RU2788736C2

RU2788736C2 - Interferon prodrug for cancer treatment

Info

Publication number: RU2788736C2
Application number: RU2020101640A
Authority: RU
Inventors: Ян-Синь Фу; Сюэчжи ЦАО
Original assignee: Дзе Борд Оф Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Техас Систем
Priority date: 2017-06-20
Filing date: 2018-06-18
Publication date: 2023-01-24

Abstract

FIELD: pharmaceutics.

SUBSTANCE: group of inventions relates to the field of pharmaceuticals and medicine. 1 object is an interferon prodrug for the treatment of cancer containing: (a) interferon alpha and beta receptor 2 domain (IFNAR2), which retains IFN-binding activity; (b) interferon type 1 domain (IFN), which retains the activity of interferon type 1 when it is not bound by the specified IFNAR2 domain; (c) the Fc domain of immunoglobulin (Ig), (d) the first linker fused at one end with the N-end of the specified IFN and fused at the other end with the specified IFNAR2, and the specified first linker is G4S-PVGLIG-G4S; and (e) a second linker fused at one end with the C-end of the specified IFN and fused at the other end with the N-end of the specified Fc-domain Ig. 2-4 objects are a nucleic acid construct encoding an interferon prodrug, a recombinant cell containing a nucleic acid construct, and a method for expressing an interferon prodrug. 5-7 objects suggest the use of the interferon prodrug for the treatment of cancer and in the preparation of a drug, a method for the treatment of cancer, including the administration of the interferon prodrug to the patient.

EFFECT: effectiveness and reduced side effects of an IFN prodrug based on IFNAR2.

26 cl, 7 dwg, 1 tbl, 1 ex

Description

ПРИТЯЗАНИЕ НА ПРИОРИТЕТPRIORITY CLAIM

По настоящей заявке испрашивается приоритет временной заявки на патент США с серийным номером 62/522564, поданной 20 июня 2017 г., которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки.This application claims priority to U.S. Provisional Application Serial No. 62/522564, filed June 20, 2017, which is incorporated herein by reference in its entirety.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE INVENTION

1. Область техники1. Technical field

Настоящее изобретение, в целом, относится к областям медицины, онкологии и иммунотерапии. Более конкретно, оно относится к разработке и применению иммунореагентов для лечения рака.The present invention generally relates to the fields of medicine, oncology and immunotherapy. More specifically, it relates to the development and use of immunoreagents for the treatment of cancer.

2. Уровень техники2. State of the art

Считается, что интерфероны I типа (IFN) непосредственно подавляют пролиферацию опухолевых клеток. Они нашли успешное применение в лечении нескольких типов рака, включая гематологические опухоли (хронический миелоидный лейкоз, волосатоклеточный лейкоз, множественную миелому и неходжкинские лимфомы), а также солидные опухоли (меланому, рак почек и саркому Капоши) (Ferrantini et al., 2007, Moschos & Kirkwood, 2007, Zitvogel et al., 2015, и Antonelli et al., 2015). Действительно, согласно накопившимся данным, эндогенный IFN I типа играет ключевую роль в «обучении» дендритных клеток (DC) для повышения эффективности кросс-праймирования против опухолевых антигенов для усиления противоопухолевой активности при химиотерапии, радиотерапии, таргетной терапии и иммунотерапии (Schiavoni et al., 2011, Burnette et al. al., 2011; Stagg et al., 2011 и Woo et al., 2014).It is believed that type I interferons (IFN) directly suppress the proliferation of tumor cells. They have been successfully used in the treatment of several types of cancer, including hematologic tumors (chronic myeloid leukemia, hairy cell leukemia, multiple myeloma, and non-Hodgkin's lymphomas) as well as solid tumors (melanoma, kidney cancer, and Kaposi's sarcoma) (Ferrantini et al., 2007, Moschos & Kirkwood, 2007, Zitvogel et al., 2015, and Antonelli et al., 2015). Indeed, according to accumulating data, endogenous type I IFN plays a key role in "teaching" dendritic cells (DCs) to increase the efficiency of cross-priming against tumor antigens to enhance antitumor activity in chemotherapy, radiotherapy, targeted therapy and immunotherapy (Schiavoni et al., 2011, Burnette et al., 2011; Stagg et al., 2011 and Woo et al., 2014).

Особое преимущество лечения с использованием IFN I типа обусловлено его способностью включаться во многих точках генерации противоопухолевых иммунных ответов, включая стимуляцию популяций врожденных и адаптивных цитотоксических лимфоцитов, негативную регуляцию клеток супрессорного типа, влияние на опухолевые клетки путем ингибирования пролиферации и модуляции апоптоза, дифференцировки, миграции и экспрессии антигена на клеточной поверхности (Parker et al., 2016). Важным является то, что некоторые из этих действий могут представлять потенциальную стратегию по использованию IFN I типа для преодоления устойчивости рака к иммунотерапии. Одним из механизмов рецидива у больных раком является неспособность Т-клеток к распознаванию из-за подавления экспрессии молекул МНС класса I и генов транспортеров пептидов для презентации опухолевого антигена (Sharma et al., 2017). IFN I типа можно использовать для индукции экспрессии MHC класса I, такой как экспрессия LMP2/7 и TAPА-1/2 в опухолевых клетках, что в совокупности является идеальной стратегией комбинированной терапии в борьбе с устойчивостью к иммунотерапии (Khanna, 1998). Кроме того, IFN I типа можно использовать для подавления Treg и MDSC путем негативной регуляции пролиферации Treg (Pace et al., 2010 и Srivastava et al., 2014) и уменьшения накопления MDSC и снижения их подавляющей функции (Zoglmeier et al., 2011), причем и те и другие непосредственно подавляют активность цитотоксических Т-лимфоцитов (Schmidt et al., 2012 и Gabrilovich et al., 2009). Эти многочисленные противоопухолевые эффекты вызывают интерес к IFN I типа как противораковым лекарственным средствам как в случае монотерапии, так и в случае их применения в комбинации с другими видами терапии.A particular benefit of type I IFN treatment is due to its ability to be activated at many points in the generation of antitumor immune responses, including stimulation of populations of innate and adaptive cytotoxic lymphocytes, downregulation of suppressor-type cells, effects on tumor cells by inhibiting proliferation and modulating apoptosis, differentiation, migration, and antigen expression on the cell surface (Parker et al., 2016). Importantly, some of these actions may represent a potential strategy for using type I IFN to overcome cancer resistance to immunotherapy. One of the mechanisms of recurrence in cancer patients is the inability of T cells to recognize due to suppression of the expression of class I MHC molecules and peptide transporter genes for tumor antigen presentation (Sharma et al., 2017). Type I IFN can be used to induce class I MHC expression, such as LMP2/7 and TAPA-1/2 expression in tumor cells, which together is an ideal combination therapy strategy to combat immunotherapy resistance (Khanna, 1998). In addition, type I IFN can be used to suppress Tregs and MDSCs by downregulating Tregs proliferation (Pace et al., 2010 and Srivastava et al., 2014) and reducing MDSC accumulation and downregulation (Zoglmeier et al., 2011) , both of which directly suppress the activity of cytotoxic T-lymphocytes (Schmidt et al., 2012 and Gabrilovich et al., 2009). These multiple antitumor effects have generated interest in type I IFNs as anticancer drugs, either alone or in combination with other therapies.

Тем не менее, одним из самых больших препятствий для использования IFN I типа в клинике являются серьезные побочные эффекты, связанные с таким лечением. Наиболее часто встречающимися побочными эффектами являются гриппоподобные симптомы, гематологическая токсичность, повышение уровня трансаминаз, тошнота, усталость и психические последствия. Эти побочные эффекты препятствуют достижению доз, необходимых для получения максимального терапевтического эффекта, и их поддержания, поскольку появление этих побочных эффектов может полностью обесценить клиническую пользу от лечения IFN I типа (Kreutzer et al., 2004, Sleijfer et al., 2005 и Lotrich, 2009). Следовательно, возможность обеспечения специфической доставки IFN I типа в микроокружение опухоли является необходимым условием для продолжительного клинического применения IFN I типа. Необходимы стратегии модификации IFN I типа для получения новых форм лекарственного средства, активность которых проявлялась бы только внутри опухоли, а также для предотвращения серьезных побочных эффектов за пределами опухоли.However, one of the biggest obstacles to the use of type I IFN in the clinic is the serious side effects associated with such treatment. The most commonly reported side effects are flu-like symptoms, haematological toxicity, elevated transaminase levels, nausea, fatigue, and psychiatric effects. These side effects prevent achievement and maintenance of doses required to obtain maximum therapeutic effect, since the occurrence of these side effects can completely invalidate the clinical benefit of type I IFN treatment (Kreutzer et al., 2004, Sleijfer et al., 2005 and Lotrich, 2009). Therefore, the ability to provide specific delivery of type I IFN to the tumor microenvironment is a necessary condition for long-term clinical use of type I IFN. Strategies for modifying type I IFN are needed to provide new forms of the drug that are only active within the tumor and to prevent serious side effects outside the tumor.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION

Таким образом, настоящее изобретение относится к пролекарству интерферона, содержащему (а) домен рецепторов интерферонов альфа и бета (IFNAR), который сохраняет IFN-связывающую активность; (b) домен интерферона (IFN) 1 типа, который сохраняет активность интерферона 1 типа, когда не связан с указанным доменом IFNAR; (c) Fc-домен иммуноглобулина (Ig), (d) первый линкер, слитый на одном конце с N-концом указанного IFN и слитый на другом конце с указанным IFNAR, причем указанный первый линкер является расщепляемым протеазой; и (e) второй линкер, слитый на одном конце с C-концом указанного IFN и слитый на другом конце с N-концом указанного Fc-домена Ig. Ig может представлять собой IgG, такой как IgG1 или IgG2. Пролекарство интерферона может содержать две копии указанного домена IFN 1 типа. Пролекарство интерферона может содержать более двух копий указанного домена IFN 1 типа. Первый линкер может быть расщепляемым одной или более матриксными металлопротеиназами, такими как MMP1, MMP3, MMP9, MMP10, MMP11, MMP12, MMP13 или MMP14. Первый линкер может быть расщепляемым UPA, FAPa и/или катепсином B. Линкер может представлять собой G4S-SUB1-G4S-SUB2-G4S-SUB3-G4S, где SUB1-3 представляют собой разные сайты расщепления ферментами. IFNAR может представлять собой IFNAR1 или IFNAR2. IFN может представлять собой IFN-α, IFN-β, IFN-κ, IFN-δ, IFN-ε, IFN-τ, IFN-ω или IFN-ζ.Thus, the present invention provides an interferon prodrug comprising (a) an interferon alpha and beta receptor (IFNAR) domain that retains IFN-binding activity; (b) a type 1 interferon (IFN) domain that retains type 1 interferon activity when not associated with said IFNAR domain; (c) an immunoglobulin (Ig) Fc domain, (d) a first linker fused at one end to the N-terminus of said IFN and fused at the other end to said IFNAR, said first linker being cleavable by a protease; and (e) a second linker fused at one end to the C-terminus of said IFN and fused at the other end to the N-terminus of said Ig Fc domain. The Ig may be an IgG such as IgG1 or IgG2. An interferon prodrug may contain two copies of said type 1 IFN domain. An interferon prodrug may contain more than two copies of the specified type 1 IFN domain. The first linker may be cleavable by one or more matrix metalloproteinases such as MMP1, MMP3, MMP9, MMP10, MMP11, MMP12, MMP13 or MMP14. The first linker may be cleavable by UPA, FAPa and/or cathepsin B. The linker may be G4S-SUB1-G4S-SUB2-G4S-SUB3-G4S, where SUB1-3 are different enzyme cleavage sites. IFNAR may be IFNAR1 or IFNAR2. The IFN may be IFN-α, IFN-β, IFN-κ, IFN-δ, IFN-ε, IFN-τ, IFN-ω or IFN-ζ.

В другом варианте осуществления изобретение относится к конструкции нуклеиновой кислоты, кодирующей пролекарство интерферона, содержащей (а) домен рецепторов интерферонов альфа и бета (IFNAR), который сохраняет IFN-связывающую активность; (b) домен интерферона 1 типа (IFN), который сохраняет активность интерферона 1 типа, когда не связан с указанным доменом IFNAR; (c) Fc-домен иммуноглобулина (Ig), (d) первый линкер, слитый на одном конце с N-концом указанного IFN и слитый на другом конце с указанным IFNAR, причем указанный первый линкер является расщепляемым протеазой; (e) второй линкер, слитый на одном конце с C-концом указанного IFN и слитый на другом конце с N-концом указанного Fc-домена Ig; и (f) промотор, расположенный 5’-концом к 5'-концу указанного домена IFNα. Ig может представлять собой IgG, такой как IgG1 или IgG2. Пролекарство интерферона содержит две копии указанного домена IFN 1 типа. Пролекарство интерферона может содержать более двух копий указанного домена IFN 1 типа. Первый линкер может быть расщепляемым матриксной металлопротеиназой, такой как MMP1, MMP3, MMP9, MMP10, MMP11, MMP12, MMP13 и/или MMP14. Первый линкер может быть расщепляемым UPA, FAPa и/или катепсином B. Линкер может представлять собой G4S-SUB1-G4S-SUB2-G4S-SUB3-G4S, где SUB1-3 представляют собой разные сайты расщепления ферментами. IFNAR может представлять собой IFNAR1 или IFNAR2. IFN может представлять собой IFN-α, IFN-β, IFN-κ, IFN-δ, IFN-ε, IFN-τ, IFN-ω или IFN-ζ.In another embodiment, the invention relates to a nucleic acid construct encoding an interferon prodrug comprising (a) an interferon alpha and beta receptor (IFNAR) domain that retains IFN-binding activity; (b) a type 1 interferon (IFN) domain that retains type 1 interferon activity when not associated with said IFNAR domain; (c) an immunoglobulin (Ig) Fc domain, (d) a first linker fused at one end to the N-terminus of said IFN and fused at the other end to said IFNAR, said first linker being cleavable by a protease; (e) a second linker fused at one end to the C-terminus of said IFN and fused at the other end to the N-terminus of said Ig Fc domain; and (f) a promoter located 5' to the 5' end of said IFNα domain. The Ig may be an IgG such as IgG1 or IgG2. The interferon prodrug contains two copies of the specified type 1 IFN domain. An interferon prodrug may contain more than two copies of the specified type 1 IFN domain. The first linker may be cleavable with a matrix metalloproteinase such as MMP1, MMP3, MMP9, MMP10, MMP11, MMP12, MMP13 and/or MMP14. The first linker may be cleavable by UPA, FAPa and/or cathepsin B. The linker may be G4S-SUB1-G4S-SUB2-G4S-SUB3-G4S, where SUB1-3 are different enzyme cleavage sites. IFNAR may be IFNAR1 or IFNAR2. The IFN may be IFN-α, IFN-β, IFN-κ, IFN-δ, IFN-ε, IFN-τ, IFN-ω or IFN-ζ.

Изобретение также относится к рекомбинантной клетке, экспрессирующей определенное выше пролекарство интерферона; рекомбинантной клетке, содержащей определенную выше конструкцию нуклеиновой кислоты; способу экспрессии пролекарства интерферона, включающему культивирование определенной выше клетки; способу экспрессии пролекарства интерферона, включающему культивирование определенной выше клетки; и применению определенного выше пролекарства интерферона (а) в получении лекарственного средства для лечения рака; или (b) для лечения рака.The invention also relates to a recombinant cell expressing an interferon prodrug as defined above; a recombinant cell containing the nucleic acid construct as defined above; a method for expressing an interferon prodrug, comprising culturing a cell as defined above; a method for expressing an interferon prodrug, comprising culturing a cell as defined above; and the use of the above-defined interferon prodrug (a) in the preparation of a medicament for the treatment of cancer; or (b) for the treatment of cancer.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу лечения рака, включающему введение пациенту определенного выше пролекарства интерферона. Способ может дополнительно включать этап оценки экспрессии протеазы в раковой клетке, полученной от указанного пациента. Раковая клетка может быть получена из биопсии или может быть циркулирующей опухолевой клеткой. Рак может представлять собой рак легких, рак молочной железы, рак головного мозга, рак ротовой полости, рак пищевода, рак головы и шеи, рак кожи, рак желудка, рак печени, рак поджелудочной железы, рак почки, рак яичников, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак толстой кишки, рак яичка, рак матки, рак шейки матки, лимфому или лейкоз. Рак может быть первичным, рецидивирующим, метастатическим или устойчивым ко многим лекарственным веществам. Пациент мог ранее пройти хирургическое лечение, химиотерапию, лучевую терапию, гормональную терапию или иммунотерапию.In another embodiment, the invention relates to a method of treating cancer comprising administering to a patient an interferon prodrug as defined above. The method may further include the step of assessing protease expression in a cancer cell obtained from said patient. The cancer cell may be obtained from a biopsy or may be a circulating tumor cell. The cancer may be lung cancer, breast cancer, brain cancer, oral cavity cancer, esophageal cancer, head and neck cancer, skin cancer, gastric cancer, liver cancer, pancreatic cancer, kidney cancer, ovarian cancer, prostate cancer, bladder cancer, colon cancer, testicular cancer, uterine cancer, cervical cancer, lymphoma, or leukemia. Cancer can be primary, recurrent, metastatic or multidrug resistant. The patient may have previously undergone surgery, chemotherapy, radiation therapy, hormonal therapy, or immunotherapy.

Способ может дополнительно включать получение указанным пациентом второй терапии рака, такой как хирургическая терапия, химиотерапия, лучевая терапия, гормональная терапия или иммунотерапия. Пациент может представлять собой человека или млекопитающее, не являющееся человеком. Способ может дополнительно включать введение указанного пролекарства интерферона более одного раза, например ежедневно, через день, еженедельно, через неделю или ежемесячно. Пролекарство можно вводить системно или внутрь опухоли, локально в опухоль или регионарно по отношению к опухоли. Лечение может включать одно или более из: замедления роста опухоли, остановки роста опухоли, уменьшения размера или объема опухоли, увеличения выживаемости по сравнению с пациентом, не принимавшим лечение, индукции ремиссии рака, индукции апоптоза опухолевых клеток или индукции некроза опухоли.The method may further include receiving said patient a second cancer therapy, such as surgery, chemotherapy, radiation therapy, hormonal therapy, or immunotherapy. The patient may be a human or a non-human mammal. The method may further include administering said interferon prodrug more than once, for example daily, every other day, weekly, every other week, or monthly. The prodrug can be administered systemically or intratumorally, locally to the tumor, or regionally to the tumor. Treatment may include one or more of: slowing tumor growth, arresting tumor growth, reducing tumor size or volume, increasing survival compared to an untreated patient, inducing cancer remission, inducing tumor cell apoptosis, or inducing tumor necrosis.

Предполагается, что любой способ или композиция, описанные в настоящей заявке, могут быть реализованы по отношению к любому другому способу или композиции, описанной в настоящей заявке.It is assumed that any method or composition described in this application can be implemented in relation to any other method or composition described in this application.

Использование единственного числа в сочетании с термином «содержащий» в формуле изобретения и/или описании может означать «один», но также подразумевает «один или более», «по меньшей мере один» и «один или более одного». Слово «примерно» означает плюс или минус 5% от указанного числа.The use of the singular in conjunction with the term "comprising" in the claims and/or description may mean "one", but also includes "one or more", "at least one", and "one or more than one". The word "about" means plus or minus 5% of the specified number.

Другие объекты изобретения, признаки и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из приведенного ниже подробного описания. Однако следует понимать, что подробное описание и конкретные примеры, хотя и указывают на конкретные варианты осуществления изобретения, приведены исключительно в качестве иллюстрации, поскольку из подробного описания специалистам в данной области техники будут очевидны различные изменения и модификации, находящиеся в пределах сущности и объема изобретения.Other objects of the invention, features and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description. However, it should be understood that the detailed description and specific examples, while pointing to specific embodiments of the invention, are provided by way of illustration only, since various changes and modifications will be apparent from the detailed description to those skilled in the art and are within the spirit and scope of the invention.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

Приведенные ниже чертежи являются частью настоящего описания и включены с целью дополнительной демонстрации некоторых аспектов настоящего раскрытия. Настоящее изобретение может быть лучше понято со ссылкой на один или более из этих чертежей в сочетании с подробным описанием конкретных вариантов осуществления, представленных в настоящем описании.The following drawings are part of the present description and are included to further demonstrate certain aspects of the present disclosure. The present invention may be better understood with reference to one or more of these drawings in conjunction with a detailed description of the specific embodiments provided herein.

Фиг. 1. Схематическая структура IFN-пролекарства. IFNAR-ECD (синий), линкер, являющийся субстратом (красный), IFN (желтый), опухолеспецифический фермент (зеленый), Fc IgG (серый). Левое N-концевое плечо представляет собой интактную форму IFN-пролекарства, слитую с IFNAR-ECD и связанную с IFN, тогда как правое N-концевое плечо представляет собой активированную форму IFN-пролекарства, от которого отщеплен IFNAR-ECD. Fig. 1. Schematic structure of an IFN prodrug. IFNAR-ECD (blue), substrate linker (red), IFN (yellow), tumor specific enzyme (green), IgG Fc (grey). The left N-terminal arm is the intact form of the IFN prodrug fused to IFNAR-ECD and coupled to IFN, while the right N-terminal arm is the activated form of the IFN prodrug from which IFNAR-ECD has been cleaved.

Фиг. 2А-С. Активированная форма IFN-пролекарства демонстрирует более высокую активность IFN, чем восстановленная. (Фиг.2А) Выполняли 5-кратное серийное разведение 20 нМ hIg, IFNa4-Fc, IFN-пролекарства на основе IFNAR1 и IFN-пролекарства на основе IFNAR2. (Фиг. 2B-C) IFN-пролекарство разбавляли до 1 мкМ в буфере для анализа (50 мМ Трис, 10 мМ CaCl₂, 150 мМ NaCl, 0,05% Brij-35 (мас./об.), pH 7,5 (TCNB)). Добавляли rmMMP-9 до конечной концентрации 1 нг/мкл и инкубировали при 37°C в течение 6 часов. (Фиг.2B) Выполняли 5-кратное серийное разведение 20 нМ IFNa4-Fc, R1-NSUB без или с обработкой rmMMP-9 и R1-SUB (субстрат MMP-2/9) без или с обработкой rmMMP-9. (Фиг.2C) Выполняли 5-кратное серийное разведение 20 нМ IFNa4-Fc, R2-NSUB (субстрат MMP-2/9) без или с обработкой rmMMP-9 и R2-SUB без или с обработкой rmMMP-9. Разведенные растворы слитых белков добавляли в репортерные клетки RAW-Lucia-ISG для стимуляции секреции люциферазы. Кондиционированные супернатанты собирали через 24 ч после стимуляции для анализа активности люциферазы. Планки погрешности представляют средние значения ± стандартная ошибка среднего (SEM) для трех повторов. Fig. 2A-C. The activated form of the IFN prodrug exhibits higher IFN activity than the reduced form. (FIG. 2A) A 5-fold serial dilution of 20 nM hIg, IFNa4-Fc, IFNAR1 based IFN prodrug and IFNAR2 based IFN prodrug was performed. (FIG. 2B-C) IFN prodrug was diluted to 1 μM in assay buffer (50 mM Tris, 10 mM CaCl ₂ , 150 mM NaCl, 0.05% Brij-35 (w/v), pH 7, 5 (TCNB)). Added rmMMP-9 to a final concentration of 1 ng/μl and incubated at 37°C for 6 hours. (FIG. 2B) A 5-fold serial dilution of 20 nM IFNa4-Fc, R1-NSUB with or without rmMMP-9 treatment and R1-SUB (MMP-2/9 substrate) with or without rmMMP-9 treatment was performed. (FIG. 2C) A 5-fold serial dilution of 20 nM IFNa4-Fc, R2-NSUB (MMP-2/9 substrate) was performed with or without rmMMP-9 treatment and R2-SUB with or without rmMMP-9 treatment. Diluted fusion protein solutions were added to RAW-Lucia-ISG reporter cells to stimulate luciferase secretion. Conditioned supernatants were collected 24 h after stimulation for analysis of luciferase activity. Error bars represent means ± standard error of the mean (SEM) for three repetitions.

Фиг. 3. IFN-пролекарство на основе IFNAR2 имеет более сильный противоопухолевый эффект по сравнению с IFN-пролекарством на основе IFNAR1. Мышам C57BL/6 (n=5 на группу) инъецировали подкожно 5×10⁵ клеток B16 и вводили внутрибрюшинно 1 нмоль hIg, IFNa4-Fc, R1-SUB (субстрат MMP2/9) или R2-SUB (субстрат MMP2/9) в дни 11, 15 и 21. Рост опухоли отслеживали два раза в неделю и регистрировали в виде среднего размера опухоли ± стандартная ошибка среднего в зависимости от времени. Fig. 3. The IFNAR2-based IFN prodrug has a stronger antitumor effect compared to the IFNAR1-based IFN prodrug . C57BL/6 mice (n=5 per group) were injected subcutaneously with 5×10 ⁵ B16 cells and injected ip with 1 nmol hIg, IFNa4-Fc, R1-SUB (MMP2/9 substrate) or R2-SUB (MMP2/9 substrate) per days 11, 15 and 21. Tumor growth was monitored twice a week and reported as mean tumor size ± standard error of the mean versus time.

Фиг. 4A-D. Экспрессия ферментов в мышиной нормальной и опухолевой тканях. Мышам C57BL/6 (n=4) инъецировали подкожно 1×10⁶ клеток МС38 или 5×10⁵ клеток В16. Указанные нормальные ткани и опухоли собирали в день 11. Внутриклеточную РНК экстрагировали для анализа методом ОТ-кПЦР (RT-qPCR) для определения количества копий мРНК (фиг. 4A) uPA, (фиг. 4B) MMP-2, (фиг. 4C) MMP-9 и (фиг. 4D) ММР-14. Результаты представлены в процентах относительно 18sr. Планки погрешности представляют средние значения ± стандартная ошибка среднего для трех повторов. Fig. 4A-D. Expression of enzymes in mouse normal and tumor tissues. C57BL/6 mice (n=4) were injected subcutaneously with 1×10 ⁶ MC38 cells or 5×10 ⁵ B16 cells. These normal tissues and tumors were harvested on day 11. Intracellular RNA was extracted for analysis by RT-qPCR (RT-qPCR) to determine the number of mRNA copies (Fig. 4A) uPA, (Fig. 4B) MMP-2, (Fig. 4C) MMP-9 and (Fig. 4D) MMP-14. The results are presented as a percentage relative to 18sr. Error bars represent means ± standard error of the mean for triplicates.

Фиг. 5A-E. IFN-пролекарство повышает безопасность без ущерба эффективности. Мышам C57BL/6 (n=3 на группу) инъецировали подкожно 5×10⁵ клеток B16 и вводили внутрибрюшинно 1 мМ hIg, IFNa4-Fc или R2-SUB (субстрат ММР-14) в дни 10, 13 и 16. У мышей брали кровь и собирали сыворотку в день 17 (фиг. 5А). Концентрацию воспалительных цитокинов IL-6, TNF, MCP-1 и IFN-g в сыворотке крови у мышей с воспалением измеряли с помощью цитометрической матрицы гранул (CBA). (Фиг. 5В) Активность ALT в сыворотке измеряли с помощью системы Reflotron Plus®. (Фиг. 5C) Рост опухоли и (фиг. 5D) массу тела регистрировали два раза в неделю. (Фиг. 5Е) Строили кривую выживания, обусловленную токсичностью. Мыши с потерей массы тела более 30% считались мертвыми. Планки погрешности представляют средние значения ± стандартная ошибка среднего. Fig. 5A-E. The IFN prodrug improves safety without sacrificing efficacy. C57BL/6 mice (n=3 per group) were injected subcutaneously with 5×10 ⁵ B16 cells and injected intraperitoneally with 1 mM hIg, IFNa4-Fc or R2-SUB (MMP-14 substrate) on days 10, 13 and 16. Mice were taken blood and serum was collected on day 17 (FIG. 5A). Serum concentrations of the inflammatory cytokines IL-6, TNF, MCP-1, and IFN-g in inflammatory mice were measured using a bead cytometric array (CBA). (FIG. 5B) Serum ALT activity was measured using the Reflotron Plus® system. (FIG. 5C) Tumor growth and (FIG. 5D) body weight were recorded twice a week. (FIG. 5E) Built a survival curve due to toxicity. Mice with more than 30% body weight loss were considered dead. Error bars represent means ± standard error of the mean.

Фиг. 6A-Н. Уровень экспрессии человеческих протеаз между опухолью и соседними нормальными тканями. Модуль DiffExp TIMER (Tumor IMmune Esribution Resource Resource) на веб-сайте для онлайн анализа сравнения уровней экспрессии генов для всех образцов из TCGA (Атлас генома рака). (Фиг. 6A) MMP-1, (фиг. 6B) MMP-3, (фиг. 6C) MMP-9, (фиг. 6D) MMP-10, (фиг. 6E) MMP-11, (фиг. 6F) MMP-12, (фиг. 6G) MMP-13 и (фиг. 6H) MMP-14. Fig. 6A-H. The level of expression of human proteases between the tumor and adjacent normal tissues. DiffExp TIMER module (Tumor IMmune Esribution Resource Resource) website for online analysis comparing gene expression levels for all samples from TCGA (Cancer Genome Atlas). (Fig. 6A) MMP-1, (Fig. 6B) MMP-3, (Fig. 6C) MMP-9, (Fig. 6D) MMP-10, (Fig. 6E) MMP-11, (Fig. 6F) MMP-12, (Fig. 6G) MMP-13 and (Fig. 6H) MMP-14.

Фиг. 7А-С. Активация человеческого ProIFN in vitro . (Фиг.7A) Выполняли 10-кратное серийное разведение 50 мкМ hIFNa2-Fc, ProIFN на основе hIFNAR1 и ProIFN на основе hIFNAR2. Активность IFN измеряли с помощью репортерных клеток 293T-Dual^ТМ hSTING-R232. (Фиг. 7В) Человеческий ProIFN на основе hIFNAR2 с субстратом (hProIFN-Sub) или без него (hProIFN-Nsub) разбавляли до 1 мкМ в буфере для анализа (50 мМ Трис, 10 мМ CaCl₂, 150 мМ NaCl, 0,05% Brij-35 (мас./об.), рН 7,5 (TCNB)). Добавляли rmMMP-9 до конечной концентрации 1 нг/мкл и инкубировали при 37°C в течение 6 часов. Активность IFN измеряли с помощью репортерных клеток 293T-Dual^ТМ hSTING-R232. (Фиг.7C) Человеческий hProIFN-Sub на основе hIFNAR2 или hProIFN-Nsub разбавляли до 1 мкМ в буфере для анализа (50 мМ Трис, 10 мМ CaCl₂, 150 мМ NaCl, 0,05% Brij-35 (мас./об.), pH 7,5 (TCNB)). Добавляли rmMMP-9 до конечной концентрации 1 нг/мкл и инкубировали при 37°С в течение 0, 0,5, 2 или 6 часов. Расщепленные образцы разделяли на геле Stain Free^ТМ. Гель визуализировали с помощью устройства для визуализации без красителя. Планки погрешности представляют средние значения ± стандартная ошибка среднего для трех повторов. Fig. 7A-C. Activation of human ProIFN in vitro . (Fig.7A) Performed a 10-fold serial dilution of 50 μm hIFNa2-Fc, ProIFN-based hIFNAR1 and ProIFN-based hIFNAR2. IFN activity was measured using reporter cells 293T-Dual ^TM hSTING-R232. (FIG. 7B) hIFNAR2-based human ProIFN with or without substrate (hProIFN-Sub) was diluted to 1 μM in assay buffer (50 mM Tris, 10 mM CaCl ₂ , 150 mM NaCl, 0.05 % Brij-35 (w/v), pH 7.5 (TCNB)). Added rmMMP-9 to a final concentration of 1 ng/μl and incubated at 37°C for 6 hours. IFN activity was measured using reporter cells 293T-Dual ^TM hSTING-R232. (FIG. 7C) Human hProIFN-Sub based on hIFNAR2 or hProIFN-Nsub was diluted to 1 μM in assay buffer (50 mM Tris, 10 mM CaCl ₂ , 150 mM NaCl, 0.05% Brij-35 (w/v .), pH 7.5 (TCNB)). Added rmMMP-9 to a final concentration of 1 ng/μl and incubated at 37°C for 0, 0.5, 2 or 6 hours. Cleaved samples were separated on a Stain ^FreeTM gel. The gel was visualized with a dye-free imaging device. Error bars represent means ± standard error of the mean for triplicates.

ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯDESCRIPTION OF ILLUSTRATIVE EMBODIMENTS

Пролекарства представляют собой фармакологически неактивные химические производные лекарственных веществ, которые должны пройти трансформацию в организме для перехода в активное состояние. Они предназначены для преодоления фармацевтических и/или фармакокинетических проблем, связанных с исходным лекарственным веществом, которые в противном случае ограничивали бы клиническую применимость этого лекарственного вещества (Stella et al., 1985). Недавно было сконструировано активируемое протеазой антитело (про-антитело), нацеленное на молекулу адгезии сосудистого эндотелия 1 типа (VCAM-1), маркер атеросклеротических бляшек, путем присоединения к антителу пептида, маскирующего связывающий участок, через линкер, восприимчивый к матричной металлопротеазе (ММР). Активность таких ассоциированных с заболеванием протеаз можно использовать для сайт-специфического нацеливания активности антител in vivo (Erster et al., 2012). В одном из примеров терапии рака идентифицированный с помощью скрининга пептид, который может блокировать связывание анти-EGFR с EGFR мишенью, связывали с анти-EGFR антителом. Полученное про-антитело, направленное на рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), имело заметно улучшенную безопасность и увеличенный период полураспада у приматов, не являющихся человеком, что обеспечивало безопасное введение гораздо более высоких доз этого вещества по сравнению с цетуксимабом (Desnoyers et al., 2013). Однако такие пептиды часто имеют слабое сродство, что приводит к неполной блокаде лекарственного белка, а также к высокой иммуногенности, которая препятствует проведению более длительного лечения. Поэтому авторы изобретения разработали новую стратегию, основанную на природном рецепторе с надлежащим сродством, без иммуногенности у хозяина, которая позволяет подавлять связывание лекарственного вещества со своим рецептором в неопухолевых тканях. В частности, упор сделан на интерферонах I типа в связи с их важной ролью в противоопухолевом иммунном ответе на многие виды рака⁸.Prodrugs are pharmacologically inactive chemical derivatives of drugs that must undergo transformation in the body to become active. They are intended to overcome pharmaceutical and/or pharmacokinetic problems associated with the parent drug that would otherwise limit the clinical utility of that drug (Stella et al., 1985). A protease-activated antibody (pro-antibody) targeting the vascular endothelial adhesion molecule type 1 (VCAM-1), a marker of atherosclerotic plaques, was recently constructed by attaching a binding site masking peptide to the antibody via a matrix metalloprotease (MMP) receptive linker. . The activity of such disease-associated proteases can be used to site-specifically target antibody activity in vivo (Erster et al., 2012). In one example of cancer therapy, a screening-identified peptide that can block anti-EGFR binding to an EGFR target is coupled to an anti-EGFR antibody. The resulting pro-antibody directed to the epidermal growth factor receptor (EGFR) had a markedly improved safety and extended half-life in non-human primates, allowing safe administration of much higher doses of this substance compared to cetuximab (Desnoyers et al., 2013). However, such peptides often have low affinity, resulting in incomplete blockade of the drug protein, as well as high immunogenicity, which precludes longer-term treatment. Therefore, the inventors have developed a novel strategy based on a naturally occurring receptor with the correct affinity, without host immunogenicity, which allows suppression of drug binding to its receptor in non-tumor tissues. In particular, emphasis has been placed on type I interferons due to their important role in the antitumor immune response to many types of cancer ⁸ .

