RU2782326C1 - Method for diagnosing hodgkin lymphoma - Google Patents
Method for diagnosing hodgkin lymphoma Download PDFInfo
- Publication number
- RU2782326C1 RU2782326C1 RU2021123297A RU2021123297A RU2782326C1 RU 2782326 C1 RU2782326 C1 RU 2782326C1 RU 2021123297 A RU2021123297 A RU 2021123297A RU 2021123297 A RU2021123297 A RU 2021123297A RU 2782326 C1 RU2782326 C1 RU 2782326C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- nev
- tmb
- mcl
- taken
- dna
- Prior art date
Links
- 206010020243 Hodgkin's disease Diseases 0.000 title claims abstract description 35
- 201000006743 Hodgkin's lymphoma Diseases 0.000 title claims abstract description 32
- 229920002395 Aptamer Polymers 0.000 claims abstract description 34
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 claims abstract description 22
- 101710040533 TNFRSF8 Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 102100009538 TNFRSF8 Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 9
- 230000003287 optical Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 7
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims abstract description 6
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-N,N-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 22
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 13
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 10
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 9
- 210000001808 Exosomes Anatomy 0.000 description 8
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 8
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 7
- 210000001165 Lymph Nodes Anatomy 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 4
- 102100005827 CD63 Human genes 0.000 description 4
- 101700052224 CD63 Proteins 0.000 description 4
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 206010025310 Other lymphomas Diseases 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000003211 malignant Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 2
- 229940072417 Peroxidase Drugs 0.000 description 2
- 108090000437 Peroxidases Proteins 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 210000001350 Reed-Sternberg cells Anatomy 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 description 2
- 238000009096 combination chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000001809 detectable Effects 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 2
- 229910000460 iron oxide Inorganic materials 0.000 description 2
- UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N iron oxide Chemical compound [Fe]=O UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 229910044991 metal oxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000004706 metal oxides Chemical class 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 230000003595 spectral Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100001249 ALB Human genes 0.000 description 1
- 101710027066 ALB Proteins 0.000 description 1
- -1 ALT Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 210000001175 Cerebrospinal Fluid Anatomy 0.000 description 1
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 description 1
- 229940109239 Creatinine Drugs 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108060002563 EPCAM Proteins 0.000 description 1
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 210000001723 Extracellular Space Anatomy 0.000 description 1
- 102100019327 FUT4 Human genes 0.000 description 1
- 101700004786 FUT4 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 210000002751 Lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000003563 Lymphoid Tissue Anatomy 0.000 description 1
- 102100000165 MS4A1 Human genes 0.000 description 1
- 101710010909 MS4A1 Proteins 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 1
- 102100005499 PTPRC Human genes 0.000 description 1
- 101700059076 PTPRC Proteins 0.000 description 1
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 1
- 229920001533 Single-stranded nucleotide Polymers 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010001801 Tumor Necrosis Factor-alpha Proteins 0.000 description 1
- 230000032900 absorption of visible light Effects 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 229940050528 albumin Drugs 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 1
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive Effects 0.000 description 1
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 1
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002687 intercalation Effects 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 230000025563 intercellular transport Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 229920001239 microRNA Polymers 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 230000003278 mimic Effects 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000771 oncological Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological Effects 0.000 description 1
- 238000002600 positron emission tomography Methods 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 238000000575 proteomic Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000012217 radiopharmaceutical Substances 0.000 description 1
- 230000002799 radiopharmaceutical Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 201000000306 sarcoidosis Diseases 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 239000000107 tumor biomarker Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cells Anatomy 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и диагностической медицины, и может быть использовано для диагностики и мониторинга эффективности лечения лимфомы Ходжкина (ЛХ).The invention relates to the field of biotechnology and diagnostic medicine, and can be used to diagnose and monitor the effectiveness of the treatment of Hodgkin's lymphoma (HL).
Лимфома Ходжкина - (лимфогранулематоз, болезнь Ходжкина, злокачественная гранулема) злокачественное заболевание лимфоидной ткани. Патогномоничными признаками заболевания являются увеличение лимфоузлов и наличие гигантских клеток Ходжкина и Рида-Штернберга, обнаруживаемых при микроскопическом исследовании пораженных лимфатических узлов. Патологические клетки обычно составляют 0,1-3% клеток ткани пораженного лимфоузла, что может быть причиной отсутствия в циркулирующей плазме каких-либо специфических молекулярных маркеров заболевания.Hodgkin's lymphoma - (lymphogranulomatosis, Hodgkin's disease, malignant granuloma) is a malignant disease of the lymphoid tissue. The pathognomonic signs of the disease are an increase in lymph nodes and the presence of giant Hodgkin and Reed-Sternberg cells, detected by microscopic examination of the affected lymph nodes. Pathological cells usually make up 0.1-3% of the tissue cells of the affected lymph node, which may be the reason for the absence of any specific molecular markers of the disease in the circulating plasma.
Известен способ диагностики ЛХ с использованием набора маркеров (CD15, CD30, CD20, CD45), экспрессия которых оценивается в биопсийном материале методом иммуногистохимии (Федеральные клинические рекомендации для диагностики ЛХ).A known method for the diagnosis of HL using a set of markers (CD15, CD30, CD20, CD45), the expression of which is evaluated in the biopsy material by immunohistochemistry (Federal clinical guidelines for the diagnosis of HL).
Наиболее информативным методом мониторинга эффекта терапии является ПЭТ/КТ (позитронная эмиссионная томография, совмещенная с компьютерной томографией) с применением туморотропных радиофармпрепаратов.The most informative method for monitoring the effect of therapy is PET / CT (positron emission tomography combined with computed tomography) using tumoritropic radiopharmaceuticals.
Данный метод является дорогостоящим, сопряжен с лучевой нагрузкой, техническая возможность реализации есть не во всех медицинских учреждениях РФ, и, главное, интерпретация результатов требует нетривиальных подходов и не всегда достаточно адекватно отражает эффект проведенной терапии.This method is expensive, is associated with radiation exposure, the technical possibility of implementation is not available in all medical institutions of the Russian Federation, and, most importantly, the interpretation of the results requires non-trivial approaches and does not always adequately reflect the effect of the therapy.
