RU2782428C1 - Multiparametric diagnostic test system for quantitative determination of mrna level of human rig-1, ifit-1, ifih-1 genes - Google Patents
Multiparametric diagnostic test system for quantitative determination of mrna level of human rig-1, ifit-1, ifih-1 genes Download PDFInfo
- Publication number
- RU2782428C1 RU2782428C1 RU2021139366A RU2021139366A RU2782428C1 RU 2782428 C1 RU2782428 C1 RU 2782428C1 RU 2021139366 A RU2021139366 A RU 2021139366A RU 2021139366 A RU2021139366 A RU 2021139366A RU 2782428 C1 RU2782428 C1 RU 2782428C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ifit
- ifih
- gene
- rig
- genes
- Prior art date
Links
- 101700022107 ROBO3 Proteins 0.000 title 1
- 101700064525 DDX58 Proteins 0.000 claims abstract description 67
- 102100013885 DDX58 Human genes 0.000 claims abstract description 67
- 101700084153 IFIT1 Proteins 0.000 claims abstract description 64
- 102100018939 IFIT1 Human genes 0.000 claims abstract description 64
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 claims abstract description 22
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 34
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 23
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 20
- 241000582786 Monoplex Species 0.000 description 19
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 16
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 14
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 14
- 101700082776 IFIH1 Proteins 0.000 description 12
- 102100018940 IFIH1 Human genes 0.000 description 12
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 10
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 238000004164 analytical calibration Methods 0.000 description 8
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 7
- 206010047461 Viral infection Diseases 0.000 description 7
- 208000001756 Virus Disease Diseases 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 7
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 6
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 6
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 6
- 208000006572 Human Influenza Diseases 0.000 description 5
- 206010022000 Influenza Diseases 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 102000002689 toll-like receptors Human genes 0.000 description 5
- 108020000411 toll-like receptors Proteins 0.000 description 5
- 108020004461 Double-Stranded RNA Proteins 0.000 description 4
- 229940047124 Interferons Drugs 0.000 description 4
- 210000003819 Peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 4
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 4
- 230000001086 cytosolic Effects 0.000 description 4
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 206010053983 Corona virus infection Diseases 0.000 description 3
- 102100003102 MAVS Human genes 0.000 description 3
- 101700018430 MAVS Proteins 0.000 description 3
- 206010057190 Respiratory tract infection Diseases 0.000 description 3
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 3
- 230000000840 anti-viral Effects 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 3
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 3
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional Effects 0.000 description 3
- 230000003612 virological Effects 0.000 description 3
- 206010059512 Apoptosis Diseases 0.000 description 2
- 210000000987 Immune System Anatomy 0.000 description 2
- 102000007578 Interferon Regulatory Factor-3 Human genes 0.000 description 2
- 108010032038 Interferon Regulatory Factor-3 Proteins 0.000 description 2
- 108060004605 MAL Proteins 0.000 description 2
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 2
- 102000004409 RNA helicases Human genes 0.000 description 2
- 108090000944 RNA helicases Proteins 0.000 description 2
- 206010061494 Rhinovirus infection Diseases 0.000 description 2
- 102100002499 TICAM2 Human genes 0.000 description 2
- 101710029703 TICAM2 Proteins 0.000 description 2
- 102100012038 TIRAP Human genes 0.000 description 2
- 230000001154 acute Effects 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 200000000015 coronavirus disease 2019 Diseases 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 description 2
- 244000052769 pathogens Species 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory Effects 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 102000003995 transcription factors Human genes 0.000 description 2
- 108090000464 transcription factors Proteins 0.000 description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 2
- 102000034451 ATPases Human genes 0.000 description 1
- 108091006096 ATPases Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 1
- 210000000349 Chromosomes Anatomy 0.000 description 1
- 229920001405 Coding region Polymers 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 210000000805 Cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 101700011961 DPOM Proteins 0.000 description 1
- 210000004443 Dendritic Cells Anatomy 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 206010014071 Ebola disease Diseases 0.000 description 1
- 201000011001 Ebola hemorrhagic fever Diseases 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N Ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000665 Exon Polymers 0.000 description 1
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 1
- 102100012864 GADD45B Human genes 0.000 description 1
- 101710037036 GADD45B Proteins 0.000 description 1
- 102100016790 HPRT1 Human genes 0.000 description 1
- 101710011940 HPRT1 Proteins 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- -1 IFIT -1 and IFIH-1) Proteins 0.000 description 1
- 101700001323 IRF3 Proteins 0.000 description 1
- 102100013275 IRF3 Human genes 0.000 description 1
- 101700061102 IRF7 Proteins 0.000 description 1
- 102100012835 IRF7 Human genes 0.000 description 1
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 1
- GRSZFWQUAKGDAV-FCIPNVEPSA-N Inosinic Acid Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 GRSZFWQUAKGDAV-FCIPNVEPSA-N 0.000 description 1
- 229940028843 Inosinic Acid Drugs 0.000 description 1
- 102000004289 Interferon Regulatory Factor-1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000890 Interferon Regulatory Factor-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon beta Proteins 0.000 description 1
- 229920002459 Intron Polymers 0.000 description 1
- 101700067074 MAPK Proteins 0.000 description 1
- 101710041325 MAPKAPK2 Proteins 0.000 description 1
- 101710029649 MDV043 Proteins 0.000 description 1
- 229920001776 Mature messenger RNA Polymers 0.000 description 1
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 1
- 241000710185 Mengo virus Species 0.000 description 1
- 210000001700 Mitochondrial Membranes Anatomy 0.000 description 1
- 210000004400 Mucous Membrane Anatomy 0.000 description 1
- 102000010168 Myeloid Differentiation Factor 88 Human genes 0.000 description 1
- 108010077432 Myeloid Differentiation Factor 88 Proteins 0.000 description 1
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 1
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 1
- 102100002692 NFKB1 Human genes 0.000 description 1
- 101700086102 NFKB1 Proteins 0.000 description 1
- 101700061424 POLB Proteins 0.000 description 1
- 210000002824 Peroxisome Anatomy 0.000 description 1
- 210000004043 Pneumocytes Anatomy 0.000 description 1
- 241000711902 Pneumovirus Species 0.000 description 1
- 101700054624 RF1 Proteins 0.000 description 1
- 102000030661 RLR family Human genes 0.000 description 1
- 108091014061 RLR family Proteins 0.000 description 1
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 206010038683 Respiratory disease Diseases 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 1
- 101710029702 TICAM1 Proteins 0.000 description 1
- 102100002498 TICAM1 Human genes 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 201000005794 allergic hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 1
- 229920002092 cellular RNA Polymers 0.000 description 1
- 108091006028 chimera Proteins 0.000 description 1
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cells Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 200000000003 influenza A Diseases 0.000 description 1
- 200000000004 influenza B Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 235000013902 inosinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004245 inosinic acid Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 102000007863 pattern recognition receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010089193 pattern recognition receptors Proteins 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000000861 pro-apoptotic Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective Effects 0.000 description 1
- 108700000006 regulatory domains Proteins 0.000 description 1
- 230000001718 repressive Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 101710024887 rl Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000001953 sensory Effects 0.000 description 1
- 230000001743 silencing Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 101700045897 spk-1 Proteins 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 244000052613 viral pathogens Species 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины и биохимии, в частности к молекулярной диагностике, а именно к многопараметрической диагностической тест-системе, и может быть использовано для количественного определения уровней мРНК генов RIG-1, IFIT-1, IFIH-1 человека в биологическом образце.The invention relates to medicine and biochemistry, in particular to molecular diagnostics, namely to a multi-parameter diagnostic test system, and can be used to quantify mRNA levels of human RIG-1, IFIT-1, IFIH-1 genes in a biological sample.