Авторами изобретения сконструировано IFN-пролекарство с использованием константных областей иммуноглобулина (IgG) и внеклеточных доменов IFNAR (IFNAR1 или IFNAR2) в качестве блокатора активности IFN, слитых на N-конце с IFN. IFNAR связан со специфическим линкером, который селективно расщепляется протеазой, сверхэкспрессируемой в микроокружении опухоли. Это позволяет маскировать токсическую активность домена IFN до тех пор, пока пролекарство не достигнет опухоли, в то время как фрагмент Fc, слитый с C-терминальным концом IFN, улучшает его период полувыведения in vivo. Такое IFN-пролекарство обладает сильно уменьшенной активностью IFN до момента отщепления линкера, при этом указанная активность восстанавливается после ферментативного расщепления. Авторы изобретения также продемонстрировали эффективность и повышенную безопасность IFN-пролекарства in vivo на мышиной модели меланомы B16-OVA.We have constructed an IFN prodrug using immunoglobulin constant regions (IgG) and IFNAR extracellular domains (IFNAR1 or IFNAR2) as an IFN activity blocker fused at the N-terminus to IFN. IFNAR is associated with a specific linker that is selectively cleaved by a protease overexpressed in the tumor microenvironment. This allows the toxic activity of the IFN domain to be masked until the prodrug reaches the tumor, while the Fc fragment fused to the C-terminal end of IFN improves its in vivo half-life. Such an IFN prodrug has a greatly reduced IFN activity until the linker is cleaved, with said activity being restored after enzymatic cleavage. The inventors have also demonstrated the efficacy and improved safety of the IFN prodrug in vivo in a mouse model of B16-OVA melanoma.

Таким образом, преимуществом применения этого IFN-пролекарства в качестве противоракового терапевтического средства является: 1) низкая токсичность; 2) неожиданно более высокая активность IFN в активированной форме по сравнению с исходным IFN-Fc; 3) простота получения и очистки с высоким выходом; 4) специфическое нацеливание на опухолевые ткани; 5) использование неиммуногенного блокирующего реагента; и 6) персонализированный дизайн IFN-пролекарства в зависимости от уровня экспрессии опухолевого фермента, который может различаться. Таким образом, такое IFN-пролекарство может улучшить профиль безопасности интерферонов без ущерба для их эффективности и, таким образом, может обеспечить более широкое применение современных форматов интерфероновой терапии, таких как биспецифические слитые белки антитело-цитокин. Эти и другие аспекты изобретения более подробно описаны ниже.Thus, the advantage of using this IFN prodrug as an anti-cancer therapeutic agent is: 1) low toxicity; 2) unexpectedly higher activity of IFN in activated form compared to the original IFN-Fc; 3) easy to obtain and clean with high yield; 4) specific targeting of tumor tissues; 5) use of a non-immunogenic blocking reagent; and 6) personalized design of the IFN prodrug depending on the expression level of the tumor enzyme, which may vary. Thus, such an IFN prodrug may improve the safety profile of interferons without compromising their efficacy, and thus may enable wider use of modern interferon therapy formats such as bispecific antibody-cytokine fusion proteins. These and other aspects of the invention are described in more detail below.

I. Интерфероны типа 1I. Type 1 interferons

А. Типы интерферонаA. Types of interferon

Интерфероны I типа (IFN) человека представляют собой большую подгруппу белков, интерферонов, которые помогают регулировать активность иммунной системы. Интерфероны связываются с рецепторами интерферонов. Все IFN I типа связываются со специфическим рецепторным комплексом на клеточной поверхности, известным как рецептор IFN-α (IFNAR), который состоит из цепей IFNAR1 и IFNAR2. IFN I типа обнаружены у всех млекопитающих, и гомологичные (сходные) молекулы обнаружены у видов птиц, рептилий, земноводных и рыб. Типы у млекопитающих обозначены как: IFN-α (альфа), IFN-β (бета), IFN-κ (каппа), IFN-δ (дельта), IFN-ε (эпсилон), IFN-τ (тау), IFN-ω (омега) и IFN-ζ (дзета, также известный как лимитин).Human type I interferons (IFNs) are a large subgroup of proteins, the interferons, that help regulate the activity of the immune system. Interferons bind to interferon receptors. All type I IFNs bind to a specific cell surface receptor complex known as the IFN-α receptor (IFNAR), which consists of the IFNAR1 and IFNAR2 chains. Type I IFNs are found in all mammals, and homologous (similar) molecules are found in bird, reptile, amphibian and fish species. Types in mammals are designated as: IFN-α (alpha), IFN-β (beta), IFN-κ (kappa), IFN-δ (delta), IFN-ε (epsilon), IFN-τ (tau), IFN- ω (omega) and IFN-ζ (zeta, also known as limitin).

Белки IFN-α продуцируются лейкоцитами. Они в основном участвуют во врожденном иммунном ответе против вирусной инфекции. Гены, ответственные за их синтез, входят в 13 подтипов, которые известны как IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNA10, IFNA13, IFNA14, IFNA16, IFNA17, IFNA21. Эти гены находятся вместе в виде кластера на хромосоме 9.IFN-α proteins are produced by leukocytes. They are mainly involved in the innate immune response against viral infection. The genes responsible for their synthesis are included in 13 subtypes, which are known as IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNA10, IFNA13, IFNA14, IFNA16, IFNA17, IFNA21. These genes are clustered together on chromosome 9.

IFN-α также получают синтетически в качестве лекарственного средства для лечения волосатоклеточного лейкоза. Международное непатентованное наименование (МНН, INN) продукта - интерферон альфа. Рекомбинантный тип - интерферон альфакон-1. Пегилированные типы представляют собой пегилированный интерферон альфа-2а и пегилированный интерферон альфа-2b.IFN-α is also produced synthetically as a drug for the treatment of hairy cell leukemia. The international non-proprietary name (INN, INN) of the product is interferon alfa. Recombinant type - interferon alfacon-1. The pegylated types are pegylated interferon alfa-2a and pegylated interferon alfa-2b.

Белки IFN-β продуцируются в больших количествах фибробластами. Они обладают противовирусной активностью, которая задействована в основном во врожденном иммунном ответе. Описаны два типа IFN-β: IFN-β (IFNB1) и IFN-β3 (IFNB3) (ген, обозначенный IFN-β2, фактически является IL-6). IFN-β1 используется для лечения рассеянного склероза, поскольку он снижает частоту рецидивов. IFN-β1 не подходит для лечения пациентов с прогрессирующими нерецидивными формами рассеянного склероза.IFN-β proteins are produced in large quantities by fibroblasts. They have antiviral activity, which is mainly involved in the innate immune response. Two types of IFN-β have been described: IFN-β (IFNB1) and IFN-β3 (IFNB3) (the gene designated IFN-β2 is actually IL-6). IFN-β1 is used in the treatment of multiple sclerosis because it reduces the recurrence rate. IFN-β1 is not suitable for the treatment of patients with progressive non-relapsing forms of multiple sclerosis.

IFN-ε, -κ, -τ и -ζ у человека, по-видимому, составляют одну изоформу, IFNK. Только у жвачных животных кодируется IFN-τ, вариант IFN-ω. К настоящему времени IFN-ζ обнаружен только у мышей, в то время как структурный гомолог IFN-δ обнаружен у широкого круга плацентарных млекопитающих, не являющихся приматами и грызунами. У большинства, но не у всех плацентарных млекопитающих, происходит кодирование функциональных генов IFN-ε и IFN-κ.IFN-ε, -κ, -τ and -ζ in humans appear to be one isoform, IFNK. Only in ruminants, IFN-τ, a variant of IFN-ω, is encoded. To date, IFN-ζ has only been found in mice, while the structural homologue of IFN-δ has been found in a wide range of non-primate and non-rodent placental mammals. Most, but not all, placental mammals code for functional IFN-ε and IFN-κ genes.

IFN-ω, хотя и имеет только одну функциональную форму, описанную на сегодняшний день (IFNW1), у людей имеется несколько псевдогенов: IFNWP2, IFNWP4, IFNWP5, IFNWP9, IFNWP15, IFNWP18 и IFNWP19. У многих плацентарных млекопитающих, не являющихся приматами, экспрессируется множество подтипов IFN-ω.IFN-ω, although it has only one functional form described to date (IFNW1), there are several pseudogenes in humans: IFNWP2, IFNWP4, IFNWP5, IFNWP9, IFNWP15, IFNWP18, and IFNWP19. Many non-primate placental mammals express multiple subtypes of IFN-ω.

IFN-ν недавно был описан как псевдоген у человека, но потенциально является функциональным в геноме домашней кошки. Во всех других геномах некошачьих плацентарных млекопитающих IFN-ν является псевдогеном; у некоторых видов этот псевдоген хорошо сохранился, в то время как у других он подвергся сильной трансформации или является недетектируемым. Более того, в геноме кошки промотор IFN-ν несет вредные мутации. Вполне вероятно, что семейство генов IFN-ν стало бесполезным до появления разнообразных видов млекопитающих. Его присутствие на краю локуса IFN I типа у млекопитающих, возможно, защитило его от уничтожения, что и привело к возможности его обнаружения.IFN-ν has recently been described as a pseudogene in humans, but is potentially functional in the domestic cat genome. In all other non-feline placental mammal genomes, IFN-ν is a pseudogene; in some species this pseudogene is well preserved, while in others it has undergone strong transformation or is undetectable. Moreover, the IFN-ν promoter carries deleterious mutations in the cat genome. It is likely that the IFN-ν gene family became useless before the advent of diverse mammalian species. Its presence at the edge of the mammalian type I IFN locus may have protected it from destruction, leading to its discovery.

IFN-α и IFN-β секретируются многими типами клеток, включая лимфоциты (NK-клетки, B-клетки и T-клетки), макрофаги, фибробласты, эндотелиальные клетки, остеобласты и другие. Они обеспечивают стимуляцию как макрофагов, так и NK-клеток, которые вызывают противовирусный ответ, а также проявляют противоопухолевую активность. Плазмоцитоидные дендритные клетки были идентифицированы как наиболее мощные продуценты IFN I типа в ответ на действие антигена, и, таким образом, были названы природными клетками, продуцирующими IFN. Согласно результатам современных исследований предполагается, что путем усиления экспрессии IFN-α в инфильтрирующих опухоль макрофагах можно вызвать более эффективную активацию дендритных клеток и цитотоксичность иммунных эффекторных клеток.IFN-α and IFN-β are secreted by many cell types, including lymphocytes (NK cells, B cells, and T cells), macrophages, fibroblasts, endothelial cells, osteoblasts, and others. They provide stimulation of both macrophages and NK cells, which cause an antiviral response, and also exhibit antitumor activity. Plasmacytoid dendritic cells have been identified as the most potent type I IFN producers in response to antigen action and thus have been termed natural IFN producing cells. According to the results of current research, it is assumed that by increasing the expression of IFN-α in tumor-infiltrating macrophages, more efficient activation of dendritic cells and cytotoxicity of immune effector cells can be induced.

IFN-ω высвобождается лейкоцитами в месте появления вирусной инфекции или опухолей. IFN-α действует как пирогенный фактор, изменяя активность термочувствительных нейронов в гипоталамусе, вызывая тем самым жар. Это происходит через связывание с опиоидными рецепторами, вызывая высвобождение простагландина-E2 (PGE2). Подобный механизм используется IFN-α для уменьшения боли; IFN-α взаимодействует с μ-опиоидным рецептором, действуя как анальгетик.IFN-ω is released by leukocytes at the site of viral infection or tumors. IFN-α acts as a pyrogenic factor, altering the activity of thermosensitive neurons in the hypothalamus, thereby causing fever. This occurs through binding to opioid receptors, causing the release of prostaglandin-E2 (PGE2). A similar mechanism is used by IFN-α to reduce pain; IFN-α interacts with the μ-opioid receptor, acting as an analgesic.

У мышей IFN-β ингибирует выработку факторов роста в иммунных клетках, тем самым замедляя рост опухоли, и препятствует другим клеткам продуцировать факторы роста, активирующие формирование сосудов, тем самым блокируя ангиогенез опухоли и препятствуя соединению опухоли с системой кровеносных сосудов.In mice, IFN-β inhibits the production of growth factors in immune cells, thereby slowing down tumor growth, and prevents other cells from producing growth factors that activate vessel formation, thereby blocking tumor angiogenesis and preventing the connection of the tumor with the blood vessel system.

В. Рецепторы интерферонаB. Interferon receptors

Рецептор интерферона-α/β (IFNAR) представляет собой рецептор, который связывает интерфероны I типа, включая интерферон-α и -β. Это гетеромерный рецептор клеточной поверхности, состоящий из одной цепи с двумя субъединицами, называемыми IFNAR1 и IFNAR2. После связывания IFN I типа IFNAR активирует сигнальный путь JAK-STAT. Стимуляция интерферонов традиционно приводит к стимуляции противовирусного иммунного ответа.The interferon-α/β receptor (IFNAR) is a receptor that binds type I interferons, including interferon-α and -β. It is a heteromeric cell surface receptor consisting of a single chain with two subunits called IFNAR1 and IFNAR2. After IFN type I binding, IFNAR activates the JAK-STAT signaling pathway. Stimulation of interferons traditionally leads to stimulation of the antiviral immune response.

Его структура была получена с помощью ЯМР. Первоначально было вычислено 35 конформеров, количество которых с учетом критерия низкой энергии было уменьшено до 22. Это была первая спиральная структура цитокинового рецептора, определенная в растворе. Молекула имеет один полимер. Структура раскрывает природу связывания. Модель IFNAR2 позволила выявить преимущественно гидрофобный участок на рецепторе, который взаимодействует с соответствующей гидрофобной поверхностью на IFN-альфа. Смежный мотив заряженных боковых цепей направляет белки на формирование прочного комплекса. Связывающая поверхность позволяет объяснить перекрестную реактивность и специфичность лиганда рецептора. Источником для экспериментов, был человек, но экспрессию осуществляли в Escherichia coli.Its structure was obtained using NMR. Initially, 35 conformers were calculated, which were reduced to 22 according to the low energy criterion. This was the first helical structure of a cytokine receptor determined in solution. The molecule has one polymer. The structure reveals the nature of the binding. The IFNAR2 model revealed a predominantly hydrophobic site on the receptor that interacts with the corresponding hydrophobic surface on IFN-alpha. An adjacent motif of charged side chains directs proteins to form a strong complex. The binding surface helps explain the cross-reactivity and specificity of the receptor ligand. The source for the experiments was human, but the expression was carried out in Escherichia coli .

IFNAR относят к группе бета-белков, исходя из его вторичной структуры. Изгибы цепи IFNAR обнаруживают четкую эволюционную связь с бета-сэндвичем иммуноглобулина. С учетом структурных и функциональных сходств, которые свидетельствуют о вероятной общей эволюции, он включен в суперсемейство и семейство фибронектинов типа III. Домен, или эволюционная единица, наблюдаемая в природе, представляет собой бета-цепь рецептора интерферона-альфа/бета. Вид представлял собой человека.IFNAR is classified as a beta protein based on its secondary structure. The folds of the IFNAR chain show a clear evolutionary relationship to the immunoglobulin beta sandwich. Given the structural and functional similarities that suggest a likely common evolution, it is included in the superfamily and the type III fibronectin family. The domain, or evolutionary unit, seen in nature is the beta chain of the interferon-alpha/beta receptor. The species was a person.

II. Пролекарства интерферонаII. Interferon prodrugs

А. Общие сведенияA. General information

Пролекарства обычно определяют как молекулы, которые способны быть терапевтическими агентами, но находятся в форме, требующей некоторой модификации, чтобы стать действительно терапевтически значимыми. Такие реагенты особенно полезны, когда доставка активной лекарственной формы имеет некоторые присущие им ограничения, такие как токсичность или отсутствие стабильности, путем создания формы пролекарства, позволяющей избежать этих недостатков и обеспечить эффективную активацию in vivo в подходящее время и/или подходящем участке.Prodrugs are generally defined as molecules that are capable of being therapeutic agents but are in a form that requires some modification to be truly therapeutically useful. Such reagents are particularly useful when the delivery of the active dosage form has some of its inherent limitations, such as toxicity or lack of stability, by designing a prodrug form that avoids these disadvantages and provides effective in vivo activation at the appropriate time and/or site.

Пролекарства по настоящему изобретению имеют пять разных компонентов. Первым компонентом является интерферон. Вторым компонентом является маскирующий домен, который блокирует способность интерферона проявлять свою обычную активность пока находится в связанном состоянии. Третьим компонентом является стабилизирующий агент, например, константный домен антитела. Эти три компонента соединены линкерами, причем линкер, расположенный между интерфероном и маскирующим доменом, подвергается селективному расщеплению, например, протеазой, которая экспрессируется раковой клеткой или в окружении опухоли.The prodrugs of the present invention have five different components. The first component is interferon. The second component is the masking domain, which blocks the ability of interferon to exercise its normal activity while in the bound state. The third component is a stabilizing agent, such as the constant domain of an antibody. These three components are connected by linkers, and the linker located between the interferon and the masking domain is selectively cleaved, for example, by a protease that is expressed by the cancer cell or in the tumor environment.

Как обсуждалось выше, интерфероны 1 типа представляют собой IFN-α (альфа), IFN-β (бета), IFN-κ (каппа), IFN-δ (дельта), IFN-ε (эпсилон), IFN-τ (тау), IFN-ω (омега) и IFN-ζ (дзета). Любая из этих молекул может быть включена в конструкции, описанные в настоящей заявке. Также возможно получение гетеродимерных конструкций с двумя или даже четырьмя различными интерферонами 1 типа. Интерфероны, используемые в настоящей заявке, для получения раскрытых в настоящем описании данных представляют собой полноразмерные белки, но не содержащие сигнальные пептиды.As discussed above, type 1 interferons are IFN-α (alpha), IFN-β (beta), IFN-κ (kappa), IFN-δ (delta), IFN-ε (epsilon), IFN-τ (tau) , IFN-ω (omega) and IFN-ζ (zeta). Any of these molecules can be included in the designs described in this application. It is also possible to obtain heterodimeric constructs with two or even four different type 1 interferons. The interferons used in this application to obtain the data disclosed in the present description are full-length proteins, but do not contain signal peptides.

Важной частью конструкции, конечно же, является область маскирования. Для этой цели авторы изобретения использовали природные рецепторы для интерферонов 1 типа, а не неприродные последовательности. Преимущество использования маскирующего домена, основанного на структуре природных рецепторов, включает как (а) высокое сродство к интерферону 1 типа, так и (b) более низкую вероятность иммунного ответа против последовательностей. Последовательности:An important part of the design, of course, is the masking area. For this purpose, the inventors used natural receptors for type 1 interferons, and not non-natural sequences. The advantage of using a masking domain based on the structure of natural receptors includes both (a) a high affinity for type 1 interferon and (b) a lower likelihood of an immune response against the sequences. Sequences:

Мышиный IFNAR1-ECD:Mouse IFNAR1-ECD:

1 mlavvgaaal vlvagapwvl psaaggenlk ppenidvyii ddnytlkwss hgesmgsvtf1 mlavvgaaal vlvagapwvl psaaggenlk ppenidvyii ddnytlkwss hgesmgsvtf

61 saeyrtkdea kwlkvpecqh ttttkcefsl ldtnvyiktq frvraeegns tsswnevdpf61 saeyrtkdea kwlkvpecqh ttttkcefsl ldtnvyiktq frvraeegns tsswnevdpf

121 ipfytahmsp pevrleaedk ailvhisppg qdgnmwalek psfsytiriw qksssdkkti121 ipfytahmsp pevrleaedk ailvhisppg qdgnmwalek psfsytiriw qksssdkkti

181 nstyyvekip ellpettycl evkaihpslk khsnystvqc isttvankmp vpgnlqvdaq181 nstyyvekip ellpettycl evkaihpslk khsnystvqc isttvankmp vpgnlqvdaq

241 gksyvlkwdy iasadvlfra qwlpgyskss sgsrsdkwkp iptcanvqtt hcvfsqdtvy241 gksyvlkwdy iasadvlfra qwlpgyskss sgsrsdkwkp iptcanvqtt hcvfsqdtvy

301 tgtfflhvqa segnhtsfws eekfidsqkh ilppppvitv tamsdtllvy vncqdstcdg301 tgtfflhvqa segnhtsfws eekfidsqkh ilppppvitv tamsdtllvy vncqdstcdg

361 lnyeiifwen tsntkismek dgpeftlknl qpltvycvqa rvlfrallnk tsnfseklce361 lnyeiifwen tsntkismek dgpeftlknl qpltvycvqa rvlfrallnk tsnfseklce

421 ktrpgsfst (SEQ ID NO: 1)421 ktrpgsfst (SEQ ID NO: 1)

Мышиный IFNAR2-ECD: Murine IFNAR2-ECD :

1 mrsrctvsav gllslclvvs asletitpsa fdgypdepct initirnsrl ilswelenks1 mrsrctvsav gllslclvvs asletitpsa fdgypdepct initirnsrl ilswelenks

61 gppanytlwy tvmskdenlt kvkncsdttk sscdvtdkwl egmesyvvai vivhrgdltv61 gppanytlwy tvmskdenlt kvkncsdttk sscdvtdkwl egmesyvvai vivhrgdltv

121 crcsdyivpa napleppefe ivgftdhinv tmefppvtsk iiqekmkttp fvikeqigds121 crcsdyivpa napleppefe ivgftdhinv tmefppvtsk iiqekmkttp fvikeqigds

181 vrkkhepkvn nvtgnftfvl rdllpktnyc vslyfdddpa iksplkcivl qpgqesglse181 vrkkhepkvn nvtgnftfvl rdllpktnyc vslyfdddpa iksplkcivl qpgqesglse

241 sa (SEQ ID NO: 2)241sa (SEQ ID NO: 2)

Человеческий IFNAR1-ECD: Human IFNAR1-ECD :

1 mmvvllgatt lvlvavapwv lsaaaggknl kspqkvevdi iddnfilrwn rsdesvgnvt1 mmvvllgatt lvlvapwv lsaaaggknl kspqkvevdi iddnfilrwn rsdesvgnvt

61 fsfdyqktgm dnwiklsgcq nitstkcnfs slklnvyeei klriraeken tsswyevdsf61 fsfdyqktgm dnwiklsgcq nitstkcnfs slklnvyeei klriraeken tsswyevdsf

121 tpfrkaqigp pevhleaedk aivihispgt kdsvmwaldg lsftyslviw knssgveeri121 tpfrkaqigp pevhleaedk aivihispgt kdsvmwaldg lsftyslviw knssgveeri

181 eniysrhkiy klspettycl kvkaalltsw kigvyspvhc ikttvenelp ppenievsvq181 eniysrhkiy klspettycl kvkaalltsw kigvyspvhc ikttvenelp ppenievsvq

241 nqnyvlkwdy tyanmtfqvq wlhaflkrnp gnhlykwkqi pdcenvkttq cvfpqnvfqk241 nqnyvlkwdy tyanmtfqvq wlhaflkrnp gnhlykwkqi pdcenvkttq cvfpqnvfqk

301 giyllrvqas dgnntsfwse eikfdteiqa fllppvfnir slsdsfhiyi gapkqsgntp301 giyllrvqas dgnntsfwse eikfdteiqa fllppvfnir slsdsfhiyi gapkqsgntp

361 viqdypliye iifwentsna erkiiekktd vtvpnlkplt vycvkaraht mdeklnkssv361 viqdypliye iifwentsna erkiiekktd vtvpnlkplt vycvkaraht mdeklnkssv

421 fsdavcektk pgntsk (SEQ ID NO: 3)421 fsdavcektk pgntsk (SEQ ID NO: 3)

Человеческий IFNAR2-ECD: Human IFNAR2-ECD :

1 mllsqnafif rslnlvlmvy islvfgisyd spdytdesct fkislrnfrs ilswelknhs1 mllsqnafif rslnlvlmvy islvfgisyd spdytdesct fkislrnfrs ilswelknhs

61 ivpthytlly timskpedlk vvkncanttr sfcdltdewr stheayvtvl egfsgnttlf61 ivpthytlly timskpedlk vvkncanttr sfcdltdewr stheayvtvl egfsgnttlf

121 scshnfwlai dmsfeppefe ivgftnhinv mvkfpsivee elqfdlslvi eeqsegivkk121 scshnfwlai dmsfeppefe ivgftnhinv mvkfpsivee elqfdlslvi eeqsegivkk

181 hkpeikgnms gnftyiidkl ipntnycvsv ylehsdeqav iksplkctll ppgqesesae181 hkpeikgnms gnftyiidkl ipntnycvsv ylehsdeqav iksplkctll ppgqesesae

241 sak (SEQ ID NO: 4)241 sak (SEQ ID NO: 4)

Далее, конструкции включают домены стабилизации, которые, например, будут увеличивать период полувыведения in vivo. Авторы изобретения решили использовать константный домен Ig. Хотя был использован Fc-домен IgG1, также можно использовать другие Fc-домены. Особое преимущество от использования Fc-доменов IgA заключается в их способности димеризоваться, что означает, что в такую конструкцию может быть включено до четырех различных интерферонов. Одним из примеров создания конструкций с множеством интерферонов является использование гетеродимера FcA-FcB IgG1 с одним блокирующим рецептором и одним интерфероном, слитым с FcA или FcB, с использованием отдельных расщепляемых субстратов, специфических для разных ферментов, встроенных в линкеры FcA и FcB, соответственно. Можно также использовать другие стабилизирующие белки, включая человеческий сывороточный альбумин и трансферрин.Further, the constructs include stabilization domains which, for example, will increase the in vivo half-life. The inventors decided to use the Ig constant domain. Although the Fc domain of IgG1 has been used, other Fc domains can also be used. A particular advantage of using IgA Fc domains is their ability to dimerize, which means that up to four different interferons can be included in such a construct. One example of multi-interferon constructs is the use of an FcA-FcB IgG1 heterodimer with one blocking receptor and one interferon fused to an FcA or FcB using separate cleavable substrates specific for different enzymes embedded in FcA and FcB linkers, respectively. Other stabilizing proteins may also be used, including human serum albumin and transferrin.

Наконец, указанные выше домены связаны друг с другом короткими пептидными участками или «линкерами». Один из этих линкеров, расположенный между молекулой интерферона и маскирующим доменом, подвергается расщеплению, когда пролекарство достигает или приближается к своей цели - опухоли или раковой клетке. В конкретном варианте осуществления линкер содержит участок, представляющий собой мишень для протеазы, в котором, когда пролекарство подвергается воздействию среды, содержащей протеазу, линкер расщепляется, высвобождая маскирующий агент из пролекарства, тем самым активируя молекулу интерферона. В идеале, линкер может быть выбран для протеаз, сверхэкспрессируемых в раковых клетках или в месте образования опухоли, и даже может быть адаптирован к профилю протеазы, экспрессируемой в раковых клетках/опухоли у конкретного индивидуума с помощью предварительного тестирования. Ниже приведены несколько примеров ферментов, селективно экспрессируемых или сверхэкспрессируемых в раковых или опухолевых средах.Finally, the above domains are connected to each other by short peptide regions or "linkers". One of these linkers, located between the interferon molecule and the masking domain, undergoes cleavage when the prodrug reaches or approaches its target, the tumor or cancer cell. In a particular embodiment, the linker contains a protease target site in which, when the prodrug is exposed to the environment containing the protease, the linker is cleaved, releasing the masking agent from the prodrug, thereby activating the interferon molecule. Ideally, the linker can be selected for proteases overexpressed in cancer cells or at the site of tumor formation, and can even be adapted to the profile of the protease expressed in cancer cells/tumor in a particular individual through preliminary testing. The following are a few examples of enzymes that are selectively expressed or overexpressed in cancer or tumor environments.

ТАБЛИЦА 1 - СУБСТРАТЫ ПРОТЕАЗЫTABLE 1 - PROTEASE SUBSTRATES

ФерментEnzyme Аминокислотная последовательность субстратаSubstrate amino acid sequence MMP2, MMP9MMP2, MMP9 PVGLIG (SEQ ID NO: 5)PVGLIG (SEQ ID NO: 5) MMP11MMP11 GGYAELRMGG (SEQ ID NO: 6)GGYAELRMGG (SEQ ID NO: 6) MMP13MMP13 GPRPFNYL (SEQ ID NO: 7)GPRPFNYL (SEQ ID NO: 7) MMP13MMP13 GGALGLSL (SEQ ID NO: 8)GGALGLSL (SEQ ID NO: 8) MMP13MMP13 GPMSYNAL (SEQ ID NO: 9)GPMSYNAL (SEQ ID NO: 9) MMP14MMP14 SGRSENIRTA (SEQ ID NO: 10)SGRSENIRTA (SEQ ID NO: 10) FAPaFAPa TSGPNQEQK (SEQ ID NO: 11)TSGPNQEQK (SEQ ID NO: 11) Катепсин BCathepsin B GFLG (SEQ ID NO: 12)GFLG (SEQ ID NO: 12)

Примером формы линкера является GGGGS-субстрат-GGGGS (GGGGS=SEQ ID NO: 13). Другими двумя примерами являются (GGGGS)_n-субстрат-(GGGGS)_n и G_n-субстрат-G_n (n может быть любым числом) (GGGGS=SEQ ID NO: 13).An example of a linker form is GGGGS-substrate-GGGGS (GGGGS=SEQ ID NO: 13). Other two examples are (GGGGS) _n -substrate-(GGGGS) _n and G _n -substrate-G _n (n can be any number) (GGGGS=SEQ ID NO: 13).

В. Разработка и экспрессия конструкций нуклеиновых кислот.B. Development and expression of nucleic acid constructs.

Доступны различные генетические конструкции, которые содержат описанные выше компоненты пролекарства интерферона, и которые могут быть введены в векторы экспрессии. Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению, которые кодируют молекулы пролекарства, необязательно могут быть связаны с другими белковыми последовательностями. В контексте настоящей заявки термин «экспрессирующая конструкция» предназначен для обозначения любого типа генетической конструкции, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую генный продукт, в которой часть или вся последовательность, кодирующая нуклеиновую кислоту, способна транскрибироваться. Транскрипт может быть транслирован в белок, но это не является обязательным. В некоторых вариантах осуществления экспрессия включает как транскрипцию гена, так и трансляцию мРНК в продукт гена. В других вариантах осуществления экспрессия включает только транскрипцию нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес ген.Various genetic constructs are available that contain the interferon prodrug components described above and that can be introduced into expression vectors. Nucleic acids of the present invention that encode prodrug molecules may optionally be linked to other protein sequences. In the context of the present application, the term "expression construct" is intended to refer to any type of genetic construct containing a nucleic acid encoding a gene product in which part or all of the sequence encoding the nucleic acid is capable of being transcribed. The transcript may be translated into a protein, but this is not required. In some embodiments, expression includes both transcription of the gene and translation of the mRNA into the gene product. In other embodiments, expression only includes transcription of the nucleic acid encoding the gene of interest.

Термин «вектор» используется для обозначения молекулы нуклеиновой кислоты-носителя, предназначенной для введения в клетку, где она может быть реплицирована, в которую может быть вставлена последовательность нуклеиновой кислоты. Последовательность нуклеиновой кислоты может быть «экзогенной», что означает, что эта последовательность является чужеродной для клетки, в которую вводится вектор, или что эта последовательность является гомологичной последовательности, находящейся в клетке, но находится внутри нуклеиновой кислоты клетки-хозяина в положении, в котором обычно эта последовательность отсутствует. Векторы включают плазмиды, космиды, вирусы (бактериофаг, вирусы животных и вирусы растений) и искусственные хромосомы (например, YAC). Специалист в данной области обладает необходимыми навыками для конструирования вектора с помощью стандартных рекомбинантных способов, которые описаны в работах Sambrook et al. (1989) и Ausubel et al. (1994), обе из которых включены в настоящее описание в качестве ссылки.The term "vector" is used to refer to a carrier nucleic acid molecule intended to be introduced into a cell, where it can be replicated, into which the nucleic acid sequence can be inserted. The nucleic acid sequence may be "exogenous", which means that the sequence is foreign to the cell into which the vector is introduced, or that the sequence is homologous to the sequence found in the cell, but is located within the nucleic acid of the host cell at a position in which usually this sequence is missing. Vectors include plasmids, cosmids, viruses (bacteriophage, animal and plant viruses) and artificial chromosomes (eg YAC). A person skilled in the art has the necessary skills to construct a vector using standard recombinant methods, which are described in the works of Sambrook et al. (1989) and Ausubel et al. (1994), both of which are incorporated herein by reference.

Термин «вектор экспрессии» относится к вектору, содержащему последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере часть генного продукта, способного транскрибироваться. В некоторых случаях молекулы РНК затем транслируются в белок, полипептид или пептид. В других случаях эти последовательности не транслируются, например, при продуцировании антисмысловых молекул или рибозимов. Векторы экспрессии могут содержать множество «контрольных последовательностей», которые относятся к последовательностям нуклеиновых кислот, необходимым для транскрипции и, возможно, трансляции функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. В дополнение к контрольным последовательностям, которые управляют транскрипцией и трансляцией, векторы и векторы экспрессии могут содержать последовательности нуклеиновых кислот, которые также выполняют другие функции и которые описаны ниже.The term "expression vector" refers to a vector containing a nucleic acid sequence encoding at least a portion of a gene product capable of being transcribed. In some cases, the RNA molecules are then translated into a protein, polypeptide, or peptide. In other cases, these sequences are not translated, such as in the production of antisense molecules or ribozymes. Expression vectors may contain a plurality of "control sequences", which refer to nucleic acid sequences necessary for transcription and possibly translation of an operably linked coding sequence in a particular host organism. In addition to control sequences that direct transcription and translation, vectors and expression vectors may contain nucleic acid sequences that also perform other functions and are described below.

1. Регуляторные элементы1. Regulatory elements

«Промотор» является контрольной последовательностью, которая представляет собой область последовательности нуклеиновой кислоты, осуществляющей контроль инициации и скорости транскрипции. Он может содержать генетические элементы, с которыми могут связываться регуляторные белки и молекулы, такие как РНК-полимераза и другие факторы транскрипции. Фразы «функционально расположенные», «функционально связанные», «под контролем» и «под транскрипционным контролем» означают, что промотор находится в правильном функциональном положении и/или ориентации относительно последовательности нуклеиновой кислоты для осуществления контроля инициации транскрипции и/или экспрессии этой последовательности. Промотор может использоваться или может не использоваться вместе с «энхансером», который относится к цис-действующей регуляторной последовательности, участвующей в активации транскрипции последовательности нуклеиновой кислоты.A "promoter" is a control sequence, which is a region of a nucleic acid sequence that controls the initiation and rate of transcription. It may contain genetic elements to which regulatory proteins and molecules such as RNA polymerase and other transcription factors can bind. The phrases "operably located", "operably linked", "under control" and "under transcriptional control" mean that the promoter is in the correct functional position and/or orientation relative to the nucleic acid sequence to control the initiation of transcription and/or expression of this sequence. A promoter may or may not be used in conjunction with an "enhancer", which refers to a cis-acting regulatory sequence involved in activating the transcription of a nucleic acid sequence.

