изобретения содержат покровный слой из материала покрытия на их поверхности, что позволяет эффективно контролировать начальный выброс, чтобы устранить побочные эффекты, вызываемые чрезмерным/вредным начальным выбросом, и получить длительное и достаточное высвобождение лекарственного средства для достижения превосходной биодоступности.Unlike the traditional form, the controlled release microsphere or microsphere prepared from the composition/formulation of the present invention is coated with a coating material to prevent excessive/harmful initial release and increase bioavailability, which cannot be achieved in the case of a traditional microsphere containing exendin, GLP-1 or a therapeutically effective analogue of GLP-1 or exendin. In particular, excessive/harmful initial release of exendin, GLP-1 or a therapeutically effective GLP-1 analog or exendin causes various side effects such as vomiting, nausea, headache, etc., and thus it is very important to reduce the initial emission value to 5% or less. The controlled release microsphere or microsphere prepared from the composition (or composition) of the present invention reduces the amount released during the first 24 hours to 5% or less. To reduce the side effects caused by the administration of controlled release microspheres containing exendin, GLP-1 or a therapeutically effective GLP-1 analog or exendin, the initial burst during the first hour can be about 5% or less (for example, about 4% or less, about 3% or less, about 2% or less, or about 1% or less The microspheres of the present invention contain a coating layer of a coating material on their surface, which allows effective control of the initial burst to eliminate the side effects caused by excessive/harmful initial burst. , and obtain a sustained and sufficient release of the drug to achieve excellent bioavailability.

В варианте осуществления настоящего изобретения состав или микросферы могут, кроме того, содержать наполнители, такие как защитные коллоиды и/или стабилизаторы.In an embodiment of the present invention, the formulation or microspheres may further contain excipients such as protective colloids and/or stabilizers.

Композиция или микросферы могут, кроме того, содержать один или более защитных коллоидов, выбираемых из поливиниловых спиртов, альбуминов, поливинилпирролидонов, желатинов и т.п. Хотя защитный коллоид не имеет особого эффекта для предотвращения чрезмерного/вредного начального выброса активного ингредиента, содержащегося в микросферах, он играет роль в предотвращении агрегации между микросферами и улучшении диспергируемости. Учитывая такую роль, содержание защитного коллоида может составлять от приблизительно 0,02% (в весовом отношении) до приблизительно 1,0% (в весовом отношении) (например, от приблизительно 0,02% до приблизительно 0,8%, от приблизительно 0,02% до приблизительно 0,6%, от приблизительно 0,02% до приблизительно 0,4%, от приблизительно 0,05% до приблизительно 1,0%, от приблизительно 0,04% до приблизительно 0,8%, от приблизительно 0,05% до приблизительно 0,5%, от приблизительно 0,05% до приблизительно 0,4%, от приблизительно 0,05% до приблизительно 0,3%, от приблизительно 0,05% до приблизительно 0,2%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 1,0%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 0,8%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 0,6%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 0,4%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 0,3%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 0,2%, от приблизительно 0,2% до приблизительно 1,0%, от приблизительно 0,2% до приблизительно 0,8%, от приблизительно 0,2% до приблизительно 0,6%, от приблизительно 0,2% до приблизительно 0,4%, от приблизительно 0,4% до приблизительно 1,0%, от приблизительно 0,4% до приблизительно 0,8%, от приблизительно 0,4% до приблизительно 0,6%, от приблизительно 0,6% до приблизительно 1,0%, от приблизительно 0,6% до приблизительно 0,8% или от приблизительно 0,8% до приблизительно 1,0%) в расчете на вес композиции, состава или микросфер, содержащих эксендин, GLP-1 или терапевтически эффективный аналог GLP-1 или эксендина, биоразлагаемый полимер(ы) и материал(ы) покрытия.The composition or microspheres may further contain one or more protective colloids selected from polyvinyl alcohols, albumins, polyvinyl pyrrolidones, gelatins, and the like. While the protective colloid has no particular effect in preventing excessive/harmful initial release of the active ingredient contained in the microspheres, it does play a role in preventing aggregation between the microspheres and improving dispersibility. Given this role, the protective colloid content may be from about 0.02% (w/w) to about 1.0% (w/w) (e.g., from about 0.02% to about 0.8%, from about 0 02% to about 0.6%, from about 0.02% to about 0.4%, from about 0.05% to about 1.0%, from about 0.04% to about 0.8%, from about 0.05% to about 0.5%, about 0.05% to about 0.4%, about 0.05% to about 0.3%, about 0.05% to about 0.2% , from about 0.1% to about 1.0%, from about 0.1% to about 0.8%, from about 0.1% to about 0.6%, from about 0.1% to about 0, 4%, about 0.1% to about 0.3%, about 0.1% to about 0.2%, about 0.2% to about 1.0%, about 0.2% to about 0.8%, from about 0.2% to about 0.6%, from about 0.2% to about 0.4%, from about 0.4% to about 1.0%, from about 0.4% to about 0.8%, from about 0, 4% to about 0.6%, about 0.6% to about 1.0%, about 0.6% to about 0.8%, or about 0.8% to about 1.0%), calculated by weight of the composition, formulation or microspheres containing exendin, GLP-1 or a therapeutically effective analogue of GLP-1 or exendin, biodegradable polymer(s) and coating material(s).

Кроме того, для улучшения стабильности микросфер во время лиофилизации композиция/ состав или микросферы настоящего изобретения могут дополнительно содержать наполнители, выбираемые из маннита, трегалозы, сахарозы, натрий-карбоксиметилцеллюлозы и т.п. в количестве от приблизительно 5% (в весовом отношении) до приблизительно 30% (в весовом отношении), например от приблизительно 10% (в весовом отношении) до приблизительно 20% (в весовом отношении) в расчете на вес композиции или микросфер, содержащих эксендин, GLP-1 или терапевтически эффективный аналог GLP-1 или эксендина, биоразлагаемый полимер(ы) и материал(ы) покрытия.In addition, to improve the stability of the microspheres during lyophilization, the composition/formulation or microspheres of the present invention may further contain excipients selected from mannitol, trehalose, sucrose, sodium carboxymethyl cellulose, and the like. in an amount of from about 5% (w/w) to about 30% (w/w), for example, from about 10% (w/w) to about 20% (w/w) based on the weight of the exendin-containing composition or microspheres , GLP-1 or a therapeutically effective analogue of GLP-1 or exendin, biodegradable polymer(s) and coating material(s).

Кроме того, композиция, состав или микросфера настоящего изобретения могут дополнительно содержать любые добавки и наполнители, обычно используемые при приготовлении лекарственного средства, вид и содержание которых могут быть легко определены специалистом в соответствующей области техники.In addition, the composition, composition or microsphere of the present invention may further contain any additives and excipients commonly used in the preparation of a medicinal product, the type and content of which can be easily determined by a person skilled in the relevant field of technology.

Содержащие эксендин, GLP-1 или терапевтически эффективный аналог GLP-1 или эксендина микросферы с контролируемым высвобождением, используемые в способах настоящего изобретения, могут быть приготовлены различными способами, например, путем нанесения покрытия на поверхность микросфер путем суспендирования микросфер в растворе материала покрытия во время или после приготовления микросфер, чтобы приготовить микросферы с контролируемым высвобождением. Способ приготовления микросфер может быть выполнен методом двойной эмульсии (W/O/W-методом), методом одной (единственной) эмульсии (O/W методом), методом разделения фаз, методом распылительной сушки и т.п.Controlled release microspheres containing exendin, GLP-1, or a therapeutically effective GLP-1 or exendin analog used in the methods of the present invention can be prepared in various ways, for example, by coating the surface of the microspheres by suspending the microspheres in a coating material solution during or after preparing the microspheres, to prepare controlled release microspheres. The microsphere preparation method can be performed by the double emulsion method (W/O/W method), the single emulsion method (O/W method), the phase separation method, the spray drying method, and the like.

В частности, способ приготовления содержащих эксендин, GLP-1 или терапевтически эффективный аналог GLP-1 или эксендина микросфер с контролируемым высвобождением может включать стадии: смешивания активного(ых) агента(ов) и биоразлагаемого полимера(ов) для получения эмульсия типа «вода в масле» (W/O-типа); или гомогенной смеси; и эмульгирование путем добавления эмульсии или гомогенной смеси в водный раствор материала покрытия для формирования слоя покрытия.In particular, a method for preparing controlled release microspheres containing exendin, GLP-1 or a therapeutically effective GLP-1 analog or exendin analog may include the steps of: mixing the active agent(s) and the biodegradable polymer(s) to form a water-in-water emulsion. oil" (W / O-type); or homogeneous mixture; and emulsifying by adding an emulsion or homogeneous mixture to an aqueous solution of the coating material to form a coating layer.

Конкретнее, в случае использования метода двойной эмульсии, способ может включать стадии эмульгирования путем смешивания водного раствора активного ингредиента(ов) и биоразлагаемого полимера, растворенного в органическом растворителе, с образованием первичной эмульсии (типа «вода в масле», W/O-типа); суспендирования эмульсии в водном растворе материала покрытия для образования эмульсии W/O/W-типа; нагревания эмульсии W/O/W-типа для удаления растворителя и отверждения полученных микросфер; сбора и промывки отверженных микросфер; и лиофилизации микросфер. Органический растворитель может быть любым органическим растворителем, который способен образовывать эмульсию при растворении биоразлагаемого полимера и затем быть смешанным с водным раствором, и, например, он может быть одним или несколькими, выбираемыми из группы, состоящей из хлороформа, этилацетата, метиленхлорида и метилэтилкетона (например, метиленхлорида). В этом случае материал покрытия содержится во вторичной водной фазе (внешняя водная фаза эмульсии W/O/W-типа), чтобы сформировать слой покрытия на внешней стороне микросфер, включающих по меньшей мере один активный ингредиент (например, эксендин, GLP-1 или терапевтически эффективный аналог GLP-1 или эксендина-4 или их комбинацию) и биоразлагаемый полимер при удалении органического растворителя.More specifically, in the case of a double emulsion method, the method may include the steps of emulsifying by mixing an aqueous solution of the active ingredient(s) and a biodegradable polymer dissolved in an organic solvent to form a primary emulsion (water-in-oil, W/O-type) ; suspending the emulsion in an aqueous solution of the coating material to form a W/O/W-type emulsion; heating the W/O/W-type emulsion to remove the solvent and cure the obtained microspheres; collection and washing of rejected microspheres; and lyophilization of microspheres. The organic solvent may be any organic solvent which is capable of emulsifying upon dissolving the biodegradable polymer and then being mixed with an aqueous solution, and for example it may be one or more selected from the group consisting of chloroform, ethyl acetate, methylene chloride and methyl ethyl ketone (for example , methylene chloride). In this case, the coating material is contained in a secondary aqueous phase (the outer aqueous phase of a W/O/W-type emulsion) to form a coating layer on the outside of the microspheres comprising at least one active ingredient (e.g. exendin, GLP-1 or therapeutic an effective analogue of GLP-1 or exendin-4, or a combination thereof) and a biodegradable polymer upon removal of the organic solvent.

В качестве альтернативы, если используется метод одной эмульсии, он может включать стадии растворения активного ингредиента(ов) и биоразлагаемого полимера в органическом растворителе с образованием гомогенной смеси; добавления водного раствора, содержащего материал покрытия, к полученной смеси для образования эмульсии; нагревания эмульсии для удаления растворителя и отверждения полученных микросфер; сбора и промывки отверженных микросфер; и лиофилизации микросфер. Органический растворитель может представлять собой любой органический растворитель, который способен полностью смешиваться с активным ингредиентом(ами) и биоразлагаемым полимером(ами) с образованием гомогенной смеси и смешиваться с водным раствором с образованием эмульсии. Например, органический растворитель может представлять собой смешанный растворитель, в котором смешаны один или несколько, выбираемых из группы, состоящей из спиртов, содержащих от 1 до 5 атомов углерода, ледяной уксусной кислоты, муравьиной кислоты, диметилсульфоксида и н-метилпирролидона, и один или несколько, выбираемых из группы, состоящей из хлороформа, этилацетата, метилэтилкетона и метиленхлорида, и, например, в котором смешаны метанол и метиленхлорид. В этом случае, эмульгируя гомогенную смесь биоразлагаемого полимера и активного ингредиента(ов) и добавляя материал покрытия в водный раствор для удаления органического растворителя, на поверхности окончательно полученных микросфер содержится слой покрытия.Alternatively, if a single emulsion method is used, it may include the steps of dissolving the active ingredient(s) and the biodegradable polymer in an organic solvent to form a homogeneous mixture; adding an aqueous solution containing the coating material to the resulting mixture to form an emulsion; heating the emulsion to remove the solvent and curing the resulting microspheres; collection and washing of rejected microspheres; and lyophilization of microspheres. The organic solvent can be any organic solvent that is fully miscible with the active ingredient(s) and biodegradable polymer(s) to form a homogeneous mixture and miscible with an aqueous solution to form an emulsion. For example, the organic solvent may be a mixed solvent in which are mixed one or more selected from the group consisting of alcohols containing from 1 to 5 carbon atoms, glacial acetic acid, formic acid, dimethyl sulfoxide and n-methylpyrrolidone, and one or more selected from the group consisting of chloroform, ethyl acetate, methyl ethyl ketone and methylene chloride, and, for example, in which methanol and methylene chloride are mixed. In this case, by emulsifying the homogeneous mixture of the biodegradable polymer and the active ingredient(s) and adding the coating material to an aqueous solution to remove the organic solvent, a coating layer is provided on the surface of the final microspheres.

Способ приготовления микросфер с контролируемым высвобождением может включать стадии смешивания активного(ых) ингредиента(ов) и биоразлагаемого полимера с образованием эмульсии или гомогенной смеси; затвердевания полученной эмульсии или гомогенной смеси для приготовления первичных микросфер; и суспендирования полученных первичных микросфер в водном растворе материала покрытия для образования слоя покрытия на каждой микросфере.The process for preparing controlled release microspheres may include the steps of mixing the active ingredient(s) and the biodegradable polymer to form an emulsion or homogeneous mixture; solidifying the resulting emulsion or homogeneous mixture for the preparation of primary microspheres; and suspending the obtained primary microspheres in an aqueous solution of the coating material to form a coating layer on each microsphere.

Способ отверждения не ограничивается и может представлять собой любой способ отверждения, обычно используемый в соответствующей области техники, например метод разделения фаз или метод распылительной сушки. Конкретнее, если на стадии отверждения используется метод разделения фаз, он может включать следующие стадии: смешивания водного раствора активного ингредиента(ов) и биоразлагаемого полимера, растворенного в органическом растворителе, с образованием эмульсии, или смешивания активного ингредиента(ов) и биоразлагаемого полимера в смешанном растворителе с образованием гомогенного раствора - смеси; добавления масла, такого как силиконовое масло, к полученной эмульсии или раствору для приготовления первичных микросфер; добавления нерастворителя для биоразлагаемого полимера, такого как смешанный растворитель из спирта, содержащего от 1 до 5 атомов углерода, и алкана, содержащего от 1 до 12 атомов углерода, такого как смешанный растворитель из этанола и гептана, для удаления органического растворителя из микросфер и отверждения микросфер; суспендирования полученных микросфер в водном растворе материала покрытия с образованием слоя покрытия на каждой микросфере; и сбора, промывки и лиофилизации микросфер со сформированным слоем покрытия.The curing method is not limited, and may be any curing method commonly used in the related art, such as a phase separation method or a spray drying method. More specifically, if a phase separation method is used in the curing step, it may include the following steps: mixing an aqueous solution of the active ingredient(s) and a biodegradable polymer dissolved in an organic solvent to form an emulsion, or mixing the active ingredient(s) and a biodegradable polymer in a mixed solvent to form a homogeneous solution - a mixture; adding an oil, such as silicone oil, to the resulting emulsion or solution to prepare the primary microspheres; adding a non-solvent for biodegradable polymer such as a mixed solvent of an alcohol containing 1 to 5 carbon atoms and an alkane containing 1 to 12 carbon atoms such as a mixed solvent of ethanol and heptane to remove the organic solvent from the microspheres and cure the microspheres ; suspending the resulting microspheres in an aqueous solution of the coating material to form a coating layer on each microsphere; and collecting, washing and lyophilizing the coated microspheres.

Органический растворитель может быть одним или несколькими (например, одним, двумя, тремя или четырьмя), выбираемыми из группы, состоящей из хлороформа, этилацетата, метиленхлорида и метилэтилкетона (например, метиленхлорида). Смешанный растворитель может представлять собой растворитель, в котором смешаны один или несколько (например, один, два, три, четыре, пять или более), выбираемых из группы, состоящей из по меньшей мере одного спирта, содержащего от 1 до 5 атомов углерода, ледяной уксусной кислоты, муравьиной кислоты, диметилсульфоксида и н-метилпирролидона, и один или несколько (например, один, два, три или четыре), выбираемых из группы, состоящей из хлороформа, этилацетата, метилэтилкетона и метиленхлорида, (например, смешанный растворитель из метанола и метиленхлорида).The organic solvent may be one or more (eg one, two, three or four) selected from the group consisting of chloroform, ethyl acetate, methylene chloride and methyl ethyl ketone (eg methylene chloride). The mixed solvent may be a solvent in which one or more (for example, one, two, three, four, five or more) selected from the group consisting of at least one alcohol containing from 1 to 5 carbon atoms, icy acetic acid, formic acid, dimethyl sulfoxide and n-methylpyrrolidone, and one or more (for example, one, two, three or four) selected from the group consisting of chloroform, ethyl acetate, methyl ethyl ketone and methylene chloride, (for example, a mixed solvent of methanol and methylene chloride).

В качестве альтернативы, если используется способ распылительной сушки, способ может включать стадии: смешивания водного раствора активного ингредиента(ов) и биоразлагаемого полимера, растворенного в органическом растворителе, с образованием эмульсии, или смешивания активного ингредиента(ов) и биоразлагаемого полимера в одном растворителе или смешанном растворителе с образованием гомогенного раствора - смеси; сушки распылением полученной эмульсии или раствора для приготовления первичных микросфер; суспендирования полученных первичных микросфер в водном растворе материала покрытия для образования слоя покрытия на каждой микросфере; и промывки и лиофилизации микросфер со сформированным слоем покрытия.Alternatively, if a spray drying method is used, the method may include the steps of: mixing an aqueous solution of the active ingredient(s) and a biodegradable polymer dissolved in an organic solvent to form an emulsion, or mixing the active ingredient(s) and a biodegradable polymer in the same solvent, or mixed solvent to form a homogeneous solution - a mixture; spray drying the resulting emulsion or solution to prepare primary microspheres; suspending the obtained primary microspheres in an aqueous solution of the coating material to form a coating layer on each microsphere; and washing and lyophilizing the microspheres with the formed coating layer.

Органический растворитель может быть одним или несколькими (например, одним, двумя, тремя или четырьмя), выбираемыми из группы, состоящей из хлороформа, этилацетата, метиленхлорида и метилэтилкетона (например, метиленхлорида). Единственный растворитель может быть одним или несколькими (например, одним, двумя, тремя, четырьмя или пятью), выбираемыми из группы, состоящей из ледяной уксусной кислоты и муравьиной кислоты, и смешанный растворитель может представлять собой растворитель, в котором смешаны один или несколько (например, один, два, три, четыре, пять или более), выбираемых из группы, состоящей из по меньшей мере одного спирта, содержащего от 1 до 5 атомов углерода, ледяной уксусной кислоты, муравьиной кислоты, диметилсульфоксида и н-метилпирролидона, и один или несколько, выбираемых из группы, состоящей из хлороформа, этилацетата, метилэтилкетона и метиленхлорида, (например, смешанный растворитель из метанола и метиленхлорида).The organic solvent may be one or more (eg one, two, three or four) selected from the group consisting of chloroform, ethyl acetate, methylene chloride and methyl ethyl ketone (eg methylene chloride). The single solvent may be one or more (for example, one, two, three, four or five) selected from the group consisting of glacial acetic acid and formic acid, and the mixed solvent may be a solvent in which one or more (for example , one, two, three, four, five or more) selected from the group consisting of at least one alcohol containing from 1 to 5 carbon atoms, glacial acetic acid, formic acid, dimethyl sulfoxide and n-methylpyrrolidone, and one or several selected from the group consisting of chloroform, ethyl acetate, methyl ethyl ketone and methylene chloride (for example, a mixed solvent of methanol and methylene chloride).

Способ может, кроме того, включать стадию добавления защитного коллоидного материала любым обычным способом, например, защитный коллоидный материал может быть добавлен во время стадии покрытия микросфер материалом покрытия.The method may further include the step of adding the protective colloidal material in any conventional manner, for example the protective colloidal material may be added during the step of coating the microspheres with the coating material.

Концентрация материала покрытия, растворенного в водной фазе или в водном растворе, может составлять от приблизительно 0,01 М до приблизительно 1 М (например, от приблизительно 0,1 М до приблизительно 0,5 М, от приблизительно 0,01 М до приблизительно 0,8 М, от приблизительно 0,01 М до приблизительно 0,6 М, от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,4 М, от приблизительно 0,1 до приблизительно 1 М, от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,8 М, от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,6 М, от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,4 М, от приблизительно 0,2 до приблизительно 1 М, от приблизительно 0,2 М до приблизительно 0,8 М, от приблизительно 0,2 М до приблизительно 0,6 М, от приблизительно 0,2 М до приблизительно 0,4 М, от приблизительно 0,4 до приблизительно 1 М, от приблизительно 0,4 М до приблизительно 0,8 М, от приблизительно 0,4 М до приблизительно 0,6 М, от приблизительно 0,6 до приблизительно 1 М, от приблизительно 0,6 до приблизительно 0,8 М или от приблизительно 0,8 до приблизительно 1 М). Более низкая концентрация материала покрытия, чем указанный выше диапазон, не позволяет полностью покрыть поверхность микросфер материалом покрытия, тогда как более высокая концентрация материала покрытия, чем указанный выше диапазон, приводит к перенасыщенному раствору материала покрытия, что не может привести к улучшению эффекта контроля начального выброса, и, таким образом, концентрация материала покрытия может находиться в пределах вышеуказанного диапазона.The concentration of coating material dissolved in the aqueous phase or aqueous solution may be from about 0.01 M to about 1 M (for example, from about 0.1 M to about 0.5 M, from about 0.01 M to about 0 .8 M, from about 0.01 M to about 0.6 M, from about 0.01 to about 0.4 M, from about 0.1 to about 1 M, from about 0.1 to about 0.8 M , from about 0.1 to about 0.6 M, from about 0.1 to about 0.4 M, from about 0.2 to about 1 M, from about 0.2 M to about 0.8 M, from about 0.2M to about 0.6M, about 0.2M to about 0.4M, about 0.4M to about 1M, about 0.4M to about 0.8M, about 0 .4 M to about 0.6 M, from about 0.6 to about 1 M, from about 0.6 to about 0.8 M, or from about 0.8 to at about 1 M). A lower concentration of coating material than the above range does not completely cover the surface of the microspheres with the coating material, while a higher concentration of coating material than the above range leads to a supersaturated solution of the coating material, which cannot lead to an improvement in the effect of controlling the initial emission , and thus the concentration of the coating material may be within the above range.

