RU2784527C2 - Method for production of particles forming pickering emulsion by derivatization of cellulose-enriched food fibers, using prepared enzymes and emulsions - Google Patents
Method for production of particles forming pickering emulsion by derivatization of cellulose-enriched food fibers, using prepared enzymes and emulsions Download PDFInfo
- Publication number
- RU2784527C2 RU2784527C2 RU2020123211A RU2020123211A RU2784527C2 RU 2784527 C2 RU2784527 C2 RU 2784527C2 RU 2020123211 A RU2020123211 A RU 2020123211A RU 2020123211 A RU2020123211 A RU 2020123211A RU 2784527 C2 RU2784527 C2 RU 2784527C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- enzyme
- phf
- fiber
- cellulose
- dietary fiber
- Prior art date
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 404
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 404
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 206
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 title claims abstract description 142
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 title claims abstract description 142
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 title claims abstract description 139
- 239000000835 fiber Substances 0.000 title claims abstract description 138
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 9
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 title 1
- 235000014106 fortified food Nutrition 0.000 title 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 60
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 claims abstract description 52
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 claims abstract description 50
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims abstract description 36
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims abstract description 27
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 101710035539 PG14 Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 101710040957 PGN1 Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 101710035540 plaa2 Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 108010093305 exopolygalacturonase Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 11
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 claims description 70
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 claims description 6
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 58
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 8
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 abstract description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 abstract description 6
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 abstract description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 abstract description 5
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 abstract description 5
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 description 263
- 235000013325 dietary fiber Nutrition 0.000 description 189
- 229920001307 poly(hydroxymethylethylene hydroxymethyl formal) Polymers 0.000 description 167
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 93
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 93
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 82
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 64
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 60
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 60
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 60
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 59
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 58
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 52
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 43
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 43
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 41
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 39
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 36
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 36
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 32
- 230000001603 reducing Effects 0.000 description 31
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 30
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 29
- 239000000047 product Substances 0.000 description 29
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 28
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 27
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 27
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 26
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- 108091003117 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 25
- 229940098773 Bovine Serum Albumin Drugs 0.000 description 25
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 25
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 22
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 22
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 21
- 240000000280 Theobroma cacao Species 0.000 description 20
- SRBFZHDQGSBBOR-SQOUGZDYSA-N Xylose Natural products O[C@@H]1CO[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 20
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 20
- 108010008885 Cellulose 1,4-beta-Cellobiosidase Proteins 0.000 description 19
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 description 17
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 17
- 235000009470 Theobroma cacao Nutrition 0.000 description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 description 16
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 15
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 15
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 15
- 235000019749 Dry matter Nutrition 0.000 description 14
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 14
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 14
- 108010029182 EC 4.2.2.10 Proteins 0.000 description 13
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 13
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 13
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 description 13
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 13
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 13
- 108010087558 pectate lyase Proteins 0.000 description 12
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 11
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 11
- 239000002609 media Substances 0.000 description 11
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 11
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 11
- 241000195940 Bryophyta Species 0.000 description 10
- 210000002421 Cell Wall Anatomy 0.000 description 10
- 229920002230 Pectic acid Polymers 0.000 description 10
- 229960003487 Xylose Drugs 0.000 description 10
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 10
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- 235000011929 mousse Nutrition 0.000 description 10
- 108010044725 pectate disaccharide-lyase Proteins 0.000 description 10
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 10
- 230000000087 stabilizing Effects 0.000 description 10
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 9
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 9
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 9
- 230000001965 increased Effects 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N β-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 9
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 8
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 8
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 8
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 8
- 210000004080 Milk Anatomy 0.000 description 8
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 8
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 238000004581 coalescence Methods 0.000 description 8
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 8
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 8
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 8
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 8
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 8
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 8
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 8
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 8
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 8
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 108020004410 pectinesterase Proteins 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 8
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 8
- 235000019220 whole milk chocolate Nutrition 0.000 description 8
- 229940080237 Sodium Caseinate Drugs 0.000 description 7
- 229940005741 Sunflower lecithin Drugs 0.000 description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 235000013736 caramel Nutrition 0.000 description 7
- 235000013353 coffee beverage Nutrition 0.000 description 7
- 238000001218 confocal laser scanning microscopy Methods 0.000 description 7
- 230000004059 degradation Effects 0.000 description 7
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 7
- 230000000593 degrading Effects 0.000 description 7
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 7
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 7
- -1 ferulic acid esters Chemical class 0.000 description 7
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 7
- 239000008274 jelly Substances 0.000 description 7
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 7
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 7
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 7
- 239000007762 w/o emulsion Substances 0.000 description 7
- 229940106157 CELLULASE Drugs 0.000 description 6
- AEMOLEFTQBMNLQ-YMDCURPLSA-N D-Galacturonic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-YMDCURPLSA-N 0.000 description 6
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 6
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 6
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 6
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 6
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 6
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 6
- 230000001804 emulsifying Effects 0.000 description 6
- 230000002538 fungal Effects 0.000 description 6
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 6
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 6
- 238000003801 milling Methods 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 6
- 239000010318 polygalacturonic acid Substances 0.000 description 6
- 230000002797 proteolythic Effects 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 6
- 235000021307 wheat Nutrition 0.000 description 6
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 5
- LCLHHZYHLXDRQG-ZNKJPWOQSA-N Pectic acid Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)O[C@H](C(O)=O)[C@@H]1OC1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O2)C(O)=O)O)[C@@H](C(O)=O)O1 LCLHHZYHLXDRQG-ZNKJPWOQSA-N 0.000 description 5
- 108091005771 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- 101700006119 XYL1 Proteins 0.000 description 5
- 101700047052 XYLA Proteins 0.000 description 5
- 101700051122 XYLD Proteins 0.000 description 5
- 101700065756 XYN4 Proteins 0.000 description 5
- 101700001256 Xyn Proteins 0.000 description 5
- 101710022772 bgc Proteins 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic Effects 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 5
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 5
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 5
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 5
- 101700065693 xlnA Proteins 0.000 description 5
- 101700006979 xyl2 Proteins 0.000 description 5
- 101710017636 xynS20E Proteins 0.000 description 5
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 4
- 101700086558 CELA1 Proteins 0.000 description 4
- 229920001405 Coding region Polymers 0.000 description 4
- 102000033147 ERVK-25 Human genes 0.000 description 4
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 4
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 4
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 4
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 4
- 238000004164 analytical calibration Methods 0.000 description 4
- 150000001479 arabinose derivatives Chemical class 0.000 description 4
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 4
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 4
- 229940071162 caseinate Drugs 0.000 description 4
- 235000019219 chocolate Nutrition 0.000 description 4
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 4
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 4
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000000416 hydrocolloid Substances 0.000 description 4
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 230000001264 neutralization Effects 0.000 description 4
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 4
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 4
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 4
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 3
- 101700010451 CELB Proteins 0.000 description 3
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 3
- 101700041462 GUX2 Proteins 0.000 description 3
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 3
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 229920002521 Macromolecule Polymers 0.000 description 3
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 3
- 229960003104 Ornithine Drugs 0.000 description 3
- 241001659863 Panna Species 0.000 description 3
- 108010043958 Peptoids Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating Effects 0.000 description 3
- 229920000617 arabinoxylan Polymers 0.000 description 3
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 3
- 230000024881 catalytic activity Effects 0.000 description 3
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 3
- 101700046922 cex Proteins 0.000 description 3
- 235000014156 coffee whiteners Nutrition 0.000 description 3
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000001461 cytolytic Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 3
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 3
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 3
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N formic acid Chemical compound OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 3
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 3
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 3
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid group Chemical group C(CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)(=O)O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 3
- 238000010951 particle size reduction Methods 0.000 description 3
- 230000002351 pectolytic Effects 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 229920001221 xylan Polymers 0.000 description 3
- 150000004823 xylans Chemical class 0.000 description 3
- 125000000969 xylosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO1)* 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N α-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 3
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N β-Alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KSEBMYQBYZTDHS-HWKANZROSA-M (E)-Ferulic acid Natural products COC1=CC(\C=C\C([O-])=O)=CC=C1O KSEBMYQBYZTDHS-HWKANZROSA-M 0.000 description 2
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 2
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000189 Arabinogalactan Polymers 0.000 description 2
- 239000001904 Arabinogalactan Substances 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 2
- 241000228215 Aspergillus aculeatus Species 0.000 description 2
- 101710014337 At1g48930 Proteins 0.000 description 2
- 241000282461 Canis lupus Species 0.000 description 2
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 2
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 2
- 229920003043 Cellulose fiber Polymers 0.000 description 2
- 229920000062 Coding strand Polymers 0.000 description 2
- GZCGUPFRVQAUEE-KCDKBNATSA-N D-(+)-Galactose Natural products OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-KCDKBNATSA-N 0.000 description 2
- AEMOLEFTQBMNLQ-DTEWXJGMSA-N D-Galacturonic acid Natural products O[C@@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-DTEWXJGMSA-N 0.000 description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L Dipotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010001817 Endo-1,4-beta Xylanases Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-2-aminohexanoic acid zwitterion Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 238000003231 Lowry assay Methods 0.000 description 2
- 238000009013 Lowry's assay Methods 0.000 description 2
- 210000001724 Microfibrils Anatomy 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 108010084695 Pea Proteins Proteins 0.000 description 2
- 229960005190 Phenylalanine Drugs 0.000 description 2
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 2
- 239000011542 SDS running buffer Substances 0.000 description 2
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 229940054967 Vanquish Drugs 0.000 description 2
- 230000036909 Volume distribution Effects 0.000 description 2
- UGXQOOQUZRUVSS-ZZXKWVIFSA-N [5-[3,5-dihydroxy-2-(1,3,4-trihydroxy-5-oxopentan-2-yl)oxyoxan-4-yl]oxy-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl (E)-3-(4-hydroxyphenyl)prop-2-enoate Chemical compound OC1C(OC(CO)C(O)C(O)C=O)OCC(O)C1OC1C(O)C(O)C(COC(=O)\C=C\C=2C=CC(O)=CC=2)O1 UGXQOOQUZRUVSS-ZZXKWVIFSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 2
- 235000019312 arabinogalactan Nutrition 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 description 2
- 101710022779 bcsZ Proteins 0.000 description 2
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 2
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic Effects 0.000 description 2
- 101710014521 cekA Proteins 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 101700026972 eglA Proteins 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060000072 faeA Proteins 0.000 description 2
- 229940114124 ferulic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000001785 ferulic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 2
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 2
- 239000000865 liniment Substances 0.000 description 2
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 2
- RXVWSYJTUUKTEA-CGQAXDJHSA-N maltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O[C@H]([C@H](O)CO)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 RXVWSYJTUUKTEA-CGQAXDJHSA-N 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 2
- 239000004533 oil dispersion Substances 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 230000036961 partial Effects 0.000 description 2
- 235000019702 pea protein Nutrition 0.000 description 2
- 101710035519 pgaX Proteins 0.000 description 2
- 101710035534 pgaX-1 Proteins 0.000 description 2
- 101710035532 pgaX-2 Proteins 0.000 description 2
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 101700015794 pro Proteins 0.000 description 2
- 230000001681 protective Effects 0.000 description 2
- 210000001938 protoplasts Anatomy 0.000 description 2
- 235000021251 pulses Nutrition 0.000 description 2
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 2
- 235000015067 sauces Nutrition 0.000 description 2
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000001953 sensory Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- ALZJERAWTOKHNO-UHFFFAOYSA-M sodium;dodecyl sulfate;3-morpholin-4-ylpropane-1-sulfonic acid Chemical compound [Na+].OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1.CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O ALZJERAWTOKHNO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 2
- IFBHRQDFSNCLOZ-RMPHRYRLSA-N (2R,3S,4S,5R,6S)-2-(hydroxymethyl)-6-(4-nitrophenoxy)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 IFBHRQDFSNCLOZ-RMPHRYRLSA-N 0.000 description 1
- NIGWMJHCCYYCSF-QMMMGPOBSA-N (2S)-2-amino-3-(4-chlorophenyl)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(Cl)C=C1 NIGWMJHCCYYCSF-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- WNNNWFKQCKFSDK-BYPYZUCNSA-N (2S)-2-aminopent-4-enoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC=C WNNNWFKQCKFSDK-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GTVVZTAFGPQSPC-QMMMGPOBSA-N (2S)-2-azaniumyl-3-(4-nitrophenyl)propanoate Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 GTVVZTAFGPQSPC-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- FYGDTMLNYKFZSV-WFYNLLPOSA-N (2S,3R,4S,5S,6R)-2-[(2R,4R,5R,6S)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-[(2R,3S,4R,5R,6S)-4,5,6-trihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1[C@@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-WFYNLLPOSA-N 0.000 description 1
- BWKMGYQJPOAASG-UHFFFAOYSA-N 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acid Chemical compound C1=CC=C2CNC(C(=O)O)CC2=C1 BWKMGYQJPOAASG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BLCJBICVQSYOIF-UHFFFAOYSA-N 2,2-diaminobutanoic acid Chemical compound CCC(N)(N)C(O)=O BLCJBICVQSYOIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXBFMLJZNCDSMP-UHFFFAOYSA-N 2-Aminobenzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC=C1N PXBFMLJZNCDSMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PEMUHKUIQHFMTH-UHFFFAOYSA-N 2-azaniumyl-3-(4-bromophenyl)propanoate Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=C(Br)C=C1 PEMUHKUIQHFMTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WTOFYLAWDLQMBZ-UHFFFAOYSA-N 2-azaniumyl-3-thiophen-2-ylpropanoate Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=CS1 WTOFYLAWDLQMBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 3,5-Dinitrosalicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC([N+]([O-])=O)=CC([N+]([O-])=O)=C1O LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LLVVMXFNKAHVEZ-GAWNPARCSA-L 4-(4-deoxy-α-D-gluc-4-enosyluronic acid)-D-galacturonate(2-) Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)C(O)O[C@H](C([O-])=O)[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)C=C(C([O-])=O)O1 LLVVMXFNKAHVEZ-GAWNPARCSA-L 0.000 description 1
- XDOLZJYETYVRKV-UHFFFAOYSA-N 7-aminoheptanoic acid Chemical compound NCCCCCCC(O)=O XDOLZJYETYVRKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100011382 ABHD2 Human genes 0.000 description 1
- 108010013043 Acetylesterase Proteins 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N Acridine Chemical group C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N Ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N Ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 229960001230 Asparagine Drugs 0.000 description 1
- 229960005261 Aspartic Acid Drugs 0.000 description 1
- 101710035537 At3g15720 Proteins 0.000 description 1
- 101700012728 BGL1 Proteins 0.000 description 1
- 101700036218 BGL2 Proteins 0.000 description 1
- 101700052368 BGL3 Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 240000008371 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 229940075615 Bacillus subtilis Drugs 0.000 description 1
- 235000017166 Bambusa arundinacea Nutrition 0.000 description 1
- 240000003917 Bambusa tulda Species 0.000 description 1
- 235000017491 Bambusa tulda Nutrition 0.000 description 1
- 229920002498 Beta-glucan Polymers 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N Bis-tris methane Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010060865 Bos taurus structural-GP protein Proteins 0.000 description 1
- 101700004908 CELL Proteins 0.000 description 1
- 229960005091 Chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N Chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N Cortisol Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UWTATZPHSA-N D-serine Chemical compound OC[C@@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- ZDRLKQLULCHOAJ-SECBINFHSA-N FC([C@](N)(C(=O)O)F)(C1=CC=C(C=C1)O)F Chemical compound FC([C@](N)(C(=O)O)F)(C1=CC=C(C=C1)O)F ZDRLKQLULCHOAJ-SECBINFHSA-N 0.000 description 1
- KSEBMYQBYZTDHS-HWKANZROSA-N Ferulic acid Chemical class COC1=CC(\C=C\C(O)=O)=CC=C1O KSEBMYQBYZTDHS-HWKANZROSA-N 0.000 description 1
- 101710003491 GLU1 Proteins 0.000 description 1
- 101710028121 GLU1 Proteins 0.000 description 1
- 101700061486 GUX1 Proteins 0.000 description 1
- 229940097043 Glucuronic Acid Drugs 0.000 description 1
- 229960002989 Glutamic Acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N HCl Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 229960000310 ISOLEUCINE Drugs 0.000 description 1
- 210000000936 Intestines Anatomy 0.000 description 1
- 229920002459 Intron Polymers 0.000 description 1
- 108020004391 Introns Proteins 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N Kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid zwitterion Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- DZLNHFMRPBPULJ-VKHMYHEASA-N L-thioproline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CSCN1 DZLNHFMRPBPULJ-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QWCKQJZIFLGMSD-VKHMYHEASA-N L-α-aminobutyrate zwitterion Chemical compound CC[C@H](N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 235000014647 Lens culinaris subsp culinaris Nutrition 0.000 description 1
- 244000043158 Lens esculenta Species 0.000 description 1
- 229920002097 Lichenin Polymers 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- FDZZZRQASAIRJF-UHFFFAOYSA-M Malachite green Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1C(C=1C=CC=CC=1)=C1C=CC(=[N+](C)C)C=C1 FDZZZRQASAIRJF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LUEWUZLMQUOBSB-ZLBHSGTGSA-N Maltotetraose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@H](O[C@@H]3[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]3O)CO)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O LUEWUZLMQUOBSB-ZLBHSGTGSA-N 0.000 description 1
- 240000004119 Melissa officinalis Species 0.000 description 1
- 235000010654 Melissa officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 239000004909 Moisturizer Substances 0.000 description 1
- 210000003666 Nerve Fibers, Myelinated Anatomy 0.000 description 1
- VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N Nile red Chemical compound C1=CC=C2C3=NC4=CC=C(N(CC)CC)C=C4OC3=CC(=O)C2=C1 VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000035443 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 240000005158 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 235000015334 Phyllostachys viridis Nutrition 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 240000000650 Plantago ovata Species 0.000 description 1
- 235000003421 Plantago ovata Nutrition 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Chemical group 0.000 description 1
- 229940103255 Polysporin Drugs 0.000 description 1
- 229940070687 Psyllium Drugs 0.000 description 1
- 239000009223 Psyllium Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N Rhamnose Chemical group C[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000490025 Schefflera digitata Species 0.000 description 1
- 229940057910 Shea butter Drugs 0.000 description 1
- 210000004927 Skin cells Anatomy 0.000 description 1
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N Sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002180 Tetracycline Drugs 0.000 description 1
- OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N Tetracycline Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 235000018936 Vitellaria paradoxa Nutrition 0.000 description 1
- 241001135917 Vitellaria paradoxa Species 0.000 description 1
- 229920002000 Xyloglucan Polymers 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000002390 adhesive tape Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-RSJOWCBRSA-M aldehydo-D-galacturonate Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C([O-])=O IAJILQKETJEXLJ-RSJOWCBRSA-M 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 125000000089 arabinosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO1)* 0.000 description 1
- 150000004783 arabinoxylans Chemical class 0.000 description 1
- 150000001491 aromatic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011425 bamboo Substances 0.000 description 1
- 230000003796 beauty Effects 0.000 description 1
- 229940000635 beta-Alanine Drugs 0.000 description 1
- 125000000188 beta-D-glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 101700048778 bglB Proteins 0.000 description 1
- 101700064371 bglX Proteins 0.000 description 1
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 1
- 230000001488 breeding Effects 0.000 description 1
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 101700062028 cbh1 Proteins 0.000 description 1
- 101710014333 celV Proteins 0.000 description 1
- 108010029402 cellobiosidase Proteins 0.000 description 1
- 101700071824 cenD Proteins 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000003889 chemical engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal Effects 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- VNFPBHJOKIVQEB-UHFFFAOYSA-N clotrimazole Chemical compound ClC1=CC=CC=C1C(N1C=NC=C1)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 VNFPBHJOKIVQEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003026 cod liver oil Substances 0.000 description 1
- 235000012716 cod liver oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000002485 combustion reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000536 complexating Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000010192 crystallographic characterization Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007257 deesterification reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 1
- 230000000249 desinfective Effects 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 230000001079 digestive Effects 0.000 description 1
- 229940079919 digestives Enzyme preparations Drugs 0.000 description 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 235000015071 dressings Nutrition 0.000 description 1
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 1
- 238000002036 drum drying Methods 0.000 description 1
- 101700021974 eglD Proteins 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 235000015114 espresso Nutrition 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting Effects 0.000 description 1
- ANUSOIHIIPAHJV-UHFFFAOYSA-N fenticlor Chemical compound OC1=CC=C(Cl)C=C1SC1=CC(Cl)=CC=C1O ANUSOIHIIPAHJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021197 fiber intake Nutrition 0.000 description 1
- 239000002657 fibrous material Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 description 1
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 description 1
- 239000005417 food ingredient Substances 0.000 description 1
- 235000003086 food stabiliser Nutrition 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002519 galactosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 101700036661 glaA Proteins 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium(0) Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 235000020603 homogenised milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 125000001145 hydrido group Chemical group *[H] 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005660 hydrophilic surface Effects 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 description 1
- 238000009114 investigational therapy Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000015250 liver sausages Nutrition 0.000 description 1
- 239000008268 mayonnaise Substances 0.000 description 1
- 235000010746 mayonnaise Nutrition 0.000 description 1
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 1
- UCUNFLYVYCGDHP-BYPYZUCNSA-N methionine sulfone Chemical compound CS(=O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O UCUNFLYVYCGDHP-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-L methylphosphonate(2-) Chemical compound CP([O-])([O-])=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000001333 moisturizer Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002829 nitrogen Chemical group 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000014571 nuts Nutrition 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 238000000879 optical micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000000399 optical microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N p-acetaminophenol Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Chemical group 0.000 description 1
- 229920000023 polynucleotide Polymers 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000003334 potential Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000010409 propane-1,2-diol alginate Nutrition 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000003614 protease activity assay Methods 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 230000006432 protein unfolding Effects 0.000 description 1
- 239000001944 prunus armeniaca kernel oil Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000001812 pycnometry Methods 0.000 description 1
- 239000005297 pyrex Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000003638 reducing agent Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000003763 resistance to breakage Effects 0.000 description 1
- 238000001507 sample dispersion Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 235000014347 soups Nutrition 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000004528 spin coating Methods 0.000 description 1
- 210000004215 spores Anatomy 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 238000004544 sputter deposition Methods 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000000859 sublimation Methods 0.000 description 1
- 230000000475 sunscreen Effects 0.000 description 1
- 239000000516 sunscreening agent Substances 0.000 description 1
- 238000000352 supercritical drying Methods 0.000 description 1
- 230000003746 surface roughness Effects 0.000 description 1
- 230000002522 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic Effects 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical group [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000006208 topical dosage form Substances 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N trans-L-hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910000406 trisodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019801 trisodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001195 ultra high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000000052 vinegar Substances 0.000 description 1
- 230000003313 weakening Effects 0.000 description 1
- 235000015099 wheat brans Nutrition 0.000 description 1
- 101700016253 xynX Proteins 0.000 description 1
- 238000000733 zeta-potential measurement Methods 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-BKBMJHBISA-N α-D-galacturonic acid Chemical group O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-BKBMJHBISA-N 0.000 description 1
- ZGUNAGUHMKGQNY-UHFFFAOYSA-N α-phenylglycine Chemical compound OC(=O)C(N)C1=CC=CC=C1 ZGUNAGUHMKGQNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-QIUUJYRFSA-N β-D-glucuronic acid Chemical compound O[C@@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-QIUUJYRFSA-N 0.000 description 1
- 150000008495 β-glucosides Chemical class 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Область применения изобретенияScope of the invention
Настоящее изобретение относится к способу получения функционализированного пищевого волокна. Настоящее изобретение дополнительно относится к композициям, содержащим функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент. Настоящее изобретение дополнительно относится к частицам Пикеринга. Настоящее изобретение дополнительно относится к применению функционализированного пищевого волокна и денатурированного фермента или к частице Пикеринга настоящего изобретения для стабилизации эмульсий и к эмульсии или продукту, их содержащему.The present invention relates to a method for producing a functionalized dietary fiber. The present invention further relates to compositions containing a functionalized dietary fiber and a denatured enzyme. The present invention further relates to Pickering particles. The present invention further relates to the use of a functionalized dietary fiber and a denatured enzyme or Pickering particle of the present invention for stabilizing emulsions, and to an emulsion or product containing them.
Предпосылки создания изобретенияPrerequisites for the creation of the invention
Стенки растительных клеток, которые являются основным источником пищевого волокна, состоят из первичного и вторичного слоев, состоящих из различных макромолекул, формирующих сложную сеть (McDougall et al, 1996 Processing and Function. Journal of the Science of Food and Agriculture, 70(2), pp. 133–150). Первичные стенки из высших растений в основном состоят из полисахаридов (до 90 мас.% сухого вещества), большая часть из которых устойчива к ферментативному расщеплению в кишечнике человека, и поэтому они называются пищевыми волокнами. Оставшиеся компоненты представляют собой относительно небольшие доли структурных гликопротеинов (2–10%), фенольных эфиров (<2%), минералов (1–5%) и ферментов.Plant cell walls, which are the main source of dietary fiber, are composed of primary and secondary layers of various macromolecules forming a complex network (McDougall et al, 1996 Processing and Function. Journal of the Science of Food and Agriculture, 70(2), pp. 133–150). Primary walls from higher plants mainly consist of polysaccharides (up to 90 wt.% dry matter), most of which are resistant to enzymatic degradation in the human intestine, and therefore they are called dietary fibers. The remaining components are relatively small fractions of structural glycoproteins (2–10%), phenolic esters (<2%), minerals (1–5%), and enzymes.
Основным полисахаридом клеточной стенки является целлюлоза. В целом целлюлоза представляет собой нерастворимый в воде гомополимер, состоящий из линейной цепи повторяющихся β-1,4-глюкозиловых звеньев. Отдельные целлюлозные цепи тесно связаны друг с другом в микрофибриллы и удерживаются вместе водородными связями. Соотношение аморфных и кристаллических областей в целлюлозе может варьироваться, при этом кристаллические области очень устойчивы к гидролизу.Cellulose is the main polysaccharide of the cell wall. In general, cellulose is a water-insoluble homopolymer consisting of a linear chain of repeating β-1,4-glucosyl units. The individual cellulose chains are tightly bound together into microfibrils and held together by hydrogen bonds. The ratio of amorphous to crystalline regions in cellulose can vary, with crystalline regions being very resistant to hydrolysis.
Пектины представляют собой разнообразную группу полисахаридов и имеют самые сложные структуры (Vincken, Voragen and Beldman, 2003 Enzymes degrading rhamnogalacturonan and xylogalacturonan. J. Whitaker, A. Voragen and D. Wong, ed., Handbook of food enzymology, 1st ed. New York: Marcel Dekker, pp. 930–941). К этой группе относятся следующие структуры: гомогалактуронан, рамногалактуронан 1 и 2, ксилогалактуронан, арабинан, арабиногалактан 1 и 2 (Bonnin, Garnier, & Ralet, 2014 Applied Microbiology and Biotechnology, 98(2), pp. 519–532). В зависимости от растения или фракции растения тип пектина может отличаться.Pectins are a diverse group of polysaccharides and have the most complex structures (Vincken, Voragen and Beldman, 2003 Enzymes degrading rhamnogalacturonan and xylogalacturonan. J. Whitaker, A. Voragen and D. Wong, ed., Handbook of food enzymology, 1st ed. New York : Marcel Dekker, pp. 930–941). This group includes the following structures: homogalacturonan,
Изложение сущности изобретенияStatement of the Invention
В соответствии с первым аспектом в настоящем изобретении предложен способ образования функционализированного пищевого волокна, включающий смешивание фермента и водной суспензии пищевого волокна, причем распределение частиц по размерам D90 указанного пищевого волокна составляет менее 800 мкм, соответственно менее 500 мкм, и указанное пищевое волокно содержит менее 25 мас.%. растворимых волокон и по меньшей мере 40 мас.% целлюлозы, при этом указанный фермент способен разрушать пищевое волокно; денатурацию указанного фермента с образованием водной суспензии, содержащей функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент.In accordance with the first aspect, the present invention provides a method for the formation of a functionalized dietary fiber, comprising mixing an enzyme and an aqueous suspension of dietary fiber, wherein the particle size distribution D90 of said dietary fiber is less than 800 μm, respectively, less than 500 μm, and said dietary fiber contains less than 25 wt.%. soluble fibers and at least 40 wt.% cellulose, while the specified enzyme is able to destroy dietary fiber; denaturing said enzyme to form an aqueous suspension containing the functionalized dietary fiber and the denatured enzyme.
В соответствии с дополнительным аспектом в настоящем изобретении предложен способ образования функционализированного пищевого волокна, включающий смешивание фермента и водной суспензии пищевого волокна, причем распределение частиц по размерам D50 указанного пищевого волокна составляет менее 30 мкм после разложения ферментом и указанное пищевое волокно содержит менее 25 мас.% растворимых волокон и по меньшей мере 40 мас.% целлюлозы; денатурацию указанного фермента с образованием функционализированного, амфифильного пищевого волокна с помощью адсорбированного фермента.In accordance with a further aspect, the present invention provides a method for forming a functionalized dietary fiber, comprising mixing an enzyme and an aqueous suspension of dietary fiber, wherein the particle size distribution D 50 of said dietary fiber is less than 30 microns after degradation by the enzyme, and said dietary fiber contains less than 25 wt. % soluble fibers and at least 40 wt.% cellulose; denaturing said enzyme to form a functionalized, amphiphilic dietary fiber with the aid of the adsorbed enzyme.
В соответствии с дополнительным аспектом настоящего изобретения предложено функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент, получаемые или полученные способом в соответствии с настоящим изобретением.In accordance with a further aspect of the present invention, there is provided a functionalized dietary fiber and a denatured enzyme obtainable or obtained by a method in accordance with the present invention.
В дополнительном аспекте в настоящем изобретении предложена частица Пикеринга, содержащая функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент.In a further aspect, the present invention provides a Pickering particle comprising a functionalized dietary fiber and a denatured enzyme.
В одном аспекте настоящего изобретения предложено применение функционализированного пищевого волокна и денатурированного фермента в соответствии с настоящим изобретением или частицы Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением для стабилизации эмульсии типа «вода в масле» или эмульсии типа «масло в воде».In one aspect of the present invention, the use of a functionalized dietary fiber and a denatured enzyme according to the present invention or a Pickering particle according to the present invention is provided to stabilize a water-in-oil emulsion or an oil-in-water emulsion.
В настоящем изобретении также дополнительно предложена эмульсия типа «масло в воде» или эмульсия типа «вода в масле», содержащая функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент в соответствии с настоящим изобретением или частицу Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением.The present invention also further provides an oil-in-water or water-in-oil emulsion containing a functionalized dietary fiber and a denatured enzyme according to the present invention or a Pickering particle according to the present invention.
В настоящем изобретении дополнительно предложен пищевой продукт, или косметический продукт, или продукт для ухода за кожей, или фармацевтический продукт, или продукт личной гигиены, или продукт для укладки волос, содержащий (например, стабилизированный) функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент в соответствии с настоящим изобретением или частицу Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением.The present invention further provides a food or cosmetic or skin care or pharmaceutical or personal care or hair styling product comprising (e.g., stabilized) functionalized dietary fiber and a denatured enzyme according to the present invention. the invention or a Pickering particle in accordance with the present invention.
Краткое описание графических материаловBrief description of graphic materials
Варианты осуществления изобретения далее описаны только в качестве примера со ссылкой на прилагаемые чертежи.Embodiments of the invention are described below, by way of example only, with reference to the accompanying drawings.
На фиг. 1 показано содержание белка в очищенных ферментах и коммерческих ферментных смесях, измеренное методом Бредфорда и Лоури.In FIG. 1 shows the protein content of purified enzymes and commercial enzyme mixtures as measured by the Bradford and Lowry method.
На фиг. 2 представлены хроматограммы, полученные посредством жидкостной хроматографии гидрофильных взаимодействий (HILIC), надосадочных жидкостей из волокна кожуры гороха (PHF), обработанного коммерческими ферментными смесями. Сверху вниз: PHF-пектин+целлюлоза, PHF-целлюлоза, PHF-пектин и контроль (разведение 1 : 100, контроль 1 : 10). IS: внутренний стандарт (ламинаритриоза).In FIG. 2 shows hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) chromatograms of pea skin fiber (PHF) supernatants treated with commercial enzyme mixtures. From top to bottom: PHF-pectin+cellulose, PHF-cellulose, PHF-pectin and control (1:100 dilution, 1:10 control). IS: internal standard (laminaritriosis).
На фиг. 3 представлены хроматограммы, полученные посредством высокоэффективной ионообменной хроматографии (HPAEC) надосадочных жидкостей из дисперсий PHF, обработанных коммерческими ферментными смесями.In FIG. 3 shows chromatograms obtained by high performance ion exchange chromatography (HPAEC) of supernatants from PHF dispersions treated with commercial enzyme mixtures.
На фиг. 4 показан выход восстанавливающего сахара в надосадочных жидкостях комплекса PHF-пектин+целлюлоза в зависимости от времени реакции.In FIG. 4 shows the yield of reducing sugar in supernatants of the PHF-pectin+cellulose complex as a function of reaction time.
На фиг. 5 показано объемное распределение частиц по размерам в водных дисперсиях PHF, обработанных коммерческими ферментными смесями.In FIG. 5 shows the volume distribution of particle sizes in aqueous PHF dispersions treated with commercial enzyme mixtures.
На фиг. 6 показаны микрофотографии в оптическом микроскопе обработанных PHF и контроля после инкубации в течение 16 ч. A: контроль, B: PHF-целлюлоза, C: PHF-пектин, D: PHF-пектин+целлюлоза.In FIG. 6 shows optical micrographs of treated PHF and control after incubation for 16 hours. A: control, B: PHF-cellulose, C: PHF-pectin, D: PHF-pectin+cellulose.
На фиг. 7 показан средний диаметр на основании объема (d4,3) и на основании площади поверхности (d3,2) в зависимости от времени реакции для комплекса PHF-пектин+целлюлоза.In FIG. 7 shows the mean diameter based on volume (d 4.3 ) and based on surface area (d 3.2 ) versus reaction time for the PHF-pectin+cellulose complex.
На фиг. 8 показана кажущаяся вязкость в зависимости от скорости сдвига обработанных дисперсий PHF (10 мас.%) и контроля через 16 ч инкубации. Измерения проводили при 20°C.In FIG. 8 shows the apparent viscosity versus shear rate of the treated dispersions of PHF (10 wt%) and controls after 16 hours of incubation. The measurements were carried out at 20°C.
На фиг. 9 показаны изображения измерений угла смачивания с использованием a) капли масла и b) капли воды и поверхности PHF в течение периода времени, равного 5 секундам. В данном примере твердую поверхность получали путем прессования 20 мг ультрадисперсного Exafine-PHF на клейкую ленту.In FIG. 9 shows images of contact angle measurements using a) an oil drop and b) a water drop and a PHF surface over a time period of 5 seconds. In this example, a hard surface was obtained by pressing 20 mg of ultrafine Exafine-PHF onto adhesive tape.
На фиг. 10 показано смачивание, определяемое как время (с), необходимое для полного погружения 1 г порошкового обработанного ферментами PHF и контрольного образца в 10 мл воды milli-Q.In FIG. 10 shows wetting, defined as the time (s) required for 1 g of enzyme-treated PHF powder and control to be completely immersed in 10 ml of milli-Q water.
На фиг. 11 показаны 50% эмульсии «масло в воде», полученные с 0,4% (масса/объем) обработанным ферментами PHF (pH 5). Контрольный образец содержал PHF, которые были обработаны в тех же условиях без добавления фермента a) через один день, b) через 4 недели.In FIG. 11 shows 50% oil-in-water emulsions prepared with 0.4% (w/v) enzyme-treated PHF (pH 5). The control sample contained PHF, which were treated under the same conditions without the addition of enzyme a) after one day, b) after 4 weeks.
На фиг. 12 показаны эмульсии, стабилизированные растворимой фазой (a) и нерастворимой фазой (b) дисперсий PHF-целлюлоза и PHF-пектин+целлюлоза через 24 часа после приготовления. Эмульсии оставались визуально неизменными в течение четырех недель.In FIG. 12 shows emulsions stabilized with soluble phase (a) and insoluble phase (b) of PHF-cellulose and PHF-pectin+cellulose dispersions 24 hours after preparation. The emulsions remained visually unchanged for four weeks.
На фиг. 13 представлены микрофотографии в оптическом микроскопе капель масла в эмульсиях 50%, полученных с помощью дисперсий PHF-целлюлоза и PHF-пектин+целлюлоза, pH 5, через 24 часа после приготовления. Масштабная полоска: 100 мкм.In FIG. 13 are optical micrographs of oil droplets in 50% emulsions prepared with PHF-cellulose and PHF-pectin+cellulose dispersions,
На фиг. 14 показаны изображения, полученные с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ) 50% эмульсии «масло в воде», стабилизированной дисперсиями PHF-пектин+целлюлоза и PHF-целлюлоза (частицы PHF показаны желтым цветом). Красный и зеленый сигналы соответствуют масляной и водной фазам соответственно. Эмульсии были приготовлены перед визуализацией, и их выдерживали в течение по меньшей мере 24 часов.In FIG. 14 shows confocal laser scanning microscopy (CLSM) images of a 50% oil-in-water emulsion stabilized with PHF-pectin+cellulose and PHF-cellulose dispersions (PHF particles shown in yellow). The red and green signals correspond to the oil and water phases, respectively. The emulsions were prepared prior to imaging and aged for at least 24 hours.
На фиг. 15 показаны гели додецилсульфата натрия (SDS) надосадочных жидкостей и осадков PHF, обработанных коммерческими ферментными смесями.In FIG. 15 shows sodium dodecyl sulfate (SDS) gels of PHF supernatants and pellets treated with commercial enzyme mixtures.
На фиг. 16 показана эмульсия 50% «масло в воде», стабилизированная (A) термообработанным PHF-BSA и (B) только термообработанным BSA при pH 5 через 4 недели.In FIG. 16 shows a 50% oil in water emulsion stabilized with (A) heat treated PHF-BSA and (B) heat treated BSA at
На фиг. 17 показаны образцы эмульсий «масло в воде», полученных с различными соотношениями масла и воды.In FIG. 17 shows samples of oil-in-water emulsions made with various ratios of oil to water.
На фиг. 18 представлена микрофотография в оптическом микроскопе эмульсии 20% «вода в масле» с высокой скоростью сдвига при 22 000 1/мин. Масштабная полоска: 50 мкм.In FIG. 18 is an optical micrograph of a
На фиг. 19 представлены жидкие забеливатели, приготовленные в соответствии с таблицей 12. Слева направо: забеливатель A, B, C, D, E и F. a) Сразу после приготовления и b) через 30 минут после приготовления.In FIG. 19 shows liquid creamers prepared according to Table 12. From left to right: creamer A, B, C, D, E and F. a) Immediately after preparation and b) 30 minutes after preparation.
На фиг. 20 показан кофе, смешанный с жидкими забеливателями в соотношении 1 : 6. Слева направо: забеливатель A, B, C, D, E, F. a) Непосредственно после приготовления и b) через 30 минут после приготовления.In FIG. 20 shows coffee mixed with liquid creamers in a ratio of 1:6. From left to right: creamer A, B, C, D, E, F. a) Immediately after brewing and b) 30 minutes after brewing.
На фиг. 21 показаны эмульсии 50% (об./об.) «масло в воде», стабилизированные 0,4% (масса/объем) PHF, обработанным Alcalase® и альфа-амилазой (левая фотография), а также контроли только с инактивированными альфа-амилазой и Alcalase® (правая фотография).In FIG. 21 shows 50% (v/v) oil-in-water emulsions stabilized with 0.4% (w/v) PHF treated with Alcalase® and alpha-amylase (left photo) and controls with only inactivated alpha- amylase and Alcalase® (right photo).
На фиг. 22 показаны эмульсии 50% (об./об.) «масло в воде», стабилизированные 0,4% (масса/объем) дисперсией AF-пектин+целлюлоза, и контроли.In FIG. 22 shows 50% (v/v) oil-in-water emulsions stabilized with 0.4% (w/v) AF-pectin+cellulose dispersion and controls.
На фиг. 23 показаны эмульсии 50% (об./об.) «масло в воде», стабилизированные 0,4% (масса/объем) дисперсией AF, и контроли.In FIG. 23 shows 50% (v/v) oil-in-water emulsions stabilized with 0.4% (w/v) AF dispersion and controls.
На фиг. 24 показаны эмульсии 50% (об./об.) «масло в воде», стабилизированные 0,4% (масса/объем) дисперсией WF, обработанной D740 L, и контроли.In FIG. 24 shows 50% (v/v) oil-in-water emulsions stabilized with 0.4% (w/v) WF dispersion treated with D740 L and controls.
