RU2781829C2

RU2781829C2 - Polynucleotide and method for control of insect infestation

Info

Publication number: RU2781829C2
Application number: RU2020143244A
Authority: RU
Inventors: Айхун ЧЖАН; Дэжун ДИН; Цин ТАО; Сяоцзяо ЛИ
Original assignee: Бэйцзин Дабэйнун Байотекнолоджи Ко., Лтд.
Priority date: 2018-05-31
Filing date: 2019-05-07
Publication date: 2022-10-18

Abstract

FIELD: biochemistry.

SUBSTANCE: invention relates to the field of biochemistry, in particular to isolated polynucleotide for control of infestation of coleoptera insect pests. An expression cassette, a recombinant expression vector, and a composition containing the specified polynucleotide are also disclosed. The use of the specified polynucleotide, a method for control of infestation of coleoptera insect pests, and a method for increasing plant resistance to Monolepta hieroglyphica, using the specified polynucleotide, a method for obtainment of a plant resistant to Monolepta hieroglyphica, using the specified polynucleotide, are disclosed.

EFFECT: invention allows for effective control of infestation of coleoptera insect pests.

28 cl, 1 dwg, 5 tbl, 12 ex

Description

Область техникиTechnical field

Настоящее изобретение относится к области защиты растений, особенно, защиты сельскохозяйственных культур. В частности, настоящее изобретение относится к полинуклеотиду и способу борьбы с нашествием насекомых, и, особенно, к способу борьбы с нашествием Monolepta hieroglyphica (Motschulsky) за счет уменьшения или прекращения экспрессии целевой последовательности в Monolepta hieroglyphica с использованием технологии РНКи.The present invention relates to the field of plant protection, especially crop protection. In particular, the present invention relates to a polynucleotide and method for controlling insect infestation, and especially a method for controlling Monolepta hieroglyphica (Motschulsky) infestation by reducing or stopping the expression of a target sequence in Monolepta hieroglyphica using RNAi technology.

Уровень техникиState of the art

Сельскохозяйственные культуры, как правило, являются мишенью для насекомых. За последние несколько десятилетий были достигнуты некоторые существенные успехи в разработке более эффективных способов и композиций против нападения насекомых на сельскохозяйственные культуры. Например, для борьбы с вредными насекомыми применяют химические инсектициды, микробные инсектициды и способы генетической инженерии.Agricultural crops are generally targeted by insects. Over the past few decades, there have been some significant advances in the development of more effective methods and compositions against insect attack on crops. For example, chemical insecticides, microbial insecticides, and genetic engineering methods are used to control harmful insects.

Химические инсектициды являются относительно эффективным средством борьбы с нашествием вредных насекомых. Однако использование химических пестицидов также имеет много недостатков. Прежде всего, химические инсектициды неселективны. Люди намереваются использовать химические инсектициды для борьбы с насекомыми, которые вредны для многих сельскохозяйственных культур и других растений. Однако из-за отсутствия селективности химические инсектициды также вредны для нецелевых организмов, таких как дождевые черви. Кроме того, после периода применения химических пестицидов они, как правило, делают поля бесплодными. Химические пестициды постоянно существуют в окружающей среде и, как правило, медленно метаболизируются. Этот медленный метаболизм вызывает накопление остатков химических пестицидов в сельскохозяйственных культурах и окружающей среде, так что они могут накапливаться в пищевой цепи, особенно в пищевой цепи высших хищников. Накопление этих химических пестицидов может вызывать заболевания у более совершенных видов, такие как злокачественные опухоли у человека. Monolepta hieroglyphica переживает зиму в виде яйца в почве, и личинки также живут в почве после вылупления в июне следующего года. Однако из-за широкомасштабной популяризации в последние годы возвращения соломы на поле, сложность использования химических пестицидов для борьбы с Monolepta hieroglyphica увеличивается с каждым годом. Тем более, что с конца июля до начала августа взрослая особь Monolepta hieroglyphica выкапывается из земли и в это время вырастает кукуруза, и применять химические пестициды для борьбы с вредителями становится еще сложнее.Chemical insecticides are relatively effective in controlling pest infestations. However, the use of chemical pesticides also has many disadvantages. First of all, chemical insecticides are not selective. People intend to use chemical insecticides to control insects that are harmful to many crops and other plants. However, due to their lack of selectivity, chemical insecticides are also harmful to non-target organisms such as earthworms. Also, after a period of application of chemical pesticides, they tend to render fields barren. Chemical pesticides are constantly present in the environment and are usually slowly metabolized. This slow metabolism causes chemical pesticide residues to build up in crops and the environment so that they can accumulate in the food chain, especially in the food chain of top predators. Accumulation of these chemical pesticides can cause diseases in more advanced species, such as malignant tumors in humans. Monolepta hieroglyphica survives the winter as an egg in the soil, and the larvae also live in the soil after hatching in June of the following year. However, due to the large-scale promotion in recent years of the return of straw to the field, the difficulty of using chemical pesticides to control Monolepta hieroglyphica is increasing every year. Moreover, from late July to early August, an adult Monolepta hieroglyphica digs out of the ground and corn grows at this time, and it becomes even more difficult to apply chemical pesticides to control pests.

