RU2785461C1 - Экспресс-метод определения чувствительности грамотрицательных бактерий к бактериофагам - Google Patents
Экспресс-метод определения чувствительности грамотрицательных бактерий к бактериофагам Download PDFInfo
- Publication number
- RU2785461C1 RU2785461C1 RU2022106346A RU2022106346A RU2785461C1 RU 2785461 C1 RU2785461 C1 RU 2785461C1 RU 2022106346 A RU2022106346 A RU 2022106346A RU 2022106346 A RU2022106346 A RU 2022106346A RU 2785461 C1 RU2785461 C1 RU 2785461C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- bacteriophage
- bacteriophages
- sensitivity
- value
- gram
- Prior art date
Links
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 title claims abstract description 63
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 25
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 title claims abstract description 25
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 15
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 5
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 4
- 230000003616 anti-epidemic Effects 0.000 description 3
- 200000000015 coronavirus disease 2019 Diseases 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 239000002609 media Substances 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 229940064005 Antibiotic throat preparations Drugs 0.000 description 2
- 229940083879 Antibiotics FOR TREATMENT OF HEMORRHOIDS AND ANAL FISSURES FOR TOPICAL USE Drugs 0.000 description 2
- 229940042052 Antibiotics for systemic use Drugs 0.000 description 2
- 229940042786 Antitubercular Antibiotics Drugs 0.000 description 2
- 229940093922 Gynecological Antibiotics Drugs 0.000 description 2
- 229940024982 Topical Antifungal Antibiotics Drugs 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial Effects 0.000 description 2
- 230000000845 anti-microbial Effects 0.000 description 2
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogens Species 0.000 description 2
- 230000000721 bacterilogical Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000001427 coherent Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious Effects 0.000 description 2
- 229940079866 intestinal antibiotics Drugs 0.000 description 2
- 229940005935 ophthalmologic Antibiotics Drugs 0.000 description 2
- 244000052769 pathogens Species 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 206010060945 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 206010053983 Corona virus infection Diseases 0.000 description 1
- 101710011667 DELEC1 Proteins 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- 229940045505 Klebsiella pneumoniae Drugs 0.000 description 1
- 210000004072 Lung Anatomy 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 229940076185 Staphylococcus aureus Drugs 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002498 deadly Effects 0.000 description 1
- 101700038865 dec-1 Proteins 0.000 description 1
- 101710015544 decr-1.2 Proteins 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000036457 multidrug resistance Effects 0.000 description 1
- 238000004848 nephelometry Methods 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- 244000039328 opportunistic pathogens Species 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа быстрого определения чувствительности грамотрицательных палочковидных бактерий к бактериофагам с помощью устройства, обеспечивающего выращивание бактерий совместно с бактериофагами в лунках с плотной питательной средой. Экспресс-метод определения чувствительности грамотрицательных бактерий к соответствующим бактериофагам предусматривает расчет коэффициента по формуле
где K - количество микроколоний в поле зрения контрольного образца, В - количество микроколоний в поле зрения образца с бактериофагом, а о степени чувствительности бактерии к бактариофагу судят по значению коэффициента, причем, если значение коеффициента k больше или равно 10, исследуемый микроорганизм считают чувствительным к бактериофагу, если значение k лежит в интервале от 2 до 10, исследуемый микроорганизм считают слабо чувствительным к бактериофагу, при значении k меньше 2, исследуемый микроорганизм считают не чувствительным к бактериофагу. Изобретение позволяет ускорить определения чувствительности грамотрицательных палочковидных бактерий к бактериофагам и уже через 2,5-3 часа судить об отношении бактериального штамма к бактериофагам. 1 ил., 2 табл.
Description
Изобретение относится к области микробиологии и касается способа быстрого определения чувствительности грамотрицательных палочковидных бактерий к бактериофагам с помощью устройства, обеспечивающего выращивание бактерий совместно с бактериофагами в лунках с плотной питательной средой.