ВВЕДЕНИЕINTRODUCTION

Композицию с контролируемым высвобождением настоящего изобретения можно вводить пероральным или парентеральным путем (например, парентеральным путем), таким как внутривенный путь, подкожный путь, внутримышечный путь, внутрибрюшинный путь и т.п. Следовательно, в одном варианте осуществления настоящего изобретения композицию или состав с контролируемым высвобождением можно применять в виде раствора для инъекций в форме дисперсного раствора. Эффективное количество композиции может быть подходящим образом отрегулировано в соответствии с возрастом субъекта, видом и серьезностью заболевания, а также состоянием субъекта, и доза активного ингредиента в композиции может составлять от приблизительно 0,01 до приблизительно 100 мкг/кг/день (например, от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 мкг/кг/день), которые можно вводить сразу или дробно за несколько раз. Точное требуемое количество будет варьировать от полипептида к полипептиду и от субъекта к субъекту, в зависимости от вида, возраста и общего состояния субъекта, тяжести заболевания, которое подвергают лечению, конкретного используемого полипептида, способа его введения и т.п. Таким образом, невозможно указать точное «инсулинотропное количество» или количество, применимое для лечения болезни или повреждения нейронов. Однако соответствующее количество может быть определено специалистом со средним уровнем компетентности в данной области техники с использованием только обычных экспериментов.The controlled release composition of the present invention may be administered by the oral or parenteral route (eg parenteral route), such as intravenous route, subcutaneous route, intramuscular route, intraperitoneal route, and the like. Therefore, in one embodiment of the present invention, the controlled release composition or formulation may be administered as an injection solution in the form of a dispersed solution. The effective amount of the composition may be appropriately adjusted according to the age of the subject, the type and severity of the disease, and the condition of the subject, and the dosage of the active ingredient in the composition may be from about 0.01 to about 100 μg/kg/day (e.g., from about 0.1 to about 10 mcg/kg/day), which can be given all at once or in divided doses. The exact amount required will vary from polypeptide to polypeptide and from subject to subject, depending on the species, age and general condition of the subject, the severity of the disease being treated, the particular polypeptide used, its route of administration, and the like. Thus, it is not possible to specify an exact "insulinotropic amount" or an amount useful for treating neuronal disease or damage. However, the appropriate amount can be determined by one of ordinary skill in the art using only routine experimentation.

Специалист в данной области техники поймет, как контролировать эффективность лечения, и как соответствующим образом корректировать лечение. Например, уровни глюкозы в крови можно контролировать с использованием нормогликемии, которая является оптимальным эффектом лечения. Если уровни глюкозы в крови выше предпочтительных уровней, то количество вводимого полипептида должно быть увеличено, а, если уровни глюкозы в крови ниже предпочтительных уровней, тогда количество вводимого полипептида будет уменьшено.One skilled in the art will understand how to monitor the effectiveness of the treatment, and how to adjust the treatment accordingly. For example, blood glucose levels can be controlled using normoglycemia, which is the optimal effect of treatment. If blood glucose levels are above preferred levels, then the amount of polypeptide administered should be increased, and if blood glucose levels are below preferred levels, then the amount of polypeptide administered will be reduced.

Соединения можно вводить перорально, внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно, местно, чрескожно, локально, системно, интравентрикулярно, интрацеребрально, субдурально или интратекально. Специалист в данной области техники должен знать, как модифицировать способ введения, фармакологический носитель или другие параметры для оптимизации инсулинотропных эффектов. Количество вводимого активного соединения будет, конечно, зависеть от субъекта, подвергаемого лечению, веса субъекта, способа введения и суждения лечащего врача.The compounds can be administered orally, intravenously, intramuscularly, intraperitoneally, topically, transdermally, locally, systemically, intraventricularly, intracerebral, subdurally or intrathecally. One skilled in the art would know how to modify the route of administration, the pharmacological carrier, or other parameters to optimize insulinotropic effects. The amount of active compound administered will, of course, depend on the subject being treated, the weight of the subject, the route of administration, and the judgment of the attending physician.

В зависимости от предлагаемого способа введения фармацевтические композиции могут быть в форме твердых, полутвердых или жидких лекарственных форм, таких как, например, таблетки, суппозитории, пилюли, капсулы, порошки, жидкости, суспензии, лосьоны, кремы, гели или т.п., например, в стандартной лекарственной форме, подходящей для однократного введения точной дозы. Композиции будут включать, как отмечено выше, эффективное количество выбранного лекарственного средства в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем и, кроме того, могут включать другие лекарственные средства, фармацевтические агенты, носители, адъюванты, разбавители и т.д. Смотрите, например, Remington's Pharmaceutical Sciences, последнее издание, EW Martin Mack Pub. Co., Easton, PA, в котором раскрыты типичные носители и общепринятые способы приготовления фармацевтических композиций, которые могут использоваться в сочетании с приготовлением составов полипептидов, и который включен сюда посредством ссылки. В случае твердых композиций общепринятые нетоксичные твердые носители включают, например, фармацевтические сорта маннита, лактозы, крахмала, стеарата магния, сахарина натрия, талька, целлюлозы, глюкозы, сахарозы, карбоната магния и т.п. Жидкие фармацевтически вводимые композиции могут быть получены, например, путем растворения, диспергирования и т.д. активного соединения, описанного здесь, и необязательных фармацевтических адъювантов в наполнителе, таком как, например, вода, солевой водный раствор декстрозы, глицерин, этанол и т.п., чтобы тем самым образовать раствор или суспензию. При желании вводимая фармацевтическая композиция может также содержать незначительные количества нетоксичных вспомогательных веществ, таких как смачивающие вещества или эмульгаторы, рН-буферные агенты и т.п., например, ацетат натрия, сорбитмонолаурат, триэтаноламин-ацетат натрия, олеат триэтаноламина и т.д. Фактические способы приготовления таких лекарственных форм известны или будут очевидны специалистам в данной области техники; например, смотрите Remington's Pharmaceutical Sciences, ссылка на который приведена выше.Depending on the proposed route of administration, the pharmaceutical compositions may be in the form of solid, semi-solid or liquid dosage forms such as, for example, tablets, suppositories, pills, capsules, powders, liquids, suspensions, lotions, creams, gels or the like, for example, in unit dosage form suitable for a single administration of an accurate dose. The compositions will include, as noted above, an effective amount of the selected drug in combination with a pharmaceutically acceptable carrier, and may also include other drugs, pharmaceutical agents, carriers, adjuvants, diluents, and the like. See, for example, Remington's Pharmaceutical Sciences, latest edition, EW Martin Mack Pub. Co., Easton, PA, which discloses typical carriers and conventional methods for the preparation of pharmaceutical compositions that can be used in conjunction with the preparation of polypeptide formulations, and which is incorporated here by reference. In the case of solid compositions, conventional non-toxic solid carriers include, for example, pharmaceutical grades of mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharin, talc, cellulose, glucose, sucrose, magnesium carbonate, and the like. Liquid pharmaceutically administrable compositions can be prepared, for example, by dissolving, dispersing, etc. the active compound described herein and optional pharmaceutical adjuvants in a vehicle such as, for example, water, dextrose saline, glycerol, ethanol, and the like, to thereby form a solution or suspension. If desired, the pharmaceutical composition administered may also contain minor amounts of non-toxic excipients such as wetting agents or emulsifiers, pH buffering agents and the like, for example sodium acetate, sorbitol monolaurate, sodium triethanolamine acetate, triethanolamine oleate, etc. The actual methods for preparing such dosage forms are known or will be apparent to those skilled in the art; for example, see Remington's Pharmaceutical Sciences linked above.

Для перорального введения тонкоизмельченные порошки или гранулы могут содержать разбавляющие, диспергирующие и/или поверхностно-активные вещества и могут быть представлены в воде или в сиропе, в капсулах или саше в сухом состоянии или в неводном растворе или суспензии, в которую могут быть включены суспендирующие агенты, в таблетках, в которые могут быть включены связующие и смазывающие вещества, или в суспензии в воде или сиропе. Там, где это желательно или необходимо, могут быть включены ароматизаторы, консерванты, суспендирующие, загущающие вещества или эмульгаторы. В некоторых вариантах осуществления форма для перорального введения представляет собой таблетки или гранулы, которые могут быть покрыты оболочкой. Парентеральное введение, если оно используется, как правило, характеризуется инъекцией.For oral administration, finely divided powders or granules may contain diluents, dispersants and/or surfactants and may be presented in water or syrup, in dry capsules or sachets, or in a non-aqueous solution or suspension in which suspending agents may be included. , in tablets, in which binders and lubricants may be included, or in suspension in water or syrup. Where desired or necessary, flavoring agents, preservatives, suspending agents, thickeners, or emulsifiers may be included. In some embodiments, the oral administration form is a tablet or granule, which may be coated. Parenteral administration, if used, is typically characterized by injection.

Инъецируемые составы могут быть приготовлены в обычных формах, либо в виде жидких растворов или суспензий, в твердых формах, подходящих для растворения или суспендирования в жидкости перед инъекцией, либо в виде эмульсий. Совсем недавно пересмотренный подход для парентерального введения включает использование системы с медленным высвобождением или с замедленным высвобождением, так что поддерживается постоянный уровень дозировки. Смотрите, например, патент США с № 3710795, который включен сюда посредством ссылки.Injectable formulations may be prepared in conventional forms, either as liquid solutions or suspensions, in solid forms suitable for dissolution or suspension in a liquid prior to injection, or as emulsions. More recently, a revised approach for parenteral administration involves the use of a slow release or sustained release system so that a constant dosage level is maintained. See, for example, US patent No. 3710795, which is incorporated here by reference.

Для местного введения могут использоваться жидкости, суспензии, лосьоны, кремы, гели или т.п. при условии, что активное соединение может быть доставлено на поверхность кожи.For topical administration, liquids, suspensions, lotions, creams, gels or the like can be used. provided that the active compound can be delivered to the surface of the skin.

ПРИМЕРЫEXAMPLES

Следующие примеры представлены для предоставления специалистам со средним уровнем компетентности в данной области техники полного раскрытия и описания того, каким образом заявленные здесь соединения, композиции, изделия, устройства и/или способы изготавливаются и оцениваются, и предназначены быть просто примером раскрытия настоящего изобретения и не предназначены для ограничения объема того, что авторы настоящего изобретения рассматривают как раскрытие своего изобретения. Были предприняты усилия для обеспечения точности в отношении чисел (например, количеств, температуры и т.д.), но следует учитывать некоторые ошибки и отклонения.The following examples are provided to provide those of ordinary skill in the art with a full disclosure and description of how the compounds, compositions, articles, devices, and/or methods claimed herein are made and evaluated, and are intended to be merely exemplary of the disclosure of the present invention and are not intended. to limit the scope of what the authors of the present invention consider as a disclosure of their invention. Efforts have been made to ensure accuracy with regard to numbers (eg quantities, temperatures, etc.), but some errors and deviations should be taken into account.

Статистика : Значения представлены в виде средних значений ± S.E.M. (стандартная ошибка среднего) Для определения нормальности распределений использовался критерий Колмогорова-Смирнова. T-критерий Стьюдента, критерий Манна-Уитни, точный критерий Фишера или одно- и двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA) использовались для статистического анализа, как указано в результатах. Ранговый дисперсионный анализ использовался при нарушении предположения о нормальности. Для всех парных множественных сравнений использовался ретроспективный критерий Ньюмена-Кейлса или критерий Данна. Статистически значимая разница определялась как p<0,05. Statistics : Values are presented as means ± S.E.M. (standard error of the mean) The Kolmogorov-Smirnov test was used to determine the normality of distributions. Student's t-test, Mann-Whitney test, Fisher's exact test, or one- and two-way analysis of variance (ANOVA) were used for statistical analysis as indicated in the results. Rank analysis of variance was used when the normality assumption was violated. For all pairwise multiple comparisons, the retrospective Newman-Keuls test or Dunn's test was used. A statistically significant difference was defined as p<0.05.

Пример 1. Фармакокинетика эксендина-4 и состава с замедленным высвобождением в плазме . Example 1 Pharmacokinetics of Exendin-4 and Sustained Release Formulation in Plasma .

PT302, состав с замедленным высвобождением эксендина-4, содержит смесь полимеров (98%) и эксендина-4 (2%). Уровни эксенатида в плазме анализировали после инъекции состава с замедленным высвобождением эксендина-4 (PT302). В частности, фармакокинетику однократной дозы PT302 исследовали с использованием 6 взрослых (возрастом 9 недель) самцов крыс Sprague-Dawley. PT302 был недавно растворенным в разбавителе, и 2 мг/кг вводили подкожно. Кровь собирали через 0, 0,5 и 1 час после инъекции, а также в дни 1, 3, 5, 7, 9, 11, 14, 18, 21 и 26 после инъекции. Уровни эксендина-4 в плазме определяли с помощью набора Peptron Exenatide EIA (Peptron, Daejeon, Южная Корея). Данные представлены на фиг. 1А с Cmax=1,85 нг/мл, Tmax=12,5 дней и AUC=18,55 нг*д/мл (значения рассчитаны по индивидуальным данным всех 6 животных). Как видно на фиг. 1А, состав с замедленным высвобождением PT302 обеспечивает пролонгированные уровни эксендина-4 в плазме в результате однократной подкожной инъекции, приемлемые для схемы дозирования от одной до двух недель.PT302, a sustained release formulation of exendin-4, contains a mixture of polymers (98%) and exendin-4 (2%). Plasma levels of exenatide were analyzed following injection of a sustained release formulation of exendin-4 (PT302). In particular, the pharmacokinetics of a single dose of PT302 was studied using 6 adult (9 weeks old) male Sprague-Dawley rats. PT302 was freshly dissolved in diluent and 2 mg/kg was administered subcutaneously. Blood was collected at 0, 0.5 and 1 hour post-injection, and on days 1, 3, 5, 7, 9, 11, 14, 18, 21 and 26 post-injection. Plasma exendin-4 levels were determined using the Peptron Exenatide EIA kit (Peptron, Daejeon, South Korea). The data is shown in Fig. 1A with Cmax=1.85 ng/ml, Tmax=12.5 days and AUC=18.55 ng*d/ml (values calculated from individual data of all 6 animals). As seen in FIG. 1A, the PT302 sustained release formulation provides sustained plasma levels of exendin-4 following a single subcutaneous injection acceptable for a one to two week dosing schedule.

Фармакокинетику однократной дозы PT302 в различных дозировках (2,4 мг/кг, 4,8 мг/кг и 9,6 мг/кг) исследовали с использованием 6 взрослых (возрастом 9 недель) самцов крыс Sprague-Dawley на группу. PT302 был недавно растворенным в разбавителе, и его вводили, как указано, подкожно. Кровь собирали через 0, 0,5 и 1 час после инъекции, а также через 1, 3, 7, 10, 14, 17, 21, 24, 28 и 31 день после инъекции. Уровни в плазме эксендина-4 анализировали количественно, как обсуждалось выше. Данные представлены на фиг. 1B с Cmax=2,23 нг/мл, Tmax=14,83 дня и AUC=21,13 нг*д/мл для дозы 2,4 мг/кг; Cmax=5,21 нг/мл, Tmax=16,17 дней и AUC=49,46 нг*д/мл для дозы 4,8 мг/кг; и Cmax=9,42 нг/мл, Tmax=17,17 дней и AUC=87,14 нг*д/мл для дозы 9,6 мг/кг. На фиг. 1В показано, что состав с замедленным высвобождением PT302 обеспечивает пролонгированные уровни эксендина-4 в плазме в результате однократной подкожной инъекции, непосредственно связанные с уровнем дозы вводимого PT302.The pharmacokinetics of a single dose of PT302 at various dosages (2.4 mg/kg, 4.8 mg/kg and 9.6 mg/kg) was studied using 6 adult (9 weeks old) male Sprague-Dawley rats per group. PT302 was freshly dissolved in diluent and administered subcutaneously as indicated. Blood was collected at 0, 0.5, and 1 hour post-injection, and 1, 3, 7, 10, 14, 17, 21, 24, 28, and 31 days post-injection. Plasma levels of exendin-4 were quantified as discussed above. The data is shown in Fig. 1B with Cmax=2.23 ng/mL, Tmax=14.83 days and AUC=21.13 ng*d/mL for the 2.4 mg/kg dose; Cmax=5.21 ng/ml, Tmax=16.17 days and AUC=49.46 ng*d/ml for a dose of 4.8 mg/kg; and Cmax=9.42 ng/mL, Tmax=17.17 days, and AUC=87.14 ng*d/mL for the 9.6 mg/kg dose. In FIG. 1B shows that the sustained release formulation of PT302 provides sustained plasma levels of exendin-4 following a single subcutaneous injection, directly related to the dose level of PT302 administered.

PT304, состав эксендина-4 с замедленным высвобождением, содержит смесь полимеров (96%) и эксендина-4 (4%). Уровни эксенатида в плазме анализировали после инъекции 6 взрослым (возрастом 9 недель) самцам крыс Sprague-Dawley состава эксендина-4 с замедленным высвобождением (PT304). PT302 был недавно растворенным в разбавителе, и подкожно вводили 4 мг/кг. Кровь собирали через 1 час и 3 часа после инъекции, а также в дни 1, 4, 7, 11, 14, 18, 21, 25, 28, 32, 35, 39 и 42 после инъекции. Уровни эксендина-4 в плазме определяли с помощью набора Peptron Exenatide EIA. Данные представлены на фиг. 2 с Cmax=3,82 нг/мл, Tmax=14,17 дней и AUC=48,34 нг*д/мл (значения рассчитаны по индивидуальным данным всех 6 животных). Как видно на фиг. 2, состав с замедленным высвобождением PT304 обеспечивает пролонгированные уровни эксендина-4 в плазме в результате однократной подкожной инъекции, приемлемые для схемы дозирования от двух до четырех недель.PT304, a sustained release formulation of exendin-4, contains a mixture of polymers (96%) and exendin-4 (4%). Exenatide plasma levels were analyzed following injection of 6 adult (9 weeks old) male Sprague-Dawley rats with a sustained release exendin-4 formulation (PT304). PT302 was freshly dissolved in diluent and 4 mg/kg was administered subcutaneously. Blood was collected 1 hour and 3 hours post-injection and on days 1, 4, 7, 11, 14, 18, 21, 25, 28, 32, 35, 39 and 42 post-injection. Plasma levels of exendin-4 were determined using the Peptron Exenatide EIA kit. The data is shown in Fig. 2 with Cmax=3.82 ng/ml, Tmax=14.17 days and AUC=48.34 ng*d/ml (values calculated from individual data of all 6 animals). As seen in FIG. 2, the sustained release formulation of PT304 provides sustained plasma levels of exendin-4 following a single subcutaneous injection acceptable for a two to four week dosing regimen.

Фармакокинетика PT302 в течение 10-недельного периода была исследована у 10 взрослых (возрастом 9 недель) крыс Sprague-Dawley на группу. Крысам подкожно инъецировали дозу 2 мг/кг PT302 раз в неделю или 4 мг/кг PT304 раз в две недели. PT302 и PT304 готовили, как описано выше, и кровь собирали через 1 час и 3 часа после первой инъекции, а также в дни 1, 3, 5, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77, 84 и 91 день после первой инъекции. Уровни эксендина-4 в сыворотке анализировали количественно, как обсуждалось выше, и это представлено на фиг. 3. Крысы, которым раз в неделю инъецировали составы, имели Cmax=5,27 нг/мл, Tmax=51,60 дней и AUC=236,42 нг*д/мл, в то время как крысы, которым составы инъецировали раз в две недели, имели Cmax=5,08 нг/мл, Tmax=47,89 дней и AUC=211,51 нг*д/мл.The pharmacokinetics of PT302 over a 10 week period was studied in 10 adult (9 weeks old) Sprague-Dawley rats per group. Rats were injected subcutaneously with a dose of 2 mg/kg PT302 once a week or 4 mg/kg PT304 once every two weeks. PT302 and PT304 were prepared as described above and blood was collected 1 hour and 3 hours after the first injection and on days 1, 3, 5, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77, 84 and 91 days after the first injection. Serum exendin-4 levels were quantified as discussed above and this is shown in FIG. 3. Rats injected with formulations once a week had Cmax=5.27 ng/mL, Tmax=51.60 days and AUC=236.42 ng*d/mL, while rats injected with formulations once a week two weeks, had Cmax=5.08 ng/ml, Tmax=47.89 days and AUC=211.51 ng*d/ml.

Пример 2. Предварительное лечение PT302 уменьшает опосредованное метамфетамином вращение в модели болезни Паркинсона, индуцированной 6-OHDA, на крысе.Example 2 Pretreatment with PT302 reduces methamphetamine-mediated rotation in a 6-OHDA rat model of Parkinson's disease.

Животных подвергали лечению носителем (9 крыс), 0,4 мг/кг PT302 (низкая доза; 9 крыс) или 2 мг/кг PT302 (высокая доза; 10 крыс) в дни, определенные на фиг. 4A (т.е. в дни 16 и 2 до одностороннего поражения с помощью 6-OHDA медиального пучка переднего мозга и в дни 12, 26 и 40 после поражения). Как показано на фиг. 4А и 4В, крыс подвергали опосредованному метамфетамином вращению в дни 20, 30 и 45 после поражения и подвергали эвтаназии в день 47. Для вызова крыс анестезировали хлоралгидратом (400 мг/кг, внутрибрюшинно) и помещали в стереотаксическую раму. 6-OHDA (2,76 мкг/мкл х 5 мкл в 0,9% NaCl, содержащем 0,2 мг/мл аскорбиновой кислоты) односторонне инъецировали в медиальный пучок переднего мозга (-4,4 мм AP, 1,2 мм ML относительно брегмы и 8,4 мм ниже черепа) на протяжении 4 минут с помощью микрошприца Гамильтона, удерживаемого стереотаксически. Микрошприц опускали до желаемого локуса-мишени в головном мозге, используя микроманипуляторы, прикрепленные к стереотаксической раме. Скорость инъекции (0,5 мкл/мин) контролировали с помощью шприцевого насоса (Micro 4, WPI, Sarasota, FL). Иглу удаляли через 5 минут после инъекции. Кусочек костного воска помещали на трепанационное отверстие для предотвращения утечки жидкости. Рану сшивали или обрезали. Температуру тела контролировали с помощью термисторного датчика и поддерживали при 37°C с помощью грелки-подушки во время анестезии. После выхода из наркоза температуру тела дополнительно поддерживали на уровне 37°C в течение 3 часов, используя термостат с контролируемой температурой.Animals were treated with vehicle (9 rats), 0.4 mg/kg PT302 (low dose; 9 rats) or 2 mg/kg PT302 (high dose; 10 rats) on the days defined in FIG. 4A (i.e., on days 16 and 2 before unilateral 6-OHDA medial forebrain bundle injury and on days 12, 26, and 40 after injury). As shown in FIG. 4A and 4B, rats were subjected to methamphetamine-mediated rotation on days 20, 30, and 45 post-lesion and euthanized on day 47. For challenge, rats were anesthetized with chloral hydrate (400 mg/kg, ip) and placed in a stereotaxic frame. 6-OHDA (2.76 µg/µl x 5 µl in 0.9% NaCl containing 0.2 mg/ml ascorbic acid) was unilaterally injected into the medial forebrain bundle (-4.4 mm AP, 1.2 mm ML bregma and 8.4 mm below the skull) for 4 minutes with a Hamilton microsyringe held stereotactically. The microsyringe was lowered to the desired target locus in the brain using micromanipulators attached to a stereotaxic frame. The injection rate (0.5 μl/min) was controlled using a syringe pump (Micro 4, WPI, Sarasota, FL). The needle was removed 5 minutes after injection. A piece of bone wax was placed over the burr hole to prevent fluid leakage. The wound was sutured or cut. Body temperature was monitored with a thermistor probe and maintained at 37°C with a heating pad during anesthesia. After recovery from anesthesia, body temperature was further maintained at 37° C. for 3 hours using a temperature-controlled thermostat.

