RU2787585C1 - Escherichia coli strain with inactive yhje gene producing l-threonine - Google Patents
Escherichia coli strain with inactive yhje gene producing l-threonine Download PDFInfo
- Publication number
- RU2787585C1 RU2787585C1 RU2022127020A RU2022127020A RU2787585C1 RU 2787585 C1 RU2787585 C1 RU 2787585C1 RU 2022127020 A RU2022127020 A RU 2022127020A RU 2022127020 A RU2022127020 A RU 2022127020A RU 2787585 C1 RU2787585 C1 RU 2787585C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- threonine
- gene
- yhje
- escherichia coli
- strain
- Prior art date
Links
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 title claims abstract description 49
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 16
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims abstract description 26
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims abstract description 26
- 101700072309 yhjE Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 6
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 abstract description 4
- 230000002906 microbiologic Effects 0.000 abstract description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 7
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 7
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 7
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 229940041514 Candida albicans extract Drugs 0.000 description 5
- 229960005091 Chloramphenicol Drugs 0.000 description 5
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N Chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 229960001031 Glucose Drugs 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N β-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N Ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 101710013413 HOM6 Proteins 0.000 description 4
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 101710004853 THRA Proteins 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 4
- 229960000310 ISOLEUCINE Drugs 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 3
- 230000037348 biosynthesis Effects 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 101700083182 ilvA Proteins 0.000 description 3
- 230000001965 increased Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N Actinospectacin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- GZCGUPFRVQAUEE-KCDKBNATSA-N D-(+)-Galactose Natural products OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-KCDKBNATSA-N 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 2
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L MgCl2 Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M Monopotassium phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000004059 degradation Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L mgso4 Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N (8S)-8-azaniumyl-7-oxononanoate Chemical compound C[C@H](N)C(=O)CCCCCC(O)=O GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- 108010063377 Aspartokinase Homoserine Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 229940052223 Basic fuchsin Drugs 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 210000000349 Chromosomes Anatomy 0.000 description 1
- 235000005979 Citrus limon Nutrition 0.000 description 1
- 240000002268 Citrus limon Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KAZBKCHUSA-N D-Mannitol Natural products OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KAZBKCHUSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 108010042687 EC 1.2.3.3 Proteins 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 101710010461 Gapdh1 Proteins 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L Iron(II) sulfate Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-UUNJERMWSA-N Lactose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)O[C@@H]1CO)[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1 GUBGYTABKSRVRQ-UUNJERMWSA-N 0.000 description 1
- AIHDCSAXVMAMJH-GFBKWZILSA-N Levan Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@](CO)(CO[C@@H]2[C@H]([C@H](O)[C@@](O)(CO)O2)O)O1 AIHDCSAXVMAMJH-GFBKWZILSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- IJROUPFSQHMOBK-UHFFFAOYSA-N NC(=N)NN=O.O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O Chemical compound NC(=N)NN=O.O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O IJROUPFSQHMOBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JUQPZRLQQYSMEQ-UHFFFAOYSA-N Pararosaniline Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC=C1C(C=1C=CC(N)=CC=1)=C1C=CC(=[NH2+])C=C1 JUQPZRLQQYSMEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 101700030942 TDH Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010006873 Threonine Dehydratase Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 150000001479 arabinose derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 102000006635 beta-Lactamases Human genes 0.000 description 1
- 108020004256 beta-Lactamases Proteins 0.000 description 1
- 230000001486 biosynthesis of amino acids Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 108060001830 copG Proteins 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 235000005824 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 108060002381 dsbB Proteins 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 1
- 230000003721 exogen phase Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 101710028189 lsc Proteins 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003390 magnesium sulfate Drugs 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate monohydrate Chemical compound O.[Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic Effects 0.000 description 1
- 210000000947 motile cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 235000011837 pasties Nutrition 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 description 1
- 108060002036 pde-2 Proteins 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 101700012521 rhtA Proteins 0.000 description 1
- 101700057137 sacB Proteins 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 101700051549 sstT Proteins 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 101710010451 tdh2 Proteins 0.000 description 1
- 230000002588 toxic Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности, к микробиологическому синтезу L-треонина с использованием бактерии вида Escherichia coli.The present invention relates to the microbiological industry, in particular to the microbiological synthesis of L-threonine using Escherichia coli.
