RU2788523C2 - ANIMALS WITH HUMANIZED IL-4 AND IL-4Rα - Google Patents
ANIMALS WITH HUMANIZED IL-4 AND IL-4Rα Download PDFInfo
- Publication number
- RU2788523C2 RU2788523C2 RU2019131253A RU2019131253A RU2788523C2 RU 2788523 C2 RU2788523 C2 RU 2788523C2 RU 2019131253 A RU2019131253 A RU 2019131253A RU 2019131253 A RU2019131253 A RU 2019131253A RU 2788523 C2 RU2788523 C2 RU 2788523C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- rodent
- human
- gene
- humanized
- mouse
- Prior art date
Links
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 title claims abstract description 479
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title description 14
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 claims abstract description 478
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims abstract description 339
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 89
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 claims abstract description 69
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 claims abstract description 52
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 39
- 210000001161 Embryo, Mammalian Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 143
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 143
- 241000700159 Rattus Species 0.000 claims description 63
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 claims description 49
- 229920000978 Start codon Polymers 0.000 claims description 44
- 101000018998 IL4 Proteins 0.000 claims description 14
- 102000026353 human IL4 protein Human genes 0.000 claims description 14
- 230000001086 cytosolic Effects 0.000 claims description 11
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims 2
- 230000003042 antagnostic Effects 0.000 abstract description 31
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 abstract description 31
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 19
- 210000001671 Embryonic Stem Cells Anatomy 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 229940028885 Interleukin-4 Drugs 0.000 description 357
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 71
- 108010067003 Interleukin-33 Proteins 0.000 description 52
- 102000017761 Interleukin-33 Human genes 0.000 description 52
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 41
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 40
- 108091003598 dupilumab Proteins 0.000 description 37
- 229950003468 Dupilumab Drugs 0.000 description 36
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 35
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 35
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 31
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 29
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 28
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 28
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 28
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 28
- 229920000665 Exon Polymers 0.000 description 27
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 25
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 25
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 25
- 210000003719 B-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 24
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 22
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 description 22
- 210000001744 T-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 22
- 230000003285 pharmacodynamic Effects 0.000 description 22
- XPVFAGULZMMNRQ-SZURENNPSA-M sodium;(7S,9S)-7-[(2R,4S,5S,6S)-4-amino-5-hydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-6,9,11-trihydroxy-9-(2-hydroxyacetyl)-4-methoxy-8,10-dihydro-7H-tetracene-5,12-dione;N,3-bis(2-chloroethyl)-2-oxo-1,3,2$l^{5}-oxazaphosphinan-2-amine;(5Z)-5-(dimethylaminohydrazinylid Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)CCS.CN(C)N\N=C1/N=CN=C1C(N)=O.ClCCNP1(=O)OCCCN1CCCl.O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 XPVFAGULZMMNRQ-SZURENNPSA-M 0.000 description 20
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 19
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 19
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 18
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 17
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 17
- 230000036961 partial Effects 0.000 description 17
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 16
- 210000004072 Lung Anatomy 0.000 description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 14
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 14
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 14
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 13
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 12
- 229920000401 Three prime untranslated region Polymers 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 12
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 11
- 102100014199 IL25 Human genes 0.000 description 11
- 101700051492 IL25 Proteins 0.000 description 11
- NJYVEMPWNAYQQN-UHFFFAOYSA-N 5-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C21OC(=O)C1=CC(C(=O)O)=CC=C21 NJYVEMPWNAYQQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 208000006673 Asthma Diseases 0.000 description 10
- 101710008343 IL4R Proteins 0.000 description 10
- 229920002459 Intron Polymers 0.000 description 10
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 description 10
- 230000002009 allergen Effects 0.000 description 10
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 10
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 230000036231 pharmacokinetics Effects 0.000 description 9
- 210000004436 Chromosomes, Artificial, Bacterial Anatomy 0.000 description 8
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 8
- 229940062713 MITE EXTRACT Drugs 0.000 description 8
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 8
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 8
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 8
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 8
- 230000001965 increased Effects 0.000 description 7
- 108010045030 monoclonal antibodies Proteins 0.000 description 7
- 102000005614 monoclonal antibodies Human genes 0.000 description 7
- 210000000349 Chromosomes Anatomy 0.000 description 6
- 229920001405 Coding region Polymers 0.000 description 6
- 108009000538 IL-4 Signaling Pathway Proteins 0.000 description 6
- 210000003097 Mucus Anatomy 0.000 description 6
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 201000004624 dermatitis Diseases 0.000 description 6
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 6
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 108040006852 interleukin-4 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 6
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 6
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 108010038486 Interleukin-4 Receptors Proteins 0.000 description 5
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 5
- 201000005794 allergic hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 230000002327 eosinophilic Effects 0.000 description 5
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 5
- 102000019207 human interleukin-13 Human genes 0.000 description 5
- 108091018136 human interleukin-13 Proteins 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 5
- 102100015968 IL4R Human genes 0.000 description 4
- 210000000987 Immune System Anatomy 0.000 description 4
- 102000004559 Interleukin-13 Receptors Human genes 0.000 description 4
- 108010017511 Interleukin-13 Receptors Proteins 0.000 description 4
- 101000074844 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 description 4
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 4
- 200000000018 inflammatory disease Diseases 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N precursor Substances N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 4
- 230000001052 transient Effects 0.000 description 4
- 238000004450 types of analysis Methods 0.000 description 4
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 3
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 3
- 102100005826 CD19 Human genes 0.000 description 3
- 101700087100 CD19 Proteins 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 3
- -1 IL-4Rα Proteins 0.000 description 3
- 102000010787 Interleukin-4 Receptors Human genes 0.000 description 3
- 241000581650 Ivesia Species 0.000 description 3
- 108010061543 Neutralizing Antibodies Proteins 0.000 description 3
- 206010039085 Rhinitis allergic Diseases 0.000 description 3
- 206010040882 Skin lesion Diseases 0.000 description 3
- 210000004241 Th2 Cells Anatomy 0.000 description 3
- 201000010105 allergic rhinitis Diseases 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 description 3
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 3
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 3
- 230000000903 blocking Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional Effects 0.000 description 3
- 206010003246 Arthritis Diseases 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 description 2
- 206010064212 Eosinophilic oesophagitis Diseases 0.000 description 2
- 210000002175 Goblet Cells Anatomy 0.000 description 2
- 206010020718 Hyperplasia Diseases 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 102000018358 Immunoglobulins Human genes 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulins Proteins 0.000 description 2
- 206010021972 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 2
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 2
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 2
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 2
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 210000004681 Ovum Anatomy 0.000 description 2
- 101700067545 REGN Proteins 0.000 description 2
- 206010038683 Respiratory disease Diseases 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- 230000000172 allergic Effects 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 2
- 230000001684 chronic Effects 0.000 description 2
- 235000019504 cigarettes Nutrition 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 201000000708 eosinophilic esophagitis Diseases 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 239000002663 humin Substances 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 230000003843 mucus production Effects 0.000 description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing Effects 0.000 description 2
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 108091008117 polyclonal antibodies Proteins 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 201000004681 psoriasis Diseases 0.000 description 2
- 238000003559 rna-seq method Methods 0.000 description 2
- 239000000779 smoke Substances 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 230000003844 B-cell-activation Effects 0.000 description 1
- 230000035639 Blood Levels Effects 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 230000037250 Clearance Effects 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 210000003979 Eosinophils Anatomy 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 230000036499 Half live Effects 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100015890 IL13RA1 Human genes 0.000 description 1
- 101710034343 IL13RA1 Proteins 0.000 description 1
- 102100004549 IL13RA2 Human genes 0.000 description 1
- 101710034342 IL13RA2 Proteins 0.000 description 1
- 101000408083 IL33 Proteins 0.000 description 1
- 101000018983 IL4R Proteins 0.000 description 1
- 108090000539 Immunoglobulin Isotypes Proteins 0.000 description 1
- 102000004090 Immunoglobulin Isotypes Human genes 0.000 description 1
- 210000004969 Inflammatory Cells Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 Macrophages Anatomy 0.000 description 1
- 108091005503 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100003288 PRPF31 Human genes 0.000 description 1
- 101710039524 PRPF31 Proteins 0.000 description 1
- 241001425761 Parthenos sylvia Species 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 101710005331 RPL7A Proteins 0.000 description 1
- 101710024753 SERPINB14 Proteins 0.000 description 1
- 101710028729 SLC25A20 Proteins 0.000 description 1
- 102000000535 Type II Interleukin-4 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010002120 Type II Interleukin-4 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 239000002390 adhesive tape Substances 0.000 description 1
- 201000009961 allergic asthma Diseases 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 238000004164 analytical calibration Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960000070 antineoplastic Monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 101700006045 cact Proteins 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000035512 clearance Effects 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture media Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000010192 crystallographic characterization Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 102000037240 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 1
- 102000028446 human IL33 protein Human genes 0.000 description 1
- 102000024888 human IL4R protein Human genes 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory Effects 0.000 description 1
- 230000004968 inflammatory condition Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting Effects 0.000 description 1
- 238000010841 mRNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic Effects 0.000 description 1
- 229960000060 monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic Effects 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000000275 pharmacokinetic Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002206 pro-fibrotic Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000001718 repressive Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible Effects 0.000 description 1
- 101710005327 rpl702 Proteins 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic Effects 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 230000007838 tissue remodeling Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 102000027575 transmembrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091007901 transmembrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИCROSS-REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS
[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США №61/989757, поданной 7 мая 2014 г., полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.[0001] This application claims priority from U.S. Provisional Application No. 61/989,757, filed May 7, 2014, the entire contents of which are incorporated herein by reference.
ВКЛЮЧЕНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИINCLUDING THE SEQUENCE LISTING VIA LINK
[0002] Перечень последовательностей в виде текстового файла ASCII размером 16 KB под названием 31260_SEQ.txt, созданного 7 мая 2015 г. и поданного в Ведомство США по патентам и товарным знакам через EFS-Web, включен в данный документ посредством ссылки.[0002] The sequence listing in a 16 KB ASCII text file called 31260_SEQ.txt, created on May 7, 2015 and filed with the US Patent and Trademark Office via EFS-Web, is incorporated herein by reference.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИFIELD OF TECHNOLOGY
[0003] В данном документе раскрыты отличные от человека животные, которые содержат последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие белки IL-4 и/или IL-4Rα, содержащие последовательности от человека. В данном документе также раскрыты трансгенные отличные от человека животные, которые содержат ген IL-4 и/или IL-4Rα, являющийся полностью или частично человеческим. Также раскрыты отличные от человека животные, которые экспрессируют человеческие или гуманизированные белки IL-4 и/или IL-4Rα. Кроме того, раскрыты способы получения и применения отличных от человека животных, содержащих последовательности нуклеиновых кислот человеческих или гуманизированных IL-4 и/или IL-4Rα.[0003] Non-human animals are disclosed herein that contain nucleic acid sequences encoding IL-4 and/or IL-4Rα proteins containing sequences from a human. Also disclosed herein are transgenic non-human animals that contain an IL-4 and/or IL-4Rα gene that is wholly or partially human. Also disclosed are non-human animals that express human or humanized IL-4 and/or IL-4Rα proteins. Also disclosed are methods for the preparation and use of non-human animals containing human or humanized IL-4 and/or IL-4Rα nucleic acid sequences.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE INVENTION
[0004] IL-4 и IL-4Rα являются терапевтическими мишенями для лечения различных заболеваний, нарушений и состояний у человека, которые ассоциированы с аномальными клетками Т-хелперами 2 типа (Th2). Оценку фармакокинетики (PK) и фармакодинамики (PD) терапевтических молекул, которые целенаправленно воздействуют на белки IL-4 человека или IL-4Rα человека, обычно проводят на отличных от человека животных, например, грызунах, например, мышах или крысах. Однако PD таких терапевтических молекул невозможно определить надлежащим образом на конкретных отличных от человека животных, поскольку эти терапевтические молекулы не воздействуют целенаправленно на эндогенные белки IL-4 или IL-4Rα.[0004] IL-4 and IL-4Rα are therapeutic targets for the treatment of various human diseases, disorders and conditions that are associated with abnormal T-helper type 2 (Th2) cells. The pharmacokinetics (PK) and pharmacodynamics (PD) of therapeutic molecules that target human IL-4 or human IL-4Rα proteins are typically evaluated in non-human animals, eg rodents, eg mice or rats. However, the PD of such therapeutic molecules cannot be properly determined in specific non-human animals because these therapeutic molecules do not target endogenous IL-4 or IL-4Rα proteins.
[0005] Более того, оценка терапевтической эффективности антагонистов, специфичных к человеческим белкам IL-4 и IL-4Rα, с применением различных отличных от человека животных в качестве моделей заболеваний, ассоциированных с аномальными Th2-клетками, является проблематичной на отличных от человека животных, у которых такие видоспецифичные антагонисты не взаимодействуют с эндогенными белками IL-4 или IL-4Rα.[0005] Moreover, evaluating the therapeutic efficacy of antagonists specific for human IL-4 and IL-4Rα proteins using various non-human animals as disease models associated with abnormal Th2 cells is problematic in non-human animals, in which such species-specific antagonists do not interact with endogenous IL-4 or IL-4Rα proteins.
[0006] Соответственно, существует потребность в отличных от человека животных, например, грызунах, например, животных подсемейства мышиные, как, например, мыши или крысы, у которых гены IL-4 и/или IL-4Rα отличного от человека животного являются полностью или частично гуманизированными или заменены (например, по эндогенным отличным от человеческих локусам) генами IL-4 и/или IL-4Rα человека, содержащими последовательности, кодирующие человеческие или гуманизированные белки IL-4 и/или IL-4Rα соответственно.[0006] Accordingly, there is a need for non-human animals, for example, rodents, for example, animals of the murine subfamily, such as mice or rats, in which the IL-4 and/or IL-4Rα genes of a non-human animal are completely or partially humanized or replaced (eg, at endogenous non-human loci) with human IL-4 and/or IL-4Rα genes containing sequences encoding human or humanized IL-4 and/or IL-4Rα proteins, respectively.
[0007] Также существует потребность в отличных от человека животных, содержащих гены IL-4 и/или IL-4Rα (например, гуманизированные или человеческие), у которых гены IL-4 и/или IL-4R находятся под контролем отличных от человеческих регуляторных элементов (например, эндогенных регуляторных элементов).[0007] There is also a need for non-human animals containing IL-4 and/or IL-4Rα genes (e.g., humanized or human) in which the IL-4 and/or IL-4R genes are under non-human regulatory control. elements (eg, endogenous regulatory elements).
[0008] Также существует потребность в отличных от человека животных с гуманизированными последовательностями, которые экспрессируют человеческий или гуманизированный белок IL-4 в крови, плазме крови или сыворотке крови в концентрации, аналогичной концентрации белка IL-4, присутствующего в крови, плазме крови или сыворотке крови отличного от человека животного соответствующей возрастной группы, которое экспрессирует функциональный белок IL-4, но не содержит человеческих или гуманизированных генов IL-4, и/или экспрессирует человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα на иммунных клетках, например, В- и Т-клетках, на уровне, аналогичном уровню белка IL-4Rα, экспрессируемого на иммунных клетках, например, В- и Т-клетках, отличного от человека животного соответствующей возрастной группы, экспрессирующего функциональный белок IL-4Rα, но не содержащего человеческого или гуманизированного гена IL-4Rα.[0008] There is also a need for non-human animals with humanized sequences that express human or humanized IL-4 protein in blood, plasma, or serum at a concentration similar to that of IL-4 protein present in blood, plasma, or serum. blood of a non-human animal of the appropriate age group that expresses functional IL-4 protein, but does not contain human or humanized IL-4 genes, and/or expresses human or humanized IL-4Rα protein on immune cells, for example, B- and T- cells, at a level similar to that of the IL-4Rα protein expressed on immune cells, such as B and T cells, of a non-human animal of the appropriate age group, expressing functional IL-4Rα protein, but not containing the human or humanized IL- 4Ra.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯBRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION
[0009] Предложены отличные от человека животные, содержащие последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие белки IL-4 и/или IL-4Rα, которые содержат последовательность от человека.[0009] Non-human animals are provided that contain nucleic acid sequences encoding IL-4 and/or IL-4Rα proteins that contain a sequence from a human.
[0010] Предложены трансгенные отличные от человека животные, содержащие гены IL-4 и/или IL-4Rα, которые полностью или частично являются человеческими.[0010] Transgenic non-human animals containing IL-4 and/or IL-4Rα genes that are fully or partially human are provided.
[0011] Предложены отличные от человека животные, которые экспрессируют человеческие или гуманизированные белки IL-4 и/или IL-4Rα.[0011] Non-human animals are provided that express human or humanized IL-4 and/or IL-4Rα proteins.
[0012] Предложены отличные от человека животные, имеющие замену (полную или частичную) эндогенных генов IL-4 и/или IL-4Rα отличного от человека животного.[0012] Non-human animals are provided that have a replacement (total or partial) of the endogenous IL-4 and/or IL-4Rα genes of a non-human animal.
[0013] Предложены отличные от человека животные с гуманизированными IL-4 и/или IL-4Rα (полностью или частично) по локусам отличных от человеческих эндогенных IL-4 и/или IL-4Rα.[0013] Non-human animals are provided with humanized IL-4 and/or IL-4Rα (in whole or in part) at loci other than human endogenous IL-4 and/or IL-4Rα.
[0014] Предложены отличные от человека животные, имеющие человеческий или гуманизированный ген IL-4, причем отличные от человека животные не экспрессируют эндогенный белок IL-4, и при этом отличные от человека животные экспрессируют человеческий или гуманизированный белок IL-4 в крови, плазме крови или сыворотке крови в концентрации, аналогичной концентрации белка IL-4, присутствующего в крови, плазме крови или сыворотке крови отличного от человека животного соответствующей возрастной группы, которое экспрессирует функциональный эндогенный белок IL-4, но не содержит человеческий или гуманизированный ген IL-4.[0014] Non-human animals are provided having a human or humanized IL-4 gene, wherein the non-human animals do not express endogenous IL-4 protein, while the non-human animals express the human or humanized IL-4 protein in blood, plasma blood or serum at a concentration similar to that of an IL-4 protein present in the blood, plasma, or serum of a non-human animal of the appropriate age group that expresses a functional endogenous IL-4 protein but does not contain a human or humanized IL-4 gene .
[0015] Предложены отличные от человека животные, имеющие человеческий или гуманизированный ген IL-4Rα, причем отличные от человека животные не экспрессируют эндогенный белок IL-4Rα, а экспрессируют человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα на иммунных клетках, например, В- и Т-клетках, на уровне, аналогичном уровню белка IL-4Rα, присутствующего на иммунных клетках, например, В- и Т-клетках, у отличного от человека животного соответствующей возрастной группы, которое экспрессирует функциональный эндогенный белок IL-4Rα, но не содержит человеческий или гуманизированный ген IL-4Rα.[0015] Non-human animals are provided having a human or humanized IL-4Rα gene, wherein non-human animals do not express endogenous IL-4Rα protein, but express human or humanized IL-4Rα protein on immune cells, e.g., B- and T cells, at a level similar to that of the IL-4Rα protein present on immune cells, e.g., B and T cells, in a non-human animal of the appropriate age group that expresses functional endogenous IL-4Rα protein, but does not contain human or humanized IL-4Rα gene.
[0016] В одном аспекте предложены отличные от человека животные, содержащие последовательность нуклеиновых кислоты человеческого или гуманизированного IL-4 и/или IL-4Rα.[0016] In one aspect, non-human animals are provided that contain a human or humanized IL-4 and/or IL-4Rα nucleic acid sequence.
[0017] В одном аспекте предложены генетически модифицированные отличные от человека животные, которые характеризуются заменой по эндогенному локусу гена IL-4 и/или IL-4Rα, кодирующего эндогенные IL-4 и/или IL-4Rα, геном, кодирующим человеческие или гуманизированные белки IL-4 и/или IL-4Rα. Предложены грызуны, например, мыши или крысы, которые характеризуются заменой эндогенного гена IL-4 по эндогенному локусу IL-4 грызуна человеческим геном IL-4 и/или характеризуются заменой эндогенного гена IL-4Rα по эндогенному локусу IL-4Rα грызуна человеческим геном IL-4Rα. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.[0017] In one aspect, genetically modified non-human animals are provided that are characterized by a substitution at an endogenous locus of an IL-4 and/or IL-4Rα gene encoding endogenous IL-4 and/or IL-4Rα with a gene encoding human or humanized proteins IL-4 and/or IL-4Rα. Rodents, e.g., mice or rats, are provided that are characterized by the replacement of the endogenous IL-4 gene at the endogenous rodent IL-4 locus with the human IL-4 gene and/or are characterized by the replacement of the endogenous IL-4Rα gene at the endogenous rodent IL-4Rα locus by the human IL-4 gene. 4Ra. In one embodiment, the rodent is a mouse. In one embodiment, the rodent is a rat.
[0018] В одном аспекте предложены генетически модифицированные грызуны, например, мыши или крысы, характеризующиеся гуманизацией эндогенного гена IL-4 грызуна, при этом гуманизация предусматривает замену по эндогенному локусу IL-4 грызуна нуклеиновой кислоты грызуна, содержащей по меньшей мере один экзон гена IL-4 грызуна, последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере один экзон человеческого гена IL-4, с образованием модифицированного гена IL-4, при этом экспрессия модифицированного гена IL-4 находится под контролем регуляторных элементов грызуна в эндогенном локусе IL-4 грызуна.[0018] In one aspect, genetically modified rodents, e.g., mice or rats, are provided, characterized by humanization of an endogenous rodent IL-4 gene, wherein the humanization involves replacing, at the endogenous rodent IL-4 locus, a rodent nucleic acid containing at least one exon of the IL gene. -4 rodent, a nucleic acid sequence containing at least one exon of the human IL-4 gene, with the formation of a modified IL-4 gene, while the expression of the modified IL-4 gene is under the control of rodent regulatory elements in the endogenous rodent IL-4 locus.
[0019] В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь или крысу. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.[0019] In one embodiment, the rodent is a mouse or rat. In one embodiment, the rodent is a mouse. In one embodiment, the rodent is a rat.
[0020] В одном варианте осуществления модифицированный ген IL-4 кодирует человеческий или гуманизированный белок IL-4 и содержит участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 4 человеческого гена IL-4.[0020] In one embodiment, the modified IL-4 gene encodes for a human or humanized IL-4 protein and contains a stretch from
[0021] В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь, которая не способна экспрессировать белок IL-4 мыши.[0021] In one embodiment, the rodent is a mouse that is unable to express mouse IL-4 protein.
[0022] В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь, у которой экспрессируется белок IL-4Rα мыши, кодируемый эндогенным геном IL-4Rα мыши.[0022] In one embodiment, the rodent is a mouse that expresses the mouse IL-4Rα protein encoded by the endogenous mouse IL-4Rα gene.
[0023] В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь, у которой экспрессируется человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα.[0023] In one embodiment, the rodent is a mouse that expresses a human or humanized IL-4Rα protein.
[0024] В одном варианте осуществления гуманизированный белок IL-4Rα содержит эктодомен человеческого белка IL-4Rα.[0024] In one embodiment, the humanized IL-4Rα protein contains the ectodomain of the human IL-4Rα protein.
[0025] В одном варианте осуществления гуманизированный белок IL-4Rα содержит трансмембранный домен и цитоплазматический домен белка IL-4Rα мыши.[0025] In one embodiment, the humanized IL-4Rα protein comprises a transmembrane domain and a cytoplasmic domain of a mouse IL-4Rα protein.
[0026] В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь, которая характеризуется заменой по эндогенному локусу IL-4Rα мыши нуклеиновой кислоты мыши, содержащей по меньшей мере один экзон гена IL-4Rα мыши, последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере один экзон человеческого гена IL-4Rα, с образованием модифицированного гена IL-4Rα, при этом экспрессия модифицированного гена IL-4Rα находится под контролем регуляторных элементов мыши в эндогенном локусе IL-4Rα мыши.[0026] In one embodiment, the rodent is a mouse that is characterized by a substitution at the endogenous mouse IL-4Rα locus of a mouse nucleic acid containing at least one exon of the mouse IL-4Rα gene with a nucleic acid sequence containing at least one exon of the human gene IL-4Rα, with the formation of a modified IL-4Rα gene, while the expression of the modified IL-4Rα gene is under the control of mouse regulatory elements in the endogenous mouse IL-4Rα locus.
[0027] В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь, где непрерывный геномный фрагмент последовательности IL-4 мыши, содержащей участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 4 IL-4 мыши, заменен непрерывным геномным фрагментом последовательности человеческого IL-4, содержащим участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 4 человеческого IL-4.[0027] In one embodiment, the rodent is a mouse, where a contiguous genomic fragment of a mouse IL-4 sequence comprising a stretch from
[0028] В одном варианте осуществления экспрессия модифицированного гена IL-4Rα, кодирующего человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα, находится под контролем регуляторных элементов мыши в эндогенном локусе IL-4Rα мыши.[0028] In one embodiment, expression of a modified IL-4Rα gene encoding a human or humanized IL-4Rα protein is under the control of mouse regulatory elements at the endogenous mouse IL-4Rα locus.
[0029] В одном аспекте предложены генетически модифицированные грызуны, например, мыши или крысы, характеризующиеся гуманизацией эндогенного гена IL-4Rα грызуна, при этом гуманизация предусматривает замену по эндогенному локусу IL-4Rα грызуна нуклеиновой кислоты грызуна, содержащей экзон гена IL-4Rα грызуна, последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере один экзон человеческого гена IL-4Rα, с образованием модифицированного (т.е. гуманизированного) гена IL-4Rα, при этом экспрессия модифицированного, гуманизированного гена IL-4Rα находится под контролем регуляторных элементов грызуна в эндогенном локусе IL-4Rα грызуна.[0029] In one aspect, genetically modified rodents, e.g., mice or rats, are provided, characterized by humanization of an endogenous rodent IL-4Rα gene, wherein the humanization involves replacing, at the endogenous rodent IL-4Rα locus, a rodent nucleic acid comprising an exon of the rodent IL-4Rα gene, a nucleic acid sequence encoding at least one exon of the human IL-4Rα gene to form a modified (i.e., humanized) IL-4Rα gene, wherein the expression of the modified, humanized IL-4Rα gene is under the control of rodent regulatory elements at the endogenous locus Rodent IL-4Rα.
[0030] В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь или крысу. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.[0030] In one embodiment, the rodent is a mouse or rat. In one embodiment, the rodent is a mouse. In one embodiment, the rodent is a rat.
[0031] В одном варианте осуществления модифицированный ген IL-4Rα кодирует человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα и содержит участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 5 человеческого гена IL-4Rα.[0031] In one embodiment, the modified IL-4Rα gene encodes for a human or humanized IL-4Rα protein and contains a stretch from
[0032] В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь, которая не способна экспрессировать белок IL-4Rα мыши.[0032] In one embodiment, the rodent is a mouse that is unable to express mouse IL-4Rα protein.
[0033] В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь, у которой экспрессируется белок IL-4 мыши, кодируемый эндогенным геном IL-4 мыши.[0033] In one embodiment, the rodent is a mouse that expresses the mouse IL-4 protein encoded by the endogenous mouse IL-4 gene.
[0034] В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь, у которой экспрессируется человеческий или гуманизированный белок IL-4.[0034] In one embodiment, the rodent is a mouse that expresses human or humanized IL-4 protein.
[0035] В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь, которая характеризуется заменой по эндогенному локусу IL-4 мыши нуклеиновой кислоты мыши, содержащей экзон гена IL-4 мыши, последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере один экзон человеческого гена IL-4, с образованием модифицированного гена IL-4, при этом экспрессия модифицированного гена IL-4 находится под контролем регуляторных элементов мыши в эндогенном локусе IL-4 мыши.[0035] In one embodiment, the rodent is a mouse that is characterized by a substitution at the endogenous murine IL-4 locus of a mouse nucleic acid containing an exon of the mouse IL-4 gene with a nucleic acid sequence encoding at least one exon of the human IL-4 gene, with the formation of a modified IL-4 gene, while the expression of the modified IL-4 gene is under the control of mouse regulatory elements in the endogenous mouse IL-4 locus.
[0036] В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь, и при этом непрерывный геномный фрагмент последовательности IL-4Rα мыши, содержащей участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 5 IL-4Rα, заменен непрерывным геномным фрагментом последовательности человеческого IL-4Rα, содержащей участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 5 человеческого IL-4Rα.[0036] In one embodiment, the rodent is a mouse, and wherein the contiguous genomic fragment of the mouse IL-4Rα sequence, comprising the region from
[0037] В одном аспекте предложены генетически модифицированные грызуны, например, мышь или крыса, которые экспрессируют человеческий или гуманизированный белок IL-4, при этом грызун, который экспрессирует человеческий или гуманизированный белок IL-4, имеет нормальную иммунную систему, т.е. количество иммунных клеток, например, В- и Т-клеток, в крови, плазме крови или сыворотке крови грызуна, экспрессирующего человеческий или гуманизированный белок IL-4, является аналогичным количеству иммунных клеток, например, В- и Т-клеток, в крови, плазме крови или сыворотке крови грызуна, который экспрессирует функциональный эндогенный белок IL-4. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.[0037] In one aspect, genetically modified rodents, such as a mouse or rat, are provided that express a human or humanized IL-4 protein, wherein the rodent that expresses the human or humanized IL-4 protein has a normal immune system, i. the number of immune cells, e.g., B and T cells, in the blood, plasma, or serum of a rodent expressing human or humanized IL-4 protein is similar to the number of immune cells, e.g., B and T cells, in the blood, blood plasma or serum of a rodent that expresses a functional endogenous IL-4 protein. In one embodiment, the rodent is a mouse. In one embodiment, the rodent is a rat.