Микробные инсектициды, особенно инсектициды, полученные из штаммов Bacillus thuringiensis (Bt) в качестве заменителей химических инсектицидов, играют важную роль в сельскохозяйственном производстве и проявляют определенную инсектицидную активность против насекомых, таких как Lepidoptera, Diptera и Coleoptera. Однако микробные инсектициды предъявляют относительно высокие требования к среде применения. Если среда не подходит для роста этих микроорганизмов, требуется повторное применение в производстве, а в некоторых случаях даже повторное нанесение не может достичь цели борьбы с вредителями, что значительно увеличивает производственные затраты.Microbial insecticides, especially insecticides derived from strains of Bacillus thuringiensis (Bt) as substitutes for chemical insecticides, play an important role in agricultural production and exhibit certain insecticidal activity against insects such as Lepidoptera, Diptera and Coleoptera. However, microbial insecticides place relatively high demands on the application environment. If the medium is not suitable for the growth of these microorganisms, re-application in production is required, and in some cases, even re-application cannot achieve the goal of pest control, which greatly increases production costs.

Один или несколько генов, кодирующих инсектицидный белок Bt, переносят в растения посредством генетической инженерии, и можно получать некоторые трансгенные растения с повышенной устойчивостью к вредителям. Например, растения кукурузы и хлопка, которые были генетически сконструированы для производства токсинов Cry, широко используются в сельскохозяйственном производстве в США и предоставляют фермерам альтернативу традиционным методам борьбы с вредителями. Однако разработанные в настоящее время генетически модифицированные сельскохозяйственные культуры, содержащие токсин Cry, можно использовать только для борьбы с относительно узким кругом жесткокрылых вредителей, таких как кукурузный корневой жук и колорадский жук. Для одного из основных вредителей кукурузы, Monolepta hieroglyphica, нет сообщений о применении токсина Cry для профилактики и лечения.One or more genes encoding the insecticidal Bt protein are transferred into plants through genetic engineering, and some transgenic plants with increased resistance to pests can be obtained. For example, corn and cotton plants that have been genetically engineered to produce Cry toxins are widely used in U.S. agricultural production and provide farmers with an alternative to traditional pest control methods. However, currently developed genetically modified crops containing Cry toxin can only be used to control a relatively narrow range of beetle pests such as corn root beetle and Colorado potato beetle. For one of the main pests of corn, Monolepta hieroglyphica, there are no reports of the use of Cry toxin for prevention and treatment.

Ввиду ограничений вышеупомянутых способов существует острая необходимость в способе борьбы с атаками насекомых или способе искоренения атак насекомых в процессе производства сельскохозяйственных культур, особенно борьбы с нашествием Monolepta hieroglyphica, способе, который является экологически чистым (т.е. селективным, экологически чистым и биоразлагаемым) и может часто использоваться в системе управления устойчивостью к вредителям.In view of the limitations of the above methods, there is a strong need for a method for controlling insect attacks or a method for eradicating insect attacks in a crop production process, especially for controlling Monolepta hieroglyphica infestation, a method that is environmentally friendly (i.e., selective, environmentally friendly, and biodegradable) and can often be used in a pest resistance management system.

РНК-интерференцию или РНКи можно использовать для подавления экспрессии гена в клетке или целом организме на основании его последовательности. Нацеленного вмешательства в экспрессию гена-мишени можно достичь путем специфического отбора мишени и эффективного подавления мРНК. Хотя использование технологии РНКи для борьбы с вредителями известно в данной области, ввиду большого разнообразия насекомых эта технология не только оказывает очень разное воздействие на разных насекомых, но также ключевым фактором для использования этой технологии в качестве меры по борьбе с вредителями является выбор наиболее подходящих генов-мишеней, то есть тех генов, потеря функции которых приводит к серьезному разрушению основных биологических процессов и/или гибели организмов. Таким образом, в настоящем изобретении используется негативная регуляция конкретных генов-мишеней у вредителей как средство борьбы с нашествием насекомых, особенно, с целью борьбы с нашествием насекомых у растенияй.RNA interference or RNAi can be used to suppress the expression of a gene in a cell or whole organism based on its sequence. Targeted interference with target gene expression can be achieved by specific target selection and effective mRNA silencing. Although the use of RNAi technology for pest control is known in the art, due to the wide variety of insects, this technology not only has very different effects on different insects, but also a key factor for using this technology as a pest control measure is the choice of the most appropriate genes - targets, i.e. those genes, the loss of function of which leads to a serious destruction of the main biological processes and/or death of organisms. Thus, the present invention uses the down-regulation of specific target genes in pests as a means of controlling insect infestation, especially for the purpose of controlling insect infestation in plants.

СущностьEssence

Задачей настоящего изобретения является создание полинуклеотида и способа борьбы с вторжением насекомого, то есть использование технологии РНКи для подавления экспрессии гена-мишени: ослабление способности насекомых выживать, расти, размножаться, колонизироваться в определенной окружающей среде и/или вторгаться в хозяина, и, таким образом, борьба с нашествием насекомых и вызываемыми ими повреждениями.The object of the present invention is to provide a polynucleotide and a method for combating insect invasion, that is, using RNAi technology to suppress the expression of a target gene: weakening the ability of insects to survive, grow, reproduce, colonize in a certain environment and/or invade a host, and thus , the fight against the invasion of insects and the damage they cause.