Промотор может представлять собой промотор, который в природных условиях связан с геном или последовательностью, который может быть получен путем выделения 5’-некодирующих последовательностей, расположенных выше кодирующего сегмента и/или экзона. Такой промотор может упоминаться как «эндогенный». Аналогичным образом, энхансер может представлять собой энхансер, который в природных условиях связан с последовательностью нуклеиновой кислоты, расположенной ниже или выше этой последовательности. Альтернативно, определенные преимущества могут быть получены при размещении сегмента кодирующей нуклеиновой кислоты под контролем рекомбинантного или гетерологичного промотора, относящегося к промотору, который в природных условиях не связан с последовательностью нуклеиновой кислоты в естественной среде.The promoter may be a promoter that is naturally associated with a gene or sequence that can be obtained by isolating 5' non-coding sequences located upstream of the coding segment and/or exon. Such a promoter may be referred to as "endogenous". Similarly, an enhancer can be an enhancer that is naturally associated with a nucleic acid sequence located upstream or downstream of that sequence. Alternatively, certain advantages may be obtained by placing the coding nucleic acid segment under the control of a recombinant or heterologous promoter related to a promoter that is not naturally associated with the nucleic acid sequence in the natural environment.

Рекомбинантный или гетерологичный энхансер относится также к энхансеру, который в природных условиях не связан с последовательностью нуклеиновой кислоты в естественной среде. Такие промоторы или энхансеры могут включать промоторы или энхансеры других генов, а также промоторы или энхансеры, выделенные из любой другой прокариотической, вирусной или эукариотической клетки, и промоторы или энхансеры, которые не «встречаются в природе», т.е. содержащие другие элементы других транскрипционных регуляторных областей и/или мутации, которые изменяют экспрессию. В дополнение к синтетически полученным последовательностям нуклеиновых кислот промоторов и энхансеров, последовательности могут быть получены с помощью метода рекомбинантного клонирования и/или амплификации нуклеиновых кислот, включая ПЦР^ТМ, применительно к раскрытыми в настоящем описании композициям (см. патент США 4683202, патент США 5928906, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки). Кроме того, предполагается, что контрольные последовательности также могут использоваться для прямой транскрипции и/или экспрессии последовательностей внутри неядерных органелл, таких как митохондрии, хлоропласты и т.п.Recombinant or heterologous enhancer also refers to an enhancer that is not naturally associated with a nucleic acid sequence in the natural environment. Such promoters or enhancers may include promoters or enhancers of other genes, as well as promoters or enhancers isolated from any other prokaryotic, viral or eukaryotic cell, and promoters or enhancers that are not "naturally occurring", i. containing other elements of other transcriptional regulatory regions and/or mutations that alter expression. In addition to synthetically derived promoter and enhancer nucleic acid sequences, sequences can be obtained by recombinant nucleic acid cloning and/or amplification techniques, including ^TMα PCR, in relation to the compositions disclosed herein (see US Patent 4,683,202, US Patent 5,928,906, each of which is incorporated herein by reference). Furthermore, it is contemplated that control sequences can also be used for direct transcription and/or expression of sequences within non-nuclear organelles such as mitochondria, chloroplasts, and the like.

Естественно, важно отметить применение промотора и/или энхансера, эффективно направляющего экспрессию сегмента ДНК в определенном типе клеток, органелле и организме, которые выбраны для экспрессии. Специалистам в области молекулярной биологии обычно известно использование комбинаций промоторов, энхансеров и типов клеток для экспрессии белка, например, см. работу Sambrook et al. (1989), включенную в настоящее описание в качестве ссылки. Используемые промоторы могут быть конститутивными, тканеспецифичными, индуцибельными и/или полезными в соответствующих условиях для получения высокого уровня экспрессии введенного сегмента ДНК, что является преимуществом при крупномасштабном производстве рекомбинантных белков и/или пептидов. Промотор может быть гетерологичным или эндогенным.Naturally, it is important to note the use of a promoter and/or enhancer that effectively directs the expression of a DNA segment in the particular cell type, organelle, and organism that is chosen for expression. Those skilled in the art of molecular biology are generally aware of the use of combinations of promoters, enhancers, and cell types for protein expression, for example, see Sambrook et al. (1989), included in the present description by reference. The promoters used can be constitutive, tissue-specific, inducible and/or useful under appropriate conditions to obtain a high level of expression of the introduced DNA segment, which is an advantage in large scale production of recombinant proteins and/or peptides. The promoter may be heterologous or endogenous.

Идентичность тканеспецифичных промоторов или элементов, а также анализы для характеристики их активности хорошо известны специалистам в данной области. Примеры таких областей включают ген LIMK2 человека (Nomoto et al. 1999), ген рецептора соматостатина 2 (Kraus et al., 1998), мышиный эпидидимальный связывающий ретиноевую кислоту ген (Lareyre et al., 1999), человеческий CD4 (Zhao-Emonet et al., 1998), мышиный альфа2 (XI) коллаген (Tsumaki, et al., 1998), ген рецептора дофамина D1A (Lee, et al., 1997), инсулиноподобный фактор роста II (Wu et al., 1997), молекулу адгезии эндотелиальных клеток тромбоцитов-1 человека (Almendro et al., 1996). Специфичные для опухоли промоторы также могут применяться в настоящем изобретении.The identity of tissue-specific promoters or elements, as well as assays to characterize their activity, are well known to those skilled in the art. Examples of such regions include the human LIMK2 gene (Nomoto et al. 1999), the somatostatin 2 receptor gene (Kraus et al., 1998), the mouse epididymal retinoic acid-binding gene (Lareyre et al., 1999), human CD4 (Zhao-Emonet et al. al., 1998), mouse alpha2 (XI) collagen (Tsumaki, et al., 1998), dopamine D1A receptor gene (Lee, et al., 1997), insulin-like growth factor II (Wu et al., 1997), molecule human platelet-1 endothelial cell adhesion (Almendro et al., 1996). Tumor-specific promoters can also be used in the present invention.

Для эффективной трансляции кодирующих последовательностей также может потребоваться конкретный сигнал инициации. Эти сигналы включают кодон инициации ATG или смежные последовательности. Может возникнуть необходимость в предоставлении экзогенных сигналов регуляции трансляции, включая кодон инициации ATG. Специалист в данной области техники легко сможет это определить и предоставить необходимые сигналы. Хорошо известно, что для обеспечения трансляции всей вставки кодон инициации должен находиться «внутри рамки считывания» с рамкой считывания требуемой кодирующей последовательности. Экзогенные сигналы регуляции трансляции и кодоны инициации могут быть естественными или синтетическими. Эффективность экспрессии может быть увеличена путем включения соответствующих энхансерных элементов транскрипции.Efficient translation of coding sequences may also require a specific initiation signal. These signals include the initiation codon ATG or adjacent sequences. It may be necessary to provide exogenous signals for the regulation of translation, including the initiation codon ATG. A person skilled in the art will easily be able to determine this and provide the necessary signals. It is well known that in order to ensure translation of the entire insert, the initiation codon must be "in-frame" with the reading frame of the desired coding sequence. Exogenous translational control signals and initiation codons may be natural or synthetic. Expression efficiency can be increased by including appropriate transcriptional enhancer elements.

2. IRES2. IRES

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения для создания мультигенных или полицистронных сообщений используются такие элементы, как участки внутренней посадки рибосомы (IRES). Элементы IRES способны обойти модель сканирования рибосомой 5'-метилированного Cap и начать трансляцию на внутренних участках (Pelletier and Sonenberg, 1988). Были описаны элементы IRES, полученные от двух членов семейства пикорнавирусов (полиомиелита и энцефаломиокардита) (Pelletier and Sonenberg, 1988), а также IRES из мРНК млекопитающих (Macejak and Sarnow, 1991). Элементы IRES могут быть связаны с гетерологичными открытыми рамками считывания. Несколько открытых рамок считывания могут подвергаться совместной транскрипции, при этом каждая рамка считывания разделена IRES, обеспечивая таким образом создание полицистронных мРНК. Благодаря элементу IRES каждая открытая рамка считывания доступна рибосомам, что обеспечивает эффективную трансляцию. С помощью одного промотора/энхансера возможна эффективная экспрессия множества генов с обеспечением транскрипции одной мРНК (см. патенты США 5925565 и 5935819, включенные в настоящее описание в качестве ссылки).In some embodiments of the present invention, elements such as internal ribosome entry sites (IRES) are used to create multigene or polycistronic messages. IRES elements are able to bypass the 5'-methylated Cap ribosome scanning pattern and initiate translation at internal sites (Pelletier and Sonenberg, 1988). IRES elements derived from two members of the picornavirus family (poliomyelitis and encephalomyocarditis) have been described (Pelletier and Sonenberg, 1988), as well as IRES from mammalian mRNA (Macejak and Sarnow, 1991). IRES elements may be associated with heterologous open reading frames. Several open reading frames can be co-transcribed, with each reading frame separated by an IRES, thus generating polycistronic mRNAs. Thanks to the IRES element, each open reading frame is accessible to ribosomes, which ensures efficient translation. With a single promoter/enhancer, multiple genes can be efficiently expressed to ensure transcription of a single mRNA (see US Pat. Nos. 5,925,565 and 5,935,819, incorporated herein by reference).

3. Многоцелевые сайты клонирования3. Multipurpose cloning sites

Векторы могут включать множественный сайт клонирования (MCS), который представляет собой область нуклеиновой кислоты, содержащую множество сайтов рестрикционных ферментов, любой из которых можно использовать в сочетании со стандартным рекомбинантным методом для расщепления вектора. См. Carbonelli et al., 1999, Levenson et al., 1998 и Cocea, 1997, включенные в настоящее описание в качестве ссылки. «Расщепление рестрикционными ферментами» относится к каталитическому расщеплению молекулы нуклеиновой кислоты ферментом, который функционирует только в определенных местах в молекуле нуклеиновой кислоты. Многие из этих рестрикционных ферментов имеются в продаже. Использование таких ферментов хорошо известно специалистам в данной области. Часто вектор линеаризуют или фрагментируют, используя рестрикционный фермент, который разрезает MCS внутри, обеспечивая возможность лигирования экзогенных последовательностей с вектором. «Лигирование» относится к процессу образования фосфодиэфирных связей между двумя фрагментами нуклеиновой кислоты, которые могут быть или могут не быть смежными друг с другом. Методы, включающие рестрикционные ферменты и реакции лигирования, хорошо известны специалистам в области рекомбинантных технологий.Vectors may include a multiple cloning site (MCS), which is a region of nucleic acid containing multiple restriction enzyme sites, any of which can be used in conjunction with a standard recombinant method to cleave the vector. See Carbonelli et al., 1999, Levenson et al., 1998 and Cocea, 1997, incorporated herein by reference. "Restriction enzyme cleavage" refers to the catalytic cleavage of a nucleic acid molecule by an enzyme that functions only at specific locations in the nucleic acid molecule. Many of these restriction enzymes are commercially available. The use of such enzymes is well known to those skilled in the art. Often, the vector is linearized or fragmented using a restriction enzyme that cuts the MCS internally, allowing exogenous sequences to be ligated to the vector. "Ligation" refers to the process of forming phosphodiester bonds between two nucleic acid fragments, which may or may not be adjacent to each other. Techniques involving restriction enzymes and ligation reactions are well known to those skilled in the art of recombinant technology.

4. Сплайсинг сайтов4. Site splicing

Большинство транскрибируемых эукариотических молекул РНК подвергают сплайсингу РНК для удаления интронов из первичных транскриптов. Для векторов, содержащих геномные эукариотические последовательности, могут потребоваться сайты для сплайсинга доноров и/или акцепторов для обеспечения надлежащего процессинга транскрипта для экспрессии белка (см. Chandler et al., 1997, включенный в настоящее описание в качестве ссылки).Most transcribed eukaryotic RNA molecules undergo RNA splicing to remove introns from primary transcripts. Vectors containing eukaryotic genomic sequences may require donor and/or acceptor splicing sites to ensure proper transcript processing for protein expression (see Chandler et al., 1997, incorporated herein by reference).

5. Сигналы терминации5. Termination signals

Векторы или конструкции по настоящему изобретению, как правило, содержат по меньшей мере один сигнал терминации. «Сигнал терминации» или «терминатор» состоит из ДНК-последовательностей, участвующих в специфической терминации РНК-транскрипта РНК-полимеразой. Таким образом, в определенных вариантах осуществления рассматривается сигнал терминации, который завершает продуцирование РНК-транскрипта. Для получения мРНК нужного уровня может понадобиться терминатор in vivo.The vectors or constructs of the present invention typically contain at least one termination signal. A "termination signal" or "terminator" consists of DNA sequences involved in the specific termination of an RNA transcript by an RNA polymerase. Thus, in certain embodiments, a termination signal is considered that terminates the production of an RNA transcript. An in vivo terminator may be needed to obtain the desired level of mRNA.

В эукариотических системах область терминатора также может содержать специфические последовательности ДНК, которые обеспечивают сайт-специфическое расщепление нового транскрипта, обнажая сайт полиаденилирования. Это является сигналом для специализированной эндогенной полимеразы к добавлению участка длиной примерно 200 А остатков (полиА) к 3'-концу транскрипта. Молекулы РНК, модифицированные таким полиА хвостом, оказываются более стабильными и транслируются более эффективно. Таким образом, в других вариантах осуществления, в которых используются эукариоты, предпочтительно, чтобы этот терминатор содержал сигнал для расщепления РНК, и более предпочтительно, чтобы сигнал терминатора стимулировал полиаденилирование мРНК. Элементы терминатора и/или сайта полиаденилирования могут служить для повышения уровней мРНК и/или для минимизации считывания кассеты в другие последовательности.In eukaryotic systems, the terminator region may also contain specific DNA sequences that provide site-specific cleavage of the new transcript, exposing the polyadenylation site. This is the signal for a specialized endogenous polymerase to add a region of approximately 200 A residues (polyA) to the 3' end of the transcript. RNA molecules modified with such a polyA tail are more stable and more efficiently translated. Thus, in other embodiments that use eukaryotes, it is preferred that the terminator contains a signal for RNA cleavage, and more preferably, the terminator signal stimulates mRNA polyadenylation. The terminator and/or polyadenylation site elements may serve to increase mRNA levels and/or to minimize reading of the cassette into other sequences.

Терминаторы, предполагаемые для использования в настоящем изобретении, включают любой известный терминатор транскрипции, описанный в настоящей заявке или известный специалисту в данной области, включая, без ограничения, например, последовательности терминации генов, такие как, например, терминатор бычьего гормона роста, или вирусные последовательности терминации, такие как, например, терминатор SV40. В некоторых вариантах осуществления сигнал терминации может представлять собой отсутствие транскрибируемой или транслируемой последовательности, например, в связи с усечением последовательности.Terminators contemplated for use in the present invention include any known transcription terminator described in this application or known to a person skilled in the art, including, without limitation, for example, gene termination sequences such as, for example, the bovine growth hormone terminator, or viral sequences terminations, such as, for example, the SV40 terminator. In some embodiments, the termination signal may be the absence of a transcribed or translated sequence, for example due to sequence truncation.

6. Сигналы полиаденилирования6. Polyadenylation signals

При экспрессии, особенно при экспрессии в эукариотической клетке, обычно включают сигнал полиаденилирования для обеспечения правильного полиаденилирования транскрипта. Природа сигнала полиаденилирования, как полагают, не имеет решающего значения для успешной реализации изобретения, и/или может быть использована любая такая последовательность. Предпочтительные варианты осуществления включают сигнал полиаденилирования SV40 и/или сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста, удобный и/или известный как хорошо функционирующий в различных клетках-мишенях. Полиаденилирование может увеличить стабильность транскрипта или может способствовать цитоплазматическому транспорту.When expressed, especially when expressed in a eukaryotic cell, a polyadenylation signal is usually included to ensure correct polyadenylation of the transcript. The nature of the polyadenylation signal is not believed to be critical to the success of the invention, and/or any such sequence may be used. Preferred embodiments include an SV40 polyadenylation signal and/or a bovine growth hormone polyadenylation signal convenient and/or known to function well in various target cells. Polyadenylation may increase transcript stability or may promote cytoplasmic transport.

7. Точка начала репликации7. Start point of replication

Для размножения вектора в клетке-хозяине, он может содержать одну или более точек начала репликации (часто называемых «ori»), которые представляют собой специфическую последовательность нуклеиновой кислоты, в которой инициируется репликация. Альтернативно, можно использовать автономно реплицируемую последовательность (ARS), если клетка-хозяин представляет собой дрожжи.To propagate a vector in a host cell, it may contain one or more origins of replication (often referred to as "ori"), which are the specific nucleic acid sequence at which replication is initiated. Alternatively, an autonomously replicable sequence (ARS) can be used if the host cell is yeast.

8. Селектируемые и скринируемые маркеры8. Selectable and screenable markers

В некоторых вариантах осуществления изобретения клетки, содержащие конструкцию нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, могут быть идентифицированы in vitro или in vivo путем включения маркера в вектор экспрессии. Благодаря таким маркерам обеспечивается идентифицируемое изменение клетки, позволяющее легко идентифицировать клетки, содержащие вектор экспрессии. Как правило, селектируемым маркером является маркер, который придает свойство, позволяющее выполнить отбор. В случае положительного селектируемого маркера, выбирают его присутствие, в то время как в случае отрицательного селектируемого маркера, его присутствие исключает выбор. Примером положительного селектируемого маркера является маркер устойчивости к лекарственным веществам.In some embodiments, cells containing the nucleic acid construct of the present invention can be identified in vitro or in vivo by incorporating a marker into an expression vector. Such markers provide an identifiable change in the cell, allowing the cells containing the expression vector to be easily identified. Typically, a selectable marker is a marker that imparts a property that allows selection to be made. In the case of a positive selectable marker, its presence is selected, while in the case of a negative selectable marker, its presence excludes the selection. An example of a positive selectable marker is a drug resistance marker.

Обычно включение маркера отбора по чувствительности к лекарственному веществу помогает в клонировании и идентификации трансформантов; например, гены, которые придают устойчивость к неомицину, пуромицину, гигромицину, DHFR, GPT, зеоцину и гистидинолу, являются полезными селектируемыми маркерами. В дополнение к маркерам, придающим фенотип, который позволяет отличить трансформантов, исходя из реализации условий, также предполагаются другие типы маркеров, включая скринируемые маркеры, такие как GFP, основой которых является колориметрический анализ. Альтернативно, можно использовать скринируемые ферменты, такие как тимидинкиназа (tk) вируса простого герпеса или хлорамфеникол-ацетилтрансфераза (CAT). Специалист в данной области также осведомлен, как использовать иммунологические маркеры, возможно, в сочетании с анализом FACS. Считается, что используемый маркер не имеет важного значения при условии, что он способен экспрессироваться одновременно с нуклеиновой кислотой, кодирующей продукт гена. Дополнительные примеры селектируемых и скринируемых маркеров хорошо известны специалисту в данной области.Typically, the inclusion of a drug susceptibility selection marker aids in the cloning and identification of transformants; for example, genes that confer resistance to neomycin, puromycin, hygromycin, DHFR, GPT, zeocin, and histidinol are useful selectable markers. In addition to markers conferring a phenotype that distinguishes transformants based on the realization of conditions, other types of markers are also contemplated, including screenable markers such as GFP, which are based on colorimetric analysis. Alternatively, screenable enzymes such as herpes simplex virus thymidine kinase (tk) or chloramphenicol acetyltransferase (CAT) can be used. One of skill in the art is also aware of how to use immunological markers, possibly in combination with FACS analysis. The marker used is considered to be of no importance, provided that it is capable of being expressed simultaneously with the nucleic acid encoding the gene product. Additional examples of selectable and screenable markers are well known to those skilled in the art.

9. Вирусные векторы9. Viral vectors

Способность некоторых вирусных векторов эффективно инфицировать или проникать в клетки, интегрироваться в геном клетки-хозяина и стабильно экспрессировать вирусные гены, привела к разработке и применению ряда различных вирусных векторных систем (Robbins et al., 1998). В настоящее время вирусные системы разрабатываются для использования в качестве векторов для переноса генов ex vivo и in vivo. Например, в настоящее время оценивают использование векторов на основе аденовируса, вируса простого герпеса, ретровируса и аденоассоциированных вирусов для лечения таких заболеваний, как рак, муковисцидоз, болезнь Гоше, почечная недостаточность и артрит (Robbins and Ghivizzani, 1998; Imai et al., 1998; патент США 5670488). Различные вирусные векторы, описанные ниже, имеют определенные преимущества и недостатки в зависимости от конкретного применения генной терапии.The ability of some viral vectors to efficiently infect or enter cells, integrate into the host cell genome, and stably express viral genes has led to the development and use of a number of different viral vector systems (Robbins et al., 1998). Virus systems are currently being developed for use as ex vivo and in vivo gene transfer vectors. For example, the use of vectors based on adenovirus, herpes simplex virus, retrovirus and adeno-associated viruses for the treatment of diseases such as cancer, cystic fibrosis, Gaucher disease, renal failure and arthritis is currently being evaluated (Robbins and Ghivizzani, 1998; Imai et al., 1998 ; US Pat. No. 5,670,488). The various viral vectors described below have certain advantages and disadvantages depending on the particular application of gene therapy.

10. Невирусная трансформация10. Non-viral transformation

Считается, что подходящие способы доставки нуклеиновой кислоты для трансформации органеллы, клетки, ткани или организма, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают практически любой способ, с помощью которого нуклеиновая кислота (например, ДНК) может быть введена в органеллу, клетку, ткань или организм, описанные в настоящей заявке или известные специалисту в данной области. Такие способы включают, без ограничения, прямую доставку ДНК, такую как инъекция (патенты США 5994624, 5981274, 5945100, 5780448, 5736524, 5702932, 5656610, 5589466 и 5580859, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки), включая микроинъекцию (Harland и Weintraub, 1985; патент США 5789215, включенные в настоящее описание в качестве ссылки); путем электропорации (патент США 5384253, включенный в настоящее описание в качестве ссылки); осаждения фосфатом кальция (Graham and Van Der Eb, 1973; Chen и Okayama, 1987; Rippe et al., 1990); с помощью DEAE декстрана, и затем полиэтиленгликоля (Gopal, 1985); с помощью прямой ультразвуковой обработки (Fechheimer et al., 1987); опосредованной липосомами трансфекции (Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987; Wong et al., 1980; Kaneda et al., 1989; Kato et al., 1991); бомбардировки микрочастицами (заявки PCT №№ WO 94/09699 и 95/06128; патенты США 5610042; 5322783, 5563055, 5550318, 5538877 и 5538880, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки); путем перемешивания с волокнами карбида кремния (Kaeppler et al., 1990; патенты США 5302523 и 5464765, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки); или с помощью опосредованной PEG трансформации протопластов (Omirulleh et al., 1993; патенты США 4684611 и 4952500, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки); путем поглощения ДНК, опосредованного высушиванием/ингибированием (Potrykus et al., 1985). Благодаря применению таких технологий, обеспечивается стабильная или временная трансформация органеллы(органелл), клетки(клеток), ткани(ей) или организма(ов).It is believed that suitable nucleic acid delivery methods for transforming an organelle, cell, tissue, or organism suitable for use in the present invention include virtually any method by which a nucleic acid (e.g., DNA) can be introduced into an organelle, cell, tissue, or organism described in this application or known to a person skilled in the art. Such methods include, without limitation, direct DNA delivery such as injection (US Pat. Nos. 5,994,624; 5,981,274; 5,945,100; 5,780,448; Harland and Weintraub, 1985; US Pat. No. 5,789,215 incorporated herein by reference); by electroporation (US patent 5384253, included in the present description by reference); calcium phosphate precipitation (Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et al., 1990); with DEAE dextran followed by polyethylene glycol (Gopal, 1985); by direct sonication (Fechheimer et al., 1987); liposome mediated transfection (Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987; Wong et al., 1980; Kaneda et al., 1989; Kato et al., 1991); microparticle bombardment (PCT Application Nos. WO 94/09699 and 95/06128; US Pat. Nos. 5,610,042; 5,322,783; 5,563,055; 5,550,318; by mixing with silicon carbide fibers (Kaeppler et al., 1990; US Pat. Nos. 5,302,523 and 5,464,765, each of which is incorporated herein by reference); or by PEG-mediated protoplast transformation (Omirulleh et al., 1993; US Pat. Nos. 4,684,611 and 4,952,500, each of which is incorporated herein by reference); by desiccation/inhibition mediated DNA uptake (Potrykus et al., 1985). Through the use of such technologies, a stable or temporary transformation of the organelle(s), cell(s), tissue(s) or organism(s) is provided.

Инъекция. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота может доставляться в органеллу, клетку, ткань или организм посредством одной или нескольких инъекций (т.е. инъекции с помощью иглы), таких как, например, либо подкожных, внутрикожных, внутримышечных, внутривенных, либо внутрибрюшинных инъекций. Способы введения вакцин хорошо известны специалистам в данной области (например, инъекция композиции, содержащей солевой раствор). Дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения включают введение нуклеиновой кислоты путем прямой микроинъекции. Прямую микроинъекцию использовали для введения конструкций нуклеиновых кислот в ооциты Xenopus (Harland and Weintraub, 1985). Injection . In some embodiments, the nucleic acid can be delivered to an organelle, cell, tissue, or organism via one or more injections (i.e., needle injections), such as, for example, either subcutaneous, intradermal, intramuscular, intravenous, or intraperitoneal injections. Methods for administering vaccines are well known to those skilled in the art (eg, injection of a saline composition). Additional embodiments of the present invention include the introduction of a nucleic acid by direct microinjection. Direct microinjection has been used to introduce nucleic acid constructs into Xenopus oocytes (Harland and Weintraub, 1985).

Электропорация. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения нуклеиновую кислоту вводят в органеллу, клетку, ткань или организм посредством электропорации. Электропорация включает воздействие на суспензию клеток и ДНК высоковольтным электрическим разрядом. В некоторых вариантах этого способа используются определенные ферменты, разрушающие клеточную стенку, такие как ферменты, разрушающие пектин, делая реципиентные клетки-мишени более восприимчивыми к трансформации с помощью электропорации по сравнению с необработанными клетками (патент США 5384253, включенный в настоящее описание в качестве ссылки). Альтернативно, реципиентные клетки можно сделать более восприимчивыми к трансформации путем механического повреждения. Electroporation . In some embodiments, implementation of the present invention, the nucleic acid is introduced into the organelle, cell, tissue or organism by electroporation. Electroporation involves exposing cell suspension and DNA to a high-voltage electrical discharge. Some embodiments of this method use certain cell wall degrading enzymes, such as pectin degrading enzymes, making recipient target cells more susceptible to transformation by electroporation compared to untreated cells (U.S. Patent 5,384,253, incorporated herein by reference) . Alternatively, recipient cells can be made more susceptible to transformation by mechanical injury.

Трансфекция эукариотических клеток с помощью электропорации является довольно успешной. Мышиные пре-B лимфоциты были трансфицированы генами человеческого иммуноглобулина (Potter et al., 1984), а гепатоциты крысы были трансфицированы таким образом геном хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (Tur Kaspa et al., 1986).Transfection of eukaryotic cells by electroporation is quite successful. Mouse pre-B lymphocytes have been transfected with human immunoglobulin genes (Potter et al., 1984) and rat hepatocytes have been transfected in this manner with the chloramphenicol acetyltransferase gene (Tur Kaspa et al., 1986).

Для осуществления трансформации в клетках, таких как, например, растительные клетки, методом электропорации можно использовать либо рыхлые ткани, такие как суспензионная культура клеток или эмбриогенный каллус, либо альтернативно можно осуществить прямую трансформацию незрелых зародышей или других организованных тканей. В этом методе можно частично разрушить клеточные стенки выбранных клеток, подвергая их воздействию ферментов, расщепляющих пектин (пектолиазы), или нанести контролируемые механически повреждения. Примеры некоторых видов, которые были трансформированы с помощью электропорации интактных клеток, включают кукурузу (патент США 5384253; Rhodes et al., 1995; D'Halluin et al., 1992), пшеницу (Zhou et al., 1993), томат (Hou и Lin, 1996), сою (Christou et al., 1987) и табак (Lee et al., 1989).To effect transformation in cells, such as, for example, plant cells, either loose tissues such as suspension cell culture or embryogenic callus can be used by electroporation, or alternatively immature embryos or other organized tissues can be directly transformed. In this method, it is possible to partially destroy the cell walls of selected cells by exposing them to pectin-degrading enzymes (pectoliases) or to inflict controlled mechanical damage. Examples of some species that have been transformed by electroporation of intact cells include corn (U.S. Patent 5,384,253; Rhodes et al., 1995; D'Halluin et al., 1992), wheat (Zhou et al., 1993), tomato (Hou and Lin, 1996), soy (Christou et al., 1987) and tobacco (Lee et al., 1989).

Для трансформации растительных клеток с помощью электропорации также можно использовать протопласты (Bates, 1994; Lazzeri, 1995). Например, получение трансгенных растений сои путем электропорации протопластов, полученных из семядолей, описано Dhir и Widholm в международной заявке на патент № WO 92/17598, включенной в настоящее описание в качестве ссылки. Другие примеры видов, для которых описана трансформация протопластов, включают ячмень (Lazerri, 1995), сорго (Battraw et al., 1991), кукурузу (Bhattacharjee et al., 1997), пшеницу (He et al., 1994) и томат (Tsukada, 1989).Protoplasts can also be used to transform plant cells by electroporation (Bates, 1994; Lazzeri, 1995). For example, the production of transgenic soybean plants by electroporation of protoplasts derived from cotyledons is described by Dhir and Widholm in International Patent Application No. WO 92/17598, incorporated herein by reference. Other examples of species for which protoplast transformation has been described include barley (Lazerri, 1995), sorghum (Battraw et al., 1991), maize (Bhattacharjee et al., 1997), wheat (He et al., 1994), and tomato ( Tsukada, 1989).

Фосфат кальция. В других вариантах осуществления настоящего изобретения нуклеиновую кислоту вводят в клетки, используя осаждение фосфатом кальция. Человеческие клетки KB были трансфицированы ДНК аденовируса 5 (Graham and Van Der Eb, 1973) с помощью этого метода. Таким же образом были трансфицированы мышиные клетки L (A9), мышиные клетки C127, клетки CHO, CV 1, BHK, NIH3T3 и HeLa маркерным геном неомицина (Chen and Okayama, 1987), и гепатоциты крысы, которые были трансфицированы различными генами-маркерами (Rippe et al., 1990). calcium phosphate . In other embodiments of the present invention, the nucleic acid is introduced into cells using calcium phosphate precipitation. Human KB cells were transfected with adenovirus 5 DNA (Graham and Van Der Eb, 1973) using this method. Mouse L (A9) cells, mouse C127 cells, CHO, CV 1, BHK, NIH3T3, and HeLa cells were transfected in the same manner with the neomycin marker gene (Chen and Okayama, 1987), and rat hepatocytes were transfected with various marker genes ( Rippe et al., 1990).

DEAE декстран. В другом варианте осуществления нуклеиновую кислоту доставляют в клетку, используя DEAE декстран, и затем полиэтиленгликоль. Таким образом вводили репортерные плазмиды в клетки мышиной миеломы и эритролейкемии (Gopal, 1985). DEAE dextran . In another embodiment, the nucleic acid is delivered to the cell using DEAE dextran followed by polyethylene glycol. Thus, reporter plasmids were introduced into mouse myeloma and erythroleukemia cells (Gopal, 1985).

Обработка ультразвуком. Дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения включают введение нуклеиновой кислоты путем прямой обработки ультразвуком. LTK-фибробласты были трансфицированы геном тимидинкиназы с помощью ультразвуковой обработки (Fechheimer et al., 1987). Ultrasonication . Additional embodiments of the present invention include the introduction of a nucleic acid by direct sonication. LTK fibroblasts were transfected with the thymidine kinase gene using sonication (Fechheimer et al., 1987).

Опосредованная липосомами трансфекция. В другом варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота может быть захвачена липидным комплексом, таким как, например, липосома. Липосомы представляют собой везикулярные структуры, характеризующиеся двухслойной фосфолипидной мембраной и внутренней водной средой. Мультиламеллярные липосомы имеют несколько липидных слоев, разделенных водной средой. Они образуются спонтанно при суспендировании фосфолипидов в избытке водного раствора. Перед образованием замкнутых структур происходит самоорганизация липидных компонентов и захват воды и растворенных компонентов между липидными бислоями (Ghosh and Bachhawat, 1991). Также рассматривается нуклеиновая кислота, образующая комплекс с липофектамином (Gibco BRL) или суперфектом (Qiagen). Liposomal mediated transfection . In another embodiment of the invention, the nucleic acid can be captured by a lipid complex, such as, for example, a liposome. Liposomes are vesicular structures characterized by a bilayer phospholipid membrane and an internal aqueous environment. Multilamellar liposomes have several lipid layers separated by an aqueous medium. They form spontaneously when phospholipids are suspended in excess aqueous solution. Before the formation of closed structures, self-organization of lipid components and the capture of water and solute components between lipid bilayers occur (Ghosh and Bachhawat, 1991). Also considered is a nucleic acid that forms a complex with lipofectamine (Gibco BRL) or superfect (Qiagen).

Опосредованная липосомами доставка нуклеиновых кислот и экспрессия чужеродной ДНК in vitro оказалась очень успешной (Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987). Также продемонстрирована возможность опосредованной липосомами доставки и экспрессии чужеродной ДНК в культивируемых эмбрионах цыплят, клетках HeLa и гепатомы (Wong et al., 1980).Liposome-mediated delivery of nucleic acids and expression of foreign DNA in vitro has been very successful (Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987). The possibility of liposome-mediated delivery and expression of foreign DNA in cultured chick embryos, HeLa cells, and hepatoma cells has also been demonstrated (Wong et al., 1980).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения липосома может образовывать комплекс с гемагглютинирующим вирусом (HVJ). Было показано, что это облегчает слияние с клеточной мембраной и способствует проникновению в клетку инкапсулированной в липосомы ДНК (Kaneda et al., 1989). В других вариантах осуществления липосома может образовывать комплекс или использоваться вместе с ядерными негистоновыми хромосомными белками (HMG 1) (Kato et al., 1991). В других вариантах осуществления липосома может образовывать комплекс или использоваться вместе с HVJ и HMG 1. В других вариантах осуществления носитель для доставки может содержать лиганд и липосому.In some embodiments, implementation of the present invention, the liposome can form a complex with hemagglutinating virus (HVJ). This has been shown to facilitate fusion with the cell membrane and facilitate the entry of liposome-encapsulated DNA into the cell (Kaneda et al., 1989). In other embodiments, the implementation of the liposome can be complexed or used together with nuclear non-histone chromosomal proteins (HMG 1) (Kato et al., 1991). In other embodiments, the liposome may be complexed with or used in conjunction with HVJ and HMG 1. In other embodiments, the delivery vehicle may comprise a ligand and a liposome.

Рецептор-опосредованная трансфекция. Нуклеиновую кислоту также можно доставлять в клетку-мишень с помощью носителей для рецептор-опосредованной доставки. Их преимущество заключается в селективном поглощении макромолекул посредством опосредованного рецептором эндоцитоза, который происходит в клетке-мишени. Ввиду специфического распределения различных рецепторов в зависимости от типа клеток этот способ доставки добавляет настоящему изобретению еще одну степень специфичности. Receptor-mediated transfection . The nucleic acid can also be delivered to the target cell using carriers for receptor-mediated delivery. Their advantage lies in the selective uptake of macromolecules through receptor-mediated endocytosis that occurs in the target cell. In view of the specific distribution of different receptors depending on the cell type, this delivery method adds another degree of specificity to the present invention.