[0038] В одном аспекте предложены генетически модифицированные грызуны, например, мышь или крыса, которые экспрессируют белок IL-4, кодируемый человеческим или гуманизированным геном IL-4, при этом человеческий или гуманизированный белок IL-4 у грызуна экспрессируется в его сыворотке крови. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.[0038] In one aspect, genetically modified rodents, such as a mouse or rat, are provided that express an IL-4 protein encoded by a human or humanized IL-4 gene, wherein the human or humanized IL-4 protein is expressed in the rodent's blood serum. In one embodiment, the rodent is a mouse. In one embodiment, the rodent is a rat.
[0039] В одном варианте осуществления сыворотка крови грызуна, который экспрессирует человеческий или гуманизированный белок IL-4, характеризуется примерно таким же уровнем белка IL-4, что и у грызуна, который экспрессирует функциональный эндогенный белок IL-4, например, мыши или крысы дикого типа. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.[0039] In one embodiment, the serum of a rodent that expresses a human or humanized IL-4 protein has approximately the same level of IL-4 protein as a rodent that expresses a functional endogenous IL-4 protein, e.g., mouse or rat wild type. In one embodiment, the rodent is a mouse. In one embodiment, the rodent is a rat.
[0040] В одном варианте осуществления мышь экспрессирует человеческий или гуманизированный белок IL-4 в сыворотке крови в концентрации по меньшей мере приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% или 200% от уровня белка IL-4, присутствующего в сыворотке крови мыши соответствующей возрастной группы, экспрессирующей функциональный эндогенный белок IL-4, но не характеризующейся заменой эндогенного гена IL-4 по эндогенному локусу IL-4 мыши человеческим геном IL-4.[0040] In one embodiment, the mouse expresses human or humanized IL-4 protein in serum at a concentration of at least about 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90 %, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% or 200% of the level of IL-4 protein present in the blood serum of mice of the corresponding age group, expressing a functional endogenous IL-4 protein, but not characterized by the replacement of the endogenous IL-4 gene at the endogenous murine IL-4 locus with the human IL-4 gene.
[0041] В одном варианте осуществления мышь экспрессирует человеческий или гуманизированный белок IL-4 в сыворотке крови в концентрации от приблизительно 10% до приблизительно 200%, от приблизительно 20% до приблизительно 150% или от приблизительно 30% до приблизительно 100% от уровня белка IL-4 мыши, присутствующего в сыворотке крови мыши соответствующей возрастной группы, экспрессирующей функциональный эндогенный белок IL-4, но не характеризующейся заменой эндогенного гена IL-4 по эндогенному локусу IL-4 мыши человеческим геном IL-4.[0041] In one embodiment, the mouse expresses human or humanized IL-4 protein in serum at a concentration of about 10% to about 200%, about 20% to about 150%, or about 30% to about 100% of the protein level. Mouse IL-4 present in the serum of mice of the appropriate age group expressing functional endogenous IL-4 protein, but not characterized by the replacement of the endogenous IL-4 gene at the endogenous IL-4 locus of the mouse with the human IL-4 gene.
[0042] В одном аспекте предложены генетически модифицированные грызуны, например, мышь или крыса, которые экспрессируют человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα, при этом грызун экспрессирует человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα на иммунных клетках, например, В- и Т-клетках, на уровне, аналогичном уровню белка IL-4Rα, присутствующего на иммунных клетках, например, В- и Т-клетках, грызуна соответствующей возрастной группы, экспрессирующего функциональный эндогенный белок IL-4Rα. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.[0042] In one aspect, genetically modified rodents, such as a mouse or rat, are provided that express a human or humanized IL-4Rα protein, wherein the rodent expresses the human or humanized IL-4Rα protein on immune cells, such as B and T cells. , at a level similar to that of the IL-4Rα protein present on immune cells, eg, B and T cells, of a rodent of an appropriate age group expressing a functional endogenous IL-4Rα protein. In one embodiment, the rodent is a mouse. In one embodiment, the rodent is a rat.
[0043] В одном аспекте предложены генетически модифицированные грызуны, например, мышь или крыса, которые экспрессируют белок IL-4Rα, кодируемый человеческим геном IL-4Rα, при этом грызун экспрессирует человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα на иммунных клетках, например, В- и Т-клетках. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.[0043] In one aspect, genetically modified rodents, such as a mouse or rat, are provided that express an IL-4Rα protein encoded by the human IL-4Rα gene, wherein the rodent expresses a human or humanized IL-4Rα protein on immune cells, such as B- and T cells. In one embodiment, the rodent is a mouse. In one embodiment, the rodent is a rat.
[0044] В одном варианте осуществления иммунные клетки, например, В- и Т-клетки, грызуна, который экспрессирует человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα, характеризуются примерно таким же уровнем белка IL-4Rα, что и иммунные клетки, например, В- и Т-клетки, грызуна, экспрессирующего функциональный эндогенный белок IL-4Rα, например, мыши или крысы дикого типа. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.[0044] In one embodiment, immune cells, e.g., B and T cells, of a rodent that express human or humanized IL-4Rα protein have approximately the same level of IL-4Rα protein as immune cells, e.g., B- and T cells, a rodent expressing functional endogenous IL-4Rα protein, eg mouse or wild-type rat. In one embodiment, the rodent is a mouse. In one embodiment, the rodent is a rat.
[0045] В одном варианте осуществления мышь экспрессирует человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα на иммунных клетках, например, В- и Т-клетках, в количестве по меньшей мере приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% или 200% от количества белка IL-4Rα, присутствующего на иммунных клетках, например, В- и Т-клетках, мыши соответствующей возрастной группы, экспрессирующей функциональный эндогенный белок IL-4Rα, но не характеризующейся заменой эндогенного гена IL-4Rα по эндогенному локусу IL-4Rα мыши человеческим геном IL-4Rα.[0045] In one embodiment, the mouse expresses human or humanized IL-4Rα protein on immune cells, e.g., B and T cells, at least about 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, or 200% of IL-4Rα protein present on immune cells, e.g., B and T cells, of mice of the appropriate age group, expressing a functional endogenous IL-4Rα protein, but not characterized by the replacement of the endogenous IL-4Rα gene at the mouse endogenous IL-4Rα locus with the human IL-4Rα gene.
[0046] В одном варианте осуществления мышь экспрессирует человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα на иммунных клетках, например, В- и Т-клетках, в количестве от приблизительно 10% до приблизительно 200%, от приблизительно 20% до приблизительно 150% или от приблизительно 30% до приблизительно 100% от количества белка IL-4Rα мыши, присутствующего на иммунных клетках, например, В- и Т-клетках, мыши соответствующей возрастной группы, экспрессирующей функциональный эндогенный белок IL-4Rα, но не характеризующейся заменой эндогенного гена IL-4Rα по эндогенному локусу IL-4Rα мыши человеческим геном IL-4Rα.[0046] In one embodiment, the mouse expresses human or humanized IL-4Rα protein on immune cells, such as B and T cells, at about 10% to about 200%, about 20% to about 150%, or about 30% to about 100% of the amount of mouse IL-4Rα protein present on immune cells, e.g., B and T cells, age appropriate mice expressing functional endogenous IL-4Rα protein but not characterized by endogenous IL- 4Rα at the endogenous mouse IL-4Rα locus by the human IL-4Rα gene.
[0047] В одном аспекте предложен генетически модифицированный грызун, содержащий гуманизированный ген IL-4Rα, содержащий замену последовательности, кодирующей эктодомен IL-4Rα грызуна, последовательностью, кодирующей эктодомен человеческого IL-4Rα, при этом гуманизированный ген IL-4Rα содержит трансмембранную последовательность IL-4Rα грызуна и цитоплазматическую последовательность IL-4Rα грызуна, при этом гуманизированный ген IL-4Rα находится под контролем эндогенных регуляторных элементов IL-4Rα грызуна в эндогенном локусе IL-4Rα, и при этом грызун дополнительно содержит гуманизированный ген IL-4, кодирующий человеческий или гуманизированный белок IL-4, где гуманизированный ген IL-4 находится под контролем эндогенных регуляторных элементов IL-4 грызуна в эндогенном локусе IL-4.[0047] In one aspect, a genetically modified rodent is provided comprising a humanized IL-4Rα gene comprising a replacement of the sequence encoding the rodent IL-4Rα ectodomain with a sequence encoding the human IL-4Rα ectodomain, wherein the humanized IL-4Rα gene contains a transmembrane IL-4Rα sequence. a rodent 4Rα and a rodent IL-4Rα cytoplasmic sequence, wherein the humanized IL-4Rα gene is under the control of endogenous rodent IL-4Rα regulatory elements at the endogenous IL-4Rα locus, and the rodent further comprises a humanized IL-4 gene encoding human or humanized an IL-4 protein, wherein the humanized IL-4 gene is under the control of endogenous rodent IL-4 regulatory elements at the endogenous IL-4 locus.
[0048] В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь или крысу. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.[0048] In one embodiment, the rodent is a mouse or rat. In one embodiment, the rodent is a mouse. In one embodiment, the rodent is a rat.
[0049] В одном варианте осуществления мышь не способна экспрессировать белок IL-4 мыши и не способна экспрессировать белок IL-4Rα мыши.[0049] In one embodiment, the mouse is unable to express mouse IL-4 protein and is unable to express mouse IL-4Rα protein.
[0050] В одном варианте осуществления регуляторные элементы или последовательности грызуна в эндогенном локусе IL-4 грызуна и/или локусе IL-4Rα грызуна получены от мыши или крысы.[0050] In one embodiment, the rodent regulatory elements or sequences at the endogenous rodent IL-4 locus and/or rodent IL-4Rα locus are derived from a mouse or rat.
[0051] В одном варианте осуществления регуляторные элементы или последовательности грызуна представляют собой эндогенные регуляторные элементы или последовательности грызуна в локусе IL-4 грызуна и/или локусе IL-4Rα грызуна.[0051] In one embodiment, the rodent regulatory elements or sequences are endogenous rodent regulatory elements or sequences at the rodent IL-4 locus and/or the rodent IL-4Rα locus.
[0052] В одном аспекте предложено отличное от человека животное, например, грызун, например, мышь или крыса, которое экспрессирует человеческие или гуманизированные белки IL-4 и/или IL-4Rα, при этом отличное от человека животное экспрессирует человеческие или гуманизированные белки IL-4 и/или IL-4Rαc отличного от человеческого эндогенного локуса IL-4Rα и/или отличного от человеческого эндогенного локуса IL-4Rα. В варианте осуществления отличное от человека животное представляет собой грызуна. В варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В варианте осуществления грызун представляет собой крысу.[0052] In one aspect, a non-human animal, such as a rodent, such as a mouse or rat, is provided that expresses human or humanized IL-4 and/or IL-4Rα proteins, wherein the non-human animal expresses human or humanized IL proteins. -4 and/or IL-4Rαc other than the human endogenous IL-4Rα locus and/or other than the human endogenous IL-4Rα locus. In an embodiment, the non-human animal is a rodent. In an embodiment, the rodent is a mouse. In an embodiment, the rodent is a rat.
[0053] В одном аспекте предложена генетически модифицированная мышь, у которой экспрессируется человеческий или гуманизированный белок IL-4 с эндогенного локуса IL-4 мыши, при этом эндогенный ген IL-4 мыши был полностью или частично заменен человеческим геном IL-4.[0053] In one aspect, a genetically modified mouse is provided that expresses a human or humanized IL-4 protein from an endogenous mouse IL-4 locus, wherein the endogenous mouse IL-4 gene has been wholly or partially replaced by a human IL-4 gene.
[0054] В одном варианте осуществления непрерывную геномную последовательность нуклеиновой кислоты мыши длиной приблизительно 6,3 т.п.о. из эндогенного локуса IL-4 мыши, включающую участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 4 (включая 3'-нетранслируемый участок) и часть 3'-участка ниже экзона 4, подвергают делеции и заменяют последовательностью нуклеиновой кислоты человеческого IL-4 длиной приблизительно 8,8 т.п.о., содержащей участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 4 (включая 3'-нетранслируемый участок) и часть 3'-участка ниже экзона 4 человеческого гена IL-4. В конкретном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты человеческого IL-4, замещающая геномную нуклеиновую кислоту мыши, содержит участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 4 и часть 3'-участка ниже экзона 4 человеческого гена IL-4 из ВАС RP11-17K19, содержащего человеческий ген. В конкретном варианте осуществления модифицированный ген IL-4 содержит 5'-регуляторные элементы из IL-4 мыши и участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 4 человеческого IL-4, т.е. последовательности, кодирующие белок IL-4.[0054] In one embodiment, a continuous mouse genomic nucleic acid sequence of approximately 6.3 kb. from the endogenous murine IL-4 locus, including the region from
[0055] В одном аспекте предложена генетически модифицированная мышь, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий или гуманизированный белок IL-4, при этом нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий или гуманизированный белок IL-4, полностью или частично заменяет эндогенную нуклеотидную последовательность, кодирующую эндогенный белок IL-4 мыши.[0055] In one aspect, a genetically modified mouse is provided that contains a nucleotide sequence encoding a human or humanized IL-4 protein, wherein the nucleotide sequence encoding a human or humanized IL-4 protein completely or partially replaces an endogenous nucleotide sequence encoding an endogenous protein mouse IL-4.
[0056] В одном аспекте предложена генетически модифицированная мышь, у которой экспрессируется человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα с эндогенного локуса IL-4Rα мыши, при этом эндогенный ген IL-4Rα мыши был полностью или частично заменен человеческим геном IL-4Rα.[0056] In one aspect, a genetically modified mouse is provided that expresses a human or humanized IL-4Rα protein from an endogenous mouse IL-4Rα locus, wherein the endogenous mouse IL-4Rα gene has been wholly or partially replaced by a human IL-4Rα gene.
[0057] В одном варианте осуществления непрерывную геномную последовательность нуклеиновой кислоты мыши длиной приблизительно 7,1 т.п.о. в эндогенном локусе IL-4Rα мыши, включающую участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 5 и часть интрона 5, подвергают делеции и заменяют последовательностью нуклеиновой кислоты человеческого IL-4Rα длиной приблизительно 15,6 т.п.о., содержащую участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 5 и часть интрона 5 человеческого гена IL-4Rα. В конкретном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты человеческого IL-4α, замещающая геномную нуклеиновую кислоту мыши, содержит участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 5 и часть интрона 5 человеческого гена IL-4α из ВАС RP11-16E24, содержащего человеческий ген. В конкретном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты человеческого IL-4Rα, замещающая геномную нуклеиновую кислоту мыши, содержит полную последовательность, кодирующую эктодомен человеческого IL-4Rα.[0057] In one embodiment, a continuous mouse genomic nucleic acid sequence of approximately 7.1 kb. in the endogenous murine IL-4Rα locus, including the stretch from
[0058] В одном аспекте предложен способ получения грызуна с гуманизированным IL-4, включающий замену последовательности гена IL-4 грызуна, кодирующую белок IL-4 грызуна, последовательностью нуклеиновой кислоты человеческого IL-4, содержащей один или более экзонов последовательности человеческого гена IL-4, с образованием модифицированного гуманизированного гена IL-4, кодирующего человеческий или гуманизированный белок IL-4, при этом замену осуществляют по эндогенному локусу IL-4 грызуна, и последовательность гуманизированного гена IL-4, содержащая один или более экзонов последовательности человеческого гена IL-4 и кодирующая человеческий или гуманизированный белок IL-4, является функционально связанной с регуляторными элементами или последовательностями грызуна (например, 5'- и/или 3'-регуляторными элементами) в эндогенном локусе IL-4 грызуна.[0058] In one aspect, a method for producing a humanized IL-4 rodent comprising replacing a rodent IL-4 gene sequence encoding a rodent IL-4 protein with a human IL-4 nucleic acid sequence comprising one or more exons of a human IL-4 gene sequence is provided. 4 to form a modified humanized IL-4 gene encoding a human or humanized IL-4 protein, wherein the substitution is at the endogenous rodent IL-4 locus, and the humanized IL-4 gene sequence containing one or more exons of the human IL-4 gene sequence. 4 and encoding a human or humanized IL-4 protein is operably linked to rodent regulatory elements or sequences (eg, 5' and/or 3' regulatory elements) at the endogenous rodent IL-4 locus.
[0059] В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь или крысу. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.[0059] In one embodiment, the rodent is a mouse or rat. In one embodiment, the rodent is a mouse. In one embodiment, the rodent is a rat.
[0060] В одном варианте осуществления регуляторные элементы или последовательности грызуна получены от мыши. В одном варианте осуществления регуляторные элементы или последовательности грызуна получены от крысы.[0060] In one embodiment, the rodent regulatory elements or sequences are derived from a mouse. In one embodiment, the rodent regulatory elements or sequences are from a rat.
[0061] В одном варианте осуществления регуляторные элементы или последовательности грызуна представляют собой эндогенные регуляторные элементы или последовательности грызуна в локусе IL-4 грызуна. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.[0061] In one embodiment, the rodent regulatory elements or sequences are endogenous rodent regulatory elements or sequences at the rodent IL-4 locus. In one embodiment, the rodent is a mouse. In one embodiment, the rodent is a rat.
[0062] В одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты человеческого IL-4, замещающая последовательность гена IL-4 грызуна, содержит по меньшей мере один экзон последовательности человеческого гена IL-4. В других вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты человеческого IL-4, замещающая последовательность гена IL-4 грызуна, содержит по меньшей мере 2 или по меньшей мере 3 экзона последовательности человеческого гена IL-4. В одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты человеческого IL-4, замещающая последовательность гена IL-4 грызуна, содержит все 4 экзоны последовательности человеческого гена IL-4. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.[0062] In one embodiment, the human IL-4 nucleic acid sequence replacing the rodent IL-4 gene sequence contains at least one exon of the human IL-4 gene sequence. In other embodiments, the human IL-4 nucleic acid sequence replacing the rodent IL-4 gene sequence contains at least 2 or at least 3 exons of the human IL-4 gene sequence. In one embodiment, the human IL-4 nucleic acid sequence replacing the rodent IL-4 gene sequence contains all 4 exons of the human IL-4 gene sequence. In one embodiment, the rodent is a mouse. In one embodiment, the rodent is a rat.
[0063] В одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты человеческого IL-4, замещающая последовательность гена IL-4 грызуна, кодирует белок, который на приблизительно 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или на приблизительно 99% идентичен человеческому IL-4 (например, человеческому белку IL-4, кодируемому нуклеиновой кислотой, изложенной в GenBank под № доступа NM_000589.3s).[0063] In one embodiment, a human IL-4 nucleic acid sequence replacing a rodent IL-4 gene sequence encodes a protein that is about 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or about 99% % is identical to human IL-4 (eg, human IL-4 protein encoded by the nucleic acid set forth in GenBank Accession No. NM_000589.3s).
[0064] В одном варианте осуществления замену осуществляют по эндогенному локусу IL-4 грызуна и последовательность гуманизированного гена IL-4, содержащая один или более экзонов последовательности человеческого гена IL-4 и кодирующая человеческий или гуманизированный белок IL-4, является функционально связанной с эндогенными регуляторными элементами или последовательностями грызуна (например, 5'- и/или 3'-регуляторными элементами) в эндогенном локусе IL-4 грызуна.[0064] In one embodiment, the substitution is at the endogenous rodent IL-4 locus and the humanized IL-4 gene sequence comprising one or more exons of the human IL-4 gene sequence and encoding the human or humanized IL-4 protein is operably linked to the endogenous rodent regulatory elements or sequences (eg, 5' and/or 3' regulatory elements) at the endogenous rodent IL-4 locus.
[0065] В одном аспекте предложен способ получения мыши с гуманизированным IL-4, включающий замену последовательности гена IL-4 мыши, кодирующей белок IL-4 мыши, последовательностью человеческого гена IL-4 с образованием модифицированного, гуманизированного гена IL-4, кодирующего человеческий или гуманизированный белок IL-4.[0065] In one aspect, a method is provided for producing a humanized IL-4 mouse, comprising replacing a mouse IL-4 gene sequence encoding a mouse IL-4 protein with a human IL-4 gene sequence to form a modified, humanized IL-4 gene encoding a human or a humanized IL-4 protein.
[0066] В одном варианте замену осуществляют по эндогенному локусу IL-4 мыши, и при этом полученный гуманизированный ген IL-4, кодирующий человеческий или гуманизированный белок IL-4, является функционально связанным с регуляторными элементами мыши или последовательностями (например, 5'- и/или 3'-регуляторными элементами) в эндогенном локусе IL-4 мыши.[0066] In one embodiment, the substitution is at an endogenous mouse IL-4 locus, and the resulting humanized IL-4 gene encoding a human or humanized IL-4 protein is operably linked to mouse regulatory elements or sequences (e.g., 5'- and/or 3'-regulatory elements) in the endogenous mouse IL-4 locus.
[0067] В одном варианте осуществления замену осуществляют по эндогенному локусу IL-4 мыши, и при этом гуманизированный ген IL-4, кодирующий человеческий или гуманизированный белок IL-4, является функционально связанным с эндогенными регуляторными элементами мыши или последовательностями (например, 5'- и/или 3'-регуляторными элементами) в эндогенном локусе IL-4 мыши.[0067] In one embodiment, the substitution is at an endogenous mouse IL-4 locus, wherein the humanized IL-4 gene encoding human or humanized IL-4 protein is operably linked to endogenous mouse regulatory elements or sequences (e.g., 5' - and/or 3'-regulatory elements) in the endogenous mouse IL-4 locus.
[0068] В одном аспекте предложен способ получения грызуна с гуманизированным IL-4Rα, включающий замену последовательности гена IL-4Rα грызуна, кодирующей белок IL-4Rα грызуна, последовательностью нуклеиновой кислоты человеческого IL-4Rα, содержащей один или более экзонов последовательности человеческого гена IL-4Rα, с образованием модифицированного гуманизированного гена IL-4Rα, кодирующего человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα, при этом замену осуществляют по эндогенному локусу IL-4Rα грызуна и последовательность гуманизированного гена IL-4Rα, содержащая один или более экзонов последовательности человеческого гена IL-4Rα и кодирующая человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα, является функционально связанной с регуляторными элементами или последовательностями грызуна (например, 5'- и/или 3'-регуляторными элементами) в эндогенном локусе IL-4Rα грызуна.[0068] In one aspect, a method for producing a humanized IL-4Rα rodent comprising replacing a rodent IL-4Rα gene sequence encoding a rodent IL-4Rα protein with a human IL-4Rα nucleic acid sequence comprising one or more exons of a human IL-4Rα gene sequence is provided. 4Rα, with the formation of a modified humanized IL-4Rα gene encoding a human or humanized IL-4Rα protein, while the replacement is carried out at the endogenous rodent IL-4Rα locus and the sequence of the humanized IL-4Rα gene containing one or more exons of the sequence of the human IL-4Rα gene and encoding a human or humanized IL-4Rα protein is operably linked to rodent regulatory elements or sequences (eg, 5' and/or 3' regulatory elements) at the endogenous rodent IL-4Rα locus.
[0069] В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь или крысу. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.[0069] In one embodiment, the rodent is a mouse or rat. In one embodiment, the rodent is a mouse. In one embodiment, the rodent is a rat.
[0070] В одном варианте осуществления регуляторные элементы или последовательности грызуна получены от мыши. В одном варианте осуществления регуляторные элементы или последовательности грызуна получены от крысы.[0070] In one embodiment, the rodent regulatory elements or sequences are derived from a mouse. In one embodiment, the rodent regulatory elements or sequences are from a rat.
[0071] В одном варианте осуществления регуляторные элементы или последовательности грызуна представляют собой эндогенные регуляторные элементы или последовательности грызуна в локусе IL-4Rα грызуна. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.[0071] In one embodiment, the rodent regulatory elements or sequences are endogenous rodent regulatory elements or sequences at the rodent IL-4Rα locus. In one embodiment, the rodent is a mouse. In one embodiment, the rodent is a rat.
[0072] В одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты человеческого IL-4Rα, замещающая последовательность гена IL-4Rα грызуна, содержит по меньшей мере один экзон последовательности человеческого гена IL-4Rα. В других вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты человеческого IL-4Rα, замещающая последовательность гена IL-4Rα грызуна, содержит по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 экзонов последовательности человеческого гена IL-4Rα. В одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты человеческого IL-4Rα, замещающая последовательность гена IL-4Rα грызуна, содержит все 9 экзонов последовательности человеческого гена IL-4Rα. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.[0072] In one embodiment, the human IL-4Rα nucleic acid sequence replacing the rodent IL-4Rα gene sequence contains at least one exon of the human IL-4Rα gene sequence. In other embodiments, the human IL-4Rα nucleic acid sequence replacing the rodent IL-4Rα gene sequence contains at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, or 8 exons of the human IL-4Rα gene sequence. In one embodiment, the human IL-4Rα nucleic acid sequence replacing the rodent IL-4Rα gene sequence contains all 9 exons of the human IL-4Rα gene sequence. In one embodiment, the rodent is a mouse. In one embodiment, the rodent is a rat.
[0073] В одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты человеческого IL-4Rα, замещающая последовательность гена IL-4Rα грызуна, кодирует белок, который на приблизительно 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или на приблизительно 99% идентичен человеческому IL-4Rα (например, человеческому белку IL-4Rα, кодируемому нуклеиновой кислотой, изложенной в GenBank под № доступа NM_000418.3).[0073] In one embodiment, the human IL-4Rα nucleic acid sequence replacing the rodent IL-4Rα gene sequence encodes a protein that is about 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or about 99% % is identical to human IL-4Rα (eg, human IL-4Rα protein encoded by the nucleic acid set forth in GenBank Accession No. NM_000418.3).
[0074] В одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты человеческого IL-4Rα, замещающая последовательность гена IL-4Rα грызуна, содержит по меньшей мере один экзон последовательности человеческого гена IL-4Rα, кодирующей эктодомен человеческого белка IL-4Rα. В других вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты человеческого IL-4Rα, замещающая последовательность гена IL-4Rα грызуна, содержит по меньшей мере 2, 3 или 4 экзона последовательности человеческого гена IL-4Rα, кодирующей эктодомен человеческого белка IL-4Rα. В одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты человеческого IL-4Rα, замещающая последовательность гена IL-4Rα грызуна, содержит все 5 экзонов последовательности человеческого гена IL-4Rα, кодирующей эктодомен человеческого белка IL-4Rα. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.[0074] In one embodiment, the human IL-4Rα nucleic acid sequence replacing the rodent IL-4Rα gene sequence contains at least one exon of the human IL-4Rα gene sequence encoding the human IL-4Rα protein ectodomain. In other embodiments, the human IL-4Rα nucleic acid sequence replacing the rodent IL-4Rα gene sequence contains at least 2, 3, or 4 exons of the human IL-4Rα gene sequence encoding the human IL-4Rα protein ectodomain. In one embodiment, the human IL-4Rα nucleic acid sequence replacing the rodent IL-4Rα gene sequence contains all 5 exons of the human IL-4Rα gene sequence encoding the human IL-4Rα protein ectodomain. In one embodiment, the rodent is a mouse. In one embodiment, the rodent is a rat.
[0075] В одном варианте осуществления последовательность человеческого гена или гуманизированного IL-4Rα, замещающая последовательность гена IL-4Rα грызуна, кодирует эктодомен белка IL-4Rα, который на приблизительно 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или на приблизительно 99% идентичен эктодомену человеческого белка IL-4Rα (например, человеческого белка IL-4Rα, кодируемого нуклеиновой кислотой, изложенной в GenBank под № доступа NM_000418.3).[0075] In one embodiment, the human or humanized IL-4Rα gene sequence replacing the rodent IL-4Rα gene sequence encodes an IL-4Rα protein ectodomain that is approximately 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98 % or approximately 99% identical to the ectodomain of a human IL-4Rα protein (eg, human IL-4Rα protein encoded by the nucleic acid set forth in GenBank Accession No. NM_000418.3).
[0076] В одном варианте осуществления замену осуществляют по эндогенному локусу IL-4Rα грызуна и последовательность гуманизированного гена IL-4Rα, содержащая один или более экзонов последовательности человеческого гена IL-4Rα и кодирующая человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα, является функционально связанной с эндогенными регуляторными элементами или последовательностями грызуна (например, 5'- и/или 3'-регуляторными элементами) в эндогенном локусе IL-4Rα грызуна.[0076] In one embodiment, the substitution is at the endogenous rodent IL-4Rα locus and the humanized IL-4Rα gene sequence comprising one or more exons of the human IL-4Rα gene sequence and encoding the human or humanized IL-4Rα protein is operably linked to the endogenous rodent regulatory elements or sequences (eg, 5' and/or 3' regulatory elements) at the endogenous rodent IL-4Rα locus.