Первый защитный барьер против вирусной инфекции – это кожные покровы и слизистые оболочки организма хозяина. На первых этапах в ответ на проникновение вирусной инфекции происходит активация экстренного неспецифического иммунного ответа. Существуют различные пути распознавания клеткой вирусных частиц. Наибольшее значение принято отводить толл-подобным рецепторам (TLR). При проникновении вируса в цитоплазму в дело вступают RLR, NLR и цитозольные сенсоры нуклеиновых кислот [1]. Передача сигнала через TLR требует привлечения белковых адаптеров: MyD88 (Myeloid differentiation primary response gene 88), Mal (MyD88 adapter-like), TRIF (TIR-domain-containing adaptor inducing IFNβ) и TRAM (Trif-related adaptor molecule) [2]. Активация молекулярных адаптеров направлена на изменение активности факторов транскрипции (Nuclear factor κВ (NFκВ), IFN-regulatory factor 3 (IRF3), IFN-regulatory factor 7 (IRF7)) и активацию MAPK-зависимых сигнальных путей [1, 3].The first protective barrier against a viral infection is the skin and mucous membranes of the host organism. At the first stages, in response to the penetration of a viral infection, an emergency non-specific immune response is activated. There are various ways for a cell to recognize viral particles. Toll-like receptors (TLRs) are considered to be of the greatest importance. When a virus enters the cytoplasm, RLR, NLR, and cytosolic nucleic acid sensors come into play [1]. Signal transmission through TLR requires the involvement of protein adapters: MyD88 (Myeloid differentiation primary response gene 88), Mal (MyD88 adapter-like), TRIF (TIR-domain-containing adapter inducing IFNβ), and TRAM (Trif-related adapter molecule) [2] . Activation of molecular adapters is aimed at changing the activity of transcription factors (Nuclear factor κB (NFκB), IFN-regulatory factor 3 (IRF3), IFN-regulatory factor 7 (IRF7)) and activation of MAPK-dependent signaling pathways [1, 3].
Клетка способна к TLR-независимому ответу на проникновение патогена, опосредованному через цитозольные сенсоры. Важнейшим звеном являются РНК-хеликазы, принадлежащие к семейству RLR: Retinoic acid-inducible gene 1 (RIG-I), Melanoma differentiation-associated gene 5 (MDA-5 или IFIH-1) и Laboratory of genetics and physiology-2 (LGP-2). РНК-сенсоры RIG-I и MDA-5 состоят из N-концевого домена CARD (Сaspase activation and recruitment domain), имеющего АТФазную активность DExD/H box домена и С-концевого репрессорного домена. В нормальных условиях RIG-I находится в неактивной форме за счет ингибиторной активности своего регуляторного домена. Наоборот, при проникновении вируса в клетку RIG-I претерпевает конформационные изменения, индуцирующие мультимеризацию данного РНК-сенсора [1]. Активированная мультимерная форма RIG-I или MDA-5 взаимодействует с белковым адаптером Mitochondrial antiviral signaling protein (MAVS), расположенным на оболочке митохондриальной мембраны или в пероксисомах [1]. Активация MAVS-зависимого сигналинга индуцирует активацию транскрипционных факторов IRF-1, IRF-3, IRF-7. Известно, что данные факторы транскрипции необходимы для продукции интерферонов 1-го и 3-го типов, а следовательно, для индукции экспрессии сотен противовирусных ISGs (Interferon-stimulated genes) [3].The cell is capable of a TLR-independent response to pathogen entry mediated through cytosolic sensors. The most important links are RNA helicases belonging to the RLR family: Retinoic acid-inducible gene 1 (RIG-I), Melanoma differentiation-associated gene 5 (MDA-5 or IFIH-1), and Laboratory of genetics and physiology-2 (LGP- 2). The RIG-I and MDA-5 RNA sensors consist of the N-terminal CARD (Сaspase activation and recruitment domain) domain, which has the ATPase activity of the DExD/H box domain, and the C-terminal repressor domain. Under normal conditions, RIG-I is inactive due to the inhibitory activity of its regulatory domain. On the contrary, when a virus enters a cell, RIG-I undergoes conformational changes that induce multimerization of this RNA sensor [1]. The activated multimeric form of RIG-I or MDA-5 interacts with the Mitochondrial antiviral signaling protein (MAVS) adapter located on the mitochondrial membrane envelope or in peroxisomes [1]. Activation of MAVS-dependent signaling induces the activation of transcription factors IRF-1, IRF-3, IRF-7. It is known that these transcription factors are necessary for the production of interferons of the 1st and 3rd types, and, consequently, for the induction of the expression of hundreds of antiviral ISGs (Interferon-stimulated genes) [3].
РНК-сенсоры RIG-I или MDA-5 играют ключевую роль в антивирусной защите различных типов клеток, включая фибробласты, эпителиальные клетки, дендритные клетки [1]. Вирусная двуцепочечная РНК активирует и RIG-I, и MDA-5, в то время как в качестве активаторов первой РНК-хеликазы могут также выступать молекулы одноцепочечной РНК с 5’-трифосфатным концом без кэп-структуры (РНК такого вида присутствует в геномах многих вирусов). Важно отметить, что RIG-I не способен распознавать одноцепочечную РНК с кэп-структурой, которая продуцируется клеткой. РНК-сенсор MDA-5 отличает вирусную РНК от РНК клетки по длине молекулы. Обычно, длинные двуцепочечные РНК не характерны для здоровой клетки и являются лигандами MDA-5 [1]. Показано, что данные РНК-сенсоры необходимы для распознавания клеткой таких опасных патогенов как вирус бешенства, вирус кори, вирусы гриппа А и В, респираторно-синцитиальный вирус, вирус гепатита С, геморрагическая лихорадка Эбола, менговирус. Все эти вирусы способны продуцировать длинную двуцепочечную РНК, которая является лигандом данных РНК-сенсоров.RIG-I or MDA-5 RNA sensors play a key role in the antiviral protection of various cell types, including fibroblasts, epithelial cells, and dendritic cells [1]. Viral double-stranded RNA activates both RIG-I and MDA-5, while single-stranded RNA molecules with a 5'-triphosphate end without a cap structure can also act as activators of the first RNA helicase (RNA of this type is present in the genomes of many viruses ). It is important to note that RIG-I is unable to recognize single-stranded capped RNA that is produced by the cell. The MDA-5 RNA sensor distinguishes viral RNA from cellular RNA by the length of the molecule. Usually, long double-stranded RNAs are not characteristic of a healthy cell and are MDA-5 ligands [1]. It has been shown that these RNA sensors are necessary for cell recognition of such dangerous pathogens as rabies virus, measles virus, influenza A and B viruses, respiratory syncytial virus, hepatitis C virus, Ebola hemorrhagic fever, mengovirus. All these viruses are capable of producing long double-stranded RNA, which is the ligand for these RNA sensors.