Уровень техникиState of the art
Традиционно L-аминокислоты в промышленном масштабе могут быть получены методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, выделенных из природных источников, или их мутантов, специально модифицированных для того, чтобы увеличить продукцию L-аминокислот.Traditionally, L-amino acids on an industrial scale can be obtained by fermentation using strains of microorganisms isolated from natural sources, or their mutants, specially modified in order to increase the production of L-amino acids.
Описано множество методов увеличения продукции L-аминокислот, например, путем трансформации микроорганизма рекомбинантной ДНК (US 4278765). Указанные методы основаны на повышении активности ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот и/или уменьшении чувствительности целевого фермента к обратному ингибированию продуцируемой L-аминокислотой (WO 9516042, US 5661012, US 6040160).Many methods have been described for increasing the production of L-amino acids, for example, by transforming a microorganism with recombinant DNA (US 4278765). These methods are based on increasing the activity of enzymes involved in the biosynthesis of amino acids and/or reducing the sensitivity of the target enzyme to reverse inhibition produced by L-amino acid (WO 9516042, US 5661012, US 6040160).
Известны различные штаммы, использующиеся для производства L-треонина методом ферментации. Это штаммы с увеличенными активностями ферментов, вовлеченных в биосинтез L-треонина (US 5175107; US 5661012; US 5705371; US 5939307; ЕР 219027), штаммы, устойчивые к некоторым химических реагентам, таким как L-треонин и его аналоги (WO 0114525, ЕР 301572, US 5376538), штаммы с инактивированными ферментами системы деградации треонина (US 5939307 и US 6297031), штаммы, в которых устранена чувствительность целевого фермента к ингибированию продуцируемой аминокислотой или ее побочными продуктами по типу обратной связи (US 5175107 и US 5661012).Various strains are known that are used to produce L-threonine by fermentation. These are strains with increased activities of enzymes involved in the biosynthesis of L-threonine (US 5175107; US 5661012; US 5705371; US 5939307; EP 219027), strains resistant to certain chemicals, such as L-threonine and its analogues (WO 0114525, EP 301572, US 5376538), strains with inactivated enzymes of the threonine degradation system (US 5939307 and US 6297031), strains in which the sensitivity of the target enzyme to inhibition of the produced amino acid or its by-products by the feedback type is eliminated (US 5175107 and US 5661012).
Известен штамм-продуцент L-треонина Е. coli ВКПМ В-3996 (SU 1694643, US 5175107 и US 5705371), полученный путем введения в штамм Е. coli ВКПМ В-7 следующих мутаций и плазмиды:Known strain-producer of L-threonine E. coli VKPM B-3996 (SU 1694643, US 5175107 and US 5705371), obtained by introducing into the strain E. coli VKPM B-7 the following mutations and plasmids:
- мутантный ген thrA (мутация thrA442) кодирует белок аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, который устойчив к ингибированию треонином по типу обратной связи;- mutant thrA gene (mutation thrA 442 ) encodes a protein aspartokinase-homoserine dehydrogenase I, which is resistant to feedback inhibition by threonine;
- мутантный ген ilvA (мутация ilvA442) кодирует белок треониндеаминазу, обладающую пониженной активностью, которая выражается в пониженном уровне биосинтеза изолейцина и в фенотипе с недостатком по изолейцину типа "leaky". В бактерии с мутацией ilvA442 транскрипция оперона thrABC не репрессируется изолейцином, что дает положительный эффект на продукцию L-треонина;- the mutant ilvA gene (mutation ilvA 442 ) encodes a threonine deaminase protein with reduced activity, which is expressed in a reduced level of isoleucine biosynthesis and in a "leaky" isoleucine-deficient phenotype. In bacteria with the ilvA 442 mutation, the transcription of the thrABC operon is not repressed by isoleucine, which has a positive effect on the production of L-threonine;
- инактивация гена tdh приводит к предотвращению деградации L-треонина, в указанный штамм была введена генетическая детерминанта ассимиляции сахарозы (гены scrKYABR);- inactivation of the tdh gene leads to the prevention of the degradation of L-threonine, the genetic determinant of sucrose assimilation (scrKYABR genes) was introduced into this strain;
- увеличение экспрессии генов, контролирующих биосинтез L-треонина, достигнута путем введения в штамм плазмиды pVIC40, содержащей мутантный треониновый оперон thrA442BC.- an increase in the expression of genes that control the biosynthesis of L-threonine was achieved by introducing the pVIC40 plasmid containing the mutant thrA 442B C threonine operon into the strain.
