RU2782261C2 - Vaccine composition for treatment of cancer - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: present invention relates to the field of biotechnology, in particular to new polypeptide for therapy of different tumor diseases; it can be used in medicine. The invention allows for obtaining polypeptide containing at least four different tumor-specific neoantigens fused with at least one amino acid sequence of T-cell amplifier. Compositions containing, in a mixture of separately, a vaccine containing therapeutic polypeptide, a vector or a collection of vectors, according to the present invention, and at least one modulator of a molecule, which is a control point, or an immunomodulator of another type for use in the treatment of cancer, are disclosed.

EFFECT: obtaining compositions for the treatment of cancer.

18 cl, 5 ex, 3 tbl, 8 dwg

Description

Настоящее изобретение относится к полипептиду, содержащему по меньшей мере четыре разных опухолеспецифических неоантигена, слитых по меньшей мере с одной аминокислотной последовательностью Т-клеточного усилителя, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей такой полипептид, вектору, содержащему такую последовательность нуклеиновой кислоты, и коллекции векторов, включающей такие векторы. Также предусмотрены композиции, содержащие, в смеси или отдельно, вакцину, содержащую полипептид, последовательность нуклеиновой кислоты, вектор или коллекцию векторов по настоящему изобретению и по меньшей мере один модулятор молекулы, являющейся контрольной точкой, или иммуномодулятор другого типа для применения в лечении рака.The present invention relates to a polypeptide containing at least four different tumor-specific neoantigens fused to at least one amino acid sequence of a T cell enhancer, a nucleic acid sequence encoding such a polypeptide, a vector containing such a nucleic acid sequence, and a collection of vectors including such vectors. Also provided are compositions comprising, in admixture or alone, a vaccine comprising a polypeptide, a nucleic acid sequence, a vector or collection of vectors of the present invention, and at least one checkpoint molecule modulator or other type of immunomodulator for use in cancer treatment.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретенияBackground of the Invention

Совсем недавно были разработаны новые методы лечения рака. Исследования в отношении взаимодействия иммунной системы и опухоли позволили идентифицировать ключевые пути уклонения от иммунных ответов хозяина, обеспечивая возможность разработки антител в качестве ингибиторов контрольных точек иммунного ответа (CPI) для возможности реализации потенциала противоопухолевой активности Т-клеток. Несмотря на их успех, ингибиторы контрольных точек являются эффективными у незначительного числа получающих лечение пациентов. С помощью анализа паттернов Т-клеточного иммунного ответа в ходе лечения CPI было показано, что для крайне ограниченного числа видов специфичности Т-клеток в отношении опухолевых клеток может быть возобновлена активность в ходе лечения CPI (Alsaab, Н.О., et al. (2017) Front Pharmacol, 8: p.561).More recently, new treatments for cancer have been developed. Research on immune system-tumor interactions has identified key pathways for evading host immune responses, enabling the development of antibodies as immune checkpoint inhibitors (CPIs) to realize the antitumor potential of T cells. Despite their success, checkpoint inhibitors are effective in a small number of treated patients. By analyzing patterns of T-cell immune response during CPI treatment, it has been shown that for a very limited number of T-cell specificities for tumor cells, activity can be restored during CPI treatment (Alsaab, H.O., et al. ( 2017) Front Pharmacol, 8: p.561).

Несколько опухолевых антигенов было идентифицировано и отнесено к разным категориям: наблюдающиеся при раке вследствие мутаций клеток зародышевой линии, антигены, образующиеся вследствие процессов тканевой дифференциации, и неоантигены, происходящие из мутированных собственных белков Fritsch, E.F., et al. (2014) Cancer Immunol Res. 2(6): 522-9. Вклад иммунных ответов в отношении аутоантигенов в ходе лечения с помощью CPI до сих пор остается предметом дискуссий (рассмотрено в Fritsch, E.F., et al. (2014) выше). Конкретной и предпочтительной категорией раковых антигенов, которые, как было показано, возобновляют активность в ходе лечения CPI, являются неоантигены. В последнее время убедительные свидетельства подтверждают концепцию о том, что неоантигены, образующиеся в опухоли как следствие мутаций в кодирующих последовательностях экспрессированных генов, являются перспективной мишенью для вакцинации против рака (Kandoth, С, et al. (2013) Nature 502(7471): 333). В мутированных белках, образующихся в результате генетических изменений в кодирующих областях генома, могут образовываться специфические в отношении типа рака неоантигены. Раковые неоантигены представляют собой антигены, присутствующие исключительно на поверхности опухолевых клеток, но не на поверхности нормальных клеток. Неоантигены образуются в результате мутаций ДНК в опухолевых клетках, и было показано, что они играют значимую роль в распознавании и уничтожении опухолевых клеток путем опосредованного Т-клетками иммунного ответа.Several tumor antigens have been identified and categorized: those observed in cancer due to germline cell mutations, antigens resulting from tissue differentiation processes, and neoantigens derived from mutated self proteins Fritsch, E.F., et al. (2014) Cancer Immunol Res. 2(6): 522-9. The contribution of immune responses to self-antigens during CPI treatment is still a matter of debate (reviewed in Fritsch, E.F., et al. (2014) supra). A specific and preferred category of cancer antigens that have been shown to reactivate during CPI treatment are neoantigens. Recently, compelling evidence supports the concept that neoantigens generated in tumors as a consequence of mutations in the coding sequences of expressed genes are a promising target for cancer vaccination (Kandoth, C, et al. (2013) Nature 502(7471): 333 ). Mutated proteins resulting from genetic changes in the coding regions of the genome can form cancer-specific neoantigens. Cancer neoantigens are antigens that are present exclusively on the surface of tumor cells, but not on the surface of normal cells. Neoantigens are formed as a result of DNA mutations in tumor cells and have been shown to play a significant role in the recognition and destruction of tumor cells by a T-cell mediated immune response.

Появление секвенирования нового поколения (NGS), которое позволяет в краткие сроки и недорого определить полную последовательность ракового генома, обеспечило возможность выявления мутационных характеристик опухолей человека (Ott, P.A., et al. (2017) Nature 547(7662): 217). Наиболее часто встречающимся типом мутации является несинонимичная однонуклеотидная вариация (SNV), и среднее число однонуклеотидных вариаций, обнаруженных в опухолях, значительно варьируется в зависимости от их гистологии. Некоторые опухоли, такие как NSCLC и меланома, характеризуются высокой мутационной нагрузкой и медианным числом мутаций более 200, а некоторые выделяющиеся из общей статистики опухоли имеют более 1000 мутаций.The advent of next generation sequencing (NGS), which allows rapid and inexpensive determination of the complete cancer genome sequencing, has made it possible to detect the mutational characteristics of human tumors (Ott, P.A., et al. (2017) Nature 547(7662): 217). The most common type of mutation is the non-synonymous single nucleotide variation (SNV), and the average number of single nucleotide variations found in tumors varies considerably depending on their histology. Some tumors, such as NSCLC and melanoma, are characterized by a high mutation load and a median number of mutations of more than 200, and some tumors that stand out from the general statistics have more than 1000 mutations.

Недавно в клинических исследованиях I фазы были оценены два разных подхода к персонализированной вакцинации, основанных на применении либо РНК, либо пептидов. Из полученных данных видно, что вакцинация может обеспечить как увеличение ограниченного числа уже существующих неоантигенспецифических Т-клеток, так и индукцию более широкого репертуара новой специфичности Т-клеток у больных раком пациентов (Ott, Р.А., et al. (2017) выше и Sahin, U., et al. (2017) Nature 547(7662): 222). Основным ограничением обоих подходов является максимальное число неоантигенов, на которые направлены такие подходы к вакцинации. Верхний предел для подхода на основе применения пептидов, исходя из опубликованных данных, составляет двадцать пептидов, и при этом он не достигался у всех пациентов, поскольку в некоторых случаях пептиды не могли быть синтезированы. Описанный верхний предел для подхода на основе применения РНК даже ниже, поскольку в каждую вакцину были включены только 10 мутаций. Клинические данные, демонстрирующие эффективность этих подходов к вакцинации, пока отсутствуют. При противораковой вакцинации важно избегать уклонения опухоли за счет появления опухолевых вариантов, не распознаваемых индуцируемыми вакциной Т-клетками. Задача противораковой вакцины при излечивании рака заключается в том, чтобы индуцировать видимо разнообразную популяцию иммунных Т-клеток, способных распознавать и устранять наибольшее число раковых клеток одновременно, поэтому желательно, чтобы вакцина кодировала довольно большое число опухолевых антигенов.Recently, two different approaches to personalized vaccination based on the use of either RNA or peptides have been evaluated in phase I clinical trials. These data show that vaccination can provide both an increase in the limited number of already existing neoantigen-specific T cells and the induction of a wider repertoire of new T cell specificity in cancer patients (Ott, P. A., et al. (2017) supra and Sahin, U., et al (2017) Nature 547(7662): 222). The main limitation of both approaches is the maximum number of neoantigens targeted by such vaccination approaches. The upper limit for the peptide-based approach, based on published data, is twenty peptides, and it was not reached in all patients because in some cases the peptides could not be synthesized. The reported upper limit for the RNA-based approach is even lower, as only 10 mutations were included in each vaccine. Clinical data demonstrating the effectiveness of these vaccination approaches are not yet available. In cancer vaccination, it is important to avoid tumor evasion by producing tumor variants that are not recognized by vaccine-induced T cells. The goal of a cancer vaccine in the treatment of cancer is to induce a visibly diverse population of immune T cells capable of recognizing and eliminating the largest number of cancer cells at the same time, so it is desirable that the vaccine encodes a fairly large number of tumor antigens.

Кроме того, в WO 2017/118702 А1 раскрыт пример конструкции только с 10 неоантигенами, соединенными линкерами, демонстрирующий при этом иммуногенность только нескольких неоантигенов и неэффективность. Более того, ни в одном из ранее проведенных исследований не была показана эффективность в моделях с высокой опухолевой массой.In addition, WO 2017/118702 A1 discloses an example of a design with only 10 neoantigens connected by linkers, while demonstrating the immunogenicity of only a few neoantigens and inefficiency. Moreover, none of the previous studies have shown efficacy in high tumor burden models.

При противораковой вакцинации важно избегать уклонения опухоли за счет появления антигенов, не распознаваемых индуцируемыми вакциной Т-клетками. Задача противораковой вакцины при излечивании рака заключается в том, чтобы индуцировать видимо разнообразную популяцию иммунных Т-клеток, способных распознавать и устранять наибольшее число раковых клеток одновременно, поэтому желательно, чтобы вакцина кодировала довольно большое число опухолевых антигенов.In cancer vaccination, it is important to avoid tumor evasion by producing antigens that are not recognized by vaccine-induced T cells. The goal of a cancer vaccine in the treatment of cancer is to induce an apparently diverse population of immune T cells capable of recognizing and eliminating the largest number of cancer cells at the same time, therefore it is desirable that the vaccine encodes a fairly large number of tumor antigens.

Авторы настоящего изобретения ожидали, на основе полученных ими доклинических данных, что вакцина на основе ограниченного числа неоантигенов идеально подходит в качестве самостоятельного лечения для предупреждения рака или лечения минимального остаточного заболевания, то есть рака, диагностированного с помощью молекулярных методов, таких как на основе обнаружения циркулирующей внеклеточной опухолевой ДНК. Показатели при минимальном остаточном заболевании зачастую находятся ниже предела обнаружения с применением способов визуализации, например, компьютерной томографии (СТ), магнитно-резонансной томографии (MRI), радио изотопной диагностики с использованием меченых атомов, которые обнаруживают с помощью сцинтиграфии в рамках позитронной эмиссионной томографии (PET). В клинических испытания в области радиоизотопной медицины было показано, что минимальная обнаруживаемость очага поражения составляет приблизительно 1,5 см в диаметре. Более того, авторы настоящего изобретения ожидали, на основе полученных ими доклинических данных, что только вакцина, удовлетворяющая обоим из следующих условий: а) на основе множества неоантигенов (т.е. >25) и b) в комбинации с иммуномодулятором, таким как ингибитор молекулы, являющейся контрольной точкой, может обеспечить эффективный контроль развившихся опухолей, причем под развившимися опухолями подразумевается опухолевая масса, которая может быть диагностирована с помощью средств визуализации.The inventors of the present invention expected, based on their preclinical data, that a vaccine based on a limited number of neoantigens would be ideal as a stand-alone treatment for cancer prevention or treatment of minimal residual disease, i.e., cancer diagnosed by molecular methods such as detection of circulating extracellular tumor DNA. Scores for minimal residual disease are often below the detection limit of imaging modalities such as computed tomography (CT), magnetic resonance imaging (MRI), radioisotope diagnostics using tagged atoms as detected by positron emission tomography scintigraphy ( PET). Clinical trials in the field of radioisotope medicine have shown that the minimum detectability of a lesion is approximately 1.5 cm in diameter. Moreover, the present inventors expected, based on their preclinical data, that only a vaccine that satisfies both of the following conditions: a) based on multiple neoantigens (i.e. >25) and b) in combination with an immunomodulator such as an inhibitor checkpoint molecule can provide effective control of advanced tumors, with advanced tumors being understood as a tumor mass that can be diagnosed using imaging tools.

Для преодоления этих и других недостатков вакцин предшествующего уровня техники, нацеленных на ограниченное число неоантигенов, настоящее изобретение относится к полинуклеотидной последовательности, кодирующей множество разных опухолевых неоантигенов, соединенных по принципу «голова к хвосту» (т.е. 31) и слитых по меньшей мере с одной аминокислотной последовательностью Т-клеточного усилителя, такого как лидерная последовательность тканевого активатора плазминогена (TPА) или инвариантная цепь, и векторам, содержащим такие нуклеиновые кислоты. Если направленную вакцину, содержащую такую нуклеиновую кислоту, вводят в комбинации с модулятором молекулы, являющейся контрольной точкой, достигается высокая эффективность лечения.To overcome these and other disadvantages of prior art vaccines targeting a limited number of neoantigens, the present invention provides a polynucleotide sequence encoding many different tumor neoantigens connected in a head-to-tail (i.e. 31) pattern and fused at least with a single amino acid sequence of a T-cell enhancer, such as a tissue plasminogen activator (TPA) leader or invariant chain, and vectors containing such nucleic acids. When a targeted vaccine containing such a nucleic acid is administered in combination with a modulator of the checkpoint molecule, a high treatment efficacy is achieved.

Настоящее изобретение основывается на обнаружении того, что для активации иммунной системы в отношении очень слабых иммуногенов, подобных тем, которые присутствующих в опухоли, включая большинство неоантигенов, требуется эффективная платформа иммунизации, и она должна сочетаться со специфической структурой кодируемых антигенов.The present invention is based on the discovery that in order to activate the immune system against very weak immunogens like those present in a tumor, including most neoantigens, an efficient immunization platform is required and must be coupled with the specific structure of the encoded antigens.

Многие неоантигены образуются вследствие точечных мутаций, несинонимичной SNV, которые являются наиболее часто встречающимся типом мутаций в опухолях. Изменение по одной аминокислоте в белковой последовательности очень редко приводит к образованию нового эпитопа, способного индуцировать сильный иммунный ответ, при этом в большинстве случаев это небольшое изменение либо не приводит к образованию нового эпитопа вовсе, либо может приводить к образованию «слабого» эпитопа. Было показано, что платформа для генной вакцинации на основе аденовируса, в частности, вирусного вектора на основе аденовируса, полученного от представителей гоминид (GAd), является очень эффективной для индукции Т-клеточных ответов, и она является подходящей для кодирования крупных антигенов в формате искусственных генов, состоящих из полинуклеотидов, кодирующих фрагменты из разных белков, связанные один за другим.Many neoantigens are formed due to point mutations, non-synonymous with SNV, which are the most common type of mutations in tumors. A change in one amino acid in a protein sequence very rarely leads to the formation of a new epitope capable of inducing a strong immune response, while in most cases this small change either does not lead to the formation of a new epitope at all, or can lead to the formation of a "weak" epitope. An adenovirus-based gene vaccination platform, in particular a hominin-derived adenovirus (GAd) viral vector, has been shown to be very effective in inducing T-cell responses and is suitable for encoding large antigens in an artificial format. genes consisting of polynucleotides encoding fragments from different proteins linked one after the other.

Неожиданно, когда авторы настоящего изобретения применяли эту платформу в контексте неоантигенов, авторы настоящего изобретения не смогли вызвать какой-либо иммунный ответ. Авторы настоящего изобретения идентифицировали способные восстанавливать иммуногенность специфические последовательности, которые в настоящей заявке называются «аминокислотной последовательностью Т-клеточного усилителя», при слиянии с цепочками раковых неоантигенов. Такая аминокислотная последовательность Т-клеточного усилителя была пригодна для преодоления сложностей, состоящих в отсутствии или слабой иммуногенности неоантигенов. Предпочтительно эти последовательности сливают выше последовательности, кодирующей неоантигены. Среди аминокислотных последовательностей Т-клеточных усилителей авторы настоящего изобретения идентифицировали лидерную последовательность тканевого активатора плазминогена (ТРА) и инвариантную цепь (INV), их варианты и фрагменты, демонстрирующие способность восстанавливать иммуногенность. Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что неоантигены для восстановления иммуногенности не обязательно должны быть соединены посредством линкеров.Surprisingly, when the present inventors used this platform in the context of neoantigens, the present inventors failed to elicit any immune response. The present inventors have identified specific sequences capable of restoring immunogenicity, referred to herein as a "T cell enhancer amino acid sequence", when fused to cancer neoantigen chains. This amino acid sequence of the T-cell enhancer was useful in overcoming the difficulties of the absence or weak immunogenicity of neoantigens. Preferably, these sequences are fused upstream of the neoantigen coding sequence. Among the amino acid sequences of T-cell enhancers, the present inventors have identified a tissue plasminogen activator (TPA) leader sequence and an invariant chain (INV), variants and fragments thereof, demonstrating the ability to restore immunogenicity. The authors of the present invention also found that neoantigens to restore immunogenicity do not have to be connected via linkers.

Соответствующий дополнительный аспект настоящего изобретения относится к числу иммуногенных неоантигенов, необходимых для эффективной противораковой вакцинации. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что генная вакцина на основе вектора на основе аденовируса, полученного от представителя гоминид, кодирующего небольшое число неоантигенов, хотя и очень эффективна в качестве самостоятельного лечения в условиях профилактики, в случае применения в условиях терапии в присутствии крупных развившихся опухолей является неэффективной и не действует синергически с иммуномодулирующей молекулой, способной обращать истощение Т-клеток, например, антителом к PD-1. В отличие от этого, в случае более крупной конструкции вакцины, кодирующей более тридцати неоантигенов, соединенных по принципу «голова к хвосту» без линкеров, и слитых с Т-клеточным усилителем, была показана сильная синергическая противоопухолевая активность при введении в сочетании с антителом к PD-1.A relevant additional aspect of the present invention relates to the number of immunogenic neoantigens required for effective cancer vaccination. The present inventors have found that a gene vaccine based on an adenovirus-based vector derived from a hominin representative encoding a small number of neoantigens, although very effective as a stand-alone treatment in a prophylactic setting, is ineffective when used in a therapy setting in the presence of large advanced tumors. and does not act synergistically with an immunomodulatory molecule capable of reversing T cell depletion, such as an anti-PD-1 antibody. In contrast, a larger vaccine construct encoding more than thirty neoantigens coupled head-to-tail without linkers and fused to a T-cell enhancer showed strong synergistic antitumor activity when administered in combination with an anti-PD antibody. -one.

Обозначения на фигурахSymbols on the figures

Фиг. 1. Иммуногенность векторов GAd, кодирующих полноразмерную TNV человека (CT26-5-INV) или последовательность ТРА (СТ26-5 ТРА), связанные с пентатопом антигенов СТ26 (СТ26-5). Представленные значения были получены с помощью анализа ELISpot с использованием клеток селезенки иммунизированных животных. Спленоциты стимулировали ex vivo через три недели после вакцинации (доза 5×10⁸ vp) с использованием пула из пяти синтетических пептидов, соответствующих последовательностям пяти содержащих мутации неоантигенов. Ответы выражены в виде числа продуцирующих IFNγ Т-клеток на миллион спленоцитов.Fig. 1. Immunogenicity of GAd vectors encoding full-length human TNV (CT26-5-INV) or a TPA sequence (CT26-5 TPA) associated with the pentatope of CT26 antigens (CT26-5). The values shown were obtained by ELISpot analysis using spleen cells from immunized animals. Splenocytes were stimulated ex vivo three weeks after vaccination (5×10 ⁸ vp dose) using a pool of five synthetic peptides corresponding to the sequences of the five mutated neoantigens. Responses are expressed as IFNγ producing T cells per million splenocytes.

Фиг. 2. Иммуногенность векторов GAd-CT26-31 ТРА и GAd-CT26-5 ТРА. Векторы GAd путем внутримышечной инъекции вводили в дозе 5×10⁸ vp, и Т-клеточные ответы измеряли с помощью по IFN-γ через три недели после иммунизации, и в данном случае они выражены в виде числа продуцирующих IFNγ Т-клеток на миллион спленоцитов. Показаны ответы в отношении мутантных раковых антигенов, которые оказались иммуногенными. Неоантигены №5, №18, №28 являются общими для двух векторов. Пунктирная линия представляет собой порог положительного ответа.Fig. 2. Immunogenicity of the GAd-CT26-31 TPA and GAd-CT26-5 TPA vectors. GAd vectors were injected intramuscularly at a dose of 5 x 10 ⁸ vp and T cell responses were measured by IFN-γ three weeks post-immunization and are expressed here as IFNγ-producing T cells per million splenocytes. Responses are shown for mutant cancer antigens that were found to be immunogenic. Neoantigens #5, #18, #28 are common for two vectors. The dotted line represents the positive response threshold.

Фиг. 3. Профилактическая вакцинация с использованием векторов GAd-CT26-5 и GAd-CT26-31, кодирующих неоантигены СТ26, обеспечивает эффективный контроль развития опухоли. Мышей (n=8-10/группа) вакцинировали с использованием GAd-CT26-5 или GAd-CT26-31, и через 2 недели после иммунизации им путем инъекции вводили s.c. клетки СТ26. Рост опухоли отслеживали в динамике. Показан объем опухоли, измеренный через 28 дней после инокуляции GAd, в сравнении с таковым у не подвергавшихся лечению (имитационный контроль) мышей.Fig. 3. Prophylactic vaccination using the GAd-CT26-5 and GAd-CT26-31 vectors encoding CT26 neoantigens provides effective control of tumor development. Mice (n=8-10/group) were vaccinated with GAd-CT26-5 or GAd-CT26-31 and were injected with s.c. CT26 cells. Tumor growth was monitored over time. Tumor volume measured 28 days after GAd inoculation is shown compared to untreated (sham control) mice.

Фиг. 4. Ранняя вакцинация с использованием векторов GAd-CT26-5 и GAd-CT26-31 обеспечивает эффективный контроль роста опухоли. Мышам (n=8-10/группа) инокулировали i.v. клетки СТ26 (день 0) и оставляли без лечения (контроль) или путем инъекции вводили 5×10⁸ vp GAd-CT26-5 или GAd-CT26-31 в день 3. Показано число узлов в легком, подсчитанное в день 16.Fig. 4. Early vaccination using the GAd-CT26-5 and GAd-CT26-31 vectors provides effective control of tumor growth. Mice (n=8-10/group) were inoculated iv with CT26 cells (day 0) and left untreated (control) or injected with 5×10 ⁸ vp of GAd-CT26-5 or GAd-CT26-31 on day 3. Shown number of nodes in the lung counted on day 16.

Фиг. 5. Для эффективности вакцин GAd у животных с высокой опухолевой массой требуется нацеливание на множество неоантигенов и комбинация с антителом к PD1. Мышам s.c. инокулировали клетки СТ26. Через одну неделю мышей рандомизировали в соответствии с объемом опухоли (среднее 70-100 мм³). Лечение с использованием вакцины GAd начинали в день 0. А) Рост опухоли у отдельных мышей с течением времени показан у мышей, вакцинированных GAd-CT26-31, в сравнении с таковым у контрольных (не подвергавшихся лечению) мышей. В) Эффективность антитела к PD1 и комбинации антитела к PD1 с GAd-CT26-5 или GAd-CT26-31. Вакцину вводили в день 0 (im), тогда как антитело к PD1 давали два раза в неделю до наступления дня 16 (ip). Показан рост опухолей у отдельных мышей с течением времени. Статистические данные рассчитаны с помощью критерия хи-квадрат, с помощью которого оценивали число излеченных мышей (ответивших на лечение) в сравнении с числом не ответивших на лечение мышей.Fig. 5. Effectiveness of GAd vaccines in high tumor burden animals requires targeting multiple neoantigens and combination with an anti-PD1 antibody. sc mice were inoculated with CT26 cells. After one week, mice were randomized according to tumor volume (mean 70-100 mm ³ ). Treatment with the GAd vaccine was started on day 0. A) Tumor growth in individual mice over time is shown in mice vaccinated with GAd-CT26-31 compared to control (untreated) mice. C) Efficacy of anti-PD1 antibody and combination of anti-PD1 antibody with GAd-CT26-5 or GAd-CT26-31. The vaccine was administered on day 0 (im), while the anti-PD1 antibody was given twice a week until day 16 (ip). The growth of tumors in individual mice over time is shown. Statistics are calculated using the chi-square test, which assesses the number of mice cured (responding to treatment) in comparison with the number of non-responding mice.

Фиг. 6. Специфические в отношении неоантигенов Т-клеточные ответы измеряли с помощью ELISpot по IFN-γ у мышей с опухолями, получающих GAd-CT26-31 и лечение антителом к PD1 (день 30). Ответы измеряли в отношении спленоцитов, стимулированных в присутствии синтетических пептидов, соответствующих иммуногенным неоантигенам, и выражали в виде числа продуцирующих IFN-γ Т-клеток на миллион спленоцитов.Fig. 6. Neoantigen-specific T cell responses were measured by IFN-γ ELISpot in tumor mice receiving GAd-CT26-31 and anti-PD1 antibody treatment (day 30). Responses were measured against splenocytes stimulated in the presence of synthetic peptides corresponding to immunogenic neoantigens and expressed as IFN-γ producing T cells per million splenocytes.

