RU2788084C2 - Intrathecal delivery of recombinant adeno-associated virus encoding methyl-cpg-binding protein 2 - Google Patents
Intrathecal delivery of recombinant adeno-associated virus encoding methyl-cpg-binding protein 2 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2788084C2 RU2788084C2 RU2019118300A RU2019118300A RU2788084C2 RU 2788084 C2 RU2788084 C2 RU 2788084C2 RU 2019118300 A RU2019118300 A RU 2019118300A RU 2019118300 A RU2019118300 A RU 2019118300A RU 2788084 C2 RU2788084 C2 RU 2788084C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mecp2
- rett syndrome
- aav
- treatment
- pharmaceutical composition
- Prior art date
Links
- 108010072388 Methyl-CpG-Binding Protein 2 Proteins 0.000 title claims abstract description 117
- 241000432074 Adeno-associated virus Species 0.000 title claims abstract description 6
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 title claims description 29
- 102000006890 Methyl-CpG-Binding Protein 2 Human genes 0.000 title description 25
- 102100014726 MECP2 Human genes 0.000 claims abstract description 157
- 101700029603 MECP2 Proteins 0.000 claims abstract description 98
- 208000006289 Rett Syndrome Diseases 0.000 claims abstract description 52
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 42
- 229920000023 polynucleotide Polymers 0.000 claims abstract description 22
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 22
- 230000003612 virological Effects 0.000 claims abstract description 18
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 17
- 230000001402 polyadenylating Effects 0.000 claims abstract description 14
- 229920002459 Intron Polymers 0.000 claims abstract description 10
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract 12
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 claims abstract 4
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 claims description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 22
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 18
- 102000004040 Capsid Proteins Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 claims description 7
- NTHXOOBQLCIOLC-UHFFFAOYSA-N Iohexol Chemical compound OCC(O)CN(C(=O)C)C1=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C1I NTHXOOBQLCIOLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229960001025 iohexol Drugs 0.000 claims description 5
- -1 yomeprol Chemical compound 0.000 claims description 4
- YLPBXIKWXNRACS-UHFFFAOYSA-N Iobitridol Chemical compound OCC(O)CN(C)C(=O)C1=C(I)C(NC(=O)C(CO)CO)=C(I)C(C(=O)N(C)CC(O)CO)=C1I YLPBXIKWXNRACS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960004647 Iopamidol Drugs 0.000 claims description 3
- 229960002603 Iopromide Drugs 0.000 claims description 3
- DGAIEPBNLOQYER-UHFFFAOYSA-N Iopromide Chemical compound COCC(=O)NC1=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)N(C)CC(O)CO)=C1I DGAIEPBNLOQYER-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- AMDBBAQNWSUWGN-UHFFFAOYSA-N Ioversol Chemical compound OCCN(C(=O)CO)C1=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C1I AMDBBAQNWSUWGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960004108 iobitridol Drugs 0.000 claims description 3
- XQZXYNRDCRIARQ-LURJTMIESA-N iopamidol Chemical compound C[C@H](O)C(=O)NC1=C(I)C(C(=O)NC(CO)CO)=C(I)C(C(=O)NC(CO)CO)=C1I XQZXYNRDCRIARQ-LURJTMIESA-N 0.000 claims description 3
- 229960004537 ioversol Drugs 0.000 claims description 3
- IUNJANQVIJDFTQ-UHFFFAOYSA-N Iopentol Chemical compound COCC(O)CN(C(C)=O)C1=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C1I IUNJANQVIJDFTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960000824 iopentol Drugs 0.000 claims description 2
- 241001470561 Arracacha virus V Species 0.000 claims 1
- 210000003169 Central Nervous System Anatomy 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 55
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 45
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 32
- 210000004556 Brain Anatomy 0.000 description 31
- 230000004083 survival Effects 0.000 description 31
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 29
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 28
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 27
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 21
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 16
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 16
- 210000000278 Spinal Cord Anatomy 0.000 description 15
- 230000001965 increased Effects 0.000 description 14
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 14
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 14
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 14
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 13
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 13
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 13
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 12
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 238000000185 intracerebroventricular Methods 0.000 description 10
- 210000001638 Cerebellum Anatomy 0.000 description 9
- 230000003542 behavioural Effects 0.000 description 9
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 9
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 8
- 210000001320 Hippocampus Anatomy 0.000 description 7
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 7
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 7
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 210000002569 neurons Anatomy 0.000 description 6
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 6
- 210000001103 Thalamus Anatomy 0.000 description 5
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 5
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 5
- 230000002458 infectious Effects 0.000 description 5
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 210000001767 Medulla Oblongata Anatomy 0.000 description 4
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 4
- 210000004255 neuroglia Anatomy 0.000 description 4
- 230000002093 peripheral Effects 0.000 description 4
- 230000002269 spontaneous Effects 0.000 description 4
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M Caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 101710008404 GAPDH Proteins 0.000 description 3
- 102100008005 GPR180 Human genes 0.000 description 3
- 101710028548 GPR180 Proteins 0.000 description 3
- 210000003128 Head Anatomy 0.000 description 3
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 3
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 3
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 3
- 229940098124 cesium chloride Drugs 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 101710025070 gapdh-2 Proteins 0.000 description 3
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 3
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 3
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 3
- 230000000926 neurological Effects 0.000 description 3
- 230000036961 partial Effects 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 108090000464 transcription factors Proteins 0.000 description 3
- 102000003995 transcription factors Human genes 0.000 description 3
- 241000649044 Adeno-associated virus 9 Species 0.000 description 2
- 210000004727 Amygdala Anatomy 0.000 description 2
- 208000008784 Apnea Diseases 0.000 description 2
- 206010002974 Apnoea Diseases 0.000 description 2
- 210000001130 Astrocytes Anatomy 0.000 description 2
- 208000005849 Atypical Rett Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 210000000601 Blood Cells Anatomy 0.000 description 2
- 210000001159 Caudate Nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 210000004720 Cerebrum Anatomy 0.000 description 2
- 210000000877 Corpus Callosum Anatomy 0.000 description 2
- 229920000665 Exon Polymers 0.000 description 2
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 210000003016 Hypothalamus Anatomy 0.000 description 2
- 206010022114 Injury Diseases 0.000 description 2
- 210000003141 Lower Extremity Anatomy 0.000 description 2
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 2
- 210000001259 Mesencephalon Anatomy 0.000 description 2
- 206010064062 Neurodevelopmental disease Diseases 0.000 description 2
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 2
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 2
- 206010034568 Peripheral coldness Diseases 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 210000002637 Putamen Anatomy 0.000 description 2
- 210000003863 Superior Colliculi Anatomy 0.000 description 2
- 210000001766 X Chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 2
- 230000001809 detectable Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000003260 fluorescence intensity Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 2
- 230000002489 hematologic Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000009114 investigational therapy Methods 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000009593 lumbar puncture Methods 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cells Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000037230 mobility Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000051 modifying Effects 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 101700030147 rep Proteins 0.000 description 2
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 2
- 230000007958 sleep Effects 0.000 description 2
- ULVBNYNCYNALAV-UHFFFAOYSA-M sodium;dodecyl sulfate;prop-2-enamide Chemical compound [Na+].NC(=O)C=C.CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O ULVBNYNCYNALAV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 230000002459 sustained Effects 0.000 description 2
- 201000010874 syndrome Diseases 0.000 description 2
- 230000002588 toxic Effects 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 108091006091 transcriptional repressors Proteins 0.000 description 2
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 2
- 230000003442 weekly Effects 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 2qpq Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102100001249 ALB Human genes 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 206010002855 Anxiety Diseases 0.000 description 1
- 206010057666 Anxiety disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000576 Arachnoid Anatomy 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 229960001230 Asparagine Drugs 0.000 description 1
- 206010003805 Autism Diseases 0.000 description 1
- 210000000988 Bone and Bones Anatomy 0.000 description 1
- 208000008581 Brain Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000001183 Brain Injury Diseases 0.000 description 1
- 230000035579 Brain Levels Effects 0.000 description 1
- 210000000133 Brain Stem Anatomy 0.000 description 1
- 241001609030 Brosme brosme Species 0.000 description 1
- 206010006514 Bruxism Diseases 0.000 description 1
- 101700041333 C1 Proteins 0.000 description 1
- 210000000234 Capsid Anatomy 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 210000003710 Cerebral Cortex Anatomy 0.000 description 1
- 206010068051 Chimerism Diseases 0.000 description 1
- 210000000349 Chromosomes Anatomy 0.000 description 1
- 229920002839 Cis-regulatory element Polymers 0.000 description 1
- 229920001405 Coding region Polymers 0.000 description 1
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KAZBKCHUSA-N D-Mannitol Natural products OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KAZBKCHUSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 206010011953 Decreased activity Diseases 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 101700070897 ENO2 Proteins 0.000 description 1
- 102100003738 ENO2 Human genes 0.000 description 1
- 210000001161 Embryo, Mammalian Anatomy 0.000 description 1
- 206010014623 Encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 206010014625 Encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- CYTYCFOTNPOANT-UHFFFAOYSA-N Ethylene tetrachloride Chemical compound ClC(Cl)=C(Cl)Cl CYTYCFOTNPOANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000002989 Euphorbia neriifolia Species 0.000 description 1
- 210000003754 Fetus Anatomy 0.000 description 1
- 101710037135 GAPC2 Proteins 0.000 description 1
- 101710037116 GAPC3 Proteins 0.000 description 1
- 101710025049 GAPDG Proteins 0.000 description 1
- 102100006425 GAPDH Human genes 0.000 description 1
- 206010017577 Gait disturbance Diseases 0.000 description 1
- 101710010461 Gapdh1 Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 229940014259 Gelatin Drugs 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229940093915 Gynecological Organic acids Drugs 0.000 description 1
- WZUVPPKBWHMQCE-VYIIXAMBSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2C[C@@]2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-VYIIXAMBSA-N 0.000 description 1
- 208000000122 Hyperventilation Diseases 0.000 description 1
- 208000001953 Hypotension Diseases 0.000 description 1
- 229940072221 IMMUNOGLOBULINS Drugs 0.000 description 1
- 102000018358 Immunoglobulins Human genes 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulins Proteins 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N Kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 206010023509 Kyphosis Diseases 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 210000003140 Lateral Ventricles Anatomy 0.000 description 1
- 208000010524 Lubs X-linked mental retardation syndrome Diseases 0.000 description 1
- 210000004705 Lumbosacral Region Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 Lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 101710025050 MK0970 Proteins 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 229920001776 Mature messenger RNA Polymers 0.000 description 1
- 208000004141 Microcephaly Diseases 0.000 description 1
- 210000000337 Motor Cortex Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 Muscles Anatomy 0.000 description 1
- DJDFFEBSKJCGHC-UHFFFAOYSA-N Naphazoline Chemical compound Cl.C=1C=CC2=CC=CC=C2C=1CC1=NCCN1 DJDFFEBSKJCGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000004248 Oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 101710027641 PPARGC1B Proteins 0.000 description 1
- 206010035039 Piloerection Diseases 0.000 description 1
- 210000002975 Pons Anatomy 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 206010039722 Scoliosis Diseases 0.000 description 1
- 206010039911 Seizure Diseases 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 210000002330 Subarachnoid Space Anatomy 0.000 description 1
- 206010042566 Superinfection Diseases 0.000 description 1
- 229960002180 Tetracycline Drugs 0.000 description 1
- OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N Tetracycline Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 210000003501 Vero Cells Anatomy 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Vitamin C Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 1
- 101710002785 WIGBRp0010 Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K [O-]P([O-])([O-])=O Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant Effects 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000001668 ameliorated Effects 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000002547 anomalous Effects 0.000 description 1
- 230000000111 anti-oxidant Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 230000036506 anxiety Effects 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 230000002567 autonomic Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 231100000874 brain damage Toxicity 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 101710025091 cbbGC Proteins 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000001010 compromised Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 1
- 230000001054 cortical Effects 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative Effects 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion media Substances 0.000 description 1
- 230000019975 dosage compensation by inactivation of X chromosome Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000005584 early death Effects 0.000 description 1
- 108010057988 ecdysone receptor Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000816 effect on animals Effects 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 230000021824 exploration behavior Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002518 glial Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000000971 hippocampal Effects 0.000 description 1
- 238000007489 histopathology method Methods 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000036543 hypotension Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 238000011031 large scale production Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesions Effects 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 238000011068 load Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000002609 media Substances 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial Effects 0.000 description 1
- 230000002025 microglial Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic Effects 0.000 description 1
- 238000009126 molecular therapy Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000004973 motor coordination Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 201000009457 movement disease Diseases 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000001537 neural Effects 0.000 description 1
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000005371 pilomotor reflex Effects 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 238000011045 prefiltration Methods 0.000 description 1
- 230000001566 pro-viral Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 1
- 230000000268 renotropic Effects 0.000 description 1
- 101700021040 repB Proteins 0.000 description 1
- 101710002782 repF Proteins 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000754 repressing Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory Effects 0.000 description 1
- 230000026416 response to pain Effects 0.000 description 1
- 108091007521 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000001340 slower Effects 0.000 description 1
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000002739 subcortical Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000152 swallowing Effects 0.000 description 1
- 230000000946 synaptic Effects 0.000 description 1
- 201000000768 syndromic X-linked intellectual disability Lubs type Diseases 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000005100 tissue tropism Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 231100000730 tolerability Toxicity 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional Effects 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 229960005486 vaccines Drugs 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001457 vasomotor Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 230000036642 wellbeing Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N β-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
[0001] Настоящая заявка испрашивает преимущество приоритета предварительной заявки на патент США № 62/423618, поданной 17 ноября 2016 года. [0001] The present application claims the benefit of priority of U.S. Provisional Application No. 62/423,618, filed November 17, 2016.
Включение посредством ссылки материала, поданного в электронном видеInclusion by reference of material submitted electronically
[0002] Перечень последовательностей в машиночитаемой форме включен посредством ссылки в полном объеме, при этом он подается одновременно с данным документом и имеет следующие характеристики: текстовый файл в формате ASCII под названием «50215PCT_SeqListing.txt», размером 24148 байт, созданный 17 ноября 2017 года. [0002] The sequence listing in machine-readable form is incorporated by reference in its entirety and is filed at the same time as this document and has the following characteristics: an ASCII text file called "50215PCT_SeqListing.txt", 24148 bytes in size, created on November 17, 2017 .
Область техники, к которой относится изобретениеThe field of technology to which the invention belongs
[0003] Настоящее изобретение относится к способам и материалам для интратекальной доставки рекомбинантного аденоассоциированного вируса 9 (rAAV9), кодирующего метил-CpG-связывающий белок 2 (MECP2). Предусмотрено применение способов и материалов, например, для лечения синдрома Ретта. [0003] The present invention relates to methods and materials for intrathecal delivery of recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) encoding methyl CpG binding protein 2 (MECP2). Methods and materials are contemplated for use, for example, in the treatment of Rett syndrome.
Уровень техникиState of the art
[0004] Синдром Ретта представляет собой Х-сцепленное доминантное нарушение развития нервной системы, которое поражает 1 из 10000 девочек. Гемизиготные особи мужского пола обычно умирают от неонатальной энцефалопатии. Гетерозиготные особи женского пола доживают до взрослого возраста, но у них проявляются тяжелые симптомы, включая микроцефалию, утрату целенаправленных движений рук и речи и двигательные нарушения, которые проявляются после периода визуально нормального развития. Манифестация заболевания приходится на возраст приблизительно 6-18 месяцев. [0004] Rett syndrome is an X-linked dominant neurodevelopmental disorder that affects 1 in 10,000 girls. Hemizygous males usually die from neonatal encephalopathy. Heterozygous females survive to adulthood but show severe symptoms, including microcephaly, loss of purposeful hand and speech movements, and movement disorders that appear after a period of visually normal development. The manifestation of the disease occurs at the age of approximately 6-18 months.
[0005] Синдром Ретта подразделяют на типичный (или классический) синдром Ретта или атипичный синдром Ретта. Спонтанные мутации гена, кодирующего транскрипционный фактор, метил-CpG-связывающий белок 2 (MECP2), вызывают большинство (~90%) случаев в обоих классах, хотя атипичный синдром Ретта может быть вызван мутациями в генах, отличных от MECP2. На тяжесть заболевания влияют природа мутации MECP2 (например, делеция или точковая мутация) и асимметричная инактивация Х-хромосомы. Транскрипционный фактор MECP2 модулирует транскрипцию тысяч генов. Ранее терапевтические усилия были направлены на мишени, представляющие собой последующие звенья процессов с участием MECP2, включая нейротрансмиттеры, факторы роста и метаболические пути. По меньшей мере в девяти клинических испытаниях, направленных на лечение синдрома Ретта, сообщалось о положительных результатах по различным показателям, но полученные результаты не были независимо подтверждены или не приводили к созданию новых средств лечения [Katz et al, Trends in Neurosciences, 39: 100-113 (2016)]. В настоящее время отсутствуют одобренные средства лечения синдрома Ретта. [0005] Rett syndrome is subdivided into typical (or classic) Rett syndrome or atypical Rett syndrome. Spontaneous mutations in the gene encoding the transcription factor methyl-CpG-binding protein 2 (MECP2) cause the majority (~90%) of cases in both classes, although atypical Rett syndrome can be caused by mutations in genes other than MECP2 . Disease severity is affected by the nature of the MECP2 mutation (eg, deletion or point mutation) and asymmetric X-chromosome inactivation. The transcription factor MECP2 modulates the transcription of thousands of genes. Previous therapeutic efforts have focused on downstream targets for MECP2, including neurotransmitters, growth factors, and metabolic pathways. At least nine clinical trials targeting Rett syndrome have reported positive outcomes across a variety of measures, but the results have not been independently validated or have not led to new treatments [Katz et al, Trends in Neurosciences, 39: 100- 113 (2016)]. There are currently no approved treatments for Rett syndrome.
[0006] Существуют модельные животные, представляющие собой самцов и самок мышей, где мыши проявляют RTT-подобное поведение [Guy et al., Nature Genetics, 27: 322-326 (2001); Chen et al., Nature Genetics 27: 327-331 (2001); и Katz et al., 5: 733-745 (2012)]. [0006] Male and female mouse animal models exist where mice exhibit RTT-like behavior [Guy et al., Nature Genetics, 27 : 322-326 (2001); Chen et al., Nature Genetics 27 : 327-331 (2001); and Katz et al., 5 : 733-745 (2012)].
[0007] MECP2 представляет собой ядерный белок массой 52 кДа, который экспрессируется в целом ряде тканей, но характеризуется высоким содержанием в нейронах, и он изучался, прежде всего, в нервной системе. У человека существуют две изоформы MECP2, известные как MECP2A и B (фигура 1) [Weaving et al., Journal of Medical Genetics, 42: 1-7 (2005)]. Две изоформы происходят из транскриптов мРНК, подвергаемых альтернативному сплайсингу, и они имеют различные сайты начала трансляции. MECP2B содержит экзоны 1, 3 и 4 и является преобладающей изоформой в головном мозге. MECP2 обратимо связывается с метилированной ДНК и модулирует экспрессию генов [Guy et al., Annual Review of Cell and Developmental Biology, 27: 631-652 (2011)]. Эти функции связывают с метил-связывающим доменом (MBD) и доменом-репрессором транскрипции (TRD), соответственно [Nan & Bird, Brain & Development, 23, Suppl 1: S32-37 (2001)]. MECP2, первоначально считавшийся репрессором транскрипции, может как индуцировать, так и подавлять экспрессию целевого гена [Chahrour et al., Science, 320: 1224-1229 (2008)]. Предполагается, что MECP2 обеспечивает правильное развитие и поддержание нейронов. В нейронах MECP2 облегчает преобразование синаптической активности в экспрессию генов за счет связывания ДНК и взаимодействия с различными партнерами по связыванию [Ebert et al., Nature, 499: 341-345 (2013) и Lyst et al., Nature Neuroscience, 16: 898-902 (2013)]. В астроцитах недостаточность MECP2 связана с эпизодами апноэ у мышей [Lioy et al., Nature, 475: 497-500 (2011)]. Недостаточность MECP2 может вызывать уменьшение размера головного мозга, увеличение плотности упаковки нейронов и снижение сложности дендритной сети [Armstrong et al., Journal of Neuropathology and Experimental Neurology, 54: 195-201 (1995)]. Важно отметить, что гибель нейронов не сопряжена с недостаточностью MECP2 [Leonard et al., Nature Reviews, Neurology, 13: 37-51 (2017)]. MECP2 также встречается за пределами нервной системы, хотя его уровни в разных тканях варьируются (фигура 2). В недавнем исследовании изучали зависимость симптомов синдрома Ретта у мышей от периферической экспрессии Mecp2 [Ross et al., Human Molecular Genetics, 25: 4389-4404 (2016)]. Периферическая недостаточность была сопряжена с гипоактивностью, усталостью при физической нагрузке и аномалиями костной ткани. У мышей с нокаутом периферического MECP2 отсутствовало большинство поведенческих, сенсорно-двигательных, связанных с походкой и вегетативных (дыхательных и сердечных) фенотипов, сопряженных с RTT. [0007] MECP2 is a 52 kDa nuclear protein that is expressed in a variety of tissues but is highly abundant in neurons and has been studied primarily in the nervous system. In humans, there are two isoforms of MECP2, known as MECP2A and B ( figure 1 ) [Weaving et al., Journal of Medical Genetics, 42 : 1-7 (2005)]. The two isoforms are derived from alternatively spliced mRNA transcripts and have different translation start sites. MECP2B contains
[0008] Поскольку MECP2 представляет собой X-сцепленный ген, одна копия MECP2 является молчащей вследствие инактивации Х-хромосомы (Xci) у самок. Полагают, что для каждой клетки Xci является случайной, что приводит к химеризму по MECP2 у самок с синдромом Ретта. На тяжесть заболевания влияет то, содержит ли большинство активных Х-хромосом интактный или мутантный ген MECP2. Это называют асимметричной Xci. У самцов Xci не происходит, поэтому недостаточность MECP2 является более сильной, поскольку отсутствуют клетки, которые будут обладать функциональной копией MECP2. На тяжесть заболевания также влияет природа мутации MECP2. В базе данных RettBASE (http://mecp2.chw.edu.au/) описаны более 600 различных мутаций гена MECP2, в том числе делеции, нонсенс-мутации и точковые мутации. Наиболее распространенной мутацией (~9% пациентов) является аллель T185M, при котором затрагивается метил-связывающий домен. Другие распространенные мутации показаны на фигуре 3 [Leonard, выше]. Совместно они составляют более 40% случаев, перечисленных в RettBASE. Крупномасштабные делеции с вовлечением MECP2 обнаруживали в 8-10% случаев [Li et al., Journal of Human Genetics, 52: 38-47 (2007) и Hardwick et al., European Journal of Human Genetics, 15: 1218-1229 (2007)]. Для R133C, R294X и C-концевых мутаций и делеций (ниже TRD), вызывающих более легкую форму заболевания, отмечена генотип-фенотипическая корреляция. Крупные делеции и мутации раннего усечения цепи (R270X, R255X и R168X) сопряжены с тяжелой формой синдрома Ретта. В таблице 1 описаны единые диагностические критерии синдрома Ретта, недавно подготовленные группой интернациональных врачей-клиницистов, специализирующихся на лечении синдрома Ретта [Neul et al., Annals of Neurology, 68: 944-950 (2010)]. [0008] Since MECP2 is an X-linked gene, one copy of MECP2 is silent due to inactivation of the X chromosome (Xci) in females. For each cell, Xci is believed to be random, leading to MECP2 chimerism in females with Rett syndrome. The severity of the disease is influenced by whether the majority of active X chromosomes contain an intact or mutated MECP2 gene. This is called asymmetric Xci. Xci does not occur in males, so MECP2 deficiency is more severe as there are no cells that will have a functional copy of MECP2 . The nature of the MECP2 mutation also influences the severity of the disease. The RettBASE database (http://mecp2.chw.edu.au/) describes more than 600 different mutations of the MECP2 gene, including deletions, nonsense mutations, and point mutations. The most common mutation (~9% of patients) is the T185M allele, which affects the methyl binding domain. Other common mutations are shown in Figure 3 [Leonard, supra ]. Together they make up over 40% of the cases listed in RettBASE. Large-scale deletions involving MECP2 were found in 8-10% of cases [Li et al., Journal of Human Genetics, 52 : 38-47 (2007) and Hardwick et al., European Journal of Human Genetics, 15 : 1218-1229 (2007 )]. For R133C, R294X and C-terminal mutations and deletions (below TRD) causing milder disease, a genotype-phenotypic correlation was noted. Large deletions and early truncation mutations (R270X, R255X, and R168X) are associated with severe Rett syndrome. Table 1 describes the common diagnostic criteria for Rett syndrome recently developed by a group of international clinicians specializing in the treatment of Rett syndrome [Neul et al., Annals of Neurology, 68 : 944-950 (2010)].
Диагностические критерии для RTT 2010
-Диагностика рекомендуется, если наблюдается постнатальное замедление роста головы.Table 1
Diagnostic Criteria for RTT 2010
-Diagnosis is recommended if postnatal head growth retardation is observed.
1. Период регрессии с последующим восстановлением или стабилизацией.*
2. Все основные критерии и все критерии исключения
3. Вспомогательные критерии не требуются, хотя зачастую присутствуют при типичном RTT Required for diagnosis of typical or classic RTT
1. Period of regression followed by recovery or stabilization.*
2. All major criteria and all exclusion criteria
3. Ancillary criteria not required, although often present in typical RTT
1. Период регрессии с последующим восстановлением или стабилизацией
2. По меньшей мере 2 из 4 основных критериев
3. 5 из 11 вспомогательных критериев Required for diagnosis of atypical or variant RTT
1. Period of regression followed by recovery or stabilization
2. At least 2 of the 4 main criteria
3. 5 out of 11 sub-criteria
1. Частичная или полная утрата приобретенных навыков целенаправленных движений рук.
2. Частичная или полная утрата приобретенных навыков устной речи**
3. Нарушения походки: нарушенная (диспраксическая) способность или отсутствие способности.