Бактериальные инфекции, в том числе связанные с оказанием медицинской помощи (ИСМП), представляют собой актуальную проблему современного здравоохранения, занимающую десятое место среди причин смертности населения. В настоящее время во всем мире отмечается глобальная тенденция к росту устойчивости бактерий к антибактериальным препаратам, а разработка новых препаратов идет крайне медленными темпами. Если эта тенденция продолжится, то перечень средств для борьбы с устойчивыми микроорганизмами может быть исчерпан, что приведет к тяжелым последствиям (Rhee С, Kadri SS, Dekker JP, et al. Prevalence of Antibiotic-Resistant Pathogens in Culture-Proven Sepsis and Outcomes Associated With Inadequate and Broad-Spectrum Empiric Antibiotic Use. JAMA Netw Open. 2020;3(4):e202899. Published 2020 Apr 1. DOI: 10.1001/jamanetworkopen.2020.2899). Наибольшую обеспокоенность вызывает дальнейшее распространение в стационарах возбудителей бактериальных осложнений новой коронавирусной инфекции COVID-19 (Bengoechea J A, Bamford CG. SARS-CoV-2, bacterial co-infections, and AMR: the deadly trio in COVID-19? EMBO Mol Med. 2020; 12(7):e 12560. DOI: 10.15252/emmm.202012560). Пот данным ряда авторов наиболее частым возбудителем бактериальных осложнений при COVID-19 являются грамотрицательные палочки, особенно Klebsiella pneumoniae. Они часто обладают множественной устойчивостью к антибиотикам. По некоторым данным доля резистентных штаммов может достигать 95%. По данным AMRmap - Российской онлайн платформы анализа данных резистентности к антимикробным препаратам, - резистентность российских штаммов является одной из самых высоких в мире. Поэтому необходимо вести научно-исследовательские работы для создания новых средств лечения, эффективных против инфекций с множественной лекарственной устойчивостью.
Оказание качественной медицинской помощи всецело зависит от эпидемиологической безопасности организации лечебно-диагностического процесса (Национальная концепция профилактики инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 06.11.2011) // Справочно-правовая система «Консультант Плюс»: [Электронный ресурс] /Компания «Консультант Плюс»). Поэтому приоритетным является разработка и применение дополнительных средств борьбы с инфекционными заболеваниями, в том числе бактериофагов.
После некоторого ослабления интереса к бактериофагам в эпоху успешного применения антибиотиков медицинское сообщество вновь обратило свой взор на альтернативный антимикробный препарат. Распоряжением правительства РФ 25 сентября 2017 г. принята «Стратегия предупреждения распространения антимикробной резистентности в РФ на период до 2030 года», в которой указывается на необходимость «разработки и внедрения биологических лекарственных препаратов, в том числе препаратов на основе бактериофагов; разработки регламентов применения бактериофагов в различных областях здравоохранения, ветеринарии и растениеводстве; усовершенствования методов профилактики и лечения инфекционных заболеваний с помощью бактериофагов путем поэтапного введения препаратов бактериофагов в отраслевые стандарты в качестве противомикробных средств». В настоящее время медицинская промышленность России производит ряд бактериофаговых препаратов против ряда патогенных и условно-патогенных возбудителей инфекций. Для более быстрого выбора эффективных терапевтических фагов в качестве альтернативного антибактериального препарата необходимо в самые коротки сроки определить чувствительность выделенных культур микроорганизмов к предполагаемым к использованию бактериофагам. Однако стандартное время данного исследования (16-24 часа) слишком велико для быстрого принятия решения о выборе препарата для терапии. В связи с этим особого внимания заслуживает разработка экспресс-методов определения чувствительности бактерий к фагам. Неоспоримым преимуществом экспрессных методов определения чувствительности к бактериофагам является возможность значительного ускорения процесса назначения лечения, особенно в тех случаях, когда возбудитель инфекции устойчив к антибиотикам и единственной альтернативой может быть использование бактериофагов.
В настоящее время рядом исследователей описаны современные методы исследования чувствительности бактерий к фагам. Так, предложен способ постановки и учета результатов чувствительности к бактериофагам в иммунологических планшетах (Negm, AC, Sandulescu О, Рора М, et al. Experimental approach for bacteriophage susceptibility testing of planktonic and sessile bacterial populations - Study protocol. Germs. 2014;4(4):92-96. Published 2014 Dec 1. doi:10.11599/germs.2014.1062). Такой способ постановки удобен в реализации, однако он занимает, как и в классических методах исследования (Национальная ассоциация специалистов по контролю инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (НП «НАСКИ») - Федеральные клинические рекомендации «Рациональное применение бактериофагов в лечебной и противоэпидемической практике», 2014 г. ), 18-24 часа.