Фиг. 7. Рост опухоли у мышей с опухолями, подвергнутых лечению с использованием GAd-CT26-31 и антитела к PD1 в присутствии антитела, обеспечивающего истощение по CD4+ Т-клеткам (с истощением по CD4) или CD8+ Т-клеткам (с истощением по CD8), или в не подвергнутой истощению по Т-клеткам контрольной группе. Данные представлены по меньшей мере для 2 независимых экспериментов. Статистическая значимость обозначена как *(Р<0,05 по точному критерию Фишера) или как NS (значимость отсутствует).Fig. 7. Tumor Growth in Tumor Mice Treated with GAd-CT26-31 and Anti-PD1 Antibody in the Presence of Antibody Depleting CD4+ T Cells (CD4 Depleted) or CD8+ T Cells (CD8 Depleted) , or in a non-depleted T-cell control group. Data are presented for at least 2 independent experiments. Statistical significance is indicated as *(P<0.05 by Fisher's exact test) or as NS (not significant).

Фиг. 8. Значимое различие (односторонний критерий Вилкоксона) внутриопухолевого разнообразия TCR (число клонотипов) между мышами, получающими комбинированное лечение (слева), и мышами, получающими лечение только антителом к PD1 (справа). Ответившие на комбинированное лечение мыши (слева, закрашенные круги), не ответившие на комбинированное лечение мыши (слева, закрашенные квадраты), ответившие на лечение только антителом к PD1 мыши (справа, направленные вверх треугольники), не ответившие на лечение только антителом к PD1 мыши (справа, направленные вниз треугольники).Fig. 8. Significant difference (one-tailed Wilcoxon test) in intratumoral TCR diversity (number of clonotypes) between mice treated with combination treatment (left) and mice treated with anti-PD1 antibody alone (right). Mice that responded to combination treatment (left, solid circles), did not respond to combination treatment (left, solid squares), responded to treatment with anti-mouse PD1 antibody alone (right, upward triangles), did not respond to treatment with anti-mouse PD1 antibody alone (right, downward-pointing triangles).

Краткое раскрытие настоящего изобретенияBrief summary of the present invention

Согласно первому аспекту настоящее изобретение относится к полипептиду, содержащему по меньшей мере 25 разных опухолеспецифических неоантигенов и по меньшей мере одну аминокислотную последовательность Т-клеточного усилителя.In a first aspect, the present invention relates to a polypeptide comprising at least 25 different tumor-specific neoantigens and at least one amino acid sequence of a T-cell enhancer.

Согласно второму аспекту настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид согласно первому аспекту настоящего изобретения.According to a second aspect, the present invention relates to a nucleic acid encoding a polypeptide according to the first aspect of the present invention.

Согласно третьему аспекту настоящее изобретение относится к вектору, содержащему нуклеиновую кислоту согласно второму аспекту настоящего изобретения, функционально связанную с последовательностью контроля экспрессии.According to a third aspect, the present invention relates to a vector containing a nucleic acid according to the second aspect of the present invention operably linked to an expression control sequence.

Согласно четвертому аспекту настоящее изобретение относится к коллекции одного или нескольких векторов экспрессии, каждый из которых содержит нуклеиновую кислоту в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения, причем каждый вектор экспрессии выбран из группы, состоящей из плазмиды; космиды; РНК; РНК, составленной с адъювантом; РНК, составленной в липосомальные частицы; самоамплифицирующейся РНК (SAM); SAM, составленной с адъювантом; SAM, составленной в липосомальные частицы; вирусного вектора; предпочтительно вектора на основе альфавируса, вектора на основе вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEE), вектора на основе вируса Синдбис (SIN), вирусного вектора на основе вируса леса Семлики (SFV), вектора на основе цитомегаловируса (CMV) обезьяны или человека, вектора на основе вируса лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), вектора на основе ретровируса или лентивируса, предпочтительно компетентного или некомпетентного по репликации вектора на основе аденовируса, полученного от представителей гоминид, предпочтительно полученного от шимпанзе, или бонобо, или гориллы, вектора на основе поксвируса, вектора на основе вируса осповакцины или вектора на основе модифицированного вируса осповакцины Анкара (MVA).According to a fourth aspect, the present invention relates to a collection of one or more expression vectors, each of which contains a nucleic acid in accordance with the second aspect of the present invention, each expression vector is selected from the group consisting of a plasmid; cosmids; RNA; RNA formulated with an adjuvant; RNA compiled into liposomal particles; self-amplifying RNA (SAM); SAM formulated with an adjuvant; SAM formulated into liposomal particles; viral vector; preferably an alphavirus vector, a Venezuelan equine encephalitis virus (VEE) vector, a Sindbis virus (SIN) vector, a Semliki Forest Virus (SFV) vector, a simian or human cytomegalovirus (CMV) vector, a lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV), a retrovirus or lentivirus vector, preferably a replication-competent or replication-incompetent adenovirus vector, derived from hominids, preferably derived from a chimpanzee or bonobo or gorilla, a poxvirus vector, a vector vaccinia virus or a modified vaccinia Ankara (MVA) vector.

Согласно пятому аспекту настоящее изобретение относится к композиции, содержащей вакцину, содержащую полипептид согласно первому аспекту, нуклеиновую кислоту согласно второму аспекту настоящего изобретения, вектор согласно третьему аспекту настоящего изобретения или коллекцию векторов в соответствии с четвертым аспектом настоящего изобретения и по меньшей мере один модулятор молекулы, являющейся контрольной точкой, или нуклеиновую кислоту, кодирующую модулятор, или вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую модулятор, для применения в предупреждении или лечении пролиферативного заболевания у субъекта.According to a fifth aspect, the present invention relates to a composition comprising a vaccine comprising a polypeptide according to the first aspect, a nucleic acid according to the second aspect of the present invention, a vector according to the third aspect of the present invention, or a collection of vectors according to the fourth aspect of the present invention, and at least one modulator of the molecule, which is a control point, or a nucleic acid encoding a modulator, or a vector containing a nucleic acid encoding a modulator, for use in the prevention or treatment of a proliferative disease in a subject.

Согласно шестому аспекту настоящее изобретение относится к набору для вакцинации, содержащему в отдельной упаковке:According to a sixth aspect, the present invention relates to a vaccination kit containing in a separate package:

(i) вакцину, содержащую полипептид согласно первому аспекту настоящего изобретения, нуклеиновую кислоту согласно второму аспекту настоящего изобретения, вектор согласно третьему аспекту настоящего изобретения или коллекции векторов в соответствии с четвертым аспектом настоящего изобретения; и(i) a vaccine comprising a polypeptide according to the first aspect of the present invention, a nucleic acid according to the second aspect of the present invention, a vector according to the third aspect of the present invention, or a collection of vectors according to the fourth aspect of the present invention; and

(ii) по меньшей мере один модулятор молекулы, являющейся контрольной точкой, или нуклеиновую кислоту, кодирующую модулятор, или вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую модулятор.(ii) at least one modulator of a checkpoint molecule, or a nucleic acid encoding a modulator, or a vector containing a nucleic acid encoding a modulator.

Подробное раскрытие настоящего изобретенияDetailed disclosure of the present invention

Прежде чем настоящее изобретение будет подробно описано ниже, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено описанными в настоящем документе конкретными методиками, протоколами и реагентами, поскольку они могут различаться. Также следует понимать, что применяемая в настоящем документе терминология предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления, и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, который будет ограничиваться только прилагаемой формулой изобретения. Если не указано иное, все применяемые в настоящем документе технические и научные термины имеют те же значения, которые обычно понятны рядовому специалисту в данной области.Before the present invention is described in detail below, it should be understood that the present invention is not limited to the specific methods, protocols, and reagents described herein, as they may vary. It should also be understood that the terminology used herein is only intended to describe specific embodiments, and is not intended to limit the scope of the present invention, which will be limited only by the appended claims. Unless otherwise indicated, all technical and scientific terms used herein have the same meanings as are commonly understood by one of ordinary skill in the art.

Предпочтительно применяемые в настоящем документе термины определены, как описано в "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Klbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland), и как описано в "Pharmaceutical Substances: Syntheses, Patents, Applications" Axel Kleemann and Jurgen Engel, Thieme Medical Publishing, 1999; "Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals", под редакцией Susan Budavari et al., CRC Press, 1996, и фармакопее Соединенных Штатов-25/Национальном формуляре-20, опубликованных United States Pharmcopeial Convention, Inc., Rockville Md., 2001.Terms preferably used herein are defined as described in "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Klbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland) and as described in "Pharmaceutical Substances: Syntheses, Patents, Applications" Axel Kleemann and Jurgen Engel, Thieme Medical Publishing, 1999; "Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals", edited by Susan Budavari et al., CRC Press, 1996, and United States Pharmacopeia-25/National Formulary-20, published by United States Pharmcopeial Convention, Inc., Rockville Md., 2001.

В настоящем описании и нижеследующей формуле изобретения, если контекст не требует иного, слово «содержать» и варианты, такие как «содержит» и «содержащий», будут подразумевать включение заявленного признака, целого числа или стадии или группы признаков, целых чисел или стадий, но не исключение любого другого признака, целого числа или стадии или группы целых чисел или стадий. В следующих параграфах различные аспекты настоящего изобретения определены более подробно. Каждый определенный таким образом аспект может быть объединен с любым другим аспектом или аспектами, если явно не указано иное. В частности, любой признак, указанный как предпочтительный или преимущественный, может быть объединен с любым другим признаком или признаками, указанными как предпочтительные или преимущественные.In the present description and the following claims, unless the context otherwise requires, the word "comprise" and variations such as "comprises" and "comprising" will be intended to include the claimed feature, integer or step or group of features, integers or steps, but not the exclusion of any other feature, integer or stage or group of integers or stages. In the following paragraphs, various aspects of the present invention are defined in more detail. Each aspect thus defined may be combined with any other aspect or aspects, unless expressly stated otherwise. In particular, any feature indicated as being preferred or advantageous may be combined with any other feature or features indicated as being preferred or advantageous.

В тексте настоящего описания приведены несколько документов. Каждый из документов, приведенных в настоящем документе (в том числе все патенты, патентные заявки, научные публикации, спецификации производителя, инструкции и т.д.), независимо от того, приведены они выше или ниже, включены в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте. Ничто в настоящем документе не должно толковаться как признание того, что настоящее изобретение не имеет права претендовать на первенство в подаче настоящего раскрытия в силу предшествующего изобретения.Several documents are cited throughout the text of this specification. Each of the documents referenced in this document (including all patents, patent applications, scientific publications, manufacturer's specifications, instructions, etc.), whether cited above or below, are incorporated herein by reference throughout its fullness. Nothing herein should be construed as an admission that the present invention is not entitled to claim primacy in filing the present disclosure by virtue of a prior invention.

ОпределенияDefinitions

Ниже приведены некоторые определения терминов, часто применяемых в настоящем описании. Такие термины, в каждом случае их применения, в остальной части описания будут иметь соответственно определенное значение и предпочтительные значения.Below are some definitions of terms frequently used in the present description. Such terms, in each case of their use, in the rest of the description will have a correspondingly defined meaning and preferred meanings.

Термины «полинуклеотид» и «нуклеиновая кислота» в настоящем документе применяют взаимозаменяемо, и они понимаются как полимерная или олигомерная макромолекула, состоящая из мономеров в виде нуклеотидов. Мономеры в виде нуклеотидов состоят из азотистого основания, пятиуглеродного сахара (такого как без ограничения рибоза или 2'-дезоксирибоза) и от одной до трех фосфатных групп. Как правило, нуклеиновая кислота образуется посредством фосфодиэфирных связей между отдельными мономерами в виде нуклеотидов. В контексте настоящего изобретения предпочтительные молекулы нуклеиновых кислот включают без ограничения рибонуклеиновую кислоту (РНК), модифицированную РНК, дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и их смеси, такие как, например, гибриды РНК-ДНК. Нуклеиновые кислоты, например, могут быть химически синтезированы, например, в соответствии с фосфотриэфирным методом (см., например, Uhlmann, Е. & Peyman, А. (1990) Chemical Reviews, 90, 543-584).The terms "polynucleotide" and "nucleic acid" are used interchangeably herein and are understood as a polymeric or oligomeric macromolecule consisting of monomers in the form of nucleotides. Monomers in the form of nucleotides are composed of a nitrogenous base, a five-carbon sugar (such as, but not limited to, ribose or 2'-deoxyribose), and one to three phosphate groups. Typically, a nucleic acid is formed through phosphodiester bonds between individual monomers in the form of nucleotides. In the context of the present invention, preferred nucleic acid molecules include, without limitation, ribonucleic acid (RNA), modified RNA, deoxyribonucleic acid (DNA), and mixtures thereof, such as, for example, RNA-DNA hybrids. Nucleic acids, for example, can be chemically synthesized, for example, according to the phosphotriester method (see, for example, Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543-584).

В контексте настоящего документа термин «белок», «пептид», «полипептид», «пептиды» и «полипептиды» по всему тексту применяют взаимозаменяемо. Эти термины в контексте настоящего изобретения применяют для обозначения как встречающихся в природе пептидов, например, встречающихся в природе белков, так и синтезированных пептидов, которые могут включать встречающиеся или не встречающиеся в природе аминокислоты.In the context of this document, the terms "protein", "peptide", "polypeptide", "peptides" and "polypeptides" are used interchangeably throughout the text. These terms are used in the context of the present invention to refer to both naturally occurring peptides, such as naturally occurring proteins, and synthesized peptides, which may or may not include naturally occurring amino acids.

Термин «неоантиген» применяют в контексте настоящего изобретения для обозначения антигена, отсутствующего в нормальных/зародышевых клетках, но который встречается в трансформированных, в частности, в раковых клетках. Неоантиген может содержать один или несколько, например, 2, 3, 4, 5 или более неоэпитопов. Предпочтительно, чтобы длина каждого неоантигена, включенного в полипептид по настоящему изобретению, была выбрана таким образом, чтобы обеспечивалась низкая вероятность того, что они будут содержать эпитопы, которые встречаются в нормальных/зародышевых клетках. Как правило, это может обеспечиваться за счет того, что неоантиген содержит 12 или менее аминокислот в сторону С-конца и/или N-конца от аминокислотного(-ых) изменения(-й), которое(-ые) привело(-и) к образованию неоэпитопа.The term "neoantigen" is used in the context of the present invention to refer to an antigen that is absent in normal/germ cells, but which occurs in transformed, in particular cancer cells. A neoantigen may contain one or more, for example 2, 3, 4, 5 or more neoepitopes. Preferably, the length of each neoantigen included in the polypeptide of the present invention is chosen such that there is a low likelihood that they will contain epitopes that occur in normal/germ cells. Typically, this can be achieved by having the neoantigen contain 12 or fewer amino acids towards the C-terminus and/or N-terminus of the amino acid(s) change(s) that led(s) to to the formation of a neoepitope.

Мутированный онкобелок образуется в результате мутации, возникающей на уровне ДНК, и при этом мутированный белок может предусматриватьA mutated oncoprotein is formed as a result of a mutation that occurs at the DNA level, and in this case, the mutated protein may include

a) одно или несколько единичных аа изменений, обусловленных несинонимичной SNV вследствие точечной мутации; и/илиa) one or more single aa changes due to a non-synonymous SNV due to a point mutation; and/or

b) аминокислотную последовательность, отличную от таковой дикого типа, образующуюся вследствие вставок/делеций, обуславливающих пептид, образующийся в результате сдвига рамки считывания; и/илиb) an amino acid sequence other than that of the wild type resulting from insertions/deletions causing a peptide resulting from a frameshift; and/or

c) аминокислотную последовательность, отличную от таковой дикого типа, образующуюся вследствие изменения границ экзонов или мутаций, приводящих к сохранению интронов; и/илиc) an amino acid sequence different from that of the wild type, resulting from changes in the boundaries of exons or mutations leading to the conservation of introns; and/or

d) мутированный онкобелок, образующийся в результате события слияния генов. Неоантиген, который является результатом одного или нескольких изменений поd) a mutated oncoprotein resulting from a gene fusion event. A neoantigen that results from one or more changes in

одной аминокислоте, обусловленных несинонимичной SNV вследствие точечной мутации в геноме, в контексте настоящего изобретения называется мутантным по одной аминокислоте пептидом.a single amino acid caused by a non-synonymous SNV due to a point mutation in the genome is referred to as a single amino acid mutant peptide in the context of the present invention.

Термин «пептид, образующийся в результате сдвига рамки считывания» в контексте настоящего изобретения применяют для обозначения полного не относящегося к дикому типу продукта трансляция белок-кодирующего сегмента нуклеиновой кислоты, предусматривающей мутации со вставкой или делецией, обуславливающие сдвиг открытой рамки считывания (ORF).The term "frameshift peptide" in the context of the present invention is used to refer to a complete non-wild-type translation product of a protein-coding segment of a nucleic acid containing insertion or deletion mutations causing an open reading frame (ORF) shift.

Термин «открытая рамка считывания», сокращенно «ORF», в контексте настоящего изобретения применяют для обозначения последовательности нуклеотидов, которая может транслироваться в последовательную цепочку аминокислот. Как правило, ORF содержит старт-кодон, последующий регион, обычно имеющий длину, кратную 3 нуклеотидам, но не содержит стоп-кодон (TAG, ТАА, TGA, UAG, UAA или UGA) в данной рамке считывания. ORF кодирует белок, где аминокислоты, в которые она может транслироваться, образуют цепь посредством пептидных связей.The term "open reading frame", abbreviated "ORF", in the context of the present invention is used to denote a nucleotide sequence that can be translated into a sequential chain of amino acids. Typically, an ORF contains a start codon followed by a region typically a multiple of 3 nucleotides in length, but does not contain a stop codon (TAG, TAA, TGA, UAG, UAA, or UGA) in a given reading frame. An ORF encodes a protein where the amino acids it can be translated into form a chain through peptide bonds.

Неоантиген, который происходит из аминокислотной последовательности, отличной от таковой дикого типа, образующейся вследствие изменения границ экзонов или мутаций, приводящих к сохранению интронов, в контексте настоящего изобретения называется мутантным по сайту сплайсинга пептидом.A neoantigen that is derived from a non-wild type amino acid sequence resulting from exon boundary changes or intron-sparing mutations is referred to as a splicing-site mutant peptide in the context of the present invention.

Неоантиген, который происходит из мутированного онкобелка, образующегося в результате события слияния генов, в контексте настоящего изобретения называется пептидом, образующимся в результате мутации сквозного прочитывания.A neoantigen that is derived from a mutated oncoprotein resulting from a gene fusion event is referred to in the context of the present invention as a read-through mutation peptide.

Термин «кассета экспрессии» в контексте настоящего изобретения применяют для обозначения молекулы нуклеиновой кислоты, которая содержит по меньшей мере одну подлежащую экспрессии последовательность нуклеиновой кислоты, например, нуклеиновой кислоты, кодирующей цепочку неоантигенов, слитую с инвариантной цепью по настоящему изобретению, или ее часть, функционально связанную с последовательностями контроля транскрипции и трансляции. Предпочтительно кассета экспрессии включает цис-регуляторные элементы для эффективной экспрессии данного гена, такие как промотор, сайт инициации и/или сайт полиаденилирования. Предпочтительно кассета экспрессии содержит все дополнительные элементы, требуемые для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке пациента. Типичная кассета экспрессии, таким образом, содержит промотор, функционально связанный с подлежащей экспрессии последовательностью нуклеиновой кислоты, и сигналы, требуемые для эффективного полиаденилирования транскрипта, сайты связывания рибосом и последовательность терминации транскрипции. Дополнительные элементы кассеты могут включать, например, энхансеры. Кассета экспрессии предпочтительно также содержит область терминации транскрипции ниже структурного гена для обеспечения эффективной терминации. Область терминации может быть получена из того же гена, что и промоторная последовательность, или может быть получена из другого гена.The term "expression cassette" in the context of the present invention is used to refer to a nucleic acid molecule that contains at least one nucleic acid sequence to be expressed, for example, a nucleic acid encoding a neoantigen strand fused to an invariant strand of the present invention, or a portion thereof, functionally associated with transcription and translation control sequences. Preferably, the expression cassette includes cis-regulatory elements for efficient expression of the gene, such as a promoter, an initiation site and/or a polyadenylation site. Preferably, the expression cassette contains all the additional elements required for the expression of the nucleic acid in the patient's cell. A typical expression cassette thus contains a promoter operably linked to the nucleic acid sequence to be expressed and the signals required for efficient polyadenylation of the transcript, ribosome binding sites and a transcription termination sequence. Additional elements of the cassette may include, for example, enhancers. The expression cassette preferably also contains a transcription termination region downstream of the structural gene to ensure efficient termination. The termination region may be derived from the same gene as the promoter sequence or may be derived from a different gene.

Термин «функционально связанный», применяемый в контексте настоящего изобретения, относится к расположению элементов, при котором описанные таким образом компоненты сконфигурированы так, чтобы выполнять свою обычную функцию. Нуклеиновая кислота «функционально связана», если она находится в функциональном отношении с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор функционально связан с одним или несколькими трансгенами, если он влияет на транскрипцию одного или нескольких трансгенов. Кроме того, элементы контроля, функционально связанные с кодирующей последовательностью, способны влиять на экспрессию кодирующей последовательности. Элементы контроля не обязательно должны быть расположены смежно с кодирующей последовательностью, если они выполняют функцию управления ее экспрессией. Таким образом, например, между промоторной последовательностью и кодирующей последовательностью могут присутствовать промежуточные нетранслируемые, но транскрибированные последовательности, и промоторная последовательность при этом все еще считается «функционально связанной» с кодирующей последовательностью.The term "operably linked" as used in the context of the present invention refers to an arrangement of elements in which the components thus described are configured to perform their normal function. A nucleic acid is "operably linked" if it is in a functional relationship with another nucleic acid sequence. For example, a promoter is operably linked to one or more transgenes if it affects the transcription of one or more transgenes. In addition, control elements operably linked to a coding sequence are capable of influencing the expression of the coding sequence. Control elements do not have to be adjacent to a coding sequence if they serve the function of directing its expression. Thus, for example, intermediate untranslated but transcribed sequences may be present between a promoter sequence and a coding sequence, and the promoter sequence is still considered to be "operably linked" to the coding sequence.

Термины «вектор» или «вектор экспрессии» применяют взаимозаменяемо, и они относятся к полинуклеотиду или смеси полинуклеотида и белков, которые можно вводить, или которые способны вводить коллекцию нуклеиновых кислот по настоящему изобретению или одну нуклеиновую кислоту, которая является частью коллекции нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, в клетку, предпочтительно клетку млекопитающего. Примеры векторов включают без ограничения плазмиды, космиды, фаги, вирусы или искусственные хромосомы. В частности, вектор применяют для переноса промотора и коллекции нуклеиновых кислот или одной нуклеиновой кислоты, которая является частью коллекции нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, в подходящую клетку-хозяина. Векторы экспрессии могут содержать полинуклеотидные последовательности «репликона», которые содействуют автономной репликации вектора экспрессии в клетке-хозяине. Попав в клетку-хозяина, вектор экспрессии может реплицироваться независимо от хромосомной ДНК хозяина, или одновременно с ней, и могут образовываться несколько копий вектора и вставленной в него ДНК. В случае применения компетентных по репликации векторов экспрессии - что часто имеет место по соображениям безопасности - вектор может не реплицироваться, а просто управлять экспрессией нуклеиновой кислоты. В зависимости от типа вектора экспрессии, вектор экспрессии может утрачиваться в ходе деления клетки, т.е. он только транзиентно экспрессирует неоантигены, кодируемые нуклеиновой кислотой, или может находиться в клетке стабильно. Векторы экспрессии, как правило, содержат кассеты экспрессии, т.е. необходимые элементы, которые обеспечивают возможность транскрипции нуклеиновой кислоты в молекулу мРНК.The terms "vector" or "expression vector" are used interchangeably and refer to a polynucleotide or a mixture of a polynucleotide and proteins that can be administered or that is capable of administering a collection of nucleic acids of the present invention or a single nucleic acid that is part of a collection of nucleic acids of the present invention. of the invention, into a cell, preferably a mammalian cell. Examples of vectors include, without limitation, plasmids, cosmids, phages, viruses, or artificial chromosomes. In particular, the vector is used to transfer a promoter and a collection of nucleic acids or a single nucleic acid that is part of the collection of nucleic acids of the present invention into a suitable host cell. Expression vectors may contain "replicon" polynucleotide sequences that facilitate autonomous replication of the expression vector in a host cell. Once in a host cell, the expression vector can replicate independently of, or simultaneously with, the host's chromosomal DNA, and multiple copies of the vector and the inserted DNA can be made. In the case of using replication-competent expression vectors - which is often the case for safety reasons - the vector may not replicate but simply direct the expression of the nucleic acid. Depending on the type of expression vector, the expression vector may be lost during cell division, i. it only transiently expresses the neoantigens encoded by the nucleic acid, or may be stably present in the cell. Expression vectors typically contain expression cassettes, ie. necessary elements that enable the transcription of a nucleic acid into an mRNA molecule.