Некоторые рецептор-опосредованные носители, нацеленные на гены, содержат специфический по отношению к клеточному рецептору лиганд и агент, связывающий нуклеиновую кислоту. Другие содержат специфический по отношению к клеточному рецептору лиганд, к которому оперативно присоединяют предназначенную для доставки нуклеиновую кислоту. Для рецептор-опосредованного переноса генов было использовано несколько лигандов (Wu и Wu, 1987; Wagner et al., 1990; Perales et al., 1994; Myers, EPO 0273085), что свидетельствует об эксплуатационной пригодности этого метода. Описана специфическая доставка в контексте другого типа клеток млекопитающих (Wu and Wu, 1993; включен в настоящее описание в качестве ссылки). В некоторых аспектах настоящего изобретения выбирают такой лиганд, который соответствует рецептору, специфически экспрессируемому в популяции клеток-мишеней.Some receptor-mediated gene-targeting carriers contain a cell receptor-specific ligand and a nucleic acid binding agent. Others contain a cell receptor-specific ligand to which the nucleic acid to be delivered is operatively attached. Several ligands have been used for receptor-mediated gene transfer (Wu and Wu, 1987; Wagner et al., 1990; Perales et al., 1994; Myers, EPO 0273085), demonstrating the operational suitability of this method. Specific delivery in the context of another mammalian cell type has been described (Wu and Wu, 1993; incorporated herein by reference). In some aspects of the present invention, a ligand is selected that corresponds to a receptor specifically expressed in a population of target cells.

В других вариантах осуществления компонент-носитель, предназначенный для доставки нуклеиновой кислоты, носителя, нацеленного на специфическую клеточную нуклеиновую кислоту клетки, может содержать специфический связывающий лиганд в комбинации с липосомой. Нуклеиновая(ые) кислота(ы), предназначенная(ые) для доставки, содержится(атся) в липосоме, а специфический связывающий лиганд функционально включен в липосомную мембрану. Таким образом, липосома будет специфически связываться с рецептором(ами) клетки-мишени и доставлять содержимое в клетку. Было показано, что такие системы функционируют с помощью систем, в которых, например, в случае рецептор-опосредованной доставки нуклеиновой кислоты в клетки, которые демонстрируют активацию рецептора EGF, используется эпидермальный фактор роста (EGF).In other embodiments, a carrier component for delivering a nucleic acid, a carrier targeting a specific cellular nucleic acid of a cell, may contain a specific binding ligand in combination with a liposome. The nucleic acid(s) to be delivered is contained in a liposome and the specific binding ligand is operably incorporated into the liposomal membrane. Thus, the liposome will specifically bind to the receptor(s) of the target cell and deliver the contents to the cell. Such systems have been shown to function by systems in which, for example, in the case of receptor-mediated nucleic acid delivery to cells that exhibit EGF receptor activation, epidermal growth factor (EGF) is used.

В других вариантах осуществления компонент-носитель, предназначенный для доставки нуклеиновой кислоты, носителя целевой доставки может представлять собой саму липосому, которая предпочтительно будет содержать один или более липидов или гликопротеинов, которые направляют связывание с определенными клетками. Например, лактозилцерамид, галактозатерминальный асиалганглиозид, вводили в липосомы и наблюдал увеличение поглощения гена инсулина гепатоцитами (Nicolau et al., 1987). Предполагается, что тканеспецифичные трансформирующие конструкции по настоящему изобретению могут быть специфически доставлены в клетку-мишень аналогичным образом.In other embodiments, the carrier component for delivering the nucleic acid of the targeted delivery carrier may be the liposome itself, which preferably will contain one or more lipids or glycoproteins that direct binding to specific cells. For example, lactosylceramide, a galactose-terminal asialganglioside, was introduced into liposomes and an increase in uptake of the insulin gene by hepatocytes was observed (Nicolau et al., 1987). It is contemplated that the tissue-specific transform constructs of the present invention can be specifically delivered to a target cell in a similar manner.

11. Системы экспрессии11. Expression systems

Существуют многочисленные системы экспрессии, которые включают, по меньшей мере, часть или все раскрытые выше композиции. В настоящем изобретении для получения последовательностей нуклеиновых кислот или их родственных полипептидов, белков и пептидов могут использоваться прокариотческие и/или эукариотические системы. Многие такие системы являются широко распространенными и коммерчески доступными.Numerous expression systems exist that include at least some or all of the compositions disclosed above. In the present invention, prokaryotic and/or eukaryotic systems can be used to obtain nucleic acid sequences or their related polypeptides, proteins and peptides. Many such systems are widely used and commercially available.

Система на основе клеток насекомых/бакуловируса может обеспечить высокий уровень экспрессии белка в сегменте гетерологичной нуклеиновой кислоты, как описано в патентах США № 5871986 и 4879236, включенные в настоящее описание в качестве ссылки, которую можно приобрести, например, под названием MaxBac^® 2.0 у компании Invitrogen® и бакуловирусная система экспрессии BacPack^ТМ у компании Clontech®.An insect cell/baculovirus system can provide a high level of protein expression in a heterologous ^nucleic acid segment as described in US Pat. Invitrogen® and ^BacPackTM baculovirus expression system from Clontech®.

Другие примеры систем экспрессии включают систему Stratagene® Complete Control^ТМ индуцибельной экспрессии у млекопитающих, которая включает синтетический рецептор, индуцируемый экдизоном, или систему его экспрессии pET, экспрессируемую в E. coli. Другой пример системы индуцибельной экспрессии доступен от Invitrogen®, которая несет систему T-Rex^ТМ (регулируемую тетрациклином экспрессию), представляющую собой систему индуцибельной экспрессии у млекопитающих, в которой используется полноразмерный промотор CMV. Invitrogen® также предоставляет дрожжевую систему экспрессии, которая называется Pichia methanolica Expression System и предназначена для высоко эффективного продуцирования рекомбинантных белков в метилотрофных дрожжах Pichia methanolica. Для экспрессии раскрытых пролекарственных конструкций также можно использовать векторы pGEM-T Easy, плазмидные векторы pCon Vectors^TM, Lonza pConIgG1 или pConK2 и клетки 293 Freestyle или клетки Lonza CHO.Other exemplary expression systems include the Stratagene® Complete ControlTM ^mammalian inducible expression system, which includes a synthetic ecdysone-inducible receptor or pET expression system expressed in E. coli . Another example of an inducible expression system is available from Invitrogen®, which carries the T- ^RexTM (Tetracycline Regulated Expression) System, which is a mammalian inducible expression system that uses the full length CMV promoter. Invitrogen® also provides a yeast expression system called the Pichia methanolica Expression System, which is designed for highly efficient production of recombinant proteins in the methylotrophic yeast Pichia methanolica . The pGEM-T Easy vectors, pCon Vectors ^TM , Lonza pConIgG1 or pConK2 plasmid vectors, and 293 Freestyle cells or Lonza CHO cells can also be used to express the disclosed prodrug constructs.

Первичные культуры клеток млекопитающих могут быть получены различными способами. Чтобы клетки были жизнеспособными в условиях in vitro и в контакте с экспрессирующей конструкцией, необходимо обеспечить содержание клеток в условиях правильного соотношения кислорода и углекислого газа и питательных веществ и одновременно защитить их от микробного загрязнения. Методы культивирования клеток хорошо задокументированы.Primary cultures of mammalian cells can be obtained in various ways. In order for the cells to be viable in vitro and in contact with the expression construct, it is necessary to ensure that the cells are maintained under conditions of the correct ratio of oxygen and carbon dioxide and nutrients, and at the same time protect them from microbial contamination. Cell culture methods are well documented.

Один из вариантов осуществления вышеизложенного включает использование переноса генов для иммортализации клеток с целью продуцирования белков. Ген представляющего интерес белка может быть перенесен описанным выше методом в соответствующие клетки-хозяева с последующим культивированием клеток в соответствующих условиях. Таким образом можно использовать ген практически любого полипептида. Создание рекомбинантных векторов экспрессии и включенных в них элементов обсуждалось выше. Альтернативно, продуцируемый белок может быть эндогенным белком, обычно синтезируемым рассматриваемой клеткой.One embodiment of the foregoing involves using gene transfer to immortalize cells to produce proteins. The gene of interest for the protein can be transferred by the method described above into appropriate host cells, followed by culturing the cells under appropriate conditions. Thus, the gene of virtually any polypeptide can be used. The creation of recombinant expression vectors and the elements included therein has been discussed above. Alternatively, the protein produced may be an endogenous protein normally synthesized by the cell in question.

Примеры полезных линий клеток-хозяев млекопитающих представляют собой клетки Vero и HeLa и линии клеток яичника китайского хомяка, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, NIH3T3, RIN и MDCK. Кроме того, может быть выбран штамм клетки-хозяина, который модулирует экспрессию введенных последовательностей или модифицирует и процессирует продукт гена требуемым способом. Такие модификации (например, гликозилирование) и процессинг (например, расщепление) белковых продуктов могут быть важными для функционирования белка. Различные клетки-хозяева имеют характерные и специфические механизмы пост-трансляционного процессинга и модификации белков. Для обеспечения правильной модификации и процессинга экспрессированного чужеродного белка могут быть выбраны подходящие клеточные линии или системы-хозяева.Examples of useful mammalian host cell lines are Vero and HeLa cells and Chinese Hamster Ovary, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, NIH3T3, RIN and MDCK cell lines. In addition, a host cell strain can be selected that modulates the expression of the introduced sequences or modifies and processes the gene product in the desired manner. Such modifications (eg, glycosylation) and processing (eg, cleavage) of protein products may be important for protein function. Various host cells have characteristic and specific mechanisms for post-translational processing and modification of proteins. Appropriate cell lines or host systems can be selected to ensure correct modification and processing of the expressed foreign protein.

Можно использовать ряд систем отбора, включая, без ограничения, тимидинкиназу HSV, гены гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы и аденин-фосфорибозилтрансферазы в tk-, hgprt- или aprt-клетках, соответственно. Кроме того, устойчивость к метаболитам может быть использована в качестве основы для выбора dhfr, обеспечивающего устойчивость к; gpt, обеспечивающего устойчивость к микофенольной кислоте; neo, обеспечивающего устойчивость к аминогликозиду G418; и hygro, обеспечивающего устойчивость к гигромицину.A number of selection systems can be used, including, without limitation, HSV thymidine kinase, hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase, and adenine phosphoribosyltransferase genes in tk , hgprt , or aprt cells, respectively. In addition, metabolite resistance can be used as a basis for selecting a dhfr that provides resistance to; gpt providing resistance to mycophenolic acid; neo providing resistance to the aminoglycoside G418; and hygro providing resistance to hygromycin.

Е. ОчисткаE. Cleaning

В некоторых вариантах осуществления пролекарства интерферона по настоящему изобретению могут быть очищены. В контексте настоящего изобретения термин «очищенный» обозначает композицию, изолированную от других компонентов, в которой белок очищен до любой степени по сравнению с его состоянием в случае получения естественным образом. Следовательно, очищенный белок также относится к белку, свободному от среды, в которой он может встречаться в природе. Когда используется термин «по существу очищенный», это обозначение относится к композиции, в которой белок или пептид образует основной компонент композиции, например, белки в композиции составляют примерно 50%, примерно 60%, примерно 70%, примерно 80%, примерно 90%, примерно 95% или более.In some embodiments, the implementation of the interferon prodrugs of the present invention can be purified. In the context of the present invention, the term "purified" means a composition, isolated from other components, in which the protein is purified to any extent compared to its state when obtained naturally. Therefore, a purified protein also refers to a protein that is free from the environment in which it may occur naturally. When the term "substantially purified" is used, this designation refers to a composition in which a protein or peptide forms the main component of the composition, for example, proteins in the composition are about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, about 90% , about 95% or more.

Методы очистки белков хорошо известны специалистам в данной области. Эти методы включают, на одном уровне, грубое фракционирование клеточной среды с получением полипептидной и неполипептидной фракций. После отделения полипептида от других белков представляющий интерес полипептид может быть дополнительно очищен методами хроматографии и электрофореза для достижения частичной или полной очистки (или очистки до гомогенного состояния). Аналитические методы, особенно подходящие для получения чистого пептида, включают ионообменную хроматографию, эксклюзионную хроматографию; электрофорез в полиакриламидном геле; изоэлектрическое фокусирование. Другие способы очистки белка включают осаждение сульфатом аммония, ПЭГ, антителами и т.п. или термическую денатурацию с последующим центрифугированием; гель-фильтрацию, обращенно-фазовую, гидроксилапатитную и аффинную хроматографию; и комбинацию этих и других методов.Protein purification methods are well known to those skilled in the art. These methods include, at one level, coarse fractionation of the cell medium to obtain polypeptide and non-polypeptide fractions. After separating the polypeptide from other proteins, the polypeptide of interest can be further purified by chromatography and electrophoresis to achieve partial or complete purification (or purification to a homogeneous state). Analytical methods particularly suitable for obtaining a pure peptide include ion exchange chromatography, size exclusion chromatography; electrophoresis in polyacrylamide gel; isoelectric focusing. Other protein purification methods include precipitation with ammonium sulfate, PEG, antibodies, and the like. or thermal denaturation followed by centrifugation; gel filtration, reverse phase, hydroxyapatite and affinity chromatography; and a combination of these and other methods.

При очистке пролекарства интерферона по настоящему изобретению может потребоваться экспрессия полипептида в прокариотической или эукариотической системе экспрессии и экстракция белка в денатурирующих условиях. Полипептид может быть очищен от других клеточных компонентов с использованием аффинной колонки, которая связывает меченную часть полипептида. В данной области техники хорошо известно, что изменение порядка проведения различных стадий очистки или пропуск некоторых стадий также обеспечит подходящий способ получения по существу очищенного белка или пептида. Обычно антитела фракционируют с помощью агентов (т.е. белка А), которые связываются с Fc-частью антитела. В тех случаях, когда пролекарство интерферона содержит такой домен, может быть использован этот подход.Purification of an interferon prodrug of the present invention may require expression of the polypeptide in a prokaryotic or eukaryotic expression system and extraction of the protein under denaturing conditions. The polypeptide can be purified from other cellular components using an affinity column that binds the labeled portion of the polypeptide. It is well known in the art that reversing the order of the various purification steps, or skipping some steps, will also provide a suitable method for obtaining a substantially purified protein or peptide. Typically, antibodies are fractionated with agents (ie, protein A) that bind to the Fc portion of the antibody. In cases where the interferon prodrug contains such a domain, this approach can be used.

Специалистам в данной области техники известны различные способы количественного определения степени очистки белка или пептида, используемые в контексте настоящего изобретения. Они включают, например, определение удельной активности активной фракции или оценку количества полипептидов во фракции с помощью анализа, основанного на методах SDS/PAGE. Другой метод оценки чистоты фракции заключается в вычислении удельной активности фракции, сравнении ее с удельной активностью исходного экстракта и, таким образом, вычисления степени чистоты. Фактические единицы, используемые для представления количества активности, конечно, зависят от конкретного метода анализа, выбранного для последующей очистки, и от того, проявляет ли экспрессируемый белок или пептид детектируемую активность.Those skilled in the art are aware of various methods for quantifying the degree of purification of a protein or peptide used in the context of the present invention. These include, for example, determining the specific activity of the active fraction, or estimating the amount of polypeptides in the fraction using an analysis based on SDS/PAGE methods. Another method for assessing the purity of a fraction is to calculate the specific activity of the fraction, compare it with the specific activity of the original extract, and thus calculate the degree of purity. The actual units used to represent the amount of activity will, of course, depend on the particular assay method chosen for subsequent purification and whether the expressed protein or peptide exhibits detectable activity.

Известно, что миграция полипептида может изменяться, иногда значительно, в разных условиях SDS/PAGE (Capaldi et al., 1977). Поэтому следует понимать, что в разных условиях электрофореза кажущаяся молекулярная масса очищенных или частично очищенных продуктов экспрессии может варьировать.It is known that polypeptide migration can vary, sometimes significantly, under different SDS/PAGE conditions (Capaldi et al., 1977). Therefore, it should be understood that under different electrophoresis conditions, the apparent molecular weight of the purified or partially purified expression products may vary.

III. Фармацевтические составы и лечение ракаIII. Pharmaceutical formulations and cancer treatment

А. Раковые заболеванияA. Cancers

Рак возникает в результате роста клональной популяции клеток из ткани. Развитие рака, называемого канцерогенезом, можно смоделировать и охарактеризовать несколькими способами. Уже давно установлена связь между развитием рака и воспалением. Воспалительный ответ участвует в защите хозяина от микробной инфекции, а также способствует восстановлению и регенерации тканей. Имеются многочисленные свидетельства, указывающие на связь между воспалением и риском развития рака, т.е. хроническое воспаление может привести к дисплазии.Cancer results from the growth of a clonal population of cells from a tissue. The development of cancer, called carcinogenesis, can be modeled and characterized in several ways. The link between the development of cancer and inflammation has long been established. The inflammatory response is involved in host defense against microbial infection and also promotes tissue repair and regeneration. There is ample evidence that points to a link between inflammation and cancer risk, ie. chronic inflammation can lead to dysplasia.

Раковые клетки, к которым могут применяться способы по настоящему изобретению, обычно включают любую клетку, которая селективно экспрессирует протеазы, и, в частности, которая сверхэкспрессирует такие протеазы по сравнению с нормальными клетками. Подходящей раковой клеткой может быть рак молочной железы, рак легкого, рак толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак почки, рак желудка, рак печени, рак кости, гематологический рак (например, лейкоз или лимфома), рак нервной ткани, меланома, рак яичника, рак яичка, рак предстательной железы, рак шейки матки, рак влагалища или рак мочевого пузыря. Кроме того, способы по изобретению могут быть применены к широкому кругу видов, например людям, приматам, не являющимся человеком (например, обезьянам, павианам или шимпанзе), лошадям, крупному рогатому скоту, свиньям, овцам, козам, собакам, кошкам, кроликам, морским свинкам, песчанкам, хомякам, крысам и мышам. Рак также может быть рецидивирующим, метастатическим и/или устойчивым ко многим лекарственным средствам, и способы по настоящему изобретению могут быть в частности применимы к таким раковым заболеваниям для обеспечения возможности осуществления резекции, пролонгирования или реиндуцирования ремиссии, подавления ангиогенеза, предотвращения или ограничения метастазирования и/или для лечения рака, устойчивого ко многим лекарственным средствам. На клеточном уровне это может привести к уничтожению раковых клеток, ингибированию роста раковых клеток или реверсии или уменьшению злокачественного фенотипа опухолевых клеток.Cancer cells to which the methods of the present invention may be applied generally include any cell that selectively expresses proteases, and in particular that overexpresses such proteases over normal cells. A suitable cancer cell may be breast cancer, lung cancer, colon cancer, pancreatic cancer, kidney cancer, stomach cancer, liver cancer, bone cancer, hematological cancer (eg leukemia or lymphoma), nervous tissue cancer, melanoma, ovarian cancer. , testicular cancer, prostate cancer, cervical cancer, vaginal cancer, or bladder cancer. In addition, the methods of the invention can be applied to a wide range of species, such as humans, non-human primates (e.g. monkeys, baboons or chimpanzees), horses, cattle, pigs, sheep, goats, dogs, cats, rabbits, guinea pigs, gerbils, hamsters, rats and mice. Cancer may also be recurrent, metastatic and/or multidrug resistant, and the methods of the present invention may be particularly applicable to such cancers to enable resection, prolong or reinduce remission, suppress angiogenesis, prevent or limit metastasis, and/ or for the treatment of multi-drug resistant cancer. At the cellular level, this can lead to the destruction of cancer cells, inhibition of cancer cell growth, or reversal or reduction of the malignant phenotype of tumor cells.

B. Состав и введениеB. Composition and introduction

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим пролекарства интерферона. В конкретном варианте осуществления термин «фармацевтически приемлемый» означает одобренный регулирующим органом федерального правительства или правительства штата или внесенный в список фармакопеи США или другой общепризнанной фармакопеи для применения на животных и, более конкретно, на людях. Термин «носитель» относится к разбавителю, наполнителю или несущей среде, с которой вводится терапевтическое средство. Такими фармацевтическими носителями могут быть стерильные жидкости, такие как вода и масла, включая масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. Другие подходящие фармацевтические наполнители включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, физиологический раствор, декстрозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и т.п.The present invention relates to pharmaceutical compositions containing interferon prodrugs. In a particular embodiment, the term "pharmaceutically acceptable" means approved by a federal or state government regulatory agency or listed in the USP or other generally accepted pharmacopeia for use in animals, and more specifically, in humans. The term "carrier" refers to a diluent, excipient, or carrier vehicle with which a therapeutic agent is administered. Such pharmaceutical carriers may be sterile liquids such as water and oils, including petroleum, animal, vegetable or synthetic oils such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil, and the like. Other suitable pharmaceutical excipients include starch, glucose, lactose, sucrose, saline, dextrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, skimmed milk powder, glycerin, propylene glycol, water , ethanol, etc.

Композиции могут быть приготовлены в виде нейтральных или солевых форм. Фармацевтически приемлемые соли включают соли, образованные с анионами, такими как соли, полученные из соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой и винной кислот и т.д., а также соли, образованные с катионами, такими как соли, полученные из гидроксидов натрия, калия, аммония, кальция, трехвалентного железа, изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, прокаина и др.The compositions may be prepared in neutral or salt forms. Pharmaceutically acceptable salts include salts formed with anions, such as those derived from hydrochloric, phosphoric, acetic, oxalic and tartaric acids, etc., as well as salts formed with cations, such as those derived from sodium, potassium hydroxides. , ammonium, calcium, ferric iron, isopropylamine, triethylamine, 2-ethylaminoethanol, histidine, procaine, etc.

Антитела по настоящему изобретению могут включать классические фармацевтические препараты. Введение этих композиций по настоящему изобретению может осуществляться любым обычным путем при условии, что этот путь обеспечит доступ к целевой ткани. Такой путь включает пероральный, назальный, буккальный, ректальный, вагинальный или топический. Альтернативно, введение может быть внутрикожным, подкожным, внутримышечным, внутрибрюшинным или внутривенным введением. Такие композиции обычно вводят в виде фармацевтически приемлемых композиций, описанных выше. Особый интерес представляет введение непосредственно внутрь опухоли, перфузия опухоли или введение локально или регионарно относительно опухоли, например, в локальную или региональную сосудистую сеть или лимфатическую систему или в ложе резецированной опухоли. The antibodies of the present invention may include classical pharmaceutical preparations. The introduction of these compositions of the present invention can be carried out by any conventional route, provided that this route provides access to the target tissue. Such a route includes oral, nasal, buccal, rectal, vaginal or topical. Alternatively, administration may be intradermal, subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal, or intravenous. Such compositions are typically administered as the pharmaceutically acceptable compositions described above. Of particular interest is administration directly into the tumor, perfusion of the tumor, or administration locally or regionally relative to the tumor, for example, into the local or regional vasculature or lymphatic system, or into the bed of the resected tumor.

Активные соединения также можно вводить парентерально или внутрибрюшинно. Растворы активных соединений в виде свободного основания или фармакологически приемлемых солей могут быть приготовлены в воде, подходящим образом смешанной с поверхностно-активным веществом, таким как гидроксипропилцеллюлоза. Также могут быть приготовлены дисперсии в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях и в маслах. В обычных условиях хранения и использования эти препараты содержат консервант для предотвращения роста микроорганизмов.The active compounds can also be administered parenterally or intraperitoneally. Solutions of the active compounds as free base or pharmacologically acceptable salts can be prepared in water suitably mixed with a surfactant such as hydroxypropyl cellulose. Dispersions can also be prepared in glycerol, liquid polyethylene glycols and mixtures thereof, and in oils. Under normal conditions of storage and use, these preparations contain a preservative to prevent the growth of microorganisms.

C. Комбинированная терапияC. Combination therapy

В контексте настоящего изобретения также предполагается, что описанные в настоящей заявке пролекарства интерферона могут быть использованы аналогично в сочетании с иммуно-, химио- или радиотерапевтическим вмешательством или другими видами лечения. Также может оказаться эффективным, в частности, комбинирование пролекарства интерферона с другими методами лечения, которые нацелены на разные аспекты функционирования раковых клеток.In the context of the present invention, it is also contemplated that the interferon prodrugs described herein can be used similarly in combination with immuno-, chemo- or radiotherapy intervention or other treatments. It may also be effective, in particular, to combine an interferon prodrug with other therapies that target different aspects of cancer cell function.

Для уничтожения клеток, ингибирования роста клеток, ингибирования метастазирования, ингибирования ангиогенеза или, с другой стороны, достижения реверсии или уменьшения злокачественного фенотипа опухолевых клеток с помощью способов и композиций по настоящему изобретению обычно клетку-мишень необходимо привести в контакт с пролекарствами интерферона по настоящему изобретению и, по меньшей мере, одним другим агентом. Эти композиции могут быть предоставлены в комбинированном количестве, эффективном для уничтожения или подавления пролиферации клетки. Этот процесс может включать приведение в контакт клеток с пролекарствами интерферона по настоящему изобретению и другим агентом(ами) или фактором(ами) одновременно. Это может быть достигнуто путем приведения в контакт клетки с одной композицией или фармакологическим составом, который включает оба агента, или путем приведения клетки в контакт одновременно с двумя разными композициями или составами, причем одна композиция включает пролекарства интерферона по настоящему изобретению, а другая включает другой агент.In order to kill cells, inhibit cell growth, inhibit metastasis, inhibit angiogenesis, or alternatively achieve reversal or reduction of the malignant phenotype of tumor cells using the methods and compositions of the present invention, it is generally necessary to contact the target cell with the interferon prodrugs of the present invention and with at least one other agent. These compositions may be provided in a combined amount effective to kill or inhibit cell proliferation. This process may include bringing the cells into contact with the interferon prodrugs of the present invention and other agent(s) or factor(s) at the same time. This can be achieved by contacting the cell with one composition or formulation that includes both agents, or by contacting the cell simultaneously with two different compositions or formulations, one composition comprising the interferon prodrugs of the present invention and the other comprising the other agent. .

Альтернативно, терапия пролекарством интерферона может предшествовать или следовать за лечением другим агентом с интервалами в пределах от минут до недель. В вариантах осуществления, в которых другой агент и пролекарства интерферона вводят в клетку по отдельности, обычно предусмотрено, чтобы доставки не были разделены значительным промежутком времени, что обеспечивает возможность комбинированного влияния обоих агентов на клетку. В таких случаях предполагается, что контактирование клетки с обоими модальностями осуществляется с промежутком между введениями в пределах примерно 12-24 и, более предпочтительно, в пределах примерно 6-12 часов, причем наиболее предпочтительно, когда время задержки составляет всего примерно 12 часов. В некоторых ситуациях может потребоваться значительное продление периода лечения, однако в этом случае интервал между соответствующими введениями составляет от нескольких дней (2, 3, 4, 5, 6 или 7) до нескольких недель (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8).Alternatively, therapy with an interferon prodrug may precede or follow treatment with another agent at intervals ranging from minutes to weeks. In embodiments in which the other agent and the interferon prodrugs are administered separately to the cell, it is generally provided that the deliveries are not separated by a significant amount of time, allowing the combined effect of both agents on the cell. In such instances, contacting the cell with both modalities is expected to occur with an interval between administrations of between about 12-24 and more preferably within about 6-12 hours, most preferably with a delay time of only about 12 hours. In some situations, a significant extension of the treatment period may be required, however, in this case, the interval between the respective injections ranges from several days (2, 3, 4, 5, 6 or 7) to several weeks (1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7 or 8).

Также может потребоваться более одного введения пролекарств интерферона или другого агента. Могут быть использованы различные комбинации, где пролекарство интерферона по настоящему изобретению представляет собой «А», а другой вид терапии представляет собой «В», как показано ниже:More than one administration of interferon prodrugs or other agent may also be required. Various combinations may be used where the interferon prodrug of the present invention is "A" and the other therapy is "B", as shown below:

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/BA/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/B

A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/AA/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A

A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/BA/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B

Предусмотрены и другие комбинации. И в этом случае следует отметить, что для уничтожения клеток оба агента доставляют в клетку в комбинированном количестве, эффективном для уничтожения клетки.Other combinations are also provided. Again, it should be noted that in order to kill cells, both agents are delivered to the cell in a combined amount effective to kill the cell.

Агенты или факторы, подходящие для лечения рака, включают любое химическое соединение или способ лечения, который вызывает повреждение ДНК при введении в клетку. Такие агенты и факторы включают излучение и волны, вызывающие повреждение ДНК, такие как облучение, микроволны, электронное излучение и т.п. Можно использовать различные химические соединения, также называемые «химиотерапевтическими» или «генотоксическими агентами». Это может быть достигнуто путем облучения локализованного участка с опухолью; альтернативно, опухолевые клетки можно приводить в контакт с агентом путем введения пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции.Agents or factors suitable for the treatment of cancer include any chemical compound or treatment that causes DNA damage when introduced into a cell. Such agents and factors include DNA damaging radiation and waves such as irradiation, microwaves, electron radiation, and the like. You can use a variety of chemical compounds, also called "chemotherapeutic" or "genotoxic agents". This can be achieved by irradiating the localized area with the tumor; alternatively, the tumor cells can be brought into contact with the agent by administering to the patient a therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition.

Для использования в настоящем изобретении предлагаются различные классы химиотерапевтических агентов. Например, селективные антагонисты рецептора эстрогена («SERM»), такие как тамоксифен, 4-гидрокситамоксифен (афимоксфен), фальсодекс, ралоксифен, базедоксифен, кломифен, фемарель, лазофоксифен, ормелоксифен и торемифен.Various classes of chemotherapeutic agents are provided for use in the present invention. For example, selective estrogen receptor antagonists ("SERMs") such as tamoxifen, 4-hydroxy tamoxifen (afimoxfen), falsodex, raloxifene, bazedoxifene, clomiphene, femarel, lasofoxifene, ormeloxifene, and toremifene.

Химиотерапевтические агенты, предлагаемые для использования, включают, например, камптотецин, актиномицин D, митомицин С. Изобретение также включает применение комбинации одного или более агентов, повреждающих ДНК, либо радиоактивные, либо фактические соединения, такие как применение рентгеновского излучения с цисплатином или применение цисплатина с этопозидом. Агент может быть приготовлен и использован в виде комбинированной терапевтической композиции.Chemotherapeutic agents contemplated for use include, for example, camptothecin, actinomycin D, mitomycin C. The invention also includes the use of a combination of one or more DNA damaging agents, either radioactive or actual compounds, such as the use of x-rays with cisplatin or the use of cisplatin with etoposide. The agent may be formulated and used as a combination therapeutic composition.

Белок теплового шока 90 является регуляторным белком, обнаруженным во многих эукариотических клетках. Было показано, что ингибиторы HSP90 полезны при лечении рака. Такие ингибиторы включают гелданамицин, 17-(аллиламино)-17-деметоксигельданамицин, PU-H71 и рифабутин.Heat shock protein 90 is a regulatory protein found in many eukaryotic cells. HSP90 inhibitors have been shown to be useful in the treatment of cancer. Such inhibitors include geldanamycin, 17-(allylamino)-17-demethoxygeldanamycin, PU-H71 and rifabutin.

Также предусмотрены агенты, которые непосредственно осуществляют поперечную сшивку ДНК или образуют аддукты. Могут быть использованы такие агенты, как цисплатин и другие ДНК-алкилирующие агенты. Цисплатин широко используется для лечения рака, при этом дозы, эффективные для клинического применения, составляют 20 мг/м² в течение 5 дней каждые три недели в течение всех трех курсов. Цисплатин не всасывается перорально и поэтому должен вводиться путем внутривенной, подкожной, внутриопухолевой или внутрибрюшинной инъекции.Also contemplated are agents that directly cross-link DNA or form adducts. Agents such as cisplatin and other DNA alkylating agents may be used. Cisplatin is widely used in the treatment of cancer, with doses effective for clinical use being 20 mg/m ² for 5 days every three weeks for all three courses. Cisplatin is not absorbed orally and therefore must be administered by intravenous, subcutaneous, intratumoral, or intraperitoneal injection.

Агенты, повреждающие ДНК, также включают соединения, которые препятствуют репликации ДНК, митозу и сегрегации хромосом. Такие химиотерапевтические соединения включают адриамицин, также известный как доксорубицин, этопозид, верапамил, подофиллотоксин и т.п. Широко используемые в клинических условиях для лечения новообразований, эти соединения вводят внутривенно в виде болюсной дозы от 25-75 мг/м² с интервалами 21 день для доксорубицина, до 35-50 мг/м² для этопозида, вводимого внутривенно или перорально в дозе, двукратно превышающей внутривенную дозу. Также предусмотрено введение ингибиторов микротрубочек, таких как таксаны. Эти молекулы представляют собой дитерпены, продуцируемые растениями рода Taxus, и включают паклитаксел и доцетаксел.DNA damaging agents also include compounds that interfere with DNA replication, mitosis, and chromosome segregation. Such chemotherapeutic compounds include adriamycin, also known as doxorubicin, etoposide, verapamil, podophyllotoxin, and the like. Widely used clinically for the treatment of neoplasms, these compounds are administered intravenously as bolus doses ranging from 25-75 mg/m ² at 21-day intervals for doxorubicin, to 35-50 mg/m ² for etoposide administered intravenously or orally at a dose twice the intravenous dose. Also contemplated is the administration of microtubule inhibitors such as taxanes. These molecules are diterpenes produced by plants of the genus Taxus , and include paclitaxel and docetaxel.

Ингибиторы рецептора эпидермального фактора роста, такие как иресса, mTOR, мишень рапамицина у млекопитающих, также известная как комплекс FK506-связывающего белка 12 с рапамицин-ассоциированным белком 1 (FRAP1), представляющая собой серин/треонин-протеинкиназу, регулируют рост клеток, пролиферацию клеток, подвижность клеток, выживание клеток, синтез белка и транскрипцию. Следовательно, рапамицин и его аналоги («рапалоги») также предусмотрены для применения в терапии рака в соответствии с настоящим изобретением.Epidermal growth factor receptor inhibitors such as iressa, mTOR, the mammalian target of rapamycin, also known as the FK506-binding protein 12 complex with rapamycin-associated protein 1 (FRAP1), which is a serine/threonine protein kinase, regulate cell growth, cell proliferation , cell motility, cell survival, protein synthesis and transcription. Therefore, rapamycin and its analogues ("rapalogues") are also contemplated for use in cancer therapy in accordance with the present invention.

Другим возможным терапевтическим агентом является TNF-α (фактор некроза опухоли-альфа), цитокин, участвующий в системном воспалении, и член группы цитокинов, которые стимулируют реакцию острой фазы. Основная роль TNF заключается в регуляции иммунных клеток. TNF также способен вызывать апоптотическую гибель клеток, воспаление и ингибировать онкогенез и репликацию вируса.Another possible therapeutic agent is TNF-α (tumor necrosis factor-alpha), a cytokine involved in systemic inflammation and a member of a group of cytokines that stimulate the acute phase response. The main role of TNF is in the regulation of immune cells. TNF is also capable of inducing apoptotic cell death, inflammation, and inhibiting oncogenesis and viral replication.

Агенты, которые нарушают синтез и точность вспроизведения предшественников нуклеиновых кислот и субъединиц, также приводят к повреждению ДНК. В качестве такового был разработан ряд предшественников нуклеиновых кислот. Особенно полезными являются агенты, которые прошли всевозможное тестирование и являются легко доступными. По существу, такие агенты, как 5-фторурацил (5-FU), предпочтительно используются опухолевой тканью, что делает этот агент особенно полезным для нацеливания на опухолевые клетки. Несмотря на то, что 5-FU является достаточно токсичным, его применяют для широкого круга носителей, включая топические, однако обычно используется внутривенное введение в дозах от 3 до 15 мг/кг/сутки.Agents that interfere with the synthesis and fidelity of nucleic acid precursors and subunits also cause DNA damage. As such, a number of nucleic acid precursors have been developed. Particularly useful are agents that have been extensively tested and are readily available. As such, agents such as 5-fluorouracil (5-FU) are preferentially utilized by the tumor tissue, making this agent particularly useful for targeting tumor cells. Although 5-FU is quite toxic, it is used in a wide range of vehicles, including topical, but intravenous administration at doses of 3 to 15 mg/kg/day is commonly used.