Для решения вышеуказанной задачи настоящее изобретение относится к изолированному полинуклеотиду, где полинуклеотид выбран из:To solve the above problem, the present invention relates to an isolated polynucleotide, where the polynucleotide is selected from:

(а) полинуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1; или(a) the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1; or

(b) полинуклеотидной последовательности, по меньшей мере, из 15 последовательных нуклеотидов из SEQ ID NO: 1, где, когда жесткокрылое насекомое-вредитель поглощает двухцепочечную РНК, содержащую, по меньшей мере, одну цепь, комплементарную полинуклеотидной последовательности, рост жесткокрылых насекомых-вредителей ингибируется; или(b) a polynucleotide sequence of at least 15 consecutive nucleotides of SEQ ID NO: 1, wherein when the beetle pest ingests a double-stranded RNA containing at least one strand complementary to the polynucleotide sequence, the beetle pest grows inhibited; or

(c) полинуклеотидной последовательности, по меньшей мере, из 17 последовательных нуклеотидов из SEQ ID NO: 1, где, когда жесткокрылое насекомое-вредитель поглощает двухцепочечную РНК, содержащую, по меньшей мере, одну цепь, комплементарную полинуклеотидной последовательности, рост жесткокрылых насекомых-вредителей ингибируется; или(c) a polynucleotide sequence of at least 17 consecutive nucleotides from SEQ ID NO: 1, wherein when the beetle pest ingests a double-stranded RNA containing at least one strand complementary to the polynucleotide sequence, the beetle pest grows inhibited; or

(d) полинуклеотидной последовательности, по меньшей мере, из 19 последовательных нуклеотидов из SEQ ID NO: 1, где, когда жесткокрылое насекомое-вредитель поглощает двухцепочечную РНК, содержащую, по меньшей мере, одну цепь, комплементарную полинуклеотидной последовательности, рост жесткокрылых насекомых-вредителей ингибируется; или(d) a polynucleotide sequence of at least 19 consecutive nucleotides of SEQ ID NO: 1, wherein when the beetle pest ingests a double-stranded RNA containing at least one strand complementary to the polynucleotide sequence, the beetle pest grows inhibited; or

(e) полинуклеотидной последовательности, по меньшей мере, из 21 последовательного нуклеотида из SEQ ID NO: 1, где, когда жесткокрылое насекомое-вредитель поглощает двухцепочечную РНК, содержащую, по меньшей мере, одну цепь, комплементарную полинуклеотидной последовательности, рост жесткокрылых насекомых-вредителей ингибируется; или(e) a polynucleotide sequence of at least 21 consecutive nucleotides from SEQ ID NO: 1, wherein when the beetle pest ingests a double-stranded RNA containing at least one strand complementary to the polynucleotide sequence, the beetle pest grows inhibited; or

(f) любой из полинуклеотидных последовательностей, показанных в SEQ ID NO: от 3 до 20; или(f) any of the polynucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 3 to 20; or

(g) полинуклеотидной последовательности, которая гибридизуется с полинуклеотидной последовательностью или комплементарна полинуклеотидной последовательности, как определено в любом из пунктов от (а) до (f), при жестких условиях.(g) a polynucleotide sequence that hybridizes to, or is complementary to, a polynucleotide sequence as defined in any of (a) to (f), under stringent conditions.

Дополнительно, полинуклеотид также включает последовательность, комплементарную полинуклеотидной последовательности.Additionally, the polynucleotide also includes a sequence that is complementary to the polynucleotide sequence.

Дополнительно, полинуклеотид также содержит спейсерную последовательность.Additionally, the polynucleotide also contains a spacer sequence.

Предпочтительно, спейсерная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 23.Preferably, the spacer sequence is SEQ ID NO: 23.

В вариантах осуществления, основанных на вышеуказанных технических решениях, жесткокрылым насекомым-вредителем является Monolepta hieroglyphica.In embodiments based on the above technical solutions, the beetle pest is Monolepta hieroglyphica.

Для достижения вышеупомянутой задачи настоящее изобретение также относится к экспрессионной кассете, содержащей полинуклеотидную последовательность под контролем функционально связанной регуляторной последовательности.To achieve the above object, the present invention also relates to an expression cassette containing a polynucleotide sequence under the control of an operably linked regulatory sequence.

Для достижения вышеупомянутой задачи настоящее изобретение также относится к рекомбинантному вектору, содержащему полинуклеотидную последовательность или экспрессионную кассету.To achieve the above object, the present invention also relates to a recombinant vector containing a polynucleotide sequence or an expression cassette.

Для достижения вышеупомянутой задачи настоящее изобретение также относится к использованию полинуклеотида для вмешательства в экспрессию целевой последовательности жесткокрылых насекомых-вредителей или для ингибирования роста жесткокрылых насекомых-вредителей.In order to achieve the above object, the present invention also relates to the use of a polynucleotide to interfere with the expression of a target sequence of a beetle pest or to inhibit the growth of a beetle pest.