4. Стереотипные движения рук, такие как автоматические движения в виде выкручивания/сжимания рук, хлопанья/постукивания, помещения рук в рот и моющих/потирающих движений.Main criteria
1. Partial or complete loss of the acquired skills of purposeful hand movements.
2. Partial or complete loss of acquired oral speech skills**
3. Gait disorders: impaired (dyspraxic) ability or lack of ability.
4. Stereotypic hand movements such as automatic hand twisting/clasping, clapping/tapping, putting hands in mouth, and washing/rubbing movements.
1. Повреждение головного мозга вследствие травмы (пери- или постнатальной), нейрометаболическое заболевание или тяжелая инфекция, которая вызывает неврологические проблемы***
2. Чрезвычайно аномальное психомоторное развитие в первые 6 месяцев жизни# Exclusion Criteria for RTT
1. Brain damage due to trauma (peri- or postnatal), neurometabolic disease, or severe infection that causes neurological problems***
2. Extremely abnormal psychomotor development in the first 6 months of life #
Нарушения дыхания в состоянии бодрствования
Бруксизм в состоянии бодрствования
Нарушенный характер сна
Аномальный мышечный тонус
Периферические вазомоторные расстройства
Сколиоз/кифоз
Замедление роста
Маленькие холодные руки и ступни
Неуместные приступы смеха/крика
Ослабленный ответ на боль
Интенсивное общение глазами - "указывание при помощи глазʺAuxiliary Criteria for Atypical RTT ##
Breathing disorders while awake
bruxism while awake
Disturbed sleep patterns
Abnormal muscle tone
Peripheral vasomotor disorders
Scoliosis/kyphosis
Growth retardation
Small cold hands and feet
Inappropriate laughing/shouting attacks
Weakened response to pain
Intensive eye communication - "pointing with the eyes"
[0009] Аденоассоциированный вирус (AAV) представляет собой дефектный по репликации парвовирус, однонитевой ДНК-геном которого имеет длину около 4,7 т. о., включая инвертированный концевой повтор (ITR) длиной 145 нуклеотидов. Нуклеотидная последовательность генома AAV серотипа 2 (AAV2) представлена в Srivastava et al., J Virol, 45: 555-564 (1983), с исправлениями согласно Ruffing et al., J Gen Virol, 75: 3385-3392 (1994). В пределах ITR содержатся действующие в цис-положении последовательности, управляющие репликацией (rep) вирусной ДНК, капсидированием/упаковкой и встраиванием в хромосому клетки-хозяина. Три промотора AAV (названные p5, p19 и p40 за их относительные местоположения на карте) управляют экспрессией двух внутренних открытых рамок считывания AAV, кодирующих гены rep и cap. Два промотора rep (p5 и p19) в сочетании с дифференциальным сплайсингом единственного интрона AAV (по нуклеотидам 2107 и 2227) приводят к образованию четырех белков rep (rep 78, rep 68, rep 52 и rep 40) на основе гена rep. Белки rep обладают свойствами нескольких ферментов, которые, в конечном итоге, ответственны за репликацию вирусного генома. Ген cap экспрессируется за счет промотора p40 и кодирует три капсидных белка VP1, VP2 и VP3. Получение трех родственных капсидных белков обусловлено альтернативным сплайсингом и неконсенсусными сайтами начала трансляции. Единственный консенсусный сайт полиаденилирования расположен в положении 95 на карте генома AAV. Обзор жизненного цикла и генетики AAV приведен в Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992). [0009] Adeno-associated virus (AAV) is a replication-defective parvovirus whose single-stranded DNA genome is about 4.7 kb long, including an inverted terminal repeat (ITR) of 145 nucleotides. The nucleotide sequence of the AAV serotype 2 (AAV2) genome is presented in Srivastava et al., J Virol, 45 : 555-564 (1983), as amended by Ruffing et al., J Gen Virol, 75 : 3385-3392 (1994). Within the ITR are cis -acting sequences that direct viral DNA replication (rep), encapsulation/packaging, and integration into the host cell's chromosome. Three AAV promoters (named p5, p19, and p40 for their relative locations on the map) drive the expression of two AAV internal open reading frames encoding the rep and cap genes. Two rep promoters (p5 and p19) combined with differential splicing of a single AAV intron (at nucleotides 2107 and 2227) result in four rep proteins (rep 78, rep 68, rep 52, and rep 40) based on the rep gene. The rep proteins share the properties of several enzymes that are ultimately responsible for the replication of the viral genome. The cap gene is expressed via the p40 promoter and encodes three capsid proteins VP1, VP2, and VP3. The production of three related capsid proteins is due to alternative splicing and non-consensual translation start sites. The only polyadenylation consensus site is located at position 95 on the AAV genome map. For a review of the life history and genetics of AAV, see Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158 : 97-129 (1992).
[0010] AAV обладает уникальными свойствами, которые делают его привлекательным в качестве вектора для доставки чужеродной ДНК в клетки, например, в генной терапии. Вызываемая AAV инфекция клеток в культуре не является цитопатической, а природная инфекция у человека и других животных является скрытой и бессимптомной. Более того, AAV инфицирует множество клеток млекопитающих, что обеспечивает возможность целенаправленного воздействия на множество различных тканей in vivo. Более того, AAV трансдуцирует медленно делящиеся и неделящиеся клетки и может сохраняться фактически в течение периода жизни этих клеток в виде транскрипционно активной ядерной эписомы (внехромосомного элемента). Провирусный геном AAV является инфекционным, поскольку клонирует ДНК в плазмиды, что делает возможным конструирование рекомбинантных геномов. Кроме того, поскольку сигналы, управляющие репликацией AAV, капсидированием и встраиванием генома, содержатся в пределах ITR генома AAV, некоторые или все внутренние участки размером примерно 4,3 т. о. генома (кодирующие белки репликации и структурные капсидные белки, rep-cap) можно заменить чужеродной ДНК, такой как генная кассета, содержащая промотор, представляющую интерес ДНК и сигнал полиаденилирования. Белки rep и cap могут обеспечиваться в транс-конфигурации. Другим важным признаком AAV является то, что он представляет собой исключительно стабильный и крепкий вирус. Он легко выдерживает условия, применяемые для инактивации аденовируса (от 56° до 65°С в течение нескольких часов), что делает менее важным хранение AAV в холодных условиях. AAV даже можно лиофилизировать. Наконец, инфицированные AAV клетки не обладают невосприимчивостью к суперинфекции. Существует множество серотипов AAV, и они характеризуются различным тканевым тропизмом. К известным серотипам относятся, например, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13 и AAVrh74. AAV9 описан в патенте США № 7198951 и в Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004). [0010] AAV has unique properties that make it attractive as a vector for delivering foreign DNA into cells, such as in gene therapy. AAV-induced infection of cells in culture is not cytopathic, while natural infection in humans and other animals is latent and asymptomatic. Moreover, AAV infects a variety of mammalian cells, which allows for the targeting of many different tissues in vivo . Moreover, AAV transduces slowly dividing and non-dividing cells and can actually persist throughout the lifetime of these cells as a transcriptionally active nuclear episome (extrachromosomal element). The proviral AAV genome is infectious because it clones DNA into plasmids, which makes it possible to construct recombinant genomes. In addition, since the signals governing AAV replication, encapsulation, and genome integration are contained within the ITR of the AAV genome, some or all of the approximately 4.3 kb internal regions genome (coding for replication proteins and structural capsid proteins, rep-cap) can be replaced with foreign DNA, such as a gene cassette containing a promoter, DNA of interest, and a polyadenylation signal. The rep and cap proteins can be provided in the trans configuration. Another important feature of AAV is that it is an exceptionally stable and robust virus. It readily withstands the conditions used to inactivate adenovirus (56° to 65°C for several hours), making cold storage of AAV less important. AAV can even be lyophilized. Finally, AAV-infected cells are not immune to superinfection. There are many AAV serotypes and they are characterized by different tissue tropisms. Known serotypes include, for example, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13 and AAVrh74. AAV9 is described in US Pat. No. 7,198,951 and in Gao et al., J. Virol. 78 : 6381-6388 (2004).
[0011] В данной области техники остается потребность в способах и продуктах для доставки полинуклеотидов MECP2 в центральную нервную систему и экспрессии в ней таких полинуклеотидов. [0011] There remains a need in the art for methods and products for delivering MECP2 polynucleotides to and expressing such polynucleotides in the central nervous system.
Краткое описаниеShort description
[0012] В настоящем изобретении предусмотрены способы и материалы, пригодные для лечения синдрома Ретта у пациента, нуждающегося в этом. [0012] The present invention provides methods and materials useful for treating Rett syndrome in a patient in need thereof.
[0013] Предусмотрены способы лечения синдрома Ретта у пациента, предусматривающие стадию интратекального введения пациенту рекомбинантного аденоассоциированного вируса 9 (rAAV9), кодирующего метил-CpG-связывающий белок 2 (MECP2), где rAAV9 содержит самокомплементарный геном, кодирующий MECP2B, и где последовательность самокомплементарного генома представляет собой SEQ ID NO:1. В качестве иллюстративного rAAV9 предусмотрен scAAV под названием AVXS-201. [0013] Methods are provided for treating Rett syndrome in a patient, comprising the step of intrathecally administering to the patient recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) encoding methyl-CpG-binding protein 2 (MECP2), where rAAV9 contains a self-complementary genome encoding MECP2B, and where the sequence of the self-complementary genome is SEQ ID NO:1. As an exemplary rAAV9, an scAAV called AVXS-201 is provided.
[0014] Предусмотрены способы, которые дополнительно предусматривают стадию интратекального введения пациенту йогексола, йобитридола, йомепрола, йопамидола, йопентола, йопромида, йоверсола или йоксилана или смесей двух или более из них, и/или которые дополнительно предусматривают приведение пациента в положение Тренделенбурга. [0014] Methods are contemplated which further comprise the step of intrathecally administering to the patient iohexol, iobitridol, yomeprol, iopamidol, jopentol, iopromide, ioversol, or joxilan, or mixtures of two or more thereof, and/or which further comprise placing the patient in a Trendelenburg position.
Краткое описание графических материаловBrief description of graphic materials
[0015] Фигура 1. Диаграмма локуса MECP2 человека. На рисунке показаны альтернативные сайты начала транскрипции (стрелки), экзоны (прямоугольники) и паттерн сплайсинга зрелых мРНК. MECP2B представляет собой изоформу, наиболее распространенную в головном мозге, и кодируется AVXS-201. [0015] Figure 1. Diagram of the human MECP2 locus. The figure shows alternative transcription start sites (arrows), exons (rectangles), and the splicing pattern of mature mRNAs. MECP2B is the most abundant isoform in the brain and is encoded by AVXS-201.
[0016] Фигура 2. На графике изображены относительные уровни экспрессии белка MECP2 в различных тканях человека, установленные с помощью иммуногистохимического анализа. Из The Human Protein Atlas (www.proteinatlas.org) с модификациями. [0016] Figure 2. The graph depicts the relative levels of expression of the MECP2 protein in various human tissues, established using immunohistochemical analysis. From The Human Protein Atlas (www.proteinatlas.org) with modifications.
[0017] Фигура 3. Ключевые функциональные домены белка MECP2 и распространенные мутации, обнаруженные у пациентов с синдромом Ретта. MBD=метил-CpG-связывающий домен, TRD=домен репрессии транскрипции, NID=домен взаимодействия NCOR-SMRT (NID) и сигнал ядерной локализации (NLS) [0017] Figure 3. Key functional domains of the MECP2 protein and common mutations found in patients with Rett syndrome. MBD=methyl-CpG binding domain, TRD=transcriptional repression domain, NID=NCOR-SMRT interaction domain (NID) and nuclear localization signal (NLS)
[0018] Фигура 4. Исследование для подтверждения механизма AAV9-опосредованного восстановления экспрессии Mecp2 у самцов мышей с синдромом Ретта. A) Упрощенная схема генома рекомбинантного AAV. B) Дизайн эксперимента. C) Кривая выживания Каплана-Мейера, демонстрирующая увеличение выживания у мышей с синдромом Ретта, обработанных посредством scAAV9.738.Mecp2, по сравнению с животными, обработанными контрольным вектором. D) Опосредованное вектором восстановление Mecp2 улучшает поведенческий фенотип, измеряемый по шкале оценок Берда (вставка 1). [0018] Figure 4. Study to confirm the mechanism of AAV9-mediated restoration of Mecp2 expression in male mice with Rett syndrome. A) Simplified diagram of the recombinant AAV genome. B) Design of the experiment. C) Kaplan-Meier survival curve showing increased survival in Rett syndrome mice treated with scAAV9.738.Mecp2 compared to control vector treated animals. D) Vector-mediated recovery of Mecp2 improves the behavioral phenotype as measured by the Byrd Rating Scale (Box 1).
[0019] Фигура 5. Обработка самок мышей с синдромом Ретта с помощью scAAV9.738.Mecp2 обеспечивает физиологические уровни Mecp2 и улучшает аберрантное поведение. A) Дизайн эксперимента. В) Результаты измерений интенсивности флуоресценции на срезах головного мозга, которые были окрашены иммунной меткой для выявления Mecp2, полученных от мышей дикого типа и мышей с синдромом Ретта, обработанных посредством scAAV9.738.Mecp2. Распределение результатов измерения интенсивности является аналогичным у двух групп. C) Оценка фенотипа по шкале Берда демонстрирует уменьшение проявления симптомов у животных, получающих scAAV9.738.Mecp2. D-G) Все из оценок поведения на вращающемся барабане, перевернутой сетке, платформе и поведения при устройстве гнезда, соответственно, демонстрируют улучшение у животных, обработанных посредством scAAV9.738.Mecp2, по сравнению с животными, обработанными контролем. [0019] Figure 5. Treatment of female mice with Rett syndrome with scAAV9.738.Mecp2 provides physiological levels of Mecp2 and improves aberrant behavior. A) Design of the experiment. C) Results of fluorescence intensity measurements on brain sections that were immunostained for Mecp2 detection, obtained from wild-type and Rett syndrome mice treated with scAAV9.738.Mecp2. The distribution of intensity measurements is similar for the two groups. C) Byrd's phenotype score demonstrates a reduction in symptom expression in animals treated with scAAV9.738.Mecp2. DG) All of the roll, inverted, platform, and nest behavior scores, respectively, show an improvement in scAAV9.738.Mecp2 treated animals compared to control treated animals.
[0020] Фигура 6. Упрощенная схема, изображающая геномы рекомбинантного AAV первого поколения (A) и переработанного (B, AVXS-201), описанные в данном документе. Цвета указывают на сходства и различия между конструкциями. При переработке scAAV9.738.Mecp2 в AVXS-201 был укорочен промотор, были укорочены промежуточные последовательности между ключевыми элементами, кДНК Mecp2-альфа мыши была заменена на кДНК MECP2B человека, а сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста был заменен на более короткий синтетический элемент. Общая цель изменений заключалась в повышении эффективности упаковки при сохранении физиологических уровней экспрессии кДНК MECP2, важной с клинической точки зрения. [0020] Figure 6. Simplified diagram showing the genomes of the first generation recombinant (A) and redesigned (B, AVXS-201) AAV described herein. Colors indicate similarities and differences between designs. When scAAV9.738.Mecp2 was processed into AVXS-201, the promoter was shortened, intermediate sequences between key elements were shortened, mouse Mecp2-alpha cDNA was replaced with human MECP2B cDNA, and the bovine growth hormone polyadenylation signal was replaced with a shorter synthetic element. The overall goal of the changes was to improve packaging efficiency while maintaining physiological expression levels of the MECP2 cDNA, which is clinically important.
[0021] Фигура 7. Дозозависимый ответ на AVXS-201 у Mecp2 -/y мышей. A) График Каплана-Мейера для различных доз, применяемых для обработки Mecp2 -/y мышей. Медиана выживания у групп с различными дозами имеет цветовую кодировку и обозначена пунктирными линиями. Каждая когорта, которая получала AVXS-201, характеризовалась увеличением выживания относительно мышей с нулевым аллелем, обработанных контролем. B) Данные медианы выживания для каждой группы были нанесены на график, чтобы показать кривую дозозависимого ответа. Пунктирная линия представляет медиану выживания у Mecp2 -/y , обработанных посредством PBS. Эти данные согласуются с известными эффектами недостаточности и переизбытка MECP2. [0021]Figure 7. Dose-dependent response to AVXS-201 inMecp2 -/y mice. A) Kaplan-Meier plot for various treatment dosesMecp2 -/y mice. The median survival of the different dose groups is color-coded and indicated by dotted lines. Each cohort that received AVXS-201 experienced an increase in survival relative to control-treated null mice. B) Median survival data for each group were plotted to show the dose-response curve. The dotted line represents the median of survival forMecp2 -/y treated with PBS. These data are consistent with the known effects of MECP2 deficiency and excess.
[0022] Фигура 8. Оценка поведения по шкале Берда у Mecp2 -/y мышей, обработанных посредством AVXS-201. A) У пораженных мышей, обработанных контролем, с увеличением возраста дефициты накапливаются. Поведенческие дефициты ослабляются при обработке посредством AVXS-201 независимо от дозы. B) На график повторно нанесены те же данные, что и на (A), но показаны только группа, обработанная контролем, и группа, обработанная AVXS-201 в количестве 1,44×1010 vg. [0022]Figure 8. Assessment of behavior on the Byrd scaleMecp2 -/y mice treated with AVXS-201. A) In affected control treated mice, deficiencies accumulate with increasing age. Behavioral deficits are ameliorated by treatment with AVXS-201 regardless of dose. B) The same data is re-plotted as in (A), but only the control group and the group treated with AVXS-201 at 1.44 x 10 are shown.10 vg.
[0023] Фигура 9. У мышей с нулевым аллелем Mecp2, обработанных посредством AVXS-201, восстанавливается способность к самопроизвольным передвижениям. Анализ в тесте "открытое поле" демонстрирует, что мыши с нулевым аллелем, обработанные посредством AVXS-201, проходят (A) большие расстояния и при увеличенной (B) средней скорости по сравнению с мышами с нулевым аллелем, обработанными контролем. C) Показатели на вращающемся барабане в возрасте 3 месяцев также улучшались при умеренных дозах AVXS-201. +=p≤0,001; *=p≤0,05; ζ=p≤0,0001. [0023] Figure 9. Mecp2 null mice treated with AVXS -201 regain the ability to move spontaneously. Open field analysis demonstrates that null mice treated with AVXS-201 travel (A) longer distances and at (B) increased average speed compared to control treated null mice. C) Turntable performance at 3 months of age also improved with moderate doses of AVXS-201. +=p≤0.001; *=p≤0.05; ζ=p≤0.0001.
[0024] Фигура 10. При терапевтических дозах AVXS-201 приводит к умеренному количеству MECP2. A) Вестерн-блоты гомогенатов полушарий головного мозга от самцов мышей дикого типа (PBS) или Mecp2 -/y мышей, которые получены с применением антител к MeCP2. Мышам с нулевым аллелем Mecp2 либо не производили инъекцию (KO), либо они получали указанные дозы AVXS-201. B) Количественная оценка панели A. Целевая терапевтическая доза, составлявшая 1,44×1010 vg, приводила к выработке 11% от уровней белка дикого типа. [0024] Figure 10. At therapeutic doses, AVXS-201 results in moderate amounts of MECP2. A) Western blots of cerebral hemisphere homogenates from male wild-type (PBS) or Mecp2 -/y mice, which were obtained using anti-MeCP2 antibodies. Mecp2 null mice were either not injected (KO) or received the indicated doses of AVXS -201. B) Quantification of panel A. The target therapeutic dose of 1.44×10 10 vg resulted in the production of 11% of wild-type protein levels.
[0025] Фигура 11. AVXS-201 хорошо переносится мышами дикого типа. A) График выживания Каплана-Мейера для самцов мышей дикого типа, которые получали ICV введение AVXS-201 в P1. B) Фенотипическая оценка по шкале Берда обработанных мышей и мышей дикого типа демонстрирует, что хорошо переносится широкий диапазон доз. Самая высокая доза (1,13×1011, синяя линия) приводила к легким нарушениям поведения. [0025] Figure 11. AVXS-201 is well tolerated in wild-type mice. A) Kaplan-Meier survival plot for wild-type male mice that received ICV administration of AVXS-201 at P1. B) Phenotypic Byrd scoring of treated mice and wild-type mice demonstrates that a wide range of doses are well tolerated. The highest dose (1.13×10 11 , blue line) resulted in mild behavioral disturbances.
[0026] Фигура 12. Обработка посредством AVXS-201 не ухудшает способность к передвижению у животных дикого типа. Анализ в тесте "открытое поле" самцов мышей дикого типа, обработанных посредством AVXS-201, демонстрирует, что (А) пройденные расстояния и (В) средние скорости аналогичны таковым у мышей дикого типа, обработанных контролем. C) Показатели на вращающемся барабане снижались у животных дикого типа, которые получали высокую дозу AVXS-201. +=p≤0,001, *=p≤0,05 [0026] Figure 12. Treatment with AVXS-201 does not impair locomotion in wild-type animals. Open field analysis of wild type male mice treated with AVXS-201 demonstrates that (A) distances traveled and (B) average speeds are similar to those of control treated wild type mice. C) Rotary drum scores decreased in wild-type animals that received a high dose of AVXS-201. +=p≤0.001, *=p≤0.05
[0027] Фигура 13. AVXS-201 приводит к дозозависимому увеличению содержания белка MECP2 в головном мозге дикого типа. A) Вестерн-блоты, полученные с применением антител к MeCP2, демонстрируют дозозависимое повышение общего белка MeCP2 в различных областях головного мозга через 3 недели после ICV инъекции в P1. (Cb=мозжечок, Med=продолговатый мозг, Hipp=гиппокамп, Ctx=кора головного мозга, Mid=средний мозг). TG3 обозначает образцы, взятые от модельной мыши с тяжелой степенью синдрома дупликации MeCP21. B) Количественная оценка панели A. Высокие, а не умеренные, дозы AVXS-201 удваивают экспрессию MECP2 в отдельных областях головного мозга. [0027] Figure 13. AVXS-201 results in a dose-dependent increase in MECP2 protein content in wild-type brain. A) Western blots obtained using anti-MeCP2 antibodies demonstrate a dose-dependent increase in total MeCP2 protein in
[0028] Фигура 14. Интратекальная инфузия AVXS-201 отличным от человека приматам не влияет на прирост массы тела. Три животных, обработанных посредством AVXS-201, показаны красным цветом, а масса тела контрольного субъекта показана синим цветом. [0028] Figure 14. Intrathecal infusion of AVXS-201 to non-human primates does not affect weight gain. The three animals treated with AVXS-201 are shown in red and the body weight of the control subject is shown in blue.
[0029] Фигура 15. Интратекальная инфузия AVXS-201 отличным от человека приматам не влияет на гематологические показатели на протяжении 18 месяцев после инъекции. Значения для трех животных, обработанных посредством AVXS-201, показаны красным цветом, а для контрольных субъектов показаны синим цветом. [0029] Figure 15. Intrathecal infusion of AVXS-201 to non-human primates does not affect hematological parameters for 18 months after injection. Values for the three animals treated with AVXS-201 are shown in red and those for control subjects are shown in blue.
[0030] Фигура 16. Интратекальная инфузия AVXS-201 отличным от человека приматам не влияет на биохимические показатели сыворотки на протяжении 12-18 месяцев после инъекции. Печеночные пробы и концентрации электролитов аналогичны у субъектов, обработанными посредством AVXS-201 и контроля. Значения для трех животных, обработанных посредством AVXS-201, показаны красным цветом, а для контрольных субъектов показаны синим цветом. [0030] Figure 16. Intrathecal infusion of AVXS-201 to non-human primates does not affect serum chemistry for 12-18 months post-injection. Liver function and electrolyte concentrations are similar in subjects treated with AVXS-201 and controls. Values for the three animals treated with AVXS-201 are shown in red and those for control subjects are shown in blue.
[0031] Фигура 17. Интратекальная инфузия AVXS-201 отличным от человека приматам не влияет на биохимические показатели сыворотки на протяжении 12-18 месяцев после инъекции. Сердечные и почечные пробы аналогичны у субъектов, обработанных посредством AVXS-201 и контроля. Значения для трех животных, обработанных посредством AVXS-201, показаны красным цветом, а для контрольных субъектов показаны синим цветом. [0031] Figure 17. Intrathecal infusion of AVXS-201 to non-human primates does not affect serum chemistry for 12-18 months post-injection. Cardiac and renal samples are similar in subjects treated with AVXS-201 and controls. Values for the three animals treated with AVXS-201 are shown in red and those for control subjects are shown in blue.
[0032] Фигура 18. Аналогичные уровни экспрессии MeCP2 во всех участках головного мозга отличных от человека приматов, обработанных посредством AVXS-201 и контроля. Иммуногистохимический анализ с применением антител к MeCP2 не выявил макроскопических аномалий структуры или очевидных отличий в экспрессии MeCP2. OC=затылочная кора, TC=височная кора, LSc=поясничный отдел спинного мозга, Thal=таламус, Hipp=гиппокамп, Cb=мозжечок. [0032] Figure 18. Similar levels of MeCP2 expression in all brain regions of non-human primates treated with AVXS-201 and control. Immunohistochemical analysis using antibodies to MeCP2 did not reveal macroscopic structural abnormalities or obvious differences in MeCP2 expression. OC=occipital cortex, TC=temporal cortex, LSc=lumbar spinal cord, Thal=thalamus, Hipp=hippocampus, Cb=cerebellum.
[0033] Фигура 19. Вестерн-блоты областей головного мозга животных, которым вводили инъекцией контроль и AVXS-201, демонстрируют аналогичные уровни MeCP2. Уровни общего MeCP2 показаны зеленым цветом, а контроли загрузки с GAPDH показаны красным цветом. Количественные оценки панелей A и B показаны под их соответствующими блотами. Пунктирными линиями на графиках показаны средние нормализованные значения, обнаруженные у контролей. OC=затылочная кора, TC=височная кора, LSc=поясничный отдел спинного мозга, Thal=таламус, Hipp=гиппокамп, Cb=мозжечок. Значения показаны как среднее ± SEM. [0033] Figure 19. Western blots of brain regions of animals injected with control and AVXS-201 show similar levels of MeCP2. Total MeCP2 levels are shown in green and loading controls from GAPDH are shown in red. Panels A and B scores are shown below their respective blots. The dotted lines in the graphs show the mean normalized values found in the controls. OC=occipital cortex, TC=temporal cortex, LSc=lumbar spinal cord, Thal=thalamus, Hipp=hippocampus, Cb=cerebellum. Values are shown as mean ± SEM.