Другие широко используемые факторы, вызывающие повреждение ДНК, включают факторы, обычно называемые γ-лучами, рентгеновскими лучами и/или направленной доставкой радиоизотопов в опухолевые клетки. Также предусмотрены другие формы факторов, повреждающих ДНК, такие как микроволны и УФ-излучение. Наиболее вероятно, что все эти факторы обеспечивают широкий спектр повреждений ДНК, предшественников ДНК, репликации и репарации ДНК, а также повреждения при сборке и поддержании хромосом. Диапазон доз используемых рентгеновских лучей варьирует от суточных доз от 50 до 200 рентген в течение продолжительных периодов времени (от 3 до 4 недель) до разовых доз от 2000 до 6000 рентген. Диапазоны доз для радиоизотопов варьируют в широких пределах и зависят от периода полураспада изотопа, силы и типа испускаемого излучения и поглощения опухолевыми клетками.Other commonly used factors that cause DNA damage include factors commonly referred to as γ-rays, x-rays and/or targeted delivery of radioisotopes to tumor cells. Other forms of DNA damaging factors such as microwaves and UV radiation are also contemplated. It is most likely that all these factors provide a wide range of damage to DNA, DNA precursors, DNA replication and repair, as well as damage to the assembly and maintenance of chromosomes. The range of doses of x-rays used varies from daily doses of 50 to 200 roentgens for extended periods of time (3 to 4 weeks) to single doses of 2000 to 6000 roentgens. Dose ranges for radioisotopes vary widely and depend on the half-life of the isotope, the strength and type of radiation emitted, and absorption by tumor cells.

Кроме того, также предусмотрено возможное применение иммунотерапии, гормонотерапии, токсинотерапии и хирургического вмешательства. В частности, можно использовать препараты таргетной терапии, такие как авастин, эрбитукс, гливек, герцептин и ритуксан.In addition, the possible use of immunotherapy, hormone therapy, toxin therapy and surgical intervention is also envisaged. In particular, targeted therapies such as Avastin, Erbitux, Gleevec, Herceptin and Rituxan can be used.

Специалист в данной области может использовать руководство «Remington's Pharmaceutical Sciences», 15-е издание, глава 33, в частности, стр. 624-652. Как правило, дозу корректируют в зависимости от состояния пациента, получающего лечение. Лицо, ответственное за введение, в любом случае, способно подобрать подходящую дозу для индивидуального пациента. Кроме того, для введения человеку препараты должны соответствовать стандартам стерильности, пирогенности, общей безопасности и чистоты, которые определенны стандартами департамента FDA по биологическим препаратам.One of skill in the art may use Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th edition, chapter 33, in particular pp. 624-652. As a rule, the dose is adjusted depending on the condition of the patient receiving treatment. The person responsible for administration is in any case able to select the appropriate dose for the individual patient. In addition, for human administration, preparations must meet the standards of sterility, pyrogenicity, general safety, and purity as defined by the FDA Department of Biological Substances Standards.

IV. Методы детектирования протеазIV. Protease detection methods

В других вариантах осуществления может возникнуть необходимость в определении природы и количества экспрессируемых протеаз в целевой раковой клетке или опухоли, что позволит подобрать конкретное пролекарство интерферона, которое будет активировано в опухоли пациента с высокой вероятностью. В целом, существует три подхода к такому детектированию: иммунологическое детектирование, например, с помощью протеаз-специфических антител, детектирование с помощью мРНК и анализ активности протеазы.In other embodiments, it may be necessary to determine the nature and amount of proteases expressed in the target cancer cell or tumor, which will allow the selection of a particular interferon prodrug that is highly likely to be activated in the patient's tumor. In general, there are three approaches to such detection: immunological detection, for example, using protease-specific antibodies, mRNA detection, and analysis of protease activity.

А. ИммунодетектированиеA. Immunodetection

Методы иммунодетектирования для идентификации и количественного определения протеаз могут включать, среди прочего, иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммуноанализ (RIA), иммунорадиометрический анализ, флюороиммуноанализ, хемилюминесцентный анализ, биолюминесцентный анализ и вестерн-блот анализ. Этапы различных полезных методов иммунодетектирования описаны в научной литературе, см., например, Doolittle and Ben-Zeev (1999), Gulbis and Galand (1993), De Jager et al. (1993) и Nakamura et al. (1987). Методы иммуноблоттинга, как правило, включают получение образца и приведение образца в контакт с первым антителом в соответствии с вариантами осуществления, обсуждаемыми в настоящем описании, в условиях, эффективных для образования иммунокомплексов.Immunodetection methods for identifying and quantifying proteases may include, among others, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), immunoradiometric assay, fluoroimmunoassay, chemiluminescence assay, bioluminescence assay, and Western blot assay. The steps of various useful immunodetection methods are described in the scientific literature, see, for example, Doolittle and Ben-Zeev (1999), Gulbis and Galand (1993), De Jager et al. (1993) and Nakamura et al. (1987). Western blot methods typically involve obtaining a sample and contacting the sample with a first antibody, according to the embodiments discussed herein, under conditions effective to form immunocomplexes.

Контактирование выбранного биологического образца с антителом в эффективных условиях и в течение периода времени, достаточного для образования иммунных комплексов (первичных иммунных комплексов), обычно заключается в простом добавлении композиции антитела к образцу и инкубации смеси в течение некоторого периода времени, достаточного для того, чтобы антитела образовали иммунные комплексы, т.е. связались с присутствующей протеазой. По истечении этого времени композицию образец-антитело, такую как на срезе ткани, в планшете для ELISA, дот-блоттинга или вестерн-блоттинга, обычно промывают для удаления любых неспецифически связанных видов антител, что обеспечивает обнаружение только тех антител, которые специфически связаны в первичных иммунных комплексах.Contacting a selected biological sample with an antibody under effective conditions and for a period of time sufficient to form immune complexes (primary immune complexes) usually consists of simply adding the antibody composition to the sample and incubating the mixture for a period of time sufficient for the antibodies to formed immune complexes, i.e. bound to the protease present. After this time, the sample-antibody composition, such as on a tissue section, in an ELISA plate, dot blot, or Western blot, is typically washed to remove any non-specifically bound antibody species, ensuring that only those antibodies that are specifically bound in the primary are detected. immune complexes.

Обнаружение образования иммунокомплекса обычно хорошо известно в данной области и может быть выполнено путем применения многочисленных подходов. Эти методы обычно основаны на обнаружении метки или маркера, например, любой из радиоактивных, флуоресцентных, биологических и ферментных меток. Патенты, касающиеся применения таких меток, включают патенты США 3817837, 3850752, 3939350, 3996345, 4277437, 4275149 и 4366241. Конечно, использования вторичного связывающего лиганда, такого как второе антитело, и/или биотин/авидин-связывающего лиганда, известного в данной области, может обеспечить дополнительные преимущества.Detection of immunocomplex formation is generally well known in the art and can be accomplished using numerous approaches. These methods are usually based on the detection of a label or marker, such as any of the radioactive, fluorescent, biological, and enzyme labels. Patents relating to the use of such labels include US Pat. may provide additional benefits.

Антитело, используемое для обнаружения, само может быть связано с детектируемой меткой, которая затем может быть легко обнаружена, тем самым позволяя определить количество первичных иммунных комплексов в композиции. Альтернативно, первое антитело, которое становится связанным в первичных иммунных комплексах, может быть обнаружено с помощью второго связывающего лиганда, который имеет сродство связывания с антителом. В этих случаях второй связывающий лиганд может быть связан с детектируемой меткой. Второй связывающий лиганд сам по себе часто является антителом, которое соотвественно можно назвать «вторичным» антителом. Первичные иммунные комплексы контактируют с меченым, вторичным связывающим лигандом или антителом в эффективных условиях и в течение периода времени, достаточного для образования вторичных иммунных комплексов. Вторичные иммунные комплексы затем обычно промывают для удаления любых неспецифически связанных меченых вторичных антител или лигандов, и затем выполняют детектирование оставшейся метки во вторичных иммунных комплексах.The antibody used for detection can itself be associated with a detectable label, which can then be easily detected, thereby allowing the amount of primary immune complexes in the composition to be determined. Alternatively, the first antibody that becomes bound in the primary immune complexes can be detected by a second binding ligand that has a binding affinity for the antibody. In these cases, the second binding ligand may be associated with a detectable label. The second binding ligand itself is often an antibody, which can appropriately be called a "secondary" antibody. Primary immune complexes are contacted with a labeled, secondary binding ligand or antibody under effective conditions and for a period of time sufficient to form secondary immune complexes. Secondary immune complexes are then typically washed to remove any non-specifically bound labeled secondary antibodies or ligands, and then detection of the remaining label in the secondary immune complexes is performed.

Дополнительные методы включают обнаружение первичных иммунных комплексов с помощью двухэтапного подхода. Второй связывающий лиганд, такой как антитело, которое имеет сродство связывания с антителом, используется для образования описанных выше вторичных иммунных комплексов. После промывки вторичные иммунные комплексы приводят в контакт с третьим связывающим лигандом или антителом, которое обладает сродством связывания со вторым антителом, снова в эффективных условиях и в течение периода времени, достаточного для образования иммунных комплексов (третичных иммунных комплексов). Третий лиганд или антитело связывается с детектируемой меткой, обеспечивая возможность детектирования образованных таким образом третичных иммунных комплексов. При необходимости, эта система может обеспечивать усиление сигнала.Additional methods include the detection of primary immune complexes using a two-step approach. A second binding ligand, such as an antibody that has a binding affinity for the antibody, is used to form the secondary immune complexes described above. After washing, the secondary immune complexes are contacted with a third binding ligand or antibody that has binding affinity for the second antibody, again under effective conditions and for a period of time sufficient to form immune complexes (tertiary immune complexes). The third ligand or antibody binds to the detectable label, allowing detection of the thus formed tertiary immune complexes. If necessary, this system can provide signal amplification.

В одном из методов иммунодетектирования используются два разных антитела. Первое биотинилированное антитело используется для обнаружения антигена-мишени, а затем используется второе антитело для обнаружения биотина, связанного с биотином, находящемся в комплексе. В этом методе тестируемый образец сначала инкубируют в растворе, содержащем антитело первого этапа. Если целевой антиген присутствует, часть антитела связывается с антигеном с образованием биотинилированного комплекса антитело/антиген. Затем комплекс антитело/антиген амплифицируют путем инкубации в последовательных растворах стрептавидина (или авидина), биотинилированной ДНК и/или комплементарной биотинилированной ДНК, при этом каждый этап добавляет дополнительные сайты биотина к комплексу антитело/антиген. Стадии амплификации повторяют до тех пор, пока не будет достигнут подходящий уровень амплификации, после чего образец инкубируют в растворе, содержащем антитело к биотину второго этапа. Это антитело второго этапа метят, например, ферментом, который можно использовать для обнаружения комплекса антитело/антиген гистоферментативным методом с помощью хромогенного субстрата. При подходящей амплификации может быть получен макроскопически видимый конъюгат.One method of immunodetection uses two different antibodies. The first biotinylated antibody is used to detect the target antigen and then the second antibody is used to detect the biotin associated with the complexed biotin. In this method, the test sample is first incubated in a solution containing the first step antibody. If the target antigen is present, the antibody portion binds to the antigen to form a biotinylated antibody/antigen complex. The antibody/antigen complex is then amplified by incubation in successive solutions of streptavidin (or avidin), biotinylated DNA, and/or complementary biotinylated DNA, with each step adding additional biotin sites to the antibody/antigen complex. The amplification steps are repeated until a suitable level of amplification is reached, after which the sample is incubated in a solution containing second step anti-biotin antibody. This second step antibody is labeled with, for example, an enzyme that can be used to detect an antibody/antigen complex by histoenzymatic assay using a chromogenic substrate. With suitable amplification, a macroscopically visible conjugate can be obtained.

В другом известном методе иммунодетектирования используются преимущества метода иммуно-ПЦР (полимеразной цепной реакции). Метод ПЦР аналогичен методу Кантора вплоть до инкубации с биотинилированной ДНК, однако вместо использования нескольких циклов инкубации со стрептавидином и биотинилированной ДНК комплекс ДНК/биотин/стрептавидин/антитело вымывается буфером с низким pH или высоким содержанием соли с высвобождением антитела. Затем полученный промывочный раствор используют для проведения реакции ПЦР с подходящими праймерами с соответствующими контролями. По меньшей мере, теоретически, мощная амплификационная способность и специфичность ПЦР позволяют обнаружить одну молекулу антигена.Another known immunodetection method takes advantage of the immuno-PCR (polymerase chain reaction) method. The PCR method is similar to the Cantor method up to incubation with biotinylated DNA, however, instead of using several cycles of incubation with streptavidin and biotinylated DNA, the DNA/biotin/streptavidin/antibody complex is washed out with a low pH or high salt buffer to release the antibody. The resulting wash solution is then used to carry out the PCR reaction with the appropriate primers with appropriate controls. At least theoretically, the powerful amplification ability and specificity of PCR allows detection of a single antigen molecule.

В одном из примеров ELISA антитела по изобретению иммобилизуют на выбранной поверхности, проявляющей сродство к белку, такой как лунка в полистирольном микротитровальном планшете. Затем тестируемую композицию, предположительно содержащую протеазу, добавляют в лунки. После связывания и промывки для удаления неспецифически связанных иммунных комплексов, может быть обнаружен связанный антиген. Обнаружение может быть достигнуто путем добавления другого антитела к протеазе, которое связывается с детектируемой меткой. Этот тип ELISA представляет собой простой «сэндвич-ELISA». Обнаружение также может быть достигнуто путем добавления второго антитела к протеазе с последующим добавлением третьего антитела, которое имеет сродство связывания со вторым антителом, причем третье антитело связано с детектируемой меткой.In one example of an ELISA, antibodies of the invention are immobilized on a selected surface that exhibits affinity for a protein, such as a well in a polystyrene microtiter plate. Then the test composition, presumably containing the protease, is added to the wells. After binding and washing to remove non-specifically bound immune complexes, bound antigen can be detected. Detection can be achieved by adding another anti-protease antibody that binds to a detectable label. This type of ELISA is a simple "sandwich ELISA". Detection can also be achieved by adding a second antibody to the protease followed by adding a third antibody that has a binding affinity for the second antibody, the third antibody being bound to a detectable label.

В другом приведенном в качестве примера методе ELISA образцы, предположительно содержащие протеазу, иммобилизуют на поверхности лунки и затем приводят в контакт с антителом к протеазе. После связывания и промывки для удаления неспецифически связанных иммунных комплексов выполняют обнаружение связанных антител к протеазе. Если исходные антитела к протеазе связаны с детектируемой меткой, это позволяет непосредственное обнаружение иммунных комплексов. И в этом случае, иммунные комплексы могут быть обнаружены с помощью второго антитела, которое имеет сродство связывания с первым антителом к протеазе, причем второе антитело связывается с детектируемой меткой.In another exemplary ELISA method, samples suspected of containing a protease are immobilized on the surface of a well and then contacted with an anti-protease antibody. After binding and washing to remove non-specifically bound immune complexes, detection of bound anti-protease antibodies is performed. If the parent anti-protease antibodies are bound to a detectable label, this allows direct detection of immune complexes. Again, immune complexes can be detected with a second antibody that has a binding affinity for the first antibody for the protease, the second antibody binding to the detectable label.

Независимо от используемого формата, методы ELISA имеют определенные общие черты, такие как покрытие, инкубация и связывание, промывка для удаления неспецифически связанных видов и детектирование связанных иммунных комплексов. Они описаны ниже.Regardless of the format used, ELISA methods share certain common features such as coating, incubation and binding, washing to remove non-specifically bound species, and detection of bound immune complexes. They are described below.

При покрытии планшета антигеном или антителом, как правило, лунки планшета инкубируют с раствором антигена или антитела либо в течение ночи, либо в течение определенного периода времени. Затем лунки планшета промывают для удаления не полностью адсорбированного материала. Затем любые оставшиеся доступные поверхности лунок «покрывают» неспецифическим белком, который является антигенно нейтральным по отношению к тестируемой антисыворотке. К ним относятся бычий сывороточный альбумин (БСА), казеин или растворы сухого молока. Покрытие позволяет блокировать сайты неспецифической адсорбции на иммобилизующей поверхности и, таким образом, уменьшает фон, вызванный неспецифическим связыванием антисыворотки на поверхности.When coating a plate with an antigen or antibody, typically the wells of the plate are incubated with a solution of the antigen or antibody, either overnight or for a specified period of time. The wells of the plate are then washed to remove incompletely adsorbed material. Any remaining accessible well surfaces are then "coated" with a non-specific protein that is antigenically neutral to the antiserum being tested. These include bovine serum albumin (BSA), casein or powdered milk solutions. The coating makes it possible to block non-specific adsorption sites on the immobilizing surface and thus reduces the background caused by non-specific binding of antiserum to the surface.

В методах ELISA, по всей видимости, привычнее использовать вторичные или третичные средства обнаружения, а не прямую процедуру. Таким образом, после связывания белка или антитела с лункой, покрытия нереакционноспособным материалом для уменьшения фона и промывки для удаления несвязанного материала, иммобилизующую поверхность приводят в контакт с тестируемым биологическим образцом в условиях, эффективных для образования иммунного комплекса (антиген/антитело). Затем для обнаружения иммунного комплекса требуется меченый вторичный связывающий лиганд или антитело и вторичный связывающий лиганд или антитело в сочетании с меченым третичным антителом или третьим связывающим лигандом.In ELISA methods, it seems more common to use secondary or tertiary means of detection rather than a direct procedure. Thus, after protein or antibody has been bound to the well, coated with non-reactive material to reduce background, and washed to remove unbound material, the immobilizing surface is brought into contact with the biological specimen under test under conditions effective to form an immune complex (antigen/antibody). The detection of the immune complex then requires a labeled secondary binding ligand or antibody and a secondary binding ligand or antibody in combination with a labeled tertiary antibody or third binding ligand.

«В условиях, эффективных для образования иммунного комплекса (антиген/антитело)» означает, что условия предпочтительно включают разбавление антигенов и/или антител растворами, такими как BSA, бычий гамма-глобулин (BGG) или физиологический раствор с фосфатным буфером (PBS)/твин. Эти добавленные агенты также способствуют уменьшению неспецифического фона."Under conditions effective to form an immune complex (antigen/antibody)" means that the conditions preferably include dilution of antigens and/or antibodies with solutions such as BSA, bovine gamma globulin (BGG) or phosphate buffered saline (PBS)/ twin. These added agents also contribute to the reduction of non-specific background.

«Подходящие» условия также означают, что инкубация проводится при температуре или в течение периода времени, достаточного для обеспечения эффективного связывания. Стадии инкубации обычно длятся от примерно 1-2 до 4 часов или около того, при температурах, предпочтительно, от 25 до 27°C, или могут длиться в течение ночи при температуре примерно 4°C или около того."Suitable" conditions also mean that the incubation is carried out at a temperature or for a period of time sufficient to ensure effective binding. The incubation steps typically last from about 1-2 to 4 hours or so, at temperatures preferably from 25 to 27°C, or may last overnight at about 4°C or so.

После всех этапов инкубации в методе ELISA контактирующую поверхность промывают для удаления не находящегося в комплексе материала. Предпочтительная процедура промывки включает промывку раствором, таким как PBS/твин или боратным буфером. После образования специфических иммунных комплексов между тестируемым образцом и первоначально связанным материалом и последующей промывки может быть определено появление даже незначительных количеств иммунных комплексов.After all incubation steps in the ELISA method, the contact surface is washed to remove uncomplexed material. A preferred washing procedure includes washing with a solution such as PBS/tween or borate buffer. After the formation of specific immune complexes between the test sample and the initially bound material and subsequent washing, the appearance of even small amounts of immune complexes can be determined.

Для обеспечения средства обнаружения второе или третье антитело обычно содержит ассоциированную метку, позволяющую выполнить детектирование. Предпочтительно, такая метка, как правило, представляет собой фермент, который обеспечивает развитие окраски при инкубации с соответствующим хромогенным субстратом. Таким образом, например, необходим контакт или инкубация первого и второго иммунного комплекса с антителами, конъюгированными с уреазой, глюкозооксидазой, щелочной фосфатазой или пероксидазой водорода, в течение периода времени и в условиях, которые способствуют развитию дальнейшего образования иммунного комплекса (например, инкубация в течение 2 часов при комнатной температуре в PBS-содержащем растворе, таком как PBS-твин).To provide a means of detection, the second or third antibody typically contains an associated label to allow detection. Preferably, such a label is typically an enzyme that allows color development upon incubation with an appropriate chromogenic substrate. Thus, for example, it is necessary to contact or incubate the first and second immune complex with antibodies conjugated to urease, glucose oxidase, alkaline phosphatase, or hydrogen peroxidase for a period of time and under conditions that promote the development of further immune complex formation (for example, incubation for 2 hours at room temperature in a PBS-containing solution such as PBS-tween).

После инкубации с меченым антителом и после промывки для удаления несвязанного материала выполняют количественное определение метки, например, путем инкубации с хромогенным субстратом, таким как мочевина или бромкрезоловый пурпурный, или 2,2'-азино-ди-(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновая кислота (ABTS) или H₂O₂, в случае пероксидазы, в качестве ферментной метки. Количественное определение достигается путем измерения степени развития цвета, например, с помощью спектрофотометра в видимом диапазоне спектра.After incubation with labeled antibody and after washing to remove unbound material, the label is quantified, for example by incubation with a chromogenic substrate such as urea or bromocresol purple, or 2,2'-azino-di-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) or H ₂ O ₂ , in the case of peroxidase, as an enzymatic label Quantification is achieved by measuring the degree of color development, for example with a spectrophotometer in the visible spectrum.

B. Детектирование мРНКB. mRNA detection

Для оценки активности протеазы в раковой клетке или опухоли может быть использован метод детектирования мРНК. Как правило, детектирование мРНК основано на гибридизации одной нуклеиновой кислоты (зонда или праймера) с другой нуклеиновой кислотой (мишенью).An mRNA detection method can be used to evaluate protease activity in a cancer cell or tumor. Typically, mRNA detection is based on the hybridization of one nucleic acid (probe or primer) with another nucleic acid (target).

Использование зонда или праймера длиной от 13 до 100 нуклеотидов, предпочтительно длиной от 17 до 100 нуклеотидов или, в некоторых аспектах, длиной до 1-2 килобаз или более, позволяет образовывать дуплексную молекулу, которая является одновременно стабильной и селективной. Молекулы, имеющие комплементарные последовательности на непрерывных участках длиной более 20 оснований, обычно являются предпочтительными с точки зрения увеличения стабильности и/или селективности полученных гибридных молекул. Обычно предпочтительнее конструировать молекулы нуклеиновой кислоты для гибридизации, имеющие одну или более комплементарных последовательностей от 20 до 30 нуклеотидов или даже больше, где это желательно. Такие фрагменты могут быть легко получены, например, путем прямого синтеза фрагмента химическими средствами или путем введения выбранных последовательностей в рекомбинантные векторы для продуцирования рекомбинантными методами.The use of a probe or primer 13 to 100 nucleotides in length, preferably 17 to 100 nucleotides in length, or in some aspects up to 1-2 kilobases or more in length, allows the formation of a duplex molecule that is both stable and selective. Molecules having complementary sequences in contiguous regions longer than 20 bases are generally preferred in terms of increasing the stability and/or selectivity of the resulting hybrid molecules. It is generally preferred to design hybridization nucleic acid molecules having one or more complementary sequences of 20 to 30 nucleotides, or even more where desired. Such fragments can be easily obtained, for example, by direct synthesis of the fragment by chemical means or by introducing selected sequences into recombinant vectors for production by recombinant methods.

Соответственно, можно использовать нуклеотидные последовательности, позволяющие селективно формировать дуплексные молекулы с комплементарными мРНК-участками или обеспечивать праймеры для амплификации мРНК из образцов. В зависимости от предполагаемого применения можно использовать различные условия гибридизации для достижения различных степеней селективности зонда или праймеров для последовательности-мишени.Accordingly, nucleotide sequences can be used to selectively generate duplex molecules with complementary mRNA regions or provide primers for amplifying mRNA from samples. Depending on the intended application, different hybridization conditions can be used to achieve different degrees of probe or primer selectivity for the target sequence.

Для применений, требующих высокой селективности, обычно желательно использовать относительно высоко жесткие условия для образования гибридов. Например, условия с относительно низким содержанием солей и/или высокой температурой, например обеспечиваемые содержанием NaCl от примерно 0,02 М до примерно 0,10 М при температурах от примерно 50°С до примерно 70°С. Такие условия высокой жесткости допускают незначительное, если таковое имеется, несоответствие между зондом или праймерами и матрицей или нитью-мишенью и могут быть особенно подходящими для выделения специфических генов или для обнаружения специфических транскриптов мРНК. Как правило, следует понимать, что могут быть обеспечены более жесткие условия путем добавления увеличивающихся количеств формамида.For applications requiring high selectivity, it is generally desirable to use relatively highly stringent hybridization conditions. For example, relatively low salt and/or high temperature conditions such as provided by about 0.02M to about 0.10M NaCl at temperatures from about 50°C to about 70°C. Such high stringency conditions allow for little, if any, mismatch between the probe or primers and the template or target strand, and may be particularly suitable for isolating specific genes or for detecting specific mRNA transcripts. As a rule, it should be understood that more stringent conditions can be provided by adding increasing amounts of formamide.

Понятно, что в некоторых случаях предпочтительны условия более низкой жесткости. В этих условиях может происходить гибридизация, даже если последовательности гибридизующихся цепей не являются точно комплементарными и не совпадают в одном или более положениях. Менее жесткие условия могут быть обеспечены за счет увеличения концентрации соли и/или уменьшения температуры. Например, условия средней жесткости могут быть обеспечены содержанием NaCl примерно от 0,1 до 0,25 М при температурах от примерно 37°С до примерно 55°С, в то время как условия низкой жесткости могут быть обеспечены содержанием соли от примерно 0,15 М до примерно 0,9 М при температурах в пределах от примерно 20°С до примерно 55°С. Условиями гибридизации можно легко манипулировать в зависимости от требуемых результатов.It is understood that in some cases lower stringency conditions are preferred. Under these conditions, hybridization can occur even if the sequences of the hybridizing strands are not exactly complementary and do not match at one or more positions. Less stringent conditions can be achieved by increasing the salt concentration and/or decreasing the temperature. For example, medium stringency conditions can be provided with a NaCl content of from about 0.1 to 0.25 M at temperatures from about 37°C to about 55°C, while low stringency conditions can be provided with a salt content of from about 0.15 M to about 0.9 M at temperatures ranging from about 20°C to about 55°C. Hybridization conditions can be easily manipulated depending on the desired results.

В других вариантах осуществления гибридизация может быть достигнута в условиях, например, 50 мМ Трис-HCl (рН 8,3), 75 мМ KCl, 3 мМ MgCl₂, 1,0 мМ дитиотреитола, при температурах от приблизительно 20°С до примерно 37°С. Другие используемые условия гибридизации могут включать приблизительно 10 мМ Трис-HCl (рН 8,3), 50 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl₂ при температурах в диапазоне от приблизительно 40°С до примерно 72°С.In other embodiments, hybridization can be achieved under conditions such as 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl ₂ , 1.0 mM dithiothreitol, at temperatures from about 20° C. to about 37 °C. Other hybridization conditions used may include about 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl ₂ at temperatures ranging from about 40°C to about 72°C.

В некоторых вариантах осуществления для определения гибридизации обычно выгодно использовать нуклеиновые кислоты определенных последовательностей по настоящему изобретению в сочетании с подходящими средствами, такими как метка. В данной области техники известно большое количество подходящих индикаторных средств, включая флуоресцентные, радиоактивные, ферментные или другие лиганды, такие как детектируемый авидин/биотин. В предпочтительных вариантах осуществления можно использовать флуоресцентную метку или ферментную метку, такую как уреаза, щелочная фосфатаза или пероксидаза, вместо радиоактивных или других нежелательных для окружающей среды реагентов. В случае ферментных меток известны колориметрические индикаторные субстраты, используемые для идентификации специфической гибридизации с комплементарными образцами, содержащими нуклеиновую кислоту, которые можно использовать в качестве средств, обеспечивающих визуальное или спектрофотометрическое обнаружение.In some embodiments, it is generally advantageous to use nucleic acids of certain sequences of the present invention in combination with suitable means, such as a label, to determine hybridization. A wide variety of suitable indicator agents are known in the art, including fluorescent, radioactive, enzymatic or other ligands such as detectable avidin/biotin. In preferred embodiments, a fluorescent label or an enzyme label, such as urease, alkaline phosphatase, or peroxidase, can be used instead of radioactive or other environmentally undesirable reagents. In the case of enzyme labels, colorimetric indicator substrates are known that are used to identify specific hybridization with complementary nucleic acid containing samples, which can be used as a means of providing visual or spectrophotometric detection.

В общем случае, предполагается, что зонды или праймеры, описанные в настоящей заявке, полезны в качестве реагентов при гибридизации растворов, как в случае ПЦР^ТМ, для обнаружения экспрессии соответствующих генов, а также в вариантах осуществления, в которых используется твердая фаза. В вариантах осуществления, в которых используется твердая фаза, тестируемую мРНК адсорбируют или иным образом прикрепляют к выбранной матрице или поверхности. Эту фиксированную одноцепочечную нуклеиновую кислоту затем подвергают гибридизации с выбранными зондами в требуемых условиях. Выбранные условия будут зависеть от конкретных обстоятельств (в зависимости, например, от содержания G+C, типа нуклеиновой кислоты-мишени, источника нуклеиновой кислоты, размера зонда для гибридизации и т.д.). Оптимизация условий гибридизации для конкретного представляющего интерес применения хорошо известна специалистам в данной области. После промывки гибридизованных молекул для удаления неспецифически связанных молекул зонда выполняют обнаружение и/или количественное определение гибридизации путем определения количества связанной метки. Типичные твердофазные способы гибридизации раскрыты в патентах США 5843663, 5900481 и 5919626. Другие способы гибридизации, которые можно использовать при осуществлении настоящего изобретения, раскрыты в патентах США № 5849481, 5849486 и 5851772 и публикации патента США 2008/0009439. Соответствующие части этих и других ссылок, указанных в этом разделе описания, включены в него в качестве ссылки.In general, the probes or primers described herein are expected to be useful as reagents in solution hybridization, as in the case of ^TM PCR, to detect the expression of relevant genes, as well as in embodiments that use a solid phase. In embodiments that use a solid phase, the mRNA to be tested is adsorbed or otherwise attached to a selected template or surface. This fixed single-stranded nucleic acid is then subjected to hybridization with selected probes under the required conditions. The conditions chosen will depend on the particular circumstances (depending on, for example, G+C content, type of target nucleic acid, nucleic acid source, hybridization probe size, etc.). Optimizing hybridization conditions for a particular application of interest is well known to those skilled in the art. After washing the hybridized molecules to remove non-specifically bound probe molecules, hybridization is detected and/or quantified by determining the amount of bound label. Typical solid phase hybridization methods are disclosed in US Pat. The relevant portions of these and other references cited in this section of the description are incorporated herein by reference.

Нуклеиновые кислоты-мишени могут быть выделены из клеток, тканей или других образцов стандартными методами (Sambrook et al., 2001). В некоторых вариантах осуществления проводят анализ на гомогенатах цельных клеток или тканей или проб биологической жидкости без существенной очистки матричной нуклеиновой кислоты. В других случаях может потребоваться очистка и/или амплификация.Target nucleic acids can be isolated from cells, tissues or other samples by standard methods (Sambrook et al., 2001). In some embodiments, analysis is performed on whole cell or tissue homogenates or body fluid samples without significant purification of the nucleic acid template. In other cases, purification and/or amplification may be required.

Амплификация обычно включает пары праймеров, предназначенных для селективной гибридизации с нуклеиновыми кислотами, которые соответствуют мишени, в условиях, обеспечивающих селективную гибридизацию. В зависимости от требуемого применения могут быть выбраны условия гибридизации высокой жесткости, которые обеспечивают гибридизацию только с последовательностями, которые полностью комплементарны праймерам. В других вариантах осуществления гибридизация может происходить в менее жестких условиях, чтобы обеспечить амплификацию нуклеиновых кислот, содержащих одно или более несовпадений с последовательностями праймеров. После гибридизации комплекс матрица-праймер связывают с одним или более ферментами, которые облегчают зависимый от матрицы синтез нуклеиновой кислоты. Несколько циклов амплификации, также называемых «циклами», проводят до тех пор, пока не будет получено достаточное количество продукта амплификации.Amplification typically includes primer pairs designed to selectively hybridize to nucleic acids that match the target, under conditions that allow selective hybridization. Depending on the desired application, high stringency hybridization conditions can be selected that ensure hybridization only with sequences that are fully complementary to the primers. In other embodiments, hybridization may occur under less stringent conditions to allow amplification of nucleic acids containing one or more primer sequence mismatches. Following hybridization, the template-primer complex is coupled to one or more enzymes that facilitate template-dependent nucleic acid synthesis. Several cycles of amplification, also referred to as "cycles", are carried out until a sufficient amount of amplification product is obtained.

Продукт амплификации может быть обнаружен или количественно определен. В некоторых случаях обнаружение может быть выполнено с помощью визуальных средств. Альтернативно, обнаружение может включать опосредованную идентификацию продукта с помощью хемилюминесценции, радиоактивной сцинтиграфии встроенной радиоактивной метки или флуоресцентной метки или даже с помощью системы, в которой используются электрические и/или тепловые импульсные сигналы (Bellus, 1994).The amplification product can be detected or quantified. In some cases, detection can be performed using visual means. Alternatively, detection may include indirect identification of the product by chemiluminescence, radioactive scintigraphy of an embedded radioactive label or fluorescent label, or even by a system that uses electrical and/or thermal pulse signals (Bellus, 1994).

Известно несколько зависимых от матрицы процессов амплификации олигонуклеотидных последовательностей, присутствующих в заданном образце матрицы. Одним из наиболее известных методов амплификации является полимеразная цепная реакция (называемая ПЦР^TM), которая подробно описана в патентах США 4683195, 4683202 и 4800159, а также в Innis et al., 1988, каждый из которых включен в настоящее описание во всей своей полноте в качестве ссылки.There are several template dependent processes for amplifying oligonucleotide sequences present in a given template template. One of the best known amplification methods is the polymerase chain reaction (called PCR ^TM ), which is detailed in US Pat. as a link.

Для количественного определения амплифицированной мРНК может быть выполнена процедура амплификации ПЦР^TM с обратной транскриптазой. Методы обратной транскрипции РНК в кДНК хорошо известны (см. Sambrook et al., 2001). В альтернативных методах обратной транскрипции используются термостабильные ДНК-полимеразы. Эти способы описаны в WO 90/07641. Методы полимеразной цепной реакции хорошо известны в данной области. Типичные методы ОТ-ПЦР описаны в патенте США № 5882864.To quantify the amplified mRNA, a reverse transcriptase PCR ^TM amplification procedure can be performed. Methods for reverse transcription of RNA into cDNA are well known (see Sambrook et al., 2001). Alternative reverse transcription methods use thermostable DNA polymerases. These methods are described in WO 90/07641. Polymerase chain reaction methods are well known in the art. Typical RT-PCR methods are described in US Pat. No. 5,882,864.