Существует взаимосвязь между генами RIG-1, IFIT-1 и IFIH-1. Интерфероны, осуществляя аутокринное или паракринное действие на клетки, активируют JAK/STAT-зависимые сигнальные каскады и индуцируют экспрессию сотен ISGs. Одним из важнейших ISGs является IFIT-1 (ISG-56). IFIT-1 – ген с выраженной противовирусной активностью. Показано, что IFIT-1 ингибирует репликацию РНК- и ДНК-вирусов. Более того, сайленсинг IFIT-1 приводит к повышению репликации вируса гепатита С. С другой стороны, IFIT-1 вовлечен в индукцию клеточного апоптоза. Так, показано, что сайленсинг гена IFIT-1 был ассоциирован с меньшим уровнем апоптоза клеток А549, обработанных 5’-РРР-ssRNA, синтетическим агонистом RIG-1. Следовательно, связанный с действием интерферонов 1-го типа клеточный апоптоз может быть ассоциирован с избыточной экспрессией гена IFIT-1. В силу этого измерение уровня экспрессии гена IFIT-1 можно рассматривать не только как маркер активации врожденного иммунного ответа, но и как маркер ассоциированного с действием интерферонов 1-го типа апоптоза [4].There is a relationship between the RIG-1, IFIT-1 and IFIH-1 genes. Interferons, performing an autocrine or paracrine effect on cells, activate JAK/STAT-dependent signaling cascades and induce the expression of hundreds of ISGs. One of the most important ISGs is IFIT-1 (ISG-56). IFIT-1 is a gene with pronounced antiviral activity. It has been shown that IFIT-1 inhibits the replication of RNA and DNA viruses. Moreover, IFIT-1 silencing leads to increased HCV replication. On the other hand, IFIT-1 is involved in the induction of cell apoptosis. Thus, it was shown that IFIT-1 gene silencing was associated with a lower level of apoptosis in A549 cells treated with 5'-PPP-ssRNA, a synthetic RIG-1 agonist. Therefore, cell apoptosis associated with the action of
Совместное определение уровня экспрессии генов RIG-1, IFIT-1 и IFIH-1 позволяет определить уровень активации врожденного иммунного ответа организма и дать оценку активации проапоптотических сигнальных каскадов. Особенную актуальность данная оценка приобретает при анализе патогенеза острых респираторных вирусных инфекций, вызванных вирусами гриппа, пневмовирусами, аденовирусами, коронавирусами. Так, низкий уровень экспрессии РНК-сенсоров MDA-5 и RIG-1 может свидетельствовать о слабой активации врожденного интерферон-опосредованного иммунного ответа на респираторную инфекцию, в то время как избыточная экспрессия IFIT-1 может быть не только сигналом активации интерфероновой защитной системы, но и маркером возможной гибели клеток. Наиболее чувствительным и специфичным методом определения уровня экспрессии генов является ОТ-ПЦР в реальном времени. В данной методике предполагается наличие двух праймеров и флуоресцентно меченного олигонуклеотидного зонда, специфических к интересующей мРНК.The joint determination of the level of expression of the RIG-1, IFIT-1, and IFIH-1 genes makes it possible to determine the level of activation of the innate immune response of the body and evaluate the activation of proapoptotic signaling cascades. This assessment is of particular relevance in the analysis of the pathogenesis of acute respiratory viral infections caused by influenza viruses, pneumoviruses, adenoviruses, and coronaviruses. Thus, a low level of expression of the RNA sensors MDA-5 and RIG-1 may indicate a weak activation of the innate interferon-mediated immune response to a respiratory infection, while overexpression of IFIT-1 may not only be a signal of the activation of the interferon defense system, but and a marker of possible cell death. The most sensitive and specific method for determining the level of gene expression is real-time RT-PCR. This technique assumes the presence of two primers and a fluorescently labeled oligonucleotide probe specific for the mRNA of interest.
Известен способ идентификации генов, регуляторов экспрессии, рецепторов, рецепторов белковых продуктов и белков, которые могут регулировать риновирусные инфекции [5], включающий: a) контактирование по меньшей мере одного соединения с мишенью, выбранной из определенных генов (группа включает RIG-1, IFIT-1 и IFIH-1), белков, кодируемых этими генами, регуляторов экспрессии генов, рецепторов кодируемых белков, продуктами белков, кодируемых генами, рецепторами продуктов белков генов и их комбинациями; б) определение, связывает ли указанное соединение мишень; и c) идентификация тех соединений, которые связывают мишень, как соединений для регулирования риновирусной инфекции. При этом данное изобретение также относится к способам идентификации терапевтических соединений, которые могут лечить различные расстройства, регулируя экспрессию и активность генов, регуляторов экспрессии, рецепторов, рецепторов белковых продуктов и идентифицированных белков.There is a method for identifying genes, expression regulators, receptors, receptors for protein products and proteins that can regulate rhinovirus infections [5], including: a) contacting at least one compound with a target selected from certain genes (the group includes RIG-1, IFIT -1 and IFIH-1), proteins encoded by these genes, gene expression regulators, encoded protein receptors, gene encoded protein products, gene protein product receptors, and combinations thereof; b) determining if said compound binds to a target; and c) identifying those compounds that bind the target as compounds for regulating rhinovirus infection. However, this invention also relates to methods for identifying therapeutic compounds that can treat various disorders by regulating the expression and activity of genes, expression regulators, receptors, protein product receptors and identified proteins.
Однако в настоящее время не известны тест-системы, которые можно использовать для одновременного определения экспрессии генов RIG-1, IFIT-1 и IFIH-1 методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Таким образом, актуальность предлагаемого изобретения обусловлена необходимостью определения уровня экспрессии РНК-сенсоров и гена IFIT-1 для более глубокого понимания патогенеза острых респираторных вирусных инфекций и определения дальнейших стратегий их лечения, определения уровня активации интерферонового ответа и риска клеточной гибели.However, there are currently no known test systems that can be used to simultaneously determine the expression of the RIG-1, IFIT-1, and IFIH-1 genes by real-time RT-PCR. Thus, the relevance of the proposed invention is due to the need to determine the level of expression of RNA sensors and the IFIT-1 gene for a deeper understanding of the pathogenesis of acute respiratory viral infections and to determine further strategies for their treatment, to determine the level of activation of the interferon response and the risk of cell death.
Техническая проблема заключается в необходимости разработки тест-системы и способа для количественного определения уровня мРНК генов RIG-1, IFIT-1, IFIH-1 человека, а также в необходимости расширения ассортимента средств диагностики респираторных заболеваний на ранних этапах.The technical problem lies in the need to develop a test system and method for quantitative determination of the mRNA level of human RIG-1, IFIT-1, IFIH-1 genes, as well as the need to expand the range of respiratory disease diagnostic tools at early stages.
Технический результат состоит в обеспечении возможности быстрого и точного определения уровня мРНК генов RIG-1, IFIT-1, IFIH-1 человека.The technical result consists in providing the ability to quickly and accurately determine the level of mRNA of the human RIG-1, IFIT-1, IFIH-1 genes.
Для подбора праймеров и олигонуклеотидных зондов использовали последовательности RIG-1, IFIT-1 и IFIH-1 человека, депонированные в базе данных GenBank (NCBI). Анализируемые гены локализованы на разных хромосомах, длины зрелых транскриптов составляют от 600 до 4700 нуклеотидов. мРНК гена RIG-1 (DDX58) представлена семью, гена IFIT-1 — пятью; а гена IFIH-1 (MDA-5) — одним транскрипционным вариантом.Human RIG-1, IFIT-1, and IFIH-1 sequences deposited in the GenBank database (NCBI) were used to select primers and oligonucleotide probes. The analyzed genes are localized on different chromosomes; the lengths of mature transcripts range from 600 to 4700 nucleotides. mRNA of the RIG-1 gene (DDX58) is represented by seven, of the IFIT-1 gene by five; and the IFIH-1 (MDA-5) gene by one transcription variant.
Оригинальные последовательности праймеров и TaqMan зондов были подобраны к консервативным белок-кодирующим областям и потенциально должны выявлять все транскрипционные варианты заявленных генов. Селекцию необходимых последовательностей проводили исходя из желательных температур плавления праймеров 60°С и выше, а олигонуклеотидного зонда — свыше 63°С, рассчитанных при выбранной концентрации солей 75 мМ. Руководствуясь рациональными критериями дизайна, подбор праймеров проводили так, чтобы они были разделены как минимум одним интроном на последовательности гена и преимущественно были расположены на стыке экзонов. Такой подход позволяет различить геномный продукт ПЦР от продукта ПЦР, полученного с кДНК, и избежать дополнительной процедуры обработки ДНКазами.The original primer and TaqMan probe sequences were matched to conserved protein coding regions and should potentially reveal all transcriptional variants of the claimed genes. The selection of the required sequences was carried out based on the desired melting temperatures of the primers of 60°C and above, and of the oligonucleotide probe above 63°C, calculated at the selected salt concentration of 75 mM. Guided by rational design criteria, primers were selected so that they were separated by at least one intron per gene sequence and were predominantly located at the junction of exons. This approach makes it possible to distinguish the genomic PCR product from the PCR product obtained from cDNA and avoid additional DNase processing.