На фиг. 25 показаны эмульсии 50% об./об., стабилизированные 0,4% (масса/объем) дисперсией PHF, доведенной до различных значений pH перед инактивацией фермента. HT: термообработкаIn FIG. 25 shows 50% v/v emulsions stabilized with 0.4% (w/v) PHF dispersion adjusted to various pH values prior to enzyme inactivation. HT: heat treatment
На фиг. 26 показаны изображения шоколадного мусса, полученные в ходе испытаний в масштабе кухни (вид сверху).In FIG. 26 shows images of chocolate mousse from kitchen scale tests (top view).
На фиг. 27 показаны изображения шоколадного мусса, полученные в ходе масштабных испытаний на кухне (вид спереди).In FIG. 27 shows images of chocolate mousse from extensive kitchen testing (front view).
На фиг. 28 показана полипептидная последовательность SEQ ID No. 1 целлобиогидролазы, которую можно получить из Trichoderma reesei.In FIG. 28 shows the polypeptide sequence of SEQ ID NO. 1 cellobiohydrolase, which can be obtained from Trichoderma reesei.
На фиг. 29 показана полипептидная последовательность SEQ ID No. 2 целлобиогидролазы, которую можно получить из Trichoderma reesei.In FIG. 29 shows the polypeptide sequence of SEQ ID NO. 2 cellobiohydrolase, which can be obtained from Trichoderma reesei.
На фиг. 30 показана полипептидная последовательность SEQ ID No. 3 полигалактуроназы, которую можно получить из Aspergillus aculeatus.In FIG. 30 shows the polypeptide sequence of SEQ ID NO. 3 polygalacturonase, which can be obtained from Aspergillus aculeatus.
Подробное описаниеDetailed description
Основной вывод настоящего изобретения заключается в получении композиции, содержащей функционализированные пищевые волокна и денатурированный фермент, которые могут быть использованы для стабилизации эмульсии, за счет обработки пищевых волокон с высоким содержанием целлюлозы и низким содержанием растворимых волокон ферментом, способным разлагать пищевые волокна.The main conclusion of the present invention is to obtain a composition containing functionalized dietary fiber and a denatured enzyme, which can be used to stabilize the emulsion, by treating dietary fibers with a high content of cellulose and a low content of soluble fibers with an enzyme capable of degrading dietary fiber.
Впервые авторы настоящего изобретения показали, что функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент в соответствии с настоящим изобретением выступают в качестве частицы Пикеринга.For the first time, the present inventors have shown that a functionalized dietary fiber and a denatured enzyme according to the present invention act as a Pickering particle.
На основании этих данных был предложен способ образования функционализированного пищевого волокна, включающий смешивание фермента и водной суспензии пищевого волокна, причем распределение частиц по размерам D90 указанного пищевого волокна составляет менее 800 мкм, соответственно менее 500 мкм, и указанное пищевое волокно содержит менее 25 мас.% растворимых волокон и по меньшей мере 40 мас.% целлюлозы, при этом указанный фермент способен разрушать пищевое волокно; денатурацию указанного фермента с образованием водной суспензии, содержащей функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент.Based on these data, a method was proposed for the formation of a functionalized dietary fiber, which includes mixing an enzyme and an aqueous suspension of dietary fiber, wherein the particle size distribution D90 of said dietary fiber is less than 800 μm, respectively, less than 500 μm, and said dietary fiber contains less than 25 wt.% soluble fibers and at least 40 wt.% cellulose, while the specified enzyme is able to destroy dietary fiber; denaturing said enzyme to form an aqueous suspension containing the functionalized dietary fiber and the denatured enzyme.
В одном варианте осуществления функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент взаимодействуют между собой с образованием частиц Пикеринга. Фермент настоящего изобретения может иметь аффинность к волокну в качестве субстрата (и таким образом связываться с ним). Благодаря ферментативному разложению пищевого волокна возможно соответственное уменьшение размера его частиц. Фермент для применения в настоящем изобретении способен разлагать пищевое волокно. Функционализированные пищевые волокна (например, частицы пищевых волокон) в комбинации с денатурированным(-и) ферментом(-ами) демонстрируют поверхностную активность и выступают в качестве частиц Пикеринга. Функционализированные частицы пищевого волокна и денатурированный(-ые) фермент(-ы) могут образовывать функционализированное пищевое волокно, связанное в комплекс с ферментом. Функционализированные пищевые волокна, связанные в комплекс с ферментом, в соответствии с настоящим изобретением могут выступать в качестве частиц Пикеринга. Фермент(-ы) может (могут) по-прежнему быть прикреплен(-ы) к поверхности функционализированного пищевого волокна и выступать в качестве белкового структурного компонента, закрепляющего частицу на поверхности раздела «масло/вода» или «вода/масло».In one embodiment, the functionalized dietary fiber and the denatured enzyme interact to form Pickering particles. The enzyme of the present invention may have an affinity for (and thus bind to) fiber as a substrate. Due to the enzymatic decomposition of dietary fiber, a corresponding reduction in the size of its particles is possible. The enzyme for use in the present invention is capable of degrading dietary fiber. Functionalized dietary fibers (eg, dietary fiber particles) in combination with denatured enzyme(s) exhibit surface activity and act as Pickering particles. The functionalized fiber particles and the denatured enzyme(s) can form a functionalized dietary fiber complexed with the enzyme. Functionalized dietary fiber complexed with an enzyme according to the present invention can act as Pickering particles. The enzyme(s) may still be attached(s) to the surface of the functionalized dietary fiber and act as a protein structural component that anchors the particle to the oil/water or water/oil interface.
Без ограничений, накладываемых какой-либо теорией, можно улучшать стабилизирующие эмульсию свойства пищевого волокна, например PHF, путем уменьшения размера частиц и индуцирования амфифильности любой части волокна/частицы, которая может быть подвергнута воздействию воды (в том числе поверхности частицы и внутренних областей частицы, подвергающихся воздействию воды) с помощью одного или более ферментов, способных к разложению волокна. Вследствие индуцирования амфифильности возможно увеличение средней смачивающей способности частицы. Без ограничений, накладываемых какой-либо теорией, цель ферментативной обработки может заключаться в модификации амфифильности и размера поверхности частицы (например, части частицы, которая может быть подвергнута воздействию воды) путем разрыва волоконной сети с обеспечением возможности воздействия на гидрофобные групп на поверхности частицы. Этого можно достичь путем обнажения структур кристаллической целлюлозы с использованием ферментов, которые расщепляют неупорядоченную аморфную часть целлюлозы, или путем обнажения гидрофобных групп, присутствующих на пектиновом каркасе (сложные метиловые, ацетиловые эфиры и сложные эфиры феруловой кислоты). Кроме того, структурные белки, связанные с пищевым волокном, могут способствовать повышению поверхностной активности функционализированного пищевого волокна.Without being bound by any theory, it is possible to improve the emulsion stabilizing properties of a dietary fiber, such as PHF, by reducing the particle size and inducing amphiphilicity in any part of the fiber/particle that can be exposed to water (including the surface of the particle and the interior of the particle, exposed to water) with the help of one or more enzymes capable of degrading the fiber. Due to the induction of amphiphilicity, an increase in the average wetting ability of the particle is possible. Without being bound by any theory, the goal of an enzymatic treatment may be to modify the amphiphilicity and surface size of the particle (e.g., the portion of the particle that can be exposed to water) by breaking the fiber network so that hydrophobic groups on the surface of the particle can be affected. This can be achieved by exposing crystalline cellulose structures using enzymes that break down the disordered amorphous portion of cellulose, or by exposing the hydrophobic groups present on the pectin backbone (methyl esters, acetyl esters and ferulic acid esters). In addition, structural proteins associated with dietary fiber can help increase the surface activity of functionalized dietary fiber.
В некоторых вариантах осуществления пищевое волокно может не разлагаться или не гидролизоваться ферментом. Однако фермент должен быть способен гидролизовать пищевое волокно. Фермент, способный гидролизовать пищевое волокно, представляет собой фермент, который обладает аффинностью к пищевому волокну в качестве субстрата и, таким образом, связывается с пищевым волокном.In some embodiments, the dietary fiber may not be degraded or hydrolyzed by the enzyme. However, the enzyme must be able to hydrolyze dietary fiber. An enzyme capable of hydrolyzing dietary fiber is an enzyme that has an affinity for dietary fiber as a substrate and thus binds to dietary fiber.
В одном варианте осуществления фермент представляет собой фермент, который гидролизует пищевое волокно.In one embodiment, the enzyme is an enzyme that hydrolyzes dietary fiber.
В одном варианте осуществления пищевое волокно может быть гидролизовано указанными одним или более ферментами в течение периода до 24 часов.In one embodiment, the dietary fiber can be hydrolyzed by said one or more enzymes for up to 24 hours.
В одном варианте осуществления пищевое волокно может быть гидролизовано в течение от приблизительно 10 минут до приблизительно 24 часов. В некоторых вариантах осуществления пищевое волокно может быть гидролизовано в течение от приблизительно 30 минут до 20 часов, соответственно от 4 часов до 20 часов, соответственно от 14 часов до 20 часов.In one embodiment, the dietary fiber can be hydrolyzed over a period of about 10 minutes to about 24 hours. In some embodiments, the implementation of dietary fiber can be hydrolyzed within from about 30 minutes to 20 hours, respectively, from 4 hours to 20 hours, respectively, from 14 hours to 20 hours.
В некоторых вариантах осуществления пищевое волокно может быть гидролизовано в течение от приблизительно 6 до приблизительно 24 часов. В некоторых вариантах осуществления пищевое волокно может быть гидролизовано в течение 4–10 часов.In some embodiments, the implementation of dietary fiber can be hydrolyzed within from about 6 to about 24 hours. In some embodiments, the implementation of dietary fiber can be hydrolyzed within 4-10 hours.
В некоторых вариантах осуществления пищевое волокно может быть гидролизовано в течение менее приблизительно 8 часов, например, для уменьшения вторичного гидролиза, который может происходить после этого.In some embodiments, the implementation of dietary fiber can be hydrolyzed for less than about 8 hours, for example, to reduce the secondary hydrolysis that may occur thereafter.
В некоторых вариантах осуществления пищевое волокно может быть гидролизовано в течение по меньшей мере 30 минут, например по меньшей мере 1 часа, или по меньшей мере 4 ч, или по меньшей мере 6 часов, или по меньшей мере 10 ч, или по меньшей мере 15 ч.In some embodiments, the dietary fiber can be hydrolyzed for at least 30 minutes, such as at least 1 hour, or at least 4 hours, or at least 6 hours, or at least 10 hours, or at least 15 h.
В некоторых вариантах осуществления пищевое волокно может быть гидролизовано в течение приблизительно 16 ч.In some embodiments, the dietary fiber may be hydrolyzed within about 16 hours.
В одном варианте осуществления посредством ферментативного гидролиза можно гидролизовать полисахаридные компоненты до олигосахаридов, но можно предотвратить полное расщепление олигосахаридов до моносахаридов. В некоторых вариантах осуществления процесс продолжается до расщепления приблизительно 35–50% полисахаридов или 35–50% целлюлозы до моносахаридов, соответственно до расщепления приблизительно 40–48% полисахаридов или 40–48% целлюлозы до моносахаридов.In one embodiment, the polysaccharide components can be hydrolyzed to oligosaccharides by enzymatic hydrolysis, but complete degradation of the oligosaccharides to monosaccharides can be prevented. In some embodiments, the process continues until about 35-50% polysaccharides or 35-50% cellulose is degraded to monosaccharides, respectively until about 40-48% polysaccharides or 40-48% cellulose is degraded to monosaccharides.
Условия гидролиза будут оптимальными условиями для конкретного используемого фермента. Как правило, их указывают при покупке фермента или определяют экспериментально. Предпочтительно гидролиз можно проводить при оптимальном значении pH для используемого(-ых) фермента(-ов). Предпочтительно гидролиз можно проводить при рН от 5 до 8. Предпочтительно гидролиз можно проводить при оптимальной температуре для используемого(-ых) фермента(-ов). Предпочтительно гидролиз можно проводить при температуре от 45 до 65°C. Предпочтительно гидролиз можно проводить при непрерывном перемешивании.The hydrolysis conditions will be the optimal conditions for the particular enzyme used. As a rule, they are indicated when buying an enzyme or determined experimentally. Preferably, the hydrolysis can be carried out at the optimum pH for the enzyme(s) used. Preferably, the hydrolysis can be carried out at a pH of 5 to 8. Preferably, the hydrolysis can be carried out at the optimum temperature for the enzyme(s) used. Preferably the hydrolysis can be carried out at a temperature of from 45 to 65°C. Preferably, the hydrolysis can be carried out with continuous stirring.
Благодаря соответственно обработке ферментами пищевого волокна уменьшается размер частиц. Другими словами, размер частиц функционализированного пищевого волокна меньше, чем у пищевого волокна до обработки. В некоторых вариантах осуществления за счет обработки ферментами можно уменьшать средний объемный диаметр пищевого волокна приблизительно на десять.Due to the appropriate processing of dietary fiber by enzymes, the particle size is reduced. In other words, the particle size of the functionalized dietary fiber is smaller than that of the dietary fiber prior to processing. In some embodiments, enzyme treatment can reduce the average volumetric diameter of dietary fiber by about ten.
Распределение частиц по размерам D90 пищевого волокна (например, перед обработкой) соответственно составляет менее 800 мкм.The particle size distribution D90 of dietary fiber (eg before processing) is accordingly less than 800 µm.
Распределение частиц по размерам D90 пищевого волокна (например, перед обработкой или после обработки) соответственно составляет менее 500 мкм.The particle size distribution D90 of the dietary fiber (eg before or after treatment) is respectively less than 500 µm.
В одном варианте осуществления распределение частиц по размерам D90 пищевого волокна (например, перед обработкой или после обработки) может составлять менее 30 мкм.In one embodiment, the particle size distribution D90 of dietary fiber (eg, pre-treatment or post-treatment) may be less than 30 microns.
В одном варианте осуществления распределение частиц по размерам D90 пищевого волокна (например, перед обработкой или после обработки) может составлять менее 10 мкм.In one embodiment, the particle size distribution D90 of dietary fiber (eg, pre-treatment or post-treatment) may be less than 10 microns.
В одном варианте осуществления распределение частиц по размерам D90 пищевого волокна (например, перед обработкой или после обработки) может составлять менее 3 мкм.In one embodiment, the particle size distribution D90 of dietary fiber (eg, pre-treatment or post-treatment) may be less than 3 microns.
Пищевое волокно (например, исходное пищевое волокно перед обработкой) можно измельчать до подходящего распределения частиц по размерам D90, например менее 800 мкм, или менее 500 мкм, или менее 30 мкм, или менее 10 мкм, или менее 3 мкм любым подходящим средством. Одним из подходящих средств может быть размалывание в струйной мельнице. В качестве примера пищевое волокно может быть измельчено в мельнице с порционной загрузкой IKA M20 (Milian, Швейцария) при постоянной скорости 2000 g в течение 10 секунд.Dietary fiber (e.g., raw dietary fiber prior to processing) can be ground to a suitable D90 particle size distribution, e.g., less than 800 microns, or less than 500 microns, or less than 30 microns, or less than 10 microns, or less than 3 microns, by any suitable means. One suitable means may be grinding in a jet mill. As an example, dietary fiber can be ground in an IKA M20 batch mill (Milian, Switzerland) at a constant speed of 2000 g for 10 seconds.
В одном варианте осуществления размалывание пищевого волокна может происходить до обработки ферментами.In one embodiment, milling of the dietary fiber may occur prior to enzyme treatment.
В одном варианте осуществления размалывание пищевого волокна может происходить после обработки ферментами, например после сушки указанной водной суспензии.In one embodiment, milling of the dietary fiber may occur after treatment with enzymes, for example after drying said aqueous suspension.
В одном варианте осуществления размалывание пищевого волокна может происходить как до, так и после обработки ферментами.In one embodiment, milling of the dietary fiber can occur both before and after enzyme treatment.
При размалывании пищевого волокна пищевое волокно предпочтительно находится в относительно сухом состоянии.When grinding the dietary fiber, the dietary fiber is preferably in a relatively dry state.
В настоящем изобретении дополнительно предложен способ образования функционализированного пищевого волокна, включающий смешивание фермента и водной суспензии пищевого волокна, причем распределение частиц по размерам D50 указанного пищевого волокна составляет менее 30 мкм после разложения ферментом и указанное пищевое волокно содержит менее 25 мас.% растворимых волокон и по меньшей мере 40 мас.% целлюлозы; денатурацию указанного фермента с образованием функционального амфифильного пищевого волокна с помощью адсорбированного фермента.The present invention further provides a method for forming a functionalized dietary fiber, comprising mixing an enzyme and an aqueous suspension of dietary fiber, wherein the particle size distribution D50 of said dietary fiber is less than 30 µm after degradation by the enzyme, and said dietary fiber contains less than 25 wt.% soluble fibers and at least 40 wt.% cellulose; denaturing said enzyme to form a functional amphiphilic dietary fiber with the aid of the adsorbed enzyme.
Функционализированные пищевые волокна (например, частицы пищевых волокон) в комбинации с денатурированным(-и) ферментом(-ами) демонстрируют поверхностную активность и выступают в качестве частиц Пикеринга. Фермент(-ы) может (могут) по-прежнему быть прикреплен(-ы) к поверхности функционализированного пищевого волокна и выступать в качестве белкового структурного компонента, закрепляющего частицу на поверхности раздела «масло/вода» или «вода/масло».Functionalized dietary fibers (eg, dietary fiber particles) in combination with denatured enzyme(s) exhibit surface activity and act as Pickering particles. The enzyme(s) may still be attached(s) to the surface of the functionalized dietary fiber and act as a protein structural component that anchors the particle to the oil/water or water/oil interface.
Без ограничений, накладываемых какой-либо теорией, можно улучшать стабилизирующие эмульсию свойства пищевого волокна, например PHF, путем уменьшения размера частиц и индуцирования амфифильности любой части волокна/частицы, которая может быть подвергнута воздействию воды (в том числе поверхности частицы и внутренних областей частицы, подвергающихся воздействию воды) с помощью одного или более ферментов, способных к разложению волокна. Вследствие индуцирования амфифильности возможно увеличение средней смачивающей способности частицы. Без ограничений, накладываемых какой-либо теорией, цель ферментативной обработки может заключаться в модификации амфифильности и размера поверхности частицы (например, части частицы, которая может быть подвергнута воздействию воды) путем разрыва волоконной сети с обеспечением возможности воздействия на гидрофобные групп на поверхности частицы. Этого можно достичь путем обнажения структур кристаллической целлюлозы с использованием ферментов, которые расщепляют неупорядоченную аморфную часть целлюлозы, или путем обнажения гидрофобных групп, присутствующих на пектиновом каркасе (сложные метиловые, ацетиловые эфиры и сложные эфиры феруловой кислоты). Кроме того, структурные белки, связанные с пищевым волокном, могут способствовать повышению поверхностной активности функционализированного пищевого волокна.Without being bound by any theory, it is possible to improve the emulsion stabilizing properties of a dietary fiber, such as PHF, by reducing the particle size and inducing amphiphilicity in any part of the fiber/particle that can be exposed to water (including the surface of the particle and the interior of the particle, exposed to water) with the help of one or more enzymes capable of degrading the fiber. Due to the induction of amphiphilicity, an increase in the average wetting ability of the particle is possible. Without being bound by any theory, the goal of an enzymatic treatment may be to modify the amphiphilicity and surface size of the particle (e.g., the portion of the particle that can be exposed to water) by breaking the fiber network so that hydrophobic groups on the surface of the particle can be affected. This can be achieved by exposing crystalline cellulose structures using enzymes that break down the disordered amorphous portion of cellulose, or by exposing the hydrophobic groups present on the pectin backbone (methyl esters, acetyl esters and ferulic acid esters). In addition, structural proteins associated with dietary fiber can help increase the surface activity of functionalized dietary fiber.
Пищевое волокно разлагается или гидролизуется ферментом. Фермент, который гидролизует пищевое волокно, представляет собой фермент, который обладает аффинностью к пищевому волокну в качестве субстрата и, таким образом, связывается с пищевым волокном.Dietary fiber is decomposed or hydrolyzed by an enzyme. An enzyme that hydrolyzes dietary fiber is an enzyme that has an affinity for dietary fiber as a substrate and thus binds to dietary fiber.
В одном варианте осуществления пищевое волокно может быть гидролизовано указанными одним или более ферментами в течение периода до 24 часов.In one embodiment, the dietary fiber can be hydrolyzed by said one or more enzymes for up to 24 hours.
В одном варианте осуществления пищевое волокно может быть гидролизовано в течение от приблизительно 10 минут до приблизительно 24 часов. В некоторых вариантах осуществления пищевое волокно может быть гидролизовано в течение от приблизительно 30 минут до 20 часов, соответственно от 4 часов до 20 часов, соответственно от 14 часов до 20 часов.In one embodiment, the dietary fiber can be hydrolyzed over a period of about 10 minutes to about 24 hours. In some embodiments, the implementation of dietary fiber can be hydrolyzed within from about 30 minutes to 20 hours, respectively, from 4 hours to 20 hours, respectively, from 14 hours to 20 hours.
В некоторых вариантах осуществления пищевое волокно может быть гидролизовано в течение от приблизительно 6 до приблизительно 24 часов. В некоторых вариантах осуществления пищевое волокно может быть гидролизовано в течение 4–10 часов.In some embodiments, the implementation of dietary fiber can be hydrolyzed within from about 6 to about 24 hours. In some embodiments, the implementation of dietary fiber can be hydrolyzed within 4-10 hours.
В некоторых вариантах осуществления пищевое волокно может быть гидролизовано в течение менее приблизительно 8 часов, например, для уменьшения вторичного гидролиза, который может происходить после этого.In some embodiments, the implementation of dietary fiber can be hydrolyzed for less than about 8 hours, for example, to reduce the secondary hydrolysis that may occur thereafter.
В некоторых вариантах осуществления пищевое волокно может быть гидролизовано в течение по меньшей мере 30 минут, например по меньшей мере 1 часа, или по меньшей мере 4 ч, или по меньшей мере 6 часов, или по меньшей мере 10 ч, или по меньшей мере 15 ч.In some embodiments, the dietary fiber can be hydrolyzed for at least 30 minutes, such as at least 1 hour, or at least 4 hours, or at least 6 hours, or at least 10 hours, or at least 15 h.
В некоторых вариантах осуществления пищевое волокно может быть гидролизовано в течение приблизительно 16 ч.In some embodiments, the dietary fiber may be hydrolyzed within about 16 hours.
В одном варианте осуществления посредством ферментативного гидролиза можно гидролизовать полисахаридные компоненты до олигосахаридов, но можно предотвратить полное расщепление олигосахаридов до моносахаридов. В некоторых вариантах осуществления процесс продолжается до расщепления приблизительно 35–50% полисахаридов или 35–50% целлюлозы до моносахаридов, соответственно до расщепления приблизительно 40–48% полисахаридов или 40–48% целлюлозы до моносахаридов.In one embodiment, the polysaccharide components can be hydrolyzed to oligosaccharides by enzymatic hydrolysis, but complete degradation of the oligosaccharides to monosaccharides can be prevented. In some embodiments, the process continues until about 35-50% polysaccharides or 35-50% cellulose is degraded to monosaccharides, respectively until about 40-48% polysaccharides or 40-48% cellulose is degraded to monosaccharides.
Условия гидролиза будут оптимальными условиями для конкретного используемого фермента. Как правило, их указывают при покупке фермента или определяют экспериментально. Предпочтительно гидролиз можно проводить при оптимальном значении pH для используемого(-ых) фермента(-ов). Предпочтительно гидролиз можно проводить при рН от 5 до 8. Предпочтительно гидролиз можно проводить при оптимальной температуре для используемого(-ых) фермента(-ов). Предпочтительно гидролиз можно проводить при температуре от 45 до 65°C. Предпочтительно гидролиз можно проводить при непрерывном перемешивании.The hydrolysis conditions will be the optimal conditions for the particular enzyme used. As a rule, they are indicated when buying an enzyme or determined experimentally. Preferably, the hydrolysis can be carried out at the optimum pH for the enzyme(s) used. Preferably, the hydrolysis can be carried out at a pH of 5 to 8. Preferably, the hydrolysis can be carried out at the optimum temperature for the enzyme(s) used. Preferably the hydrolysis can be carried out at a temperature of from 45 to 65°C. Preferably, the hydrolysis can be carried out with continuous stirring.
Благодаря обработке ферментами пищевого волокна уменьшается размер частиц. Другими словами, размер частиц функционализированного пищевого волокна меньше, чем у пищевого волокна до обработки. В некоторых вариантах осуществления за счет обработки ферментами можно уменьшать средний объемный диаметр пищевого волокна приблизительно на десять.Due to the processing of dietary fiber by enzymes, the particle size is reduced. In other words, the particle size of the functionalized dietary fiber is smaller than that of the dietary fiber prior to processing. In some embodiments, enzyme treatment can reduce the average volumetric diameter of dietary fiber by about ten.
В одном варианте осуществления распределение частиц по размерам D50 пищевого волокна после обработки может составлять менее 10 мкм.In one embodiment, the particle size distribution D50 of dietary fiber after treatment may be less than 10 microns.
В одном варианте осуществления распределение частиц по размерам D50 пищевого волокна после обработки может составлять менее 3 мкм.In one embodiment, the particle size distribution D50 of dietary fiber after treatment may be less than 3 microns.
Пищевое волокно (например, исходное пищевое волокно перед обработкой) можно измельчать до подходящего распределения частиц по размерам D50, например менее 800 мкм, или менее 500 мкм, или менее 30 мкм, или менее 10 мкм, или менее 3 мкм любым подходящим средством. Одним из подходящих средств может быть размалывание в струйной мельнице. В качестве примера пищевое волокно может быть измельчено в мельнице с порционной загрузкой IKA M20 (Milian, Швейцария) при постоянной скорости 2000 g в течение 10 секунд.The dietary fiber (e.g., the original dietary fiber prior to processing) can be ground to a suitable particle size distribution D50, e.g., less than 800 microns, or less than 500 microns, or less than 30 microns, or less than 10 microns, or less than 3 microns, by any suitable means. One suitable means may be grinding in a jet mill. As an example, dietary fiber can be ground in an IKA M20 batch mill (Milian, Switzerland) at a constant speed of 2000 g for 10 seconds.
В одном варианте осуществления размалывание пищевого волокна может происходить до обработки ферментами.In one embodiment, milling of the dietary fiber may occur prior to enzyme treatment.
В одном варианте осуществления размалывание пищевого волокна может происходить после обработки ферментами, например после сушки указанной водной суспензии.In one embodiment, milling of the dietary fiber may occur after treatment with enzymes, for example after drying said aqueous suspension.
В одном варианте осуществления размалывание пищевого волокна может происходить как до, так и после обработки ферментами.In one embodiment, milling of the dietary fiber can occur both before and after enzyme treatment.
При размалывании пищевого волокна пищевое волокно предпочтительно находится в относительно сухом состоянии.When grinding the dietary fiber, the dietary fiber is preferably in a relatively dry state.
Без ограничений, накладываемых какой-либо теорией, считается, что денатурированный фермент настоящего изобретения образует амфифильные комплексы с волокнами уменьшенного размера, таким образом передавая поверхностную активность гидрофильной части частицы.Without being bound by any theory, it is believed that the denatured enzyme of the present invention forms amphiphilic complexes with the reduced size fibers, thus imparting surface activity to the hydrophilic portion of the particle.
В одном варианте осуществления соответственно распределение частиц по размерам D90 функционализированного пищевого волокна или частицы Пикеринга составляет менее приблизительно 300 мкм. В одном варианте осуществления распределение частиц по размерам D90 функционализированного пищевого волокна или частицы Пикеринга составляет менее приблизительно 50 мкм.In one embodiment, respectively, the particle size distribution D 90 of the functionalized dietary fiber or Pickering particle is less than about 300 microns. In one embodiment, the particle size distribution D 90 of the functionalized dietary fiber or Pickering particle is less than about 50 microns.
В одном варианте осуществления распределение частиц по размерам D90 функционализированного пищевого волокна или частицы Пикеринга составляет менее приблизительно 25 мкм.In one embodiment, the particle size distribution D 90 of the functionalized dietary fiber or Pickering particle is less than about 25 microns.
В одном варианте осуществления распределение частиц по размерам D90 функционализированного пищевого волокна или частицы Пикеринга составляет приблизительно 10 мкм или менее.In one embodiment, the particle size distribution D 90 of the functionalized dietary fiber or Pickering particle is about 10 microns or less.
В одном варианте осуществления распределение частиц по размерам D90 функционализированного пищевого волокна или частицы Пикеринга составляет приблизительно 3 мкм или менее.In one embodiment, the particle size distribution D 90 of the functionalized dietary fiber or Pickering particle is about 3 microns or less.
В одном варианте осуществления распределение частиц по размерам D50 функционализированного пищевого волокна или частицы Пикеринга составляет менее приблизительно 25 мкм.In one embodiment, the particle size distribution D 50 of the functionalized dietary fiber or Pickering particle is less than about 25 microns.
В одном варианте осуществления распределение частиц по размерам D50 функционализированного пищевого волокна или частицы Пикеринга составляет приблизительно 10 мкм или менее.In one embodiment, the particle size distribution D 50 of the functionalized dietary fiber or Pickering particle is about 10 microns or less.
В одном варианте осуществления распределение частиц по размерам D50 функционализированного пищевого волокна или частицы Пикеринга составляет приблизительно 3 мкм или менее.In one embodiment, the particle size distribution D 50 of the functionalized dietary fiber or Pickering particle is about 3 microns or less.
DP, 3 измеряют в единицах длины (например, мкм), и он обозначает такой диаметр частицы, при котором P% от общего объема, занимаемого частицей в образце, имеют диаметр, меньший или равный длине, заданной для этого параметра. Следовательно, например, если D90,3 = 1 мкм, это означает, что 90% от общего объема частиц в образце представлены частицами, имеющими диаметр 1 мкм или менее.D P, 3 is measured in units of length (eg, µm) and denotes the particle diameter such that P% of the total volume occupied by the particle in the sample has a diameter less than or equal to the length specified for this parameter. Therefore, for example, if D 90.3 = 1 µm, this means that 90% of the total volume of particles in the sample are particles having a diameter of 1 µm or less.
Например, объемный средний размер частиц можно измерять способом, в котором средний объемный диаметр частицы получают с помощью лазерной дифракции с применением оптического инструмента Malvern (Mastersizer 2000, г. Малверн, Великобритания).For example, the volume average particle size can be measured by a method in which the volume average particle diameter is obtained by laser diffraction using a Malvern optical instrument (Mastersizer 2000, Malvern, UK).
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения частицы функционализированного пищевого волокна настоящего изобретения и/или используемые в настоящем изобретении также могут иметь распределение частиц по размерам (PSD) на основании объема, которое является би- или мономодальным.In some preferred embodiments, the functionalized dietary fiber particles of the present invention and/or used in the present invention may also have a particle size distribution (PSD) based on volume that is bi- or monomodal.
В некоторых вариантах осуществления отношение размера функционализированного пищевого волокна или частицы Пикеринга к размеру масла (в эмульсии может находиться в диапазоне 1 : 10. Другими словами, в некоторых вариантах осуществления функционализированное пищевое волокно (в комбинации с денатурированным ферментом) или частица Пикеринга должны быть по меньшей мере на один порядок меньше, чем стабилизируемые ими капли масла.In some embodiments, the ratio of the size of the functionalized dietary fiber or Pickering particle to the size of the oil (in emulsion may be in the range of 1:10. In other words, in some embodiments, the functionalized dietary fiber (in combination with the denatured enzyme) or Pickering particle must be at least least one order of magnitude less than the oil drops they stabilize.
В одном варианте осуществления способ в соответствии с настоящим изобретением включает сушку указанной водной суспензии, содержащей функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент.In one embodiment, the method in accordance with the present invention includes drying the specified aqueous suspension containing functionalized dietary fiber and denatured enzyme.
Сушку можно проводить любыми известными подходящими средствами, включая распылительную сушку, вакуумную сушку, сушку в барабанной сушилке, сублимационную сушку (или лиофилизацию) или сверхкритическую сушку.Drying can be carried out by any known suitable means, including spray drying, vacuum drying, drum drying, freeze drying (or lyophilization), or supercritical drying.
В одном предпочтительном варианте осуществления функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент в соответствии с настоящим изобретением или частица Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением высушены посредством сублимационной сушки.In one preferred embodiment, the functionalized dietary fiber and the denatured enzyme according to the present invention or the Pickering particle according to the present invention are freeze-dried.
Функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент в соответствии с настоящим изобретением или частица Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы в сухом состоянии.The functionalized dietary fiber and the denatured enzyme according to the present invention or the Pickering particle according to the present invention can be used in the dry state.
Функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент в соответствии с настоящим изобретением или частица Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением может быть в любой подходящей форме. В одном варианте осуществления настоящее изобретение или частица Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением может быть в форме гранулы или порошка.The functionalized dietary fiber and denatured enzyme according to the present invention or the Pickering particle according to the present invention may be in any suitable form. In one embodiment, the present invention or the Pickering particle of the present invention may be in the form of a granule or powder.
В одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение или частица Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой порошок.In one preferred embodiment, the present invention or the Pickering particle according to the present invention may be a powder.
В настоящем документе термин «частица Пикеринга» означает твердую частицу, которая адсорбируется на поверхности раздела масляной и водяной фаз в эмульсии, например, из-за их смачивающих свойств, для стабилизации эмульсии с образованием эмульсии Пикеринга. Используемый в настоящем документе термин «частица Пикеринга» может означать частицу, проявляющую межфазную активность на поверхности раздела масло/вода. В настоящем изобретении частицы Пикеринга настоящего изобретения могут стабилизировать как эмульсии «масло в воде», так и «вода в масле».As used herein, the term "Pickering particle" means a solid particle that is adsorbed at the interface between oil and water phases in an emulsion, for example, due to their wetting properties, to stabilize the emulsion to form a Pickering emulsion. As used herein, the term "Pickering particle" may mean a particle exhibiting interfacial activity at an oil/water interface. In the present invention, the Pickering particles of the present invention can stabilize both oil-in-water and water-in-oil emulsions.
Фермент (-ы)Enzyme(s)
Соответственно фермент для применения в настоящем изобретении может представлять собой один или более ферментов, выбранных из группы, состоящей из эндо-1,4-β-глюканазы, целлобиогидролазы, β-глюкозидазы, эндополигалактуроназы, экзополигалактуроназы, пектинметилэстеразы, эндопектатлиазы, экзопектатлиазы и пектинлиазы.Accordingly, the enzyme for use in the present invention may be one or more selected from the group consisting of endo-1,4-β-glucanase, cellobiohydrolase, β-glucosidase, endopolygalacturonase, exopolygalacturonase, pectin methylesterase, endopectate lyase, exopectate lyase, and pectin lyase.
Основным полисахаридом клеточной стенки является целлюлоза. В целом целлюлоза представляет собой нерастворимый в воде гомополимер, состоящий из линейной цепи повторяющихся β-1,4-глюкозиловых звеньев. Отдельные целлюлозные цепи тесно связаны друг с другом в микрофибриллы и удерживаются вместе водородными связями. Соотношение аморфных и кристаллических областей в целлюлозе может варьироваться, при этом кристаллические области очень устойчивы к гидролизу.Cellulose is the main polysaccharide of the cell wall. In general, cellulose is a water-insoluble homopolymer consisting of a linear chain of repeating β-1,4-glucosyl units. The individual cellulose chains are tightly bound together into microfibrils and held together by hydrogen bonds. The ratio of amorphous to crystalline regions in cellulose can vary, with crystalline regions being very resistant to hydrolysis.
Для деполимеризации этого неразветвленного и гомогенного полимера необходимы три различных класса ферментов: эндо-1,4-β-глюканазы (которые гидролизуют целлюлозу до глюкоолигосахаридов); экзоглюканазы или целлобиогидролазы (которые высвобождают целлобиозу из целлюлозы и глюкоолигосахаридов) и β-глюкозидазы (которые расщепляют целлобиозу до глюкозы). Недоступность целлюлозы для гидролитических ферментов в матриксе клеточной стенки является основным препятствием для ее разрушения. Для повышения доступности целлюлозы может потребоваться совместное действие ферментов, расщепляющих пектин и гемицеллюлозу, и/или подходящая предварительная обработка.Three distinct classes of enzymes are required for the depolymerization of this unbranched and homogeneous polymer: endo-1,4-β-glucanases (which hydrolyze cellulose to glucooligosaccharides); exoglucanases or cellobiohydrolases (which release cellobiose from cellulose and glucooligosaccharides) and β-glucosidases (which break down cellobiose to glucose). The inaccessibility of cellulose to hydrolytic enzymes in the cell wall matrix is the main obstacle to its destruction. To increase the availability of cellulose, the combined action of pectin and hemicellulose degrading enzymes and/or suitable pre-treatment may be required.
Пектины представляют собой разнообразную группу полисахаридов и имеют самые сложные структуры (Vincken, Voragen and Beldman, 2003 Enzymes degrading rhamnogalacturonan and xylogalacturonan. J. Whitaker, A. Voragen and D. Wong, ed., Handbook of food enzymology, 1st ed. New York: Marcel Dekker, pp. 930–941). К этой группе относятся следующие структуры: гомогалактуронан, рамногалактуронан 1 и 2, ксилогалактуронан, арабинан, арабиногалактан 1 и 2 (Bonnin, Garnier, & Ralet, 2014 Applied Microbiology and Biotechnology, 98(2), pp. 519–532). В зависимости от растения или фракции растения тип пектина может отличаться.Pectins are a diverse group of polysaccharides and have the most complex structures (Vincken, Voragen and Beldman, 2003 Enzymes degrading rhamnogalacturonan and xylogalacturonan. J. Whitaker, A. Voragen and D. Wong, ed., Handbook of food enzymology, 1st ed. New York : Marcel Dekker, pp. 930–941). This group includes the following structures: homogalacturonan,
Пектины расщепляются различными типами пектиназ, которые можно различать в зависимости от стороны их действия и типа расщепления. Эндополигалактуроназа, экзополигалактуроназа и пектин/пектатлиазы расщепляют каркас однородных областей. Метилэстеразы и ацетилэстеразы участвуют в удалении метанола и ацетэтиловых эфиров из галактуроновой кислоты соответственно.Pectins are cleaved by various types of pectinases, which can be distinguished depending on the side of their action and the type of cleavage. Endopolygalacturonase, exopolygalacturonase, and pectin/pectate lyases cleave the framework of homogeneous regions. Methylesterases and acetylesterases are involved in the removal of methanol and acetyl esters from galacturonic acid, respectively.
В одном варианте осуществления подходящим ферментом для применения в настоящем изобретении может быть ферментная композиция, имеющая более одного фермента или более одной ферментативной активности.In one embodiment, a suitable enzyme for use in the present invention may be an enzyme composition having more than one enzyme or more than one enzyme activity.
В одном варианте осуществления предпочтительно фермент для применения в настоящем изобретении имеет две или более ферментативных активности, выбранных из группы, состоящей из эндо-1,4-β-глюканазы, целлобиогидролазы, β-глюкозидазы, эндополигалактуроназы, экзополигалактуроназы, пектинметилэстеразы, эндопектатлиазы, экзопектатлиазы и пектинлиазы.In one embodiment, preferably the enzyme for use in the present invention has two or more enzymatic activities selected from the group consisting of endo-1,4-β-glucanase, cellobiohydrolase, β-glucosidase, endopolygalacturonase, exopolygalacturonase, pectinmethylesterase, endopectate lyase, exopectate lyase, and pectin lyases.
В настоящем изобретении один или более ферментов, которые действуют на целлюлозу, например один или более из эндо-1,4-β-глюканазы, целлобиогидролазы, β-глюкозидазы могут быть использованы в комбинации с одним или более ферментов, расщепляющих пектин, например одним или более из эндополигалактуроназы, экзополигалактуроназы, пектинметилэстеразы, эндопектатлиазы, экзопектатлиазы и пектинлиазы.In the present invention, one or more enzymes that act on cellulose, for example one or more of endo-1,4-β-glucanase, cellobiohydrolase, β-glucosidases can be used in combination with one or more pectin-cleaving enzymes, for example one or more from endopolygalacturonase, exopolygalacturonase, pectin methylesterase, endopectate lyase, exopectate lyase and pectin lyase.
В одном варианте осуществления один или более ферментов для применения в настоящем изобретении представляют собой ферментную смесь, которая обладает активностью эндо-1,4-β-глюканазы и β-глюкозидазы.In one embodiment, one or more enzymes for use in the present invention is an enzyme mixture that has endo-1,4-β-glucanase and β-glucosidase activity.
В одном варианте осуществления один или более ферментов для применения в настоящем изобретении представляют собой ферментную смесь, которая обладает активностью целлобиогидролазы.In one embodiment, one or more enzymes for use in the present invention is an enzyme mixture that has cellobiohydrolase activity.