Термин «последовательность контроля экспрессии» относится к метке, подходящей для определения или измерения экспрессии. Подходящие метки известны в данной области. В контексте настоящего изобретения подходящие метки могут представлять собой белковые метки, пептидные последовательности которых связаны с полипептидом по настоящему изобретению. Белковые метки могут охватывать, например, аффинные метки, обеспечивающие растворимость метки, метки для хроматографии, эпитопные метки или флуоресцентные метки. Аффинные метки присоединяют к белкам, за счет чего они могут быть очищены из их биологического источника с применением методики аффинной очистки. Они включают хитинсвязывающий белок (СВР), мальтозосвязывающий белок (МВР) и глутатион-S-трансферазу (GST). Поли(His)-метка является широко используемой меткой для белков, которая связывается с металлсодержащими матрицами. Обеспечивающие растворимость метки применяют, в частности, для рекомбинантных белков, экспрессированных у дефицитных по шаперонам видов, для содействия надлежащему сворачивания белков и предотвращения их осаждения. Они включают тиоредоксин (TRX) и поли(NANP). Некоторые аффинные метки играют двойную роль в качестве солюбилизирующего средства, такие как МВР и GST. Метки для хроматографии применяют для изменения хроматографических свойств белка с целью обеспечения различного разрешения в зависимости от конкретной методики разделения. Зачастую такие метки состоят из полианионных аминокислот, как, например, FLAG-метка. Эпитопные метки представляют собой короткие пептидные последовательности, выбираемые ввиду того, что у множества разных видов могут стабильно продуцироваться высокоаффинные антитела. Они обычно происходят из вирусных генов, что объясняет их высокую иммунореактивность. Эпитопные метки включают V5-метку, Myc-метку и HA-метку. Такие метки являются особенно пригодными для вестерн-блоттинга, экспериментов на основе иммунофлуоресценции и иммунопреципитации, хотя они также находят применение при очистке антител. Флуоресцентные метки применяют для получения визуального считывания показаний для белка. GFP и его варианты являются наиболее часто применяемыми флуоресцентными метками. Более современные применения GFP включают применение его в качестве репортера сворачивания (флуоресцентный при сворачивании, бесцветный в случае отсутствия сворачивания). Дополнительные примеры флуорофоров включают флуоресцеин, родамин и сульфоиндоцианиновый краситель Су5.The term "expression control sequence" refers to a label suitable for detecting or measuring expression. Suitable labels are known in the art. In the context of the present invention, suitable labels may be protein labels, the peptide sequences of which are linked to the polypeptide of the present invention. Protein labels may include, for example, affinity labels, solubility labels, chromatography labels, epitope labels, or fluorescent labels. Affinity tags are attached to proteins, whereby they can be purified from their biological source using affinity purification techniques. They include chitin-binding protein (CBP), maltose-binding protein (MBP), and glutathione-S-transferase (GST). The poly(His) tag is a widely used protein tag that binds to metal-containing matrices. Solubility-enhancing labels are used particularly on recombinant proteins expressed in chaperone-deficient species to promote proper protein folding and prevent precipitation. They include thioredoxin (TRX) and poly(NANP). Some affinity tags play a dual role as a solubilizing agent, such as MBP and GST. Chromatography labels are used to modify the chromatographic properties of a protein to provide different resolutions depending on the particular separation technique. Often such tags are composed of polyanionic amino acids, such as the FLAG tag. Epitope tags are short peptide sequences chosen because many different species can stably produce high affinity antibodies. They usually come from viral genes, which explains their high immunoreactivity. Epitope tags include V5 tag, Myc tag and HA tag. Such labels are particularly useful for Western blotting, immunofluorescence and immunoprecipitation experiments, although they also find use in antibody purification. Fluorescent labels are used to obtain a visual reading of protein readings. GFP and its variants are the most commonly used fluorescent labels. More recent uses of GFP include its use as a fold reporter (fluorescent when folded, colorless when not folded). Additional examples of fluorophores include fluorescein, rhodamine, and Cy5 sulfoindocyanine dye.

Примеры такой метки включают без ограничения AviTag, кальмодулиновую метку, полиглутаматную метку, Е-метку, FLAG-метку, НА-метку, His-метку, Мус-метку, S-метку, SBP-метку, Softag 1, Softag 3, Strep-метку, ТС-метку, У5-метку, VSV-метку, Xpress-метку, Isopeptag, SpyTag, ВССР-метку, метку, представляющую собой глутатион-S-трансферазу, метку, представляющую собой зеленый флуоресцентный белок, метку, представляющую собой мальтозосвязывающий белок, Nus-метку, тиоредоксиновую метку, Fc-метку и Ту-метку. Наиболее предпочтительной является НА-метка (последовательность пептида НА в соответствии с SEQ ID NO: 41).Examples of such a tag include, without limitation, AviTag, calmodulin tag, polyglutamate tag, E tag, FLAG tag, HA tag, His tag, Myc tag, S tag, SBP tag, Softag 1, Softag 3, Strep- tag, TC tag, Y5 tag, VSV tag, Xpress tag, Isopeptag, SpyTag, BCCP tag, glutathione S-transferase tag, green fluorescent protein tag, maltose binding protein tag , Nus tag, thioredoxin tag, Fc tag and Tu tag. Most preferred is the HA tag (HA peptide sequence according to SEQ ID NO: 41).

Термин «антиген» в контексте настоящего изобретения применяют для обозначения любой структуры, распознаваемой молекулами иммунного ответа, например, антителами, Т-клеточными рецепторами (TCR) и т.п. Предпочтительными антигенами являются клеточные белки, которые ассоциированы с конкретным заболеванием. Антигены распознаются высоковариабельными антигенными рецепторами (В-клеточным рецептором или Т-клеточным рецептором) адаптивной иммунной системы, и могут вызывать гуморальный или клеточный иммунный ответ. Антигены, которые вызывают такой ответ, также называют иммуногенами. Доля белков внутри клеток, независимо от того, являются ли они чужеродными или клеточными, процессируются с образованием пептидов меньшего размера, и презентируются главным комплексом гистосовместимости (МНС).The term "antigen" in the context of the present invention is used to refer to any structure recognized by immune response molecules, such as antibodies, T cell receptors (TCRs), and the like. Preferred antigens are cellular proteins that are associated with a particular disease. Antigens are recognized by the highly variable antigen receptors (B-cell receptor or T-cell receptor) of the adaptive immune system, and may elicit a humoral or cellular immune response. Antigens that elicit such a response are also called immunogens. A proportion of proteins within cells, whether foreign or cellular, are processed into smaller peptides and presented by the major histocompatibility complex (MHC).

Термин «эпитоп», также известный как антигенная детерминанта, в контексте настоящего изобретения применяют для обозначения сегмента антигена, предпочтительно пептида, который связывается молекулами иммунной системы, например, В-клеточными рецепторами, Т-клеточными рецепторами или антителами. Эпитопы, связываемые антителами или В-клетками, называют «В-клеточными эпитопами», а эпитопы, связываемые Т-клетками, называют «Т-клеточными эпитопами». В этом контексте термин «связывание» предпочтительно относится к специфическому связыванию, которое определяется как связывание антитела или Т-клеточного рецептора (TCR) и соответствующего эпитопа с константой ассоциации 1×10⁵ М-1 или выше, предпочтительно 1×10⁶ М-1, 1×10⁷ М-1, 1×10⁸ М-1 или выше. Специалисту в данной области хорошо известно, как определить константу ассоциации (см., например, Caoili, S.E. (2012) Advances in Bioinformatics Vol.2012). Предпочтительно специфическое связывание антител с эпитопом опосредовано Fab-(антигенсвязывающий фрагмент)-областью антитела, специфическое связывание В-клетки опосредовано Fab-областью антитела в составе В-клеточного рецептора и специфическое связывание Т-клетки опосредовано вариабельной (V) областью Т-клеточного рецептора. Т-клеточные эпитопы презентируются на поверхности антигенпрезентирующей клетки, где они связываются с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС). Существует по меньшей мере два разных класса молекул МНС, называемых МНС класса I, II соответственно. Эпитопы, презентируемые посредством MHC-I-пути, вызывают ответ посредством цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+ клеток), тогда как эпитопы, презентируемые посредством МНС-II-пути, вызывают ответ посредством Т-хелперов (CD4+ клеток). Т-клеточные эпитопы, презентируемые молекулами МНС класса I, как правило, представляют собой пептиды длиной 8-11 аминокислот, и Т-клеточные эпитопы, презентируемые молекулами МНС класса II, как правило, представляют собой пептиды длиной 13-17 аминокислот. Молекулы МНС класса III также презентируют непептидные эпитопы, такие как гликолипиды. Соответственно, термин «Т-клеточный эпитоп» предпочтительно относится к пептидам длиной 8-11 или 13-17 аминокислот, которые могут быть презентированы молекулами либо МНС класса I, либо МНС класса II. Эпитопы обычно состоят из химически активных групп на поверхности аминокислот, которые могут нести или могут не нести боковые цепи из сахаров, и обычно обладают специфическими характеристиками трехмерной структуры, а также специфическими характеристиками заряда. Конформационный и неконформационный эпитоп отличаются тем, что связывание с первым, но не с последним, утрачивается в присутствии денатурирующих растворителей.The term "epitope", also known as an antigenic determinant, is used in the context of the present invention to refer to a segment of an antigen, preferably a peptide, that is bound by immune system molecules such as B-cell receptors, T-cell receptors or antibodies. Epitopes bound by antibodies or B cells are referred to as "B cell epitopes", and epitopes bound by T cells are referred to as "T cell epitopes". In this context, the term "binding" preferably refers to specific binding, which is defined as the binding of an antibody or T cell receptor (TCR) and the corresponding epitope with an association constant of 1×10 ⁵ M-1 or higher, preferably 1×10 ⁶ M-1 , 1×10 ⁷ M-1, 1×10 ⁸ M-1 or higher. One skilled in the art is well aware of how to determine the association constant (see, for example, Caoili, SE (2012) Advances in Bioinformatics Vol. 2012). Preferably, specific binding of antibodies to an epitope is mediated by the Fab (antigen binding fragment) region of the antibody, specific binding of the B cell is mediated by the Fab region of the antibody in the B cell receptor, and specific binding of the T cell is mediated by the variable (V) region of the T cell receptor. T-cell epitopes are presented on the surface of the antigen-presenting cell, where they bind to major histocompatibility complex (MHC) molecules. There are at least two different classes of MHC molecules, referred to as MHC class I, II, respectively. Epitopes presented via the MHC-I pathway elicit a response via cytotoxic T lymphocytes (CD8+ cells), while epitopes presented via the MHC-II pathway elicit a response via T helper cells (CD4+ cells). T cell epitopes presented by class I MHC molecules are typically 8-11 amino acid long peptides, and T cell epitopes presented by class II MHC molecules are typically 13 to 17 amino acid long peptides. Class III MHC molecules also present non-peptide epitopes such as glycolipids. Accordingly, the term "T-cell epitope" preferably refers to peptides 8-11 or 13-17 amino acids long, which can be represented by either MHC class I or MHC class II molecules. Epitopes typically consist of reactive groups on the surface of amino acids that may or may not carry sugar side chains, and typically have specific three-dimensional structural characteristics as well as specific charge characteristics. Conformational and non-conformational epitopes differ in that binding to the former, but not to the latter, is lost in the presence of denaturing solvents.

Термин «аминокислотная последовательность Т-клеточного усилителя» относится к полипептидной последовательности, которая при слиянии с антигенной последовательностью обеспечивает повышение индукции Т-клеток в отношении неоантигенов в контексте генной вакцинации. Примерами Т-клеточных усилителей являются последовательность инвариантной цепи или ее фрагмент; лидерная последовательность тканевого активатора плазминогена, необязательно включающая шесть дополнительных нижерасположенных аминокислотных остатков; последовательность PEST; бокс деструкции циклина; сигнал убиквитинирования; сигнал сумоилирования.The term "amino acid sequence of a T cell enhancer" refers to a polypeptide sequence that, when fused to an antigenic sequence, provides an increase in the induction of T cells against neoantigens in the context of gene vaccination. Examples of T cell enhancers are an invariant chain sequence or fragment thereof; a tissue plasminogen activator leader sequence, optionally including six additional downstream amino acid residues; PEST sequence; boxing destruction of cyclin; ubiquitination signal; sumoylation signal.

Подразумевается, что термины «препарат» и «композиция», применяемые в контексте настоящего изобретения, включают состав на основе активного соединения, например, вектора на основе аденовируса представителей гоминид по настоящему изобретению, с носителем и/или вспомогательным веществом.The terms "preparation" and "composition" as used in the context of the present invention are intended to include a formulation based on the active compound, for example, the hominid adenovirus vector of the present invention, with a carrier and/or an excipient.

Термин «фармацевтически приемлемый», применяемый в контексте настоящего изобретения, означает одобренный регулирующим органом федерального или регионального правительства или внесенный в список фармакопеи США или другой общепризнанной фармакопеи для применения у животных и, в частности, у людей.The term "pharmaceutically acceptable" as used in the context of the present invention means approved by a federal or state government regulatory agency or listed in the USP or other generally accepted pharmacopeia for use in animals, and in particular in humans.

Термин «носитель» в контексте настоящего документа относится к фармакологически неактивному веществу, такому как без ограничения разбавитель, вспомогательное вещество, поверхностно-активные вещества, стабилизаторы, физиологические буферные растворы или инертные вещества, с которыми вводят терапевтически активный ингредиент. Такие фармацевтические носители могут быть жидкими или твердыми. Жидкие носители включают без ограничения стерильные жидкости, такие как солевые растворы в воде и маслах, включая без ограничения таковые петролейного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также можно использовать в качестве жидких носителей, в частности, для инъецируемых растворов. Если фармацевтическую композицию вводят внутривенно, предпочтительным носителем является солевой раствор. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в "Remington's Pharmaceutical Sciences" под авторством Е.W. Martin.The term "carrier" in the context of this document refers to a pharmacologically inactive substance, such as, without limitation, a diluent, excipient, surfactants, stabilizers, physiological buffers or inert substances, with which the therapeutically active ingredient is administered. Such pharmaceutical carriers may be liquid or solid. Liquid carriers include, without limitation, sterile liquids such as saline solutions in water and oils, including but not limited to those of petroleum, animal, vegetable, or synthetic origin such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil, and the like. Saline solutions and aqueous solutions of dextrose and glycerol can also be used as liquid carriers, in particular for injectable solutions. When the pharmaceutical composition is administered intravenously, saline is the preferred carrier. Examples of suitable pharmaceutical carriers are described in "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin.

Подходящие фармацевтические «вспомогательные вещества» включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и т.п.Suitable pharmaceutical "excipients" include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, skimmed milk powder, glycerin, propylene, glycol, water, ethanol, etc.

«Поверхностно-активные вещества» включают анионные, катионные и неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как без ограничения дезоксихолат натрия, додецилсульфат натрия, Triton Х-100 и полисорбаты, такие как полисорбат 20, полисорбат 40, полисорбат 60, полисорбат 65 и полисорбат 80."Surfactants" includes anionic, cationic, and nonionic surfactants such as, but not limited to, sodium deoxycholate, sodium dodecyl sulfate, Triton X-100, and polysorbates such as polysorbate 20, polysorbate 40, polysorbate 60, polysorbate 65, and polysorbate 80 .

«Стабилизаторы» включают без ограничения маннит, сахарозу, трегалозу, альбумин, а также антагонисты протеаз и/или нуклеаз."Stabilizers" include, without limitation, mannitol, sucrose, trehalose, albumin, and protease and/or nuclease antagonists.

«Физиологический буферный раствор», который можно применять в контексте настоящего изобретения, включает без ограничения раствор хлорида натрия, деминерализованную воду, а также подходящие органические или неорганические буферные растворы, такие как без ограничения фосфатный буфер, цитратный буфер, трис-буфер (трис(гидроксиметил)аминометан), буфер HEPES ([4-(2-гидроксиэтил)пиперазино]этансульфоновая кислота) или буфер MOPS (3-морфолино-1-пропансульфоновая кислота). Выбор соответствующего буфера в целом зависит от молярности буфера. Фосфатный буфер подходит, например, для инъекционных и инфузионных растворов."Physiological buffer solution" that can be used in the context of the present invention includes, without limitation, sodium chloride solution, demineralized water, as well as suitable organic or inorganic buffer solutions, such as, but not limited to, phosphate buffer, citrate buffer, tris buffer (tris(hydroxymethyl )aminomethane), HEPES buffer ([4-(2-hydroxyethyl)piperazino]ethanesulfonic acid) or MOPS buffer (3-morpholino-1-propanesulfonic acid). The choice of an appropriate buffer generally depends on the molarity of the buffer. The phosphate buffer is suitable, for example, for injection and infusion solutions.

«Эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» представляет собой количество терапевтического средства, достаточное для достижения предполагаемой цели. Эффективное количество данного терапевтического средства будет варьироваться в зависимости от таких факторов, как природа средства, путь введения, размер и вид животного, которое будет получать терапевтическое средства, и цели введения. Эффективное количество в каждом отдельном случае может быть определено эмпирически специалистом в данной области в соответствии с устоявшимися в данной области способами.An "effective amount" or "therapeutically effective amount" is an amount of a therapeutic agent sufficient to achieve the intended purpose. The effective amount of a given therapeutic agent will vary depending on factors such as the nature of the agent, the route of administration, the size and species of the animal to be treated with the therapeutic agent, and the purpose of administration. The effective amount in each individual case can be determined empirically by a person skilled in the art in accordance with well-established methods in this field.

В контексте настоящего документа «лечить», «осуществление лечения», «лечение» или «терапия» заболевания или нарушения означает осуществление одного или нескольких из следующего: (а) уменьшение тяжести нарушения; (b) ограничение или предупреждение развития симптомов, характерных для подлежащего(-их) лечению нарушения(-й); (с) ингибирование ухудшения симптомов, характерных для подлежащего(-их) лечению нарушения(-й); (d) ограничение или предупреждение рецидива нарушения(-й) у индивидуума, у которого ранее наблюдалось(-ись) нарушение(-я); и (е) ограничение или предупреждение рецидива симптомов у индивидуумов, у которых ранее наблюдались симптомы нарушения(-й).As used herein, "treating", "administering treatment", "treatment", or "treatment" of a disease or disorder means effecting one or more of the following: (a) lessening the severity of the disorder; (b) limiting or preventing the development of symptoms characteristic of the disorder(s) to be treated; (c) inhibiting worsening of symptoms characteristic of the disorder(s) to be treated; (d) limiting or preventing recurrence of the disorder(s) in an individual who has previously experienced the disorder(s); and (e) limiting or preventing the recurrence of symptoms in individuals who have previously experienced symptoms of the disorder(s).

Аспекты настоящего изобретения и предпочтительные варианты осуществленияAspects of the present invention and preferred embodiments

Согласно первому аспекту настоящее изобретение относится к полипептиду, содержащему по меньшей мере четыре разных опухолеспецифических неоантигена и по меньшей мере одну аминокислотную последовательность Т-клеточного усилителя.In a first aspect, the present invention relates to a polypeptide comprising at least four different tumor-specific neoantigens and at least one amino acid sequence of a T-cell enhancer.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что эффективность лечения в рамках терапевтического плана с крупными развившимися опухолями зависит от числа иммуногенных неоантигенов, вызывающих Т-клеточные ответы. Это является особенно очевидным в контексте совместного введения с модулятором молекулы, являющейся контрольной точкой. Если число иммуногенных неоантигенов превышает 3, результат лечения значительно улучшается. «Иммуногенный» в этом контексте означает способность вызывать Т-клеточный ответ у пациента. Следовательно, в целом предпочтительно, чтобы по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 из неоантигенов были иммуногенными (вызывали Т-клеточный ответ у пациента). Специалисту в данной области хорошо известно, как измерять Т-клеточный ответ у пациента. Один из возможных способов описан ниже в разделе Примеры.The authors of the present invention surprisingly found that the effectiveness of treatment within a therapeutic plan with large advanced tumors depends on the number of immunogenic neoantigens that cause T-cell responses. This is particularly evident in the context of co-administration of a checkpoint molecule with a modulator. If the number of immunogenic neoantigens exceeds 3, the treatment outcome is significantly improved. "Immunogenic" in this context means the ability to induce a T-cell response in a patient. Therefore, it is generally preferred that at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 8, at least 9, or at least 10 of the neoantigens are immunogenic. (caused a T-cell response in the patient). One skilled in the art is well aware of how to measure the T cell response in a patient. One possible way is described below in the Examples section.

Для последовательного достижения такого минимального числа иммуногенных неоантигенов, особенно предпочтительно, чтобы полипептид согласно первому аспекту содержал по меньшей мере 25 опухолеспецифических неоантигенов, предпочтительно по меньшей мере 26, 27, 28, 29 или 30 опухолеспецифических неоантигенов, наиболее предпочтительно по меньшей мере 31. Хотя в разделе Примеры в настоящем документе представлено применение 31 опухолеспецифического неоантигена, разумеется, возможным является, и в пределах объема настоящего изобретения, увеличение числа дополнительно, например, до по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45 или по меньшей мере 50 опухолеспецифических неоантигенов. Предпочтительно полипептид содержит от (и включительно) 25 до 200, более предпочтительно от 25 до 150, даже более предпочтительно от 25 до 100 или наиболее предпочтительно от 25 до 80 опухолеспецифических неоантигенов. Более предпочтительно полипептид содержит от (и включительно) 31 до 200, более предпочтительно от 31 до 150, даже более предпочтительно от 31 до 100 или наиболее предпочтительно от 31 до 80 опухолеспецифических неоантигенов. В целом в отношении любого упоминаемого в настоящем документе минимального числа предпочтительно, чтобы верхний предел опухолеспецифических неоантигенов составлял 80. Это обусловлено не тем, что невозможно включить более 80, а с целью более быстрого получения вакцины.To consistently achieve such a minimum number of immunogenic neoantigens, it is particularly preferred that the polypeptide according to the first aspect contains at least 25 tumor-specific neoantigens, preferably at least 26, 27, 28, 29 or 30 tumor-specific neoantigens, most preferably at least 31. Although in The Examples section of this document presents the use of 31 tumor-specific neoantigens, of course, it is possible, and within the scope of the present invention, to increase the number further, for example, to at least 35, at least 40, at least 45, or at least 50 tumor-specific neoantigens. Preferably, the polypeptide contains from (and including) 25 to 200, more preferably from 25 to 150, even more preferably from 25 to 100, or most preferably from 25 to 80 tumor-specific neoantigens. More preferably, the polypeptide contains from (and including) 31 to 200, more preferably from 31 to 150, even more preferably from 31 to 100, or most preferably from 31 to 80 tumor-specific neoantigens. In general, for any minimum number mentioned herein, it is preferred that the upper limit of tumor-specific neoantigens be 80. This is not because more than 80 cannot be included, but in order to obtain a vaccine more quickly.

Предпочтительно, чтобы по меньшей мере 25 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере 26 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере 27 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере 28 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере 29 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере 30 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере 31 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере 35 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере 40 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере 45 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере 50 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными. Кроме того, предпочтительно, чтобы от по меньшей мере 25 до 200 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными. Предпочтительно, чтобы от по меньшей мере 25 до 150 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными. Предпочтительно, чтобы от по меньшей мере 25 до 100 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными. Предпочтительно, чтобы от по меньшей мере 25 до 80 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными. Предпочтительно, чтобы от по меньшей мере 31 до 200 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными. Предпочтительно, чтобы от по меньшей мере 31 до 150 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными. Предпочтительно, чтобы от по меньшей мере 31 до 100 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными. Предпочтительно, чтобы от по меньшей мере 31 до 80 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными.Preferably at least 25 tumor-specific neoantigens, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, or at least 10 (with increasing preference) neoantigens were immunogenic. Preferably at least 26 tumor-specific neoantigens, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, or at least 10 (with increasing preference) neoantigens were immunogenic. Preferably at least 27 tumor-specific neoantigens, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, or at least 10 (with increasing preference) neoantigens were immunogenic. Preferably at least 28 tumor-specific neoantigens, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, or at least 10 (with increasing preference) neoantigens were immunogenic. Preferably at least 29 tumor-specific neoantigens, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, or at least 10 (with increasing preference) neoantigens were immunogenic. Preferably at least 30 tumor-specific neoantigens, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, or at least 10 (with increasing preference) neoantigens were immunogenic. Preferably at least 31 tumor-specific neoantigens, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, or at least 10 (with increasing preference) neoantigens were immunogenic. Preferably at least 35 tumor-specific neoantigens, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, or at least 10 (with increasing preference) neoantigens were immunogenic. Preferably at least 40 tumor-specific neoantigens, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, or at least 10 (with increasing preference) neoantigens were immunogenic. Preferably at least 45 tumor-specific neoantigens, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, or at least 10 (with increasing preference) neoantigens were immunogenic. Preferably at least 50 tumor-specific neoantigens, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, or at least 10 (with increasing preference) neoantigens were immunogenic. It is further preferred that at least 25 to 200 tumor-specific neoantigens, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, or at least 10 (with increasing preference) neoantigens were immunogenic. Preferably, at least 25 to 150 tumor-specific neoantigens, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, or at least 10 (with increasing preference) neoantigens were immunogenic. Preferably, at least 25 to 100 tumor-specific neoantigens, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, or at least 10 (with increasing preference) neoantigens were immunogenic. Preferably, at least 25 to 80 tumor-specific neoantigens, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, or at least 10 (with increasing preference) neoantigens were immunogenic. Preferably, at least 31 to 200 tumor-specific neoantigens, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, or at least 10 (with increasing preference) neoantigens were immunogenic. Preferably, at least 31 to 150 tumor-specific neoantigens, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, or at least 10 (with increasing preference) neoantigens were immunogenic. Preferably, at least 31 to 100 tumor-specific neoantigens, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, or at least 10 (with increasing preference) neoantigens were immunogenic. Preferably, at least 31 to 80 tumor-specific neoantigens, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, or at least 10 (with increasing preference) neoantigens were immunogenic.

Также в целом предпочтительно, чтобы опухоль была по меньшей мере на стадии Tis или Т1 (исключая Тх и Т0), предпочтительно по меньшей мере на стадии Т2, Т3 или Т4. Опухоль может находиться одновременно на всех стадиях N (например, Nx или N0) и М (например, М0), и согласно предпочтительному варианту осуществления по меньшей мере на стадии N1, N2 или N3 и/или M1. Указанное относится к классификации TNM, согласно которой стадии опухоли определены следующим образом:It is also generally preferred that the tumor is at least Tis or T1 (excluding Tx and T0), preferably at least T2, T3 or T4. The tumor may be in all N (eg, Nx or N0) and M (eg, M0) stages simultaneously, and in a preferred embodiment, at least N1, N2 or N3 and/or M1 stages. The above refers to the TNM classification, according to which the stages of the tumor are defined as follows:

Т: размер или непосредственное распространение первичной опухолиT: size or direct spread of the primary tumor

Тх: опухоль не может быть оцененаTx: tumor cannot be assessed

Tis: карцинома in situTis: carcinoma in situ

Т0: данные об опухоли отсутствуютT0: no evidence of tumor

T1, Т2, Т3, Т4: данные о первичной опухоли, размер и/или степень распространенности, возрастающие со стадиейT1, T2, T3, T4: Primary tumor data, size and/or extent increasing with stage

N: степень распространенности в регионарные лимфатические узлыN: extent to regional lymph nodes

Nx: лимфатические узлы не могут быть оцененыNx: lymph nodes cannot be assessed

N0: метастазы в регионарных лимфатических узлах отсутствуютN0: no metastases in regional lymph nodes

N1: наличие метастазов в регионарных лимфатических узлах; в некоторых участках опухоль распространяется в небольшое число регионарных лимфатических узлов, или ближайшие из них.N1: presence of metastases in regional lymph nodes; in some areas, the tumor spreads to a small number of regional lymph nodes, or the nearest of them.