Известны способы диагностики и мониторинга эффекта терапии к ЛХ, основанные на вариантах использования технологии жидкостной биопсии. В целом, методы жидкостной биопсии можно разделить на 4 класса, на основе структуры (размера) детектируемых компонентов циркулирующей крови: 1) свободно циркулирующие молекулярные маркеры; 2) внеклеточная ДНК [Rossi D., Spina V., Bruscaggin A., Gaidano G. Liquid biopsy in lymphoma//Haematologica. Сер. 104. - 2019. - N4. - С. 648-652], 3) внеклеточные нановезикулы [Marrugo-Ramfrez J., Mir M., Samitier J. Blood-Based Cancer Biomarkers in Liquid Biopsy: A Promising Non-Invasive Alternative to Tissue Biopy//International Journal of Molecular Sciences. Сер. 19. - 2018. - N10. - С. 2877] и 4) циркулирующие опухолевые клетки. Последний вариант, вряд ли в принципе применим в случае ЛХ, т.к. при этом заболевании доля опухолевых клеток составляет незначительный процент от объема пораженных лимфоузлов и сложно предполагать возможность циркуляции клеток Ходжкина или клеток Рида-Штернберга. В категорию молекулярных маркеров могут быть формально отнесены показатели биохимического анализа (ЛДГ, мочевина, креатинин, общий белок, альбумин, билирубин, ACT, АЛТ, щелочная фосфатаза, калий, натрий), который должен выполнятся всем пациентам с ЛХ согласно федеральным клиническим рекомендациям (2020 г.). Но ни один из этих параметров не обладает диагностической специфичностью по отношению к ЛХ, их анализ позволяет лишь оценить общее состояние пациента перед или в ходе проведения терапии. Специфические для ЛХ молекулярные маркеры пока не известны.Known methods for diagnosing and monitoring the effect of therapy to HL, based on options for using the technology of liquid biopsy. In general, liquid biopsy methods can be divided into 4 classes, based on the structure (size) of the detectable components of circulating blood: 1) freely circulating molecular markers; 2) extracellular DNA [Rossi D., Spina V., Bruscaggin A., Gaidano G. Liquid biopsy in lymphoma//Haematologica. Ser. 104. - 2019. - N4. - S. 648-652], 3) extracellular nanovesicles [Marrugo-Ramfrez J., Mir M., Samitier J. Blood-Based Cancer Biomarkers in Liquid Biopsy: A Promising Non-Invasive Alternative to Tissue Biopy//International Journal of Molecular Sciences. Ser. 19. - 2018. - N10. - S. 2877] and 4) circulating tumor cells. The last option is hardly applicable in principle in the case of LH, since in this disease, the proportion of tumor cells is a small percentage of the volume of affected lymph nodes and it is difficult to assume the possibility of circulation of Hodgkin cells or Reed-Sternberg cells. The category of molecular markers can formally include indicators of biochemical analysis (LDH, urea, creatinine, total protein, albumin, bilirubin, AST, ALT, alkaline phosphatase, potassium, sodium), which should be performed in all patients with HL according to federal clinical guidelines (2020 G.). But none of these parameters has diagnostic specificity in relation to HL, their analysis allows only assessing the general condition of the patient before or during therapy. Molecular markers specific for HL are not yet known.
В качестве потенциального аналога разработанной технологии можно рассмотреть метод детекции свободно циркулирующей ДНК (цДНК), который в настоящее время активно разрабатывается [Cirillo М., Craig A.F.M., Borchmann S., Kurtz D.M. Liquid biopsy in lymphoma: Molecular methods and clinical applications // Cancer Treatment Reviews. Сер. 91. - 2020. - С. 102106.19]. Основным преимуществом технологии анализа цДНК по сравнению с заявляемым способом является относительная простота исполнения: метод предполагает этап выделения ДНК из плазмы и ПНР для специфичной детекции мутантных последовательностей ДНК.As a potential analogue of the developed technology, we can consider the method of detection of freely circulating DNA (cDNA), which is currently being actively developed [Cirillo M., Craig A.F.M., Borchmann S., Kurtz D.M. Liquid biopsy in lymphoma: Molecular methods and clinical applications // Cancer Treatment Reviews. Ser. 91. - 2020. - S. 102106.19]. The main advantage of the cDNA analysis technology in comparison with the claimed method is the relative ease of execution: the method involves the stage of DNA extraction from plasma and NDP for the specific detection of mutant DNA sequences.
Основной недостаток технологии анализа цДНК в применении к задаче диагностики или мониторинга ЛХ заключается в отсутствии характерных для клеток Ходжкина мутаций. Эта проблема имеет принципиальный характер, так как ее решение требует анализа ДНК из изолированных клеток, что технически трудно из-за низкой представленности специфических клеток в составе пораженных лимфоузлов. До настоящего времени проведено лишь несколько исследований с целью анализа ДНК клеток Ходжкина, и их результаты не позволяют идентифицировать характерные для ЛХ генетические маркеры. В этой ситуации технология детекции цДНК имеет сомнительные перспективы как метод диагностики и/или мониторинга терапии ЛХ.The main drawback of the cDNA analysis technology when applied to the task of diagnosing or monitoring HL is the absence of mutations characteristic of Hodgkin cells. This problem is of fundamental nature, since its solution requires DNA analysis from isolated cells, which is technically difficult due to the low representation of specific cells in the affected lymph nodes. To date, only a few studies have been conducted to analyze the DNA of Hodgkin cells, and their results do not allow the identification of genetic markers characteristic of HL. In this situation, cDNA detection technology has dubious prospects as a method for diagnosing and/or monitoring HL therapy.