Последовательности, сконструированные для выявления мРНК RIG-1, IFIT-1 и IFIH-1 человека были проанализированы в программе BLAST на предмет выявления их возможного спектра неспецифической гибридизации. Последовательностей, высокогомологичных каким-либо другим генам данного вида, выявлено не было.Sequences designed to detect human RIG-1, IFIT-1, and IFIH-1 mRNAs were analyzed by BLAST for their possible spectrum of non-specific hybridization. No sequences highly homologous to any other genes of this species have been identified.
Технический результат достигается тем, что многопараметрическая диагностическая тест-система для количественного определения уровня мРНК генов RIG-1, IFIT-1, IFIH-1 методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией включает набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов со следующей структурой:The technical result is achieved by the fact that the multi-parameter diagnostic test system for quantitative determination of the mRNA level of the RIG-1, IFIT-1, IFIH-1 genes by reverse transcription polymerase chain reaction includes a set of oligonucleotide primers and fluorescent probes with the following structure:
прямой праймер гена RIG-1 GAGCACTTGTGGACGCTTTAforward primer of RIG-1 gene GAGCACTTGTGGACGCTTTA
обратный праймер гена RIG-1 ATACACTTCTGTGCCGGGAGreverse primer of RIG-1 gene ATACACTTCTGTGCCGGGAG
флуоресцентный зонд гена RIG-1 Rox-CCTGGCATATTGACTGGACGTGGC-BHQ2fluorescent probe of the RIG-1 gene Rox-CCTGGCATATTGACTGGACGTGGC-BHQ2
прямой праймер гена IFIT-1 AAACTTCGGAGAAAGGCATTAGATforward primer of the IFIT-1 gene AAACTTCGGAGAAAGGCATTAGAT
обратный праймер гена IFIT-1 TGAAATGAAATGTGAAAGTGGCTGreverse primer of the IFIT-1 gene TGAAATGAAATGTGAAAGTGGCTG
флуоресцентный зонд гена IFIT-1 Hex-CCTGAGACTGGCTGCTGACTTTGAGAAC-BHQ1IFIT-1 gene fluorescent probe Hex-CCTGAGACTGGCTGCTGACTTTGAGAAC-BHQ1
прямой праймер гена IFIH-1 AAACCCATGACACAGAATGAACAforward primer of the IFIH-1 gene AAACCCATGACACAGAATGAACA
обратный праймер гена IFIH-1 TGTGAGCAACCAGGACGTAGreverse primer of the IFIH-1 gene TGTGAGCAACCAGGACGTAG
флуоресцентный зонд гена IFIH-1 Cy5.5-CACAGTGGCAGAAGAAGGTCTGGA- BHQ3IFIH-1 gene fluorescent probe Cy5.5-CACAGTGGCAGAAGAAGGTCTGGA-BHQ3
Прямой праймер гена RIG-1 представлен в SEQ NO:1; обратный праймер гена RIG-1 представлен в SEQ NO:2; флуоресцентный зонд гена RIG-1 представлен в SEQ NO:3; прямой праймер гена IFIT-1 представлен в SEQ NO:4; обратный праймер гена IFIT-1 представлен в SEQ NO:5; флуоресцентный зонд гена IFIT-1 представлен в SEQ NO:6; прямой праймер гена IFIH-1 представлен в SEQ NO:7; обратный праймер гена IFIH-1 представлен в SEQ NO:8; флуоресцентный зонд гена IFIH-1 представлен в SEQ NO:9.The forward primer of the RIG-1 gene is shown in SEQ NO:1; the reverse primer of the RIG-1 gene is shown in SEQ NO:2; a fluorescent probe for the RIG-1 gene is shown in SEQ NO:3; the forward primer of the IFIT-1 gene is shown in SEQ NO:4; the reverse primer of the IFIT-1 gene is shown in SEQ NO:5; a fluorescent probe for the IFIT-1 gene is shown in SEQ NO:6; the forward primer of the IFIH-1 gene is shown in SEQ NO:7; the reverse primer of the IFIH-1 gene is shown in SEQ NO:8; a fluorescent probe for the IFIH-1 gene is shown in SEQ NO:9.
С помощью указанной тест-системы осуществляют количественное определение уровня мРНК генов RIG-1, IFIT-1, IFIH-1 человека, в ходе которого проводят полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией, причем первичную денатурацию проводят в течение 5 мин при температуре 95 °С, далее проводят 40 циклов, состоящих из двух этапов: денатурации в течение 10 с при температуре 95°С, затем отжига праймеров и элонгации цепи в течение 30 с при температуре 61,3°С.With the help of this test system, the level of mRNA of the human RIG-1, IFIT-1, IFIH-1 genes is quantified, during which a reverse transcription polymerase chain reaction is carried out, and the primary denaturation is carried out for 5 minutes at a temperature of 95 ° C, then 40 cycles are carried out, consisting of two stages: denaturation for 10 s at a temperature of 95°C, then primer annealing and chain elongation for 30 s at a temperature of 61.3°C.
Описание фигурDescription of figures
На фиг.1 представлен анализ методом электрофоретического разделения в агарозном геле продуктов ПЦР, полученных при соответствующих температурах отжига (указаны сверху в °С): А – продукты ПЦР для количественной детекции мРНК гена RIG-1; Б – продукты ПЦР для количественной детекции мРНК гена IFIT-1; В – продукты ПЦР для количественной детекции мРНК гена IFIH-1; Г – продукты ПЦР для количественной детекции мРНК гена HPRT-1.Figure 1 shows the analysis by electrophoretic separation in agarose gel of PCR products obtained at the corresponding annealing temperatures (indicated above in °C): A - PCR products for quantitative detection of mRNA of the RIG-1 gene; B – PCR products for quantitative detection of mRNA of the IFIT-1 gene; C – PCR products for quantitative detection of mRNA of the IFIH-1 gene; (d) PCR products for quantitative detection of mRNA of the HPRT-1 gene.
На фиг. 2 представлен расчёт эффективности реакции ПЦР для количественной детекции мРНК гена RIG-1, проведённой в моноплексном режиме: A – кривые роста флуоресценции, полученные для линейки разведений образцов (от –10 до –2) при анализе флуоресценции на канале ROX в режиме реального времени; Б – построенная по полученным значениям Cq кривая, используемая для расчёта эффективности реакции.In FIG. Figure 2 shows the calculation of the efficiency of the PCR reaction for the quantitative detection of RIG-1 gene mRNA, carried out in the monoplex mode: A – fluorescence growth curves obtained for a range of sample dilutions (from –10 to –2) in real-time fluorescence analysis on the ROX channel; B – curve constructed from the obtained values of Cq, used to calculate the reaction efficiency.
На фиг. 3 представлен Расчёт эффективности реакции ПЦР для количественной детекции мРНК гена IFIT-1, проведённой в моноплексном режиме: A – кривые роста флуоресценции, полученные для линейки разведений образцов (от –10 до –2) при анализе флуоресценции на канале ROX в режиме реального времени; Б – построенная по полученным значениям Cq кривая, используемая для расчёта эффективности реакции.In FIG. Figure 3 shows the Calculation of the efficiency of the PCR reaction for the quantitative detection of the IFIT-1 gene mRNA, carried out in the monoplex mode: A - fluorescence growth curves obtained for a line of sample dilutions (from –10 to –2) in the analysis of fluorescence on the ROX channel in real time; B – curve constructed from the obtained values of Cq, used to calculate the reaction efficiency.
На фиг. 4 представлен расчёт эффективности реакции ПЦР для количественной детекции мРНК гена IFIH-1, проведённой в моноплексном режиме: A – кривые роста флуоресценции, полученные для линейки разведений образцов (от –10 до –2) при анализе флуоресценции на канале Cy5.5 в режиме реального времени; Б – построенная по полученным значениям Cq кривая, используемая для расчёта эффективности реакции.In FIG. Figure 4 shows the calculation of the efficiency of the PCR reaction for the quantitative detection of IFIH-1 mRNA, carried out in monoplex mode: A - fluorescence growth curves obtained for a line of sample dilutions (from –10 to –2) when analyzing fluorescence on the Cy5.5 channel in real mode time; B – curve constructed from the obtained values of Cq, used to calculate the reaction efficiency.