В одном варианте осуществления один или более ферментов для применения в настоящем изобретении представляют собой ферментную смесь, которая обладает активностью эндо-1,4-β-глюканазы, целлобиогидролазы и β-глюкозидазы.In one embodiment, one or more enzymes for use in the present invention is an enzyme mixture that has endo-1,4-β-glucanase, cellobiohydrolase, and β-glucosidase activities.
В одном варианте осуществления один или более ферментов для применения в настоящем изобретении представляют собой ферментную смесь, обладающую одной или более ферментативными активностями, выбранными из эндополигалактуроназы, экзополигалактуроназы, пектинметилэстеразы, эндопектатлиазы, экзопектатлиазы и пектинлиазы.In one embodiment, one or more enzymes for use in the present invention is an enzyme mixture having one or more enzymatic activities selected from endopolygalacturonase, exopolygalacturonase, pectin methylesterase, endopectate lyase, exopectate lyase, and pectin lyase.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения ферментная смесь, содержащая два или более из эндо-1,4-β-глюканазы, целлобиогидролазы и/или β-глюкозидазы могут быть использованы в комбинации с одним или более ферментов, расщепляющих пектин, например одним или более из эндополигалактуроназы, экзополигалактуроназы, пектинметилэстеразы, эндопектатлиазы, экзопектатлиазы и пектинлиазы.In one embodiment of the present invention, an enzyme mixture containing two or more of endo-1,4-β-glucanase, cellobiohydrolase and/or β-glucosidase can be used in combination with one or more pectin-cleaving enzymes, for example one or more of endopolygalacturonase, exopolygalacturonase, pectin methylesterase, endopectate lyase, exopectate lyase and pectin lyase.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения ферментную смесь, содержащую два или более из эндо-1,4-β-глюканазы, целлобиогидролазы и/или β-глюкозидазы, можно применять в комбинации с полигалактуроназой, например эндополигалактуроназой или экзополигалактуроназой.In one embodiment of the present invention, an enzyme mixture containing two or more of endo-1,4-β-glucanase, cellobiohydrolase and/or β-glucosidase can be used in combination with a polygalacturonase, eg endopolygalacturonase or exopolygalacturonase.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения ферментную смесь, содержащую целлобиогидролазу, можно применять в комбинации с полигалактуроназой, например эндополигалактуроназой или экзополигалактуроназой.In one embodiment of the present invention, an enzyme mixture containing cellobiohydrolase can be used in combination with a polygalacturonase, such as endopolygalacturonase or exopolygalacturonase.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный один или более ферментов для применения в настоящем изобретении могут представлять собой один или более ферментов, содержащих (или имеющих или состоящих из) полипептидные последовательности, показанные в настоящем документе как SEQ ID № 1, SEQ ID № 2 или SEQ ID № 3, или полипептидную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную ей.In one embodiment of the present invention, said one or more enzymes for use in the present invention may be one or more enzymes containing (or having or consisting of) the polypeptide sequences shown herein as SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, or SEQ ID No. 3, or a polypeptide sequence at least 70% identical to it.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный один или более ферментов для применения в настоящем изобретении могут представлять собой один или более ферментов, содержащих (или имеющих или состоящих из) полипептидные последовательности, показанные в настоящем документе как SEQ ID № 1, SEQ ID № 2 или SEQ ID № 3, или полипептидную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную ей.In one embodiment of the present invention, said one or more enzymes for use in the present invention may be one or more enzymes containing (or having or consisting of) the polypeptide sequences shown herein as SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, or SEQ ID No. 3, or a polypeptide sequence at least 80% identical to it.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный один или более ферментов для применения в настоящем изобретении могут представлять собой один или более ферментов, содержащих (или имеющих или состоящих из) полипептидные последовательности, показанные в настоящем документе как SEQ ID № 1, SEQ ID № 2 или SEQ ID № 3, или полипептидную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную ей.In one embodiment of the present invention, said one or more enzymes for use in the present invention may be one or more enzymes containing (or having or consisting of) the polypeptide sequences shown herein as SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, or SEQ ID No. 3, or a polypeptide sequence at least 90% identical to it.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный один или более ферментов для применения в настоящем изобретении могут представлять собой один или более ферментов, содержащих (или имеющих или состоящих из) полипептидные последовательности, показанные в настоящем документе как SEQ ID № 1, SEQ ID № 2 или SEQ ID № 3, или полипептидную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную ей.In one embodiment of the present invention, said one or more enzymes for use in the present invention may be one or more enzymes containing (or having or consisting of) the polypeptide sequences shown herein as SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, or SEQ ID No. 3, or a polypeptide sequence at least 95% identical to it.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный один или более ферментов для применения в настоящем изобретении могут представлять собой полипептид, имеющий активность целлобиогидролазы, содержащий (или имеющий или состоящий из) полипептидную последовательность, показанную в настоящем документе как SEQ ID № 1 или SEQ ID № 2, или аминокислотную последовательность, которая содержит консервативную замену по меньшей мере одной из аминокислот; или вариант, гомолог или производное SEQ ID № 1 или SEQ ID № 2, по меньшей мере на 70% идентичное ей.In one embodiment of the present invention, said one or more enzymes for use in the present invention may be a polypeptide having cellobiohydrolase activity, comprising (or having or consisting of) the polypeptide sequence shown herein as SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 2 , or an amino acid sequence that contains a conservative substitution of at least one of the amino acids; or a variant, homologue or derivative of SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 2 at least 70% identical to it.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный один или более ферментов для применения в настоящем изобретении могут представлять собой полипептид, имеющий активность полигалактуроназы, содержащий (или имеющий или состоящий из) полипептидную последовательность, показанную в настоящем документе как SEQ ID № 3, или аминокислотную последовательность, которая содержит консервативную замену по меньшей мере одной из аминокислот; или вариант, гомолог или производное SEQ ID № 3, по меньшей мере на 70% идентичное ей.In one embodiment of the present invention, said one or more enzymes for use in the present invention may be a polypeptide having polygalacturonase activity, comprising (or having or consisting of) a polypeptide sequence shown herein as SEQ ID NO: 3, or an amino acid sequence, which contains a conservative substitution of at least one of the amino acids; or a variant, homologue or derivative of SEQ ID NO: 3 at least 70% identical to it.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения один или более ферментов кодируют нуклеотидной последовательностью, которая кодирует полипептидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID № 1, SEQ ID № 2 или SEQ ID № 3, или аминокислотную последовательность, которая содержит консервативную замену по меньшей мере одной из аминокислот; или вариант, гомолог или производное SEQ ID № 1, SEQ ID № 2 или SEQ ID № 3, по меньшей мере на 70% идентичное ей.In one embodiment of the present invention, one or more enzymes are encoded with a nucleotide sequence that encodes a polypeptide sequence selected from the group consisting of SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, or SEQ ID No. 3, or an amino acid sequence that contains a conservative substitution of at least at least one of the amino acids; or a variant, homologue, or derivative of SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, or SEQ ID No. 3 at least 70% identical to it.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный один или более ферментов для применения в настоящем изобретении могут представлять собой комбинацию полипептида, показанного в настоящем документе как SEQ ID № 1 или SEQ ID № 2, или аминокислотную последовательность, которая содержит консервативную замену по меньшей мере одной из аминокислот; или вариант, гомолог или производное SEQ ID № 1 или SEQ ID № 2, по меньшей мере на 70% идентичное ей, и полипептид, имеющий активность полигалактуроназы, содержащий (или имеющий или состоящий из) полипептидную последовательность, показанную в настоящем документе как SEQ ID № 3, или аминокислотную последовательность, которая содержит консервативную замену по меньшей мере одной из аминокислот; или вариант, гомолог или производное SEQ ID № 3, по меньшей мере на 70% идентичное ей.In one embodiment of the present invention, said one or more enzymes for use in the present invention may be a combination of a polypeptide shown herein as SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 2, or an amino acid sequence that contains a conservative substitution of at least one of amino acids; or a variant, homologue, or derivative of SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 2 at least 70% identical thereto, and a polypeptide having polygalacturonase activity, comprising (or having or consisting of) the polypeptide sequence shown herein as SEQ ID No. 3, or an amino acid sequence that contains a conservative substitution of at least one of the amino acids; or a variant, homologue or derivative of SEQ ID NO: 3 at least 70% identical to it.
В одном варианте осуществления фермент представляет собой эндо-1,4-β-глюканазу. Ферменты эндо-1,4-β-глюканазы можно охарактеризовать как относящиеся к КФ. 3.2.1.4 в соответствии с рекомендациями по номенклатуре ферментов Международного союза биохимии и молекулярной биологии (IUBMB). Этот фермент эндогидролизует (1→4)-β-D-глюкозидные связи в целлюлозе, лихенине и β-D-глюканах зерновых. Другими названиями этого фермента могут быть целлюлаза, β-1,4-глюканаза; β-1,4-эндоглюкангидролаза; целлюлаза A; целлюлозин АР; эндоглюканаза D; щелочная целлюлаза; целлюлаза A 3; целлюдекстриназа; 9.5 целлюлаза; авицелаза; панцеллаза SS; 1,4-(1,3;1,4)-β-D-глюкан-4-глюканогидрола. Систематическим названием этого фермента является 4-(1,3;1,4)-β-D-глюкан-4-глюканогидролаза.In one embodiment, the enzyme is an endo-1,4-β-glucanase. Enzymes endo-1,4-β-glucanase can be characterized as related to CP. 3.2.1.4 in accordance with the recommendations for enzyme nomenclature of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB). This enzyme endohydrolyzes (1→4)-β-D-glucosidic bonds in cellulose, lichenin, and β-D-glucans in cereals. Other names for this enzyme may be cellulase, β-1,4-glucanase; β-1,4-endoglucan hydrolase; cellulase A; cellulose AR; endoglucanase D; alkaline cellulase;
В одном варианте осуществления фермент представляет собой β-глюкозидазу. β-глюкозидаза может быть отнесена к классификации КФ 3.2.1.21 в соответствии с рекомендациями по номенклатуре ферментов Международного союза биохимии и молекулярной биологии (IUBMB). В некоторых вариантах осуществления данный фермент гидролизует концевые, невосстанавливающие β-D-глюкозиловые остатки с высвобождением β-D-глюкозы. Другими названиями этого фермента могут быть гентиобиаза; целлобиаза; эмульсин; элатераза; арил-β-глюкозидаза; β-D-глюкозидаза; β-глюкозидглюкогидролаза; арбутиназа; амигдалиназа; p-нитрофенил-β-глюкозидаза; примеверозидаза; амигдалаза; линамараза; салицилиназа; β-1,6-глюкозидаза. Систематическим названием этого фермента является β-D-глюкозидглюкогидролаза. В одном варианте осуществления фермент может представлять собой фермент GH3 согласно классификации с использованием базы данных углеводных активных ферментов (www.CAZy.org).In one embodiment, the enzyme is β-glucosidase. β-glucosidase can be assigned to the classification of EC 3.2.1.21 in accordance with the recommendations on the nomenclature of enzymes of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB). In some embodiments, the enzyme hydrolyzes terminal, non-reducing β-D-glucosyl residues to release β-D-glucose. Other names for this enzyme may be gentiobiase; cellobiase; emulsin; elatherase; aryl-β-glucosidase; β-D-glucosidase; β-glucoside glucohydrolase; arbutinase; amygdalinase; p-nitrophenyl-β-glucosidase; primeverosidase; amygdalase; linamase; salicillinase; β-1,6-glucosidase. The systematic name of this enzyme is β-D-glucoside glucohydrolase. In one embodiment, the enzyme may be a GH3 enzyme as classified using the Carbohydrate Active Enzyme Database (www.CAZy.org).
В одном варианте осуществления фермент представляет собой целлобиогидролазу. Целлобиогидролаза может представлять собой целлюлозо-1,4-β-целлобиозидазу (невосстанавливающий конец). Целлобиогидролаза может быть отнесена к классификации КФ 3.2.1.91 в соответствии с рекомендациями по номенклатуре ферментов Международного союза биохимии и молекулярной биологии (IUBMB). В некоторых вариантах осуществления данный фермент гидролизует(1→4)-β-D-глюкозидные связи в целлюлозе и целлотетраозе за счет высвобождения целлобиозы из невосстанавливающих концов цепей. Другими названиями этого фермента могут быть экзоцеллобиогидролаза; β-1,4-глюканцеллобиогидролаза; β-1,4-глюканцеллобиосилгидролаза; 1,4-β-глюканцеллобиозидаза; экзоглюканаза; авицелаза; CBH 1; C1 целлюлаза; целлобиогидролаза I; целлобиогидролаза; экзо-β-1,4-глюканцеллобиогидролаза; 1,4-β-D-глюканцеллобиогидролаза; целлобиозидаза. Систематическим названием этого фермента является 4-β-D-глюканцеллобиогидролаза (невосстанавливающий конец).In one embodiment, the enzyme is a cellobiohydrolase. Cellobiohydrolase may be cellulose-1,4-β-cellobiosidase (non-reducing end). Cellobiohydrolase can be assigned to the classification of EC 3.2.1.91 in accordance with the recommendations on the nomenclature of enzymes of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB). In some embodiments, the enzyme hydrolyzes (1→4)-β-D-glucosidic bonds in cellulose and cellotetraose by releasing the cellobiose from the non-reducing ends of the chains. Other names for this enzyme may be exocellobiohydrolase; β-1,4-glucancellobiohydrolase; β-1,4-glucancellobiosil hydrolase; 1,4-β-glucancellobiosidase; exoglucanase; avicelase;
В одном варианте осуществления фермент представляет собой эндополигалактуроназу. В одном варианте осуществления фермент представляет собой эндо-1,4-α-полигалактуроназу. Эндо-1,4-α-полигалактуроназа может быть отнесена к классификации КФ 3.2.1.15 в соответствии с рекомендациями по номенклатуре ферментов Международного союза биохимии и молекулярной биологии (IUBMB). В некоторых вариантах осуществления данный фермент гидролизует (1→ 4)-α-D-галактозидуроновые связи в пектате и других галактуронанах. Другими названиями этого фермента могут быть полигалактуроназа, пектиндеполимераза; пектиназа; эндополигалактуроназа; пектолаза; пектингидролаза; пектинполигалактуроназа; эндополигалактуроназа; поли-α-1,4-галактуронидгликаногидролаза; эндогалактуроназа; эндо-D-галактуроназа; поли(1,4-α-D-галактуронид)гликаногидролаза. Систематическим названием этого фермента является (1→4)-α-D-галактуронангликаногидролаза.In one embodiment, the enzyme is an endopolygalacturonase. In one embodiment, the enzyme is an endo-1,4-α-polygalacturonase. Endo-1,4-α-polygalacturonase can be assigned to the classification of EC 3.2.1.15 in accordance with the recommendations for the nomenclature of enzymes of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB). In some embodiments, this enzyme hydrolyzes (1→4)-α-D-galactosiduronic bonds in pectate and other galacturonans. Other names for this enzyme may be polygalacturonase, pectin depolymerase; pectinase; endopolygalacturonase; pectolase; pectin hydrolase; pectinpolygalacturonase; endopolygalacturonase; poly-α-1,4-galacturonide glycanohydrolase; endogalacturonase; endo-D-galacturonase; poly(1,4-α-D-galacturonide)glycanohydrolase. The systematic name of this enzyme is (1→4)-α-D-galacturon anglicanohydrolase.
В одном варианте осуществления фермент представляет собой экзополигалактуроназу. Экзополигалактуроназы могут быть отнесены к классификации КФ 3.2.1.67 в соответствии с рекомендациями по номенклатуре ферментов Международного союза биохимии и молекулярной биологии (IUBMB). В некоторых вариантах осуществления данный фермент осуществляет гидролиз в следующей реакции: [(1→4)-α-D-галактуронид]n + H2O = [(1→4)-α-D-галактуронид]n-1 + D-галактуронат. Другими названиями этого фермента могут быть галактуран-1,4-α-галактуронидаза; поли(галактуронат)гидролаза; экзо-D-галактуроназа; экзо-D-галактуронаназа; экзополи-D-галактуроназа; поли(1,4-α-D-галактуронид)галактуроногидролаза. Систематическим названием этого фермента является поли[(1→4)-α-D-галактуронид]галактуроногидролаза.In one embodiment, the enzyme is an exopolygalacturonase. Exopolygalacturonases can be assigned to the classification of EC 3.2.1.67 in accordance with the recommendations on the nomenclature of enzymes of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB). In some embodiments, this enzyme hydrolyzes in the following reaction: [(1→4)-α-D-galacturonide] n + H 2 O = [(1→4)-α-D-galacturonide] n-1 + D- galacturonate. Other names for this enzyme may be galacturan-1,4-α-galacturonidase; poly(galacturonate)hydrolase; exo-D-galacturonase; exo-D-galacturonanase; exopoly-D-galacturonase; poly(1,4-α-D-galacturonide)galacturonohydrolase. The systematic name of this enzyme is poly[(1→4)-α-D-galacturonide]galacturonohydrolase.
В одном варианте осуществления фермент представляет собой пектинметилэстеразу. Пектинметилэстеразы могут быть отнесены к классификации КФ 3.1.1.11 в соответствии с рекомендациями по номенклатуре ферментов Международного союза биохимии и молекулярной биологии (IUBMB). В некоторых вариантах осуществления данный фермент осуществляет гидролиз в следующей реакции: пектин + n H2O = n метанол + пектат. Другими названиями этого фермента могут быть пектиндеметоксилаза; пектинметоксилаза; пектинметилэстераза. Систематическим названием этого фермента является пектинпектилгидролаза.In one embodiment, the enzyme is pectin methylesterase. Pectin methylesterases can be assigned to the classification of EC 3.1.1.11 in accordance with the recommendations for the nomenclature of enzymes of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB). In some embodiments, this enzyme hydrolyzes in the following reaction: pectin + n H 2 O = n methanol + pectate. Other names for this enzyme may be pectin demethoxylase; pectin methoxylase; pectin methylesterase. The systematic name of this enzyme is pectin pectyl hydrolase.
В одном варианте осуществления фермент представляет собой эндопектатлиазу. Эндопектатлиазы могут быть отнесены к классификации КФ 4.2.2.2 в соответствии с рекомендациями по номенклатуре ферментов Международного союза биохимии и молекулярной биологии (IUBMB). В некоторых вариантах осуществления данный фермент осуществляет гидролиз в следующей реакции: элиминационное расщепление (1→4)-α-D-галактуронана с получением олигосахаридов с 4-дезокси-α-D-галакт-4-энуронозиловыми группами на невосстанавливающих концах. Другими названиями этого фермента могут быть лиаза альфа-1,4-D-эндополигалактуроновой кислоты; лиаза эндо-альфа-1,4-полигалактуроновой кислоты; эндогалактуронаттрансэлиминаза; эндопектинметилтрансэлиминаза; пектаттрансэлиминаза; лиаза пектиновой кислоты; трансэлиминаза пектиновой кислоты; пектиновая лиаза; пектинтрансэлиминаза; лиаза PGA; полигалактуронатлиаза; лиаза полигалактуроновой кислоты; трансэлиминаза полигалактуроновой кислоты; трансэлиминаза полигалактуроновой кислоты; PPase-N. Систематическим названием этого фермента является (1→4)-α-D-галактуронанлиаза.In one embodiment, the enzyme is an endopectate lyase. Endopectate lyases can be assigned to the classification of EC 4.2.2.2 in accordance with the recommendations on the nomenclature of enzymes of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB). In some embodiments, the enzyme hydrolyzes in the following reaction: elimination cleavage of (1→4)-α-D-galacturonan to produce oligosaccharides with 4-deoxy-α-D-galact-4-enuronosyl groups at the non-reducing ends. Other names for this enzyme may be alpha-1,4-D-endopolygalacturonic acid lyase; endo-alpha-1,4-polygalacturonic acid lyase; endogalacturonate transeliminase; endopectin methyl transeliminase; pectate transeliminase; pectin acid lyase; pectic acid transeliminase; pectin lyase; pectintranseliminase; lyase PGA; polygalacturonate lyase; polygalacturonic acid lyase; polygalacturonic acid transeliminase; polygalacturonic acid transeliminase; PPase-N. The systematic name of this enzyme is (1→4)-α-D-galacturonan lyase.
В одном варианте осуществления фермент представляет собой экзопектатлиазу. Экзопектатлиазы могут быть отнесены к классификации КФ 4.2.2.9 в соответствии с рекомендациями по номенклатуре ферментов Международного союза биохимии и молекулярной биологии (IUBMB). В некоторых вариантах осуществления данный фермент осуществляет гидролиз в следующей реакции: элиминационное расщепление 4-(4-дезокси-α-D-галакт-4-энуронозил)-D-галактуроната из восстанавливающего конца пектата, т.е. деэтерификация пектина. Другими названиями этого фермента могут быть экзо-PATE; экзо-PGL; экзопектатлиаза; трансэлиминаза экзопектиновой кислоты; экзополигалактуронатлиаза; трансэлиминаза экзополигалактуроновой кислоты; PATE; пектатэкзолиаза. Систематическим названием этого фермента является (1→4)-α-D-галактуронандисахаридлиаза восстанавливающего конца.In one embodiment, the enzyme is an exopectate lyase. Exopectate lyases can be assigned to the EC 4.2.2.9 classification in accordance with the recommendations for enzyme nomenclature of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB). In some embodiments, this enzyme hydrolyzes in the following reaction: elimination cleavage of 4-(4-deoxy-α-D-galact-4-enuronosyl)-D-galacturonate from the reducing end of the pectate, i. deesterification of pectin. Other names for this enzyme may be exo-PATE; exo-PGL; exopectate lyase; exopectic acid transeliminase; exopolygalacturonate lyase; transeliminase exopolygalacturonic acid; PATE; pectate exoliase. The systematic name of this enzyme is (1→4)-α-D-galacturonandisaccharide lyase of the reducing end.
В одном варианте осуществления фермент представляет собой пектинлиазу. Пектинлиазы могут быть отнесены к классификации КФ 4.2.2.10 в соответствии с рекомендациями по номенклатуре ферментов Международного союза биохимии и молекулярной биологии (IUBMB). В некоторых вариантах осуществления данный фермент осуществляет гидролиз в следующей реакции: элиминационное расщепление метилового сложного эфира (1→4)-α-D-галактуронана с получением олигосахаридов с 4-дезокси-6-O-метил-α-D-галакт-4-энуронозиловыми группами на невосстанавливающих концах. Другими названиями этого фермента могут быть эндопектинлиаза; пектинметилтрансэлиминаза; пектинтрансэлиминаза; пектолиаза; PL; PMGL; PNL; трансэлиминаза полиметилгалактуроновой кислоты. Систематическим названием этого фермента является (1→4)-6-O-метил-α-D-галактуронанлиаза.In one embodiment, the enzyme is a pectin lyase. Pectin lyases can be assigned to the classification of EC 4.2.2.10 in accordance with the recommendations on the nomenclature of enzymes of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB). In some embodiments, the enzyme hydrolyzes in the following reaction: elimination cleavage of (1→4)-α-D-galacturonan methyl ester to produce oligosaccharides with 4-deoxy-6-O-methyl-α-D-galact-4- enuronosyl groups at the non-reducing ends. Other names for this enzyme may be endopectin lyase; pectin methyl transeliminase; pectintranseliminase; pectoliase; PL; PMGL; PNL; transeliminase of polymethylgalacturonic acid. The systematic name of this enzyme is (1→4)-6-O-methyl-α-D-galacturonan lyase.
В одном варианте осуществления ферментативную активность можно измерять в соответствии с ферментными анализами, представленными в разделе 1.2.1 раздела примеров.In one embodiment, enzymatic activity can be measured in accordance with the enzyme assays presented in section 1.2.1 of the examples section.
В одном варианте осуществления фермент может быть выбран из группы, состоящей из:In one embodiment, the enzyme may be selected from the group consisting of:
В одном варианте осуществления соответственно фермент может представлять собой Celluclast® 1.5L, или Pectinex Ultra SP-L, или их комбинацию.In one embodiment, respectively, the enzyme may be Celluclast® 1.5L, or Pectinex Ultra SP-L, or a combination thereof.
В одном варианте осуществления фермент может представлять собой ферментный комплекс, имеющий более одной ферментативной активности.In one embodiment, the enzyme may be an enzyme complex having more than one enzymatic activity.
Способ настоящего изобретения предусматривает денатурирование фермента(-ов). Без ограничений, накладываемых какой-либо теорией, фермент(-ы) в активной и растворимой форме не обладают какими-либо эмульгирующими свойствами в комбинации с функционализированным пищевым волокном. Однако после инактивации или денатурирования фермент(-ы) становятся поверхностно-активными агентами и стабилизируют эмульсию в присутствии функционализированных пищевых волокон. Без ограничений, накладываемых какой-либо теорией, денатурированный(-ые) фермент(-ы) может (могут) образовывать амфифильные комплексы с функционализированным пищевым волокном и, таким образом, передавать поверхностную активность гидрофильной части частицы волокна. Данные показывают, что фермент(-ы) связан(-ы) с функционализированным пищевым волокном, поскольку фермент не экстрагируется с растворимой фазой и может быть измерен в нерастворимой фазе посредством электрофореза белков в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE).The method of the present invention involves the denaturation of the enzyme(s). Without being limited by any theory, the enzyme(s) in active and soluble form do not have any emulsifying properties in combination with functionalized dietary fiber. However, once inactivated or denatured, the enzyme(s) become surface active agents and stabilize the emulsion in the presence of functionalized dietary fiber. Without being limited by any theory, the denatured enzyme(s) may form amphiphilic complexes with functionalized dietary fiber and thus transfer the surface activity of the hydrophilic portion of the fiber particle. The data show that the enzyme(s) is(are) bound to the functionalized dietary fiber because the enzyme is not extracted with the soluble phase and can be measured in the insoluble phase by protein electrophoresis in polyacrylamide gel in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE).
Фермент (-ы) можно денатурировать любым подходящим средством, например с помощью тепла, например путем повышения температуры выше 60°C, например до 100°C, в течение 10 минут; или с использованием крайних значений pH, например путем обработки щелочью, например путем увеличения pH до уровня выше 9.The enzyme(s) can be denatured by any suitable means, eg by heat, eg by raising the temperature above 60°C, eg to 100°C, for 10 minutes; or by using pH extremes, for example by treatment with alkali, for example by increasing the pH to above 9.
В одном варианте осуществления функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент настоящего изобретения или частица Пикеринга настоящего изобретения содержит денатурированный фермент в соотношении более 0,25 мг денатурированного фермента : 1 г масла.In one embodiment, the functionalized dietary fiber and denatured enzyme of the present invention or Pickering particle of the present invention contains the denatured enzyme in a ratio of greater than 0.25 mg denatured enzyme: 1 g oil.
В одном варианте осуществления фермент можно выбирать таким образом, чтобы он имел оптимальное значение pH в пределах диапазона pH для применения продукта. Таким образом можно обеспечивать устойчивость к образованию хлопьев в конечном продукте.In one embodiment, the enzyme can be selected such that it has an optimal pH value within the pH range for product application. In this way, flocculation resistance in the final product can be ensured.
Пищевое волокноdietary fiber
Настоящее изобретение относится к способу получения функционализированного пищевого волокна.The present invention relates to a method for producing a functionalized dietary fiber.
Настоящее изобретение включает смешивание фермента и пищевого волокна, которое имеет распределение частиц по размеру D90 менее 800 мкм и которое содержит по меньшей мере 40 мас.% целлюлозы.The present invention includes a blend of enzyme and dietary fiber that has a D90 particle size distribution of less than 800 µm and that contains at least 40% by weight of cellulose.
В одном варианте осуществления пищевое волокно может иметь по меньшей мере 50 мас.% целлюлозы.In one embodiment, the dietary fiber may have at least 50 wt.% cellulose.
В одном варианте осуществления пищевое волокно может иметь по меньшей мере 55 мас.% целлюлозы.In one embodiment, the dietary fiber may have at least 55 wt.% cellulose.
В одном варианте осуществления пищевое волокно может иметь по меньшей мере 60 мас.% целлюлозы.In one embodiment, the dietary fiber may have at least 60 wt.% cellulose.
В одном варианте осуществления пищевое волокно может содержать по меньшей мере 40–98 мас.% целлюлозы.In one embodiment, the dietary fiber may contain at least 40-98% by weight of cellulose.
В одном варианте осуществления пищевое волокно может содержать по меньшей мере 50–80 мас.% целлюлозы.In one embodiment, the dietary fiber may contain at least 50-80% by weight of cellulose.
В одном варианте осуществления пищевое волокно может содержать по меньшей мере 60–75 мас.% целлюлозы.In one embodiment, the dietary fiber may contain at least 60-75% by weight of cellulose.
Настоящее изобретение включает смешивание фермента и пищевого волокна, которое имеет распределение частиц по размеру D50 менее 30 мкм и которое содержит по меньшей мере 40 мас.% целлюлозы.The present invention includes a blend of enzyme and dietary fiber that has a D50 particle size distribution of less than 30 µm and that contains at least 40% by weight of cellulose.
В одном варианте осуществления пищевое волокно может иметь по меньшей мере 50 мас.% целлюлозы.In one embodiment, the dietary fiber may have at least 50 wt.% cellulose.
В одном варианте осуществления пищевое волокно может иметь по меньшей мере 55 мас.% целлюлозы.In one embodiment, the dietary fiber may have at least 55 wt.% cellulose.
В одном варианте осуществления пищевое волокно может иметь по меньшей мере 60 мас.% целлюлозы.In one embodiment, the dietary fiber may have at least 60 wt.% cellulose.
В одном варианте осуществления пищевое волокно может содержать по меньшей мере 40–98 мас.% целлюлозы.In one embodiment, the dietary fiber may contain at least 40-98% by weight of cellulose.
В одном варианте осуществления пищевое волокно может содержать по меньшей мере 50–80 мас.% целлюлозы.In one embodiment, the dietary fiber may contain at least 50-80% by weight of cellulose.
В одном варианте осуществления пищевое волокно может содержать по меньшей мере 60–75 мас.% целлюлозы.In one embodiment, the dietary fiber may contain at least 60-75% by weight of cellulose.
В одном варианте осуществления пищевое волокно в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой волокно кожуры растения. В другом варианте осуществления пищевое волокно может быть получено из богатой волокнами фракции овоща или фрукта.In one embodiment, the dietary fiber of the present invention may be plant skin fiber. In another embodiment, the dietary fiber can be obtained from a fiber-rich fraction of a vegetable or fruit.
Кожура или кожица растения представляет собой внешнюю оболочку или покрытие семени. Кожица или кожура включает в себя защитное внешнее покрытие семян, фруктов или овощей. Кожура бобовых и некоторых схожих фруктов может называться стручком.The rind or skin of a plant is the outer shell or covering of the seed. The skin or rind includes the protective outer covering of a seed, fruit or vegetable. The skin of legumes and some similar fruits may be referred to as a pod.
В одном варианте осуществления волокно кожуры растения может представлять собой любое волокно кожуры растения, которое содержит менее 25 мас.% растворимых волокон.In one embodiment, the plant skin fiber can be any plant skin fiber that contains less than 25% by weight of soluble fibers.
В одном варианте осуществления волокно кожуры растения может представлять собой любое волокно кожуры растения, которое содержит менее 20 мас.% растворимых волокон.In one embodiment, the plant skin fiber can be any plant skin fiber that contains less than 20% by weight of soluble fibers.
В одном варианте осуществления волокно кожуры растения может представлять собой любое волокно кожуры растения, которое содержит менее 15 мас.% растворимых волокон.In one embodiment, the plant skin fiber can be any plant skin fiber that contains less than 15% by weight of soluble fibers.
В одном варианте осуществления волокно кожуры растения может представлять собой любое волокно кожуры растения, которое содержит менее 10 мас.% растворимых волокон.In one embodiment, the plant skin fiber can be any plant skin fiber that contains less than 10% by weight of soluble fibers.
В одном варианте осуществления волокно кожуры растения может представлять собой любое волокно кожуры растения, которое содержит менее 25 мас.% растворимых волокон и по меньшей мере 40 мас.% целлюлозы.In one embodiment, the plant skin fiber can be any plant skin fiber that contains less than 25 wt.% soluble fibers and at least 40 wt.% cellulose.
В одном варианте осуществления волокно кожуры растения может представлять собой любое волокно кожуры растения, которое содержит менее 20 мас.% растворимых волокон и по меньшей мере 50 мас.% целлюлозы.In one embodiment, the plant skin fiber can be any plant skin fiber that contains less than 20 wt.% soluble fibers and at least 50 wt.% cellulose.
В одном варианте осуществления волокно кожуры растения может представлять собой любое волокно кожуры растения, которое содержит менее 15 мас.% растворимых волокон и по меньшей мере 55 мас.% целлюлозы.In one embodiment, the plant skin fiber can be any plant skin fiber that contains less than 15 wt.% soluble fibers and at least 55 wt.% cellulose.
В одном варианте осуществления волокно кожуры растения может представлять собой любое волокно кожуры растения, которое содержит менее 10 мас.% растворимых волокон и по меньшей мере 60 мас.% целлюлозы.In one embodiment, the plant skin fiber can be any plant skin fiber that contains less than 10 wt.% soluble fibers and at least 60 wt.% cellulose.
В одном варианте осуществления волокно кожуры растения выбрано из группы, состоящей из волокна кожуры гороха, кожуры бобовых (например, чечевицы, бобов), волокна бамбука, волокон какао и волокон кофе. Волокно кожуры растения может представлять собой волокно кожуры гороха.In one embodiment, the plant skin fiber is selected from the group consisting of pea skin fiber, legume (eg, lentil, bean) skin fiber, bamboo fiber, cocoa fiber, and coffee fiber. The plant skin fiber may be pea skin fiber.
В одном варианте осуществления пищевые волокна могут быть выбраны по вкусу, а также по другим характеристикам. В качестве примера пищевое волокно может представлять собой волокно с нейтральным вкусом или волокно, которое не имеет вкуса.In one embodiment, dietary fiber can be selected for taste as well as other characteristics. By way of example, dietary fiber may be a neutral taste fiber or a fiber that has no taste.
В одном варианте осуществления пищевые волокна могут быть выбраны по цвету, а также по другим характеристикам. В качестве примера пищевое волокно может представлять собой волокно, которое имеет светлый цвет, нейтральный цвет или бесцветно.In one embodiment, dietary fiber can be selected for color as well as other characteristics. By way of example, dietary fiber may be a fiber that is light in color, neutral in color, or colorless.
В одном варианте осуществления пищевые волокна могут быть выбраны по запаху, а также по другим характеристикам. В качестве примера пищевое волокно может представлять собой волокно, которое не имеет запаха.In one embodiment, dietary fiber can be selected for flavor as well as other characteristics. By way of example, the dietary fiber may be a fiber that is odorless.
В одном варианте осуществления пищевые волокна не являются пшеничными отрубями (или пшеничными волокнами).In one embodiment, the dietary fiber is not wheat bran (or wheat fiber).
В одном варианте осуществления пищевые волокна не являются яблочными выжимками или яблочными волокнами.In one embodiment, the dietary fiber is not apple pomace or apple fibre.
В одном варианте осуществления пищевые волокна не являются подорожником.In one embodiment, the dietary fiber is not psyllium.
В одном варианте осуществления пищевые волокна не являются высокорастворимым пектиновым волокном, например пищевое волокно может представлять собой волокно, которое содержит менее 50% растворимого пектина.In one embodiment, the dietary fiber is not a highly soluble pectin fiber, for example, the dietary fiber may be a fiber that contains less than 50% soluble pectin.
В одном варианте осуществления пищевое волокно не является волокном с низким содержанием целлюлозы, например не является волокном, которое содержит менее 60 мас.% целлюлозы.In one embodiment, the dietary fiber is not a low cellulose fiber, eg is not a fiber that contains less than 60 wt.% cellulose.
Используемый в настоящем документе термин «функционализированный» означает, что пищевое волокно модифицируют (например, с помощью способа настоящего изобретения) путем смешивания с ферментом для получения стабилизирующих эмульсию свойств при нахождении в комбинации с денатурированным ферментом. Используемый в настоящем документе термин «функционализированный» может означать возможность обеспечения функции, например стабилизатора эмульсии типа «масло в воде». Используемый в настоящем документе термин «функционализированный» может означать, что пищевое волокно модифицируют (например, с помощью способа настоящего изобретения) с образованием частицы Пикеринга. Без ограничений, накладываемых какой-либо теорией, пищевое волокно, например PHF, может быть модифицировано путем уменьшения размера частиц и индуцирования амфифильности на поверхности частицы с применением одного или более ферментов с расщепляющей волокно активностью.The term "functionalized" as used herein means that the dietary fiber is modified (eg, by the method of the present invention) by mixing with an enzyme to provide emulsion stabilizing properties when combined with a denatured enzyme. As used herein, the term "functionalized" may mean the ability to provide a function, such as an oil-in-water emulsion stabilizer. As used herein, the term "functionalized" may mean that the dietary fiber is modified (eg, by the method of the present invention) to form a Pickering particle. Without being limited by any theory, dietary fiber, such as PHF, can be modified by reducing particle size and inducing amphiphilicity on the surface of the particle using one or more enzymes with fiber-cleaving activity.
Горох (Pisum sativum L.) представляет собой богатый источник сложных углеводов, и интерес к нему объясняется его использованием в качестве богатого волокнами побочного продукта, имеющего коммерческую ценность (Weightman et al, 1995). Общее содержание пищевых волокон и относительное содержание целлюлозных и нецеллюлозных полисахаридов зависит от их локализации в семядоле или кожуре гороха (Guillon & Champ 2002). В данном исследовании для работы выбран коммерческий состав волокна кожуры гороха, полученный из желтого гороха (Exafine, Cosucra), из-за относительно высокого общего содержания пищевых волокон и из-за меньшего количества крахмальных и белковых примесей (см. таблицу A).The pea (Pisum sativum L.) is a rich source of complex carbohydrates and has attracted interest as a fiber-rich by-product of commercial value (Weightman et al, 1995). The total content of dietary fiber and the relative content of cellulose and non-cellulose polysaccharides depends on their location in the cotyledon or pea skin (Guillon & Champ 2002). In this study, a commercial pea skin fiber formulation derived from yellow peas (Exafine, Cosucra) was chosen to work because of the relatively high total dietary fiber content and because of the lower amount of starch and protein contaminants (see Table A).
ТАБЛИЦА A. Композиция коммерчески доступных волокон кожуры гороха в мас.% сухого вещества (по данным Guillon & Champ, 2002)TABLE A Composition of commercially available pea skin fibers in wt % dry matter (according to Guillon & Champ, 2002)
aПеревариваемые поли-, олиго- и моносахариды a Digestible poly-, oligo- and monosaccharides
Используемый в настоящем документе термин «волокно» означает пищевой материал, содержащий такие вещества, как целлюлоза, лигнин и пектин, которые устойчивы к действию пищеварительных ферментов.Used in this document, the term "fiber" means food material containing substances such as cellulose, lignin and pectin, which are resistant to the action of digestive enzymes.
Для выбора оптимального состава ферментов для их расщепления может быть желательно получить подробные сведения о химической структуре волокон. Клеточные стенки кожуры гороха приблизительно на 69 мас.% состоят из целлюлозы, на 16,8 мас.% из пектина и на 7,5 мас.% из гемицеллюлозы в пересчете на сухое вещество (Reichert, 1982), что согласуется с составом нейтрального сахара, описанным в нескольких исследованиях (см. таблицу B). Кожура гороха только в малой степени лигнифицируется (<1,5 мас.% сухого вещества), и, следовательно, считается, что она не содержит большого количества вторичных клеточных стенок (Weightman et al, 1995 Carbohydrate Polymers, 26, pp. 121–128; Reichert 1981 Cereal Chemistry, 58(4), pp. 266–270).To select the optimal composition of enzymes for their cleavage, it may be desirable to obtain detailed information about the chemical structure of the fibers. Pea skin cell walls are approximately 69 wt% cellulose, 16.8 wt% pectin and 7.5 wt% hemicellulose on a dry matter basis (Reichert, 1982), consistent with a neutral sugar composition described in several studies (see Table B). Pea skins are only slightly lignified (<1.5 wt% dry matter) and hence are not considered to contain a large amount of secondary cell walls (Weightman et al, 1995 Carbohydrate Polymers, 26, pp. 121–128 ; Reichert 1981 Cereal Chemistry, 58(4), pp. 266–270).