К более быстрым методам исследования чувствительности бактерий к бактериофагам относится когерентная флуктуационная нефелометрия (Экспресс-диагностика чувствительности проблемных микроорганизмов к бактериофагам с использованием отечественного когерентного флуктуационного нефелометра / В.В. Щелкова, Е.В. Русанова, А.С.Гурьев [и др.] // Проблемы медицинской микологии. - 2020. - Т. 22. - №3. - С. 152). Однако этот метод позволяет получить результат не ранее чем через 6 часов.
Более быструю оценку восприимчивости Staphylococcus aureus к стафилококковому бактериофагу удавалось получить за 3 часа с помощью безлинзового визуализирующего устройства (Perlemoine Р, Marcoux PR, Picard Е, Hadji Е, Zelsmann М, Mugnier G, Marchet A, Resch G, O'Connell L, Lacot E. Phage susceptibility testing and infectious titer determination through wide-field lensless monitoring of phage plaque growth. PLoS One. 2021 Mar 23;16(3):e0248917. doi: 10.1371/journal.pone.0248917. PMID: 33755710; PMCID: PMC7987195). Однако описанная методика на позволяет осуществлять подобные исследования без специального устройства, компьютерной программы, связанной с ним, и самое главное - не предлагает критериев оценки чувствительности и резистентности бактерий к фагу. Таким образом, оно не может быть воспроизведено в рутинной практике бактериолога.
Также описана экспрессная методика оценки эффективности специфических бактериофагов на культуре клеток (Захарова Ю. А., Федотова О. С, Шмелева Н. А. Новый способ оценки специфической активности бактериофага с использованием клеточной культуры ЛЭЧ-3 // Медицинский алфавит. Серия «Обозрение». - 2019. - Т. 3. - 32 (407). - С. 16-18), позволяющая получить результат через 3 часа. Однако для постановки этого метода необходимы специальные диплоидные клетки легкого эмбриона человека (ЛЭЧ - 3), которые должны быть стандартизированы и поддерживаться в определенных условиях. Это также неудобно для использования в рутинной практике бактериологической лаборатории.
Изобретение направлено на разработку экспрессного определения чувствительности грамотрицательных бактерий к бактериофагам. При этом сокращено время определения чувствительности, что способствует более быстрому назначению терапии, и количества реагентов, используемых для постановки метода, что делает этот способ более экономически выгодным.
Экспресс-метод определения чувствительности грамотрицательных бактерий к бактериофагам предусматривает внесение в питательную среду инокулята бактерии и исследуемые жидкие препараты бактериофагов. Через 2,5-3 часа нахождения исследуемого образца при температуре 36,8+0,2°С его рассматривают под микроскопом с увеличением не менее 400 крат. Затем подсчитывают в поле зрения микроскопа количество выросших микроколоний грамотрицательных бактерий, которое сравнивают с количеством микроколоний в образце без бактериофага. Далее рассчитывают коэффициент, по значению которого судят о степени чувствительности бактерии к бактариофагу. Коеффициент рассчитывают по формуле:
где K - количество микроколоний в поле зрения контрольного образца, В - количество микроколоний в поле зрения образца с бактериофагом, а о степени чувствительности бактерии к бактариофагу судят по значению коэффициента, причем, если значение коэффициента k больше или равно 10, исследуемый микроорганизм считают чувствительным к бактериофагу, если значение k лежит в интервале от 2 до 10, исследуемый микроорганизм считают слабо чувствительным к бактериофагу, при значении к меньше 2, исследуемый микроорганизм считают не чувствительным к бактериофагу.
Пограничные значения коэффициентов получены путем сопоставления с результатами исследования чувствительности к бактериофагам, полученными с использованием классического метода (Федеральные клинические рекомендации «Рациональное применение бактериофагов в лечебной и противоэпидемической практике», (2014 г.)).
Время выращивания бактерий определено эмпирическим путем, так как в течение этого времени вырастает достаточное количество микроколоний. Температура инкубации является стандартной при такого рода исследованиях.