На фиг. 5 представлен анализ методом капиллярного электрофореза с использованием системы Bioanalyzer 2100 (Agilent) продуктов ПЦР, полученных при оптимальных условиях в мультиплексных и моноплексных режимах: A – электрофореграмма продуктов ПЦР: Sample 1–3 содержат продукты моноплексных ПЦР на гены RIG-1, IFIT-1 и IFIH-1, соответственно, Sample 4 – продукты мультиплексной ПЦР на эти гены при одновременной амплификации их в одной пробирке, полученные из образца, выделенного из клеток A549, Sample 5 – смесь продуктов моноплексных ПЦР, полученная путём смешивания образцов Sample 1–3, Sample 6 – продукты мультиплексной ПЦР на гены RIG-1, IFIT-1 и IFIH-1 при одновременной амплификации их в одной пробирке, полученные из образца, выделенного из мононуклеарных клеток периферической крови; Б — спектрофореграмма, отражающая наложение результатов ПЦР в мультиплексном режиме (проба Sample 4, содержащая все три специфических продукта RIG-1, IFIT-1 и IFIH-1) и моноплексных режимах, проба Sample 1 содержит специфический продукт гена RIG-1, Sample 2 и Sample-3 – продукты генов IFIT-1 и IFIH-1, соответственно.In FIG. Figure 5 shows the analysis by capillary electrophoresis using the Bioanalyzer 2100 system (Agilent) of PCR products obtained under optimal conditions in multiplex and monoplex modes: A - electrophoregram of PCR products:
На фиг. 6 представлено сравнение эффективностей реакций ПЦР в моноплексном и мультиплексном форматах: А – представлены стандартные калибровочные кривые, используемые для расчёта эффективностей амплификации RIG-1, IFIT-1 и IFIH-1 в мультиплексном формате (одновременная детекция в одной пробирке); Б – стандартная калибровочная кривая, полученная в мультиплексном формате ПЦР (синие точки) в сравнении калибровочной кривой при моноплексной постановке (оранжевые точки) для гена RIG-1; В – стандартная калибровочная кривая, полученная в мультиплексном формате ПЦР (синие точки), в сравнении с калибровочной кривой при моноплексной постановке (оранжевые точки) для гена IFIH-1; Г – стандартная калибровочная кривая, полученная в мультиплексном формате ПЦР (синие точки), в сравнении калибровочной кривой при моноплексной постановке (оранжевые точки) для гена IFIT-1.In FIG. Figure 6 shows a comparison of the efficiencies of PCR reactions in monoplex and multiplex formats: A - shows standard calibration curves used to calculate the amplification efficiencies of RIG-1, IFIT-1 and IFIH-1 in multiplex format (simultaneous detection in one tube); B – standard calibration curve obtained in the multiplex PCR format (blue dots) compared to the calibration curve in monoplex setting (orange dots) for the RIG-1 gene; C – standard calibration curve obtained in multiplex PCR format (blue dots) compared to the calibration curve in monoplex setting (orange dots) for the IFIH-1 gene; D – standard calibration curve obtained in multiplex PCR format (blue dots) compared to the calibration curve in monoplex setting (orange dots) for the IFIT-1 gene.
На фиг. 7 представлена специфичность амплификации требуемых продуктов с использованием различных матриц для ПЦР: cDNA – комплементарной ДНК, полученной из препарата мРНК методом обратной транскрипции; RNA – препарата тотальной РНК, выделенной из стимулированных клеток A549, water – используемой в качестве отрицательного контроля ПЦР. Подписи генов RIG-1, IFIT-1 и IFIH-1 означают, что реакция была поставлена в моноплексном формате на соответствующие гены, MIX – мультиплексный формат проведения ПЦР.In FIG. Figure 7 shows the amplification specificity of the required products using various PCR matrices: cDNA - complementary DNA obtained from the mRNA preparation by reverse transcription; RNA - preparation of total RNA isolated from stimulated A549 cells, water - used as a negative PCR control. The signatures of the RIG-1, IFIT-1 and IFIH-1 genes mean that the reaction was performed in a monoplex format for the corresponding genes, MIX is a multiplex PCR format.
На фиг. 8 представлено определение уровня экспрессии генов RIG-1, IFIT-1, IFIH-1 с использованием разработанной мультиплексной ПЦР в культуре клеток A549, стимулированных низкомолекулярной (LMW) и высокомолекулярной (HMW) poly(I:C) дцРНК. Доставку LMW и HMW в клетки осуществляли с использованием реагента Lipofectamine MessengerMAX, обозначение КК_ЛП – контроль клеток, стимулированных только реагентом Lipofectamine MessengerMAX (без дцРНК), КК – интактный контроль клеток. Достоверность различий определялась с использованием критерия ANOVA (дисперсионный анализ) с множественными сравнениями. **** – P < 0,0001.In FIG. Figure 8 shows the determination of the expression level of the RIG-1, IFIT-1, IFIH-1 genes using the developed multiplex PCR in A549 cell culture stimulated with low molecular weight (LMW) and high molecular weight (HMW) poly(I:C) dsRNA. Delivery of LMW and HMW into cells was carried out using the Lipofectamine MessengerMAX reagent, the designation KK_LP is the control of cells stimulated only with the Lipofectamine MessengerMAX reagent (without dsRNA), KK is the intact control of cells. The significance of differences was determined using the ANOVA test (analysis of variance) with multiple comparisons. **** - P < 0.0001.
На фиг. 9 представлено определение уровня экспрессии генов RIG-1, IFIT-1, IFIH-1 в периферических мононуклеарных клетках крови здоровых волонтеров и пациентов с гриппозной и новой коронавирусной инфекцией. Достоверность различий определялась с использованием непараметрического критерия Краскела-Уоллиса с множественными сравнениями. * – P < 0,05; ** – P < 0,01.In FIG. Figure 9 shows the determination of the level of expression of the RIG-1, IFIT-1, IFIH-1 genes in peripheral blood mononuclear cells of healthy volunteers and patients with influenza and new coronavirus infection. Significance of differences was determined using the non-parametric Kruskal-Wallis test with multiple comparisons. * – P < 0.05; ** - P < 0.01.
Для определения уровня экспрессии генов RIG-1, IFIT-1 и IFIH-1 были подобраны праймеры и олигонуклеотидные зонды (таблица 1).Primers and oligonucleotide probes were selected to determine the expression level of the RIG-1, IFIT-1, and IFIH-1 genes (Table 1).
РНК-сенсор RIG-1 человека представлен в базе данных 7 транскрипционными вариантами. Поэтому было проведено множественное выравнивание этих вариантов и к идентичному участку подобрана пара праймеров и олигонуклеотидный зонд.The human RIG-1 sensor RNA is represented in the database by 7 transcriptional variants. Therefore, multiple alignment of these variants was carried out, and a pair of primers and an oligonucleotide probe were matched to the identical site.
Ген IFIT-1 представлен 5 транскрипционными вариантами. Поэтому было проведено множественное выравнивание этих вариантов и к идентичному участку подобрана пара праймеров и олигонуклеотидный зонд.The IFIT-1 gene is represented by 5 transcriptional variants. Therefore, multiple alignment of these variants was carried out, and a pair of primers and an oligonucleotide probe were matched to the identical site.
РНК-сенсор MDA-5 (IFIH-1) представлен только одним транскрипционным вариантом.The MDA-5 (IFIH-1) sensor RNA is represented by only one transcription variant.
В качестве референсного гена, подходящего для проведения ОТ-ПЦР в реальном времени, при заражении клеток респираторными инфекциями был выбран ген HPRT-1.The HPRT-1 gene was chosen as a reference gene suitable for real-time RT-PCR when cells were infected with respiratory infections.