В ряде исследований было показано, что развитие лимфомы Ходжкина ассоциировано с «появлением» в плазме внеклеточных нановезикул (ВНВ), в состав мембраны которых входит маркер клеток Ходжкина CD30 [Caivano A., Laurenzana I., De Luca L., La Rocca F., Simeon V., Trino S., D'Auria F., Traficante A., Maietti M., Izzo Т., D'Arena G., Mansueto G., Pietrantuono G., Laurenti L., Musto P., Del Vecchio L. High serum levels of extracellular vesicles expressing malignancy-related markers are released in patients with various types of hematological neoplastic disorders // Tumor Biology. Сер. 36. - 2015. - N12. - С. 9739-9752].A number of studies have shown that the development of Hodgkin's lymphoma is associated with the "appearance" in the plasma of extracellular nanovesicles (ECVs), the membrane of which includes the marker of Hodgkin cells CD30 [Caivano A., Laurenzana I., De Luca L., La Rocca F. , Simeon V., Trino S., D'Auria F., Traficante A., Maietti M., Izzo T., D'Arena G., Mansueto G., Pietrantuono G., Laurenti L., Musto P., Del Vecchio L. High serum levels of extracellular vesicles expressing malignancy-related markers are released in patients with various types of hematological neoplastic disorders // Tumor Biology. Ser. 36. - 2015. - N12. - S. 9739-9752].
Теоретическая возможность количественной оценки таких CD30(+)BHB с целью диагностики или мониторинга эффекта терапии пациентов с ЛХ предполагалась относительно давно [Kuppers R. New insights in the biology of Hodgkin lymphoma // Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. American Society of Hematology. Education Program], но прецедентов практической реализации такой возможности пока не было.The theoretical possibility of quantifying such CD30(+)BHB for the purpose of diagnosing or monitoring the effect of therapy in patients with HL has been proposed for a relatively long time [Kuppers R. New insights in the biology of Hodgkin lymphoma // Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. American Society of Hematology. Education Program], but there have been no precedents for the practical implementation of such an opportunity yet.
Внеклеточные нановезикулы (ВНВ) - это мембранные образования диаметром 30-150 нм, присутствующие почти во всех биологических жидкостях. Они секретируются большинством типов клеток во внеклеточное пространство и обеспечивают межклеточный транспорт сигнальных и структурных молекул. Основными компонентами мембраны ВНВ являются липиды и белки [Zhang J., Li S., Li L., Li M., Guo C, Yao J., Mi S. Exosome and exosomal microRNA: Trafficking, sorting, and function//Genomics, Proteomics and Bioinformatics.]. Состав ВНВ напрямую зависит от «родительских» клеток и их состояния [Zhang Y., Liu Y., Liu H., Tang W. H. Exosomes: biogenesis, biologic function and clinical potentiall // Cell & Bioscience. Сер. 9. - 2019. - N1.- С. 19]. При возникновении и развитии онкологических заболеваний, злокачественные клетки так же секретируют ВНВ, которые попадают в физиологические жидкости (плазму, лимфу, ликвор и т.д.), искажая нормальный состав ВНВ. Таким образом, ВНВ, секретируемые злокачественными клетками, являются перспективными онкомаркерами, на основе методов анализа ВНВ могут быть созданы системы ранней диагностики. Такие методы основаны на анализе изменений белкового профиля или нуклеиновых кислот в составе циркулирующих везикул, всех или отдельных фракций [Malek A.V., Samsonov R.B., Chiesi А. Development of cancer diagnostics and monitoring methods based on analysis of tumor-derived exosomes // Russian Journal of Biotherapy. Сер. 14. - 2015. - N4. - С. 9-18; Whiteside Т. L. The potential of tumor-derived exosomes for noninvasive cancer monitoring//Expert Review of Molecular Diagnostics. Сер. 15. - 2015. - N10. - С. 1293-1310]. Например, для оценки белкового состава ВНВ, в теории, могут быть использованы стандартные технологии, такие как: проточная цитометрия, иммуно-ферментный анализ, иммуно-химический анализ и вестерн-блоттинг.Extracellular nanovesicles (ECVs) are membrane formations with a diameter of 30-150 nm, present in almost all biological fluids. They are secreted by most cell types into the extracellular space and provide intercellular transport of signaling and structural molecules. The main components of the GHV membrane are lipids and proteins [Zhang J., Li S., Li L., Li M., Guo C, Yao J., Mi S. Exosome and exosomal microRNA: Trafficking, sorting, and function//Genomics, Proteomics and Bioinformatics]. The composition of the VNV directly depends on the "parent" cells and their condition [Zhang Y., Liu Y., Liu H., Tang W. H. Exosomes: biogenesis, biologic function and clinical potentiall // Cell & Bioscience. Ser. 9. - 2019. - N1.- P. 19]. During the onset and development of oncological diseases, malignant cells also secrete VNV, which enter physiological fluids (plasma, lymph, cerebrospinal fluid, etc.), distorting the normal composition of VNV. Thus, VNV secreted by malignant cells are promising tumor markers; based on VNV analysis methods, early diagnostic systems can be created. Such methods are based on the analysis of changes in the protein profile or nucleic acids in the composition of circulating vesicles, all or individual fractions [Malek A.V., Samsonov R.B., Chiesi A. Development of cancer diagnostics and monitoring methods based on analysis of tumor-derived exosomes // Russian Journal of biotherapy. Ser. 14. - 2015. - N4. - S. 9-18; Whiteside T. L. The potential of tumor-derived exosomes for noninvasive cancer monitoring//Expert Review of Molecular Diagnostics. Ser. 15. - 2015. - N10. - S. 1293-1310]. For example, standard technologies such as flow cytometry, enzyme immunoassay, immunochemical analysis, and Western blotting can theoretically be used to evaluate the protein composition of the VNV.
Однако чувствительность этих методов недостаточна для детекции малых концентраций объектов исследования, что определяет востребованность новых аналитических технологий.However, the sensitivity of these methods is insufficient for detecting low concentrations of research objects, which determines the demand for new analytical technologies.