N2: опухоль распространяется в пределах от N1 до N3 (N2 не применяют для всех участков)N2: Tumor extends from N1 to N3 (N2 does not apply to all sites)

N3: опухоль распространяется в более отдаленные или численные регионарные лимфатические узлы (N3 не применяют для всех участков)N3: Tumor has spread to more distant or numerous regional lymph nodes (N3 does not apply to all sites)

М: наличие отдаленных метастазовM: presence of distant metastases

М0: отдаленные метастазы отсутствуютM0: no distant metastases

M1: метастазирование отдаленных органов (за пределами регионарных лимфатических узлов).M1: Metastasis to distant organs (outside of regional lymph nodes).

Иллюстративными стадиями, в отношении которых предусматривается польза, в частности, от настоящего изобретения, являются Tis и любая из N (предпочтительно N1, или N2, или N3) и любая из М (предпочтительно M1), Т1 и любая из N (предпочтительно N1, или N2, или N3) и любая из М (предпочтительно M1), Т2 и любая из N (предпочтительно N1, или N2, или N3) и любая из М (предпочтительно M1), Т3 и любая из N (предпочтительно N1, или N2, или N3) и любая из М (предпочтительно M1), и Т4 и любая из N (предпочтительно N1, или N2, или N3), и любая из М (предпочтительно M1). Наличие опухоли и ее распространение у пациента может быть обнаружено с применением способов визуализации, например, компьютерной томографии (СТ), магнитно-резонанс ной томографии (MRI), радиоизотопной диагностики с использованием меченых атомов, которые обнаруживают с помощью сцинтиграфии в рамках позитронной эмиссионной томографии (PET), или их комбинации. Способы визуализации также можно сочетать с другими способами, такими как, например, ультразвуковое исследование, эндоскопическое исследование, маммография, обнаружение биомаркеров в крови, тонкоигольная биопсия или их комбинация. Размер опухолей, который может быть обнаружен с помощью способов визуализации, зависит от применяемого способа и составляет приблизительно 1,5 см в диаметре для визуализации с использованием изотопов, приблизительно 3 мм в диаметре для СТ и MRI и приблизительно 7 мм в диаметре для способов на основе PET (Erdi. (2012) Molecular Imaging and Radionuclide Therapy 21(1): 23).Illustrative steps for which the benefit of the present invention in particular are Tis and any of N (preferably N1 or N2 or N3) and any of M (preferably M1), T1 and any of N (preferably N1, or N2 or N3) and any of M (preferably M1), T2 and any of N (preferably N1 or N2 or N3) and any of M (preferably M1), T3 and any of N (preferably N1 or N2 , or N3) and any of M (preferably M1) and T4 and any of N (preferably N1 or N2 or N3) and any of M (preferably M1). The presence of a tumor and its spread in a patient can be detected using imaging techniques such as computed tomography (CT), magnetic resonance imaging (MRI), radioisotope diagnostics using tagged atoms, which are detected using positron emission tomography scintigraphy ( PET), or combinations thereof. Imaging techniques may also be combined with other techniques such as, for example, ultrasound, endoscopy, mammography, blood biomarker detection, fine needle biopsy, or a combination thereof. The size of tumors that can be detected using imaging methods depends on the method used and is approximately 1.5 cm in diameter for isotope imaging, approximately 3 mm in diameter for CT and MRI, and approximately 7 mm in diameter for imaging based methods. PET (Erdi. (2012) Molecular Imaging and Radionuclide Therapy 21(1): 23).

Предпочтительно наличие опухоли («подтвержденный случай») определяют с использованием способа, выбранного из группы, состоящей из обнаружения циркулирующей внеклеточной опухолевой ДНК, компьютерной томографии (СТ), магнитно-резонансной томографии (MRI), радиоизотопной диагностики с использованием меченых атомов, которые обнаруживают с помощью сцинтиграфии в рамках позитронной эмиссионной томографии (PET), и любой комбинации вышеперечисленного. Согласно одному варианту осуществления один или несколько из вышеперечисленных способов, или их комбинацию, сочетают со способом из группы, состоящей из ультразвукового исследования, эндоскопического исследования, маммографии, обнаружения биомаркеров в крови, тонкоигольной биопсии и любой комбинации вышеперечисленного.Preferably, the presence of a tumor ("case confirmed") is determined using a method selected from the group consisting of detection of circulating extracellular tumor DNA, computed tomography (CT), magnetic resonance imaging (MRI), radioisotope diagnostics using tagged atoms that are detected with using positron emission tomography (PET) scintigraphy, and any combination of the above. In one embodiment, one or more of the above methods, or a combination thereof, is combined with a method from the group consisting of ultrasound, endoscopy, mammography, blood biomarker detection, fine needle biopsy, and any combination of the above.

Согласно предпочтительному варианту осуществления опухоль характеризуется наличием очага по меньшей мере приблизительно 3 мм в диаметре, предпочтительно по меньшей мере 7 мм в диаметре и более предпочтительно по меньшей мере 1,5 см в диаметре.In a preferred embodiment, the tumor is characterized by having a lesion at least about 3 mm in diameter, preferably at least 7 mm in diameter, and more preferably at least 1.5 cm in diameter.

Предпочтительно опухолеспецифический неоантиген независимо выбран из группы, состоящей из мутантного по одной аминокислоте пептида, пептида, образующегося в результате сдвига рамки считывания, пептида, образующегося в результате мутации сквозного прочитывания, и мутантного по сайту сплайсинга пептида.Preferably, the tumor-specific neoantigen is independently selected from the group consisting of a single amino acid mutant peptide, a frameshift peptide, a read-through mutation peptide, and a splice-site mutant peptide.

Согласно предпочтительному варианту осуществления в соответствии с первым аспектом полипептид содержит по меньшей мере пять белковых фрагментов, содержащих опухолеспецифические неоантигены. Предпочтительно, чтобы полипептид содержал по меньшей мере десять белковых фрагментов, содержащих опухолеспецифические неоантигены. Также предпочтительно, чтобы полипептид содержал по меньшей мере пятнадцать белковых фрагментов, содержащих опухолеспецифические неоантигены. Также предпочтительно, чтобы полипептид содержал по меньшей мере двадцать белковых фрагментов, содержащих опухолеспецифические неоантигены. Также предпочтительно, чтобы полипептид содержал по меньшей мере двадцать пять белковых фрагментов, содержащих опухолеспецифические неоантигены. Более предпочтительно полипептид содержит по меньшей мере тридцать белковых фрагментов, содержащих опухолеспецифические неоантигены.According to a preferred embodiment according to the first aspect, the polypeptide contains at least five protein fragments containing tumor-specific neoantigens. Preferably, the polypeptide contains at least ten protein fragments containing tumor-specific neoantigens. It is also preferred that the polypeptide contains at least fifteen protein fragments containing tumor-specific neoantigens. It is also preferred that the polypeptide contains at least twenty protein fragments containing tumor-specific neoantigens. Also preferably, the polypeptide contains at least twenty-five protein fragments containing tumor-specific neoantigens. More preferably, the polypeptide contains at least thirty protein fragments containing tumor-specific neoantigens.

Согласно другому варианту осуществления в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения полипептид содержит по меньшей мере пять, по меньшей мере десять, по меньшей мере пятнадцать, по меньшей мере двадцать и предпочтительно по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50 или более опухолеспецифических неоантигенов. Предпочтительно полипептид содержит от 5 до 200, более предпочтительно от 15 до 150, даже более предпочтительно от 25 до 100 или более предпочтительно от 30 до 50 опухолеспецифических неоантигенов.According to another embodiment according to the first aspect of the present invention, the polypeptide comprises at least five, at least ten, at least fifteen, at least twenty, and preferably at least 30, at least 35, at least 40, at least 45, at least 50 or more tumor-specific neoantigens. Preferably the polypeptide contains from 5 to 200, more preferably from 15 to 150, even more preferably from 25 to 100 or more preferably from 30 to 50 tumor-specific neoantigens.

Согласно другому варианту осуществления в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения опухолеспецифические неоантигены независимо друг от друга имеют длину от 8 до 50 аминокислот. Предпочтительно, чтобы опухолеспецифические неоантигены независимо друг от друга имели длину от 9 до 45 аминокислот. Более предпочтительно, чтобы опухолеспецифические неоантигены независимо друг от друга имели длину от 10 до 40 аминокислот. Также предпочтительно, чтобы опухолеспецифические неоантигены независимо друг от друга имели длину от 15 до 35 аминокислот. Также предпочтительно, чтобы опухолеспецифические неоантигены независимо друг от друга имели длину от 12 до 30 аминокислот. Более предпочтительно, чтобы опухолеспецифические неоантигены независимо друг от друга имели длину от 13 до 28 аминокислот. Более предпочтительно, чтобы опухолеспецифические неоантигены независимо друг от друга имели длину от 14 до 45 аминокислот. Даже более предпочтительно, чтобы опухолеспецифические неоантигены независимо друг от друга имели длину от 15 до 35 аминокислот. Наиболее предпочтительно опухолеспецифические неоантигены независимо друг от друга имеют длину 25 аминокислот.According to another embodiment according to the first aspect of the present invention, the tumor-specific neoantigens are independently 8 to 50 amino acids in length. Preferably, the tumor-specific neoantigens are independently 9 to 45 amino acids in length. More preferably, the tumor-specific neoantigens are independently 10 to 40 amino acids in length. It is also preferred that the tumor-specific neoantigens are independently 15 to 35 amino acids in length. It is also preferred that the tumor-specific neoantigens are independently 12 to 30 amino acids in length. More preferably, the tumor-specific neoantigens are independently 13 to 28 amino acids in length. More preferably, the tumor-specific neoantigens are independently 14 to 45 amino acids in length. Even more preferably, the tumor-specific neoantigens are independently 15 to 35 amino acids in length. Most preferably, the tumor-specific neoantigens are independently 25 amino acids in length.

Согласно другому варианту осуществления в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения каждый из опухолеспецифических неоантигенов независимо друг от друга имеет длину от 8 до 50 аминокислот, предпочтительно длину от 15 до 35, более предпочтительно 25 аминокислот.According to another embodiment according to the first aspect of the present invention, each of the tumor-specific neoantigens is independently 8 to 50 amino acids in length, preferably 15 to 35, more preferably 25 amino acids in length.

Предпочтительно полипептид содержит от 5 до 200 опухолеспецифических неоантигенов длиной от 8 до 50 аминокислот, предпочтительно длиной от 15 до 35, более предпочтительно 25 аминокислот; более предпочтительно от 15 до 150 опухолеспецифических неоантигенов длиной от 8 до 50 аминокислот, предпочтительно длиной от 15 до 35, более предпочтительно 25 аминокислот; даже более предпочтительно от 25 до 100 опухолеспецифических неоантигенов длиной от 8 до 50 аминокислот, предпочтительно длиной от 15 до 35, более предпочтительно 25 аминокислот; или более предпочтительно от 30 до 50 опухолеспецифических неоантигенов длиной от 8 до 50 аминокислот, предпочтительно длиной от 15 до 35, более предпочтительно 25 аминокислот.Preferably the polypeptide contains from 5 to 200 tumor-specific neoantigens of 8 to 50 amino acids in length, preferably 15 to 35, more preferably 25 amino acids in length; more preferably 15 to 150 tumor-specific neoantigens 8 to 50 amino acids long, preferably 15 to 35, more preferably 25 amino acids long; even more preferably 25 to 100 tumor-specific neoantigens of 8 to 50 amino acids in length, preferably 15 to 35, more preferably 25 amino acids in length; or more preferably 30 to 50 tumor-specific neoantigens 8 to 50 amino acids long, preferably 15 to 35, more preferably 25 amino acids long.

Общая длина неоантигенов в пределах пептида предпочтительно находится в диапазоне от 100 до 2000 аминокислот. Более предпочтительно от 500 до 1000 аминокислот.The total length of neoantigens within a peptide is preferably in the range of 100 to 2000 amino acids. More preferably 500 to 1000 amino acids.

Согласно другому варианту осуществления в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения каждый опухолеспецифический неоантиген независимо выбран из группы, состоящей из мутантного по одной аминокислоте пептида, пептида, образующегося в результате сдвига рамки считывания, пептида, образующегося в результате мутации сквозного прочитывания, и мутантного по сайту сплайсинга пептида. Предпочтительно по меньшей мере 80% опухолеспецифических неоантигенов являются мутантным по одной аминокислоте пептидом, более предпочтительно по меньшей мере 85% опухолеспецифических неоантигенов являются мутантным по одной аминокислоте пептидом, более предпочтительно по меньшей мере 90% опухолеспецифических неоантигенов являются мутантным по одной аминокислоте пептидом и более предпочтительно по меньшей мере 95% опухолеспецифических неоантигенов являются мутантным по одной аминокислоте пептидом.In another embodiment, in accordance with the first aspect of the present invention, each tumor-specific neoantigen is independently selected from the group consisting of a single amino acid mutant peptide, a frameshift peptide, a read-through mutation peptide, and a splice-site mutant peptide. Preferably at least 80% of the tumor-specific neoantigens are a single amino acid mutant peptide, more preferably at least 85% of the tumor-specific neoantigens are a single amino acid mutant peptide, more preferably at least 90% of the tumor-specific neoantigens are a single amino acid mutant peptide, and more preferably at least 95% of tumor-specific neoantigens are single amino acid mutant peptides.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения опухолеспецифические неоантигены непосредственно связаны друг с другом.According to another preferred embodiment according to the first aspect of the present invention, the tumor-specific neoantigens are directly linked to each other.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения между каждым неоантигеном или между группами неоантигенов включены аминокислотные линкерные последовательности. Подходящие линкерные последовательности хорошо известны в данной области, и предпочтительно содержат от 1 до 10 аминокислот, или состоят из них. Линкер предпочтительно содержит небольшие аминокислоты, такие как Ser и Gly, или состоит из них.According to another preferred embodiment according to the first aspect of the present invention, amino acid linker sequences are included between each neoantigen or between groups of neoantigens. Suitable linker sequences are well known in the art, and preferably contain or consist of 1 to 10 amino acids. The linker preferably contains or consists of small amino acids such as Ser and Gly.

Согласно другому варианту осуществления в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения между каждым неоантигеном или между группами неоантигенов включены аминокислотные линкерные последовательности. Предпочтительно линкеры могут происходить из встречающихся в природе мультидоменных белков или могут быть получены путем конструирования. Линкеры включают гибкие линкеры и/или расщепляемые in vivo линкеры, которые могут быть обработаны клеточными протеазами.According to another embodiment according to the first aspect of the present invention, amino acid linker sequences are included between each neoantigen or between groups of neoantigens. Preferably the linkers may be derived from naturally occurring multidomain proteins or may be engineered. Linkers include flexible linkers and/or in vivo cleavable linkers that can be processed by cellular proteases.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения аминокислотная последовательность Т-клеточного усилителя выбрана из группы, состоящей из инвариантной цепи; лидерной последовательности тканевого активатора плазминогена (ТРА); последовательности PEST; бокса деструкции циклина; сигнала убиквитинирования; сигнала сумоилирования.According to another preferred embodiment, according to the first aspect of the present invention, the amino acid sequence of the T cell enhancer is selected from the group consisting of an invariant chain; tissue plasminogen activator (TRA) leader sequence; PEST sequences; boxing destruction of cyclin; ubiquitination signal; sumoylation signal.

Предпочтительно, чтобы аминокислотная последовательность Т-клеточного усилителя была помещена со стороны N-конца в пределах полипептида, более предпочтительно на N-конце полипептида по настоящему изобретению.Preferably, the amino acid sequence of the T cell enhancer is placed at the N-terminus within the polypeptide, more preferably at the N-terminus of the polypeptide of the present invention.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения ТРА представляет собой удлиненную лидерную последовательность ТРА, предусматривающую лидерную последовательность ТРА и от двух до десяти, предпочтительно от четырех до восьми и более, предпочтительно шесть остатков ТРА непосредственно вблизи лидерной последовательности ТРА со стороны ее С-конца. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что наличие этих дополнительных остатков повышает надежность правильного расщепления лидерной последовательности («правильное» означает, что лидерная последовательность отщепляется именно по тому остатку, что и в ТРА дикого типа). Они обнаружили, что введение только лидерной последовательности может привести к расщеплению в пределах части неоантигена, и это привело бы к отщеплению участка цепочки неоантигенов. Предпочтительно, чтобы ТРА присутствовал на N-конце полипептида в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения. Предпочтительно ТРА, который может быть включен в полипептид по настоящему изобретению, имеет аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 42.According to another preferred embodiment according to the first aspect of the present invention, TPA is an extended TPA leader comprising a TPA leader and two to ten, preferably four to eight or more, preferably six TPA residues immediately adjacent to the TPA leader on its side. From the end. The present inventors have found that the presence of these additional residues increases the reliability of the correct cleavage of the leader sequence ("correct" means that the leader sequence is cleaved at exactly the same residue as in wild-type TPA). They found that the introduction of only a leader sequence could result in cleavage within a portion of the neoantigen, and this would result in cleavage of a portion of the neoantigen chain. Preferably, TPA is present at the N-terminus of the polypeptide according to the first aspect of the present invention. Preferably, the TPA that can be included in the polypeptide of the present invention has an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 42.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения инвариантная цепь выбрана из группы, состоящей из:According to another preferred embodiment according to the first aspect of the present invention, the invariant circuit is selected from the group consisting of:

(a) инвариантной цепи человека в соответствии с SEQ ID NO: 36, инвариантной цепи мыши в соответствии с SEQ ID NO: 37 и инвариантной цепи рыбы-мандаринки в соответствии с SEQ ID NO: 38;(a) a human invariant chain according to SEQ ID NO: 36, a mouse invariant chain according to SEQ ID NO: 37, and a mandarin fish invariant chain according to SEQ ID NO: 38;

(b) иммуностимулирующего фрагмента инвариантной цепи в соответствии с (а); и/или(b) an immunostimulatory fragment of the invariant chain according to (a); and/or

(c) иммуностимулирующего варианта (а) или (b), причем вариант характеризуется по меньшей мере 70% идентичностью последовательностей с инвариантной цепью в соответствии с (а) или ее фрагментом в соответствии с (b).(c) an immunostimulatory variant of (a) or (b), wherein the variant has at least 70% sequence identity with an invariant chain according to (a) or a fragment thereof according to (b).

Предпочтительно, чтобы инвариантная цепь представляла собой инвариантную цепь человека в соответствии с SEQ ID NO: 36. Также предпочтительно, чтобы инвариантная цепь представляла собой инвариантную цепь мыши в соответствии с SEQ ID NO: 37. Также предпочтительно, чтобы инвариантная цепь представляла собой инвариантную цепь рыбы-мандаринки в соответствии с SEQ ID NO: 38. Такие инвариантные цепи описаны в уровне техники, например, в WO 2007/062656.Preferably, the invariant chain is a human invariant chain according to SEQ ID NO: 36. It is also preferred that the invariant chain is a mouse invariant chain according to SEQ ID NO: 37. It is also preferred that the invariant chain is a fish invariant chain. -mandarin in accordance with SEQ ID NO: 38. Such invariant chains are described in the prior art, for example, in WO 2007/062656.

Предпочтительно инвариантная цепь представляет собой иммуностимулирующий фрагмент инвариантной цепи человека в соответствии с SEQ ID NO: 36. Также предпочтительно, чтобы инвариантная цепь представляла собой иммуностимулирующий фрагмент инвариантной цепи мыши в соответствии с SEQ ID NO: 37. Также предпочтительно, чтобы инвариантная цепь представляла собой инвариантную цепь рыбы-мандаринки в соответствии с SEQ ID NO: 38. Такие фрагменты были описаны в уровне техники, например, WO 2010/057501 и WO 2015/082922. Особенно предпочтительные фрагменты содержат фрагмент SEQ ID NO: 38, или состоят из него, в частности, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39 или 40, или состоящего из нее.Preferably, the invariant chain is an immunostimulatory fragment of a human invariant chain according to SEQ ID NO: 36. It is also preferred that the invariant chain is an immunostimulatory fragment of a mouse invariant chain according to SEQ ID NO: 37. Also preferably, the invariant chain is an a mandarin fish chain according to SEQ ID NO: 38. Such fragments have been described in the prior art, for example WO 2010/057501 and WO 2015/082922. Particularly preferred fragments comprise or consist of a fragment of SEQ ID NO: 38, in particular containing or consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39 or 40.

Также предпочтительно, чтобы инвариантная цепь представляла собой иммуностимулирующий вариант инвариантной цепи человека в соответствии с SEQ ID NO: 36, причем вариант характеризуется по меньшей мере 70% идентичностью последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичностью последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью последовательностей и даже более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичностью последовательностей с инвариантной цепью в соответствии с SEQ ID NO: 36. Также предпочтительно, чтобы инвариантная цепь представляла собой иммуностимулирующий вариант инвариантной цепи мыши в соответствии с SEQ ID NO: 37, причем вариант характеризуется по меньшей мере 70% идентичностью последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичностью последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью последовательностей и даже более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичностью последовательностей с инвариантной цепью в соответствии с SEQ ID NO: 37. Также предпочтительно, чтобы инвариантная цепь представляла собой иммуностимулирующий вариант инвариантной цепи рыбы-мандаринки в соответствии с SEQ ID NO: 38, причем вариант характеризуется по меньшей мере 70% идентичностью последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичностью последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью последовательностей и даже более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичностью последовательностей с инвариантной цепью в соответствии с SEQ ID NO: 38.It is also preferred that the invariant chain is an immunostimulatory variant of the human invariant chain according to SEQ ID NO: 36, wherein the variant has at least 70% sequence identity, more preferably at least 75% sequence identity, more preferably at least 80% sequence identity. sequence identity, more preferably at least 85% sequence identity, more preferably at least 90% sequence identity, and even more preferably at least 95% sequence identity with an invariant chain according to SEQ ID NO: 36. It is also preferred that the invariant chain was an immunostimulatory variant of an invariant mouse chain according to SEQ ID NO: 37, the variant having at least 70% sequence identity, more preferably at least 75% sequence identity, greater than preferably at least 80% sequence identity, more preferably at least 85% sequence identity, more preferably at least 90% sequence identity, and even more preferably at least 95% sequence identity with the invariant chain according to SEQ ID NO: 37 It is also preferred that the invariant chain is an immunostimulatory variant of the mandarinfish invariant chain according to SEQ ID NO: 38, the variant having at least 70% sequence identity, more preferably at least 75% sequence identity, more preferably at least at least 80% sequence identity, more preferably at least 85% sequence identity, more preferably at least 90% sequence identity, and even more preferably at least 95% sequence identity with variant chain according to SEQ ID NO: 38.

Термин «иммуностимулирующий вариант» иммуностимулирующего фрагмента инвариантной цепи в контексте настоящего изобретения означает, что активность в анализе, с помощью которого оценивают иммуностимулирующую активность неоантигена (см., например, примеры ниже), составляет по меньшей мере 50% активности, измеренной для неизмененной инвариантной цепи или ее фрагмента. Предпочтительно указанный вариант обладает по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, наиболее предпочтительно такой же или более высокой иммуностимулирующей активностью.The term "immunostimulatory variant" of an immunostimulatory fragment of an invariant chain in the context of the present invention means that the activity in the assay by which the immunostimulatory activity of a neoantigen is assessed (see, for example, examples below) is at least 50% of the activity measured for an unchanged invariant chain or a fragment of it. Preferably said variant has at least 60%, more preferably at least 70%, more preferably at least 80%, most preferably the same or more immunostimulatory activity.

Также предпочтительно, чтобы полипептид не содержал MITD (сигнал транспортировки МНС класса I), поскольку это бы привело к направлению полипептида в мембрану эндоплазматического ретикулума после экспрессии, что является нежелательным. Даже более предпочтительно, соответственно, чтобы полипептид в целом не содержал элемент, направляющий его в мембрану эндоплазматического ретикулума после экспрессии. Согласно конкретному варианту осуществления полипептид связан на С-конце с меткой (последовательностью контроля экспрессии), как определено в настоящем документе. Согласно такому варианту осуществления предпочтительно, чтобы метка находилась на С-конце полипептида (т.е. чтобы не было дополнительного элемента). Если полипептид не содержит метку, предпочтительно, чтобы С-конец полипептида представлял собой неоантиген (т.е. чтобы не было дополнительного элемента, не являющегося неоантигеном).It is also preferred that the polypeptide does not contain MITD (class I MHC transport signal) as this would result in targeting the polypeptide to the endoplasmic reticulum membrane upon expression, which is undesirable. Even more preferably, therefore, the polypeptide as a whole does not contain an element that directs it to the endoplasmic reticulum membrane after expression. In a specific embodiment, the polypeptide is linked at the C-terminus to a tag (expression control sequence) as defined herein. In such an embodiment, it is preferred that the tag is located at the C-terminus of the polypeptide (ie, that there is no additional element). If the polypeptide does not contain a label, it is preferred that the C-terminus of the polypeptide is a neoantigen (ie, that there is no additional non-neoantigen element).

Согласно второму аспекту настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид согласно первому аспекту настоящего изобретения.According to a second aspect, the present invention relates to a nucleic acid encoding a polypeptide according to the first aspect of the present invention.

Согласно третьему аспекту настоящее изобретение относится к вектору, содержащему нуклеиновую кислоту согласно второму аспекту настоящего изобретения, функционально связанную с последовательностью контроля экспрессии.According to a third aspect, the present invention relates to a vector containing a nucleic acid according to the second aspect of the present invention operably linked to an expression control sequence.

Согласно предпочтительному варианту осуществления коллекции векторов экспрессии согласно седьмому аспекту, каждый вектор экспрессии из коллекции независимо выбран из группы, состоящей из плазмиды; космиды; РНК; РНК, составленной с адъювантом; РНК, составленной в липосомальные частицы; самоамплифицирующейся РНК (SAM); SAM, составленной с адъювантом; SAM, составленной в липосомальные частицы; вирусного вектора; предпочтительно вектора на основе альфавируса, вектора на основе вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEE), вектора на основе вируса Синдбис (SIN), вирусного вектора на основе вируса леса Семлики (SFV), также предпочтительно компетентного или некомпетентного по репликации вектора на основе аденовируса, предпочтительно полученного от шимпанзе, или бонобо, или гориллы, вектора на основе поксвируса, вектора на основе вируса осповакцины или вектора на основе модифицированного вируса осповакцины Анкара (MVA), вектора на основе цитомегаловируса (CMV) обезьяны или человека, вектора на основе вируса лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), вектора на основе ретровируса или лентивируса. Предпочтительно, чтобы все векторы экспрессии, применяемые для одной коллекции, были одного типа, например, представляли собой некомпетентные по репликации векторы на основе аденовируса.According to a preferred embodiment of the collection of expression vectors according to the seventh aspect, each expression vector from the collection is independently selected from the group consisting of a plasmid; cosmids; RNA; RNA formulated with an adjuvant; RNA compiled into liposomal particles; self-amplifying RNA (SAM); SAM formulated with an adjuvant; SAM formulated into liposomal particles; viral vector; preferably an alphavirus vector, a Venezuelan equine encephalitis virus (VEE) vector, a Sindbis virus (SIN) vector, a Semliki Forest Virus (SFV) vector, also preferably a replication-competent or replication-incompetent adenovirus vector, preferably chimpanzee or bonobo or gorilla derived poxvirus, vaccinia or modified vaccinia Ankara (MVA) vector, simian or human cytomegalovirus (CMV) vector, lymphocytic choriomeningitis virus vector ( LCMV), retrovirus or lentivirus vectors. Preferably, all expression vectors used for one collection are of the same type, eg replication-incompetent adenovirus vectors.