[0077] В одном аспекте предложен способ получения мыши с гуманизированным IL-4Rα, включающий замену последовательности гена IL-4Rα мыши, кодирующей белок IL-4Rα мыши, последовательностью нуклеиновой кислоты человеческого IL-4Rα с образованием гуманизированного гена IL-4Rα, кодирующего человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα.[0077] In one aspect, a method is provided for producing a humanized IL-4Rα mouse, comprising replacing a mouse IL-4Rα gene sequence encoding a mouse IL-4Rα protein with a human IL-4Rα nucleic acid sequence to form a humanized IL-4Rα gene encoding a human or humanized IL-4Rα protein.
[0078] В одном варианте осуществления замену осуществляют по эндогенному локусу IL-4Rα мыши и гуманизированный ген IL-4Rα, кодирующий человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα, является функционально связанным с регуляторными элементами мыши или последовательностями (например, 5'- и/или 3'-регуляторными элементами) в эндогенном локусе IL-4Rα мыши.[0078] In one embodiment, the substitution is at the endogenous murine IL-4Rα locus and the humanized IL-4Rα gene encoding human or humanized IL-4Rα protein is operably linked to mouse regulatory elements or sequences (e.g., 5'- and/or 3'-regulatory elements) in the endogenous mouse IL-4Rα locus.
[0079] В одном варианте осуществления замену осуществляют по эндогенному локусу IL-4Rα мыши и гуманизированный ген IL-4Rα, кодирующий человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα, является функционально связанным с эндогенными регуляторными элементами мыши или последовательностями (например, 5'- и/или 3'-регуляторными элементами) в эндогенном локусе IL-4Rα мыши.[0079] In one embodiment, the substitution is at the mouse endogenous IL-4Rα locus and the humanized IL-4Rα gene encoding human or humanized IL-4Rα protein is operably linked to endogenous mouse regulatory elements or sequences (e.g., 5'- and/ or 3'-regulatory elements) in the endogenous mouse IL-4Rα locus.
[0080] В различных аспектах описанные в данном документе генетически модифицированные отличные от человека животные, например, грызуны, например, мыши или крысы, несут генетические модификации в их зародышевой линии.[0080] In various aspects, the genetically modified non-human animals described herein, for example, rodents, such as mice or rats, carry genetic modifications in their germline.
[0081] В одном аспекте предложен эмбрион отличного от человека животного, например, грызуна, например, мыши или крысы, содержащий генетическую модификацию, описанную в данном документе.[0081] In one aspect, there is provided an embryo of a non-human animal, such as a rodent, such as a mouse or rat, containing the genetic modification described herein.
[0082] В одном аспекте предложен эмбрион-хозяин отличного от человека животного, например, грызуна, например, мыши или крысы, который содержит донорную клетку, содержащую генетическую модификацию, описанную в данном документе.[0082] In one aspect, a host embryo of a non-human animal, such as a rodent, such as a mouse or rat, is provided that contains a donor cell containing the genetic modification described herein.
[0083] В одном аспекте предложена плюрипотентная или тотипотентная клетка отличного от человека животного, например, грызуна, например, мыши или крысы, содержащая генетическую модификацию, описанную в данном документе. В одном варианте осуществления клетка представляет собой клетку грызуна. В одном варианте осуществления клетка представляет собой клетку мыши. В одном варианте осуществления клетка представляет собой ES-клетку грызуна. В одном варианте осуществления клетка представляет собой ES-клетку мыши.[0083] In one aspect, a pluripotent or totipotent cell of a non-human animal, such as a rodent, such as a mouse or rat, is provided, comprising the genetic modification described herein. In one embodiment, the cell is a rodent cell. In one embodiment, the cell is a mouse cell. In one embodiment, the cell is a rodent ES cell. In one embodiment, the cell is a mouse ES cell.
[0084] В одном аспекте предложена яйцеклетка отличного от человека животного, например, грызуна, например, мыши или крысы, при этом яйцеклетка отличного от человека животного содержит эктопическую хромосому отличного от человека животного, где эктопическая хромосома отличного от человека животного содержит генетическую модификацию, описанную в данном документе. В одном варианте осуществления отличное от человека животное представляет собой грызуна. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.[0084] In one aspect, a non-human animal ovum, such as a rodent, such as a mouse or rat, is provided, wherein the non-human animal ovum comprises a non-human ectopic chromosome, wherein the non-human ectopic chromosome comprises the genetic modification described in this document. In one embodiment, the non-human animal is a rodent. In one embodiment, the rodent is a mouse. In one embodiment, the rodent is a rat.
[0085] В одном аспекте эмбрион, яйцеклетка или клетка мыши, которые генетически модифицируют с тем, чтобы они содержали ген человеческого IL-4 или ген человеческого IL-4Rα, принадлежит мыши, которая является мышью линии C57BL, выбранной из C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr и C57BL/Ola. В другом варианте осуществления мышь представляет собой мышь линии 129, выбранной из группы, состоящей из линий, представляющих собой 129Р1, 129Р2, 129Р3, 129X1, 129S1 (например, 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129Т1, 129Т2 (см., например, Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, см. также Auerbach et al (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv-and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). В конкретном варианте осуществления генетически модифицированная мышь является гибридом вышеуказанной линии 129 и вышеуказанной линии C57BL/6. В другом конкретном варианте осуществления мышь является гибридом вышеуказанных линий 129 или гибридом вышеуказанных линий BL/6. В конкретном варианте осуществления линия 129 в гибриде представляет собой линию 129S6 (129/SvEvTac). В другом варианте осуществления мышь представляет собой мышь линии BALB, например, линии BALB/c. В еще одном варианте осуществления мышь представляет собой гибрид линии BALB и другой вышеуказанной линии. В одном варианте осуществления мышь представляет собой мышь Swiss или Swiss Webster.[0085] In one aspect, the mouse embryo, egg, or cell that is genetically modified to contain a human IL-4 gene or a human IL-4Rα gene is from a mouse that is a C57BL mouse selected from C57BL/A, C57BL /An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr and C57BL/Ola. In another embodiment, the mouse is a mouse of line 129 selected from the group consisting of lines that are 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (e.g., 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/ SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (see e.g. Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, see also Auerbach et al (2000 ) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv-and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). In a specific embodiment, the genetically modified mouse is a hybrid of the above line 129 and the above line C57BL/6. In another specific embodiment, the mouse is a hybrid of the above 129 lines or a hybrid of the above BL/6 lines. In a particular embodiment, line 129 in the hybrid is line 129S6 (129/SvEvTac). In another embodiment, the mouse is a BALB mouse, eg BALB/c. In yet another embodiment, the mouse is a hybrid of the BALB strain and another of the aforementioned strains. In one embodiment, the mouse is a Swiss or Swiss Webster mouse.
[0086] В различных аспектах отличные от человека животные, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты человеческих или гуманизированных IL-4R и/или IL-4, выбраны из млекопитающих и птиц. В одном варианте осуществления отличные от человека животные представляют собой млекопитающих. В одном варианте осуществления млекопитающие представляют собой подсемейство мышиных.[0086] In various aspects, non-human animals containing the human or humanized IL-4R and/or IL-4 nucleic acid sequence are selected from mammals and birds. In one embodiment, the non-human animals are mammals. In one embodiment, mammals are a subfamily of mice.
[0087] В одном аспекте предложен способ скрининга в отношении антагониста, специфичного к IL-4 или IL-4Rα человека. Способ является применимым для идентификации терапевтических кандидатов и оценки терапевтической эффективности. Способ включает введение средства генетически модифицированному грызуну, у которого гуманизированы две последовательности IL-4 и IL-4Rα, как описано в данном документе, определение эффекта средства по отношению к биологической функции, опосредованной сигнальным путем IL-4/IL-4Rα, и идентификацию средства в качестве антагониста, специфичного к человеческим IL-4 или IL-4Rα, если оно проявляет антагонизм по отношению к функции, опосредованной сигнальным путем IL-4/IL-4Rα, у генетически модифицированного грызуна.[0087] In one aspect, a method for screening for an antagonist specific for human IL-4 or IL-4Rα is provided. The method is useful for identifying therapeutic candidates and evaluating therapeutic efficacy. The method includes administering an agent to a genetically modified rodent in which two sequences of IL-4 and IL-4Rα are humanized as described herein, determining the effect of the agent on biological function mediated by the IL-4/IL-4Rα signaling pathway, and identifying the agent as an antagonist specific for human IL-4 or IL-4Rα if it antagonizes function mediated by the IL-4/IL-4Rα signaling pathway in a genetically modified rodent.
[0088] В одном варианте осуществления средство содержит вариабельный домен иммуноглобулина, который связывает IL-4 или IL-4Rα. В одном варианте осуществления средство специфически связывает человеческий IL-4 или IL-4Rα, но не IL-4 или IL-4Rα грызуна. В одном варианте осуществления средство представляет собой антитело. В конкретном варианте осуществления средство представляет собой антитело, которое специфически связывает человеческий IL-4Rα, но не IL-4Rα грызуна.[0088] In one embodiment, the agent contains an immunoglobulin variable domain that binds IL-4 or IL-4Rα. In one embodiment, the agent specifically binds human IL-4 or IL-4Rα, but not rodent IL-4 or IL-4Rα. In one embodiment, the agent is an antibody. In a particular embodiment, the agent is an antibody that specifically binds human IL-4Rα but not rodent IL-4Rα.
[0089] В одном варианте осуществления в способе скрининга используют мышь с двумя гуманизированными последовательностями, у которой экспрессируется человеческий белок IL-4 и гуманизированный белок IL-4Rα, где гуманизированный белок IL-4Rα содержит эктодомен человеческого белка IL-4Rα, связанный с трансмембранным и цитоплазматическим доменами эндогенного белка IL-4Rα мыши, и где мышь не экспрессирует IL-4 мыши или IL-4Rα мыши.[0089] In one embodiment, the screening method uses a mouse with two humanized sequences that expresses a human IL-4 protein and a humanized IL-4Rα protein, where the humanized IL-4Rα protein contains a human IL-4Rα protein ectodomain associated with a transmembrane and cytoplasmic domains of endogenous mouse IL-4Rα protein, and where the mouse does not express mouse IL-4 or mouse IL-4Rα.
[0090] В некоторых вариантах осуществления способ скрининга включает стадии индуцирования у описанного в данном документе грызуна с двумя гуманизированными последовательностями заболевания, ассоциированного с передачей сигналов IL-4/IL-4Rα, введения средства грызуну, определения того, уменьшает ли средство тяжесть заболевания, и идентифицирования средства в качестве антагониста, специфичного к человеческим IL-4 или IL-4Rα, подходящего для лечения заболевания, если данное средство уменьшает тяжесть заболевания.[0090] In some embodiments, the screening method comprises the steps of inducing a disease associated with IL-4/IL-4Rα signaling in a two-sequence humanized rodent described herein, administering an agent to the rodent, determining whether the agent reduces the severity of the disease, and identifying an agent as a human IL-4 or IL-4Rα specific antagonist suitable for treating a disease if the agent reduces the severity of the disease.
[0091] В некоторых вариантах осуществления заболевание, ассоциированное с передачей сигналов IL-4/IL-4Rα, представляет собой воспаление дыхательных путей, которое может быть индуцировано у грызуна путем интраназального введения аллергена (например, экстракта клещей домашней пыли) в одной или более дозах в течение определенного периода времени. Эффект средства можно определить путем измерения того, снижается ли степень воспаления дыхательных путей (что отражается, например, по накоплению слизи, клеточному инфильтрату в жидкости бронхоальвеолярного лаважа и/или уровням общего IgE в кровотоке) в результате введения средства.[0091] In some embodiments, an IL-4/IL-4Rα signaling-associated disease is airway inflammation that can be induced in a rodent by intranasal administration of an allergen (e.g., house dust mite extract) at one or more doses within a certain period of time. The effect of an agent can be determined by measuring whether the degree of inflammation of the airways (as reflected, for example, by accumulation of mucus, cellular infiltrate in bronchoalveolar lavage fluid and/or total IgE levels in the bloodstream) is reduced as a result of administration of the agent.
[0092] В некоторых вариантах осуществления заболевание, ассоциированное с передачей сигналов IL-4/IL-4Rα, представляет собой кожное воспаление или атопический дерматит, которые могут быть индуцированы у грызуна путем создания кожного повреждения и воздействия на поврежденную кожу аллергеном (например, бактериальным токсином или экстрактом клещей домашней пыли) в одной или более дозах в течение определенного периода времени. Эффект средства можно определить путем измерения того, уменьшается ли кожное воспаление в результате введения средства.[0092] In some embodiments, the disease associated with IL-4/IL-4Rα signaling is skin inflammation or atopic dermatitis, which can be induced in a rodent by creating a skin lesion and exposing the damaged skin to an allergen (e.g., a bacterial toxin or house dust mite extract) in one or more doses over a period of time. The effect of an agent can be determined by measuring whether skin inflammation is reduced by administration of the agent.
[0093] В дополнительном аспекте отличное от человека животное с тремя гуманизированными генами IL-4, IL-4Rα и IL-33, описанное в данном документе, используют для оценки фармакодинамики (PD) и терапевтической эффективности соединения или комбинации соединений.[0093] In a further aspect, a non-human animal with the three humanized IL-4, IL-4Rα, and IL-33 genes described herein is used to evaluate pharmacodynamics (PD) and therapeutic efficacy of a compound or combination of compounds.
[0094] Каждый из описанных в данном документе аспектов и вариантов осуществления можно использовать совместно, если это явно не исключается или очевидно из контекста варианта осуществления или аспекта.[0094] Each of the aspects and embodiments described herein may be used in conjunction unless expressly excluded or evident from the context of the embodiment or aspect.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВBRIEF DESCRIPTION OF GRAPHICS
[0095] На фиг. 1 представлена иллюстрация, без соблюдения масштаба, передачи сигнала рецепторами для IL-4 и IL-13 и механизм действия дупилумаба, нейтрализующего полностью человеческое моноклональное антитело, который специфически связывается с α-цепью рецептора человеческого IL-4 (IL-4Rα).[0095] FIG. 1 is an illustration, not to scale, of IL-4 and IL-13 receptor signaling and the mechanism of action of dupilumab neutralizing a fully human monoclonal antibody that specifically binds to the human IL-4 receptor α chain (IL-4Rα).
[0096] На фиг. 2А-2В представлена иллюстрация, без соблюдения масштаба, стратегий гуманизации локусов IL-4 
[0097] На фиг. 3 показана экспрессия гуманизированного белка IL-4Rα на В- и Т-клетках от мышей с двумя гуманизированными последовательностями IL-4/IL-4Rα (Il4hu/hu/Il4rahu/hu).[0097] FIG. 3 shows expression of humanized IL-4Rα protein on B and T cells from mice with two humanized IL-4/IL-4Rα sequences (Il4 hu/hu /Il4ra hu/hu ).
[0098] На фиг. 4 показаны характеристики специфичности к лигандам IL-4 и IL-13 и функциональные свойства рецепторов с использованием первичных клеток, полученных от мышей с гуманизированной последовательностью IL4Rα (Il4rahu/hu).[0098] FIG. 4 shows IL-4 and IL-13 ligand specificity and receptor functional properties using primary cells derived from mice with a humanized IL4Rα (Il4ra hu/hu ) sequence.
[0099] На фиг. 5 показано зависимое от IL-4 продуцирование IgE in vivo у мышей дикого типа, но не у мышей с гуманизированной последовательностью IL4Rα (Il4rahu/hu).[0099] FIG. 5 shows IL-4 dependent IgE production in vivo in wild-type mice, but not mice with a humanized IL4Rα sequence (Il4ra hu/hu ).
[00100] На фиг. 6 показано, что зависимая от дозы IL-4 индукция продуцирования mIgE ex vivo в В-клетках мыши (левая панель) блокируется дупилумабом в зависимости от его дозы (правая панель).[00100] FIG. 6 shows that dose-dependent induction of ex vivo mIgE production in mouse B cells (left panel) of IL-4 is blocked by dupilumab in a dose-dependent manner (right panel).
[00101] На фиг. 7 показано, что дупилумаб в зависимости от его дозы предупреждает развитию IL-25-индуцированных патологий в легких in vivo у мышей с гуманизированной последовательностью IL4Rα (Il4rahu/hu).[00101] FIG. 7 shows that dupilumab dose-dependently prevents the development of IL-25-induced lung pathologies in vivo in mice with a humanized IL4Rα (Il4ra hu/hu ) sequence.
[00102] На фиг. 8 показана схема эксперимента по оценке терапевтической эффективности дупилумаба на модели с воспалением легких, индуцированным экстрактом клещей домашней пыли (HDM), с использованием мышей с двумя гуманизированными последовательностями IL-4 и IL-4Rα (IL-4hu/hu/IL-4Rhu/hu). «REGN668» относится к человеческому моноклональному антителу к человеческому IL-4Rα, также известному как дупилумаб. «REGN129» означает раствор IL-13Rα-2-Fc мыши, который представляет собой белок слияния из эктодомена IL-13R2α мыши и Fc.[00102] FIG. Figure 8 shows a design of an experiment evaluating the therapeutic efficacy of dupilumab in a house dust mite extract (HDM) induced lung inflammation model using mice with two humanized sequences of IL-4 and IL-4Rα (IL-4 hu/hu /IL-4R hu /hu ). "REGN668" refers to a human anti-human IL-4Rα monoclonal antibody, also known as dupilumab. "REGN129" means a solution of mouse IL-13Rα-2-Fc, which is a fusion protein from the ectodomain of mouse IL-13R2α and Fc.
[00103] На фиг. 9 показана схема эксперимента по оценке терапевтической эффективности дупилумаба на модели с воспалением легких, индуцированным с помощью HDM, с использованием мышей с двумя гуманизированными последовательностями IL-4 и IL-4Rα (IL-4hu/hu/IL-4Rhu/hu) и антитела в качестве изотипического контроля.[00103] FIG. 9 shows a design of an experiment evaluating the therapeutic efficacy of dupilumab in an HDM-induced lung inflammation model using mice with two humanized sequences of IL-4 and IL-4Rα (IL-4 hu/hu /IL-4R hu/hu ) and antibodies as an isotype control.
[00104] На фиг. 10А-10С проиллюстрированы стратегии гуманизации локуса IL-33 мыши. На фиг. 10А проиллюстрировано, что ген IL-33 мыши (вверху), охватывающий кодирующий участок от экзона 2, начинающегося участком со стартового кодона ATG, до стоп-кодона экзона 8, подвергают делеции и заменяют кодирующим участком от экзона 2, начинающегося кодоном ATG, до экзона 8 (включая 3'-нетранслируемый участок) человеческого гена IL-33 (внизу). На фиг. 10В показан аллель гуманизированного IL-33 в клоне MAID 7060 ES-клетки мыши, который содержит фланкированную loxP кассету с селектируемым маркером устойчивости к неомицину. На фиг. 10С показан аллель гуманизированного IL-33 в клоне MAID 7061 ES-клетки мыши, в котором кассету с селектируемым маркером устойчивости к неомицину подвергли делеции, при этом сайты loxP и сайты клонирования (77 п.о.) оставались ниже последовательности человеческого IL-33, а 3'-UTR мыши оставалась ниже loxP-сайта.[00104] FIG. 10A-10C illustrate strategies for humanizing the mouse IL-33 locus. In FIG. 10A illustrates that the murine IL-33 gene (top) spanning the coding region from
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
IL-4 и IL-4Rα в качестве терапевтических мишенейIL-4 and IL-4Rα as therapeutic targets
[00105] Аллергические заболевания представляют собой спектр заболеваний, которые возникают с возрастающими темпами, особенно в развитых странах. Атопический дерматит, астма и аллергический ринит являются наиболее распространенными воспалительными состояниями среди пациентов с аллергическими заболеваниями; при этом данные пациенты часто испытывают проявление нескольких клинических симптомов. Патогенез аллергии связан с аномальными иммунными ответами на экзогенные антигены (см. Mueller et al. (2002) Structure, binding, and antagonists in the IL-4/IL-13 receptor system, Biochim Biophys Acta 1592:237-250).[00105] Allergic diseases are a spectrum of diseases that are emerging at an increasing rate, especially in developed countries. Atopic dermatitis, asthma, and allergic rhinitis are the most common inflammatory conditions among patients with allergic diseases; however, these patients often experience multiple clinical symptoms. Allergy pathogenesis is associated with abnormal immune responses to exogenous antigens (see Mueller et al. (2002) Structure, binding, and antagonists in the IL-4/IL-13 receptor system, Biochim Biophys Acta 1592:237-250).
[00106] Избыточное продуцирование антигенспецифических IgE является важной составляющей в инициировании аллергического воспаления. Поляризация аномальных клеток Т-хелперов 2 типа (Th2) приводит к усиленным IgE-опосредованным ответам.[00106] Excessive production of antigen-specific IgE is an important component in initiating allergic inflammation. Polarization of abnormal T-helper type 2 (Th2) cells leads to enhanced IgE-mediated responses.
[00107] Интерлейкин-4 (IL-4) и интерлейкин-13 (IL-13), впервые идентифицированные в активированных Т-клетках, являются основными цитокинами Th2, которые играют ведущую роль в инициировании и поддержании иммунных и воспалительных реакций при аллергических заболеваниях.[00107] Interleukin-4 (IL-4) and interleukin-13 (IL-13), first identified in activated T cells, are major Th2 cytokines that play a major role in initiating and maintaining immune and inflammatory responses in allergic diseases.
[00108] Передача сигналов IL-4 и IL-13 опосредуется двумя разными рецепторными комплексами с общей субъединицей, альфа-рецептор IL-4 (IL-4Rα), что может способствовать пересечению биологических ответов между этими двумя цитокинами. См. фигуру 1.[00108] IL-4 and IL-13 signaling is mediated by two different receptor complexes with a common subunit, the IL-4 receptor alpha (IL-4Rα), which may contribute to the crossover of biological responses between these two cytokines. See figure 1.
[00109] Передача сигналов рецепторами интерлейкинов-4/13 и механизм действия дупилумаба. IL-4Rα образует два разных гетеродимерных рецепторных комплекса для опосредования биологических функций IL-4 и IL-13 тканеспецифическим и реакционноспецифическим образом. Рецептор I типа, состоящий из IL-4Rα и общей гамма-цепи цитокиновых рецепторов (γС), является уникальным для IL-4. Рецептор II типа, образующийся из IL-4Rα и IL-13Rα1, является основным рецептором для IL-13, но он также функционален для IL-4. Кроме того, IL-13 будет связываться со вторым высокоаффинным рецептором IL-13Rα2, который обычно определяют как рецептор-ловушка или как характеризующийся возможным профибротическим эффектом в полноразмерной форме.[00109] Interleukin-4/13 receptor signaling and mechanism of action of dupilumab. IL-4Rα forms two different heterodimeric receptor complexes to mediate the biological functions of IL-4 and IL-13 in a tissue-specific and reaction-specific manner. The type I receptor, consisting of IL-4Rα and a common cytokine receptor gamma chain (γC), is unique to IL-4. The type II receptor derived from IL-4Rα and IL-13Rα1 is the main receptor for IL-13 but is also functional for IL-4. In addition, IL-13 will bind to a second high affinity receptor, IL-13Rα2, which is usually defined as a decoy receptor or as having a possible profibrotic effect in full length form.
[00110] Дупилумаб представляет собой антагонистическое моноклональное антитело к IL-4Rα человека, которое подавляет индуцированные IL-4 и IL-13 виды биологической активности. Дупилумаб блокирует передачу сигнала IL-4 за счет предотвращения его связывания с субъединицами рецепторов, тогда как ингибирующее действие в отношении передачи сигнала IL-13 по всей видимости опосредовано благодаря препятствию взаимодействия с димерным рецептором.[00110] Dupilumab is a human IL-4Rα antagonist monoclonal antibody that suppresses IL-4 and IL-13 induced biological activities. Dupilumab blocks IL-4 signaling by preventing its binding to receptor subunits, while the inhibitory effect on IL-13 signaling appears to be mediated by preventing interaction with the dimeric receptor.
[00111] Дупилумаб, полностью человеческое моноклональное антитело к общей субъединице IL-4Rα, был разработан в Regeneron Pharmaceuticals, Inc. с использованием мышей VelocImmune®. Дупилумаб проходит клинические испытания в качестве средства для лечения астмы со степенью тяжести от умеренной до тяжелой и для лечения атопического дерматита со степенью тяжести от умеренной до тяжелой.[00111] Dupilumab, a fully human monoclonal antibody to the common IL-4Rα subunit, was developed by Regeneron Pharmaceuticals, Inc. using mice VelocImmune ® . Dupilumab is in clinical trials for the treatment of moderate to severe asthma and for the treatment of moderate to severe atopic dermatitis.
[00112] Оценка эффективности дупилумаба на мышиных моделях сопряжена со многими трудностями: (а) дупилумаб не распознает когнатный рецептор IL-4 мыши; и (b) существует недостаток функционального взаимодействия между белком IL-4 и рецептором человеческого IL-4.[00112] Evaluation of the efficacy of dupilumab in mouse models is fraught with many difficulties: (a) dupilumab does not recognize the mouse IL-4 cognate receptor; and (b) there is a lack of functional interaction between the IL-4 protein and the human IL-4 receptor.
Ген и белок IL-4IL-4 gene and protein
[00113] Ген IL-4 кодирует секретируемый белок IL-4, который играет важную роль в активации В-клеток, а также других типов клеток (см. Фигуру 1).[00113] The IL-4 gene encodes a secreted IL-4 protein that plays an important role in the activation of B cells as well as other cell types (see Figure 1).
[00114] Человеческий IL-4. ID гена в NCBI: 3565; первоисточник: HGNC:6014; транскрипт эталонной последовательности: NM_000589.3; ID в UniProt: Р05112; геномная сборка: GRCh37; локализация: chr5:132009743-132018576+нить.[00114] Human IL-4. Gene ID at NCBI: 3565; original source: HGNC:6014; reference sequence transcript: NM_000589.3; ID in UniProt: Р05112; genomic assembly: GRCh37; localization: chr5:132009743-132018576+thread.
[00115] Ген человеческого IL-4 локализован на хромосоме 5 в участке 5q31.1. Ген человеческого IL-4 содержит 4 экзона и кодирует полипептид-предшественник длиной 153 аминокислоты, включающих в себя 24 аминокислоты сигнального пептида и 129 аминокислот зрелого белка IL-4.[00115] The human IL-4 gene is located on chromosome 5 at 5q31.1. The human IL-4 gene contains 4 exons and encodes a 153 amino acid precursor polypeptide comprising the 24 amino acids of the signal peptide and the 129 amino acids of the mature IL-4 protein.
[00116] IL-4 мыши. ID гена в NCBI: 16189; первоисточник: MGI:96556; транскрипт эталонной последовательности: NM_021283.2; ID в UniProt: Р07750; геномная сборка: GRCm38; локализация: chr11:53612350-53618606 - нить.[00116] Mouse IL-4. Gene ID at NCBI: 16189; source: MGI:96556; reference sequence transcript: NM_021283.2; ID in UniProt: Р07750; genomic assembly: GRCm38; localization: chr11:53612350-53618606 - thread.
[00117] Ген IL-4 мыши локализован на хромосоме 11 в участке 11, 31, 97 сМ. Ген IL-4 мыши содержит 4 экзона и кодирует полипептид-предшественник длиной 140 аминокислот, включающих в себя 20 аминокислоты сигнального пептида и 120 аминокислот зрелого белка IL-4.[00117] The mouse IL-4 gene is located on
Ген и белок IL-4RαIL-4Rα gene and protein
[00118] Ген IL-4Rα кодирует трансмембранный рецепторный белок IL-4Rα, который экспрессируется в основном на В- и Т-клетках и является рецептором для белков IL-4 и IL-13 (см. фигуру 1).[00118] The IL-4Rα gene encodes the IL-4Rα transmembrane receptor protein, which is expressed primarily on B and T cells and is the receptor for IL-4 and IL-13 proteins (see Figure 1).
[00119] Человеческий IL-4Rα. ID гена в NCBI: 3566; первоисточник: MGI:6015; транскрипт эталонной последовательности: NM_000418.3; ID в UniProt: Р24394; геномная сборка: GRCh37; локализация: chr16:27351525-27367111+нить.[00119] Human IL-4Rα. Gene ID at NCBI: 3566; source: MGI:6015; reference sequence transcript: NM_000418.3; ID in UniProt: Р24394; genomic assembly: GRCh37; localization: chr16:27351525-27367111+thread.
[00120] Ген человеческого IL-4Rα локализован на хромосоме 16 в участке 16р12.1-р11.2. Ген человеческого IL-4Rα содержит 9 кодирующих экзонов и кодирует полипептид-предшественник из 825 аминокислот, включающих в себя 25 аминокислот сигнального пептида и 800 аминокислот зрелого белка IL-4Rα, при этом первые 207 аминокислотных остатков зрелого белка составляют внеклеточный домен. Внеклеточный домен (т.е. эктодомен) человеческого белка IL-4Rα кодируется кодирующими экзонами 1-5 человеческого гена IL-4Rα.[00120] The human IL-4Rα gene is located on chromosome 16 at 16p12.1-p11.2. The human IL-4Rα gene contains 9 coding exons and encodes a precursor polypeptide of 825 amino acids, including 25 amino acids of the signal peptide and 800 amino acids of the mature IL-4Rα protein, while the first 207 amino acid residues of the mature protein constitute the extracellular domain. The extracellular domain (ie, ectodomain) of the human IL-4Rα protein is encoded by coding exons 1-5 of the human IL-4Rα gene.