Для определения относительных концентраций конкретных видов мРНК, выделенных из клетки, можно использовать обратную транскрипцию (ОТ) РНК в кДНК с последующей количественной ПЦР (ОТ-ПЦР). Путем определения того, что концентрация конкретных видов мРНК варьирует, показано, что ген, кодирующий конкретные виды мРНК, экспрессируется дифференциально. При построении графика, на котором номер цикла находится на оси X, а логарифм концентрации амплифицированной ДНК-мишени находится на оси Y, путем соединения точек, нанесенных на график, получают изогнутую линию характерной формы. Начиная с первого цикла, наклон линии является положительным и постоянным. Это называется линейной частью кривой. После того, как реагент становится ограничивающим фактором, наклон линии начинает уменьшаться и в конечном итоге становится равным нулю. В этот момент концентрация амплифицированной ДНК-мишени становится асимптотической до некоторого фиксированного значения. Эта часть кривой называется плато.Reverse transcription (RT) of RNA into cDNA followed by quantitative PCR (RT-PCR) can be used to determine the relative concentrations of specific mRNA species isolated from a cell. By determining that the concentration of particular mRNA species varies, it is shown that the gene encoding particular mRNA species is differentially expressed. When plotting with the cycle number on the x-axis and the logarithm of the amplified target DNA concentration on the y-axis, by connecting the points plotted on the graph, a curved line of characteristic shape is obtained. Starting from the first cycle, the slope of the line is positive and constant. This is called the linear part of the curve. After the reactant becomes the limiting factor, the slope of the line begins to decrease and eventually becomes zero. At this point, the concentration of the amplified target DNA becomes asymptotic to some fixed value. This part of the curve is called the plateau.

Концентрация ДНК-мишени в линейной части амплификации ПЦР прямо пропорциональна начальной концентрации мишени до начала реакции. Определяя концентрацию амплифицированных продуктов ДНК-мишени в реакциях ПЦР, которые прошли одинаковое количество циклов и находятся в линейных диапазонах, можно определить относительные концентрации конкретной последовательности-мишени в исходной смеси ДНК. Если смеси ДНК представляют собой кДНК, синтезированные из РНК, выделенных из разных тканей или клеток, то для соответствующих тканей или клеток могут быть определены относительные количества копий конкретных мРНК, из которых была получена последовательность-мишень. Эта прямая пропорциональность между концентрацией продуктов ПЦР и относительным содержанием мРНК верна только в линейном диапазоне реакции ПЦР.The target DNA concentration in the linear part of the PCR amplification is directly proportional to the initial target concentration before the start of the reaction. By determining the concentration of amplified target DNA products in PCR reactions that have gone through the same number of cycles and are in linear ranges, one can determine the relative concentrations of a particular target sequence in the original DNA mixture. If the DNA mixtures are cDNAs synthesized from RNA isolated from different tissues or cells, then the relative copy numbers of the specific mRNAs from which the target sequence was derived can be determined for the respective tissues or cells. This direct relationship between the concentration of PCR products and the relative content of mRNA is true only in the linear range of the PCR reaction.

Конечная концентрация целевой ДНК в части кривой, представленной плато, определяется наличием реагентов в реакционной смеси и не зависит от исходной концентрации целевой ДНК. Таким образом, первое условие, которое должно быть выполнено до того, как методом ОТ-ПЦР можно будет определить относительное количество копий видов мРНК для коллекции популяций РНК, заключается в том, что забор образцов для определения концентрации амплифицированных продуктов ПЦР должен быть выполнен, когда реакции ПЦР находятся в линейной части соответствующей кривой.The final concentration of the target DNA in the part of the curve represented by the plateau is determined by the presence of reagents in the reaction mixture and does not depend on the initial concentration of the target DNA. Thus, the first condition that must be met before RT-PCR can determine the relative copy number of mRNA species for a collection of RNA populations is that sampling to determine the concentration of amplified PCR products must be performed when the reactions PCR are in the linear part of the corresponding curve.

Вторым условием эксперимента ОТ-ПЦР является определение относительного содержания конкретных видов мРНК. Как правило, относительные концентрации амплифицируемых кДНК нормируют относительно некоторого независимого стандарта. Цель эксперимента методом ОТ-ПЦР заключается в определении количества конкретных видов мРНК относительно среднего количества всех видов мРНК в образце.The second condition of the RT-PCR experiment is to determine the relative content of specific mRNA species. Typically, the relative concentrations of amplified cDNA are normalized against some independent standard. The purpose of the RT-PCR experiment is to determine the amount of specific mRNA species relative to the average amount of all mRNA species in the sample.

В большинстве протоколов для конкурентной ПЦР используют внутренние стандарты ПЦР, которых имеют примерно такую же копийность как и мишени. Эти стратегии эффективны, если образцы продуктов амплификации ПЦР отбирают во время их линейных фаз. Если продукты отбирают, когда реакции приближаются к фазе плато, то появляется избыточное количество менее распространенного продукта. Это приводит к искажению результатов сравнения относительного содержания, сделанного для многих различных образцов РНК, например в случае изучения образцов РНК на предмет дифференциальной экспрессии, такому как уменьшение различий в относительном содержании РНК, что не соответствует действительности. Это не является серьезной проблемой, если внутренний стандарт имеет гораздо более высокую копийность по сравнению с мишенью. Если внутренний стандарт имеет более высокую копийность по сравнению с мишенью, то можно выполнить прямые линейные сравнения между образцами РНК.Most protocols for competitive PCR use internal PCR standards that have approximately the same copy number as the targets. These strategies are effective if PCR amplification products are sampled during their linear phases. If the products are withdrawn as the reactions approach a plateau phase, then an excess of the less abundant product appears. This leads to misrepresentation of relative abundance comparisons made for many different RNA samples, for example in the case of examining RNA samples for differential expression, such as reducing differences in relative RNA abundance, which is not true. This is not a serious problem if the internal standard has a much higher copy number than the target. If the internal standard has a higher copy number than the target, direct linear comparisons can be made between RNA samples.

Метод ОТ-ПЦР может быть выполнен в виде относительной количественной ОТ-ПЦР с внутренним стандартом, где внутренний стандарт представляет собой амплифицируемый фрагмент кДНК, который длиннее целевого фрагмента кДНК, и где копийность мРНК, кодирующей внутренний стандарт примерно 5-100 раз выше, чем мРНК, кодирующей мишень. Этот анализ позволяет измерять относительное содержание, а не абсолютное количество соответствующих видов мРНК.The RT-PCR method can be performed as relative quantitative RT-PCR with an internal standard, where the internal standard is an amplified cDNA fragment that is longer than the target cDNA fragment, and where the copy number of the mRNA encoding the internal standard is approximately 5-100 times higher than the mRNA , which encodes the target. This assay allows one to measure the relative content, rather than the absolute amount, of the respective mRNA species.

Другим способом амплификации является лигазная цепная реакция («ЛЦР»), раскрытая в европейской заявке № 320308, полностью включенная в настоящее описание в качестве ссылки. В патенте США 4883750 описан способ, аналогичный ЛЦР, используемый для связывания пар зондов с последовательностью-мишенью. Также может быть использован способ, основанный на ПЦР^TM и олигонуклеотид-лигазном анализе (ОЛА), раскрытый в патенте США № 5912148.Another amplification method is the ligase chain reaction ("LCR") disclosed in European application No. 320308, fully incorporated in the present description by reference. US Pat. No. 4,883,750 describes a method similar to LCR used to link pairs of probes to a target sequence. A method based on PCR ^TM and oligonucleotide ligase assay (OLA) as disclosed in US Pat. No. 5,912,148 can also be used.

Альтернативные способы амплификации целевых последовательностей нуклеиновых кислот, которые можно использовать для осуществления настоящего изобретения, раскрыты в патентах США 5843650, 5846709, 5,846783, 5849,546, 5849497, 5849547, 5858652, 5866366, 5916776, 5922574, 5928905, 5928906, 5932451, 5935825, 5939291 и 5942391, в заявке Великобритании № 2202328 и в заявке PCT № PCT/US89/01025, каждая из которых включена в настоящее описание во всей полноте в качестве ссылки.Альтернативные способы амплификации целевых последовательностей нуклеиновых кислот, которые можно использовать для осуществления настоящего изобретения, раскрыты в патентах США 5843650, 5846709, 5,846783, 5849,546, 5849497, 5849547, 5858652, 5866366, 5916776, 5922574, 5928905, 5928906, 5932451, 5935825, 5939291 and 5942391, UK Application No. 2202328 and PCT Application No. PCT/US89/01025, each of which is incorporated herein in its entirety by reference.

Q-бета репликаза, описанная в заявке PCT № PCT/US87/00880, также может быть использована в качестве способа амплификации в настоящем изобретении. В этом методе репликативную последовательность РНК, которая имеет область, комплементарную области-мишени, добавляют к образцу в присутствии РНК-полимеразы. Полимераза копирует репликативную последовательность, которая затем может быть обнаружена.The Q-beta replicase described in PCT Application No. PCT/US87/00880 can also be used as an amplification method in the present invention. In this method, a replicative RNA sequence that has a complementary region to the target region is added to the sample in the presence of RNA polymerase. The polymerase copies the replicative sequence, which can then be detected.

Метод изотермической амплификации, в котором используют рестрикционные эндонуклеазы и лигазы для достижения амплификации молекул-мишеней, содержащих нуклеотид-5'-[альфа-тио]-трифосфаты на одной нити сайта расщепления, также может быть полезным для амплификации нуклеиновых кислот по настоящему изобретению (Walker et al., 1992). Амплификация смещением цепи (SDA), раскрытая в патенте США 5916779, представляет собой другой способ выполнения изотермической амплификации нуклеиновых кислот, который включает многочисленные циклы смещения и синтеза цепи, т.е. ник-трансляции.The isothermal amplification method, which uses restriction endonucleases and ligases to achieve the amplification of target molecules containing nucleotide 5'-[alpha-thio]-triphosphates on a single strand of the cleavage site, may also be useful for amplifying the nucleic acids of the present invention (Walker et al., 1992). Strand displacement amplification (SDA) as disclosed in US Pat. nick-broadcast.

Другие процедуры амплификации нуклеиновых кислот включают системы амплификации на основе транскрипции (TAS), включая амплификацию на основе последовательностей нуклеиновых кислот (NASBA) и 3SR (Kwoh et al., 1989; заявка PCT WO 88/10315, полностью включенные в настоящее описание в качестве ссылки). В европейской заявке № 329822 раскрыт процесс амплификации нуклеиновой кислоты, включающий циклический синтез одноцепочечной РНК («оцРНК»), оцДНК и двухцепочечной ДНК (дцДНК), который можно использовать в соответствии с настоящим изобретением.Other nucleic acid amplification procedures include transcription-based amplification systems (TAS), including nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) and 3SR (Kwoh et al., 1989; PCT application WO 88/10315, herein incorporated by reference in its entirety ). EP 329822 discloses a nucleic acid amplification process involving the cyclic synthesis of single-stranded RNA ("ssRNA"), ssDNA and double-stranded DNA (dsDNA), which can be used in accordance with the present invention.

В заявке PCT WO 89/06700 (полностью включенной в настоящее описание в качестве ссылки) раскрыта схема амплификации последовательности нуклеиновой кислоты, основанная на гибридизации последовательности промоторной области/праймера с одноцепочечной ДНК-мишенью («оцДНК») с последующей транскрипцией многих РНК-копии последовательности. Эта схема не является циклической, т.е. новые матрицы не создаются из полученных в результате РНК-транскриптов. Другие способы амплификации включают «RACE» и «одностороннюю ПЦР» (Frohman, 1990; Ohara et al., 1989).PCT application WO 89/06700 (incorporated herein by reference in its entirety) discloses a nucleic acid sequence amplification scheme based on hybridization of a promoter region/primer sequence to a single-stranded DNA target ("ssDNA") followed by transcription of multiple RNA copies of the sequence . This scheme is not cyclic; new templates are not created from the resulting RNA transcripts. Other amplification methods include "RACE" and "one way PCR" (Frohman, 1990; Ohara et al., 1989).

После любой амплификации может возникнуть необходимость в отделении продукта амплификации от матрицы и/или избытка праймера. В одном из вариантов осуществления продукты амплификации разделяют электрофорезом в агарозном, агарозо-акриламидном или полиакриламидном геле стандартными методами (Sambrook et al., 2001). Отделенные продукты амплификации могут быть вырезаны и элюированы из геля для дальнейшей манипуляции. В случае использования агарозных гелей с низкой температурой плавления, отделенную полосу можно удалить путем нагревания геля с последующей экстракцией нуклеиновой кислоты.After any amplification, it may be necessary to separate the amplification product from the template and/or excess primer. In one embodiment, the amplification products are separated by agarose, agarose-acrylamide or polyacrylamide gel electrophoresis by standard methods (Sambrook et al., 2001). The separated amplification products can be excised and eluted from the gel for further manipulation. In the case of low melting agarose gels, the separated band can be removed by heating the gel followed by extraction of the nucleic acid.

Разделение нуклеиновых кислот также можно осуществлять методами хроматографии, известными в данной области. Существует много видов хроматографии, которые могут быть использованы для реализации настоящего изобретения, включая адсорбционную, разделительную, ионообменную, гидроксилапатитную хроматографию, хроматографию на молекулярных ситах, обращенно-фазовую, колоночную, бумажную, тонкослойную и газовую хроматографию, а также ВЭЖХ.Separation of nucleic acids can also be carried out by chromatographic methods known in the art. There are many types of chromatography that can be used to implement the present invention, including adsorption, separation, ion exchange, hydroxyapatite chromatography, molecular sieve chromatography, reversed phase, column, paper, thin layer and gas chromatography, as well as HPLC.

В некоторых вариантах осуществления продукты амплификации визуализируют. Типичный метод визуализации включает окрашивание геля бромидом этидия и визуализацию полос в УФ-свете. Альтернативно, если выполняют целочисленное мечение продуктов амплификации радиоактивными или флуорометрически меченными нуклеотидами, то отдельные продукты амплификации могут быть экспонированы на рентгеновской пленке или визуализированы в соответствующих возбуждающих спектрах.In some embodiments, the amplification products are visualized. A typical imaging technique involves staining the gel with ethidium bromide and visualizing the bands under UV light. Alternatively, if integer labeling of the amplification products is performed with radioactive or fluorometrically labeled nucleotides, then the individual amplification products can be exposed to x-ray film or visualized in the appropriate excitation spectra.

В одном из вариантов осуществления после разделения продуктов амплификации меченый зонд нуклеиновой кислоты приводят в контакт с амплифицированной маркерной последовательностью. Зонд предпочтительно конъюгируют с хромофором, но можно выполнить мечение радиоактивным изотопом. В другом варианте осуществления зонд конъюгируют с партнером по связыванию, таким как антитело или биотин, или другим партнером по связыванию, несущим детектируемый фрагмент.In one embodiment, after separation of the amplification products, the labeled nucleic acid probe is brought into contact with the amplified marker sequence. The probe is preferably conjugated to a chromophore, but radioactive labeling may be performed. In another embodiment, the probe is conjugated to a binding partner, such as an antibody or biotin, or other binding partner carrying a detectable fragment.

В конкретных вариантах осуществления обнаружение осуществляется с помощью саузерн-блоттинга и гибридизации с меченым зондом. Методы саузерн-блоттинга хорошо известны специалистам в данной области (см. Sambrook et al., 2001). Один из примеров вышеизложенного описан в патенте США 5279721, включенном в настоящее описание в качестве ссылки, в котором описано устройство и способ для осуществления автоматического электрофореза и переноса нуклеиновых кислот. Устройство позволяет выполнять электрофорез и блоттинг без внешних манипуляций с гелем и идеально подходит для осуществления способов в соответствии с настоящим изобретением.In specific embodiments, detection is by Southern blotting and hybridization with a labeled probe. Southern blot techniques are well known to those skilled in the art (see Sambrook et al., 2001). One example of the foregoing is described in US Pat. No. 5,279,721, incorporated herein by reference, which describes an apparatus and method for performing automatic electrophoresis and transfer of nucleic acids. The device allows electrophoresis and blotting without external manipulation of the gel and is ideally suited for carrying out the methods of the present invention.

Различные методы обнаружения нуклеиновых кислот, известные в данной области техники, раскрыты в патентах США 5840873, 5843640, 5843651, 5846708, 5846717, 5846726, 5846729, 5849487, 5853990, 5853992, 5853993, 5856092, 5861244, 5863732, 5863753, 5866331, 5905024, 5910407, 5912124, 5912145, 5919630, 5925517, 5928862, 5928869, 5929227, 5932413 и 5935791, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки.Различные методы обнаружения нуклеиновых кислот, известные в данной области техники, раскрыты в патентах США 5840873, 5843640, 5843651, 5846708, 5846717, 5846726, 5846729, 5849487, 5853990, 5853992, 5853993, 5856092, 5861244, 5863732, 5863753, 5866331, 5905024, 5910407, 5912124, 5912145, 5919630, 5925517, 5928862, 5928869, 5929227, 5932413 and 5935791, each of which is incorporated herein by reference.

Обнаружение мРНК протеазы может включать использование массивов или данных, сгенерированных из массива. Массив обычно относится к упорядоченным макрочипам или микрочипам молекул нуклеиновых кислот (зондов), которые полностью или почти комплементарны или идентичны множеству молекул мРНК или молекул кДНК и которые расположены на материале-носителе пространственно разделенным образом. Макрочипы, как правило, представляют собой листы нитроцеллюлозы или нейлона, на которые нанесены зонды. На микрочипах зонды нуклеиновой кислоты расположены более плотно, таким образом, что область размером обычно от 1 до 4 квадратных сантиметров может содержать до 10000 молекул нуклеиновой кислоты. Микрочипы могут быть изготовлены путем нанесения молекул нуклеиновой кислоты, например генов, олигонуклеотидов и т.д., на субстраты или путем изготовления олигонуклеотидных последовательностей in situ на субстрате. Нанесенные в виде пятен или изготовленные молекулы нуклеиновой кислоты можно наносить в виде матрицы высокой плотности, содержащей до 30 неидентичных молекул нуклеиновой кислоты на квадратный сантиметр или более, например до примерно 100 или даже 1000 на квадратный сантиметр. В микрочипах в качестве твердой подложки обычно используют стекло с покрытием, в отличие от материала на основе нитроцеллюлозы для фильтрующих матриц. Имея упорядоченный массив образцов комплементарных нуклеиновых кислот, положение каждого образца можно отслеживать и связывать с исходным образцом. Специалистам в данной области известны разнообразные матричные устройства, в которых множество различных зондов нуклеиновых кислот стабильно связаны с поверхностью твердой подложки. Подходящие подложки для массивов включают нейлон, стекло и кремний. Такие матрицы можно менять различными способами, включая среднюю длину зонда, последовательность или типы зондов, характер связи между зондом и поверхностью матрицы, например ковалентный или нековалентный, и т.п. Применение способов мечения и скрининга по настоящему изобретению и матриц не ограничено каким-либо параметром, за исключением того, что зонды должны позволять обнаружение уровней экспрессии; следовательно, способы и композиции могут быть использованы с множеством различных типов генов.Protease mRNA detection may involve the use of arrays or data generated from an array. An array generally refers to ordered macroarrays or microarrays of nucleic acid molecules (probes) that are completely or nearly complementary or identical to a plurality of mRNA molecules or cDNA molecules and that are spatially separated on a carrier material. Macrochips are typically sheets of nitrocellulose or nylon on which probes are applied. On microarrays, nucleic acid probes are more densely packed such that a region typically 1 to 4 square centimeters in size can contain up to 10,000 nucleic acid molecules. Microarrays can be made by depositing nucleic acid molecules, eg genes, oligonucleotides, etc., on substrates, or by making oligonucleotide sequences in situ on a substrate. Spotted or fabricated nucleic acid molecules can be applied as a high density matrix containing up to 30 non-identical nucleic acid molecules per square centimeter or more, such as up to about 100 or even 1000 per square centimeter. Microchips typically use coated glass as a solid support, as opposed to nitrocellulose-based material for filter matrices. With an ordered array of complementary nucleic acid samples, the position of each sample can be tracked and associated with the original sample. A variety of array devices are known to those skilled in the art in which a plurality of different nucleic acid probes are stably attached to the surface of a solid support. Suitable array substrates include nylon, glass, and silicon. Such matrices can be changed in a variety of ways, including the average length of the probe, the sequence or types of probes, the nature of the bond between the probe and the surface of the matrix, such as covalent or non-covalent, and the like. The use of the labeling and screening methods of the present invention and matrices is not limited in any way, except that the probes must be capable of detecting expression levels; therefore, the methods and compositions can be used with many different types of genes.

Типичные способы и устройства для изготовления микрочипов описаны, например, в патентах США №№ 5143854; 5202231; 5242974; 5288644; 5324633; 5384261; 5405783; 5412087; 5424186; 5429807; 5432049; 5436327; 5445934; 5468613; 5470710; 5472672; 5492806; 5503980; 5510270; 5525464; 5527681; 5529756; 5532128; 5545531; 5547839; 5554501; 5556752; 5561071; 5571639; 5580726; 5580732; 5593839; 5599695; 5599672; 5610287; 5624711; 5631134; 5639603; 5654413; 5658734; 5661028; 5665547; 5667972; 5695940; 5700637; 5744305; 5800992; 5807522; 5830645; 5837196; 5871928; 5847219; 5876932; 5919626; 6004755; 6087102; 6368799; 6383749; 6617112; 6638717; 6720138, а также WO 93/17126; WO 95/11995; WO 95/21265; WO 95/21944; WO 95/35505; WO 96/31622; WO 97/10365; WO 97/27317; WO 99/35505; WO 09923256; WO 09936760; WO 0138580; WO 0168255; WO 03020898; WO 03040410; WO 03053586; WO 03087297; WO 03091426; WO 03100012; WO 04020085; WO 04027093; ЕР 373203; ЕР 785280; EP 799897 и UK 8803000; раскрытие которых включено в настоящее описание в качестве ссылки.Typical methods and devices for making microchips are described in, for example, US Pat. Nos. 5,143,854; 5202231; 5242974; 5288644; 5324633; 5384261; 5405783; 5412087; 5424186; 5429807; 5432049; 5436327; 5445934; 5468613; 5470710; 5472672; 5492806; 5503980; 5510270; 5525464; 5527681; 5529756; 5532128; 5545531; 5547839; 5554501; 5556752; 5561071; 5571639; 5580726; 5580732; 5593839; 5599695; 5599672; 5610287; 5624711; 5631134; 5639603; 5654413; 5658734; 5661028; 5665547; 5667972; 5695940; 5700637; 5744305; 5800992; 5807522; 5830645; 5837196; 5871928; 5847219; 5876932; 5919626; 6004755; 6087102; 6368799; 6383749; 6617112; 6638717; 6720138, as well as WO 93/17126; WO 95/11995; WO 95/21265; WO 95/21944; WO 95/35505; WO 96/31622; WO 97/10365; W097/27317; WO 99/35505; WO 09923256; WO09936760; WO0138580; WO0168255; W003020898; W003040410; WO03053586; WO03087297; W003091426; W003100012; WO 04020085; WO 04027093; EP 373203; EP 785280; EP 799897 and UK 8803000; the disclosure of which is incorporated into the present description by reference.

Предполагается, что массивы могут представлять собой массивы высокой плотности, которые могут содержать 100 или более различных зондов. Предполагается, что они могут содержать 1000, 16000, 65000, 250000 или 1000000 или более различных зондов. Зонды могут быть направлены на мишени, находящиеся в одном или нескольких различных организмах. В некоторых вариантах осуществления длина олигонуклеотидных зондов составляет от 5 до 50, от 5 до 45, от 10 до 40 или от 15 до 40 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотидные зонды имеют длину от 20 до 25 нуклеотидов.It is contemplated that the arrays may be high density arrays that may contain 100 or more different probes. It is contemplated that they may contain 1000, 16000, 65000, 250000 or 1000000 or more different probes. Probes can be directed to targets located in one or more different organisms. In some embodiments, the oligonucleotide probes are 5 to 50, 5 to 45, 10 to 40, or 15 to 40 nucleotides in length. In some embodiments, the oligonucleotide probes are 20 to 25 nucleotides in length.

Расположение и последовательность каждой другой последовательности зонда в массиве общеизвестны. Кроме того, большое количество различных зондов может занимать относительно небольшую площадь, обеспечивая массив высокой плотности с плотностью зондов, как правило, более чем примерно 60, 100, 600, 1000, 5000, 10000, 40000, 100000 или 400000 различных олигонуклеотидных зондов на см². Площадь поверхности массива может составлять примерно или менее чем примерно 1, 1,6, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 см².The location and sequence of every other probe sequence in the array is publicly known. In addition, a large number of different probes can occupy a relatively small area, providing a high density array with probe densities typically greater than about 60, 100, 600, 1000, 5000, 10000, 40000, 100000 or 400000 different oligonucleotide probes per ^cm2 . The surface area of the array may be about or less than about 1, 1.6, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 cm ² .

Кроме того, специалист в данной области может легко проанализировать данные, сгенерированные с помощью массива. Такие протоколы раскрыты выше и включают информацию, которую можно найти в заявках на патент №№ WO 9743450; WO 03023058; WO 03022421; WO 03029485; WO 03067217; WO 03066906; WO 03076928; WO 03093810; WO 03100448A1, каждая из которых специально включена в настоящее описание в качестве ссылки.In addition, a person skilled in the art can easily analyze the data generated by the array. Such protocols are disclosed above and include information that can be found in patent applications No. WO 9743450; WO03023058; WO03022421; WO03029485; W003067217; WO03066906; W003076928; W003093810; WO 03100448A1, each of which is specifically incorporated herein by reference.

V. ПримерыV. Examples

Приведенные ниже примеры включены для демонстрации предпочтительных вариантов осуществления. Специалистам в данной области должно быть понятно, что методы, раскрытые в приведенных ниже примерах, являются методами, раскрытыми авторами изобретения для эффективного осуществления на практике вариантов осуществления изобретения, и, таким образом, могут рассматриваться как составляющие предпочтительные режимы его реализации. Однако специалистам в данной области техники в свете настоящего раскрытия должно быть понятно, что в конкретных раскрытых вариантах осуществления может быть сделано множество изменений, обеспечивающих такой же или аналогичный результат, без отступления от сущности и объема изобретения.The following examples are included to demonstrate the preferred embodiments. It will be appreciated by those skilled in the art that the methods disclosed in the examples below are methods disclosed by the inventors for effectively practicing embodiments of the invention, and thus may be considered as constituting preferred modes of implementation. However, those skilled in the art, in light of the present disclosure, will appreciate that many changes can be made to the specific disclosed embodiments to achieve the same or similar result without departing from the spirit and scope of the invention.

Пример 1Example 1

IFN-пролекарство на основе рецептора интерферона альфа и бета (IFNAR). Авторы изобретения разработали IFN-пролекарство на основе структуры человеческого иммуноглобулина G1 (IgG1) (фиг.1). Блокирующий реагент представляет собой внеклеточный домен (ECD) природного IFNAR1 или IFNAR2 и связан с N-концом интерферона альфа через расщепляемый линкер, являющийся субстратом. В этой форме IFNAR блокирует связывание с гетеродимером IFNAR1/IFNAR2 клеточной поверхности. Для увеличения стабильности и периода полураспада авторы изобретения выполнили слияние Fc-домена IgG1 с С-концом альфа-интерферона (фиг. 1). Interferon alpha and beta receptor (IFNAR) IFN prodrug. The inventors have developed an IFN prodrug based on the structure of human immunoglobulin G1 (IgG1) (FIG. 1). The blocking reagent is the extracellular domain (ECD) of native IFNAR1 or IFNAR2 and is linked to the N-terminus of interferon alpha via a cleavable substrate linker. In this form, IFNAR blocks binding to the cell surface IFNAR1/IFNAR2 heterodimer. To increase stability and half-life, the inventors performed a fusion of the Fc domain of IgG1 with the C-terminus of alpha interferon (Fig. 1).

Для определения, способен ли ECD либо IFNAR1, либо IFNAR2 блокировать активность альфа-интерферона, авторы изобретения очистили IFNa4-Fc, R1-IFNa4-Fc и R2-IFNa4-Fc. Линкер R1-IFNa4-Fc или R2-IFNa4-Fc представляет собой тройной пептид Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, состоящий из 15 аминокислот, который является гибким аналогом, допускающим взаимодействие между доменами²³. Были использованы клетки RAW-Lucia ISG, которые экспрессируют ген люциферазы Lucia под контролем минимального промотора ISG54 в сочетании с пятью элементами IFN-стимулированного ответа. Клетки RAW-Lucia ISG реагируют на мышиный IFN-α и IFN-β. Выполняли 5-кратное серийное разведение 20 нМ hIg, IFNa4-Fc, R1-IFNa4-Fc и R2-IFNa4-Fc для анализа активности люциферазы. Как R1-IFNa4-Fc, так и R2-IFNa4-Fc показали значимое снижение активности IFN по меньшей мере в 125 раз по сравнению с активностью IFNa4-Fc (фиг. 2A).To determine if either IFNAR1 or IFNAR2 ECD is capable of blocking interferon alpha activity, we purified IFNa4-Fc, R1-IFNa4-Fc and R2-IFNa4-Fc. The R1-IFNa4-Fc or R2-IFNa4-Fc linker is a 15 amino acid Gly-Gly-Gly-Gly-Ser ternary peptide that is a flexible analog that allows interaction between the ^23α domains. RAW-Lucia ISG cells were used that express the Lucia luciferase gene under the control of the minimal ISG54 promoter in combination with five IFN-stimulated response elements. RAW-Lucia ISG cells are responsive to mouse IFN-α and IFN-β. Performed a 5-fold serial dilution of 20 nm hIg, IFNa4-Fc, R1-IFNa4-Fc and R2-IFNa4-Fc to analyze the activity of luciferase. Both R1-IFNa4-Fc and R2-IFNa4-Fc showed a significant reduction in IFN activity of at least 125-fold compared to that of IFNa4-Fc (FIG. 2A).

Для определения, была ли активность активированного IFN-пролекарства сопоставимой с активностью IFNa4-Fc, выполняли очистку R1-NSUB, R1-SUB, R2-NSUB и R2-SUB. Линкер R1-SUB или R2-SUB представляет собой пептид, состоящий из 16 аминокислот, несущий состоящий из 6 остатков субстрат (PVGLIG)²⁴, расщепляемый протеазой, который может быть разрезан с помощью MMP-2 или MMP-9, фланкированный с двух сторон гибкими пептидами Gly-Gly-Gly-Gly-Ser. R1-NSUB и R2-NSUB без расщепляемого протеазой субстрата использовали в качестве контрольных конструкций. R1-NSUB, R1-SUB, R2-NSUB или R2-SUB инкубировали с rmMMP-9 при 37°C в течение 6 часов для активации. Активированный R1-SUB показал увеличение активности IFN в 25 раз по сравнению с активностью IFNa4-Fc, тогда как активность R1-NSUB не изменилась после введения фермента (фиг.2B). Аналогичный результат наблюдали с R2-NSUB и R2-SUB, при этом активированный R2-SUB показал еще более сильное увеличение активности IFN, более чем в 25 раз, по сравнению с IFNa4-Fc (фиг.2C).To determine if the activity of the activated IFN prodrug was comparable to that of IFNa4-Fc, purification of R1-NSUB, R1-SUB, R2-NSUB and R2-SUB was performed. The R1-SUB or R2-SUB linker is a 16 amino acid peptide bearing a 6 residue protease cleavable substrate (PVGLIG) ²⁴ that can be cut with MMP-2 or MMP-9, flanked on both sides with flexible peptides Gly-Gly-Gly-Gly-Ser. R1-NSUB and R2-NSUB without protease-cleavable substrate were used as control constructs. R1-NSUB, R1-SUB, R2-NSUB or R2-SUB were incubated with rmMMP-9 at 37°C for 6 hours for activation. Activated R1-SUB showed a 25-fold increase in IFN activity compared to IFNa4-Fc activity, while R1-NSUB activity did not change after enzyme administration (FIG. 2B). A similar result was observed with R2-NSUB and R2-SUB, with activated R2-SUB showing an even greater increase in IFN activity, over 25-fold, compared to IFNa4-Fc (FIG. 2C).

Таким образом, биологическая активность активированного протеазой IFN-пролекарства увеличивалась в обеих формах на основе IFNA1 и на основе IFNAR2, а не при ожидаемом восстановлении до эквивалентного родительского IFNa4-Fc. Более того, до расщепления протеазой IFN-пролекарство, по-видимому, имело заметно сниженную биологическую активность, что позволяет предположить, что по своему действию IFN-пролекарство будет безопасным in vivo до расщепления, но после расщепления в локальном микроокружении опухоли терапевтическая активность увеличится.Thus, the biological activity of the protease-activated IFN prodrug was increased in both the IFNA1 and IFNAR2 forms, rather than the expected recovery to the equivalent parental IFNa4-Fc. Moreover, prior to protease cleavage, the IFN prodrug appears to have markedly reduced biological activity, suggesting that the IFN prodrug would be safe in vivo prior to cleavage, but would increase therapeutic activity after cleavage in the local tumor microenvironment.

IFN-пролекарство на основе IFNAR1 и IFNAR2 демонстрирует различные противоопухолевые эффекты in vivo . Затем на мышиной модели меланомы В16 была изучена возможность преобразования локальной активации IFN-пролекарства в противоопухолевую эффективность in vivo. Без скрининга экспрессии фермента в мышиных моделях опухолей сначала изучали IFN-пролекарство, несущее расщепляемый субстрат ММР-2 и ММР-9. Мышей с установленными опухолями меланомы В16 лечили R1-SUB, R2-SUB, IFNa4-Fc или контрольным hIg. При дозе 1 нмоль (три инъекции каждые три дня) R1-SUB, R2-SUB и IFNa4-Fc имели разную эффективность в отношении подавления роста опухоли в этой модели. Через 10 дней после лечения R1-SUB ингибировал рост опухоли на 24%, R2-SUB на 57% и IFNa4-Fc на 72% относительно контрольной группы, получавшей hIg (фиг.3). An IFN prodrug based on IFNAR1 and IFNAR2 shows various antitumor effects in vivo . The possibility of converting local activation of the IFN prodrug into antitumor efficacy in vivo was then studied in a mouse model of B16 melanoma. Without screening for enzyme expression in mouse tumor models, an IFN prodrug carrying a cleavable substrate MMP-2 and MMP-9 was first studied. Mice with established B16 melanoma tumors were treated with R1-SUB, R2-SUB, IFNa4-Fc or control hIg. At a dose of 1 nmol (three injections every three days), R1-SUB, R2-SUB and IFNa4-Fc had different efficacy in suppressing tumor growth in this model. 10 days after treatment, R1-SUB inhibited tumor growth by 24%, R2-SUB by 57% and IFNa4-Fc by 72% relative to the control group treated with hIg (figure 3).

Следовательно, IFN-пролекарство на основе IFNAR2 показало более высокие противоопухолевые эффекты in vivo чем IFN-пролекарство на основе IFNAR1, что дало основание сосредоточить основное внимание в следующем исследовании на R2-SUB. Однако R2-SUB, несущий расщепляемый субстрат ММР-2 и ММР-9 имел более низкую эффективность в отношении подавления роста опухоли по сравнению с IFNa4-Fc. Было выдвинуто предположение, что улучшение эффективности IFN-пролекарства в мышиных моделях опухолей может быть достигнуто путем выбора подходящего расщепляемого линкера, являющегося субстратом.Therefore, the IFNAR2 based IFN prodrug showed superior antitumor effects in vivo than the IFNAR1 based IFN prodrug, which led to the focus of the next study on R2-SUB. However, R2-SUB carrying the cleavable substrate MMP-2 and MMP-9 had a lower efficacy in suppressing tumor growth compared to IFNa4-Fc. It has been suggested that improvement in the efficacy of the IFN prodrug in mouse tumor models can be achieved by selecting an appropriate cleavable substrate linker.