Для достижения вышеупомянутой задачи настоящее изобретение также относится к интерферирующей рибонуклеиновой кислоте, которая после того, как интерферирующая рибонуклеиновая кислота попадает в организм жесткокрылого насекомого-вредителя, подавляет экспрессию, по меньшей мере, одного гена-мишени у жесткокрылого насекомого-вредителя, где интерферирующая рибонуклеиновая кислота содержит, по меньшей мере, один элемент сайленсинга, где элемент сайленсинга представляет собой двухцепочечную область РНК, содержащую соединенные комплементарные цепи, где одна цепь содержит нуклеотидную последовательность или состоит из нуклеотидной последовательности, которая, по меньшей мере, частично комплементарна целевой последовательности в гене-мишени, и ген-мишень содержит полинуклеотидную последовательность.In order to achieve the above object, the present invention also relates to an interfering ribonucleic acid which, after the interfering ribonucleic acid enters the body of a hemipteran pest, suppresses the expression of at least one target gene in the hemipteran pest, wherein the interfering ribonucleic acid contains at least one silencing element, where the silencing element is a double-stranded region of RNA containing connected complementary strands, where one strand contains a nucleotide sequence or consists of a nucleotide sequence that is at least partially complementary to the target sequence in the target gene , and the target gene contains a polynucleotide sequence.

Дополнительно, элемент сайленсинга содержит нуклеотидную последовательность или состоит из нуклеотидной последовательности, по меньшей мере, из 15 последовательных нуклеотидов, которая, по меньшей мере, частично комплементарны целевому фрагменту в целевой последовательности.Additionally, the silencing element contains or consists of a nucleotide sequence of at least 15 consecutive nucleotides that is at least partially complementary to the target fragment in the target sequence.

Дополнительно, элемент сайленсинга содержит нуклеотидную последовательность или состоит из нуклеотидной последовательности, по меньшей мере, из 17 последовательных нуклеотидов, которая, по меньшей мере, частично комплементарны целевому фрагменту в целевой последовательности.Additionally, the silencing element contains a nucleotide sequence or consists of a nucleotide sequence of at least 17 consecutive nucleotides, which is at least partially complementary to the target fragment in the target sequence.

Дополнительно, элемент сайленсинга содержит нуклеотидную последовательность или состоит из нуклеотидной последовательности, по меньшей мере, из 19 последовательных нуклеотидов, которая, по меньшей мере, частично комплементарны целевому фрагменту в целевой последовательности.Additionally, the silencing element contains or consists of a nucleotide sequence of at least 19 consecutive nucleotides that is at least partially complementary to the target fragment in the target sequence.

Дополнительно, элемент сайленсинга содержит нуклеотидную последовательность или состоит из нуклеотидной последовательности, по меньшей мере, из 21 последовательного нуклеотида, которая, по меньшей мере, частично комплементарна целевому фрагменту в целевой последовательности.Additionally, the silencing element contains or consists of a nucleotide sequence of at least 21 consecutive nucleotides that is at least partially complementary to the target fragment in the target sequence.

Альтернативно, интерферирующая рибонуклеиновая кислота содержит, по меньшей мере, два элемента сайленсинга, и каждый из элементов сайленсинга содержит нуклеотидную последовательность или состоит из нуклеотидной последовательности, которая, по меньшей мере, частично комплементарна целевой последовательности в гене-мишени.Alternatively, the interfering ribonucleic acid contains at least two silencing elements, and each of the silencing elements contains or consists of a nucleotide sequence that is at least partially complementary to the target sequence in the target gene.

Дополнительно, каждый из элементов сайленсинга содержит или включает разные нуклеотидные последовательности, комплементарные другой целевой последовательности.Additionally, each of the silencing elements contains or includes different nucleotide sequences that are complementary to another target sequence.

Дополнительно, другая целевая последовательность происходит исключительно из гена-мишени или происходит из дополнительного гена-мишени, отличного от гена-мишени.Additionally, the other target sequence is derived exclusively from the target gene or is derived from an additional target gene other than the target gene.

Дополнительный ген-мишень, отличный от гена-мишени, получен от того же жесткокрылого насекомого-вредителя или от другого жесткокрылого насекомого-вредителя.An additional target gene other than the target gene is derived from the same beetle pest or from another beetle pest.

Предпочтительно, жесткокрылое насекомое-вредитель представляет собой Monolepta hieroglyphica.Preferably, the beetle pest is Monolepta hieroglyphica.

В вариантах осуществления, основанных на вышеуказанных технических решениях, интерферирующая рибонуклеиновая кислота дополнительно содержит спейсерную последовательность.In embodiments based on the above technical solutions, the interfering ribonucleic acid further comprises a spacer sequence.

В частности, спейсерная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 23.In particular, the spacer sequence is SEQ ID NO: 23.

Для достижения вышеупомянутой задачи настоящее изобретение также относится к композиции для борьбы с нашествием жесткокрылых насекомых-вредителей, содержащей, по меньшей мере, одну из интерферирующих рибонуклеиновых кислот и, по меньшей мере, один подходящий носитель, эксципиент или разбавитель.To achieve the above object, the present invention also relates to a composition for combating the invasion of beetle pests, containing at least one of the interfering ribonucleic acids and at least one suitable carrier, excipient or diluent.

Дополнительно композиция содержит клетку-хозяина, которая экспрессирует или способна экспрессировать интерферирующую рибонуклеиновую кислоту. В частности, клетка-хозяин представляет собой бактериальную клетку.Additionally, the composition contains a host cell that expresses or is capable of expressing an interfering ribonucleic acid. In particular, the host cell is a bacterial cell.