[00121] IL-4Rα мыши. ID гена в NCBI: 16190; первоисточник: MGI: 105367; транскрипт эталонной последовательности: NM_001008700.3; ID в UniProt: Р16382; геномная сборка: GRCm38; локализация: chr11:125565655-125572745+нить.[00121] Mouse IL-4Rα. Gene ID at NCBI: 16190; source: MGI: 105367; reference sequence transcript: NM_001008700.3; ID in UniProt: Р16382; genomic assembly: GRCm38; localization: chr11:125565655-125572745+thread.
[00122] Ген IL-4Rα мыши локализован на хромосоме 7 в участке 7, 68,94 сМ. Ген IL-4Rα мыши содержит 9 кодирующих экзонов и кодирует полипептид-предшественник из 810 аминокислот, включающих в себя 25 аминокислот сигнального пептида и 785 аминокислот зрелого белка IL-4Rα, при этом первые 208 аминокислотных остатков зрелого белка составляют внеклеточный домен. Внеклеточный домен (т.е. эктодомен) белка IL-4Rα мыши кодируется кодирующими экзонами 1-5 гена IL-4Rα мыши.[00122] The mouse IL-4Rα gene is located on
Видоспецифичность белков IL-4 и IL-4RαSpecies specificity of IL-4 and IL-4Rα proteins
[00123] Как показано в данном документе, IL-4 мыши, а не человеческий, является функциональным у мышей дикого типа, и наоборот, человеческий IL-4, а не мыши, является функциональным у мышей с гуманизированными последовательностями IL-4Rα 
Видоспецифичность ингибиторов человеческих IL-4 и IL-4RαSpecies specificity of human IL-4 and IL-4Rα inhibitors
[00124] Кандидатные терапевтические молекулы, целенаправленно воздействующие на белки IL-4 или IL-4Rα, как правило, оценивают в отношении фармакокинетики (PK) и фармакодинамики (PD) на отличных от человека животных, например, грызунах, например, мышах или крысах. Такие терапевтические молекулы также тестируют в отношении терапевтической эффективности in vivo на отличных от человека животных, например, грызунах, например, мышах или крысах, в качестве моделей заболеваний, нарушений и состояний у человека, ассоциированных с аномальными Th2-клетками.[00124] Candidate therapeutic molecules targeting IL-4 or IL-4Rα proteins are typically evaluated for pharmacokinetics (PK) and pharmacodynamics (PD) in non-human animals, e.g., rodents, e.g., mice or rats. Such therapeutic molecules are also being tested for in vivo therapeutic efficacy in non-human animals, eg rodents, eg mice or rats, as human models of diseases, disorders and conditions associated with abnormal Th2 cells.
[00125] Однако терапевтические молекулы, специфичные к человеческим белкам IL-4 или IL-4Rα, например, ингибиторы, специфичные к человеческим IL-4 или IL-4Rα, невозможно оценить с достаточной точностью в отношении PD или терапевтической эффективности in vivo на грызунах, в частности мышах, поскольку мишени для этих терапевтических молекул у них отсутствуют. Эта проблема не устраняется путем применения трансгенных отличных от человека животных, например, грызунов, например, мышей или крыс, экспрессирующих человеческие белки IL-4 или IL-4Rα, из-за вышеуказанной видоспецифичности белка IL-4.[00125] However, therapeutic molecules specific for human IL-4 or IL-4Rα proteins, such as inhibitors specific for human IL-4 or IL-4Rα, cannot be assessed with sufficient accuracy in relation to PD or in vivo therapeutic efficacy in rodents, mice in particular, since they lack targets for these therapeutic molecules. This problem is not eliminated by the use of transgenic non-human animals, eg rodents, eg mice or rats, expressing human IL-4 or IL-4Rα proteins due to the aforementioned species specificity of the IL-4 protein.
[00126] Соответственно, в различных вариантах осуществления для оценки PD и терапевтической эффективности in vivo антагонистов или ингибиторов, специфичных к человеческим белкам IL-4 или IL-4Rα, на отличных от человека животных, например, грызунах, например, мышах или крысах, желательно заменить эндогенные белки IL-4 и/или IL-4Rα человеческими белками IL-4 и/или IL-4Rα.[00126] Accordingly, in various embodiments, in order to evaluate the PD and in vivo therapeutic efficacy of antagonists or inhibitors specific for human IL-4 or IL-4Rα proteins in non-human animals, e.g., rodents, e.g., mice or rats, it is desirable replace endogenous IL-4 and/or IL-4Rα proteins with human IL-4 and/or IL-4Rα proteins.
[00127] Кроме того, в различных вариантах осуществления во избежание потенциальных проблем сверхэкспресии или недостаточной экспрессии человеческих белков IL-4 и/или IL-4Rα, необходимо встроить гены человеческих IL-4 и/или IL-4Rα в геном отличных от человека животных, например, грызунов, например, мышей или крыс, по эндогенным локусам генов IL-4 и/или IL-4Rα и поместить экспрессию человеческих белков IL-4 и/или IL-4Rα в отличных от человека животных, например, грызунах, например, мышах или крысах, под контроль по меньшей мере частично эндогенных регуляторных элементов IL-4 и/или IL-4Rα.[00127] In addition, in various embodiments, in order to avoid potential problems of overexpression or underexpression of human IL-4 and/or IL-4Rα proteins, it is necessary to insert human IL-4 and/or IL-4Rα genes into the genome of non-human animals, e.g. rodents, e.g. mice or rats, at endogenous IL-4 and/or IL-4Rα gene loci and place the expression of human IL-4 and/or IL-4Rα proteins in non-human animals, e.g. rodents, e.g. mice or rats, under the control of at least partially endogenous regulatory elements IL-4 and/or IL-4Rα.
Генетически модифицированные отличные от человека животныеGenetically modified non-human animals
[00128] В данном документе предложены генетически модифицированные отличные от человека животные, у которых эндогенные гены IL-4 и/или гены IL-4Rα полностью или частично заменили по эндогенному локусу IL-4 и/или локусу IL-4Rα нуклеиновой кислотой человеческого IL-4 и/или нуклеиновой кислотой человеческого IL-4Rα с образованием модифицированного гена IL-4 и/или модифицированного гена IL-4Rα, которые кодируют человеческий или гуманизированный белок IL-4 и/или человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα.[00128] Provided herein are genetically modified non-human animals in which endogenous IL-4 genes and/or IL-4Rα genes have been completely or partially replaced at the endogenous IL-4 locus and/or IL-4Rα locus with human IL- 4 and/or human IL-4Rα nucleic acid to form a modified IL-4 gene and/or a modified IL-4Rα gene that encode a human or humanized IL-4 protein and/or a human or humanized IL-4Rα protein.
[00129] Используемая в данном документе фраза «отличное от человека животное» относится к любому позвоночному организму, который не является человеком. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное представляет собой млекопитающее. В конкретных вариантах осуществления отличное от человека животное представляет собой грызуна, такого как крыса или мышь.[00129] As used herein, the phrase "non-human animal" refers to any vertebrate organism that is not a human. In some embodiments, the non-human animal is a mammal. In specific embodiments, the non-human animal is a rodent, such as a rat or mouse.
[00130] В одном аспекте предложены генетически модифицированные грызуны, например, мыши или крысы, у которых эндогенный ген IL-4 грызуна полностью или частично заменен по эндогенному локусу IL-4 нуклеиновой кислотой, кодирующей человеческий IL-4.[00130] In one aspect, genetically modified rodents, such as mice or rats, are provided in which the endogenous rodent IL-4 gene is wholly or partially replaced at the endogenous IL-4 locus with a nucleic acid encoding human IL-4.
[00131] Замена включает замену по меньшей мере одного экзона, т.е. одного или более экзонов, в гене IL-4 грызуна последовательностью человеческой нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере один экзон человеческого гена IL-4. В некоторых вариантах осуществления непрерывный геномный фрагмент грызуна, который включает участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 4 гена IL-4 грызуна, заменен непрерывным геномным фрагментом человека, включающим участок от экзона 1, начинающийся стартовым кодоном ATG, до экзона 4 человеческого гена IL-4. В конкретном варианте осуществления грызун представляет собой мышь, при этом непрерывный геномный фрагмент мыши длиной приблизительно 6,3 т.п.о. в эндогенном локусе IL-4 мыши, включающий участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 4 (включая 3'-нетранслируемый участок) и часть 3'-участка ниже экзона 4, подвергают делеции и заменяют последовательностью нуклеиновой кислоты человеческого IL-4 длиной приблизительно 8,8 т.п.о., содержащей участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 4 (включая 3'-нетранслируемый участок) и часть 3'-участка ниже экзона 4 человеческого гена IL-4.[00131] The replacement includes the replacement of at least one exon, i. e. one or more exons, in the rodent IL-4 gene, with a human nucleic acid sequence comprising at least one exon of the human IL-4 gene. In some embodiments, a rodent contiguous genomic fragment that includes the region from
[00132] В некоторых вариантах осуществления результатом замены является модифицированный гуманизированный ген IL-4 в эндогенном локусе гена IL-4, при этом экспрессия модифицированного гена IL-4 находится под контролем эндогенных регуляторных элементов в эндогенном локусе IL-4. Используемое в данном документе выражение «регуляторные элементы» относится к последовательностям, регулирующим транскрипцию, в том числе как к 5'-концевым последовательностям, регулирующим транскрипцию, таким как промотор, энхансер и элементы, подавляющие транскрипцию, так и к 3'-концевым последовательностям, регулирующим транскрипцию, таким как последовательность терминации транскрипции. В некоторых вариантах осуществления экспрессия модифицированного гена IL-4 находится под контролем эндогенных 5'-концевых регуляторных элементов. В других вариантах осуществления экспрессия модифицированного гена IL-4 находится под контролем эндогенных 3'-концевых регуляторных элементов. В определенных вариантах осуществления экспрессия модифицированного гена IL-4 находится под контролем эндогенных 5'-концевых и 3'-концевых регуляторных элементов.[00132] In some embodiments, the replacement results in a modified humanized IL-4 gene at the endogenous IL-4 gene locus, wherein expression of the modified IL-4 gene is under the control of endogenous regulatory elements at the endogenous IL-4 locus. As used herein, the expression "regulatory elements" refers to transcriptional regulatory sequences, including both 5' transcriptional regulatory sequences such as promoter, enhancer, and transcription repressive elements, and 3' transcriptional regulatory sequences, regulating transcription, such as a transcription termination sequence. In some embodiments, expression of the modified IL-4 gene is under the control of endogenous 5' end regulatory elements. In other embodiments, expression of the modified IL-4 gene is under the control of endogenous 3'-terminal regulatory elements. In certain embodiments, expression of the modified IL-4 gene is under the control of endogenous 5' and 3' regulatory elements.
[00133] Модифицированный гуманизированный ген IL-4, образовавшийся в эндогенном локусе IL-4, кодирует человеческий или гуманизированный белок IL-4. Выражение «гуманизированный» относится к нуклеиновым кислотам или белкам, которые содержат части или последовательности гена или белка, встречающиеся у отличного от человека животного (например, грызуна, такого как мышь или крыса), а также содержат части или последовательности, которые отличаются от таковых, встречающихся у отличного от человека животного, но вместо этого соответствуют (являются идентичными) частям или последовательностям аналогов человеческих гена или белка. Модифицированный гуманизированный ген IL-4 может кодировать белок IL-4, который по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен человеческому белку IL-4 или является на 100% идентичным ему (например, человеческому белку IL-4, кодируемому нуклеиновой кислотой, изложенной в GenBank под № доступа NM_000589.3).[00133] A modified humanized IL-4 gene generated at the endogenous IL-4 locus encodes a human or humanized IL-4 protein. The expression "humanized" refers to nucleic acids or proteins that contain portions or sequences of a gene or protein found in a non-human animal (for example, a rodent such as a mouse or rat) and also contain portions or sequences that are different from those occurring in a non-human animal, but instead correspond (are identical) to portions or sequences of analogues of a human gene or protein. The modified humanized IL-4 gene can encode an IL-4 protein that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identical to or 100% identical to human IL-4 protein it (eg, human IL-4 protein encoded by the nucleic acid set forth in GenBank Accession No. NM_000589.3).
[00134] Генетически модифицированный грызун с полной или частичной заменой эндогенного гена IL-4 грызуна по эндогенному локусу IL-4 нуклеиновой кислотой человеческого IL-4 может быть гомозиготным или гетерозиготным по замене. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный грызун является гетерозиготным по замене, т.е. только одну из двух копий эндогенного гена IL-4 грызуна заменили нуклеиновой кислотой человеческого IL-4. В других вариантах осуществления генетически модифицированный грызун является гомозиготным по замене, т.е. обе копии эндогенного гена IL-4 грызуна заменили нуклеиновой кислотой человеческого IL-4.[00134] A genetically modified rodent with complete or partial replacement of the endogenous rodent IL-4 gene at the endogenous IL-4 locus with human IL-4 nucleic acid may be homozygous or heterozygous for the substitution. In some embodiments, the genetically modified rodent is heterozygous for the substitution, i. only one of the two copies of the endogenous rodent IL-4 gene was replaced with human IL-4 nucleic acid. In other embodiments, the genetically modified rodent is homozygous for the substitution, i. both copies of the endogenous rodent IL-4 gene were replaced with human IL-4 nucleic acid.
[00135] У генетически модифицированного грызуна человеческий или гуманизированный белок IL-4 экспрессируется в сыворотке крови. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный грызун не экспрессирует эндогенный белок IL-4 грызуна. В одном варианте осуществления сыворотка крови грызуна, экспрессирующего человеческий или гуманизированный белок IL-4, характеризуется примерно таким же уровнем белка IL-4, что и у грызуна, экспрессирующего функциональный эндогенный белок IL-4, например, грызуна дикого типа (например, грызуна, экспрессирующего функциональный эндогенный белок IL-4, но не содержащего полную или частичную замену эндогенного гена IL-4 по эндогенному локусу IL-4 нуклеиновой кислотой человеческого IL-4). Под выражением «примерно такой же уровень» подразумевают уровень, который находится в пределах 25%, 20%, 15%, 10%, 5% или менее в любую сторону (т.е. более или менее) от уровня у грызуна дикого типа. В других вариантах осуществления грызун экспрессирует человеческий или гуманизированный белок IL-4 в сыворотке крови в концентрации по меньшей мере приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% или 200% от уровня белка IL-4, присутствующего в сыворотке крови грызуна соответствующей возрастной группы, экспрессирующего функциональный эндогенный белок IL-4, но не содержащего полную или частичную замену эндогенного гена IL-4 по эндогенному локусу IL-4 нуклеиновой кислотой человеческого IL-4.[00135] In a genetically modified rodent, human or humanized IL-4 protein is expressed in serum. In some embodiments, the genetically modified rodent does not express endogenous rodent IL-4 protein. In one embodiment, the serum of a rodent expressing a human or humanized IL-4 protein has approximately the same level of IL-4 protein as a rodent expressing a functional endogenous IL-4 protein, e.g., a wild type rodent (e.g., a rodent, expressing a functional endogenous IL-4 protein, but not containing a complete or partial replacement of the endogenous IL-4 gene at the endogenous IL-4 locus with human IL-4 nucleic acid). By "about the same level" is meant a level that is within 25%, 20%, 15%, 10%, 5% or less to either side (i.e., more or less) of the level in the wild-type rodent. In other embodiments, the rodent expresses human or humanized IL-4 protein in serum at a concentration of at least about 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100 %, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% or 200% of the level of IL-4 protein present in the blood serum of a rodent of the corresponding age group expressing functional endogenous IL-4 protein, but not containing a complete or partial replacement of the endogenous IL-4 gene at the endogenous IL-4 locus with human IL-4 nucleic acid.
[00136] В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный грызун, характеризующийся полной или частичной заменой эндогенного гена IL-4 грызуна нуклеиновой кислотой человеческого IL-4 и экспрессирующий человеческий или гуманизированный белок IL-4 в сыворотке крови, имеет нормальную иммунную систему, т.е. количество иммунных клеток, например, В- и Т-клеток, в крови, плазме крови или сыворотке крови грызуна, экспрессирующего человеческий или гуманизированный белок IL-4, является аналогичным количеству иммунных клеток, например, В- и Т-клеток, в крови, плазме крови или сыворотке крови грызуна, экспрессирующего функциональный эндогенный белок IL-4 и не характеризующегося полной или частичной заменой эндогенного гена IL-4 грызуна нуклеиновой кислотой человеческого IL-4.[00136] In some embodiments, a genetically modified rodent characterized by complete or partial replacement of the endogenous rodent IL-4 gene with human IL-4 nucleic acid and expressing human or humanized IL-4 protein in serum has a normal immune system, i. the number of immune cells, e.g., B and T cells, in the blood, plasma, or serum of a rodent expressing human or humanized IL-4 protein is similar to the number of immune cells, e.g., B and T cells, in the blood, blood plasma or serum of a rodent expressing a functional endogenous IL-4 protein and not characterized by complete or partial replacement of the endogenous rodent IL-4 gene with human IL-4 nucleic acid.
[00137] В дополнительных вариантах осуществления генетически модифицированный грызун, характеризующийся полной или частичной заменой эндогенного гена IL-4 грызуна нуклеиновой кислотой человеческого IL-4 и экспрессирующий человеческий или гуманизированный белок IL-4, также характеризуется полной или частичной заменой эндогенного гена IL-4Rα грызуна по эндогенному локусу IL-4 Rα нуклеиновой кислотой человеческого IL-4Rα и вследствие этого также экспрессирует человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα.[00137] In additional embodiments, a genetically modified rodent characterized by a complete or partial replacement of the endogenous rodent IL-4 gene with a human IL-4 nucleic acid and expressing a human or humanized IL-4 protein also has a complete or partial replacement of the endogenous rodent IL-4Rα gene at the endogenous IL-4 Rα locus with human IL-4Rα nucleic acid and therefore also expresses human or humanized IL-4Rα protein.
[00138] В другом аспекте предложены генетически модифицированные грызуны, например, мыши или крысы, у которых эндогенный ген IL-4Rα грызуна был полностью или частично заменен по эндогенному локусу IL-4Rα нуклеиновой кислотой человеческого IL-4Rα.[00138] In another aspect, genetically modified rodents, such as mice or rats, are provided in which the endogenous rodent IL-4Rα gene has been completely or partially replaced at the endogenous IL-4Rα locus with a human IL-4Rα nucleic acid.
[00139] Замена предусматривает замену по меньшей мере одного экзона, т.е. одного или более экзонов, в гене IL-4Rα грызуна последовательностью человеческой нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере один экзон человеческого гена IL-4Rα. В некоторых вариантах осуществления замена предусматривает замену по меньшей мере одного из экзонов гена IL-4Rα грызуна, кодирующего эктодомен грызуна, по меньшей мере одним из экзонов человеческого гена IL-4Rα, кодирующего эктодомен человека. В некоторых вариантах осуществления замена предусматривает замену человеческой последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере 2, 3 или 4 из 5 экзонов, кодирующих эктодомен, человеческого гена IL-4Rα. В других вариантах осуществления непрерывный геномный фрагмент грызуна, который включает участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 5 от гена IL-4Rα грызуна, заменили геномным фрагментом, включающим участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 5 человеческого гена IL-4Rα. В конкретном варианте осуществления грызун представляет собой мышь, при этом непрерывный геномный фрагмент мыши длиной приблизительно 7,1 т.п.о. в эндогенном локусе IL-4Rα мыши, включающий участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 5 и часть интрона 5, подвергают делеции и заменяют последовательностью нуклеиновой кислоты человеческого IL-4Rα длиной приблизительно 15,6 т.п.о., содержащей участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 5 и часть интрона 5 человеческого гена IL-4Rα.[00139] The replacement involves the replacement of at least one exon, i. e. one or more exons, in the rodent IL-4Rα gene, with a human nucleic acid sequence comprising at least one exon of the human IL-4Rα gene. In some embodiments, the replacement involves replacing at least one of the exons of the rodent IL-4Rα gene encoding the rodent ectodomain with at least one of the exons of the human IL-4Rα gene encoding the human ectodomain. In some embodiments, the replacement involves replacing with a human nucleic acid sequence containing at least 2, 3, or 4 of the 5 ectodomain-encoding exons of the human IL-4Rα gene. In other embodiments, a continuous rodent genomic fragment that includes the stretch from
[00140] В некоторых вариантах осуществления результатом замены является модифицированный гуманизированный ген IL-4Rα в эндогенном локусе гена IL-4Rα, при этом экспрессия модифицированного гена IL-4Rα находится под контролем эндогенных регуляторных элементов в эндогенном локусе IL-4Rα.[00140] In some embodiments, the replacement results in a modified humanized IL-4Rα gene at the endogenous IL-4Rα gene locus, wherein expression of the modified IL-4Rα gene is under the control of endogenous regulatory elements at the endogenous IL-4Rα locus.
[00141] Модифицированный гуманизированный ген IL-4Rα, полученный в эндогенном локусе IL-4Rα, кодирует человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα. В некоторых вариантах осуществления модифицированный гуманизированный ген IL-4Rα кодирует белок IL-4Rα, который по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или на 99% идентичен человеческому белку IL-4Rα или является на 100% идентичным ему (например, человеческому белку IL-4, кодируемому нуклеиновой кислотой, изложенной в GenBank под № доступа NM_000418.3). В других вариантах осуществления модифицированный ген IL-4Rα кодирует гуманизированный белок IL-4Rα, который содержит эктодомен, который по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или на 99% идентичен эктодомену человеческого белка IL-4Rα или является на 100% идентичным ему (например, человеческого белка IL-4, кодируемого нуклеиновой кислотой, изложенной в GenBank под № доступа NM_000418.3). В конкретных вариантах осуществления трансмембранный и цитоплазматический домены гуманизированного белка IL-4Rα являются идентичными трансмембранному и цитоплазматическому доменам эндогенного белка IL-4Rα грызуна.[00141] A modified humanized IL-4Rα gene derived from the endogenous IL-4Rα locus encodes a human or humanized IL-4Rα protein. In some embodiments, the modified humanized IL-4Rα gene encodes an IL-4Rα protein that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identical to human IL-4Rα protein or is 100% identical to it (eg, the human IL-4 protein encoded by the nucleic acid disclosed in GenBank Accession No. NM_000418.3). In other embodiments, the modified IL-4Rα gene encodes a humanized IL-4Rα protein that contains an ectodomain that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identical to the human protein ectodomain. IL-4Rα or is 100% identical to it (for example, the human IL-4 protein encoded by the nucleic acid set forth in GenBank Accession No. NM_000418.3). In specific embodiments, the transmembrane and cytoplasmic domains of the humanized IL-4Rα protein are identical to the transmembrane and cytoplasmic domains of the endogenous rodent IL-4Rα protein.
[00142] Генетически модифицированный грызун, характеризующийся полной или частичной заменой эндогенного гена IL-4Rα грызуна по эндогенному локусу IL-4Rα нуклеиновой кислотой человеческого IL-4Rα, может быть гомозиготным или гетерозиготным по замене. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный грызун является гетерозиготным по замене, т.е. только одну из двух копий эндогенного гена IL-4Rα грызуна заменили нуклеиновой кислотой человеческого IL-4Rα. В других вариантах осуществления генетически модифицированный грызун является гомозиготным по замене, т.е. обе копии эндогенного гена IL-4Rα грызуна заменили нуклеиновой кислотой человеческого IL-4Rα.[00142] A genetically modified rodent characterized by complete or partial replacement of the endogenous rodent IL-4Rα gene at the endogenous IL-4Rα locus with a human IL-4Rα nucleic acid may be homozygous or heterozygous for the substitution. In some embodiments, the genetically modified rodent is heterozygous for the substitution, i. only one of the two copies of the endogenous rodent IL-4Rα gene was replaced with human IL-4Rα nucleic acid. In other embodiments, the genetically modified rodent is homozygous for the substitution, i. both copies of the endogenous rodent IL-4Rα gene were replaced with human IL-4Rα nucleic acid.
[00143] У генетически модифицированного грызуна, раскрытого в данном документе, человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα экспрессируется на иммунных клетках, например, В- и Т-клетках. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный грызун не экспрессирует эндогенный белок IL-4Rα грызуна. В одном варианте осуществления иммунные клетки грызуна, экспрессирующего человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα, характеризуются примерно таким же уровнем белка IL-4Rα на иммунных клетках, что и у грызуна, экспрессирующего функциональный эндогенный белок IL-4Rα на иммунных клетках, такого как грызуна дикого типа, экспрессирующего функциональный, эндогенный белок IL-4Rα и не экспрессирующего человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα. В других вариантах осуществления у грызуна экспрессируется человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα на иммунных клетках в количестве по меньшей мере приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% или 200% от количества белка IL-4Rα, присутствующего на иммунных клетках грызуна соответствующей возрастной группы, экспрессирующего функциональный эндогенный белок IL-4Rα, но не характеризующегося полной или частичной заменой эндогенного гена IL-4Rα нуклеиновой кислотой человеческого IL-4Rα.[00143] In the genetically modified rodent disclosed herein, the human or humanized IL-4Rα protein is expressed on immune cells such as B and T cells. In some embodiments, the genetically modified rodent does not express endogenous rodent IL-4Rα protein. In one embodiment, immune cells of a rodent expressing human or humanized IL-4Rα protein have approximately the same level of IL-4Rα protein on immune cells as a rodent expressing functional endogenous IL-4Rα protein on immune cells, such as a wild rodent. type expressing functional, endogenous IL-4Rα protein and not expressing human or humanized IL-4Rα protein. In other embodiments, the rodent expresses human or humanized IL-4Rα protein on immune cells in an amount of at least about 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% or 200% of the amount of IL-4Rα protein present on the immune cells of a rodent of the appropriate age group expressing a functional endogenous IL-4Rα protein, but not characterized by complete or partial replacement of the endogenous IL-4Rα gene with human IL-4Rα nucleic acid.
[00144] В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный грызун, характеризующийся полной или частичной заменой эндогенного гена IL-4Rα грызуна нуклеиновой кислотой человеческого IL-4Rα и экспрессирующий человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα, имеет нормальную иммунную систему, т.е. количество иммунных клеток, например, В- и Т-клеток, в крови, плазме крови или сыворотке крови грызуна, экспрессирующего человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα, является аналогичным количеству иммунных клеток, например, В- и Т-клеток, в крови, плазме крови или сыворотке крови грызуна дикого типа (например, грызуна, экспрессирующего функциональный эндогенный белок IL-4Rα и не характеризующегося полной или частичной замены эндогенного гена IL-4Rα грызуна нуклеиновой кислотой человеческого IL-4Rα).[00144] In some embodiments, a genetically modified rodent characterized by complete or partial replacement of the endogenous rodent IL-4Rα gene with human IL-4Rα nucleic acid and expressing human or humanized IL-4Rα protein has a normal immune system, i. the number of immune cells, e.g., B and T cells, in the blood, plasma, or serum of a rodent expressing human or humanized IL-4Rα protein is similar to the number of immune cells, e.g., B and T cells, in the blood, blood plasma or serum of a wild-type rodent (eg, a rodent expressing a functional endogenous IL-4Rα protein and not characterized by complete or partial replacement of the endogenous rodent IL-4Rα gene with human IL-4Rα nucleic acid).
[00145] В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный грызун, характеризующийся полной или частичной заменой эндогенного гена IL-4Rα грызуна нуклеиновой кислотой человеческого IL-4Rα и экспрессирующий человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα, способен опосредовать зависимую от IL-4 передачу сигнала и зависимую от IL-13 передачу сигнала и имеет функциональные свойства к этому. Например, гуманизированный белок IL-4Rα с эктодоменом человеческого белка IL-4Rα, экспрессируемый на иммунных клетках генетически модифицированного грызуна, взаимодействует с человеческим IL-4 и опосредует зависимую от человеческого IL-4 передачу сигнала посредством образования рецептора I типа (см. фиг. 1). Такой гуманизированный белок IL-4Rα с эктодоменом человеческого белка IL-4Rα также взаимодействует с человеческим и IL-13 мыши и опосредует зависимую от человеческого IL-13 передачу сигналов посредством образования рецептора II типа (см. фиг. 1). Функциональные свойства гуманизированного белка IL-4Rα, экспрессируемого у генетически модифицированного грызуна, можно оценить с помощью различных анализов, известных из уровня техники, в том числе конкретно описанных в примерах, приведенных в данном документе ниже, таких как анализ, в котором измеряют IL-4-индуцированное переключение на синтез класса IgE с использованием первичных В-клеток, полученных от генетически модифицированного грызуна.[00145] In some embodiments, a genetically modified rodent characterized by complete or partial replacement of the endogenous rodent IL-4Rα gene with human IL-4Rα nucleic acid and expressing human or humanized IL-4Rα protein is capable of mediating IL-4 dependent signaling and IL-13 signal transduction and has functional properties to it. For example, a humanized IL-4Rα protein with the ectodomain of the human IL-4Rα protein, expressed on genetically modified rodent immune cells, interacts with human IL-4 and mediates human IL-4 dependent signaling via type I receptor formation (see FIG. 1 ). This humanized IL-4Rα protein with the ectodomain of the human IL-4Rα protein also interacts with human and mouse IL-13 and mediates human IL-13 dependent signaling through type II receptor formation (see FIG. 1). The functional properties of a humanized IL-4Rα protein expressed in a genetically modified rodent can be assessed using various assays known in the art, including those specifically described in the examples provided herein below, such as an assay that measures IL-4 -induced switch to the synthesis of the IgE class using primary B cells obtained from a genetically modified rodent.