IFN-пролекарство на основе IFNAR2 имеет улучшенную эффективность и уменьшенные побочные эффекты. Для выбора более выгодного расщепляемого линкера, являющегося субстратом, на мышиных моделях опухолей был выполнен скрининг наиболее изученных протеаз, которые, как известно, являются активированными во многих различных раковых заболеваниях человека. Этот процесс выбора субстрата включал контр-отбор в отношении протеаз, экспрессируемых в нормальных здоровых тканях, для снижения вероятности системной (неспецифической) активации IFN-пролекарства. Мышей с установленными опухолями меланомы B16 или опухолями толстой кишки MC38 умерщвляли, а опухолевые ткани и нормальные ткани, включая селезенку, сердце, печень, легкое и почку, использовали для определения уровня экспрессии мРНК следующих генов протеаз: uPA, MMP-2, MMP-9 и MMP-14. uPA имел высокие уровни экспрессии только в почках, но не в двух опухолевых тканях (фиг.4А). ММР-2 имел высокие уровни экспрессии в опухолях МС38, но не в опухолях В16; однако он имел высокий фон в сердце и легких (фиг. 4B). Уровень экспрессии ММР-9 был очень низким во всех нормальных и опухолевых тканях (фиг.4С). Наконец, опухоли MC38 и B16 имели высокий уровень экспрессии MMP-14, тогда как, напротив, экспрессия MMP-14 в нормальных тканях оказалась минимальной (фиг.4D). Данные скрининга на мышиных моделях опухолей показали, что расщепляемый линкер, являющийся субстратом, чувствительным к ММР-14, можно использовать для получения потенциального IFN-пролекарства in vivo. The IFNAR2 based IFN prodrug has improved efficacy and reduced side effects. In order to select a more advantageous cleavable substrate linker, the most studied proteases, which are known to be activated in many different human cancers, were screened in murine tumor models. This substrate selection process involved counter-selection for proteases expressed in normal healthy tissues to reduce the likelihood of systemic (non-specific) activation of the IFN prodrug. Mice with established B16 melanoma tumors or MC38 colon tumors were sacrificed, and tumor tissues and normal tissues, including spleen, heart, liver, lung, and kidney, were used to determine the level of mRNA expression of the following protease genes: uPA, MMP-2, MMP-9 and MMP-14. uPA was only highly expressed in the kidneys, but not in the two tumor tissues (FIG. 4A). MMP-2 was highly expressed in MC38 tumors but not in B16 tumors; however, it had a high background in the heart and lungs (Fig. 4B). The expression level of MMP-9 was very low in all normal and tumor tissues (Fig. 4C). Finally, MC38 and B16 tumors had a high level of expression of MMP-14, while, on the contrary, the expression of MMP-14 in normal tissues was minimal (Fig.4D). Screening data in mouse tumor models indicated that a cleavable linker, which is a MMP-14 sensitive substrate, can be used to generate a potential IFN prodrug in vivo .

Также был проанализирован уровень экспрессии человеческих протеаз между опухолью и соседними нормальными тканями. Модуль DiffExp в TIMER (ресурсе для оценки опухолевого иммунитета) обеспечивает сравнение уровней экспрессии генов для всех образцов из TCGA (Атлас генома рака). Была проведена оценка большинства ассоциированных с опухолью ферментов, и было обнаружено, что ММР-1, ММР-3, ММР-9, ММР-10, ММР-11, ММР-12, ММР-13 и ММР-14 являются протеазами, которые являются сильно активированными в большинстве опухолей, но имеют относительно низкий фон в нормальных тканях (фиг. 6A-H). Эти протеазы являются отличными кандидатами для разработки пролекарства человеческого IFN для достижения максимального противоопухолевого эффекта и минимального побочного воздействия на нормальные ткани. Интересно, что согласованные данные об уровне экспрессии ММР-14 в образцах как у мышей, так и у людей увеличивают надежность выбора субстрата ММР-14 в получении IFN-пролекарства.The expression level of human proteases between the tumor and adjacent normal tissues was also analyzed. The DiffExp module in TIMER (Tumor Immunity Assessment Resource) provides a comparison of gene expression levels for all samples from the TCGA (Cancer Genome Atlas). Most of the tumor-associated enzymes have been evaluated and it has been found that MMP-1, MMP-3, MMP-9, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13 and MMP-14 are proteases that are highly upregulated in most tumors, but have a relatively low background in normal tissues (FIGS. 6A-H). These proteases are excellent candidates for the development of a human IFN prodrug to achieve maximum antitumor effect and minimal side effects on normal tissues. Interestingly, consistent data on the level of expression of MMP-14 in samples from both mice and humans increase the reliability of the choice of MMP-14 substrate in obtaining IFN prodrug.

Поэтому было разработано и очищено IFN-пролекарство на основе IFNAR2 и субстрата MMP-14 (SGRSENIRTA)²⁵. Было проведено изучение потенциальных преимуществ в отношении безопасности и противоопухолевой эффективности in vivo. Мышей с установленными опухолями меланомы B16-OVA лечили R2-SUB, IFNa4-Fc или контрольным hIg, которые вводили в виде трех инъекций в дозе 1 мМ в течение каждых трех дней. Было проведено сравнение относительной безопасности IFN-пролекарства и IFNa4-Fc. Высокие уровни воспалительных цитокинов в сыворотке, включая IL-6, TNF, MCP-1 и IFN-g, наблюдались в группе IFNa4-Fc на следующий день после третьего введения. Напротив, мыши, получавшие R2-SUB, показали очень низкие уровни этих воспалительных цитокинов (фиг. 5А). Уровень ALT, указывающий на токсичность по отношению к печени, также показал аналогичные результаты (фиг.5B).Therefore, an IFN prodrug based on IFNAR2 and MMP-14 substrate (SGRSENIRTA) ²⁵ was developed and purified. Potential benefits in terms of safety and antitumor efficacy in vivo have been studied. Mice with established B16-OVA melanoma tumors were treated with R2-SUB, IFNa4-Fc, or control hIg administered as three injections of 1 mM every three days. The relative safety of IFN prodrug and IFNa4-Fc was compared. High levels of inflammatory cytokines in serum, including IL-6, TNF, MCP-1 and IFN-g, were observed in the IFNa4-Fc group the day after the third injection. In contrast, mice treated with R2-SUB showed very low levels of these inflammatory cytokines (FIG. 5A). The level of ALT indicating liver toxicity also showed similar results (FIG. 5B).

Продолжали выполнять мониторинг роста опухоли и массы тела. Через 12 дней после лечения R2-SUB ингибировал рост опухоли на 76%, а IFNa4-Fc на 67% по сравнению с контрольной группой, получавшей лечение hIg (фиг.5C). Однако в этот момент мыши из группы, получавшей IFN-4-Fc, выглядели больными (отстраненными, неактивными и худыми), вероятно, из-за серьезных побочных эффектов, вызванных IFN. Затем было проведено сравнение кинетики веса тела. Данные показали, что мыши из группы IFNa4-Fc начали быстро терять вес после третьего введения, однако масса тела мышей из группы R2-SUB значительно не изменилась после трех введений (фиг.5D). Наконец, на кривой выживаемости, основанной на токсичности, было показано, что группа, получавшая R2-SUB, имела выживаемость 100%, в то время как группа, получавшая IFNa4-Fc, продемонстрировала выживаемость 33% (фиг.5E).Monitoring of tumor growth and body weight continued. At 12 days post-treatment, R2-SUB inhibited tumor growth by 76% and IFNa4-Fc by 67% compared to the hIg-treated control group (FIG. 5C). However, at this point, the mice in the IFN-4-Fc group appeared ill (distracted, inactive, and lean), probably due to severe side effects caused by IFN. Then a comparison was made of the kinetics of body weight. The data showed that mice from the IFNa4-Fc group began to rapidly lose weight after the third injection, however, the body weight of mice from the R2-SUB group did not change significantly after three injections (FIG. 5D). Finally, the toxicity-based survival curve showed that the R2-SUB group had a 100% survival rate, while the IFNa4-Fc group showed a 33% survival rate (FIG. 5E).

Пролекарство человеческого IFN основе рецептора интерферона альфа и бета (IFNAR).Prodrug of human IFN-based interferon receptor alfa and beta (IFNAR).

Для определения, способен ли ECD человеческого IFNAR1 или IFNAR2 блокировать активность человеческого интерферона альфа 2, была выполнена очистка человеческих IFNa2-Fc, R1-IFNa2-Fc и R2-IFNa2-Fc. Линкер R1-IFNa2-Fc или R2-IFNa2-Fc представлял собой тройной пептид Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, состоящий из 15 аминокислот (SEQ ID NO: 13), который представляет собой гибкий линкер, допускающий взаимодействие между доменами²³. Были использованы репортерные клетки 293T-Dual^ТМ hSTING-R232, экспрессирующие репортерный ген SEAP (секретируемая эмбриональная щелочная фосфатаза) под контролем минимального промотора IFN-β, слитого с пятью связывающими участками NF-κB и AP-1. Клетки 293T-Dual^ТМ hSTING-R232 чувствительны к человеческому IFN-α и IFN-β. Выполняли 10-кратное серийное разведение 50 нМ человеческих IFNa2-Fc, R1-IFNa2-Fc и R2-IFNa2-Fc для анализа гена-репортера SEAP. По сравнению с человеческим IFNa2-Fc, R1-IFNa2-Fc показал уменьшение активности IFN в 10 раз, тогда как R2-IFNa2-Fc показал уменьшение активности IFN в 100 раз (фиг.7A). Таким образом, IFNAR2 является более эффективным блокирующим агентом для человеческого IFN.To determine whether human IFNAR1 or IFNAR2 ECD is capable of blocking human interferon alfa 2 activity, purification of human IFNa2-Fc, R1-IFNa2-Fc and R2-IFNa2-Fc was performed. The R1-IFNa2-Fc or R2-IFNa2-Fc linker was a 15 amino acid Gly-Gly-Gly-Gly-Ser ternary peptide (SEQ ID NO: 13), which is a flexible linker allowing interaction between the ^23α domains. 293T-Dual ^TM hSTING-R232 reporter cells were used expressing the reporter gene SEAP (Secreted Embryonic Alkaline Phosphatase) under the control of the minimal IFN-β promoter fused to the five binding sites of NF-κB and AP-1. Cells 293T-Dual ^TM hSTING-R232 sensitive to human IFN-α and IFN-β. A 10-fold serial dilution of 50 nM human IFNa2-Fc, R1-IFNa2-Fc and R2-IFNa2-Fc was performed to analyze the SEAP reporter gene. Compared to human IFNa2-Fc, R1-IFNa2-Fc showed a 10-fold decrease in IFN activity, while R2-IFNa2-Fc showed a 100-fold decrease in IFN activity (FIG. 7A). Thus, IFNAR2 is a more effective blocking agent for human IFN.

Для определения, является ли активность активированного человеческого IFN-пролекарства сопоставимой с активностью IFNa2-Fc, выполняли очистку человеческих R2-NSUB и R2-SUB. Линкер R2-SUB представляет собой пептид, состоящий из 16 аминокислот, несущий состоящий из 6 остатков субстрат (PVGLIG)²⁴, расщепляемый протеазой, который можно разрезать с помощью MMP-2 или MMP-9, фланкированный с обеих сторон гибким пептидом Gly-Gly-Gly-Gly-Сер. R2-NSUB без расщепляемого протеазой субстрата использовали в качестве контрольных конструкций. R2-NSUB или R2-SUB инкубировали с rmMMP-9 при 37°C в течение 0, 0,5, 2 или 6 часов. Человеческий R2-SUB расщепляли rmMMP-9 в зависимости от времени. Через 6 часов эффективность расщепления составила 100% (фиг. 7C). Активированный человеческий R2-SUB показал сопоставимую активность IFN по сравнению с человеческим IFNa2-Fc, тогда как активность R2-NSUB не изменилась после введения фермента (фиг.7B).To determine if the activity of the activated human IFN prodrug is comparable to that of IFNa2-Fc, purification of human R2-NSUB and R2-SUB was performed. The R2-SUB linker is a 16 amino acid peptide bearing a 6 residue protease cleavable substrate (PVGLIG) ²⁴ that can be cut with MMP-2 or MMP-9, flanked on both sides by a flexible Gly-Gly- peptide. Gly-Gly-Ser. R2-NSUB without protease-cleavable substrate was used as control constructs. R2-NSUB or R2-SUB was incubated with rmMMP-9 at 37°C for 0, 0.5, 2 or 6 hours. Human R2-SUB was digested with rmMMP-9 in a time dependent manner. After 6 hours, the cleavage efficiency was 100% (FIG. 7C). Activated human R2-SUB showed comparable IFN activity to human IFNa2-Fc, while R2-NSUB activity did not change after enzyme administration (FIG. 7B).

Таким образом, биологическая активность активируемого протеазой пролекарства человеческого IFN полностью восстанавливалась в форме на основе IFNAR2 по сравнению с родительским IFNa4-Fc. Кроме того, пролекарство человеческого IFN на основе IFNAR2, по-видимому, имело заметно уменьшенную биологическую активность до расщепления протеазой, что свидетельствует о том, что пролекарство человеческого IFN будет до расщепления безопасным in vivo, но после расщепления в локальном микроокружении опухоли у человека его терапевтическая активность увеличится.Thus, the biological activity of the protease-activated human IFN prodrug was completely restored in the IFNAR2-based form compared to the parental IFNa4-Fc. In addition, the IFNAR2-based human IFN prodrug appeared to have a markedly reduced biological activity prior to protease cleavage, suggesting that the human IFN prodrug would be safe in vivo prior to cleavage, but would be therapeutic after cleavage in the local human tumor microenvironment. activity will increase.

Таким образом, изученное в настоящей заявке IFN-пролекарство обеспечивает улучшенное нацеливание интерферона I типа на опухолевую ткань за счет уменьшения токсичности в нормальных тканях. Противоопухолевая эффективность IFN-пролекарства может быть адаптирована с учетом активности протеазы в каждой опухоли, что в определенных ситуациях делает IFN-пролекарство персонализированным лекарственным средством с выбранным расщепляемым линкером, являющимся субстратом, обеспечивающим наилучший результат. Кроме того, IFN-пролекарство может быть разработано для переноса нескольких доменов IFN с использованием разных линкеров, которые чувствительны к разным протеазам, тем самым значительно улучшая его терапевтический эффект.Thus, the IFN prodrug studied here provides improved targeting of type I interferon to tumor tissue by reducing toxicity in normal tissues. The antitumor efficacy of an IFN prodrug can be tailored to the protease activity in each tumor, making the IFN prodrug a personalized drug in certain situations, with the selected cleavable linker substrate providing the best outcome. In addition, an IFN prodrug can be designed to transfer multiple IFN domains using different linkers that are sensitive to different proteases, thereby greatly improving its therapeutic effect.

Все композиции и способы, раскрытые и заявленные в настоящем описании, могут быть изготовлены и выполнены с учетом настоящего описания без чрезмерного экспериментирования. Хотя композиции и способы по изобретению описаны в терминах предпочтительных вариантов осуществления, специалистам в данной области техники должно быть очевидно, что могут быть введены изменения в композиции и способы, а также в этапы способов и в последовательность выполнения этапов без отступления от концепции, сущности и объема изобретения. Более конкретно, будет очевидно, что определенные агенты, которые являются как химически, так и физиологически родственными, могут заменить агенты, описанные в настоящей заявке, с достижением таких же или аналогичных результатов. Все подобные аналогичные заместители и модификации, очевидные специалистам в данной области техники, считаются находящимися в пределах сущности, объема и концепции изобретения, определенного в прилагаемой формуле изобретения.All compositions and methods disclosed and claimed in the present description can be made and performed in view of the present description without undue experimentation. While the compositions and methods of the invention are described in terms of the preferred embodiments, it should be apparent to those skilled in the art that changes can be made to the compositions and methods, as well as to the method steps and the sequence of steps, without departing from the concept, spirit, and scope. inventions. More specifically, it will be apparent that certain agents that are both chemically and physiologically related can replace the agents described in this application, with the same or similar results. All such analogous substituents and modifications obvious to those skilled in the art are considered to be within the spirit, scope and concept of the invention as defined in the appended claims.

VII. ЛИТЕРАТУРАVII. LITERATURE

Приведенные ниже документы в той мере, в которой они предоставляют примеры выполнения процедур или иные подробности, дополняющие изложенную в настоящем описании информацию, специально включены в настоящее описание в качестве ссылки.The following documents, to the extent that they provide examples of performing procedures or other details that supplement the information set forth in the present description, are expressly incorporated herein by reference.

Almendro et al., J. Immunol., 157(12):5411-5421, 1996.Almendro et al. , J. Immunol ., 157(12):5411-5421, 1996.

Antonelli et al., Cytokine Growth Factor Rev 26, 121-131, 2015.Antonelli et al. , Cytokine Growth Factor Rev 26, 121-131, 2015.

Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1994.Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY, 1994.

Bates, Mol. Biotechnol., 2(2):135-145, 1994.Bates, Mol. Biotechnol ., 2(2):135-145, 1994.

Battraw and Hall, Theor. App. Genet., 82(2):161-168, 1991.Battraw and Hall, Theor. app. Genet ., 82(2):161-168, 1991.

Bellus, J. Macromol. Sci. Pure Appl. Chem., A31(1): 1355-1376, 1994.Bellus, J. Macromol. sci. Pure Apple. Chem. , A31(1): 1355-1376, 1994.

Bhattacharjee et al., J. Plant Bioch. Biotech., 6(2):69-73. 1997.Bhattacharjee et al. , J. Plant Bioch. Biotech ., 6(2):69-73. 1997.

Burnette et al., Cancer Res 71, 2488-2496, 2011.Burnette et al. , Cancer Res 71, 2488-2496, 2011.

Capaldi et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 74(2):425-433, 1977.Capaldi et al. , Biochem. Biophys. Res. Comm ., 74(2):425-433, 1977.

Carbonelli et al., FEMS Microbiol. Lett., 177(1):75-82, 1999.Carbonelli et al. , FEMS Microbiol. Lett ., 177(1):75-82, 1999.

Chen and Okayama, Mol. Cell Biol., 7(8):2745-2752, 1987.Chen and Okayama, Mol. Cell Biol ., 7(8):2745-2752, 1987.

Christou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84(12):3962-3966, 1987.Christou et al. , Proc. Natl. Acad. sci. USA , 84(12):3962-3966, 1987.

Cocea, Biotechniques, 23(5):814-816, 1997.Cocea, Biotechniques , 23(5):814-816, 1997.

D’Halluin et al., Plant Cell, 4(12):1495-1505, 1992. D'Halluin et al. , Plant Cell , 4(12):1495-1505, 1992.

De Jager et al., Semin. Nucl. Med., 23(2):165-179, 1993.De Jager et al., Semin. Nucl. Med. , 23(2):165-179, 1993.

Desnoyers et al., Sci Transl Med 5, 207ra144, 2013.Desnoyers et al. , Sci Transl Med 5, 207ra144, 2013.

Doolittle and Ben-Zeev, Methods Mol. Biol., 109, :215-237, 1999.Doolittle and Ben-Zeev, Methods Mol. Biol ., 109:215-237, 1999.

EPO 0273085EPO 0273085

Erster, et al., J Control Release 161, 804-812, 2012.Erster, et al. , J Control Release 161, 804-812, 2012.

Fechheimer et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA, 84:8463-8467, 1987.Fechheimer et al. , Proc Natl. Acad. sci. USA , 84:8463-8467, 1987.

Ferrantini et al., Biochimie 89, 884-893, 2007.Ferrantini et al. , Biochimie 89, 884-893, 2007.

Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3348-3352, 1979.Fraley et al. , Proc. Natl. Acad. sci. USA , 76:3348-3352, 1979.

Frohman, In: PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications, Academic Press, N.Y., 1990.Frohman, In: PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications , Academic Press, NY, 1990.

Gabrilovich & Nagaraj, Nat Rev Immunol 9, 162-174, 2009.Gabrilovich & Nagaraj, Nat Rev Immunol 9, 162-174, 2009.

GB Application No. 2 202 328GB Application No. 2 202 328

Ghosh and Bachhawat, In: Liver Diseases, Targeted Diagnosis and Therapy Using Specific Receptors and Ligands, Wu et al. (Eds.), Marcel Dekker, NY, 87-104, 1991.Ghosh and Bachhawat, In: Liver Diseases, Targeted Diagnosis and Therapy Using Specific Receptors and Ligands, Wu et al. (Eds.), Marcel Dekker, NY, 87-104, 1991.

Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190, 1985.Gopal, Mol. Cell Biol ., 5:1188-1190, 1985.

Graham and Van Der Eb, Virology, 52:456-467, 1973.Graham and Van Der Eb, Virology , 52:456-467, 1973.

Greene et al., Immunology Today, 10:272, 1989.Greene et al. , Immunology Today , 10:272, 1989.

Harland and Weintraub, J. Cell Biol., 101(3):1094-1099, 1985.Harland and Weintraub, J. Cell Biol ., 101(3):1094-1099, 1985.

He et al., Plant Cell Reports, 14 (2-3):192-196, 1994.He et al. , Plant Cell Reports , 14(2-3):192-196, 1994.

Hou and Lin, Plant Physiology, 111:166, 1996.Hou and Lin, Plant Physiology , 111:166, 1996.

Imai et al., Nephrologie, 19(7):397-402, 1998.Imai et al. , Nephrologie , 19(7):397-402, 1998.

Kaeppler et al., Plant Cell Rep., 8:415-418, 1990.Kaeppler et al. , Plant Cell Rep ., 8:415-418, 1990.

Kaneda et al., Science, 243:375-378, 1989.Kaneda et al. , Science , 243:375-378, 1989.

Kato et al., J. Biol. Chem., 266:3361 3364, 1991.Kato et al ., J. Biol. Chem ., 266:3361 3364, 1991.

Kato et al., N Engl J Med, 350:1713-21, 2004.Kato et al., N Engl J Med, 350:1713-21, 2004.

Khanna, Immunol Cell Biol 76, 20-26, 1998.Khanna, Immunol Cell Biol 76, 20-26, 1998.

Kraus et al., FEBS Lett., 428(3):165-170, 1998.Kraus et al., FEBS Lett ., 428(3):165-170, 1998.

Kreutzer et al., J Dtsch Dermatol Ges 2, 689-694, 2004.Kreutzer et al. , J Dtsch Dermatol Ges 2, 689-694, 2004.

Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1173, 1989.Kwoh et al. , Proc. Natl. Acad. sci. USA 86:1173, 1989.

Lareyre et al., J. Biol. Chem., 274(12):8282-8290, 1999.Lareyre et al. J. Biol. Chem ., 274(12):8282-8290, 1999.

Lazzeri, Methods Mol. Biol., 49:95-106, 1995.Lazzeri, Methods Mol. Biol ., 49:95-106, 1995.

Lee et al., Clin Cancer Res, 14:7397-404, 2008. Lee et al., Clin Cancer Res, 14:7397-404, 2008.

Lee et al., Environ. Mol. Mutagen., 13(1):54-59, 1989.Lee et al. , Environ. Mol. Mutagen ., 13(1):54-59, 1989.

Levenson et al., Hum. Gene Ther., 9(8):1233-1236, 1998.Levenson et al. , Hum. Gene Ther ., 9(8):1233-1236, 1998.

Lotrich, Dialogues Clin Neurosci 11, 417-425, 2009.Lotrich, Dialogues Clin Neurosci 11, 417-425, 2009.

Macejak and Sarnow, Nature, 353:90-94, 1991.Macejak and Sarnow, Nature , 353:90-94, 1991.

Moschos & Kirkwood, Cytokine Growth Factor Rev 18, 451-458, 2007.Moschos & Kirkwood, Cytokine Growth Factor Rev 18, 451-458, 2007.

Nakamura et al., In: Handbook of Experimental Immunology (4^th Ed.), Weir et al. (Eds), 1:27, Blackwell Scientific Publ., Oxford, 1987.Nakamura et al. , In: Handbook of Experimental Immunology (4th ^Ed .), Weir et al. (Eds), 1:27, Blackwell Scientific Publ., Oxford, 1987.

Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190, 1982.Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta , 721:185-190, 1982.

Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176, 1987.Nicolau et al. , Methods Enzymol ., 149:157-176, 1987.

Nomoto et al., Gene, 236(2):259-271, 1999.Nomoto et al. , Gene , 236(2):259-271, 1999.

Ohara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:5673-5677, 1989.Ohara et al., Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 86:5673-5677, 1989.

Olaussen et al., Curr Opin Pulm Med, 13:284-9, 2007.Olaussen et al., Curr Opin Pulm Med, 13:284-9, 2007.

Olaussen et al., N Engl J Med, 355:983-91, 2006.Olaussen et al., N Engl J Med, 355:983-91, 2006.

Omirulleh et al., Plant Mol. Biol., 21(3):415-428, 1993.Omirulleh et al. , Plant Mol. Biol ., 21(3):415-428, 1993.

Pace et al., J Immunol 184, 5969-5979, 2010.Pace et al. , J Immunol 184, 5969-5979, 2010.

Parker et al., Nat Rev Cancer 16, 131-144, 2016.Parker et al. , Nat Rev Cancer 16, 131-144, 2016.

PCT Appln. WO 92/17598PCT Appln. W092/17598

PCT Appln. WO 94/09699PCT Appln. W094/09699

Pelletier and Sonenberg, Nature, 334(6180):320-325, 1988.Pelletier and Sonenberg, Nature , 334(6180):320-325, 1988.

Perales et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:4086 4090, 1994.Perales et al. , Proc. Natl. Acad. sci. USA 91:4086 4090, 1994.

Potrykus et al., Mol. Gen. Genet., 199(2):169-177, 1985.Potrykus et al. , Mol. Gen. Genet ., 199(2):169-177, 1985.

Potter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:7161-7165, 1984.Potter et al. , Proc. Natl. Acad. sci. USA , 81:7161-7165, 1984.

Remington’s Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., 33:624-652, 1990.Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., 33:624-652, 1990.

Rhodes et al., Methods Mol. Biol., 55:121 131, 1995.Rhodes et al. , Methods Mol. Biol ., 55:121 131, 1995.

Rippe, et al., Mol. Cell Biol., 10:689-695, 1990.Rippe, et al. , Mol. Cell Biol ., 10:689-695, 1990.

Roepman et al., Clin Cancer Res, 15:284-90, 2009.Roepman et al., Clin Cancer Res, 15:284-90, 2009.

Sambrook et al., In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.Sambrook et al. , In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Schiavoni et al., Cancer Res 71, 768-778, 2011.Schiavoni et al. , Cancer Res 71, 768-778, 2011.

Schmidt et al., Front Immunol 3, 51, 2012.Schmidt et al. , Front Immunol 3, 51, 2012.

Sharma et al., Cell 168, 707-723, 2017.Sharma et al. , Cell 168, 707-723, 2017.

Sleijfer et al., Pharm World Sci 27, 423-431, 2005.Sleijfer et al. , Pharm World Science 27, 423-431, 2005.

Srivastava et al., J Exp Med 211, 961-974, 2014.Srivastava et al. , J Exp Med 211, 961-974, 2014.

Stagg et al., Proc Nat’l Acad Sci USA 108, 7142-7147, 2011.Stagg et al. , Proc Nat'l Acad Sci USA 108, 7142-7147, 2011.

Stella et al., Drugs 29, 455-473, 1985.Stella et al. , Drugs 29, 455-473, 1985.

Tsukada et al., Plant Cell Physiol., 30(4)599-604, 1989.Tsukada et al. , Plant Cell Physiol ., 30(4)599-604, 1989.

Tsumaki et al., J. Biol. Chem., 273(36):22861-22864, 1998.Tsumaki et al. J. Biol. Chem ., 273(36):22861-22864, 1998.

Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718, 1986. Tur-Kaspa et al. , Mol. Cell Biol ., 6:716-718, 1986.

Патент США 3817837US Patent 3,817,837

Патент США 3850752US Patent 3850752

Патент США 3939350US Patent 3939350

Патент США 3996345US Patent 3996345

Патент США 4275,149US Patent 4275,149

Патент США 4277437US Patent 4277437

Патент США 4366241US Patent 4366241

Патент США 4415723US Patent 4415723

Патент США 4458066US Patent 4458066

Патент США 4683195US Patent 4683195

Патент США 4683202US Patent 4683202

Патент США 4684611US Patent 4,684,611

Патент США 4800159US Patent 4,800,159

Патент США 4879236US Patent 4,879,236

Патент США 4883750US Patent 4,883,750

Патент США 4952500US Patent 4,952,500

Патент США 5143854US Patent 5143854

Патент США 5202231US Patent 5202231

Патент США 5242974US Patent 5242974

Патент США 5279721US Patent 5279721

Патент США 5288644US Patent 5288644

Патент США 5302523US Patent 5302523

Патент США 5322783US Patent 5322783

Патент США 5324633US Patent 5324633

Патент США 5384253US Patent 5384253

Патент США 5384261US Patent 5384261

Патент США 5405783US Patent 5405783

Патент США 5412087US Patent 5412087

Патент США 5424186US Patent 5424186

Патент США 5429807US Patent 5429807

Патент США 5432049US Patent 5432049

Патент США 5436327US Patent 5436327

Патент США 5445934US Patent 5445934

Патент США 5464765US Patent 5464765

Патент США 5468613US Patent 5468613

Патент США 5470710US Patent 5470710

Патент США 5472672US Patent 5472672

Патент США 5492806US Patent 5492806

Патент США 5503980US Patent 5503980

Патент США 5510270US Patent 5510270

Патент США 5525464US Patent 5525464

Патент США 5527681US Patent 5527681

Патент США 5529756US Patent 5529756

Патент США 5532128US Patent 5532128

Патент США 5538877US Patent 5538877

Патент США 5538880US Patent 5538880

Патент США 5545531US Patent 5545531

Патент США 5547839US Patent 5547839

Патент США 5550318US Patent 5550318

Патент США 5554501US Patent 5554501

Патент США 5556752US Patent 5556752

Патент США 5561071US Patent 5561071

Патент США 5563055US Patent 5563055

Патент США 5571639US Patent 5,571,639

Патент США 5580726US Patent 5580726

Патент США 5580732US Patent 5580732

Патент США 5580859US Patent 5580859

Патент США 5589466US Patent 5589466

Патент США 5593839US Patent 5593839

Патент США 5599672US Patent 5599672

Патент США 5599695US Patent 5599695

Патент США 5610042US Patent 5610042

Патент США 5610287US Patent 5610287

Патент США 5624711US Patent 5624711

Патент США 5631134US Patent 5631134

Патент США 5639603US Patent 5639603

Патент США 5654413US Patent 5654413

Патент США 5656610US Patent 5656610

Патент США 5658734US Patent 5658734

Патент США 5661028US Patent 5661028

Патент США 5665547US Patent 5665547

Патент США 5667972US Patent 5667972

Патент США 5670488US Patent 5670488

Патент США 5695940US Patent 5695940

Патент США 5700637US Patent 5,700,637

Патент США 5702932US Patent 5702932

Патент США 5736524US Patent 5736524

Патент США 5739018US Patent 5739018

Патент США 5739169US Patent 5739169

Патент США 5744305US Patent 5744305

Патент США 5780448US Patent 5,780,448

Патент США 5789215US Patent 5789215

Патент США 5795715US Patent 5,795,715

Патент США 5800992US Patent 5,800,992

Патент США 5801005US Patent 5801005

Патент США 5807522US Patent 5,807,522

Патент США 5824311US Patent 5,824,311

Патент США 5830645US Patent 5,830,645

Патент США 5830880US Patent 5830880

Патент США 5837196US Patent 5,837,196

Патент США 5840873US Patent 5840873

Патент США 5843640US Patent 5843640

Патент США 5843650US Patent 5843650

Патент США 5843651US Patent 5843651

Патент США 5843663US Patent 5843663

Патент США 5846708US Patent 5846708

Патент США 5846709US Patent 5846709

Патент США 5846717US Patent 5846717

Патент США 5846726US Patent 5846726

Патент США 5846729US Patent 5846729

Патент США 5846783US Patent 5846783

Патент США 5846945US Patent 5846945

Патент США 5847219US Patent 5847219

Патент США 5849481US Patent 5849481

Патент США 5849486US Patent 5849486

Патент США 5849487US Patent 5849487

Патент США 5849497US Patent 5849497

Патент США 5849546US Patent 5849546

Патент США 5849547US Patent 5,849,547

Патент США 5851772US Patent 5,851,772

Патент США 5853990US Patent 5,853,990

Патент США 5853992US Patent 5,853,992

Патент США 5853993US Patent 5,853,993

Патент США 5856092US Patent 5,856,092

Патент США 5858652US Patent 5858652

Патент США 5861244US Patent 5,861,244

Патент США 5863732US Patent 5,863,732

Патент США 5863753US Patent 5863753

Патент США 5866331US Patent 5,866,331

Патент США 5866366US Patent 5,866,366

Патент США 5871928US Patent 5871928

Патент США 5871986US Patent 5871986

Патент США 5876932US Patent 5,876,932

Патент США 5882864US Patent 5,882,864

Патент США 5889136US Patent 5889136

Патент США 5900481US Patent 5900481

Патент США 5905024US Patent 5905024

Патент США 5910407US Patent 5910407

Патент США 5912124US Patent 5912124

Патент США 5912145US Patent 5912145

Патент США 5912148US Patent 5912148

Патент США 5916776US Patent 5916776

Патент США 5916779US Patent 5916779

Патент США 5919626US Patent 5919626

Патент США 5919630US Patent 5919630

Патент США 5922574US Patent 5922574

Патент США 5925517US Patent 5925517

Патент США 5925565US Patent 5925565

Патент США 5928862US Patent 5928862

Патент США 5928869US Patent 5928869

Патент США 5928905US Patent 5928905

Патент США 5928906US Patent 5928906

Патент США 5929227US Patent 5929227

Патент США 5932413US Patent 5932413

Патент США 5932451US Patent 5932451

Патент США 5935791US Patent 5935791

Патент США 5935819US Patent 5935819

Патент США 5935825US Patent 5935825

Патент США 5939291US Patent 5939291

Патент США 5942391US Patent 5942391

Патент США 5945100US Patent 5945100

Патент США 5981274US Patent 5981274

Патент США 5994624US Patent 5994624

Патент США 6004755US Patent 6004755

Патент США 6087102US Patent 6087102

Патент США 6368799US Patent 6368799

Патент США 6383749US Patent 6383749

Патент США 6506559US Patent 6506559

Патент США 6573099US Patent 6573099

Патент США 6617112US Patent 6617112

Патент США 6638717US Patent 6638717

Патент США 6720138US Patent 6720138

Публикация заявки на патент США 2002/0168707US Patent Application Publication 2002/0168707

Публикация заявки на патент США 2003/0051263US Patent Application Publication 2003/0051263

Публикация заявки на патент США 2003/0055020US Patent Application Publication 2003/0055020

Публикация заявки на патент США 2003/0159161US Patent Application Publication 2003/0159161

Публикация заявки на патент США 2004/0064842US Patent Application Publication 2004/0064842

Публикация заявки на патент США 2004/0265839U.S. Patent Application Publication 2004/0265839

Публикация заявки на патент США 2008/0009439US Patent Application Publication 2008/0009439

Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(9):3410-3414, 1990.Wagner et al. , Proc. Natl. Acad. Sci . USA 87(9):3410-3414, 1990.

Walker et al., Nucleic Acids Res. 20(7):1691-1696, 1992.Walker et al. , Nucleic Acids Res. 20(7):1691-1696, 1992.

Weir et al., Nature, 450:893-8, 2007.Weir et al., Nature, 450:893-8, 2007.

Woo et al., Immunity 41, 830-842, 2014.Woo et al. , Immunity 41, 830-842, 2014.

Wu and Wu, Adv. Drug Delivery Rev., 12:159 167, 1993.Wu and Wu, Adv. Drug Delivery Rev. , 12:159 167, 1993.

Wu and Wu, J. Biol. Chem., 262:4429 4432, 1987.Wu and Wu, J. Biol. Chem ., 262:4429 4432, 1987.

Wu et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 233(1):221-226, 1997.Wu et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun ., 233(1):221-226, 1997.