Наиболее предпочтительными векторами экспрессии являются векторы на основе аденовируса, в частности, векторы на основе аденовируса, полученного от человека или представителей гоминид, отличных от человека. Предпочтительными представителями гоминид, от которых получают аденовирусы, являются шимпанзе (Pan), горилла (Gorilla) и орангутаны (Pongo), предпочтительно бонобо (Pan paniscus) и обыкновенный шимпанзе (Pan troglodytes). Как правило, встречающиеся в природе аденовирусы представителя гоминид, отличного от человека, выделяют из образцов кала соответствующего представителя гоминид. Наиболее предпочтительными векторами являются нереплицирующиеся векторы на основе аденовируса на основе векторов hAd5, hAd11, hAd26, hAd35, hAd49, ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd55, ChAd63, ChAd73, ChAd82, ChAd83, ChAdl46, ChAdl47, PanAd1, PanAd2 и PanAd3 или компетентных по репликации векторов Ad4 и Ad7. Аденовирусы человека hAd4, hAd5, hAd7, hAd11, hAd26, hAd35 и hAd49 хорошо известны в данной области. Векторы на основе встречающихся в природе ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63 и ChAd82 подробно описаны в WO 2005/071093. Векторы на основе встречающихся в природе PanAd1, PanAd2, PanAd3, ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAdl46 и ChAdl47 подробно описаны в WO 2010/086189.The most preferred expression vectors are adenovirus vectors, in particular adenovirus vectors derived from humans or non-human hominids. Preferred members of the hominids from which adenoviruses are derived are chimpanzees (Pan), gorillas (Gorilla) and orangutans (Pongo), preferably bonobos (Pan paniscus) and common chimpanzees (Pan troglodytes). Typically, naturally occurring adenoviruses of a non-human hominid are isolated from fecal samples of the corresponding hominid. The most preferred vectors are non-replicating adenovirus based vectors hAd5, hAd11, hAd26, hAd35, hAd49, ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd55, ChAd63, ChAd73, ChAd82, ChAd83, ChAdl46, ChAdl47, PanAd1, PanAd2 and PanAd3 or Ad4 and Ad7 replication competent vectors. The human adenoviruses hAd4, hAd5, hAd7, hAd11, hAd26, hAd35 and hAd49 are well known in the art. Vectors based on naturally occurring ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd34, and ChAd82 are described in detail in WO 2005/071093. Vectors based on the naturally occurring PanAd1, PanAd2, PanAd3, ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAdl46 and ChAdl47 are described in detail in WO 2010/086189.

Согласно четвертому аспекту настоящее изобретение относится к коллекции одного или нескольких векторов экспрессии, каждый из которых содержит нуклеиновую кислоту согласно пункту 11, причем каждый вектор экспрессии выбран из группы, состоящей из плазмиды; космиды; РНК; РНК, составленной с адъювантом; РНК, составленной в липосомальные частицы; самоамплифицирующейся РНК (SAM); SAM, составленной с адъювантом; SAM, составленной в липосомальные частицы; вирусного вектора; предпочтительно вектора на основе альфавируса, вектора на основе вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEE), вектора на основе вируса Синдбис (SIN), вирусного вектора на основе вируса леса Семлики (SFV), вектора на основе цитомегаловируса (CMV) обезьяны или человека, вектора на основе вируса лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), вектора на основе ретровируса или лентивируса, предпочтительно компетентного или некомпетентного по репликации вектора на основе аденовируса, полученного от представителя гоминид, предпочтительно полученного от шимпанзе, или бонобо, или гориллы, вектора на основе поксвируса, вектора на основе вируса осповакцины или вектора на основе модифицированного вируса осповакцины Анкара (MVA).According to a fourth aspect, the present invention relates to a collection of one or more expression vectors, each of which contains the nucleic acid according to paragraph 11, and each expression vector is selected from the group consisting of a plasmid; cosmids; RNA; RNA formulated with an adjuvant; RNA compiled into liposomal particles; self-amplifying RNA (SAM); SAM formulated with an adjuvant; SAM formulated into liposomal particles; viral vector; preferably an alphavirus vector, a Venezuelan equine encephalitis virus (VEE) vector, a Sindbis virus (SIN) vector, a Semliki Forest Virus (SFV) vector, a simian or human cytomegalovirus (CMV) vector, a lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV), a retrovirus or lentivirus vector, preferably a replication-competent or replication-incompetent adenovirus vector, derived from a hominin, preferably derived from a chimpanzee or bonobo or gorilla, a poxvirus vector, a vector vaccinia virus or a modified vaccinia Ankara (MVA) vector.

Согласно пятому аспекту настоящее изобретение относится к композиции, содержащей вакцину, содержащую полипептид согласно первому аспекту, нуклеиновую кислоту согласно второму аспекту настоящего изобретения, вектор согласно третьему аспекту настоящего изобретения или коллекцию векторов в соответствии с четвертым аспектом настоящего изобретения и по меньшей мере один модулятор молекулы, являющейся контрольной точкой, или нуклеиновую кислоту, кодирующую модулятор, или вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую модулятор, для применения в предупреждении или лечении пролиферативного заболевания у субъекта.According to a fifth aspect, the present invention relates to a composition comprising a vaccine comprising a polypeptide according to the first aspect, a nucleic acid according to the second aspect of the present invention, a vector according to the third aspect of the present invention, or a collection of vectors according to the fourth aspect of the present invention, and at least one modulator of the molecule, which is a control point, or a nucleic acid encoding a modulator, or a vector containing a nucleic acid encoding a modulator, for use in the prevention or treatment of a proliferative disease in a subject.

Согласно предпочтительному варианту осуществления в соответствии с пятым аспектом модулятор молекулы, являющейся контрольной точкой, выбран из группы, состоящей из:According to a preferred embodiment according to the fifth aspect, the modulator of the reference point molecule is selected from the group consisting of:

(a) агониста члена суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNF), предпочтительно CD27 (например, варлилумаба), CD40 (например, СР-870,893), ОХ40 (например, INCAGN01949 или MEDI0562), GITR (например, MEDI1873) или CD137 (например, утомилумаба);(a) a tumor necrosis factor (TNF) receptor superfamily member agonist, preferably CD27 (eg varlilumab), CD40 (eg CP-870,893), OX40 (eg INCAGN01949 or MEDI0562), GITR (eg MEDI1873) or CD137 (eg , utomilumab);

(b) антагониста PD-1 (например, антитела, такого как пембролизумаб или ниволумаб), PD-L1 (например, антитела, такого как атезолизумаб), CD274 (атезолизумаб или дурвалумаб), A2AR (например, преладенант), В7-Н3 (например, MGA271), В7-Н4, BTLA, CTLA-4 (например, тремелимумаб или AGEN1884), IDO, KIR, LAG3, TIM-3 (например, СА-327 или RMT3-23) или VISTA (например, СА-170) или антагониста члена суперсемейства B7-CD28, предпочтительно CD28 или ICOS, или антагониста их лиганда.(b) PD-1 antagonist (eg, an antibody such as pembrolizumab or nivolumab), PD-L1 (eg, an antibody such as atezolizumab), CD274 (eg, atezolizumab or durvalumab), A2AR (eg, preladenant), B7-H3 ( eg MGA271), B7-H4, BTLA, CTLA-4 (eg tremelimumab or AGEN1884), IDO, KIR, LAG3, TIM-3 (eg CA-327 or RMT3-23) or VISTA (eg CA-170 ) or a B7-CD28 superfamily member antagonist, preferably CD28 or ICOS, or a ligand antagonist thereof.

Предпочтительными иммуномодуляторами являются факторы роста Т-клеток, такие как IL-2, IL-12 или IL-15.Preferred immunomodulators are T cell growth factors such as IL-2, IL-12 or IL-15.

Согласно предпочтительному варианту осуществления в соответствии с пятым аспектом настоящего изобретения введение модулятора молекулы, являющейся контрольной точкой, начинается до начала введения вакцины, или введение ингибитора контрольной точки начинается после начала введения вакцины, или введение ингибитора контрольной точки начинается одновременно с началом введения вакцины.According to a preferred embodiment according to the fifth aspect of the present invention, the administration of the checkpoint molecule modulator is started prior to the start of vaccine administration, or the administration of the checkpoint inhibitor is started after the start of vaccine administration, or the administration of the checkpoint inhibitor is started simultaneously with the start of vaccine administration.

Согласно предпочтительному варианту осуществления в соответствии с пятым аспектом настоящего изобретения схема вакцинации представляет собой гетер о логичную схему прайм-буст с использованием двух разных вирусных векторов. Предпочтительными комбинациями являются вектор на основе аденовируса, полученного от представителей гоминид, для примирования, и вектор на основе поксвируса, вектор на основе вируса осповакцины или вектор на основе модифицированного вируса осповакцины Анкара (MVA) для стимуляции. Предпочтительно их вводят последовательно с интервалом по меньшей мере 1 неделя, предпочтительно 6 недель.According to a preferred embodiment according to the fifth aspect of the present invention, the vaccination schedule is a heterologous prime-boost schedule using two different viral vectors. Preferred combinations are a hominin-derived adenovirus vector for priming and a poxvirus vector, vaccinia vector, or modified vaccinia Ankara (MVA) vector for stimulation. Preferably they are administered sequentially at least 1 week apart, preferably 6 weeks apart.

Согласно предпочтительному варианту осуществления в соответствии с пятым аспектом настоящего изобретения субъект подвержен риску развития или страдает от:According to a preferred embodiment according to the fifth aspect of the present invention, the subject is at risk of developing or suffering from:

(a) злокачественных новообразований губы, ротовой полости и глотки; и/или(a) malignant neoplasms of the lip, oral cavity and pharynx; and/or

(b) злокачественных новообразований органов пищеварения; и/или(b) malignant neoplasms of the digestive organs; and/or

(c) злокачественных новообразований респираторных органов и органов грудной полости; и/или(c) malignant neoplasms of the respiratory and thoracic organs; and/or

(d) злокачественных новообразований кости и суставного хряща; и/или(d) malignant neoplasms of bone and articular cartilage; and/or

(e) меланомы и других злокачественных новообразований кожи; и/или(e) melanoma and other malignant neoplasms of the skin; and/or

(f) злокачественных новообразований мезотелиальной и мягкой ткани; и/или(f) malignant neoplasms of mesothelial and soft tissue; and/or

(g) злокачественного новообразования молочной железы; и/или(g) breast cancer; and/or

(h) злокачественных новообразований женских половых органов; и/или(h) malignant neoplasms of the female genital organs; and/or

(i) злокачественных новообразований мужских половых органов; и/или(i) malignant neoplasms of the male genital organs; and/or

(j) злокачественных новообразований мочевыводящих путей; и/или(j) malignant neoplasms of the urinary tract; and/or

(k) злокачественных новообразований глаза, головного мозга и других частей центральной нервной системы; и/или(k) malignant neoplasms of the eye, brain and other parts of the central nervous system; and/or

(l) злокачественных новообразований щитовидной железы и других желез внутренней секреции; и/или(l) malignant neoplasms of the thyroid and other endocrine glands; and/or

(m) злокачественных новообразований лимфоидной, кроветворной и связанных с ними тканей.(m) malignant neoplasms of the lymphoid, hematopoietic and related tissues.

В целом предпочтительно, чтобы у субъекта наблюдалась опухоль на стадии TNM, как описано выше.In general, it is preferred that the subject has a TNM stage tumor as described above.

Согласно одному предпочтительному варианту осуществления опухоль характеризуется наличием очага по меньшей мере приблизительно 3 мм в диаметре, предпочтительно по меньшей мере 7 мм в диаметре и более предпочтительно по меньшей мере 1,5 см в диаметре.In one preferred embodiment, the tumor is characterized by having a lesion at least about 3 mm in diameter, preferably at least 7 mm in diameter, and more preferably at least 1.5 cm in diameter.

Согласно шестому аспекту настоящее изобретение относится к набору для вакцинации, содержащему в отдельной упаковке:According to a sixth aspect, the present invention relates to a vaccination kit containing in a separate package:

(i) вакцину, содержащую полипептид согласно первому аспекту настоящего изобретения, нуклеиновую кислоту согласно второму аспекту настоящего изобретения, вектор согласно третьему аспекту настоящего изобретения или коллекции векторов в соответствии с четвертым аспектом настоящего изобретения; и(i) a vaccine comprising a polypeptide according to the first aspect of the present invention, a nucleic acid according to the second aspect of the present invention, a vector according to the third aspect of the present invention, or a collection of vectors according to the fourth aspect of the present invention; and

(ii) по меньшей мере один модулятор молекулы, являющейся контрольной точкой, или нуклеиновую кислоту, кодирующую модулятор, или вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую модулятор.(ii) at least one modulator of a checkpoint molecule, or a nucleic acid encoding a modulator, or a vector containing a nucleic acid encoding a modulator.

ПримерыExamples

Пример 1. Слияние неоантигенов либо с инвариантной цепью, либо с последовательностью ТРА обеспечивает восстановление иммуногенности в контексте вакцинации GAd.Example 1 Fusion of neoantigens to either an invariant strand or a TPA sequence provides restoration of immunogenicity in the context of GAd vaccination.

Вектор на основе аденовируса представителя гоминид, кодирующий пентатоп, содержащий 5 неоантигенов, которому предшествует инициирующий метионин (СТ26-5; SEQ ID NO: 32), полученный из опухоли СТ26 мыши, неспособен индуцировать иммунный ответ в отношении раковых антигенов, если не поместить последовательность INV на N-конце неоантигенов (СТ26-5 INV; SEQ ID NO: 33). Способность к восстановлению иммуногенности достигалась также при слиянии последовательности ТРА со стороны N-конца с цепочкой, кодирующей 5 неоантигенов (СТ26-5 ТРА; SEQ ID NO: 3).Hominid adenovirus vector encoding a pentatope containing 5 neoantigens preceded by an initiator methionine (CT26-5; SEQ ID NO: 32) derived from a mouse CT26 tumor fails to induce an immune response against cancer antigens unless the INV sequence is inserted at the N-terminus of neoantigens (CT26-5 INV; SEQ ID NO: 33). The ability to restore immunogenicity was also achieved by fusing the TPA sequence from the N-terminus to the chain encoding 5 neoantigens (CT26-5 TPA; SEQ ID NO: 3).

Выбранные неоантигены образовывались в результате 5 несинонимичных однонуклеотидных вариаций (SNV), наиболее распространенного типа мутаций, обнаруживаемых в опухолях. Аминокислотная последовательность каждого неоантигена содержала расположенную в его центре мутированную аминокислоту, фланкированную как выше, так и ниже по последовательности 12 аминокислотами дикого типа (wt), при этом общая длина составляла 25аа (таблица 1). Последовательности неоантигенов соединены по принципу «голова к хвосту» с образованием искусственного антигена, слитого ниже по последовательности с последовательностью пептида НА с целью отслеживания его экспрессии (SEQ ID NO: 41).The selected neoantigens resulted from 5 nonsynonymous single nucleotide variations (SNVs), the most common type of mutation found in tumors. The amino acid sequence of each neoantigen contained a centrally located mutated amino acid flanked both upstream and downstream by 12 wild-type amino acids (wt), with a total length of 25aa (Table 1). The neoantigen sequences are linked head-to-tail to form an artificial antigen fused downstream with the HA peptide sequence to track its expression (SEQ ID NO: 41).

Иммуногенность оценивали у инбредных мышей BalBC после единичной внутримышечной иммунизации в дозе 5×10⁸ вирусных частиц GAd (vp) для каждой из 3 вакцин. Спленоциты собирали через три недели после иммунизации и тестировали с помощью ELISpot по IFN-γ путем стимулирования клеток в присутствии пула синтетических пептидов, соответствующих каждому из 5 неоантигенов. Иммунные ответы (число продуцирующих IFN-γ Т-клеток на миллион спленоцитов) показаны на фиг. 1. Ответы считали положительными, если (i) среднее по лункам с антигенами составляло более 20 пятнообразующих колоний SFC/106 РВМС, и (ii) в 3 раза превышало фоновое значение для лунок, инкубированных с DMSO в качестве разбавителя для пептидов. Как показано на фиг. 1, добавление либо INV, либо ТРА обеспечивало превращение неиммуногенного антигена СТ26-5 в иммуногенный антиген со 100% частотой ответа у вакцинированных животных.Immunogenicity was assessed in inbred BalBC mice after a single intramuscular immunization at a dose of 5×10 ⁸ GAd virus particles (vp) for each of the 3 vaccines. Splenocytes were harvested three weeks after immunization and tested by ELISpot for IFN-γ by stimulating the cells in the presence of a pool of synthetic peptides corresponding to each of the 5 neoantigens. Immune responses (number of IFN-γ producing T cells per million splenocytes) are shown in FIG. 1. Responses were considered positive if (i) the average of antigen wells was greater than 20 SFC/106 PBMC spotting colonies, and (ii) was 3 times background for wells incubated with DMSO as peptide diluent. As shown in FIG. 1, the addition of either INV or TPA resulted in the conversion of the non-immunogenic CT26-5 antigen to an immunogenic antigen with a 100% response rate in vaccinated animals.

Пример 2. Для получения синергической активности вакцины и антитела к PD-1 в условиях агрессивной терапии требуется большое число неоантигенов.Example 2 A large number of neoantigens are required to obtain synergistic activity between a vaccine and an anti-PD-1 antibody under aggressive therapy conditions.

Был сконструирован второй вектор на основе аденовируса представителя гоминид (GAd-CT26-31 ТРА), соответствующий более длинной конструкции, кодирующей 31 неоантиген с последовательностью ТРА на N-конце (СТ26-31 ТРА, SEQ ID 35). Предпочтительная применяемая последовательность ТРА характеризовалась аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 42. Выбранные мутации, обуславливающие образование неоантигенов, представляли собой 31 несинонимичную SNV (таблица 2), 3 из которых также присутствовали в векторе GAd-CT26-5 ТРА, кодирующем более короткую конструкцию СТ26-5 ТРА (таблица 1). Аминокислотная последовательность каждого из 31 неоантигена содержала расположенную в его центре мутированную аминокислоту, фланкированную как выше, так и ниже по последовательности 12 аминокислотами wt, при этом общая длина составляла 25аа (таблица 1). Исключением являлся неоантиген ID 6 (таблица 2), в котором выше по последовательности присутствовали только 6 аминокислот wt, соответствующие N-концу мутированного белка и неоантигену SEQ ID: 16 (таблица 2), где дополнительная мутация, возникающая в результате дополнительной SNV, присутствовала в вышерасположенном сегменте из аминокислот (таблица 2). Аминокислотные последовательности неоантигенов были соединены по принципу «голова к хвосту» в порядке, показанном в таблице 2, и с целью отслеживания экспрессии на С-конце подвергнутых сборке неоантигенов добавляли последовательность пептида НА (SEQ ID NO: 41).A second hominid adenovirus (GAd-CT26-31 TPA) vector was constructed, corresponding to a longer construct encoding 31 neoantigens with a TPA sequence at the N-terminus (CT26-31 TPA, SEQ ID 35). The preferred TPA sequence used was the amino acid sequence SEQ ID NO: 42. The selected neoantigen mutations were 31 non-synonymous SNVs (Table 2), 3 of which were also present in the GAd-CT26-5 TPA vector encoding the shorter CT26- 5 TPAs (Table 1). The amino acid sequence of each of the 31 neoantigens contained a mutated amino acid located in its center, flanked both upstream and downstream by 12 wt amino acids, with a total length of 25aa (Table 1). The exception was neoantigen ID 6 (Table 2), in which only 6 wt amino acids were present upstream, corresponding to the N-terminus of the mutated protein and neoantigen SEQ ID: 16 (Table 2), where an additional mutation resulting from additional SNV was present in upstream segment of amino acids (Table 2). The amino acid sequences of the neoantigens were linked head-to-tail in the order shown in Table 2, and the HA peptide sequence (SEQ ID NO:41) was added to track C-terminal expression of the assembled neoantigens.

Иммуногенность GAd-CT26-5 ТРА (короткая конструкция) и GAd-CT26-31 ТРА (длинная конструкция) определяли in vivo путем иммунизации интактных мышей BalbC внутримышечно однократно в дозе 5×10⁸ вирусных частиц (vp). Т-клеточные ответы измеряли через 3 недели после иммунизации с помощью ELISpot по iNFγ на предмет распознавания отдельных пептидов, соответствующих мутированным 25-мерным последовательностям, кодируемым конструкциями вакцины. Конструкция меньшего размера (СТ26-5 ТРА) индуцировала Т-клеточный ответ только в отношении 3 неоантигенов. При этом вакцинация СТ26-31 ТРА обеспечивала индукцию Т-клеточных ответов в отношении 8 из 31 неоантигена (фиг. 2), включая 3 неоантигена, общих для конструкции СТ26-5.The immunogenicity of GAd-CT26-5 TPA (short construct) and GAd-CT26-31 TPA (long construct) was determined in vivo by immunizing intact BalbC mice intramuscularly at a dose of 5×10 ⁸ viral particles (vp). T cell responses were measured 3 weeks after immunization with an iNFγ ELISpot for recognition of individual peptides corresponding to the mutated 25mer sequences encoded by the vaccine constructs. The smaller construct (CT26-5 TPA) induced a T-cell response for only 3 neoantigens. At the same time, vaccination with CT26-31 TPA provided the induction of T-cell responses against 8 of 31 neoantigens (Fig. 2), including 3 neoantigens common to the CT26-5 construct.

Чтобы определить, является ли общее количество присутствующих в вакцине иммуногенных неоантигенов критическим фактором, авторы настоящего изобретения оценили эффективность вакцинации для двух конструкций, как в условиях профилактики, так и в условиях агрессивной терапии. В случае условий профилактики, авторы настоящего изобретения сперва провели вакцинацию один раз с помощью GAd-CT26-31 ТРА или GAd-СТ26-5 ТРА (5×10⁸ vp/мышь) внутримышечно, а затем через 15 дней после вакцинации инокулировали опухолевые клетки (2×10⁶ клеток на мышь). Все вакцинированные мыши (100%), независимо от типа применяемой конструкции, были без опухоли, тогда как все контрольные мыши, вакцинированные имитирующей вакциной, погибали спустя 4 недели из-за наличия очень крупных опухолей.To determine whether the total amount of immunogenic neoantigens present in a vaccine is a critical factor, the present inventors evaluated the efficacy of vaccination for two constructs, both in prophylactic and aggressive therapy settings. In the case of prophylactic conditions, the present inventors first vaccinated once with GAd-CT26-31 TPA or GAd-CT26-5 TPA (5×10 ⁸ vp/mouse) intramuscularly, and then 15 days after vaccination inoculated tumor cells ( 2×10 ⁶ cells per mouse). All vaccinated mice (100%), regardless of the type of construct used, were tumor free, while all control mice vaccinated with the mock vaccine died after 4 weeks due to the presence of very large tumors.

Для имитации условий терапии мышам BALB/c прививали опухолевые клетки СТ26 (2×10⁶ клеток на мышь). Показатели опухолевой массы измеряли с течением времени, и лечение начинали в том случае, когда опухолевая масса становилась заметной, и средний объем достигал 70 мм³. Терапевтическую эффективность лечения с использованием GAd-СТ26-31 ТРА и GAd-CT26-5 ТРА по отдельности или в комбинации с антителом к PD1 (клон RMP1-14, Bioxcell) затем оценивали путем начального лечения развившихся опухолей с помощью внутримышечной инъекции одной дозы вакцины GAd-CT26-31 ТРА или GAd-CT26-5 ТРА (5×10⁸ vp) и внутрибрюшинной инъекции антитела к PD1. Лечение с помощью антитела к PD-1 продолжали в течение 2 недель (дни 3, 6,9, 13 или 16).To mimic therapy conditions, BALB/c mice were inoculated with CT26 tumor cells (2×10 ⁶ cells per mouse). Tumor mass values were measured over time and treatment started when tumor mass became visible and the mean volume reached 70 mm ³ . Therapeutic efficacy of treatment with GAd-CT26-31 TPA and GAd-CT26-5 TPA alone or in combination with an anti-PD1 antibody (clone RMP1-14, Bioxcell) was then evaluated by initial treatment of established tumors with a single dose intramuscular injection of GAd vaccine -CT26-31 TPA or GAd-CT26-5 TPA (5×10 ⁸ vp) and intraperitoneal injection of anti-PD1 antibody. Anti-PD-1 treatment was continued for 2 weeks (days 3, 6.9, 13 or 16).