Кроме того, композиция представляет собой твердое вещество, жидкость или гель. В частности, композиция представляет собой инсектицидный спрей.In addition, the composition is a solid, liquid or gel. In particular, the composition is an insecticidal spray.

Необязательно, композиция содержит по меньшей мере один инсектицид, в котором инсектицид представляет собой химический инсектицид, специфический белок клубней картофеля, инсектицидный белок Bacillus thuringiensis, инсектицидный белок Xenorhabdus ehlersii, инсектицидный белок Photorhabdus luminescens, инсектицидный белок Bacillus laterosporus или инсектицидный белок Bacillus sphaericus.Optionally, the composition comprises at least one insecticide, wherein the insecticide is a chemical insecticide, a potato tuber specific protein, a Bacillus thuringiensis insecticidal protein, a Xenorhabdus ehlersii insecticidal protein, a Photorhabdus luminescens insecticidal protein, a Bacillus laterosporus insecticidal protein, or a Bacillus sphaericus insecticidal protein.

Для решения вышеупомянутой задачи настоящее изобретение также относится к применению композиции для борьбы с нашествием жесткокрылых насекомых-вредителей для профилактики нашествия и/или борьбы с нашествием жесткокрылых насекомых-вредителей.In order to achieve the above object, the present invention also relates to the use of a beetle pest control composition for preventing and/or controlling beetle pest infestation.

Для достижения вышеупомянутой задачи настоящее изобретение также относится к способу борьбы с нашествием жесткокрылых насекомых-вредителей, включающему контактирование жесткокрылых насекомых-вредителей с эффективным количеством, по меньшей мере, одной из последовательностей интерферирующей рибонуклеиновой кислоты.To achieve the above object, the present invention also relates to a method for controlling the invasion of hemipteran pests, comprising contacting the hemipteran pests with an effective amount of at least one of the interfering ribonucleic acid sequences.

Для достижения вышеупомянутой задачи настоящее изобретение также относится к способу повышения устойчивости растений к жесткокрылому насекомому-вредителю, включающему введение в растение полинуклеотида или экспрессионной кассеты, или рекомбинантного вектора или конструкции, содержащей интерферирующую рибонуклеиновую кислоту.In order to achieve the above object, the present invention also relates to a method for increasing the resistance of plants to a hemipteran insect pest, comprising introducing into a plant a polynucleotide or an expression cassette, or a recombinant vector or construct containing an interfering ribonucleic acid.

Для достижения вышеупомянутой задачи настоящее изобретение также относится к способу получения растения для борьбы с жесткокрылым насекомым-вредителем, включающему введение в растение полинуклеотида или экспрессионной кассеты, или рекомбинантного вектора или конструкции, содержащей интерферирующую рибонуклеиновую кислоту.To achieve the above object, the present invention also relates to a method for producing a plant for combating a hemipteran insect pest, comprising introducing into the plant a polynucleotide or an expression cassette, or a recombinant vector or construct containing an interfering ribonucleic acid.

Для достижения вышеупомянутой задачи настоящее изобретение также относится к способу защиты растения от повреждения, вызываемого жесткокрылым насекомым-вредителем, включающим введение в растение полинуклеотида или экспрессионной кассеты, или рекомбинантного вектора или конструкции, содержащей интерферирующую рибонуклеиновую кислоту, где растение после введения подавляет рост жесткокрылых насекомых-вредителей после того, как его поедают жесткокрылые насекомые-вредители.To achieve the above object, the present invention also relates to a method for protecting a plant from damage caused by a hemipteran insect pest, comprising introducing into the plant a polynucleotide or an expression cassette, or a recombinant vector or construct containing an interfering ribonucleic acid, where the plant, after administration, inhibits the growth of hemipteran insects - pests after being eaten by beetle pests.

В вариантах осуществления, основанных на вышеуказанных технических решениях, растение представляет собой сою, пшеницу, ячмень, кукурузу, табак, рис, рапс, хлопок или подсолнечник.In embodiments based on the above technical solutions, the plant is soybean, wheat, barley, corn, tobacco, rice, rapeseed, cotton, or sunflower.

Настоящее изобретение включает способ регулирования или ингибирования экспрессии одного или нескольких генов-мишеней у жесткокрылого насекомого-вредителя, способ, включающий введение части или целой стабилизированной двухцепочечной РНК (дцРНК) или ее модифицированной формы (например, последовательности малой интерферирующей РНК) в клетку или внеклеточную среду беспозвоночного вредного насекомого. В организме насекомого дцРНК или миРНК проникает в клетки, подавляя экспрессию, по меньшей мере, одного или нескольких генов-мишеней, и это ингибирование снижает способность насекомого выживать, расти, воспроизводиться и вторгаться в хозяина.The present invention includes a method for regulating or inhibiting the expression of one or more target genes in a hemipteran insect pest, a method comprising introducing a portion or whole of a stabilized double-stranded RNA (dsRNA) or a modified form thereof (e.g., a small interfering RNA sequence) into a cell or extracellular environment invertebrate pest. In the insect body, dsRNA or siRNA enters cells to repress the expression of at least one or more target genes, and this inhibition reduces the insect's ability to survive, grow, reproduce and invade the host.

Подробное описаниеDetailed description

Далее в настоящем документе будут подробно описаны различные аспекты настоящего изобретения.Hereinafter, various aspects of the present invention will be described in detail.