Сущность изобретения поясняется чертежами, где на фигуре 1 представлен вид слайда с культурами бактерий и бактериофагами.
Изобретение реализуется следующим образом: слайд FAST®, который представляет из себя пластиковую рамку с 16-ю сквозными отверстиями размерами 6x6x2 мм (2 ряда по 8 в каждом ряду) располагается в стерильной чашке Петри (рис. 1); лунки заполняются питательным агаром (температура 45°С), приготовленным из сухой среды промышленного производства в соответствии с инструкцией изготовителя; после застывания и подсушивания поверхности агара в лунки закапывается по 1 капле (25 мкл) инокулята бактерии в концентрации 1,5⋅108 КОЕ/мл (как и при определении чувствительности к АБП в соответствии с МУК 4.12.1890-04), приготовленный на физиологическом растворе NaCl; через несколько минут после подсыхания культуры на ее поверхность наносят по капле исследуемые жидкие препараты бактериофагов, предварительно промаркировав лунки (при этом одна или две лунки остаются свободными от бактериофагов, так как они будут служить контролями при подсчете колоний); чашка Петри накрывается крышкой и ставится в термостат на 3 часа при температуре 37°С; после этого чашка достается из термостата, крышка открывается, нижняя часть чашки вместе со слайдом устанавливается под объектив микроскопа с увеличением в 40 раз (таким образом, при увеличении окуляра в 10 раз достигается увеличение в 400 раз) и производится фокусировка над лункой с контролем культуры; подсчитывается количество микроколоний изучаемых бактерий в поле зрения, о чем производится запись; далее объектив перемещается к лунке с бактериофагом, производится подсчет микроколоний в поле зрения; рассчитывается коэффициент по формуле:
где k - коэффициент, K - количество микроколоний в поле зрения контрольного образца, В - количество микроколоний в поле зрения образца с бактериофагом.
В зависимости от полученных результатов в заключении указывается степень чувствительности конкретного микроорганизма к действию конкретного бактериофага:
1) k больше или равно 10 - исследуемый микроорганизм чувствителен к бактериофагу;
2) k больше или равно 2, но менее 10 - исследуемый микроорганизм слабо чувствителен к бактериофагу;
3) k менее 2 - исследуемый микроорганизм не чувствителен к бактериофагу.
В случае, если В равно 0, считаем, что этот показатель равен 1, и штамм признается чувствительным к бактериофагу.
Примеры, подтверждающие результаты от реализации способа, представлены в таблицах 1 и 2.
При подсчете микроколоний необходимо иметь в виду, что учету подлежат только сформировавшиеся микроколонии; отдельно лежащие бактериальные клетки не
учитываются, как клетки, не имеющие возможности выжить и/иди сформировать колонию.
Все проведенные эксперименты сверяли с классическим методом определения чувствительности к бактериофагам согласно Федеральным клиническим рекомендациям «Рациональное применение бактериофагов в лечебной и противоэпидемической практике», (2014 г, зудьтате уже через 2,5-3 часа можно судить об отношении бактериального штамма к бактериофагам. Этот способ не требует дополнительного оснащения, легко выполним в бактериологической лаборатории любого уровня. Он позволит получать результат в 6-8 раз быстрее, чем при использовании классической методики, что в свою очередь позволит своевременно назначить пациенту адекватную терапию, а значит, улучшить его состояние здоровья.
Claims (3)
- Экспресс-метод определения чувствительности грамотрицательных бактерий к бактериофагам, предусматривающий внесение в питательную среду инокулята бактерии и исследуемые жидкие препараты бактериофагов, отличающийся тем, что через 2,5-3 часа нахождения исследуемого образца при температуре 36,8±0,2°С его рассматривают под микроскопом с увеличением не менее 400 крат с последующим подсчетом в поле зрения микроскопа количества выросших микроколоний грамотрицательных бактерий, которое сравнивают с количеством микроколоний в образце без бактериофага, и рассчитывают коэффициент по формуле
- где K - количество микроколоний в поле зрения контрольного образца, В - количество микроколоний в поле зрения образца с бактериофагом, а о степени чувствительности бактерии к бактариофагу судят по значению коэффициента, причем, если значение коеффициента k больше или равно 10, исследуемый микроорганизм считают чувствительным к бактериофагу, если значение k лежит в интервале от 2 до 10, исследуемый микроорганизм считают слабо чувствительным к бактериофагу, при значении k меньше 2, исследуемый микроорганизм считают не чувствительным к бактериофагу.