Ферментативная (фермент-миметическая) активность нано-материалов - это свойство, которое приобретают твердофазные материалы, для которых в обычном состоянии не характерна ферментативная активность. В виде суспензии нано-частиц (НЧ), т.е. частиц сфероидной формы с размерами 1-100 нм, твердофазные материалы, например, металлы или оксиды металлов, приобретают ферментативную активность. Этот феномен особенно характерен для НЧ, размер которых варьирует в диапазоне 3-30 нм. Феномен фермент-миметической активности НЧ металлов привлекает значительный интерес в области промышленного катализа и биомедицины [Tsekhmistrenko S.I., Bityutskyy V.S., Tsekhmistrenko O.S., Polishchuk V.M., Polishchuk S.A., Ponomarenko N.V., Melnychenko Y.O., Spivak M.Y. Enzyme-like activity of nanomaterials//Regulatory Mechanisms in Biosystems. Сер. 9. - 2018.- N3.- С. 469-476; Liu L., Hao Y., Deng D., Xia N. Nanomaterials-Based Colorimetric Immunoassays//Nanomaterials. Сер. 9. - 2019.- N3.- С.316]. Это свойство открывает возможность применения НЧ в качестве биосенсоров к различным органическим молекулам [Liu X., Huang D., Lai С, Qin L., Zeng G., Xu P., Li В., Yi H., Zhang M. Peroxidase Like Activity of Smart Nanomaterials and Their Advanced Application in Colorimetric Glucose Biosensors // Small. Сер. 15.-2019. - N17. - С. 1900133]. Модификация поверхности НЧ приводит к изменению фермент-миметической активности. Например, НЧ золота способны катализировать окисление тетраметилбензидин (ТМБ) [Li R.S., Liu Н., Chen В. Bin, Zhang H.Z., Huang C.Z., Wang J. Stable gold nanoparticles as a novel peroxidase mimic for colorimetric detection of cysteine//Analytical Methods. Сер. 8. - 2016. - N11.- С. 2494-2501], а модификация поверхности НЧ изменяет это свойство. В качестве «модификаторов» могут быть использованы анионные полимеры, например, нуклеиновые кислоты, которые способны не специфически адсорбироваться на поверхности НЧ.The enzymatic (enzyme-mimetic) activity of nano-materials is a property that solid-phase materials acquire, for which enzymatic activity is not typical in the normal state. In the form of a suspension of nanoparticles (NPs), i.e. particles of a spheroid shape with a size of 1-100 nm, solid-phase materials, such as metals or metal oxides, acquire enzymatic activity. This phenomenon is especially typical for NPs whose size varies in the range of 3–30 nm. The phenomenon of enzyme-mimetic activity of metal NPs attracts considerable interest in the field of industrial catalysis and biomedicine [Tsekhmistrenko S.I., Bityutskyy V.S., Tsekhmistrenko O.S., Polishchuk V.M., Polishchuk S.A., Ponomarenko N.V., Melnychenko Y.O., Spivak M.Y. Enzyme-like activity of nanomaterials//Regulatory Mechanisms in Biosystems. Ser. 9. - 2018.- N3.- S. 469-476; Liu L., Hao Y., Deng D., Xia N. Nanomaterials-Based Colorimetric Immunoassays//Nanomaterials. Ser. 9. - 2019.- N3.- P.316]. This property opens up the possibility of using nanoparticles as biosensors for various organic molecules [Liu X., Huang D., Lai C, Qin L., Zeng G., Xu P., Li B., Yi H., Zhang M. Peroxidase Like Activity of Smart Nanomaterials and Their Advanced Application in Colorimetric Glucose Biosensors // Small. Ser. 15.-2019. - N17. - S. 1900133]. Modification of the NP surface leads to a change in the enzyme-mimetic activity. For example, gold NPs are able to catalyze the oxidation of tetramethylbenzidine (TMB) [Li R.S., Liu H., Chen B. Bin, Zhang H.Z., Huang C.Z., Wang J. Stable gold nanoparticles as a novel peroxidase mimic for colorimetric detection of cysteine//Analytical Methods . Ser. 8. - 2016. - N11. - S. 2494-2501], and modification of the NP surface changes this property. Anionic polymers, for example, nucleic acids, which are capable of adsorbing nonspecifically on the surface of NPs, can be used as “modifiers”.
Аптамеры это короткие (~ 20-70 оснований) одноцепочечные нуклеотиды, способные связывать различные молекулы с высокой аффинностью и специфичностью [Lakhin A.V., Tarantul V.Z., Gening L.V. Aptamers: Problems, solutions and prospects//Acta Naturae. Russian Federation Agency for Science and Innovation].Aptamers are short (~ 20-70 bases) single-stranded nucleotides capable of binding various molecules with high affinity and specificity [Lakhin A.V., Tarantul V.Z., Gening L.V. Aptamers: Problems, solutions and prospects//Acta Naturae. Russian Federation Agency for Science and Innovation].
Связывание аптамера с мишенью определяется его третичной структурой, гидрофобными взаимодействиями, укладкой оснований и интеркаляцией [Adachi, Nakamura. Aptamers: A Review of Their Chemical Properties and Modifications for Therapeutic Application // Molecules. Сер. 24. - 2019. - N23.- С. 4229]. В свою очередь третичная структура аптамера определяется первичной структурой (последовательностью нуклеотидов в составе ДНК или РНК цепи) и условиями формирования внутримолекулярных связей. При этом пространственная организация молекулы аптамера характеризуется высокой специфичностью и стабильностью, что обеспечивает возможность специфического взаимодействия с другими молекулами. Природным прототипом аптамеров являются молекулы РНК, пространственная организация которых обеспечивает их взаимодействие с ядерными белками. Высокая специфичность аптамеров к мишеням позволила использовать их в качестве терапевтических агентов в области онкологии и вирусологии. Аптамеры, взаимодействующие с мембранным рецептором фактора некроза опухоли CD30 (также известный как TNFRDF8), были описаны относительно недавно [Parekh P., Kamble S., Zhao N., Zeng Z., Portier B.P., Zu Y. Immunotherapy of CD30-expressing lymphoma using a highly stable ssDNA aptamer // Biomaterials. Сер. 34. - 2013. - N35. - С. 8909-8917].Aptamer binding to the target is determined by its tertiary structure, hydrophobic interactions, base stacking and intercalation [Adachi, Nakamura. Aptamers: A Review of Their Chemical Properties and Modifications for Therapeutic Application // Molecules. Ser. 24. - 2019. - N23.- S. 4229]. In turn, the tertiary structure of the aptamer is determined by the primary structure (the sequence of nucleotides in the DNA or RNA chain) and the conditions for the formation of intramolecular bonds. At the same time, the spatial organization of the aptamer molecule is characterized by high specificity and stability, which provides the possibility of specific interaction with other molecules. The natural prototype of aptamers are RNA molecules, the spatial organization of which ensures their interaction with nuclear proteins. The high target specificity of aptamers has made it possible to use them as therapeutic agents in oncology and virology. Aptamers interacting with the tumor necrosis factor membrane receptor CD30 (also known as TNFRDF8) have been described relatively recently [Parekh P., Kamble S., Zhao N., Zeng Z., Portier B.P., Zu Y. Immunotherapy of CD30-expressing lymphoma using a highly stable ssDNA aptamer // Biomaterials. Ser. 34. - 2013. - N35. - S. 8909-8917].