Их результатов видно, что вакцинация с помощью GAd-CT26-31 ТРА и GAd-CT26-5 ТРА без лечения антителом к PD1 не была эффективной в этих условиях, и все мыши погибали спустя 4 недели из-за наличия очень крупных опухолей, как и в случае не подвергавшихся лечению мышей. Следовательно, при применении обоих вакцин в качестве самостоятельного лечения излечивание животных не представлялось возможным, в отличие от тех результатов, которые наблюдались в условиях профилактики. Монотерапия антителом к PD-1 или комбинация терапии антителом к PD-1 с вакцинацией GAd-CT26-5 ТРА обуславливали сокращение размеров опухоли лишь у 15% подвергнутых лечению мышей. В отличие от этого, комбинация лечения антителом к PD-1 с вакцинацией с использованием GAd-CT26-31 ТРА, кодирующей длинную конструкцию, обеспечивала заметную противораковую активность с сокращением размеров опухоли и полным излечением у 48% подвергнутых лечению животных. Данные обобщены в таблице 3, из которых видно, что различие между монотерапией PD-1 или комбинацией PD-1/GAd-CT26-5 ТРА по сравнению с комбинацией PD-1/GAd-CT26-31 ТРА является статистически значимым. Из этих результатов видно, что генная вакцина способна обеспечивать устранение развившихся опухолей в том случае, если она кодирует большое число неоантигенов, и в случае комбинации ее с лечением с помощью иммуномодулирующих молекул.Their results show that vaccination with GAd-CT26-31 TPA and GAd-CT26-5 TPA without anti-PD1 antibody treatment was not effective under these conditions and all mice died after 4 weeks due to the presence of very large tumors, as did in the case of untreated mice. Therefore, when using both vaccines as a stand-alone treatment, it was not possible to cure the animals, in contrast to the results that were observed in the conditions of prophylaxis. Anti-PD-1 antibody alone or combination of anti-PD-1 antibody therapy with GAd-CT26-5 TPA vaccination resulted in tumor shrinkage in only 15% of treated mice. In contrast, the combination of anti-PD-1 antibody treatment with vaccination with GAd-CT26-31 TPA encoding the long construct provided marked anti-cancer activity with tumor reduction and complete cure in 48% of treated animals. The data are summarized in Table 3 showing that the difference between PD-1 monotherapy or PD-1/GAd-CT26-5 TPA combination versus PD-1/GAd-CT26-31 TPA combination is statistically significant. It can be seen from these results that a gene vaccine is able to eliminate established tumors when it encodes a large number of neoantigens and when combined with treatment with immunomodulatory molecules.

Пример 3. Сравнение эффективности вакцинации в трех разных условиях.Example 3. Comparison of the effectiveness of vaccination in three different conditions.

Чтобы определить, является ли общее количество присутствующих в вакцине неоантигенов критическим для определения эффективности подхода к вакцинации, авторы настоящего изобретения оценивали эффективность вакцинации в трех разных условиях: 1) условия профилактики, 2) раннее вмешательство в модели метастазирования при раке легкого и 3) условия передовой терапии крупных развившихся подкожных опухолей.To determine whether the total number of neoantigens present in a vaccine is critical for determining the effectiveness of a vaccination approach, the present inventors evaluated the effectiveness of vaccination under three different conditions: 1) prophylaxis conditions, 2) early intervention in a lung cancer metastasis model, and 3) advanced disease conditions. treatment of large developed subcutaneous tumors.

При профилактическом вмешательстве мышей сперва иммунизировали GAd-CT26-31 или GAd-CT26-5 в дозе 5×10⁸ vp, и через две недели вводили опухолевые клетки СТ26 для оценки профилактической ценности вакцинации. Вакцинация обеспечивала защиту от приживления опухоли у 100% вакцинированных мышей независимо от типа применяемой конструкции, тогда как у всех не подвергавшихся лечению мышей развивались крупные опухоли (фиг. 3).In prophylactic intervention, mice were first immunized with GAd-CT26-31 or GAd-CT26-5 at a dose of 5×10 ⁸ vp and CT26 tumor cells were injected two weeks later to evaluate the prophylactic value of vaccination. Vaccination provided protection against tumor engraftment in 100% of vaccinated mice, regardless of the type of construct used, while all untreated mice developed large tumors (FIG. 3).

Подобным образом, GAd-CT26-31 и GAd-CT26-5 были в равной степени эффективными в устранении происходящих из клеток СТ26 метастазов в легком, измеряемом по числу узлов в легком, в условиях ранней терапии, имитирующих минимальное остаточное заболевание, поскольку опухолевые массы еще не сформировались на момент доставки вакцины. Вакцинацию (доза 5×10⁸ vp) проводили через 3 дня после внутривенной инъекции опухолевых клеток (фиг. 4).Similarly, GAd-CT26-31 and GAd-CT26-5 were equally effective in eradicating CT26-derived lung metastases, as measured by the number of nodules in the lung, under early therapy conditions that mimic minimal residual disease, as tumor masses are still not formed at the time of vaccine delivery. Vaccination (dose 5×10 ⁸ vp) was carried out 3 days after intravenous injection of tumor cells (Fig. 4).

В случае, когда мышей с крупными развившимися подкожными опухолями вакцинировали GAd-CT26-31 ТРА, никакой противоопухолевой активности не наблюдалось (фиг. 5А). Частичный ответ наблюдали в случае монотерапии антителом к PD-1 или комбинации терапии антителом к PD-1 с GAd-CT26-5 ТРА (фиг. 5b). В отличие от этого, комбинация блокирования PD1 с крупной конструкцией GAd-CT26-31 ТРА обеспечивала заметную противораковую активность, что приводило к сокращению размеров опухоли и полному излечению у 48% подвергнутых лечению животных (фиг. 5В). Совместное лечение GAd-CT26-31 ТРА и антителом к PD1 индуцировало Т-клеточные ответы в отношении тех же 8 из 31 неоантигена (фиг. 6) в сравнении с вакцинацией GAd-СТ26-31 ТРА в отдельности в условиях профилактики (фиг. 2).When mice with large developed subcutaneous tumors were vaccinated with GAd-CT26-31 TPA, no antitumor activity was observed (FIG. 5A). A partial response was observed with anti-PD-1 antibody monotherapy or combination of anti-PD-1 antibody therapy with GAd-CT26-5 TPA (FIG. 5b). In contrast, the combination of PD1 blocking with the large GAd-CT26-31 TPA construct provided marked anti-cancer activity resulting in tumor shrinkage and complete cure in 48% of treated animals (FIG. 5B). Co-treatment with GAd-CT26-31 TPA and anti-PD1 antibody induced T cell responses against the same 8 of 31 neoantigens (Figure 6) compared to vaccination with GAd-CT26-31 TPA alone in a prophylactic setting (Figure 2) .

Пример 4. Эффективность персонализированной вакцины зависит от CD8+ Т-клеточного ответа.Example 4 The effectiveness of a personalized vaccine depends on the CD8+ T cell response.

Для оценки вклада CD4+ Т-клеток и CD8+ Т-клеток в терапевтический противоопухолевый эффект GAd-CT26-31 ТРА осуществляли истощение по CD4+ или CD8+ Т-клеткам с помощью специфических антител (α-mCD8, BioXcell клон YTS 169.4; α-mCD4, BioXcell клон YTS 191), введенных путем инъекции (200 мкг) через одну неделю после начала терапии. Истощение по CD8+ Т-клеткам полностью отменяет противоопухолевый эффект (фиг. 8), подчеркивая основной вклад CD8+ Т-клеток. Напротив, истощение по CD4+ Т-клеткам не влияет на эффективность лечения (фиг. 7). Идентификация CD8+ Т-клеточного ответа как посредника эффективности также согласуется с известным свойством векторов на основе аденовируса стимулировать сильный CD8+ Т-клеточный ответ.To assess the contribution of CD4+ T cells and CD8+ T cells to the therapeutic antitumor effect of GAd-CT26-31, TPA depleted CD4+ or CD8+ T cells using specific antibodies (α-mCD8, BioXcell clone YTS 169.4; α-mCD4, BioXcell clone YTS 191) administered by injection (200 μg) one week after the start of therapy. Depletion of CD8+ T cells completely abolishes the antitumor effect (FIG. 8), highlighting the major contribution of CD8+ T cells. In contrast, CD4+ T cell depletion did not affect treatment efficacy (FIG. 7). The identification of a CD8+ T cell response as a mediator of efficacy is also consistent with the known property of adenovirus-based vectors to stimulate a strong CD8+ T cell response.

Пример 5. Эффективность комбинированного применения персонализированной вакцины и лечения антителом к PD1 коррелирует с повышением клональности TCR в опухоли.Example 5 Efficacy of combined use of personalized vaccine and anti-PD1 antibody treatment correlates with increased TCR clonality in the tumor.

РНК из опухолей СТ26 от мышей, подвергнутых лечению только антителом к PD1, или подвергнутых лечению комбинацией терапии антителом к PD-1 с GAd-CT26-31 ТРА, экстрагировали и подвергали RNASeq-анализу. Клональность Т-клеточного рецептора (TCR) бета оценивали на основе данных RNASeq с применением инструмента MIXCR с использованием стандартных параметров, описанных в рабочем руководстве для RNA-seq (https://mixcr.readthedocs.io/en/master/maseq.html). Полученные с помощью MLXCR первичные данные (последовательности и экспрессия обнаруженных клонотипов TCR) дополнительно анализировали с помощью пакета программного обеспечения tcR R (https://cran.r-project.org/web/packages/tcR/vignettes/tcrvignette.html) для получения реконструированных последовательностей CDR3 и получения сводной статистики. Как показано на фиг.8, совместное лечение антителом к PD-1 и GAd-CT26-5 ТРА обеспечивает наличие значимо большего числа отдельных клонов TCR (клонотипов) в опухолях, в сравнении с лечением антителом к PD1 отдельно.RNA from CT26 tumors from mice treated with anti-PD1 antibody alone or treated with a combination of anti-PD-1 antibody therapy with GAd-CT26-31 TPA was extracted and subjected to RNASeq analysis. T cell receptor (TCR) beta clonality was assessed from RNASeq data using the MIXCR tool using the standard parameters described in the RNA-seq workbook (https://mixcr.readthedocs.io/en/master/maseq.html) . Primary data obtained using MLXCR (sequences and expression of detected TCR clonotypes) were further analyzed using the tcR R software package (https://cran.r-project.org/web/packages/tcR/vignettes/tcrvignette.html) to obtain reconstructed CDR3 sequences and obtain summary statistics. As shown in Figure 8, co-treatment with anti-PD-1 antibody and GAd-CT26-5 TPA results in a significantly greater number of distinct TCR clones (clonotypes) in tumors compared to treatment with anti-PD1 antibody alone.

--->--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ SEQUENCE LIST

<110> НОУСКОМ АГ<110> NOWCOME AG

<120> ВАКЦИННАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА<120> VACCINE COMPOSITION FOR CANCER TREATMENT

<130> 854-20 PCT<130> 854-20 PCT

<150> 17181026.0<150> 17181026.0

<151> 2017-07-12<151> 2017-07-12

<150> 17200036.6<150> 17200036.6

<151> 2017-11-03<151> 2017-11-03

<160> 44 <160> 44

<170> PatentIn version 3.5<170>PatentIn version 3.5

<210> 1<210> 1

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 1<400> 1

Pro Gly Pro Gln Asn Phe Pro Pro Gln Asn Met Phe Glu Phe Pro Pro Pro Gly Pro Gln Asn Phe Pro Pro Gln Asn Met Phe Glu Phe Pro Pro

1 5 10 15 1 5 10 15

His Leu Ser Pro Pro Leu Leu Pro Pro His Leu Ser Pro Pro Leu Leu Pro Pro

20 25 20 25

<210> 2<210> 2

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 2<400> 2

Gly Ala Gln Glu Glu Pro Gln Val Glu Pro Leu Asp Phe Ser Leu Pro Gly Ala Gln Glu Glu Pro Gln Val Glu Pro Leu Asp Phe Ser Leu Pro

1 5 10 15 1 5 10 15

Lys Gln Gln Gly Glu Leu Leu Glu Arg Lys Gln Gln Gly Glu Leu Leu Glu Arg

20 25 20 25

<210> 3<210> 3

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 3<400> 3

Ala Val Phe Ala Gly Ser Asp Asp Pro Phe Ala Thr Pro Leu Ser Met Ala Val Phe Ala Gly Ser Asp Asp Pro Phe Ala Thr Pro Leu Ser Met

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Glu Met Asp Arg Arg Asn Asp Ala Ser Glu Met Asp Arg Arg Asn Asp Ala

20 25 20 25

<210> 4<210> 4

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 4<400> 4

His Ser Gly Gln Asn His Leu Lys Glu Met Ala Ile Ser Val Leu Glu His Ser Gly Gln Asn His Leu Lys Glu Met Ala Ile Ser Val Leu Glu

1 5 10 15 1 5 10 15

Ala Arg Ala Cys Ala Ala Ala Gly Gln Ala Arg Ala Cys Ala Ala Ala Gly Gln

20 25 20 25

<210> 5<210> 5

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 5<400> 5

Ile Leu Pro Gln Ala Pro Ser Gly Pro Ser Tyr Ala Thr Tyr Leu Gln Ile Leu Pro Gln Ala Pro Ser Gly Pro Ser Tyr Ala Thr Tyr Leu Gln

1 5 10 15 1 5 10 15

Pro Ala Gln Ala Gln Met Leu Thr Pro Pro Ala Gln Ala Gln Met Leu Thr Pro

20 25 20 25

<210> 6<210> 6

<211> 19<211> 19

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 6<400> 6

Met Ser Tyr Ala Glu Lys Ser Asp Glu Ile Thr Lys Asp Glu Trp Met Met Ser Tyr Ala Glu Lys Ser Asp Glu Ile Thr Lys Asp Glu Trp Met

1 5 10 15 1 5 10 15

Glu Lys Leu Glu Lys Leu

<210> 7<210> 7

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 7<400> 7

Gly Ala Gly Lys Gly Lys Tyr Tyr Ala Val Asn Phe Ser Met Arg Asp Gly Ala Gly Lys Gly Lys Tyr Tyr Ala Val Asn Phe Ser Met Arg Asp

1 5 10 15 1 5 10 15

Gly Ile Asp Asp Glu Ser Tyr Gly Gln Gly Ile Asp Asp Glu Ser Tyr Gly Gln

20 25 20 25

<210> 8<210> 8

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 8<400> 8

Tyr Arg Gly Ala Asp Lys Leu Cys Arg Lys Ala Ser Ser Val Lys Leu Tyr Arg Gly Ala Asp Lys Leu Cys Arg Lys Ala Ser Ser Val Lys Leu

1 5 10 15 1 5 10 15

Val Lys Thr Ser Pro Glu Leu Ser Glu Val Lys Thr Ser Pro Glu Leu Ser Glu

20 25 20 25

<210> 9<210> 9

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 9<400> 9

Asp Ser Asn Leu Gln Ala Arg Leu Thr Ser Tyr Glu Thr Leu Lys Lys Asp Ser Asn Leu Gln Ala Arg Leu Thr Ser Tyr Glu Thr Leu Lys Lys

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Leu Ser Lys Ile Arg Glu Glu Ser Ser Leu Ser Lys Ile Arg Glu Glu Ser

20 25 20 25

<210> 10<210> 10

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 10<400> 10

His Ser Phe Ile His Ala Ala Met Gly Met Ala Val Thr Trp Cys Ala His Ser Phe Ile His Ala Ala Met Gly Met Ala Val Thr Trp Cys Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Ala Ile Met Thr Lys Gly Gln Tyr Ser Ala Ile Met Thr Lys Gly Gln Tyr Ser

20 25 20 25

<210> 11<210> 11

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 11<400> 11

Leu Arg Thr Ala Ala Tyr Val Asn Ala Ile Glu Lys Ile Phe Lys Val Leu Arg Thr Ala Ala Tyr Val Asn Ala Ile Glu Lys Ile Phe Lys Val

1 5 10 15 1 5 10 15

Tyr Asn Glu Ala Gly Val Thr Phe Thr Tyr Asn Glu Ala Gly Val Thr Phe Thr

20 25 20 25

<210> 12<210> 12

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 12<400> 12

Phe Glu Gly Ser Leu Ala Lys Asn Leu Ser Leu Asn Phe Gln Ala Val Phe Glu Gly Ser Leu Ala Lys Asn Leu Ser Leu Asn Phe Gln Ala Val

1 5 10 15 1 5 10 15

Lys Glu Asn Leu Tyr Tyr Glu Val Gly Lys Glu Asn Leu Tyr Tyr Glu Val Gly

20 25 20 25

<210> 13<210> 13

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 13<400> 13

Asp Pro Arg Ala Ala Tyr Phe Arg Gln Ala Glu Asn Asp Met Tyr Ile Asp Pro Arg Ala Ala Tyr Phe Arg Gln Ala Glu Asn Asp Met Tyr Ile

1 5 10 15 1 5 10 15

Arg Met Ala Leu Leu Ala Thr Val Leu Arg Met Ala Leu Leu Ala Thr Val Leu

20 25 20 25

<210> 14<210> 14

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 14<400> 14

Leu Arg Ser Gln Met Val Met Lys Met Arg Glu Tyr Phe Cys Asn Leu Leu Arg Ser Gln Met Val Met Lys Met Arg Glu Tyr Phe Cys Asn Leu

1 5 10 15 1 5 10 15

His Gly Phe Val Asp Ile Glu Thr Pro His Gly Phe Val Asp Ile Glu Thr Pro

20 25 20 25

<210> 15<210> 15

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 15<400> 15

Asp Leu Leu Ala Phe Glu Arg Lys Leu Asp Gln Thr Val Met Arg Lys Asp Leu Leu Ala Phe Glu Arg Lys Leu Asp Gln Thr Val Met Arg Lys

1 5 10 15 1 5 10 15

Arg Leu Asp Ile Gln Glu Ala Leu Lys Arg Leu Asp Ile Gln Glu Ala Leu Lys

20 25 20 25

<210> 16<210> 16

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 16<400> 16

Ile Lys Arg Glu Lys Cys Trp Lys Asp Ala Thr Tyr Pro Glu Ser Phe Ile Lys Arg Glu Lys Cys Trp Lys Asp Ala Thr Tyr Pro Glu Ser Phe

1 5 10 15 1 5 10 15

His Thr Leu Glu Ser Val Pro Ala Thr His Thr Leu Glu Ser Val Pro Ala Thr

20 25 20 25

<210> 17<210> 17

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 17<400> 17

Gly Arg Ser Ser Gln Val Tyr Phe Thr Ile Asn Val Asn Leu Asp Leu Gly Arg Ser Ser Gln Val Tyr Phe Thr Ile Asn Val Asn Leu Asp Leu

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Glu Ala Ala Val Val Thr Phe Ser Ser Glu Ala Ala Val Val Thr Phe Ser

20 25 20 25

<210> 18<210> 18

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 18<400> 18

Lys Pro Leu Arg Arg Asn Asn Ser Tyr Thr Ser Tyr Ile Met Ala Ile Lys Pro Leu Arg Arg Asn Asn Ser Tyr Thr Ser Tyr Ile Met Ala Ile

1 5 10 15 1 5 10 15

Cys Gly Met Pro Leu Asp Ser Phe Arg Cys Gly Met Pro Leu Asp Ser Phe Arg

20 25 20 25

<210> 19<210> 19

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 19<400> 19

Thr Thr Cys Leu Ala Val Gly Gly Leu Asp Val Lys Phe Gln Glu Ala Thr Thr Cys Leu Ala Val Gly Gly Leu Asp Val Lys Phe Gln Glu Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Ala Leu Arg Ala Ala Pro Asp Ile Leu Ala Leu Arg Ala Ala Pro Asp Ile Leu

20 25 20 25

<210> 20<210> 20

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 20<400> 20

Ile Tyr Glu Phe Asp Tyr His Leu Tyr Gly Gln Asn Ile Thr Met Ile Ile Tyr Glu Phe Asp Tyr His Leu Tyr Gly Gln Asn Ile Thr Met Ile

1 5 10 15 1 5 10 15

Met Thr Ser Val Ser Gly His Leu Leu Met Thr Ser Val Ser Gly His Leu Leu

20 25 20 25

<210> 21<210> 21

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 21<400> 21

Pro Asp Ser Phe Ser Ile Pro Tyr Leu Thr Ala Leu Asp Asp Leu Leu Pro Asp Ser Phe Ser Ile Pro Tyr Leu Thr Ala Leu Asp Asp Leu Leu

1 5 10 15 1 5 10 15

Gly Thr Ala Leu Leu Ala Leu Ser Phe Gly Thr Ala Leu Leu Ala Leu Ser Phe

20 25 20 25

<210> 22<210> 22

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 22<400> 22

Tyr Ala Thr Ile Leu Glu Met Gln Ala Met Met Thr Leu Asp Pro Gln Tyr Ala Thr Ile Leu Glu Met Gln Ala Met Met Thr Leu Asp Pro Gln

1 5 10 15 1 5 10 15

Asp Ile Leu Leu Ala Gly Asn Met Met Asp Ile Leu Leu Ala Gly Asn Met Met

20 25 20 25

<210> 23<210> 23

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 23<400> 23

Ser Trp Ile His Cys Trp Lys Tyr Leu Ser Val Gln Ser Gln Leu Phe Ser Trp Ile His Cys Trp Lys Tyr Leu Ser Val Gln Ser Gln Leu Phe

1 5 10 15 1 5 10 15

Arg Gly Ser Ser Leu Leu Phe Arg Arg Arg Gly Ser Ser Leu Leu Phe Arg Arg

20 25 20 25

<210> 24<210> 24

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 24<400> 24

Tyr Asp Asn Lys Gly Ile Thr Tyr Leu Phe Asp Leu Tyr Tyr Glu Ser Tyr Asp Asn Lys Gly Ile Thr Tyr Leu Phe Asp Leu Tyr Tyr Glu Ser

1 5 10 15 1 5 10 15

Asp Glu Phe Thr Val Asp Ala Ala Arg Asp Glu Phe Thr Val Asp Ala Ala Arg

20 25 20 25

<210> 25<210> 25

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 25<400> 25

Ala Gln Ala Ala Lys Asn Lys Gly Asn Lys Tyr Phe Gln Ala Gly Lys Ala Gln Ala Ala Lys Asn Lys Gly Asn Lys Tyr Phe Gln Ala Gly Lys

1 5 10 15 1 5 10 15

Tyr Glu Gln Ala Ile Gln Cys Tyr Thr Tyr Glu Gln Ala Ile Gln Cys Tyr Thr

20 25 20 25

<210> 26<210> 26

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 26<400> 26

Gln Pro Met Leu Pro Ile Gly Leu Ser Asp Ile Pro Asp Glu Ala Met Gln Pro Met Leu Pro Ile Gly Leu Ser Asp Ile Pro Asp Glu Ala Met

1 5 10 15 1 5 10 15

Val Lys Leu Tyr Cys Pro Lys Cys Met Val Lys Leu Tyr Cys Pro Lys Cys Met

20 25 20 25

<210> 27<210> 27

<211> 23<211> 23

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 27<400> 27

His Arg Gly Ala Ile Tyr Gly Ser Ser Trp Lys Tyr Phe Thr Phe Ser His Arg Gly Ala Ile Tyr Gly Ser Ser Trp Lys Tyr Phe Thr Phe Ser

1 5 10 15 1 5 10 15

Gly Tyr Leu Leu Tyr Gln Asp Gly Tyr Leu Leu Tyr Gln Asp

20 twenty

<210> 28<210> 28

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 28<400> 28

Val Ile Gln Thr Ser Lys Tyr Tyr Met Arg Asp Val Ile Ala Ile Glu Val Ile Gln Thr Ser Lys Tyr Tyr Met Arg Asp Val Ile Ala Ile Glu

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Ala Trp Leu Leu Glu Leu Ala Pro Ser Ala Trp Leu Leu Glu Leu Ala Pro

20 25 20 25

<210> 29<210> 29

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 29<400> 29

Pro Arg Gly Val Asp Leu Tyr Leu Arg Ile Leu Met Pro Ile Asp Ser Pro Arg Gly Val Asp Leu Tyr Leu Arg Ile Leu Met Pro Ile Asp Ser

1 5 10 15 1 5 10 15

Glu Leu Val Asp Arg Asp Val Val His Glu Leu Val Asp Arg Asp Val Val His

20 25 20 25

<210> 30<210> 30

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 30<400> 30

Gln Ile Glu Gln Asp Ala Leu Cys Pro Gln Asp Thr Tyr Cys Asp Leu Gln Ile Glu Gln Asp Ala Leu Cys Pro Gln Asp Thr Tyr Cys Asp Leu

1 5 10 15 1 5 10 15

Lys Ser Arg Ala Glu Val Asn Gly Ala Lys Ser Arg Ala Glu Val Asn Gly Ala

20 25 20 25

<210> 31<210> 31

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 31<400> 31

Ala Leu Ala Ser Ala Ile Leu Ser Asp Pro Glu Ser Tyr Ile Lys Lys Ala Leu Ala Ser Ala Ile Leu Ser Asp Pro Glu Ser Tyr Ile Lys Lys

1 5 10 15 1 5 10 15

Leu Lys Glu Leu Arg Ser Met Leu Met Leu Lys Glu Leu Arg Ser Met Leu Met

20 25 20 25

<210> 32<210> 32

<211> 137<211> 137

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 32<400> 32

Met Leu Leu Pro Phe Tyr Pro Pro Asp Glu Ala Leu Glu Ile Gly Leu Met Leu Leu Pro Phe Tyr Pro Pro Asp Glu Ala Leu Glu Ile Gly Leu

1 5 10 15 1 5 10 15

Glu Leu Asn Ser Ser Ala Leu Pro Pro Thr Ile Leu Pro Gln Ala Pro Glu Leu Asn Ser Ser Ala Leu Pro Pro Thr Ile Leu Pro Gln Ala Pro

20 25 30 20 25 30

Ser Gly Pro Ser Tyr Ala Thr Tyr Leu Gln Pro Ala Gln Ala Gln Met Ser Gly Pro Ser Tyr Ala Thr Tyr Leu Gln Pro Ala Gln Ala Gln Met

35 40 45 35 40 45

Leu Thr Pro Lys Pro Leu Arg Arg Asn Asn Ser Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Thr Pro Lys Pro Leu Arg Arg Asn Asn Ser Tyr Thr Ser Tyr Ile

50 55 60 50 55 60

Met Ala Ile Cys Gly Met Pro Leu Asp Ser Phe Arg Val Ile Gln Thr Met Ala Ile Cys Gly Met Pro Leu Asp Ser Phe Arg Val Ile Gln Thr

65 70 75 80 65 70 75 80

Ser Lys Tyr Tyr Met Arg Asp Val Ile Ala Ile Glu Ser Ala Trp Leu Ser Lys Tyr Tyr Met Arg Asp Val Ile Ala Ile Glu Ser Ala Trp Leu

85 90 95 85 90 95

Leu Glu Leu Ala Pro His Ile His Arg Ala Gly Gly Leu Phe Val Ala Leu Glu Leu Ala Pro His Ile His Arg Ala Gly Gly Leu Phe Val Ala

100 105 110 100 105 110

Asp Ala Ile Gln Val Gly Phe Gly Arg Ile Gly Lys His Phe Gly Tyr Asp Ala Ile Gln Val Gly Phe Gly Arg Ile Gly Lys His Phe Gly Tyr