Штамм Е. coli ВКПМ В-3996 в ходе ферментации пробирках продуцирует 13 г/л L-треонина (RU 2182173), при культивировании в ферментере - 85 г/л L-треонина (US 5175107).E. coli strain VKPM B-3996 during fermentation in test tubes produces 13 g/l L-threonine (RU 2182173), when cultivated in a fermenter - 85 g/l L-threonine (US 5175107).
Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение является поиск новых генов-мишеней, модификация которых приводит к увеличению продукции L-треонина.The technical problem to be solved by the claimed invention is the search for new target genes, the modification of which leads to an increase in the production of L-threonine.
Раскрытие сущности изобретенияDisclosure of the essence of the invention
Техническим результатом заявляемого изобретения является расширение арсенала штаммов Escherichia coli, способных к продукции L-треонина.The technical result of the claimed invention is the expansion of the arsenal of Escherichia coli strains capable of producing L-threonine.
Он достигается тем, что получен штамм бактерии Escherichia coli ВКПМ В-14270 с инактивированным геном yhjE, обладающий способностью продуцировать L-треонин.It is achieved by obtaining a strain of the bacterium Escherichia coli VKPM B-14270 with an inactivated yhjE gene, which has the ability to produce L-threonine.
Краткое описание чертежейBrief description of the drawings
На фигуре показана схема плазмиды pITA.The figure shows a diagram of the pITA plasmid.
Осуществление изобретенияImplementation of the invention
Термин "ген yhjE инактивирован" означает, что целевой ген модифицирован таким образом, что такой модифицированный ген кодирует мутантный белок со сниженной активностью, или полностью неактивный белок. Также возможно, что естественная экспрессия модифицированного участка ДНК невозможна из-за делеции целевого гена или его части, сдвига рамки считывания данного гена или введения missense/nonsense мутации или модификации прилегающей к гену областей, которые включают последовательности, контролирующие экспрессию гена, такие как промотор(ы), энхансер(ы), аттенуатор(ы), сайт(ы) связывания рибосомы, и т.д.The term "yhjE gene is inactivated" means that the target gene is modified such that the modified gene encodes a mutant protein with reduced activity, or a completely inactive protein. It is also possible that natural expression of the modified DNA region is not possible due to deletion of the target gene or part of it, a shift in the reading frame of this gene, or the introduction of a missense / nonsense mutation or modification of regions adjacent to the gene that include sequences that control gene expression, such as a promoter ( s), enhancer(s), attenuator(s), ribosome binding site(s), etc.
Инактивация гена может быть осуществлена любым возможным методом, например, такими как мутагенез с использованием УФ излучения или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин), сайт-направленный мутагенез, инактивации гена с помощью гомологичной рекомбинации, или/и инсерционно-делеционного мутагенеза (Yu, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97: 12: 5978-83); (Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97: 12: 6640-45), также называемого "Red-зависимая интеграция".Gene inactivation can be carried out by any possible method, such as mutagenesis using UV radiation or treatment with nitrosoguanidine (N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine), site-directed mutagenesis, gene inactivation by homologous recombination, or/ and insertion-deletion mutagenesis (Yu, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:5978-83); (Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97: 12: 6640-45), also called "Red-dependent integration".
В данной работе инактивацию гена yhjE проводят путем замены открытой рамки считывания гена на селективный маркер cat, ген устойчивости к хлорамфениколу. Полученный таким образом штамм не способен синтезировать белок YhjE, кодируемый геном yhjE.In this work, the inactivation of the yhjE gene is carried out by replacing the open reading frame of the gene with the cat selective marker, the chloramphenicol resistance gene. The thus obtained strain is unable to synthesize the YhjE protein encoded by the yhjE gene.