[0034] Фигура 20. In situ гибридизация демонстрирует транскрипт, полученный за счет вектора, во всех исследованных областях головного мозга у животных, обработанных посредством AVXS-201, но не у контрольных животных. На фигуре показаны зонды к Gapdh (красный) и мРНК MECP2, полученная на основе вектора (зеленый), а также мечение ядер (Dapi, синий). OC=затылочная кора, TC=височная кора, LSc=поясничный отдел спинного мозга, Hipp=гиппокамп, Cb=мозжечок. Масштабные полоски=20 мкм. [0034] Figure 20. In situ hybridization demonstrates the vector-derived transcript in all brain regions examined in AVXS-201-treated animals, but not in control animals. The figure shows probes for Gapdh (red) and vector-based MECP2 mRNA (green), as well as nuclear labeling (Dapi, blue). OC=occipital cortex, TC=temporal cortex, LSc=lumbar spinal cord, Hipp=hippocampus, Cb=cerebellum. Scale bars=20 µm.
[0035] Фигура 21. In situ гибридизация демонстрирует транскрипт, полученный за счет вектора, во всех исследованных областях головного мозга у животных, обработанных посредством AVXS-201, но не у контрольных животных через 18 месяцев после инъекции. На фигуре показаны зонды к Gapdh (красный) и мРНК MECP2, полученная на основе вектора (зеленый), а также мечение ядер (Dapi, синий). OC=затылочная кора, TC=височная кора, CA1 и CA3=области гиппокампа, CC=мозолистое тело, Thal=таламус, Cau=хвостатое ядро, Put=скорлупа, SColl=верхнее двухолмие, Med=продолговатый мозг, Cb=мозжечок, Cerv=шейный отдел спинного мозга, Thor=грудной отдел спинного мозга, Lumb=поясничный отдел спинного мозга. Масштабные полоски=20 мкм [0035] Figure 21. In situ hybridization demonstrates the vector-derived transcript in all brain regions examined in AVXS-201 treated animals, but not in controls 18 months post-injection. The figure shows probes for Gapdh (red) and vector-based MECP2 mRNA (green), as well as nuclear labeling (Dapi, blue). OC=occipital cortex, TC=temporal cortex, CA1 and CA3=hippocampal regions, CC=corpus callosum, Thal=thalamus, Cau=caudate nucleus, Put=putamen sac, SColl=superior colliculus, Med=medulla oblongata, Cb=cerebellum, Cerv =cervical spinal cord, Thor=thoracic spinal cord, Lumb=lumbar spinal cord. Scale bars=20 µm
Подробное описаниеDetailed description
[0036] В одном аспекте настоящего изобретения предусмотрены способы интратекального введения (т. е. введения в пространство под паутинной оболочкой головного или спинного мозга) полинуклеотида, кодирующего MECP2, пациенту, предусматривающие введение rAAV9 с геномом, содержащим полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления геном rAAV9 представляет собой самокомплементарный геном. В других вариантах осуществления геном rAAV9 представляет собой однонитевой геном. [0036] In one aspect of the present invention, methods are provided for intrathecal administration (i.e., administration to the space below the arachnoid of the brain or spinal cord) of a MECP2-encoding polynucleotide to a patient, comprising administering rAAV9 with a genome containing the polynucleotide. In some embodiments, the rAAV9 genome is a self-complementary genome. In other embodiments, the rAAV9 genome is a single stranded genome.
[0037] С помощью способов полинуклеотид, кодирующий MECP2, доставляется в головной и спинной мозг пациента (т. е. в центральную нервную систему пациента). Некоторые целевые области головного мозга, в которые предусмотрена доставка, охватывают без ограничения двигательную зону коры головного мозга и ствол головного мозга. Некоторые целевые клетки центральной нервной системы, в которые предусмотрена доставка, охватывают без ограничения нервные клетки и клетки глии. Примерами клеток глии являются клетки микроглии, олигодендроциты и астроциты. [0037] Using the methods, a polynucleotide encoding MECP2 is delivered to the patient's brain and spinal cord (ie, the patient's central nervous system). Certain target regions of the brain to which delivery is intended include, but are not limited to, the motor cortex and the brainstem. Certain target cells of the central nervous system to which delivery is intended include, but are not limited to, nerve cells and glial cells. Examples of glial cells are microglial cells, oligodendrocytes and astrocytes.
[0038] Доставка полинуклеотидов, кодирующих MECP2, например, показана при лечении синдрома Ретта. [0038] Delivery of polynucleotides encoding MECP2, for example, is indicated in the treatment of Rett syndrome.
[0039] "Лечение" предусматривает стадию введения интратекальным путем эффективной дозы или многократных эффективных доз композиции, содержащей rAAV по настоящему изобретению, субъекту-животному (в том числе пациенту-человеку), нуждающемуся в этом. Если дозу вводят до развития нарушения/заболевания, то введение является профилактическим. Если дозу вводят после развития нарушения/заболевания, то введение является терапевтическим. В вариантах осуществления настоящего изобретения эффективная доза представляет собой дозу, которая облегчает (либо устраняет, либо уменьшает) по меньшей мере один симптом, сопряженный с нарушением/болезненным состоянием, подлежащими лечению, ослабляет по меньшей мере один симптом, сопряженный с нарушением/болезненным состоянием, подлежащими лечению, которая замедляет или предупреждает прогрессирование нарушения/болезненного состояния, которая снижает стадию заболевания, которая приводит к ремиссии (частичной или полной) заболевания и/или которая продлевает выживание. [0039] "Treatment" includes the step of administering by intrathecal route an effective dose or multiple effective doses of a composition comprising an rAAV of the present invention to an animal subject (including a human patient) in need thereof. If the dose is administered prior to the development of the disorder/disease, then the administration is prophylactic. If the dose is administered after the development of the disorder/disease, then the administration is therapeutic. In embodiments of the present invention, an effective dose is a dose that alleviates (or eliminates or reduces) at least one symptom associated with the disorder/disease condition being treated, relieves at least one symptom associated with the disorder/disease condition, treatable, which slows or prevents the progression of the disorder/disease condition, which lowers the stage of the disease, which results in remission (partial or complete) of the disease, and/or which prolongs survival.
[0040] В случае лечения синдрома Ретта способы приводят к эффекту, включающему без ограничения восстановление целенаправленных движений рук, улучшение речи, уменьшение апноэ, уменьшение судорог, уменьшение тревоги, увеличенную социализацию, повышение IQ, нормализацию характера сна и/или увеличенную подвижность субъекта. [0040] In the case of treating Rett syndrome, the methods result in an effect including, without limitation, restoration of purposeful hand movements, improvement in speech, reduction in apnea, reduction in seizures, reduction in anxiety, increased socialization, increase in IQ, normalization of sleep patterns, and/or increased mobility of the subject.
[0041] Также в настоящем изобретении предусмотрены комбинированные варианты лечения. Используемая в данном документе комбинация охватывает как одновременное лечение, так и последовательное лечение. В частности, предусмотрены комбинации способов по настоящему изобретению со стандартным медикаментозным лечением синдрома Ретта, а также комбинации с новыми средствами терапии. [0041] Combination treatment options are also contemplated by the present invention. As used herein, the combination encompasses both simultaneous treatment and sequential treatment. In particular, combinations of the methods of the present invention with standard medical treatment of Rett syndrome, as well as combinations with novel therapies, are contemplated.
[0042] Хотя предусмотрена доставка индивидууму, нуждающемуся в этом, после рождения, также предусмотрена внутриутробная доставка плоду. [0042] While delivery to an individual in need after birth is contemplated, intrauterine delivery to a fetus is also contemplated.
[0043] В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрены геномы rAAV. Геномы rAAV содержат один или несколько ITR AAV, фланкирующих полинуклеотид, кодирующий MECP2. Полинуклеотид функционально связан с ДНК транскрипционного контроля, в частности, ДНК промотора и ДНК сигнальной последовательности полиаденилирования, которые являются функциональными в целевых клетках, с образованием "генной кассеты". Генная кассета может содержать промоторы, которые обеспечивают специфическую экспрессию в нейронах или специфическую экспрессию в клетках глии. Примеры охватывают промотор гена нейрон-специфической енолазы и промотор генов фибриллярных кислых белков глии. Также можно применять промоторы, индуцируемые под контролем принимаемого внутрь лекарственного средства. Примеры охватывают без ограничения такие системы, как тетрациклиновая (TET on/off) система [Urlinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(14):7963-7968 (2000)] и система, регулируемая экдизоновым рецептором [Palli et al., Eur J. Biochem 270: 1308-1315 (2003]. Генная кассета может дополнительно включать интронные последовательности для облегчения процессинга РНК-транскрипта, когда полинуклеотид экспрессируется в клетках млекопитающих. [0043] In another aspect of the present invention, rAAV genomes are provided. rAAV genomes contain one or more AAV ITRs flanking a polynucleotide encoding MECP2. The polynucleotide is operably linked to a transcription control DNA, in particular a promoter DNA and a polyadenylation signal sequence DNA, that are functional in the target cells to form a "gene cassette". The gene cassette may contain promoters that provide specific expression in neurons or specific expression in glial cells. Examples include the neuron-specific enolase gene promoter and the glial fibrillar acidic protein gene promoter. Promoters that are inducible under the control of an ingested drug can also be used. Examples include, without limitation, systems such as the tetracycline (TET on/off) system [Urlinger et al., Proc. Natl. Acad. sci. USA 97(14):7963-7968 (2000)] and an ecdysone receptor regulated system [Palli et al., Eur J. Biochem 270: 1308-1315 (2003) The gene cassette may further include intron sequences to facilitate RNA- transcript when the polynucleotide is expressed in mammalian cells.
[0044] Геномы rAAV по настоящему изобретению не содержат ДНК rep и cap AAV. ДНК AAV в геномах rAAV (например, ITR) может быть получена от любого серотипа AAV, из которого может происходить рекомбинантный вирус, включая без ограничения такие серотипы AAV: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13 и AAVrh74. Нуклеотидные последовательности геномов серотипов AAV известны из уровня техники. Например, геном AAV9 приведен в Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004). [0044] The rAAV genomes of the present invention do not contain AAV rep and cap DNA. AAV DNA in rAAV genomes (e.g., ITR) can be derived from any AAV serotype from which the recombinant virus can be derived, including, but not limited to, AAV serotypes: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13 and AAVrh74. The nucleotide sequences of the genomes of AAV serotypes are known in the art. For example, the AAV9 genome is given in Gao et al., J. Virol., 78 : 6381-6388 (2004).
[0045] В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрены ДНК-плазмиды, содержащие геномы rAAV по настоящему изобретению. ДНК-плазмиды переносятся в клетки, восприимчивые к инфицированию, с вирусом-помощником AAV (например, аденовирусом, аденовирусом с делецией E1 или герпесвирусом) для сборки генома rAAV в инфекционные вирусные частицы с капсидными белками AAV9. Методики продуцирования частиц rAAV, при которых подлежащий упаковке геном AAV, гены rep и cap и функциональные элементы вируса-помощника обеспечиваются в клетке, являются стандартными в данной области техники. Для продуцирования rAAV необходимо, чтобы в пределах одной клетки (обозначаемой в данном документе как упаковывающая клетка) присутствовали следующие компоненты: геном rAAV, гены rep и cap AAV, отделенные от генома rAAV (т. е. не находящиеся в нем), и функциональные элементы вируса-помощника. Продуцирование псевдотипированного rAAV, например, раскрыто в WO 01/83692, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В различных вариантах осуществления капсидные белки AAV могут быть модифицированы для улучшения доставки рекомбинантного вектора. Модификации, вводимые в капсидные белки, в целом известны из уровня техники. См., например, US 2005/0053922 и US 2009/0202490, раскрытия которых включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. [0045] In another aspect of the present invention, DNA plasmids containing the rAAV genomes of the present invention are provided. The DNA plasmids are transferred into susceptible cells with an AAV helper virus (eg, adenovirus, E1-deleted adenovirus, or herpesvirus) to assemble the rAAV genome into infectious viral particles with AAV9 capsid proteins. Techniques for the production of rAAV particles, in which the AAV genome to be packaged, the rep and cap genes, and helper virus functional elements are provided in the cell, are standard in the art. The production of rAAV requires the following components to be present within a single cell (referred to herein as a packaging cell): the rAAV genome, the AAV rep and cap genes separated from (i.e., not residing in) the rAAV genome, and functional elements helper virus. The production of pseudotyped rAAV, for example, is disclosed in WO 01/83692, which is incorporated herein by reference in its entirety. In various embodiments, the AAV capsid proteins can be modified to improve delivery of the recombinant vector. Modifications introduced into capsid proteins are generally known in the art. See, for example, US 2005/0053922 and US 2009/0202490, the disclosures of which are incorporated herein by reference in their entirety.
[0046] Способ получения упаковывающей клетки заключается в создании клеточной линии, которая стабильно экспрессирует все необходимые компоненты для продуцирования частиц AAV. Например, в геном клетки встроены плазмида (или несколько плазмид), содержащие геном rAAV без генов rep и cap AAV, гены rep и cap AAV, отделенные от генома rAAV, и селектируемый маркер, такой как ген устойчивости к неомицину. Геномы AAV были введены в бактериальные плазмиды с помощью таких процедур, как GC-наращивание (Samulski et al., 1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077-2081), добавление синтетических линкеров, содержащих сайты расщепления рестрикционной эндонуклеазой (Laughlin et al., 1983, Gene, 23:65-73), или путем прямого лигирования тупых концов (Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666). Затем линию упаковывающих клеток инфицируют вирусом-помощником, таким как аденовирус. Преимущества этого способа заключаются в том, что клетки можно подвергать отбору, и они подходят для крупномасштабного продуцирования rAAV. В других примерах подходящих способов вместо плазмид используют аденовирус или бакуловирус для введения в упаковывающие клетки геномов rAAV и/или генов rep и cap. [0046] The method of obtaining a packaging cell is to create a cell line that stably expresses all the necessary components for the production of AAV particles. For example, a plasmid (or several plasmids) containing the rAAV genome without the rep and cap AAV genes, the rep and cap AAV genes separated from the rAAV genome, and a selectable marker such as a neomycin resistance gene are inserted into the cell genome. AAV genomes have been introduced into bacterial plasmids using procedures such as GC extension (Samulski et al., 1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077-2081), addition of synthetic linkers containing restriction endonuclease cleavage sites (Laughlin et al., 1983, Gene, 23:65-73), or by direct blunt end ligation (Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666). The packaging cell line is then infected with a helper virus such as an adenovirus. The advantages of this method are that the cells can be selected and are suitable for large scale production of rAAV. Other examples of suitable methods use adenovirus or baculovirus instead of plasmids to introduce rAAV genomes and/or rep and cap genes into packaging cells.
[0047] Обзор общих принципов продуцирования rAAV изложен, например, в Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539; и Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial. and Immunol., 158:97-129). Различные подходы описаны в Ratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984); Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251 (1985); McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963 (1988); и Lebkowski et al., 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988). Samulski et al. (1989, J. Virol., 63:3822-3828); патенте США № 5173414; WO 95/13365 и соответствующем патенте США № 5658776; WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441 (PCT/US96/14423); WO 97/08298 (PCT/US96/13872); WO 97/21825 (PCT/US96/20777); WO 97/06243 (PCT/FR96/01064); WO 99/11764; Perrin et al. (1995) Vaccine 13:1244-1250; Paul et al. (1993) Human Gene Therapy 4:609-615; Clark et al. (1996) Gene Therapy 3:1124-1132; патенте США № 5786211; патенте США № 5871982 и патенте США № 6258595. Вышеперечисленные документы настоящим включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте, при этом особый акцент делается на те разделы документов, которые относятся к продуцированию rAAV. [0047] A review of the general principles of rAAV production is set forth, for example, in Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539; and Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbials. and Immunol., 158:97-129). Various approaches are described in Ratschin et al., Mol. cell. Biol. 4:2072 (1984); Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. sci. USA 81:6466 (1984); Tratschin et al., Mol. cell. Biol. 5:3251 (1985); McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963 (1988); and Lebkowski et al., 1988 Mol. cell. Biol. 7:349 (1988). Samulski et al. (1989, J. Virol., 63:3822-3828); US Pat. No. 5,173,414; WO 95/13365 and the corresponding US patent No. 5658776; WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441 (PCT/US96/14423); WO 97/08298 (PCT/US96/13872); WO 97/21825 (PCT/US96/20777); WO 97/06243 (PCT/FR96/01064); W099/11764; Perrin et al. (1995) Vaccine 13:1244-1250; Paul et al. (1993) Human Gene Therapy 4:609-615; Clark et al. (1996) Gene Therapy 3:1124-1132; US patent No. 5786211; US Pat. No. 5,871,982 and US Pat. No. 6,258,595. The above documents are hereby incorporated by reference in their entirety, with particular emphasis on those sections of the documents relating to rAAV production.
[0048] Таким образом, в настоящем изобретении предусмотрены упаковывающие клетки, которые продуцируют дефектный по репликации инфекционный rAAV. В одном варианте осуществления упаковывающие клетки могут представлять собой стабильно трансформированные раковые клетки, такие как клетки HeLa, клетки 293 и клетки PerC.6 (линия, родственная линии 293). В другом варианте осуществления упаковывающие клетки представляют собой клетки, которые не являются трансформированными раковыми клетками, такие как клетки 293 с малым числом пассажей (человеческие эмбриональные клетки почки эмбриона человека, трансформированные с помощью E1 аденовируса), клетки MRC-5 (фибробласты эмбриона человека), клетки WI-38 (фибробласты эмбриона человека), клетки Vero (клетки почки обезьяны) и клетки FRhL-2 (клетки легкого эмбриона макака-резуса). [0048] Thus, the present invention provides packaging cells that produce replication-defective infectious rAAV. In one embodiment, the packaging cells may be stably transformed cancer cells such as HeLa cells, 293 cells, and PerC.6 cells (a lineage related to lineage 293). In another embodiment, the packaging cells are cells that are not transformed cancer cells, such as low passage number 293 cells (human embryonic kidney cells transformed with adenovirus E1), MRC-5 cells (human embryonic fibroblasts), WI-38 cells (human embryonic fibroblasts), Vero cells (monkey kidney cells), and FRhL-2 cells (rhesus monkey embryo lung cells).
[0049] Таким образом, в другом аспекте настоящего изобретения предусмотрен rAAV, такой как rAAV9 (т. е. дефектные по репликации инфекционные капсидированные частицы rAAV9), содержащий геном rAAV по настоящему изобретению. Геномы rAAV не содержат ДНК rep и cap AAV, то есть между ITR геномов отсутствует ДНК rep или cap AAV. В некоторых вариантах осуществления геном rAAV представляет собой самокомплементарный геном. В некоторых вариантах осуществления геном rAAV представляет собой однонитевой геном. [0049] Thus, in another aspect of the present invention, an rAAV, such as rAAV9 (i.e., replication-defective rAAV9 infectious encapsulated particles) containing the rAAV genome of the present invention, is provided. The rAAV genomes do not contain rep and cap AAV DNA, i.e. there is no rep or cap AAV DNA between the ITR genomes. In some embodiments, the rAAV genome is a self-complementary genome. In some embodiments, the rAAV genome is a single stranded genome.
[0050] Предусмотрены такие rAAV, как самокомплементарный AAV9 (scAAV9) под названием "AVXS-201". Его генная кассета (нуклеотиды 151-2558 генома AVXS-201, изложенные под SEQ ID NO:1) содержит последовательно: промоторный фрагмент длиной 546 п. о. (SEQ ID NO:2) (нуклеотиды 74085586-74086323 из NC_000086.7 в обратной ориентации) из гена MECP2 мыши, интрон SV40, кДНК MECP2B человека (SEQ ID NO:3) (№ CCDS48193.1 в базе данных CCDS) и синтетическую последовательность сигнала полиаденилирования (SEQ ID NO:4). Генная кассета фланкирована мутантным инвертированным концевым повтором (ITR) AAV2 и инвертированным концевым повтором AAV2 дикого типа, которые совместно делают возможной упаковку самокомплементарных геномов AAV. Геном не содержит ДНК rep и cap AAV, то есть между ITR генома отсутствует ДНК rep или cap AAV. [0050] rAAVs such as the self-complementary AAV9 (scAAV9) called "AVXS-201" are provided. Its gene cassette (nucleotides 151-2558 of the AVXS-201 genome set forth under SEQ ID NO:1) contains in sequence: a 546 bp promoter fragment. (SEQ ID NO:2) (nucleotides 74085586-74086323 of NC_000086.7 in reverse orientation) from mouse MECP2 gene, SV40 intron, human MECP2B cDNA (SEQ ID NO:3) (CCDS #CCDS48193.1) and synthetic polyadenylation signal sequence (SEQ ID NO:4). The gene cassette is flanked by mutant AAV2 inverted terminal repeat (ITR) and wild-type AAV2 inverted terminal repeat, which together allow the packaging of self-complementary AAV genomes. The genome does not contain rep and cap AAV DNA, that is, there is no rep or cap AAV DNA between the ITRs of the genome.
[0051] Предусмотрены такие rAAV, как scAAV9 под названием "scAAV9.738.Mecp2ʺ. Его генная кассета (нуклеотиды 198-2890 генома scAAV9.738.Mecp2, изложенные под SEQ ID NO:5) содержит последовательно: промоторный фрагмент длиной 738 п. о. (SEQ ID NO:6) (нуклеотиды 74085586-74086323 из NC_000086.7 в обратной ориентации) из гена MECP2 мыши, интрон SV40, кДНК MECP2α мыши (SEQ ID NO:7) (№ CCDS41016.1 в базе данных CCDS) и последовательность сигнала полиаденилирования из гена бычьего гормона роста. Генная кассета фланкирована мутантным инвертированным концевым повтором (ITR) AAV2 и инвертированным концевым повтором AAV2 дикого типа, которые совместно делают возможной упаковку самокомплементарных геномов AAV. Геном не содержит ДНК rep и cap AAV, то есть между ITR генома отсутствует ДНК rep или cap AAV. [0051] rAAVs such as scAAV9 are provided under the name "scAAV9.738.Mecp2". Its gene cassette (nucleotides 198-2890 of the scAAV9.738.Mecp2 genome set forth under SEQ ID NO: 5) contains in sequence: a 738 bp promoter fragment. o (SEQ ID NO:6) (nucleotides 74085586-74086323 of NC_000086.7 in reverse orientation) from mouse MECP2 gene, SV40 intron, mouse MECP2α cDNA (SEQ ID NO:7) (CCDS #CCDS41016.1) and a polyadenylation signal sequence from the bovine growth hormone gene.The gene cassette is flanked by AAV2 mutant inverted terminal repeat (ITR) and wild-type AAV2 inverted terminal repeat, which together allow the packaging of self-complementary AAV genomes.The genome does not contain AAV rep and cap DNA, i.e. between ITR genome lacks AAV rep or cap DNA.
[0052] Консервативные нуклеотидные замены в геноме rAAV9 предусмотрены, в том числе без ограничения, в генной кассете генома rAAV9. Например, кДНК MECP2 в генной кассете может характеризоваться 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с кДНК MECP2α в scAAV9.738.Mecp2 или кДНК MECP2B в AVXS-201. [0052] Conservative nucleotide substitutions in the rAAV9 genome are provided, including without limitation, in the gene cassette of the rAAV9 genome. For example, the MECP2 cDNA in the gene cassette can be characterized by 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93% , 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% sequence identity with the MECP2α cDNA in scAAV9.738.Mecp2 or the MECP2B cDNA in AVXS-201.
[0053] В некоторых вариантах осуществления полипептид MECP2, кодируемый rAAV9 по настоящему изобретению, может представлять собой вариант полипептида MECP2. Вариант полипептида сохраняет активность MECP2 и имеет аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере приблизительно 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 или 99,5% идентична аминокислотной последовательности полипептида MECP2, кодируемого кДНК MECP2α в scAAV9.738.Mecp2 или кДНК MECP2B в AVXS-201. [0053] In some embodiments, the implementation of the MECP2 polypeptide encoded by rAAV9 of the present invention may be a variant of the MECP2 polypeptide. The polypeptide variant retains MECP2 activity and has an amino acid sequence that is at least about 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, or 99.5% identical to the amino acid sequence of the MECP2 polypeptide encoded by the MECP2α cDNA in scAAV9. 738.Mecp2 or MECP2B cDNA in AVXS-201.
[0054] rAAV можно очищать с помощью способов, стандартных в данной области техники, таких как колоночная хроматография или применение градиентов хлорида цезия. Способы очистки векторов rAAV от вируса-помощника известны из уровня техники и включают способы, раскрытые, например, в Clark et al., Hum. Gene Ther., 10(6): 1031-1039 (1999); Schenpp and Clark, Methods Mol. Med., 69: 427-443 (2002); патенте США № 6566118 и WO 98/09657. [0054] rAAV can be purified using methods standard in the art, such as column chromatography or the use of cesium chloride gradients. Methods for purifying rAAV vectors from helper virus are known in the art and include those disclosed, for example, in Clark et al., Hum. Gene Ther., 10(6): 1031-1039 (1999); Schenpp and Clark, Methods Mol. Med. 69 : 427-443 (2002); US patent No. 6566118 and WO 98/09657.
[0055] В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрены композиции, содержащие rAAV, такой как rAAV9, кодирующий полипептид MECP2. [0055] In another aspect of the present invention, compositions are provided that contain an rAAV, such as rAAV9, encoding a MECP2 polypeptide.