115 120 125 115 120 125

Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser

130 135 130 135

<210> 33<210> 33

<211> 368<211> 368

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 33<400> 33

Met His Arg Arg Arg Ser Arg Ser Cys Arg Glu Asp Gln Lys Pro Val Met His Arg Arg Arg Ser Arg Ser Cys Arg Glu Asp Gln Lys Pro Val

1 5 10 15 1 5 10 15

Met Asp Asp Gln Arg Asp Leu Ile Ser Asn Asn Glu Gln Leu Pro Met Met Asp Asp Gln Arg Asp Leu Ile Ser Asn Asn Glu Gln Leu Pro Met

20 25 30 20 25 30

Leu Gly Arg Arg Pro Gly Ala Pro Glu Ser Lys Cys Ser Arg Gly Ala Leu Gly Arg Arg Pro Gly Ala Pro Glu Ser Lys Cys Ser Arg Gly Ala

35 40 45 35 40 45

Leu Tyr Thr Gly Phe Ser Ile Leu Val Thr Leu Leu Leu Ala Gly Gln Leu Tyr Thr Gly Phe Ser Ile Leu Val Thr Leu Leu Leu Ala Gly Gln

50 55 60 50 55 60

Ala Thr Thr Ala Tyr Phe Leu Tyr Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys Ala Thr Thr Ala Tyr Phe Leu Tyr Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys

65 70 75 80 65 70 75 80

Leu Thr Val Thr Ser Gln Asn Leu Gln Leu Glu Asn Leu Arg Met Lys Leu Thr Val Thr Ser Gln Asn Leu Gln Leu Glu Asn Leu Arg Met Lys

85 90 95 85 90 95

Leu Pro Lys Pro Pro Lys Pro Val Ser Lys Met Arg Met Ala Thr Pro Leu Pro Lys Pro Pro Lys Pro Val Ser Lys Met Arg Met Ala Thr Pro

100 105 110 100 105 110

Leu Leu Met Gln Ala Leu Pro Met Gly Ala Leu Pro Gln Gly Pro Met Leu Leu Met Gln Ala Leu Pro Met Gly Ala Leu Pro Gln Gly Pro Met

115 120 125 115 120 125

Gln Asn Ala Thr Lys Tyr Gly Asn Met Thr Glu Asp His Val Met His Gln Asn Ala Thr Lys Tyr Gly Asn Met Thr Glu Asp His Val Met His

130 135 140 130 135 140

Leu Leu Gln Asn Ala Asp Pro Leu Lys Val Tyr Pro Pro Leu Lys Gly Leu Leu Gln Asn Ala Asp Pro Leu Lys Val Tyr Pro Pro Leu Lys Gly

145 150 155 160 145 150 155 160

Ser Phe Pro Glu Asn Leu Arg His Leu Lys Asn Thr Met Glu Thr Ile Ser Phe Pro Glu Asn Leu Arg His Leu Lys Asn Thr Met Glu Thr Ile

165 170 175 165 170 175

Asp Trp Lys Val Phe Glu Ser Trp Met His His Trp Leu Leu Phe Glu Asp Trp Lys Val Phe Glu Ser Trp Met His His Trp Leu Leu Phe Glu

180 185 190 180 185 190

Met Ser Arg His Ser Leu Glu Gln Lys Pro Thr Asp Ala Pro Pro Lys Met Ser Arg His Ser Leu Glu Gln Lys Pro Thr Asp Ala Pro Pro Lys

195 200 205 195 200 205

Glu Ser Leu Glu Leu Glu Asp Pro Ser Ser Gly Leu Gly Val Thr Lys Glu Ser Leu Glu Leu Glu Asp Pro Ser Ser Gly Leu Gly Val Thr Lys

210 215 220 210 215 220

Gln Asp Leu Gly Pro Val Pro Met Leu Leu Pro Phe Tyr Pro Pro Asp Gln Asp Leu Gly Pro Val Pro Met Leu Leu Pro Phe Tyr Pro Pro Asp

225 230 235 240 225 230 235 240

Glu Ala Leu Glu Ile Gly Leu Glu Leu Asn Ser Ser Ala Leu Pro Pro Glu Ala Leu Glu Ile Gly Leu Glu Leu Asn Ser Ser Ala Leu Pro Pro

245 250 255 245 250 255

Thr Ile Leu Pro Gln Ala Pro Ser Gly Pro Ser Tyr Ala Thr Tyr Leu Thr Ile Leu Pro Gln Ala Pro Ser Gly Pro Ser Tyr Ala Thr Tyr Leu

260 265 270 260 265 270

Gln Pro Ala Gln Ala Gln Met Leu Thr Pro Lys Pro Leu Arg Arg Asn Gln Pro Ala Gln Ala Gln Met Leu Thr Pro Lys Pro Leu Arg Arg Asn

275 280 285 275 280 285

Asn Ser Tyr Thr Ser Tyr Ile Met Ala Ile Cys Gly Met Pro Leu Asp Asn Ser Tyr Thr Ser Tyr Ile Met Ala Ile Cys Gly Met Pro Leu Asp

290 295 300 290 295 300

Ser Phe Arg Val Ile Gln Thr Ser Lys Tyr Tyr Met Arg Asp Val Ile Ser Phe Arg Val Ile Gln Thr Ser Lys Tyr Tyr Met Arg Asp Val Ile

305 310 315 320 305 310 315 320

Ala Ile Glu Ser Ala Trp Leu Leu Glu Leu Ala Pro His Ile His Arg Ala Ile Glu Ser Ala Trp Leu Leu Glu Leu Ala Pro His Ile His Arg

325 330 335 325 330 335

Ala Gly Gly Leu Phe Val Ala Asp Ala Ile Gln Val Gly Phe Gly Arg Ala Gly Gly Leu Phe Val Ala Asp Ala Ile Gln Val Gly Phe Gly Arg

340 345 350 340 345 350

Ile Gly Lys His Phe Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Ile Gly Lys His Phe Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser

355 360 365 355 360 365

<210> 34<210> 34

<211> 165<211> 165

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 34<400> 34

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Gln Glu Ile His Ala Arg Leu Leu Pro Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Gln Glu Ile His Ala Arg Leu Leu Pro

20 25 30 20 25 30

Phe Tyr Pro Pro Asp Glu Ala Leu Glu Ile Gly Leu Glu Leu Asn Ser Phe Tyr Pro Pro Asp Glu Ala Leu Glu Ile Gly Leu Glu Leu Asn Ser

35 40 45 35 40 45

Ser Ala Leu Pro Pro Thr Ile Leu Pro Gln Ala Pro Ser Gly Pro Ser Ser Ala Leu Pro Pro Thr Ile Leu Pro Gln Ala Pro Ser Gly Pro Ser

50 55 60 50 55 60

Tyr Ala Thr Tyr Leu Gln Pro Ala Gln Ala Gln Met Leu Thr Pro Lys Tyr Ala Thr Tyr Leu Gln Pro Ala Gln Ala Gln Met Leu Thr Pro Lys

65 70 75 80 65 70 75 80

Pro Leu Arg Arg Asn Asn Ser Tyr Thr Ser Tyr Ile Met Ala Ile Cys Pro Leu Arg Arg Asn Asn Ser Tyr Thr Ser Tyr Ile Met Ala Ile Cys

85 90 95 85 90 95

Gly Met Pro Leu Asp Ser Phe Arg Val Ile Gln Thr Ser Lys Tyr Tyr Gly Met Pro Leu Asp Ser Phe Arg Val Ile Gln Thr Ser Lys Tyr Tyr

100 105 110 100 105 110

Met Arg Asp Val Ile Ala Ile Glu Ser Ala Trp Leu Leu Glu Leu Ala Met Arg Asp Val Ile Ala Ile Glu Ser Ala Trp Leu Leu Glu Leu Ala

115 120 125 115 120 125

Pro His Ile His Arg Ala Gly Gly Leu Phe Val Ala Asp Ala Ile Gln Pro His Ile His Arg Ala Gly Gly Leu Phe Val Ala Asp Ala Ile Gln

130 135 140 130 135 140

Val Gly Phe Gly Arg Ile Gly Lys His Phe Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Val Gly Phe Gly Arg Ile Gly Lys His Phe Gly Tyr Pro Tyr Asp Val

145 150 155 160 145 150 155 160

Pro Asp Tyr Ala Ser Pro Asp Tyr Ala Ser

165 165

<210> 35<210> 35

<211> 807<211> 807

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 35<400> 35

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Gln Glu Ile His Ala Arg Pro Gly Pro Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Gln Glu Ile His Ala Arg Pro Gly Pro

20 25 30 20 25 30

Gln Asn Phe Pro Pro Gln Asn Met Phe Glu Phe Pro Pro His Leu Ser Gln Asn Phe Pro Pro Gln Asn Met Phe Glu Phe Pro Pro His Leu Ser

35 40 45 35 40 45

Pro Pro Leu Leu Pro Pro Gly Ala Gln Glu Glu Pro Gln Val Glu Pro Pro Pro Leu Leu Pro Pro Gly Ala Gln Glu Glu Pro Gln Val Glu Pro

50 55 60 50 55 60

Leu Asp Phe Ser Leu Pro Lys Gln Gln Gly Glu Leu Leu Glu Arg Ala Leu Asp Phe Ser Leu Pro Lys Gln Gln Gly Glu Leu Leu Glu Arg Ala

65 70 75 80 65 70 75 80

Val Phe Ala Gly Ser Asp Asp Pro Phe Ala Thr Pro Leu Ser Met Ser Val Phe Ala Gly Ser Asp Asp Pro Phe Ala Thr Pro Leu Ser Met Ser

85 90 95 85 90 95

Glu Met Asp Arg Arg Asn Asp Ala His Ser Gly Gln Asn His Leu Lys Glu Met Asp Arg Arg Asn Asp Ala His Ser Gly Gln Asn His Leu Lys

100 105 110 100 105 110

Glu Met Ala Ile Ser Val Leu Glu Ala Arg Ala Cys Ala Ala Ala Gly Glu Met Ala Ile Ser Val Leu Glu Ala Arg Ala Cys Ala Ala Ala Gly

115 120 125 115 120 125

Gln Ile Leu Pro Gln Ala Pro Ser Gly Pro Ser Tyr Ala Thr Tyr Leu Gln Ile Leu Pro Gln Ala Pro Ser Gly Pro Ser Tyr Ala Thr Tyr Leu

130 135 140 130 135 140

Gln Pro Ala Gln Ala Gln Met Leu Thr Pro Met Ser Tyr Ala Glu Lys Gln Pro Ala Gln Ala Gln Met Leu Thr Pro Met Ser Tyr Ala Glu Lys

145 150 155 160 145 150 155 160

Ser Asp Glu Ile Thr Lys Asp Glu Trp Met Glu Lys Leu Gly Ala Gly Ser Asp Glu Ile Thr Lys Asp Glu Trp Met Glu Lys Leu Gly Ala Gly

165 170 175 165 170 175

Lys Gly Lys Tyr Tyr Ala Val Asn Phe Ser Met Arg Asp Gly Ile Asp Lys Gly Lys Tyr Tyr Ala Val Asn Phe Ser Met Arg Asp Gly Ile Asp

180 185 190 180 185 190

Asp Glu Ser Tyr Gly Gln Tyr Arg Gly Ala Asp Lys Leu Cys Arg Lys Asp Glu Ser Tyr Gly Gln Tyr Arg Gly Ala Asp Lys Leu Cys Arg Lys

195 200 205 195 200 205

Ala Ser Ser Val Lys Leu Val Lys Thr Ser Pro Glu Leu Ser Glu Asp Ala Ser Ser Val Lys Leu Val Lys Thr Ser Pro Glu Leu Ser Glu Asp

210 215 220 210 215 220

Ser Asn Leu Gln Ala Arg Leu Thr Ser Tyr Glu Thr Leu Lys Lys Ser Ser Asn Leu Gln Ala Arg Leu Thr Ser Tyr Glu Thr Leu Lys Lys Ser

225 230 235 240 225 230 235 240

Leu Ser Lys Ile Arg Glu Glu Ser His Ser Phe Ile His Ala Ala Met Leu Ser Lys Ile Arg Glu Glu Ser His Ser Phe Ile His Ala Ala Met

245 250 255 245 250 255

Gly Met Ala Val Thr Trp Cys Ala Ala Ile Met Thr Lys Gly Gln Tyr Gly Met Ala Val Thr Trp Cys Ala Ala Ile Met Thr Lys Gly Gln Tyr

260 265 270 260 265 270

Ser Leu Arg Thr Ala Ala Tyr Val Asn Ala Ile Glu Lys Ile Phe Lys Ser Leu Arg Thr Ala Ala Tyr Val Asn Ala Ile Glu Lys Ile Phe Lys

275 280 285 275 280 285

Val Tyr Asn Glu Ala Gly Val Thr Phe Thr Phe Glu Gly Ser Leu Ala Val Tyr Asn Glu Ala Gly Val Thr Phe Thr Phe Glu Gly Ser Leu Ala

290 295 300 290 295 300

Lys Asn Leu Ser Leu Asn Phe Gln Ala Val Lys Glu Asn Leu Tyr Tyr Lys Asn Leu Ser Leu Asn Phe Gln Ala Val Lys Glu Asn Leu Tyr Tyr

305 310 315 320 305 310 315 320

Glu Val Gly Asp Pro Arg Ala Ala Tyr Phe Arg Gln Ala Glu Asn Asp Glu Val Gly Asp Pro Arg Ala Ala Tyr Phe Arg Gln Ala Glu Asn Asp

325 330 335 325 330 335

Met Tyr Ile Arg Met Ala Leu Leu Ala Thr Val Leu Leu Arg Ser Gln Met Tyr Ile Arg Met Ala Leu Leu Ala Thr Val Leu Leu Arg Ser Gln

340 345 350 340 345 350

Met Val Met Lys Met Arg Glu Tyr Phe Cys Asn Leu His Gly Phe Val Met Val Met Lys Met Arg Glu Tyr Phe Cys Asn Leu His Gly Phe Val

355 360 365 355 360 365

Asp Ile Glu Thr Pro Asp Leu Leu Ala Phe Glu Arg Lys Leu Asp Gln Asp Ile Glu Thr Pro Asp Leu Leu Ala Phe Glu Arg Lys Leu Asp Gln

370 375 380 370 375 380

Thr Val Met Arg Lys Arg Leu Asp Ile Gln Glu Ala Leu Lys Ile Lys Thr Val Met Arg Lys Arg Leu Asp Ile Gln Glu Ala Leu Lys Ile Lys

385 390 395 400 385 390 395 400

Arg Glu Lys Cys Trp Lys Asp Ala Thr Tyr Pro Glu Ser Phe His Thr Arg Glu Lys Cys Trp Lys Asp Ala Thr Tyr Pro Glu Ser Phe His Thr

405 410 415 405 410 415

Leu Glu Ser Val Pro Ala Thr Gly Arg Ser Ser Gln Val Tyr Phe Thr Leu Glu Ser Val Pro Ala Thr Gly Arg Ser Ser Gln Val Tyr Phe Thr

420 425 430 420 425 430

Ile Asn Val Asn Leu Asp Leu Ser Glu Ala Ala Val Val Thr Phe Ser Ile Asn Val Asn Leu Asp Leu Ser Glu Ala Ala Val Val Thr Phe Ser

435 440 445 435 440 445

Lys Pro Leu Arg Arg Asn Asn Ser Tyr Thr Ser Tyr Ile Met Ala Ile Lys Pro Leu Arg Arg Asn Asn Ser Tyr Thr Ser Tyr Ile Met Ala Ile

450 455 460 450 455 460

Cys Gly Met Pro Leu Asp Ser Phe Arg Thr Thr Cys Leu Ala Val Gly Cys Gly Met Pro Leu Asp Ser Phe Arg Thr Thr Cys Leu Ala Val Gly

465 470 475 480 465 470 475 480

Gly Leu Asp Val Lys Phe Gln Glu Ala Ala Leu Arg Ala Ala Pro Asp Gly Leu Asp Val Lys Phe Gln Glu Ala Ala Leu Arg Ala Ala Pro Asp

485 490 495 485 490 495

Ile Leu Ile Tyr Glu Phe Asp Tyr His Leu Tyr Gly Gln Asn Ile Thr Ile Leu Ile Tyr Glu Phe Asp Tyr His Leu Tyr Gly Gln Asn Ile Thr

500 505 510 500 505 510

Met Ile Met Thr Ser Val Ser Gly His Leu Leu Pro Asp Ser Phe Ser Met Ile Met Thr Ser Val Ser Gly His Leu Leu Pro Asp Ser Phe Ser

515 520 525 515 520 525

Ile Pro Tyr Leu Thr Ala Leu Asp Asp Leu Leu Gly Thr Ala Leu Leu Ile Pro Tyr Leu Thr Ala Leu Asp Asp Leu Leu Gly Thr Ala Leu Leu

530 535 540 530 535 540

Ala Leu Ser Phe Tyr Ala Thr Ile Leu Glu Met Gln Ala Met Met Thr Ala Leu Ser Phe Tyr Ala Thr Ile Leu Glu Met Gln Ala Met Met Thr

545 550 555 560 545 550 555 560

Leu Asp Pro Gln Asp Ile Leu Leu Ala Gly Asn Met Met Ser Trp Ile Leu Asp Pro Gln Asp Ile Leu Leu Ala Gly Asn Met Met Ser Trp Ile

565 570 575 565 570 575

His Cys Trp Lys Tyr Leu Ser Val Gln Ser Gln Leu Phe Arg Gly Ser His Cys Trp Lys Tyr Leu Ser Val Gln Ser Gln Leu Phe Arg Gly Ser

580 585 590 580 585 590

Ser Leu Leu Phe Arg Arg Tyr Asp Asn Lys Gly Ile Thr Tyr Leu Phe Ser Leu Leu Phe Arg Arg Tyr Asp Asn Lys Gly Ile Thr Tyr Leu Phe

595 600 605 595 600 605

Asp Leu Tyr Tyr Glu Ser Asp Glu Phe Thr Val Asp Ala Ala Arg Ala Asp Leu Tyr Tyr Glu Ser Asp Glu Phe Thr Val Asp Ala Ala Arg Ala

610 615 620 610 615 620

Gln Ala Ala Lys Asn Lys Gly Asn Lys Tyr Phe Gln Ala Gly Lys Tyr Gln Ala Ala Lys Asn Lys Gly Asn Lys Tyr Phe Gln Ala Gly Lys Tyr

625 630 635 640 625 630 635 640

Glu Gln Ala Ile Gln Cys Tyr Thr Gln Pro Met Leu Pro Ile Gly Leu Glu Gln Ala Ile Gln Cys Tyr Thr Gln Pro Met Leu Pro Ile Gly Leu

645 650 655 645 650 655

Ser Asp Ile Pro Asp Glu Ala Met Val Lys Leu Tyr Cys Pro Lys Cys Ser Asp Ile Pro Asp Glu Ala Met Val Lys Leu Tyr Cys Pro Lys Cys

660 665 670 660 665 670

Met His Arg Gly Ala Ile Tyr Gly Ser Ser Trp Lys Tyr Phe Thr Phe Met His Arg Gly Ala Ile Tyr Gly Ser Ser Trp Lys Tyr Phe Thr Phe

675 680 685 675 680 685

Ser Gly Tyr Leu Leu Tyr Gln Asp Val Ile Gln Thr Ser Lys Tyr Tyr Ser Gly Tyr Leu Leu Tyr Gln Asp Val Ile Gln Thr Ser Lys Tyr Tyr

690 695 700 690 695 700

Met Arg Asp Val Ile Ala Ile Glu Ser Ala Trp Leu Leu Glu Leu Ala Met Arg Asp Val Ile Ala Ile Glu Ser Ala Trp Leu Leu Glu Leu Ala

705 710 715 720 705 710 715 720

Pro Pro Arg Gly Val Asp Leu Tyr Leu Arg Ile Leu Met Pro Ile Asp Pro Pro Arg Gly Val Asp Leu Tyr Leu Arg Ile Leu Met Pro Ile Asp

725 730 735 725 730 735

Ser Glu Leu Val Asp Arg Asp Val Val His Gln Ile Glu Gln Asp Ala Ser Glu Leu Val Asp Arg Asp Val Val His Gln Ile Glu Gln Asp Ala

740 745 750 740 745 750

Leu Cys Pro Gln Asp Thr Tyr Cys Asp Leu Lys Ser Arg Ala Glu Val Leu Cys Pro Gln Asp Thr Tyr Cys Asp Leu Lys Ser Arg Ala Glu Val

755 760 765 755 760 765

Asn Gly Ala Ala Leu Ala Ser Ala Ile Leu Ser Asp Pro Glu Ser Tyr Asn Gly Ala Ala Leu Ala Ser Ala Ile Leu Ser Asp Pro Glu Ser Tyr

770 775 780 770 775 780

Ile Lys Lys Leu Lys Glu Leu Arg Ser Met Leu Met Gly Tyr Pro Tyr Ile Lys Lys Leu Lys Glu Leu Arg Ser Met Leu Met Gly Tyr Pro Tyr

785 790 795 800 785 790 795 800

Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser

805 805

<210> 36<210> 36

<211> 232<211> 232

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 36<400> 36

Met His Arg Arg Arg Ser Arg Ser Cys Arg Glu Asp Gln Lys Pro Val Met His Arg Arg Arg Ser Arg Ser Cys Arg Glu Asp Gln Lys Pro Val

1 5 10 15 1 5 10 15

Met Asp Asp Gln Arg Asp Leu Ile Ser Asn Asn Glu Gln Leu Pro Met Met Asp Asp Gln Arg Asp Leu Ile Ser Asn Asn Glu Gln Leu Pro Met

20 25 30 20 25 30

Leu Gly Arg Arg Pro Gly Ala Pro Glu Ser Lys Cys Ser Arg Gly Ala Leu Gly Arg Arg Pro Gly Ala Pro Glu Ser Lys Cys Ser Arg Gly Ala

35 40 45 35 40 45

Leu Tyr Thr Gly Phe Ser Ile Leu Val Thr Leu Leu Leu Ala Gly Gln Leu Tyr Thr Gly Phe Ser Ile Leu Val Thr Leu Leu Leu Ala Gly Gln

50 55 60 50 55 60

Ala Thr Thr Ala Tyr Phe Leu Tyr Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys Ala Thr Thr Ala Tyr Phe Leu Tyr Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys

65 70 75 80 65 70 75 80

Leu Thr Val Thr Ser Gln Asn Leu Gln Leu Glu Asn Leu Arg Met Lys Leu Thr Val Thr Ser Gln Asn Leu Gln Leu Glu Asn Leu Arg Met Lys

85 90 95 85 90 95

Leu Pro Lys Pro Pro Lys Pro Val Ser Lys Met Arg Met Ala Thr Pro Leu Pro Lys Pro Pro Lys Pro Val Ser Lys Met Arg Met Ala Thr Pro

100 105 110 100 105 110

Leu Leu Met Gln Ala Leu Pro Met Gly Ala Leu Pro Gln Gly Pro Met Leu Leu Met Gln Ala Leu Pro Met Gly Ala Leu Pro Gln Gly Pro Met

115 120 125 115 120 125

Gln Asn Ala Thr Lys Tyr Gly Asn Met Thr Glu Asp His Val Met His Gln Asn Ala Thr Lys Tyr Gly Asn Met Thr Glu Asp His Val Met His

130 135 140 130 135 140

Leu Leu Gln Asn Ala Asp Pro Leu Lys Val Tyr Pro Pro Leu Lys Gly Leu Leu Gln Asn Ala Asp Pro Leu Lys Val Tyr Pro Pro Leu Lys Gly

145 150 155 160 145 150 155 160

Ser Phe Pro Glu Asn Leu Arg His Leu Lys Asn Thr Met Glu Thr Ile Ser Phe Pro Glu Asn Leu Arg His Leu Lys Asn Thr Met Glu Thr Ile

165 170 175 165 170 175

Asp Trp Lys Val Phe Glu Ser Trp Met His His Trp Leu Leu Phe Glu Asp Trp Lys Val Phe Glu Ser Trp Met His His Trp Leu Leu Phe Glu

180 185 190 180 185 190

Met Ser Arg His Ser Leu Glu Gln Lys Pro Thr Asp Ala Pro Pro Lys Met Ser Arg His Ser Leu Glu Gln Lys Pro Thr Asp Ala Pro Pro Lys

195 200 205 195 200 205

Glu Ser Leu Glu Leu Glu Asp Pro Ser Ser Gly Leu Gly Val Thr Lys Glu Ser Leu Glu Leu Glu Asp Pro Ser Ser Gly Leu Gly Val Thr Lys

210 215 220 210 215 220

Gln Asp Leu Gly Pro Val Pro Met Gln Asp Leu Gly Pro Val Pro Met

225 230 225 230

<210> 37<210> 37

<211> 215<211> 215

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 37<400> 37

Met Asp Asp Gln Arg Asp Leu Ile Ser Asn His Glu Gln Leu Pro Ile Met Asp Asp Gln Arg Asp Leu Ile Ser Asn His Glu Gln Leu Pro Ile

1 5 10 15 1 5 10 15

Leu Gly Asn Arg Pro Arg Glu Pro Glu Arg Cys Ser Arg Gly Ala Leu Leu Gly Asn Arg Pro Arg Glu Pro Glu Arg Cys Ser Arg Gly Ala Leu

20 25 30 20 25 30

Tyr Thr Gly Val Ser Val Leu Val Ala Leu Leu Leu Ala Gly Gln Ala Tyr Thr Gly Val Ser Val Leu Val Ala Leu Leu Leu Ala Gly Gln Ala

35 40 45 35 40 45

Thr Thr Ala Tyr Phe Leu Tyr Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys Leu Thr Thr Ala Tyr Phe Leu Tyr Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys Leu

50 55 60 50 55 60

Thr Ile Thr Ser Gln Asn Leu Gln Leu Glu Ser Leu Arg Met Lys Leu Thr Ile Thr Ser Gln Asn Leu Gln Leu Glu Ser Leu Arg Met Lys Leu

65 70 75 80 65 70 75 80

Pro Lys Ser Ala Lys Pro Val Ser Gln Met Arg Met Ala Thr Pro Leu Pro Lys Ser Ala Lys Pro Val Ser Gln Met Arg Met Ala Thr Pro Leu

85 90 95 85 90 95

Leu Met Arg Pro Met Ser Met Asp Asn Met Leu Leu Gly Pro Val Lys Leu Met Arg Pro Met Ser Met Asp Asn Met Leu Leu Gly Pro Val Lys