Пример 1. Конструирование штамма с инактивированным геном yhjEExample 1. Construction of a strain with an inactivated yhjE gene
Инактивацию гена осуществляют в штамме ВКПМ В-13207, который получен на основе дикого штамма Escherichia coli K-12 MG1655 (АТСС 47076) в результате проведения нескольких раундов мутагеза различными мутирующими агентами с целью отбора мутантов наиболее устойчивых к L-треонину, и последующего введения направленных генетических модификаций: замена промотора генов треонинового оперона, введение десенсибилизирующей мутации в ген thrA, оверэспрессия rhtA, инактивация гена sstT, инактивация гена рохВ, кодирующего пируватоксидазу.Gene inactivation is carried out in the strain VKPM B-13207, which was obtained on the basis of the wild strain Escherichia coli K-12 MG1655 (ATCC 47076) as a result of several rounds of mutagesis with various mutating agents in order to select the mutants most resistant to L-threonine, and then introduce targeted genetic modifications: replacement of the promoter of the threonine operon genes, introduction of a desensitizing mutation in the thrA gene, overexpression of rhtA, inactivation of the sstT gene, inactivation of the roxB gene encoding pyruvate oxidase.
Делецию гена yhjE осуществляют путем замены его ORF (номер последовательности по базе данных GenBank NC_000913.3 U00096.3: 3,674,786 -> 3,676,108), на селективный маркер устойчивости к хлорамфениколу, методом ПЦР с использованием следующих олигонуклеотидов:The deletion of the yhjE gene is carried out by replacing its ORF (sequence number according to the GenBank database NC_000913.3 U00096.3: 3,674,786 -> 3,676,108), with a selective marker of resistance to chloramphenicol, by PCR using the following oligonucleotides:
yhjECinsF 5'-atgcaagcaacagccacaacactcgaccacgagcaagaatacacgccgatgccaagcttgcatgcctgcyhjECinsF 5'-atgcaagcaacagccacaacactcgaccacgagcaagaatacacgccgatgccaagcttgcatgcctgc
yhjEinsR 5'-ttacaacgactgatgtcgcgtctcatgggtcagcagcagggcgattaacggggatcctctagagtcgagyhjEinsR 5'-ttacaacgactgatgtcgcgtctcatgggtcagcagcagggcgattaacggggatcctctagagtcgag
В качестве матрицы для синтеза используют плазмиду pITA (Биотехнология 2019 Т. 35 №4 с. 42-54). В своем составе эта плазмида (фиг. 1) несет следующие генетические элементы: ген cat обуславливающий устойчивость клеток к хлорамфениколу для прямого отбора трансформантов; последовательности фага λ attL и attR - сайты узнавания системы рекомбинации Int/Xis; repA - репликон; ген bla, кодирующий бета-лактамазу, обуславливающий устойчивость к ампициллину, и ген sacB обеспечивающий превращение сахарозы в леван, токсичный для E. coli.The pITA plasmid is used as a template for synthesis (Biotechnology 2019 T. 35 No. 4 p. 42-54). In its composition, this plasmid (Fig. 1) carries the following genetic elements: the cat gene causing cell resistance to chloramphenicol for direct selection of transformants; phage sequences λ attL and attR - recognition sites of the Int/Xis recombination system; repA - replicon; the bla gene encoding beta-lactamase, which confers resistance to ampicillin; and the sacB gene, which ensures the conversion of sucrose to levan, which is toxic to E. coli.
Амплификацию фрагмента проводят с использованием полимеразы KAPA (KAPAbiosystems) для того, чтобы избежать ошибок в последовательности. Используют следующий температурный профиль для ПЦР: денатурация при 95°С в течение 3 мин; 25 циклов: 20 сек при 98°С, 20 сек при 60°С, 4 мин при 72°С; и заключительная полимеризация: 4 мин при 72°С. ПЦР продукт размером 3800 п.о. очищают методом экстракции из агарозного геля и далее используют для трансформации штамма ВКПМ В-13207, который предварительно трансформируют плазмидой pKD46, которая необходима для интеграции продукта ПЦР в хромосому штамма. Плазмида pKD46 (Datsenko, K.А. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97: 12: 6640-45) содержит фрагмент ДНК фага λ, (инвентарный номер последовательности J02459 в базе данных GenBank) длиной 2,154 нуклеотида (31088-33241), а также содержит гены Red гомологичной системы рекомбинации (β, γ, ехо гены) под контролем промотора ParaB; индуцируемого арабинозой.Fragment amplification was performed using KAPA polymerase (KAPAbiosystems) in order to avoid sequence errors. Use the following temperature profile for PCR: denaturation at 95°C for 3 min; 25 cycles: 20 sec at 98°C, 20 sec at 60°C, 4 min at 72°C; and final polymerization: 4 min at 72°C. PCR product 3800 bp in size. purified by extraction from agarose gel and then used to transform the VKPM B-13207 strain, which is preliminarily transformed with the pKD46 plasmid, which is necessary for the integration of the PCR product into the strain chromosome. Plasmid pKD46 (Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97: 12: 6640-45) contains a DNA fragment of phage λ, (sequence accession number J02459 in the GenBank database) 2.154 nucleotides long (31088-33241), and also contains the Red genes of the homologous recombination system (β, γ, exo genes) under the control of the ParaB promoter; induced by arabinose.