[0056] Композиции по настоящему изобретению содержат rAAV в фармацевтически приемлемом носителе. Композиции также могут содержать другие ингредиенты, такие как разбавители и вспомогательные средства. Приемлемые носители, разбавители и вспомогательные средства не оказывают токсического действия на пациентов, принимающих их, а также предпочтительно инертны при используемых дозировках и концентрациях и охватывают буферы, такие как фосфатный, цитратный или на основе других органических кислот; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота; низкомолекулярные полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, в том числе глюкозу, маннозу или декстрины; хелатообразующие средства, такие как EDTA; сахароспирты, такие как маннит или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; и/или неионное поверхностно-активные вещества, такие как Tween, плюроники или полиэтиленгликоль (PEG). [0056] Compositions of the present invention contain rAAV in a pharmaceutically acceptable carrier. The compositions may also contain other ingredients such as diluents and auxiliaries. Acceptable carriers, diluents and auxiliaries do not have a toxic effect on the patients taking them, and are also preferably inert at the dosages and concentrations used and include buffers such as phosphate, citrate or other organic acids; antioxidants such as ascorbic acid; low molecular weight polypeptides; proteins such as serum albumin, gelatin or immunoglobulins; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, arginine or lysine; monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates, including glucose, mannose or dextrins; chelating agents such as EDTA; sugar alcohols such as mannitol or sorbitol; salt-forming counterions such as sodium; and/or non-ionic surfactants such as Tween, pluronics or polyethylene glycol (PEG).
[0057] Стерильные инъекционные растворы готовят посредством включения rAAV в требуемом количестве в подходящий растворитель с различными другими ингредиентами, перечисленными выше, если потребуется, с последующей стерилизацией фильтрацией. Как правило, дисперсии получают путем включения простерилизованного активного ингредиента в стерильную среду-носитель, которая содержит основную дисперсионную среду и другие требуемые ингредиенты из перечисляемых выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами получения являются вакуумная сушка и методика лиофилизации, которые дают порошок активного ингредиента с любым дополнительным требуемым ингредиентом из их предварительного стерилизованного фильтрацией раствора. [0057] Sterile injectable solutions are prepared by incorporating the required amount of rAAV in a suitable solvent with various other ingredients listed above, if required, followed by filter sterilization. Typically, dispersions are prepared by incorporating the sterilized active ingredient into a sterile carrier medium which contains the basic dispersion medium and the other required ingredients listed above. In the case of sterile powders for the preparation of sterile injectable solutions, the preferred methods of preparation are vacuum drying and freeze-drying techniques which yield a powder of the active ingredient with any additional required ingredient from their pre-filtered sterile solution.
[0058] Титры и дозировки rAAV, подлежащие введению в способах по настоящему изобретению, будут варьироваться в зависимости, например, от конкретного rAAV, способа введения, цели лечения, индивидуума, времени введения и типа(типов) клеток, на которые оказывают целенаправленное воздействие, и их можно определить способами, стандартными для данной области техники. Титры могут находиться в диапазоне от приблизительно 1×106, приблизительно 1×107, приблизительно 1×108, приблизительно 1×109, приблизительно 1×1010, приблизительно 1×1011, приблизительно 1×1012, приблизительно 1×1013 до приблизительно 1×1014 или более устойчивых к ДНКазам частиц (DRP) на мл. Дозировки также могут быть выражены в единицах вирусных геномов (vg). Такие дозировки rAAV могут находиться в диапазоне от приблизительно 1×109 vg или более, приблизительно 1×1010 vg или более, приблизительно 1×1011 vg или более, приблизительно 1×1012 vg или более, приблизительно 6×1012 или более, приблизительно 1×1013 vg или более, приблизительно 1,3×1013 vg или более, приблизительно 1,4×1013 vg или более, приблизительно 2×1013 vg или более, приблизительно 3×1013 vg или более, приблизительно 6×1013 vg или более, приблизительно 1×1014 vg или более, приблизительно 3×1014 или более, приблизительно 6×1014 или более, приблизительно 1×1015 vg или более, приблизительно 3×1015 или более, приблизительно 6×1015 или более, приблизительно 1×1016 или более, приблизительно 3×1016 или более или приблизительно 6×1016 или более. В случае новорожденного дозировки rAAV могут находиться в диапазоне от приблизительно 1×109 vg или более, приблизительно 1×1010 vg или более, приблизительно 1×1011 vg или более, приблизительно 1×1012 vg или более, приблизительно 6×1012 или более, приблизительно 1×1013 vg или более, приблизительно 1,3×1013 vg или более, приблизительно 1,4×1013 vg или более, приблизительно 2×1013 vg или более, приблизительно 3×1013 vg или более, приблизительно 6×1013 vg или более, приблизительно 1×1014 vg или более, приблизительно 3×1014 или более, приблизительно 6×1014 или более, приблизительно 1×1015 vg или более, приблизительно 3×1015 или более, приблизительно 6×1015 или более, приблизительно 1×1016 или более, приблизительно 3×1016 или более или приблизительно 6×1016 или более. [0058] The titers and dosages of rAAV to be administered in the methods of the present invention will vary depending on, for example, the particular rAAV, route of administration, goal of treatment, individual, time of administration, and cell type(s) being targeted, and they can be determined by methods standard in the art. Titles can range from about 1x10 6 , about 1x10 7 , about 1x10 8 , about 1x10 9 , about 1x10 10 , about 1x10 11 , about 1x10 12 , about 1 x10 13 to about 1 x 10 14 or more DNase resistant particles (DRP) per ml. Dosages can also be expressed in units of viral genomes (vg). Such rAAV dosages may range from about 1x10 9 vg or more, about 1x10 10 vg or more, about 1x10 11 vg or more, about 1x10 12 vg or more, about 6x10 12 or more. more, about 1x10 13 vg or more, about 1.3x10 13 vg or more, about 1.4x10 13 vg or more, about 2x10 13 vg or more, about 3x10 13 vg or more , about 6x10 13 vg or more, about 1x10 14 vg or more, about 3x10 14 or more, about 6x10 14 or more, about 1x10 15 vg or more, about 3x10 15 or more more, about 6x10 15 or more, about 1x10 16 or more, about 3x10 16 or more, or about 6x10 16 or more. In the neonate, rAAV dosages may range from about 1x10 9 vg or more, about 1x10 10 vg or more, about 1x10 11 vg or more, about 1x10 12 vg or more, about 6x10 12 or more, about 1x10 13 vg or more, about 1.3x10 13 vg or more, about 1.4x10 13 vg or more, about 2x10 13 vg or more, about 3x10 13 vg or more, approximately 6×10 13 vg or more, approximately 1×10 14 vg or more, approximately 3×10 14 or more, approximately 6×10 14 or more, approximately 1×10 15 vg or more, approximately 3×10 15 or more, about 6x10 15 or more, about 1x10 16 or more, about 3x10 16 or more, or about 6x10 16 or more.
[0059] Способы по настоящему изобретению приводят к трансдукции целевых клеток (включая без ограничения нервные клетки или клетки глии). Термин "трансдукцияʺ используют для обозначения либо in vivo, либо in vitro введения/доставки полинуклеотида в целевую клетку с помощью дефектного по репликации инфекционного rAAV по настоящему изобретению, что приводит к экспрессии в реципиентной клетке функционального полипептида MECP2. [0059] the Methods of the present invention lead to the transduction of target cells (including, without limitation, nerve cells or glial cells). The term "transduction" is used to refer to either in vivo or in vitro introduction/delivery of a polynucleotide into a target cell by the replication-defective infectious rAAV of the present invention, resulting in the expression of a functional MECP2 polypeptide in the recipient cell.
[0060] Трансдукция клеток с применением rAAV по настоящему изобретению приводит к устойчивой экспрессии полипептида MECP2, кодируемого rAAV. В некоторых вариантах осуществления предусмотрен целевой уровень экспрессии, составляющий от приблизительно 75% до приблизительно 125% от нормального (или дикого типа) физиологического уровня экспрессии у субъекта, у которого отсутствует синдром Ретта. Целевой уровень экспрессии может составлять приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 100%, приблизительно 105%, приблизительно 110%, приблизительно 115%, приблизительно 120% или приблизительно 125% от нормального уровня экспрессии. [0060] Transduction of cells using rAAV of the present invention results in sustained expression of the rAAV-encoded MECP2 polypeptide. In some embodiments, the target expression level is from about 75% to about 125% of the normal (or wild-type) physiological expression level in a subject who does not have Rett syndrome. The target expression level may be about 75%, about 80%, about 85%, about 90%, about 95%, about 100%, about 105%, about 110%, about 115%, about 120%, or about 125% of normal. expression level.
[0061] В некоторых вариантах осуществления способов лечения по настоящему изобретению пациенту также вводят неионное низкоосмолярное контрастное средство. Такие контрастные средства охватывают без ограничения йобитридол, йогексол, йомепрол, йопамидол, йопентол, йопромид, йоверсол, йоксилан и смеси из двух или более контрастных средств. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления способы лечения дополнительно предусматривают введение пациенту йогексола. Неионное низкоосмолярное контрастное средство предусмотрено для увеличения трансдукции целевых клеток в центральной нервной системе пациента. Предусматривается, что трансдукция клеток увеличивается, когда rAAV по настоящему изобретению применяют в комбинации с контрастным средством, описываемым в данном документе, по сравнению с трансдукцией клеток, когда rAAV по настоящему изобретению применяют отдельно. В различных вариантах осуществления трансдукция клеток увеличивается на по меньшей мере приблизительно 1% или по меньшей мере приблизительно 5%, по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 100%, по меньшей мере приблизительно 120%, по меньшей мере приблизительно 150%, по меньшей мере приблизительно 180%, по меньшей мере приблизительно 200%, по меньшей мере приблизительно 250%, по меньшей мере приблизительно 300%, по меньшей мере приблизительно 350%, по меньшей мере приблизительно 400%, по меньшей мере приблизительно 450%, по меньшей мере приблизительно 500% или более, когда вектор по настоящему изобретению применяют в комбинации с контрастным средством, описываемым в данном документе, по сравнению с трансдукцией вектора по настоящему изобретению, когда его применяют не в комбинации с контрастным средством. В дополнительных вариантах осуществления трансдукция клеток увеличивается на величину, составляющую от приблизительно 10% до приблизительно 50%, или от приблизительно 10% до приблизительно 100%, или от приблизительно 5% до приблизительно 10%, или от приблизительно 5% до приблизительно 50%, или от приблизительно 1% до приблизительно 500%, или от приблизительно 10% до приблизительно 200%, или от приблизительно 10% до приблизительно 300%, или от приблизительно 10% до приблизительно 400%, или от приблизительно 100% до приблизительно 500%, или от приблизительно 150% до приблизительно 300%, или от приблизительно 200% до приблизительно 500%, когда вектор по настоящему изобретению применяют в комбинации с контрастным средством, описываемым в данном документе, по сравнению с трансдукцией вектора по настоящему изобретению, когда его применяют не в комбинации с контрастным средством. [0061] In some embodiments of the treatment methods of the present invention, a nonionic low osmolar contrast agent is also administered to the patient. Such contrast agents include, without limitation, iobitridol, iohexol, yomeprol, iopamidol, iopentol, iopromide, ioversol, joxylan, and mixtures of two or more contrast agents. Thus, in some embodiments, the methods of treatment further comprise administering iohexol to the patient. The non-ionic low osmolar contrast agent is provided to increase target cell transduction in the patient's central nervous system. It is contemplated that cell transduction is increased when the rAAV of the present invention is used in combination with the contrast agent described herein compared to cell transduction when the rAAV of the present invention is used alone. In various embodiments, cell transduction is increased by at least about 1%, or at least about 5%, at least about 10%, at least about 20%, at least about 30%, at least about 40%, at least about 50%, at least about 60%, at least about 70%, at least about 80%, at least about 90%, at least about 100%, at least about 120%, at least about 150%, at least about 180%, at least about 200%, at least about 250%, at least about 300%, at least about 350%, at least about 400%, at least at least about 450%, at least about 500%, or more when the vector of the present invention is used in combination with a contrast agent as described herein nte, compared with the transduction of the vector of the present invention, when it is not used in combination with a contrast agent. In further embodiments, cell transduction is increased by about 10% to about 50%, or about 10% to about 100%, or about 5% to about 10%, or about 5% to about 50%, or from about 1% to about 500%, or from about 10% to about 200%, or from about 10% to about 300%, or from about 10% to about 400%, or from about 100% to about 500%, or from about 150% to about 300%, or from about 200% to about 500%, when the vector of the present invention is used in combination with the contrast agent described herein, compared with transduction of the vector of the present invention when it is not used. in combination with a contrast agent.
[0062] В некоторых вариантах осуществления предусматривается, что трансдукция клеток увеличивается, когда пациента переводят в положение Тренделенбурга (положение головой вниз). В некоторых вариантах осуществления, например, пациента наклоняют в положение головой вниз на угол, составляющий от приблизительно 1 градуса до приблизительно 30 градусов, от приблизительно 15 до приблизительно 30 градусов, от приблизительно 30 до приблизительно 60 градусов, от приблизительно 60 до приблизительно 90 градусов или от приблизительно 90 до приблизительно 180 градусов) во время интратекальной инфузии вектора или после нее. В различных вариантах осуществления трансдукция увеличивается на по меньшей мере приблизительно 1% или по меньшей мере приблизительно 5%, по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 100%, по меньшей мере приблизительно 120%, по меньшей мере приблизительно 150%, по меньшей мере приблизительно 180%, по меньшей мере приблизительно 200%, по меньшей мере приблизительно 250%, по меньшей мере приблизительно 300%, по меньшей мере приблизительно 350%, по меньшей мере приблизительно 400%, по меньшей мере приблизительно 450%, по меньшей мере приблизительно 500% или более, когда применяют положение Тренделенбурга, описываемое в данном документе, по сравнению с ситуацией, когда положения Тренделенбурга не применяют. [0062] In some embodiments, it is contemplated that cell transduction is increased when the patient is placed in the Trendelenburg (head down) position. In some embodiments, for example, the patient is tilted into a head-down position through an angle of about 1 degree to about 30 degrees, about 15 to about 30 degrees, about 30 to about 60 degrees, about 60 to about 90 degrees, or from about 90 to about 180 degrees) during or after intrathecal vector infusion. In various embodiments, transduction is increased by at least about 1%, or at least about 5%, at least about 10%, at least about 20%, at least about 30%, at least about 40%, at least about 50%, at least about 60%, at least about 70%, at least about 80%, at least about 90%, at least about 100%, at least about 120%, at least at least about 150%, at least about 180%, at least about 200%, at least about 250%, at least about 300%, at least about 350%, at least about 400%, at least about 450%, at least about 500%, or more when the Trendelenburg position described herein is applied, compared to when the Trendelenburg position is applied. Elenburg is not used.
[0063] В дополнительных вариантах осуществления трансдукция клеток увеличивается на величину, составляющую от приблизительно 10% до приблизительно 50%, или от приблизительно 10% до приблизительно 100%, или от приблизительно 5% до приблизительно 10%, или от приблизительно 5% до приблизительно 50%, или от приблизительно 1% до приблизительно 500%, или от приблизительно 10% до приблизительно 200%, или от приблизительно 10% до приблизительно 300%, или от приблизительно 10% до приблизительно 400%, или от приблизительно 100% до приблизительно 500%, или от приблизительно 150% до приблизительно 300%, или от приблизительно 200% до приблизительно 500%, когда вектор по настоящему изобретению применяют в комбинации с контрастным средством и положением Тренделенбурга, описываемыми в данном документе, по сравнению с трансдукцией вектора по настоящему изобретению, когда его применяют не в комбинации с контрастным средством и положением Тренделенбурга. [0063] In further embodiments, cell transduction is increased by about 10% to about 50%, or about 10% to about 100%, or about 5% to about 10%, or about 5% to about 50%, or about 1% to about 500%, or about 10% to about 200%, or about 10% to about 300%, or about 10% to about 400%, or about 100% to about 500%, or from about 150% to about 300%, or from about 200% to about 500%, when the vector of the present invention is used in combination with the contrast agent and Trendelenburg position described herein, compared to the transduction of the vector of the present of the invention when it is not used in combination with a contrast agent and the Trendelenburg position.
[0064] В настоящем изобретении также предусмотрены варианты осуществления способа лечения, где интратекальное введение вектора по настоящему изобретению и контрастного средства в центральную нервную систему пациента, нуждающегося в этом, приводит к увеличению выживания пациента по сравнению с выживанием пациента, когда вектор по изобретению вводят в отсутствие контрастного средства. В различных вариантах осуществления введение вектора по настоящему изобретению и контрастного средства в центральную нервную систему пациента, нуждающегося в этом, приводит к увеличению выживания пациента на по меньшей мере приблизительно 1%, по меньшей мере приблизительно 5%, по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 100%, по меньшей мере приблизительно 150%, по меньшей мере приблизительно 200% или более по сравнению с выживанием пациента, когда вектор по настоящему изобретению вводят в отсутствие контрастного средства. [0064] The present invention also contemplates embodiments of a method of treatment wherein intrathecal administration of the vector of the present invention and a contrast agent into the central nervous system of a patient in need thereof results in increased patient survival compared to patient survival when the vector of the invention is administered into no contrast agent. In various embodiments, administration of a vector of the present invention and a contrast agent into the central nervous system of a patient in need thereof results in an increase in patient survival of at least about 1%, at least about 5%, at least about 10%, at least about 20%, at least about 30%, at least about 40%, at least about 50%, at least about 60%, at least about 70%, at least about 80%, at least at least about 90%, at least about 100%, at least about 150%, at least about 200% or more compared to patient survival when the vector of the present invention is administered in the absence of a contrast agent.
[0065] В настоящем изобретении также предусмотрены варианты осуществления способа лечения, где интратекальное введение вектора по настоящему изобретению и контрастного средства в центральную нервную систему пациента, нуждающегося в этом, который приведен в положение Тренделенбурга, приводит к дополнительному увеличению выживания пациента по сравнению с выживанием пациента, когда вектор по настоящему изобретению вводят в отсутствие контрастного средства и положения Тренделенбурга. В различных вариантах осуществления введение вектора по настоящему изобретению и контрастного средства в центральную нервную систему пациента, нуждающегося в этом, который приведен в положение Тренделенбурга, приводит к увеличению выживания пациента на по меньшей мере приблизительно 1%, по меньшей мере приблизительно 5%, по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 100%, по меньшей мере приблизительно 150%, по меньшей мере приблизительно 200% или более по сравнению с выживанием пациента, когда вектор по настоящему изобретению вводят в отсутствие контрастного средства и положения Тренделенбурга. [0065] The present invention also provides embodiments of a method of treatment wherein intrathecal administration of a vector of the present invention and a contrast agent into the central nervous system of a patient in need thereof, which is in Trendelenburg position, results in an additional increase in patient survival compared to patient survival. when the vector of the present invention is administered in the absence of a contrast agent and Trendelenburg position. In various embodiments, administration of the vector of the present invention and a contrast agent into the central nervous system of a patient in need thereof, which is placed in a Trendelenburg position, results in an increase in patient survival of at least about 1%, at least about 5%, at least at least about 10%, at least about 20%, at least about 30%, at least about 40%, at least about 50%, at least about 60%, at least about 70%, at least about 80%, at least about 90%, at least about 100%, at least about 150%, at least about 200% or more compared to patient survival when the vector of the present invention is administered in the absence of a contrast agent, and Trendelenburg positions.
ПримерыExamples
[0066] Настоящее изобретение проиллюстрировано с помощью нижеприведенного. [0066] The present invention is illustrated by the following.
Исследования для подтверждения механизма на модельных животных, представляющих собой самок и самцов мышей с синдромом Ретта, демонстрируют терапевтическую эффективность после внутривенного введения scAAV9.738.Mecp2 (пример 1).Mechanism validation studies in female and male mice with Rett syndrome demonstrate therapeutic efficacy following intravenous administration of scAAV9.738.Mecp2 (Example 1).
Для вектора генной терапии второго поколения, AVXS-201, продемонстрировано увеличение выживания в широком диапазоне доз после интрацеребровентрикулярной (ICV) обработки Mecp2 -/y мышей. Максимальное увеличение медианного выживания составляло 477% после обработки посредством AVXS-201 (пример 2).The second generation gene therapy vector, AVXS-201, has been shown to increase survival over a wide dose range after intracerebroventricular (ICV) treatment.Mecp2 -/y mice. The maximum increase in median survival was 477% after treatment with AVXS-201 (example 2).
Самцы Mecp2 -/y мышей, обработанные с помощью AVXS-201, демонстрировали стойкое улучшение поведения, как измерено с помощью обобщенной оценки, разработанной для мышей с синдромом Ретта (пример 3).MalesMecp2 -/y mice treated with AVXS-201 showed a sustained improvement in behavior as measured by a pooled score developed for mice with Rett syndrome (Example 3).
Фенотипическое преимущество у Mecp2 -/y мышей, обработанных с помощью AVXS-201, получают при умеренных уровнях экспрессии белка (пример 4).Phenotypic advantage inMecp2 -/y mice treated with AVXS-201 were obtained at moderate levels of protein expression (Example 4).
Обработка мышей дикого типа с помощью AVXS-201 хорошо переносилась при всех протестированных дозах, что согласуется с тем, что изменения в поведенческих баллах отмечались только в группе с высокими дозами (пример 5 и пример 6).Treatment of wild type mice with AVXS-201 was well tolerated at all doses tested, consistent with changes in behavioral scores only in the high dose group (Example 5 and Example 6).
Интратекальное введение дозы отличным от человека приматам свидетельствует о том, что AVXS-201 является безопасным и хорошо переносится на протяжении 18 месяцев после инъекции (пример 7).Intrathecal dosing in non-human primates indicates that AVXS-201 is safe and well tolerated up to 18 months after injection (Example 7).
AVXS-201 приводит к широкой экспрессии трансгена на физиологических уровнях в головном и спинном мозге отличных от человека приматов после однократной интратекальной инъекции (пример 8).AVXS-201 results in broad expression of the transgene at physiological levels in the brain and spinal cord of non-human primates after a single intrathecal injection (Example 8).
Пример 1Example 1
Исследование для подтверждения механизма генной терапии синдрома Ретта на самках мышей с синдромом РеттаStudy to Confirm Mechanism of Rett Syndrome Gene Therapy in Female Rett Syndrome Mice
[0067] В качестве исследования для подтверждения механизма самцов и самок мышей с симптомами синдрома Ретта обрабатывали посредством внутривенного введения scAAV9.738.Mecp2 [Garg et al., The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience, 33: 13612-13620 (2013)]. Рекомбинантный вирусный геном scAAV9.738.Mecp2 (SEQ ID NO:5) содержит промоторный фрагмент длиной 738 п. о. из гена Mecp2 мыши [Adachi et al., Human Molecular Genetics, 14: 3709-3722 (2005)], управляющий экспрессией кДНК Mecp2α мыши (№ CCDS41016.1 в базе данных CCDS), и сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста. Генная кассета (нуклеотиды 198-2890 из SEQ ID NO:5) фланкирована мутантным инвертированным концевым повтором (ITR) AAV2 и ITR дикого типа AAV2, которые делают возможной упаковку самокомплементарных геномов AAV. [0067] As a study to confirm the mechanism, male and female mice with symptoms of Rett syndrome were treated with intravenous administration of scAAV9.738.Mecp2 [Garg et al., The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience, 33 : 13612- 13620 (2013)]. The recombinant viral genome scAAV9.738.Mecp2 (SEQ ID NO:5) contains a 738 bp promoter fragment. from the mouse Mecp2 gene [Adachi et al., Human Molecular Genetics, 14 : 3709-3722 (2005)], driving expression of the mouse Mecp2α cDNA (CCDS No. CCDS41016.1), and the bovine growth hormone polyadenylation signal. The gene cassette (nucleotides 198-2890 of SEQ ID NO:5) is flanked by AAV2 mutant inverted terminal repeat (ITR) and wild-type AAV2 ITRs, which allow the packaging of self-complementary AAV genomes.
[0068] Самокомплементарный AAV9 (scAAV9) получали посредством процедур временной трансфекции с применением двухнитевого вектора на основе ITR AAV2 с плазмидой, кодирующей последовательность Rep2Cap9, как описано ранее [Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004)], совместно с аденовирусной плазмидой-помощником pHelper (Stratagene, Санта-Клара, Калифорния) в клетках 293. Для проведения экспериментов вирус получали тремя отдельными партиями и очищали с помощью двух стадий очистки в градиенте плотности хлорида цезия, диализировали против PBS, и составляли в смесь с 0,001% Pluronic-F68 для предупреждения агрегации вируса, и хранили при 4°C. У всех векторных препаратов определяли титр с помощью количественной ПЦР с применением технологии Taq-Man. Чистоту векторов оценивали с помощью электрофореза в акриламидном геле с добавлением 4-12% додецилсульфата натрия и окрашивания серебром (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). [0068] Self-complementary AAV9 (scAAV9) was generated by transient transfection procedures using a double-stranded AAV2 ITR-based vector with a plasmid encoding the Rep2Cap9 sequence as previously described [Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004) ], together with the adenoviral helper plasmid pHelper (Stratagene, Santa Clara, CA) in 293 cells. For experiments, virus was generated in three separate batches and purified using two cesium chloride density gradient purification steps, dialyzed against PBS, and formulated in mixture with 0.001% Pluronic-F68 to prevent virus aggregation, and stored at 4°C. All vector preparations were titered by quantitative PCR using Taq-Man technology. The purity of the vectors was assessed by 4-12% sodium dodecyl sulfate acrylamide gel electrophoresis and silver staining (Invitrogen, Carlsbad, CA).
[0069] Самцов мышей с нулевым аллелем Mecp2 обрабатывали внутривенной инъекцией, содержащей 3×1012 vg либо scAAV9.738.Mecp2, либо контрольного вектора scAAV9, в возрасте 4-6 недель. За животными наблюдали в отношении выживания и еженедельно оценивали в отношении фенотипического балла [Guy et al., Science, 315: 1143-1147 (2007)]. [0069] Mecp2 null male mice were treated with an intravenous injection containing 3x10 12 vg of either scAAV9.738.Mecp2 or scAAV9 control vector at 4-6 weeks of age. Animals were monitored for survival and assessed weekly for phenotypic score [Guy et al., Science, 315 : 1143-1147 (2007)].