Таблица 1: Подобранные праймеры и TaqMan зонды для определения экспрессии RIG-1, IFIT-1, IFIH-1 Table 1 : Matched primers and TaqMan probes for RIG-1, IFIT-1, IFIH-1 expression
Подбор и оптимизация условий ПЦРSelection and optimization of PCR conditions
На этом этапе работы экспериментально оценили качество подобранных пар праймеров и зондов, а также возможность образования ими гетеро- и гомодимеров и неспецифических продуктов. Материалом для этого исследования служили образцы кДНК, полученные из препаратов тотальной РНК, выделенных из клеток A549, инфицированных вирусом гриппа A. Работа проводилась с использованием набора для проведения ПЦР HS 2× ПЦР-микса («Биолабмикс», Россия). В реакцию объёмом 25 мкл добавляли по 5 пмоль праймеров и зондов (0,5 мкл из стока праймеров и зондов с концентрациями 10 пмоль/мкл).At this stage of the work, we experimentally evaluated the quality of the selected pairs of primers and probes, as well as the possibility of their formation of hetero- and homodimers and nonspecific products. The material for this study was cDNA samples obtained from total RNA preparations isolated from A549 cells infected with influenza A virus. The work was carried out using the
Для определения оптимального термального профиля были проведены следующие ПЦР с градиентом отжига:To determine the optimal thermal profile, the following PCR was performed with an annealing gradient:
1) первичная денатурация 95°С – 5 мин,1) primary denaturation 95°C - 5 min,
далее следовали 40 трёхступенчатых циклов:followed by 40 three-stage cycles:
2) денатурация 95°С – 10 с;2) denaturation 95°С – 10 s;
3) отжиг праймеров при температурах в диапазоне от 57,5°C до 63,5°С – 30 с (точные температуры составили 63,5°, 63,2°, 62,5°, 61,3°, 59,9°, 58,7°, 57,9°, 57,5°С);3) primer annealing at temperatures ranging from 57.5°C to 63.5°C - 30 s (the exact temperatures were 63.5°, 63.2°, 62.5°, 61.3°, 59.9 °, 58.7°, 57.9°, 57.5°C);
4) элонгация 72°С – 30 с;4) elongation 72°С – 30 s;
Детекцию результатов осуществляли по росту флуоресценции, наличие неспецифических продуктов оценивали электрофоретическим разделением продуктов в агарозном геле. На Фиг. 1 представлены результаты электрофоретического разделения продуктов ПЦР на RIG-1 (Фиг. 1 А), IFIT-1 (Фиг. 1 Б), IFIH-1 (Фиг. 1 В) и на ген HPRT1 (Фиг. 1 Г), предложенный в качестве эндогенного контроля, при проведении реакции при соответствующих температурах отжига. Электрофорез проводили в 1% агарозе на буфере 1× TBE с окрашиванием бромистым этидием.The detection of the results was carried out by the growth of fluorescence, the presence of nonspecific products was assessed by electrophoretic separation of the products in an agarose gel. On FIG. 1 shows the results of electrophoretic separation of PCR products for RIG-1 (Fig. 1 A), IFIT-1 (Fig. 1 B), IFIH-1 (Fig. 1 C) and for the HPRT1 gene (Fig. 1 D), proposed in as an endogenous control, when carrying out the reaction at appropriate annealing temperatures. Electrophoresis was performed in 1% agarose in 1x TBE buffer and stained with ethidium bromide.
С учётом полученных результатов в качестве оптимального температурного профиля ПЦР было предложено использовать следующий:Taking into account the results obtained, it was proposed to use the following as the optimal temperature profile for PCR:
1) первичная денатурация 95°С – 5 мин,1) primary denaturation 95°C - 5 min,
далее 40 двухступенчатых циклов:further 40 two-stage cycles:
2) денатурация 95°С – 10 с;2) denaturation 95°С – 10 s;
3) отжиг праймеров и элонгация цепи 61,3°С – 30 c.3) primer annealing and chain elongation 61.3°С – 30 s.
Расчет эффективностей ПЦРCalculation of PCR efficiencies
Для корректного проведения относительного количественного анализа экспрессии генов RIG-1 подобных рецепторов в мультиплексном формате значения эффективностей амплификации соответствующих генов должны быть идентичными или максимально приближенными друг к другу. Поэтому далее при подобранных оптимальных условиях рассчитали эффективности ПЦР.For a correct relative quantitative analysis of the expression of RIG-1 genes of similar receptors in the multiplex format, the values of the amplification efficiencies of the corresponding genes should be identical or as close as possible to each other. Therefore, further, under the selected optimal conditions, we calculated the efficiency of PCR.
Эффективность амплификации продуктов ПЦР рассчитывали по углу наклона кривых, полученных серией последовательных десятикратных разбавлений образцов кДНК.The efficiency of amplification of PCR products was calculated from the slope of the curves obtained by a series of successive tenfold dilutions of cDNA samples.
На Фиг. 2 показаны результаты расчёта эффективности ПЦР при амплификации гена RIG-1 в моноплексном формате. Как видно на Фиг. 2 А, экспрессионные участки кривых накопления, полученных для соответствующих разведений пробы, параллельны, расстояние между последовательными разведениями постоянно, углы наклона кривых одинаковы. Рассчитанная эффективность ПЦР на RIG-1 (Фиг. 2 Б) составила 99,81%, что является практически идеальным параметром амплификации. Аналогичным образом были получены эффективности амплификации ПЦР для IFIT-1 (Фиг. 3) и для IFIH-1 (Фиг. 4). Таким образом, продемонстрировано, что в моноплексном формате эффективности амплификации продуктов трех генов RIG-1, IFIT-1 и IFIH-1 составили: 99,81%, 99,81%, 99,87%, соответственно. Графически это выражается в том, что стандартные калибровочные кривые (представлены на Фиг. 2–4 Б) имеют похожие углы наклона, т.е. параллельны.On FIG. Figure 2 shows the results of calculating the efficiency of PCR when amplifying the RIG-1 gene in a monoplex format. As seen in FIG. 2A, the expression sections of the accumulation curves obtained for the corresponding dilutions of the sample are parallel, the distance between successive dilutions is constant, the slopes of the curves are the same. The calculated PCR efficiency on RIG-1 (FIG. 2B) was 99.81%, which is an almost ideal amplification parameter. Similarly, PCR amplification efficiencies were obtained for IFIT-1 (FIG. 3) and for IFIH-1 (FIG. 4). Thus, it was demonstrated that in the monoplex format, the efficiency of amplification of the products of the three genes RIG-1, IFIT-1 and IFIH-1 was: 99.81%, 99.81%, 99.87%, respectively. Graphically, this is expressed in the fact that the standard calibration curves (shown in Fig. 2–4 B) have similar slope angles, i.e. are parallel.
Для проведения мультиплексной ПЦР амплификацию всех генов RIG-1, IFIT-1 и IFIH-1 проводили одновременно в одной пробирке. Для этого проба ПЦР, кроме фермента ДНК-зависимой ДНК-полимеразы и прилагаемого к ней буфера, содержала одновременно все подобранные пары праймеров и олигонуклеотидные зонды, специфически выявляющие заявленные гены. Конечные концентрации праймеров и зондов, содержащиеся в пробе при проведении мультиплексной ПЦР, представлены в таблице 2.For multiplex PCR, amplification of all RIG-1, IFIT-1, and IFIH-1 genes was performed simultaneously in one tube. For this, the PCR sample, in addition to the DNA-dependent DNA polymerase enzyme and the buffer attached to it, simultaneously contained all the selected pairs of primers and oligonucleotide probes that specifically detect the claimed genes. The final concentrations of primers and probes contained in the sample during multiplex PCR are presented in Table 2.