Электрокомпетентные клетки получают следующим образом: ночную культуру штамма Е. coli ВКПМ В-13207 выращивают при 30°С в жидкой среде LB (мас. %): триптон - 1, NaCl - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, вода - остальное, рН 7,0 с добавкой ампициллина (125 мг/л), разводят в 100 раз при помощи 5 мл среды SOB (мас. %): триптон 2, дрожжевой экстракт - 0,5, MgCl2 - 0,0956, MgSO4 - 7H2O - 0,252, NaCl - 0,0058, KCl - 0,0185, вода остальное с добавлением ампициллина (100 мг/л) и L-арабинозы (1 мМ). Полученную культуру растят с перемешиванием при 30°С до достижения оптической плотности ОП660нм 0,6 ед., после чего делают клетки электрокомпетентными путем концентрации в 100 раз и трехкратного отмывания ледяной деионизированной Н2О. Электропорацию проводят с использованием 40 мкл клеток и 1 мкг продукта ПЦР. После электропорации клетки инкубируют в 1 мл среды SOC (мас. %): триптон 2, дрожжевой экстракт - 0,5, глюкоза - 0,36, MgCl2 - 0,0956, MgSO4⋅7H2O - 0,252, NaCl - 0,0058, KCl - 0,0185, вода - остальное при 37°С в течение 2,5 часов, после чего высевают на чашки со средой LA (мас. %): агар-агар - 2, триптон - 1, NaCl - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, вода - остальное, рН 7,0 с добавлением спектиномицина (75 мкг/мл).Electrocompetent cells are obtained as follows: an overnight culture of E. coli strain VKPM B-13207 is grown at 30°C in a liquid LB medium (wt.%): tryptone - 1, NaCl - 1, yeast extract - 0.5, water - the rest, pH 7.0 with the addition of ampicillin (125 mg / l), diluted 100 times with 5 ml of SOB medium (wt.%): tryptone 2, yeast extract - 0.5, MgCl 2 - 0.0956, MgSO 4 - 7H 2 O - 0.252, NaCl - 0.0058, KCl - 0.0185, the rest is water with the addition of ampicillin (100 mg/l) and L-arabinose (1 mm). The resulting culture is grown with stirring at 30°C until an optical density of OD 660 nm of 0.6 units is reached, after which the cells are made electrocompetent by concentrating 100 times and washing three times with ice-cold deionized H 2 O. Electroporation is carried out using 40 μl of cells and 1 μg PCR product. After electroporation, the cells are incubated in 1 ml of SOC medium (wt.%): tryptone 2, yeast extract - 0.5, glucose - 0.36, MgCl 2 - 0.0956, MgSO 4 ⋅7H 2 O - 0.252, NaCl - 0 ,0058, KCl - 0.0185, water - the rest at 37°C for 2.5 hours, after which they are sown on plates with LA medium (wt.%): agar-agar - 2, tryptone - 1, NaCl - 1 , yeast extract - 0.5, water - the rest, pH 7.0 with the addition of spectinomycin (75 µg/ml).
Отбор трансформантов, несущих делецию в гене yhjE, проводят на чашках со средой LA с добавлением хлорамфеникола. Наличие инсерции в локусе yhjE у отобранных клонов подтверждают методом ПЦР. Для амплификации фрагмента используют полимеразу Taq (Thermo Fisher Scientific) и следующие олигонуклеотиды:The selection of transformants carrying a deletion in the yhjE gene is carried out on LA plates with the addition of chloramphenicol. The presence of an insertion at the yhjE locus in selected clones was confirmed by PCR. To amplify the fragment, Taq polymerase (Thermo Fisher Scientific) and the following oligonucleotides were used:
yhjEoutF 5'-accatttccgcgatttgttacyhjEoutF 5'-accatttccgcgatttgttac
yhjEoutR 5'-tagattgttggcaaagtgtgcyhjEoutR 5'-tagattgttggcaaagtgtgc
Для проведения ПЦР используют следующий температурный профиль: денатурация при 94°С в течение 4 мин; 25 циклов: 20 сек при 94°С, 20 сек при 55°С, 4 мин 0 сек при 72°С; и заключительная полимеризация: 5 мин при 72°С.For PCR use the following temperature profile: denaturation at 94°C for 4 min; 25 cycles: 20 sec at 94°C, 20 sec at 55°C, 4 min 0 sec at 72°C; and final polymerization: 5 min at 72°C.