Компоненты фенотипической оценки из публикации Guy et al. 2007. Phenotypic score components from Guy et al. 2007.
A. Подвижность. За мышью наблюдают при помещении ее на стол, а затем при осторожном прикосновении к ней рукой. 0=как у мыши дикого типа. 1=уменьшенное движение по сравнению с мышью дикого типа: увеличенный период замирания при первом помещении на стол и более длительные периоды, проводимые в неподвижном состоянии. 2=отсутствует самопроизвольное передвижение при помещении на стол; мышь может двигаться в ответ на нежное подталкивание или при помещении неподалеку гранулы корма. (Примечание: мыши могут стать более активными, когда находятся в условиях своей собственной клетки).A. Mobility. The mouse is observed by placing it on the table and then gently touching it with the hand. 0=similar to wild-type mouse. 1=reduced movement compared to wild-type mouse: increased freezing period when first placed on the table and longer periods spent immobile. 2=no spontaneous movement when placed on a table; the mouse may move in response to a gentle nudge or when a pellet of food is placed nearby. (Note: mice may become more active when in their own cage).
B. Походка. 0=как у мыши дикого типа. 1=при ходьбе или беге задние конечности раздвинуты шире, чем у мыши дикого типа, при этом уменьшено поднятие таза, что приводит к "ковыляющейʺ походке. 2=более серьезные аномалии: тремор при поднятии ног, ходьба назад или походка 'прыгающего кролика' за счет одновременного поднятия обеих задних ног.B. Gait. 0=similar to wild-type mouse. 1=when walking or running, the hind limbs are spread more widely than in the wild-type mouse, with reduced pelvic elevation resulting in a "waddling" gait. by raising both hind legs at the same time.
C. Поджатие задних конечностей. За мышью наблюдают, когда она находится в подвешенном состоянии и ее удерживают за основание хвоста. 0=ноги раскинуты наружу. 1=задние конечности приближены друг к другу (без соприкосновения), или одна нога приближена к туловищу. 2=обе ноги сильно сокращены, либо касаются друг друга, либо касаются туловища.C. Pretraction of the hind limbs. The mouse is observed while suspended and held by the base of the tail. 0=legs outstretched. 1 = hind limbs close together (no contact), or one leg close to the body. 2=both legs are strongly contracted, either touching each other or touching the torso.
D. Тремор. За мышью наблюдают, когда она стоит на уплощенной ладони руки. 0=тремор отсутствует. 1=прерывистый легкий тремор. 2*=постоянный тремор или прерывистый сильный треморD. Tremor. The mouse is observed when it stands on the flattened palm of the hand. 0=no tremor. 1=intermittent mild tremor. 2*=constant tremor or intermittent severe tremor
E. Дыхание. Наблюдают за движением боков, когда животное стоит на месте. 0=нормальное дыхание. 1=периоды регулярного дыхания, чередующиеся с короткими периодами более частого дыхания или с паузами в дыхании. 2*=очень нерегулярное дыхание - одышка или гиперпноэ.E. Breathing. Observe the movement of the sides when the animal is standing still. 0=normal breathing. 1=periods of regular breathing alternating with short periods of faster breathing or pauses in breathing. 2*=very irregular breathing - shortness of breath or hyperpnea.
F. Общее состояние. У мышей определяют показатели общего самочувствия, такие как состояние шерсти, глаза, положение тела. 0=чистая блестящая шерсть, чистые глаза, нормальное положение. 1=глаза тусклые, шерсть тусклая/неухоженная, несколько сгорбленное положение. 2*=глаза покрыты корками или сужены, пилоэрекция, сгорбленная поза.F. General condition. In mice, indicators of general well-being are determined, such as the condition of the coat, eyes, and body position. 0=clear shiny coat, clear eyes, normal posture. 1=eyes dull, coat dull/unkempt, slightly hunched over. 2*=eyes crusted or constricted, piloerection, hunched posture.
[0070] На фигуре 4 показано, что группа, обработанная посредством scAAV9.738.Mecp2, не достигла медианного выживания в период проведения эксперимента на момент публикации, но превосходила животных, обработанных контролем, более чем на 10 недель. Животные, обработанные посредством scAAV9.738.Mecp2, также характеризовались более низким поведенческим баллом по сравнению с животными, обработанными контролем. Эксперимент повторяли с пораженными самками мышей (фигура 5). Животных обрабатывали IV введением либо scAAV9.738.Mecp2, либо контроля, как перед этим поступали с самцами. Самок обрабатывали в возрасте 10-12 месяцев, когда у мышей с синдромом Ретта появлялись симптомы. За животными наблюдали в течение примерно 6 месяцев после инъекции и тестировали в отношении их фенотипического балла. Важно отметить, что для самок мышей с синдромом Ретта не характерна ранняя смертность, как в случае самцов с более тяжелым проявлением синдрома [Guy et al., Nature Genetics, 27: 322-326 (2001)]. Обработка посредством scAAV9.738.Mecp2 останавливала прогрессирование заболевания, и было показано снижение тяжести заболевания, при этом баллы уменьшались почти до 1. Это составляло резкий контраст с животными, обработанными контролем, которые закончили эксперимент с фенотипическими баллами примерно 6, что указывало на ухудшение симптомов (фигура 5C). Все данные, полученные на вращающемся барабане, в тесте "перевернутая сетка", тесте на платформе, а также на основе способности к устройству гнезда, подтверждали улучшение поведения у животных, обработанных посредством scAAV9.738.Mecp2, по сравнению с животными, обработанными контролем. Посмертный анализ головного мозга от самок, обработанных посредством scAAV9.738.Mecp2, показал, что показатели интенсивности флуоресценции при экспрессии MECP2 были идентичны таковым в головном мозге мышей дикого типа, что свидетельствовало о том, что экспрессия трансгена, вводимого в качестве генной терапии, была на примерно физиологических уровнях. [0070] Figure 4 shows that the scAAV9.738.Mecp2 treated group did not achieve median survival during the experiment at the time of publication, but outperformed control treated animals by more than 10 weeks. Animals treated with scAAV9.738.Mecp2 also had a lower behavioral score compared to control treated animals. The experiment was repeated with affected female mice ( Figure 5 ). Animals were treated IV with either scAAV9.738.Mecp2 or control, as previously done with males. Females were treated at 10-12 months of age when mice with Rett syndrome developed symptoms. Animals were observed for about 6 months after injection and tested for their phenotypic score. It is important to note that female mice with Rett syndrome do not show early mortality, as is the case with males with more severe manifestation of the syndrome [Guy et al., Nature Genetics, 27 : 322-326 (2001)]. Treatment with scAAV9.738.Mecp2 halted disease progression and a reduction in disease severity was shown, with scores dropping to almost 1. This was in sharp contrast to control-treated animals, which ended the experiment with a phenotypic score of approximately 6, indicating worsening symptoms. (figure 5C). All data from the spinning drum, inverted mesh test, platform test, and nesting ability confirmed improved behavior in scAAV9.738.Mecp2-treated animals compared to control-treated animals. Post-mortem analysis of brains from females treated with scAAV9.738.Mecp2 showed that fluorescence intensity readings when MECP2 was expressed were identical to those in the brains of wild-type mice, indicating that expression of the transgene administered as gene therapy was at physiological levels.
Пример 2Example 2
Доклинические исследования эффективности AVXS-201Preclinical Efficacy Studies of AVXS-201
[0071] Для повышения эффективности упаковки и для включения кДНК MECP2 человека, важной с клинической точки зрения, при сохранении физиологических уровней генной экспрессии повторно конструировали scAAV9.738.Mecp2 с более коротким промотором, кДНК MECP2B человека и синтетическим сигналом полиаденилирования. Повторно сконструированный геном упаковывался в капсиды AAV9, как описано ниже, и полученный scAAV затем получил название "AVXS-201ʺ (фигура 6). AVXS-201 изначально назывался "AAV9-P545-MeCP2''. [0071] To improve packaging efficiency and to incorporate the clinically important human MECP2 cDNA while maintaining physiological levels of gene expression, scAAV9.738.Mecp2 was reengineered with a shorter promoter, human MECP2B cDNA and a synthetic polyadenylation signal. The re-engineered genome was packaged into AAV9 capsids as described below and the resulting scAAV was then named "AVXS-201" ( Figure 6 ). AVXS-201 was originally named "AAV9-P545-MeCP2''.
Последовательность промоторной области (промоторный фрагмент гена MeCP2 мыши) (SEQ ID NO:2)Promoter Region Sequence (Mouse MeCP2 Gene Promoter Fragment) (SEQ ID NO:2)
GTGAACAACGCCAGGCTCCTCAACAGGCAACTTTGCTACTTCTACAGAAAATGATAATAAAGAAATGCTGGTGAAGTCAAATGCTTATCACAATGGTGAACTACTCAGCAGGGAGGCTCTAATAGGCGCCAAGAGCCTAGACTTCCTTAAGCGCCAGAGTCCACAAGGGCCCAGTTAATCCTCAACATTCAAATGCTGCCCACAAAACCAGCCCCTCTGTGCCCTAGCCGCCTCTTTTTTCCAAGTGACAGTAGAACTCCACCAATCCGCAGCTGAATGGGGTCCGCCTCTTTTCCCTGCCTAAACAGACAGGAACTCCTGCCAATTGAGGGCGTCACCGCTAAGGCTCCGCCCCAGCCTGGGCTCCACAACCAATGAAGGGTAATCTCGACAAAGAGCAAGGGGTGGGGCGCGGGCGCGCAGGTGCAGCAGCACACAGGCTGGTCGGGAGGGCGGGGCGCGACGTCTGCCGTGCGGGGTCCCGGCATCGGTTGCGCGCGCGCTCCCTCCTCTCGGAGAGAGGGCTGTGGTAAAACCCGTCCGGAAAACGTGAACAACGCCAGGCTCCTCAACAGGCAACTTTGCTACTTCTACAGAAAATGATAATAAAGAAATGCTGGTGAAGTCAAATGCTTATCACAATGGTGAACTACTCAGCAGGGAGGCTCTAATAGGCGCCAAGAGCCTAGACTTCCTTAAGCGCCAGAGTCCACAAGGGCCCAGTTAATCCTCAACATTCAAATGCTGCCCACAAAACCAGCCCCTCTGTGCCCTAGCCGCCTCTTTTTTCCAAGTGACAGTAGAACTCCACCAATCCGCAGCTGAATGGGGTCCGCCTCTTTTCCCTGCCTAAACAGACAGGAACTCCTGCCAATTGAGGGCGTCACCGCTAAGGCTCCGCCCCAGCCTGGGCTCCACAACCAATGAAGGGTAATCTCGACAAAGAGCAAGGGGTGGGGCGCGGGCGCGCAGGTGCAGCAGCACACAGGCTGGTCGGGAGGGCGGGGCGCGACGTCTGCCGTGCGGGGTCCCGGCATCGGTTGCGCGCGCGCTCCCTCCTCTCGGAGAGAGGGCTGTGGTAAAACCCGTCCGGAAAAC
Последовательность кодирующей области (cds MeCP2B человека) (SEQ ID NO:3)Coding region sequence (human MeCP2B cds) (SEQ ID NO:3)
ATGGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCGCCGAGCGGAGGAGGAGGAGGAGGCGAGGAGGAGAGACTGGAAGAAAAGTCAGAAGACCAGGACCTCCAGGGCCTCAAGGACAAACCCCTCAAGTTTAAAAAGGTGAAGAAAGATAAGAAAGAAGAGAAAGAGGGCAAGCATGAGCCCGTGCAGCCATCAGCCCACCACTCTGCTGAGCCCGCAGAGGCAGGCAAAGCAGAGACATCAGAAGGGTCAGGCTCCGCCCCGGCTGTGCCGGAAGCTTCTGCCTCCCCCAAACAGCGGCGCTCCATCATCCGTGACCGGGGACCCATGTATGATGACCCCACCCTGCCTGAAGGCTGGACACGGAAGCTTAAGCAAAGGAAATCTGGCCGCTCTGCTGGGAAGTATGATGTGTATTTGATCAATCCCCAGGGAAAAGCCTTTCGCTCTAAAGTGGAGTTGATTGCGTACTTCGAAAAGGTAGGCGACACATCCCTGGACCCTAATGATTTTGACTTCACGGTAACTGGGAGAGGGAGCCCCTCCCGGCGAGAGCAGAAACCACCTAAGAAGCCCAAATCTCCCAAAGCTCCAGGAACTGGCAGAGGCCGGGGACGCCCCAAAGGGAGCGGCACCACGAGACCCAAGGCGGCCACGTCAGAGGGTGTGCAGGTGAAAAGGGTCCTGGAGAAAAGTCCTGGGAAGCTCCTTGTCAAGATGCCTTTTCAAACTTCGCCAGGGGGCAAGGCTGAGGGGGGTGGGGCCACCACATCCACCCAGGTCATGGTGATCAAACGCCCCGGCAGGAAGCGAAAAGCTGAGGCCGACCCTCAGGCCATTCCCAAGAAACGGGGCCGAAAGCCGGGGAGTGTGGTGGCAGCCGCTGCCGCCGAGGCCAAAAAGAAAGCCGTGAAGGAGTCTTCTATCCGATCTGTGCAGGAGACCGTACTCCCCATCAAGAAGCGCAAGACCCGGGAGACGGTCAGCATCGAGGTCAAGGAAGTGGTGAAGCCCCTGCTGGTGTCCACCCTCGGTGAGAAGAGCGGGAAAGGACTGAAGACCTGTAAGAGCCCTGGGCGGAAAAGCAAGGAGAGCAGCCCCAAGGGGCGCAGCAGCAGCGCCTCCTCACCCCCCAAGAAGGAGCACCACCACCATCACCACCACTCAGAGTCCCCAAAGGCCCCCGTGCCACTGCTCCCACCCCTGCCCCCACCTCCACCTGAGCCCGAGAGCTCCGAGGACCCCACCAGCCCCCCTGAGCCCCAGGACTTGAGCAGCAGCGTCTGCAAAGAGGAGAAGATGCCCAGAGGAGGCTCACTGGAGAGCGACGGCTGCCCCAAGGAGCCAGCTAAGACTCAGCCCGCGGTTGCCACCGCCGCCACGGCCGCAGAAAAGTACAAACACCGAGGGGAGGGAGAGCGCAAAGACATTGTTTCATCCTCCATGCCAAGGCCAAACAGAGAGGAGCCTGTGGACAGCCGGACGCCCGTGACCGAGAGAGTTAGCTGAATGGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCGCCGAGCGGAGGAGGAGGAGGAGGCGAGGAGGAGAGACTGGAAGAAAAGTCAGAAGACCAGGACCTCCAGGGCCTCAAGGACAAACCCCTCAAGTTTAAAAAGGTGAAGAAAGATAAGAAAGAAGAGAAAGAGGGCAAGCATGAGCCCGTGCAGCCATCAGCCCACCACTCTGCTGAGCCCGCAGAGGCAGGCAAAGCAGAGACATCAGAAGGGTCAGGCTCCGCCCCGGCTGTGCCGGAAGCTTCTGCCTCCCCCAAACAGCGGCGCTCCATCATCCGTGACCGGGGACCCATGTATGATGACCCCACCCTGCCTGAAGGCTGGACACGGAAGCTTAAGCAAAGGAAATCTGGCCGCTCTGCTGGGAAGTATGATGTGTATTTGATCAATCCCCAGGGAAAAGCCTTTCGCTCTAAAGTGGAGTTGATTGCGTACTTCGAAAAGGTAGGCGACACATCCCTGGACCCTAATGATTTTGACTTCACGGTAACTGGGAGAGGGAGCCCCTCCCGGCGAGAGCAGAAACCACCTAAGAAGCCCAAATCTCCCAAAGCTCCAGGAACTGGCAGAGGCCGGGGACGCCCCAAAGGGAGCGGCACCACGAGACCCAAGGCGGCCACGTCAGAGGGTGTGCAGGTGAAAAGGGTCCTGGAGAAAAGTCCTGGGAAGCTCCTTGTCAAGATGCCTTTTCAAACTTCGCCAGGGGGCAAGGCTGAGGGGGGTGGGGCCACCACATCCACCCAGGTCATGGTGATCAAACGCCCCGGCAGGAAGCGAAAAGCTGAGGCCGACCCTCAGGCCATTCCCAAGAAACGGGGCCGAAAGCCGGGGAGTGTGGTGGCAGCCGCTGCCGCCGAGGCCAAAAAGAAAGCCGTGAAGGAGTCTTCTATCCGATCTGTGCAGGAGACCGTACTCCCCATCAAGAAGCGCAAGACCCGGGAGACGGTCAGCATCGAGGTCAAGGAAGTGGTGAAGC CCCTGCTGGTGTCCACCCTCGGTGAGAAGAGCGGGAAAGGACTGAAGACCTGTAAGAGCCCTGGGCGGAAAAGCAAGGAGAGCAGCCCCAAGGGGCGCAGCAGCAGCGCCTCCTCACCCCCCAAGAAGGAGCACCACCACCATCACCACCACTCAGAGTCCCCAAAGGCCCCCGTGCCACTGCTCCCACCCCTGCCCCCACCTCCACCTGAGCCCGAGAGCTCCGAGGACCCCACCAGCCCCCCTGAGCCCCAGGACTTGAGCAGCAGCGTCTGCAAAGAGGAGAAGATGCCCAGAGGAGGCTCACTGGAGAGCGACGGCTGCCCCAAGGAGCCAGCTAAGACTCAGCCCGCGGTTGCCACCGCCGCCACGGCCGCAGAAAAGTACAAACACCGAGGGGAGGGAGAGCGCAAAGACATTGTTTCATCCTCCATGCCAAGGCCAAACAGAGAGGAGCCTGTGGACAGCCGGACGCCCGTGACCGAGAGAGTTAGCTGA
Последовательность полиA (синтетическая) (SEQ ID NO:4)PolyA sequence (synthetic) (SEQ ID NO:4)
AATAAAAGATCTTTATTTTCATTAGATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGAATAAAAGATCTTTATTTTCATTAGATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGTG
[0072] scAAV9 получали посредством процедур временной трансфекции с применением двухнитевого вектора на основе ITR AAV2 с плазмидой, кодирующей последовательность Rep2Cap9, как описано ранее [Gao et al., выше], совместно с аденовирусной плазмидой-помощником pHelper (Stratagene, Санта-Клара, Калифорния) в клетках 293. Для проведения экспериментов вирус получали тремя отдельными партиями и очищали с помощью двух стадий очистки в градиенте плотности хлорида цезия, диализировали против PBS, и составляли в смесь с 0,001% Pluronic-F68 для предупреждения агрегации вируса, и хранили при 4°C. У всех векторных препаратов определяли титр с помощью количественной ПЦР с применением технологии Taq-Man. Чистоту векторов оценивали с помощью электрофореза в акриламидном геле с добавлением 4-12% додецилсульфата натрия и окрашивания серебром (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). [0072] scAAV9 was generated by transient transfection procedures using a double-stranded AAV2 ITR-based vector with a plasmid encoding the Rep2Cap9 sequence as previously described [Gao et al., supra], together with the adenovirus helper plasmid pHelper (Stratagene, Santa Clara, California) in 293 cells. For experiments, virus was generated in three separate batches and purified by two steps of cesium chloride density gradient purification, dialyzed against PBS, and formulated with 0.001% Pluronic-F68 to prevent virus aggregation, and stored at 4 °C All vector preparations were titered by quantitative PCR using Taq-Man technology. The purity of the vectors was assessed by 4-12% sodium dodecyl sulfate acrylamide gel electrophoresis and silver staining (Invitrogen, Carlsbad, CA).
[0073] Исследования эффективности и подбора дозы проводили на той же линии мышей с синдромом Ретта, что и на фигуре 4. Дозы в примере 1 и примеры 2 не сопоставимы из-за усовершенствований в способах определения титра. В экспериментах примера 1 применяли оптический способ определения титра вирусных препаратов, в то время как в исследованиях примера 2 и далее применяли более точный способ определения титра методом цифровой капельной ПЦР. Для имитации предложенного клинического пути доставки в виде интратекального введения эти инъекции проводили как интрацеребровентрикулярную (ICV) инъекцию детенышам в день 1 после рождения. Интратекальную доставку выбрали для доставки AVXS-201 непосредственно в нервную систему, которая является ключевым местом действия синдрома Ретта. За детенышами наблюдали в отношении их естественной жизни и оценивали в отношении выживания, обобщенного фенотипического балла, поведения в тесте "открытое поле" и на вращающемся барабане. Данные по выживанию в диапазоне доз в двулогарифмическом масштабе показаны на фигуре 7. Результаты, показанные на фигуре 7, демонстрируют, что комбинация векторов и методик, применяемых в способах лечения по настоящему изобретению, обеспечивает улучшенный результат. Все протестированные дозы увеличивали медианное выживание по сравнению с Mecp2 y/- мышами, обработанными контролем, при этом наблюдаемое максимальное индивидуальное выживание достигло 500 дней (и продолжается) по сравнению с 93 днями у мышей с синдромом Ретта, обработанных контролем. Самая большая медианная продолжительность жизни (315 дней) достигалась при умеренной дозе 1,44×1010 vg на животное. Данные показывают колоколообразный дозозависимый ответ (фигура 7В), что отличает результаты, полученные в данном документе, от эффектов неправильной дозировки (число копий гена) MECP2, наблюдаемых ранее [см., например, Lombardi et al., The Journal of Clinical Investigation, 125: 2914-2923 (2015)]. Важно отметить, что даже при самой высокой протестированной дозе обработка посредством AVXS-201 не укорачивала выживание Mecp -/y мышей по сравнению с обработкой контролем. [0073]Efficacy and dose titration studies were performed in the same strain of mice with Rett syndrome as infigure 4. The doses in example 1 and examples 2 are not comparable due to improvements in titer determination methods. In the experiments of example 1, an optical method for determining the titer of viral preparations was used, while in the studies of example 2 and further, a more accurate method for determining the titer by digital droplet PCR was used. To mimic the proposed intrathecal clinical delivery route, these injections were administered as an intracerebroventricular (ICV) injection to pups on
[0074] В дополнение к оценке выживания, обработанных и контрольных мышей еженедельно оценивали в отношении фенотипов синдрома Ретта (фенотипы, изложенные в предыдущем примере). У необработанные самцов фенотип быстро прогрессировал от балла 0 до среднего пика 5,25 к 10-недельному возрасту (фигура 8). В отличие от этого, у всех обработанных групп фенотипические баллы достигали только балла приблизительно 2 к 17-недельному возрасту, за исключением группы с 5,56×1010 vg, которая через 18 недель достигла балла 5. Обработанных и контрольных животных также оценивали в тестах "открытое поле" и на вращающемся барабане (фигура 9). Уменьшение самопроизвольного передвижения является симптомом синдрома Ретта у самцов мышей. Анализ в тесте "открытое поле" проводили для оценки самопроизвольного передвижения и скорости, когда группы достигали возраста 2-3 месяца. Пораженные животных характеризовались практически 43% уменьшением общего пройденного расстояния по сравнению с мышами дикого типа. Значительное увеличение пройденного расстояния отмечали у всех, за исключением двух, групп, обработанных посредством AVXS-201, по сравнению с нокаутными по Mecp2 самцами, обработанными контролем. Также значимо увеличивалась скорость в сравнении с нокаутными мышами, обработанными контролем. Это показывает, что обработка посредством AVXS-201 модельных мышей, представляющих собой самцов с синдромом Ретта, улучшала исследовательское поведение и способность к передвижению. Обработанных и контрольных животных тестировали в возрасте 3 месяцев в отношении показателей на вращающемся барабане, которые являются мерой координации движений. Животных тестировали в течение трех последовательных дней, и баллы усредняли по дням и дозе. Полученные данные представлены на фигуре 9С. У Mecp -/ y мышей, обработанных контролем, показатели на вращающемся барабане были значимо хуже, чем у однопометников дикого типа, обработанными контролем. Показатели на вращающемся барабане значимо улучшались в сравнении с контрольной обработкой в когортах 7,00×109 и 1,44×1010 vg. [0074]In addition to survival assessment, treated and control mice were assessed weekly for Rett syndrome phenotypes (phenotypes outlined in the previous example). In untreated males, the phenotype rapidly progressed from a score of 0 to a mean peak of 5.25 by 10 weeks of age (figure 8). In contrast, all treated groups only achieved a phenotypic score of approximately 2 at 17 weeks of age, except for the 5.56×1010 vg, which after 18 weeks reached a score of 5. Treated and control animals were also evaluated in the "open field" tests and on a rotating drum (figure 9). Decreased spontaneous locomotion is a symptom of Rett syndrome in male mice. An open field test was performed to assess spontaneous locomotion and speed when the groups reached 2-3 months of age. Affected animals were characterized by almost 43% reduction in total distance traveled compared to wild-type mice. A significant increase in walking distance was noted in all but two of the AVXS-201 treated groups compared to the knockout groups.Mecp2males treated with control. There was also a significant increase in speed compared to control-treated knockout mice. This shows that AVXS-201 treatment of male Rett syndrome model mice improved exploratory behavior and ambulation. Treated and control animals were tested at 3 months of age for tumbler performance, which is a measure of motor coordination. Animals were tested on three consecutive days and scores were averaged by day and dose. The data obtained are presented onfigure 9C. Atmecp -/ y control-treated mice performed significantly worse on the tumbler than control-treated wild-type littermates. Spinner scores improved significantly compared to control treatment in the 7.00 x 10 cohortsnine and 1.44×1010 vg.