Описанные особенности НЧ и аптамеров дают почву для создания технологии, в основе которой лежит конкурентное связывание ДНК-аптамеров либо золотом (слабо и неспецифично) - либо молекулярными лигандами (эффективно и специфично). Если молекулярный лиганд входит в состав мембраны внеклеточной нановезикулы (ВНВ), то возможно создание динамической системы из трех компонентов НЧ - аптамеры - ВНВ. При этом ДНК-аптамеры распределяются между НЧ и ВНВ, мембрана которых содержит лиганды. Принцип способа показан на Фиг. 1. Чем больше в такой системе везикул, несущих специфические лиганды, тем большее число молекул аптамеров будет связано с ВНВ и меньшее - с НЧ, при этом НЧ начинают проявлять свою фермент-миметическую активность. Эта активность проявляется в виде цветной реакции при добавлении субстрата и может быть оценена методом колориметрии.The described features of NPs and aptamers provide the basis for creating a technology based on the competitive binding of DNA aptamers with either gold (weak and nonspecific) or molecular ligands (effective and specific). If the molecular ligand is part of the membrane of an extracellular nanovesicle (ECV), then it is possible to create a dynamic system of three components of NPs - aptamers - EEC. In this case, DNA aptamers are distributed between NPs and VNV, the membrane of which contains ligands. The principle of the method is shown in Fig. 1. The more vesicles carrying specific ligands in such a system, the greater the number of aptamer molecules will be associated with VNV and the smaller number - with NPs, while NPs begin to show their enzyme-mimetic activity. This activity appears as a color reaction upon addition of the substrate and can be assessed by colorimetry.
В качестве ближайших аналогов, близких по технологии заявляемому способу могут, быть рассмотрены два метода, представленных в научных публикациях.As the closest analogues, close in technology to the claimed method, two methods presented in scientific publications can be considered.
В первом случае авторами технологии решалась задача количественной оценки концентрации специфических белков, представленных на поверхности ВНВ; были использованы нано-частицы золота (13 нм) и аптамеры, специфично связывающие различные везикулярные маркеры [Jiang Y., Shi М., Liu Y., Wan S., Cui C, Zhang L., Tan W. Aptamer/AuNP Biosensor for Colorimetric Profiling of Exosomal Proteins // Angewandte Chemie International Edition. Сер. 56. - 2017. - N39. - С. 11916-11920]. Авторы статьи оценивали изменение спектральных характеристик золотых НЧ (НЧ-Au) при добавлении аптамера, а также последующего добавления ВНВ, но эти изменения возникали по причине феномена агрегации-дезагрегации НЧ, а не в результате проявления их фермент-миметических характеристик. Точнее, в солевых растворах золотые НЧ-Au склонны к сильному агрегированию, модификация аптамером стабилизируют частицы в солевом растворе. Добавление ВНВ влечет за собой переход молекул аптамера с НЧ-Au на поверхность добавляемых ВНВ. Отсутствие «стабилизатора» на поверхности золотых НЧ приводит к обратному их агрегированию и изменению спектра поглощения раствора. В зависимости от концентрации детектируемого везикулярного маркера в суспензии ВНВ, раствор НЧ-Au агрегирует с большей или меньшей степенью, что пропорционально оптической плотности частиц. Параметром оценки концентрации везикулярного маркера в пробе было отношение коэффициентов экстинции при 650 нм и 520 нм.In the first case, the authors of the technology solved the problem of quantifying the concentration of specific proteins present on the surface of the VNV; gold nanoparticles (13 nm) and aptamers specifically binding various vesicular markers were used [Jiang Y., Shi M., Liu Y., Wan S., Cui C, Zhang L., Tan W. Aptamer/AuNP Biosensor for Colorimetric Profiling of Exosomal Proteins // Angewandte Chemie International Edition. Ser. 56. - 2017. - N39. - S. 11916-11920]. The authors of the article evaluated the change in the spectral characteristics of gold NPs (NP-Au) upon addition of the aptamer, as well as the subsequent addition of VNV, but these changes arose due to the aggregation-deaggregation phenomenon of NPs, and not as a result of their enzyme-mimetic characteristics. More precisely, in saline solutions, gold Au NPs are prone to strong aggregation; modification with an aptamer stabilizes the particles in saline solution. The addition of VNV entails the transfer of aptamer molecules from Au NPs to the surface of the added VNV. The absence of a “stabilizer” on the surface of gold NPs leads to their reverse aggregation and changes in the absorption spectrum of the solution. Depending on the concentration of the detectable vesicular marker in the VNV suspension, the NP-Au solution aggregates to a greater or lesser extent, which is proportional to the optical density of the particles. The parameter for assessing the concentration of the vesicular marker in the sample was the ratio of extinction coefficients at 650 nm and 520 nm.
Во втором случае авторами решалась аналогичная задача количественной оценки специфических популяций PSA(+)BHB или EpCam(+)BHB [Chen J., Xu Y., Lu Y., Xing W. Isolation and Visible Detection of Tumor-Derived Exosomes from Plasma // Analytical Chemistry - 2018), были использованы наночастицы оксида желез (Fe304) и аптамеры; измерялось изменение фермент-миметической активности оксида железа в присутствии ВНВ, имеющих специфический маркер. Но авторы этой технологии наблюдали обратный эффект адсорбции ДНК-аптамеров на поверхности нано-частиц: адсорбция ДНК вызывала активацию фермент-миметических свойств частиц оксида металла. Поэтому принцип метода количественной оценки специфических нано-везикул заключался в оценке степени угнетения цветной реакции ферментативного окисления ТМБ в присутствии ВНВ.In the second case, the authors solved a similar problem of quantifying specific populations of PSA(+)BHB or EpCam(+)BHB [Chen J., Xu Y., Lu Y., Xing W. Isolation and Visible Detection of Tumor-Derived Exosomes from Plasma / / Analytical Chemistry - 2018), iron oxide nanoparticles (Fe304) and aptamers were used; the change in the enzyme-mimetic activity of iron oxide was measured in the presence of BHBs having a specific marker. However, the authors of this technology observed the reverse effect of adsorption of DNA aptamers on the surface of nanoparticles: DNA adsorption caused the activation of the enzyme-mimetic properties of metal oxide particles. Therefore, the principle of the method for quantitative assessment of specific nanovesicles was to assess the degree of inhibition of the color reaction of the enzymatic oxidation of TMB in the presence of VNV.