Monolepta hieroglyphica и повреждение сельскохозяйственных культурMonolepta hieroglyphica and crop damage

Monolepta hieroglyphica (Motschulsky) по настоящему изобретению представляет собой голометаболическое насекомое из отрядов Galeruca, Chrysomelidae, Coleoptera. Его яйцо, личинки и куколки живут в почве, а взрослое насекомое вылетает из почвы после вылупления. Это однолетнее насекомое зимует в виде диапаузных яиц. Диапаузные яйца начинают вылупляться в мае каждого года, а личинки можно наблюдать в полевой почве с мая до начала июля; куколки можно увидеть в поле с конца июня до середины июля; взрослые особи появляются время от времени и летают на кукурузные, соевые и другие поля, чтобы нанести ущерб; пиковый период вылупления происходит с конца июля до начала августа; приблизительно через 15 суток после вылупления, может начаться отложение яиц, и период размножения длится приблизительно 1 месяц.Monolepta hieroglyphica (Motschulsky) according to the present invention is a holometabolic insect from the orders Galeruca, Chrysomelidae, Coleoptera. Its egg, larvae and pupae live in the soil, and the adult flies out of the soil after hatching. This annual insect hibernates as diapause eggs. Diapause eggs begin to hatch in May of each year, and larvae can be observed in the field soil from May to early July; pupae can be seen in the field from late June to mid-July; adults appear from time to time and fly into corn, soybean and other fields to cause damage; the peak hatching period occurs from late July to early August; about 15 days after hatching, egg laying can begin and the breeding season lasts about 1 month.

Личинки Monolepta hieroglyphica, в основном, питаются корнями сельскохозяйственных культур в полевых условиях, и повреждение личинками не отражается на надземных частях; ежегодно в середине июля взрослые особи повреждают листья кукурузы и сои; большое количество взрослых особей в основном повреждает волокна кукурузы с конца июля до начала августа, в результате чего кукурузные волокна откусываются, что серьезно влияет на опыление и колосья остаются заостренными и веретеновидными, что приводит к сокращению производства кукурузы; затем Monolepta hieroglyphica перемещается на соевые поля, чтобы питаться листьями сои, или перемещается на окружающие овощные поля, чтобы нанести вред овощам. С 2009 по 2016 год в Китае площадь кукурузы, пораженной Monolepta hieroglyphica, увеличилась с 16 миллионов му до почти 40 миллионов му, а площадь распространения увеличилась вдвое. Зона поражения также распространилась с северо-запада и других мест на основные районы производства кукурузы, такие как северо-восток и север Китая.The larvae of Monolepta hieroglyphica mainly feed on crop roots in the field, and larval damage does not affect aboveground parts; annually in mid-July, adults damage the leaves of corn and soybeans; a large number of adults mainly damage the corn fibers from late July to early August, causing the corn fibers to be bitten off, which seriously affects pollination and the ears remain pointed and fusiform, resulting in a reduction in corn production; then Monolepta hieroglyphica moves to soybean fields to feed on soybean leaves, or moves to surrounding vegetable fields to harm vegetables. From 2009 to 2016, in China, the area of maize affected by Monolepta hieroglyphica increased from 16 million mu to almost 40 million mu, and the area of distribution doubled. The affected area has also spread from the northwest and elsewhere to major corn production areas such as the northeast and north of China.

В то же время, постоянное совершенствование мер по возврату соломы, постоянное обогащение полевого гумуса и увеличение поверхностного покрова почвы затрудняют внесение пестицидов в почву, и профилактика, и борьба с личинками Monolepta hieroglyphica становятся более серьезными и трудными. Иными словами, естественная защита, обеспечиваемая личинкам Monolepta hieroglyphica возвращаемой соломой, может значительно увеличить коэффициент выживаемости личинок Monolepta hieroglyphica, тем самым вызывая увеличение плотности популяции Monolepta hieroglyphica. Взрослые особи Monolepta hieroglyphica представляют собой хорошо летающих и прыгучих насекомых, и начинают повреждать кукурузу после вылупления с середины до конца июля, когда кукуруза вступает в период опушения. В это время кукуруза становится выше, сложность применения пестицидов возрастает, и легко спровоцировать трагедию, что пестициды случайно повредят опрыскивателям. В то же время их неселективное инсектицидное действие может вызывать повреждение сельскохозяйственных культур и нецелевых органических веществ. Кроме того, химические пестициды могут иметь кумулятивное воздействие на организм человека и становиться мутагенами или канцерогенами. Таким образом, необходимо иметь точный, экологически чистый и простой в использовании способ, позволяющий фермерам бороться с ущербом, наносимым Monolepta hieroglyphica. За счет генетической модификации сельскохозяйственная культура оказывает определенное воздействие против насекомых в течение всего периода роста и обеспечивает защиту всего растения и всего периода роста.At the same time, the constant improvement of straw return measures, the constant enrichment of field humus and the increase in the surface soil cover make it difficult to apply pesticides to the soil, and the prevention and control of Monolepta hieroglyphica larvae become more serious and difficult. In other words, the natural protection provided to Monolepta hieroglyphica larvae by returned straw can significantly increase the survival rate of Monolepta hieroglyphica larvae, thereby causing an increase in Monolepta hieroglyphica population density. Adult Monolepta hieroglyphica are well-flying and jumping insects, and begin to damage corn after hatching from mid to late July, when the corn enters its hairy period. At this time, the corn is getting taller, the difficulty of applying pesticides is increasing, and it is easy to provoke a tragedy that pesticides accidentally damage the sprayers. At the same time, their non-selective insecticidal action can cause damage to crops and non-target organic matter. In addition, chemical pesticides can have a cumulative effect on the human body and become mutagens or carcinogens. Thus, it is necessary to have an accurate, environmentally friendly and easy-to-use way to enable farmers to combat the damage caused by Monolepta hieroglyphica. Through genetic modification, the crop has a certain effect against insects during the entire growth period and provides protection for the entire plant and the entire growth period.