Пример 3Example 3
Экспрессия белка MECP2 за счет AVXS-201 в головном мозге обработанных мышей с синдромом РеттаExpression of the MECP2 protein by AVXS-201 in the brain of treated mice with Rett syndrome
[0075] Через 3 недели после инъекции самцов дикого типа, обработанных посредством PBS, необработанных животных с синдромом Ретта и животных с синдромом Ретта, обработанных вектором, подвергали эвтаназии для проверки уровней белка MECP2 в головном мозге после ICV инъекции AVXS-201 в день 1 после рождения. Одно полушарие головного мозга гомогенизировали и анализировали с помощью вестерн-блоттинга для отслеживания экспрессии MECP2. Репрезентативный блот и результаты количественной оценки показаны на фигуре 10. После нормализации относительно головного мозга мышей дикого типа, обработанных PBS, группа нокаутных мышей и группа с дозой 1,75×109 vg AVXS-201 характеризовались отсутствием детектируемых уровней MECP2. Обработка посредством 3,50×109 vg и 7,00×109 vg приводила к детектируемым уровням MECP2, которые достигали ~1% и 3,6% от уровней дикого типа, соответственно. Наиболее эффективная доза, при измерении по увеличению медианного выживания (1,44×1010 vg), приводила к ~11% от уровней MeCP2 дикого типа. Доза 5,56×1010 vg, изученная с помощью вестерн-блоттинга, приводила к уровням MECP2, составляющим ~54% от уровней дикого типа, тогда как при дозе 1,13×1011 достигались более чем 2-кратные уровни от уровней дикого типа. Эти данные показывают, что уровень экспрессии белка и его распределение во всех участках головного мозга являются ключевыми для прогнозирования эффективности генной терапии посредством MECP2. [0075] 3 weeks post-injection, PBS-treated wild-type males, untreated Rett syndrome animals, and vector-treated Rett syndrome animals were euthanized to check MECP2 protein levels in the brain after ICV injection of AVXS-201 on
Пример 4Example 4
Обработка мышей дикого типа посредством AVXS-201 безопасна и хорошо переноситсяTreatment of wild-type mice with AVXS-201 is safe and well tolerated
[0076] Важной проблемой, касающейся заместительной терапии посредством MECP2, была оценка влияния на клетки, экспрессирующие интактную копию MECP2. AVXS-201 разрабатывали с учетом сказанного выше путем включения фрагмента промотора гена Mecp2 мыши для поддержки физиологической регуляции трансгена MECP2. Для тестирования безопасности AVXS-201 проводили анализ выживания и поведения на когортах мышей дикого типа, которые получали ICV инъекции AVXS-201 в P1, как в случае самцов мышей с синдромом Ретта. [0076] An important issue regarding replacement therapy with MECP2 has been the evaluation of the effect on cells expressing an intact copy of MECP2 . AVXS-201 was designed with the above in mind by incorporating a mouse Mecp2 gene promoter fragment to support physiological regulation of the MECP2 transgene. To test the safety of AVXS-201, a survival and behavioral analysis was performed on cohorts of wild-type mice that received ICV injections of AVXS-201 in P1, as in the case of male mice with Rett syndrome.
[0077] В общей сложности 131 самца мышей дикого типа обрабатывали различными ICV дозами AVXS-201 и наблюдали в отношении выживания (фигура 11). При целевой терапевтической дозе (1,44×1010 vg) ни одного случая смерти не регистрировали, при этом 21 обработанное животное оставалось живым вплоть до P342. Ни одного случая смерти не регистрировали в группе, обработанной PBS, и по одному случаю смерти регистрировали в каждой из групп, обработанных посредством 3,50×109, 2,78×1010 и 1,13×1011 vg. Оценка поведения с применением критериев из вставки 1 показывает, что группы, обработанные вектором, в большинстве характеризовались средними фенотипическими баллами <1. Средние совокупные баллы >1 отмечали лишь у двух групп с самыми высокими дозами (5,56×1010 и 1,13×1011 vg). Исследование в тесте "открытое поле" в возрасте 2-3 месяцев не показало статистической разницы между самцами дикого типа, обработанными вектором и PBS (фигура 12). Интересно отметить, что у когорты, обработанной 1,13×1011 vg, обнаружили значимое снижение показателей на вращающемся барабане в сравнении с мышами дикого типа, обработанными контролем, в возрасте трех месяцев. Эти данные позволяют предположить токсический эффект сверхэкспрессии MECP2 при самой высокой дозе AVXS-201. Взятые вместе, эти данные свидетельствуют о том, что в случае “наихудшего сценария”, если при обработке посредством AVXS-201 трансдуцируются только клетки дикого типа, при целевой терапевтической дозе наблюдается минимальное воздействие на выживание и поведение животных. [0077] A total of 131 wild-type male mice were treated with various ICV doses of AVXS-201 and observed for survival ( Figure 11 ). At the target therapeutic dose (1.44×10 10 vg), no deaths were recorded, with 21 treated animals remaining alive up to P342. No deaths were recorded in the PBS-treated group, and one death was recorded in each of the groups treated with 3.50×10 9 , 2.78×10 10 and 1.13×10 11 vg. Behavioral evaluation using the criteria in
Пример 5Example 5
Физиологические уровни MECP2 сохраняются в головном мозге мышей дикого типа, обработанных терапевтическими дозами AVXS-201Physiological levels of MECP2 are maintained in the brains of wild-type mice treated with therapeutic doses of AVXS-201
[0078] Для дополнительного исследования уровней, сопряженных с симптоматической сверхэкспрессией MECP2, самцы мышей дикого типа получали ICV инъекции PBS или AVXS-201 P1 из расчета терапевтической целевой дозы 1,44×1010 vg или самой высокой тестируемой дозы 1,13×1011 vg. Животных подвергали эвтаназии через 3 недели после инъекции и головной мозг животных собирали для проведения вестерн-блоттинга. Для целей сравнения блоттинг тканей производили параллельно с образцами головного мозга мышиной модели со сверхэкспрессией MECP2 под названием Tg3. Головной мозг рассекали на отдельные области (Cb=мозжечок, Med=продолговатый мозг, Hipp=гиппокамп, Ctx=кора головного мозга и Mid=средний мозг; фигура 13) и эти отдельные области гомогенизировали для проведения блоттинга. Данные нормализовали относительно уровней MECP2 в головном мозге мышей дикого типа, обработанных посредством PBS. При обработке целевой терапевтической дозой (1,44×1010 vg) для всех исследованных областей характерны уровни MECP2, составляющие от 1 до 1,5x от уровней в тканях животных дикого типа. При высокой дозе (1,13×1011 vg) уровни находились в диапазоне 1,31-2,56x от уровней дикого типа, но не достигала 2,31-3,93x уровней, характерных для тканей от Tg3. Эти данные, вместе с данными по поведению и выживанию, продемонстрированными ранее, вселяют уверенность в том, что при введении в целевой дозе AVXS-201 экспрессирует белок практически на физиологических уровнях. Важно отметить, что при введении терапевтической дозы не наблюдали приближение к 2-кратным уровням белка, которые сопряжены с синдромом дупликации MECP2. Это показывает безопасность подхода замещения MECP2 с применением генной терапии. [0078] To further investigate the levels associated with symptomatic MECP2 overexpression, wild-type male mice received ICV injections of PBS or AVXS-201 P1 at a therapeutic target dose of 1.44×10 10 vg or the highest tested dose of 1.13×10 11 vg. Animals were euthanized 3 weeks after injection and animal brains were harvested for Western blotting. For comparison purposes, tissue blotting was performed in parallel with brain samples from a MECP2 overexpressing mouse model called Tg3. The brain was dissected into distinct regions (Cb=cerebellum, Med=medulla oblongata, Hipp=hippocampus, Ctx=cortex and Mid=midbrain; FIG. 13 ) and these distinct regions were homogenized for blotting. Data were normalized for MECP2 brain levels in PBS-treated wild-type mice. When treated at the target therapeutic dose (1.44×10 10 vg), all areas examined exhibited MECP2 levels ranging from 1 to 1.5x the levels in tissues of wild-type animals. At the high dose (1.13x10 11 vg), levels ranged from 1.31-2.56x wild-type levels, but did not reach the 2.31-3.93x tissue levels from Tg3. These data, together with the behavioral and survival data previously demonstrated, provide confidence that, when administered at a targeted dose, AVXS-201 expresses the protein at near physiological levels. Importantly, no approach to the 2-fold protein levels that are associated with MECP2 duplication syndrome was observed upon administration of the therapeutic dose. This shows the safety of the MECP2 replacement approach using gene therapy.
Пример 6Example 6
Масса тела, гематологические и биохимические показатели сыворотки у отличных от человека приматов не были отягощены вплоть до 18 месяцев после интратекальной инъекции AVXS-201Body weight, serum hematology, and biochemistry were not compromised in non-human primates up to 18 months after intrathecal injection of AVXS-201
[0079] Для изучения безопасности и переносимости AVXS-201 и сопряженной с ними процедуры интратекальной инъекции за тремя обработанными самцами яванского макака наблюдали в течение 18 месяцев после инъекции. Параметры введения дозы показаны в таблице 2. [0079] To study the safety and tolerability of AVXS-201 and the associated intrathecal injection procedure, three treated male cynomolgus monkeys were observed for 18 months post-injection. Dosing parameters are shown in Table 2 .
[0080] Двух животных обрабатывали предполагаемой терапевтической дозой (эквивалент ~1,44×109 vg на кг массы тела) и одно получало в ~2 раза более низкую дозу (эквивалент ~7,00×108 vg на кг массы тела). Процедура интратекальной инъекции была ранее описана в Meyer et al., Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy, 23: 477-487 (2015). Вкратце, вектор смешивали с контрастным средством для проверки распределения вектора. Подвергнутого анестезии субъекта помещали в положение лежа на боку и готовили место для инъекции по средней линии спины на уровне ~L4/5 (ниже конуса спинного мозга). В стерильных условиях вводили иглу для спинномозговой пункции со стилетом и катетеризацию подпаутинного пространства подтверждали при вытекании прозрачной CSF из иглы. Для снижения давления в подпаутинном пространстве сливали 0,8 мл CSF и сразу же после этого инъецировали раствор с вектором. После инъекции животных удерживали в положении Тренделенбурга и их тело наклоняли головой вниз в течение 10 минут. Подвергаемым обработке животным дозу вводили в возрасте 6 или 12 месяцев, данные о массе тела, числе форменных элементов крови и биохимических показателях сыворотки собирали ежемесячно в течение первых 6 месяцев после инъекции и раз в два месяца впоследствии. Масса тела показана на фигуре 14, число форменных элементов крови показано на фигуре 15, а биохимические показатели сыворотки показаны на фигурах 16 и 17, при этом они нанесены на график со значениями от обработанных контролем животных из той же колонии в фонде Маннхеймера (Хомстед, Флорида). Таким образом, масса тела, число клеток и показатели сыворотки крови у обработанных вектором животных соответствовали таковым у обработанных контролем животных. У рассматриваемого животного отсутствовали значения, которые в значительной степени отклонялись от значений контроля на протяжении более чем 2 последовательных наблюдений, за исключением уровня амилазы, который был выше у двух обработанных вектором животных на исходном уровне. Эти данные показывают, что AVXS-201 и процедура интратекальной инъекцией безопасны и хорошо переносятся. [0080] Two animals were treated with the intended therapeutic dose (equivalent to ~1.44×10 9 vg per kg of body weight) and one received a ˜2-fold lower dose (equivalent to ~7.00×10 8 vg per kg of body weight). The intrathecal injection procedure was previously described in Meyer et al., Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy, 23 : 477-487 (2015). Briefly, the vector was mixed with a contrast agent to check the distribution of the vector. The anesthetized subject was placed in a lateral supine position and the injection site was prepared in the midline of the back at ~L4/5 (below the cone of the spinal cord). Under sterile conditions, a lumbar puncture needle with a stylet was inserted and subarachnoid catheterization was confirmed when clear CSF leaked from the needle. To reduce the pressure in the subarachnoid space, 0.8 ml of CSF was decanted and immediately after that the solution with the vector was injected. After the injection, the animals were kept in the Trendelenburg position and their bodies were tilted head down for 10 minutes. Treated animals were dosed at 6 or 12 months of age, and data on body weight, blood cell count, and serum chemistry were collected monthly for the first 6 months after injection and bimonthly thereafter. Body weight is shown in Figure 14 , blood cell counts are shown in Figure 15 , and serum chemistry are shown in Figures 16 and 17 , plotted with values from control-treated animals from the same colony at the Mannheimer Foundation (Homstead, FL). ). Thus, the body weight, cell number and blood serum parameters of the animals treated with the vector corresponded to those of the animals treated with the control. The animal in question had no values that deviated significantly from control values over more than 2 consecutive observations, except for the amylase level, which was higher in the two vector-treated animals at baseline. These data show that AVXS-201 and the intrathecal injection procedure are safe and well tolerated.
Пример 7Example 7
Гистопатологический анализ тканей отличных от человека приматов после интратекальной инъекции AVXS-201Histopathological Analysis of Non-Human Primate Tissues Following Intrathecal Injection of AVXS-201
[0081] В дополнение к in vivo анализу (пример 6) и посмертному анализу (пример 8) образцы висцеральных тканей и тканей нервной системы от животных 15C38, 15C49 и 15C34 (таблица 1) отправляли в GEMpath Inc. (Лонгмонт, Колорадо) для заливки парафином, изготовления срезов и окрашивания гематоксилином и эозином. Остальные животные (таблица 8.2) все еще живы, и их ткани будут отправлены на анализ по окончании исследования. Микроскопические препараты были проанализированы и отчеты подготовлены сертифицированным ветеринарным патоморфологом из экспертного совета компании GEMpath. Ткани, из которых отбирали образцы и которые изучали, показаны в таблице 3. В гистологическом заключении отмечается, что обработка посредством AVXS-201 не индуцировала развития очагов поражения в каких-либо из указанных в протоколе тканях на момент времени 6 недель или 18 месяцев. [0081] In addition to in vivo analysis (Example 6) and post-mortem analysis (Example 8), visceral and nervous system tissue samples from 15C38, 15C49, and 15C34 animals (Table 1) were sent to GEMpath Inc. (Longmont, Colorado) for paraffin embedding, sectioning, and staining with hematoxylin and eosin. The rest of the animals (Table 8.2) are still alive and their tissues will be sent for analysis at the end of the study. Slides were analyzed and reports prepared by a certified veterinary pathologist on the GEMpath Expert Council. The tissues that were sampled and studied are shown in Table 3 . The histological report noted that AVXS-201 treatment did not induce the development of lesions in any of the tissues specified in the protocol at the time point of 6 weeks or 18 months.
Пример 8Example 8
Физиологические уровни MeCP2 в головном мозге отличных от человека приматов после интратекальной инъекции AVXS-201Physiological levels of MeCP2 in the brain of non-human primates after intrathecal injection of AVXS-201
[0082] Два 12-месячных самца яванского макака получали интратекальные инъекции, содержащие 7,7×1012 vg/кг AVXS-201, как описано выше. Животных поддерживали в течение шести недель после инъекции, а потом подвергали эвтаназии для анализа экспрессии MeCP2. Выбранные области головного мозга анализировали в отношении общей экспрессии MeCP2 с помощью иммуногистохимического анализа (фигура 18). Явного повышения содержания MeCP2 не выявляли ни в кортикальных и подкорковых областях, ни вблизи места инъекции (поясничный отдел спинного мозга). Важно отметить, что эти данные также не показали никаких чрезвычайных аномалий в тканях животных, которые получали инъекцию AVXS-201. Для дополнительного исследования экспрессии трансгена области головного мозга гомогенизировали и сравнивали с ретроспективной контрольной тканью животных из той же колонии (фигура 19). Образцы затылочной и височной коры, гипоталамуса, поясничного отдела спинного мозга, таламуса, миндалины, гиппокампа и мозжечка анализировали с помощью вестерн-блоттинга в отношении общей экспрессии MeCP2. Для всех исследованных областей превышение уровня экспрессии MeCP2 ≥2x в сравнении с контролями не было показано ни для одной из областей. Повышение содержания MeCP2 выявили в гипоталамусе и миндалине, которые являются областями, расположенными вблизи 3го желудочка и бокового желудочка, соответственно, но не в мозжечке. Кроме того, в поясничном отделе спинного мозга, который расположен вблизи места инъекции, не показано повышение уровней MeCP2. Эти данные позволяют предположить, что комбинация дозы вируса и конструкции экспрессии регулируют экспрессию MECP2. Кроме того, in situ гибридизацию (ISH) проводили для обнаружения полученного за счет вектора транскрипта и определения его распределения в головном мозге через 6 недель и 18 месяцев после инъекции (фигуры 20 и 21). Для всех исследованных областей головного и спинного мозга (затылочная кора, височная кора, гиппокамп, мозолистое тело, таламус, хвостатое ядро, скорлупа, верхнее двухолмие, варолиев мост, продолговатый мозг, мозжечок, шейный, грудной и поясничный отделы спинного мозга) показана экспрессия транскрипта, полученного за счет вектора, который отсутствовал в тканях животных, обработанных контролем. Эти данные показывают специфичность зонда для ISH в отношении транскрипта MECP2, полученного за счет вектора, и показывают, что промоторная конструкция AVXS-201 функциональна в ткани нервной системы NHP. Эти данные показывают, что при введении посредством люмбальной пункции AVXS-201 широко распределяется по всем областям ЦНС и экспрессируется на физиологических уровнях. [0082] Two 12-month-old male cynomolgus monkeys received intrathecal injections containing 7.7×10 12 vg/kg AVXS-201 as described above. Animals were maintained for six weeks post-injection and then euthanized for analysis of MeCP2 expression. Selected brain regions were analyzed for total MeCP2 expression by immunohistochemical analysis ( Figure 18 ). A clear increase in the content of MeCP2 was not detected either in the cortical and subcortical areas, or near the injection site (lumbar spinal cord). Importantly, these data also did not show any extreme abnormalities in the tissues of the animals that received the AVXS-201 injection. For further investigation of transgene expression, brain regions were homogenized and compared with retrospective control animal tissue from the same colony ( Figure 19 ). Samples from the occipital and temporal cortex, hypothalamus, lumbar spinal cord, thalamus, amygdala, hippocampus, and cerebellum were analyzed by Western blotting for total MeCP2 expression. For all studied areas, the excess of MeCP2 expression level ≥2x in comparison with controls was not shown for any of the areas. An increase in MeCP2 was detected in the hypothalamus and amygdala, which are regions located near the 3rd ventricle and lateral ventricle, respectively, but not in the cerebellum. In addition, the lumbar region of the spinal cord, which is located near the injection site, does not show an increase in MeCP2 levels. These data suggest that the combination of virus dose and expression construct regulates MECP2 expression. In addition, in situ hybridization (ISH) was performed to detect the vector-derived transcript and determine its distribution in the brain at 6 weeks and 18 months after injection ( Figures 20 and 21 ). For all studied areas of the brain and spinal cord (occipital cortex, temporal cortex, hippocampus, corpus callosum, thalamus, caudate nucleus, putamen, superior colliculus, pons varolii, medulla oblongata, cerebellum, cervical, thoracic and lumbar spinal cord), transcript expression was shown obtained from a vector that was absent in the tissues of animals treated with control. These data show the specificity of the ISH probe for the vector-derived MECP2 transcript and show that the AVXS-201 promoter construct is functional in NHP nervous system tissue. These data show that when administered via lumbar puncture, AVXS-201 is widely distributed throughout the CNS and expressed at physiological levels.
Раскрытие из предварительной заявки на патент № 62/423618Disclosure from Provisional Patent Application No. 62/423618
Генная терапия синдрома РеттаGene therapy for Rett syndrome
Генная терапия, направленная на восстановление транскрипционного фактора MeCP2, по-видимому, является реалистичной стратегией для лечения синдрома Ретта, прогрессирующего нарушения развития нервной системы, приводящего к выраженному аутистическому поведению, утрате двигательной функции и ранней смерти. Авторы настоящего изобретения разработали аденоассоциированный вирус серотипа 9 (AAV9), экспрессирующий MECP2 человека под контролем усеченного эндогенного промотора. Задача данной работы заключается в оценке эффективности и безопасности данного вектора на мышах (с нулевым аллелем MeCP2 и дикого типа) и отличных от человека приматах. В рамках продолжения исследования нашей целью является перенесение данного лечения из лаборатории к постели больного.Gene therapy aimed at restoring the transcription factor MeCP2 appears to be a realistic strategy for the treatment of Rett syndrome, a progressive neurodevelopmental disorder leading to marked autistic behavior, loss of motor function, and early death. The present inventors have developed an adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) expressing human MECP2 under the control of a truncated endogenous promoter. The aim of this work is to evaluate the efficacy and safety of this vector in mice (MeCP2 null and wild type) and non-human primates. As part of the continuation of the study, our goal is to transfer this treatment from the laboratory to the patient's bedside.
--->--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ SEQUENCE LIST
<110> КАСПАР, Брайан, К. et al.<110> CASPAR, Brian, K. et al.