Индуцированное метамфетамином вращательное поведение [Liu DM, Lin SZ, Wang SD, Wu MI, Wang Y. Xenografting human T2 sympathetic ganglion from hyperhidrotic patients partially restores catecholaminergic functions in hemi-Parkinsonian athymic rats. Cell Transplant 1999;8:563-91; and Luo Y, Hoffer BJ, Wang Y. Rotation, Drug-induced. In: Kompoliti K, Verhagen Metman L, editors. Encyclopedia of Movement Disorders. Oxford: Academic Press, 2010. p 49-51] оценивали с использованием 8-канальной системы ротометра (RotoMax, AccuScan Instruments, Inc). Животным вводили метамфетамин (2,5 мг/кг) через 6 дней после поражения с помощью 6-OHDA, как описано ранее [Yin LH, Shen H, Diaz-Ruiz O, Backman CM, Bae E, Yu SJ, Wang Y. Early post-treatment with 9-cis retinoic acid reduces neurodegeneration of dopaminergic neurons in a rat model of Parkinson's disease. BMC Neurosci 2012;13:120]. Метамфетамин является непрямым агонистом, который вызывает выброс дофамина в головном мозге. Крысы, которые получают односторонние инъекции 6-OHDA в нигростриарную дофаминергическую систему, используются в качестве модели для PD. У этих животных наблюдается ипсилатеральное вращение после введения непрямых агонистов дофамина (таких как метамфетамин) и контралатеральное вращение после введения прямых агонистов дофамина (таких как апоморфин). Такое поведение связано с односторонними изменениями экспрессии дофаминергических маркеров в полосатом теле.Methamphetamine-induced rotational behavior [Liu DM, Lin SZ, Wang SD, Wu MI, Wang Y. Xenografting human T2 sympathetic ganglion from hyperhidrotic patients partially restores catecholaminergic functions in hemi-Parkinsonian athymic rats. Cell Transplant 1999;8:563-91; and Luo Y, Hoffer BJ, Wang Y. Rotation, Drug-induced. In: Kompoliti K, Verhagen Metman L, editors. Encyclopedia of Movement Disorders. Oxford: Academic Press, 2010. p 49-51] were evaluated using an 8-channel rotometer system (RotoMax, AccuScan Instruments, Inc). Animals were treated with methamphetamine (2.5 mg/kg) 6 days after 6-OHDA injury as previously described [Yin LH, Shen H, Diaz-Ruiz O, Backman CM, Bae E, Yu SJ, Wang Y. Early post-treatment with 9-cis retinoic acid reduces neurodegeneration of dopaminergic neurons in a rat model of Parkinson's disease. BMC Neurosci 2012;13:120]. Methamphetamine is an indirect agonist that causes the release of dopamine in the brain. Rats that receive unilateral injections of 6-OHDA into the nigrostriatal dopaminergic system are used as a model for PD. These animals show ipsilateral rotation after administration of indirect dopamine agonists (such as methamphetamine) and contralateral rotation after administration of direct dopamine agonists (such as apomorphine). This behavior is associated with unilateral changes in the expression of dopaminergic markers in the striatum.

Как показано на фиг. 4B, значительно уменьшало вращение лечение PT302 как в высокой, так и в низкой дозе в группе лечения PT302 (p=0,018, F2, 87=4,309, двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA) в группе низкой дозы) по сравнению с носителем. Ретроспективный тест Ньюмена-Кейлса показал, что высокая доза PT302 значительно ослабляла опосредованное метамфетамином вращение (р=0,037). Таким образом, продолжительное, устойчивое введение эксендина-4 в форме PT302 значительно смягчало поведенческие эффекты, вызванные односторонним поражением с помощью 6-OHDA медиального пучка переднего мозга у крыс (в хорошо охарактеризованной модели PD на животном), обеспечивая нейропротективную активность.As shown in FIG. 4B significantly reduced rotation with both high and low dose PT302 treatment in the PT302 treatment group (p=0.018, F2, 87=4.309, two-way analysis of variance (ANOVA) in the low dose group) compared to vehicle. A retrospective Newman-Keuls test showed that a high dose of PT302 significantly attenuated methamphetamine-mediated rotation (p=0.037). Thus, prolonged, sustained administration of exendin-4 in the form of PT302 significantly attenuated the behavioral effects induced by unilateral 6-OHDA damage to the medial forebrain bundle in rats (in a well-characterized animal model of PD), conferring neuroprotective activity.

Уровни в плазме эксендина-4 анализировали количественно, как обсуждалось выше. Как показано на фиг. 4C, средний уровень эксендина-4 в плазме составлял 30,845 пг/мл (n=10) у крыс с высокой дозой и 8,990 пг/мл (n=9) у крыс с низкой дозой. Однако при удалении резко выделяющихся крыс/измерений (крыс 1, 10 и 12) средний уровень эксендина-4 в плазме составлял 5596 пг/мл (n=8) у крыс с высокой дозой и 574 пг/мл (n=8) у крыс с низкой дозой.Plasma levels of exendin-4 were quantified as discussed above. As shown in FIG. 4C, the mean plasma level of exendin-4 was 30.845 pg/mL (n=10) in high dose rats and 8.990 pg/mL (n=9) in low dose rats. However, when outlier rats/measurements (rats 1, 10 and 12) were removed, the mean plasma exendin-4 level was 5596 pg/mL (n=8) in high-dose rats and 574 pg/mL (n=8) in rats with a low dose.

Пример 3. Последующее лечение PT302 уменьшало индуцированное метамфетамином вращательное поведение у крыс с поражением с помощью 6-OHDA.Example 3 Post-treatment with PT302 reduced methamphetamine-induced rotational behavior in 6-OHDA-affected rats.

Использование одностороннего поражения с помощью 6-OHDA медиального пучка переднего мозга в модели PD на грызуне, описанного в примере 2, может сочетаться с последующим лечением потенциальным лекарственным средством, как показано на схеме на фиг. 5A. В этом случае у грызунов вызывается одностороннее поражение с помощью 6-OHDA (0 дней), и лечение начинается через 6 дней после этого. Это более сложная модель PD для лечения грызунов, поскольку гибель дофаминергических клеток уже началась и продолжается до начала лечения. У девятнадцати крыс было вызвано поражение, как описано выше. Индуцированное метамфетамином вращение исследовали, как обсуждалось выше, при этом животные, которые вращались со скоростью, превышающей 300 оборотов в час, были разделены на 2 группы, чтобы скорректировать групповое вращательное поведение для групп носителя и PT302 перед началом лечения. Как показано на фиг. 5А, индуцированное метамфетамином вращение исследовали через 6, 20, 30 и 45 дней после поражения, и животные (взрослые самцы крыс Sprague-Dawley - в возрасте 2 месяца по прибытии) были подвергнуты лечению носителем (подкожно, n=11) или PT302 (100 мг/кг, содержащих 2,0 мг/кг эксендина-4, подкожно, n=8) в дни 6, 20 и 34 после поражения с помощью 6-OHDA. PT302 готовили, как описано выше. Животных умерщвляли в день 47 после поражения. Образцы крови и головного мозга собирали, а плазму отделяли и хранили (-80°С). Эксендин-4 измеряли в собранной плазме.The use of a unilateral 6-OHDA lesion of the medial forebrain fasciculus in the rodent model of PD described in Example 2 can be combined with subsequent drug potential treatment as shown in the scheme in FIG. 5A. In this case, rodents are induced unilaterally with 6-OHDA (0 days) and treatment is started 6 days thereafter. This is a more complex PD model for rodent treatment, as dopaminergic cell death has already begun and continues until treatment is initiated. Nineteen rats were induced to lesion as described above. Methamphetamine-induced rotation was examined as discussed above, with animals that rotated in excess of 300 rpm being divided into 2 groups to correct group rotation behavior for the vehicle and PT302 groups prior to treatment. As shown in FIG. 5A, methamphetamine-induced rotation was examined at 6, 20, 30, and 45 days post-challenge, and animals (adult male Sprague-Dawley rats - 2 months of age on arrival) were treated with vehicle (SC, n=11) or PT302 (100 mg/kg containing 2.0 mg/kg exendin-4, subcutaneously, n=8) on days 6, 20 and 34 after 6-OHDA challenge. PT302 was prepared as described above. Animals were sacrificed on day 47 post-lesion. Blood and brain samples were collected and plasma was separated and stored (-80°C). Exendin-4 was measured in the collected plasma.

Как показано на фиг. 5В, PT302 значительно уменьшал индуцированное метамфетамином вращательное поведение у крыс с односторонним поражением с помощью 6-OHDA (p=0,032, двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA)) по сравнению с носителем в качестве контроля.As shown in FIG. 5B, PT302 significantly reduced methamphetamine-induced rotational behavior in unilateral rats with 6-OHDA (p=0.032, two-way analysis of variance (ANOVA)) compared to vehicle control.

Тирозингидроксилазу (TH) исследовали иммуногистохимически. В частности, серийный криостатные срезы всего головного мозга были сделаны толщиной 25 мкм. Одну серию, состоящую из каждого шестого среза, окрашивали на TH. Для контроля изменчивости окрашивания образцы от всех экспериментальных групп включали в каждую партию и подвергали реакции вместе в чистом луночном планшете в одинаковых условиях. Срезы промывали в 0,1 М фосфатном буфере (PB), блокировали 4% бычьим сывороточным альбумином (BSA) и 0,3% Triton X-100 в 0,1M PB. Затем срезы инкубировали в первом антителе (мышином моноклональном антителе против TH, разведенном в 4% BSA и 0,3% Triton X-100 в 0,1 М PB, в концентрации 1:100; Chemicon, Temecula, CA) в течение 17-19 часов при 4°С. Затем срезы промывали в 0,1 М PB и инкубировали во вторых антителах в течение 1 часа, затем инкубировали в течение 1 часа с комплексом авидин-биотин-пероксидаза хрена. Срезы размещали на предметных стеклах и покрывали стеклами. Контрольные срезы инкубировали без первых антител.Tyrosine hydroxylase (TH) was examined immunohistochemically. In particular, serial cryostat sections of the whole brain were made with a thickness of 25 µm. One series consisting of every sixth section was stained for TH. To control for color variability, samples from all experimental groups were included in each batch and reacted together in a clean well plate under the same conditions. Sections were washed in 0.1M phosphate buffer (PB), blocked with 4% bovine serum albumin (BSA) and 0.3% Triton X-100 in 0.1M PB. Sections were then incubated in the first antibody (murine anti-TH monoclonal antibody diluted in 4% BSA and 0.3% Triton X-100 in 0.1 M PB, at a concentration of 1:100; Chemicon, Temecula, CA) for 17- 19 hours at 4°C. Then the sections were washed in 0.1 M PB and incubated in the second antibody for 1 hour, then incubated for 1 hour with avidin-biotin-horseradish peroxidase complex. Sections were placed on glass slides and covered with slides. Control sections were incubated without the first antibodies.

TH-иммунореактивность в полосатом теле измеряли с помощью ImageJ и усредняли, исходя из 3 срезов головных мозга, выбранных так, чтобы была видна передняя комиссура. TH-иммунореактивность в черной субстанции измеряли каждые 360 мкм по всему среднему мозгу (от брегмы - 4,2 мм до -6,0 мм). Всего было использовано 5 срезов головного мозга от каждого животного. Объем черной субстанции анализировали по методу Кавальери.TH immunoreactivity in the striatum was measured with ImageJ and averaged from 3 brain sections selected to show the anterior commissure. TH immunoreactivity in the substantia nigra was measured every 360 μm throughout the midbrain (from bregma - 4.2 mm to -6.0 mm). A total of 5 brain sections from each animal were used. The volume of substantia nigra was analyzed by the Cavalieri method.

PT302 снижал 6-OHDA-опосредованную дофаминергическую нейродегенерацию в полосатом теле. Репрезентативное иммуноокрашивание на ТН в полосатом теле и уровни эксендина-4 в плазме у 3 крыс (#866, 883, 886), получавших носитель, и 3 крыс (#881, 875, 882), получающих PT302, представлены на фиг. 5C (концентрации эксендина-4 в плазме у этих же животных были определены и также отмечены на фиг. 5C). Как показано на фиг. 5D, инъекция 6-OHDA значительно снижала TH-иммунореактивность в полосатом теле у животных, получавших носитель, в то время как PT302 значительно увеличивал TH-иммунореактивность в пораженном полосатом теле (*p<0,001, двухфакторный ANOVA). L=пораженная сторона; non-L=непораженная сторона; veh=животные, получающие носитель; PT=PT302. PT302 reduced 6-OHDA-mediated dopaminergic neurodegeneration in the striatum . Representative striatal TH immunostaining and plasma exendin-4 levels in 3 vehicle-treated rats (#866, 883, 886) and PT302-treated rats (#881, 875, 882) are shown in FIG. 5C (plasma exendin-4 concentrations in the same animals were determined and also noted in FIG. 5C). As shown in FIG. 5D, 6-OHDA injection significantly reduced TH immunoreactivity in the striatum in vehicle treated animals, while PT302 significantly increased TH immunoreactivity in the affected striatum (*p<0.001, two-way ANOVA). L=affected side; non-L=non-affected side; veh=vehicle receiving animals; PT=PT302.

TH-иммунореактивность в черной субстанции измеряли с помощью ImageJ и усредняли, исходя из 3 срезов головного мозга, выбранных так, чтобы была видна передняя комиссура. Репрезентативное TH-иммуноокрашивание от животных, получающих носитель (крысы #866, #883, #886) или PT302 (крысы #881, #875, #882), представлено на фиг. 5E (также представлены уровни эксендина-4 в плазме у этих же животных). ТН-иммунореактивность в черной субстанции анализировалась количественно каждые 360 мкм от брегмы -4,2 мм до -6 мм, и это представлено на фиг. 5F. Инъекция 6-OHDA значительно снижала ТН-иммунореактивность в черной субстанции у животных, получавших носитель, тогда как PT302 значительно уменьшал потерю ТН-иммунореактивности в пораженной черной субстанции (*p<0,001, двухфакторный ANOVA). L = пораженная сторона; non-L = непораженная сторона; veh = животные, получавшие носитель; PT=PT302.TH immunoreactivity in substantia nigra was measured using ImageJ and averaged over 3 brain sections chosen to show the anterior commissure. Representative TH immunostaining from animals receiving vehicle (rats #866, #883, #886) or PT302 (rats #881, #875, #882) is shown in FIG. 5E (also shows plasma exendin-4 levels in the same animals). TN immunoreactivity in substantia nigra was quantified every 360 µm from bregma -4.2 mm to -6 mm and this is shown in FIG. 5F. 6-OHDA injection significantly reduced TH immunoreactivity in the substantia nigra in vehicle-treated animals, while PT302 significantly reduced the loss of TH immunoreactivity in affected substantia nigra (*p<0.001, two-way ANOVA). L = affected side; non-L = unaffected side; veh = animals treated with vehicle; PT=PT302.

Последующее лечение PT302 защищает TH+ нейроны в пораженной черной субстанции. Делали срезы головного мозга, и иммуногистохимический анализ проводили, как описано выше. TH+ нейроны были обнаружены на непораженной стороне мозга (фиг. 5G и 5H). В черной субстанции на пораженной стороне головного мозга почти не были обнаружены TH+ нейроны или волокна (крыса #886; фиг. 5I). Лечение PT302 частично защищало TH+ нейроны (фиг. 5J, 5K и 5L). Subsequent treatment with PT302 protects TH+ neurons in the affected substantia nigra . Brain sections were made and immunohistochemical analysis was performed as described above. TH+ neurons were found on the unaffected side of the brain (FIGS. 5G and 5H). Almost no TH+ neurons or fibers were found in the substantia nigra on the affected side of the brain (rat #886; Fig. 5I). Treatment with PT302 partially protected TH+ neurons (FIGS. 5J, 5K and 5L).

Опосредованная эксендином-4 защита в ТН нейронах связана с уровнем эксендина 4 в плазме. На фиг. 5M показана значимая корреляция, обнаруженная между TH-иммунореактивностью в полосатом теле после приведения (т.е. пораженная/непораженная сторона) и уровнями эксендина 4 в плазме у тех же животных (р=0,002, R=0,663). На фиг. 5L показана значимая корреляция, наблюдаемая между уровнями эксендина 4 в плазме и TH-иммунореактивностью в черной субстанции на пораженной стороне (р<0,001, R=0,842). Exendin-4 mediated protection in TH neurons is associated with plasma levels of exendin 4 . In FIG. 5M shows a significant correlation found between TH-immunoreactivity in the striatum after adduction (ie, affected/unaffected side) and plasma levels of exendin 4 in the same animals (p=0.002, R=0.663). In FIG. 5L shows the significant correlation observed between plasma levels of exendin 4 and substantia nigra TH immunoreactivity on the affected side (p<0.001, R=0.842).

Пример 4. Предварительное лечение PT302 уменьшает опосредованное метамфетамином вращение в индуцированной 6-OHDA модели PD на крысе.Example 4 Pre-treatment with PT302 reduces methamphetamine-mediated rotation in a 6-OHDA-induced rat model of PD.

Как показано на фиг. 6А, животные получали подкожно Ex-4 (5 мкг/кг, дважды в день) или PT302 (0,4 мг/кг) за 7 дней до и через 7 дней после поражения с помощью 6-OHDA, как описано выше. Используемая в этом исследовании доза эксендина-4, равная 5 мкг/кг дважды в день, выше, чем можно добиться у людей (смотрите таблицу 1 ниже), а более низкая доза, приблизительно равная 1 мкг/кг дважды в день, эквивалентна как дозе для человека, так и дозе PT302, используемой в исследовании. Лечение и Ex-4 (5 мкг/кг, дважды в день), и PT302 (0,4 мг/кг) значительно уменьшало вращение (р=0,005 в группе Ex-4 и 0,002 в группе PT302) у крыс с поражениями с помощью 6-OHDA (фиг. 6B).As shown in FIG. 6A, animals received Ex-4 (5 μg/kg, twice daily) or PT302 (0.4 mg/kg) subcutaneously 7 days before and 7 days after 6-OHDA challenge as described above. The dose of Exendin-4 used in this study of 5 µg/kg twice daily is higher than what can be achieved in humans (see Table 1 below), and the lower dose of approximately 1 µg/kg twice daily is equivalent to both for humans and the dose of PT302 used in the study. Treatment with both Ex-4 (5 µg/kg, b.i.d.) and PT302 (0.4 mg/kg) significantly reduced rotation (p=0.005 in the Ex-4 group and 0.002 in the PT302 group) in rats with lesions using 6-OHDA (FIG. 6B).

Предварительное лечение или эксендином-4, или PT302 защищало от 6-OHDA-опосредованной дофаминергической нейродегенерации в черной субстанции. Репрезентативная TH-иммунореактивность от животных - ложных контролей и животных с поражениями с помощью 6-OHDA, получающих носитель, Ex-4 (5 мкг/кг, дважды в день) или PT302 (0,4 мг/кг), представлена на фиг. 6C. Инъекция 6-OHDA значительно уменьшала TH-иммунореактивности на стороне поражения (отмечено как ipsi на фиг. 6C). Репрезентативная TH-иммунореактивность в черной субстанции была проанализирована количественно и представлена на фиг. 6D. Лечение PT302 и Ex-4 значительно снижало потерю TH-иммунореактивности на стороне с 6-OHDA-поражением (по оценке путем представления TH-иммунореактивности в виде отношения иммунореактивности, присутствующей на стороне поражения (ipsi), в процентах от иммунореактивности, присутствующей у того же животного на контрольной непораженной стороне (contra)). Pretreatment with either exendin-4 or PT302 protected against 6-OHDA-mediated dopaminergic neurodegeneration in the substantia nigra . Representative TH immunoreactivity from mock controls and 6-OHDA-lesioned animals receiving vehicle, Ex-4 (5 μg/kg, twice daily) or PT302 (0.4 mg/kg) is shown in FIG. 6C. Injection of 6-OHDA significantly reduced TH immunoreactivity on the side of the lesion (labeled as ipsi in Fig. 6C). Representative TH immunoreactivity in substantia nigra was quantified and presented in FIG. 6d. Treatment with PT302 and Ex-4 significantly reduced the loss of TH immunoreactivity on the side with the 6-OHDA lesion (as assessed by representing TH immunoreactivity as the ratio of immunoreactivity present on the side of the lesion (ipsi) as a percentage of the immunoreactivity present in the same animal on the control unaffected side (contra)).

Пример 5. Последующее лечение PT302 уменьшает опосредованное метамфетамином вращение в модели болезни Паркинсона, индуцированной 6-OHDA, на крысе.Example 5 Post-treatment with PT302 reduces methamphetamine-mediated rotation in a 6-OHDA rat model of Parkinson's disease.

Животные получали Ex-4 (1 мкг/кг, дважды в день со дня 2) или PT302 (0,4 мг/кг, один раз в день 2) после поражения с помощью 6-OHDA, и опосредованное метамфетамином вращательное поведение исследовали в день 9 после поражения, как описано выше (фиг. 7А). Как показано на фиг. 7B, PT302 значительно ослаблял вращательное поведение у крыс с односторонним поражением с помощью 6-OHDA (p=0,0075). Напротив, эксендин-4 не ослаблял вращательное поведение у крыс с односторонним поражением с помощью 6-OHDA. Таким образом, использование эксендина-4 в эквивалентной для человека дозе (1 мкг/кг дважды в день у крысы) оказалось неэффективным в уменьшении индуцированного метамфетамином вращения, в то время как PT302 в переносимой человеком дозе оказался эффективным в модели PD, индуцированной 6-OHDA, на крысе. Когда доза эксендина-4 была повышена до эквивалента, который выше, чем достигаемая у человека доза, (5 мкг/кг дважды в день, как в примере 4), эксендин-4 мог обеспечить смягчение нарушений, вызванных 6-OHDA. Напротив, эквивалентная клинически переносимая доза PT302 обеспечивает благоприятное действие как в примере 4, так и в примере 5.Animals received Ex-4 (1 μg/kg, twice daily from day 2) or PT302 (0.4 mg/kg, once daily 2) after challenge with 6-OHDA, and methamphetamine-mediated rotational behavior was examined on the day 9 after the lesion as described above (FIG. 7A). As shown in FIG. 7B, PT302 significantly attenuated rotational behavior in unilaterally affected rats with 6-OHDA (p=0.0075). In contrast, exendin-4 did not attenuate rotational behavior in unilaterally affected rats with 6-OHDA. Thus, the use of exendin-4 at the human equivalent dose (1 µg/kg twice daily in rat) was not effective in reducing methamphetamine-induced rotation, while PT302 at the human tolerated dose was effective in the 6-OHDA-induced model of PD. , on a rat. When the dose of exendin-4 was increased to an equivalent higher than that achieved in humans (5 μg/kg twice a day, as in example 4), exendin-4 could provide mitigation of the disturbances caused by 6-OHDA. On the contrary, an equivalent clinically tolerated dose of PT302 provides a beneficial effect in both example 4 and example 5.