Таблица 2: Состав мультиплексной реакции Table 2 : Composition of the multiplex reaction
Ввиду того, что при нахождении в одной пробирке праймеры могу давать неспецифические химерные продукты, анализ продуктов ПЦР в мультиплексном и моноплексном режимах был проведен методом капиллярного электрофореза (Фиг. 5). Как продемонстрировано на Фиг. 5 А, при проведении моноплексной ПЦР в пробирках амплифицировались только продукты, соответствующие заявленным генам RIG-1, IFIT-1, IFIH-1, с длинами 175 п.о., 187 п.о. и 216 п.о. для каждого. При проведении мультиплексной ПЦР в пробирке одновременно выявлялись все три гена, имеющие аналогичные длины. Спектрофореграмма продуктов, полученных в мультиплексном формате, наложенная на спектрофореграммы продуктов ПЦР, образовавшихся в моноплексных форматах, имели идентичные пики (Фиг. 5 Б). Таким образом, мультиплексирование не приводило к образованию каких-либо нежелательных случайных продуктов.Due to the fact that primers can give nonspecific chimeric products when in the same tube, the analysis of PCR products in multiplex and monoplex modes was carried out by capillary electrophoresis (Fig. 5). As shown in FIG. 5 A, when performing monoplex PCR in test tubes, only products corresponding to the declared genes RIG-1, IFIT-1, IFIH-1 were amplified, with lengths of 175 bp, 187 bp. and 216 b.p. for everybody. When conducting multiplex PCR in a test tube, all three genes with similar lengths were simultaneously detected. The spectrophorogram of the products obtained in the multiplex format, superimposed on the spectrophorograms of the PCR products formed in the monoplex formats, had identical peaks (Fig. 5B). Thus, the multiplexing did not lead to the formation of any unwanted random products.
Далее были рассчитаны эффективности амплификации каждого из заявленных генов в мультиплексном формате ПЦР. Как продемонстрировано на Фиг. 6 А, эффективности амплификации всех специфических продуктов при проведении ПЦР в одной пробирке практически идентичны и превышают 98% (для RIG-1, IFIT-1 и IFIH-1 составили: 99,75%, 99,09%, 98,80%, соответственно). Кроме того, мультиплексирование праймеров приводит к снижению амплификации не более чем на 1–2% по сравнению с амплификацией в моноплексном формате для каждого из специфических продуктов (Фиг. 6 В–Г). Такие результаты свидетельствуют, что при проведении мультиплексной ПЦР в каждом её раунде происходит удвоение специфических продуктов.Further, the efficiency of amplification of each of the declared genes in the multiplex PCR format was calculated. As shown in FIG. 6 A, the amplification efficiencies of all specific products during PCR in one tube are almost identical and exceed 98% (for RIG-1, IFIT-1 and IFIH-1 were: 99.75%, 99.09%, 98.80%, respectively). In addition, primer multiplexing resulted in a decrease in amplification of no more than 1–2% compared to monoplex amplification for each of the specific products (Fig. 6C–D). These results indicate that during multiplex PCR, doubling of specific products occurs in each round.
Для оценки появления возможных неспецифических продуктов, обусловленных геномной контаминацией комплементарных кДНК-проб, разработанные ПЦР в мультиплексном и моноплексном форматах тестировали с использованием различных матриц (РНК или кДНК). Как видно из электрофоретического разделения соответствующих продуктов ПЦР, представленных на Фиг. 7, ПЦР на IFIT-1 даёт положительные специфические продукты, полученные с геномной ДНК (на Фиг. 7 проба RNA). Такие результаты ожидаемы и были предсказаны на этапе подбора последовательностей праймеров и зонда, специфически выявляющего IFIT-1. Тем не менее, такие результаты свидетельствуют о строгой необходимости в предварительной обработке тестируемой в ПЦР пробы РНК ДНКазами для удаления геномной ДНК.To assess the appearance of possible nonspecific products due to genomic contamination of complementary cDNA probes, the PCR developed in multiplex and monoplex formats was tested using various matrices (RNA or cDNA). As can be seen from the electrophoretic separation of the respective PCR products shown in FIG. 7, PCR for IFIT-1 gives positive specific products obtained from genomic DNA (RNA probe in FIG. 7). Such results are expected and were predicted at the stage of selection of primer sequences and a probe specifically detecting IFIT-1. However, these results indicate a strong need for pretreatment of the RNA sample tested in PCR with DNases to remove genomic DNA.
Верификация тест-системы Verification of the test system in vitroin vitro и на клинических образцах and on clinical specimens
Разработанная система количественной мультиплексной ПЦР была применена для анализа экспрессии генов RIG-1, IFIT-1 и IFIH-1 в стимулированных культурах клеток A549 и в периферических мононуклеарных клетках крови здоровых волонтеров и пациентов с гриппозной и новой коронавирусной инфекцией.The developed quantitative multiplex PCR system was used to analyze the expression of the RIG-1, IFIT-1, and IFIH-1 genes in stimulated A549 cell cultures and in peripheral blood mononuclear cells of healthy volunteers and patients with influenza and novel coronavirus infection.
Известно, что двухцепочечные молекулы РНК (дцРНК) – лиганд, который активирует сенсорные компоненты врожденной иммунной системы. В первую очередь, в ответ на проникновение в клетку дцРНК происходит активация TLR-3 и цитозольных сенсоров IFIH-1 (MDA-5). Длинные дцРНК не характерны для здоровых клеток. Обычно их присутствие связано с проникновением вирусных патогенов [1]. Синтетическим аналогом вирусной дцРНК является poly(I:C) дцРНК. Данная молекула состоит из двух цепей: первая – полимер инозиновой кислоты, вторая — цитидиновой кислоты. Данный агонист используется в исследовательской практике для индукции интерферонов и ISGs. Внесение poly(I:C) дцРНК в клеточную среду моделирует ситуацию вирусной инфекции. Используется два вида синтетических агонистов: высокомолекулярная poly(I:C) дцРНК (High molecular weight poly(I:C) дцРНК, HMW) и низкомолекулярный аналог (Low molecular weight poly(I:C) дцРНК, LMW). Длина HMW составляет от 1500 до 8000 пар оснований, в то время как у LMW – от 200 до 1000 пар азотистых оснований.It is known that double-stranded RNA molecules (dsRNA) are a ligand that activates sensory components of the innate immune system. First of all, TLR-3 and cytosolic sensors IFIH-1 (MDA-5) are activated in response to dsRNA penetration into the cell. Long dsRNAs are not characteristic of healthy cells. Usually their presence is associated with the penetration of viral pathogens [1]. The synthetic analogue of viral dsRNA is poly(I:C) dsRNA. This molecule consists of two chains: the first is a polymer of inosinic acid, the second is cytidinic acid. This agonist is used in research practice to induce interferons and ISGs. The introduction of poly(I:C) dsRNA into the cell medium simulates the situation of a viral infection. Two types of synthetic agonists are used: high molecular weight poly(I:C) dsRNA (High molecular weight poly(I:C) dsRNA, HMW) and low molecular weight analog (Low molecular weight poly(I:C) dsRNA, LMW). HMW is 1500 to 8000 base pairs long, while LMW is 200 to 1000 base pairs long.
Для первого этапа верификации в нашей работе была проведена оценка изменения экспрессии генов RIG-1, IFIT-1, IFIH-1 при стимуляции клеток линии А549 HMW и LMW poly(I:C) дцРНК. Клетки А549 – линия клеток, которая является моделью альвеолярных пневмоцитов II типа. Нами было показано, что HMW и LMW достоверно увеличивают уровень мРНК генов RIG-1, IFIT-1, IFIH-1 (Фиг. 8), что отражено в научной литературе как общеизвестный факт. Следовательно, разрабатываемая нами тест-система пригодна для оценки активации интерферон-опосредованных механизмов врожденной иммунной системы.For the first stage of verification, in our work, we assessed changes in the expression of the RIG-1, IFIT-1, and IFIH-1 genes upon stimulation of A549 HMW and LMW poly(I:C) dsRNA cells. A549 cells are a cell line that is a model of type II alveolar pneumocytes. We have shown that HMW and LMW significantly increase the level of mRNA of the RIG-1, IFIT-1, IFIH-1 genes (Fig. 8), which is reflected in the scientific literature as a well-known fact. Therefore, the test system we are developing is suitable for assessing the activation of interferon-mediated mechanisms of the innate immune system.