Таблица B. Композиция (мг/г) кожуры гороха (Weightman et al, 1995 Carbohydrate Polymers, 26, pp. 121–128)Table B Composition (mg/g) of Pea Peel (Weightman et al, 1995 Carbohydrate Polymers, 26, pp. 121–128)
aн/о — не обнаружено a n/a — not detected
bAUA — ангидроуроновые кислоты b AUA - anhydrouronic acids
Помимо высокого содержания целлюлозы, кожура гороха имеет значительное содержание пектина и гемицеллюлозы. Пектиновые фракции из кожуры гороха содержат как гомогалактуронановые, так и рамногалактуронановые области с очень сложными и разнообразными боковыми цепями, главным образом состоящими из остатков арабинозила, галактозила и ксилозила. В кожуре гороха остатки рамнозила обнаруживались в (1→2)-связанной, (1→2,4)-связанной и концевой форме (Renard et al, 1997). Известно, что рамногалактуронаны с 1→5-связанными арабинанами, ассоциированными с (арабино)галактанами типа 1 и 2 представляют собой наиболее распространенный признак. Арабинаны также имеют свободную форму в кожуре гороха (Weightman et al, 1995 Carbohydrate Polymers, 26, pp. 121–128; Renard et al, 1997 (см. ниже); Ralet et al, 1993 (см. ниже)). Уроновые кислоты преимущественно состоят из галактуроновой кислоты с соотношением галактуроновая кислота / глюкуроновая кислота 97 : 3 (Weightman et al, 1994 Carbohydrate Polymers, 24(2), pp. 139–148). Известно, что гомогалактуронановая фракция из кожуры гороха имеет относительно низкую степень метилирования (приблизительно 12–50) и сильно ацетилирована, отличаясь этим от высокометилированных пектинов, обычно встречающихся в первичных клеточных стенках фруктов (Weightman et al, 1995 Carbohydrate Polymers, 26, pp. 121–128; Le Goff et al, 2001 Carbohydrate Polymers, 45(4), pp. 325–334; Weightman et al, 1994 Carbohydrate Polymers, 24(2), pp. 139–148). В нескольких исследованиях также отмечено значительное количество ксилогалактуронана в кожуре гороха (18 мг/г), в котором ксилозиловые звенья присутствуют в виде отдельных звеньев или коротких боковых цепей на каркасе галактуроновой кислоты (Le Goff et al, 2001 Carbohydrate Polymers, 45(4), pp. 325–334; Weightman et al, 1995 Carbohydrate Polymers, 26, pp. 121–128; Ralet et al, 1993 Biochemical Engineering Journal, 16(2), pp. 191–201; Renard et al, 1997 International Journal of Biological Macromolecules, 21(1–2), pp. 155–162). Анализ метилирования выявил наличие (1,4)- и (1,3,4)-связанных остатков галактуроновой кислоты и терминальных остатков ксилозила, что указывает на замещение галактуронанового каркаса ксилозой на O-3. Кроме того, были выявлены некоторые олигомерные боковые цепи (1→2)-связанной ксилозы. Молярное отношение ксилозы к галактуроновой кислоте, согласно принятым данным, составляет 0,76 (Le Goff et al, 2001 Carbohydrate Polymers, 45(4), pp. 325–334). Ксилогалактуронаны можно рассматривать как подфракцию волосяных областей пектинов (Schols et al, 1995 Carbohydrate Research, 279, pp. 265–279).In addition to its high cellulose content, pea skins have a significant content of pectin and hemicellulose. Pectin fractions from pea peel contain both homogalacturonan and rhamnogalacturonan regions with very complex and diverse side chains, mainly consisting of arabinosyl, galactosyl and xylosyl residues. In pea skins, rhamnosyl residues were found in (1→2)-linked, (1→2,4)-linked, and terminal forms (Renard et al, 1997). It is known that rhamnogalacturonans with 1→5-linked arabinans associated with
Ксиланы представляют собой наиболее часто встречающуюся в кожуре гороха гемицеллюлозу (Weightman et al, 1994 Carbohydrate Polymers, 24(2), pp. 139–148; Tosh & Yada 2010 Food Research International, 43(2), pp. 450–460). Ксиланы, встречающиеся в кожуре гороха, представляют собой главным образом кислые ксиланы, имеющие (1→4)-β-D-ксилановый каркас с несколькими точками ветвления в O-2 и арабиноксиланах (Banerji & Rao 1963 Structural Studies On An Arabinoxylan From Pea Skin (Pisum Sativum): Part I. Methylation Studies. Canadian Journal of Chemistry, 41(11), pp. 2844–2848; Renard et al, 1997 International Journal of Biological Macromolecules, 21(1–2), pp. 155–162; Weightman et al, 1994 Carbohydrate Polymers, 24(2), pp. 139–148; Ralet et al, 1993 Biochemical Engineering Journal, 16(2), pp. 191–201). Отношение арабинозы к ксилозе в гемицеллюлозной фракции, экстрагированной из кожуры гороха, составляет 0,36 (Ralet et al, 1993, см. выше). Присутствие небольшого количества ксилоглюкана также показано Weightman et al, (1994 Carbohydrate Polymers, 24(2), pp. 139–148), но эти структуры чаще встречаются в семядоле гороха (Hayashi & MacLachlan 1984 Plant Physiology, 75(3), pp. 596–604).Xylans are the most abundant hemicellulose in pea skins (Weightman et al, 1994 Carbohydrate Polymers, 24(2), pp. 139–148; Tosh & Yada 2010 Food Research International, 43(2), pp. 450–460). The xylans found in pea skins are primarily acidic xylans having a (1→4)-β- D -xylan backbone with several branch points in O-2 and arabinoxylans (Banerji & Rao 1963 Structural Studies On An Arabinoxylan From Pea Skin (Pisum Sativum): Part I. Methylation Studies, Canadian Journal of Chemistry, 41(11), pp. 2844–2848 Renard et al, 1997 International Journal of Biological Macromolecules, 21(1–2), pp. 155–162 ; Weightman et al, 1994 Carbohydrate Polymers, 24(2), pp. 139-148; Ralet et al, 1993 Biochemical Engineering Journal, 16(2), pp. 191-201). The ratio of arabinose to xylose in the hemicellulose fraction extracted from pea skins is 0.36 (Ralet et al, 1993, supra). The presence of a small amount of xyloglucan has also been shown by Weightman et al, (1994 Carbohydrate Polymers, 24(2), pp. 139–148), but these structures are more common in pea cotyledon (Hayashi & MacLachlan 1984 Plant Physiology, 75(3), pp. 596-604).
Эмульсииemulsions
Эмульсии представляют собой смесь двух несмешивающихся текучих сред, в большинстве случаев воды (в) и масла (м), в которой масляная фаза диспергирована в водной фазе в виде капель масла (эмульсии м/в) или в которых капли воды диспергированы в масляной фазе (эмульсии в/м). Эмульсия представляет собой термодинамически нестабильную систему (Floury, Desrumaux and Lardières, 2000 Innovative Food Science & Emerging Technologies, 1(2), pp. 127–134). Амфифильные белки или низкомолекулярные эмульгаторы (LMWE), адсорбирующиеся на поверхности раздела м/в, чаще всего используют для замедления термодинамически управляемого разделения фаз эмульсии путем уменьшения поверхностного натяжения.Emulsions are a mixture of two immiscible fluids, in most cases water (w) and oil (l), in which the oil phase is dispersed in the water phase as oil droplets (o/w emulsions) or in which water droplets are dispersed in the oil phase ( emulsions w / m). The emulsion is a thermodynamically unstable system (Floury, Desrumaux and Lardières, 2000 Innovative Food Science & Emerging Technologies, 1(2), pp. 127–134). Amphiphilic proteins or low molecular weight emulsifiers (LMWE) adsorbed at the O/W interface are most often used to slow down the thermodynamically controlled phase separation of an emulsion by reducing surface tension.
Волоконные материалы природного происхождения, включая PHF, преимущественно гидрофильны, а значит, как правило, не адсорбируются на поверхности раздела масло-вода. При использовании в качестве гидроколлоидов волокна, как правило, добавляют к эмульсиям м/в высоких концентрациях, при которых они за счет способности к сгущению/превращению в гель вододисперсионной фазы физически захватывают капли масла, за счет чего замедляется отстаивание сливок и коалесценция капель масла.Fiber materials of natural origin, including PHF, are predominantly hydrophilic, and therefore, as a rule, do not adsorb at the oil-water interface. When used as hydrocolloids, fibers are usually added to emulsions w/w at high concentrations, at which they, due to the ability to thicken / gel the water-dispersed phase, physically capture oil droplets, thereby slowing down the settling of cream and coalescence of oil droplets.
Частицы Пикеринга должны иметь достаточный размер и смачиваемость в отношении обеих фаз для адсорбирования на поверхности раздела. Наиболее распространенной методикой определения смачиваемости материала является измерение угла смачивания, образуемого между поверхностью раздела жидкости и твердым веществом. Принцип этого измерения основан на уравнении Юнга , в котором и отражают натяжения на поверхности раздела жидкость — пар, твердое вещество — пар и твердое вещество — жидкость соответственно, а представляет собой угол смачивания (Bracco and Holst, 2013 Surface Science Techniques. 51st ed. Heidelberg: Springer). Размер частицы, и в частности ее угол смачивания, обозначают положение частицы на поверхности раздела, которое определяет энергию, необходимую для десорбции таких частиц из поверхности раздела. При правильном угле смачивания (30° << 150°) энергия десорбции может составлять несколько тысяч kTs для всех частиц больше 10 нм, следовательно, можно сказать, что частицы необратимо присоединены (Hunter et al, 2008 Advances in Colloid and Interface Science, 137(2), pp. 57–81), а значит, обеспечена долгосрочная устойчивость эмульсии.The Pickering particles must have sufficient size and wettability with respect to both phases to be adsorbed at the interface. The most common technique for determining the wettability of a material is to measure the contact angle formed between the liquid-solid interface. The principle of this measurement is based on the Young equation , wherein and reflect tensions at the liquid-vapor, solid-vapor, and solid-liquid interfaces, respectively, and is the contact angle (Bracco and Holst, 2013 Surface Science Techniques. 51st ed. Heidelberg: Springer). The size of a particle, and in particular its contact angle, denotes the position of the particle on the interface, which determines the energy required to desorb such particles from the interface. With the correct contact angle (30° < < 150°) the desorption energy can be several thousand kTs for all particles larger than 10 nm, hence the particles can be said to be irreversibly attached (Hunter et al, 2008 Advances in Colloid and Interface Science, 137(2), pp. 57–81 ), which means that the long-term stability of the emulsion is ensured.
Без ограничений, накладываемых какой-либо теорией, структурные компоненты пищевого волокна (волокно кожуры растения), такие как кристаллическая целлюлоза и гидрофобные метиловые, ацетиловые эфиры и эфиры феруловой кислоты на пектиновом каркасе, могут появляться на поверхности частицы после обработки ферментами в соответствии с настоящим изобретением и, следовательно, сообщать некоторую степень амфифильности очень гидрофильной в иных условиях поверхности.Without being limited by any theory, the structural components of dietary fiber (plant skin fiber), such as crystalline cellulose and hydrophobic methyl, acetyl and ferulic acid esters on a pectin backbone, can appear on the surface of the particle after treatment with enzymes in accordance with the present invention. and therefore impart some degree of amphiphilicity to an otherwise very hydrophilic surface.
Функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент в соответствии с настоящим изобретением или частица Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы для стабилизации и эмульсии. Эмульсия может представлять собой эмульсию типа «масло в воде» (м/в) или эмульсию типа «вода в масле» (в/м) или непрерывную масляную дисперсию или двойную эмульсию (например, в/м/в).A functionalized dietary fiber and a denatured enzyme according to the present invention or a Pickering particle according to the present invention can be used for stabilization and emulsion. The emulsion may be an oil-in-water (o/w) emulsion or a water-in-oil (w/o) emulsion or a continuous oil dispersion or a double emulsion (eg w/o/w).
В настоящем изобретении предложена эмульсия типа «масло в воде» или эмульсия типа «вода в масле», содержащая функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент в соответствии с настоящим изобретением или частицу Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением.The present invention provides an oil-in-water or water-in-oil emulsion containing a functionalized dietary fiber and a denatured enzyme according to the present invention or a Pickering particle according to the present invention.
В одном варианте осуществления функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент в соответствии с настоящим изобретением или частица Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы в комбинации с другим эмульгатором, например казеинатом натрия.In one embodiment, a functionalized dietary fiber and a denatured enzyme according to the present invention or a Pickering particle according to the present invention may be used in combination with another emulsifier such as sodium caseinate.
В одном варианте осуществления функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент в соответствии с настоящим изобретением или частица Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением содержат значительное количество белка, например более 0,5 мг на 1 г масла, например от 0,6 до 0,9 мг на 1 г масла.In one embodiment, the functionalized dietary fiber and denatured enzyme according to the present invention or the Pickering particle according to the present invention contain a significant amount of protein, such as more than 0.5 mg per gram of oil, such as 0.6 to 0.9 mg per 1 g oil.
ПрименениеApplication
Функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент настоящего изобретения или частица Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы для стабилизации эмульсии, например эмульсии типа «вода в масле» или эмульсии типа «масло в воде».The functionalized dietary fiber and the denatured enzyme of the present invention or the Pickering particle of the present invention can be used to stabilize an emulsion, such as a water-in-oil emulsion or an oil-in-water emulsion.
Эмульсия может представлять собой эмульсию, используемую в любом продукте, таком как пищевой продукт или косметический продукт или фармацевтический продукт.The emulsion may be an emulsion used in any product such as a food product or a cosmetic product or a pharmaceutical product.
В настоящем изобретении дополнительно предложен пищевой продукт, или косметический продукт, или продукт для ухода за кожей, или фармацевтический продукт, или продукт личной гигиены, или продукт для укладки волос, содержащий функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент в соответствии с настоящим изобретением или частицу Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением.The present invention further provides a food product, or a cosmetic product, or a skin care product, or a pharmaceutical product, or a personal care product, or a hair styling product, comprising a functionalized dietary fiber and a denatured enzyme according to the present invention, or a Pickering particle in in accordance with the present invention.
Функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент в соответствии с настоящим изобретением или частица Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением стабилизируют эмульсию.The functionalized dietary fiber and the denatured enzyme according to the present invention or the Pickering particle according to the present invention stabilize the emulsion.
Под «стабилизацией» в контексте настоящего документа подразумевается задержка разделения эмульсии на водную и масляную фазы, например путем коалесценции капель, благодаря функционализированному пищевому волокну и денатурированному ферменту в соответствии с настоящим изобретением или частица Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением. В одном варианте осуществления может учитываться устойчивость эмульсий к разрушению.By "stabilizing" in the context of this document is meant delaying the separation of the emulsion into an aqueous and oily phase, for example by droplet coalescence, due to a functionalized dietary fiber and a denatured enzyme in accordance with the present invention or a Pickering particle in accordance with the present invention. In one embodiment, the resistance to breakage of emulsions may be considered.
Пищевой продукт, или косметический продукт, или продукт для ухода за кожей, или фармацевтический продукт, или продукт личной гигиены, или продукт для укладки волос может содержать функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент в соответствии с настоящим изобретением или частицу Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением и быть стабилизированным ими.A food product or a cosmetic product or a skin care product or a pharmaceutical product or a personal care product or a hair styling product may contain a functionalized dietary fiber and a denatured enzyme in accordance with the present invention or a Pickering particle in accordance with the present invention and be stabilized by them.
Пищевые продуктыfood products
Частицы Пикеринга настоящего изобретения или функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы в пищевой эмульсии, например в смеси двух или более жидкостей, которые в обычных условиях не смешиваются.The Pickering particles of the present invention or the functionalized dietary fiber and denatured enzyme of the present invention can be used in a food emulsion, for example in a mixture of two or more liquids which are normally immiscible.
В настоящем документе термин «продукт» используется в широком смысле и охватывает пищу для людей, а также пищу для животных (т.е. корм). В предпочтительном аспекте продукт предназначен для потребления человеком.In this document, the term "product" is used in a broad sense and includes food for humans, as well as food for animals (ie food). In a preferred aspect, the product is for human consumption.
Эмульсия может представлять собой эмульсию типа «масло в воде» или эмульсию типа «вода в масле» или непрерывную масляную дисперсию или двойную эмульсию (например, в/м/в). Примеры пищевых эмульсий, в которых можно использовать настоящее изобретение, включают в себя уксусные заправки, гомогенизированное молоко, соусы, например майонез или голландский соус, супы, крема (пену) в эспрессо, молочные эмульсии и растительные эмульсии, такие как соевые напитки.The emulsion may be an oil-in-water emulsion or a water-in-oil emulsion or a continuous oil dispersion or a double emulsion (eg w/o/w). Examples of food emulsions in which the present invention can be used include vinegar dressings, homogenized milk, sauces such as mayonnaise or hollandaise sauce, soups, espresso cremes, milk emulsions, and vegetable emulsions such as soy drinks.
Продукты для ухода за кожейSkin care products
Частицы Пикеринга настоящего изобретения или функционализированное пищевое волокно и денатурированный фермент в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы в продуктах для ухода за кожей.The Pickering particles of the present invention or the functionalized dietary fiber and denatured enzyme of the present invention can be used in skin care products.
Продукт для ухода за кожей может представлять собой любой продукт, содержащий эмульсию.The skin care product may be any product containing an emulsion.
Продукт для ухода за кожей может представлять собой, например, очищающие, защитные, лечебные или гигиенические кремы; солнцезащитные кремы, защищающие от УФ-излучения; лосьоны для ухода за кожей, такие как очищающие или дезинфицирующие лосьоны; или увлажнители.The skin care product may be, for example, cleansing, protective, healing or hygiene creams; sunscreens that protect against UV radiation; skin care lotions such as cleansing or disinfecting lotions; or moisturizers.
Продукт для ухода за кожей настоящего изобретения может представлять собой композицию, содержащую другие ингредиенты, включая масло ши, масло какао, кокосовое масло, подсолнечное масло и масла из ядер орехов (такие как масло ядер абрикоса).The skin care product of the present invention may be a composition containing other ingredients including shea butter, cocoa butter, coconut oil, sunflower oil, and nut kernel oils (such as apricot kernel oil).
Если композиция изобретения представляет собой эмульсию, доля жировой фазы может находиться в диапазоне от 5 мас.% до 80 мас.% и предпочтительно от 10 мас.% до 50 мас.% относительно общей массы композиции.If the composition of the invention is an emulsion, the proportion of the fatty phase may be in the range from 5 wt.% to 80 wt.% and preferably from 10 wt.% to 50 wt.% relative to the total weight of the composition.
Фармацевтические продукты, продукты для укладки волос, продукты для личной гигиены и косметические продуктыPharmaceutical products, hair styling products, personal care products and beauty products
В фармацевтических препаратах, продуктах для укладки волос, для личной гигиены и косметических продуктах часто используют эмульсии. Эти эмульсии могут называться кремами, мазями, линиментами (бальзамами), пастами, пленками или жидкостями, главным образом в зависимости от соотношения в них масла и воды, наличия других добавок и предусмотренного способа введения.Emulsions are often used in pharmaceuticals, hair styling, personal care and cosmetic products. These emulsions may be called creams, ointments, liniments (balms), pastes, films or liquids, depending mainly on the ratio of oil and water in them, the presence of other additives and the method of administration envisaged.
Эмульсии могут представлять собой лекарственные формы для местного применения, и их можно применять на поверхности кожи, трансдермально, путем внутриглазной инъекции, ректально или вагинально.Emulsions can be topical dosage forms and can be applied to the skin surface, transdermally, by intraocular injection, rectally or vaginally.
Очень жидкую эмульсию также можно использовать перорально или в некоторых случаях ее можно вводить в виде инъекции.The very thin emulsion can also be taken orally, or in some cases it can be given as an injection.
К распространенным лекарственным препаратам, представленным в форме эмульсии, относятся, например, масло печени трески, полиспорин, кортизоловый крем или «Канестен».Common drugs presented in emulsion form include, for example, cod liver oil, polysporin, cortisol cream or Kanesten.
Нуклеотидная последовательностьNucleotide sequence
Термин «нуклеотидная последовательность» в настоящем документе означает олигонуклеотидную последовательность или полинуклеотидную последовательность и ее вариант, гомологи, фрагменты и производные (например, ее части). Нуклеотидная последовательность может иметь геномное, или синтетическое, или рекомбинантное происхождение, и может быть двухцепочечной или одноцепочечной, независимо от того, является ли она кодирующей или некодирующей цепью.The term "nucleotide sequence" as used herein means an oligonucleotide sequence or a polynucleotide sequence and its variant, homologues, fragments and derivatives (eg parts thereof). The nucleotide sequence may be of genomic or synthetic or recombinant origin, and may be double-stranded or single-stranded, whether it is a coding or non-coding strand.
Термин «нуклеотидная последовательность» в отношении настоящего изобретения включает геномную ДНК, кДНК, синтетическую ДНК и РНК. Это предпочтительно означает последовательность ДНК, более предпочтительно кДНК, кодирующую настоящее изобретение.The term "nucleotide sequence" in relation to the present invention includes genomic DNA, cDNA, synthetic DNA and RNA. This preferably means a DNA sequence, more preferably a cDNA encoding the present invention.
Получение нуклеотидной последовательностиObtaining a nucleotide sequence
Нуклеотидная последовательность, кодирующая фермент настоящего изобретения, может быть идентифицирована, и/или изолирована, и/или очищена от любой клетки или организма, продуцирующего указанный белок. В данной области хорошо известны различные способы идентификации, и/или выделения, и/или очистки нуклеотидных последовательностей. Например, методики амплификации ПЦР для получения большего количества последовательности могут быть использованы после идентификации, и/или выделения, и/или очистки подходящей последовательности.The nucleotide sequence encoding the enzyme of the present invention can be identified and/or isolated and/or purified from any cell or organism that produces said protein. Various methods for identifying and/or isolating and/or purifying nucleotide sequences are well known in the art. For example, PCR amplification techniques to obtain more sequence can be used after identification and/or isolation and/or purification of a suitable sequence.
В качестве дополнительного примера, библиотека геномной ДНК и/или кДНК может быть сконструирована с использованием хромосомной ДНК или матричной РНК, полученной из организма, вырабатывающего фермент. Если известна аминокислотная последовательность фермента, можно синтезировать меченые олигонуклеотидные зонды и применять их для идентификации кодирующих фермент клонов из геномной библиотеки, полученной из организма. В альтернативном варианте осуществления для идентификации кодирующих фермент клонов можно использовать меченый олигонуклеотидный зонд, содержащий последовательности, гомологичные другому известному гену фермента. В последнем случае используют условия гибридизации и промывки меньшей жесткости.As a further example, a genomic DNA and/or cDNA library can be constructed using chromosomal DNA or messenger RNA obtained from an enzyme-producing organism. If the amino acid sequence of the enzyme is known, labeled oligonucleotide probes can be synthesized and used to identify clones encoding the enzyme from a genomic library obtained from the organism. In an alternative embodiment, a labeled oligonucleotide probe containing sequences homologous to another known enzyme gene can be used to identify enzyme-encoding clones. In the latter case, hybridization and washing conditions of lower severity are used.
В альтернативном варианте осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая фермент, может быть получена синтетическим путем с помощью установленных стандартных способов, например с помощью амидофосфитного способа, описанного Beucage S.L. et al, (1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859–1869, или с помощью способа, описанного Matthes et al, (1984) EMBO J. 3, p 801–805. В амидофосфитном способе олигонуклеотиды синтезируют, например в автоматическом синтезаторе ДНК, очищают, отжигают, лигируют и клонируют в соответствующие векторы.In an alternative embodiment, the nucleotide sequence encoding the enzyme can be obtained synthetically using established standard methods, for example using the amidophosphite method described by Beucage S.L. et al, (1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869, or using the method described by Matthes et al, (1984) EMBO J. 3, p 801-805. In the amidophosphite method, oligonucleotides are synthesized, for example in an automated DNA synthesizer, purified, annealed, ligated and cloned into appropriate vectors.
Аминокислотные последовательностиAmino acid sequences
При использовании в настоящем документе термин «аминокислотная последовательность» является синонимом термина «полипептид» и/или термина «белок». В некоторых случаях термин «аминокислотная последовательность» является синонимом термина «пептид». В некоторых случаях термин «аминокислотная последовательность» является синонимом термина «фермент».As used herein, the term "amino acid sequence" is synonymous with the term "polypeptide" and/or the term "protein". In some cases, the term "amino acid sequence" is synonymous with the term "peptide". In some cases, the term "amino acid sequence" is synonymous with the term "enzyme".
Аминокислотная последовательность может быть получена/изолирована из подходящего источника, или она может быть получена синтетическим способом, или может быть получена с применением методик рекомбинантной ДНК.The amino acid sequence may be obtained/isolated from a suitable source, or it may be obtained synthetically, or may be obtained using recombinant DNA techniques.
Идентичность последовательности или гомология последовательностиSequence identity or sequence homology
Настоящее изобретение также включает применение последовательностей, имеющих определенную степень идентичности последовательности с аминокислотной(-ыми) последовательностью(-ями) полипептида, имеющего специфические свойства, определенные в настоящем документе, или любой нуклеотидной последовательности, кодирующей такой полипептид.The present invention also includes the use of sequences having a certain degree of sequence identity with the amino acid(s) sequence(s) of a polypeptide having the specific properties defined herein, or any nucleotide sequence encoding such a polypeptide.
Аминокислотная последовательность и/или нуклеотидная последовательность должны обеспечивать и/или кодировать полипептид, который сохраняет функциональную активность.The amino acid sequence and/or nucleotide sequence must provide and/or encode a polypeptide that retains functional activity.
В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность или нуклеотидная последовательность может быть по меньшей мере на 75, 85 или 90% идентичной, предпочтительно по меньшей мере на 95 или 98% идентичной последовательности субъекта. Как правило, последовательности с определенным процентом идентичности содержат, например, те же активные сайты и т.п., что и, например, аминокислотная последовательность субъекта.In some embodiments, the amino acid sequence or nucleotide sequence may be at least 75%, 85% or 90% identical, preferably at least 95% or 98% identical to the subject's sequence. Typically, sequences with a certain percentage of identity contain, for example, the same active sites and the like as, for example, the amino acid sequence of the subject.
В одном варианте осуществления последовательность, которая имеет определенный процент идентичности, может быть выбрана таким образом, чтобы включать в себя аминокислотную последовательность или нуклеотидную последовательность, которая имеет одно или несколько добавлений, делеций и/или замен по сравнению с последовательностью субъекта.In one embodiment, a sequence that has a certain percentage of identity may be chosen to include an amino acid sequence or a nucleotide sequence that has one or more additions, deletions, and/or substitutions compared to the subject's sequence.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к белку (или к нуклеотидной последовательности (или гену), чья аминокислотная последовательность кодирует белок), аминокислотная последовательность которого представлена в настоящем документе, или белку, полученному из этого (родительского) белка путем замены, делеции или добавления одной или более аминокислот, например 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 аминокислот, или более аминокислот, например 10 или более 10 аминокислот, в аминокислотную последовательность родительского белка, и имеющему активность родительского белка.In one embodiment, the present invention relates to a protein (or a nucleotide sequence (or gene) whose amino acid sequence encodes a protein), the amino acid sequence of which is provided herein, or a protein derived from this (parent) protein by substitution, deletion, or addition one or more amino acids, such as 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 amino acids, or more amino acids, such as 10 or more than 10 amino acids, in the amino acid sequence of the parent protein, and having the activity of the parent protein.
Степень идентичности в отношении аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности соответственно определяют на протяжении по меньшей мере 20 смежных аминокислот/нуклеотидов, соответственно на протяжении по меньшей мере 30 смежных аминокислот/нуклеотидов, соответственно на протяжении по меньшей мере 40 смежных аминокислот/нуклеотидов, соответственно на протяжении по меньшей мере 50 смежных аминокислот/нуклеотидов, соответственно на протяжении по меньшей мере 60 смежных аминокислот/нуклеотидов, соответственно на протяжении по меньшей мере 100 смежных аминокислот/нуклеотидов, соответственно на протяжении по меньшей мере 200 смежных аминокислот/нуклеотидов.The degree of identity with respect to an amino acid sequence or a nucleotide sequence, respectively, is determined over at least 20 contiguous amino acids/nucleotides, respectively over at least 30 contiguous amino acids/nucleotides, respectively over at least 40 contiguous amino acids/nucleotides, respectively over at least 50 contiguous amino acids/nucleotides, respectively, over at least 60 contiguous amino acids/nucleotides, respectively, over at least 100 contiguous amino acids/nucleotides, respectively, over at least 200 contiguous amino acids/nucleotides.
Степень идентичности в отношении аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности соответственно определяют на всей протяженности аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности.The degree of identity in relation to the amino acid sequence or nucleotide sequence, respectively, is determined over the entire length of the amino acid sequence or nucleotide sequence.
Сравнение идентичности можно проводить визуально или чаще всего с помощью легкодоступных программ сравнения последовательностей. Эти доступные на рынке компьютерные программы могут вычислять % гомологии между двумя или более последовательностями.Identity comparisons can be made visually or most commonly with readily available sequence comparison programs. These commercially available computer programs can calculate % homology between two or more sequences.
% идентичности может быть рассчитан по смежным последовательностям, т.е. одну последовательность совмещают с другой последовательностью, и каждую аминокислоту в одной последовательности напрямую сравнивают с соответствующей аминокислотой в другой последовательности, по одному остатку за раз. Это называется выравниванием «без гэпов». Как правило, такие выравнивания без гэпов выполняют только на относительно небольшом количестве остатков.% identity can be calculated over contiguous sequences, i.e. one sequence is combined with another sequence, and each amino acid in one sequence is directly compared to the corresponding amino acid in the other sequence, one residue at a time. This is called "gapless" alignment. Typically, such gapless alignments are performed on only a relatively small number of residues.
Хотя это очень простой и надежный способ, в нем не учитывается, например, что в идентичной во всем остальном паре последовательностей из-за одной вставки или делеции будет нарушено выравнивание следующих аминокислотных остатков, а значит, возможно значительное снижение % гомологии при выполнении общего выравнивания. Следовательно, большинство способов сравнения последовательностей разработаны с возможностью получения оптимальных выравниваний, в которых учитываются возможные вставки и делеции без необоснованного уменьшения общего показателя гомологии. Это возможно за счет вставки «гэпов» при выравнивании последовательности, чтобы попытаться максимально увеличить локальную гомологию.Although this is a very simple and reliable method, it does not take into account, for example, that in an otherwise identical pair of sequences, due to one insertion or deletion, the alignment of the following amino acid residues will be disrupted, which means that a significant decrease in % homology is possible when performing an overall alignment. Consequently, most sequence comparison methods are designed to produce optimal alignments that take into account possible insertions and deletions without unreasonably reducing the overall homology score. This is possible by inserting "gaps" into the sequence alignment to try to maximize local homology.
Однако в этих более сложных способах предусмотрены «штрафы за гэп» каждому гэпу, возникающему при выравнивании так, что при одинаковом числе идентичных аминокислот в случае выравнивания последовательности с как можно меньшим количеством гэпов, отражающего более высокую корреляцию между двумя сравниваемыми последовательностями, будет получен больший показатель, чем при наличии множества гэпов. Как правило, используют «аффинные штрафы за гэп», предусматривающие относительно высокий штраф за наличие гэпа и меньший штраф за каждый последующий остаток в гэпе. Это наиболее часто используемая система оценки гэпов. Высокие штрафы за гэп, естественно, обеспечивают оптимальные выравнивания с меньшим числом гэпов. С помощью большинства программ выравнивания можно изменять штрафы за гэп. Однако при использовании такого программного обеспечения для сравнения последовательностей рекомендуется использовать значения по умолчанию.However, in these more complex methods, "gap penalties" are provided for each gap that occurs in the alignment so that for the same number of identical amino acids, if a sequence is aligned with as few gaps as possible, reflecting a higher correlation between the two compared sequences, a larger score will be obtained. than in the presence of many gaps. As a rule, "affine gap penalties" are used, which provide for a relatively high gap penalty and a smaller penalty for each subsequent gap balance. This is the most commonly used gap scoring system. High gap penalties naturally provide optimal alignments with fewer gaps. With most alignment programs, gap penalties can be modified. However, when using such sequence comparison software, it is recommended that you use the default values.
Таким образом, для расчета максимального % идентичности в первую очередь требуется оптимальное выравнивание с учетом штрафов за гэп. Подходящей компьютерной программой для выполнения такого выравнивания является Vector NTI (Invitrogen Corp.). Примеры программного обеспечения, которое может выполнять сравнение последовательностей, включают в себя, без ограничений, например, пакет BLAST (см. Ausubel et al, 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed - Chapter 18), BLAST 2 (см. FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247–50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 и [email protected]), FASTA (Altschul et al, 1990 J. Mol. Biol. 403–410) и AlignX. По крайней мере BLAST, BLAST 2 и FASTA доступны для автономного и интерактивного поиска (см. Ausubel et al, 1999, стр. от 7-58 до 7-60), например в инструменте поиска GenomeQuest (www.genomequest.com).Thus, to calculate the maximum % identity, first of all, optimal alignment is required, taking into account gap penalties. A suitable computer program for performing such an alignment is Vector NTI (Invitrogen Corp.). Examples of software that can perform sequence comparisons include, but are not limited to, e.g. 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 and [email protected]), FASTA (Altschul et al, 1990 J. Mol. Biol. 403-410 ) and AlignX. At least BLAST,
Хотя конечный % идентичности может быть измерен с точки зрения идентичности, сам способ выравнивания, как правило, не основан на сравнении пар по принципу «все или ничего». Вместо этого, как правило, используют пересчитанную матрицу оценки сходства, в которой присваиваются показатели каждому попарному сравнению на основании химического сходства или эволюционного расстояния. Часто используемым примером такой матрицы является матрица BLOSUM62, представляющая собой используемую по умолчанию матрицу для программного пакета BLAST. В программах Vector NTI обычно используют либо общие значения по умолчанию, либо пользовательскую таблицу сравнения символов при наличии (дополнительные сведения приведены в руководстве пользователя). Для некоторых приложений рекомендуется использовать значения по умолчанию для пакета Vector NTI.Although the final % identity can be measured in terms of identity, the method of alignment itself is generally not based on an all-or-nothing comparison of pairs. Instead, a recalculated similarity score matrix is typically used, in which scores are assigned to each pairwise comparison based on chemical similarity or evolutionary distance. A commonly used example of such a matrix is the BLOSUM62 matrix, which is the default matrix for the BLAST software package. Vector NTI programs typically use either the generic defaults or a custom character comparison table if available (see the user manual for more information). For some applications, it is recommended to use the default values for the Vector NTI package.
В альтернативном варианте осуществления процентную гомологию можно рассчитывать с использованием функции множественного выравнивания в Vector NTI (Invitrogen Corp.) на основании алгоритма, аналогичного CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237–244).In an alternative embodiment, percent homology can be calculated using the multiple alignment function of Vector NTI (Invitrogen Corp.) based on an algorithm similar to CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244).
После обеспечения в ПО оптимального выравнивания можно рассчитывать % гомологии, предпочтительно % идентичности последовательности. ПО, как правило, делает это в рамках сравнения последовательностей и генерирует числовой результат.Once an optimal alignment has been achieved in the software, % homology, preferably % sequence identity, can be calculated. The software typically does this as part of a sequence comparison and generates a numerical result.
Если при определении идентичности последовательности необходимо использовать штрафы за гэп, для попарного выравнивания предпочтительно использовать следующие параметры.If gap penalties are to be used in determining sequence identity, the following parameters are preferred for pairwise alignment.
В одном варианте осуществления CLUSTAL можно использовать с указанными выше штрафом за гэп и штрафом за продление гэпа.In one embodiment, CLUSTAL may be used with the gap penalty and gap extension penalty described above.
В контексте настоящего документа термин «запрашиваемая последовательность» означает гомологичную последовательность или чужеродную последовательность, совмещаемую с последовательностью субъекта, чтобы определить, входит ли она в объем настоящего изобретения. Соответственно, такая запрашиваемая последовательность может представлять собой, например, последовательность предшествующего уровня техники или последовательность третьей стороны.In the context of this document, the term "requested sequence" means a homologous sequence or a foreign sequence that is compatible with the sequence of the subject to determine whether it is within the scope of the present invention. Accordingly, such a requested sequence may be, for example, a prior art sequence or a third party sequence.
В одном предпочтительном варианте осуществления последовательности выравнивают при помощи универсальной программы выравнивания, а идентичность последовательности рассчитывают путем определения числа точных совпадений, выявленных программой, и деления на длину последовательности субъекта.In one preferred embodiment, sequences are aligned using a universal alignment program and sequence identity is calculated by determining the number of exact matches found by the program and dividing by the length of the subject's sequence.
В одном варианте осуществления степень идентичности последовательности между запрашиваемой последовательностью и последовательностью субъекта определяют путем 1) выравнивания двух последовательностей с помощью любой подходящей программы выравнивания с использованием выбранных по умолчанию матрицы оценки и штрафа за гэп, 2) определения числа точных совпадений, причем точное совпадение представляет собой место, в котором программа выравнивания выявила идентичную аминокислоту или нуклеотид в двух выровненных последовательностях в данном положении в выравнивании, и 3) деления числа точных совпадений на длину последовательности субъекта.In one embodiment, the degree of sequence identity between a query sequence and a subject sequence is determined by 1) aligning the two sequences with any suitable alignment program using a default score and gap penalty matrix, 2) determining the number of exact matches, where an exact match is the location where the alignment program found an identical amino acid or nucleotide in the two aligned sequences at that position in the alignment, and 3) dividing the number of exact matches by the length of the subject's sequence.
В другом дополнительном предпочтительном варианте осуществления универсальная программа выравнивания выбрана из группы, состоящей из CLUSTAL и BLAST (предпочтительно BLAST), а идентичность последовательности рассчитывают путем определения числа точных совпадений, выявленных программой, и деления на длину последовательности субъекта.In another further preferred embodiment, the universal alignment program is selected from the group consisting of CLUSTAL and BLAST (preferably BLAST) and sequence identity is calculated by determining the number of exact matches found by the program and dividing by the length of the subject's sequence.
Последовательности могут также иметь делеции, вставки или замены аминокислотных остатков, из-за которых происходит неактивное изменение и образование функционально эквивалентного вещества. Преднамеренные аминокислотные замены могут быть выполнены на основе сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатков при условии сохранения вторичной связывающей активности вещества. Например, отрицательно заряженные аминокислоты включают в себя аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту; положительно заряженные аминокислоты включают в себя лизин и аргинин; и аминокислоты с незаряженными полярными головками, имеющими сходные значения гидрофильности, включают в себя лейцин, изолейцин, валин, глицин, аланин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, фенилаланин и тирозин.Sequences may also have deletions, insertions, or substitutions of amino acid residues that cause an inactive change to form a functionally equivalent substance. Intentional amino acid substitutions can be made based on similarity in polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, and/or the amphipathic nature of the residues, as long as the secondary binding activity of the substance is maintained. For example, negatively charged amino acids include aspartic acid and glutamic acid; positively charged amino acids include lysine and arginine; and amino acids with uncharged polar heads having similar hydrophilicity values include leucine, isoleucine, valine, glycine, alanine, asparagine, glutamine, serine, threonine, phenylalanine, and tyrosine.
Консервативные замены могут быть выполнены, например, в соответствии с таблицей ниже. Аминокислоты в одном блоке во втором столбце и предпочтительно в одной и той же строке в третьем столбце могут быть замещены друг другом.Conservative substitutions can be made, for example, in accordance with the table below. Amino acids in the same block in the second column, and preferably in the same row in the third column, may be substituted for each other.
Настоящее изобретение также включает в себя гомологичную замену (термины «замещение» и «замена» в настоящем документе используются для обозначения замены существующего аминокислотного остатка с альтернативным остатком), которая может происходить, т.е. сопоставимую замену, например щелочного на щелочной, кислого на кислый, полярного на полярный и т.п. Негомологичная замена также может происходить, т.е. из одного класса остатка на другой или в альтернативном варианте осуществления включающая вставку неприродных аминокислот, таких как орнитин (далее обозначаемый как Z), орнитин диаминобутировой кислоты (далее обозначаемый как B), орнитин норлейцина (далее обозначаемый как O), пирилаланин, тиенилаланин, нафтилаланин и фенилглицин.The present invention also includes a homologous substitution (the terms "substitution" and "substitution" in this document are used to mean the replacement of an existing amino acid residue with an alternative residue), which can occur, i. a comparable substitution, for example, alkaline to alkaline, acidic to acidic, polar to polar, and the like. Non-homologous substitution can also occur, i.e. from one class of residue to another, or alternatively comprising the insertion of unnatural amino acids such as ornithine (hereinafter referred to as Z), diaminobutyric acid ornithine (hereinafter referred to as B), norleucine ornithine (hereinafter referred to as O), pyrylalanine, thienylalanine, naphthylalanine and phenylglycine.