Таким образом, известная методика имеет сходство с разработанной нами технологией, но основана на обратной зависимости между фермент миметической активностью наночастиц и степенью адсорбции к их поверхности ДНК-аптамеров.Thus, the known technique is similar to the technology developed by us, but is based on an inverse relationship between the enzyme-mimetic activity of nanoparticles and the degree of adsorption of DNA aptamers to their surface.
Техническим результатом изобретения является создание технологии количественной оценки CD30(+)BHB, основанной на эффекте изменения фермент-миметических свойств наночастиц золота (НЧ-Au) в результате адсорбции на их поверхности ДНК, для диагностики и мониторинга эффективности терапии ЛХ, безопасность и безвредность исследования для пациентов, низкая стоимость процедуры, технологичность.The technical result of the invention is the creation of a technology for quantitative evaluation of CD30(+)BHB, based on the effect of changing the enzyme-mimetic properties of gold nanoparticles (NP-Au) as a result of adsorption of DNA on their surface, for diagnosing and monitoring the effectiveness of HL therapy, the safety and harmlessness of the study for patients, low cost of the procedure, manufacturability.
Указанный технический результат достигается в способе диагностики лимфомы Ходжкина, в котором выделяют тотальную популяцию внеклеточных нановезикул (ВНВ) из плазмы крови с помощью двухфазной полимерной системы, формируют комплекс из наночастиц золота (НЧ-Au) размером 5-10 нм и ДНК-аптамеров ACTGGGCGAAACAAGTCTATTGACTATGAG (CD30-Apt), взятых в соотношении 10 мкл /2,5 мкл, инкубируют полученный комплекс с тотальной популяцией ВНВ, взятой в объеме 1 мкл, добавляют 10 мкл субстрата тетраметилбензидиина (ТМБ) в концентрации 100 пмоль/мл, полученную смесь препарата ВНВ с тремя компонентами НЧ-Au, CD30-Apt и ТМБ инкубируют 18 мин при 37°С, осуществляют количественную оценку фракции ВНВ, в состав мембраны которых входит белковый маркер CD30 (CD30 (+) ВНВ), путем цветной реакции окисления ТМБ и регистрации оптической плотности смеси с помощью спектрофотометрического анализа на длине волны 378 нм, значение оптической плотности 1.8 - 2,2 считают нормой, а при значении 6-11 диагностируют лимфому Ходжкина.This technical result is achieved in a method for diagnosing Hodgkin's lymphoma, in which a total population of extracellular nanovesicles (ECVs) is isolated from blood plasma using a two-phase polymer system, a complex is formed from gold nanoparticles (NP-Au) 5-10 nm in size and DNA aptamers ACTGGGCGAAACAAGTCTATTGACTATGAG ( CD30-Apt), taken in a ratio of 10 µl / 2.5 µl, the resulting complex is incubated with a total population of VNV taken in a volume of 1 µl, 10 µl of tetramethylbenzidiine (TMB) substrate at a concentration of 100 pmol/ml is added, the resulting mixture of the VNV preparation with three components of NP-Au, CD30-Apt and TMB are incubated for 18 min at 37°C, a quantitative assessment of the VHB fraction, the membrane of which includes the CD30 protein marker (CD30 (+) VHB), is carried out by color reaction of TMB oxidation and registration of optical density mixture using spectrophotometric analysis at a wavelength of 378 nm, the optical density value of 1.8 - 2.2 is considered the norm, and at a value of 6-11 Ho lymphoma is diagnosed jkina.
Количественная оценка CD30(+)BHB, основанная на эффекте изменения фермент-миметических свойств наночастиц золота (НЧ-Аи) в результате адсорбции на их поверхности ДНК, является способом диагностики лимфомы Ходжкина, так как концентрация CD30(+)BHB отражает активность заболевания ЛХ.Quantification of CD30(+)BHB, based on the effect of changing the enzyme-mimetic properties of gold nanoparticles (NP-Ai) as a result of adsorption of DNA on their surface, is a method for diagnosing Hodgkin's lymphoma, since the concentration of CD30(+)BHB reflects the activity of HL disease.
В качестве ДНК были использованы ДНК-аптамеры, специфично взаимодействующие с маркером CD30. В ходе работы было показано, НЧ-Аи способны катализировать цветную реакцию окисления ТМБ, эта способность доза-зависимо и обратимо угнетается в результате адсорбции ДНК на поверхности НЧ-Аи.DNA aptamers specifically interacting with the CD30 marker were used as DNA. In the course of the work, it was shown that NP-Au are able to catalyze the color reaction of TMB oxidation, this ability is dose-dependently and reversibly inhibited as a result of DNA adsorption on the surface of NP-Au.
В случае использования ДНК-аптамеров к маркеру CD30, появление в реакционной смеси CD30(+)BHB приводило к перераспределению молекул аптамера от НЧ-Au к CD30(+)BHB.In the case of using DNA aptamers to the CD30 marker, the appearance of CD30(+)BHB in the reaction mixture led to a redistribution of the aptamer molecules from NP-Au to CD30(+)BHB.
В ходе работы над созданием технологии были оптимизированы условия проведения данной реакции, включая детали процедуры, концентрации компонентов, время / температура инкубаций, длина волны при оценке степени поглощения раствором света видимого спектра.In the course of work on the creation of the technology, the conditions for carrying out this reaction were optimized, including the details of the procedure, the concentrations of the components, the time / temperature of incubations, the wavelength when assessing the degree of absorption of visible light by the solution.