На втором этапе верификации разработанная мультиплексная ПЦР применялась для одновременного измерения экспрессии генов RIG-1, IFIT-1, IFIH-1 в периферических мононуклеарных клетках крови здоровых доноров и пациентов с диагнозом COVID-19 или грипп. Диагностика этих инфекций была проведена ПЦР-наборами, сертифицированными для проведения подобных исследований. В результате измерения было показано, что у пациентов, страдающих респираторными инфекциями (грипп, SARS-CoV-2), происходит повышение уровня экспрессии цитозольного РНК-сенсора RIG-1 (Фиг. 9). Таким образом, с использованием мультиплексной ПЦР-системы было показано, что RIG-1 – маркер вирусной инфекции, который неспецифически активируется в ответ на заражение организма гриппозной или новой коронавирусной инфекцией. Наоборот, экспрессия IFIT-1 и IFIH-1 была повышена только у пациентов, зараженных вирусом гриппа. В случае заражения COVID-19 уровень данных маркеров, видимо, зависит от тяжести перенесенного заболевания.At the second stage of verification, the developed multiplex PCR was used to simultaneously measure the expression of the RIG-1, IFIT-1, IFIH-1 genes in peripheral blood mononuclear cells of healthy donors and patients diagnosed with COVID-19 or influenza. Diagnosis of these infections was carried out with PCR kits certified for such studies. As a result of the measurement, it was shown that in patients suffering from respiratory infections (influenza, SARS-CoV-2), there is an increase in the expression level of the cytosolic RNA sensor RIG-1 (Fig. 9). Thus, using a multiplex PCR system, it was shown that RIG-1 is a marker of a viral infection that is nonspecifically activated in response to infection of the body with an influenza or new coronavirus infection. On the contrary, the expression of IFIT-1 and IFIH-1 was increased only in patients infected with the influenza virus. In the case of COVID-19 infection, the level of these markers seems to depend on the severity of the disease.
В целом, использование разработанной мультиплексной ПЦР тест-системы позволяет с высокой эффективностью проводить количественный анализ генов RIG-1, IFIT-1, IFIH-1 как в клинических образцах, так и в культуре клеток.In general, the use of the developed multiplex PCR test system allows high-efficiency quantitative analysis of the RIG-1, IFIT-1, IFIH-1 genes both in clinical samples and in cell culture.
Список литературыBibliography
1 Thompson M. R. et al. Pattern recognition receptors and the innate immune response to viral infection//Viruses. – 2011. – Т. 3. – №. 6. – С. 920-940.1 Thompson MR et al. Pattern recognition receptors and the innate immune response to viral infection// Viruses . - 2011. - T. 3. - No. 6. - S. 920-940.
2 Kaisho, T., & Akira, S. Toll-like receptor function and signaling//Journal of allergy and clinical immunology. – 2006. – T. 117. – №. 5. – C. 979-987.2 Kaisho, T., & Akira, S. Toll-like receptor function and signaling// Journal of allergy and clinical immunology . - 2006. - T. 117. - No. 5. - C. 979-987.
3 Randall R. E., Goodbourn S. Interferons and viruses: an interplay between induction, signalling, antiviral responses and virus countermeasures//Journal of General Virology. – 2008. – Т. 89. – №. 1. – С. 1-47.3 Randall RE, Goodbourn S. Interferons and viruses: an interplay between induction, signaling, antiviral responses and virus countermeasures// Journal of General Virology . - 2008. - T. 89. - No. 1. - S. 1-47.
4 Yap, G. L. et al., Annexin-A1 promotes RIG-I-dependent signaling and apoptosis via regulation of the IRF3–IFNAR–STAT1–IFIT1 pathway in A549 lung epithelial cells//Cell death & disease, – 2020. – Т. 11. – №. 6. – С. 1-12.4 Yap, GL et al., Annexin-A1 promotes RIG-I-dependent signaling and apoptosis via regulation of the IRF3–IFNAR–STAT1–IFIT1 pathway in A549 lung epithelial cells// Cell death & disease , – 2020. – T. 11. - no. 6. - S. 1-12.
5 Methods and targets for identifying compounds for regulating rhinovirus infection: patent appl. CA2679412A1, Canada, appl. CA2679412A, 28.02.2008, publ. 04.09.2009.5 Methods and targets for identifying compounds for regulating rhinovirus infection: patent appl. CA2679412A1, Canada, appl. CA2679412A, 02/28/2008, publ. 09/04/2009.
Claims (14)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2782428C1 true RU2782428C1 (en) | 2022-10-26 |
Family
ID=
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| YAP, G. L. et al., Annexin-A1 promotes RIG-I-dependent signaling and apoptosis via regulation of the IRF3-IFNAR-STAT1-IFIT1 pathway in A549 lung epithelial cells, Cell death & disease, 2020, Т. 11. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yapar et al. | Rapid and quantitative detection of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus by one-step real-time reverse transcriptase-PCR | |
| Singh et al. | Gene expression changes in peripheral blood mononuclear cells from multiple sclerosis patients undergoing β-interferon therapy | |
| KR102018201B1 (en) | Method and kit for detecting batcoronavirus using real-time PCR | |
| RU2727054C1 (en) | Method for detecting cdna of sars-cov-2 coronavirus using synthetic oligonucleotide primers in polymerase chain reaction | |
| CN111286559B (en) | Primer, probe and kit for detecting African swine fever virus | |
| US20180298455A1 (en) | Risk stratification in influenza | |
| JP2017519498A5 (en) | ||
| Tong et al. | Alteration of gene expression in human middle ear epithelial cells induced by influenza A virus and its implication for the pathogenesis of otitis media | |
| EP4161951A1 (en) | Methods for detecting and treating covid patients requiring intensive care | |
| RU2782428C1 (en) | Multiparametric diagnostic test system for quantitative determination of mrna level of human rig-1, ifit-1, ifih-1 genes | |
| TWI698640B (en) | Methods for detecting or assessing the risk of developing lupus nephritis and application thereof | |
| ES2827241T3 (en) | DNA methylation status as a biomarker of alcohol consumption and withdrawal | |
| RU2515911C1 (en) | Set of oligodesoxyribonucleic primers and fluorescence-labelled probes for identification of rna and differentiation of human parainfluenza virus of 1, 2, 3 and 4 types | |
| RU2511043C2 (en) | Set of oligodeoxyribonucleotide primers and fluorescently labelled probe for identification of dna of adenoviruses of serotypes 3, 4, 7, 14, 21 by method of hybridisation-fluorescence polymerase chain reaction | |
| US20230014092A1 (en) | Materials and methods for monitoring inflammation | |
| RU2811690C1 (en) | Test system for quantitative diagnostics of human mrna of mxa, oas1, eif2ak2 genes based on pcr | |
| van Rijn et al. | Single step high-throughput determination of Toll-like receptor 4 polymorphisms | |
| US10227655B2 (en) | Method for analyzing body fluid samples | |
| RU2751791C1 (en) | Test system for quantitative diagnosis of mrna of human interferon type i, ii and iii based on pcr | |
| Werling et al. | Ability to differentiate between cp and ncp BVDV by microarrays: Towards an application in clinical veterinary medicine? | |
| RU2644233C2 (en) | Method for leukosis diagnosis in cattle | |
| RU2795939C2 (en) | Reagent kit for detection of sars-cov-2 virus rna by real-timr polymerase chain reaction | |
| RU2627179C1 (en) | Test system for determination of interferon, il23 interleukine and mxa anti-virus protein rna | |
| KR101326367B1 (en) | Diagnostic methods and kits for monitoring resistance to therapeutic chemoagent | |
| RU2778855C1 (en) | Set of oligonucleotide primers and fluorescently labeled probes for the identification of human coronavirus sars-cov-2 rna by isothermal pcr with real-time hybridization-fluorescence detection |