Замены также могут быть выполнены с помощью синтетических аминокислот (например, неприродных аминокислот), включая альфа-* и альфа-двузамещенные* аминокислоты, N-алкиламинокислоты*, молочную кислоту*, галидные производные природных аминокислот, такие как трифтортирозин*, p-Cl-фенилаланин*, p-Br-фенилаланин*, p-I-фенилаланин*, L-аллилглицин*, β-аланин*, L-α-аминобутировую кислоту*, L-γ-аминобутировую кислоту*, L-α-аминоизобутировую кислоту*, L-ε-аминокапроновую кислоту#, 7-аминогептаноевую кислоту*, L-метионинсульфон#*, L-норлейцин*, L-норвалин*, p-нитро-L-фенилаланин*, L-гидроксипролин#, L-тиопролин*, метиловые производные фенилаланина (Phe), такие как 4-метил-Phe*, пентаметил-Phe*, L-Phe (4-амино)#, L-Tyr (метил)*, L-Phe (4-изопропил)*, L-Tic (1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновая кислота)*, L-диаминопропионовая кислота# и L-Phe (4-бензил)*. Отметка * используется в приведенном выше обсуждении (в отношении гомологичной или негомологичной замены) для обозначения гидрофобного характера производного, в то время как # используется для обозначения гидрофильного характера производного, #* подразумевает амфипатические свойства.Substitutions can also be made with synthetic amino acids (e.g., non-natural amino acids), including alpha-* and alpha-disubstituted* amino acids, N-alkylamino acids*, lactic acid*, natural amino acid halide derivatives such as trifluorotyrosine*, p-Cl- phenylalanine*, p-Br-phenylalanine*, pI-phenylalanine*, L-allylglycine*, β-alanine*, L-α-aminobutyric acid*, L-γ-aminobutyric acid*, L-α-aminoisobutyric acid*, L -ε-aminocaproic acid # , 7-aminoheptanoic acid*, L-methionine sulfone #* , L-norleucine*, L-norvaline*, p-nitro-L-phenylalanine*, L-hydroxyproline # , L-thioproline*, methyl derivatives phenylalanine (Phe) such as 4-methyl-Phe*, pentamethyl-Phe*, L-Phe (4-amino) # , L-Tyr (methyl)*, L-Phe (4-isopropyl)*, L-Tic (1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acid)*, L-diaminopropionic acid # and L-Phe (4-benzyl)*. The mark * is used in the above discussion (in relation to homologous or non-homologous substitution) to indicate the hydrophobic nature of the derivative, while # is used to indicate the hydrophilic nature of the derivative, #* implies amphipathic properties.
Варианты аминокислотных последовательностей могут включать в себя подходящие спейсерные группы, которые могут быть вставлены между любыми двумя аминокислотными остатками последовательности, включая алкильные группы, такие как метильные, этильные или пропильные группы, в дополнение к аминокислотным спейсерам, таким как остатки глицина или β-аланина. Дополнительная форма вариации, включающая наличие одного или более аминокислотных остатков в форме пептоида, будет хорошо понятной специалистам в данной области. Во избежание сомнений, термин «форма пептоида» используется для обозначения вариантов аминокислотных остатков, в которых α-углеродная замещающая группа находится на атоме азота остатка, а не на α-углероде. Способы получения пептидов в форме пептоидов хорошо известны специалистам в данной области, например, см. Simon RJ et al, PNAS (1992) 89(20), 9367–9371 and Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132–134.Amino acid sequence variants may include suitable spacer groups that may be inserted between any two amino acid residues of the sequence, including alkyl groups such as methyl, ethyl or propyl groups, in addition to amino acid spacers such as glycine or β-alanine residues. An additional form of variation, including the presence of one or more amino acid residues in peptoid form, will be well understood by those skilled in the art. For the avoidance of doubt, the term "peptoid form" is used to denote variants of amino acid residues in which the α-carbon substituent group is on the nitrogen atom of the residue, and not on the α-carbon. Methods for preparing peptides in the form of peptoids are well known to those skilled in the art, for example see Simon RJ et al, PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 and Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132–134.
Нуклеотидные последовательности для применения в настоящем изобретении могут включать в себя синтетические или модифицированные нуклеотиды. В данной области известен ряд различных типов модификации олигонуклеотидов. К ним относятся метилфосфонатные и фосфортиоатные каркасы и/или добавление акридиновых или полилизиновых цепей на 3'- и/или 5'-концах молекулы. Для целей настоящего изобретения следует понимать, что нуклеотидные последовательности, описанные в настоящем документе, могут быть модифицированы любым способом, известным в данной области. Такие модификации могут быть выполнены для повышения активности in vivo или продолжительности жизни нуклеотидных последовательностей настоящего изобретения.Nucleotide sequences for use in the present invention may include synthetic or modified nucleotides. A number of different types of modification of oligonucleotides are known in the art. These include methylphosphonate and phosphorothioate backbones and/or the addition of acridine or polylysine chains at the 3' and/or 5' ends of the molecule. For the purposes of the present invention, it should be understood that the nucleotide sequences described herein may be modified in any manner known in the art. Such modifications may be made to increase the in vivo activity or lifespan of the nucleotide sequences of the present invention.
Экспрессия ферментовExpression of enzymes
Нуклеотидная последовательность для применения в настоящем изобретении может быть встроена в рекомбинантный реплицируемый вектор. Вектор может быть использован для репликации и экспрессии нуклеотидной последовательности в форме белка/фермента, в совместимой клетке-хозяине и/или из нее.The nucleotide sequence for use in the present invention may be inserted into a recombinant replicable vector. The vector can be used to replicate and express a nucleotide sequence in protein/enzyme form, in and/or from a compatible host cell.
Экспрессией можно управлять с помощью управляющих последовательностей, например регуляторных последовательностей.Expression can be controlled by escape sequences, such as regulatory sequences.
Белок, продуцируемый рекомбинантной клеткой-хозяином путем экспрессии нуклеотидной последовательности, может быть секретирован или может находиться внутри клетки в зависимости от последовательности и/или используемого вектора. Кодирующие последовательности могут быть сконструированы вместе с сигнальными последовательностями, которые управляют секрецией кодирующих вещество последовательностей с помощью конкретной прокариотической или эукариотической клеточной мембраны.The protein produced by the recombinant host cell by expression of the nucleotide sequence may be secreted or may be present within the cell, depending on the sequence and/or the vector used. Coding sequences can be designed along with signal sequences that direct the secretion of substance-coding sequences by a particular prokaryotic or eukaryotic cell membrane.
Экспрессионный векторExpression vector
Термин «экспрессионный вектор» означает конструкт, способный к экспрессии in vivo или in vitro.The term "expression vector" means a construct capable of in vivo or in vitro expression.
Экспрессионный вектор предпочтительно встроен в геном подходящего организма-хозяина. Термин «встроен» предпочтительно относится к устойчивому встраиванию в геном.The expression vector is preferably inserted into the genome of a suitable host organism. The term "built in" preferably refers to stable integration into the genome.
Нуклеотидная последовательность настоящего изобретения может присутствовать в векторе, в котором нуклеотидная последовательность функционально связана с регуляторными последовательностями, способными обеспечивать экспрессию нуклеотидной последовательности подходящим организмом-хозяином.The nucleotide sequence of the present invention may be present in a vector in which the nucleotide sequence is operably linked to regulatory sequences capable of allowing expression of the nucleotide sequence by a suitable host organism.
Векторы для применения в настоящем изобретении могут быть трансформированы в подходящую клетку-хозяина, как описано ниже, для обеспечения экспрессии полипептида настоящего изобретения.Vectors for use in the present invention may be transformed into a suitable host cell, as described below, to allow expression of the polypeptide of the present invention.
Выбор вектора, например плазмидного, космидного или фагового вектора, часто будет зависеть от клетки-хозяина, в которую его вводят.The choice of vector, for example a plasmid, cosmid or phage vector, will often depend on the host cell into which it is to be introduced.
Векторы для применения в настоящем изобретении могут содержать один или более селектируемых маркерных генов, таких как ген, который сообщает устойчивость к антибиотикам, например устойчивость к ампициллину, канамицину, хлорамфениколу или тетрациклину. В альтернативном варианте осуществления селекция может быть осуществлена путем котрансформации (как описано в WO91/17243).Vectors for use in the present invention may contain one or more selectable marker genes, such as a gene that confers antibiotic resistance, such as resistance to ampicillin, kanamycin, chloramphenicol, or tetracycline. In an alternative embodiment, the selection may be by co-transformation (as described in WO91/17243).
Векторы можно использовать in vitro, например для производства РНК, или использовать для трансфекции, трансформации, трансдукции или инфицирования клетки-хозяина.Vectors can be used in vitro, for example to produce RNA, or used to transfect, transform, transduce, or infect a host cell.
Таким образом, в дополнительном варианте осуществления в изобретении предложен способ получения нуклеотидных последовательностей настоящего изобретения посредством введения нуклеотидной последовательности настоящего изобретения в реплицируемый вектор, введения вектора в совместимую клетку-хозяина и выращивания клетки-хозяина в условиях, в которых возможна репликация вектора.Thus, in a further embodiment, the invention provides a method for obtaining the nucleotide sequences of the present invention by introducing the nucleotide sequence of the present invention into a replicable vector, introducing the vector into a compatible host cell, and growing the host cell under conditions that allow the vector to replicate.
Вектор может дополнительно содержать нуклеотидную последовательность, благодаря которой возможна репликация вектора в рассматриваемой клетке-хозяине. Примерами таких последовательностей являются точки начала репликации плазмид pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 и pIJ702.The vector may further comprise a nucleotide sequence that allows the vector to replicate in the host cell in question. Examples of such sequences are the origins of replication of plasmids pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 and pIJ702.
Регуляторные последовательностиRegulatory sequences
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность для применения в настоящем изобретении функционально связана с регуляторной последовательностью, которая способна обеспечивать экспрессию нуклеотидной последовательности, такой как выбранная клетка-хозяин. В качестве примера, настоящее изобретение включает в себя вектор, содержащий нуклеотидную последовательность настоящего изобретения, функционально связанную с такой регуляторной последовательностью, т.е. вектор представляет собой экспрессионный вектор.In some embodiments, a nucleotide sequence for use in the present invention is operably linked to a regulatory sequence that is capable of conferring expression of the nucleotide sequence, such as a selected host cell. By way of example, the present invention includes a vector containing the nucleotide sequence of the present invention operably linked to such a regulatory sequence, i. the vector is an expression vector.
Термин «функционально связанный» относится к смежному положению, в котором описанные компоненты находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать надлежащим образом. Регуляторная последовательность, «функционально связанная» с кодирующей последовательностью, лигирована с возможностью осуществления экспрессии кодирующей последовательности в условии, которое подходит для управляющих последовательностей.The term "operably linked" refers to a contiguous position in which the described components are in a relationship that allows them to function properly. A regulatory sequence "operably linked" to a coding sequence is ligated to allow expression of the coding sequence in a condition that is appropriate for the control sequences.
Термин «регуляторные последовательности» включает промоторы и энхансеры, а также другие сигналы регуляции экспрессии.The term "regulatory sequences" includes promoters and enhancers, as well as other expression regulation signals.
Термин «промотор» используется в обычном понимании в данной области, например промотором является область связывания РНК-полимеразы.The term "promoter" is used in the usual sense in this area, for example, the promoter is the binding region of RNA polymerase.
Усиленная экспрессия нуклеотидной последовательности, кодирующей фермент настоящего изобретения, также может быть достигнута путем выбора гетерологичных регуляторных областей, например промоторных, секреторных лидерных и терминаторных областей.Enhanced expression of the nucleotide sequence encoding the enzyme of the present invention can also be achieved by selecting heterologous regulatory regions, such as promoter, secretory leader and terminator regions.
Нуклеотидная последовательность для применения в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно функционально связана с по меньшей мере промотором.The nucleotide sequence for use in accordance with the present invention is preferably operably linked to at least a promoter.
Для управления экспрессией полипептида настоящего изобретения можно использовать и другие промоторы.Other promoters may be used to direct expression of the polypeptide of the present invention.
Примеры подходящих промоторов для управления транскрипцией нуклеотидной последовательности в бактериальном, грибковом или дрожжевом хозяине хорошо известны в данной области.Examples of suitable promoters for directing the transcription of a nucleotide sequence in a bacterial, fungal or yeast host are well known in the art.
Промотор может дополнительно включать в себя элементы для обеспечения или повышения экспрессии в подходящем хозяине. Например, элементы могут представлять собой консервативные области, такие как бокс Прибнова или ТАТА-бокс.The promoter may further include elements for providing or enhancing expression in a suitable host. For example, the elements may be conservative regions such as a Pribnow box or a TATA box.
КонструкцииConstructions
Термин «конструкт», который является синонимом таких терминов, как «конъюгат», «кассета» и «гибрид», означает нуклеотидную последовательность для применения в соответствии с настоящим изобретением, непосредственно или опосредованно прикрепленную к промотору.The term "construct", which is synonymous with terms such as "conjugate", "cassette" and "hybrid", means a nucleotide sequence for use in accordance with the present invention, directly or indirectly attached to a promoter.
Конструкция может даже содержать или экспрессировать маркер, с помощью которого можно осуществлять селекцию генетического конструкта.The construct may even contain or express a marker by which the genetic construct can be selected.
В некоторых областях применения конструкция настоящего изобретения предпочтительно содержит по меньшей мере нуклеотидную последовательность для применения в настоящем изобретении, функционально связанную с промотором.In some applications, the construct of the present invention preferably contains at least a nucleotide sequence for use in the present invention, operably linked to a promoter.
Клетки-хозяеваHost cells
Термин «клетка-хозяин» в отношении настоящего изобретения включает любую клетку, которая содержит либо нуклеотидную последовательность, либо экспрессионный вектор, как описано выше, и которую используют при рекомбинантном производстве белка, имеющего специфические свойства, как определено в настоящем документе.The term "host cell" in relation to the present invention includes any cell that contains either a nucleotide sequence or an expression vector, as described above, and which is used in the recombinant production of a protein having specific properties, as defined herein.
Таким образом, в дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения предложены клетки-хозяева, трансформированные или трансфицированные нуклеотидной последовательностью, которая экспрессирует белок настоящего изобретения. Клетки будут выбраны с возможностью их совместимости с указанным вектором и могут, например, быть прокариотическими (например, бактериальными), грибковыми, дрожжевыми или растительными.Thus, in a further embodiment, the present invention provides host cells that have been transformed or transfected with a nucleotide sequence that expresses a protein of the present invention. Cells will be selected for their compatibility with said vector and may, for example, be prokaryotic (eg bacterial), fungal, yeast or plant.
Трансформация клеток-хозяев/организмаTransformation of host cells/organism
Как указано выше, организм-хозяин может представлять собой прокариотический или эукариотический организм. Примеры подходящих прокариотических хозяев включают в себя E. coli и Bacillus subtilis.As indicated above, the host organism may be a prokaryotic or eukaryotic organism. Examples of suitable prokaryotic hosts include E. coli and Bacillus subtilis.
Принципы трансформации прокариотических хозяев подробно описаны в данной области, например, в издании Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). При использовании прокариотического хозяина перед трансформацией может потребоваться соответствующая модификация нуклеотидной последовательности, например удаление интронов.The principles of transformation of prokaryotic hosts are described in detail in the art, for example, in Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). When using a prokaryotic host, appropriate modification of the nucleotide sequence, such as the removal of introns, may be required prior to transformation.
Мицелиальные грибковые клетки могут быть трансформированы с использованием различных способов, известных в данной области, таких как способ, включающий образование протопластов и трансформацию протопластов с последующей регенерацией клеточной стенки известным способом. Применение Aspergillus в качестве микроорганизма-хозяина описано в EP 0 238 023.Mycelial fungal cells can be transformed using various methods known in the art, such as a method involving protoplast formation and protoplast transformation followed by cell wall regeneration in a known manner. The use of Aspergillus as a host microorganism is described in
Другим организмом-хозяином может быть растение. Обзор общих методик, используемых для трансформации растений, можно найти в публикациях Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205–225) и Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17–27). Дополнительные принципы трансформации растений можно найти в EP-A-0449375.The other host organism may be a plant. An overview of the general techniques used for plant transformation can be found in Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205–225) and Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17–27) . Additional principles for plant transformation can be found in EP-A-0449375.
Культивирование и продуцированиеCultivation and production
Клетки-хозяева, трансформированные нуклеотидной последовательностью настоящего изобретения, могут быть культивированы в условиях, способствующих продуцированию кодируемого полипептида и облегчающих восстановление полипептида из клеток и/или культуральной среды.Host cells transformed with a nucleotide sequence of the present invention may be cultured under conditions that promote production of the encoded polypeptide and facilitate recovery of the polypeptide from the cells and/or culture medium.
Среда, используемая для культивирования клеток, может представлять собой любую стандартную среду, подходящую для выращивания интересующих клеток-хозяев и получения экспрессии полипептида.The medium used for culturing the cells can be any standard medium suitable for growing the host cells of interest and obtaining expression of the polypeptide.
Белок, продуцируемый рекомбинантной клеткой, может быть представлен на поверхности клетки.The protein produced by the recombinant cell may be present on the surface of the cell.
Белок может быть секретирован из клеток-хозяев и может быть легко извлечен из культуральной среды с помощью хорошо известных процедур.The protein can be secreted from the host cells and can be easily recovered from the culture medium using well known procedures.
СекрецияSecretion
Часто желательна секреция белка из экспрессионного организма-хозяина в культуральную среду, из которой белок можно легче извлекать. В соответствии с настоящим изобретением лидерную последовательность секреции можно выбирать на основании желаемого организма-хозяина экспрессии. В контексте настоящего изобретения также можно использовать гибридные сигнальные последовательности.It is often desirable to secrete the protein from the expression host organism into the culture medium from which the protein can be more easily recovered. In accordance with the present invention, the secretion leader sequence can be selected based on the desired expression host. Hybrid signal sequences can also be used in the context of the present invention.
К типичным примерам гетерологичных лидерных последовательностей секреции относятся последовательности, происходящие из гена амилоглюкозидазы (AG) грибов (glaA, как версия с 18 аминокислотами, так и с 24 аминокислотами, например из Aspergillus), гена А-фактора (дрожжи, например Saccharomyces, Kluyveromyces и Hansenula) или гена α-амилазы (Bacillus).Typical examples of heterologous secretion leader sequences include those derived from the fungal amyloglucosidase (AG) gene (glaA, both the 18 amino acid version and the 24 amino acid version, e.g. from Aspergillus), the A-factor gene (yeasts, e.g. Saccharomyces, Kluyveromyces and Hansenula) or the α-amylase gene (Bacillus).
В качестве примера секреция гетерологичных белков в E. coli рассматривается в Methods Enzymol (1990) 182:132–43.As an example, the secretion of heterologous proteins in E. coli is discussed in Methods Enzymol (1990) 182:132–43.
ПреимуществаAdvantages
Преимущества настоящего изобретения станут понятны из принципов, представленных в настоящем документе.The advantages of the present invention will become clear from the principles presented in this document.
Одним из преимуществ настоящего изобретения является получение функционализированного пищевого волокна и денатурированного фермента и их применение в качестве частиц Пикеринга, например, для стабилизации эмульсий и/или замены применения поверхностно-активных веществ в производстве эмульсии.One of the advantages of the present invention is the preparation of a functionalized dietary fiber and a denatured enzyme and their use as Pickering particles, for example, to stabilize emulsions and/or replace the use of surfactants in emulsion production.
Одно из преимуществ настоящего изобретения заключается в способности эмульсий, стабилизированных низкими количествами (0,4% масса/объем) функционализированного пищевого волокна и денатурированного фермента настоящего изобретения, эффективно защищать крупные отстоявшиеся капли масла от коалесценции в течение четырех недель или дольше.One advantage of the present invention is the ability of emulsions stabilized with low levels (0.4% w/v) of the functionalized dietary fiber and denatured enzyme of the present invention to effectively protect large settled oil droplets from coalescence for four weeks or longer.
Одно дополнительное преимущество настоящего изобретения заключается в способности эмульсий, стабилизированных низкими количествами (0,4% масса/объем) функционализированного пищевого волокна и денатурированного фермента настоящего изобретения, эффективно защищать крупные отстоявшиеся капли масла от коалесценции в широком диапазоне рН (например, рН 3,0–8,0).One additional advantage of the present invention is the ability of emulsions stabilized with low amounts (0.4% w/v) of the functionalized dietary fiber and denatured enzyme of the present invention to effectively protect large settled oil droplets from coalescence over a wide pH range (e.g., pH 3.0 –8.0).
Обнаружена большая устойчивость частиц Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением в эмульсии по сравнению только с белками или поверхностно-активными веществами.The Pickering particles of the present invention have been found to be more stable in emulsion than with proteins or surfactants alone.
Одно дополнительное преимущество настоящего изобретения состоит в способности функционализированного пищевого волокна и денатурированного фермента или частицы Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением заменять стандартные стабилизаторы эмульсии с получением, таким образом, чистого, безмолочного стабилизатора эмульсии на основе волокон.One additional advantage of the present invention is the ability of the functionalized dietary fiber and the denatured enzyme or Pickering particle of the present invention to replace standard emulsion stabilizers, thus providing a pure, dairy-free fiber-based emulsion stabilizer.
С помощью функционализированного пищевого волокна и денатурированного фермента или частицы Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением можно стабилизировать относительно большие капли, например до 500 мкм.Using a functionalized dietary fiber and a denatured enzyme or Pickering particle according to the present invention, relatively large droplets, for example up to 500 µm, can be stabilized.
За счет функционализированного пищевого волокна и денатурированного фермента или частицы Пикеринга в соответствии с настоящим изобретением можно улучшать характеристики текстуры, и/или вкуса, и/или цвета, и/или запаха по сравнению со стандартными стабилизаторами эмульсии.With the functionalized dietary fiber and the denatured enzyme or Pickering particle according to the present invention, texture and/or taste and/or color and/or odor characteristics can be improved over standard emulsion stabilizers.
Все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, если не дано иное их определение, имеют общепринятое значение, понятное любому специалисту в области, к которой принадлежит настоящее изобретение. В изданиях Singleton et al DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994) и Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) для специалистов приведен общий словарь многих терминов, используемых в настоящем описании.All technical and scientific terms used in this document, unless otherwise defined, have a generally accepted meaning, understandable to any person skilled in the field to which the present invention belongs. Singleton et al DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994) and Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) provide a general vocabulary for professionals many of the terms used in the present description.
Настоящее описание не ограничено примерами способов и материалов, описанных в настоящем документе, и любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем документе, могут быть использованы при практической реализации или тестировании вариантов осуществления настоящего описания. Числовые диапазоны включают числа, определяющие диапазон.The present disclosure is not limited to the examples of methods and materials described herein, and any methods and materials similar or equivalent to those described herein may be used in the practice or testing of embodiments of the present disclosure. Numeric ranges include numbers that define the range.
Заголовки, представленные в настоящем документе, не ограничивают различные аспекты или варианты осуществления этого описания, которые могут существовать в виде ссылок на описание в целом. Соответственно, термины, определения которых даны в настоящем документе, более полно определены путем ссылки на описание в целом.The headings provided in this document do not limit the various aspects or embodiments of this description, which may exist as references to the description as a whole. Accordingly, terms defined herein are more fully defined by reference to the description as a whole.
Используемый в настоящем документе термин «белок» включает белки, полипептиды и пептиды.As used herein, the term "protein" includes proteins, polypeptides, and peptides.
При использовании в настоящем документе термин «аминокислотная последовательность» является синонимом термина «полипептид» и/или термина «белок». В некоторых случаях термин «аминокислотная последовательность» является синонимом термина «пептид». В некоторых случаях термин «аминокислотная последовательность» является синонимом термина «фермент».As used herein, the term "amino acid sequence" is synonymous with the term "polypeptide" and/or the term "protein". In some cases, the term "amino acid sequence" is synonymous with the term "peptide". In some cases, the term "amino acid sequence" is synonymous with the term "enzyme".
Термины «белок» и «полипептид» в настоящем документе применяются взаимозаменяемо. В настоящем описании и пунктах формулы изобретения могут использоваться стандартные однобуквенные и трехбуквенные коды для обозначения аминокислотных остатков. 3-буквенный код для аминокислот, определенный в соответствии с Объединенной комиссией IUPACIUB по биохимической номенклатуре (JCBN). Кроме того, следует понимать, что полипептид может быть кодирован более чем одной нуклеотидной последовательностью из-за вырожденности генетического кода.The terms "protein" and "polypeptide" are used interchangeably herein. In the present description and claims, standard one-letter and three-letter codes can be used to designate amino acid residues. 3-letter code for amino acids, defined in accordance with the IUPACIUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN). In addition, it should be understood that the polypeptide can be encoded by more than one nucleotide sequence due to the degeneracy of the genetic code.
В настоящем описании могут встречаться другие определения терминов. Перед более подробным описанием примеров осуществления следует понять, что данное описание не ограничено конкретными описанными вариантами осуществления, так как они могут, конечно, изменяться. Кроме того, следует понимать, что терминология, используемая в настоящем документе, служит только для описания конкретных вариантов осуществления и не ограничивает объем настоящего описания, который может быть ограничен только прилагаемой формулой изобретения.In the present description, other definitions of terms may occur. Before describing the exemplary embodiments in more detail, it should be understood that this description is not limited to the specific embodiments described, as these may, of course, change. In addition, it should be understood that the terminology used herein is only to describe specific embodiments and does not limit the scope of the present description, which may be limited only by the appended claims.
Если приводится диапазон значений, следует понимать, что каждое промежуточное значение до десятой доли единицы нижнего предела (если в контексте явно не указано иное) между верхним и нижним пределами этого диапазона также включено в изобретение. Каждый меньший диапазон между любым указанным значением или промежуточным значением в указанном диапазоне и любым другим указанным или промежуточным значением в указанном диапазоне входит в объем этого описания. Верхнее и нижнее предельные значения этих меньших диапазонов могут быть независимо включены в диапазон или исключены из него, и каждый диапазон, в котором один из, ни один из или оба предельных значения включены в эти меньшие диапазоны, также входит в объем этого описания при условии соблюдения специально исключенного предельного значения в указанном диапазоне. Если указанный диапазон значений включает один или оба предела, диапазоны, из которых исключены любой из двух или оба таких предела сразу, также включены в это описание.If a range of values is given, it should be understood that every intermediate value up to a tenth of one of the lower limit (unless the context clearly indicates otherwise) between the upper and lower limits of this range is also included in the invention. Every smaller range between any specified value or intermediate value in the specified range and any other specified or intermediate value in the specified range is within the scope of this description. The upper and lower limits of these smaller ranges may be independently included in or excluded from the range, and each range in which either, neither, or both of the limits are included in these smaller ranges is also within the scope of this specification, provided that specially excluded limit value within the specified range. If the indicated range of values includes one or both of the limits, the ranges from which either or both of the two or both such limits are excluded are also included in this description.
Следует отметить, что в настоящем документе и в приложенной формуле изобретения формы единственного числа также включают объекты во множественном числе, если из контекста явно не следует иное. Так, например, слово «фермент» подразумевает множество таких потенциальных агентов и их эквивалентов, известных специалистам в данной области, и т.д. It should be noted that in this document and in the appended claims, singular forms also include plural entities, unless the context clearly dictates otherwise. Thus, for example, the word "enzyme" implies a variety of such potential agents and their equivalents known to those skilled in the art, and so on.
Обсуждаемые в настоящем документе публикации приведены исключительно для их описания до даты подачи настоящей заявки. Ничто в настоящем документе не должно толковаться как признание того, что такие публикации представляют собой предшествующий уровень техники в отношении формулы изобретения, прилагаемой к настоящему документу.The publications discussed herein are provided solely for their description prior to the filing date of this application. Nothing herein should be construed as an admission that such publications constitute prior art with respect to the claims appended hereto.
Далее изобретение будет описано только в качестве примера со ссылкой на следующие фигуры и примеры.Hereinafter, the invention will be described by way of example only with reference to the following figures and examples.
ПримерыExamples
Повышение уровня информированности потребителей о состоянии здоровья приводит к росту спроса на продукты, основанные на природных ингредиентах. В этом исследовании в качестве функциональных пищевых ингредиентов оценены фракции, богатые пищевыми волокнами (например, целлюлоза) из кожицы (или кожуры) растений, например гороха. Такое применение может быть перспективным способом оценки этого сырья и разработки более здоровых продуктов. Например, кожура гороха богата пищевым волокном (приблизительно 90 мас.% сухого вещества) и состоит главным образом из целлюлозы (69 мас.% сухого вещества), гемицеллюлозы (7,5 мас.% сухого вещества) и пектина (16,8 мас.% сухого вещества) (публикация Reichert, 1981 Cereal Chemistry 58(4) pp 266–270, включенная в настоящий документ путем ссылки). Согласно эпидемиологическим данным потребление волокна имеет важные последствия для здоровья (публикация Hu, 2003 American J. of Clinical Nutrition (78) pp 544–551, включенная в настоящий документ путем ссылки). Кроме того, волокна кожуры гороха (PHF), например, имеют нейтральный вкус, светлый цвет и, следовательно, могут быть включены в различные пищевые продукты в качестве «невидимого» источника волокна (публикация Guillon & Champ 2002 The British J. of Nutrition 88 Suppl.3, pp. S293–S306, включенная в настоящий документ путем ссылки). В настоящем документе описано влияние гидролиза пищевого волокна, например PHF, с выбранными ферментами на функциональные возможности и поиск новых областей применения для этих модифицированных волокон. Были изучены две системы, а именно масляные непрерывные дисперсии и эмульсии типа «масло в воде» (м/в).Increasing consumer health awareness is driving demand for products based on natural ingredients. In this study, fractions rich in dietary fiber (eg, cellulose) from the skin (or skin) of plants, such as peas, were evaluated as functional food ingredients. This application could be a promising way to evaluate these raw materials and develop healthier products. For example, pea skin is rich in dietary fiber (approximately 90 wt.% dry matter) and consists mainly of cellulose (69 wt.% dry matter), hemicellulose (7.5 wt.% dry matter) and pectin (16.8 wt.% dry matter). % dry matter) (Reichert, 1981 Cereal Chemistry 58(4) pp 266-270, incorporated herein by reference). According to epidemiological data, fiber intake has important health consequences (Hu, 2003 American J. of Clinical Nutrition (78) pp 544-551, incorporated herein by reference). In addition, pea skin fibers (PHF), for example, have a neutral flavor, light color, and therefore can be included in various foods as an "invisible" source of fiber (Guillon & Champ 2002 The British J. of Nutrition 88 Suppl .3, pp. S293-S306, incorporated herein by reference). This document describes the effect of hydrolysis of dietary fiber, such as PHF, with selected enzymes on functionality and the search for new applications for these modified fibers. Two systems were studied, namely continuous oil dispersions and oil-in-water (o/w) emulsions.
Пример 1Example 1
МетодикаMethodology
1.1. Материалы1.1. materials
Субстратsubstrate
В Cosucra (к. Пек, Бельгия) были закуплены порошковые PHF Exafine®. Материал один раз пропускали через струйную мельницу при постоянном давлении 10 бар и скорости подачи 0,5 кг/ч для уменьшения размера частиц и улучшения диспергируемости растворов. Приблизительный состав PHF показан в таблице 1.PHF Exafine® powders were purchased from Cosucra (Peck, Belgium). The material was passed through the jet mill once at a constant pressure of 10 bar and a feed rate of 0.5 kg/h to reduce the particle size and improve the dispersibility of the solutions. The approximate composition of PHF is shown in Table 1.
Таблица 1. Приблизительный состав PHF Exafine. Информация предоставлена компанией CosucraTable 1 Approximate composition of PHF Exafine. Information provided by Cosucra
(мас.%/мас.%)Percentage
(wt%/wt%)
ФерментыEnzymes
Целлюлолитические и пектинолитические ферменты (таблица 2 и таблица 3) отбирали для ферментативной обработки на основании наиболее часто встречающихся классов полимеров в кожуре растений, например кожуре гороха.Cellulolytic and pectinolytic enzymes (Table 2 and Table 3) were selected for enzymatic treatment based on the most commonly occurring classes of polymers in plant skins, such as pea skins.
Очищенные ферментыPurified Enzymes
Таблица 2. Описание очищенных ферментов, используемых в данном исследовании. Информация предоставлена компанией MegazymeTable 2. Description of the purified enzymes used in this study. Information provided by Megazyme
aCAZy = база данных активного фермента углеводов (www.CAZy.org) a CAZy = Carbohydrate Active Enzyme Database (www.CAZy.org)
bКодирование для PHF, обработанных соответствующими ферментами. b Coding for PHF treated with appropriate enzymes.
Коммерческие ферментные смесиCommercial enzyme blends
Таблица 3. Описание коммерческих ферментных смесей, использованных в данном исследовании. Информация предоставлена компанией NovozymesTable 3. Description of commercial enzyme mixtures used in this study. Information provided by Novozymes
(Целлюлоза)Celluclast 1.5L
(Cellulose)
(Пектин)Pectinex Ultra SP-L
(Pectin)
aКодирование для PHF, обработанных соответствующими ферментами a Coding for PHF treated with appropriate enzymes
1.2. Ферментативная модификация волокон кожуры растений, например волокон кожуры гороха1.2. Enzymatic modification of plant skin fibers, e.g. pea skin fibers
1.2.1. Определение ферментативной активности1.2.1. Determination of enzymatic activity
Анализы активности ксиланазы, целлюлазы и пектиназыXylanase, cellulase and pectinase activity assays
Активности ксиланазы (эндо-β-1,4-ксиланазы), целлюлазы (эндо-β-1,4-глюканазы) и пектиназы (эндо-1,4-α-полигалактуронаназы) оценивали с использованием динитросалицилового (DNS) способа для уменьшения содержания сахаров. 1% (масса/объем) растворы субстрата пшеничного арабиноксилана (средняя вязкость, Megazyme, Ирландия), карбоксиметилцеллюлозы (CMC, Megazyme, Ирландия) или полигалактуроновой кислоты (Megazyme, Ирландия) готовили в 100 мМ цитрат-фосфатном буфере при рН 5,0. Добавляли 12,5 мкл фермента в разведении (1 : 10 – 1 : 10 000) к 112,5 мкл соответствующего раствора субстрата в пробирке Эппендорфа объемом 1,5 мл. Реакции выполняли при 50°C в течение 10 мин. Реакции останавливали на ледяной бане и добавляли 125 мкл реагента DNS. В контрольные образцы добавляли реагент DNS перед добавлением ферментов. Холостой образец включал в себя добавление воды вместо фермента. Строили соответствующие стандартные кривые ксилозы и глюкозы (стандарты от 0,1 до 2 мг/мл в воде). Абсорбцию определяли при 540 нм с помощью спектрометра Unicam видимого и УФ-диапазонов (Helios Gamma, г. Хелиос-Дельта, Великобритания).The activities of xylanase (endo-β-1,4-xylanase), cellulase (endo-β-1,4-glucanase), and pectinase (endo-1,4-α-polygalacturonanase) were evaluated using the dinitrosalicylic (DNS) method to reduce sugars. 1% (w/v) substrate solutions of wheat arabinoxylan (medium viscosity, Megazyme, Ireland), carboxymethylcellulose (CMC, Megazyme, Ireland) or polygalacturonic acid (Megazyme, Ireland) were prepared in 100 mM citrate-phosphate buffer at pH 5.0. 12.5 µl of the enzyme diluted (1:10–1:10,000) was added to 112.5 µl of the corresponding substrate solution in a 1.5 ml Eppendorf tube. Reactions were performed at 50°C for 10 min. Reactions were stopped in an ice bath and 125 μl of DNS reagent was added. DNS reagent was added to control samples before addition of enzymes. The blank sample included the addition of water instead of the enzyme. The corresponding xylose and glucose standard curves were built (standards from 0.1 to 2 mg/ml in water). Absorbance was determined at 540 nm using a Unicam visible and UV spectrometer (Helios Gamma, Helios Delta, UK).
В этом исследовании одна единица активности (1 Ед) определяется как масса (мг) или объем (мл) ферментного препарата, высвобождающего 1 мкмоль продукта (глюкоза, ксилоза) в минуту в определенных условиях. Все образцы готовили и анализировали в двух повторностях.In this study, one unit of activity (1 U) is defined as the mass (mg) or volume (ml) of an enzyme preparation that releases 1 µmol of product (glucose, xylose) per minute under certain conditions. All samples were prepared and analyzed in duplicate.
Анализ активности β-глюкозидазыAnalysis of β-glucosidase activity
Активность β-глюкозидазы определяли при pH 5,0 с помощью 1 мМ раствора p-нитрофенил-β-D-глюкопиранозида (pNP-β-D-glcP, Sigma, Швейцария), который готовили в 100 мМ цитрат-фосфатном буфере. 0,25 мл фермента в соответствующем разведении (1 : 10 – 1 : 10 000) добавляли к 1,25 мл pNP-b-D-glcP. Реакции (50°C, 10 мин) останавливали на ледяной бане путем добавления 0,25 мл Na2CO3 (2% масса/объем, Merck). Абсорбцию определяли при 410 нм с помощью спектрометра Unicam видимого и УФ-диапазонов (Helios Gamma, г. Хелиос-Дельта, Великобритания). В контрольные образцы добавляли Na2CO3 перед добавлением ферментативной активности. Холостой образец включал в себя добавление воды вместо фермента. Строили стандартную кривую p-нитрофенола (от 0,05 мМ до 0,3 мМ). В данном исследовании одну единицу β-глюкозидазы определяли как количество фермента, которое высвобождало 1 мкмоль p-нитрофенола в минуту в условиях анализа.β-glucosidase activity was determined at pH 5.0 with a 1 mM solution of p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (pNP-β- D -glcP, Sigma, Switzerland) prepared in 100 mM citrate-phosphate buffer. 0.25 ml of the enzyme at the appropriate dilution (1:10–1:10,000) was added to 1.25 ml of pNP-bD-glcP. Reactions (50°C, 10 min) were stopped in an ice bath by adding 0.25 ml Na 2 CO 3 (2% w/v, Merck). Absorbance was determined at 410 nm using a Unicam visible and UV spectrometer (Helios Gamma, Helios Delta, UK). Na 2 CO 3 was added to control samples prior to addition of enzymatic activity. The blank sample included the addition of water instead of the enzyme. Built a standard curve of p-nitrophenol (from 0.05 mm to 0.3 mm). In this study, one unit of β-glucosidase was defined as the amount of enzyme that released 1 μmol p-nitrophenol per minute under assay conditions.
Анализ активности протеазыProtease activity assay
Активность протеазы в коммерческих ферментных составах и волокне кожуры растения, например PHF, измеряли с помощью набора эндопротеазы Megazyme, используя таблетки протазима AK. Таблетку протазима AK добавляли к 5 мл 100 мМ ацетатного буфера при pH 5 мл в стеклянной пробирке объемом 20 мл и оставляли таблетку для гидратации в течение 1 часа при температуре 50°C. Фермент и PHF разводили в ацетатном буфере (1 : 1 – 1 : 10 000) и перемешивали в течение 15 минут при комнатной температуре. В пробирку с перемешанным раствором добавляли 1 мл суспензии ферментов, и реакция продолжалась в течение 10 минут и 1, 8, 24 часов. Реакцию прекращали путем добавления 10 мл 2% (масса/объем) тринатрий-фосфатного буфера (pH 12) с энергичным перемешиванием на вихревом смесителе. Пробирки оставляли на 5 минут при комнатной температуре. При образовании осадка надосадочную жидкость центрифугировали при 1000 g в течение 10 минут. Абсорбцию фильтрата измеряли при 590 нм относительно холостого образца. Положительный контроль содержал алкалазу (разведенную в 20 000 раз). Одну протеазную единицу определяли как количество фермента/PHF, которое в определенных заданных условиях продуцирует эквивалент одного микромоля тирозина в минуту из растворимого казеина. Стандартная кривая была предоставлена компанией Megazyme (мЕд / анализ (т.е. 1 мл)) = 2029 x Abs590 - 4,5; R2 = 0,99).Protease activity in commercial enzyme formulations and plant peel fiber, eg PHF, was measured with the Megazyme endoprotease kit using protazime AK tablets. A protazime AK tablet was added to 5 ml of 100 mM acetate buffer at
1.2.2. Ферментативная обработка волокон кожуры растений, например волокон кожуры гороха, очищенными ферментами и коммерческими ферментными смесями1.2.2. Enzymatic treatment of plant skin fibers, e.g. pea skin fibers, with purified enzymes and commercial enzyme blends
ИнкубацияIncubation
Готовили дисперсию PHF с общим содержанием твердых веществ (TS) 10% в 100 мМ цитратном/фосфатном буфере с pH 5,0, которую перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре для достижения полной гидратации. Буфер содержал 0,04% (масса/объем) NaN3 (Sigma Aldrich, Швейцария) в качестве антимикробного агента. Ферментативные реакции проводили в течение ночи (16 часов) с непрерывным перемешиванием при 430 об./мин и 50°C. Использованные дозы ферментов указаны в таблице 6 в разделе результатов. Образцы кипятили в течение 10 минут для завершения ферментативной реакции. Для стандартного контроля PHF подвергали одной и той же обработке без добавления фермента. Другие контроли содержали инактивированные ферменты или бычий сывороточный альбумин (BSA) вместо активного фермента при эквивалентных концентрациях белка, как с PHF, так и без него. Корректировку pH дисперсий BSA выполняли с помощью 1 M HCl и 1 M NaOH. Дисперсии PHF, полученные после ферментативной обработки, либо непосредственно использовали для дополнительных анализов, либо сублимировали перед дальнейшим использованием.A 10% total solids (TS) PHF dispersion was prepared in 100 mM citrate/phosphate buffer pH 5.0, which was stirred for 1 hour at room temperature to achieve complete hydration. The buffer contained 0.04% (w/v) NaN 3 (Sigma Aldrich, Switzerland) as an antimicrobial agent. Enzymatic reactions were carried out overnight (16 hours) with continuous stirring at 430 rpm and 50°C. The doses of enzymes used are shown in Table 6 in the results section. The samples were boiled for 10 minutes to complete the enzymatic reaction. For a standard control, PHF was subjected to the same treatment without enzyme addition. Other controls contained inactivated enzymes or bovine serum albumin (BSA) instead of active enzyme at equivalent protein concentrations, both with and without PHF. The pH adjustment of the BSA dispersions was performed with 1 M HCl and 1 M NaOH. The PHF dispersions obtained after the enzymatic treatment were either used directly for further assays or sublimated prior to further use.