<120> ИНТРАТЕКАЛЬНАЯ ДОСТАВКА РЕКОМБИНАНТНОГО АДЕНОАССОЦИИРОВАННОГО ВИРУСА,<120> INTRATHECAL DELIVERY OF RECOMBINANT ADENO-ASSOCIATED VIRUS,
КОДИРУЮЩЕГО МЕТИЛ-CPG-СВЯЗЫВАЮЩИЙ БЕЛОК 2ENCODING METHYL
<130> 28335/50215PCT<130> 28335/50215PCT
<160> 8<160> 8
<170> PatentIn версия 3.5<170> PatentIn version 3.5
<210> 1<210> 1
<211> 2558<211> 2558
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический полинуклеотид<223> Synthetic polynucleotide
<220><220>
<221> другой_признак<221> other_attribute
<223> Геном AVXS-201<223> Genome AVXS-201
<220><220>
<221> другой_признак<221> other_attribute
<222> (1)..(106)<222> (1)..(106)
<223> Мутантный ITR<223> Mutant ITR
<220><220>
<221> другой_признак<221> other_attribute
<222> (151)..(699)<222> (151)..(699)
<223> Промоторный фрагмент из 546 нуклеотидов<223> 546 bp promoter fragment
<220><220>
<221> другой_признак<221> other_attribute
<222> (729)..(827)<222> (729)..(827)
<223> Интрон SV40<223> SV40 intron
<220><220>
<221> другой_признак<221> other_attribute
<222> (848)..(2344)<222> (848)..(2344)
<223> cds hMECP2B<223> cds hMECP2B
<220><220>
<221> другой_признак<221> other_attribute
<222> (2345)..(2393)<222> (2345)..(2393)
<223> Синтетический pA<223> Synthetic pA
<220><220>
<221> другой_признак<221> other_attribute
<222> (2418)..(2558)<222> (2418)..(2558)
<223> ITR<223> ITR
<400> 1<400> 1
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60ctgcgcgctc ggcgctcac tgaggccgcc
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggaatt cacgcgtgga 120ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggaatt cacgcgtgga 120
tctgaattca attcacgcgt ggtaccacgc gtgaacaacg ccaggctcct caacaggcaa 180tctgaattca attcacgcgt ggtaccacgc gtgaacaacg ccaggctcct caacaggcaa 180
ctttgctact tctacagaaa atgataataa agaaatgctg gtgaagtcaa atgcttatca 240ctttgctact tctacagaaa atgataataa agaaatgctg gtgaagtcaa atgcttatca 240
caatggtgaa ctactcagca gggaggctct aataggcgcc aagagcctag acttccttaa 300caatggtgaa ctactcagca gggaggctct aataggcgcc aagagcctag acttccttaa 300
gcgccagagt ccacaagggc ccagttaatc ctcaacattc aaatgctgcc cacaaaacca 360gcgccagagt ccacaagggc ccagttaatc ctcaacattc aaatgctgcc cacaaaacca 360
gcccctctgt gccctagccg cctctttttt ccaagtgaca gtagaactcc accaatccgc 420gcccctctgt gccctagccg cctctttttt ccaagtgaca gtagaactcc accaatccgc 420
agctgaatgg ggtccgcctc ttttccctgc ctaaacagac aggaactcct gccaattgag 480agctgaatgg ggtccgcctc ttttccctgc ctaaacagac aggaactcct gccaattgag 480
ggcgtcaccg ctaaggctcc gccccagcct gggctccaca accaatgaag ggtaatctcg 540ggcgtcaccg ctaaggctcc gccccagcct gggctccaca accaatgaag ggtaatctcg 540
acaaagagca aggggtgggg cgcgggcgcg caggtgcagc agcacacagg ctggtcggga 600acaaagagca aggggtgggg cgcgggcgcg caggtgcagc agcacacagg ctggtcggga 600
gggcggggcg cgacgtctgc cgtgcggggt cccggcatcg gttgcgcgcg cgctccctcc 660gggcggggcg cgacgtctgc cgtgcggggt cccggcatcg gttgcgcgcg cgctccctcc 660
tctcggagag agggctgtgg taaaacccgt ccggaaaacg cgtcgaaggg cgaattctgc 720tctcggagag agggctgtgg taaaacccgt ccggaaaacg cgtcgaaggg cgaattctgc 720
agataactgg taagtttagt cttttttgtc ttttatttca ggtcccggat ccggtggtgg 780agataactgg taagtttagt cttttttgtc ttttatttca ggtcccggat ccggtggtgg 780
tgcaaatcaa agaactgctc ctcagtcgat gttgccttta cttctaggcc tgtacggaag 840tgcaaatcaa agaactgctc ctcagtcgat gttgccttta cttctaggcc tgtacggaag 840
tgttactatg gccgccgccg ccgccgccgc gccgagcgga ggaggaggag gaggcgagga 900tgttactatg gccgccgccg ccgccgccgc gccgagcgga ggaggaggag gaggcgagga 900
ggagagactg gaagaaaagt cagaagacca ggacctccag ggcctcaagg acaaacccct 960ggagagactg gaagaaaagt cagaagacca ggacctccag ggcctcaagg acaaacccct 960
caagtttaaa aaggtgaaga aagataagaa agaagagaaa gagggcaagc atgagcccgt 1020caagtttaaa aaggtgaaga aagataagaa agaagagaaa gagggcaagc atgagcccgt 1020
gcagccatca gcccaccact ctgctgagcc cgcagaggca ggcaaagcag agacatcaga 1080gcagccatca gcccaccact ctgctgagcc cgcagaggca ggcaaagcag agacatcaga 1080
agggtcaggc tccgccccgg ctgtgccgga agcttctgcc tcccccaaac agcggcgctc 1140agggtcaggc tccgccccgg ctgtgccgga agcttctgcc tcccccaaac agcggcgctc 1140
catcatccgt gaccggggac ccatgtatga tgaccccacc ctgcctgaag gctggacacg 1200catcatccgt gaccggggac ccatgtatga tgaccccacc ctgcctgaag gctggacacg 1200
gaagcttaag caaaggaaat ctggccgctc tgctgggaag tatgatgtgt atttgatcaa 1260gaagcttaag caaaggaaat ctggccgctc tgctgggaag tatgatgtgt atttgatcaa 1260
tccccaggga aaagcctttc gctctaaagt ggagttgatt gcgtacttcg aaaaggtagg 1320tccccaggga aaagcctttc gctctaaagt ggagttgatt gcgtacttcg aaaaggtagg 1320
cgacacatcc ctggacccta atgattttga cttcacggta actgggagag ggagcccctc 1380cgacacatcc ctggacccta atgattttga cttcacggta actgggag ggagcccctc 1380
ccggcgagag cagaaaccac ctaagaagcc caaatctccc aaagctccag gaactggcag 1440ccggcgagag cagaaaccac ctaagaagcc caaatctccc aaagctccag gaactggcag 1440
aggccgggga cgccccaaag ggagcggcac cacgagaccc aaggcggcca cgtcagaggg 1500aggccggggga cgccccaaag ggagcggcac cacgagaccc aaggcggcca cgtcagaggg 1500
tgtgcaggtg aaaagggtcc tggagaaaag tcctgggaag ctccttgtca agatgccttt 1560tgtgcaggtg aaaagggtcc tggagaaaag tcctgggaag ctccttgtca agatgccttt 1560
tcaaacttcg ccagggggca aggctgaggg gggtggggcc accacatcca cccaggtcat 1620tcaaacttcg ccagggggca aggctgaggg gggtggggcc accacatcca cccaggtcat 1620
ggtgatcaaa cgccccggca ggaagcgaaa agctgaggcc gaccctcagg ccattcccaa 1680ggtgatcaaa cgccccggca ggaagcgaaa agctgaggcc gaccctcagg ccattcccaa 1680
gaaacggggc cgaaagccgg ggagtgtggt ggcagccgct gccgccgagg ccaaaaagaa 1740gaaacggggc cgaaagccgg ggagtgtggt ggcagccgct gccgccgagg ccaaaaagaa 1740
agccgtgaag gagtcttcta tccgatctgt gcaggagacc gtactcccca tcaagaagcg 1800agccgtgaag gagtcttcta tccgatctgt gcaggagacc gtactcccca tcaagaagcg 1800
caagacccgg gagacggtca gcatcgaggt caaggaagtg gtgaagcccc tgctggtgtc 1860caagacccgg gagacggtca gcatcgaggt caaggaagtg gtgaagcccc tgctggtgtc 1860
caccctcggt gagaagagcg ggaaaggact gaagacctgt aagagccctg ggcggaaaag 1920caccctcggt gagaagagcg ggaaaggact gaagacctgt aagagccctg ggcggaaaag 1920
caaggagagc agccccaagg ggcgcagcag cagcgcctcc tcacccccca agaaggagca 1980caaggagagc agccccaagg ggcgcagcag cagcgcctcc tcacccccca agaaggagca 1980
ccaccaccat caccaccact cagagtcccc aaaggccccc gtgccactgc tcccacccct 2040ccaccaccat caccaccact cagagtcccc aaaggccccc gtgccactgc tcccacccct 2040
gcccccacct ccacctgagc ccgagagctc cgaggacccc accagccccc ctgagcccca 2100gcccccacct cccacctgagc cgagagctc cgaggacccc accagccccc ctgagcccca 2100
ggacttgagc agcagcgtct gcaaagagga gaagatgccc agaggaggct cactggagag 2160ggacttgagc agcagcgtct gcaaagagga gaagatgccc agaggaggct cactggagag 2160
cgacggctgc cccaaggagc cagctaagac tcagcccgcg gttgccaccg ccgccacggc 2220cgacggctgc cccaaggagc cagctaagac tcagcccgcg gttgccaccg ccgccacggc 2220
cgcagaaaag tacaaacacc gaggggaggg agagcgcaaa gacattgttt catcctccat 22802280
gccaaggcca aacagagagg agcctgtgga cagccggacg cccgtgaccg agagagttag 23402340
ctgaaataaa agatctttat tttcattaga tctgtgtgtt ggttttttgt gtggcatgct 2400ctgaaataaa agatctttat ttttcattaga tctgtgtgtt ggttttttgt gtggcatgct 2400
ggggagagat cgatctgagg aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc 2460ggggagagat cgatctgagg aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc 2460
tcgctcgctc actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc 2520tcgctcgctc actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccggggct ttgcccggggc 2520
ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtgg 2558ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtgg 2558
<210> 2<210> 2
<211> 549<211> 549
<212> ДНК<212> DNA
<213> Mus musculus<213> Mus musculus
<400> 2<400> 2
gtgaacaacg ccaggctcct caacaggcaa ctttgctact tctacagaaa atgataataa 60gtgaacaacg ccaggctcct caacaggcaa ctttgctact tctacagaaa atgataataa 60
agaaatgctg gtgaagtcaa atgcttatca caatggtgaa ctactcagca gggaggctct 120agaaatgctg gtgaagtcaa atgcttatca caatggtgaa ctactcagca gggaggctct 120
aataggcgcc aagagcctag acttccttaa gcgccagagt ccacaagggc ccagttaatc 180aataggcgcc aagagcctag acttccttaa gcgccagagt ccacaagggc ccagttaatc 180
ctcaacattc aaatgctgcc cacaaaacca gcccctctgt gccctagccg cctctttttt 240ctcaacattc aaatgctgcc cacaaaacca gcccctctgt gccctagccg cctctttttt 240
ccaagtgaca gtagaactcc accaatccgc agctgaatgg ggtccgcctc ttttccctgc 300ccaagtgaca gtagaactcc acccaatccgc agctgaatgg ggtccgcctc ttttccctgc 300
ctaaacagac aggaactcct gccaattgag ggcgtcaccg ctaaggctcc gccccagcct 360ctaaacagac aggaactcct gccaattgag ggcgtcaccg ctaaggctcc gccccagcct 360
gggctccaca accaatgaag ggtaatctcg acaaagagca aggggtgggg cgcgggcgcg 420gggctccaca accaatgaag ggtaatctcg acaaagagca aggggtgggg cgcgggcgcg 420
caggtgcagc agcacacagg ctggtcggga gggcggggcg cgacgtctgc cgtgcggggt 480caggtgcagc agcacacagg ctggtcggga gggcggggcg cgacgtctgc cgtgcggggt 480
cccggcatcg gttgcgcgcg cgctccctcc tctcggagag agggctgtgg taaaacccgt 540cccggcatcg gttgcgcgcg cgctccctcc tctcggagag agggctgtgg taaaacccgt 540
ccggaaaac 549ccggaaaac 549
<210> 3<210> 3
<211> 1497<211> 1497
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<220><220>
<221> другой_признак<221> other_attribute
<223> cds MeCP2B<223> cds MeCP2B
<400> 3<400> 3
atggccgccg ccgccgccgc cgcgccgagc ggaggaggag gaggaggcga ggaggagaga 60atggccgccg ccgccgccgc cgcgccgagc ggaggaggag gaggaggcga ggaggagaga 60
ctggaagaaa agtcagaaga ccaggacctc cagggcctca aggacaaacc cctcaagttt 120ctggaagaaa agtcagaaga ccaggacctc cagggcctca aggacaaacc cctcaagttt 120
aaaaaggtga agaaagataa gaaagaagag aaagagggca agcatgagcc cgtgcagcca 180aaaaaggtga agaaagataa gaaagaagag aaagagggca agcatgagcc cgtgcagcca 180
tcagcccacc actctgctga gcccgcagag gcaggcaaag cagagacatc agaagggtca 240tcagcccacc actctgctga gcccgcagag gcaggcaaag cagagacatc agaagggtca 240
ggctccgccc cggctgtgcc ggaagcttct gcctccccca aacagcggcg ctccatcatc 300ggctccgcc cggctgtgcc ggaagcttct gcctccccca aacagcggcg ctccatcatc 300
cgtgaccggg gacccatgta tgatgacccc accctgcctg aaggctggac acggaagctt 360cgtgaccggg gacccatgta tgatgacccc accctgcctg aaggctggac acggaagctt 360
aagcaaagga aatctggccg ctctgctggg aagtatgatg tgtatttgat caatccccag 420aagcaaagga aatctggccg ctctgctggg aagtatgatg tgtatttgat caatccccag 420
ggaaaagcct ttcgctctaa agtggagttg attgcgtact tcgaaaaggt aggcgacaca 480ggaaaagcct ttcgctctaa agtggagttg attgcgtact tcgaaaaggt aggcgacaca 480
tccctggacc ctaatgattt tgacttcacg gtaactggga gagggagccc ctcccggcga 540tccctggacc ctaatgattt tgacttcacg gtaactggga gagggagccc ctcccggcga 540
gagcagaaac cacctaagaa gcccaaatct cccaaagctc caggaactgg cagaggccgg 600gagcagaaac cacctaagaa gcccaaatct cccaaagctc caggaactgg cagaggccgg 600
ggacgcccca aagggagcgg caccacgaga cccaaggcgg ccacgtcaga gggtgtgcag 660ggacgcccca aagggagcgg caccacgaga cccaaggcgg ccacgtcaga gggtgtgcag 660
gtgaaaaggg tcctggagaa aagtcctggg aagctccttg tcaagatgcc ttttcaaact 720gtgaaaaggg tcctggagaa aagtcctggg aagctccttg tcaagatgcc ttttcaaact 720
tcgccagggg gcaaggctga ggggggtggg gccaccacat ccacccaggt catggtgatc 780tcgccagggg gcaaggctga ggggggtggg gccaccacat ccacccaggt catggtgatc 780
aaacgccccg gcaggaagcg aaaagctgag gccgaccctc aggccattcc caagaaacgg 840aaacgccccg gcaggaagcg aaaagctgag gccgaccctc aggccattcc caagaaacgg 840
ggccgaaagc cggggagtgt ggtggcagcc gctgccgccg aggccaaaaa gaaagccgtg 900ggccgaaagc cggggagtgt ggtggcagcc gctgccgccg aggccaaaaa gaaagccgtg 900
aaggagtctt ctatccgatc tgtgcaggag accgtactcc ccatcaagaa gcgcaagacc 960aaggagtctt ctatccgatc tgtgcaggag accgtactcc ccatcaagaa gcgcaagacc 960
cgggagacgg tcagcatcga ggtcaaggaa gtggtgaagc ccctgctggt gtccaccctc 1020cgggagacgg tcagcatcga ggtcaaggaa gtggtgaagc ccctgctggt gtccaccctc 1020
ggtgagaaga gcgggaaagg actgaagacc tgtaagagcc ctgggcggaa aagcaaggag 1080ggtgagaaga gcgggaaagg actgaagacc tgtaagagcc ctgggcggaa aagcaaggag 1080
agcagcccca aggggcgcag cagcagcgcc tcctcacccc ccaagaagga gcaccaccac 1140agcagcccca aggggcgcag cagcagcgcc tcctcacccc ccaagaagga gcaccaccac 1140
catcaccacc actcagagtc cccaaaggcc cccgtgccac tgctcccacc cctgccccca 1200catcaccacc actcagagtc cccaaaggcc cccgtgccac tgctcccacc cctgccccca 1200
cctccacctg agcccgagag ctccgaggac cccaccagcc cccctgagcc ccaggacttg 1260cctccacctg agcccgag ctccgaggac cccaccagcc cccctgagcc ccaggacttg 1260
agcagcagcg tctgcaaaga ggagaagatg cccagaggag gctcactgga gagcgacggc 1320agcagcagcg tctgcaaaga ggagaagatg cccagaggag gctcactgga gagcgacggc 1320
tgccccaagg agccagctaa gactcagccc gcggttgcca ccgccgccac ggccgcagaa 1380tgccccaagg agccagctaa gactcagccc gcggttgcca ccgccgccac ggccgcagaa 1380
aagtacaaac accgagggga gggagagcgc aaagacattg tttcatcctc catgccaagg 1440aagtacaaac accgagggga gggagagcgc aaagacattg tttcatcctc catgccaagg 1440
ccaaacagag aggagcctgt ggacagccgg acgcccgtga ccgagagagt tagctga 1497ccaaacagag aggagcctgt ggacagccgg acgcccgtga ccgagagagt tagctga 1497
<210> 4<210> 4
<211> 49<211> 49
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический полинуклеотид<223> Synthetic polynucleotide
<220><220>
<221> другой_признак<221> other_attribute
<223> Последовательность полиA<223> PolyA sequence
<400> 4<400> 4
aataaaagat ctttattttc attagatctg tgtgttggtt ttttgtgtg 49aataaaagat ctttattttc attagatctg tgtgttggtt ttttgtgtg 49
<210> 5<210> 5
<211> 3093<211> 3093
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический полинуклеотид<223> Synthetic polynucleotide
<220><220>
<221> другой_признак<221> other_attribute
<223> Геном scAAV9.738.Mecp1<223> scAAV9.738.Mecp1 genome
<220><220>
<221> другой_признак<221> other_attribute
<222> (1)..(106)<222> (1)..(106)
<223> Мутантный ITR<223> Mutant ITR
<220><220>
<221> другой_признак<221> other_attribute
<222> (198)..(936)<222> (198)..(936)
<223> Промоторный фрагмент из 738 нуклеотидов<223> 738 bp promoter fragment
<220><220>
<221> другой_признак<221> other_attribute
<222> (941)..(1037)<222> (941)..(1037)
<223> Интрон SV40<223> SV40 intron
<220><220>
<221> другой_признак<221> other_attribute
<222> (1138)..(2643)<222> (1138)..(2643)
<223> cds MeCP2<223> cds MeCP2
<220><220>
<221> другой_признак<221> other_attribute
<222> (2709)..(2890)<222> (2709)..(2890)
<223> pA BGH<223> pA BGH
<220><220>
<221> другой_признак<221> other_attribute
<222> (2953)..(3093)<222> (2953)..(3093)
<223> ITR<223> ITR
<400> 5<400> 5
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60ctgcgcgctc ggcgctcac tgaggccgcc
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggaatt cacgcgtgga 120ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggaatt cacgcgtgga 120
tctgaattca attcacgcgt ggtaccgagc tcggatccac tagtaacggc cgccagtgtg 180tctgaattca attcacgcgt ggtaccgagc tcggatccac tagtaacggc cgccagtgtg 180
ctggaattcg cccttaatat caaaccatct gattcaacaa tgacagaccg atctcttatg 240ctggaattcg cccttaatat caaaccatct gattcaacaa tgacagaccg atctcttatg 240
ggcttggcac acaccatctg cccattataa acgtctgcaa agaccaaggt ttgatatgtt 300ggcttggcac acaccatctg cccattataa acgtctgcaa agaccaaggt ttgatatgtt 300
gattttactg tcagccttaa gagtgcgaca tctgctaatt tagtgtaata atacaatcag 360gattttactg tcagccttaa gagtgcgaca tctgctaatt tagtgtaata atacaatcag 360
tagacccttt aaaacaagtc ccttggcttg gaacaacgcc aggctcctca acaggcaact 420tagacccttt aaaacaagtc ccttggcttg gaacaacgcc aggctcctca acaggcaact 420
ttgctacttc tacagaaaat gataataaag aaatgctggt gaagtcaaat gcttatcaca 480ttgctacttc tacagaaaat gataataaag aaatgctggt gaagtcaaat gcttatcaca 480
atggtgaact actcagcagg gaggctctaa taggcgccaa gagcctagac ttccttaagc 540atggtgaact actcagcagg gaggctctaa taggcgccaa gagcctagac ttccttaagc 540
gccagagtcc acaagggccc agttaatcct caacattcaa atgctgccca caaaaccagc 600gccagagtcc acaagggccc agttaatcct caacattcaa atgctgccca caaaaccagc 600
ccctctgtgc cctagccgcc tcttttttcc aagtgacagt agaactccac caatccgcag 660ccctctgtgc cctagccgcc tcttttttcc aagtgacagt agaactccac caatccgcag 660
ctgaatgggg tccgcctctt ttccctgcct aaacagacag gaactcctgc caattgaggg 720ctgaatgggg tccgcctctt ttccctgcct aaacagacag gaactcctgc caattgaggg 720
cgtcaccgct aaggctccgc cccagcctgg gctccacaac caatgaaggg taatctcgac 780cgtcaccgct aaggctccgc cccagcctgg gctccacaac caatgaaggg taatctcgac 780
aaagagcaag gggtggggcg cgggcgcgca ggtgcagcag cacacaggct ggtcgggagg 840aaagagcaag gggtggggcg cgggcgcgca ggtgcagcag cacacaggct ggtcgggagg 840
gcggggcgcg acgtctgccg tgcggggtcc cggcatcggt tgcgcgcgcg ctccctcctc 900gcggggcgcg acgtctgccg tgcggggtcc cggcatcggt tgcgcgcgcg ctccctcctc 900
tcggagagag ggctgtggta aaacccgtcc ggaaaaactg gtaagtttag tctttttgtc 960tcggagagag ggctgtggta aaacccgtcc ggaaaaactg gtaagtttag tctttttgtc 960
ttttatttca ggtcccggat ccggtggtgg tgcaaatcaa agaactgctc ctcagtggat 1020ttttatttca ggtcccggat ccggtggtgg tgcaaatcaa agaactgctc ctcagtggat 1020
gttgccttta cttctaggcc tgtacggaag tgttacttct gctctaaaag ctgcggaatt 10801080 gttgccttta cttctaggcc tgtacggaag tgttacttct
gtacccgcgg ccgatccacc ggttttaagg gccgaggcgg ccagatcttt cgaagatatg 1140gtacccgcgg ccgatccacc ggttttaagg gccgaggcgg ccagatcttt cgaagatatg 1140
gccgccgctg ccgccaccgc cgccgccgcc gccgcgccga gcggaggagg aggaggaggc 1200gccgccgctg ccgccaccgc cgccgccgcc gccgcgccga gcggaggagg aggaggaggc 1200
gaggaggaga gactggagga aaagtcagaa gaccaggatc tccagggcct cagagacaag 1260gaggaggaga gactggagga aaagtcagaa gaccaggatc tccagggcct cagagacaag 1260
ccactgaagt ttaagaaggc gaagaaagac aagaaggagg acaaagaagg caagcatgag 1320ccactgaagt ttaagaaggc gaagaaagac aagaaggagg acaaagaagg caagcatgag 1320
ccactacaac cttcagccca ccattctgca gagccagcag aggcaggcaa agcagaaaca 1380cccatacaac cttcagccca ccattctgca gagccagcag aggcaggcaa agcagaaaca 1380
tcagaaagct caggctctgc cccagcagtg ccagaagcct cggcttcccc caaacagcgg 1440tcagaaagct caggctctgc ccagcagtg ccagaagcct cggcttcccc caaacagcgg 1440
cgctccatta tccgtgaccg gggacctatg tatgatgacc ccaccttgcc tgaaggttgg 1500cgctccatta tccgtgaccg gggacctatg tatgatgacc ccaccttgcc tgaaggttgg 1500
acacgaaagc ttaaacaaag gaagtctggc cgatctgctg gaaagtatga tgtatatttg 15601560
atcaatcccc agggaaaagc ttttcgctct aaagtagaat tgattgcata ctttgaaaag 1620atcaatcccc agggaaaagc ttttcgctct aaagtagaat tgattgcata ctttgaaaag 1620
gtgggagaca cctccttgga ccctaatgat tttgacttca cggtaactgg gagagggagc 1680gtgggagaca cctccttgga ccctaatgat tttgacttca cggtaactgg gagagggagc 1680
ccctccagga gagagcagaa accacctaag aagcccaaat ctcccaaagc tccaggaact 1740ccctccagga gagagcagaa accacctaag aagcccaaat ctcccaaagc tccaggaact 1740
ggcaggggtc ggggacgccc caaagggagc ggcactggga gaccaaaggc agcagcatca 1800ggcaggggtc ggggacgccc caaagggagc ggcactggga gaccaaaggc agcagcatca 1800
gaaggtgttc aggtgaaaag ggtcctggag aagagccctg ggaaacttgt tgtcaagatg 1860gaaggtgttc aggtgaaaag ggtcctggag aagagccctg ggaaacttgt tgtcaagatg 1860
cctttccaag catcgcctgg gggtaagggt gagggaggtg gggctaccac atctgcccag 1920cctttccaag catcgcctgg gggtaagggt gagggaggtg gggctaccac atctgcccag 1920
gtcatggtga tcaaacgccc tggcagaaag cgaaaagctg aagctgaccc ccaggccatt 1980gtcatggtga tcaaacgccc tggcagaaag cgaaaagctg aagctgaccc ccaggccatt 1980
cctaagaaac ggggtagaaa gcctgggagt gtggtggcag ctgctgcagc tgaggccaaa 2040cctaagaaac ggggtagaaa gcctgggagt gtggtggcag ctgctgcagc tgaggccaaa 2040
aagaaagccg tgaaggagtc ttccatacgg tctgtgcatg agactgtgct ccccatcaag 2100aagaaagccg tgaaggagtc ttccatacgg tctgtgcatg agactgtgct ccccatcaag 2100
aagcgcaaga cccgggagac ggtcagcatc gaggtcaagg aagtggtgaa gcccctgctg 2160aagcgcaaga ccggggagac ggtcagcatc gaggtcaagg aagtggtgaa gcccctgctg 2160
gtgtccaccc ttggtgagaa aagcgggaag ggactgaaga cctgcaagag ccctgggcgt 2220gtgtccaccc ttggtgagaa aagcgggaag ggactgaaga cctgcaagag ccctgggcgt 2220
aaaagcaagg agagcagccc caaggggcgc agcagcagtg cctcctcccc acctaagaag 22802280
gagcaccatc atcaccacca tcactcagag tccacaaagg cccccatgcc actgctccca 2340gagcaccatc atcaccacca tcactcagag tccacaaagg cccccatgcc actgctccca 2340
tccccacccc cacctgagcc tgagagctct gaggacccca tcagcccccc tgagcctcag 2400tccccacccc cacctgagcc tgagagctct gaggacccca tcagcccccc tgagcctcag 2400
gacttgagca gcagcatctg caaagaagag aagatgcccc gaggaggctc actggaaagc 2460gacttgagca gcagcatctg caaagaagag aagatgcccc gaggaggctc actggaaagc 2460
gatggctgcc ccaaggagcc agctaagact cagcctatgg tcgccaccac taccacagtt 2520gatggctgcc ccaaggagcc agctaagact cagcctatgg tcgccaccac taccacagtt 2520
gcagaaaagt acaaacaccg aggggaggga gagcgcaaag acattgtttc atcttccatg 2580gcagaaaagt acaaacaccg agggggaggga gagcgcaaag acattgtttc atcttccatg 2580
ccaaggccaa acagagagga gcctgtggac agccggacgc ccgtgaccga gagagttagc 2640ccaaggccaa acagagagga gcctgtggac agccggacgc ccgtgaccga gagagttagc 2640
tgaatcggcg ccgctagcgc ggccgcgttt aaaccctgca ggtctagaaa gcttatcgat 2700tgaatcggcg ccgctagcgc ggccgcgttt aaaccctgca ggtctagaaa gcttatcgat 2700
accgtcgact agagctcgct gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt 2760accgtcgact agagctcgct gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt 2760
tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc 2820tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc 2820
ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg 2880ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg 2880
tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga 2940tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga 2940
gagatcgatc tgaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct 3000gagatcgatc tgaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct 3000
cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct 30603060
cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tgg 3093cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tgg 3093
<210> 6<210> 6
<211> 739<211> 739
<212> ДНК<212> DNA
<213> Mus musculus<213> Mus musculus
<220><220>
<221> другой_признак<221> other_attribute
<223> Промотор MECP2<223> MECP2 promoter
<400> 6<400> 6
tatcaaacca tctgattcaa caatgacaga ccgatctctt atgggcttgg cacacaccat 60tatcaaacca tctgattcaa caatgacaga ccgatctctt atgggcttgg cacacaccat 60
ctgcccatta taaacgtctg caaagaccaa ggtttgatat gttgatttta ctgtcagcct 120ctgcccatta taaacgtctg caaagaccaa ggtttgatat gttgatttta ctgtcagcct 120
taagagtgcg acatctgcta atttagtgta ataatacaat cagtagaccc tttaaaacaa 180taagagtgcg acatctgcta atttagtgta ataatacaat cagtagaccc tttaaaacaa 180
gtcccttggc ttggaacaac gccaggctcc tcaacaggca actttgctac ttctacagaa 240gtcccttggc ttggaacaac gccaggctcc tcaacaggca actttgctac ttctacagaa 240
aatgataata aagaaatgct ggtgaagtca aatgcttatc acaatggtga actactcagc 300aatgataata aagaaatgct ggtgaagtca aatgcttatc acaatggtga actactcagc 300
agggaggctc taataggcgc caagagccta gacttcctta agcgccagag tccacaaggg 360agggaggctc taataggcgc caagagccta gacttcctta agcgccagag tccacaaggg 360
cccagttaat cctcaacatt caaatgctgc ccacaaaacc agcccctctg tgccctagcc 420cccagttaat cctcaacatt caaatgctgc ccacaaaacc agcccctctg tgccctagcc 420
gcctcttttt tccaagtgac agtagaactc caccaatccg cagctgaatg gggtccgcct 480gcctcttttt tccaagtgac agtagaactc caccaatccg cagctgaatg gggtccgcct 480
cttttccctg cctaaacaga caggaactcc tgccaattga gggcgtcacc gctaaggctc 540cttttccctg cctaaacaga caggaactcc tgccaattga gggcgtcacc gctaaggctc 540