Wu et al., Cancer Res., 58(8): 1605-8, 1998.Wu et al. , Cancer Res ., 58(8): 1605-8, 1998.

Zhao-Emonet et al., Biochim. Biophys. Acta, 1442(2-3):109-119, 1998. Zhao-Emonet et al. , Biochim. Biophys. Acta , 1442(2-3):109-119, 1998.

Zhou et al., Nature, 361(6412):543-547 , 1993.Zhou et al. , Nature , 361(6412):543-547 , 1993.

Zitvogel et al., Nat Rev Immunol 15, 405-414, 2015.Zitvogel et al. , Nat Rev Immunol 15, 405-414, 2015.

Zoglmeier et al., Clin Cancer Res 17, 1765-1775, 2011.Zoglmeier et al. , Clin Cancer Res 17, 1765-1775, 2011.

--->--->

СПИСКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНСТЕЙ SEQUENCE LISTS

<110> The Board of Regents of the University of Texas System<110> The Board of Regents of the University of Texas System

<120> ПРОЛЕКАРСТВО ИНТЕРФЕРОНА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА<120> INTERFERON PRODRUG FOR CANCER TREATMENT

<130> UTFD.P3214WO<130> UTFD.P3214WO

<140> PCT/US2018/037982<140> PCT/US2018/037982

<141> 2018-06-18<141> 2018-06-18

<150> US 62/522,564<150> US 62/522,564

<151> 2017-06-20<151> 2017-06-20

<160> 13 <160> 13

<170> PatentIn version 3.5<170>PatentIn version 3.5

<210> 1<210> 1

<211> 429<211> 429

<212> Белок<212> Protein

<213> Mus musculus<213> Mus musculus

<400> 1<400> 1

Met Leu Ala Val Val Gly Ala Ala Ala Leu Val Leu Val Ala Gly Ala Met Leu Ala Val Val Gly Ala Ala Ala Leu Val Leu Val Ala Gly Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Pro Trp Val Leu Pro Ser Ala Ala Gly Gly Glu Asn Leu Lys Pro Pro Pro Trp Val Leu Pro Ser Ala Ala Gly Gly Glu Asn Leu Lys Pro Pro

20 25 30 20 25 30

Glu Asn Ile Asp Val Tyr Ile Ile Asp Asp Asn Tyr Thr Leu Lys Trp Glu Asn Ile Asp Val Tyr Ile Ile Asp Asp Asn Tyr Thr Leu Lys Trp

35 40 45 35 40 45

Ser Ser His Gly Glu Ser Met Gly Ser Val Thr Phe Ser Ala Glu Tyr Ser Ser His Gly Glu Ser Met Gly Ser Val Thr Phe Ser Ala Glu Tyr

50 55 60 50 55 60

Arg Thr Lys Asp Glu Ala Lys Trp Leu Lys Val Pro Glu Cys Gln His Arg Thr Lys Asp Glu Ala Lys Trp Leu Lys Val Pro Glu Cys Gln His

65 70 75 80 65 70 75 80

Thr Thr Thr Thr Lys Cys Glu Phe Ser Leu Leu Asp Thr Asn Val Tyr Thr Thr Thr Thr Lys Cys Glu Phe Ser Leu Leu Asp Thr Asn Val Tyr

85 90 95 85 90 95

Ile Lys Thr Gln Phe Arg Val Arg Ala Glu Glu Gly Asn Ser Thr Ser Ile Lys Thr Gln Phe Arg Val Arg Ala Glu Glu Gly Asn Ser Thr Ser

100 105 110 100 105 110

Ser Trp Asn Glu Val Asp Pro Phe Ile Pro Phe Tyr Thr Ala His Met Ser Trp Asn Glu Val Asp Pro Phe Ile Pro Phe Tyr Thr Ala His Met

115 120 125 115 120 125

Ser Pro Pro Glu Val Arg Leu Glu Ala Glu Asp Lys Ala Ile Leu Val Ser Pro Pro Glu Val Arg Leu Glu Ala Glu Asp Lys Ala Ile Leu Val

130 135 140 130 135 140

His Ile Ser Pro Pro Gly Gln Asp Gly Asn Met Trp Ala Leu Glu Lys His Ile Ser Pro Pro Gly Gln Asp Gly Asn Met Trp Ala Leu Glu Lys

145 150 155 160 145 150 155 160

Pro Ser Phe Ser Tyr Thr Ile Arg Ile Trp Gln Lys Ser Ser Ser Asp Pro Ser Phe Ser Tyr Thr Ile Arg Ile Trp Gln Lys Ser Ser Ser Asp

165 170 175 165 170 175

Lys Lys Thr Ile Asn Ser Thr Tyr Tyr Val Glu Lys Ile Pro Glu Leu Lys Lys Thr Ile Asn Ser Thr Tyr Tyr Val Glu Lys Ile Pro Glu Leu

180 185 190 180 185 190

Leu Pro Glu Thr Thr Tyr Cys Leu Glu Val Lys Ala Ile His Pro Ser Leu Pro Glu Thr Thr Tyr Cys Leu Glu Val Lys Ala Ile His Pro Ser

195 200 205 195 200 205

Leu Lys Lys His Ser Asn Tyr Ser Thr Val Gln Cys Ile Ser Thr Thr Leu Lys Lys His Ser Asn Tyr Ser Thr Val Gln Cys Ile Ser Thr Thr

210 215 220 210 215 220

Val Ala Asn Lys Met Pro Val Pro Gly Asn Leu Gln Val Asp Ala Gln Val Ala Asn Lys Met Pro Val Pro Gly Asn Leu Gln Val Asp Ala Gln

225 230 235 240 225 230 235 240

Gly Lys Ser Tyr Val Leu Lys Trp Asp Tyr Ile Ala Ser Ala Asp Val Gly Lys Ser Tyr Val Leu Lys Trp Asp Tyr Ile Ala Ser Ala Asp Val

245 250 255 245 250 255

Leu Phe Arg Ala Gln Trp Leu Pro Gly Tyr Ser Lys Ser Ser Ser Gly Leu Phe Arg Ala Gln Trp Leu Pro Gly Tyr Ser Lys Ser Ser Ser Gly

260 265 270 260 265 270

Ser Arg Ser Asp Lys Trp Lys Pro Ile Pro Thr Cys Ala Asn Val Gln Ser Arg Ser Asp Lys Trp Lys Pro Ile Pro Thr Cys Ala Asn Val Gln

275 280 285 275 280 285

Thr Thr His Cys Val Phe Ser Gln Asp Thr Val Tyr Thr Gly Thr Phe Thr Thr His Cys Val Phe Ser Gln Asp Thr Val Tyr Thr Gly Thr Phe

290 295 300 290 295 300

Phe Leu His Val Gln Ala Ser Glu Gly Asn His Thr Ser Phe Trp Ser Phe Leu His Val Gln Ala Ser Glu Gly Asn His Thr Ser Phe Trp Ser

305 310 315 320 305 310 315 320

Glu Glu Lys Phe Ile Asp Ser Gln Lys His Ile Leu Pro Pro Pro Pro Glu Glu Lys Phe Ile Asp Ser Gln Lys His Ile Leu Pro Pro Pro Pro

325 330 335 325 330 335

Val Ile Thr Val Thr Ala Met Ser Asp Thr Leu Leu Val Tyr Val Asn Val Ile Thr Val Thr Ala Met Ser Asp Thr Leu Leu Val Tyr Val Asn

340 345 350 340 345 350

Cys Gln Asp Ser Thr Cys Asp Gly Leu Asn Tyr Glu Ile Ile Phe Trp Cys Gln Asp Ser Thr Cys Asp Gly Leu Asn Tyr Glu Ile Ile Phe Trp

355 360 365 355 360 365

Glu Asn Thr Ser Asn Thr Lys Ile Ser Met Glu Lys Asp Gly Pro Glu Glu Asn Thr Ser Asn Thr Lys Ile Ser Met Glu Lys Asp Gly Pro Glu

370 375 380 370 375 380

Phe Thr Leu Lys Asn Leu Gln Pro Leu Thr Val Tyr Cys Val Gln Ala Phe Thr Leu Lys Asn Leu Gln Pro Leu Thr Val Tyr Cys Val Gln Ala

385 390 395 400 385 390 395 400

Arg Val Leu Phe Arg Ala Leu Leu Asn Lys Thr Ser Asn Phe Ser Glu Arg Val Leu Phe Arg Ala Leu Leu Asn Lys Thr Ser Asn Phe Ser Glu

405 410 415 405 410 415

Lys Leu Cys Glu Lys Thr Arg Pro Gly Ser Phe Ser Thr Lys Leu Cys Glu Lys Thr Arg Pro Gly Ser Phe Ser Thr

420 425 420 425

<210> 2<210> 2

<211> 242<211> 242

<212> Белок<212> Protein

<213> Mus musculus<213> Mus musculus

<400> 2<400> 2

Met Arg Ser Arg Cys Thr Val Ser Ala Val Gly Leu Leu Ser Leu Cys Met Arg Ser Arg Cys Thr Val Ser Ala Val Gly Leu Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15 1 5 10 15

Leu Val Val Ser Ala Ser Leu Glu Thr Ile Thr Pro Ser Ala Phe Asp Leu Val Val Ser Ala Ser Leu Glu Thr Ile Thr Pro Ser Ala Phe Asp

20 25 30 20 25 30

Gly Tyr Pro Asp Glu Pro Cys Thr Ile Asn Ile Thr Ile Arg Asn Ser Gly Tyr Pro Asp Glu Pro Cys Thr Ile Asn Ile Thr Ile Arg Asn Ser

35 40 45 35 40 45

Arg Leu Ile Leu Ser Trp Glu Leu Glu Asn Lys Ser Gly Pro Pro Ala Arg Leu Ile Leu Ser Trp Glu Leu Glu Asn Lys Ser Gly Pro Pro Ala

50 55 60 50 55 60

Asn Tyr Thr Leu Trp Tyr Thr Val Met Ser Lys Asp Glu Asn Leu Thr Asn Tyr Thr Leu Trp Tyr Thr Val Met Ser Lys Asp Glu Asn Leu Thr

65 70 75 80 65 70 75 80

Lys Val Lys Asn Cys Ser Asp Thr Thr Lys Ser Ser Cys Asp Val Thr Lys Val Lys Asn Cys Ser Asp Thr Thr Lys Ser Ser Cys Asp Val Thr

85 90 95 85 90 95

Asp Lys Trp Leu Glu Gly Met Glu Ser Tyr Val Val Ala Ile Val Ile Asp Lys Trp Leu Glu Gly Met Glu Ser Tyr Val Val Ala Ile Val Ile

100 105 110 100 105 110

Val His Arg Gly Asp Leu Thr Val Cys Arg Cys Ser Asp Tyr Ile Val Val His Arg Gly Asp Leu Thr Val Cys Arg Cys Ser Asp Tyr Ile Val

115 120 125 115 120 125

Pro Ala Asn Ala Pro Leu Glu Pro Pro Glu Phe Glu Ile Val Gly Phe Pro Ala Asn Ala Pro Leu Glu Pro Pro Glu Phe Glu Ile Val Gly Phe

130 135 140 130 135 140

Thr Asp His Ile Asn Val Thr Met Glu Phe Pro Pro Val Thr Ser Lys Thr Asp His Ile Asn Val Thr Met Glu Phe Pro Pro Val Thr Ser Lys

145 150 155 160 145 150 155 160

Ile Ile Gln Glu Lys Met Lys Thr Thr Pro Phe Val Ile Lys Glu Gln Ile Ile Gln Glu Lys Met Lys Thr Thr Pro Phe Val Ile Lys Glu Gln

165 170 175 165 170 175

Ile Gly Asp Ser Val Arg Lys Lys His Glu Pro Lys Val Asn Asn Val Ile Gly Asp Ser Val Arg Lys Lys His Glu Pro Lys Val Asn Asn Val

180 185 190 180 185 190

Thr Gly Asn Phe Thr Phe Val Leu Arg Asp Leu Leu Pro Lys Thr Asn Thr Gly Asn Phe Thr Phe Val Leu Arg Asp Leu Leu Pro Lys Thr Asn

195 200 205 195 200 205

Tyr Cys Val Ser Leu Tyr Phe Asp Asp Asp Pro Ala Ile Lys Ser Pro Tyr Cys Val Ser Leu Tyr Phe Asp Asp Asp Pro Ala Ile Lys Ser Pro

210 215 220 210 215 220

Leu Lys Cys Ile Val Leu Gln Pro Gly Gln Glu Ser Gly Leu Ser Glu Leu Lys Cys Ile Val Leu Gln Pro Gly Gln Glu Ser Gly Leu Ser Glu

225 230 235 240 225 230 235 240

Ser Ala Ser Ala

<210> 3<210> 3

<211> 436<211> 436

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 3<400> 3

Met Met Val Val Leu Leu Gly Ala Thr Thr Leu Val Leu Val Ala Val Met Met Val Val Leu Leu Gly Ala Thr Thr Leu Val Leu Val Ala Val

1 5 10 15 1 5 10 15

Ala Pro Trp Val Leu Ser Ala Ala Ala Gly Gly Lys Asn Leu Lys Ser Ala Pro Trp Val Leu Ser Ala Ala Ala Gly Gly Lys Asn Leu Lys Ser

20 25 30 20 25 30

Pro Gln Lys Val Glu Val Asp Ile Ile Asp Asp Asn Phe Ile Leu Arg Pro Gln Lys Val Glu Val Asp Ile Ile Asp Asp Asn Phe Ile Leu Arg

35 40 45 35 40 45

Trp Asn Arg Ser Asp Glu Ser Val Gly Asn Val Thr Phe Ser Phe Asp Trp Asn Arg Ser Asp Glu Ser Val Gly Asn Val Thr Phe Ser Phe Asp

50 55 60 50 55 60

Tyr Gln Lys Thr Gly Met Asp Asn Trp Ile Lys Leu Ser Gly Cys Gln Tyr Gln Lys Thr Gly Met Asp Asn Trp Ile Lys Leu Ser Gly Cys Gln

65 70 75 80 65 70 75 80

Asn Ile Thr Ser Thr Lys Cys Asn Phe Ser Ser Leu Lys Leu Asn Val Asn Ile Thr Ser Thr Lys Cys Asn Phe Ser Ser Leu Lys Leu Asn Val

85 90 95 85 90 95

Tyr Glu Glu Ile Lys Leu Arg Ile Arg Ala Glu Lys Glu Asn Thr Ser Tyr Glu Glu Ile Lys Leu Arg Ile Arg Ala Glu Lys Glu Asn Thr Ser

100 105 110 100 105 110

Ser Trp Tyr Glu Val Asp Ser Phe Thr Pro Phe Arg Lys Ala Gln Ile Ser Trp Tyr Glu Val Asp Ser Phe Thr Pro Phe Arg Lys Ala Gln Ile

115 120 125 115 120 125

Gly Pro Pro Glu Val His Leu Glu Ala Glu Asp Lys Ala Ile Val Ile Gly Pro Pro Glu Val His Leu Glu Ala Glu Asp Lys Ala Ile Val Ile

130 135 140 130 135 140

His Ile Ser Pro Gly Thr Lys Asp Ser Val Met Trp Ala Leu Asp Gly His Ile Ser Pro Gly Thr Lys Asp Ser Val Met Trp Ala Leu Asp Gly

145 150 155 160 145 150 155 160

Leu Ser Phe Thr Tyr Ser Leu Val Ile Trp Lys Asn Ser Ser Gly Val Leu Ser Phe Thr Tyr Ser Leu Val Ile Trp Lys Asn Ser Ser Gly Val

165 170 175 165 170 175

Glu Glu Arg Ile Glu Asn Ile Tyr Ser Arg His Lys Ile Tyr Lys Leu Glu Glu Arg Ile Glu Asn Ile Tyr Ser Arg His Lys Ile Tyr Lys Leu

180 185 190 180 185 190

Ser Pro Glu Thr Thr Tyr Cys Leu Lys Val Lys Ala Ala Leu Leu Thr Ser Pro Glu Thr Thr Tyr Cys Leu Lys Val Lys Ala Ala Leu Leu Thr

195 200 205 195 200 205

Ser Trp Lys Ile Gly Val Tyr Ser Pro Val His Cys Ile Lys Thr Thr Ser Trp Lys Ile Gly Val Tyr Ser Pro Val His Cys Ile Lys Thr Thr

210 215 220 210 215 220

Val Glu Asn Glu Leu Pro Pro Pro Glu Asn Ile Glu Val Ser Val Gln Val Glu Asn Glu Leu Pro Pro Pro Glu Asn Ile Glu Val Ser Val Gln

225 230 235 240 225 230 235 240

Asn Gln Asn Tyr Val Leu Lys Trp Asp Tyr Thr Tyr Ala Asn Met Thr Asn Gln Asn Tyr Val Leu Lys Trp Asp Tyr Thr Tyr Ala Asn Met Thr

245 250 255 245 250 255

Phe Gln Val Gln Trp Leu His Ala Phe Leu Lys Arg Asn Pro Gly Asn Phe Gln Val Gln Trp Leu His Ala Phe Leu Lys Arg Asn Pro Gly Asn

260 265 270 260 265 270

His Leu Tyr Lys Trp Lys Gln Ile Pro Asp Cys Glu Asn Val Lys Thr His Leu Tyr Lys Trp Lys Gln Ile Pro Asp Cys Glu Asn Val Lys Thr

275 280 285 275 280 285

Thr Gln Cys Val Phe Pro Gln Asn Val Phe Gln Lys Gly Ile Tyr Leu Thr Gln Cys Val Phe Pro Gln Asn Val Phe Gln Lys Gly Ile Tyr Leu

290 295 300 290 295 300

Leu Arg Val Gln Ala Ser Asp Gly Asn Asn Thr Ser Phe Trp Ser Glu Leu Arg Val Gln Ala Ser Asp Gly Asn Asn Thr Ser Phe Trp Ser Glu

305 310 315 320 305 310 315 320

Glu Ile Lys Phe Asp Thr Glu Ile Gln Ala Phe Leu Leu Pro Pro Val Glu Ile Lys Phe Asp Thr Glu Ile Gln Ala Phe Leu Leu Pro Pro Val

325 330 335 325 330 335

Phe Asn Ile Arg Ser Leu Ser Asp Ser Phe His Ile Tyr Ile Gly Ala Phe Asn Ile Arg Ser Leu Ser Asp Ser Phe His Ile Tyr Ile Gly Ala

340 345 350 340 345 350

Pro Lys Gln Ser Gly Asn Thr Pro Val Ile Gln Asp Tyr Pro Leu Ile Pro Lys Gln Ser Gly Asn Thr Pro Val Ile Gln Asp Tyr Pro Leu Ile

355 360 365 355 360 365

Tyr Glu Ile Ile Phe Trp Glu Asn Thr Ser Asn Ala Glu Arg Lys Ile Tyr Glu Ile Ile Phe Trp Glu Asn Thr Ser Asn Ala Glu Arg Lys Ile

370 375 380 370 375 380

Ile Glu Lys Lys Thr Asp Val Thr Val Pro Asn Leu Lys Pro Leu Thr Ile Glu Lys Lys Thr Asp Val Thr Val Pro Asn Leu Lys Pro Leu Thr

385 390 395 400 385 390 395 400

Val Tyr Cys Val Lys Ala Arg Ala His Thr Met Asp Glu Lys Leu Asn Val Tyr Cys Val Lys Ala Arg Ala His Thr Met Asp Glu Lys Leu Asn

405 410 415 405 410 415

Lys Ser Ser Val Phe Ser Asp Ala Val Cys Glu Lys Thr Lys Pro Gly Lys Ser Ser Val Phe Ser Asp Ala Val Cys Glu Lys Thr Lys Pro Gly

420 425 430 420 425 430

Asn Thr Ser Lys Asn Thr Ser Lys

435 435

<210> 4<210> 4

<211> 243<211> 243

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 4<400> 4

Met Leu Leu Ser Gln Asn Ala Phe Ile Phe Arg Ser Leu Asn Leu Val Met Leu Leu Ser Gln Asn Ala Phe Ile Phe Arg Ser Leu Asn Leu Val

1 5 10 15 1 5 10 15

Leu Met Val Tyr Ile Ser Leu Val Phe Gly Ile Ser Tyr Asp Ser Pro Leu Met Val Tyr Ile Ser Leu Val Phe Gly Ile Ser Tyr Asp Ser Pro

20 25 30 20 25 30

Asp Tyr Thr Asp Glu Ser Cys Thr Phe Lys Ile Ser Leu Arg Asn Phe Asp Tyr Thr Asp Glu Ser Cys Thr Phe Lys Ile Ser Leu Arg Asn Phe

35 40 45 35 40 45

Arg Ser Ile Leu Ser Trp Glu Leu Lys Asn His Ser Ile Val Pro Thr Arg Ser Ile Leu Ser Trp Glu Leu Lys Asn His Ser Ile Val Pro Thr

50 55 60 50 55 60

His Tyr Thr Leu Leu Tyr Thr Ile Met Ser Lys Pro Glu Asp Leu Lys His Tyr Thr Leu Leu Tyr Thr Ile Met Ser Lys Pro Glu Asp Leu Lys

65 70 75 80 65 70 75 80

Val Val Lys Asn Cys Ala Asn Thr Thr Arg Ser Phe Cys Asp Leu Thr Val Val Lys Asn Cys Ala Asn Thr Thr Arg Ser Phe Cys Asp Leu Thr

85 90 95 85 90 95

Asp Glu Trp Arg Ser Thr His Glu Ala Tyr Val Thr Val Leu Glu Gly Asp Glu Trp Arg Ser Thr His Glu Ala Tyr Val Thr Val Leu Glu Gly

100 105 110 100 105 110

Phe Ser Gly Asn Thr Thr Leu Phe Ser Cys Ser His Asn Phe Trp Leu Phe Ser Gly Asn Thr Thr Leu Phe Ser Cys Ser His Asn Phe Trp Leu

115 120 125 115 120 125

Ala Ile Asp Met Ser Phe Glu Pro Pro Glu Phe Glu Ile Val Gly Phe Ala Ile Asp Met Ser Phe Glu Pro Pro Glu Phe Glu Ile Val Gly Phe

130 135 140 130 135 140

Thr Asn His Ile Asn Val Met Val Lys Phe Pro Ser Ile Val Glu Glu Thr Asn His Ile Asn Val Met Val Lys Phe Pro Ser Ile Val Glu Glu

145 150 155 160 145 150 155 160

Glu Leu Gln Phe Asp Leu Ser Leu Val Ile Glu Glu Gln Ser Glu Gly Glu Leu Gln Phe Asp Leu Ser Leu Val Ile Glu Glu Gln Ser Glu Gly

165 170 175 165 170 175

Ile Val Lys Lys His Lys Pro Glu Ile Lys Gly Asn Met Ser Gly Asn Ile Val Lys Lys His Lys Pro Glu Ile Lys Gly Asn Met Ser Gly Asn

180 185 190 180 185 190

Phe Thr Tyr Ile Ile Asp Lys Leu Ile Pro Asn Thr Asn Tyr Cys Val Phe Thr Tyr Ile Ile Asp Lys Leu Ile Pro Asn Thr Asn Tyr Cys Val

195 200 205 195 200 205

Ser Val Tyr Leu Glu His Ser Asp Glu Gln Ala Val Ile Lys Ser Pro Ser Val Tyr Leu Glu His Ser Asp Glu Gln Ala Val Ile Lys Ser Pro

210 215 220 210 215 220

Leu Lys Cys Thr Leu Leu Pro Pro Gly Gln Glu Ser Glu Ser Ala Glu Leu Lys Cys Thr Leu Leu Pro Pro Gly Gln Glu Ser Glu Ser Ala Glu

225 230 235 240 225 230 235 240

Ser Ala Lys Ser Ala Lys

<210> 5<210> 5

<211> 6<211> 6

<212> Белок<212> Protein

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Синтетический пептид<223> Synthetic peptide

<400> 5<400> 5

Pro Val Gly Leu Ile Gly Pro Val Gly Leu Ile Gly

1 5 15

<210> 6<210> 6

<211> 10<211> 10

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

<223> Синтетический пептид<223> Synthetic peptide

<400> 6<400> 6

Gly Gly Tyr Ala Glu Leu Arg Met Gly Gly Gly Gly Tyr Ala Glu Leu Arg Met Gly Gly

1 5 10 1 5 10

<210> 7<210> 7

<211> 8<211> 8

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

<223> Синтетический пептид<223> Synthetic peptide

<400> 7<400> 7

Gly Pro Arg Pro Phe Asn Tyr Leu Gly Pro Arg Pro Phe Asn Tyr Leu

1 5 15

<210> 8<210> 8

<211> 8<211> 8

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

<223> Синтетический пептид<223> Synthetic peptide

<400> 8<400> 8

Gly Gly Ala Leu Gly Leu Ser Leu Gly Gly Ala Leu Gly Leu Ser Leu

1 5 15

<210> 9<210> 9

<211> 8<211> 8

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

<223> Синтетический пептид<223> Synthetic peptide

<400> 9<400> 9

Gly Pro Met Ser Tyr Asn Ala Leu Gly Pro Met Ser Tyr Asn Ala Leu

1 5 15

<210> 10<210> 10

<211> 10<211> 10

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

<223> Синтетический пептид<223> Synthetic peptide

<400> 10<400> 10

Ser Gly Arg Ser Glu Asn Ile Arg Thr Ala Ser Gly Arg Ser Glu Asn Ile Arg Thr Ala

1 5 10 1 5 10

<210> 11<210> 11

<211> 9<211> 9

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

<223> Синтетический пептид<223> Synthetic peptide

<400> 11<400> 11

Thr Ser Gly Pro Asn Gln Glu Gln Lys Thr Ser Gly Pro Asn Gln Glu Gln Lys

1 5 15

<210> 12<210> 12

<211> 4<211> 4

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

<223> Синтетический пептид<223> Synthetic peptide

<400> 12<400> 12

Gly Phe Leu Gly Gly Phe Leu Gly

1 1

<210> 13<210> 13

<211> 5<211> 5

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

<223> Синтетический пептид<223> Synthetic peptide

<400> 13<400> 13

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 15

<---<---

Claims

1. Пролекарство интерферона для лечения рака, содержащее:1. An interferon prodrug for the treatment of cancer, comprising:

(а) домен рецептора 2 интерферона альфа и бета (IFNAR2), который сохраняет IFN-связывающую активность;(a) an interferon alpha and beta receptor 2 (IFNAR2) domain that retains IFN-binding activity;

(b) домен интерферона 1 типа (IFN), который сохраняет активность интерферона 1 типа, когда он не связан указанным доменом IFNAR2;(b) a type 1 interferon (IFN) domain that retains type 1 interferon activity when not bound by said IFNAR2 domain;

(c) Fc-домен иммуноглобулина (Ig),(c) Fc domain of an immunoglobulin (Ig),

(d) первый линкер, слитый на одном конце с N-концом указанного IFN и слитый на другом конце с указанным IFNAR2, причем указанный первый линкер является расщепляемым протеазой, указанный первый линкер является расщепляемым матриксной металлопротеиназой, указанная матриксная металлопротеиназа представляет собой MMP2 или MMP9, указанный первый линкер представляет собой G4S-PVGLIG-G4S; и(d) a first linker fused at one end to the N-terminus of said IFN and fused at the other end to said IFNAR2, said first linker being cleavable by a protease, said first linker being cleavable by a matrix metalloproteinase, said matrix metalloproteinase being MMP2 or MMP9, said first linker is G4S-PVGLIG-G4S; and

(e) второй линкер, слитый на одном конце с C-концом указанного IFN и слитый на другом конце с N-концом указанного Fc-домена Ig. (e) a second linker fused at one end to the C-terminus of said IFN and fused at the other end to the N-terminus of said Ig Fc domain.

2. Пролекарство интерферона по п. 1, в котором указанный Ig представляет собой IgG, такой как IgG1 или IgG2.2. An interferon prodrug according to claim 1, wherein said Ig is an IgG such as IgG1 or IgG2.

3. Пролекарство интерферона по пп. 1, 2, в котором указанное пролекарство интерферона содержит две копии указанного домена IFN 1 типа.3. Prodrug of interferon according to paragraphs. 1, 2, wherein said interferon prodrug contains two copies of said type 1 IFN domain.

4. Пролекарство интерферона по пп. 1-3, в котором указанное пролекарство интерферона содержит более двух копий указанного домена IFN 1 типа.4. Prodrug of interferon according to paragraphs. 1-3, wherein said interferon prodrug contains more than two copies of said type 1 IFN domain.

5. Пролекарство интерферона по пп. 1-4, в котором указанный IFN представляет собой IFN-α, IFN-β, IFN-κ, IFN-δ, IFN-ε, IFN-τ, IFN-ω или IFN-ζ.5. Prodrug of interferon according to paragraphs. 1-4, wherein said IFN is IFN-α, IFN-β, IFN-κ, IFN-δ, IFN-ε, IFN-τ, IFN-ω, or IFN-ζ.

6. Конструкция нуклеиновой кислоты, кодирующая пролекарство интерферона, содержащее:6. A nucleic acid construct encoding an interferon prodrug containing:

(d) первый линкер, слитый на одном конце с N-концом указанного IFN и слитый на другом конце с указанным IFNAR2, причем указанный первый линкер является расщепляемым протеазой, указанный первый линкер является расщепляемым матриксной металлопротеиназой, указанная матриксная металлопротеиназа представляет собой MMP2 или MMP9, указанный первый линкер представляет собой G4S-PVGLIG-G4S;(d) a first linker fused at one end to the N-terminus of said IFN and fused at the other end to said IFNAR2, said first linker being cleavable by a protease, said first linker being cleavable by a matrix metalloproteinase, said matrix metalloproteinase being MMP2 or MMP9, said first linker is G4S-PVGLIG-G4S;

(e) второй линкер, слитый на одном конце с C-концом указанного IFN и слитый на другом конце с N-концом указанного Fc-домена Ig; и(e) a second linker fused at one end to the C-terminus of said IFN and fused at the other end to the N-terminus of said Ig Fc domain; and

причем конструкция содержит промотор, расположенный 5'-концом к 5'-концу указанного домена IFN.wherein the construct contains a promoter located 5' to the 5' end of said IFN domain.

7. Конструкция нуклеиновой кислоты по п. 6, в которой указанный Ig представляет собой IgG, такой как IgG1 или IgG2.7. A nucleic acid construct according to claim 6, wherein said Ig is an IgG such as IgG1 or IgG2.

8. Конструкция нуклеиновой кислоты по пп. 6, 7, в которой указанное пролекарство интерферона содержит две копии указанного домена IFN 1 типа.8. The design of the nucleic acid according to paragraphs. 6, 7, wherein said interferon prodrug contains two copies of said type 1 IFN domain.

9. Конструкция нуклеиновой кислоты по пп. 6-8, в которой указанное пролекарство интерферона содержит более двух копий указанного домена IFN 1 типа.9. The design of the nucleic acid according to paragraphs. 6-8, wherein said interferon prodrug contains more than two copies of said type 1 IFN domain.

10. Конструкция нуклеиновой кислоты по пп. 6-9, в которой указанный IFN представляет собой IFN-α, IFN-β, IFN-κ, IFN-δ, IFN-ε, IFN-τ, IFN-ω или IFN-ζ.10. The design of the nucleic acid according to paragraphs. 6-9, wherein said IFN is IFN-α, IFN-β, IFN-κ, IFN-δ, IFN-ε, IFN-τ, IFN-ω, or IFN-ζ.

11. Рекомбинантная клетка, содержащая конструкцию нуклеиновой кислоты по пп. 6-10, причем клетка предназначена для экспрессии пролекарства интерферона по пп. 1-5.11. Recombinant cell containing the nucleic acid construct according to paragraphs. 6-10, and the cell is designed to express the prodrug of interferon according to paragraphs. 1-5.

12. Способ экспрессии пролекарства интерферона, включающий культивирование клетки по п. 11.12. A method for expressing an interferon prodrug, comprising culturing a cell according to claim 11.

13. Применение пролекарства интерферона по пп. 1-5 в получении лекарственного средства для лечения рака.13. The use of an interferon prodrug according to paragraphs. 1-5 in obtaining a drug for the treatment of cancer.

14. Применение пролекарства интерферона по пп. 1-5 для лечения рака.14. The use of an interferon prodrug according to paragraphs. 1-5 for cancer treatment.

15. Способ лечения рака, включающий введение пациенту пролекарства интерферона по пп. 1-5.15. A method of treating cancer, comprising administering to a patient an interferon prodrug according to paragraphs. 1-5.

16. Способ по п. 15, дополнительно включающий стадию оценки экспрессии протеазы в раковой клетке, полученной от указанного пациента.16. The method of claim 15, further comprising the step of evaluating protease expression in a cancer cell obtained from said patient.

17. Способ по п. 16, в котором указанная раковая клетка получена из биопсии.17. The method of claim 16 wherein said cancer cell is obtained from a biopsy.

18. Способ по п. 16, в котором указанная раковая клетка представляет собой циркулирующую опухолевую клетку.18. The method of claim 16 wherein said cancer cell is a circulating tumor cell.

19. Способ по пп. 16-18, в котором указанный рак представляет собой рак легкого, рак молочной железы, рак головного мозга, рак ротовой полости, рак пищевода, рак головы и шеи, рак кожи, рак желудка, рак печени, рак поджелудочной железы, рак почки, рак яичника, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак толстой кишки, рак яичка, рак матки, рак шейки матки, лимфому или лейкоз.19. The method according to paragraphs. 16-18, wherein said cancer is lung cancer, breast cancer, brain cancer, oral cavity cancer, esophageal cancer, head and neck cancer, skin cancer, stomach cancer, liver cancer, pancreatic cancer, kidney cancer, cancer ovarian cancer, prostate cancer, bladder cancer, colon cancer, testicular cancer, uterine cancer, cervical cancer, lymphoma, or leukemia.

20. Способ по пп. 15-19, в котором указанный рак является первичным, рецидивирующим, метастатическим или устойчивым ко многим лекарственным веществам.20. The method according to paragraphs. 15-19, wherein said cancer is primary, recurrent, metastatic, or multidrug resistant.

21. Способ по пп. 15-20, в котором указанный пациент представляет собой человека или млекопитающее, не являющееся человеком.21. The method according to paragraphs. 15-20, wherein said patient is a human or non-human mammal.

22. Способ по пп. 15-21, дополнительно включающий введение указанного пролекарства интерферона более одного раза.22. The method according to paragraphs. 15-21 further comprising administering said interferon prodrug more than once.

23. Способ по п. 22, в котором указанное пролекарство интерферона вводят ежедневно, через день, еженедельно, через неделю или ежемесячно.23. The method of claim 22, wherein said interferon prodrug is administered daily, every other day, weekly, every other week, or monthly.

24. Способ по пп. 15-23, в котором указанное пролекарство интерферона вводят системно.24. The method according to paragraphs. 15-23, wherein said interferon prodrug is administered systemically.

25. Способ по пп. 15-23, в котором указанное пролекарство интерферона вводят внутрь опухоли, локально по отношению к опухоли или регионарно по отношению к опухоли.25. The method according to paragraphs. 15-23, wherein said interferon prodrug is administered intratumorally, either locally to the tumor or regionally to the tumor.

26. Способ по пп. 15-25, в котором лечение включает одно или более из: замедления роста опухоли, остановки роста опухоли, уменьшения размера или объема опухоли, увеличения выживаемости по сравнению с пациентом, не получавшим лечение, индукции ремиссии рака, индукции апоптоза опухолевых клеток или индукции некроза опухоли.26. The method according to paragraphs. 15-25, wherein the treatment comprises one or more of: slowing tumor growth, arresting tumor growth, reducing tumor size or volume, increasing survival compared to an untreated patient, inducing cancer remission, inducing tumor cell apoptosis, or inducing tumor necrosis .