Пример 6. Последующее лечение PT302 улучшало токсин-индуцированный поведенческий дефицит в модели PD, индуцированной MPTP, на мыши.Example 6 Follow-up treatment with PT302 improved toxin-induced behavioral deficits in an MPTP-induced PD mouse model.

Животные получали Ex-4 (16,7 мкг/кг, дважды в день с дня 6) или PT302 (0,6 мг/кг, в дни на 6, 20 и 34) после индукции паркинсонизма с помощью MPTP, как описано выше (фиг. 8A). В частности, паркинсонизм был индуцирован в результате системного введения 30 мг/кг MPTP ежедневно в течение 5 дней. Смотрите, например, Filichia E, Hoffer B, Qi X, Luo Y. Inhibition of Drp1 mitochondrial translocation provides neural protection in dopaminergic system in a Parkinson's disease model induced by MPTP. Sci Rep. 2016; 6:32656. Лечение или Ex-4, или PT302 начинали через один день после первой дозы MPTP и продолжали в течение 18 дней. Выбранные дозы Ex-4 (16,7 мкг/кг подкожно дважды в день) и PT302 (0,4 мг/кг однократная подкожная доза) были эквивалентны по доставляемому количеству Ex-4 и обеспечили 601,2 мкг/кг и менее 600 мкг/кг, соответственно, за 18 дней лечения. Тест на сцепление с проволокой использовался для оценки двигательной координации всех групп животных в день 18. Тест на сцепление с проволокой (также известный как тест на длительность захвата лапой (PaGE) и тест регистрации силы захвата) часто используется в качестве показателя силы двигательных мышц. PaGE предназначен для оценки силы захвата у мышей, что может свидетельствовать о снижении двигательных навыков, и был выполнен здесь, как описано Jessica AL и др. (Jessica A. L. Hutter-Saunders, Howard E. Gendelman, R. Lee Mosley. Murine Motor and Behavior Functional Evaluations for Acute 1-Methyl-4-Phenyl-1,2,3,6-Tetrahydropyridine (MPTP) Intoxication. J Neuroimmune Pharmacol. 2012; 7(1): 279-288). Вкратце, каждую мышь помещали на крышку из проволоки обычной клетки для грызунов; крышку осторожно встряхивали, чтобы вызвать захват, и перевертывали вверх дном (180°). Время ожидания, пока мышь не расцепит обе задние конечности, измерялось в секундах. Каждую мышь тестировали три раза с произвольным максимумом 240 с, и регистрировали наибольшее время ожидания до падения или отцепления обеих задних конечностей (Jessica, et al. 2012).Animals received Ex-4 (16.7 µg/kg, twice daily from day 6) or PT302 (0.6 mg/kg, on days 6, 20, and 34) after MPTP induction of parkinsonism as described above ( Fig. 8A). In particular, parkinsonism was induced by systemic administration of 30 mg/kg MPTP daily for 5 days. See, for example, Filichia E, Hoffer B, Qi X, Luo Y. Inhibition of Drp1 mitochondrial translocation provides neural protection in dopaminergic system in a Parkinson's disease model induced by MPTP. sci rep. 2016; 6:32656. Treatment with either Ex-4 or PT302 was started one day after the first dose of MPTP and continued for 18 days. Selected doses of Ex-4 (16.7 µg/kg s.c. twice daily) and PT302 (0.4 mg/kg single s.c. dose) were equivalent in delivered amount of Ex-4 and provided 601.2 µg/kg and less than 600 µg /kg, respectively, for 18 days of treatment. The wire grip test was used to assess the motor coordination of all groups of animals on day 18. The wire grip test (also known as the Paw Hold Duration (PaGE) test and the Grip Strength Registration Test) is often used as an indicator of motor muscle strength. PAGE is designed to assess grip strength in mice, which may be indicative of reduced motor skills, and was performed here as described by Jessica A. L. Hutter-Saunders, Howard E. Gendelman, R. Lee Mosley. Murine Motor and Behavior Functional Evaluations for Acute 1-Methyl-4-Phenyl-1,2,3,6-Tetrahydropyridine (MPTP) Intoxication J Neuroimmune Pharmacol 2012;7(1):279-288). Briefly, each mouse was placed on a wire lid of a conventional rodent cage; the lid was gently shaken to induce capture and turned upside down (180°). The waiting time until the mouse disengages both hind limbs was measured in seconds. Each mouse was tested three times with an arbitrary maximum of 240 s, and the longest waiting time before falling or disengaging both hind limbs was recorded (Jessica, et al. 2012).

Как показано на фиг. 8B, введение токсина для дофаминергических клеток, MPTP, приводило к значительному сокращению времени ожидания в тесте на сцепление (MPTP: 94,5 с по сравнению с объединенной контрольной группой без MPTP: 148,3 с; p=0,02). PT302 значительно увеличивал время до падения с проволоки у мышей, получавших МРТР (118,3 с, статистически не отличается от значения у объединенной контрольной группы), тогда как эксендин-4 (вводимый дважды в день способом, подобным использованию Byetta человеком (т.е. Ex-4 с немедленным высвобождением)) не уменьшал вызванный токсином поведенческий дефицит у мышей, получавших МРТР (72,9 с, р+0,01 по сравнению со значением у объединенной контрольной группы) (фиг. 8В: во всех группах число мышей было между 7 и 10).As shown in FIG. 8B, administration of the dopaminergic cell toxin, MPTP, resulted in a significant reduction in latency in the linkage test (MPTP: 94.5 s compared to the pooled control group without MPTP: 148.3 s; p=0.02). PT302 significantly increased the time to fall off the wire in MPTP-treated mice (118.3 s, not statistically different from the pooled control group), while exendin-4 (given twice daily in a manner similar to human Byetta (i.e. .Ex-4 immediate release)) did not reduce toxin-induced behavioral deficits in MPTP-treated mice (72.9 s, p+0.01 vs. pooled control group) (Fig. 8B: across all groups, the number of mice was between 7 and 10).

Пример 7. Доставка Ex-4 в центральную нервную систему с помощью эксендина-4 с замедленным высвобождением эффективна для достижения терапевтических количеств эксендина-4 в спинномозговой жидкости.Example 7 Delivery of Ex-4 to the central nervous system with sustained release exendin-4 is effective in achieving therapeutic amounts of exendin-4 in the cerebrospinal fluid.

Эксендин-4 (инъекция и мини-насос) и состав с замедленным высвобождением эксендина-4 (РТ302) вводили, как описано в таблице 1, взрослым самцам крыс Sprague-Dawley (возрастом 9 недель), которые использовались для этого исследования. Кровь и спинномозговую жидкость (CSF) собирали в день 14 после первой инъекции эксендина-4 для измерения уровней эксендина-4. Уровни эксендина-4 в плазме и CSF анализировали количественно, как описано выше. Как показано в таблице 2, эксендин-4 был обнаружен в плазме и CSF группы введения состава с замедленным высвобождением и в группе введения эксендина-4 с помощью мини-насоса, в то время как уровень эксендина-4 был ниже определяемых пределов в CSF в группе введения эксендина-4 дважды в день (BID, немедленное освобождение). Это отличается от высоких уровней эксендина-4, обнаруженных в плазме этой группы введения эксендина-4. Отношения уровней CSF/плазма находились в диапазоне от 0,0081 (или 0,81%) до приблизительно 0,0412 (или 4,12%), при этом среднее значение, равное 0,018 (или 1,8%), отмечали при введении с помощью насоса эксендина-4 в дозах в диапазоне 3,5-15 пМ/кг/мин. Аналогично, отношение уровней в CSF/плазме варьировало от 0,0117 (или 1,17%) до приблизительно 0,016 (или 1,6%) у животных, которым вводили PT302 0,46-2,0 мг/кг/14 дней. Эти данные демонстрируют, что замедленное высвобождение эксендина-4 обеспечивает более высокие уровни эксендина-4 в ЦНС.Exendin-4 (injection and mini-pump) and exendin-4 sustained release formulation (PT302) were administered as described in Table 1 to adult male Sprague-Dawley rats (9 weeks old) used for this study. Blood and cerebrospinal fluid (CSF) were collected on day 14 after the first injection of exendin-4 to measure levels of exendin-4. Plasma exendin-4 and CSF levels were quantified as described above. As shown in Table 2, exendin-4 was detected in the plasma and CSF of the sustained release formulation group and in the mini-pump group of exendin-4, while the level of exendin-4 was below the detectable limits in the CSF in the administration of exendin-4 twice a day (BID, immediate release). This is in contrast to the high levels of exendin-4 found in the plasma of this exendin-4 administration group. CSF/plasma ratios ranged from 0.0081 (or 0.81%) to approximately 0.0412 (or 4.12%), with a mean value of 0.018 (or 1.8%) noted with administration using the exendin-4 pump at doses in the range of 3.5-15 pM / kg / min. Similarly, the CSF/plasma ratio ranged from 0.0117 (or 1.17%) to about 0.016 (or 1.6%) in animals treated with PT302 0.46-2.0 mg/kg/14 days. These data demonstrate that sustained release of exendin-4 provides higher levels of exendin-4 in the CNS.

Таблица 1. Экспериментальная процедураTable 1. Experimental procedure

Ex-4 дважды в день (немедленное высвобождениеEx-4 twice a day (immediate release Ex-4 в день 16, мини-насосEx-4 on day 16, mini pump РТ302RT302 РациональнаяRational ЖивотныеAnimals 2,3 мкг/кг/день (1,15 дважды в день)2.3 mcg/kg/day (1.15 twice daily) 3,5 пМ/кг/мин3.5 pM/kg/min 0,46 мг/кг/14 дней0.46 mg/kg/14 days Суточная доза, пересчетDaily dose, recalculation 5 крыс/группу5 rats/group 4,6 мкг/кг/день (2,3 дважды в день)4.6 mcg/kg/day (2.3 twice daily) 7,0 пМ/кг/мин7.0 pM/kg/min 0,92 мг/кг/14 дней0.92 mg/kg/14 days Суточная доза х2Daily dose x2 5 крыс/группу5 rats/group 10,0 мкг/кг/день (5 дважды в день)10.0 mcg/kg/day (5 twice daily) 15 пМ/кг/мин15 pM/kg/min 2,0 мг/кг/14 дней2.0 mg/kg/14 days Равносильный уровень в плазмеEquivalent plasma level 5 крыс/группу5 rats/group

Таблица 2. Уровни в плазме и спинномозговой жидкости у крыс, получавших эксендин-4 с помощью мини-насоса, PT302 и эксендин-4Table 2. Plasma and cerebrospinal fluid levels in rats treated with mini-pump exendin-4, PT302, and exendin-4

составcompound ДозаDose ПлазмаPlasma CSFCSF Отношение CSF/плазмаCSF/plasma ratio Насос (низкая скорость)Pump (low speed) 3,5 пМ/кг/мин3.5 pM/kg/min 394,8484394.8484 14,8872114.88721 0,0412790.041279 Насос (средняя)Pump (medium) 7,0 пМ/кг/мин7.0 pM/kg/min 4293,4094293.409 35,052935.0529 0,0081590.008159 Насос (высокая)Pump (high) 15 пМ/кг/мин15 pM/kg/min 7899,6347899.634 137,688137.688 0,01850.0185 РТ302 (низкая доза)PT302 (low dose) 0,46 мг/кг/14 дней0.46 mg/kg/14 days 1853,3291853.329 18,2818518.28185 0,016120.01612 РТ302 (средняя)RT302 (medium) 0,92 мг/кг/14 дней0.92 mg/kg/14 days 4438,4964438.496 54,3703654.37036 0,0127560.012756 РТ302 (высокая)RT302 (high) 2,0 мг/кг/14 дней2.0 mg/kg/14 days 2316,8012316.801 29,9807229.98072 0,0117890.011789 Ex-4 (низкая)Ex-4 (low) 2,3 мкг/кг/день (1,15 дважды в день)2.3 mcg/kg/day (1.15 twice daily) 93,47993.479 Ниже НПКО (нижнего предела количественного анализа)Below LLQ (lower limit of quantitation) Нет данныхNo data Ex-4 (средняя)Ex-4 (medium) 4,6 мкг/кг/день (2,3 дважды в день)4.6 mcg/kg/day (2.3 twice daily) 576,886576.886 Ниже НПКОBelow NPCO Нет данныхNo data Ex-4 (высокая)Ex-4 (high) 10,0 мкг/кг/день (5 дважды в день)10.0 mcg/kg/day (5 twice daily) 5819,2825819.282 Ниже НПКОBelow NPCO Нет данныхNo data

Пример 8. Лечение эксенатидом с замедленным высвобождением мышей с легкой черепно-мозговой травмой (mTBI) улучшает распознавание новых объектов.EXAMPLE 8 Sustained release exenatide treatment of mice with mild traumatic brain injury (mTBI) improves recognition of novel objects.

Травму головы наносили с использованием устройства для нанесения травмы методом падающего груза, как описано ранее (Tweedie et al. 2007). Устройство состоит из металлической трубки (длина 90 см, внутренний диаметр 1,3 см) и губки под трубкой для поддержки головы мышей. Мышей слегка анестезировали ингаляцией изофлурана и помещали под устройство. Металлический вес (30 грамм) был сброшен с верхней части трубки для нанесения удара в голову мыши с височной стороны между углом глаза и ухом. Сразу после нанесения травмы мышей помещали обратно в их первоначальную клетку для выздоровления. Эта процедура нанесения травмы головы хорошо переносится мышами и приводит к диффузной потере нейронов в гиппокампе и коре головного мозга на стороне травмы и сопровождается когнитивными нарушениями в тестах на зрительную и пространственную память (Deselms H, Maggio N, Rubovitch V, Chapman J, Schreiber S, Tweedie D, Kim DS, Greig NH, Pick CG. Novel pharmaceutical treatments for minimal traumatic brain injury and evaluation of animal models and methodologies supporting their development. J Neurosci Methods. 2016; 272:69-76).Head trauma was applied using a drop weight trauma device as previously described (Tweedie et al. 2007). The device consists of a metal tube (length 90 cm, inner diameter 1.3 cm) and a sponge under the tube to support the mice's heads. Mice were lightly anesthetized with isoflurane inhalation and placed under the device. A metal weight (30 grams) was dropped from the top of the tube to strike the mouse's head from the temporal side between the corner of the eye and the ear. Immediately after injury, the mice were placed back in their original cage to recover. This head injury procedure is well tolerated in mice and results in diffuse neuronal loss in the hippocampus and cerebral cortex on the side of injury and is accompanied by cognitive impairment in visual and spatial memory tests (Deselms H, Maggio N, Rubovitch V, Chapman J, Schreiber S, Tweedie D, Kim DS, Greig NH, Pick CG Novel pharmaceutical treatments for minimal traumatic brain injury and evaluation of animal models and methodologies supporting their development J Neurosci Methods 2016; 272:69-76.

PT302 с замедленным высвобождением вводили (0,6 мг/кг, подкожно) через 1 час после нанесения травмы головы, как описано выше (фиг. 9A). Мышей исследовали через 7 дней после нанесения травмы в отношении парадигмы распознавания новых объектов, которая обычно используется для оценки опознающей памяти у грызунов. Грызуны без нарушений демонстрируют присущую им тенденцию исследовать новые объекты в их непосредственных расположениях. Эта особенность поведения мыши позволяет оценить функцию памяти визуального распознавания. Возможно, что еще более важно, это также позволяет оценить влияние различных стимулов на эту присущую им активность. В тесте используются два испытания. В первом испытании животным разрешают исследовать два объекта в течение определенного времени - 5 минут. Через 24 часа после первого испытания проводится второе испытание, в котором животным показывают два объекта, один из которых такой же, как в первом испытании, а другой является новым для животного. Во втором испытании мышам также разрешено исследовать объекты в течение 5 минут. Показатель предпочтения или дискриминации рассчитывается и используется для оценки опознающей памяти у животного. Показатель рассчитывается следующим образом: время, которое животное проводит возле нового объекта, минус время, проведенное возле знакомого объекта, деленное на сумму времени, проведенного возле нового и знакомого объектов (Dix SL, Aggleton JP. Extending the spontaneous preference test of recognition: evidence of object-location and object-context recognition. Behav. Brain Res. 1999;99:191-200). Как показано на фиг. 9В, введение эксенатида значительно увеличивало распознавание нового объекта у мышей с mTBI (n=5) по сравнению с не подвергнутыми лечению мышами с mTBI (n=7), демонстрируя тем самым, что у мышей, подвергнутых лечению PT302, уменьшалось нарушение визуального распознавания, вызванное mTBI.Sustained release PT302 was administered (0.6 mg/kg, sc) 1 hour after head injury as described above (FIG. 9A). Mice were examined 7 days post-injury for the novel object recognition paradigm that is commonly used to assess recognition memory in rodents. Rodents without impairments show an inherent tendency to explore new objects in their immediate locations. This feature of mouse behavior allows us to evaluate the function of visual recognition memory. Perhaps more importantly, it also makes it possible to evaluate the impact of different stimuli on this inherent activity. The test uses two trials. In the first trial, the animals are allowed to explore two objects for a specified time of 5 minutes. 24 hours after the first test, a second test is performed in which the animals are shown two objects, one of which is the same as in the first test and the other is new to the animal. In the second trial, the mice were also allowed to explore the objects for 5 minutes. A preference or discrimination score is calculated and used to evaluate the animal's recognition memory. The indicator is calculated as follows: the time that the animal spends near the new object, minus the time spent near the familiar object, divided by the sum of the time spent near the new and familiar objects (Dix SL, Aggleton JP. Extending the spontaneous preference test of recognition: evidence of object-location and object-context recognition Behav Brain Res 1999;99:191-200). As shown in FIG. 9B, exenatide administration significantly increased novel object recognition in mTBI mice (n=5) compared to untreated mTBI mice (n=7), demonstrating that visual recognition impairment was reduced in PT302-treated mice, called mTBI.

Пример 9. Исследование уровня эксендина-4 в плазме у нормальных мышей ICR. Концентрацию эксендина-4 в плазме измеряли у нормальных мышей ICR через 7 дней после подкожного введения PT302 (0,1, 0,3, 0,6, 1,0 и 2,0 мг/кг). Уровни в плазме эксендина-4 анализировали количественно, как описано выше. Уровень эксендина-4 в плазме является устойчивым и нарастает в зависимости от дозы до приблизительно 4000 пг/мл в течение 7 дней после инъекции (фиг. 10А). Example 9 Exendin-4 Plasma Level Examination in Normal ICR Mice. Plasma exendin-4 concentration was measured in normal ICR mice 7 days after subcutaneous administration of PT302 (0.1, 0.3, 0.6, 1.0 and 2.0 mg/kg). Plasma levels of exendin-4 were analyzed quantitatively as described above. The plasma level of exendin-4 is stable and increases in a dose dependent manner up to about 4000 pg/ml within 7 days after injection (FIG. 10A).

Пример 10. Исследование уровней эксендина-4 в плазме у нормальных мышей и мышей с черепно-мозговыми травмами. Уровни эксендина-4 в плазме измеряли у нормальных мышей и мышей-моделей TBI через 7 дней после подкожного введения PT302 (0,6 мг/кг). Уровни в плазме эксендина-4 анализировали количественно, как описано выше. Не наблюдалось различий в уровнях эксендина-4 в плазме между нормальными мышами и мышами с вызовом TBI (фиг. 10B). Example 10 Plasma levels of exendin-4 in normal mice and mice with traumatic brain injury. Plasma levels of exendin-4 were measured in normal and TBI model mice 7 days after subcutaneous administration of PT302 (0.6 mg/kg). Plasma levels of exendin-4 were analyzed quantitatively as described above. No differences were observed in plasma levels of exendin-4 between normal and TBI challenged mice (FIG. 10B).

Пример 11. Эксенатид с замедленным высвобождением поддерживает уровни эксендина-4 в плазме в течение продолжительного периода времени. Нормальные мыши ICR получали однократную подкожную инъекцию PT302 в трех разных дозах: 0,024 мг/кг, 0,12 мг/кг и 0,6 мг/кг. Кровь собирали через 0, 0,5 и 1 час после первой инъекции, а также в день 1, 3, 7, 14 и 21 для измерения в плазме. Концентрацию эксендина-4 в плазме анализировали количественно, как описано выше. Как показано на фиг. 10C, однократная доза PT302 поддерживала уровни эксендина-4 в плазме более 20 дней. Example 11 Sustained release exenatide maintains plasma levels of exendin-4 over an extended period of time. Normal ICR mice received a single subcutaneous injection of PT302 at three different doses: 0.024 mg/kg, 0.12 mg/kg, and 0.6 mg/kg. Blood was collected at 0, 0.5 and 1 hour after the first injection, and on days 1, 3, 7, 14 and 21 for plasma measurements. Plasma exendin-4 concentration was analyzed quantitatively as described above. As shown in FIG. 10C, a single dose of PT302 maintained plasma levels of exendin-4 for over 20 days.