cgccccagcc tgggctccac aaccaatgaa gggtaatctc gacaaagagc aaggggtggg 600cgccccagcc tgggctccac aaccaatgaa gggtaatctc gacaaagagc aaggggtggg 600
gcgcgggcgc gcaggtgcag cagcacacag gctggtcggg agggcggggc gcgacgtctg 660gcgcgggcgc gcaggtgcag cagcacacag gctggtcggg agggcggggc gcgacgtctg 660
ccgtgcgggg tcccggcatc ggttgcgcgc gcgctccctc ctctcggaga gagggctgtg 720ccgtgcgggg tcccggcatc ggttgcgcgc gcgctccctc ctctcggaga gagggctgtg 720
gtaaaacccg tccggaaaa 739gtaaaacccg tcgggaaaa 739
<210> 7<210> 7
<211> 1563<211> 1563
<212> ДНК<212> DNA
<213> Mus musculus<213> Mus musculus
<220><220>
<221> другой_признак<221> other_attribute
<223> MECP2 альфа<223> MECP2 alpha
<400> 7<400> 7
gtacccgcgg ccgatccacc ggttttaagg gccgaggcgg ccagatcttt cgaagatatg 60gtacccgcgg ccgatccacc ggttttaagg gccgaggcgg ccagatcttt cgaagatatg 60
gccgccgctg ccgccaccgc cgccgccgcc gccgcgccga gcggaggagg aggaggaggc 120gccgccgctg ccgccaccgc cgccgccgcc gccgcgccga gcggaggagg aggaggaggc 120
gaggaggaga gactggagga aaagtcagaa gaccaggatc tccagggcct cagagacaag 180gaggaggaga gactggagga aaagtcagaa gaccaggatc tccagggcct cagagacaag 180
ccactgaagt ttaagaaggc gaagaaagac aagaaggagg acaaagaagg caagcatgag 240ccactgaagt ttaagaaggc gaagaaagac aagaaggagg acaaagaagg caagcatgag 240
ccactacaac cttcagccca ccattctgca gagccagcag aggcaggcaa agcagaaaca 300ccactacaac cttcagccca ccattctgca gagccagcag aggcaggcaa agcagaaaca 300
tcagaaagct caggctctgc cccagcagtg ccagaagcct cggcttcccc caaacagcgg 360tcagaaagct caggctctgc ccagcagtg ccagaagcct cggcttcccc caaacagcgg 360
cgctccatta tccgtgaccg gggacctatg tatgatgacc ccaccttgcc tgaaggttgg 420cgctccatta tccgtgaccg gggacctatg tatgatgacc ccaccttgcc tgaaggttgg 420
acacgaaagc ttaaacaaag gaagtctggc cgatctgctg gaaagtatga tgtatatttg 480acacgaaagc ttaaacaaag gaagtctggc cgatctgctg gaaagtatga tgtatatttg 480
atcaatcccc agggaaaagc ttttcgctct aaagtagaat tgattgcata ctttgaaaag 540atcaatcccc agggaaaagc ttttcgctct aaagtagaat tgattgcata ctttgaaaag 540
gtgggagaca cctccttgga ccctaatgat tttgacttca cggtaactgg gagagggagc 600gtgggagaca cctccttgga ccctaatgat tttgacttca cggtaactgg gagagggagc 600
ccctccagga gagagcagaa accacctaag aagcccaaat ctcccaaagc tccaggaact 660ccctccagga gagagcagaa accacctaag aagcccaaat ctcccaaagc tccaggaact 660
ggcaggggtc ggggacgccc caaagggagc ggcactggga gaccaaaggc agcagcatca 720ggcaggggtc ggggacgccc caaagggagc ggcactggga gaccaaaggc agcagcatca 720
gaaggtgttc aggtgaaaag ggtcctggag aagagccctg ggaaacttgt tgtcaagatg 780gaaggtgttc aggtgaaaag ggtcctggag aagagccctg ggaaacttgt tgtcaagatg 780
cctttccaag catcgcctgg gggtaagggt gagggaggtg gggctaccac atctgcccag 840cctttccaag catcgcctgg gggtaagggt gagggaggtg gggctaccac atctgcccag 840
gtcatggtga tcaaacgccc tggcagaaag cgaaaagctg aagctgaccc ccaggccatt 900gtcatggtga tcaaacgccc tggcagaaag cgaaaagctg aagctgaccc ccaggccatt 900
cctaagaaac ggggtagaaa gcctgggagt gtggtggcag ctgctgcagc tgaggccaaa 960cctaagaaac ggggtagaaa gcctgggagt gtggtggcag ctgctgcagc tgaggccaaa 960
aagaaagccg tgaaggagtc ttccatacgg tctgtgcatg agactgtgct ccccatcaag 1020aagaaagccg tgaaggagtc ttccatacgg tctgtgcatg agactgtgct ccccatcaag 1020
aagcgcaaga cccgggagac ggtcagcatc gaggtcaagg aagtggtgaa gcccctgctg 1080aagcgcaaga ccggggagac ggtcagcatc gaggtcaagg aagtggtgaa gcccctgctg 1080
gtgtccaccc ttggtgagaa aagcgggaag ggactgaaga cctgcaagag ccctgggcgt 11401140
aaaagcaagg agagcagccc caaggggcgc agcagcagtg cctcctcccc acctaagaag 1200aaaagcaagg agagcagccc caaggggcgc agcagcagtg cctcctcccc acctaagaag 1200
gagcaccatc atcaccacca tcactcagag tccacaaagg cccccatgcc actgctccca 1260gagcaccatc atcaccacca tcactcagag tccacaaagg cccccatgcc actgctccca 1260
tccccacccc cacctgagcc tgagagctct gaggacccca tcagcccccc tgagcctcag 13201320
gacttgagca gcagcatctg caaagaagag aagatgcccc gaggaggctc actggaaagc 1380gacttgagca gcagcatctg caaagaagag aagatgcccc gaggaggctc actggaaagc 1380
gatggctgcc ccaaggagcc agctaagact cagcctatgg tcgccaccac taccacagtt 1440gatggctgcc ccaaggagcc agctaagact cagcctatgg tcgccaccac taccacagtt 1440
gcagaaaagt acaaacaccg aggggaggga gagcgcaaag acattgtttc atcttccatg 1500gcagaaaagt acaaacaccg aggggaggga gagcgcaaag acattgtttc atcttccatg 1500
ccaaggccaa acagagagga gcctgtggac agccggacgc ccgtgaccga gagagttagc 1560ccaaggccaa acagagagga gcctgtggac agccggacgc ccgtgaccga gagagttagc 1560
tga 1563tga 1563
<210> 8<210> 8
<211> 6087<211> 6087
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетический полинуклеотид<223> Synthetic polynucleotide
<220><220>
<221> другой_признак<221> other_attribute
<223> Плазмида для продуцирования AVXS-201<223> AVXS-201 Production Plasmid
<220><220>
<221> другой_признак<221> other_attribute
<222> (1)..(106)<222> (1)..(106)
<223> Мутантный ITR<223> Mutant ITR
<220><220>
<221> другой_признак<221> other_attribute
<222> (151)..(699)<222> (151)..(699)
<223> Промоторный фрагмент из 546 нуклеотидов<223> 546 bp promoter fragment
<220><220>
<221> другой_признак<221> other_attribute
<222> (729)..(829)<222> (729)..(829)
<223> Интрон SV40<223> SV40 intron
<220><220>
<221> другой_признак<221> other_attribute
<222> (848)..(2344)<222> (848)..(2344)
<223> hMECP2B<223> hMECP2B
<220><220>
<221> другой_признак<221> other_attribute
<222> (2345)..(2393)<222> (2345)..(2393)
<223> Синтетический pA<223> Synthetic pA
<220><220>
<221> другой_признак<221> other_attribute
<222> (2418)..(2558)<222> (2418)..(2558)
<223> ITR<223> ITR
<220><220>
<221> другой_признак<221> other_attribute
<222> (3309)..(4259)<222> (3309)..(4259)
<223> Ген устойчивости к канамицину<223> Kanamycin resistance gene
<220><220>
<221> другой_признак<221> other_attribute
<222> (4325)..(4939)<222> (4325)..(4939)
<223> Точка начала репликации pMB1<223> Replication origin pMB1
<400> 8<400> 8
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60ctgcgcgctc ggcgctcac tgaggccgcc
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggaatt cacgcgtgga 120ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggaatt cacgcgtgga 120
tctgaattca attcacgcgt ggtaccacgc gtgaacaacg ccaggctcct caacaggcaa 180tctgaattca attcacgcgt ggtaccacgc gtgaacaacg ccaggctcct caacaggcaa 180
ctttgctact tctacagaaa atgataataa agaaatgctg gtgaagtcaa atgcttatca 240ctttgctact tctacagaaa atgataataa agaaatgctg gtgaagtcaa atgcttatca 240
caatggtgaa ctactcagca gggaggctct aataggcgcc aagagcctag acttccttaa 300caatggtgaa ctactcagca gggaggctct aataggcgcc aagagcctag acttccttaa 300
gcgccagagt ccacaagggc ccagttaatc ctcaacattc aaatgctgcc cacaaaacca 360gcgccagagt ccacaagggc ccagttaatc ctcaacattc aaatgctgcc cacaaaacca 360
gcccctctgt gccctagccg cctctttttt ccaagtgaca gtagaactcc accaatccgc 420gcccctctgt gccctagccg cctctttttt ccaagtgaca gtagaactcc accaatccgc 420
agctgaatgg ggtccgcctc ttttccctgc ctaaacagac aggaactcct gccaattgag 480agctgaatgg ggtccgcctc ttttccctgc ctaaacagac aggaactcct gccaattgag 480
ggcgtcaccg ctaaggctcc gccccagcct gggctccaca accaatgaag ggtaatctcg 540ggcgtcaccg ctaaggctcc gccccagcct gggctccaca accaatgaag ggtaatctcg 540
acaaagagca aggggtgggg cgcgggcgcg caggtgcagc agcacacagg ctggtcggga 600acaaagagca aggggtgggg cgcgggcgcg caggtgcagc agcacacagg ctggtcggga 600
gggcggggcg cgacgtctgc cgtgcggggt cccggcatcg gttgcgcgcg cgctccctcc 660gggcggggcg cgacgtctgc cgtgcggggt cccggcatcg gttgcgcgcg cgctccctcc 660
tctcggagag agggctgtgg taaaacccgt ccggaaaacg cgtcgaaggg cgaattctgc 720tctcggagag agggctgtgg taaaacccgt ccggaaaacg cgtcgaaggg cgaattctgc 720
agataactgg taagtttagt cttttttgtc ttttatttca ggtcccggat ccggtggtgg 780agataactgg taagtttagt cttttttgtc ttttatttca ggtcccggat ccggtggtgg 780
tgcaaatcaa agaactgctc ctcagtcgat gttgccttta cttctaggcc tgtacggaag 840tgcaaatcaa agaactgctc ctcagtcgat gttgccttta cttctaggcc tgtacggaag 840
tgttactatg gccgccgccg ccgccgccgc gccgagcgga ggaggaggag gaggcgagga 900tgttactatg gccgccgccg ccgccgccgc gccgagcgga ggaggaggag gaggcgagga 900
ggagagactg gaagaaaagt cagaagacca ggacctccag ggcctcaagg acaaacccct 960ggagagactg gaagaaaagt cagaagacca ggacctccag ggcctcaagg acaaacccct 960
caagtttaaa aaggtgaaga aagataagaa agaagagaaa gagggcaagc atgagcccgt 1020caagtttaaa aaggtgaaga aagataagaa agaagagaaa gagggcaagc atgagcccgt 1020
gcagccatca gcccaccact ctgctgagcc cgcagaggca ggcaaagcag agacatcaga 1080gcagccatca gcccaccact ctgctgagcc cgcagaggca ggcaaagcag agacatcaga 1080
agggtcaggc tccgccccgg ctgtgccgga agcttctgcc tcccccaaac agcggcgctc 1140agggtcaggc tccgccccgg ctgtgccgga agcttctgcc tcccccaaac agcggcgctc 1140
catcatccgt gaccggggac ccatgtatga tgaccccacc ctgcctgaag gctggacacg 1200catcatccgt gaccggggac ccatgtatga tgaccccacc ctgcctgaag gctggacacg 1200
gaagcttaag caaaggaaat ctggccgctc tgctgggaag tatgatgtgt atttgatcaa 1260gaagcttaag caaaggaaat ctggccgctc tgctgggaag tatgatgtgt atttgatcaa 1260
tccccaggga aaagcctttc gctctaaagt ggagttgatt gcgtacttcg aaaaggtagg 1320tccccaggga aaagcctttc gctctaaagt ggagttgatt gcgtacttcg aaaaggtagg 1320
cgacacatcc ctggacccta atgattttga cttcacggta actgggagag ggagcccctc 1380cgacacatcc ctggacccta atgattttga cttcacggta actgggag ggagcccctc 1380
ccggcgagag cagaaaccac ctaagaagcc caaatctccc aaagctccag gaactggcag 1440ccggcgagag cagaaaccac ctaagaagcc caaatctccc aaagctccag gaactggcag 1440
aggccgggga cgccccaaag ggagcggcac cacgagaccc aaggcggcca cgtcagaggg 1500aggccggggga cgccccaaag ggagcggcac cacgagaccc aaggcggcca cgtcagaggg 1500
tgtgcaggtg aaaagggtcc tggagaaaag tcctgggaag ctccttgtca agatgccttt 1560tgtgcaggtg aaaagggtcc tggagaaaag tcctgggaag ctccttgtca agatgccttt 1560
tcaaacttcg ccagggggca aggctgaggg gggtggggcc accacatcca cccaggtcat 1620tcaaacttcg ccagggggca aggctgaggg gggtggggcc accacatcca cccaggtcat 1620
ggtgatcaaa cgccccggca ggaagcgaaa agctgaggcc gaccctcagg ccattcccaa 1680ggtgatcaaa cgccccggca ggaagcgaaa agctgaggcc gaccctcagg ccattcccaa 1680
gaaacggggc cgaaagccgg ggagtgtggt ggcagccgct gccgccgagg ccaaaaagaa 1740gaaacggggc cgaaagccgg ggagtgtggt ggcagccgct gccgccgagg ccaaaaagaa 1740
agccgtgaag gagtcttcta tccgatctgt gcaggagacc gtactcccca tcaagaagcg 1800agccgtgaag gagtcttcta tccgatctgt gcaggagacc gtactcccca tcaagaagcg 1800
caagacccgg gagacggtca gcatcgaggt caaggaagtg gtgaagcccc tgctggtgtc 1860caagacccgg gagacggtca gcatcgaggt caaggaagtg gtgaagcccc tgctggtgtc 1860
caccctcggt gagaagagcg ggaaaggact gaagacctgt aagagccctg ggcggaaaag 1920caccctcggt gagaagagcg ggaaaggact gaagacctgt aagagccctg ggcggaaaag 1920
caaggagagc agccccaagg ggcgcagcag cagcgcctcc tcacccccca agaaggagca 1980caaggagagc agccccaagg ggcgcagcag cagcgcctcc tcacccccca agaaggagca 1980
ccaccaccat caccaccact cagagtcccc aaaggccccc gtgccactgc tcccacccct 2040ccaccaccat caccaccact cagagtcccc aaaggccccc gtgccactgc tcccacccct 2040
gcccccacct ccacctgagc ccgagagctc cgaggacccc accagccccc ctgagcccca 2100gcccccacct cccacctgagc cgagagctc cgaggacccc accagccccc ctgagcccca 2100
ggacttgagc agcagcgtct gcaaagagga gaagatgccc agaggaggct cactggagag 2160ggacttgagc agcagcgtct gcaaagagga gaagatgccc agaggaggct cactggagag 2160
cgacggctgc cccaaggagc cagctaagac tcagcccgcg gttgccaccg ccgccacggc 2220cgacggctgc cccaaggagc cagctaagac tcagcccgcg gttgccaccg ccgccacggc 2220
cgcagaaaag tacaaacacc gaggggaggg agagcgcaaa gacattgttt catcctccat 22802280
gccaaggcca aacagagagg agcctgtgga cagccggacg cccgtgaccg agagagttag 23402340
ctgaaataaa agatctttat tttcattaga tctgtgtgtt ggttttttgt gtggcatgct 2400ctgaaataaa agatctttat ttttcattaga tctgtgtgtt ggttttttgt gtggcatgct 2400
ggggagagat cgatctgagg aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc 2460ggggagagat cgatctgagg aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc 2460
tcgctcgctc actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc 2520tcgctcgctc actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccggggct ttgcccggggc 2520
ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc cccccccccc cccccccggc 2580ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc cccccccccc cccccccggc 2580
gattctcttg tttgctccag actctcaggc aatgacctga tagcctttgt agagacctct 2640gattctcttg tttgctccag actctcaggc aatgacctga tagcctttgt agagacctct 2640
caaaaatagc taccctctcc ggcatgaatt tatcagctag aacggttgaa tatcatattg 2700caaaaatagc taccctctcc ggcatgaatt tatcagctag aacggttgaa tatcatattg 2700
atggtgattt gactgtctcc ggcctttctc acccgtttga atctttacct acacattact 2760atggtgatt gactgtctcc ggcctttctc acccgtttga atctttacct acacattact 2760
caggcattgc atttaaaata tatgagggtt ctaaaaattt ttatccttgc gttgaaataa 2820caggcattgc atttaaaata tatgaggggtt ctaaaaattt ttatccttgc gttgaaataa 2820
aggcttctcc cgcaaaagta ttacagggtc ataatgtttt tggtacaacc gatttagctt 2880aggcttctcc cgcaaaagta ttacagggtc ataatgtttt tggtacaacc gatttagctt 2880
tatgctctga ggctttattg cttaattttg ctaattcttt gccttgcctg tatgatttat 2940tatgctctga ggctttattg cttaattttg ctaattcttt gccttgcctg tatgatttat 2940
tggatgttgg aatcgcctga tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca 3000tggatgttgg aatcgcctga tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca 3000
ccgcatatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg 3060ccgcatatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg 3060
acacccgcca acactatggt gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag 3120acacccgcca acactatggt gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag 3120
ccagccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc 3180ccagccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc 3180
atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc 3240atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc 3240
gtcatcaccg aaacgcgcga gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa 3300gtcatcaccg aaacgcgcga gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa 3300
tgtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt 3360tgtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt 3360
taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttagaaaa actcatcgag 3420taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttagaaaa actcatcgag 3420
catcaaatga aactgcaatt tattcatatc aggattatca ataccatatt tttgaaaaag 3480catcaaatga aactgcaatt tattcatatc aggattatca ataccatatt tttgaaaaag 3480
ccgtttctgt aatgaaggag aaaactcacc gaggcagttc cataggatgg caagatcctg 3540ccgtttctgt aatgaaggag aaaactcacc gaggcagttc cataggatgg caagatcctg 3540
gtatcggtct gcgattccga ctcgtccaac atcaatacaa cctattaatt tcccctcgtc 3600gtatcggtct gcgattccga ctcgtccaac atcaatacaa cctattaatt tcccctcgtc 3600
aaaaataagg ttatcaagtg agaaatcacc atgagtgacg actgaatccg gtgagaatgg 3660aaaaataagg ttatcaagtg agaaatcacc atgagtgacg actgaatccg gtgagaatgg 3660
caaaagttta tgcatttctt tccagacttg ttcaacaggc cagccattac gctcgtcatc 3720caaaagttta tgcatttctt tccagacttg ttcaacaggc cagccattac gctcgtcatc 3720
aaaatcactc gcatcaacca aaccgttatt cattcgtgat tgcgcctgag cgaggcgaaa 3780aaaatcactc gcatcaacca aaccgttatt cattcgtgat tgcgcctgag cgaggcgaaa 3780
tacgcgatcg ctgttaaaag gacaattaca aacaggaatc gagtgcaacc ggcgcaggaa 38403840
cactgccagc gcatcaacaa tattttcacc tgaatcagga tattcttcta atacctggaa 3900cactgccagc gcatcaacaa tattttcacc tgaatcagga tattcttcta atacctggaa 3900
cgctgttttt ccggggatcg cagtggtgag taaccatgca tcatcaggag tacggataaa 39603960
atgcttgatg gtcggaagtg gcataaattc cgtcagccag tttagtctga ccatctcatc 4020atgcttgatg gtcggaagtg gcataaattc cgtcagccag tttagtctga ccatctcatc 4020
tgtaacatca ttggcaacgc tacctttgcc atgtttcaga aacaactctg gcgcatcggg 4080tgtaacatca ttggcaacgc tacctttgcc atgtttcaga aacaactctg gcgcatcggg 4080
cttcccatac aagcgataga ttgtcgcacc tgattgcccg acattatcgc gagcccattt 4140cttcccatac aagcgataga ttgtcgcacc tgattgcccg acattatcgc gagcccattt 4140
atacccatat aaatcagcat ccatgttgga atttaatcgc ggcctcgacg tttcccgttg 4200atacccatat aaatcagcat ccatgttgga atttaatcgc ggcctcgacg tttcccgttg 4200
aatatggctc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct 4260aatatggctc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct 4260
catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa 4320catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa 4320
gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa 4380gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa 4380
aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc 4440aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc 4440
gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta 4500gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat acccaaatact gttcttctag tgtagccgta 4500
gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct 4560gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct 4560
gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg 4620gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg 4620
atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag 4680atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag 4680
cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc 4740cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc 4740
cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg 4800cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg 4800
agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt 4860agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt 4860
tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg 4920tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg 4920
gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca 4980gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca 4980
catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg 5040catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg 5040
agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc 5100agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc 5100
ggaagagcgc ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag 5160ggaagagcgc ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag 5160
ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa 5220ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa 5220
tggcgaatgg cgattccgtt gcaatggctg gcggtaatat tgttctggat attaccagca 5280tggcgaatgg cgattccgtt gcaatggctg gcggtaatat tgttctggat attaccagca 5280
aggccgatag tttgagttct tctactcagg caagtgatgt tattactaat caaagaagta 5340aggccgatag tttgagttct tctactcagg caagtgatgt tattactaat caaagaagta 5340
ttgcgacaac ggttaatttg cgtgatggac agactctttt actcggtggc ctcactgatt 5400ttgcgacaac ggttaatttg cgtgatggac agactctttt actcggtggc ctcactgatt 5400
ataaaaacac ttctcaggat tctggcgtac cgttcctgtc taaaatccct ttaatcggcc 5460ataaaaacac ttctcaggat tctggcgtac cgttcctgtc taaaatccct ttaatcggcc 5460
tcctgtttag ctcccgctct gattctaacg aggaaagcac gttatacgtg ctcgtcaaag 5520tcctgtttag ctcccgctct gattctaacg aggaaagcac gttatacgtg ctcgtcaaag 5520
caaccatagt acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc 5580caaccatagt acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc 5580
agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc 5640agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc 5640
tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg 5700tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg 5700
ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca 5760ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca 5760
cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc 5820cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc 5820
tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct 5880tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct 5880
tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa 5940tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa 5940
caaaaattta acgcgaattt taacaaaata ttaacgctta caatttaaat atttgcttat 60006000
acaatcttcc tgtttttggg gcttttctga ttatcaaccg gggtacatat gattgacatg 6060acaatcttcc tgtttttgggg gcttttctga ttatcaaccg gggtacatat gattgacatg 6060
ctagttttac gattaccgtt catcgcc 6087ctagttttac gattaccgtt catcgcc 6087
<---<---
Claims (26)
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201662423618P | 2016-11-17 | 2016-11-17 | |
| US62/423,618 | 2016-11-17 | ||
| PCT/US2017/062371 WO2018094251A1 (en) | 2016-11-17 | 2017-11-17 | Intrathecal delivery of recombinant adeno-associated virus encoding methyl-cpg binding protein 2 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2022134051A Division RU2022134051A (en) | 2016-11-17 | 2017-11-17 | INTRATHECAL DELIVERY OF RECOMBINANT ADENO-ASSOCIATED VIRUS ENCODING METHYL-CPG-BINDING PROTEIN 2 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2019118300A RU2019118300A (en) | 2020-12-17 |
| RU2019118300A3 RU2019118300A3 (en) | 2021-01-11 |
| RU2788084C2 true RU2788084C2 (en) | 2023-01-16 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090246768A1 (en) * | 2008-02-15 | 2009-10-01 | Sawalha Amr H | Predicting and Diagnosing Patients With Autoimmune Disease |
| US20160038613A1 (en) * | 2008-12-19 | 2016-02-11 | Nationwide Children's Hospital, Inc. | Delivery of polynucleotides using recombinant aav9 |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090246768A1 (en) * | 2008-02-15 | 2009-10-01 | Sawalha Amr H | Predicting and Diagnosing Patients With Autoimmune Disease |
| US20160038613A1 (en) * | 2008-12-19 | 2016-02-11 | Nationwide Children's Hospital, Inc. | Delivery of polynucleotides using recombinant aav9 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| БОГОСЛОВСКАЯ Е.В. Безопасность использования ретровирусных векторов в генной терапии. Вестник РАМН, 2012, N10, с.55-61. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7497247B2 (en) | Intrathecal delivery of recombinant adeno-associated virus 9 | |
| US20200297872A1 (en) | Delivery of polynucleotides using recombinant aav9 | |
| JP6397391B2 (en) | Gene therapy for neurodegenerative disorders | |
| US20220125952A1 (en) | Delivery of polynucleotides using recombinant aav9 | |
| Bevan et al. | Systemic gene delivery in large species for targeting spinal cord, brain, and peripheral tissues for pediatric disorders | |
| JP2022137210A (en) | Intrathecal delivery of recombinant adeno-associated virus encoding methyl-CPG binding protein 2 | |
| JP2023144087A (en) | Recombinant glut1 adeno-associated viral vector constructs and methods for restoring glut1 expression | |
| US20210277362A1 (en) | Recombinant adeno-associated virus products and methods for treating limb girdle muscular dystrophy 2a | |
| KR20210124300A (en) | Adeno-associated viral delivery of CLN3 polynucleotides | |
| RU2788084C2 (en) | Intrathecal delivery of recombinant adeno-associated virus encoding methyl-cpg-binding protein 2 | |
| NZ794471A (en) | Intrathecal delivery of recombinant adeno-associated virus encoding methyl-cpg binding protein 2 | |
| WO2022170038A1 (en) | Adeno-associated virus delivery of cln3 polynucleotide | |
| CN116033915A (en) | Compositions and methods for treating GM1 gangliosidosis and other disorders |