Сублимационная сушка и размалываниеFreeze drying and grinding
Для экспериментов, в которых требуется обработанный PHF в сухом состоянии, дисперсии PHF были подвергнуты сублимационной сушке. Дисперсию, полученную после обработки, центрифугировали в угловом роторе Sorvall SLA-3000 (Thermofisher Scientific, Швейцария) при 10 000 g в течение 10 минут при 20°C. Полученный осадок собирали и сублимировали (-40°C, 10-1 мбар в течение 72 ч). После сублимационной сушки сухую массу переносили в мельницу с порционной загрузкой IKA M20 (Milian, Швейцария) и размалывали при постоянной скорости 2000 g в течение 10 секунд.For experiments requiring dry processed PHF, PHF dispersions were freeze-dried. The dispersion obtained after treatment was centrifuged in a Sorvall SLA-3000 angle rotor (Thermofisher Scientific, Switzerland) at 10,000 g for 10 minutes at 20°C. The resulting precipitate was collected and sublimated (-40°C, 10 -1 mbar for 72 h). After freeze drying, the dry mass was transferred to an IKA M20 batch mill (Milian, Switzerland) and ground at a constant speed of 2000 g for 10 seconds.
1.3. Физико-химические свойства волокон кожуры гороха1.3. Physical and chemical properties of pea peel fibers
1.3.1. Влагосодержание1.3.1. Moisture content
Содержание влаги в подвергнутых сублимационной сушке PHF и контрольных образцах измеряли с помощью анализатора влажности Mettler Toledo METLAB (Mettler-Toledo, Швейцария). Выбирали способ Puree en flocon с нагреванием 1,7–2,5 г PHF до 115°C.The moisture content of freeze-dried PHF and control samples was measured using a Mettler Toledo METLAB moisture analyzer (Mettler-Toledo, Switzerland). We chose the Puree en flocon method with heating 1.7–2.5 g of PHF to 115°C.
1.3.2. Плотность1.3.2. Density
Плотность подвергнутых сублимационной сушке PHF и контролей измеряли с помощью газовой пикнометрии с помощью пикнометра AccuPyc 1330 (Instrumat AG, Швейцария). Известное количество газа (при известных давлении и температуре) пропускали через калиброванный эталонный объем в калиброванную кювету, содержащую приблизительно 2 г образца. Плотность определяли путем измерения изменения давления гелия в калиброванном объеме (10 см3) на основании уравнения состояния идеального газа.The density of freeze-dried PHF and controls was measured by gas pycnometry using an AccuPyc 1330 pycnometer (Instrumat AG, Switzerland). A known amount of gas (at known pressure and temperature) was passed through a calibrated reference volume into a calibrated cuvette containing approximately 2 g of sample. The density was determined by measuring the pressure change of helium in a calibrated volume (10 cm 3 ) based on the ideal gas equation of state.
1.3.3. Распределение частиц по размерам1.3.3. Particle Size Distribution
Распределение по размерам частиц, подвергнутых сублимационной сушке PHF и контролей измеряли с помощью лазерной дифракции с использованием прибора Malvern Mastersizer 2000 (Malvern, Великобритания) с дисперсионным блоком небольшого объема, содержащим масло с триглицеридами средней цепи (MCT). Применяли способ MCT, в котором используется методика дифракции Фраунгофера для определения распределения частиц по размерам (публикация Lee Black, McQuay, and Bonin, 1996 Progress in Energy and Combustion Science, 22(3), pp. 267–306 включена в настоящий документ путем ссылки).The particle size distribution of freeze-dried PHF and controls was measured by laser diffraction using a Malvern Mastersizer 2000 (Malvern, UK) with a small volume dispersion unit containing medium chain triglyceride (MCT) oil. The MCT method, which uses the Fraunhofer diffraction technique to determine the particle size distribution, was used (Lee Black, McQuay, and Bonin, 1996 Progress in Energy and Combustion Science, 22(3), pp. 267-306 incorporated herein by reference ).
Распределение по размерам частиц обработанных дисперсий PHF и контролей измеряли с использованием того же прибора, но дисперсионного блока для влажного образца Hydro 2000 SM, содержащего воду.The particle size distribution of the treated PHF dispersions and controls was measured using the same instrument, but with a hydro 2000 SM wet sample dispersion unit containing water.
Используемые показатель преломления, коэффициент абсорбции и плотность составляли 1,544, 0,1 и 1,5 соответственно, что соответствует значениям чистой целлюлозы (данные предоставлены компанией Malvern). Анализ выполняли в трех повторениях с затуханием излучения лазера в диапазоне от 8 до 12%. Полученное распределение по размерам было представлено в виде объемного процентного содержания в зависимости от диаметра частиц. Средние размеры частиц выражали в виде средних диаметров частиц на основании площади поверхности (d3,2) и объема (d4,3).The refractive index, absorption coefficient and density used were 1.544, 0.1 and 1.5, respectively, corresponding to pure cellulose (data provided by Malvern). The analysis was performed in three repetitions with attenuation of laser radiation in the range from 8 to 12%. The resulting size distribution was presented as a volume percentage as a function of particle diameter. Average particle sizes were expressed as average particle diameters based on surface area (d 3 , 2 ) and volume (d 4.3 ).
1.3.4. Морфология1.3.4. Morphology
Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (КЛСМ)Confocal laser scanning microscopy (CLSM)
Изображения микроструктуры эмульсий 50% м/в, стабилизированных обработанными ферментами PHF и контролями, получали с помощью КЛСМ. Для этого анализа эмульсии получали с использованием воды milli-Q вместо цитратно-фосфатного буфера, поскольку флуоресцеин проявлял реакционную способность в отношении буфера. Водную фазу образцов окрашивали посредством 0,01 мас.% флуоресцеина натрия (Merck, Германия). Масляную фазу окрашивали разбавлением в 100 раз маточного раствора нила красного (Sigma, США) из 0,25 мг / 100 мл EtOH. Образцы помещали внутрь пластиковой камеры глубиной 1 мм, закрытой предметным стеклом для предотвращения дефектов, вызванных сжатием и высыханием. Визуализацию выполняли при комнатной температуре с помощью конфокального микроскопа LSM 710, модернизированного путем установки детектора Airyscan (Zeiss, Германия). Сбор данных и обработку изображений выполняли с использованием программного обеспечения Zen 2.1.Microstructure images of 50% w/w emulsions stabilized with treated PHF enzymes and controls were obtained using CLSM. For this assay, emulsions were prepared using milli-Q water instead of citrate-phosphate buffer because fluorescein was reactive with the buffer. The aqueous phase of the samples was stained with 0.01 wt.% sodium fluorescein (Merck, Germany). The oil phase was stained by a 100-fold dilution of a stock solution of Nile red (Sigma, USA) in 0.25 mg/100 ml EtOH. The samples were placed inside a 1 mm deep plastic chamber covered with a glass slide to prevent defects caused by compression and drying. Visualization was performed at room temperature using an LSM 710 confocal microscope upgraded with an Airyscan detector (Zeiss, Germany). Data collection and image processing was performed using Zen 2.1 software.
Параметры регистрации для флуоресцеина:Registration parameters for fluorescein:
Длина волны возбуждения: 488 нм. Эмиссия: BP = 420–480 нм и BP = 495–550 нм.Excitation wavelength: 488 nm. Emission: BP = 420–480 nm and BP = 495–550 nm.
Параметры регистрации для нила красного:Registration parameters for red nil:
Длина волны возбуждения: 561 нм. Эмиссия: BP = 570–620 нм и LP = 645 нм.Excitation wavelength: 561 nm. Emission: BP = 570–620 nm and LP = 645 nm.
Растровая электронная микроскопия (SEM)Scanning electron microscopy (SEM)
Обработанные PHF после сушки сублимацией и коммерческие эталонные волокна PHF анализировали с помощью SEM. Порошки приклеивали к металлической ножке для образцов, оснащенной двусторонней проводящей лентой. Ножку встряхивали для обеспечения хорошего распределения порошка. Образцы покрывали слоем золота толщиной 10 нм с использованием устройства для ионного напыления Leica SCD500, а затем визуализировали в режиме низкого вакуума при 6 кВ с использованием растрового электронного микроскопа Quanta F200 (FEI, Нидерланды).Freeze-dried PHF and commercial PHF reference fibers were analyzed by SEM. The powders were glued to a metal sample leg equipped with double-sided conductive tape. The leg was shaken to ensure good distribution of the powder. The samples were coated with a 10 nm thick layer of gold using a Leica SCD500 ion sputtering device and then visualized in low vacuum mode at 6 kV using a Quanta F200 scanning electron microscope (FEI, the Netherlands).
Влажные образцы устанавливали на металлическую ножку для образцов, оснащенную двусторонней проводящей лентой. Ножку помещали на столик Пельтье, температуру которого поддерживали на уровне 4°C. Изображения регистрировали с помощью газового вторичного электронного детектора в растровом электронном микроскопе Quanta F200, работающем при 10 кВ. Давление микроскопа устанавливали равным 4,60 торр, что соответствует относительной влажности 75%, для визуализации образца в гидратированном состоянии.Wet samples were mounted on a metal sample leg fitted with double-sided conductive tape. The leg was placed on a Peltier table, the temperature of which was maintained at 4°C. Images were recorded using a gas secondary electron detector in a Quanta F200 scanning electron microscope operating at 10 kV. The microscope pressure was set to 4.60 Torr, corresponding to a relative humidity of 75%, to visualize the sample in a hydrated state.
Световая микроскопияLight microscopy
Изображения микроструктур эмульсий 50% м/в и дисперсий PHF 10 мас.% и контролей получали с использованием световой микроскопии. Каплю образца помещали на стеклянную пластину и получали изображение с помощью светового микроскопа Olympus SZX16 (Olympus, Германия), оснащенного цифровой камерой и программным обеспечением для обработки изображений (cellSens) с использованием освещения темного поля и соответствующего увеличения.Microstructure images of 50% w/w emulsions and 10 wt% PHF dispersions and controls were obtained using light microscopy. A drop of sample was placed on a glass plate and imaged using an Olympus SZX16 light microscope (Olympus, Germany) equipped with a digital camera and image processing software (cellSens) using dark field illumination and appropriate magnification.
1.3.5. Поверхностный заряд1.3.5. Surface charge
Для определения электрофоретической подвижности обработанного ферментами PHF и контролей в воде (1% масса/объем) использовали прибор серии Zetasizer Nano (Malvern, Великобритания), который затем переводили в дзета-потенциал. Оптимальный диапазон размеров частиц в растворе для измерения дзета-потенциала составлял от 5 нм до 10 мкм, поэтому PHF (размер >10 мкм) не подходили для данного анализа, так как во время измерения они оседали в кювете. Возможно потенциальное улучшение данного способа путем фильтрации частиц до диапазонов размеров по меньшей мере 1–10 мкм.To determine the electrophoretic mobility of enzyme-treated PHF and controls in water (1% w/v), a Zetasizer Nano instrument (Malvern, UK) was used, which was then converted to zeta potential. The optimal particle size range in solution for zeta potential measurement was 5 nm to 10 µm, so PHF (>10 µm size) were not suitable for this analysis as they settled in the cuvette during the measurement. There is a potential improvement to this process by filtering particles down to size ranges of at least 1-10 µm.
1.3.6. Смачивающие способности1.3.6. Wetting ability
Для исследования смачиваемости сухих PHF применяли гониометр KSV CAM200 (Biolin Scientific, Финляндия). Каплю воды или масла (3–5 мкл) наносили на уплощенную поверхность волокна с помощью шприца, закрепленного на установке гониометра. Изменение угла смачивания с течением времени регистрировали при высокой контрастности и рассчитывали угол смачивания с помощью программы анализа изображений, которая выстраивает круг на основании формы капли и получает угол смачивания по наклону этой кривой в точке, в которой этот круг пересекает базовую линию (публикация Mitchell et al, 2017 Chemical Engineering Science, 167, pp. 29–41 включена в настоящий документ путем ссылки).To study the wettability of dry PHF, a KSV CAM200 goniometer (Biolin Scientific, Finland) was used. A drop of water or oil (3–5 μl) was applied to the flattened surface of the fiber using a syringe attached to the goniometer. The change in contact angle over time was recorded at high contrast and the contact angle was calculated using an image analysis program that builds a circle based on the shape of the drop and derives the contact angle from the slope of this curve at the point where the circle intersects the baseline (Mitchell et al. , 2017 Chemical Engineering Science, 167, pp. 29-41 incorporated herein by reference).
Для создания уплощенной поверхности волокон кожуры гороха использовали три различных методики.Three different techniques were used to create the flattened surface of the pea skin fibers.
Таблетирование. 2 г порошка прессовали между двумя штампами при давлении 20 т в форме для таблетирования, изготовленной из нержавеющей стали, с диаметром 24 мм.Tableting. 2 g of the powder was compressed between two dies at a pressure of 20 tons in a tablet mold made of stainless steel with a diameter of 24 mm.
Покрытие методом центрифугирования. Готовили раствор волокна с TS 10–20% и перемешивали его в течение одного часа. Небольшую каплю наносили на стеклянную пластину в центре центрифуги для нанесения покрытия и выполняли вращение с разными скоростями, создавая такую центробежную силу, с помощью которой можно получать тонкий слой.Spin coating. A fiber solution with a TS of 10–20% was prepared and stirred for one hour. A small drop was deposited on a glass plate in the center of the coating centrifuge, and rotation was performed at different speeds to generate a centrifugal force such that a thin layer could be obtained.
Фиксация порошкового волокна на ленте. 20 мг волокна распределяли с помощью шпателя по ленте, фиксируемой на предметном стекле.Fixation of the powder fiber on the tape. 20 mg of fiber was distributed with a spatula over a tape fixed on a glass slide.
1.4. Способность стабилизации эмульсии «масло в воде»1.4. Ability to stabilize an oil-in-water emulsion
1.4.1. Приготовление эмульсии1.4.1. Emulsion preparation
Если не указано иное, эмульсии 50 мас.% м/в готовили следующим образом. Первые 10 мл 100 мМ цитратно-фосфатного буфера с pH 5 (содержащего 0,04 мас.% NaN3 в качестве антимикробного агента) добавляли в пробирку Pyrex и смешивали с 1 мл обработанной или контрольной дисперсии. К водной фазе добавляли 10 мл подсолнечного масла с высоким содержанием олеиновой кислоты (Nestrade, Швейцария) и встряхивали эмульсию вручную в течение 10 секунд. Если не указано иное, образцы выдерживали при комнатной температуре в течение 4 недель.Unless otherwise indicated, 50% w/w emulsions were prepared as follows. The first 10 ml of 100 mM citrate-phosphate buffer pH 5 (containing 0.04 wt% NaN 3 as antimicrobial agent) was added to a Pyrex tube and mixed with 1 ml of the treated or control dispersion. 10 ml high oleic sunflower oil (Nestrade, Switzerland) was added to the aqueous phase and the emulsion was shaken by hand for 10 seconds. Unless otherwise noted, samples were kept at room temperature for 4 weeks.
Для оценки стабилизирующего эмульсию эффекта растворимой фазы 2 мл дисперсии PHF центрифугировали в кювете Эппендорфа объемом 2 мл при 16 000 g в течение десяти минут. В водную фазу эмульсий 50% м/в добавляли 1 мл надосадочной жидкости вместо дисперсии PHF. Для оценки стабилизирующего эмульсию эффекта нерастворимой фазы осадок, полученный после центрифугирования, 3 раза промывали цитратно-фосфатным буфером для удаления любых оставшихся растворимых компонентов, а затем дисперсию PHF восстанавливали промытым PHF до такой же концентрации путем повторного заполнения кюветы Eppendorf цитратно-фосфатным буфером до метки 2 мл, допуская, что количество PHF, потерянное в ходе промывки, ничтожно мало. 1 мл промытого осадка в цитратно-фосфатном буфере добавляли к водной фазе эмульсий 50% м/в, как описано выше.To evaluate the emulsion-stabilizing effect of the soluble phase, 2 ml of the PHF dispersion was centrifuged in a 2 ml Eppendorf cuvette at 16,000 g for ten minutes. 1 ml of supernatant was added to the aqueous phase of the 50% w/w emulsions in place of the PHF dispersion. To evaluate the emulsion-stabilizing effect of the insoluble phase, the pellet obtained after centrifugation was washed 3 times with citrate-phosphate buffer to remove any remaining soluble components, and then the PHF dispersion was restored with washed PHF to the same concentration by refilling the Eppendorf cuvette with citrate-phosphate buffer to the
1.4.2. Устойчивость эмульсий1.4.2. Emulsion stability
Устойчивость эмульсий к схлопыванию оценивали визуально в течение по меньшей мере 4 недель, если не указано иное. Для определения механизма стабилизации обработанного ферментами (функционализированного) PHF использовали различные методики микроскопии (1.3.4.).The stability of the emulsions to collapse was evaluated visually for at least 4 weeks, unless otherwise indicated. Various microscopy techniques (1.3.4.) were used to determine the stabilization mechanism of the enzyme-treated (functionalized) PHF.
1.4.3. Кухонные прототипы1.4.3. kitchen prototypes
Способность функционализированных (обработанных ферментами) PHF стабилизировать эмульсию оценивали в прототипах жидкого забеливателя. Готовили 250 мл дисперсии 10% (масса/объем) PHF в воде PANNA и перемешивали ее в течение 1 часа при комнатной температуре для обеспечения полной гидратации. В дисперсию добавляли 240 мкл целлюлозы на г PHF и 120 мкл пектина на г PHF. Дисперсию инкубировали в течение ночи (16 часов) при 50°C с непрерывным перемешиванием, не регулируя pH (значение pH, измеренное при 21°C перед реакцией: 5,98).The ability of functionalized (enzymatically treated) PHFs to stabilize an emulsion was evaluated in liquid creamer prototypes. A 250 ml dispersion of 10% (w/v) PHF in PANNA water was prepared and stirred for 1 hour at room temperature to ensure complete hydration. 240 μl of cellulose per g of PHF and 120 μl of pectin per g of PHF were added to the dispersion. The dispersion was incubated overnight (16 hours) at 50° C. with continuous stirring without adjusting the pH (pH value measured at 21° C. before reaction: 5.98).
Составы прототипов забеливателя и результаты представлены в примере 2.Creamer prototype formulations and results are shown in Example 2.
Сначала все водорастворимые ингредиенты растворяли в воде PANNA путем перемешивания смеси в пластиковом стакане объемом 200 мл, покрытом парафином, в течение двух часов при комнатной температуре. После этого в водную фазу добавляли в пластиковый стакан объемом 500 мл, содержащий предварительно взвешенное подсолнечное масло с высоким содержанием олеиновой кислоты. Смесь гомогенизировали с помощью прибора IKA Ultra-turax (IKA, Германия) при 16 000 1/мин в течение 2 минут.First, all water-soluble ingredients were dissolved in PANNA water by stirring the mixture in a 200 ml plastic beaker coated with paraffin for two hours at room temperature. Thereafter, the aqueous phase was added to a 500 ml plastic beaker containing pre-weighed high oleic sunflower oil. The mixture was homogenized using an IKA Ultra-turax device (IKA, Germany) at 16,000 1/min for 2 minutes.
Растворимый кофе (2,5 г кофе Nescafé Gold / 150 г воды) растворяли в воде PANNA при 80°C. 5 г жидкого забеливателя добавляли к 30 мл кофе и выдерживали в печи при 70°C до дегустации в течение максимум одного часа. Перед дегустацией образцы слегка перемешивали пластиковым шпателем и подавали под красным освещением для маскировки цвета. Контрольный образец (совпадающий со стандартным образцом) подавали для проверки воспроизводимости органолептической оценки.Instant coffee (2.5 g Nescafé Gold coffee / 150 g water) was dissolved in PANNA water at 80°C. 5 g of liquid creamer was added to 30 ml of coffee and kept in an oven at 70° C. until tasting for a maximum of one hour. Prior to tasting, the samples were lightly agitated with a plastic spatula and served under red lighting to mask the color. A control sample (matching the standard sample) was submitted to check the reproducibility of the organoleptic evaluation.
1.5. Аналитические способы1.5. Analytical methods
1.5.1. Определение содержания белков-ферментов1.5.1. Determination of the content of enzyme proteins
Содержание белка в очищенных ферментах и коммерческих ферментных смесях определяли с помощью анализа Брэдфорда и Лоури в соответствии с протоколом Sigma (Sigma Aldrich, Швейцария).The protein content of purified enzymes and commercial enzyme mixtures was determined using Bradford and Lowry analysis according to the Sigma protocol (Sigma Aldrich, Switzerland).
Метод БрэдфордаBradford method
100 мкл реагента Брэдфорда (Sigma Aldrich, Швейцария) добавляли к 100 мкл образцов в 96-луночном микропланшете Nunc MicroWell (Thermo Scientific, Швейцария). Соответствующие разведения образцов готовили в milli-Q для получения концентрации в пределах линейной части калибровочной кривой. Растворы оставляли для протекания реакции на 5 минут при комнатной температуре, после чего определяли абсорбцию стандартов и образцов при длине волны 595 нм с использованием Varioskan Flash (Thermo Scientific, Швейцария). Калибровочную кривую с бычьим сывороточным альбумином (BSA, Sigma, Швейцария) готовили с концентрациями в диапазоне от 0 до 25 мкг/мл.100 µl of Bradford's reagent (Sigma Aldrich, Switzerland) was added to 100 µl of samples in a 96-well Nunc MicroWell microplate (Thermo Scientific, Switzerland). Appropriate sample dilutions were prepared in milli-Q to obtain a concentration within the linear portion of the calibration curve. The solutions were left to react for 5 minutes at room temperature, after which the absorbance of standards and samples was determined at a wavelength of 595 nm using Varioskan Flash (Thermo Scientific, Switzerland). A calibration curve with bovine serum albumin (BSA, Sigma, Switzerland) was prepared with concentrations ranging from 0 to 25 µg/ml.
Метод ЛоуриLowry method
100 мкл раствора реагента Лоури добавляли к 100 мкл образцов в 96-луночном микропланшете Nunc MicroWell (Thermo Scientific, Швейцария). Растворы оставляли для протекания реакции на 20 минут при комнатной температуре, после чего в каждую лунку добавляли 50 мкл фенолового реагента Фолина — Чокальтеу и оставляли для проявления цвета на 30 минут при комнатной температуре. Абсорбцию образцов определяли при длине волны 600 нм с помощью прибора Thermo Scientific Varioskan Flash (Thermo Scientific, Швейцария). Калибровочную кривую с бычьим сывороточным альбумином (BSA) готовили с концентрациями в диапазоне от 0 до 400 мкг/мл.100 µl of Lowry's reagent solution was added to 100 µl of samples in a 96-well Nunc MicroWell microplate (Thermo Scientific, Switzerland). The solutions were left to react for 20 minutes at room temperature, after which 50 µl of Folin-Ciocalteu phenol reagent was added to each well and left to develop color for 30 minutes at room temperature. The absorbance of the samples was determined at a wavelength of 600 nm using a Thermo Scientific Varioskan Flash instrument (Thermo Scientific, Switzerland). A calibration curve with bovine serum albumin (BSA) was prepared with concentrations ranging from 0 to 400 μg/ml.
1.5.2. SDS-PAGE1.5.2. SDS-PAGE
Электрофорез белков в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) проводили на растворимой и нерастворимой фазе дисперсий PHF после инкубации. Образцы для анализа SDS готовили следующим образом. Дисперсии PHF центрифугировали в кювете Eppendorf объемом 2 мл при 16 000 g в течение 10 минут, после чего надосадочную жидкость отделяли от осадка (надосадочная жидкость 1). Осадок растворяли в буфере трис-SDS-мочевина с pH 8,5 в той же кювете Eppendorf в течение по меньшей мере 10 минут, после чего смесь центрифугировали, а надосадочную жидкость отделяли от гранулы (надосадочная жидкость 2). Надосадочную жидкость 1 и надосадочную жидкость 2 использовали для анализа белков, присутствующих в растворимой и нерастворимой фазах соответственно. Контрольные образцы готовили с применением дисперсий PHF, которые инкубировали с инактивированными ферментами и без ферментов.Protein electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS) was performed on the soluble and insoluble phase of PHF dispersions after incubation. Samples for SDS analysis were prepared as follows. The PHF dispersions were centrifuged in a 2 ml Eppendorf cuvette at 16,000 g for 10 minutes, after which the supernatant was separated from the pellet (supernatant 1). The pellet was dissolved in Tris-SDS-urea pH 8.5 buffer in the same Eppendorf cuvette for at least 10 minutes, after which the mixture was centrifuged and the supernatant was separated from the pellet (supernatant 2). Supernatant 1 and
25 мкл буфера для образцов NuPAGE LDS (Invitrogen, Швейцария) и 10 мкл восстанавливающего агента для образцов NuPAGE (Invitrogen, Швейцария) добавляли к 65 мкл образца, а затем нагревали при 70°C в течение 10 минут в приборе Thermomixer (Thermo Scientific, Швейцария, Швейцария).25 µl of NuPAGE LDS Sample Buffer (Invitrogen, Switzerland) and 10 µl of NuPAGE Sample Reducing Agent (Invitrogen, Switzerland) were added to 65 µl of sample and then heated at 70°C for 10 minutes in a Thermomixer (Thermo Scientific, Switzerland). , Switzerland).
Гели трижды промывали подвижным буфером NuPAGE MOPS SDS и помещали в миникювету X-CELL II Mini Cell (LifeTechnologies, Швейцария). Затем образцы помещали в лунки на NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel (Invitrogen, Швейцария), а маркер молекулярной массы (Sigma Aldrich, Швейцария) помещали в лунки 1 и 12. Буфер для образцов NuPAGE LDS помещали в пустые лунки. Обе камеры кюветы для электрофореза заполняли подвижным буфером NuPAGE MOPS SDS (Invitrogen, Швейцария), а к буферу в верхнюю камеру добавляли 500 мкл антиоксиданта NuPAGE (Invitrogen, Швейцария). Электрофорез проводили в миникювете X-CELL II Mini Cell при 200 В в течение 50 минут. Затем гель инкубировали в 100 мл фиксирующего раствора (50% метанол, 10% уксусная кислота и 40% вода milli-Q) в Q пластиковом контейнере в течение 10 минут при комнатной температуре при осторожном встряхивании. Через 10 минут контейнер опорожняли и заполняли окрашивающим раствором (55% мл воды milli-Q, 20 мл метанола, 20 мл красителя A из набора для окрашивания коллоидным синим (Invitrogen, Швейцария)). Гель инкубировали в течение еще 10 минут, после чего добавляли 5 мл красителя B из набора для окрашивания коллоидным синим (Invitrogen, Швейцария). Гели окрашивали в течение 3–4 часов. Окрашивающий раствор удаляли и добавляли 200 мл воды milli-Q и осторожно встряхивали в течение по меньшей мере 7 часов для обесцвечивания. Гели сканировали с помощью сканера Image Scanner III (GE Healthcare, Life Sciences, Швейцария) с использованием белой подложки.The gels were washed three times with NuPAGE MOPS SDS running buffer and placed in an X-CELL II Mini Cell (Life Technologies, Switzerland). Samples were then placed in wells on
1.5.3. Анализ восстанавливающего сахара1.5.3. Reducing Sugar Analysis
Восстанавливающие сахара в реакционных надосадочных жидкостях и контрольных образцах измеряли с помощью способа DNS.Reducing sugars in reaction supernatants and controls were measured using the DNS method.
Реагент DNS готовили путем смешивания 200 мл 8% (масса/объем) NaOH (Merck, Швейцария) с 500 мл воды milli-Q с последующим добавлением 10 г 3,5-динитросалициловой кислоты (DNS). 402,7 г C4H4KNaO6x4H2O медленно добавляли при непрерывном перемешивании.The DNS reagent was prepared by mixing 200 ml of 8% (w/v) NaOH (Merck, Switzerland) with 500 ml of milli-Q water followed by the addition of 10 g of 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS). 402.7 g of C 4 H 4 KNaO 6 x4H 2 O were added slowly with continuous stirring.
125 мкл раствора DNS добавляли к 125 мкл образца, а смесь кипятили в течение 5 минут. Добавляли 1 мл воды milli-Q и считывали абсорбцию при 540 нм с помощью спектрометра Unicam видимого и УФ диапазонов (Helios Gamma, г. Хелиос-Дельта, Великобритания). Стандартные кривые готовили с использованием глюкозы, ксилозы и D-галактуроновой кислоты в концентрациях, варьирующихся от 0 до 2 мг/мл.125 µl of DNS solution was added to 125 µl of sample and the mixture was boiled for 5 minutes. 1 ml milli-Q water was added and the absorbance at 540 nm was read using a Unicam visible and UV spectrometer (Helios Gamma, Helios Delta, UK). Standard curves were prepared using glucose, xylose and D-galacturonic acid at concentrations ranging from 0 to 2 mg/ml.
1.5.4. Качественный анализ олигосахаридов с использованием гидрофильной хроматографии (HILIC)1.5.4. Qualitative analysis of oligosaccharides using hydrophilic chromatography (HILIC)
Реакционные надосадочные жидкости PHF, обработанные коммерческими ферментными смесями, анализировали с помощью HILIC.PHF reaction supernatants treated with commercial enzyme mixtures were analyzed by HILIC.
Готовили мальтотриозные стандарты (2 мкмоль/мл, 0,5 мкмоль/мл и 0,1 мкмоль/мл) и ламинаритриозный внутренний стандартный рабочий раствор (0,4 мкмоль/мл). Реагент для мечения 2AB готовили путем добавления 524,2 мг антраниламида (Sigma Aldrich, Швейцария) и 691,2 мг цианоборогидрида натрия (Sigma Aldrich, Швейцария) в растворе 3,6 мл безводной уксусной кислоты (Merck, Швейцария) и 8,4 мл сульфоксида диметила (Sigma Aldrich, Швейцария). Затем реагент для мечения 2AB смешивали на встряхивателе и помещали в ультразвуковую баню на 10 минут для полного растворения. Элюент A (раствор вода : ацетонитрил в соотношении 25 : 75) готовили путем смешивания 250 мл воды Milli-Q и 750 мл ацетонитрила (Merck, Швейцария). Элюент B (50 мМ формиат аммония) готовили путем добавления 1,89 мл муравьиной кислоты 100% (Merck, Швейцария) в 800 мл воды Milli-Q и последующей корректировки рН до 4,4 с помощью гидроксида аммония 25% (Merck, Швейцария).Maltotriose standards (2 µmol/mL, 0.5 µmol/mL and 0.1 µmol/mL) and laminatriose internal standard working solution (0.4 µmol/mL) were prepared. The 2AB labeling reagent was prepared by adding 524.2 mg anthranilamide (Sigma Aldrich, Switzerland) and 691.2 mg sodium cyanoborohydride (Sigma Aldrich, Switzerland) in a solution of 3.6 ml anhydrous acetic acid (Merck, Switzerland) and 8.4 ml dimethyl sulfoxide (Sigma Aldrich, Switzerland). Then the 2AB labeling reagent was mixed on a shaker and placed in an ultrasonic bath for 10 minutes for complete dissolution. Eluent A (25 : 75 water : acetonitrile solution) was prepared by mixing 250 ml of Milli-Q water and 750 ml of acetonitrile (Merck, Switzerland). Eluent B (50 mM ammonium formate) was prepared by adding 1.89 ml of
Интересующие образцы разбавляли в 20–100 раз в воде Milli-Q. 50 мкл рабочего раствора внутреннего стандарта ламинаритриозы (0,4 мкмоль/мл) добавляли к 50 мкл разбавленных образцов и стандартов мальтотриозы. 20 мкл каждой смеси переносили в микропробирку емкостью 2 мл и добавляли в нее 200 мкл реагента для мечения 2AB. После перемешивания вихревым смесителем пробирки инкубировали при 65°C в течение 2 ч на водяной бане. После этой реакции мечения пробирки выдерживали при температуре 4°C в течение 10 мин. Каждую из смесей затем разбавляли 0,6 мл элюента A, встряхивали, а затем количественно переносили в хроматографические виалы емкостью 2 мл (Agilent, Швейцария), а на них навинчивали крышки с отверстием (Agilent, Швейцария).Samples of interest were diluted 20–100 times in Milli-Q water. 50 µl of laminatriose internal standard working solution (0.4 µmol/ml) was added to 50 µl of diluted samples and maltotriose standards. 20 μl of each mixture was transferred to a 2 ml microtube and 200 μl of 2AB labeling reagent was added thereto. After mixing with a vortex mixer, the tubes were incubated at 65°C for 2 h in a water bath. After this labeling reaction, the tubes were kept at 4°C for 10 min. Each of the mixtures was then diluted with 0.6 ml of eluent A, shaken, and then quantitatively transferred to 2 ml chromatography vials (Agilent, Switzerland) with vented caps (Agilent, Switzerland) screwed onto them.
Анализы выполняли на системе УВЭЖХ Thermo Scientific Vanquish (Thermo Scientific, Швейцария). При использовании вводимого объема 2 мкл олигосахариды разделяли на колонке ACQUITY UPLC BEH Amide (130 Å, 1,7 мкм, 2,1 мм X 150 мм, Waters, Швейцария) с предколонкой ACQUITY UPLC BEH Amide VanGuard (130 Å, 1,7 мкм, 2,1 мм X 5 мм, Waters, Швейцария). Элюенты A и B применяли со скоростью потока подвижной фазы 0,5 мл/мин с градиентным профилем, состоящим из элюента A со следующими пропорциями (об./об.) элюента B: 0–2,3 мин, 5% B; 2,3–2,5 мин, 5–10% B; 2,5–4,9 мин, 10% B; 4,9–65 мин, 10–22% B; 65–65,5 мин, 22–70% B; 65,5–68 мин, 70% B; 68–69 мин, 70–10% B; 69–74 мин, 10% B; 74–75,5 мин, 10–5% B. Камеру колонки нагревали и выдерживали при 60°C в течение всего периода анализа. Использовали флуоресцентный детектор Vanquish F (Thermo Scientific, Швейцария) с длиной волны возбуждения 330 нм, длиной волны излучения 420 нм и чувствительностью 3 в режиме высокой мощности лампы. Получали хроматограммы и анализировали площади пика с помощью программного обеспечения Chromeleon 7.2 Chromatography Data System (Dionex, Швейцария).Analyzes were performed on a Thermo Scientific Vanquish UHPLC system (Thermo Scientific, Switzerland). Using an injection volume of 2 µl, oligosaccharides were separated on an ACQUITY UPLC BEH Amide column (130 Å, 1.7 µm, 2.1
1.5.5. Количественный анализ моно- и олигосахаридов с использованием высокоэффективной ионообменной хроматографии (HPAEC)1.5.5. Quantitative analysis of mono- and oligosaccharides using high performance ion exchange chromatography (HPAEC)
Реакционные надосадочные жидкости PHF, обработанные коммерческими ферментными смесями, анализировали с помощью HPAEC.PHF reaction supernatants treated with commercial enzyme mixtures were analyzed by HPAEC.
Моно- и олигосахаридыMono- and oligosaccharides
Моно- и олигосахариды анализировали с использованием устройства Dionex ICS-3000 DC, оснащенного колонкой CarboPac PA1 (Dionex Corporation, 2010) и настроенного на температуру на 30°C и импульсную амперометрическую детекцию (PAD) с тройным потенциалом на золотом электроде. В качестве подвижной фазы с градиентом ацетата натрия использовали элюент A (100 мМ водный раствор NaOH) и элюент B (600 мМ ацетат натрия в 100 мМ водном растворе NaOH): 0–5 мин, 0 мМ; 5–50 мин, 0–48 мМ; 50–55 мин, 48–600 мМ; 55–65 мин, 600 мМ; 65–68 мин, 600–0 мМ; 68–75 мин, 0 мМ при скорости потока 1,0 мл/мин. Приложенные потенциалы PAD для E1 (400 мс), E2 (200 мс) и E3 (400 мс) составляли соответственно 50, 750 и -150 мВ, а выходной диапазон составил 1 мкКл. Вводимый с помощью автоматического пробоотборника Dionex AS (настройка температуры: 10°C) объем для каждого образца составлял 20 мкл. Образцы разводили в 100 раз и фильтровали (0,2 мкм). Стандарты с целлобиозой, -триозой, -тетраозой и -пентаозой получали в трех различных концентрациях (25 мкг/мл, 75 мкг/мл и 150 мкг/мл, при этом линейность подтверждена). Для получения и обработки хроматографических данных использовали программное обеспечение хроматографии Chromeleon™ версия 7.1.Mono- and oligosaccharides were analyzed using a Dionex ICS-3000 DC instrument equipped with a CarboPac PA1 column (Dionex Corporation, 2010) and set to a temperature of 30°C and triple potential pulsed amperometric detection (PAD) on a gold electrode. Eluent A (100 mM aqueous NaOH solution) and eluent B (600 mM sodium acetate in 100 mM aqueous NaOH solution) were used as the mobile phase with a sodium acetate gradient: 0–5 min, 0 mM; 5–50 min, 0–48 mM; 50–55 min, 48–600 mM; 55–65 min, 600 mM; 65–68 min, 600–0 mM; 68-75 min, 0 mM at a flow rate of 1.0 ml/min. The applied PAD potentials for E1 (400 ms), E2 (200 ms) and E3 (400 ms) were 50, 750 and -150 mV, respectively, and the output range was 1 µC. The volume injected with the Dionex AS autosampler (temperature setting: 10°C) for each sample was 20 μl. Samples were diluted 100 times and filtered (0.2 µm). Cellobiose, .beta.-triose, .beta.-tetraose and .beta.-pentaose standards were prepared at three different concentrations (25 μg/ml, 75 μg/ml and 150 μg/ml, with linearity confirmed). Chromeleon™ chromatography software version 7.1 was used to acquire and process chromatographic data.
Анализ на моносахаридыAnalysis for monosaccharides
Маточный раствор углеводного стандарта готовили путем растворения 100 мг глюкозы (Sigma Aldrich, Швейцария), маннозы (Merck, Швейцария), арабинозы (Sigma Aldrich, Швейцария), ксилозы (Sigma Aldrich, Швейцария), галактозы (Sigma Aldrich, Швейцария) в 100 мл воды Milli-Q в мерной колбе емкостью 100 мл, с получением раствора с концентрацией 1000 мкг/мл для каждого моносахарида. Из этого маточного раствора готовили серию стандартов 500 мкг/мл, 250 мкг/мл, 100 мкг/мл, 25 мкг/мл, 5 мкг/мл, 2,5 мкг/мл и 0,5 мкг/мл. 1,5 мл стандартов и разведенных в 100 раз образцов помещали в хроматографические виалы емкостью 2 мл (Agilent, Швейцария), на которые навинчивали крышки с отверстием (Agilent, Швейцария).The carbohydrate standard stock solution was prepared by dissolving 100 mg of glucose (Sigma Aldrich, Switzerland), mannose (Merck, Switzerland), arabinose (Sigma Aldrich, Switzerland), xylose (Sigma Aldrich, Switzerland), galactose (Sigma Aldrich, Switzerland) in 100 ml Milli-Q water in a 100 ml volumetric flask to obtain a solution with a concentration of 1000 µg/ml for each monosaccharide. A series of standards were prepared from this stock solution at 500 µg/ml, 250 µg/ml, 100 µg/ml, 25 µg/ml, 5 µg/ml, 2.5 µg/ml and 0.5 µg/ml. 1.5 ml of standards and 100-fold diluted samples were placed in 2-ml chromatographic vials (Agilent, Switzerland), on which caps with a hole (Agilent, Switzerland) were screwed on.