Пример 12. Эксенатид с замедленным высвобождением значительно увеличивает распознавание новых объектов и новых рукавов лабиринта через семь дней после черепно-мозговой травмы. Травму головы наносили, как описано выше, и мышей немедленно помещали в их первоначальную клетку для выздоровления. PT302 (0,024 мг/кг, 0,12 мг/кг и 0,6 мг/кг) вводили мышам подкожно в виде однократной инъекции через 1 час после вызова TBI. Оценки поведения (распознавание новых объектов и тест в Y-лабиринте) проводились через 7 дней после mTBI. Парадигма Y-лабиринта обычно используется для оценки спонтанного исследования и реагирования на новое окружение и функции пространственной рабочей памяти (Deselms, et al., 2016). Устройство для испытания изготовлено из идентичных рукавов из черного плексигласа (8×30×15 см), причем рукава идут от центральной точки под углом 120° от центра. Внутри каждого рукава находится разная пространственная подсказка, предназначенная для того, чтобы дать мыши привязку к зрительной памяти. Как правило, существуют два испытания, проводимых с интервалом в несколько минут; здесь испытания проводились с 5-минутными интервалами. Для каждого первого испытания стартовый рукав выбирается случайным образом. Каждое животное помещается в центральную точку окружения Y-лабиринта; во время первого 5-минутного испытания один из двух рукавов наугад закрывается, во время второго 2-минутного испытания все три рукава открыты для исследования. Регистрируется общее время, которое мышь исследовала в каждом рукаве во время второго испытания. Во избежание возможной путаницы, между испытаниями Т-лабиринт тщательно очищается. Время, проведенное в новом ранее не исследованном рукаве относительно знакомого ранее исследованного рукава, используется для оценки любых поведенческих различий между каждой группой лечения животных, т.е. (время, проведенное в новом рукаве минус время, проведенное в знакомом рукаве)/(время, проведенное в новом рукаве плюс время, проведенное в знакомом рукаве). Example 12 Sustained release exenatide significantly increases recognition of new objects and new maze arms seven days after traumatic brain injury. Head trauma was applied as described above and the mice were immediately placed in their original cage to recover. PT302 (0.024 mg/kg, 0.12 mg/kg and 0.6 mg/kg) was administered to mice subcutaneously as a single injection 1 hour after the TBI challenge. Behavioral assessments (novel object recognition and Y-maze test) were performed 7 days after mTBI. The Y-maze paradigm is commonly used to assess spontaneous exploration and response to new environments and spatial working memory functions (Deselms, et al., 2016). The test apparatus is made of identical black plexiglass sleeves (8 x 30 x 15 cm) with the sleeves extending from a central point at an angle of 120° from the center. Inside each sleeve is a different spatial cue designed to give the mouse visual memory binding. As a rule, there are two tests carried out with an interval of several minutes; here the tests were carried out at 5-minute intervals. For each first test, the starting arm is chosen at random. Each animal is placed at the center point of the Y-maze environment; during the first 5-minute trial, one of the two sleeves is randomly closed; during the second 2-minute trial, all three sleeves are open for examination. The total time the mouse explored in each arm during the second trial is recorded. To avoid possible confusion, the T-maze is thoroughly cleaned between tests. The time spent in a new previously untested arm relative to a familiar previously tested arm is used to assess any behavioral differences between each animal treatment group, i.e. (time spent in new arm minus time spent in familiar arm)/(time spent in new arm plus time spent in familiar arm).

Подвергнутые лечению носителем мыши с mTBI страдали от дефицита зрительной памяти и проводили меньше времени возле новых объектов по сравнению с контрольными мышами (p<0,001) (фиг. 11A). Высокое предпочтение нового объекта по сравнению с не подвергнутыми лечению мышами с mTBI наблюдалось у мышей, получавших однократную подкожную инъекцию PT302 через 1 час после вызова mTBI в дозе 0,12 мг/кг (р<0,05) и 0,6 мг/кг (р<0,01) (фиг. 11А).Vehicle-treated mTBI mice suffered from visual memory deficits and spent less time around novel objects compared to control mice (p<0.001) (FIG. 11A). A high preference for novelty over untreated mTBI mice was observed in mice treated with a single subcutaneous injection of PT302 1 hour after mTBI challenge at 0.12 mg/kg (p<0.05) and 0.6 mg/kg (p<0.01) (Fig. 11A).

Мыши, подвергнутые mTBI, продемонстрировали значительное нарушение пространственной памяти и проводили меньше времени в новом рукаве Y-лабиринта по сравнению с фиктивными животными - ложными контролями (p<0,001) (фиг. 11B). Однократная подкожная инъекция PT302 через 1 час после вызова mTBI в дозе 0,12 мг/кг и 0,6 мг/кг уменьшала дефицит пространственной памяти у мышей с mTBI по сравнению с не подвергнутыми лечению мышами с mTBI (p<0,01) (фиг. 11B). [F(4,50)=4,83, р=0,002, ретроспективный тест Фишера для выявления значимости различий].Mice subjected to mTBI showed significant impairment of spatial memory and spent less time in the new arm of the Y-maze compared to dummy controls (p<0.001) (FIG. 11B). A single subcutaneous injection of PT302 1 hour after mTBI challenge at 0.12 mg/kg and 0.6 mg/kg reduced spatial memory deficits in mTBI mice compared to untreated mTBI mice (p<0.01) ( Fig. 11B). [F(4.50)=4.83, p=0.002, Fisher's retrospective test for significance differences].

Все группы проводили приблизительно одинаковое время в открытом рукаве приподнятого плюс лабиринта, и их нельзя было отличить друг от друга в отношении их поведения, подобного тревоге (фиг. 11C); важно отметить, что поведение, подобное тревоге, не было мешающим фактором в предшествующем распознавании новых объектов и парадигмах Y-лабиринта (p>0,05). [F(4,36)=0,28, р=0,89].All groups spent approximately the same amount of time in the open arm of the elevated plus maze and could not be distinguished from each other with respect to their anxiety-like behavior (Fig. 11C); it is important to note that anxiety-like behavior was not a confounding factor in prior recognition of new objects and Y-maze paradigms (p>0.05). [F(4.36)=0.28, p=0.89].

Пример 13. Эксенатид с замедленным высвобождением значительно повышает распознавание новых объектов и новых рукавов лабиринта через тридцать дней после черепно-мозговой травмы. Травму головы наносили, как описано выше, и мышей немедленно помещали в их первоначальную клетку для выздоровления. PT302 (0,6 мг/кг) вводили мышам подкожно в виде однократной инъекции через 1 час после вызова TBI. Оценки поведения (распознавание новых объектов и тест в Y-лабиринте) проводились через 30 дней после mTBI. EXAMPLE 13 Sustained release exenatide significantly enhances recognition of new objects and new maze arms thirty days after traumatic brain injury. Head trauma was applied as described above and the mice were immediately placed in their original cage to recover. PT302 (0.6 mg/kg) was administered to mice subcutaneously as a single injection 1 hour after the TBI challenge. Behavioral assessments (novel object recognition and Y-maze test) were performed 30 days after mTBI.

Подвергнутые лечению носителем мыши с mTBI страдали от дефицита зрительной памяти и проводили меньше времени возле нового объекта по сравнению с контрольными мышами (р<0,001; фиг. 12А). Высокое предпочтение нового объекта по сравнению с мышами с mTBI наблюдалось у мышей, получавших однократную подкожную инъекцию PT302 через 1 час после вызова mTBI в дозе 0,12 мг/кг или 0,6 мг/кг (р<0,01 и р<0,001, соответственно; фиг. 12А).Vehicle-treated mTBI mice suffered from visual memory deficits and spent less time around a novel object compared to control mice (p<0.001; FIG. 12A). A high preference for the new entity over mTBI mice was observed in mice receiving a single subcutaneous injection of PT302 1 hour after the mTBI challenge at 0.12 mg/kg or 0.6 mg/kg (p<0.01 and p<0.001 , respectively, Fig. 12A).

Мыши, подвергнутые mTBI, продемонстрировали значительное нарушение пространственной памяти и проводили меньше времени в новом рукаве лабиринта по сравнению с животными - ложными контролями (p<0,001; фиг. 12B). Однократная подкожная инъекция PT302 через 1 час после вызова mTBI в дозе 0,6 мг/кг уменьшала дефицит пространственной памяти у мышей с mTBI по сравнению с одной только mTBI (p<0,01; фиг. 12B).Mice subjected to mTBI showed significant impairment of spatial memory and spent less time in the new arm of the maze compared to sham controls (p<0.001; Fig. 12B). A single subcutaneous injection of PT302 1 hour after the mTBI challenge at 0.6 mg/kg reduced spatial memory deficits in mTBI mice compared to mTBI alone (p<0.01; FIG. 12B).

Все группы проводили приблизительно одинаковое время в открытом рукаве лабиринта, и их нельзя было отличить друг от друга в отношении их поведения, подобного тревоге (фиг. 12C); что указывает на то, что поведение, подобное тревоге, не было фактором в предыдущем распознавание нового объекта и парадигме Y-лабиринта (р>0,05).All groups spent approximately the same amount of time in the open arm of the maze and could not be distinguished from each other with respect to their anxiety-like behavior (Fig. 12C); indicating that anxiety-like behavior was not a factor in prior novel object recognition and the Y-maze paradigm (p > 0.05).

Пример 14. Введение PT302 предотвращало снижение NeuN-иммунореактивности после черепно-мозговой травмы в областях височной коры и гиппокампа мышей. NeuN является маркером зрелого нейрона, который можно использовать для оценки потери нейронов вследствие черепно-мозговой травмы. Для оценки NeuN клеток в определенных областях головного мозга мышей анестезировали путем введения избытка кетамина + ксилазина и сразу же перфузировали транскардиально с использованием физиологического буферного солевого раствора, а затем 4% параформальдегида ((PFA) в 0,1 М фосфатном буфере, pH 7,4). Их головной мозг удаляли, фиксировали в течение ночи (4% PFA в 0,1 М фосфатном буфере, pH 7,4) и затем помещали в 30% сахарозу на 48 часов. Коронарные срезы (30 мкм) делали в криостате, помещали в криопротектор и хранили при -20°С до использования. После этого 5 срезов коры и 5 срезов гиппокампа блокировали путем инкубации с 0,1% Triton X-100 в фосфатно-солевом буфере (PBST) и 10% нормальной лошадиной сывороткой в течение 1 часа при 25°С. Первое антитело, мышиные антитело против ядер нейронов (NeuN; 1:50, Millipore, Danvers, MA, США, каталожный #MAB3377) затем растворяли в PBST и 2% нормальной лошадиной сыворотке и инкубировали с срезами в течение 48 часов при 4°С. После промывания в PBST срезы инкубировали в течение 1 часа при 25°C с конъюгированным с DyLight™ 594 антикроличьим IgG осла, подвергнутым аффинной хроматографии, и с конъюгированным с DyLight™ 488 антимышиным IgG осла, подвергнутым аффинной хроматографии, (1:300; Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, США). После промывки в PBST срезы устанавливали на сухие предметные стекла, покрытые желатином, и оценивали флуоресценцию с помощью конфокального микроскопа Zeiss LSM 510 с линзами ×20 и ×63 (Carl Zeiss, Jena, Германия). Для каждого головного мозга делали от трех до пяти срезов, и среднее количество клеток в гиппокампе и височной коре рассчитывали в определенных полях или 140², или 440² мкМ. Оценка иммуногистохимических предметных стекол в отношении иммунофлуоресценции была предпринята слепым метолом, и пропуск первого антитела обычно предпринимался при получении срезов отрицательного контроля. Анализы выполнялись с помощью программы Imaris для количественного анализа цвета (Bitplane AG, Zurich, Швейцария). Example 14 Administration of PT302 prevented a decrease in NeuN immunoreactivity after traumatic brain injury in the temporal cortex and hippocampus regions of mice. NeuN is a marker of a mature neuron that can be used to assess neuronal loss due to traumatic brain injury. To assess NeuN cells in specific areas of the brain, mice were anesthetized with an excess of ketamine + xylazine and immediately perfused transcardially with physiological buffered saline followed by 4% paraformaldehyde ((PFA) in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.4 ). Their brains were removed, fixed overnight (4% PFA in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.4) and then placed in 30% sucrose for 48 hours. Coronal sections (30 μm) were made in a cryostat, placed in a cryoprotector and stored at -20°C until use. After that, 5 sections of the cortex and 5 sections of the hippocampus were blocked by incubation with 0.1% Triton X-100 in phosphate-buffered saline (PBST) and 10% normal horse serum for 1 hour at 25°C. The first antibody, mouse anti-nucleus antibody (NeuN; 1:50, Millipore, Danvers, MA, USA, catalog #MAB3377) was then dissolved in PBST and 2% normal horse serum and incubated with sections for 48 hours at 4°C. After washing in PBST, sections were incubated for 1 hour at 25°C with DyLight™ 594 conjugated donkey anti-rabbit IgG affinity chromatographed and DyLight™ 488 conjugated donkey anti-mouse IgG affinity chromatographed (1:300; Jackson Laboratories , Bar Harbor, ME, USA). After washing in PBST, sections were mounted on dry glass slides coated with gelatin and fluorescence was assessed using a Zeiss LSM 510 confocal microscope with ×20 and ×63 lenses (Carl Zeiss, Jena, Germany). Three to five sections were made for each brain, and the average number of cells in the hippocampus and temporal cortex was calculated in certain fields or 140², or 440² µM. Evaluation of immunohistochemical slides for immunofluorescence was undertaken blindly, and omission of the first antibody was generally attempted when negative control sections were obtained. Analyzes were performed with Imaris color quantification software (Bitplane AG, Zurich, Switzerland).

На фиг. 13А представлены репрезентативные изображения NeuN (красных (при оценке в цвете)) нейронов в коре головного мозга, CA3 и зубчатой извилины контрольных мышей, не подвергнутых лечению мышей с mTBI и подвергнутых лечению PT302 мышей с mTBI (0,6 мг/кг через 1 час после mTBI) через 30 дней после mTBI. Гистограммы на фиг. 13B, 13C и 13D показывают количественный анализ выживаемости нейронов в коре, CA3 и зубчатой извилине, соответственно, как было определено по количеству нейронов, положительно окрашенных антителом против NeuN в ложном контроле, группах mTBI и mTBI+PT302 0,6 мг/кг (**р<0,01, ***р<0,001). Значения представляют собой средние значения ± SEM. Введение эксендина-4 с замедленным высвобождением в форме PT302 предотвращало потерю нейронов, наблюдаемую вследствие черепно-мозговой травмы.In FIG. 13A are representative images of NeuN (red (when judged in color)) neurons in the cerebral cortex, CA3, and dentate gyrus of control, untreated mTBI mice and PT302-treated mTBI mice (0.6 mg/kg after 1 hour). after mTBI) 30 days after mTBI. The histograms in Fig. 13B, 13C, and 13D show a quantitative analysis of neuronal survival in the cortex, CA3, and dentate gyrus, respectively, as determined by the number of neurons positively stained with anti-NeuN antibody in the mock control, mTBI and mTBI+PT302 0.6 mg/kg groups (* *p<0.01, ***p<0.001). Values are means ± SEM. The administration of sustained release exendin-4 in the form of PT302 prevented the neuronal loss observed due to traumatic brain injury.

Пример 15. Введение PT302 уменьшало количество дегенеративных нейронов у мышей с mTBI . Fluoro-Jade® C представляет собой флуоресцентный краситель, который метит поврежденные дегенеративные нейроны головного мозга, который может использоваться для оценки потери нейронов вследствие черепно-мозговой травмы. Связывающая ионизированный кальций адаптерная молекула 1 (IBA1) специфически экспрессируется в микроглии, и ее экспрессия увеличивается в активированной микроглии, что может использоваться в качестве маркера нейровоспаления. Мышей умерщвляли, и их головной мозг готовили для иммуногистохимического анализа, как описано выше. Коронарные срезы из гиппокампа и теменной коры (40 мкм) делали в криостате и собирали в раствор криопротектора. Были проанализированы CA1, CA3 и зубчатая извилина гиппокампа. Example 15 PT302 administration reduced the number of degenerative neurons in mTBI mice . Fluoro-Jade® C is a fluorescent dye that marks damaged degenerative brain neurons that can be used to assess neuronal loss due to traumatic brain injury. Ionized calcium binding adapter molecule 1 (IBA1) is specifically expressed in microglia and its expression is increased in activated microglia, which can be used as a marker of neuroinflammation. Mice were sacrificed and their brains were prepared for immunohistochemical analysis as described above. Coronal sections from the hippocampus and parietal cortex (40 µm) were made in a cryostat and collected in a cryoprotectant solution. CA1, CA3 and the dentate gyrus of the hippocampus were analyzed.

Для окрашивания FluoroJade C срезы головного мозга сначала погружали в раствор, содержащий 1% NaOH в 80% этаноле, на 5 минут. Их промывали в течение 2 минут в 70% этаноле, промывали в дистиллированной воде, затем инкубировали в 0,06% растворе перманганата калия в течение 10 минут. После промывки водой предметные стекла инкубировали в окрашивающем растворе FJC (полученном путем добавления 4 мл 0,01% исходного раствора FJC в дистиллированной воде к 96 мл 0,1% уксусной кислоты) и окрашивали в течение 10 минут. После 3 промывок дистиллированной водой предметные стекла полностью высушивали на воздухе на нагревателе для предметных стекол, очищали в ксилоле и покрывали DPX. Позитивные по FluoroJade C клетки подсчитывали для каждой области в обоих полушариях с помощью конфокального микроскопа FV 1000MPE Olympus.For FluoroJade C staining, brain sections were first immersed in a solution containing 1% NaOH in 80% ethanol for 5 minutes. They were washed for 2 minutes in 70% ethanol, washed in distilled water, then incubated in 0.06% potassium permanganate solution for 10 minutes. After washing with water, slides were incubated in FJC staining solution (prepared by adding 4 ml of 0.01% FJC stock solution in distilled water to 96 ml of 0.1% acetic acid) and stained for 10 minutes. After 3 washes with distilled water, the slides were completely air-dried on a slide warmer, cleaned in xylene, and coated with DPX. FluoroJade C positive cells were counted for each region in both hemispheres using an FV 1000MPE Olympus confocal microscope.

Для IBA1/TNF-α двойного мечения срезы инкубировали в течение 48 часов с антителом против IBA1 (поликлональным козьим антителом против IBA1 1:200, Abcam, США) и антителом против TNF-α (поликлональным кроличьим антителом против TNF-α, 1:800, Abbiotec, США). После промывки PBS срезы инкубировали со вторым антителом против IBA1, в то время как трехстадийное обнаружение использовали для увеличения сигнала TNF-α с помощью конъюгированного с биотином IgG (антикроличьего IgG (H+L), Biotin-Goat 1:500, Invitrogen, США) и стрептавидина-флуоресцеина (1:200, Vector, Соединенное Королевство).For IBA1/TNF-α double labeling, sections were incubated for 48 hours with anti-IBA1 antibody (polyclonal goat anti-IBA1 antibody 1:200, Abcam, USA) and anti-TNF-α antibody (polyclonal rabbit anti-TNF-α antibody, 1:800 , Abbiotec, USA). After washing with PBS, sections were incubated with a second anti-IBA1 antibody while three-step detection was used to increase TNF-α signal with biotin-conjugated IgG (anti-rabbit IgG (H+L), Biotin-Goat 1:500, Invitrogen, USA) and streptavidin-fluorescein (1:200, Vector, United Kingdom).

Качественный и количественный анализы IBA1 и TNFα проводили с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа FV 1000MPE. Изображения серии Z были обработаны с помощью ImageJ 1.47v, а объем колокализованных элементов был измерен с помощью Imaris 7.4.2 следующим образом: для каждого набора данных канал колокализации был автоматически составлен программным обеспечением. В последних стеках выбиралась представляющая интерес область для каждой области головного мозга (CA1, CA3, DG и коры головного мозга) в каждом полушарии каждого животного, и объем представляющих интерес элементов был рассчитан, суммирован и выражен как объем/мкм³.Qualitative and quantitative analyzes of IBA1 and TNFα were performed using an FV 1000MPE confocal laser scanning microscope. The Z-series images were processed with ImageJ 1.47v and the volume of colocalized elements was measured with Imaris 7.4.2 as follows: for each dataset, a colocalization channel was automatically generated by the software. In the last stacks, a region of interest was selected for each region of the brain (CA1, CA3, DG and cerebral cortex) in each hemisphere of each animal, and the volume of elements of interest was calculated, summarized and expressed as volume/μm ³ .

Как показано на фиг. 14А, после травмы mTBI наблюдалось сильное увеличение числа позитивных по FluoroJade C нейронов во всех исследованных областях (CA1, CA3, DG для гиппокампа и латеральной поверхности коры) по сравнению с контролями (p<0,05 для CA1; p<0,001 для CA3, DG и CTX; фиг. 14A и фиг. 14B, 14C и 14D и 14E, соответственно). Лечение PT302 в дозе 0,6 мг/кг противодействовало индуцированной mTBI нейродегенерации во всех исследованных областях (p<0,01 в CA3 и DG, фиг. 14C и 14D; p<0,05 в CTX и CA1, фиг. 14E и 14B), в то время как доза PT302 0,12 мг/кг продемонстрировала значительный эффект в области CA3 (р<0,05).As shown in FIG. 14A, after mTBI injury, there was a strong increase in the number of FluoroJade C positive neurons in all regions studied (CA1, CA3, DG for the hippocampus and lateral cortex) compared with controls (p<0.05 for CA1; p<0.001 for CA3, DG and CTX, Fig. 14A and Fig. 14B, 14C and 14D and 14E, respectively). Treatment with PT302 at 0.6 mg/kg counteracted mTBI-induced neurodegeneration in all areas studied (p<0.01 in CA3 and DG, Figs. 14C and 14D; p<0.05 in CTX and CA1, Figs. 14E and 14B ), while the 0.12 mg/kg dose of PT302 showed a significant effect in the CA3 region (p<0.05).

Как показано на фиг. 15А, после травмы mTBI IBA1-иммунореактивность увеличивалась по сравнению с носителем в качестве контроля во всех анализируемых областях (р<0,05 для CA1; p<0,001 для CA3, DG и CTX). В контрольной группе клетки микроглии продемонстрировали морфологию покоя с небольшой сомой, длинными и тонкими отростками (фиг. 15А). После травмы mTBI микроглия продемонстрировала активированную морфологию, характеризующуюся более крупным телом с более короткими и более толстыми отростками (фиг. 15А). PT302 в обеих дозах ингибировал активацию микроглии: PT302 в дозе 0,6 мг/кг эффективен во всех областях головного мозга (p<0,001 в CTX; p<0,001 в CA1 и CA3; p<0,05 в DG).As shown in FIG. 15A, after mTBI injury, IBA1 immunoreactivity increased compared to vehicle control in all regions analyzed (p<0.05 for CA1; p<0.001 for CA3, DG, and CTX). In the control group, microglial cells showed a resting morphology with a small soma, long and thin processes (Fig. 15A). After mTBI injury, microglia showed an activated morphology characterized by a larger body with shorter and thicker processes (Fig. 15A). PT302 at both doses inhibited microglial activation: PT302 at 0.6mg/kg was effective in all areas of the brain (p<0.001 in CTX; p<0.001 in CA1 and CA3; p<0.05 in DG).

Иммунореактивность в отношении провоспалительного цитокина TNF-α увеличивалась в IBA1+ клетках в группе с травмой IBA1 во всех анализируемых областях (p<0,05 в DG; p<0,01 в CA1; p<0,001 в CA3 и коре головного мозга; фиг. 15D 15В, 15С и 15Е, соответственно). Введение PT302 в дозах 0,6 и 0,12 мг/кг снижало уровни колокализации IBA1/TNF-α IR как в гиппокампе, так и в коре.Immunoreactivity for the pro-inflammatory cytokine TNF-α increased in IBA1+ cells in the IBA1 injury group in all regions analyzed (p<0.05 in DG; p<0.01 in CA1; p<0.001 in CA3 and cerebral cortex; Fig. 15D 15B, 15C and 15E, respectively). Administration of PT302 at doses of 0.6 and 0.12 mg/kg reduced the levels of IBA1/TNF-α IR colocalization in both the hippocampus and the cortex.

КОНКРЕТНЫЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯSPECIFIC IMPLEMENTATION OPTIONS

В одном аспекте настоящего изобретения предложен способ доставки нейропротективного полипептида по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) субъекта. Способ включает: введение в системный кровоток субъекта терапевтически эффективного количества нейропротективного полипептида с помощью состава с контролируемым высвобождением или устройства, обеспечивающего замедленное высвобождение или долговременную доставку нейропротективного полипептида, причем нейропротективный полипептид включает по меньшей мере один нейропротективный полипептид, выбираемый из группы, состоящей из GLP-1, эксендина-4 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина-4, причем нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина-4 или их комбинации; и причем нейропротективный состав с контролируемым высвобождением или замедленное высвобождение нейропротективного полипептида усиливает доставку и/или ввод нейропротективного полипептида через гематоэнцефалический барьер (ВВВ) субъекта по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС)) по сравнению с составом с быстрым высвобождением нейропротективного пептида.In one aspect, the present invention provides a method for delivering a neuroprotective polypeptide to at least a portion of the central nervous system (CNS) of a subject. The method includes: administering a therapeutically effective amount of a neuroprotective polypeptide to the systemic circulation of a subject using a controlled release formulation or a device that provides sustained release or sustained delivery of the neuroprotective polypeptide, the neuroprotective polypeptide comprising at least one neuroprotective polypeptide selected from the group consisting of GLP- 1, exendin-4 or a therapeutically effective GLP-1 analog or exendin-4, wherein the neuroprotective polypeptide binds to and activates a receptor that binds at least one of GLP-1, exendin-4, or combinations thereof; and wherein the controlled release or sustained release neuroprotective polypeptide formulation enhances delivery and/or entry of the neuroprotective polypeptide across the subject's blood-brain barrier (BBB) into at least a portion of the central nervous system (CNS) compared to a fast release neuroprotective peptide formulation.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения субъекта с заболеванием, связанным с центральной нервной системой (ЦНС), или ослабления по меньшей мере одного симптома заболевания, связанного с ЦНС, у субъекта, нуждающегося в этом. Способ включает: введение в системный кровоток субъекта терапевтически эффективного количества нейропротективного полипептида с помощью состава с контролируемым высвобождением или устройства, обеспечивающего замедленное высвобождение или долговременную доставку нейропротективного полипептида, причем нейропротективный полипептид включает по меньшей мере один нейропротективный полипептид, выбираемый из группы, состоящей из GLP-1, эксендина-4 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина-4, причем нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина-4 или их комбинации; и причем нейропротективный состав с контролируемым высвобождением или устройство усиливают доставку нейропротективного полипептида через гематоэнцефалический барьер (BBB) субъекта по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) по сравнению с составом с быстрым высвобождением нейропротективного полипептида.In another aspect of the present invention, there is provided a method of treating a subject with a central nervous system (CNS) related disease or ameliorating at least one symptom of a CNS related disease in a subject in need thereof. The method includes: administering a therapeutically effective amount of a neuroprotective polypeptide to the systemic circulation of a subject using a controlled release formulation or a device that provides sustained release or sustained delivery of the neuroprotective polypeptide, the neuroprotective polypeptide comprising at least one neuroprotective polypeptide selected from the group consisting of GLP- 1, exendin-4 or a therapeutically effective GLP-1 analog or exendin-4, wherein the neuroprotective polypeptide binds to and activates a receptor that binds at least one of GLP-1, exendin-4, or combinations thereof; and wherein the controlled release neuroprotective formulation or device enhances delivery of the neuroprotective polypeptide across the subject's blood-brain barrier (BBB) to at least a portion of the central nervous system (CNS) compared to a fast release neuroprotective polypeptide formulation.

В одном аспекте настоящего изобретения предложен способ доставки нейропротективного полипептида по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) субъекта. Способ включает введение в системный кровоток субъекта состава с контролируемым высвобождением, включающего по меньшей мере один нейропротективный полипептид, выбираемый из группы, состоящей из GLP-1, эксендина-4 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина-4, причем нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина-4 или их комбинации, и нейропротективный состав с контролируемым высвобождением усиливает доставку и/или ввод нейропротективного полипептида через гематоэнцефалический барьер (BBB) субъекта по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) по сравнению с составом с быстрым высвобождением нейропротективного полипептида.In one aspect, the present invention provides a method for delivering a neuroprotective polypeptide to at least a portion of the central nervous system (CNS) of a subject. The method includes administering to the subject's systemic circulation a controlled release formulation comprising at least one neuroprotective polypeptide selected from the group consisting of GLP-1, exendin-4, or a therapeutically effective GLP-1 analog or exendin-4, wherein the neuroprotective polypeptide binds and activates a receptor that binds at least one of GLP-1, exendin-4, or a combination thereof, and the controlled release neuroprotective formulation enhances delivery and/or entry of the neuroprotective polypeptide across the blood-brain barrier (BBB) of the subject to at least a portion of the central nervous system (CNS) compared to a fast release neuroprotective polypeptide formulation.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, состав с контролируемым высвобождением представляет собой состав нейропротективного полипептида длительного действия.In any aspect or embodiment described herein, the controlled release formulation is a long acting neuroprotective polypeptide formulation.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, состав с контролируемым высвобождением, кроме того, содержит биоразлагаемый полимер с определенной вязкостью и материал покрытия, так что биодоступность и замедленное высвобождение эффективного количества нейропротективного полипептида осуществляется в течение достаточного периода времени (например, без начального выброса, такого как вредный начальный выброс, активного ингредиента).In any aspect or embodiment described herein, the controlled release formulation further comprises a biodegradable polymer of defined viscosity and a coating material such that an effective amount of the neuroprotective polypeptide is bioavailable and sustained for a sufficient period of time (e.g., without initial burst , such as a harmful initial release, of the active ingredient).

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, нейропротективный состав с контролируемым высвобождением включает: микросферу с контролируемым высвобождением, которая включает ядро с нейропротективным полипептидом и биоразлагаемым полимером; и слой покрытия, который покрывает ядро.In any aspect or embodiment described herein, the controlled release neuroprotective formulation comprises: a controlled release microsphere that includes a core with a neuroprotective polypeptide and a biodegradable polymer; and a coating layer that covers the core.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, состав длительного действия включает депо-состав для замедленного высвобождения нейропротективного полипептида.In any aspect or embodiment described herein, the long acting formulation comprises a depot formulation for sustained release of a neuroprotective polypeptide.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, состав длительного действия включает композицию для замедленного высвобождения нейропротективного полипептида.In any aspect or embodiment described herein, the long acting formulation comprises a sustained release formulation for a neuroprotective polypeptide.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением ослабляет по меньшей мере один симптом по меньшей мере одного связанного с ЦНС состояния у субъекта.In any aspect or embodiment described herein, administration of a controlled release neuroprotective formulation ameliorates at least one symptom of at least one CNS-related condition in a subject.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, связанное с ЦНС состояние выбирают из группы, состоящей из болезни Паркинсона (PD), черепно-мозговой травмы (TBI), рассеянного склероза, наркомании, алкогольной зависимости, нейродегенеративных состояний, воспаления головного мозга, болезни Альцгеймера (AD), множественной системной атрофии, болезни Хантингтона, хронической травматической энцефалопатии, заболеваний двигательных нейронов (например, бокового амиотрофического склероза, повреждения спинного мозга, спиноцеребеллярной атаксии (SCA), атрофии мышц позвоночника (SMA)), сосудистой деменции, деменции с тельцами Леви (DLB), смешанной деменции, лобно-височной деменции, болезни Крейтцфельда-Якоба, гидроцефалии нормального давления или их комбинации.In any aspect or embodiment described herein, the CNS-related condition is selected from the group consisting of Parkinson's disease (PD), traumatic brain injury (TBI), multiple sclerosis, drug addiction, alcohol dependence, neurodegenerative conditions, brain inflammation, Alzheimer's disease (AD), multiple system atrophy, Huntington's disease, chronic traumatic encephalopathy, motor neuron diseases (eg, amyotrophic lateral sclerosis, spinal cord injury, spinocerebellar ataxia (SCA), spinal muscle atrophy (SMA)), vascular dementia, body dementia Lewy disease (DLB), mixed dementia, frontotemporal dementia, Creutzfeldt-Jakob disease, normal pressure hydrocephalus, or a combination thereof.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением включает инъекцию нейропротективного состава с контролируемым высвобождением.In any aspect or embodiment described herein, administering the controlled release neuroprotective formulation comprises injecting the controlled release neuroprotective formulation.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, инъекция нейропротективного состава с контролируемым высвобождением представляет собой подкожную инъекцию.In any aspect or embodiment described herein, the injection of the controlled release neuroprotective formulation is a subcutaneous injection.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением приводит к стационарной концентрации нейропротективного полипептида в плазме, которая находится в диапазоне от приблизительно 50 до приблизительно 4500 пг/мл.In any aspect or embodiment described herein, administration of a controlled release neuroprotective formulation results in a steady state plasma concentration of the neuroprotective polypeptide that is in the range of about 50 to about 4500 pg/mL.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением приводит к нарастающему увеличению концентрации нейропротективного полипептида в спинномозговой жидкости (CSF), головном мозге или их комбинации у субъекта.In any aspect or embodiment described herein, administration of a controlled release neuroprotective formulation results in a progressive increase in the concentration of the neuroprotective polypeptide in the cerebrospinal fluid (CSF), brain, or combination thereof in the subject.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, концентрация нейропротективного полипептида в CSF находится в диапазоне от приблизительно 5 до приблизительно 400 пг/мл.In any aspect or embodiment described herein, the concentration of the neuroprotective polypeptide in CSF is in the range of about 5 to about 400 pg/ml.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения субъекта с заболеванием, связанным с центральной нервной системой (ЦНС), или ослабления по меньшей мере одного симптома заболевания, связанного с ЦНС, у субъекта, нуждающегося в этом. Способ включает введение в системный кровоток субъекта терапевтически эффективного количества нейропротективного состава с контролируемым высвобождением, включающего по меньшей мере один нейропротективный полипептид, выбираемый из группы, состоящей из GLP-1, эксендина-4 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина-4, причем нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина-4 или их комбинации, и нейропротективный состав с контролируемым высвобождением усиливает доставку нейропротективного полипептида через гематоэнцефалический барьер (ВВВ) субъекта по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) по сравнению с составом с быстрым высвобождением нейропротективного полипептида.In yet another aspect, the present invention provides a method for treating a subject with a central nervous system (CNS) related disease or ameliorating at least one symptom of a CNS related disease in a subject in need thereof. The method includes administering to the subject's systemic circulation a therapeutically effective amount of a controlled release neuroprotective composition comprising at least one neuroprotective polypeptide selected from the group consisting of GLP-1, exendin-4 or a therapeutically effective GLP-1 analog or exendin-4, wherein the neuroprotective polypeptide binds to and activates a receptor that binds at least one of GLP-1, exendin-4, or a combination thereof, and the controlled release neuroprotective formulation enhances delivery of the neuroprotective polypeptide across the blood-brain barrier (BBB) of the subject to at least a portion of the central nervous system (CNS) compared to a fast release neuroprotective polypeptide formulation.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, состав с контролируемым высвобождением, кроме того, содержит биоразлагаемый полимер с определенной вязкостью и материалы покрытия, обладая биодоступностью и замедленным высвобождением нейропротективного полипептида в эффективной концентрации в течение определенного периода времени (например, без начального выброса, такого как вредный начальный выброс, активного ингредиента).In any aspect or embodiment described herein, the controlled release formulation further comprises a biodegradable polymer of defined viscosity and coating materials, being bioavailable and sustained release of the neuroprotective polypeptide at an effective concentration over a defined period of time (e.g., no initial burst, such as a harmful initial release, of the active ingredient).

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением включает инъекцию нейропротективного состава с контролируемым высвобождением субъекту.In any aspect or embodiment described herein, administering the controlled release neuroprotective formulation comprises injecting the controlled release neuroprotective formulation into a subject.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, инъекция нейропротективного состава с контролируемым высвобождением субъекту представляет собой подкожную инъекцию.In any aspect or embodiment described herein, injection of the controlled release neuroprotective formulation into a subject is a subcutaneous injection.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, введение состава с контролируемым высвобождением приводит к стационарной концентрации в плазме нейропротективного полипептида, которая находится в диапазоне от приблизительно 50 до приблизительно 4500 пг/мл.In any aspect or embodiment described herein, administration of a controlled release formulation results in a steady state plasma concentration of the neuroprotective polypeptide that is in the range of about 50 to about 4500 pg/mL.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, введение состава с контролируемым высвобождением приводит к нарастающему увеличению концентрации нейропротективного полипептида в по меньшей мере одном из спинномозговой жидкости (CSF), головного мозга или их комбинации.In any aspect or embodiment described herein, administration of the controlled release formulation results in progressive increases in the concentration of the neuroprotective polypeptide in at least one of the cerebrospinal fluid (CSF), the brain, or a combination thereof.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, состав вводят один раз каждые 7-21 день (например, один раз каждые 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 день).In any aspect or embodiment described herein, the formulation is administered once every 7-21 days (e.g., once every 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 , 20 or 21 days).

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, состав вводят во второй раз через приблизительно 7-21 день (например, один раз каждые приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19, приблизительно 20 или приблизительно 21 дней) после предшествующего введения.In any aspect or embodiment described herein, the composition is administered a second time after about 7-21 days (e.g., once every about 7, about 8, about 9, about 10, about 11, about 12, about 13, about 14 , about 15, about 16, about 17, about 18, about 19, about 20, or about 21 days) after the previous administration.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, процентное изменение концентрации нейропротективного полипептида в плазме не превышает приблизительно 30%, когда состав повторно вводят в пределах приблизительно 28 дней (например, в пределах приблизительно 21 или приблизительно 14 дней) от предшествующего введения состава.In any aspect or embodiment described herein, the percentage change in plasma concentration of the neuroprotective polypeptide does not exceed about 30% when the formulation is re-administered within about 28 days (e.g., within about 21 or about 14 days) from prior formulation administration.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложен способ доставки нейропротективного полипептида по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) субъекта. Способ включает: обеспечение долговременной доставки в системный кровоток субъекта по меньшей мере одного нейропротективного полипептида, выбираемого из группы, состоящей из GLP-1, эксендина-4 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина-4, причем нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина-4 или их комбинации; и причем нейропротективный состав с контролируемым высвобождением усиливает доставку и/или ввод нейропротективного полипептида через гематоэнцефалический барьер (BBB) субъекта по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) по сравнению с составом с быстрым высвобождением нейропротективного полипептида.In a further aspect of the present invention, there is provided a method for delivering a neuroprotective polypeptide to at least a portion of the central nervous system (CNS) of a subject. The method includes: providing long-term delivery to the subject's systemic circulation of at least one neuroprotective polypeptide selected from the group consisting of GLP-1, exendin-4 or a therapeutically effective analogue of GLP-1 or exendin-4, wherein the neuroprotective polypeptide binds to and activates the receptor, which binds at least one of GLP-1, exendin-4, or combinations thereof; and wherein the controlled release neuroprotective formulation enhances the delivery and/or entry of the neuroprotective polypeptide across the blood brain barrier (BBB) of the subject to at least a portion of the central nervous system (CNS) compared to the rapid release formulation of the neuroprotective polypeptide.

В дальнейшем аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения субъекта с заболеванием, связанным с центральной нервной системой (ЦНС), или ослабления по меньшей мере одного симптома заболевания, связанного с ЦНС, у субъекта, нуждающегося в этом. Способ включает: обеспечение долговременной доставки в системный кровоток субъекта по меньшей мере одного нейропротективного полипептида, выбираемого из группы, состоящей из GLP-1, эксендина-4 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина-4, причем нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина-4 или их комбинации; и причем нейропротективный состав с контролируемым высвобождением усиливает доставку нейропротективного полипептида через гематоэнцефалический барьер (ВВВ) субъекта по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) по сравнению с составом с быстрым высвобождением нейропротективного полипептида.In a further aspect of the present invention, there is provided a method for treating a subject with a central nervous system (CNS) related disease or ameliorating at least one symptom of a CNS related disease in a subject in need thereof. The method includes: providing long-term delivery to the subject's systemic circulation of at least one neuroprotective polypeptide selected from the group consisting of GLP-1, exendin-4 or a therapeutically effective analogue of GLP-1 or exendin-4, wherein the neuroprotective polypeptide binds to and activates the receptor, which binds at least one of GLP-1, exendin-4, or combinations thereof; and wherein the controlled release neuroprotective formulation enhances delivery of the neuroprotective polypeptide across the blood-brain barrier (BBB) of the subject to at least a portion of the central nervous system (CNS) as compared to the rapid release formulation of the neuroprotective polypeptide.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, предоставление нейропротективного полипептида или полипептидов с замедленным высвобождением включает введение нейропротективного полипептида или полипептидов с помощью устройства (например, насоса, мини-насоса, осмотического насоса, осмотического устройства доставки, инфузионного насоса, устройства для внутривенного введения, перистальтического насоса, миниатюрного инфузионного насоса или т.п.).In any aspect or embodiment described herein, providing a sustained release neuroprotective polypeptide or polypeptides comprises administering the neuroprotective polypeptide or polypeptides via a device (e.g., pump, minipump, osmotic pump, osmotic delivery device, infusion pump, IV device). , peristaltic pump, miniature infusion pump, or the like).

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, процентное изменение стационарной концентрации нейропротективного полипептида в плазме после достижения стационарного состояния, составляет не более приблизительно 80% (например, не более приблизительно 50% или не более приблизительно 40%) при введении состава (например, при введении один раз каждые 7-28 дней или один раз каждые 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 дней).In any aspect or embodiment described herein, the percentage change in steady state plasma concentration of the neuroprotective polypeptide after reaching steady state is no more than about 80% (e.g., no more than about 50% or no more than about 40%) upon administration of the composition (e.g., when administered once every 7-28 days or once every 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 or 28 days).

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, нейропротективный полипептид или полипептиды вводят с помощью устройства (например, насоса, мини-насоса, осмотического насоса, осмотического устройства доставки, инфузионного насоса, устройства для внутривенного введения, перистальтического насоса, миниатюрного инфузионного насоса или т.п.).In any aspect or embodiment described herein, the neuroprotective polypeptide or polypeptides are administered using a device (e.g., a pump, mini-pump, osmotic pump, osmotic delivery device, infusion pump, IV device, peristaltic pump, miniature infusion pump, or the like). .P.).

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, нейропротективный полипептид или полипептиды вводят со скоростью от приблизительно 1 пМ/кг/мин до приблизительно 30 пМ/кг/мин (например, от приблизительно 3 пМ/кг/мин до приблизительно 17,5 пМ/кг/мин).In any aspect or embodiment described herein, the neuroprotective polypeptide or polypeptides are administered at a rate of about 1 pM/kg/min to about 30 pM/kg/min (e.g., about 3 pM/kg/min to about 17.5 pM /kg/min).

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением или обеспечение долговременной доставки нейропротективного полипептида ослабляет по меньшей мере один симптом по меньшей мере одного связанного с ЦНС состояния у субъекта.In any aspect or embodiment described herein, administering a controlled release neuroprotective formulation or providing long term delivery of a neuroprotective polypeptide ameliorates at least one symptom of at least one CNS related condition in a subject.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, введение состава с контролируемым высвобождением или обеспечение замедленного высвобождения нейропротективного полипептида приводит к стационарной концентрации нейропротективного полипептида в плазме, которая находится в диапазоне от приблизительно 50 до приблизительно 4500 мкг/мл.In any aspect or embodiment described herein, administering a controlled release formulation or providing sustained release of a neuroprotective polypeptide results in a steady state plasma concentration of the neuroprotective polypeptide that is in the range of about 50 to about 4500 µg/mL.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, введение композиции с контролируемым высвобождением или обеспечение замедленного высвобождения нейропротективного полипептида приводит к нарастающему увеличению концентрации нейропротективного полипептида в по меньшей мере одном из спинномозговой жидкости (CSF), головного мозга или их комбинации.In any aspect or embodiment described herein, administering a controlled release composition or providing sustained release of a neuroprotective polypeptide results in an incremental increase in the concentration of the neuroprotective polypeptide in at least one of the cerebrospinal fluid (CSF), the brain, or a combination thereof.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, концентрация нейропротективного полипептида в CSF находится в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 400 пг/мл.In any aspect or embodiment described herein, the concentration of the neuroprotective polypeptide in CSF is in the range of about 10 to about 400 pg/ml.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, отношение стационарной концентрации полипептида в CFS к таковой в плазме находится в диапазоне от приблизительно 0,1% до приблизительно 5%.In any aspect or embodiment described herein, the ratio of the steady-state concentration of the polypeptide in CFS to that in plasma is in the range of from about 0.1% to about 5%.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, аналог эксендина-4 представлен химической формулой I или его фармацевтически приемлемой солью:In any aspect or embodiment described herein, the exendin-4 analog is represented by the chemical formula I, or a pharmaceutically acceptable salt thereof:

где:Where:

Xaa5 представляет собой Ala или Thr;Xaa5 is Ala or Thr;

Xaa7 представляет собой Thr или Ser;Xaa7 is Thr or Ser;

Xaa11 представляет собой Ala или Ser;Xaa11 is Ala or Ser;

Xaa12 представляет собой Ala или Lys;Xaa12 is Ala or Lys;

Xaa13 представляет собой Ala или Gln;Xaa13 is Ala or Gln;

Xaa15 представляет собой Ala или Glu;Xaa15 is Ala or Glu;

Xaa16 представляет собой Ala или Glu;Xaa16 is Ala or Glu;

Xaa17 представляет собой Ala или Glu;Xaa17 is Ala or Glu;

Xaa19 представляет собой Ala или Val;Xaa19 is Ala or Val;

Xaa20 представляет собой Ala или Arg;Xaa20 is Ala or Arg;

Xaa26 представляет собой Ala или Leu;Xaa26 is Ala or Leu;

Xaa27 представляет собой Ala или Lys;Xaa27 is Ala or Lys;

при условии, что:provided that:

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, аналог эксендина-4 представлен химической формулой II или его фармацевтически приемлемой солью:In any aspect or embodiment described herein, the exendin-4 analog is represented by the chemical formula II, or a pharmaceutically acceptable salt thereof:

где:Where:

Xaa5 представляет собой Ala или Thr;Xaa5 is Ala or Thr;

Xaa7 представляет собой Thr или Ser;Xaa7 is Thr or Ser;

Xaa11 представляет собой Ala или Ser;Xaa11 is Ala or Ser;

Xaa12 представляет собой Ala или Lys;Xaa12 is Ala or Lys;

Xaa13 представляет собой Ala или Gln;Xaa13 is Ala or Gln;

Xaa15 представляет собой Ala или Glu;Xaa15 is Ala or Glu;

Xaa16 представляет собой Ala или Glu;Xaa16 is Ala or Glu;

Xaa17 представляет собой Ala или Glu;Xaa17 is Ala or Glu;

Xaa19 представляет собой Ala или Val;Xaa19 is Ala or Val;

Xaa20 представляет собой Ala или Arg;Xaa20 is Ala or Arg;

Xaa25 представляет собой Ala, Tarp, Phi, Tyr или нафтилаланин;Xaa25 is Ala, Tarp, Phi, Tyr, or naphthylalanine;

Xaa26 представляет собой Ala или Leu;Xaa26 is Ala or Leu;

при условии, что:provided that:

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, нейропротективный полипептид выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-55.In any aspect or embodiment described herein, the neuroprotective polypeptide is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-55.