В рамках разработки технологии, была проведена серия экспериментов с использованием аптамера другой последовательности, который специфично связывает известный маркер CD63, присутствующий на мембране всех ВНВ - экзосомальной природы.As part of the development of the technology, a series of experiments was carried out using an aptamer of a different sequence, which specifically binds the known marker CD63, which is present on the membrane of all VHV - exosomal nature.
Результаты исследования представлены на фиг.2-6.The results of the study are presented in Fig.2-6.
Способ иллюстрируется фиг.1-6, где:The method is illustrated in figures 1-6, where:
На фиг. 1 - показан принцип способа.In FIG. 1 shows the principle of the method.
На фиг. 2 - Внешний вид пробирок с реакционной смесью, содержащей аптамер к общему маркеру ВНВ - белку CD63 (Apt-CD63), НЧ-Au, субстрат ТМБ и различное количество ВНВ, который отражает степень окраски раствора в зависимости от активации фермент-миметической активности НЧ-Au.In FIG. 2 - Appearance of the test tubes with the reaction mixture containing the aptamer to the common marker VNV - CD63 protein (Apt-CD63), NP-Au, TMB substrate and various amounts of VNV, which reflects the degree of color of the solution depending on the activation of the enzyme-mimetic activity of NP- Au.
На фиг. 3 - Спектральные линии анализируемого раствора, содержащего аптамеры к общему маркеру ВНВ - белку CD63 (Apt-CD63) и НЧ-Au, в присутствии различного количества экзосом, выраженного в условных единицах, и ТМБ.In FIG. 3 - Spectral lines of the analyzed solution containing aptamers to the common VHV marker - CD63 protein (Apt-CD63) and NP-Au, in the presence of a different number of exosomes, expressed in arbitrary units, and TMB.
На фиг. 4 - График зависимости коэффициента экстинции при анализе смеси аптамера к общему маркеру ВНВ - белку CD63 (Apt-CD63), НЧ-Au, ВНВ и субстрата ТМБ от количества ВНВ в составе смеси (при 378 нм).In FIG. 4 - Graph of the dependence of the extinction coefficient in the analysis of the aptamer mixture to the common VNV marker - CD63 protein (Apt-CD63), NP-Au, VNV and TMB substrate on the amount of VNV in the mixture (at 378 nm).
На фиг. 5,6 - Результаты исследования к примерам 1,2 соответственно.In FIG. 5.6 - Results of the study for examples 1.2, respectively.
Способ осуществляют, например, следующим образом.The method is carried out, for example, as follows.
Плазму помещают в пробирку объемом 2 мл. Центрифугируют последовательно 200g 10 мин, 800g 10 мин, 1500g 10 мин. Далее плазма проходит через гидрофильный фильтр 0,22 мкм. Из подготовленной плазмы выделяют экзосомы (CD30(+)BHB с помощью двухфазной полимерной системы [Slyusarenko М., Nikiforova N., Sidina Е., Nazarova I., Egorov V., Garmay Y., Merdalimova A., Yevlampieva N., Gorin D., Malek A. Formation and Evaluation of a Two-Phase Polymer System in Human Plasma as a Method for Extracellular Nanovesicle Isolation // Polymers. Сер. 13. - 2021. - N3.- С. 458. - 17]. Далее в центрифужную пробирку объемом 200 мкл добавляют 10 мкл золотых наночастиц, к ним добавляют 2,5 мкл аптамера (концентрация 100 пмоль/мл), перемешивают аккуратным пипетированием 8-10 раз. Полученную смесь перемешивают в течение 30 мин при +4°С. К смеси добавляют 1 мкл экзосом (образец с концентрацией (2±1)*1011 частиц/мл), перемешивают аккуратным пипетированием 8-10 раз. Полученный раствор инкубируют при +4°С при постоянном перемешивании в течение 30 минут.Далее к суспензии наночастиц и везикул добавляют 10 мкл субстрата пероксидазы хрена (ТМБ).The plasma is placed in a 2 ml tube. Centrifuge successively
Ферментативная реакция протекает в темноте при +37°С 18 минут. Образовавшиеся конгломераты осаждают путем центрифугирования при 6000g 3 минуты. Далее происходит регистрация оптической плотности раствора при 378 нм. У здоровых доноров это значение изменяется в диапазоне значений 1,8-2,2. У пациентов с ЛХ до начала лечения это значение изменяется в диапазоне 6-11, в процессе лечения снижается, иногда до нормальных значений.The enzymatic reaction takes place in the dark at +37°C for 18 minutes. The resulting conglomerates are precipitated by centrifugation at 6000g for 3 minutes. Next, the optical density of the solution is recorded at 378 nm. In healthy donors, this value varies in the range of 1.8-2.2. In patients with HL before treatment, this value varies in the range of 6-11, during treatment it decreases, sometimes to normal values.
Способ подтверждается следующими клиническими примерами.The method is confirmed by the following clinical examples.
Пример 1. Сравнение образцов здоровых доноров и пациентов с впервые установленным диагнозом ЛХ: диагностикаExample 1 Comparison of Healthy Donor and Newly Diagnosed HL Samples: Diagnosis
Образцы венозной крови были получены от 5 здоровых доноров и 5 пациентов с вновь поставленным диагнозом ЛХ были собраны в вакутейнеры с ЭДТА. Все диагнозы были верифицированы морфологическим и ИГХ исследованием биоптатов пораженных лимфоузлов. После отделения плазмы путем центрифугирования (1500g 3 мин), 2 мл плазмы были использованы для анализа, который проведен согласно протоколу, представленному выше. Измерение поглощения света на длине волны 378 нм проведено на планшетном ридере Varioskan Flash. Проведен подсчет средних для групп образцов значений (доноры 2,6 vs. пациенты 7,1) и показателей стандартных отклонений. Результаты представлены на фиг. 5.Venous blood samples were obtained from 5 healthy donors and 5 newly diagnosed HL patients were collected in EDTA vacutainers. All diagnoses were verified by morphological and IHC examination of biopsy specimens of the affected lymph nodes. After separation of plasma by centrifugation (1500g 3 min), 2 ml of plasma were used for analysis, which was carried out according to the protocol presented above. Light absorption at a wavelength of 378 nm was measured using a Varioskan Flash tablet reader. The mean values for groups of samples (donors 2.6 vs. patients 7.1) and standard deviations were calculated. The results are shown in FIG. 5.