Наличие продукта размером 4045 п.о. интерпретируют как интеграцию кассеты в целевой локус. Для удаления вспомогательной плазмиды pKD46, проводят 2 пассажа на среде LA со спектиномицином при 42°С и полученные колонии тестируют на чувствительность к ампициллину.Availability of a product with a size of 4045 b.p. interpreted as integration of the cassette into the target locus. To remove the helper plasmid pKD46, spend 2 passages on LA medium with spectinomycin at 42°C and the resulting colonies are tested for sensitivity to ampicillin.
В результате отобрано 5 клонов, несущих делецию в гене yhjE.As a result, 5 clones carrying a deletion in the yhjE gene were selected.
Пример 2. Отбор наиболее продуктивного клонаExample 2. Selection of the most productive clone
Для проверки влияния делеции гена yhjE на продукцию L-треонина проводят пробирочную ферментацию пяти отобранных клонов, в качестве контрольного штамма используют родительский штамм ВКПМ В-13207.To test the effect of deletion of the yhjE gene on the production of L-threonine, test-tube fermentation of five selected clones is carried out, the parent strain VKPM B-13207 is used as a control strain.
Штаммы выращивают на чашках со средой LA в течение 24 часов при 37°С. Для приготовления инокулята используют посевную среду следующего состава (мас. %)The strains are grown on cups with medium LA for 24 hours at 37°C. To prepare the inoculum, use the seed medium of the following composition (wt.%)
В пробирки объемом 50 мл с рабочим объемом 5 мл посевной среды вносят биомассу клеток до стартового значения оптической плотности равной ОП660нм 0,1 ед. Пробирки инкубируют на роторной качалке в течение 5 часов при 37°С и скорости перемешивания 220 об/мин. Для основного процесса ферментации используют среду следующего состава (мас. %):In test tubes with a volume of 50 ml with a working volume of 5 ml of seed medium, cell biomass is added to the starting value of the optical density equal to OP 660nm 0.1 units. The tubes are incubated on a rotary shaker for 5 hours at 37°C and agitation speed of 220 rpm. For the main fermentation process, a medium of the following composition is used (wt.%):
Растворы глюкозы, сульфата марганца и сульфата магния стерилизуют отдельно автоклавированием при 121°С в течение 40 мин. Навески СаСО3 по 40 мг стерилизуют в стеклянных пробирках автоклавированием при 121°С в течение 20 мин. рН доводят до значения 7,0. Раствор сульфата железа стерилизуют фильтрованием через мембрану диаметром пор 22 мкм.Solutions of glucose, manganese sulfate and magnesium sulfate are sterilized separately by autoclaving at 121° C. for 40 minutes. 40 mg portions of CaCO 3 are sterilized in glass test tubes by autoclaving at 121°C for 20 minutes. The pH is adjusted to a value of 7.0. The ferrous sulfate solution is sterilized by filtration through a membrane with a pore diameter of 22 μm.
Полученный инокулят вносят в пробирки объемом 50 мл с рабочим объемом 2 мл ферментационной среды до стартовой оптической плотности ОП660 нм 0,1 ед. Клетки культивируют в течение 24 часов при 37°С на роторной качалке - 220 об/мин.The resulting inoculum is introduced into test tubes with a volume of 50 ml with a working volume of 2 ml of the fermentation medium to a starting optical density of OD 660 nm of 0.1 units. Cells are cultured for 24 hours at 37°C on a rotary shaker - 220 rpm.
После выращивания количество накопленного в среде L-треонина определяют с методом ВЭЖХ (Waters 2695, Alliance). Результаты ферментации пяти клонов приведены в табл. 1.After cultivation, the amount of L-threonine accumulated in the medium is determined with the HPLC method (Waters 2695, Alliance). The results of the fermentation of the five clones are shown in table. 1.