[00146] В дополнительных вариантах осуществления генетически модифицированный грызун, характеризующийся полной или частичной заменой эндогенного гена IL-4Rα грызуна нуклеиновой кислотой человеческого IL-4Rα и экспрессирующий человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα, также характеризуется полной или частичной заменой эндогенного гена IL-4 грызуна по эндогенному локусу IL-4 нуклеиновой кислотой человеческого IL-4 и вследствие этого также экспрессирует человеческий или гуманизированный IL-4.[00146] In additional embodiments, a genetically modified rodent characterized by complete or partial replacement of the endogenous rodent IL-4Rα gene with a human IL-4Rα nucleic acid and expressing a human or humanized IL-4Rα protein is also characterized by complete or partial replacement of the endogenous rodent IL-4 gene at the endogenous IL-4 locus with human IL-4 nucleic acid and therefore also expresses human or humanized IL-4.
[00147] В дополнительном аспекте предусмотрены грызуны с двумя гуманизированными последовательностями, например, мыши или крысы, у которых эндогенный ген IL-4 грызуна полностью или частично заменили по эндогенному локусу IL-4 нуклеиновой кислотой человеческого IL-4, и у которых эндогенный ген IL-4Rα грызуна также полностью или частично заменили по эндогенному локусу IL-4 Rα нуклеиновой кислотой человеческого IL-4Rα. Такие грызуны с двумя гуманизированными последовательностями могут быть гомозиготными или гетерозиготными по каждой замене, приводящей к гуманизации. В конкретном варианте осуществления грызун с двумя гуманизированными последовательностями является гомозиготным как по гуманизированному IL-4, так и по гуманизированному IL-4Rα.[00147] In a further aspect, dual sequence humanized rodents, e.g., mice or rats, have been provided in which the endogenous rodent IL-4 gene has been completely or partially replaced at the endogenous IL-4 locus with human IL-4 nucleic acid, and in which the endogenous IL-4 gene Rodent -4Rα has also been completely or partially replaced at the endogenous IL-4 Rα locus with human IL-4Rα nucleic acid. Such rodents with two humanized sequences may be homozygous or heterozygous for each substitution resulting in humanization. In a specific embodiment, a rodent with two humanized sequences is homozygous for both humanized IL-4 and humanized IL-4Rα.
[00148] Генетическая модификация эндогенного гена IL-4 грызуна у грызуна с двумя гуманизированными последовательностями включает такие модификации или замены, как описаны в данном документе выше для генетически модифицированного грызуна, характеризующегося полной или частичной заменой эндогенного гена IL-4 грызуна нуклеиновой кислотой человеческого IL-4. Подобным образом, генетическая модификация эндогенного гена IL-4Rα грызуна у грызуна с двумя гуманизированными последовательностями включает такие модификации или замены, которые описаны в данном документе выше для генетически модифицированного грызуна, характеризующегося полной или частичной заменой эндогенного гена IL-4Rα грызуна нуклеиновой кислотой человеческого IL-4Rα. Таким образом, признаки, раскрытые в данном документе относительно гуманизации гена IL-4 грызуна и относительно гуманизации гена грызуна соответственно, конкретно включены в данный документ по отношению к грызуну с двумя гуманизированными последовательностями.[00148] Genetic modification of an endogenous rodent IL-4 gene in a rodent with two humanized sequences includes such modifications or substitutions as described herein above for a genetically modified rodent characterized by complete or partial replacement of the endogenous rodent IL-4 gene with human IL-4 nucleic acid. four. Similarly, genetic modification of an endogenous rodent IL-4Rα gene in a rodent with two humanized sequences includes such modifications or substitutions as described herein above for a genetically modified rodent characterized by complete or partial replacement of an endogenous rodent IL-4Rα gene with human IL- 4Ra. Thus, the features disclosed herein regarding the humanization of the rodent IL-4 gene and regarding the humanization of the rodent gene, respectively, are specifically included herein in relation to a rodent with two humanized sequences.
[00149] В конкретных вариантах осуществления предложен грызун с двумя гуманизированными последовательностями, например, мышь или крыса, экспрессирующая человеческий белок IL-4 и гуманизированный белок IL-4Rα, где гуманизированный белок IL-4Rα содержит эктодомен человеческого белка IL-4Rα и содержит трансмембранный и цитоплазматический домены эндогенного белка IL-4Rα грызуна. В конкретных вариантах осуществления экспрессия человеческого белка IL-4 и гуманизированного белка IL-4Rα находится под контролем эндогенных регуляторных последовательностей грызуна в эндогенном локусе IL-4 грызуна и локусе IL-4Rα грызуна соответственно.[00149] In specific embodiments, a rodent with two humanized sequences, such as a mouse or rat, expressing human IL-4 protein and humanized IL-4Rα protein, wherein the humanized IL-4Rα protein comprises the ectodomain of the human IL-4Rα protein and contains a transmembrane and cytoplasmic domains of the endogenous rodent IL-4Rα protein. In specific embodiments, expression of human IL-4 protein and humanized IL-4Rα protein is under the control of endogenous rodent regulatory sequences at the endogenous rodent IL-4 locus and the rodent IL-4Rα locus, respectively.
[00150] В некоторых вариантах осуществления грызун с двумя гуманизированными последовательностями имеет нормальную иммунную систему (т.е. количество иммунных клеток является примерно таким же, как у грызуна дикого типа), характеризуется примерно таким же уровнем белка IL-4 в сыворотке крови и экспрессирует примерно такое же количество белка IL-4Rα на иммунных клетках, как и грызун дикого типа, при этом грызун дикого типа представляет собой грызуна, который экспрессирует функциональный эндогенный белок IL-4 и белок IL-4Rα и не экспрессирует человеческий или гуманизированный белок IL-4 или белок IL-4Rα.[00150] In some embodiments, the dual humanized sequence rodent has a normal immune system (i.e., the number of immune cells is about the same as that of the wild-type rodent), has about the same level of serum IL-4 protein, and expresses approximately the same amount of IL-4Rα protein on immune cells as a wild-type rodent, whereby a wild-type rodent is a rodent that expresses functional endogenous IL-4 protein and IL-4Rα protein and does not express human or humanized IL-4 protein or IL-4Rα protein.
[00151] В конкретных вариантах осуществления грызун с двумя гуманизированными последовательностями характеризуется функциональным путем передачи сигнала IL-4. Под «функциональным путем передачи сигнала IL-4» подразумевают, что как человеческий или гуманизированный белок IL-4, так и человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα экспрессируются у грызуна с двумя гуманизированными последовательностями и взаимодействуют друг с другом у грызуна с двумя гуманизированными последовательностями с тем, чтобы эффективно опосредовать нисходящую передачу сигнала и осуществлять виды биологической активности нормального пути передачи сигнала IL-4. Биологические активности нормального пути передачи сигнала IL-4 описаны в данном документе выше и проиллюстрированы на фигуре 1, включая таковые активности, которые опосредованы рецептором I типа, такие как инициация и поддержка дифференцировки Th2, активация и рост В-клеток, переключение синтеза между классами IgE и IgG4, и такие активности, которые опосредованы передачей сигнала рецептором II типа, такие как гиперплазия бокаловидных клеток, субэпителиальный фиброз и тканевое ремоделирование. Например, функциональный путь передачи сигнала IL-4 у грызуна с двумя гуманизированными последовательностями проявляется воспалительным фенотипом, характеризующимся, например, повышенным уровнем IgE в кровотоке, воспалением дыхательных путей и/или эозинофильным клеточным инфильтратом в ответ на введение экстракта клещей домашней пыли, при этом фенотип также наблюдают у грызунов дикого типа без двух гуманизированных последовательностей.[00151] In specific embodiments, the dual humanized sequence rodent is characterized by a functional IL-4 signaling pathway. By "functional IL-4 signaling pathway" is meant that both human or humanized IL-4 protein and human or humanized IL-4Rα protein are expressed in a rodent with two humanized sequences and interact with each other in a rodent with two humanized sequences with in order to effectively mediate downstream signaling and carry out the biological activities of the normal IL-4 signaling pathway. The biological activities of the normal IL-4 signaling pathway are described herein above and illustrated in Figure 1, including those activities that are mediated by the type I receptor, such as initiation and maintenance of Th2 differentiation, B cell activation and growth, switching synthesis between IgE classes and IgG4, and activities that are mediated by type II receptor signaling such as goblet cell hyperplasia, subepithelial fibrosis, and tissue remodeling. For example, a functional IL-4 signaling pathway in a rodent with two humanized sequences exhibits an inflammatory phenotype characterized by, for example, elevated circulating IgE levels, airway inflammation, and/or eosinophilic cell infiltrate in response to house dust mite extract administration, wherein the phenotype also seen in wild-type rodents without two humanized sequences.
Способы получения генетически модифицированного отличного от человека животногоMethods for producing a genetically modified non-human animal
[00152] Генетически модифицированное отличное от человека животное, такое как грызун, можно получить с помощью способов, известных из уровня техники. Например, можно получить целенаправленно воздействующий вектор, который содержит человеческую нуклеиновую кислоту (такую как человеческий ген IL-4 или IL-4Rα, полностью или частично), фланкированную ниже и выше гомологичными участками отличного от человека животного. Целенаправленно воздействующая конструкция также может содержать кассету с селектируемым маркером устойчивости к лекарственному средству (например, фланкированная loxP кассета с селектируемым маркером устойчивости к гигромицину, которую можно затем удалить транзиентным Cre-экспрессирующим вектором), которую размещают относительно 3'-конца человеческой нуклеиновой кислоты. Целенаправленно воздействующий вектор можно ввести в геном клетки отличного от человека животного, например, эмбриональной стволовой (ES) клетки (такой как ES-клетки мыши), например, посредством электропорации. Подвергшиеся точному целенаправленному воздействию клоны ES-клеток можно затем вводить в эмбрион на ранней стадии (например, эмбрион мыши на стадии 8 клеток). Отличные от человека животные, полностью происходящие от подвергшихся точному целенаправленному воздействию ES-клеток, идентифицируют на основе, например, анализа аллелей. Для отличных от человека животных, для которых подходящие генетически модифицируемые ES-клетки являются труднодоступными, можно использовать другие способы с получением отличного от человека животного, содержащего генетические модификации, описанные в данном документе. Такие способы включают, например, модифицирование генома клеток, отличных от ES-клеток (например, фибробласта или индуцированной плюрипотентной клетки) и использование переноса ядер для перемещения модифицированного генома в подходящую клетку, например, ооцит, и вынашивание модифицированной клетки (например, модифицированного ооцита) в отличном от человека животном в подходящих условиях с образованием эмбриона.[00152] A genetically modified non-human animal, such as a rodent, can be obtained using methods known in the art. For example, a targeting vector can be prepared that contains a human nucleic acid (such as the human IL-4 or IL-4Rα gene, in whole or in part) flanked below and above by non-human animal homologous regions. The targeting construct may also comprise a selectable drug resistance marker cassette (e.g., a loxP flanked hygromycin resistance selectable marker cassette that can then be removed with a transient Cre expression vector) that is positioned relative to the 3' end of the human nucleic acid. The targeting vector can be introduced into the genome of a non-human animal cell, such as an embryonic stem (ES) cell (such as mouse ES cells), for example, by electroporation. Precisely targeted ES cell clones can then be introduced into an early stage embryo (eg mouse embryo at 8 cell stage). Non-human animals descended entirely from precisely targeted ES cells are identified based on, for example, allelic analysis. For non-human animals for which suitable genetically modified ES cells are difficult to obtain, other methods can be used to produce a non-human animal containing the genetic modifications described herein. Such methods include, for example, modifying the genome of cells other than ES cells (e.g., a fibroblast or an induced pluripotent cell) and using nuclear transfer to move the modified genome into a suitable cell, such as an oocyte, and incubating the modified cell (e.g., a modified oocyte) in a non-human animal under suitable conditions to form an embryo.
Способы использования генетически модифицированного отличного от человека животногоMethods of using a genetically modified non-human animal
[00153] В одном аспекте генетически модифицированных по IL-4 и/или IL-4Rα отличных от человека животных, раскрытых в данном документе, используют для оценки фармакодинамики (PD) и терапевтической эффективности антагонистов, специфичных к человеческим IL-4 и/или IL-4Rα, например, нейтрализующих антител к IL-4 и/или к IL-4Rα (например, дупилумаба), на различных моделях заболеваний, дополнительно проиллюстрированных в примерах ниже.[00153] In one aspect, IL-4 and/or IL-4Rα genetically modified non-human animals disclosed herein are used to evaluate the pharmacodynamics (PD) and therapeutic efficacy of human IL-4 and/or IL-specific antagonists. -4Rα, for example, neutralizing antibodies to IL-4 and/or to IL-4Rα (eg, dupilumab), in various disease models, further illustrated in the examples below.
[00154] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предложен способ скрининга в отношении антагониста, специфичного к IL-4 или IL-4Rα человека, с использованием мышей с двумя гуманизированных генами IL-4 и IL-4Rα, раскрытыми в данном документе.[00154] In some embodiments, the present invention provides a method for screening for an antagonist specific for human IL-4 or IL-4Rα using mice with the two humanized IL-4 and IL-4Rα genes disclosed herein.
[00155] Под «антагонистами IL-4 или IL-4Rα» подразумевают молекулы (например, антитела), которые блокируют, подавляют или ингибируют одну или более биологических функций, опосредованных IL-4 или IL-4Rα.. «Антагонисты, специфичные к человеческим IL-4 или IL-4Rα» относятся к антагонистам, которые являются специфичными к человеческим IL-4 или IL-4Rα, и практически не воздействуют на IL-4 или IL-4Rα грызуна.[00155] By "antagonists of IL-4 or IL-4Rα" is meant molecules (e.g., antibodies) that block, suppress or inhibit one or more biological functions mediated by IL-4 or IL-4Rα.. "Antagonists specific to human "IL-4 or IL-4Rα" refers to antagonists that are specific for human IL-4 or IL-4Rα and have little or no effect on rodent IL-4 or IL-4Rα.
[00156] В конкретных вариантах осуществления в способе скрининга используют мышь с двумя гуманизированными последовательностями, у которой экспрессируется человеческий белок IL-4 и гуманизированный белок IL-4Rα, где гуманизированный белок IL-4Rα содержит эктодомен человеческого белка IL-4Rα, связанный с трансмембранным и цитоплазматическим доменами эндогенного белка IL-4Rα мыши, и где мышь не экспрессирует IL-4 или IL-4Rα мыши.[00156] In specific embodiments, the screening method uses a mouse with two humanized sequences that expresses a human IL-4 protein and a humanized IL-4Rα protein, where the humanized IL-4Rα protein contains an ectodomain of a human IL-4Rα protein associated with a transmembrane and cytoplasmic domains of endogenous mouse IL-4Rα protein, and where the mouse does not express mouse IL-4 or IL-4Rα.
[00157] В некоторых вариантах осуществления способ скрининга антагониста, специфичного к человеческим IL-4 или IL-4Rα, включает введение средства генетически модифицированному грызуну с двумя гуманизированными генами IL-4 и IL-4Rα, как описано в данном документе, определение эффекта средства по отношению к биологической функции, опосредованной сигнальным путем IL-4/IL-4Rα, и идентифицирование средства в качестве антагониста, специфичного к человеческим IL-4 или IL-4Rα, если оно вызывает антагонизм функции, опосредованной сигнальным путем IL-4/IL-4Rα, у генетически модифицированного грызуна.[00157] In some embodiments, a method for screening for an antagonist specific for human IL-4 or IL-4Rα comprises administering the agent to a genetically modified rodent with two humanized IL-4 and IL-4Rα genes as described herein, determining the effect of the agent by relation to biological function mediated by the IL-4/IL-4Rα signaling pathway and identifying the agent as an antagonist specific to human IL-4 or IL-4Rα if it antagonizes the function mediated by the IL-4/IL-4Rα signaling pathway , in a genetically modified rodent.
[00158] В одном варианте осуществления средство содержит вариабельный домен иммуноглобулина, который связывает IL-4 или IL-4Rα. В одном варианте осуществления средство специфически связывает человеческий IL-4 или IL-4Rα, но не IL-4 или IL-4Rα грызуна. В одном варианте осуществления средство представляет собой антитело. В конкретном варианте осуществления средство представляет собой антитело, которое специфически связывает человеческий IL-4Rα, но не IL-4Rα грызуна.[00158] In one embodiment, the agent contains an immunoglobulin variable domain that binds IL-4 or IL-4Rα. In one embodiment, the agent specifically binds human IL-4 or IL-4Rα, but not rodent IL-4 or IL-4Rα. In one embodiment, the agent is an antibody. In a particular embodiment, the agent is an antibody that specifically binds human IL-4Rα but not rodent IL-4Rα.
[00159] В одном варианте осуществления в способе скрининга используют мышь с двумя гуманизированными последовательностями, у которой экспрессируется человеческий белок IL-4 и гуманизированный белок IL-4Rα, где гуманизированный белок IL-4Rα содержит эктодомен человеческого белка IL-4Rα, связанный с трансмембранным и цитоплазматическим доменами эндогенного белка IL-4Rα мыши, и где мышь не экспрессирует IL-4 мыши или IL-4Rα мыши.[00159] In one embodiment, the screening method uses a mouse with two humanized sequences that expresses a human IL-4 protein and a humanized IL-4Rα protein, where the humanized IL-4Rα protein contains an ectodomain of a human IL-4Rα protein associated with a transmembrane and cytoplasmic domains of endogenous mouse IL-4Rα protein, and where the mouse does not express mouse IL-4 or mouse IL-4Rα.
[00160] В некоторых вариантах осуществления способ скрининга включает стадии индуцирования у описанного в данном документе грызуна с двумя гуманизированными последовательностями заболевания, ассоциированного с передачей сигналов IL-4/IL-4Rα, введения средства грызуну, определения того, уменьшает ли средство тяжесть заболевания, и идентифицирования средства в качестве антагониста, специфичного к человеческим IL-4 или IL-4Rα, подходящего для лечения заболевания, если данное средство уменьшает тяжесть заболевания.[00160] In some embodiments, the screening method comprises the steps of inducing a disease associated with IL-4/IL-4Rα signaling in a two humanized sequence described rodent, administering an agent to the rodent, determining whether the agent reduces the severity of the disease, and identifying an agent as a human IL-4 or IL-4Rα specific antagonist suitable for treating a disease if the agent reduces the severity of the disease.
[00161] Под «заболеванием, связанным с передачей сигналов IL-4/IL-4Rα» подразумевают заболевание, при котором вовлечена биологическая функция, опосредованная передачей сигналов IL-4/IL-4Rα. Примеры заболеваний, ассоциированных с передачей сигналов IL-4/IL-4Rα, включают, например, воспалительные заболевания или нарушения, такие как астма, атопический дерматит, хроническое обструктивное заболевание легких (COPD) (которое может возникать по меньшей мере частично от сигаретного дыма), воспалительное заболевание кишечника, рассеянный склероз, артрит, аллергический ринит, эозинофильный эзофагит и псориаз. Астма может представлять собой эозинофильную или неэозинофильную астму и стероид-чувствительную или стероид-резистентную астму.[00161] By "disease associated with IL-4/IL-4Rα signaling" is meant a disease in which a biological function mediated by IL-4/IL-4Rα signaling is implicated. Examples of diseases associated with IL-4/IL-4Rα signaling include, for example, inflammatory diseases or disorders such as asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD) (which may arise at least in part from cigarette smoke) , inflammatory bowel disease, multiple sclerosis, arthritis, allergic rhinitis, eosinophilic esophagitis, and psoriasis. Asthma can be eosinophilic or non-eosinophilic asthma and steroid sensitive or steroid resistant asthma.
[00162] В некоторых вариантах осуществления заболевание, ассоциированное с передачей сигналов IL-4/IL-4Rα, представляет собой воспаление дыхательных путей, которое может быть индуцировано у грызуна путем интраназального введения аллергена (например, экстракта клещей домашней пыли) в одной или более дозах в течение определенного периода времени. Эффект средства можно определить путем измерения того, снижается ли степень воспаления дыхательных путей (что выражается, например, по накоплением слизи, эозинофильным клеточным инфильтратом в жидкости бронхоальвеолярного лаважа, уровнями общего IgE в кровотоке и/или изменением профиля экспрессии, измеряемому посредством анализа экспрессии на микрочипе) вследствие введения средства. Аллерген, используемый для индуцирования воспаления дыхательных путей, и тестируемое средство можно вводить одновременно или в разные моменты времени. В некоторых вариантах осуществления аллерген вводят грызуну в одной или более дозах, а тестируемое средство вводят грызуну после того, как грызуну ввели по меньшей мере одну дозу аллергена.[00162] In some embodiments, an IL-4/IL-4Rα signaling-associated disease is airway inflammation that can be induced in a rodent by intranasal administration of an allergen (e.g., house dust mite extract) at one or more doses within a certain period of time. The effect of an agent can be determined by measuring whether the degree of inflammation of the airways is reduced (as expressed, for example, by accumulation of mucus, eosinophilic cell infiltrate in bronchoalveolar lavage fluid, total IgE levels in the bloodstream, and/or a change in the expression profile, measured by microarray expression analysis ) due to the introduction of funds. The allergen used to induce airway inflammation and the test agent may be administered simultaneously or at different times. In some embodiments, the allergen is administered to the rodent in one or more doses, and the test agent is administered to the rodent after the rodent has received at least one dose of the allergen.
[00163] В некоторых вариантах осуществления заболевание, ассоциированное с передачей сигналов IL-4/IL-4Rα, представляет собой кожное воспаление или атопический дерматит, которые могут быть индуцированы у грызуна путем создания кожного повреждения и воздействия на поврежденную кожу аллергеном (например, бактериальным токсином или экстрактом клещей домашней пыли) в одной или более дозах в течение определенного периода времени. Эффект средства можно определить путем измерения того, уменьшается ли кожное воспаление как результат введения средства.[00163] In some embodiments, the disease associated with IL-4/IL-4Rα signaling is skin inflammation or atopic dermatitis, which can be induced in a rodent by creating a skin lesion and exposing the damaged skin to an allergen (e.g., a bacterial toxin or house dust mite extract) in one or more doses over a period of time. The effect of an agent can be determined by measuring whether skin inflammation is reduced as a result of administration of the agent.
[00164] В дополнительном аспекте отличные от человека животных с тремя гуманизированными последовательностями, т.е. отличных от человека животные, гены IL-4, IL-4Rα и IL-33 которых гуманизировали, используют для оценки фармакодинамики (PD) и терапевтической эффективности кандитатных соединений, таких как, например, антагонистов, специфичных к человеческим IL-4 и/или IL-4Rα, и антагонистов, специфичных к человеческому IL-33.[00164] In a further aspect, non-human animals with three humanized sequences, i.e. non-human animals whose IL-4, IL-4Rα and IL-33 genes have been humanized are used to evaluate the pharmacodynamics (PD) and therapeutic efficacy of candidate compounds such as, for example, antagonists specific for human IL-4 and/or IL -4Rα, and antagonists specific to human IL-33.
[00165] Под «антагонистами IL-33» подразумевают молекулы (например, антитела), которые блокируют, подавляют или ингибируют одну или более биологических функций или передачу сигналов, опосредованных IL-33. «Антагонисты, специфичные к человеческому IL-33», относятся к антагонистам, которые являются специфичными к IL-33, и практически не воздействуют на IL-33 грызуна. Известно, что IL-33 стимулирует передачу сигнала через ST2 и RAcP IL-1, которая ослабляется в присутствии антагониста, такого как антитела к IL-33. Ингибирование передачи сигнала IL-33 через ST2 и RAcP IL-1 можно определить путем анализа передачи сигнала IL-33 в анализах in vitro или in vivo, как, например, таких анализах, которые описаны в опубликованной заявке на патент США 2014/0271658 А1, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки. Например, анализ, как, например, такой, который описан в опубликованной заявке на патент США 2014/0271658 А1, можно использовать для оценки эффекта антитела к IL-33 по отношению к воспалению легких у аллерген-чувствительных животных, которые являются гомозиготными по экспрессии человеческого IL-33. Антитело к IL-33, эффективное в качестве антагониста IL-33, должно проявлять тенденцию к снижению количества воспалительных клеток в легком, а также тенденцию к снижению количества цитокинов, таких как IL-4 и IL-5.[00165] By "antagonists of IL-33" is meant molecules (eg, antibodies) that block, suppress or inhibit one or more biological functions or signaling mediated by IL-33. "Antagonists specific for human IL-33" refers to antagonists that are specific for IL-33 and have little or no effect on rodent IL-33. IL-33 is known to stimulate signal transduction through ST2 and RAcP of IL-1, which is attenuated in the presence of an antagonist such as anti-IL-33 antibodies. Inhibition of IL-33 signaling through ST2 and IL-1 RAcP can be determined by assaying IL-33 signaling in in vitro or in vivo assays, such as those described in US Published Application 2014/0271658 A1, the entire contents of which are incorporated herein by reference. For example, an assay such as that described in U.S. Published Application 2014/0271658 A1 can be used to evaluate the effect of an anti-IL-33 antibody on lung inflammation in allergen-susceptible animals that are homozygous for the expression of human IL-33. An anti-IL-33 antibody effective as an IL-33 antagonist should tend to decrease the number of inflammatory cells in the lung and also tend to decrease the amount of cytokines such as IL-4 and IL-5.
[00166] В конкретных вариантах осуществления отличное от человека животное с тремя гуманизированными последовательностями используют согласно данному документу для оценки кандидатных соединений, при этом животное с тремя гуманизированными последовательностями представляет собой мышь с тремя гуманизированными последовательностями, у которой экспрессируется человеческий белок IL-4, гуманизированный белок IL-4Rα, который содержит эктодомен человеческого белка IL-4Rα, связанный с трансмембранным и цитоплазматическим доменами белка IL-4Rα мыши, и человеческий белок IL-33, при этом мышь не экспрессирует IL-4 мыши, IL-4Rα мыши или IL-33 мыши.[00166] In specific embodiments, a non-human tri-humanized sequence animal is used according to this document to evaluate candidate compounds, wherein the tri-humanized sequence animal is a tri-humanized mouse that expresses human IL-4 protein, a humanized protein IL-4Rα, which contains the ectodomain of the human IL-4Rα protein associated with the transmembrane and cytoplasmic domains of the mouse IL-4Rα protein and the human IL-33 protein, while the mouse does not express mouse IL-4, mouse IL-4Rα, or IL-33 mice.
[00167] В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное с тремя гуманизированными последовательностями используют для оценки фармакодинамики (PD) и терапевтической эффективности кандидатного соединения, такого как, например, антагониста, специфичного к человеческим IL-4 и/или IL-4Rα, или антагониста, специфичного к человеческому IL-33. Например, антитело, специфичное к человеческому IL-4, антитело, специфичное к человеческому IL-4Rα, и антитело, специфичное к человеческому IL-33, можно тестировать по отдельности на животном с тремя гуманизированными последовательностями (таком как грызун, например, мышь или крыса), после чего можно оценить и сравнить их PD-профили и терапевтические эффективности.[00167] In some embodiments, a non-human animal with three humanized sequences is used to evaluate the pharmacodynamics (PD) and therapeutic efficacy of a candidate compound, such as, for example, an antagonist specific for human IL-4 and/or IL-4Rα, or an antagonist specific to human IL-33. For example, an antibody specific for human IL-4, an antibody specific for human IL-4Rα, and an antibody specific for human IL-33 can be tested separately in a three-sequence humanized animal (such as a rodent, e.g., mouse or rat ), after which their PD profiles and therapeutic efficacy can be evaluated and compared.
[00168] В других вариантах осуществления отличное от человека животное с тремя гуманизированными последовательностями используют для оценки эффективности комбинации соединений, например, комбинации антитела-антагониста, специфичного к человеческим IL-4 и/или IL-4Rα, с антителом-антагонистом, специфичным к человеческому IL-33, по сравнению с эффективностью данных соединений при использовании их отдельно для определения, например, проявляет ли комбинация соединений синергический терапевтический эффект. В конкретных вариантах осуществления комбинацию антитела, специфичного к человеческому IL-4, и антитела, специфичного к человеческому IL-33, тестируют на отличном от человека животном с тремя гуманизированными последовательностями. В других конкретных вариантах осуществления комбинацию антитела, специфичного к человеческому IL-4Rα, и антитела, специфичного к человеческому IL-33, тестируют на отличном от человека животном с тремя гуманизированными последовательностями.[00168] In other embodiments, a non-human animal with three humanized sequences is used to evaluate the efficacy of a combination of compounds, e.g., a combination of an antagonist antibody specific for human IL-4 and/or IL-4Rα with an antagonist antibody specific for human IL-33, compared with the effectiveness of these compounds when used alone to determine, for example, whether a combination of compounds exhibits a synergistic therapeutic effect. In specific embodiments, the combination of an antibody specific for human IL-4 and an antibody specific for human IL-33 is tested in a non-human animal with three humanized sequences. In other specific embodiments, the combination of an antibody specific for human IL-4Rα and an antibody specific for human IL-33 is tested in a non-human animal with three humanized sequences.