Каждый упомянутый здесь документ включен сюда посредством ссылки. За исключением примеров или случаев, где иное явно указано, все числовые величины в этом описании, определяющие количества материалов и т.п., следует понимать как измененные словом «приблизительно». Следует понимать, что верхний и нижний пределы количества, диапазона и соотношения, приведенные здесь, могут независимо комбинироваться. Аналогично, диапазоны и количества для каждого элемента настоящего изобретения могут использоваться вместе с диапазонами или количествами для любого из других элементов.Each document referenced herein is incorporated herein by reference. Except in the examples or where otherwise expressly stated, all numerical values in this description, defining the amount of materials and the like, should be understood as modified by the word "approximately". It should be understood that the upper and lower limits of the amount, range and ratio given here may be independently combined. Likewise, ranges and amounts for each element of the present invention may be used in conjunction with ranges or amounts for any of the other elements.

Специалисты в данной области техники распознают или смогут установить, используя не более чем обычные эксперименты, множество эквивалентов конкретных вариантов осуществления и способов, описанных здесь. Такие эквиваленты, как предполагается, охватываются объемом следующей формулы изобретения.Those skilled in the art will recognize, or be able to ascertain using no more than routine experimentation, many equivalents to the specific embodiments and methods described herein. Such equivalents are intended to be covered by the scope of the following claims.

Понятно, что подробные примеры и варианты осуществления, описанные здесь, даны в качестве примера только для иллюстративных целей и никоим образом не рассматриваются как ограничивающие настоящее изобретение. В свете этого у специалистов в данной области техники будут вызываться мысли о различных модификациях или изменениях, и они включены в сущность и содержание этой заявки и рассматриваются в объеме прилагаемой формулы изобретения. Например, относительные количества ингредиентов могут меняться для оптимизации желаемых эффектов, могут добавляться дополнительные ингредиенты, и/или аналогичные ингредиенты могут заменять один или более описанных ингредиентов. Дополнительные преимущественные признаки и функциональные возможности, связанные с системами, способами и процессами настоящего изобретения, будут очевидны из прилагаемой формулы изобретения. Кроме того, специалисты в данной области техники распознают или смогут установить, используя не более чем обычные эксперименты, множество эквивалентов конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения, описанных здесь. Такие эквиваленты, как предполагается, охватываются следующей формулой изобретения.It is understood that the detailed examples and embodiments described herein are given by way of example for illustrative purposes only and are not intended to limit the present invention in any way. In light of this, various modifications or changes will be evoked by those skilled in the art and are incorporated into the spirit and scope of this application and are construed within the scope of the appended claims. For example, the relative amounts of ingredients may be varied to optimize the desired effects, additional ingredients may be added, and/or similar ingredients may be substituted for one or more of the ingredients described. Additional advantageous features and functionality associated with the systems, methods and processes of the present invention will be apparent from the appended claims. In addition, those skilled in the art will recognize, or be able to ascertain using no more than routine experimentation, many equivalents to the specific embodiments of the present invention described herein. Such equivalents are intended to be covered by the following claims.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫBIBLIOGRAPHY

Abercrombie M (1946) Estimation of nuclear population from microtome sections. Anat Rec 94:239-247.Abercrombie M (1946) Estimation of nuclear population from microtome sections. Anat Rec 94:239-247.

Bressler et al. "Pharmacological regulation of blood glucose levels in non-insulin dependent diabetes," Arch. Int. Med. 157:836-848 (1997)Bressler et al . "Pharmacological regulation of blood glucose levels in non-insulin dependent diabetes," Arch. Int. Med. 157:836-848 (1997)

Calvo et al. "Structural characterization by affinity cross-linking of glucagon-like peptide-1 (7-36) amide receptor in rat brain," J. Neurochem. 64(1):299-306 (1995)Calvo et al . "Structural characterization by affinity cross-linking of glucagon-like peptide-1 (7-36) amide receptor in rat brain," J. Neurochem. 64(1):299-306(1995)

Campos et al. "Divergent tissue-specific and developmental expression of receptors for glucagon and glucagon-like peptide-1 in the mouse," Endocrinology 134:2156 -64 (1994)Campos et al . "Divergent tissue-specific and developmental expression of receptors for glucagon and glucagon-like peptide-1 in the mouse," Endocrinology 134:2156-64 (1994)

Chen et al. "Tissue-specific expression of unique mRNAs that encode pro-glucagon-derived peptides or exendin-4 in the lizard," J. Biol. Chem. 272: 4108-4115 (1997Chen et al . "Tissue-specific expression of unique mRNAs that encode pro-glucagon-derived peptides or exendin-4 in the lizard," J. Biol. Chem. 272:4108-4115 (1997)

De Ore et al. "The effect of GLP-1 on insulin release in young and old rats in the fasting state and during an intravenous glucose tolerance test," J. Gerontol. 52:B245-249 (1997)DeOre et al . "The effect of GLP-1 on insulin release in young and old rats in the fasting state and during an intravenous glucose tolerance test," J. Gerontol. 52:B245-249 (1997)

Drucker et al. "Glucagon-like peptide I stimulates insulin gene expression and increases cyclic AMP levels in a rat islet cell line," Proc. Natl. Acad. Sci. 84:3434-3438 (1987)Drucker et al . "Glucagon-like peptide I stimulates insulin gene expression and increases cyclic AMP levels in a rat islet cell line," Proc. Natl. Acad. sci. 84:3434-3438 (1987)

During MJ, et al. ʺGlucagon-like peptide-1 receptor is involved in learning and neuroprotection,ʺ Nature Medicine 9: 1173-1179 (2003).During MJ, et al . "Glucagon-like peptide-1 receptor is involved in learning and neuroprotection," Nature Medicine 9: 1173-1179 (2003).

Elahi et al. "The insulinotropic actions of glucose-dependent insulinotropic polypeptide (GIP) and glucagon-like peptide-1 (7-36) in normal and diabetic subjects," Regul. Pep. 51:63-74 (1994)Elahiet al. "The insulinotropic actions of glucose-dependent insulinotropic polypeptide (GIP) and glucagon-like peptide-1 (7-36) in normal and diabetic subjects,"Regul. Pep.51:63-74 (1994)

Fehmann et al. "Cell and Molecular Biology of the Incretin Hormones Glucagon-Like Peptide-I and Glucose-Dependent Insulin Releasing Polypeptide," Endocrine Rev. 16:390-410 (1995)Fehmann et al . "Cell and Molecular Biology of the Incretin Hormones Glucagon-Like Peptide-I and Glucose-Dependent Insulin Releasing Polypeptide," Endocrine Rev. 16:390-410 (1995)

Fehmann et al. "Insulinotropic hormone glucagon-like peptide-1 (7-37) stimulation of proinsulin gene expression and proinsulin biosynthesis in insulinoma BTC-1 cells", Endocrinology 130: 159-166 (1992)Fehmann et al . "Insulinotropic hormone glucagon-like peptide-1 (7-37) stimulation of proinsulin gene expression and proinsulin biosynthesis in insulinoma BTC-1 cells", Endocrinology 130: 159-166 (1992)

Geula and Mesulam "Cortical cholinergic fibers in aging and Alzheimer's disease: a morphometric study," Neuroscience. 33:469-81 (1989)Geula and Mesulam "Cortical cholinergic fibers in aging and Alzheimer's disease: a morphometric study," Neuroscience. 33:469-81 (1989)

Ghazzi et al. "Cardiac and glycemic benefits of troglitazone treatment in NIDDM," Diabetes 46: 433-439. Care. 15: 270-276 (1997)Ghazzi et al . "Cardiac and glycemic benefits of troglitazone treatment in NIDDM," Diabetes 46: 433-439. care. 15:270-276 (1997)

Goke et al. "Cardiac and Glycemic Benefits of Troglitazone Treatment in NIDDM," Diabetes 46:433-439 (1993)Goke et al . "Cardiac and Glycemic Benefits of Troglitazone Treatment in NIDDM," Diabetes 46:433-439 (1993)

Goke et al. "Distribution of GLP-1 binding sites in the rat brain: evidence that exendin-4 is a ligand of brain GLP-1 binding sites, Eur. J. Neurosci7:2294-2300 (1995)Goke et al . "Distribution of GLP-1 binding sites in the rat brain: evidence that exendin-4 is a ligand of brain GLP-1 binding sites, Eur. J. Neurosci7:2294-2300 (1995)

Goke et al. "Exendin-4 is a high potency agonist and truncated exendin-4 (9-39)-amide in an antagonist at the GLP-1 (7-36)-amide receptor of insulin-secreting -cells," J. Biol. Chem. 268:19650-19655 (1993)Goke et al . "Exendin-4 is a high potency agonist and truncated exendin-4 (9-39)-amide in an antagonist at the GLP-1 (7-36)-amide receptor of insulin-secreting -cells," J. Biol. Chem. 268:19650-19655 (1993)

Greig N et al. "Once daily injection of exendin-4 to diabetic mice achieves long-term beneficial effects on blood glucose concentrations." Diabetologia 42:45-50, (1999).Greig N et al . "Once daily injection of exendin-4 to diabetic mice achieves long-term beneficial effects on blood glucose concentrations." Diabetologia 42:45-50, (1999).

Gross and Meienhofer (eds.) "The Peptides: Analysis, Synthesis," Biology 3: Protection of Functional Groups in Peptide Synthesis, Academic Press, N.Y. (1981)Gross and Meienhofer (eds.) "The Peptides: Analysis, Synthesis," Biology 3: Protection of Functional Groups in Peptide Synthesis, Academic Press, NY (1981)

Gutniak et al. "Antidiabetogenic effect of glucagon-like peptide-1 (7-36) amide in normal subjects and patients with diabetes mellitus," N. Engl. J. Med. 326:1316-1322 (1992)Gutniak et al . "Antidiabetogenic effect of glucagon-like peptide-1 (7-36) amide in normal subjects and patients with diabetes mellitus," N. Engl. J. Med . 326:1316-1322 (1992)

Jia Y et al. 2015 Peptidic exenatide and herbal catapol mediate neuroprotection via the hippocampal GLP-1 receptor/β-endorphin pathway,ʺ Pharmacological Research 102:276-85.Jia Y et al . 2015 Peptidic exenatide and herbal catapol mediate neuroprotection via the hippocampal GLP-1 receptor/β-endorphin pathway,ʺ Pharmacological Research 102:276-85.

Jin et al. "Distribution of glucagonlike peptide I (GLP-I), glucagon, and glicentin in the rat brain: an immunocytochemical study," J. Comp. Neurol. 271:519-32. (1988)Jin et al . "Distribution of glucagonlike peptide I (GLP-I), glucagon, and glicentin in the rat brain: an immunocytochemical study," J. Comp. Neurol. 271:519-32. (1988)

Kastin AJ and Akeerstrom V, International Journal of Obesity (2003) 27, 313-31Kastin AJ and Akeerstrom V, International Journal of Obesity (2003) 27, 313-31

Kim BJ, et al. ʺTransferrin fusion technology: a novel approach to prolonging biological half-life of insulinotropic peptides,ʺ J Pharmacol Exp. Ther. 2010 Sep 1; 334(3):682-92.Kim BJ, et al . ʺTransferrin fusion technology: a novel approach to prolonging biological half-life of insulinotropic peptides,ʺ J Pharmacol Exp. Ther. 2010 Sep 1; 334(3):682-92.

Kim S, et al. ʺExendin-4 protects dopaminergic neurons by inhibition of microglial activation and matrix metalloproteinase-3 expression in an animal model of Parkinson's disease,ʺ J Endocrinol 202(3):431-9 (2009)Kim S, et al. ʺExendin-4 protects dopaminergic neurons by inhibition of microglial activation and matrix metalloproteinase-3 expression in an animal model of Parkinson's disease,ʺ J Endocrinol 202(3):431-9 (2009)

Lahiri DK, Farlow MR, Hintz N, Utsuki T and Greig NH. 2000 Cholinesterase inhibitors, beta-amyloid precursor protein and amyloid beta-peptides in Alzheimer's disease Acta Neurol Scand Suppl 176:60-67.Lahiri DK, Farlow MR, Hintz N, Utsuki T and Greig NH. 2000 Cholinesterase inhibitors, beta-amyloid precursor protein and amyloid beta-peptides in Alzheimer's disease Acta Neurol Scand Suppl 176:60-67.

Li Y, et al. ʺGLP-1 receptor stimulation preserves primary cortical and dopaminergic neurons in cellular and rodent models of stroke and Parkinsonism,ʺ Proc Natl Acad Sci USA 106(4):1285-90 (2009)LiY, et al. ʺGLP-1 receptor stimulation preserves primary cortical and dopaminergic neurons in cellular and rodent models of stroke and Parkinsonism,ʺ Proc Natl Acad Sci USA 106(4):1285-90 (2009)

Liu W, et al. ʺNeuroprotective effects of lixisenatide and liraglutide in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson's disease,ʺ Neuroscience 202:42-50 (2015)Liu W, et al. ʺNeuroprotective effects of lixisenatide and liraglutide in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson's disease,ʺ Neuroscience 202:42-50 (2015)

Lu Z, et al., 2014 ʺDifferential hypoglycaemic, anorectic, autonomic and emetic effects of the glucagon-like peptide receptor agonist, exendin-4, in the conscious telemetered ferret,ʺ J. Transl Med. 12: 327.Lu Z, et al ., 2014 ʺDifferential hypoglycaemic, anorectic, autonomic and emetic effects of the glucagon-like peptide receptor agonist, exendin-4, in the conscious telemetered ferret,ʺ J. Transl Med. 12:327.

Mark RJ, Pang Z, Geddes JW, Uchida K and Mattson MP. 1997 Amyloid beta-peptide impairs glucose transport in hippocampal and cortical neurons: involvement of membrane lipid peroxidation J Neurosci 17:1046-1054. Mark RJ, Pang Z, Geddes JW, Uchida K and Mattson MP. 1997 Amyloid beta-peptide impairs glucose transport in hippocampal and cortical neurons: involvement of membrane lipid peroxidation J Neurosci 17:1046-1054.

Martin B, et al. 2012 ʺEuglycemic agent-mediated hypothalamic transcriptomic manipulation in the N171-82Q model of Huntington disease is related to their physiological efficacy,ʺ J Biol Chem 287(38):31766-82.Martin B, et al. 2012 ʺEuglycemic agent-mediated hypothalamic transcriptomic manipulation in the N171-82Q model of Huntington disease is related to their physiological efficacy,ʺ J Biol Chem 287(38):31766-82.

Mattson MP, Lovell MA, Furukawa K et al., (1995) Neurotrophic factors attenuate glutamate-induced accumulation of peroxides, elevation of intracellular Ca2+ concentration, and neurotoxicity and increase antioxidant enzyme activities in hippocampal neurons. J Neurochem 65(4):1740-1751.Mattson MP, Lovell MA, Furukawa K et al., (1995) Neurotrophic factors attenuate glutamate-induced accumulations of peroxides, elevation of intracellular Ca2+ concentration, and neurotoxicity and increase antioxidant enzyme activities in hippocampal neurons. J Neurochem 65(4):1740-1751.

Moceri et al. "Early-life risk factors and the development of Alzheimer's disease," Neurology 54:415-420 (2000)Moceri et al. "Early-life risk factors and the development of Alzheimer's disease," Neurology 54:415-420 (2000)

Montrose-Rafizadeh C, Wang Y, Janczewski AM et al., (1997a) Overexpression of glucagon-like peptide-1 receptor in an insulin-secreting cell line enhances glucose responsiveness. Mol Cell Endocrinol 130(1-2):109-117.Montrose-Rafizadeh C, Wang Y, Janczewski AM et al., (1997a) Overexpression of glucagon-like peptide-1 receptor in an insulin-secreting cell line enhances glucose responsiveness. Mol Cell Endocrinol 130(1-2):109-117.

Montrose-Rafizadeh et al. "High potency antagonists of the pancreatic glucagon-like peptide-1 receptor," J. Biol. Chem. 272:21201-21206 (1997b)Montrose Rafizadeh et al. "High potency antagonists of the pancreatic glucagon-like peptide-1 receptor," J. Biol. Chem. 272:21201-21206(1997b)

Montrose-Rafizadeh et al. "Incretin hormones regulate glucose dependent insulin secretion in RIN 1046-38 cells: mechanisms of action," Endocrinology 135:589-594 (1994)Montrose Rafizadeh et al . "Incretin hormones regulate glucose dependent insulin secretion in RIN 1046-38 cells: mechanisms of action," Endocrinology 135:589-594 (1994)

Nathan et al. "Insulinotropic action of glucagonlike peptide-I-(7-37) in diabetic and nondiabetic subjects," Diabetes Care 15:270-276 (1992)Nathan et al . "Insulinotropic action of glucagonlike peptide-I-(7-37) in diabetic and nondiabetic subjects," Diabetes Care 15:270-276 (1992)

Nauck et al. "Preserved incretin activity of Glucagon-like peptide 1 (7-36) amide but not of synthetic human gastric inhibitory polypeptide in patients with Type-2 diabetes mellitus," J. Clin. Invest. 91: 301-307 (1993)Nauck et al . "Preserved incretin activity of Glucagon-like peptide 1 (7-36) amide but not of synthetic human gastric inhibitory polypeptide in patients with Type-2 diabetes mellitus," J. Clin. Invest. 91:301-307 (1993)

Nauck et al. "Normalization of fasting hyperglycemia by exogenous glucagon-like peptide-1 (7-36) amide in type II (non-insulin dependent) diabetic patients," Diabetologia 36:741-744 (1993)Nauck et al . "Normalization of fasting hyperglycemia by exogenous glucagon-like peptide-1 (7-36) amide in type II (non-insulin dependent) diabetic patients," Diabetologia 36:741-744 (1993)

Naya et al. "Diabetes, defective pancreatic morphogenesis, and abnormal enteroendocrine differentiation in BETA2/neuroD-deficient mice," Genes Dev. 11:2323-2334 (1997)Naya et al . "Diabetes, defective pancreatic morphogenesis, and abnormal enteroendocrine differentiation in BETA2/neuroD-deficient mice," Genes Dev. 11:2323-2334 (1997)

Orskov "Glucagon-like peptide-1, a new hormone of the entero-insular axis," Diabetologia 35: 701-711 (1992)Orskov "Glucagon-like peptide-1, a new hormone of the entero-insular axis," Diabetologia 35: 701-711 (1992)

Ott et al. " Diabetes mellitus and the risk of dementia: The Rotterdam Study," Neurology 53:1937-42 (1999)Ott et al . "Diabetes mellitus and the risk of dementia: The Rotterdam Study," Neurology 53:1937-42 (1999)

Paxinos and Watson. "The rat brain in stereotaxic coordinates", Academic Press, NSW Australia (1998).Paxinos and Watson. "The rat brain in stereotaxic coordinates", Academic Press, NSW Australia (1998).

Perry et al. "Behavioural, histological and immunocytochemical consequences following 192 IgG-saporin immunolesions of the basal forebrain cholinergic system," Brain Res. Bull. 54:29-48 (2001) Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, E. W. (ed.) latest edition Mack Publishing Co., Easton, PA)Perry et al. "Behavioural, histological and immunocytochemical consequences following 192 IgG-saporin immunolesions of the basal forebrain cholinergic system," Brain Res. Bull. 54:29-48 (2001) Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, EW (ed.) latest edition Mack Publishing Co., Easton, PA)

Ritzel et al. "Pharmacokinetic, insulinotropic, and glucagonostatic properties of GLP-1 [7-36 amide] after subcutaneous injection in healthy volunteers. Dose-response-relationships," Diabetologia. 38:720-725 (1995)Ritzel et al. "Pharmacokinetic, insulinotropic, and glucagonostatic properties of GLP-1 [7-36 amide] after subcutaneous injection in healthy volunteers. Dose-response-relationships," Diabetologia. 38:720-725 (1995)

Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, (2nd ed.) Vol. 1-3 Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989)Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, (2nd ed.) Vol. 1-3 Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989)

Satoh et al. "Characterization of human and rat glucagon-like peptide-1 receptors in the neurointermediate lobe: lack of coupling to either stimulation or inhibition of adenylyl cyclase," Endocrinology 141:1301-9 (2000)Satoh et al. "Characterization of human and rat glucagon-like peptide-1 receptors in the neurointermediate lobe: lack of coupling to either stimulation or inhibition of adenylyl cyclase," Endocrinology 141:1301-9 (2000)

Shughrue et al. "Glucagon-like peptide-1 receptor (GLP1-R) mRNA in the rat hypothalamus," Endocrin. 137(11):5159-62 (1996)Shughrue et al. "Glucagon-like peptide-1 receptor (GLP1-R) mRNA in the rat hypothalamus," Endocrin. 137(11):5159-62 (1996)

Suzuki N, Cheung TT, Cai XD, Odaka A, Otvos L, Jr, Eckman C, Golde TE and Younkin SG. 1994 An increased percentage of long amyloid beta protein secreted by familial amyloid beta protein precursor (beta APP717) mutants Science 264:1336-1340.Suzuki N, Cheung TT, Cai XD, Odaka A, Otvos L, Jr, Eckman C, Golde TE and Younkin SG. 1994 An increased percentage of long amyloid beta protein secreted by familial amyloid beta protein precursor (beta APP717) mutants Science 264:1336-1340.