Как видно из табл. 1, клон 3, содержащий делецию гена yhjE, накапливает большее количество L-треонина по сравнению с контрольным штаммом ВКПМ В-13207. Отобранный клон 1 депонирован в Биоресурсном Центре Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» (117545 Москва, 1-ый Дорожный пр-д, д. 1) как штамм Escherichia coli ВКПМ В-14270.As can be seen from Table. 1, clone 3 containing the deletion of the yhjE gene accumulates more L-threonine than the control strain VKPM B-13207. Selected clone 1 was deposited at the Bioresource Center All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (BRC VKPM) National Research Center "Kurchatov Institute" (117545 Moscow, 1st Dorozhny pr-d, 1) as a strain of Escherichia coli VKPM V-14270.
Заявляемый штамм Escherichia coli ВКПМ В-14270 характеризуется следующими признаками:The claimed strain of Escherichia coli VKPM B-14270 is characterized by the following features:
Культурально-морфологические характеристикиCultural and morphological characteristics
Грамм-отрицательная бактерия. Суточная культура в жидкой LB представлена слабо подвижными клетками округлой формы 1 мкм в диаметре. При культивировании на L-агаре в течение 18-24 часов при 37°С образует круглые, беловатый, полупрозрачные на свет колонии колонии 1-2 мм, поверхность колонии гладкая, края ровные или слегка волнистые, центр колоний приподнят, структура однородная, консистенция пастообразная, легко эмульгируется. При культивировании на агаризованной среде Эндо (мас. %: пептон - 1, лактоза - 1, Na2SO3 - 0,33, K2HPO4 - 0,25, фуксин основной - 0,03, агар-агар - 2%, вода - остальное) при 37°С образуются колонии, круглой формы с ровным четко очерченным краем малиново-красного цвета с металлическим блеском. Диаметр колоний 0,5 - 1,5 мм.Gram-negative bacterium. The daily culture in liquid LB is represented by weakly motile cells of a rounded shape 1 µm in diameter. When cultivated on L-agar for 18-24 hours at 37°C, it forms round, whitish, translucent to light colonies of 1-2 mm colonies, the surface of the colony is smooth, the edges are even or slightly wavy, the center of the colonies is raised, the structure is homogeneous, the consistency is pasty , easy to emulsify. When cultivating on Endo agar medium (wt.%: peptone - 1, lactose - 1, Na 2 SO 3 - 0.33, K 2 HPO 4 - 0.25, basic fuchsin - 0.03, agar-agar - 2% , water - the rest) at 37 ° C, colonies are formed, round in shape with a smooth, clearly defined edge of crimson-red color with a metallic sheen. The diameter of the colonies is 0.5 - 1.5 mm.
Физиолого-биохимические характеристики.Physiological and biochemical characteristics.
Факультативный анаэроб. Сахара не сбраживает. Ассимилирует: D-глюкозу, L-арабинозу, D-маннитол, D-ксилозу, в меньшей мере: D-галактозу, D-лактозу. Отсутствует способность к гидролизу крахмала. Отсутствует потребность в факторах роста. Штамм устойчив к хлорамфениколу. Оптимальное значение рН для роста 7,2-7,4. Не растет при температурах свыше 45°С. Оптимальная температура роста 37°С. Штамм не патогенен.Facultative anaerobe. Sugar does not ferment. Assimilates: D-glucose, L-arabinose, D-mannitol, D-xylose, to a lesser extent: D-galactose, D-lactose. There is no ability to hydrolyze starch. There is no need for growth factors. The strain is resistant to chloramphenicol. The optimal pH value for growth is 7.2-7.4. Does not grow at temperatures above 45°C. The optimum growth temperature is 37°C. The strain is not pathogenic.
Таким образом, получен штамм Escherichia coli ВКПМ В-14270 с инактивированным геном yhjE, способный синтезировать до 17,3 г/л L-треонина при культивировании в пробирках.Thus, a strain of Escherichia coli VKPM B-14270 with an inactivated yhjE gene was obtained, capable of synthesizing up to 17.3 g/l of L-threonine when cultivated in test tubes.