[00169] Для оценки кандидатного соединения или комбинации соединений у животного с тремя гуманизированными последовательностями можно индуцировать заболевание, ассоциированное с передачей сигналов IL-4/IL-4Rα и передачей сигналов IL-33. Примеры заболеваний, ассоциированных с передачей сигналов IL-4/IL-4Rα и передачей сигналов IL-33, включают, например, воспалительные заболевания или нарушения, такие как астма, атопический дерматит, хроническое обструктивное заболевание легких (COPD) (которое может возникать по меньшей мере частично от сигаретного дыма), воспалительное заболевание кишечника, рассеянный склероз, артрит, аллергический ринит, эозинофильный эзофагит и псориаз. Астма может представлять собой эозинофильную или неэозинофильную астму и стероид-чувствительную или стероид-резистентную астму. Эффект соединения или комбинации соединений можно оценить подобным образом, как и для животного, характеризующегося двойной гуманизацией по IL-4/IL-4Rα, как описано в данном документе выше.[00169] To evaluate a candidate compound or combination of compounds, a disease associated with IL-4/IL-4Rα signaling and IL-33 signaling can be induced in an animal with three humanized sequences. Examples of diseases associated with IL-4/IL-4Rα signaling and IL-33 signaling include, for example, inflammatory diseases or disorders such as asthma, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD) (which can occur at least least partly from cigarette smoke), inflammatory bowel disease, multiple sclerosis, arthritis, allergic rhinitis, eosinophilic esophagitis, and psoriasis. Asthma can be eosinophilic or non-eosinophilic asthma and steroid sensitive or steroid resistant asthma. The effect of a compound or combination of compounds can be evaluated in a similar manner to an animal characterized by IL-4/IL-4Rα dual humanization as described herein above.
[00170] Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано нижеследующими неограничивающими примерами.[00170] The present invention is further illustrated by the following non-limiting examples.
Пример 1Example 1
Замена эндогенного гена IL-4 мыши человеческим геном IL-4Replacement of Endogenous Mouse IL-4 Gene with Human IL-4 Gene
[00171] Геном человеческого IL-4 длиной 8,8 т.п.о., содержащий кодирующую часть от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 4 (включая 3'-нетраслируемый участок) и часть 3'-участка ниже экзона 4 человеческого гена IL-4, заменяли локус гена IL-4 мыши длиной 6,3 т.п.о., охватывающий кодирующую часть от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 4 (включая 3'-нетраслируемый участок) и часть 3'-участка ниже экзона 4. См. фигуру 2А.[00171] The 8.8 kb human IL-4 genome containing the coding portion from
[00172] Целенаправленно воздействующую конструкцию для замены гена IL-4 мыши человеческим в одной стадии целенаправленного воздействия конструировали с использованием генноинженерной технологии VelociGene® (см. Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech, 21(6):652-659). ДНК IL-4 мыши и человеческого IL-4 получали из клонов бактериальной искусственной хромосомы (ВАС) bMQ-41A12 и RP11-17K19 соответственно. Вкратце, SbfI-линеаризованную целенаправленно воздействующую конструкцию, полученную путем клонирования с репарацией гэпов, и содержащую IL-4 мыши выше и ниже гомологичных участков, фланкирующих последовательность человеческого IL-4 длиной 8,8 т.п.о., простирающуюся от кодона ATG в экзоне 1 до экзона 4 (включая 3'-нетранслируемый участок), и часть 3'-участка ниже экзона 4 (геномные координаты: GRCh37: chr5:132 009 743-132 018 576 (+ нить)), и фланкированную кассету с селектируемым маркером устойчивости к гигромицину, вводили посредством электропорации в эмбриональные стволовые (ES) клетки мыши F1H4 (гибрид F1 C57BL/6 × 129). Подвергшиеся точному целенаправленному воздействию ES-клетки (MAID 879) затем подвергали электропорации транзиентным Cre-экспрессирующим вектором для удаления кассеты с селектируемым маркером устойчивости к лекарственному средству. Клоны подвергшихся целенаправленному воздействию ES-клеток без кассеты, обеспечивающей устойчивость к лекарственному средству (MAID 1553), вводили в эмбрион SW мыши на стадии 8 клеток с помощью способа VelociMouse® (см. патенты США №№7294754, 7576259, 7659442 и Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech. 25(1):91-99). VelociMice® (мыши F0, полностью произошедшие от донорной ES-клетки), несущие гуманизированный ген IL-4, идентифицировали с помощью генотипирования на предмет потери аллеля мыши и приобретения человеческого аллеля с использованием модифицированного анализа алеллей (см. Valenzuela et al. (2003)).[00172] A targeting construct to replace the mouse IL-4 gene with a human one in a single targeting step was constructed using VelociGene® engineering technology (see Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech, 21(6):652-659). Mouse IL-4 and human IL-4 DNA was obtained from bacterial artificial chromosome (BAC) clones bMQ-41A12 and RP11-17K19, respectively. Briefly, an SbfI linearized targeting construct obtained by gap-repair cloning and containing mouse IL-4 upstream and downstream of homologous regions flanking an 8.8 kb human IL-4 sequence extending from the ATG codon to
[00173] Клоны подвергшихся точному целенаправленному воздействию ES-клеток идентифицировали с помощью анализа потери нативного аллеля (LONA) (Valenzuela et al. 2003), при котором количество копий нативного немодифицированного гена IL-4 определяли посредством двух количественных полимеразных цепных реакций TaqMan™ (qPCR) со специфическими праймерами к последовательностям гена IL-4 мыши, на которые целенаправленно воздействовали для делеции. Реакционные смеси для qPCR содержали следующие наборы праймер-зонд (записано от 5'- до 3'-конца): прямой праймер выше целевого участка, CATGCACGGA GATGGATGTG (SEQ ID NO:1); обратный праймер выше целевого участка, GACCCCTCAG GTCCACTTAC С (SEQ ID NO: 2); зонд выше целевого участка, FAM-AACGTCCTCA CAGCAACGA-MGB (SEQ ID NO: 3); прямой праймер ниже целевого участка, GTGCCCAGGT GTGCTCATG (SEQ ID NO: 4); обратный праймер ниже целевого участка, CGCCTGCCTC СТСАСТТТАТ С (SEQ ID NO: 5); зонд ниже целевого участка, FAM-ATCTGCTTCA CCATCCACT-MGB (SEQ ID NO: 6); при этом FAM относится к флуоресцентному зонду 5-карбоксифлуоресцеину, a BHQ относится к гасителю флуоресценции типа «черная дыра» (Biosearch Technologies). ДНК, выделенную из клонов ES-клеток, которую они поглотили в составе целенаправленно воздействующего вектора и она встроилась в их геномы, объединяли с мастер-миксом TaqMan™ Gene Expression Master Mix (Life Technologies) согласно инструкциям производителя в 384-луночном планшете для ПЦР (оптический 384-луночный реакционный планшет MicroAmp™, Life Technologies) и выполняли циклы в Prism 7900НТ от Applied Biosystems, которая собирала данные о флуоресценции в ходе циклов ПЦР и определяла пороговый цикл (Ct), дробный цикл ПЦР, при котором накопленная флуоресценция достигала предварительно установленного порога. QPCR со специфическими праймерами выше и ниже IL-4 и две qPCR для не подвергшихся целенаправленному воздействию эталонных генов проводили для каждого образца ДНК. Рассчитывали разницы значений Ct (ΔCt) между каждой IL-4-специфической qPCR и каждой qPCR для эталонного гена, а затем рассчитывали разницу между каждым ΔCt и медианным ΔCt для всех анализируемых образцов с получением значений ΔΔCt для каждого образца. Количество копий гена IL-4 в каждом образце рассчитывали с учетом следующей формулы: количество копий = 2×2-ΔΔCt. Клон, подвергшийся точному целенаправленному воздействию, утративший одну из его нативных копий будет характеризоваться количеством копий гена IL-4, равным одному. Для доказательства того, что последовательность человеческого гена IL-4 заменила подвергнутую делеции последовательность гена IL-4 мыши в гуманизированном аллеле, проводили анализ qPCR с TaqMan™, в который включали следующие наборы праймер-зонд (записано от 5'- до 3'-конца): прямой праймер, специфический к человеческому гену, GCCTGGACCA AGACTCTGT (SEQ ID NO: 7); обратный праймер, специфический к человеческому гену, ACCGTGGGAC GGCTTCTTAC (SEQ ID NO: 8); зонд, специфический к человеческому гену, FAM-CACCGAGTTG ACCGTAACAG ACATC-BHQ (SEQ ID NO: 9). Для доказательства того, что кассета с селектируемым маркером устойчивости к гигромицину встроилась с последовательностью человеческого гена IL-4 в гуманизированном аллеле, проводили анализ qPCR с TaqMan™, в который включали следующие наборы праймер-зонд (записано от 5'- до 3'-конца): прямой праймер, специфический к гену устойчивости к гигромицину, TGCGGCCGAT CTTAGCC (SEQ ID NO: 10); обратный праймер, специфический к гену устойчивости к гигромицину, TTGACCGATT CCTTGCGG (SEQ ID NO: 11); зонд, специфический к гену устойчивости к гигромицину, FAM-ACGAGCGGGT TCGGCCCATT C-BHQ (SEQ ID NO: 12).[00173] Accurately targeted ES cell clones were identified using native allele loss assay (LONA) (Valenzuela et al. 2003), in which copy number of the native unmodified IL-4 gene was determined by two TaqMan™ quantitative polymerase chain reactions (qPCR ) with specific primers for mouse IL-4 gene sequences that were targeted for deletion. The qPCR reactions contained the following primer-probe sets (written 5' to 3' end): forward primer upstream of the target region, CATGCACGGA GATGGATGTG (SEQ ID NO:1); reverse primer upstream of the target region, GACCCCTCAG GTCCACTTAC C (SEQ ID NO: 2); probe above target site, FAM-AACGTCCTCA CAGCAACGA-MGB (SEQ ID NO: 3); forward primer below the target site, GTGCCCAGGT GTGCTCATG (SEQ ID NO: 4); reverse primer below the target region, CGCCTGCCTC STCATTTTAT C (SEQ ID NO: 5); probe below target site, FAM-ATCTGCTTCA CCATCCACT-MGB (SEQ ID NO: 6); whereby FAM refers to the 5-carboxyfluorescein fluorescent probe and BHQ refers to a black hole fluorescence quencher (Biosearch Technologies). DNA isolated from clones of ES cells that they had taken up as part of a targeted vector and incorporated into their genomes was combined with a TaqMan™ Gene Expression Master Mix (Life Technologies) according to the manufacturer's instructions in a 384-well PCR plate ( Optical 384-well MicroAmp™ Reaction Plate, Life Technologies) and cycled in Prism 7900HT from Applied Biosystems, which collected fluorescence data during PCR cycles and determined the threshold cycle (Ct), a fractional PCR cycle at which accumulated fluorescence reached a predetermined threshold. QPCR with specific primers upstream and downstream of IL-4 and two qPCRs for untargeted reference genes were performed for each DNA sample. Differences in Ct values (ΔCt) between each IL-4-specific qPCR and each qPCR for the reference gene were calculated, and then the difference between each ΔCt and the median ΔCt for all analyzed samples was calculated to obtain ΔΔCt values for each sample. The number of copies of the IL-4 gene in each sample was calculated using the following formula: number of copies = 2×2 -ΔΔCt . A clone subjected to precise targeted action that has lost one of its native copies will be characterized by the number of copies of the IL-4 gene equal to one. To prove that the human IL-4 gene sequence had replaced the deleted mouse IL-4 gene sequence in the humanized allele, a TaqMan™ qPCR assay was performed that included the following primer-probe sets (written 5' to 3' end ): forward primer specific for the human gene, GCCTGGACCA AGACTCTGT (SEQ ID NO: 7); reverse primer specific for the human gene, ACCGTGGGAC GGCTTCTTAC (SEQ ID NO: 8); probe specific for the human gene, FAM-CACCGAGTTG ACCGTAACAG ACATC-BHQ (SEQ ID NO: 9). To prove that the hygromycin resistance selectable marker cassette inserted with the human IL-4 gene sequence in the humanized allele, a TaqMan™ qPCR assay was performed that included the following primer-probe sets (written 5' to 3' end ): forward primer specific for the hygromycin resistance gene, TGCGGCCGAT CTTAGCC (SEQ ID NO: 10); reverse primer specific for the hygromycin resistance gene, TTGACCGATT CCTTGCGG (SEQ ID NO: 11); probe specific for the hygromycin resistance gene, FAM-ACGAGCGGGT TCGGCCCATT C-BHQ (SEQ ID NO: 12).
[00174] Тот же самый анализ LONA использовали для анализа ДНК, выделенной из биоптатов, полученных из хвостов мышей, полученных из подвергшихся целенаправленному воздействию ES-клеток, для определения их генотипов по IL-4 и подтверждения того, что гуманизированный аллель IL-4 передался в зародышевой линии. Два потомка, гетерозиготные по замене, скрещивали с получением мыши, гомозиготной по замене эндогенного гена IL-4 мыши человеческим геном IL-4. Потомков, гомозиготных по замене, использовали для фенотипирования.[00174] The same LONA assay was used to analyze DNA isolated from mouse tail biopsies derived from targeted ES cells to determine their IL-4 genotypes and confirm that the humanized IL-4 allele was passed on in the germline. Two offspring heterozygous for the substitution were crossed to produce a mouse homozygous for the substitution of the endogenous mouse IL-4 gene with the human IL-4 gene. Offspring homozygous for the substitution were used for phenotyping.
[00175] Верхний участок соединения локуса IL-4 мыши и последовательности, содержащей ген человеческого IL-4, сконструировали так, чтобы он находился в пределе 
Пример 2Example 2
Замена последовательности гена эктодомена эндогенного IL-4Rα мыши последовательностью гена эктодомена человеческого IL-4RαReplacement of the mouse endogenous IL-4Rα ectodomain gene sequence with the human IL-4Rα ectodomain gene sequence
[00176] Ген человеческого IL-4Rα длиной 15,6 т.п.о., содержащий участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 5 и часть интрона 5 человеческого гена IL-4Rα, заменяли локусом гена IL-4Rα мыши длиной 7,1 т.п.о., охватывающим кодирующую часть от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 5 и часть интрона 5. Экзоны 6-9 мыши сохраняли; при этом гуманизировали только экзоны 1-5 (т.е. эктодомены). См. фигуру 2В.[00176] The 15.6 kb human IL-4Rα gene, containing the region from
[00177] Целенаправленно воздействующую конструкцию для замены гена IL-4Rα мыши человеческим в одной стадии целенаправленного воздействия конструировали с использованием генноинженерной технологии VelociGene® (см. Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech, 21(6):652-659). ДНК IL-4Rα мыши и человеческого IL-4Rα получали из клонов бактериальной искусственной хромосомы (ВАС) RP23-136G14 и RP11-166E24 соответственно. Вкратце, NotI-линеаризованную целенаправленно воздействующую конструкцию, полученную путем клонирования с репарацией гэпов и содержащую ген IL-4Rα мыши выше и ниже гомологичных участков, фланкирующих последовательность человеческого IL-4Rα длиной 15,6 т.п.о., простирающуюся от кодона ATG в экзоне 1 до экзона 5, и часть интрона 5 (геномные координаты: GRCh37: chr16:27351525-27367111 (+ нить)), и фланкированную loxP кассету с селектируемым маркером устойчивости к неомицину, вводили посредством электропорации в эмбриональные стволовые (ES) клетки F1H4 мыши (гибрид F1 C57BL/6 × 129). Подвергшиеся точному целенаправленному воздействию ES-клетки (MAID 803) затем подвергали электропорации транзиентным Cre-экспрессирующим вектором для удаления кассеты с селектируемым маркером устойчивости к лекарственному средству. Клоны подвергшихся целенаправленному воздействию ES-клеток без кассеты, обеспечивающей устойчивость к лекарственному средству (MAID 1444), вводили в эмбрион SW мыши на стадии 8 клеток с помощью способа VelociMouse® (см. патенты США №№7294754, 7576259, 7659442 и Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech. 25(1):91-99). VelociMice® (мыши F0, полностью произошедшие от донорной ES-клетки) с гуманизированным геном IL-4Rα идентифицировали с помощью генотипирования на предмет потери аллеля мыши и приобретения человеческого аллеля с использованием модифицированного анализа алеллей (см. Valenzuela et al. (2003)).[00177] A targeting construct to replace the mouse IL-4Rα gene with a human one in a single targeting step was constructed using VelociGene® engineering technology (see Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech, 21(6):652-659). Mouse IL-4Rα and human IL-4Rα DNA were obtained from bacterial artificial chromosome (BAC) clones RP23-136G14 and RP11-166E24, respectively. Briefly, a NotI linearized targeting construct obtained by gap repair cloning and containing the mouse IL-4Rα gene upstream and downstream of homologous regions flanking a 15.6 kb human IL-4Rα sequence extending from the ATG codon to
[00178] Клоны подвергшихся точному целенаправленному воздействию ES-клеток идентифицировали с помощью анализа потери нативного аллеля (LONA) (Valenzuela et al. 2003), при котором количество копий нативного немодифицированного гена IL-4Rα определяли посредством двух количественных полимеразных цепных реакций TaqMan™ (qPCR) со специфическими праймерами к последовательностям гена IL-4Rα мыши, на которые целенаправленно воздействовали для делеции. Реакционные смеси для qPCR содержали следующие наборы праймер-зонд (записано от 5'- до 3'-конца): прямой праймер выше целевого участка, CCGCTGGCAT GTGTATTGTG (SEQ ID NO: 16); обратный праймер выше целевого участка, TGAGTGTGGG ACCCTCAAGA G (SEQ ID NO: 17); зонд выше целевого участка, FAM-TGACCCAAGC CCTACATGGC CACT-BHQ (SEQ ID NO: 18); прямой праймер ниже целевого участка, TGAGGAGAGC TCACGGGAAT С (SEQ ID NO: 19); обратный праймер ниже целевого участка, АСССАТСТСС TGCGTTTCTG (SEQ ID NO: 20); зонд ниже целевого участка, FAM-TTGACACGCC AGCTACACTG CTCCA-BHQ (SEQ ID NO: 21); при этом FAM относится к флуоресцентному зонду 5-карбоксифлуоресцеину, а BHQ относится к гасителю флуоресценции типа «черная дыра» (Biosearch Technologies). ДНК, выделенную из клонов ES-клеток, которую они поглотили в составе целенаправленно воздействующего вектора и она встроилась в их геномы, объединяли с мастер-миксом TaqMan™ Gene Expression Master Mix (Life Technologies) согласно инструкциям производителя в 384-луночном планшете для ПЦР (оптический 384-луночный реакционный планшет MicroAmp™, Life Technologies) и выполняли циклы в Prism 7900НТ от Applied Biosystems, которая собирала данные о флуоресценции в ходе циклов ПЦР и определяла пороговый цикл (Ct), дробный цикл ПЦР, при котором накопленная флуоресценция достигала предварительно установленного порога. QPCR со специфическими праймерами выше и ниже IL-4Rα и две qPCR для не подвергшихся целенаправленному воздействию эталонных генов проводили для каждого образца ДНК. Рассчитывали разницы значений Ct (ΔCt) между каждой IL-4Rα-специфической qPCR и каждой qPCR для эталонного гена, а затем рассчитывали разницу между каждым ΔCt и медианным ΔCt для каждого анализируемого образца с получением значений ΔΔCt для каждого образца. Количество копий гена IL-4Rα в каждом образце рассчитывали с учетом следующей формулы: количество копий = 2×2-ΔΔCt. Клон, подвергшийся точному целенаправленному воздействию, утративший одну из его нативных копий будет характеризоваться количеством копий гена IL-4Rα, равным одному. Для доказательства того, что последовательность человеческого гена IL-4Rα заменила подвергнутую делеции последовательность гена IL-4Rα мыши в гуманизированном аллеле, проводили анализ qPCR с TaqMan™, в который включали следующие наборы праймер-зонд (записано от 5'- до 3'-конца): прямой праймер, специфический к человеческому гену, ACCTGCGTCT CCGACTACAT G (SEQ ID NO: 22); обратный праймер, специфический к человеческому гену, GAGCTCGGTG CTGCAATTG (SEQ ID NO: 23); зонд, специфический к человеческому гену, FAM-TGGGACCATT CATCTTCCAC TCGCA-BHQ (SEQ ID NO: 24). Для доказательства того, что кассета с селектируемым маркером устойчивости к неомицину встроилась с последовательностью человеческого гена IL-4Rα в гуманизированном аллеле, проводили анализ qPCR с TaqMan™, в который включали следующие наборы праймер-зонд (записано от 5'- до 3'-конца): прямой праймер, специфический к гену устойчивости к неомицину, GGTGGAGAGG CTATTCGGC (SEQ ID NO: 25); обратный праймер, специфический к гену устойчивости к неомицину, GAACACGGCG GCATCAG (SEQ ID NO: 26); зонд, специфический к гену устойчивости к неомицину, FAM-TGGGCACAAC AGACAATCGG CTG-BHQ (SEQ ID NO: 27).[00178] Accurately targeted ES cell clones were identified using native allele loss assay (LONA) (Valenzuela et al. 2003), in which copy number of the native unmodified IL-4Rα gene was determined by two TaqMan™ quantitative polymerase chain reactions (qPCR ) with specific primers for mouse IL-4Rα gene sequences that have been targeted for deletion. The qPCR reactions contained the following primer-probe sets (written 5' to 3'): forward primer upstream of the target region, CCGCTGGCAT GTGTATTGTG (SEQ ID NO: 16); reverse primer upstream of the target region, TGAGTGTGGG ACCCTCAAGA G (SEQ ID NO: 17); probe above target site, FAM-TGACCCAAGC CCTACATGGC CACT-BHQ (SEQ ID NO: 18); forward primer below the target site, TGAGGAGAGC TCACGGGAAT C (SEQ ID NO: 19); reverse primer below the target region, ACCATCCCC TGCGTTTCTG (SEQ ID NO: 20); probe below target site, FAM-TTGACACGCC AGCTACACTG CTCCA-BHQ (SEQ ID NO: 21); whereby FAM refers to the 5-carboxyfluorescein fluorescent probe and BHQ refers to a black hole fluorescence quencher (Biosearch Technologies). DNA isolated from clones of ES cells that they had taken up as part of a targeted vector and incorporated into their genomes was combined with a TaqMan™ Gene Expression Master Mix (Life Technologies) according to the manufacturer's instructions in a 384-well PCR plate ( Optical 384-well MicroAmp™ Reaction Plate, Life Technologies) and cycled in Prism 7900HT from Applied Biosystems, which collected fluorescence data during PCR cycles and determined the threshold cycle (Ct), a fractional PCR cycle at which accumulated fluorescence reached a predetermined threshold. QPCR with specific primers upstream and downstream of IL-4Rα and two qPCRs for untargeted reference genes were performed for each DNA sample. Differences in Ct values (ΔCt) between each IL-4Rα-specific qPCR and each qPCR for the reference gene were calculated, and then the difference between each ΔCt and the median ΔCt for each sample analyzed was calculated to obtain ΔΔCt values for each sample. The copy number of the IL-4Rα gene in each sample was calculated using the following formula: copy number = 2×2 -ΔΔCt . A precisely targeted clone that has lost one of its native copies will have a copy number of the IL-4Rα gene equal to one. To prove that the human IL-4Rα gene sequence had replaced the deleted mouse IL-4Rα gene sequence in the humanized allele, a TaqMan™ qPCR assay was performed that included the following primer-probe sets (written 5' to 3' end ): forward primer specific for the human gene, ACTGCGTCT CCGACTACAT G (SEQ ID NO: 22); reverse primer specific for the human gene, GAGCTCGGTG CTGCAATTG (SEQ ID NO: 23); probe specific for the human gene, FAM-TGGGACCATT CATCTTCCAC TCGCA-BHQ (SEQ ID NO: 24). To prove that the neomycin resistance selectable marker cassette inserted with the human IL-4Rα gene sequence in the humanized allele, a TaqMan™ qPCR assay was performed that included the following primer-probe sets (written 5' to 3' end ): forward primer specific for the neomycin resistance gene, GGTGGAGAGG CTATTCGGC (SEQ ID NO: 25); a reverse primer specific for the neomycin resistance gene, GAACACCGGCG GCATCAG (SEQ ID NO: 26); probe specific for the neomycin resistance gene, FAM-TGGGCACAAC AGACAATCGG CTG-BHQ (SEQ ID NO: 27).
[00179] Тот же самый анализ LONA использовали для анализа ДНК, выделенной из биоптатов, полученных из хвостов мышей, полученных из подвергшихся целенаправленному воздействию ES-клеток, для определения их генотипов по IL-4Rα и подтверждения того, что гуманизированный аллель IL-4Rα передался в зародышевой линии. Два потомка, гетерозиготные по замене, скрещивали с получением мыши, гомозиготной по замене эндогенного гена IL-4Rα мыши человеческим геном IL-4Rα. Потомков, гомозиготных по замене, использовали для фенотипирования.[00179] The same LONA assay was used to analyze DNA isolated from mouse tail biopsies derived from targeted ES cells to determine their IL-4Rα genotypes and to confirm that the humanized IL-4Rα allele was transmitted in the germline. Two offspring heterozygous for the substitution were crossed to produce a mouse homozygous for the replacement of the endogenous mouse IL-4Rα gene with the human IL-4Rα gene. Offspring homozygous for the substitution were used for phenotyping.
[00180] Верхний участок соединения локуса IL-4Rα мыши и последовательности, содержащей человеческий ген IL-4Rα, конструировали так, что бы он находился в пределе 
Пример 3Example 3
Получение мышей с двумя гуманизированными IL-4/IL-4RαObtaining mice with two humanized IL-4/IL-4Rα
[00181] Мышей с двумя гуманизированными IL-4/IL-4Rα (Il4hu/hu/Il4rahu/hu) получали следующим образом. Клон ES-клеток MAID 803, содержащий гуманизированный ген IL-4Rα и фланкированную loxP кассету, обеспечивающую устойчивость к неомицину, подвергали электропорации Cre-экспрессирующим вектором для удаления фланкированной loxP кассеты, обеспечивающей устойчивость к неомицину, с получением клона ES-клеток MAID 1444, содержащего гуманизированный ген IL-4Rα без кассеты с селектируемым маркером устойчивости к лекарственному средству (см. пример 2). Такую же целенаправленно воздействующую конструкцию, которую использовали для получения клона ES-клеток MAID 879, содержащего гуманизированный ген IL-4 и фланкированную loxP кассету, обеспечивающую устойчивость к гигромицину (см. пример 1), встраивали посредством электропорации в клон ES-клеток MAID 1444 с получением ES-клеток 879 Het/1444 Het (Il4+/hu/Il4ra+/hu), которые впоследствии подвергали электропорации Cre-экспрессирующим вектором для удаления фланкированной loxP кассеты, обеспечивающей устойчивость к гигромицину, с получением клона ES-клеток (MAID 1553/1444), содержащего гуманизированные гены IL-4 и IL-4Rα. Клон ES-клеток MAID 1553/1444, не содержащий кассету, обеспечивающую устойчивость к лекарственному средству, вводили в эмбрион SW мыши на стадии 8 клеток с получением мышей с двумя гуманизированными IL-4/IL-4Rα.[00181] Mice with two humanized IL-4/IL-4Rα (Il4 hu/hu /Il4ra hu/hu ) were generated as follows. The MAID 803 ES cell clone containing the humanized IL-4Rα gene and a loxP flanked cassette conferring neomycin resistance was electroporated with a Cre-expressing vector to remove the loxP flanked cassette conferring neomycin resistance to produce a MAID 1444 ES cell clone containing humanized IL-4Rα gene without selectable drug resistance marker cassette (see example 2). The same targeting construct that was used to generate the MAID 879 ES cell clone containing the humanized IL-4 gene and a loxP-flanked hygromycin resistance cassette (see Example 1) was inserted by electroporation into the MAID 1444 ES cell clone with 879 Het/1444 Het (Il4 +/hu /Il4ra +/hu ) ES cells, which were subsequently electroporated with a Cre-expression vector to remove the loxP flanked cassette conferring hygromycin resistance, to obtain an ES cell clone (MAID 1553/ 1444) containing humanized IL-4 and IL-4Rα genes. The MAID 1553/1444 ES cell clone lacking the drug resistance cassette was introduced into an 8 cell stage SW mouse embryo to produce dual humanized IL-4/IL-4Rα mice.
Пример 4Example 4
Оценка эффективности дупилумаба, полностью человеческого mAb к IL-4Rα, на мышах с заменами генов человеческими IL-4 и IL4RαEvaluation of the efficacy of dupilumab, a fully human anti-IL-4Rα mAb, in mice with gene substitutions for human IL-4 and IL4Rα
СпособыWays
[00182] Полученных при помощи генноинженерной методики мышей создали с использованием технологии VelociGene® для замены как полноразмерного локуса IL-4 мыши геномными последовательностями человеческого IL-4 длиной 8,8 т.п.о. (см. пример 1 и фигуру 2А), так и гена внеклеточного домена (т.е. эктодомена) IL-4Rα мыши (CD124) фрагментом длиной 15,6 т.п.о. соответствующей геномной ДНК человеческого IL-4Rα (см. пример 2 и фигуру 2В).[00182] Genetically engineered mice were generated using VelociGene® technology to replace the full-length mouse IL-4 locus with 8.8 kb human IL-4 genomic sequences. (see example 1 and figure 2A), and gene extracellular domain (ie ectodomain) IL-4Rα mouse (CD124) fragment length of 15.6 kb. corresponding genomic DNA of human IL-4Rα (see example 2 and figure 2B).