Анализы проводили на безреагентной системе HPIC Thermo Scientific Dionex ICS-5000+ (Dionex, Швейцария). Используя вводимый объем 25 мкл, моносахариды разделяли на колонке CarboPac PA1 (4 x 250 мм, Dionex, Швейцария). Элюент A представлял собой 300 мМ гидроксид натрия (J.T.Baker Chemicals, Швейцария), а элюент B представлял собой воду Milli-Q со скоростью потока подвижной фазы 1 мл/мин и градиентным профилем, состоящим из элюента A со следующими пропорциями (об./об.) элюента B: 0–60 мин, 100% B; 60–75 мин, 0% B; 75–90 мин, 100% B. Послеколоночный элюент, представляющий собой 300 мМ гидроксид натрия, добавляли со скоростью потока 0,6 мл/мин для повышения силы сигнала и уменьшения отношения сигнала к шуму. Электрохимический детектор Dionex ICS-5000+ ED40 (Dionex, Швейцария), оснащенный золотым рабочим электродом, использовали с импульсным амперометрическим датчиком, используя параметры импульса волны Carbo Quad. Получали хроматограммы и анализировали площади пика с помощью программного обеспечения Chromeleon 7.2 Chromatography Data System (Dionex, Швейцария).Analyzes were performed on a reagentless HPIC Thermo Scientific Dionex ICS-5000+ system (Dionex, Switzerland). Using an injection volume of 25 μl, the monosaccharides were separated on a CarboPac PA1 column (4 x 250 mm, Dionex, Switzerland). Eluent A was 300 mM sodium hydroxide (J.T. Baker Chemicals, Switzerland) and eluent B was Milli-Q water with a mobile phase flow rate of 1 ml/min and a gradient profile consisting of eluent A with the following proportions (v/v .) eluent B: 0–60 min, 100% B; 60–75 min, 0% B; 75–90 min, 100% B. A post-column eluent of 300 mM sodium hydroxide was added at a flow rate of 0.6 ml/min to increase the signal strength and decrease the signal to noise ratio. A Dionex ICS-5000+ ED40 electrochemical detector (Dionex, Switzerland) equipped with a gold working electrode was used with a pulse amperometric sensor using the Carbo Quad wave pulse parameters. Chromatograms were obtained and peak areas were analyzed using Chromeleon 7.2 Chromatography Data System software (Dionex, Switzerland).
Результатыresults
2.1. Определение характеристик очищенных ферментов и коммерческих расщепляющих волокна ферментных смесей2.1. Characterization of Purified Enzymes and Commercial Fiber-Splitting Enzyme Blends
Содержание белка в очищенных ферментах и коммерческих ферментных смесях, измеренное с помощью стандартных анализов Лоури и Брэдфорда, показано на фиг. 1. Независимо от выбранного анализа, в коммерческих ферментных составах было существенно более высокое содержание белка (раствор фермента 19,1–182 мг/мл) по сравнению с очищенными ферментами (раствор фермента 0,2–1,0 мг/мл). Содержание белка, измеренное с помощью анализа Лоури, было стабильно выше, чем значение, измеренное с помощью анализа Брэдфорда. Различия можно объяснить различиями в чувствительности анализа по отношению к определенным пептидам или другим соединениям, присутствующим в растворе ферментов (Berges, Fisher and Harrison, 1993). Хотя анализ Лоури в целом считается более точным способом количественного определения белка (Redmile-Gordon et al, 2013 Soil Biology and Biochemistry, 67, pp. 166–173), в его ходе была выявлена высокая реакционная способность в отношении очищенной ß-глюкозидазы (E-BGLUC). Следовательно, для нормализации ферментов по содержанию белка использовали метод Брэдфорда.The protein content of purified enzymes and commercial enzyme mixtures, as measured by standard Lowry and Bradford assays, is shown in FIG. 1. Regardless of the assay chosen, commercial enzyme formulations had significantly higher protein content (enzyme solution 19.1–182 mg/mL) compared to purified enzymes (enzyme solution 0.2–1.0 mg/mL). The protein content measured by the Lowry assay was consistently higher than the value measured by the Bradford assay. The differences can be explained by differences in assay sensitivity to certain peptides or other compounds present in the enzyme solution (Berges, Fisher and Harrison, 1993). Although the Lowry assay is generally considered to be a more accurate method for protein quantification (Redmile-Gordon et al, 2013 Soil Biology and Biochemistry, 67, pp. 166–173), it has shown high reactivity with purified ß-glucosidase (E -BGLUC). Therefore, the Bradford method was used to normalize enzymes for protein content.
Активность эндоглюканазы, эндоксиланазы, β-глюкозидазы и пектиназыActivity of endoglucanase, endoxylanase, β-glucosidase and pectinase
Активность очищенных ферментов и коммерческих ферментных смесей показана в таблице 4. Коммерческие ферментные составы обладали гораздо более высокими активностями (9748–10 467 Ед/мл), чем очищенные ферменты (182–3844 Ед/мл). Однако специфическая активность очищенных ферментов была существенно выше, чем в коммерческих ферментных смесях. Важно отметить, что эти значения применимы только при определенных условиях анализа.The activities of the purified enzymes and commercial enzyme mixtures are shown in Table 4. The commercial enzyme formulations had much higher activities (9748–10467 U/mL) than the purified enzymes (182–3844 U/mL). However, the specific activity of the purified enzymes was significantly higher than in commercial enzyme mixtures. It is important to note that these values are only applicable under certain assay conditions.
Таблица 4. Ферментативные активности (целлюлаза, ксиланаза, пектиназа и β-глюкозидаза) очищенных ферментов и коммерческих ферментных смесейTable 4. Enzymatic activities (cellulase, xylanase, pectinase and β-glucosidase) of purified enzymes and commercial enzyme mixtures
(раствор фермента Ед/мл)Enzymatic activity
(enzyme solution U/ml)
(Ед/мг белка)Specific activity b
(U/mg protein)
bНа основе данных Брэдфорда (фиг. 1) b Based on Bradford data (Fig. 1)
Протеолитическая активность в коммерческих ферментных смесях и в PHF показана в таблице 5. Цель данного измерения заключалась в подтверждении или опровержении наличия протеолитической активности, которая может воздействовать на белки или ферменты гороха, присутствующие в реакционном растворе. Pectinex Ultra SP-L обладал протеолитической активностью, в то время как эта активность отсутствовала в отношении Celluclast 1.5 L. Exafine PHF также обладал значимой протеолитической активностью. Это можно объяснить наличием эндогенных ферментов, которые обычно образуют часть стенок первичных клеточных стенок (публикация O’Neill & York, 2003 The composition and structure of plant primary cell wall. In Annual Plant Reviews 8: The plant cell wall, Rose, JKC Ed. Oxford: Blackwall, которая включена в настоящий документ путем ссылки), и не были инактивированы во время промышленной обработки. Следует отметить, что единицы были рассчитаны по стандартной калибровочной кривой, предоставленной компанией Megazyme (см. публикацию 1.5.1.), и не отражают общее количество единиц, поскольку условия проведения анализа были адаптированы к обычным условиям реакции (pH 5, температура 50°C), которые отличаются от условий, используемых Megazyme для калибровки.Proteolytic activity in commercial enzyme mixtures and in PHF is shown in Table 5. The purpose of this measurement was to confirm or refute the presence of proteolytic activity that may affect pea proteins or enzymes present in the reaction solution. Pectinex Ultra SP-L had proteolytic activity, while this activity was absent against Celluclast 1.5 L. Exafine PHF also had significant proteolytic activity. This can be explained by the presence of endogenous enzymes that normally form part of the walls of primary cell walls (O'Neill & York, 2003 The composition and structure of plant primary cell wall. In Annual Plant Reviews 8: The plant cell wall, Rose, JKC Ed. Oxford: Blackwall, which is incorporated herein by reference), and have not been inactivated during industrial processing. It should be noted that the units were calculated from the standard calibration curve provided by Megazyme (see publication 1.5.1.) and do not reflect the total number of units because the assay conditions were adapted to the usual reaction conditions (
Таблица 5. Эндопротеазная активность в коммерческих ферментных смесях и в PHFTable 5. Endoprotease activity in commercial enzyme mixtures and in PHF
Влияние обработки очищенными ферментами и коммерческими ферментными смесями на степень гидролиза PHFEffect of Treatment with Purified Enzymes and Commercial Enzyme Blends on the Degree of PHF Hydrolysis
Таблица 6. Дозы ферментов, используемые для ферментативной обработки PHF (10% TS, 16 ч, 50°C, pH 5) очищенными ферментами и коммерческими ферментными смесями, включая снижение выхода сахаров для каждой реакцииTable 6. Enzyme Doses Used for Enzymatic Treatment of PHF (10% TS, 16 h, 50°C, pH 5) with Purified Enzymes and Commercial Enzyme Blends, Including Sugar Yield Reduction for Each Reaction
(мкл/г PHF)Enzyme dose
(µL/g PHF)
(Ед/г PHF)Added units
(U/g PHF)
aСтандартное отклонение восстанавливающих сахаров для каждого образца составляло менее 6% a The standard deviation of reducing sugars for each sample was less than 6%
Анализ восстанавливающего сахара после обработки очищенными ферментами указал на высвобождение только незначительного количества новых восстанавливающих концов или отсутствие новых высвобожденных восстанавливающих концов (1,6–2,9 г/л, таблица 6). Это было ожидаемо, поскольку не предполагалось, что действие только очищенных ферментов, по существу, гидролизует резистентные волокна. Однако низкие значения также указывают на повышенную сложность и плотность, по существу, гетерогенной полисахаридной сети для разложения очищенными ферментами (Huisman, Schols and Voragen, 1999 Carbohydrate Polymers, 38(4), pp 299–307). Эквивалентные концентрации восстанавливающего сахара в контрольных образцах можно объяснить наличием загрязнителей, таких как растворимые олигосахариды или крахмал, из семядолей, которые поступают в раствор во время инкубации.Reducing sugar analysis after treatment with purified enzymes showed only a small amount of new reducing ends released or no new reducing ends released (1.6-2.9 g/L, Table 6). This was expected since it was not expected that the action of purified enzymes alone would essentially hydrolyze resistant fibers. However, low values also indicate increased complexity and density of a substantially heterogeneous polysaccharide network for degradation by purified enzymes (Huisman, Schols and Voragen, 1999 Carbohydrate Polymers, 38(4), pp 299-307). The equivalent reducing sugar concentrations in the controls can be explained by the presence of contaminants such as soluble oligosaccharides or starch from the cotyledons that enter the solution during incubation.
Затем проводили ферментативную обработку коммерческими целлюлолитическими и пектинолитическими ферментными препаратами в высоких дозах для обеспечения более эффективного гидролиза. Как и ожидалось, после этой обработки заметно увеличивалась степень гидролиза по сравнению с очищенными ферментами, о чем свидетельствует увеличение числа высвобожденных восстанавливающих концов (46,3–75,4 г/л, таблица 6). Увеличенный гидролиз волокна можно объяснить как более высокой концентрацией ферментов, так и синергетическим эффектом нескольких ферментов, присутствующих в коммерческих ферментных составах.Enzymatic treatment was then carried out with commercial cellulolytic and pectinolytic enzyme preparations at high doses to ensure more efficient hydrolysis. As expected, after this treatment, the degree of hydrolysis increased markedly compared to purified enzymes, as evidenced by the increase in the number of reducing ends released (46.3-75.4 g/l, table 6). The increased fiber hydrolysis can be explained both by the higher concentration of enzymes and by the synergistic effect of several enzymes present in commercial enzyme formulations.
Анализ надосадочной жидкости с помощью HILICSupernatant analysis with HILIC
Для лучшего понимания воздействия ферментативной обработки на химический состав PHF гидролизаты анализировали дополнительно с помощью HILIC и HPAEC. С помощью этой информации можно было бы отнести изменения функциональных свойств PHF к экстрагированным углеводам и, следовательно, ферментативной активности.To better understand the effect of enzymatic treatment on PHF chemistry, hydrolysates were further analyzed by HILIC and HPAEC. With this information, it would be possible to attribute changes in the functional properties of PHF to the extracted carbohydrates and hence in enzymatic activity.
Графики обработанных ферментами PHF и контрольных образцов представлены на фиг. 2. Результаты показали неожиданное присутствие в надосадочной жидкости низкомолекулярного материала, подтвержденное путем раннего (2–15 минут) элюирования всех компонентов. Несмотря на то, что были выполнены длительные, а затем короткие анализы HILIC при различных разведениях, в PHF было выявлено либо отсутствие, либо малое количество олигосахаридов (минута 17). Все спектры, кроме контрольных, состояли из идентичных пиков с различной высотой, за исключением двух различных пиков на 2-й и 5-й минутах в образцах, обработанных пектином. Можно сделать вывод об образовании низкомолекулярных фрагментов в результате действия ферментов, которые в основном приводила в действие активность клетки.PHF enzyme-treated and control samples are plotted in FIG. 2. The results showed an unexpected presence of low molecular weight material in the supernatant, confirmed by early (2-15 minutes) elution of all components. Although long and then short HILIC assays were performed at different dilutions, PHF showed either no or low levels of oligosaccharides (minute 17). All spectra, except for the control ones, consisted of identical peaks with different heights, except for two different peaks at the 2nd and 5th minutes in the samples treated with pectin. It can be concluded that the formation of low molecular weight fragments as a result of the action of enzymes, which were mainly driven by the activity of the cell.
Анализ надосадочной жидкости с помощью HPAECSupernatant analysis by HPAEC
Для выявления целло-олиго-, ди- и моносахаридов выполняли композиционный анализ гидролизатов с помощью HPAEC при различных разведениях (от 1 : 10 до 1 : 100). С помощью анализа на целлоолигосахариды не удалось выполнить точное комплексирование из-за совместного элюирования соединений и недостаточного разрешения пиков. Наконец, посредством анализа на моносахариды обработанных ферментами PHF путем аналогичной системы удалось разделить пики при разведениях 1 : 100 и продемонстрировать, что молекулы, которые элюировали раньше, представляли собой глюкозу (26,5–31,4 г / 100 PHF в виде сухого вещества), арабинозу (0,2–3,3 г / 100 PHF в виде сухого вещества) и ксилозу (7,6–8,0 г / 100 PHF в виде сухого вещества). Пик на 45-й минуте не идентифицировали, но он мог соответствовать целлозозе. Эти молекулы соответствуют общей композиции PHF. Принимая во внимание, что источником глюкозы в основном была фракция целлюлозы в PHF (69 мас.% сухого вещества), было рассчитано, что приблизительно 40–48% целлюлозы было расщеплено на моносахариды в комплексе PHF-целлюлоза и PHF-пектин+целлюлоза.To identify cello-oligo-, di-, and monosaccharides, the compositional analysis of hydrolysates was performed using HPAEC at various dilutions (from 1 : 10 to 1 : 100). Cello-oligosaccharide analysis failed to perform accurate complexing due to co-elution of compounds and insufficient peak resolution. Finally, by analyzing enzyme-treated PHF for monosaccharides using a similar system, it was possible to separate the peaks at 1:100 dilutions and demonstrate that the molecules that eluted earlier were glucose (26.5–31.4 g/100 PHF as dry matter) , arabinose (0.2–3.3 g/100 PHF dry matter) and xylose (7.6–8.0 g/100 PHF dry matter). The peak at 45 minutes was not identified, but it could correspond to cellose. These molecules correspond to the general composition of PHF. Considering that the source of glucose was mainly the cellulose fraction in PHF (69 wt.% dry matter), it was calculated that approximately 40–48% of the cellulose was degraded into monosaccharides in the PHF-cellulose and PHF-pectin+cellulose complex.
Согласно результатам за счет длительного периода выдерживания в сочетании с присутствием экзоактивности в коммерческих ферментных смесях активировалось расщепление волокон, присутствующих в PHF, до моносахаридов. Наличие экзоактивности в ферментных смесях пектина и целлюлозы ранее сообщалось в публикации Combo et al. (2012) Food and Bioproducts Processing 90(3) p 588–596 (включена в настоящий документ путем ссылки) и Rosales-Calderon, Trajano and Duff (2014) Peer J. 2 pe402 (включена в настоящий документ путем ссылки).According to the results, due to the long period of exposure in combination with the presence of exoactivity in commercial enzyme mixtures, the breakdown of fibers present in PHF into monosaccharides was activated. The presence of exoactivity in pectin and cellulose enzyme mixtures was previously reported by Combo et al. (2012) Food and Bioproducts Processing 90(3) p 588-596 (incorporated herein by reference) and Rosales-Calderon, Trajano and Duff (2014) Peer J. 2 pe402 (incorporated herein by reference).
При наблюдении за восстанавливающими сахарами комплекса PHF-пектин+целлюлоза в зависимости от времени реакции (фиг. 4) можно наблюдать первичные и вторичные процессы гидролиза. После первых 4–6 часов высвобождение восстанавливающих сахаров достигало плато. На этой стадии растворимые промежуточные соединения из поверхности частиц волокна, вероятно, высвобождались в растворимую фазу (первичный гидролиз) (публикация Sievers et al., 2009 Industrial & Engineering Chemistry Research 48(3) p 1277-1286 включена в настоящий документ путем ссылки). Через 8 часа эти длинноцепочечные и короткоцепочечные промежуточные соединения затем расщеплялись до моносахаридов ферментами, обладающими экзоактивностью. Эта стадия была гораздо быстрее первичного гидролиза, о чем свидетельствует резкое увеличение наклона восстанавливающих сахаров с 8 до 16 часов.By observing the reducing sugars of the PHF-pectin+cellulose complex as a function of the reaction time (FIG. 4), primary and secondary hydrolysis processes can be observed. After the first 4–6 hours, the release of reducing sugars plateaued. At this stage, soluble intermediates from the surface of the fiber particles were likely released into the soluble phase (primary hydrolysis) (Sievers et al., 2009 Industrial & Engineering Chemistry Research 48(3) p 1277-1286 incorporated herein by reference). After 8 hours, these long and short chain intermediates were then degraded to monosaccharides by exoactive enzymes. This step was much faster than the primary hydrolysis, as evidenced by the sharp increase in the slope of reducing sugars from 8 to 16 hours.
2.2. Функциональные свойства обработанных ферментами волокон кожуры гороха2.2. Functional properties of enzyme-treated pea peel fibers
2.2.1. Обработанные ферментами волокна кожуры гороха в качестве стабилизаторов эмульсии Пикеринга типа «масло в воде»2.2.1. Enzyme Treated Pea Skin Fibers as Oil-in-Water Pickering Emulsion Stabilizers
Влияние ферментативной обработки коммерческими ферментными смесями на размер частиц и морфологию PHFEffect of Enzymatic Treatment with Commercial Enzyme Blends on PHF Particle Size and Morphology
Объемное распределение частиц по размерам (PSD) для всех обработанных ферментами образцов и контрольного образца представлено на фиг. 5.Volumetric particle size distribution (PSD) for all enzyme-treated samples and the control sample is shown in FIG. 5.
Приведенная ниже таблица соответствует фиг. 5. Контрольный образец соответствует ультрадисперсным волокнам кожуры гороха, в отношении которых не выполняли ферментативную обработку.The table below corresponds to FIG. 5. The control sample corresponds to ultrafine pea skin fibers, which were not subjected to enzymatic treatment.
(без ферментов)Control
(without enzymes)
Одним из последствий ферментативной обработки для физической структуры ультрадисперсного PHF было уменьшение размера частиц, вследствие чего были получены частицы в диапазоне размеров от 1 до 300 мкм. Частицы самых малых размеров получали при одновременной обработке PHF с Pectinex SP-L и Celluclast 1.5 L. При такой обработке средний объемный диаметр снижался в десять раз.One of the effects of the enzymatic treatment on the physical structure of ultrafine PHF was a reduction in particle size, resulting in particles in the size range from 1 to 300 µm. The smallest particle sizes were obtained by simultaneous treatment of PHF with Pectinex SP-L and Celluclast 1.5 L. With this treatment, the mean volume diameter was reduced by a factor of ten.
Влияние ферментативной обработки на физическую структуру PHF также оценивали с помощью оптической микроскопии. Качественный анализ результатов показал изменения в морфологии и полидисперсности размеров частиц при различных типах ферментативной обработки. По сравнению с обработанными PHF необработанные модифицированные частицы PHF демонстрировали более высокую полидисперсность и повышенную шероховатость поверхности, которые четко не видны на изображениях из-за их низкого разрешения. С помощью обработки PHF только с пектинолитическими ферментами (фиг. 6C) получали стержнеподобные частицы в отличие от обработки целлюлолитическими ферментами (фиг. 6 B, D).The effect of enzymatic treatment on the physical structure of PHF was also evaluated using optical microscopy. Qualitative analysis of the results showed changes in the morphology and polydispersity of particle sizes with different types of enzymatic treatment. Compared to the treated PHF, the untreated modified PHF particles showed higher polydispersity and increased surface roughness, which are not clearly visible in the images due to their low resolution. PHF treatment with pectinolytic enzymes alone (FIG. 6C) produced rod-like particles in contrast to cellulolytic enzyme treatment (FIG. 6B,D).
Важно подчеркнуть, что PSD на фиг. 5 выражено в виде объемного распределения по размерам. Поскольку большая часть объема в образцах с полидисперсным распределением по размерам занята более крупными частицами, относительный вклад частиц меньшего размера в распределение объема уменьшается, и, следовательно, эти малые частицы плохо представлены при измерении устройством компании Malvern. Наличие некоторых крупных частиц в комплексе PHF-целлюлоза (фиг. 6, B) может объяснить, почему при измерении PSD с помощью Malvern Mastersizer 2000 не наблюдалось существенных изменений размера частиц для комплекса PHF-целлюлоза (фиг. 5), тогда как на микрофотографиях в оптическом микроскопе показано значительное образование частиц меньшего размера (фиг. 6, B).It is important to emphasize that the PSD in FIG. 5 is expressed as a volumetric size distribution. Since most of the volume in samples with a polydisperse size distribution is occupied by larger particles, the relative contribution of smaller particles to the volume distribution is reduced and hence these small particles are poorly represented when measured by the Malvern device. The presence of some large particles in the PHF-cellulose complex (Fig. 6b) may explain why the PSD measurement with the Malvern Mastersizer 2000 did not show significant changes in particle size for the PHF-cellulose complex (Fig. 5), while the micrographs in an optical microscope showed a significant formation of smaller particles (Fig. 6, B).
На графике на фиг. 7 представлен средний размер частиц комплекса PHF-пектин+целлюлоза в зависимости от времени реакции. Уменьшение размера частиц постепенно сглаживалось через 8 часов. Таким образом, для будущей оптимизации процесса время реакции можно сократить до приблизительно 8 часов без изменения конечного размера частиц. За счет этого будет также ограничен вторичный гидролиз, возникающий приблизительно через 6–8 часов, как описано ранее при обсуждении (фиг. 4), а значит, уменьшится нежелательное образование моносахаридов.On the graph in Fig. 7 shows the average particle size of the PHF-pectin+cellulose complex as a function of reaction time. The decrease in particle size gradually smoothed out after 8 hours. Thus, for future process optimization, the reaction time can be reduced to about 8 hours without changing the final particle size. This will also limit the secondary hydrolysis occurring after about 6-8 hours, as described earlier in the discussion (FIG. 4), and thus reduce the undesirable formation of monosaccharides.
Влияние ферментативной обработки на скорость сдвига в водных суспензиях PHFEffect of Enzymatic Treatment on Shear Rate in Aqueous PHF Suspensions
Вискозиметрические измерения проводили на обработанных ферментами водных дисперсиях PHF (10 мас.%) после инкубации. В комплексе PHF-пектин+целлюлоза были самые низкие значения вязкости (фиг. 8), которые соответствовали системе с наименьшим размером частиц (фиг. 5). Таким образом, кажущаяся вязкость, по-видимому, в большей степени обусловлена корпускулярной дисперсной фазой по сравнению с содержащей моносахарид водной дисперсионной фазой.Viscometric measurements were carried out on enzyme-treated aqueous dispersions of PHF (10 wt%) after incubation. The PHF-pectin+cellulose complex had the lowest viscosities (FIG. 8), which corresponded to the system with the smallest particle size (FIG. 5). Thus, the apparent viscosity appears to be due more to the particulate dispersed phase than to the monosaccharide-containing aqueous dispersed phase.
В отношении комплекса PHF-целлюлоза не было измерено никаких изменений значений кажущейся вязкости в соответствии с результатами распределения частиц по размерам, которые не показали существенных отличий. Наконец, измеренного уменьшения размера частиц PHF-пектин оказалось недостаточно для существенного изменения скорости потока по сравнению с контрольным образцом.With respect to the PHF-cellulose complex, no change in apparent viscosity values was measured according to the particle size distribution results, which did not show significant differences. Finally, the measured particle size reduction of PHF-pectin was not sufficient to significantly change the flow rate compared to the control.
Влияние ферментативной обработки на смачивающую способность PHFEffect of enzymatic treatment on the wetting ability of PHF
Оценка смачивающей способности PHF была центральной частью данного исследования, поскольку изменение поверхностной гидрофобности в иных условиях гидрофильных частиц имело решающее значение для получения функциональных частиц для стабилизации эмульсии. Смачивающая способность относится к трехфазному углу θ смачивания, определяющему разделение частиц между двумя фазами текучей среды.The evaluation of the wetting ability of PHF was a central part of this study, as the change in the surface hydrophobicity of the otherwise hydrophilic particles was critical in obtaining functional particles to stabilize the emulsion. Wetting ability refers to the three-phase contact angle θ, which determines the separation of particles between two fluid phases.
Результаты показаны на фиг. 9.The results are shown in FIG. 9.
Точное определение угла смачивания, образованного между каплей масла или воды и PHF, было затруднено из-за пористости PHF, вследствие которой происходило быстрое поглощение жидкости в течение первых 3–5 секунд, постепенное снижение объема капель, набухание частиц при контакте с водой и захват частиц каплей.Precise determination of the contact angle formed between a drop of oil or water and PHF was difficult due to the porosity of PHF, which resulted in rapid absorption of liquid during the first 3–5 seconds, gradual decrease in droplet volume, swelling of particles upon contact with water, and particle capture drop.
Использовали другой способ, при котором смачиваемость была выражена в виде количества времени (с), необходимого для полного погружения 1 г образца в фиксированный объем (10 мл) воды mili-Q. Для этого PHF подвергали сушке сублимацией и растирали в порошок. Этот способ продемонстрировал значительные различия между образцами и хорошую воспроизводимость (см. фиг. 10).A different method was used in which wettability was expressed as the amount of time (s) required to fully submerge 1 g of sample in a fixed volume (10 ml) of mili-Q water. To do this, PHF was subjected to drying by sublimation and triturated into powder. This method showed significant inter-sample differences and good reproducibility (see FIG. 10).
Комплекс PHF-пектин+целлюлоза показал наилучшую смачиваемость (для полного погружения частиц требовалось всего 3 секунды), а следующие результаты показали PHF-пектин и PHF-целлюлоза. Контрольному PHF потребовалось почти 120 секунд для исчезновения с поверхности, и, следовательно, его считали наименее гидрофильным. Однако улучшенная смачиваемость может также быть результатом снижения размера частиц (фиг. 5), вследствие которой на поверхности частицы появляются более функциональные группы, которые доступны для связывания с молекулами воды (публикация Einhorn-Stoll, Hatakeyama and Hatakeyama, 2012 Food Hydrocolloids 27(2) pp 494–502, включенная в настоящий документ путем ссылки).The PHF-pectin+cellulose complex showed the best wettability (it took only 3 seconds for the particles to completely submerge), and the following results were shown by PHF-pectin and PHF-cellulose. The control PHF took almost 120 seconds to disappear from the surface and was therefore considered the least hydrophilic. However, improved wettability may also be the result of particle size reduction (FIG. 5), which results in more functional groups on the particle surface that are available to bind to water molecules (Einhorn-Stoll, Hatakeyama and Hatakeyama, 2012 Food Hydrocolloids 27(2) pp 494–502, incorporated herein by reference).
Стабилизирующие эмульсию свойства обработанного ферментами PHFEmulsion-stabilizing properties of enzyme-treated PHF
Первоначальные эмульсии готовили с возможностью ускорения дестабилизации, за счет чего получалось более быстрое сравнение образцов. Вкратце 1 мл обработанного PHF сначала диспергировали в водной фазе, после чего добавляли подсолнечное масло с высоким содержанием олеиновой кислоты. Смесь вручную встряхивали в течение 10 секунд и сравнивали устойчивость эмульсий, полученных с обработанными волокнами, с устойчивостью их необработанных аналогов в течение четырех недель, если не указано иное. На фиг. 21 показано изображение полученных эмульсий через 1 день и 4 недели.The initial emulsions were prepared with the ability to accelerate the destabilization, due to which a faster comparison of the samples was obtained. Briefly, 1 ml of treated PHF was first dispersed in the aqueous phase, after which high oleic sunflower oil was added. The mixture was shaken by hand for 10 seconds and the stability of the emulsions made with the treated fibers was compared with that of their untreated counterparts for four weeks, unless otherwise noted. In FIG. 21 shows an image of the resulting emulsions after 1 day and 4 weeks.
Вследствие приложения небольшого количества энергии в результате ручного встряхивания формировались более крупные капли масла и, следовательно, повышалась скорость отстаивания, из-за чего появлялся толстый отстоявшийся слой. Через 30–180 секунд отстоявшийся слой эмульсий, приготовленных с использованием комплекса PHF-пектина, и контрольных образцов разделяли на масляную и водную фазы, а капли (диапазон размеров 10–500 мкм) в отстоявшемся слое эмульсии, приготовленном с использованием комплексов PHF-пектин+целлюлоза и PHF-целлюлоза, сохраняли стабильность в течение по меньшей мере 4 недель. Те же результаты наблюдали при приготовлении эмульсий при рН 3,0, 5,0 и 8,0.Due to the application of a small amount of energy, as a result of manual shaking, larger oil droplets were formed and, consequently, the settling speed was increased, due to which a thick settled layer appeared. After 30–180 seconds, the settled layer of the emulsions prepared using the PHF-pectin complex and control samples were separated into oil and water phases, and the drops (
Устойчивость эмульсии, как правило, оценивают на основании ее способности сопротивляться физико-химическим изменениям в течение времени хранения (издание McClements, 2005 Food Emulsions: Principles, Practice, and Techniques. Boca Raton: CRC Press, которое включено в настоящий документ путем ссылки). Эмульсии считаются стабильными при наличии однородного внешнего вида без разделения фаз. Благодаря такому способу приготовления эмульсий возможно быстрое отстаивание сливок, поэтому определение устойчивости было основано на том, будут ли отстоявшиеся капли масла сохранять устойчивость с течением времени, независимо от размера капель или высоты отстоявшегося слоя. С помощью такого сравнительного анализа можно получить только два варианта ответа, причем «стабильный» относится к случаю, при котором отстоявшиеся капли масла устойчивы к коалесценции в течение по меньшей мере 4 недель, а «нестабильный» к случаю отсутствия капель.The stability of an emulsion is generally evaluated based on its ability to resist physical and chemical changes during storage (McClements, 2005 Food Emulsions: Principles, Practice, and Techniques. Boca Raton: CRC Press, which is incorporated herein by reference). Emulsions are considered stable when they have a uniform appearance without phase separation. This emulsifying method allows cream to settle quickly, so stability was determined by whether the settled oil droplets would remain stable over time, regardless of the size of the droplets or the height of the settled layer. With this comparative analysis, only two responses can be obtained, with “stable” referring to the case in which the settled oil droplets are resistant to coalescence for at least 4 weeks, and “unstable” to the case where there are no drops.
Ослабление влияния растворимой и нерастворимой фракций на стабилизирующие эмульсию свойстваWeakening the influence of soluble and insoluble fractions on emulsion stabilizing properties
Проведены дополнительные эксперименты по ослаблению влияния частиц и других потенциальных поверхностно-активных соединений в растворе. Дисперсии PHF (PHF-целлюлоза и PHF-пектин+целлюлоза) центрифугировали, а надосадочную жидкость и осадок использовали отдельно для приготовления эмульсий. Как показано на фиг. 12, эмульсии, полученные с нерастворимой фазой (b), сохраняли стабильность в течение по меньшей мере 4 недель. Эмульсии, полученные с растворимой фазой (a), быстро разделялись на фазы (приблизительно через 10 минут), но медленнее по сравнению с контрольным образцом. Согласно этим результатам устойчивость эмульсии была обусловлена нерастворимой корпускулярной фазой. Это согласуется с ранее сообщенными результатами химического анализа (фиг. 3), согласно которым с помощи ферментативной обработки получали главным образом моносахариды, которые не обладают поверхностной активностью. После определения фазы, обеспечивающей устойчивость, все же продолжали эксперименты с использованием смеси обеих фаз.Additional experiments were carried out to reduce the effect of particles and other potential surfactants in solution. PHF dispersions (PHF-cellulose and PHF-pectin+cellulose) were centrifuged and the supernatant and pellet were used separately to prepare emulsions. As shown in FIG. 12, the emulsions made with the insoluble phase (b) were stable for at least 4 weeks. The emulsions made with the soluble phase (a) separated rapidly into phases (after about 10 minutes), but slower than the control. According to these results, the stability of the emulsion was due to the insoluble corpuscular phase. This is consistent with the previously reported results of chemical analysis (FIG. 3), according to which mainly monosaccharides were obtained by means of enzymatic treatment, which did not have surface activity. After determining the phase that provides stability, nevertheless, experiments were continued using a mixture of both phases.
Микроструктура эмульсий, стабилизированных обработанным ферментами PHFMicrostructure of emulsions stabilized with enzyme-treated PHF
Эмульсии визуализировали с помощью светового микроскопа для наблюдения за микроструктурой устойчивых капель. На микрофотографиях на фиг. 13 показана текстурированная шероховатая поверхность капель, которая представляет собой типичную характеристику жидких поверхностей, стабилизированных частицами. Капли контрольного образца и PHF-пектин не визуализировали, поскольку они быстро теряли стабильность после приготовления эмульсии.The emulsions were visualized using a light microscope to observe the microstructure of stable droplets. In the micrographs in Fig. 13 shows a textured, rough droplet surface, which is a typical characteristic of particle-stabilized liquid surfaces. Control droplets and PHF-pectin were not visualized as they rapidly lost stability after emulsion preparation.
Изображения тех же эмульсий, полученные посредством CLSM, (фиг. 14) показали предпочтительное присутствие мелких частиц (<30 мкм) на поверхности раздела, а не в основной массе эмульсии, и, следовательно, более высокую аффинность к поверхности раздела м/в. Полученные эмульсии соответствуют определению эмульсии Пикеринга, в которой эмульсия стабилизируется адсорбцией твердых частиц на поверхности раздела м/в (публикация Murray et al., 2011 Food Hydrocolloids 25(4) p 627–638, включенная в настоящий документ путем ссылки). Была выявлена разнородность как капель масла, так и частиц PHF в отношении формы и размера частиц, но общее отношение частиц к маслу находилось в диапазоне 1 : 10, что соответствует общепринятому убеждению в том, что частицы Пикеринга должны быть по меньшей мере на один порядок меньше, чем стабилизируемые ими капли масла (публикация Berton-Carabin and Schroën, 2015 Annual review of Food Science and Technology 6(1) pp 263–297 включена в настоящий документ путем ссылки). Частицы большего размера (>30 мкм) не могли адсорбироваться на поверхности раздела м/в и, как правило, выпадали в осадок из эмульсии. Эти неадсорбированные частицы могут играть роль в обеспечении дополнительной устойчивости путем структурирования дисперсионной фазы между каплями (Gould, Vieira and Wolf, 2013 Food & Function 4(9), p 1369; Tamayo Tenorio et al, 2017 Food Hydrocolloids 71 pp 8–16).The CLSM images of the same emulsions (FIG. 14) showed a preferential presence of fine particles (<30 µm) at the interface rather than in the bulk of the emulsion, and hence a higher affinity for the O/W interface. The resulting emulsions meet the definition of a Pickering emulsion in which the emulsion is stabilized by the adsorption of solid particles at the O/W interface (Murray et al., 2011 Food Hydrocolloids 25(4) p 627-638, incorporated herein by reference). Heterogeneity was found in both oil droplets and PHF particles in terms of particle shape and size, but the overall particle to oil ratio was in the range of 1:10, consistent with the generally accepted belief that Pickering particles should be at least one order of magnitude smaller than the oil droplets they stabilize (Berton-Carabin and Schroën, 2015 Annual review of Food Science and Technology 6(1) pp 263–297 are incorporated herein by reference). Larger particles (>30 µm) could not be adsorbed on the O/W interface and, as a rule, precipitated out of the emulsion. These non-adsorbed particles may play a role in providing additional stability by structuring the dispersed phase between droplets (Gould, Vieira and Wolf, 2013 Food & Function 4(9), p 1369; Tamayo Tenorio et al, 2017 Food Hydrocolloids 71
Эффект Пикеринга, по-видимому, был более выраженным для комплекса PHF-пектин+целлюлоза, чем для PHF-целлюлоза. Причина этого заключается в получении с помощью ферментативной обработки комплексом пектин+целлюлоза частиц меньшего размера по сравнению с обработкой только целлюлозой (фиг. 5), вследствие чего возрастало количество частиц, покрывающих масляную поверхность раздела. Результаты, полученные Gould, Vieira и Wolf, (2013) (см. выше), также показали, что только фракция частиц малого размера (<2 мкм) из какао будет адсорбироваться на поверхности капель масла (d3,2 приблизительно 10 мкм).The Pickering effect seemed to be more pronounced for the PHF-pectin+cellulose complex than for PHF-cellulose. The reason for this is that the enzymatic treatment with the pectin+cellulose complex produces smaller particles compared to the treatment with cellulose alone (FIG. 5), thereby increasing the number of particles covering the oily interface. The results by Gould, Vieira and Wolf, (2013) (see above) also showed that only a small particle size fraction (<2 µm) from cocoa would be adsorbed onto the surface of the oil droplets (d 3.2 approximately 10 µm).
Несмотря на меньшее количество частиц Пикеринга на поверхности раздела м/в в эмульсиях, стабилизированных с помощью комплекса PHF-целлюлоза, были получены аналогичные уровни устойчивости, что указывает на возможность влияния других поверхностно-активных соединений на обеспечение дополнительной устойчивости капель. Сообщается, что для обеспечения эффективной защиты от коалесценции в течение нескольких месяцев требуется покрыть частицами капли масла только на 20% (Binks et al, 2005 Naturally Occurring Spore Particles at Planar Fluid Interfaces and in Emulsions. Langmuir 21(18), pp. 8161–8167). Однако в случае комплекса PHF-целлюлоза (фиг. 14) некоторые капли вообще не содержали частиц.Despite the lower number of Pickering particles at the O/W interface, emulsions stabilized with PHF-cellulose complex achieved similar levels of stability, indicating that other surfactants may be involved in providing additional droplet stability. It has been reported that only 20% particle coverage of oil droplets is required to provide effective coalescence protection for several months (Binks et al, 2005 Naturally Occurring Spore Particles at Planar Fluid Interfaces and in Emulsions. Langmuir 21(18), pp. 8161– 8167). However, in the case of the PHF-cellulose complex (FIG. 14), some of the droplets contained no particles at all.
При первой попытке измерения присутствия белков на поверхности раздела эмульсию окрашивали красителем Fast Green, который флуоресцирует при контакте с белками, но сигнал не был получен. Однако отсутствие сигнала не было достаточным доказательством отсутствия белков на поверхности раздела из-за пределов обнаружения при таких низких концентрациях.In the first attempt to measure the presence of proteins at the interface, the emulsion was stained with Fast Green, which fluoresces when in contact with proteins, but no signal was obtained. However, the absence of a signal was not sufficient evidence for the absence of proteins at the interface due to the limits of detection at such low concentrations.
Наличие белков в растворимой и нерастворимой фазахPresence of proteins in soluble and insoluble phases
Таблица 7. Композиция эмульсий м/в, приготовленных с использованием обработанного ферментами PHF, и контрольного образца. Контрольный образец был приготовлен с использованием PHF, которое обрабатывали в тех же условиях без добавления ферментаTable 7. Composition of O/W emulsions prepared using enzyme-treated PHF and control. A control sample was prepared using PHF, which was processed under the same conditions without the addition of an enzyme.
aНа основе данных Брэдфорда a Based on data from Bradford
bНа основе данных Кьелдала, взятых из RDLS-RD170010-00 b Based on Kjeldahl data from RDLS-RD170010-00
Хотя с помощью CLSM не было выявлено ни одного белка, а устойчивость капель масла не зависела от pH, нельзя исключать участие белков, поскольку они присутствовали в значительных количествах (от 0,8 до 0,7 мг на 1 г масла в случае комплекса PHF-пектин+целлюлоза и PHF-целлюлоза, таблица 7). Более того, стабильными были только эмульсии с наиболее высоким содержанием белка (таблица 7).Although no proteins were detected by CLSM, and the stability of the oil droplets was independent of pH, the involvement of proteins cannot be ruled out, since they were present in significant amounts (from 0.8 to 0.7 mg per 1 g of oil in the case of the PHF- pectin+cellulose and PHF-cellulose, table 7). Moreover, only the emulsions with the highest protein content were stable (Table 7).