Исходя из вышеупомянутых проблем, одним из лучших решений является применение способа генетически модифицированных РНКи, способных контролировать Monolepta hieroglyphica и обеспечивать профилактику и борьбу в течение полного периода роста и всего растения кукурузы, сои и других сельскохозяйственных культур.Based on the above problems, one of the best solutions is to use the method of genetically modified RNAi, able to control Monolepta hieroglyphica and provide prevention and control throughout the entire growth period and the whole plant of corn, soybean and other crops.

РНКи и полинуклеотидная последовательностьRNAi and polynucleotide sequence

Настоящее изобретение в основном относится к технологии РНКи. В настоящем изобретении «РНК-интерференция (РНКи)» относится к тому, что некоторые РНК могут эффективно и специфично блокировать экспрессию конкретных генов in vivo, способствовать деградации мРНК и побуждать клетки проявлять фенотип делеции конкретного гена. Ее еще называют вмешательством РНК или интерференцией. РНК-интерференция представляет собой высокоспецифичный механизм подавления генов на уровне мРНК.The present invention mainly relates to RNAi technology. In the present invention, "RNA interference (RNAi)" refers to the fact that certain RNAs can effectively and specifically block the expression of specific genes in vivo, promote mRNA degradation, and induce cells to exhibit a specific gene deletion phenotype. It is also called RNA interference or interference. RNA interference is a highly specific mechanism for gene silencing at the mRNA level.

В настоящем изобретении, РНК-интерференцию или РНКи применяют для снижения экспрессии гена. РНКи представляет собой способ регуляции генов на основе последовательности, как правило, опосредованный двухцепочечной молекулой РНК (такой как миРНК). миРНК содержит смысловую цепь РНК, которая спаривается за счет комплементарного спаривания оснований с антисмысловой цепью РНК. Смысловая или «направляющая цепь» молекулы миРНК включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности, расположенной в транскрипте РНК гена-мишени. Таким образом, смысловая цепь миРНК может быть спарена с транскриптом РНК посредством спаривания оснований типа Уотсона-Крика и нацелена на РНК, чтобы разрушить в клетке комплекс, называемый РНКи-индуцированный комплекс сайленсинга или RISC.In the present invention, RNA interference or RNAi is used to reduce gene expression. RNAi is a sequence-based gene regulation method, typically mediated by a double-stranded RNA molecule (such as siRNA). The miRNA contains an RNA sense strand that pairs by complementary base pairing with an antisense RNA strand. The sense or "guide strand" of an siRNA molecule includes a nucleotide sequence that is complementary to the nucleotide sequence located in the RNA transcript of the target gene. Thus, the siRNA sense strand can be paired with the RNA transcript via Watson-Crick type base pairing and targeted to the RNA to disrupt a complex in the cell called the RNAi-Induced Silencing Complex or RISC.

Настоящее изобретение относится к изолированному и очищенному полинуклеотиду, последовательность которого показана в SEQ ID NO: 1. Настоящее изобретение также относится к любой РНК, включая дцРНК, экспрессируемой из полинуклеотида. Настоящее изобретение относится к стабилизированной двухцепочечной молекуле РНК для ингибирования экспрессии целевой последовательности жесткокрылых вредителей. При экспрессии в виде дцРНК и предоставлении вредителю, фрагмент можно определить как фрагмент, который заставляет вредителя погибать, препятствует питанию, блокирует или останавливает.Фрагмент может, например, содержать по меньшей мере, приблизительно 19, 21, 23, 25, 40, 60, 80, 100, 125 или более последовательных нуклеотидов, или приблизительно от 19 до приблизительно 100 или более нуклеотидов из SEQ ID NO: 1 или ее комплементарной последовательности, такой как SEQ ID NO: с 3 до 20. Особенно подходящей является последовательность дцРНК, содержащая приблизительно от 19 до 300 нуклеотидов, гомологичных целевой последовательности вредителя.The present invention relates to an isolated and purified polynucleotide, the sequence of which is shown in SEQ ID NO: 1. The present invention also relates to any RNA, including dsRNA, expressed from a polynucleotide. The present invention relates to a stabilized double-stranded RNA molecule for inhibiting the expression of a target sequence in a beetle pest. When expressed as dsRNA and presented to a pest, a fragment can be defined as a fragment that causes the pest to die, interfere with feeding, block or stop. The fragment may, for example, contain at least about 19, 21, 23, 25, 40, 80, 100, 125 or more consecutive nucleotides, or from about 19 to about 100 or more nucleotides from SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence, such as SEQ ID NO: 3 to 20. Particularly suitable is a dsRNA sequence containing about from 19 to 300 nucleotides homologous to the target pest sequence.