[00183] Мышей с гуманизированным геном IL-4Rα в гомозиготном состоянии валидировали в отношении экспрессии и функционирования человеческого гена. Для определения экспрессии человеческого IL-4Rα гуманизированными мышами отбирали спленоциты от мышей дикого типа и мышей с гуманизированными последовательностями и обрабатывали их меченными флуоресцирующими антителами к CD3 мыши, CD19 мыши, CD124 человека и CD124 мыши для проведения анализа сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS). (См, например, Blaeser et al. (2003) Targeted inactivation of the IL-4 receptor a chain I4R motif promotes allergic airway inflammation, J Exp Med 198(8): 1189-1200).[00183] Homozygous mice with a humanized IL-4Rα gene were validated for human gene expression and function. To determine human IL-4Rα expression in humanized mice, splenocytes from wild-type and humanized mice were harvested and treated with labeled fluorescent anti-mouse CD3, mouse CD19, human CD124, and mouse CD124 antibodies for fluorescent activated cell sorting (FACS) analysis. (See, for example, Blaeser et al. (2003) Targeted inactivation of the IL-4 receptor a chain I4R motif promotes allergic airway inflammation, J Exp Med 198(8): 1189-1200).
[00184] Для демонстрации специфичностей к лигандам и функциональных свойств рецепторов использовали первичные клетки, полученные от мышей с гуманизированным IL-4Rα. Макрофаги, полученные из костного мозга, культивировали с использованием клеток костного мозга из бедренной кости мышей дикого типа и мышей с гуманизированным IL-4Rα, в DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и 20% кондиционированной среды с L-клетками, на протяжении 7 дней.[00184] Primary cells derived from mice with humanized IL-4Rα were used to demonstrate ligand specificities and functional properties of the receptors. Bone marrow-derived macrophages were cultured using bone marrow cells from the femur of wild-type and humanized IL-4Rα mice in DMEM containing 10% fetal bovine serum and 20% conditioned medium with L-cells for 7 days. .
[00185] Затем клетки отдельно обрабатывали 20 нг/мл IL-4 мыши, IL-13 мыши, человеческого IL-4, человеческого IL-13 или растворителя, разбавленных в культуральной среде, на протяжении 20 часов. Образцы в четырех повторностях от каждого условия отбирали для анализа экспрессии генов.[00185] Cells were then separately treated with 20 ng/ml mouse IL-4, mouse IL-13, human IL-4, human IL-13, or solvent diluted in culture medium for 20 hours. Quadruple samples from each condition were taken for gene expression analysis.
[00186] Общую РНК из этих образцов экстрагировали и амплифицировали до кРНК путем введения Су3-СТР. Су3-меченные кРНК из каждого образца затем гибридизировали на созданном по индивидуальному заказу чипе от Agilent, содержащему 43538 олигонуклеотидных последовательностей длиной 60 нуклеотидов, покрывающих транскриптомы мыши. Данные считывали с отсканированных изображений чипа с использованием программного обеспечения Feature Extraction 9.5 от Agilent.[00186] Total RNA from these samples was extracted and amplified to cRNA by introducing Cy3-TP. Cy3-labeled cRNAs from each sample were then hybridized on a custom-designed chip from Agilent containing 43,538 60 nucleotide long oligonucleotide sequences spanning mouse transcriptomes. Data was read from scanned images of the chip using Feature Extraction 9.5 software from Agilent.
[00187] Дифференциально экспрессируемые гены среди экспериментальных групп идентифицировали с использованием t-критерия Стьюдента (р<0,05, кратность изменения ≥ 1,5). Кластер этих генов по экспрессии получали с использованием алгоритма кластеризации по коэффициенту корреляции Пирсона из GeneSpring GX7.3.[00187] Differentially expressed genes among experimental groups were identified using Student's t-test (p<0.05, fold change ≥ 1.5). The expression cluster of these genes was obtained using the Pearson correlation coefficient clustering algorithm from GeneSpring GX7.3.
[00188] Нейтрализующий эффект дупилумаба в отношении IL-4 оценивали с использованием анализа переключения синтеза с класса IgE in vitro на первичных В-клетках, выделенных от мышей с гуманизированным IL-4Rα
[00189] Мышам дикого типа (WT) и мышам с гуманизированным IL-4Rα 
[00190] Первичные В-клетки, очищенные от спленоцитов мыши с гуманизированной последовательностью, активировали бактериальным LPS и смешивали с возрастающими количествами рекомбинантного человеческого IL-4 в 7-дневной культуре для индуцирования переключения синтеза между классами иммуноглобулинов. Для эксперимента по блокирующим свойствам антитела очищенные В-клетки инкубировали с возрастающими дозами дупилумаба на протяжении 30 минут перед добавлением 0,167 нМ рекомбинантного человеческого IL-4, и культивировали на протяжении 7 дней. Продуцирование IgE в отсутствии IL-4 или с mAb изотипического контроля обозначена (
[00191] Интерлейкин-25 (IL-25) представляет собой цитокин, продуцируемый Th2-клетками, основные виды активности которого опосредуются благодаря продуцированию IL-4 и IL-13, что приводит к индуцированию тканеспецифичных патологий, таких как повышенное продуцирование слизи в легких и гиперплазия бокаловидных клеток. (См. Fort et al. (2001) IL-25 induces IL-4, IL-5, and IL-13 and Th2-associated pathologies in vivo, Immunity 15(6):985-995.)[00191] Interleukin-25 (IL-25) is a cytokine produced by Th2 cells whose main activities are mediated through the production of IL-4 and IL-13, resulting in the induction of tissue-specific pathologies such as increased mucus production in the lungs and goblet cell hyperplasia. (See Fort et al. (2001) IL-25 induces IL-4, IL-5, and IL-13 and Th2-associated pathologies in vivo, Immunity 15(6):985-995.)
[00192] Отсутствие IL-13 обеспечивает защиту животных от индуцированных IL-25 патологий в органе-мишени. Таким образом, модель воспаления легких, обусловленную IL-25, использовали для оценки фармакодинамических (PD) свойств дупилумаба in vivo на мышах, содержащих гуманизированные гены IL-4 и/или IL-4Rα.[00192] The absence of IL-13 provides protection to animals from IL-25-induced pathologies in the target organ. Thus, the IL-25 model of lung inflammation was used to evaluate the pharmacodynamic (PD) properties of dupilumab in vivo in mice containing humanized IL-4 and/or IL-4Rα genes.
[00193] PD-свойства откликов рецепторов II типа на воздействие дупилумабом характеризовали с использованием способа индуцирования воспаления с помощью IL-25 путем измерения накопления слизи в легких мышей с гуманизированным IL-4Rα 
[00194] В день 0 мышам WT и с гуманизированым IL-4Rα 
Результатыresults
[00195] Мышей с гуманизированным IL-4Rα охарактеризовали как демонстрирующие: (а) экспрессию человеческого IL-4Rα на первичных клетках от мышей с двумя гуманизированными IL-4/IL-4Rα 
[00196] Как показано на фиг. 3, на которой изображены отмеченные профили IL-4Rα (CD124) на гейтированных популяциях В- и Т-клеток и распределение соответствующей популяции неокрашенных клеток, изображенное заштрихованной областью, мыши дикого типа и мыши с гуманизированным IL-4Rα 
[00197] Как показано на фигуре 4 (слева), мыши дикого типа 
[00198] Эти данные показывают, что IL-4, но не IL-13, характеризуется видоспецифичностью у мышей дикого типа и у мышей с гуманнизированным IL-4Rα 
[00199] Как показано на фигуре 5, роль IL-4 в качестве основного фактора, опосредующего переключение синтеза с класса IgE, подкреплялась отсутствием повышенных уровней IgE в кровотоке после доставки гена IL-25 мыши мышам с гуманизированным IL-4Rα 
[00200] Моноклональное антитело дупилумаб исследовали in vitro и in vivo.[00200] The monoclonal antibody dupilumab was studied in vitro and in vivo.
[00201] Как показано на фигуре 6, дупилумаб предотвращал выработку IgE, индуцированную человеческим IL-4, в культурах первичных В-клеток, полученных от мышей с гуманизированным IL-4Rα 
[00202] Как показано на фигуре 7, дупилумаб дозозависимо уменьшал индуцированные IL-25 легочные патологии в дозе 10 мг/кг и выше (доза 25 мг/кг снижала патологию, ассоциированную с накоплением слизи).[00202] As shown in Figure 7, dupilumab dose-dependently reduced IL-25-induced lung pathologies at a dose of 10 mg/kg and above (25 mg/kg dose reduced pathology associated with mucus accumulation).
Выводыfindings
[00203] Данные результаты демонстрируют фармакологическую активность дупилумаба, являющегося полностью человеческого моноклонального антитела к человеческому IL-4Rα, на генетически модифицированный мышах в качестве модели воспаления, индуцированной цитокинами.[00203] These results demonstrate the pharmacological activity of dupilumab, a fully human anti-human IL-4Rα monoclonal antibody, in genetically engineered mice as a model of cytokine-induced inflammation.
[00204] Получение генетически модифицированных мышей с заменами человеческих генов IL-4 и/или IL-4Rα обеспечивает мощный инструмент для оценки функционирования ортологов генов и эффективности антител-кандидатов in vivo с ограниченной межвидовой реактивностью.[00204] Generation of genetically engineered mice with human IL-4 and/or IL-4Rα gene substitutions provides a powerful tool to assess the function of gene orthologs and the performance of candidate antibodies in vivo with limited cross-species reactivity.
Пример 5Example 5
Модель воспаления легких, индуцированная экстрактом клещей домашней пыли (HDM)House dust mite extract (HDM) induced lung inflammation model
[00205] Хроническое воспаление дыхательных путей у мышей с гуманизированными IL-4 и IL-R4α индуцировали путем интраназального введения экстракта клещей домашней пыли (HDM) (Greer laboratories). Вкратце, мышей сначала сенсибилизировали путем интраназальной инстилляции суспензии HDM (20 мкл при концентрации 2,5 мкг/мл) на протяжении 10 дней. После двухнедельного интервала купирования процесса мышей повторно подвергали воздействию аллергена путем интраназального введения HDM 3 раза в неделю в период с 5 по 12 неделю. Обработку дупилумабом (антителом к IL4Rα) начинали с 7-ой недели с периодичностью два раза в неделю путем подкожных инъекций до завершения эксперимента на 12 неделе. Образцы тканей отбирали для последующих анализов. План эксперимента изображен на фигуре 8.[00205] Chronic airway inflammation in humanized IL-4 and IL-R4α mice was induced by intranasal administration of house dust mite (HDM) extract (Greer laboratories). Briefly, mice were first sensitized by intranasal instillation of HDM suspension (20 μl at a concentration of 2.5 μg/ml) for 10 days. After a two week reversal interval, mice were re-exposed to the allergen by
Демонстрация терапевтической эффективности дупилумаба на HDM-индуцированной модели воспаления дыхательных путей с использованием мышей с двумя гуманизированными IL-4 и IL-4RαDemonstration of the therapeutic efficacy of dupilumab in an HDM-induced airway inflammation model using dual humanized IL-4 and IL-4Rα mice
[00206] Заболевание дыхательных путей индуцировали у мышей с двумя гуманизированными IL-4 и IL-4Rα (IL-4hu/hu/IL-4Rhu/hu) с использованием описанного выше протокола. Гистологический анализ ткани легкого показал, что интраназальная инстилляция HDM приводила к повышенному продуцированию слизи в дыхательных путях. Обработка дупилумабом снижала накопление слизи у мышей, подверженных воздействию аллергена HDM. Анализ клеточного инфильтрата в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (BALF) указывает на то, что количество эозинофилов увеличивалось при инстилляции HDM и снижалось при обработке дупилумабом. Общий IgE в кровотоке гуманизированных мышей повышался при обработке HDM, что свидетельствует о компетентном пути передачи сигнала IL-4. Применение дупилумаба обеспечивало возможность снижения уровня IgE. В отличие от этого, молекула сравнения, IL13R2α-Fc, которая вызывала антагонизм только по отношению к IL-13 без вмешательства в передачу сигнала IL-4, характеризовалась сопоставимыми видами активности касательно снижения накопления слизи и предупреждения эозинофильной инфильтрации. Тем не менее, дифференциальный эффект обнаруживали в отношении уровня IgE в кровотоке между дупилумабом и антагонистом IL-13, IL13R2α-Fc. Блокирование только пути IL-13 было недостаточным для снижения HDM-индуцированного уровня IgE; тогда как дупилумаб снижал продуцирование IgE, основного патологического медиатора аллергии, посредством блокирования как пути IL-4, так и пути IL-13.[00206] Respiratory disease was induced in mice with two humanized IL-4 and IL-4Rα (IL-4 hu/hu /IL-4R hu/hu ) using the protocol described above. Histological analysis of lung tissue showed that intranasal instillation of HDM resulted in increased mucus production in the airways. Dupilumab treatment reduced mucus accumulation in mice exposed to the HDM allergen. Analysis of cellular infiltrate in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) indicates that the number of eosinophils increased with HDM instillation and decreased with dupilumab treatment. Total IgE in the circulation of humanized mice was increased by HDM treatment, indicating a competent IL-4 signaling pathway. The use of dupilumab provided the opportunity to reduce the level of IgE. In contrast, the reference molecule, IL13R2α-Fc, which antagonized only IL-13 without interfering with IL-4 signaling, had comparable activities in reducing mucus accumulation and preventing eosinophilic infiltration. However, a differential effect was found in terms of circulating IgE levels between dupilumab and the IL-13 antagonist, IL13R2α-Fc. Blocking the IL-13 pathway alone was not sufficient to reduce HDM-induced IgE levels; while dupilumab reduced the production of IgE, the major pathological mediator of allergy, by blocking both the IL-4 and IL-13 pathways.
[00207] В отдельной серии экспериментов заболевание дыхательных путей индуцировали у мышей с двумя гуманизированными IL-4 и IL-4Rα (IL-4hu/hu/IL-4Rhu/hu) с использованием такого же протокола, описанного выше, за исключением того, что использовали разный контроль. В этих экспериментах использовали антитело изотопического контроля того же изотипа IgG, что и дупилумаб. План эксперимента изображен на фигуре 9. МРНК очищали от общей РНК с использованием набора для выделения Dynabeads mRNA kit (Life Tech), а библиотеку со специфическими нитями для РНК-секвенирования получали из мРНК с использованием набора для получения библиотек РНК Scriptseq (Illumina). Библиотеку секвенировали с помощью HiSeq 2000 (Illumina) при длине прочтения 33 п.о. и данные об уровнях экспрессии гена экстрагировали из необработанных ридов с помощью системы управления РНК-секвенирования Clcbio (Qiagen). Дифференциально экспрессируемые гены среди экспериментальных групп идентифицировали с использованием t-критерия Стьюдента (р<0,05, кратность изменения ≥1,5). Кластер этих генов по экспрессии получали с использованием алгоритма кластеризации по коэффициенту корреляции Пирсона из GeneSpring GX7.3. Было обнаружено, что HDM индуцирует изменение экспрессии генов в легких у дважды гуманизированных по IL-4 и IL-4Rα мышей и такое изменение блокировалось с помощью дупилумаба. Образцы сыворотки крови отбирали у подверженных эвтаназии мышей в конце периода обработки. Уровни IgE мыши в сыворотке крови измеряли с использованием коммерческого набора для ELISA (R & D systems). Статистический анализ проводили с помощью общепринятого способа однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA).[00207] In a separate series of experiments, respiratory disease was induced in mice with two humanized IL-4 and IL-4Rα (IL-4 hu/hu /IL-4R hu/hu ) using the same protocol described above, except that that used different controls. In these experiments, an isotope control antibody of the same IgG isotype as dupilumab was used. The experimental design is depicted in Figure 9. mRNA was purified from total RNA using the Dynabeads mRNA isolation kit (Life Tech), and a specific strand library for RNA sequencing was generated from the mRNA using the Scriptseq RNA Library Preparation Kit (Illumina). The library was sequenced with a HiSeq 2000 (Illumina) at 33 bp read length. and data on gene expression levels were extracted from raw reads using the Clcbio RNA sequencing management system (Qiagen). Differentially expressed genes among experimental groups were identified using Student's t-test (p<0.05, fold change ≥1.5). The expression cluster of these genes was obtained using the Pearson correlation coefficient clustering algorithm from GeneSpring GX7.3. HDM was found to induce a change in lung gene expression in IL-4 and IL-4Rα doubly humanized mice and this change was blocked by dupilumab. Serum samples were taken from euthanized mice at the end of the treatment period. Mouse serum IgE levels were measured using a commercial ELISA kit (R&D systems). Statistical analysis was performed using the conventional method of one-way analysis of variance (ANOVA).
Пример 6Example 6
Модель кожного воспаления, индуцированная антигеномAn antigen-induced skin inflammation model
[00208] Хроническое кожное воспаление у мышей с двумя гуманизированными Il-4 и IL-4Rα можно индуцировать с помощью следующей процедуры. Шерсть на спине мышей с гуманизированной последовательностью состригали с помощью электростригальной машины, а затем обдирали при помощи липкой ленты для создания незначительных повреждений и трещин кожного барьера. Марлевую повязку, смоченную раствором аллергена (такого как яичный альбумин с бактериальным токсином или экстракт клещей домашней пыли) накладывали на кожу на одну неделю с последующими двумя неделями периода купирования процесса. Процедуру повторяли три раза на протяжении в общей сложности 7 недель с индуцированием в результате кожных повреждений наподобие атопического дерматита. Обработанные мыши характеризуются повышенными уровнями IgE, пруритом, утолщением слоя эпидермиса, типичными симптомами атопического дерматита.[00208] Chronic skin inflammation in mice with two humanized Il-4 and IL-4Rα can be induced using the following procedure. The fur on the back of mice with the humanized sequence was sheared with an electric clipper and then stripped with adhesive tape to create minor damage and cracks in the skin barrier. A gauze dressing moistened with an allergen solution (such as egg albumin with bacterial toxin or house dust mite extract) was applied to the skin for one week, followed by a two-week relief period. The procedure was repeated three times for a total of 7 weeks with induction as a result of skin lesions like atopic dermatitis. Treated mice are characterized by elevated IgE levels, pruritis, thickening of the epidermal layer, typical symptoms of atopic dermatitis.
Пример 7Example 7
Характеристика PK профилей антител к человеческому IL-4Rα у мышей, экспрессируюших гуманизированный IL-4RαCharacterization of PK profiles of anti-human IL-4Rα antibodies in mice expressing humanized IL-4Rα
[00209] В этом примере описаны эксперименты, проводимые для оценки PK профилей REGN 668 (человеческого моноклонального антитела к человеческому IL-4Rα, также известного как «дупилумаб») и контрольного антитела REGN646 (суррогат обезьяны, несвязывающее контрольное антитело к mfIL-4R).[00209] This example describes experiments conducted to evaluate the PK profiles of REGN 668 (human anti-human IL-4Rα monoclonal antibody, also known as "dupilumab") and control antibody REGN646 (monkey surrogate, non-binding anti-mfIL-4R control antibody).
[00210] Мыши, используемые в этих экспериментах, представляли собой MAID 1444 (гомозиготные по гуманизированному IL-4Rα, или «IL-4Rα HumIn», в котором эктодомен IL-4Rα человеческого происхождения, а трансмембранный и цитоплазматические участки мыши) и мышей дикого типа («WT») соответствующей линии (75% C57BL/6/25%129Sv) возрастом 20-23 недель. Исследуемая группа состояла в общей сложности из 40 мышей, самцов и самок, при этом размер когорты из расчета на одно лекарственное средство на одну дозу составлял 5 гомозиготных и 5 WT соответствующей линии. Антитела (в PBS буфере) вводили мышам посредством подкожной инъекции в количестве 10 мг/кг. Образцы крови отбирали для анализа в день инъекции (момент времени «0» или день 0), через 6 ч после инъекции и в день 1, день 3, день 7, день 10, день 14, день 21 и день 30 соответственно.[00210] The mice used in these experiments were MAID 1444 (homozygous for humanized IL-4Rα, or "IL-4Rα HumIn", in which the IL-4Rα ectodomain is of human origin, and the transmembrane and cytoplasmic regions of the mouse) and wild-type mice ("WT") of the corresponding line (75% C57BL/6/25%129Sv) aged 20-23 weeks. The study group consisted of a total of 40 mice, male and female, with a cohort size per drug per dose of 5 homozygous and 5 WT of the respective strain. Antibodies (in PBS buffer) were administered to mice by subcutaneous injection at 10 mg/kg. Blood samples were taken for analysis on the day of injection (time "0" or day 0), 6 hours after injection and on
[00211] Уровни лекарственных средств (т.е. REGN668 или REGN646) в кровотоке определяли путем анализа общих человеческих антител с использованием иммуноанализа ELISA. Вкратце, козьим поликлональным антителом к человеческому IgG (Jackson ImmunoResearch, #109-005-098) покрывали 96-луночные планшеты для захвата тестируемых человеческих антител в сыворотке крови, а затем антитела, связанные с подложкой планшета, выявляли с помощью козьего поликлонального антитела к человеческому IgG, конъюгированного с пероксидазой хрена (Jackson ImmunoResearch, #109-035-098), и субстрата ТМВ (BD Pharmingen). Образцы сыворотки крови представляли собой шестикратные серийные разведения дозы из расчета на один образец, варьирующие в диапазоне 1:100-1:243000, а эталонные стандарты соответствующих антител представляли собой 12-кратные серийные разведения дозы. Концентрации лекарственного антитела в сыворотке крови рассчитывали на основе калибровочной кривой, построенной с использованием программного обеспечения Graphpad Prism.[00211] Blood levels of drugs (ie, REGN668 or REGN646) were determined by assaying total human antibodies using an ELISA immunoassay. Briefly, goat anti-human IgG polyclonal antibody (Jackson ImmunoResearch, #109-005-098) was coated on 96-well plates to capture test human antibodies in serum, and then antibodies bound to the plate substrate were detected using goat anti-human polyclonal antibody. IgG conjugated to horseradish peroxidase (Jackson ImmunoResearch, #109-035-098) and TMB substrate (BD Pharmingen). Serum samples were 6-fold dose serial dilutions per sample ranging from 1:100-1:243,000, and reference standards of the respective antibodies were 12-fold dose serial dilutions. Serum drug antibody concentrations were calculated from a calibration curve constructed using Graphpad Prism software.
[00212] Было обнаружено, что период полувыведения REGN 668 сокращен у мышей с IL-4Rα HumIn по сравнению с мышами дикого типа, у которых продуцировался только белок IL-4Rα мыши. Это различие в PK профилях можно объяснить взаимодействием, опосредуемым мишенью, и клиренсом между моноклональными антителами и рецептором к человеческому IL-4α. Таким образом, мыши, экспрессирующие человеческий или гуманизированный IL-4Rα, обеспечивают подходящую имитационную среду для характеристики PK свойств антител к человеческому IL-4Rα (например, дупилумаба) на доклинической мышиной модели.[00212] The half-life of REGN 668 was found to be shortened in HumIn IL-4Rα mice compared to wild-type mice producing only mouse IL-4Rα protein. This difference in PK profiles can be explained by target-mediated interaction and clearance between monoclonal antibodies and the human IL-4α receptor. Thus, mice expressing human or humanized IL-4Rα provide a suitable mimic for characterizing the PK properties of anti-human IL-4Rα antibodies (eg, dupilumab) in a preclinical mouse model.
Применения мышей с гуманизированными IL-4 и/или IL-4RαUses of mice with humanized IL-4 and/or IL-4Rα
[00213] Мыши с гуманизированными IL-4 и/или IL-4Rα являться применимыми для оценки фармакодинамики (PD) антагонистов, специфичных к человеческим IL-4 и/или IL-4Rα, например, нейтрализующих антител к IL-4 и/или к IL-4Rα, например, дупилумаба.[00213] Mice with humanized IL-4 and/or IL-4Rα are applicable to evaluate the pharmacodynamics (PD) of antagonists specific for human IL-4 and/or IL-4Rα, for example, neutralizing antibodies to IL-4 and/or to IL-4Rα, such as dupilumab.
[00214] Анализы фармакокинетики (PK) и PD на гуманизированных по IL-4 и/или IL-4Rα мышах проводили согласно стандартным процедурам, известным из уровня техники.[00214] Pharmacokinetic (PK) and PD analyzes in IL-4 and/or IL-4Rα humanized mice were performed according to standard procedures known in the art.
[00215] Мыши с гуманизированными IL-4 и/или IL-4Rα являются применимыми для тестирования терапевтической эффективности in vivo антагонистов, специфичных к человеческим IL-4 и/или IL-4Rα, например, нейтрализующих антител к IL-4 и/или IL-4Rα, например, дупилумаба, на различных моделях заболеваний, известных из уровня техники, как, например, показанных в данном документе выше.[00215] Humanized IL-4 and/or IL-4Rα mice are useful for testing in vivo therapeutic efficacy of human IL-4 and/or IL-4Rα specific antagonists, e.g., anti-IL-4 and/or IL neutralizing antibodies -4Rα, for example, dupilumab, in various disease models known in the art, such as those shown herein above.
Пример 8Example 8
Замена эндогенного гена IL-33 мыши человеческим геном IL-33Replacement of Endogenous Mouse IL-33 Gene with Human IL-33 Gene
[00216] Ген IL-33 мыши (ID гена в NCBI: 77125, первоисточник: MGI: 1924375; транскрипт эталонной последовательности: NM_001164724.1; ID в UniProt: Q8BVZ5; геномная сборка: NCBI37/mm9; локализация: chr19:29999604-30035205+нить) содержит 8 экзонов и кодирует белок из 266 аминокислот (№ доступа в GenBank NP_001158196.1).[00216] Mouse IL-33 gene (NCBI gene ID: 77125, original source: MGI: 1924375; reference sequence transcript: NM_001164724.1; UniProt ID: Q8BVZ5; genomic assembly: NCBI37/mm9; localization: chr19:29999604-30035205 + strand) contains 8 exons and encodes a protein of 266 amino acids (GenBank accession no. NP_001158196.1).
[00217] Человеческий ген IL-33 (ID гена в NCBI: 90865, первоисточник: HGNC: 16028; транскрипт эталонной последовательности: NM_033439.3; ID в UniProt: O95760; геномная сборка: GRCh37/hg19; локализация: chr9:6215149-6257983+нить) также содержит 8 экзонов и кодирует белок из 270 аминокислот (№ доступа в GenBank NP_254274.1).[00217] Human IL-33 gene (NCBI gene ID: 90865, original source: HGNC: 16028; reference sequence transcript: NM_033439.3; UniProt ID: O95760; genomic assembly: GRCh37/hg19; localization: chr9:6215149-6257983 + strand) also contains 8 exons and encodes a protein of 270 amino acids (GenBank accession no. NP_254274.1).