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2787585C1 true RU2787585C1 (en) | 2023-01-11 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8623619B2 (en) * | 2009-02-09 | 2014-01-07 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | Process for producing L-amino acid |
| RU2697499C1 (en) * | 2018-09-28 | 2019-08-14 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Bacterium of the form escherichia coli - an l-threonine producer, a method for microbiological synthesis of l-threonine using it |
| RU2728251C1 (en) * | 2019-11-22 | 2020-07-28 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Escherichia coli strain with inactivated yche gene - l-threonine producer |
| RU2758269C1 (en) * | 2020-10-05 | 2021-10-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Escherichia coli strain with the inactivated lysp gene - l-threonine producer |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8623619B2 (en) * | 2009-02-09 | 2014-01-07 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | Process for producing L-amino acid |
| RU2697499C1 (en) * | 2018-09-28 | 2019-08-14 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Bacterium of the form escherichia coli - an l-threonine producer, a method for microbiological synthesis of l-threonine using it |
| RU2728251C1 (en) * | 2019-11-22 | 2020-07-28 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Escherichia coli strain with inactivated yche gene - l-threonine producer |
| RU2758269C1 (en) * | 2020-10-05 | 2021-10-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Escherichia coli strain with the inactivated lysp gene - l-threonine producer |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ВЫБОРНАЯ Т.В. И ДР. Использование альтернативного пути синтеза изолейцина в штаммах Escherichia coli - продуцентах треонина. Биотехнология, 2019. Т. 35, N4, C. 42-54. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2144564C1 (en) | Dna fragment rhtb encoding synthesis of protein rhtb that determines resistance of bacterium escherichia coli to l-homoserine and method of l-amino acid producing | |
| KR100792095B1 (en) | - - genetically engineered l-tryptophan producing recombinant escherichia coli which has originally l-phenylalanine production character and the method for producing l-tryptophan using the microorganism | |
| ES2382473T3 (en) | L-threonine production procedure using a microorganism that has the inactivated galR gene | |
| US20090093030A1 (en) | fadR KNOCK-OUT MICROORGANISM AND METHODS FOR PRODUCING L-THREONINE | |
| CN100582220C (en) | E.coli mutant containing mutant genes related with tryptophan biosynthesis and production method of tryptophan by using the same | |
| CN1351660A (en) | directed evolution of microorganisms | |
| KR20000029691A (en) | Novel strains of escherichia coli, methods of preparing the same and use thereof in fermentation processes for l-threonine production | |
| RU2697499C1 (en) | Bacterium of the form escherichia coli - an l-threonine producer, a method for microbiological synthesis of l-threonine using it | |
| RU2728251C1 (en) | Escherichia coli strain with inactivated yche gene - l-threonine producer | |
| RU2787585C1 (en) | Escherichia coli strain with inactive yhje gene producing l-threonine | |
| RU2787583C1 (en) | Escherichia coli strain with inactive yqeg gene producing l-threonine | |
| RU2774071C1 (en) | ESCHERICHIA COLI STRAIN WITH INACTIVATED sdaC GENE - L-THREONINE PRODUCER | |
| RU2775206C1 (en) | Escherichia coli strain with inactivated yjem gene - l-threonine producer | |
| RU2731282C1 (en) | Escherichia coli strain with inactivated ttdt gene - l-threonine producer | |
| RU2748676C1 (en) | Escherichia coli strain with inactivated ydgi gene - producer of l-threonine | |
| RU2758269C1 (en) | Escherichia coli strain with the inactivated lysp gene - l-threonine producer | |
| RU2728242C1 (en) | Escherichia coli strain - l-threonine producer | |
| RU2697219C1 (en) | Recombinant escherichia coli bacterium strain - l-threonine producer | |
| ZA200507688B (en) | TDCBC/PCKA gene-inactivated microorganism and met hod of producing I-threonine using the same | |
| CN100342006C (en) | Method for producing L-threonine | |
| WO2005075626A1 (en) | MICROORGANISM PRODUCING L-THREONINE HAVING INACTIVATED tyrR GENE, METHOD OF PRODUCING THE SAME AND METHOD OF PRODUCING L-THREONINE USING THE MICROORGANISM | |
| KR20230005137A (en) | Method for producing heparoic acid and bacteria of the genus Escherichia having the ability to produce heparoic acid | |
| RU2817252C1 (en) | Strain escherichia coli - producer of l-threonine | |
| US20090298138A1 (en) | Microorganism producing l-threonine having an inactivated lysr gene, method for producing the same and method for producing l-threonine using the microorganism | |
| JP4582573B2 (en) | Method for producing pyruvic acid and method for producing L-valine |