Растворимая (надосадочная жидкость) и нерастворимая фазы (осадок) дисперсий PHF (PHF-целлюлоза и PHF-пектин+целлюлоза) дополнительно анализировали с помощью SDS-PAGE, чтобы определить, остаются ли белки в растворимой или нерастворимой фракции (фиг. 15). Гели SDS показали, что в растворимой фазе белки отсутствовали или присутствовали только в следовых количествах (полосы 1–5). Анализ SDS осадков показал, что практически весь доступный белок оставался в нерастворимой фазе (фиг. 15, полоса 8–12). Инактивированные ферменты, которые добавляли к контрольному образцу до инкубации в течение 16 ч, были показаны в виде низкомолекулярного материала в полосах 8 и 11, вероятно, из-за разложения эндогенными ферментами, присутствующими в PHF. Протеолитическую активность эндогенных ферментов в PHF ранее подтверждали путем анализа протеазной активности (таблица 7). Активные ферменты в сворачиваемой форме, по-видимому, были устойчивы к протеолитической активности.The soluble (supernatant) and insoluble phases (precipitate) of the PHF dispersions (PHF-cellulose and PHF-pectin+cellulose) were further analyzed by SDS-PAGE to determine whether proteins remained in the soluble or insoluble fraction (FIG. 15). The SDS gels showed that proteins were absent in the soluble phase or were present only in trace amounts (
Для того чтобы сделать выводы из этого эксперимента, было показано, что белки остаются в нерастворимой фазе, следовательно, с частицами PHF, но неясно, связаны ли оба компонента или они присутствуют в виде отдельных компонентов.In order to draw conclusions from this experiment, the proteins were shown to remain in an insoluble phase, hence with the PHF particles, but it is not clear whether both components are related or whether they are present as separate components.
Таблица 8. Описание полос на фиг. 15Table 8. Description of the strips in FIG. fifteen
Оценка роли фермента в стабилизации эмульсии «масло в воде»Evaluation of the role of the enzyme in the stabilization of the oil-in-water emulsion
Четкая корреляция между содержанием фермента в эмульсии и устойчивостью стала причиной исследования стабилизирующих эмульсию свойств ферментов. Ферменты представляют собой белки и могут частично обуславливать эмульгирующий эффект вследствие своей естественной амфифильности. Данную гипотезу тестировали путем приготовления контрольных дисперсий PHF, содержащих активные и инактивированные ферменты с PHF и без него. В следующих экспериментах было продолжено применение только комплекса PHF-пектин+целлюлоза, поскольку с помощью такой обработки получали больше частиц Пикеринга, которые представляют особый интерес для данного исследования.The clear correlation between the enzyme content in the emulsion and stability has led to the investigation of the emulsion-stabilizing properties of enzymes. Enzymes are proteins and may contribute in part to the emulsifying effect due to their natural amphiphilicity. This hypothesis was tested by preparing PHF control dispersions containing active and inactivated enzymes with and without PHF. In the following experiments, only the PHF-pectin+cellulose complex was continued, since more Pickering particles were obtained with this treatment, which are of particular interest for this study.
Таблица 9. Обзор экспериментальных условий для эмульсий, приготовленных с активными и инактивированными ферментами (пектин+целлюлоза)Table 9. Overview of experimental conditions for emulsions prepared with active and inactivated enzymes (pectin + cellulose)
aВ данном случае концентрацию белка в мл водной фазы оценивали по содержанию белка в ферментах, предоставленных поставщиком (14 мас.% и 7,5 мас.% для целлюлозы и пектина соответственно.) a In this case, the protein concentration in ml of the aqueous phase was estimated from the protein content of the enzymes provided by the supplier (14 wt.% and 7.5 wt.% for cellulose and pectin, respectively.)
Интересно, что в активной и растворимой форме ферменты не демонстрировали никаких эмульгирующих свойств, но когда их подвергали термообработке (100°C в течение 10 минут) для инактивации, они превращались в поверхностно-активные вещества и стабилизировали эмульсию как в присутствии, так и в отсутствие PHF в течение по меньшей мере 4 недель. С помощью результатов этого эксперимента удалось создать вторую основную гипотезу этого исследования, а именно, о стимуляции денатурированными ферментами свойств, стабилизирующих эмульсию.Interestingly, in the active and soluble form, the enzymes did not show any emulsifying properties, but when they were subjected to heat treatment (100°C for 10 minutes) to inactivate, they converted to surfactants and stabilized the emulsion in both the presence and absence of PHF for at least 4 weeks. With the help of the results of this experiment, it was possible to create the second main hypothesis of this study, namely, the stimulation of emulsion-stabilizing properties by denatured enzymes.
В связи с этим было также было выдвинуто предположение о влиянии прямых взаимодействий фермента с частицами PHF на повышенную функциональность частиц PHF на поверхности раздела м/в. Ферменты являются катализаторами биохимических реакций и должны находиться в физическом контакте со своим субстратом для инициирования гидролиза. Крепление фермента к субстрату обычно опосредовано связывающим углевод доменом, который состоит из нескольких ароматических аминокислотных последовательностей (публикация Levy, Shani, and Shoseyov, 2002 Biomolecular Engineering, 19(1), pp. 17–30, включенная в настоящий документ путем ссылки; публикация Shoseyov, Shani and Levy, 2006 Microbiology and Molecular Biology Reviews, 70(2), pp. 283–295, включенная в настоящий документ путем ссылки). Соединение CBM с субстратом осуществляется посредством водородных связей, гидрофобных, а также слабых электростатических взаимодействий с углеводом, и сильно зависит от укладки белка (публикация Boraston et al, 2004 Biochemical Journal, 382(3), pp. 769–781, включенная в настоящий документ путем ссылки). После денатурации фермент разворачивается и теряет свою третичную (и часто вторичную) структуру. Из-за этого явления появляются гидрофобные группы на поверхности белка (публикация Daniel, Dines and Petach, 1996 Biochemical Journal, 317(1), pp. 1–11, включенная в настоящий документ путем ссылки). Хотя природа взаимодействия PHF-фермент остается неясной, из-за термообработки могли потенциально возникнуть конформационные изменения фермента на поверхности частицы с обеспечением амфифильности поверхности частицы. Это может объяснить более высокую аффинность частиц PHF к поверхности раздела м/в.In this regard, it was also suggested that direct interactions of the enzyme with PHF particles affect the increased functionality of PHF particles at the O/W interface. Enzymes are catalysts for biochemical reactions and must be in physical contact with their substrate to initiate hydrolysis. Enzyme attachment to the substrate is usually mediated by a carbohydrate-binding domain that consists of several aromatic amino acid sequences (Levy, Shani, and Shoseyov, 2002 Biomolecular Engineering, 19(1), pp. 17–30, incorporated herein by reference; Shoseyov , Shani and Levy, 2006 Microbiology and Molecular Biology Reviews, 70(2), pp. 283-295, incorporated herein by reference). The attachment of the CBM to the substrate is via hydrogen bonding, hydrophobic as well as weak electrostatic interactions with the carbohydrate, and is highly protein folding dependent (Boraston et al, 2004 Biochemical Journal, 382(3), pp. 769–781, incorporated herein by reference). After denaturation, the enzyme unfolds and loses its tertiary (and often secondary) structure. Due to this phenomenon, hydrophobic groups appear on the surface of the protein (Daniel, Dines and Petach, 1996 Biochemical Journal, 317(1), pp. 1-11, incorporated herein by reference). Although the nature of the PHF-enzyme interaction remains unclear, due to heat treatment, conformational changes of the enzyme on the surface of the particle could potentially occur due to the amphiphilic nature of the particle surface. This may explain the higher affinity of PHF particles for the O/W interface.
Эмульгирующие свойства «не содержащих белка» частиц PHFEmulsifying properties of "protein-free" PHF particles
Для того чтобы проверить, обусловлена ли стабильность капель в основном инактивированным ферментом, необходимо подтвердить, что модифицированные частицы PHF сами по себе не оказывают какого-либо влияния. Основная трудность такого доказательства состояла в получении обработанных ферментами частиц без присутствия остаточных ферментов.In order to check whether the stability of the droplets is mainly due to the inactivated enzyme, it is necessary to confirm that the modified PHF particles themselves do not have any effect. The main difficulty in this proof was to obtain enzyme-treated particles without the presence of residual enzymes.
Таблица 10. Обзор экспериментальных условий для эмульсий, приготовленных с использованием термообработанного BSATable 10. Overview of experimental conditions for emulsions prepared using heat treated BSA
Удаление активного растворимого фермента после инкубации путем его промывки цитратно-фосфатным буферным раствором при температуре инкубации (50°C) представляет собой хороший способ предотвращения инактивации фермента после обработки и получения частиц со схожими свойствами. Более того, было доказано, что ферменты в активной форме не обладают эмульгирующими свойствами (таблица 9). Эмульсия не была стабильной ни в одном из случаев (таблица 10). Это подтвердило отсутствие зависимости между адсорбцией мелких частиц PHF на поверхности раздела м/в и наличием инактивированных ферментов.Removing active soluble enzyme after incubation by washing it with citrate-phosphate buffer at incubation temperature (50°C) is a good way to prevent enzyme inactivation after treatment and obtain particles with similar properties. Moreover, it has been proven that enzymes in their active form do not have emulsifying properties (Table 9). The emulsion was not stable in any of the cases (Table 10). This confirmed the absence of a relationship between the adsorption of small PHF particles on the O/W interface and the presence of inactivated enzymes.
Альтернативные источники белка для функционализации частицAlternative protein sources for particle functionalization
Таблица 11. Обзор экспериментальных условий для эмульсий, приготовленных с использованием термообработанного BSA, содержащих и не содержащих PHFTable 11. Overview of experimental conditions for emulsions prepared using heat-treated BSA, containing and not containing PHF
мг/млProtein concentration in the aqueous phase
mg/ml
Все белки, даже не обладающие каталитической активностью, как правило, адсорбируются на поверхностях, присутствующих в одной и той же системе (Murray et al., 2011 (см. выше)). Контрольные образцы, содержащие бычий сывороточный альбумин (BSA) в концентрациях белка, эквивалентных концентрациям ферментов, готовили при различных значениях pH для оценки преимуществ инактивированных целлюлозы и пектина по сравнению с другими белками в отношении функционализации частиц PHF в поверхностно-активные стабилизаторы эмульсии.All proteins, even those without catalytic activity, tend to be adsorbed on surfaces present in the same system (Murray et al., 2011 (see above)). Control samples containing bovine serum albumin (BSA) at protein concentrations equivalent to enzyme concentrations were prepared at various pH values to evaluate the advantages of inactivated cellulose and pectin over other proteins in functionalizing PHF particles into surfactant emulsion stabilizers.
Контрольные образцы, содержащие BSA, не были стабильными при концентрациях белка, эквивалентных обработанным ферментами образцам (таблица 11). Стабилизацию наблюдали только при концентрациях BSA, в 10 раз превышающих (5,14 мг/мл) концентрации в обработанных ферментами образцах. Кроме того, образцы, полученные с использованием BSA, были чувствительны к изменениям температуры и pH, и это отражалось в появлении видимого осадка после термообработки при pH 5 (фиг. 16A). Появление осадка в эмульсиях, стабилизированных BSA при pH 5, относится к уменьшению электростатического отталкивания между белками вблизи изоэлектрической точки (IEP, pH 5 для BSA), а также к увеличению гидрофобных взаимодействий вследствие термической обработки (публикация Evans, Ratcliffe, Williams, 2013 Current Opinion in Colloid & Interface Science, 18(4), pp. 272–282 (включена в настоящий документ путем ссылки); публикация McClements, 2004 Current Opinion in Colloid & Interface Science, 9(5), pp. 305–313 (включена в настоящий документ путем ссылки), публикация Medda, Monduzzi and Salis, 2015 Chemical Commuications., 51(30), pp. 6663–6666 включена в настоящий документ путем ссылки). Только термообработанный BSA был способен стабилизировать капли, несмотря на переход в нерастворимую форму (фиг. 16B), но в отношении эмульсий, стабилизированных смесями PHF и BSA при pH 5, из-за осаждения в конечном итоге происходила дестабилизация эмульсии через одну неделю (фиг. 16A).Control samples containing BSA were not stable at protein concentrations equivalent to enzyme-treated samples (Table 11). Stabilization was only observed at 10 times the BSA concentrations (5.14 mg/mL) of the enzyme-treated samples. In addition, samples prepared using BSA were sensitive to changes in temperature and pH, and this was reflected in the appearance of a visible precipitate after heat treatment at pH 5 (Fig. 16A). The appearance of precipitation in emulsions stabilized with BSA at
Механизм Пикеринга, наблюдаемый для обработанных ферментами PHF, может быть дополнен предварительным уменьшением размера частиц за счет каталитической активности ферментов, с образованием частиц достаточно малого размера (<30 мкм) для адсорбции на поверхности раздела. Поверхностно-активные частицы Пикеринга не образовывались при совместной инкубации PHF и BSA, главным образом из-за отсутствия снижения размера частиц и, возможно, также из-за низкой аффинности BSA к PHF по сравнению с ферментами. Результаты данного исследования указывают на потенциальную возможность применения аффинности фермента к субстрату в качестве новой стратегии создания пищевых функциональных белково-углеводных комплексов.The Pickering mechanism observed for enzyme-treated PHFs can be supplemented by a preliminary reduction in particle size due to the catalytic activity of the enzymes, producing particles small enough (<30 µm) to be adsorbed at the interface. Surfactant Pickering particles were not formed when PHF and BSA were co-incubated, mainly due to the lack of particle size reduction and possibly also due to the low affinity of BSA for PHF compared to enzymes. The results of this study point to the potential use of enzyme-substrate affinity as a new strategy for the creation of nutritional functional protein-carbohydrate complexes.
Выводыconclusions
3.1. Заключение3.1. Conclusion
Обработанные ферментами PHF в виде стабилизаторов эмульсий Пикеринга м/вEnzyme-treated PHF as Pickering emulsion stabilizers O/W
Воздействие коммерческих пектиназ и целлюлаз в концентрациях 1169–3682,2 Ед/г PHF выразилось в существенном уменьшении размера частиц (с 87,2 до <30 мкм) и образовании поверхностно-активных участков с возможностью адсорбции частиц на поверхности раздела м/в и действия в роли стабилизаторов эмульсии м/в. Эмульсии м/в (50% об./об. масла) готовили с низкими концентрациями обоих обработанных PHF (0,4% масса/объем) и фермента (0,01% масса/объем), но несмотря на это отстоявшиеся капли масла (10–500 мкм) были устойчивы к коалесценции в широком диапазоне pH (3,0–8,0) в течение по меньшей мере четырех недель.Exposure to commercial pectinases and cellulases at concentrations of 1169–3682.2 U/g PHF resulted in a significant reduction in particle size (from 87.2 to <30 µm) and the formation of surfactant sites with the possibility of particle adsorption at the O/W interface and action as emulsion stabilizers m/w. O/W emulsions (50% v/v oil) were prepared with low concentrations of both treated PHF (0.4% w/v) and enzyme (0.01% w/v), but despite this settled oil droplets ( 10–500 µm) were resistant to coalescence over a wide pH range (3.0–8.0) for at least four weeks.
Без ограничений, накладываемых какой-либо теорией, функциональные свойства этих модифицированных PHF усиливались главным образом за счет изменения исходной формы добавленных ферментов и их взаимодействия с малыми частицами PHF, а не за счет появления гидрофобных полимерных групп на поверхности частицы PHF, как это первоначально предполагалось в данном исследовании. Два интересных наблюдения были сделаны в отношении стабилизирующих свойств обработанных ферментами PHF.Without being limited by any theory, the functional properties of these modified PHFs were enhanced primarily by changing the original shape of the added enzymes and their interaction with the small PHF particles, rather than by the appearance of hydrophobic polymeric groups on the surface of the PHF particle, as originally thought in this study. Two interesting observations were made regarding the stabilizing properties of enzyme-treated PHF.
1. Активные в отношении волокон ферменты, присутствующие в дисперсии, становились отличными эмульгаторами после денатурации, что можно объяснить появлением гидрофобных групп на поверхности из-за разворачивания белка.1. The fiber-active enzymes present in the dispersion became excellent emulsifiers after denaturation, which can be explained by the appearance of hydrophobic groups on the surface due to protein unfolding.
2. Благодаря взаимодействию между этими ферментами и небольшими расщепленными PHF происходит образование пищевых стабилизаторов эмульсии Пикеринга.2. Through the interaction between these enzymes and small cleaved PHFs, food stabilizers of the Pickering emulsion are formed.
В целом показано, что частицы PHF сами по себе не обладают поверхностной активностью, но функционализированные частицы PHF в комплексе с денатурированными ферментами обладают поверхностной активностью и выступают в качестве частиц Пикеринга. Функционализированные частицы PHF могут формировать комплексы фермент-PHF, которые выступают в качестве частиц Пикеринга. Ферменты могут все еще быть прикрепленными к поверхности PHF и выступать в качестве белкового структурного компонента, закрепляющего частицу на поверхности раздела «масло/вода».In general, it has been shown that PHF particles themselves do not have surface activity, but functionalized PHF particles in combination with denatured enzymes have surface activity and act as Pickering particles. Functionalized PHF particles can form enzyme-PHF complexes that act as Pickering particles. The enzymes may still be attached to the surface of the PHF and act as a proteinaceous structural component anchoring the particle to the oil/water interface.
Способ изготовления поверхностно-активных частиц посредством взаимодействия частицы-белок не может быть использован для других белков, таких как BSA, при заданных условиях.The method of making surfactant particles by particle-protein interaction cannot be used for other proteins such as BSA under given conditions.
Пример 2. Растительные волокна с низким содержанием целлюлозыExample 2 Low Cellulose Vegetable Fibers
Испытывали различные растительные волокна, а именно волокна кожуры гороха (PHF), богатые пектином яблочные волокна, не содержащие целлюлозы пшеничные волокна.Various plant fibers were tested, namely pea skin fibers (PHF), pectin-rich apple fibers, cellulose-free wheat fibers.
Те же ферменты (Pectinex и Celluclast) и другие ферменты (протеаза [Alcalase® от компании Sigma-Aldrich — в настоящее время Merck], α-амилаза [Mats L Classic от компании DSM] и ксиланаза) проверяли на способность функционализировать эти волоконные частицы и на способность обработанных ферментами волоконных частиц стабилизировать масляные капли эмульсии.The same enzymes (Pectinex and Celluclast) and other enzymes (protease [Alcalase® from Sigma-Aldrich - now Merck], α-amylase [Mats L Classic from DSM] and xylanase) were tested for the ability to functionalize these fiber particles and on the ability of the fiber particles treated with enzymes to stabilize the oil droplets of the emulsion.
Условия инкубации: 10% TS, pH 5, 50°C, 16 ч, доза фермента: 51,4 мг белка / г волокна. Температура и рН соответствуют оптимальным условиям для всех ферментов. Инактивация фермента: кипячение в течение 10 мин.Incubation conditions: 10% TS,
«Устойчивость эмульсии»: 1 мл обработанных ферментами волокон (10 мас.%, в буфере с pH 5, если не указано иное) добавляют к 10 мл водной фазы, pH 5, эмульсий 50% м/в. Эмульсию встряхивали вручную в течение 10 секунд. Устойчивость оценивали по устойчивости больших отстоявшихся капель масла к коалесценции в течение 9 недель."Emulsion stability": 1 ml of enzyme-treated fibers (10 wt%, in
Результатыresults
Стандартный образец. Эмульсии 50% об./об. м/в, содержащие 0,4% (масса/объем) волокон кожуры гороха (PHF), обработанных Pectinex и Celluclast (пектин+целлюлоза)Standard sample.
PHF, обработанные не расщепляющими волокна ферментамиPHF Treated with Non-Fiber Digesting Enzymes
Эмульсии, содержащие 0,4% (масса/объем) PHF, обработанные не расщепляющими волокна ферментами (Alcalase® 2.4 L, MATS L CLASSIC (DSM)) или только инактивированные ферменты были нестабильными (фиг. 21). Однако поверхностная активность только ферментов после термообработки является ключевым требованием для выполнения функционализации, независимо от основной активности фермента.Emulsions containing 0.4% (w/v) PHF treated with non-fibre-degrading enzymes (Alcalase® 2.4 L, MATS L CLASSIC (DSM)) or only inactivated enzymes were unstable (FIG. 21). However, the surface activity of only enzymes after heat treatment is a key requirement to perform functionalization, regardless of the underlying activity of the enzyme.
Яблочные волокна, обработанные Pectinex и CelluclastApple fibers treated with Pectinex and Celluclast
Эмульсии, содержащие 0,4% (масса/объем) яблочных волокон, обработанных Pectinex и Celluclast (AF-пектин+целлюлоза), были нестабильными (фиг. 22A и фиг. 23A). Однако все контроли [только инактивированный фермент (фиг. 23B), яблочные волокна (AF) с инактивированными ферментами (фиг. 23C) или только AF (фиг. 3D)] были стабильными, что указывает на взаимодействие определенных соединений, присутствующих в AF, с активными ферментами и изменение их функциональности во время инкубации.Emulsions containing 0.4% (w/v) apple fibers treated with Pectinex and Celluclast (AF-pectin+cellulose) were unstable (Fig. 22A and Fig. 23A). However, all controls [enzyme-inactivated only (Fig. 23B), enzyme-inactivated apple fibers (AF) (Fig. 23C), or AF alone (Fig. 3D)] were stable, indicating an interaction of certain compounds present in AF with active enzymes and changes in their functionality during incubation.
Стабилизирующий эффект в образцах, содержащих только AF, был, предположительно, обусловлен растворимой фракцией пектина в AF. Отсутствие стабилизирующего эффекта в обработанных образцах было связано с разрушением пектинов под воздействием пектиназ.The stabilizing effect in samples containing only AF was presumably due to the soluble fraction of pectin in AF. The absence of a stabilizing effect in the treated samples was associated with the destruction of pectins under the influence of pectinases.
Дополнительный анализ показал, что стабилизирующий агент расположен в нерастворимой фазе (фиг. 22C) гидратированных AF и что он также является нерастворимой фазой, которая содержит влияющие на функциональность соединения (фиг. 22E). Термообработка (кипячение, 15 минут) AF перед ферментативной реакцией для инактивации потенциальных нативных протеаз в AF не изменяла результат.Additional analysis showed that the stabilizing agent is located in the insoluble phase (FIG. 22C) of the hydrated AF and that it is also the insoluble phase that contains the functionally affecting compounds (FIG. 22E). Heat treatment (boiling, 15 minutes) of AF prior to enzymatic reaction to inactivate potential native proteases in AF did not change the result.
Растворимая фаза дисперсий AF не стабилизировала эмульсии (фиг. 22B), но при обработке комплексом пектин+целлюлоза наблюдали некоторые стабильные капли (фиг. 22D), что можно объяснить наличием денатурированных, поверхностно-активных комплексов пектин+целлюлоза.The soluble phase of the AF dispersions did not stabilize the emulsions (FIG. 22B), but some stable droplets were observed upon treatment with the pectin+cellulose complex (FIG. 22D), which can be explained by the presence of denatured, surfactant pectin+cellulose complexes.
Пшеничные волокна, обработанные Depol 740 LWheat fibers treated with Depol 740 L
Эмульсии, содержащие 0,4% (масса/объем) пшеничных волокон (WF), обработанных ферулоилэстеразой, а именно Depol 740 L (D740 L) (бета-глюканаза с ферулоилэстеразной и ксиланазной побочными активностями, продаваемая компанией Biocatalysts, Великобритания), были нестабильными (фиг. 24B), при этом контроли с инактивированным D740 L были стабильными (фиг. 24A). Как было отмечено ранее для AF-пектин+целлюлоза, определенные соединения в WF, по-видимому, ингибируют поверхностную активность D740 L. Однако, когда D740 L заменяли ферментами пектин+целлюлоза, этот ингибирующий эффект отсутствовал (фиг. 24C), что указывает на то, что ингибирование является специфичным в отношении фермента/субстрата.Emulsions containing 0.4% (w/v) wheat fiber (WF) treated with feruloylesterase namely Depol 740 L (D740 L) (beta-glucanase with feruloylesterase and xylanase side activities sold by Biocatalysts, UK) were unstable (Fig. 24B), while the controls with inactivated D740 L were stable (Fig. 24A). As previously noted for AF-pectin+cellulose, certain compounds in WF appear to inhibit the surface activity of D740 L. However, when D740 L was replaced with pectin+cellulose enzymes, this inhibitory effect was absent (Fig. 24C), indicating that the inhibition is enzyme/substrate specific.
Волокна кожуры гороха, обработанные комплексом пектин+целлюлоза, регулировка pH перед термообработкойPea skin fibers treated with pectin+cellulose complex, pH adjusted before heat treatment
Дополнительный эксперимент проводили с использованием PHF и комплекса пектин+целлюлоза, в котором pH доводили до 2,0 или 11,0 перед термообработкой (HT), чтобы понять, изменяет ли это взаимодействие фермент-частица и могут ли такие частицы по-прежнему стабилизировать масляные капли.An additional experiment was performed using PHF and a pectin+cellulose complex in which the pH was adjusted to 2.0 or 11.0 before heat treatment (HT) to see if this enzyme-particle interaction changes and if such particles can still stabilize oil drops.
Независимо от pH перед HT, получали стабильные масляные капли. Для дисперсий PHF, доведенных до pH 11,0, поверхностной активности достигали без термообработки, вероятнее всего из-за индуцированной рН денатурации. Это не относилось к образцам, доведенным до pH 2,0 перед HT.Regardless of the pH before HT, stable oil drops were obtained. For PHF dispersions adjusted to pH 11.0, surface activity was achieved without heat treatment, most likely due to pH-induced denaturation. This did not apply to samples brought to pH 2.0 prior to HT.
Выводыconclusions
- Способ функционализации комплекса PHF-пектин+целлюлоза не работал с яблочными волокнами (волокна с высоким содержанием пектина) или пшеничными волокнами (волокна с низким содержанием целлюлозы или не содержащие целлюлозу) или с ферментами, которые не были способны расщеплять пищевое волокно.- The PHF-pectin+cellulose complex functionalization method did not work with apple fibers (high pectin fibers) or wheat fibers (low or no cellulose fibers) or with enzymes that were not able to break down dietary fiber.
Пример 3. Кухонные прототипы. Жидкие забеливатели для кофе и органолептические испытанияExample 3: Kitchen Prototypes. Liquid coffee whiteners and sensory testing
Предварительные органолептические испытания показали хорошее восприятие жидких забеливателей для кофе, приготовленных с обработанным ферментом PHF в качестве альтернативных эмульгаторов для казеината натрия.Preliminary organoleptic tests have shown good acceptance of liquid coffee whiteners prepared with PHF enzyme treated as alternative emulsifiers for sodium caseinate.
Обработанные ферментами PHF (PHF-пектин+целлюлоза) тестировали в выбранном прототипе продукта. Жидкие забеливатели для кофе выбирали в качестве модельной системы для оценки потенциала обработанных ферментами (функционализированных) волокон кожуры гороха (и денатурированного фермента) в качестве стабилизаторов эмульсии и сравнивали их стабилизирующие характеристики с традиционным эмульгатором казеинатом натрия. Упрощенная рецептура для экспериментального жидкого забеливателя показана в таблице 12.Enzymatically treated PHFs (PHF-pectin+cellulose) were tested in a selected prototype product. Liquid coffee whiteners were chosen as a model system to evaluate the potential of enzyme-treated (functionalized) pea skin fibers (and denatured enzyme) as emulsion stabilizers and compared their stabilizing performance to the traditional emulsifier sodium caseinate. A simplified formulation for the experimental liquid creamer is shown in Table 12.
Предварительные испытания выполняли путем приготовления эмульсий с постоянным количеством обработанного PHF (0,5 мл на 10 мл эмульсии) и различным соотношением масла и воды. Эмульсии смешивали с помощью Ultra-turax при двух разных скоростях сдвига (13 000 и 22 000 1/мин). Эмульсию дестабилизировали в двухслойной системе, причем высота слоя сливок прямо пропорциональна объемной доле масла. В связи с проведением стадии гомогенизации при более высоких скоростях сдвига размер капель существенно уменьшился по сравнению с ранее приготовленными эмульсиями 50% м/в, полученными путем ручного встряхивания, как показано на фиг. 17. Размер капель по-прежнему находился в диапазоне 50 мкм. Считается, что эти относительно большие масляные капли способны усиливать вкус / улучшать покрытие полости рта (фиг. 18).Preliminary tests were carried out by preparing emulsions with a constant amount of treated PHF (0.5 ml per 10 ml of emulsion) and various ratios of oil and water. The emulsions were mixed with Ultra-turax at two different shear rates (13,000 and 22,000 1/min). The emulsion was destabilized in a two-layer system, the height of the cream layer being directly proportional to the oil volume fraction. Due to the homogenization step being carried out at higher shear rates, the droplet size was significantly reduced compared to previously prepared 50% w/w hand shake emulsions, as shown in FIG. 17. The droplet size was still in the 50 µm range. These relatively large oil droplets are believed to be able to enhance flavor/improve oral coverage (FIG. 18).
Затем в экспериментальной кухне получали пять различных составов путем частичного или полного замещения казеината натрия в жидких забеливателях, который представляет собой основной эмульгатор, используемый в настоящее время, с различными концентрациями PHF (таблица 12).Five different formulations were then made in the experimental kitchen by partial or total replacement of sodium caseinate in liquid creamers, which is the main emulsifier currently used, with different concentrations of PHF (Table 12).
Таблица 12. Составы прототипов жидких забеливателей и стандартного образцаTable 12. Formulations of liquid creamer prototypes and reference material
aВ данном случае PHF относится к комплексу PHF-пектин+целлюлоза a In this case, PHF refers to the complex PHF-pectin + cellulose
8 дегустаторам было предложено провести органолептическую оценку для получения информации о устойчивости, вкусе, ощущении во рту и внешнем виде жидких забеливателей, стабилизированных обработанным ферментами PHF в соответствии с настоящим изобретением по сравнению со стандартным образцом. Дегустаторам было предложено пять различных опытных образцов и один контрольный, который и в этом случае являлся стандартным образцом для оценивания достоверности этого испытания.8 tasters were asked to perform a sensory evaluation to obtain information on the stability, taste, mouthfeel and appearance of the liquid creamers stabilized with the enzyme-treated PHF according to the present invention compared to a standard sample. The tasters were offered five different test samples and one control, which in this case was the standard sample for evaluating the reliability of this test.
Изображения забеливателей представлены на фиг. 19. Благодаря замене казеината натрия волокном кожуры гороха получали слегка бежевый цвет. Во всех образцах наблюдали образование сливок, которое было наиболее выраженным в образцах C и D. Смесь PHF и казеината натрия 50 : 50 скрывала все неблагоприятные влияния на внешний вид.Images of whiteners are shown in Fig. 19. Replacing sodium caseinate with pea skin fiber resulted in a slightly beige color. Creaming was observed in all samples, which was most pronounced in samples C and D. The mixture of PHF and sodium caseinate 50:50 masked any adverse effects on appearance.
То же справедливо и для образцов, приготовленных с кофе и забеливателем (фиг. 20).The same is true for samples prepared with coffee and creamer (Fig. 20).
Согласно комментариям дегустаторов было выявлено общее хорошее органолептическое восприятие жидких забеливателей, приготовленных с использованием PHF, по сравнению со стандартным образцом.According to the comments of the tasters, an overall good organoleptic perception of liquid creamers prepared using PHF was found compared to a standard sample.
Главными преимуществами жидких забеливателей, стабилизированных PHF, было бы замещение традиционных эмульгаторов волокнами в качестве альтернативы, подходящей под определение «чистой этикетки». Функциональное преимущество заключается в предположительном наличии капель масла большего размера, благодаря которому будет лучшее ощущение во рту. Другим преимуществом является неполное покрытие поверхности, которое способствует увеличению переноса массы между масляной и водной фазой и способно захватывать агрессивные липофильные ароматические соединения (например, в кофе).The main advantages of PHF stabilized liquid creamers would be the replacement of traditional emulsifiers with fibers as a clean label alternative. The functional advantage is supposedly the presence of larger oil droplets, which will give a better mouthfeel. Another advantage is the incomplete surface coverage, which helps to increase the mass transfer between the oil and water phase and is able to trap aggressive lipophilic aromatic compounds (eg in coffee).
Пример 4. Технические испытания «раствора кожуры гороха»Example 4 - Technical tests of "pea peel solution"
Испытания в масштабе кухни проводили на шоколадном муссе, чтобы увидеть, в какой степени обработанные PHF могут обеспечивать частичную/полную замену искусственных эмульгаторов и/или желатина.Kitchen scale trials were performed on chocolate mousse to see to what extent processed PHFs could provide a partial/total replacement for artificial emulsifiers and/or gelatin.
2-я скорость15 minutes /
2nd speed
Темный цвет. Не очень стабильнаWeak whipping, slight mousse collapse. Wrinkling is visible only on the surface
Dark color. Not very
2-я скорость15 minutes /
2nd speed
Быстрое взбивание. Аэрированная текстура. Не очень стабильна
Незначительное схлопывание во время дозирования. Отсутствуют пузырьки. Быстро принимает форму чашки.
Светлый цветLiquid texture before whipping at 4°C
Rapid whipping. Aerated texture. Not very stable
Slight collapse during dosing. There are no bubbles. Quickly takes the form of a cup.
2-я скорость15 minutes /
2nd speed
Сложно взбивается. Взбивание начинается через 10 минут.
Отсутствие устойчивости и отсутствие когезии ингредиентов
Всплытие пузырьков воздуха при дозировании
Темный цветliquid texture
Difficult to whip up. Whipping starts after 10 minutes.
Lack of stability and lack of cohesion of ingredients
Rise of air bubbles when dosing
2-я скорость15 minutes /
2nd speed
Быстрое взбивание
Более твердая текстура по сравнению с рецептурой № 2 — небольшой фигурный купол при дозировании
Небольшое схлопывание мусса
Светлый цвет (цвет мусса из молочного шоколада)The nature of whipping is similar to recipe No. 2
Quick Whipping
Firmer texture than Formulation #2 - slight dome when dosing
Slight mousse collapse
Light color (color of milk chocolate mousse)
2-я скорость15 minutes /
2nd speed
Сложно взбивается. Схлопнувшийся мусс. Очень темный цвет.Firm texture before whipping (when removed from refrigerator)
Difficult to whip up. Collapsing mousse. Very dark color.
2-я скорость15 minutes /
2nd speed
Очень жидкая текстура перед взбиванием
Текстура мусса только на поверхности. Жидкая текстура на дне чашки.No whipping
Very fluid texture before whipping
The mousse texture is only on the surface. Liquid texture at the bottom of the cup.
OR = значения взбитостиOR = overrun values
Изображения рецептур 1–6 шоколадного мусса в течение срока годности показаны сверху после удаления ложки мусса (фиг. 26) и спереди (фиг. 27).Images of chocolate mousse recipes 1-6 during the expiration date are shown from above after removing the mousse spoon (Fig. 26) and from the front (Fig. 27).
Все публикации, указанные в описании выше, включены в настоящий документ путем ссылки. Специалистам в данной области будут очевидны различные модификации и вариации описанных способов и системы настоящего изобретения, без выхода за рамки сущности и объема настоящего изобретения. Хотя настоящее изобретение описано в связи с конкретными предпочтительными вариантами осуществления, следует понимать, что заявленное изобретение не должно излишне ограничиваться такими конкретными вариантами осуществления. Фактически подразумевается, что в объем приведенной ниже формулы изобретения входят различные модификации описанных способов реализации изобретения, которые очевидны для специалистов в области биохимии и биотехнологии или родственных областях.All publications mentioned in the description above are incorporated herein by reference. Various modifications and variations of the described methods and systems of the present invention will be apparent to those skilled in the art without departing from the spirit and scope of the present invention. While the present invention has been described in connection with specific preferred embodiments, it should be understood that the claimed invention should not be unduly limited to such specific embodiments. In fact, the scope of the following claims is intended to include various modifications of the described methods for carrying out the invention, which are obvious to experts in the field of biochemistry and biotechnology or related fields.
Claims (5)
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP17209097.9 | 2017-12-20 | ||
EP17209097 | 2017-12-20 | ||
PCT/EP2018/085741 WO2019121852A1 (en) | 2017-12-20 | 2018-12-19 | Process for the preparation of pickering emulsion forming particles by derivatization of cellulose-rich dietary fibers with enzymes and emulsions prepared |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2020123211A RU2020123211A (en) | 2022-01-13 |
RU2784527C2 true RU2784527C2 (en) | 2022-11-28 |
Family
ID=
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE10043662A1 (en) * | 2000-08-30 | 2001-02-22 | Saechsisches Inst Fuer Angewan | Production of lignocellulosic fiber products, e.g. fiberboard, comprises treating the fibers with hydrolytic enzymes during or after disintegration to improve adhesion |
RU2287295C2 (en) * | 2004-06-28 | 2006-11-20 | Вячеслав Феодосьевич Король | Method for obtaining food product out of leguminous varieties |
US20090311376A1 (en) * | 2008-06-11 | 2009-12-17 | 21St Century Grain Processing | Method of producing modified whole grain oat flour and products containing modified whole grain oat flour |
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE10043662A1 (en) * | 2000-08-30 | 2001-02-22 | Saechsisches Inst Fuer Angewan | Production of lignocellulosic fiber products, e.g. fiberboard, comprises treating the fibers with hydrolytic enzymes during or after disintegration to improve adhesion |
RU2287295C2 (en) * | 2004-06-28 | 2006-11-20 | Вячеслав Феодосьевич Король | Method for obtaining food product out of leguminous varieties |
US20090311376A1 (en) * | 2008-06-11 | 2009-12-17 | 21St Century Grain Processing | Method of producing modified whole grain oat flour and products containing modified whole grain oat flour |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
TAMAYO TENORIO A. et al., Interfacial properties of green leaf cellulosic particles. Food Hydrocolloids, vol.71, October 2017, pp.8-16. DUOXIA XU et al., Impact of whey protein - Beet pectin conjugation on the physicochemical stability of b-carotene emulsions. Food Hydrocolloids, vol.28, August 2012, pp.258-266. DICKINSON E. Biopolymer-based particles as stabilizing agents for emulsions and foams. Food Hydrocolloids, vol.68, July 2017, pp.219-231. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11696596B2 (en) | Process for the preparation of pickering emulsion forming particles by derivatization of cellulose-rich dietary fibers with enzymes and emulsions prepared | |
JP4383052B2 (en) | Grain bran fractionation method | |
EP1706001B1 (en) | Soluble dietary fibre from oat and barley grains, method for producing a fraction rich in b-glucan and use of the fraction in foods, pharmaceuticals and cosmetics | |
Funami et al. | Structural modifications of sugar beet pectin and the relationship of structure to functionality | |
CN111836625A (en) | Process for preparing xyloglucan-oligosaccharides | |
Li et al. | Characterization of the composition and the techno-functional properties of mannoproteins from Saccharomyces cerevisiae yeast cell walls | |
EP2646474A2 (en) | Viscosity control in compositions comprising plant fiber materials | |
JP2022545650A (en) | Methods of processing biomass to produce oligosaccharides and related compositions | |
US6242237B1 (en) | Enzyme with galactanase activity | |
AU713323B2 (en) | An enzyme with galactanase activity | |
Miceli-Garcia | Pectin from apple pomace: extraction, characterization, and utilization in encapsulating alpha-tocopherol acetate | |
JP4116108B2 (en) | Polysaccharides excellent in emulsifying power derived from cell walls of grasses, emulsifiers and emulsification methods using the same | |
WO2006016685A1 (en) | Method for producing capsinoid-containing microcapsule | |
Nakamura et al. | Emulsifying properties of enzyme-digested soybean soluble polysaccharide | |
KR20200142089A (en) | Seaweed powder and its manufacturing method | |
CN113667034A (en) | Method for extracting citrus pectin by using complex enzyme | |
RU2784527C2 (en) | Method for production of particles forming pickering emulsion by derivatization of cellulose-enriched food fibers, using prepared enzymes and emulsions | |
CA3009315A1 (en) | Composition of cereal bran and enzyme | |
US6015840A (en) | Process for producing emulsifiers, and emulsified compositions | |
US9795154B2 (en) | Enzymatic treatment of gum arabic | |
Timira et al. | Potential use of yeast protein in terms of biorefinery, functionality, and sustainability in food industry | |
Louw | The development of polysaccharide degrading wine yeast strains | |
CN115915948A (en) | Method for treating protein-containing compositions |