[00218] Человеческим геномным сегментом длиной 16333 п. о., содержащим участок от экзона 2, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 8 (включая 3'-нетранслируемый участок) человеческого гена IL-33, заменяли локус гена IL-33 мыши длиной 9381 п.о., охватывающего участок от экзона 2, начинающегося со стартового кодона ATG, до кодирующей части экзона 8, включая стоп-кодон. См. фигуру 10А.[00218] The 16333 bp human genomic segment containing the stretch from
[00219] Целенаправленно воздействующую конструкцию для замены гена IL-33 мыши геномным сегментом IL-33 человека в одной стадии целенаправленного воздействия конструировали с использованием генноинженерной технологии VelociGene® (см. Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech, 21(6):652-659) подобно процедуре, описанной в примере 1 выше, для замены гена IL-4 мыши геномным сегментом IL-4 человека, за исключением того, что ДНК IL-33 мыши и человека получали из клонов бактериальной искусственной хромосомы (ВАС) bMQ-350I18 и CTD-3015M15 соответственно и что целенаправленно воздействующий вектор содержал фланкированную loxP кассету с селектируемым маркером устойчивости к неомицину (фигура 10В).[00219] A targeting construct to replace the mouse IL-33 gene with a human IL-33 genomic segment in a single targeting step was constructed using VelociGene® engineering technology (see Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech, 21(6):652-659) similar to the procedure described in Example 1 above to replace the mouse IL-4 gene with the human IL-4 genomic segment, except that the IL-4
[00220] Клоны подвергшихся точному целенаправленному воздействию ES-клеток (MAID 7060) идентифицировали с помощью анализа потери нативного аллеля (LONA) (Valenzuela et al. 2003), при котором количество копий нативного немодифицированного гена IL-33 определяли посредством двух количественных полимеразных цепных реакций TaqMan™ (qPCR) со специфическими праймерами к последовательностям гена IL-33 мыши, на которые целенаправленно воздействовали для делеции. Реакционные смеси для qPCR содержали следующие наборы праймер-зонд (записано от 5'- до 3'-конца):[00220] Accurately targeted ES cell clones (MAID 7060) were identified by native allele loss assay (LONA) (Valenzuela et al. 2003) in which copy number of the native unmodified IL-33 gene was determined by two quantitative polymerase chain reactions TaqMan™ (qPCR) with specific primers for mouse IL-33 gene sequences targeted for deletion. The qPCR reaction mixtures contained the following primer-probe sets (written 5' to 3' end):
выше целевого участка («mTU»):above the target site ("mTU"):
прямой праймер, 
обратный праймер, 
зонд (MGB), 
ниже целевого участка («mTD»):below the target area ("mTD"):
прямой праймер, 
обратный праймер, 
зонд (MGB), 
[00221] Для доказательства того, что последовательность человеческого гена IL-33 заменила последовательность гена IL-33 мыши в гуманизированном аллеле, проводили анализ qPCR с TaqMan™, в который включали следующие наборы праймер-зонд (записано от 5'- до 3'-конца):[00221] To prove that the human IL-33 gene sequence had replaced the mouse IL-33 gene sequence in the humanized allele, a TaqMan™ qPCR assay was performed that included the following primer-probe sets (written 5'- to 3'- end):
выше целевого участка («hTU»)above the target area ("hTU")
прямой праймер, 
обратный праймер, 
зонд (MGB), 
ниже целевого участка («hTD»):below the target area ("hTD"):
прямой праймер, 
обратный праймер, 
зонд (MGB), 
[00222] Верхний участок соединения локуса IL-33 мыши и последовательности, содержащей человеческий ген IL-33 (обозначенной «I» на фиг. 10В), конструировали так, чтобы он находился в пределе 
[00223] Подвергшиеся точному целенаправленному воздействию ES-клетки (MAID 7060) затем подвергали электропорации транзиентным Cre-экспрессирующим вектором для удаления кассеты с селектируемым маркером устойчивости к лекарственному средству и получали клоны ES-клеток без кассеты, обеспечивающей устойчивость к лекарственному средству (MAID 7061). Верхний участок соединения в этих ES-клетках MAID 7061 (обозначен «I» на фиг. 18С) являлся таким же, как и у ES-клеток MAID 7060. Нижний участок соединения (обозначенный «II» на фиг. 18С) конструировали так, чтобы он находился в пределе 
[00224] Подвергшиеся точному целенаправленному воздействию ES-клетки (MAID 7060 или MAID 7061) вводили в эмбрион SW мыши на стадии 8 клеток с помощью способа VelociMouse® (см. патенты США №№7294754, 7576259, 7659442 и Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech. 25(1):91-99). VelociMice® (мыши F0, полностью произошедшие от донорной ES-клетки), несущие гуманизированный ген IL-33, идентифицировали с помощью генотипирования на предмет потери аллеля мыши и приобретения человеческого аллеля с использованием модифицированного анализа алеллей (см. Valenzuela et al. (2003)). Тот же самый анализ LONA использовали для анализа ДНК, выделенной из биоптатов, полученных из хвостов мышей, полученных из подвергшихся целенаправленному воздействию ES-клеток, для определения их генотипов по IL-33 и подтверждения того, что гуманизированный аллель IL-33 передался в зародышевой линии. Двух потомков, гетерозиготных по замене, скрещивали для получения мыши, гомозиготной по замене эндогенного гена IL-33 мыши на человеческий ген IL-33.[00224] Precisely targeted ES cells (MAID 7060 or MAID 7061) were introduced into an 8-cell stage SW mouse embryo using the VelociMouse® method (See US Pat. ) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech.25(1):91-99). VelociMice® (F0 mice entirely derived from a donor ES cell) carrying the humanized IL-33 gene were identified by genotyping for mouse allele loss and human allele gain using modified allele analysis (see Valenzuela et al. (2003) ). The same LONA assay was used to analyze DNA isolated from mouse tail biopsies derived from targeted ES cells to determine their IL-33 genotypes and confirm that the humanized IL-33 allele was germline transmitted. . Two offspring heterozygous for the substitution were crossed to produce a mouse homozygous for the substitution of the endogenous mouse IL-33 gene with the human IL-33 gene.
--->--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙSEQUENCE LIST
<110> Ванг, Ли-Сьен<110> Wang, Li-Sien
Сюэ, Ингзи Xue, Yingzi
Мерфи, Эндрю Дж. Murphy, Andrew J.
Стивенс, Шон Stephens, Sean
<120> ЖИВОТНЫЕ С ГУМАНИЗИРОВАННЫМИ IL-4 и IL-4а<120> ANIMALS WITH HUMANIZED IL-4 and IL-4a
<130> 31260 (T0029)<130> 31260 (T0029)
<150> 61/989757 <150> 61/989757
<151> 2014-05-07<151> 2014-05-07
<160> 46 <160> 46
<170> PatentIn, версии 3.5<170> PatentIn version 3.5
<210> 1<210> 1
<211> 20<211> 20
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 1<400> 1
catgcacgga gatggatgtg 20
<210> 2<210> 2
<211> 21<211> 21
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 2<400> 2
gacccctcag gtccacttac c 21gacccctcag gtccacttac c 21
<210> 3<210> 3
<211> 19<211> 19
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<220><220>
<221> иная_характеристика<221> other_characteristic
<222> (1)..(1)<222> (1)..(1)
<223> Меченый FAM: 5-карбоксифлуоресцеиновым флуоресцентным зондом<223> Labeled FAM: 5-carboxyfluorescein fluorescent probe
<220><220>
<221> иная_характеристика<221> other_characteristic
<222> (25)..(25)<222> (25)..(25)
<223> Меченый BHQ: гасителем флуоресценции, соответствующим типу гасителя <223> Labeled with BHQ: with a fluorescence quencher corresponding to the type of quencher
«черная дыра» "black hole"
<400> 3<400> 3
aacgtcctca cagcaacga 19aacgtcctca cagcaacga 19
<210> 4<210> 4
<211> 19<211> 19
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 4<400> 4
gtgcccaggt gtgctcatg 19gtgcccaggt gtgctcatg 19
<210> 5<210> 5
<211> 21<211> 21
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 5<400> 5
cgcctgcctc ctcactttat c 21cgcctgcctc ctcactttat c 21
<210> 6<210> 6
<211> 19<211> 19
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<220><220>
<221> иная_характеристика<221> other_characteristic
<222> (1)..(1)<222> (1)..(1)
<223> Меченый FAM: 5-карбоксифлуоресцеиновым флуоресцентным зондом<223> Labeled FAM: 5-carboxyfluorescein fluorescent probe
<220><220>
<221> иная_характеристика<221> other_characteristic
<222> (19)..(19)<222> (19)..(19)
<223> Меченый BHQ: гасителем флуоресценции, соответствующим типу гасителя <223> Labeled with BHQ: with a fluorescence quencher corresponding to the type of quencher
«черная дыра» "black hole"
<400> 6<400> 6
atctgcttca ccatccact 19atctgcttca ccatccact 19
<210> 7<210> 7
<211> 19<211> 19
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 7<400> 7
gcctggacca agactctgt 19gcctggacca agactctgt 19
<210> 8<210> 8
<211> 20<211> 20
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 8<400> 8
accgtgggac ggcttcttac 20
<210> 9<210> 9
<211> 25<211> 25
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<220><220>
<221> иная_характеристика<221> other_characteristic
<222> (1)..(1)<222> (1)..(1)
<223> Меченый FAM: 5-карбоксифлуоресцеиновым флуоресцентным зондом<223> Labeled FAM: 5-carboxyfluorescein fluorescent probe
<220><220>
<221> иная_характеристика<221> other_characteristic
<222> (19)..(19)<222> (19)..(19)
<223> Меченый BHQ: гасителем флуоресценции, соответствующим типу гасителя <223> Labeled with BHQ: with a fluorescence quencher corresponding to the type of quencher
«черная дыра» "black hole"
<400> 9<400> 9
caccgagttg accgtaacag acatc 25caccgagttg accgtaacag acatc 25
<210> 10<210> 10
<211> 17<211> 17
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 10<400> 10
tgcggccgat cttagcc 17tgcggccgat cttagcc 17
<210> 11<210> 11
<211> 18<211> 18
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 11<400> 11
ttgaccgatt ccttgcgg 18ttgaccgatt ccttgcgg 18
<210> 12<210> 12
<211> 21<211> 21
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<220><220>
<221> иная_характеристика<221> other_characteristic
<222> (1)..(1)<222> (1)..(1)
<223> Меченый FAM: 5-карбоксифлуоресцеиновым флуоресцентным зондом<223> Labeled FAM: 5-carboxyfluorescein fluorescent probe
<220><220>
<221> иная_характеристика<221> other_characteristic
<222> (21)..(21)<222> (21)..(21)
<223> Меченый BHQ: гасителем флуоресценции, соответствующим типу гасителя <223> Labeled with BHQ: with a fluorescence quencher corresponding to the type of quencher
«черная дыра» "black hole"
<400> 12<400> 12
acgagcgggt tcggcccatt c 21acgagcgggt tcggcccatt c 21
<210> 13<210> 13
<211> 458<211> 458
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая верхний участок<223> Nucleic acid sequence containing the upper region
соединения локуса мышиного IL-4 и последовательности человеческого IL-4 mouse IL-4 locus and human IL-4 sequences
<400> 13<400> 13
tgctgattgg cccagaataa ctgacaatct ggtgtaataa aattttccaa tgtaaactca 60tgctgattgg cccagaataa ctgacaatct ggtgtaataa aattttccaa tgtaaactca 60
ttttcccttg gtttcagcaa ctttaactct atatatagag agacctctgc cagcattgca 120ttttcccttg gtttcagcaa ctttaactct atatatagag agacctctgc cagcattgca 120
ttgttagcat ctcttgataa acttaattgt ctctcgtcac tgacggcaca gagctattga 180ttgttagcat ctcttgataa acttaattgt ctctcgtcac tgacggcaca gagctattga 180
tgggtctcac ctcccaactg cttccccctc tgttcttcct gctagcatgt gccggcaact 240tgggtctcac ctcccaactg cttccccctc tgttcttcct gctagcatgt gccggcaact 240
ttgtccacgg acacaagtgc gatatcacct tacaggagat catcaaaact ttgaacagcc 300ttgtccacgg acacaagtgc gatatcacct tacaggagat catcaaaact ttgaacagcc 300
tcacagagca gaaggtgagt acctatctgg caccatctct ccagatgttc tggtgatgct 360tcacagagca gaaggtgagt acctatctgg caccatctct ccagatgttc tggtgatgct 360
ctcagtattt ctaggcatga aaacgttaac agctgctaga gaagttggaa ctggtggttg 420ctcagtattt ctggcatga aaacgttaac agctgctaga gaagttggaa ctggtggttg 420
gtggcagtcc agggcacaca gcgaggcttc tcccctgc 458gtggcagtcc agggcacaca gcgaggcttc tcccctgc 458
<210> 14<210> 14
<211> 565<211> 565
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая нижний участок <223> Nucleic acid sequence containing the bottom portion
соединения последовательности человеческого IL-4, и фланкированной loxP compound sequence of human IL-4, and flanked loxP
кассеты с селектируемым маркером устойчивости к гигромицину cassettes with selectable hygromycin resistance marker
<400> 14<400> 14
tgtttatttt gcagaattcc tgtcctgtga aggaagccaa ccagagtacg ttggaaaact 60tgtttatttt gcagaattcc tgtcctgtga aggaagccaa ccagagtacg ttggaaaact 60
tcttggaaag gctaaagacg atcatgagag agaaatattc aaagtgttcg agctgaatat 120tcttggaaag gctaaagacg atcatgagag agaaatattc aaagtgttcg agctgaatat 120
tttaatttat gagtttttga tagctttatt ttttaagtat ttatatattt ataactcatc 180tttaatttat gagtttttga tagctttatt ttttaagtat ttatatattt ataactcatc 180
ataaaataaa gtatatatag aatctaacag caatggcatt taatgtattg gctatgttta 240ataaaataaa gtatatatag aatctaacag caatggcatt taatgtattg gctatgttta 240
cttgacaaat gaaattatgg tttgcaactt ttagggaaat caatttagtt taccaagaga 300cttgacaaat gaaattatgg tttgcaactt ttagggaaat caatttagtt taccaagaga 300
ctataaatgc tatgggagca aaacaggaaa gaccacttcc ccctcgaggg gttccctctc 360ctataaatgc tatgggagca aaacaggaaa gaccacttcc ccctcgaggg gttccctctc 360
gagttaggga cataacacac aagataatta aagaacacaa ggccatacaa gatgcggccg 420gagttagggga cataacacac aagataatta aagaacacaa ggccatacaa gatgcggccg 420
caccggtata acttcgtata aggtatccta tacgaagtta tatgcatggc ctccgcgccg 480caccggtata acttcgtata aggtatccta tacgaagtta tatgcatggc ctccgcgccg 480
ggttttggcg cctcccgcgg gcgcccccct cctcacggcg agcgctgcca cgtcagacga 540ggttttggcg cctcccgcgg gcgcccccct cctcacggcg agcgctgcca cgtcagacga 540
agggcgcagc gagcgtcctg atcct 565agggcgcagc gagcgtcctg atcct 565
<210> 15<210> 15
<211> 438<211> 438
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая нижний участок <223> Nucleic acid sequence containing the bottom portion
соединения последовательности фланкированной loxP кассеты с селектируемым connecting the sequence of a flanked loxP cassette with a selectable
маркером устойчивости к гигромицину и локус мышиного IL-4 hygromycin resistance marker and mouse IL-4 locus
<400> 15<400> 15
tgccaagttc taattccatc agacctcgac ctgcagccgg cgcgccataa cttcgtataa 60tgccaagttc taattccatc agacctcgac ctgcagccgg cgcgccataa cttcgtataa 60
ggtatcctat acgaagttat ctcgagagga gttcccaccc ttctcaagag cataatgcgc 120ggtatcctat acgaagttat ctcgaggagga gttcccaccc ttctcaagag cataatgcgc 120
agatcattaa gggacagatg caggctgggg agacggttca gcagttagga gtacctgttg 180agatcattaa gggacagatg caggctgggg agacggttca gcagttagga gtacctgttg 180
ctcttccaga ggacccaggt tcaattcccg gcactcacat agcagcttaa aacaataact 240ctcttccaga ggacccaggt tcaattcccg gcactcacat agcagcttaa aacaataact 240
caagttctgg gggagctgat gctctcctct ggcctcctgt ggaggtacac agaccacatg 300caagttctgg gggagctgat gctctcctct ggcctcctgt ggaggtacac agaccacatg 300
cctgtaggca agacacccac acacataaaa acaaaataaa ataaggatag aaaggccagg 360cctgtaggca agacacccac acacataaaa acaaaataaa ataaggatag aaaggccagg 360
gggatgaatc cagaggtaga agaaaactta ttccctggaa ttgtcctctg actcccctcc 420gggatgaatc cagaggtaga agaaaactta ttccctggaa ttgtcctctg actcccctcc 420
caaaacctct aacacgca 438caaaacctct aacacgca 438
<210> 16<210> 16
<211> 20<211> 20
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 16<400> 16
ccgctggcat gtgtattgtg 20
<210> 17<210> 17
<211> 21<211> 21
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 17<400> 17
tgagtgtggg accctcaaga g 21tgagtgtggg accctcaaga g 21
<210> 18<210> 18
<211> 24<211> 24
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<220><220>
<221> иная_характеристика<221> other_characteristic
<222> (1)..(1)<222> (1)..(1)
<223> Меченый FAM: 5-карбоксифлуоресцеиновым флуоресцентным зондом<223> Labeled FAM: 5-carboxyfluorescein fluorescent probe
<220><220>
<221> иная_характеристика<221> other_characteristic
<222> (24)..(24)<222> (24)..(24)
<223> Меченый BHQ: гасителем флуоресценции, соответствующим типу гасителя <223> Labeled with BHQ: with a fluorescence quencher corresponding to the type of quencher
«черная дыра» "black hole"
<400> 18<400> 18
tgacccaagc cctacatggc cact 24tgacccaagc cctacatggc cact 24
<210> 19<210> 19
<211> 21<211> 21
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 19<400> 19
tgaggagagc tcacgggaat c 21tgaggagagc tcacgggaat c 21
<210> 20<210> 20
<211> 20<211> 20
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 20<400> 20
acccatctcc tgcgtttctg 20
<210> 21<210> 21
<211> 25<211> 25
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<220><220>
<221> иная_характеристика<221> other_characteristic
<222> (1)..(1)<222> (1)..(1)
<223> Меченый FAM: 5-карбоксифлуоресцеиновым флуоресцентным зондом<223> Labeled FAM: 5-carboxyfluorescein fluorescent probe
<220><220>
<221> иная_характеристика<221> other_characteristic
<222> (25)..(25)<222> (25)..(25)
<223> Меченый BHQ: гасителем флуоресценции, соответствующим типу гасителя <223> Labeled with BHQ: with a fluorescence quencher corresponding to the type of quencher
«черная дыра» "black hole"
<400> 21<400> 21
ttgacacgcc agctacactg ctcca 25ttgacacgcc agctacactg ctcca 25
<210> 22<210> 22
<211> 21<211> 21
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 22<400> 22
acctgcgtct ccgactacat g 21acctgcgtct ccgactacat g 21
<210> 23<210> 23
<211> 19<211> 19
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 23<400> 23
gagctcggtg ctgcaattg 19gagctcggtg ctgcaattg 19
<210> 24<210> 24
<211> 25<211> 25
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<220><220>
<221> иная_характеристика<221> other_characteristic
<222> (1)..(1)<222> (1)..(1)
<223> Меченый FAM: 5-карбоксифлуоресцеиновым флуоресцентным зондом<223> Labeled FAM: 5-carboxyfluorescein fluorescent probe
<220><220>
<221> иная_характеристика<221> other_characteristic
<222> (25)..(25)<222> (25)..(25)
<223> Меченый BHQ: гасителем флуоресценции, соответствующим типу гасителя <223> Labeled with BHQ: with a fluorescence quencher corresponding to the type of quencher
«черная дыра» "black hole"
<400> 24<400> 24
tgggaccatt catcttccac tcgca 25tgggaccatt catcttccac tcgca 25
<210> 25<210> 25
<211> 19<211> 19
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 25<400> 25
ggtggagagg ctattcggc 19ggtggagagg ctattcggc 19
<210> 26<210> 26
<211> 17<211> 17
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 26<400> 26
gaacacggcg gcatcag 17gaacacggcg gcatcag 17
<210> 27<210> 27
<211> 23<211> 23
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<220><220>
<221> иная_характеристика<221> other_characteristic
<222> (1)..(1)<222> (1)..(1)
<223> Меченый FAM: 5-карбоксифлуоресцеиновым флуоресцентным зондом<223> Labeled FAM: 5-carboxyfluorescein fluorescent probe
<220><220>
<221> иная_характеристика<221> other_characteristic
<222> (23)..(23)<222> (23)..(23)
<223> Меченый BHQ: гасителем флуоресценции, соответствующим типу гасителя <223> Labeled with BHQ: with a fluorescence quencher corresponding to the type of quencher
«черная дыра» "black hole"
<400> 27<400> 27
tgggcacaac agacaatcgg ctg 23tgggcacaac agacaatcgg ctg 23
<210> 28<210> 28
<211> 243<211> 243
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Часть локуса мышиного IL-4Raльфа и последовательность, содержащая ген <223> Portion of the mouse IL-4Ralf locus and sequence containing the gene
IL-4Rальфа IL-4Ralpha
<400> 28<400> 28
tgggggaggg aggccatgac acaaatgaaa tggaccccgc tgacccagga tcagcatctg 60tgggggaggg aggccatgac acaaatgaaa tggaccccgc tgacccagga tcagcatctg 60
cccactcttc tttctgcagg caccttttgt gtccccaatg gggtggcttt gctctgggct 120cccactcttc tttctgcagg caccttttgt gtccccaatg gggtggcttt gctctgggct 120
cctgttccct gtgagctgcc tggtcctgct gcaggtggca agctctggta agtcaccact 180cctgttccct gtgagctgcc tggtcctgct gcaggtggca agctctggta agtcaccact 180
tctcaatcat tcatttgttg gctattaatg gcgtgccagg gtcctgcagt atgtcacctg 240tctcaatcat tcatttgttg gctattaatg gcgtgccagg gtcctgcagt atgtcacctg 240
gcc 243gcc 243
<210> 29<210> 29
<211> 243<211> 243
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая нижний участок <223> Nucleic acid sequence containing the bottom portion
соединения последовательности человеческого IL-4Rальфа, и фланкированной compound sequence of human IL-4Ralpha, and flanked
loxP кассеты с селектируемым маркером устойчивости к неомицину loxP cassettes with neomycin resistance selectable marker
<400> 29<400> 29
gtcagatcgt ggagggtctc ggacgagggt cctgaccctg ggtctccagt cctgggaagt 60gtcagatcgt ggagggtctc ggacgagggt cctgaccctg ggtctccagt cctgggaagt 60
ggagcccagg ctgtaccatg gctgacctca gctcatggct cccgggctcg ataactataa 120ggagcccagg ctgtaccagg gctgacctca gctcatggct cccgggctcg ataactataa 120
cggtcctaag gtagcgactc gagataactt cgtataatgt atgctatacg aagttatatg 180cggtcctaag gtagcgactc gagataactt cgtataatgt atgctatacg aagttatatg 180
catggcctcc gcgccgggtt ttggcgcctc ccgcgggcgc ccccctcctc acggcgagcg 240catggcctcc gcgccgggtt ttggcgcctc ccgcgggcgc ccccctcctc acggcgagcg 240
ctg 243ctg 243
<210> 30<210> 30
<211> 390<211> 390
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Часть последовательности, фланкированной loxP кассетой с селектируемым <223> Part of a sequence flanked by a loxP selectable cassette
маркером устойчивости к неомицину, и локус мышиного IL-4Rальфа neomycin resistance marker, and the mouse IL-4Ralpha locus
<400> 30<400> 30
tattgttttg ccaagttcta attccatcag acctcgacct gcagccccta gataacttcg 60tattgttttg ccaagttcta attccatcag acctcgacct gcagccccta gataacttcg 60
tataatgtat gctatacgaa gttatcctag gttggagctc tctgtagcca ggtaaccaag 120tataatgtat gctatacgaa gttatcctag gttggagctc tctgtagcca ggtaaccaag 120
ggtcccaggg gaacccccag tgtggacgcg gactgcacat gacacagggc ggcctcccca 180ggtcccaggg gaacccccag tgtggacgcg gactgcacat gacacaggggc ggcctcccca 180
ttcatgactg tttttctcct tgcagacttc cagctgcccc tgatacagcg ccttccactg 240ttcatgactg ttttctctcct tgcagacttc cagctgcccc tgatacagcg ccttccactg 240
ggggtcacca tctcctgcct ctgcatcccg ttgttttgcc tgttctgtta cttcagcatt 300ggggtcacca tctcctgcct ctgcatcccg ttgttttgcc tgttctgtta cttcagcatt 300
accaagtgag ttcctgcttt ggctggtgtc tctggctggc ccttcagcag tgctctcaga 360accaagtgag ttcctgcttt ggctggtgtc tctggctggc ccttcagcag tgctctcaga 360
ggtcacagtc attgtgctgg ctgagaaaag 390ggtcacagtc attgtgctgg ctgagaaaag 390
<210> 31<210> 31
<211> 26<211> 26
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 31<400> 31
ttggactagt aacaagaagg gtagca 26ttggactagt aacaagaagg gtagca 26
<210> 32<210> 32
<211> 23<211> 23
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 32<400> 32
cctttcccat caccctctaa ctt 23cctttcccat caccctctaa ctt 23
<210> 33<210> 33
<211> 16<211> 16
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 33<400> 33
agctctggtg gacaga 16agctctggtg gacaga 16
<210> 34<210> 34
<211> 21<211> 21
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 34<400> 34
tctctgccaa gctgcttatc c 21tctctgccaa gctgcttatc c 21
<210> 35<210> 35
<211> 20<211> 20
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 35<400> 35
ggctgcatgg aagaggtgaa 20
<210> 36<210> 36
<211> 14<211> 14
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 36<400> 36
ctctccacaa atcg 14
<210> 37<210> 37
<211> 25<211> 25
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 37<400> 37
caggcaggaa tagctgagat aatct 25caggcaggaa tagctgagat aatct 25
<210> 38<210> 38
<211> 22<211> 22
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 38<400> 38
tgtggagcaa aaagtggttg at 22tgtggagcaa aaagtggttg at 22
<210> 39<210> 39
<211> 19<211> 19
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 39<400> 39
cctgtgaata gtgataaac 19cctgtgaata gtgataaac 19
<210> 40<210> 40
<211> 22<211> 22
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 40<400> 40
cagttccaaa cgataggctc aa 22cagttccaaa cgataggctc aa 22
<210> 41<210> 41
<211> 26<211> 26
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 41<400> 41
ataattctgt gaagcatctg gtcttc 26ataattctgt gaagcatctg gtcttc 26
<210> 42<210> 42
<211> 18<211> 18
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 42<400> 42
ctagagctgc tagtaaaa 18ctagagctgc tagtaaaa 18
<210> 43<210> 43
<211> 160<211> 160
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 43<400> 43
atagccaagg ttgcttctga tgacttcagg tccatatagt tggattaatg ttatatttca 60atagccaagg ttgcttctga tgacttcagg tccatatagt tggattaatg ttatatttca 60
atcccacaga aacctgaaaa atgaagccta aaatgaagta ttcaaccaac aaaatttcca 120atcccacaga aacctgaaaa atgaagccta aaatgaagta ttcaaccaac aaaatttcca 120
cagcaaagtg gaagaacaca gcaagcaaag ccttgtgttt 160cagcaaagtg gaagaacaca gcaagcaaag ccttgtgttt 160
<210> 44<210> 44
<211> 160<211> 160
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 44<400> 44
tttatattat tgaataaagt atattttcca aatgtatgtg agactataat gattttatca 60tttatattat tgaataaagt atattttcca aatgtatgtg agactataat gattttatca 60
tatgatgact caatattctg ctcgagataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat 120tatgatgact caatattctg ctcgagataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat 120
atgcatggcc tccgcgccgg gttttggcgc ctcccgcggg 160atgcatggcc tccgcgccgg gttttggcgc ctcccgcggg 160
<210> 45<210> 45
<211> 160<211> 160
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 45<400> 45
agcccctaga taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tatgctagta actataacgg 60agcccctaga taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tatgctagta actataacgg 60
tcctaaggta gcgagctagc cgcctgtgcg ttctgggttg aatgacttaa tgcttccaac 120tcctaaggta gcgagctagc cgcctgtgcg ttctgggttg aatgacttaa tgcttccaac 120
tgaagaaagg gtaacagaga gaaagaaagc cattcttggc 160tgaagaaagg gtaacagaga gaaagaaagc cattcttggc 160
<210> 46<210> 46
<211> 237<211> 237
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический олигонуклеотид<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 46<400> 46
tttatattat tgaataaagt atattttcca aatgtatgtg agactataat gattttatca 60tttatattat tgaataaagt atattttcca aatgtatgtg agactataat gattttatca 60
tatgatgact caatattctg ctcgagataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat 120tatgatgact caatattctg ctcgagataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat 120
gctagtaact ataacggtcc taaggtagcg agctagccgc ctgtgcgttc tgggttgaat 180gctagtaact ataacggtcc taaggtagcg agctagccgc ctgtgcgttc tgggttgaat 180
gacttaatgc ttccaactga agaaagggta acagagagaa agaaagccat tcttggc 237gacttaatgc ttccaactga agaaagggta acagagagaa agaaagccat tcttggc 237
<---<---
Claims (31)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201461989757P | 2014-05-07 | 2014-05-07 | |
| US61/989,757 | 2014-05-07 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016143376A Division RU2703139C2 (en) | 2014-05-07 | 2015-05-07 | ANIMALS WITH HUMANIZED IL-4 AND IL-4Rα |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2019131253A RU2019131253A (en) | 2019-12-06 |
| RU2788523C2 true RU2788523C2 (en) | 2023-01-23 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2425880C2 (en) * | 2009-07-30 | 2011-08-10 | Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН | Method of producing transgene mice |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2425880C2 (en) * | 2009-07-30 | 2011-08-10 | Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН | Method of producing transgene mice |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| OKUMA K et al., Interleukin-4-transgenic hu-PBL-SCID mice: a model for the screening of antiviral drugs and immunotherapeutic agents against X4 HIV-1 viruses, J Infect Dis. 2008, Vol.197, N.1, pp.134-141. SEKI N et al., IL-4-induced GATA-3 expression is a time-restricted instruction switch for Th2 cell differentiation, J Immunol, 2004, 172, Vol. 10, pp.6158-6166. * |
| REPASS JF et al., IL7-hCD25 and IL7-Cre BAC transgenic mouse lines: new tools for analysis of IL-7 expressing cells, Genesis, 2009, Vol.47, N.4, pp.281-287. PREETA DASGUPTA et al., Transfer of in vivo primed transgenic T cells supports allergic lung inflammation and FIZZ1and Ym1 production in an IL-4Ra and STAT6 dependent manner, Dasgupta et al. BMC Immunology 2011, 12:60. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2021218060B2 (en) | Humanized il-4 and il-4r alpha animals | |
| US20220015343A1 (en) | Genetically modified non-human animal with human or chimeric genes | |
| US11154041B2 (en) | Genetically modified non-human animal with human or chimeric genes | |
| RU2788523C2 (en) | ANIMALS WITH HUMANIZED IL-4 AND IL-4Rα |