100 105 110 100 105 110

Asn Val Thr Lys Tyr Gly Asn Met Thr Gln Asp His Val Met His Leu Asn Val Thr Lys Tyr Gly Asn Met Thr Gln Asp His Val Met His Leu

115 120 125 115 120 125

Leu Thr Arg Ser Gly Pro Leu Glu Tyr Pro Gln Leu Lys Gly Thr Phe Leu Thr Arg Ser Gly Pro Leu Glu Tyr Pro Gln Leu Lys Gly Thr Phe

130 135 140 130 135 140

Pro Glu Asn Leu Lys His Leu Lys Asn Ser Met Asp Gly Val Asn Trp Pro Glu Asn Leu Lys His Leu Lys Asn Ser Met Asp Gly Val Asn Trp

145 150 155 160 145 150 155 160

Lys Ile Phe Glu Ser Trp Met Lys Gln Trp Leu Leu Phe Glu Met Ser Lys Ile Phe Glu Ser Trp Met Lys Gln Trp Leu Leu Phe Glu Met Ser

165 170 175 165 170 175

Lys Asn Ser Leu Glu Glu Lys Lys Pro Thr Glu Ala Pro Pro Lys Glu Lys Asn Ser Leu Glu Glu Lys Lys Pro Thr Glu Ala Pro Pro Lys Glu

180 185 190 180 185 190

Pro Leu Asp Met Glu Asp Leu Ser Ser Gly Leu Gly Val Thr Arg Gln Pro Leu Asp Met Glu Asp Leu Ser Ser Gly Leu Gly Val Thr Arg Gln

195 200 205 195 200 205

Glu Leu Gly Gln Val Thr Leu Glu Leu Gly Gln Val Thr Leu

210 215 210 215

<210> 38<210> 38

<211> 281<211> 281

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 38<400> 38

Met Ala Asp Ser Ala Glu Asp Ala Pro Met Ala Arg Gly Ser Leu Ala Met Ala Asp Ser Ala Glu Asp Ala Pro Met Ala Arg Gly Ser Leu Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Gly Ser Asp Glu Ala Leu Ile Leu Pro Ala Gly Pro Thr Gly Gly Ser Gly Ser Asp Glu Ala Leu Ile Leu Pro Ala Gly Pro Thr Gly Gly Ser

20 25 30 20 25 30

Asn Ser Arg Ala Leu Lys Val Ala Gly Leu Thr Thr Leu Thr Cys Leu Asn Ser Arg Ala Leu Lys Val Ala Gly Leu Thr Thr Leu Thr Cys Leu

35 40 45 35 40 45

Leu Leu Ala Ser Gln Val Phe Thr Ala Tyr Met Val Phe Gly Gln Lys Leu Leu Ala Ser Gln Val Phe Thr Ala Tyr Met Val Phe Gly Gln Lys

50 55 60 50 55 60

Glu Gln Ile His Thr Leu Gln Lys Asn Ser Glu Arg Met Ser Lys Gln Glu Gln Ile His Thr Leu Gln Lys Asn Ser Glu Arg Met Ser Lys Gln

65 70 75 80 65 70 75 80

Leu Thr Arg Ser Ser Gln Ala Val Ala Pro Met Lys Met His Met Pro Leu Thr Arg Ser Ser Gln Ala Val Ala Pro Met Lys Met His Met Pro

85 90 95 85 90 95

Met Asn Ser Leu Pro Leu Leu Met Asp Phe Thr Pro Asn Glu Asp Ser Met Asn Ser Leu Pro Leu Leu Met Asp Phe Thr Pro Asn Glu Asp Ser

100 105 110 100 105 110

Lys Thr Pro Leu Thr Lys Leu Gln Asp Thr Ala Val Val Ser Val Glu Lys Thr Pro Leu Thr Lys Leu Gln Asp Thr Ala Val Val Ser Val Glu

115 120 125 115 120 125

Lys Gln Leu Lys Asp Leu Met Gln Asp Ser Gln Leu Pro Gln Phe Asn Lys Gln Leu Lys Asp Leu Met Gln Asp Ser Gln Leu Pro Gln Phe Asn

130 135 140 130 135 140

Glu Thr Phe Leu Ala Asn Leu Gln Gly Leu Lys Gln Gln Met Asn Glu Glu Thr Phe Leu Ala Asn Leu Gln Gly Leu Lys Gln Gln Met Asn Glu

145 150 155 160 145 150 155 160

Ser Glu Trp Lys Ser Phe Glu Ser Trp Met Arg Tyr Trp Leu Ile Phe Ser Glu Trp Lys Ser Phe Glu Ser Trp Met Arg Tyr Trp Leu Ile Phe

165 170 175 165 170 175

Gln Met Ala Gln Gln Lys Pro Val Pro Pro Thr Ala Asp Pro Ala Ser Gln Met Ala Gln Gln Lys Pro Val Pro Pro Thr Ala Asp Pro Ala Ser

180 185 190 180 185 190

Leu Ile Lys Thr Lys Cys Gln Met Glu Ser Ala Pro Gly Val Ser Lys Leu Ile Lys Thr Lys Cys Gln Met Glu Ser Ala Pro Gly Val Ser Lys

195 200 205 195 200 205

Ile Gly Ser Tyr Lys Pro Gln Cys Asp Glu Gln Gly Arg Tyr Lys Pro Ile Gly Ser Tyr Lys Pro Gln Cys Asp Glu Gln Gly Arg Tyr Lys Pro

210 215 220 210 215 220

Met Gln Cys Trp His Ala Thr Gly Phe Cys Trp Cys Val Asp Glu Thr Met Gln Cys Trp His Ala Thr Gly Phe Cys Trp Cys Val Asp Glu Thr

225 230 235 240 225 230 235 240

Gly Ala Val Ile Glu Gly Thr Thr Met Arg Gly Arg Pro Asp Cys Gln Gly Ala Val Ile Glu Gly Thr Thr Met Arg Gly Arg Pro Asp Cys Gln

245 250 255 245 250 255

Arg Arg Ala Leu Ala Pro Arg Arg Met Ala Phe Ala Pro Ser Leu Met Arg Arg Ala Leu Ala Pro Arg Arg Met Ala Phe Ala Pro Ser Leu Met

260 265 270 260 265 270

Gln Lys Thr Ile Ser Ile Asp Asp Gln Gln Lys Thr Ile Ser Ile Asp Asp Gln

275 280 275 280

<210> 39<210> 39

<211> 27<211> 27

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 39<400> 39

Gly Gln Lys Glu Gln Ile His Thr Leu Gln Lys Asn Ser Glu Arg Met Gly Gln Lys Glu Gln Ile His Thr Leu Gln Lys Asn Ser Glu Arg Met

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Lys Gln Leu Thr Arg Ser Ser Gln Ala Val Ser Lys Gln Leu Thr Arg Ser Ser Gln Ala Val

20 25 20 25

<210> 40<210> 40

<211> 16<211> 16

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 40<400> 40

Gln Ile His Thr Leu Gln Lys Asn Ser Glu Arg Met Ser Lys Gln Leu Gln Ile His Thr Leu Gln Lys Asn Ser Glu Arg Met Ser Lys Gln Leu

1 5 10 15 1 5 10 15

<210> 41<210> 41

<211> 11<211> 11

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Influenza virus<213> Influenza virus

<400> 41<400> 41

Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser

1 5 10 1 5 10

<210> 42<210> 42

<211> 29<211> 29

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 42<400> 42

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Gln Glu Ile His Ala Arg Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Gln Glu Ile His Ala Arg

20 25 20 25

<210> 43<210> 43

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 43<400> 43

Leu Leu Pro Phe Tyr Pro Pro Asp Glu Ala Leu Glu Ile Gly Leu Glu Leu Leu Pro Phe Tyr Pro Pro Asp Glu Ala Leu Glu Ile Gly Leu Glu

1 5 10 15 1 5 10 15

Leu Asn Ser Ser Ala Leu Pro Pro Thr Leu Asn Ser Ser Ala Leu Pro Pro Thr

20 25 20 25

<210> 44<210> 44

<211> 25<211> 25

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 44<400> 44

His Ile His Arg Ala Gly Gly Leu Phe Val Ala Asp Ala Ile Gln Val His Ile His Arg Ala Gly Gly Leu Phe Val Ala Asp Ala Ile Gln Val

1 5 10 15 1 5 10 15

Gly Phe Gly Arg Ile Gly Lys His Phe Gly Phe Gly Arg Ile Gly Lys His Phe

20 25 20 25

<---<---

Claims (63)

1. Полипептид, пригодный для применения в предупреждении или лечении пролиферативного заболевания у субъекта, содержащий от 25 до 100 разных опухолеспецифических неоантигенов и по меньшей мере одну аминокислотную последовательность T-клеточного усилителя,1. A polypeptide suitable for use in the prevention or treatment of a proliferative disease in a subject, containing from 25 to 100 different tumor-specific neoantigens and at least one amino acid sequence of a T-cell enhancer, причем неоантигены представляют собой антигены, отсутствующие в зародышевых клетках человека, но которые встречаются в раковых клетках человека и независимо друг от друга имеют длину от 8 до 50 аминокислот,moreover, neoantigens are antigens that are absent in human germ cells, but which are found in human cancer cells and independently of each other have a length of 8 to 50 amino acids, причем аминокислотная последовательность T-клеточного усилителя представляет собой инвариантную цепь или лидерную последовательность тканевого активатора плазминогена (TPA), и wherein the amino acid sequence of the T-cell enhancer is an invariant chain or leader sequence of tissue plasminogen activator (TPA), and причем аминокислотная последовательность T-клеточного усилителя помещена со стороны N-конца в пределах полипептида, и wherein the amino acid sequence of the T-cell enhancer is placed at the N-terminal side within the polypeptide, and причем инвариантная цепь выбрана из группы, состоящей из:wherein the invariant chain is selected from the group consisting of: (a) инвариантной цепи человека в соответствии с SEQ ID NO: 36, инвариантной цепи мыши в соответствии с SEQ ID NO: 37 и инвариантной цепи рыбы-мандаринки в соответствии с SEQ ID NO: 38;(a) a human invariant chain according to SEQ ID NO: 36, a mouse invariant chain according to SEQ ID NO: 37, and a mandarin fish invariant chain according to SEQ ID NO: 38; (b) иммуностимулирующего фрагмента инвариантной цепи в соответствии с (a);(b) an immunostimulatory fragment of the invariant chain according to (a); и/илиand/or (c) иммуностимулирующего варианта (a) или (b),(c) an immunostimulatory variant of (a) or (b), причем вариант характеризуется по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с инвариантной цепью в соответствии с (a) или ее фрагментом в соответствии с (b).wherein the variant has at least 90% sequence identity with the invariant strand according to (a) or a fragment thereof according to (b). 2. Полипептид по п.1, в котором неоантигены непосредственно связаны друг с другом.2. The polypeptide of claim 1, wherein the neoantigens are directly linked to each other. 3. Полипептид по п.1, в котором линкерные последовательности включены между каждым неоантигеном или между группами неоантигенов.3. The polypeptide of claim 1, wherein linker sequences are included between each neoantigen or between groups of neoantigens. 4. Полипептид по любому из пп. 1-3, содержащий по меньшей мере 31 опухолеспецифический неоантиген.4. The polypeptide according to any one of paragraphs. 1-3 containing at least 31 tumor-specific neoantigens. 5. Полипептид по любому из пп. 1-4, где каждый опухолеспецифический неоантиген независимо друг от друга имеет длину от 15 до 35, более предпочтительно 25 аминокислот.5. The polypeptide according to any one of paragraphs. 1-4, wherein each tumor-specific neoantigen is independently 15 to 35, more preferably 25 amino acids in length. 6. Полипептид по любому из пп. 1-5, где каждый опухолеспецифический неоантиген независимо выбран из группы, состоящей из 6. The polypeptide according to any one of paragraphs. 1-5, where each tumor-specific neoantigen is independently selected from the group consisting of мутантного по одной аминокислоте пептида,one amino acid mutant peptide, пептида, образующегося в результате сдвига рамки считывания, peptide resulting from a frameshift, пептида, образующегося в результате мутации сквозного прочитывания, и a peptide resulting from a pass-through mutation, and мутантного по сайту сплайсинга пептида.mutant at the splicing site of the peptide. 7. Полипептид по любому из пп. 1-6, где по меньшей мере 4 из опухолеспецифических неоантигенов вызывают T-клеточный ответ у пациента.7. The polypeptide according to any one of paragraphs. 1-6, wherein at least 4 of the tumor-specific neoantigens elicit a T cell response in the patient. 8. Полипептид по п. 1, где TPA представляет собой удлиненную лидерную последовательность TPA с аминокислотной последовательностью в соответствии с SEQ ID NO: 42 и предпочтительно присутствует на N-конце полипептида.8. The polypeptide of claim 1, wherein TPA is an extended TPA leader with an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 42 and is preferably present at the N-terminus of the polypeptide. 9. Вектор, пригодный для применения в предупреждении или лечении пролиферативного заболевания у субъекта, содержащий нуклеиновую кислоту, функционально связанную с последовательностью контроля экспрессии, причем указанная нуклеиновая кислота кодирует полипептид по любому из пп. 1-8.9. A vector suitable for use in the prevention or treatment of a proliferative disease in a subject, comprising a nucleic acid operably linked to an expression control sequence, said nucleic acid encoding a polypeptide according to any one of paragraphs. 1-8. 10. Композиция, пригодная для применения в предупреждении или лечении пролиферативного заболевания у субъекта, содержащая 10. A composition suitable for use in the prevention or treatment of a proliferative disease in a subject, comprising эффективное количество вакцины, содержащей полипептид по любому из пп. 1-8, или вектор по п. 9 или коллекцию векторов экспрессии по п. 9, причем каждый вектор экспрессии выбран из группы, состоящей из плазмиды; космиды; РНК; РНК, составленной с адъювантом; РНК, составленной в липосомальные частицы; самоамплифицирующейся РНК (SAM); SAM, составленной с адъювантом; SAM, составленной в липосомальные частицы; вирусного вектора; предпочтительно вектора на основе альфавируса, вектора на основе вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEE), вектора на основе вируса Синдбис (SIN), вирусного вектора на основе вируса леса Семлики (SFV), вектора на основе цитомегаловируса (CMV) обезьяны или человека, вектора на основе вируса лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), вектора на основе ретровируса или лентивируса, предпочтительно компетентного или некомпетентного по репликации вектора на основе аденовируса, полученного от представителей гоминид, предпочтительно полученного от шимпанзе, или бонобо, или гориллы, вектора на основе поксвируса, вектора на основе вируса осповакцины или вектора на основе модифицированного вируса осповакцины Анкара (MVA) иan effective amount of a vaccine containing a polypeptide according to any one of paragraphs. 1-8, or a vector according to p. 9 or a collection of expression vectors according to p. 9, and each expression vector is selected from the group consisting of a plasmid; cosmids; RNA; RNA formulated with an adjuvant; RNA compiled into liposomal particles; self-amplifying RNA (SAM); SAM formulated with an adjuvant; SAM formulated into liposomal particles; viral vector; preferably an alphavirus vector, a Venezuelan equine encephalitis virus (VEE) vector, a Sindbis virus (SIN) vector, a Semliki Forest Virus (SFV) vector, a simian or human cytomegalovirus (CMV) vector, a lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV), a retrovirus or lentivirus vector, preferably a replication-competent or replication-incompetent adenovirus vector, derived from hominids, preferably derived from a chimpanzee or bonobo or gorilla, a poxvirus vector, a vector vaccinia virus or modified vaccinia Ankara (MVA) vector and по меньшей мере один модулятор молекулы, являющейся контрольной точкой, или иммуномодулятор, или нуклеиновую кислоту, кодирующую модулятор или иммуномодулятор, или вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую модулятор или иммуномодулятор. at least one modulator of a control point molecule, or an immunomodulator, or a nucleic acid encoding a modulator or immunomodulator, or a vector containing a nucleic acid encoding a modulator or immunomodulator. 11. Композиция по п. 10, где модулятор молекулы, являющейся контрольной точкой, выбран из группы, состоящей из:11. The composition of claim 10, wherein the modulator of the checkpoint molecule is selected from the group consisting of: (a) агониста члена суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNF), предпочтительно CD27, CD40, OX40, GITR или CD137; и/или(a) a tumor necrosis factor (TNF) receptor superfamily member agonist, preferably CD27, CD40, OX40, GITR, or CD137; and/or (b) антагониста PD-1, PD-L1, CD274, A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, TIM-3 или VISTA, или антагониста члена суперсемейства B7-CD28, предпочтительно CD28 или ICOS, или антагониста их лиганда; и/или (b) a PD-1, PD-L1, CD274, A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, TIM-3, or VISTA antagonist, or a B7-CD28 superfamily member antagonist, preferably CD28 or ICOS, or their ligand antagonist; and/or где иммуномодулятор представляет собой фактор роста Т-клеток, такой как IL-2, IL-12, IL-15.where the immunomodulator is a T cell growth factor such as IL-2, IL-12, IL-15. 12. Композиция по п. 10 или 11, где введение модулятора молекулы, являющейся контрольной точкой, начинается до начала введения вакцины, или где введение ингибитора контрольной точки начинается после начала введения вакцины, или где введение ингибитора контрольной точки начинается одновременно с началом введения вакцины, причем предпочтительно схема вакцинации представляет собой гетерологичную схему прайм-буст с использованием двух разных вирусных векторов.12. The composition according to claim 10 or 11, where the administration of the checkpoint molecule modulator begins before the start of the vaccine, or where the administration of the checkpoint inhibitor begins after the start of the vaccine, or where the administration of the checkpoint inhibitor begins simultaneously with the start of the vaccine, wherein preferably the vaccination schedule is a heterologous prime-boost schedule using two different viral vectors. 13. Композиция по любому из пп. 10-12, где субъект подвержен риску развития или страдает от:13. The composition according to any one of paragraphs. 10-12, where the subject is at risk of developing or suffering from: (a) злокачественных новообразований губы, ротовой полости и глотки; и/или(a) malignant neoplasms of the lip, oral cavity and pharynx; and/or (b) злокачественных новообразований органов пищеварения; и/или(b) malignant neoplasms of the digestive organs; and/or (c) злокачественных новообразований респираторных органов и органов грудной полости; и/или(c) malignant neoplasms of the respiratory and thoracic organs; and/or (d) злокачественных новообразований кости и суставного хряща; и/или(d) malignant neoplasms of bone and articular cartilage; and/or (e) меланомы и других злокачественных новообразований кожи; и/или(e) melanoma and other malignant neoplasms of the skin; and/or (f) злокачественных новообразований мезотелиальной и мягкой ткани; и/или(f) malignant neoplasms of mesothelial and soft tissue; and/or (g) злокачественного новообразования молочной железы; и/или(g) breast cancer; and/or (h) злокачественных новообразований женских половых органов; и/или(h) malignant neoplasms of the female genital organs; and/or (i) злокачественных новообразований мужских половых органов; и/или(i) malignant neoplasms of the male genital organs; and/or (j) злокачественных новообразований мочевыводящих путей; и/или(j) malignant neoplasms of the urinary tract; and/or (k) злокачественных новообразований глаза, головного мозга и других частей центральной нервной системы; и/или(k) malignant neoplasms of the eye, brain and other parts of the central nervous system; and/or (l) злокачественных новообразований щитовидной железы и других желез внутренней секреции; и/или(l) malignant neoplasms of the thyroid and other endocrine glands; and/or (m) злокачественных новообразований лимфоидной, кроветворной и связанных с ними тканей.(m) malignant neoplasms of the lymphoid, hematopoietic and related tissues. 14. Композиция по любому из пп. 10-13, где у субъекта наблюдается опухоль в соответствии с классификацией TNM по меньшей мере на стадии T1 с любой из стадий N и M и/или опухоль, которая характеризуется наличием очага по меньшей мере приблизительно 3 мм в диаметре.14. The composition according to any one of paragraphs. 10-13 wherein the subject has a tumor according to the TNM classification of at least a T1 stage with any of stages N and M and/or a tumor characterized by a lesion at least about 3 mm in diameter. 15. Набор для вакцинации, содержащий в отдельной упаковке:15. Vaccination kit containing in a separate package: (i) вакцину, содержащую (i) a vaccine containing полипептид по любому из пп. 1-8, пригодный для применения в предупреждении или лечении пролиферативного заболевания у субъекта, содержащий по меньшей мере 25 разных опухолеспецифических неоантигенов и по меньшей мере одну аминокислотную последовательность T-клеточного усилителя,a polypeptide according to any one of paragraphs. 1-8, suitable for use in the prevention or treatment of a proliferative disease in a subject, containing at least 25 different tumor-specific neoantigens and at least one amino acid sequence of a T-cell enhancer, причем неоантигены представляют собой антигены, отсутствующие в зародышевых клетках человека, но которые встречается в раковых клетках человека и независимо друг от друга имеют длину от 8 до 50 аминокислот, причем аминокислотная последовательность T-клеточного усилителя представляет собой инвариантную цепь или лидерную последовательность тканевого активатора плазминогена (TPA), и причем инвариантная цепь выбрана из группы, состоящей из:moreover, neoantigens are antigens that are absent in human germ cells, but which are found in human cancer cells and independently of each other have a length of 8 to 50 amino acids, and the amino acid sequence of the T-cell enhancer is an invariant chain or leader sequence of tissue plasminogen activator ( TPA), and moreover, the invariant circuit is selected from the group consisting of: (a) инвариантной цепи человека в соответствии с SEQ ID NO: 36, инвариантной цепи мыши в соответствии с SEQ ID NO: 37 и инвариантной цепи рыбы-мандаринки в соответствии с SEQ ID NO: 38;(a) a human invariant chain according to SEQ ID NO: 36, a mouse invariant chain according to SEQ ID NO: 37, and a mandarin fish invariant chain according to SEQ ID NO: 38; (b) иммуностимулирующего фрагмента инвариантной цепи в соответствии с (a);(b) an immunostimulatory fragment of the invariant chain according to (a); и/илиand/or (c) иммуностимулирующего варианта (a) или (b), причем вариант характеризуется по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с инвариантной цепью в соответствии с (a) или ее фрагментом в соответствии с (b);(c) an immunostimulatory variant of (a) or (b), wherein the variant has at least 90% sequence identity with an invariant chain according to (a) or a fragment thereof according to (b); или вектор по п. 9 или коллекцию векторов экспрессии по п. 9, причем каждый вектор экспрессии выбран из группы, состоящей из плазмиды; космиды; РНК; РНК, составленной с адъювантом; РНК, составленной в липосомальные частицы; самоамплифицирующейся РНК (SAM); SAM, составленной с адъювантом; SAM, составленной в липосомальные частицы; вирусного вектора; предпочтительно вектора на основе альфавируса, вектора на основе вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEE), вектора на основе вируса Синдбис (SIN), вирусного вектора на основе вируса леса Семлики (SFV), вектора на основе цитомегаловируса (CMV) обезьяны или человека, вектора на основе вируса лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), вектора на основе ретровируса или лентивируса, предпочтительно компетентного или некомпетентного по репликации вектора на основе аденовируса, полученного от представителей гоминид, предпочтительно полученного от шимпанзе, или бонобо, или гориллы, вектора на основе поксвируса, вектора на основе вируса осповакцины или вектора на основе модифицированного вируса осповакцины Анкара (MVA); иor a vector according to claim 9 or a collection of expression vectors according to claim 9, each expression vector selected from the group consisting of a plasmid; cosmids; RNA; RNA formulated with an adjuvant; RNA compiled into liposomal particles; self-amplifying RNA (SAM); SAM formulated with an adjuvant; SAM formulated into liposomal particles; viral vector; preferably an alphavirus vector, a Venezuelan equine encephalitis virus (VEE) vector, a Sindbis virus (SIN) vector, a Semliki Forest Virus (SFV) vector, a simian or human cytomegalovirus (CMV) vector, a lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV), a retrovirus or lentivirus vector, preferably a replication-competent or replication-incompetent adenovirus vector, derived from hominids, preferably derived from a chimpanzee or bonobo or gorilla, a poxvirus vector, a vector vaccinia virus or modified vaccinia Ankara (MVA) vector; and (ii) по меньшей мере один модулятор молекулы, являющейся контрольной точкой, иммуномодулятор, или нуклеиновую кислоту, кодирующую модулятор или иммуномодулятор, или вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую модулятор или иммуномодулятор.(ii) at least one modulator of a checkpoint molecule, an immunomodulator, or a nucleic acid encoding a modulator or immunomodulator, or a vector containing a nucleic acid encoding a modulator or immunomodulator. 16. Фармацевтическая комбинация, пригодная для применения в предупреждении или лечении пролиферативного заболевания у субъекта, содержащая:16. A pharmaceutical combination suitable for use in the prevention or treatment of a proliferative disease in a subject, comprising: (a) полипептид по любому из пп. 1-8,(a) a polypeptide according to any one of paragraphs. 1-8, (b) модулятор молекулы, являющейся контрольной точкой, иммуномодулятор или нуклеиновую кислоту, кодирующую модулятор или иммуномодулятор.(b) a modulator of a checkpoint molecule, an immunomodulator, or a nucleic acid encoding a modulator or immunomodulator. 17. Фармацевтическая комбинация по п.16, где модулятор молекулы, являющейся контрольной точки выбран из группы, состоящей из:17. The pharmaceutical combination of claim 16, wherein the control point molecule modulator is selected from the group consisting of: (a) агониста члена суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNF), предпочтительно CD27, CD40, OX40, GITR или CD137; и/или(a) a tumor necrosis factor (TNF) receptor superfamily member agonist, preferably CD27, CD40, OX40, GITR, or CD137; and/or (b) антагониста PD-1, PD-L1, CD274, A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, TIM-3 или VISTA, или антагониста члена суперсемейства B7-CD28, предпочтительно CD28 или ICOS, или антагониста их лиганда; и/или(b) a PD-1, PD-L1, CD274, A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, TIM-3, or VISTA antagonist, or a B7-CD28 superfamily member antagonist, preferably CD28 or ICOS, or their ligand antagonist; and/or где иммуномодулятор представляет собой фактор роста Т-клеток, такой как IL-2, IL-12, IL-15.where the immunomodulator is a T cell growth factor such as IL-2, IL-12, IL-15. 18. Фармацевтическая комбинация п. 16 или п.17, где модулятор молекулы, являющейся контрольной точкой представляет собой антитело к PD1.18. The pharmaceutical combination of claim 16 or claim 17, wherein the modulator of the control point molecule is an anti-PD1 antibody.

Images