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2785461C1 true RU2785461C1 (ru) | 2022-12-08 |
Family
ID=
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
ЗАХАРОВА Ю. А., и др., Новый способ оценки специфической активности бактериофага с использованием клеточной культуры ЛЭЧ-3, Медицинский алфавит, Серия "Обозрение", 2019, т. 3. - 32 (407), с. 16-18. PERLEMOINE Р, et al, Phage susceptibility testing and infectious titer determination through wide-field lensless monitoring of phage plaque growth. PLoS One. 2021 Mar 23;16(3):e0248917. doi: 10.1371/journal.pone.0248917. PMID: 33755710; PMCID: PMC7987195. ЩЕЛКОВА В.В., и др., Проблемы медицинской микологии, 2020, т. 22., N 3, c. 152.. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Birgersson et al. | Species identification and some characteristics of coagulase-negative staphylococci isolated from bovine udders | |
Biadglegne et al. | Bacterial isolates from wound infection and their antimicrobial susceptibility pattern in Felege Hiwot referral Hospital North West Ethiopia | |
Adetayo et al. | Prevalence of methicillin resistant Staphylococcus aureus from clinical specimens in Ibadan, Nigeria | |
Kumar et al. | Prevalence, current antibiogram and risk factors associated with mastitis in dairy goats in Punjab | |
Welch et al. | Method for determining the effect of chemical antisepsis on phagocytosis | |
RU2785461C1 (ru) | Экспресс-метод определения чувствительности грамотрицательных бактерий к бактериофагам | |
Blom et al. | Validation of FLEXICULT™ SSI-Urinary kit for use in the primary health care setting | |
Kadhum et al. | Staphylococcus aureus Incidence in Some Patients with a Topic Dermatitis in Baghdad City | |
Lainjong | Identification of Air Bacteria Using Gram Style Methods in The Integrated Laboratory of Bina Mandiri University Gorontalo | |
Sampson et al. | Incidence of Staphylococcus aureus wound infection amongst patients attending university of Port Harcourt teaching hospital, Rivers State, Nigeria | |
Al-Asadi et al. | Isolation and identification of Multidrug-Resistant (MDR) bacteria from ophthalmic patients in some hospitals in Basrah | |
CZ33918U1 (cs) | Testovací sada ke stanovení antimikrobiální biologické účinnosti fágových přípravků na bakterii Staphylococcus aureus | |
RU2628063C1 (ru) | Способ прогнозирования транслокации E.coli из кишечника при некультивируемом типе инфекционного процесса в эксперименте на кроликах | |
Ogefere et al. | Prevalence of methicillin-resistant staphylococci among apparently healthy students attending a tertiary institution in Benin City, Nigeria | |
Neves et al. | Effectiveness of disinfection of anesthetics tubes in oral surgery-an in vitro study | |
RU2781985C1 (ru) | Способ определения чувствительности бактерий к антисептическим средствам в растворе | |
RU2732222C1 (ru) | Способ диагностики бактериемии | |
Kitara | Antibiotic susceptibility of Staphylococcus aureus in HIV positive and HIV negative primary pyomyositis patients in Northern Uganda | |
Choi et al. | Single-cell morphological analysis for rapid antimicrobial susceptibility test | |
Faridi et al. | An Easy New Modified Method for Detection of Antibacterial Susceptibility in Biofilm-Growing Bacteria | |
Nyamngee et al. | Prevalence of Biofilm Forming Staphylococci from Clinical Isolates in University of Ilorin Teaching Hospital, North Central Nigeria | |
Nyamgee et al. | Prevalence of biofilm staphylococci from clinical isolates in University of Ilorin Teaching Hospital, North Central Nigeria | |
Jamal et al. | Abasyn Journal of Life Sciences Open Access | |
Kadhim et al. | The Most Common Isolated Pathogen Bacteria from Post-Surgical Operation Cases | |
Alwan et al. | Evaluation of The Environment in Operating Theater and Delivery Unit and Neonatal Care Unit at Al-Zahra Hospital for Women and Children |