Thorens et al. "Cloning and functional expression of the human islet GLP-1 receptor. Demonstration that exendin-4 is an agonist and exendin(9-39) an antagonist of the receptor," Diabetes 42:1678-1682 (1993)Thorens et al. "Cloning and functional expression of the human islet GLP-1 receptor. Demonstration that exendin-4 is an agonist and exendin(9-39) an antagonist of the receptor," Diabetes 42:1678-1682 (1993)

Thorens et al. "Glucagon-like peptide-1 and the control of insulin secretion in the normal state and in NIDDM," Diabetes 42:1219-1225 (1993)Thorens et al. "Glucagon-like peptide-1 and the control of insulin secretion in the normal state and in NIDDM," Diabetes 42:1219-1225 (1993)

U.S. Patent No. 3,710,795 "Drug-Delivery device with Stretched, Rate-Controlling Membrane," Higuchi et al. (Jan. 16, 1973)U.S. Patent No. 3,710,795 "Drug-Delivery device with Stretched, Rate-Controlling Membrane," Higuchi et al. (Jan. 16, 1973)

Wang et al. "GIP regulates glucose transporters, hexokinases, and glucose-induced insulin secretion in RIN 1046-38 cells," Moll. Cell. Endo.116:81-87 (1996)Wang et al. "GIP regulates glucose transporters, hexokinases, and glucose-induced insulin secretion in RIN 1046-38 cells," Moll. cell. Endo.116:81-87 (1996)

Wang et al. "Glucagon-like peptide-1 affects gene transcription and messenger ribonucleic acid stability of components of the insulin secretory system in RIN 1046-38 cells," Endocrinology 136:4910-4917 (1995)Wang et al. "Glucagon-like peptide-1 affects gene transcription and messenger ribonucleic acid stability of components of the insulin secretory system in RIN 1046-38 cells," Endocrinology 136:4910-4917 (1995)

Wei et al. "Tissue-specific expression of the human receptor for glucagon-like peptide-I: brain, heart and pancreatic forms have the same deduced amino acid sequences," FEBS Lett 358(3):219-224 (Jan. 30, 1995)Wei et al. "Tissue-specific expression of the human receptor for glucagon-like peptide-I: brain, heart and pancreatic forms have the same deduced amino acid sequences," FEBS Lett 358(3):219-224 (Jan. 30, 1995)

Wilms et al. "Gastric emptying, glucose responses, and insulin secretion after a liquid test meal: effects of exogenous glucagon-like peptide-1 (7-36) amide in Type II (non-insulin-dependent) diabetic patients," J. Clin. Edocrinol. Metab. 81:327 332 (1996)Wilms et al. "Gastric emptying, glucose responses, and insulin secretion after a liquid test meal: effects of exogenous glucagon-like peptide-1 (7-36) amide in Type II (non-insulin-dependent) diabetic patients," J. Clin. edocrinol. Metab. 81:327 332 (1996)

--->--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙSEQUENCE LIST

<110> PEPTRON CO., LTD<110> PEPTRON CO.,LTD

<120> СПОСОБЫ ДОСТАВКИ НЕЙРОПРОТЕКТИВНОГО ПОЛИПЕПТИДА В ЦЕНТРАЛЬНУЮ <120> METHODS FOR DELIVERY OF A NEUROPROTECTIVE POLYPEPTIDE TO THE CENTRAL

НЕРВНУЮ СИСТЕМУ И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫNERVOUS SYSTEM AND METHODS OF TREATMENT OF DISEASES OF THE CENTRAL NERVOUS SYSTEM

<130> 1568390.100US0<130> 1568390.100US0

<140> TBD<140> TBD

<141> 2017-10-20<141> 2017-10-20

<150> 62/410,748<150> 62/410.748

<151> 2016-10-20<151> 2016-10-20

<160> 55<160> 55

<170> FastSEQ для версии 4.0 Windows<170> FastSEQ for Windows version 4.0

<210> 1<210> 1

<211> 30<211> 30

<212> Белок<212> Protein

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220> <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =<223> Artificial sequence description: Note =

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 1<400> 1

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu GlyHis Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly ArgGln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg

20 25 30 20 25 30

<210> 2<210> 2

<211> 39<211> 39

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 2<400> 2

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu GluHis Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu

1 5 10 15 1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro SerGlu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser

20 25 30 20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro SerSer Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35 35

<210> 3<210> 3

<211> 30<211> 30

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 3<400> 3

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu GlyHis Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

<210> 4<210> 4

<211> 30<211> 30

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 4<400> 4

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

<210> 5<210> 5

<211> 30<211> 30

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 5<400> 5

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Ser Tyr Leu Glu GlyHis Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

<210> 6<210> 6

<211> 30<211> 30

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 6<400> 6

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu GlyHis Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

<210> 7<210> 7

<211> 30<211> 30

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 7<400> 7

1 5 10 15 1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly GlyGlu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly

20 25 30 20 25 30

<210> 8<210> 8

<211> 31<211> 31

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<220><220>

<221> Вариант <221> Option

<222> 2<222> 2

<223> Xaa=аминокапроновая кислота<223> Xaa=aminocaproic acid

<400> 8<400> 8

His Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu GluHis Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu

1 5 10 15 1 5 10 15

Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly ArgGly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg

20 25 30 20 25 30

<210> 9<210> 9

<211> 39<211> 39

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<220><220>

<221> Вариант <221> Option

<222> 30<222> 30

<223> Xaa=любая аминокислота<223> Xaa=any amino acid

<400> 9<400> 9

1 5 10 15 1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Xaa Pro SerGln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Xaa Pro Ser

20 25 30 20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro SerSer Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35 35

<210> 10<210> 10

<211> 39<211> 39

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 10<400> 10

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu GluHis Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro SerSer Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35 35

<210> 11<210> 11

<211> 30<211> 30

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 11<400> 11

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

<210> 12<210> 12

<211> 37<211> 37

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 12<400> 12

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Ser Gly Ala Pro ProSer Gly Ala Pro Pro

35 35

<210> 13<210> 13

<211> 35<211> 35

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 13<400> 13

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Ser Gly AlaSer Gly Ala

35 35

<210> 14<210> 14

<211> 33<211> 33

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 14<400> 14

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

SerSer

<210> 15<210> 15

<211> 28<211> 28

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 15<400> 15

1 5 10 15 1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys AsnGlu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn

20 25 20 25

<210> 16<210> 16

<211> 26<211> 26

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 16<400> 16

1 5 10 15 1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp LeuGlu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu

20 25 20 25

<210> 17<210> 17

<211> 23<211> 23

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 17<400> 17

1 5 10 15 1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe IleGlu Ala Val Arg Leu Phe Ile

20 20

<210> 18<210> 18

<211> 20<211> 20

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 18<400> 18

1 5 10 15 1 5 10 15

Glu Ala Val ArgGlu Ala Val Arg

20 20

<210> 19<210> 19

<211> 17<211> 17

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 19<400> 19

1 5 10 15 1 5 10 15

GluGlu

<210> 20<210> 20

<211> 14<211> 14

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 20<400> 20

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln MetHis Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met

1 5 10 1 5 10

<210> 21<210> 21

<211> 11<211> 11

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 21<400> 21

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu SerHis Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser

1 5 10 1 5 10

<210> 22<210> 22

<211> 34<211> 34

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<220><220>

<221> Вариант <221> Option

<222> 3,4,5,6<222> 3,4,5,6

<400> 22<400> 22

His Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser SerHis Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser

1 5 10 15 1 5 10 15

Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val LysTyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys

20 25 30 20 25 30

Gly ArgGly Arg

<210> 23<210> 23

<211> 38<211> 38

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<220><220>

<221> Вариант <221> Option

<222> 3,4,5,6,7,8,9,10<222> 3,4,5,6,7,8,9,10

<400> 23<400> 23

His Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr SerHis Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser

1 5 10 15 1 5 10 15

Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile AlaAsp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala

20 25 30 20 25 30

Trp Leu Val Lys Gly ArgTrp Leu Val Lys Gly Arg

35 35

<210> 24<210> 24

<211> 30<211> 30

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 24<400> 24

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Met Glu GluHis Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Met Glu Glu

1 5 10 15 1 5 10 15

Gln Ala Val Arg Leu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly ArgGln Ala Val Arg Leu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg

20 25 30 20 25 30

<210> 25<210> 25

<211> 30<211> 30

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 25<400> 25

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

<210> 26<210> 26

<211> 30<211> 30

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 26<400> 26

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

<210> 27<210> 27

<211> 30<211> 30

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 27<400> 27

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Leu Glu GlyHis Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

<210> 28<210> 28

<211> 30<211> 30

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 28<400> 28

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Leu Glu GluHis Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15 1 5 10 15

Glu Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly ArgGlu Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg

20 25 30 20 25 30

<210> 29<210> 29

<211> 30<211> 30

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 29<400> 29

1 5 10 15 1 5 10 15

Glu Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly GlyGlu Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Gly

20 25 30 20 25 30

<210> 30<210> 30

<211> 30<211> 30

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 30<400> 30

1 5 10 15 1 5 10 15

Glu Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly ArgGlu Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Arg

20 25 30 20 25 30

<210> 31<210> 31

<211> 30<211> 30

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 31<400> 31

1 5 10 15 1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly ArgGlu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg

20 25 30 20 25 30

<210> 32<210> 32

<211> 30<211> 30

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 32<400> 32

1 5 10 15 1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Ala Trp Leu Lys Asn Gly ArgGlu Ala Val Arg Leu Phe Ile Ala Trp Leu Lys Asn Gly Arg

20 25 30 20 25 30

<210> 33<210> 33

<211> 30<211> 30

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 33<400> 33

1 5 10 15 1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Lys Asn Gly ArgGlu Ala Val Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Lys Asn Gly Arg

20 25 30 20 25 30

<210> 34<210> 34

<211> 39<211> 39

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 34<400> 34

1 5 10 15 1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro SerGln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro Ser

20 25 30 20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro SerSer Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35 35

<210> 35<210> 35

<211> 39<211> 39

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 35<400> 35

1 5 10 15 1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro SerGln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser

20 25 30 20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro SerSer Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35 35

<210> 36<210> 36

<211> 30<211> 30

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 36<400> 36

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu GluHis Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15 1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly ArgGlu Ala Val Arg Leu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg

20 25 30 20 25 30

<210> 37<210> 37

<211> 30<211> 30

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 37<400> 37

1 5 10 15 1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly ArgGln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg

20 25 30 20 25 30

<210> 38<210> 38

<211> 42<211> 42

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 38<400> 38

Tyr Gly Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp LysTyr Gly Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys

1 5 10 15 1 5 10 15

Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys Gly LysIle His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys Gly Lys

20 25 30 20 25 30

Lys Asn Asp Trp Lys His Asn Ile Thr GlnLys Asn Asp Trp Lys His Asn Ile Thr Gln

35 40 35 40

<210> 39<210> 39

<211> 39<211> 39

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 39<400> 39

1 5 10 15 1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Pro SerGln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Pro Ser

20 25 30 20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro SerSer Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35 35

<210> 40<210> 40

<211> 42<211> 42

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 40<400> 40

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ala ProSer Gly Ala Pro Pro Ser Gly Ala Pro

35 40 35 40

<210> 41<210> 41

<211> 45<211> 45

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 41<400> 41

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ala Pro Pro Ser SerSer Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ala Pro Pro Ser Ser

35 40 45 35 40 45

<210> 42<210> 42

<211> 40<211> 40

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<220><220>

<221> Вариант <221> Option

<222> 2<222> 2

<400> 42<400> 42

1 5 10 15 1 5 10 15

Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg ProGly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Pro

20 25 30 20 25 30

Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro SerSer Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35 40 35 40

<210> 43<210> 43

<211> 43<211> 43

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<220><220>

<221> Вариант <221> Option

<222> 2<222> 2

<400> 43<400> 43

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ala ProSer Ser Gly Ala Pro Pro Ser Gly Ala Pro

35 40 35 40

<210> 44<210> 44

<211> 46<211> 46

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<220><220>

<221> Вариант <221> Option

<222> 2<222> 2

<400> 44<400> 44

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ala Pro Pro Ser SerSer Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ala Pro Pro Ser Ser

35 40 45 35 40 45

<210> 45<210> 45

<211> 40<211> 40

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<220><220>

<221> Вариант <221> Option

<222> 3<222> 3

<400> 45<400> 45

His Ala Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu GluHis Ala Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro SerSer Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35 40 35 40

<210> 46<210> 46

<211> 43<211> 43

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<220><220>

<221> Вариант <221> Option

<222> 3<222> 3

<400> 46<400> 46

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 35 40

<210> 47<210> 47

<211> 46<211> 46

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<220><220>

<221> Вариант <221> Option

<222> 3<222> 3

<400> 47<400> 47

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

<210> 48<210> 48

<211> 43<211> 43

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<220><220>

<221> Вариант <221> Option

<222> 2<222> 2

<400> 48<400> 48

Tyr Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met AspTyr Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp

1 5 10 15 1 5 10 15

Lys Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys GlyLys Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys Gly

20 25 30 20 25 30

Lys Lys Asn Asp Trp Lys His Asn Ile Thr GlnLys Lys Asn Asp Trp Lys His Asn Ile Thr Gln

35 40 35 40

<210> 49<210> 49

<211> 36<211> 36

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 49<400> 49

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Ser Gly Ala ProSer Gly Ala Pro

35 35

<210> 50<210> 50

<211> 39<211> 39

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 50<400> 50

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro SerSer Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35 35

<210> 51<210> 51

<211> 36<211> 36

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 51<400> 51

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Ser Gly Ala ProSer Gly Ala Pro

35 35

<210> 52<210> 52

<211> 33<211> 33

<212> Белок<212> Protein

<220> <220>

Синтетическая конструкция Synthetic construction

<400> 52<400> 52

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

SerSer

<210> 53<210> 53

<211> 39<211> 39

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

<223> аминокислотная последовательность эксендина-3<223> exendin-3 amino acid sequence

<400> 53<400> 53

His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu GluHis Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro SerSer Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35 35

<210> 54<210> 54

<211> 31<211> 31

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

<223> аминокислотная последовательность варианта эксендина-4<223> amino acid sequence of exendin-4 variant

<400> 54<400> 54

1 5 10 15 1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly ProGlu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro

20 25 30 20 25 30

<210> 55<210> 55

<211> 39<211> 39

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

<223> аминокислотная последовательность 14Leu25Phe варианта эксендина-4<223> amino acid sequence of 14Leu25Phe exendin-4 variant

<400> 55<400> 55

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu GluHis Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu

1 5 10 15 1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Phe Leu Lys Asn Gly Gly Pro SerGlu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Phe Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser

20 25 30 20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro SerSer Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35 35

<---<---

Claims

1. Способ лечения субъекта с заболеванием, связанным с центральной нервной системой (ЦНС), или ослабления по меньшей мере одного симптома заболевания, связанного с ЦНС, у субъекта, нуждающегося в этом, при этом способ включает:1. A method of treating a subject with a disease associated with the central nervous system (CNS), or alleviating at least one symptom of a disease associated with the CNS, in a subject in need thereof, the method includes:

введение в системный кровоток субъекта терапевтически эффективного количества нейропротективного полипептида с помощью состава с контролируемым высвобождением, содержащего по меньшей мере один биоразлагаемый полимер, причем нейропротективный полипептид включает по меньшей мере один нейропротективный полипептид, выбираемый из группы, состоящей из GLP-1, эксендина-4 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина-4,administration to the subject's systemic circulation of a therapeutically effective amount of a neuroprotective polypeptide using a controlled release formulation containing at least one biodegradable polymer, wherein the neuroprotective polypeptide comprises at least one neuroprotective polypeptide selected from the group consisting of GLP-1, exendin-4, or a therapeutically effective GLP-1 analog or exendin-4,

причем нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина-4 или их комбинации; иwherein the neuroprotective polypeptide binds to and activates a receptor that binds at least one of GLP-1, exendin-4, or combinations thereof; And

причем состав с контролируемым высвобождением также содержит материал покрытия, и биоразлагаемый полимер имеет определенную вязкость, так что биодоступность и замедленное высвобождение эффективного количества нейропротективного полипептида осуществляется в течение достаточного периода времени; wherein the controlled release formulation also contains a coating material and the biodegradable polymer has a specific viscosity such that an effective amount of the neuroprotective polypeptide is bioavailable and sustained for a sufficient period of time;

где заболевание, связанное с ЦНС, выбирают из группы, состоящей из болезни Паркинсона (PD), черепно-мозговой травмы (TBI), болезни Альцгеймера (AD), множественной системной атрофии, болезни Хантингтона, деменции с тельцами Леви (DLB), смешанной деменции, лобно-височной деменции или их комбинации,where the disease associated with the CNS is selected from the group consisting of Parkinson's disease (PD), traumatic brain injury (TBI), Alzheimer's disease (AD), multiple system atrophy, Huntington's disease, dementia with Lewy bodies (DLB), mixed dementia , frontotemporal dementia, or a combination thereof,

где нейропротективный состав с контролируемым высвобождением содержит микросферу с контролируемым высвобождением, которая включает ядро с нейропротективным полипептидом и по меньшей мере одним биоразлагаемым полимером; и слой покрытия, который покрывает ядро,where the neuroprotective composition with controlled release contains a microsphere with controlled release, which includes a core with a neuroprotective polypeptide and at least one biodegradable polymer; and the coating layer that covers the core,

где слой покрытия включает материал покрытия, выбранный из группы, состоящей из основных аминокислот, полипептидов и органических азотсодержащих соединений.where the coating layer includes a coating material selected from the group consisting of basic amino acids, polypeptides and organic nitrogen compounds.

2. Способ по п. 1, в котором состав с контролируемым высвобождением представляет собой состав нейропротективного полипептида длительного действия.2. The method of claim 1 wherein the controlled release formulation is a long acting neuroprotective polypeptide formulation.

3. Способ по п. 2, в котором состав длительного действия включает депо-состав для замедленного высвобождения нейропротективного полипептида.3. The method of claim 2 wherein the long acting formulation comprises a depot formulation for sustained release of the neuroprotective polypeptide.

4. Способ по п. 2, в котором состав длительного действия включает композицию для замедленного высвобождения нейропротективного полипептида.4. The method of claim 2 wherein the long acting formulation comprises a sustained release formulation for the neuroprotective polypeptide.

5. Способ по п. 1, в котором биоразлагаемый полимер выбирают из группы, состоящей из полилактида (PLA), полигликолида (PGA), сополимера лактида и гликолида (PLGA), полиортоэфира, полиангидрида, полигидроксимасляной кислоты, поликапролактона и полиалкилкарбоната, сополимера или простой смеси двух или более, выбираемых из группы полимеров, сополимера полимера и полиэтиленгликоля (PEG) или комплекса полимер-сахар, в котором сахар связан с полимером или сополимером.5. The method of claim 1, wherein the biodegradable polymer is selected from the group consisting of polylactide (PLA), polyglycolide (PGA), lactide-glycolide copolymer (PLGA), polyorthoester, polyanhydride, polyhydroxybutyric acid, polycaprolactone and polyalkyl carbonate, a copolymer, or a simple mixtures of two or more selected from the group of polymers, a copolymer of a polymer and polyethylene glycol (PEG) or a polymer-sugar complex in which the sugar is associated with a polymer or copolymer.

6. Способ по любому из пп. 1-5, в котором введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением включает инъекцию субъекту нейропротективного состава с контролируемым высвобождением.6. The method according to any one of paragraphs. 1-5, wherein administering the controlled release neuroprotective formulation comprises injecting the subject with the controlled release neuroprotective formulation.

7. Способ по п. 6, в котором инъекция субъекту состава с контролируемым высвобождением представляет собой подкожную инъекцию.7. The method of claim 6, wherein the injection of the controlled release formulation into the subject is a subcutaneous injection.

8. Способ по любому из пп. 1-7, в котором состав с контролируемым высвобождением вводят в следующий раз через приблизительно 7-21 день (например, один раз каждые приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19, приблизительно 20 или приблизительно 21 дней) после предшествующего введения.8. The method according to any one of paragraphs. 1-7, wherein the controlled release formulation is administered again about 7-21 days later (e.g., once every about 7, about 8, about 9, about 10, about 11, about 12, about 13, about 14, about 15, about 16, about 17, about 18, about 19, about 20, or about 21 days) after the previous administration.

9. Способ по любому из пп. 1-8, в котором введение нейропротективного полипептида в системный кровоток ослабляет по меньшей мере один симптом по меньшей мере одного связанного с ЦНС заболевания у субъекта.9. The method according to any one of paragraphs. 1-8, wherein administration of the neuroprotective polypeptide to the systemic circulation ameliorates at least one symptom of at least one CNS-related disease in the subject.

10. Способ по любому из пп. 1-9, в котором введение состава с контролируемым высвобождением приводит к стационарной концентрации нейропротективного полипептида в плазме, которая находится в диапазоне от приблизительно 50 до приблизительно 4500 пг/мл.10. The method according to any one of paragraphs. 1-9, wherein administration of the controlled release formulation results in a steady state plasma concentration of the neuroprotective polypeptide that ranges from about 50 to about 4500 pg/mL.

11. Способ по любому из пп. 1-10, в котором введение состава с контролируемым высвобождением приводит к нарастающему увеличению концентрации нейропротективного полипептида в по меньшей мере одном из спинномозговой жидкости (CSF), головного мозга или их комбинации.11. The method according to any one of paragraphs. 1-10, wherein administration of the controlled release formulation results in progressive increases in the concentration of the neuroprotective polypeptide in at least one of the cerebrospinal fluid (CSF), the brain, or a combination thereof.

12. Способ по любому из пп. 1-11, в котором концентрация нейропротективного полипептида в CSF находится в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 400 пг/мл.12. The method according to any one of paragraphs. 1-11, in which the concentration of the neuroprotective polypeptide in CSF is in the range from about 10 to about 400 pg/ml.

13. Способ по любому из пп. 1-12, в котором отношение стационарной концентрации полипептида в CFS к таковой в плазме находится в диапазоне от приблизительно 0,1% до приблизительно 5%.13. The method according to any one of paragraphs. 1-12, in which the ratio of steady-state concentration of the polypeptide in CFS to that in plasma is in the range from about 0.1% to about 5%.

14. Способ по любому из пп. 1-13, в котором аналог эксендина-4 представлен химической формулой I или его фармацевтически приемлемой солью:14. The method according to any one of paragraphs. 1-13, wherein the exendin-4 analog is represented by the chemical formula I or a pharmaceutically acceptable salt thereof:

Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Ala Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28-Z₁ (Химическая формула I),Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Ala Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 Xaa27 _Xaa ),

гдеWhere

Xaa5 представляет собой Ala или Thr;Xaa5 is Ala or Thr;

Xaa7 представляет собой Thr или Ser;Xaa7 is Thr or Ser;

Xaa11 представляет собой Ala или Ser;Xaa11 is Ala or Ser;

Xaa12 представляет собой Ala или Lys;Xaa12 is Ala or Lys;

Xaa13 представляет собой Ala или Gln;Xaa13 is Ala or Gln;

Xaa15 представляет собой Ala или Glu;Xaa15 is Ala or Glu;

Xaa16 представляет собой Ala или Glu;Xaa16 is Ala or Glu;

Xaa17 представляет собой Ala или Glu;Xaa17 is Ala or Glu;

Xaa19 представляет собой Ala или Val;Xaa19 is Ala or Val;

Xaa20 представляет собой Ala или Arg;Xaa20 is Ala or Arg;

Xaa26 представляет собой Ala или Leu;Xaa26 is Ala or Leu;

Xaa27 представляет собой Ala или Lys;Xaa27 is Ala or Lys;

при условии, чтоprovided that

15. Способ по любому из пп. 1-13, в котором аналог эксендина-4 представлен химической формулой II или его фармацевтически приемлемой солью:15. The method according to any one of paragraphs. 1-13, wherein the exendin-4 analog is represented by the chemical formula II or a pharmaceutically acceptable salt thereof:

Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Ala Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 X₁-Z₁ (Химическая формула II),Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Ala Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 X ₁ -Z ₁ ,

гдеWhere

Xaa5 представляет собой Ala или Thr;Xaa5 is Ala or Thr;

Xaa7 представляет собой Thr или Ser;Xaa7 is Thr or Ser;

Xaa11 представляет собой Ala или Ser;Xaa11 is Ala or Ser;

Xaa12 представляет собой Ala или Lys;Xaa12 is Ala or Lys;

Xaa13 представляет собой Ala или Gln;Xaa13 is Ala or Gln;

Xaa15 представляет собой Ala или Glu;Xaa15 is Ala or Glu;

Xaa16 представляет собой Ala или Glu;Xaa16 is Ala or Glu;

Xaa17 представляет собой Ala или Glu;Xaa17 is Ala or Glu;

Xaa19 представляет собой Ala или Val;Xaa19 is Ala or Val;

Xaa20 представляет собой Ala или Arg;Xaa20 is Ala or Arg;

Xaa26 представляет собой Ala или Leu;Xaa26 is Ala or Leu;

при условии, чтоprovided that

16. Способ по любому из пп. 1-13, в котором нейропротективный полипептид выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-55.16. The method according to any one of paragraphs. 1-13, wherein the neuroprotective polypeptide is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-55.