Пример 2. Сравнение образцов пациентов, с впервые установленным диагнозом ЛХ, до начала лечения, после проведения двух циклов полихимиотерапии (ABDV): мониторинг терапииExample 2 Comparison of samples from patients with newly diagnosed HL, before treatment, after two cycles of polychemotherapy (ABDV): therapy monitoring
Образцы венозной крови были получены от 5 пациентов, с вновь поставленным диагнозом ЛХ, до начала лечения и после проведения двух циклов полихимиотерапии. Образцы крови были собраны в вакутейнеры с ЭДТА. После отделения плазмы путем центрифугирования (1500g 3 мин), 2 мл плазмы были использованы для анализа, который проведен согласно протоколу, представленному выше. Измерение поглощения света на длине волны 378 нм проведено на планшетном ридере Varioskan Flash. Проведен подсчет средних для групп образцов значений (пациенты до лечения -7,1 vs. пациенты после лечения 2,3), и показателей стандартных отклонений. Результаты представлены на фиг. 6.Venous blood samples were obtained from 5 patients with newly diagnosed HL before treatment and after two cycles of polychemotherapy. Blood samples were collected in EDTA vacutainers. After separation of plasma by centrifugation (1500g 3 min), 2 ml of plasma were used for analysis, which was carried out according to the protocol presented above. Light absorption at a wavelength of 378 nm was measured using a Varioskan Flash tablet reader. The mean values for groups of samples were calculated (patients before treatment -7.1 vs. patients after treatment 2.3), and standard deviations. The results are shown in FIG. 6.
Заявляемый способ позволяет осуществлять диагностику и мониторинг эффективности терапии лимфомы Ходжкина с помощью новой технологии количественной оценки CD30(+)BHB, основанной на эффекте изменения фермент-миметических свойств нано-частиц золота (НЧ-Au) в результате адсорбции на их поверхности ДНК. Является безопасным и безвредным для пациентов, обладает низкой стоимостью процедуры.The claimed method allows to diagnose and monitor the effectiveness of therapy for Hodgkin's lymphoma using a new technology for quantitative evaluation of CD30(+)BHB, based on the effect of changing the enzyme-mimetic properties of gold nanoparticles (NP-Au) as a result of DNA adsorption on their surface. It is safe and harmless for patients, has a low cost of the procedure.
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2782326C1 true RU2782326C1 (en) | 2022-10-25 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017004243A1 (en) * | 2015-06-29 | 2017-01-05 | Caris Science, Inc. | Therapeutic oligonucleotides |
| RU2743657C2 (en) * | 2014-10-08 | 2021-02-20 | Новартис Аг | Biomarkers predicting a therapeutic response to therapy with a chimeric antigen receptor, and use thereof |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2743657C2 (en) * | 2014-10-08 | 2021-02-20 | Новартис Аг | Biomarkers predicting a therapeutic response to therapy with a chimeric antigen receptor, and use thereof |
| WO2017004243A1 (en) * | 2015-06-29 | 2017-01-05 | Caris Science, Inc. | Therapeutic oligonucleotides |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JIANG Y. et al., Aptamer/AuNP Biosensor for Colorimetric Profiling of Exosomal Proteins. Angew Chem Int Ed Engl. 2017 Sep 18; 56(39): 11916-11920. CHEN J. et al., Isolation and Visible Detection of Tumor-Derived Exosomes from Plasma. Anal. Chem. 2018; 90(24): 14207-14215. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hu et al. | Extracellular vesicles in cancer detection: hopes and hypes | |
| Szaniawska et al. | Applications of surface-enhanced Raman scattering in biochemical and medical analysis | |
| US9686395B2 (en) | Apparatus and method for point-of-collection measurement of a biomolecular reaction | |
| Mondello et al. | Blood-based diagnostics of traumatic brain injuries | |
| US11971408B2 (en) | Methods and devices for analyzing species to determine diseases | |
| Van der Meel et al. | Toward routine detection of extracellular vesicles in clinical samples | |
| Wang et al. | Visual detection of myoglobin via G-quadruplex DNAzyme functionalized gold nanoparticles-based colorimetric biosensor | |
| CN108613977B (en) | N-terminal brain natriuretic peptide precursor detection kit | |
| Chandel et al. | Procalcitonin as the biomarker of inflammation in diagnosis of appendicitis in pediatric patients and prevention of unnecessary appendectomies | |
| US20200316605A1 (en) | Microfluidic sensor | |
| CN211905389U (en) | Non-invasive brain injury diagnostic device | |
| CN101231288B (en) | Novel method for analyzing human thymidine kinase fluorescence immune based on magnetic nanometer particular | |
| US9005994B2 (en) | Methods for biomolecule and biomolecule complex (BMC) detection and analysis and the use of such for research and medical diagnosis | |
| CN103353521A (en) | Method for determining contents of biological marker and DNA through direct-reading portable glucometer | |
| CN102243241A (en) | Homogeneous phase aerosol particle-type neutrophile granulocyte gelatinase-related lipid carrier protein determination kit and preparation method thereof | |
| Kang et al. | Multiplex isolation and profiling of extracellular vesicles using a microfluidic DICE device | |
| Slyusarenko et al. | AuNP aptasensor for hodgkin lymphoma monitoring | |
| CN107870244B (en) | Immunoliposome LAMP method for protein hypersensitivity detection | |
| RU2782326C1 (en) | Method for diagnosing hodgkin lymphoma | |
| Ramzannezhad et al. | Magnetic detection of albuminuria using hematite nanorods synthesized via chemical hydrothermal method | |
| Berezin et al. | The promises, methodological discrepancies and pitfalls in measurement of cell-derived extracellular vesicles in diseases | |
| Castro et al. | Exploring alternative ovarian cancer biomarkers using innovative nanotechnology strategies | |
| Yang et al. | Quantitative, point-of-care immunoassay platform to guide and monitor sickle cell disease therapy | |
| JPS6281567A (en) | Quantification method using particle agglutination reaction | |
| US20070292963A1 (en) | Optical determination of serum components for cancer screening |