Стабилизированная двухцепочечная РНК содержит, по меньшей мере, две кодирующих последовательности, которые расположены в смысловом и антисмысловом направлениях относительно, по меньшей мере, одного промотора, где нуклеотидные последовательности, содержащие смысловую цепь и антисмысловую цепь, связаны через спейсерную последовательность, по меньшей мере, длиной приблизительно от 5 до 1000 нуклеотидов, где смысловая цепь и антисмысловая цепь могут иметь разную длину, и где, по меньшей мере, одна из двух кодирующих последовательностей имеет идентичность последовательности, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 98% или 100% с нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 1.The stabilized double-stranded RNA contains at least two coding sequences that are located in the sense and antisense directions relative to at least one promoter, where the nucleotide sequences containing the sense strand and the antisense strand are linked via a spacer sequence of at least a length about 5 to 1000 nucleotides, where the sense strand and antisense strand may be of different lengths, and where at least one of the two coding sequences has a sequence identity of at least 80%, at least 90%, at least at least 95%, at least 98% or 100% with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.

Термин «борьба с насекомыми» или «борьба с вредителями» или «борьба с насекомыми-вредителями» в настоящем изобретении относится к любому эффекту, который может ограничить ущерб, причиняемый насекомым, и действовать на насекомое, включая в качестве неограничивающих примеров уничтожение насекомых, замедление развития насекомого, изменение размножения или роста насекомого таким образом, что насекомое наносит меньший ущерб растению, уменьшение количества потомства, производимого насекомым, производство меньшего количества нормальных насекомых, создание насекомого, более уязвимого для хищника, или предотвращение того, чтобы насекомое поедало растение.The term "insect control" or "pest control" or "insect pest control" in the present invention refers to any effect that can limit the damage caused by insects and act on an insect, including, but not limited to, killing insects, retarding development of an insect, altering the reproduction or growth of an insect so that the insect causes less damage to the plant, reducing the number of offspring produced by the insect, producing fewer normal insects, making the insect more vulnerable to a predator, or preventing the insect from eating the plant.

«Ген-мишень», описанный в настоящем изобретении, представляет собой любую последовательность, которая предназначена для подавления у насекомых. Нашествие насекомых контролируется подавлением генов-мишеней, таким как разрушение важного биологического процесса у насекомых. Таким образом, предпочтительный ген-мишень в качестве неограничивающих примеров включает ген, который играет ключевую роль в регулировании кормления, выживания, роста, развития, размножения, нашествия и заражения. Когда экспрессия генов-мишеней подавляется или ингибируется, по меньшей мере, 30% насекомых погибают; или, по меньшей мере, у 30% насекомых предотвращен/задерживается/затруднен/отстает/блокируется рост, или, по меньшей мере, у 30% насекомых не происходит размножения, или, по меньшей мере, у 30% насекомых предотвращается переход через жизненный цикл; или снижен ущерб, причиненный насекомыми, и/или способность насекомых заражать или вторгаться в окружающую среду, на поверхности и/или растения или сельскохозяйственную культуру; или, по меньшей мере, 30% насекомых перестают поедать свои естественные пищевые ресурсы (такие как растения и растительные продукты). Эти гены-мишени можно экспрессировать во всех или в части клеток насекомых. Кроме того, эти гены-мишени можно экспрессировать только на определенной стадии жизненного цикла насекомых, такой как стадия взрослого или личиночная стадия, или стадия яйца.A "target gene" described in the present invention is any sequence that is intended to be suppressed in insects. Insect invasion is controlled by suppression of target genes, such as disruption of an important biological process in insects. Thus, a preferred target gene includes, but is not limited to, a gene that plays a key role in the regulation of feeding, survival, growth, development, reproduction, invasion, and infection. When expression of target genes is suppressed or inhibited, at least 30% of insects die; or at least 30% of insects are prevented/delayed/hindered/lagged/blocked in growth, or at least 30% of insects do not reproduce, or at least 30% of insects are prevented from passing through the life cycle ; or reduced damage caused by insects and/or the ability of insects to infect or invade the environment, surfaces and/or plants or crops; or at least 30% of insects stop eating their natural food resources (such as plants and plant products). These target genes can be expressed in all or part of the insect cells. In addition, these target genes can only be expressed at a certain stage in the insect life cycle, such as the adult or larval or egg stage.

В настоящем изобретении термин «вредитель» относится, предпочтительно, к насекомому, которое вызывает нашествие/нападение на растения/заражение растений, и принадлежит к Coleoptera, предпочтительно, Monolepta hieroglyphica. Термины «заражение», «нападение» и/или «нашествие» в настоящем изобретении в основном используются взаимозаменяемо.In the present invention, the term "pest" preferably refers to an insect that causes invasion/attack on plants/infection of plants and belongs to Coleoptera, preferably Monolepta hieroglyphica. The terms "infection", "attack" and/or "invasion" in the present invention are generally used interchangeably.

В настоящем изобретении "нуклеиновая кислота" относится к одно- или двухцепочечному полимеру из оснований дезоксирибонуклеиновой кислоты или рибонуклеиновой кислоты, которые читаются от 5'к 3'-концу. Необязательно, «нуклеиновая кислота» может также содержать неприродные или измененные основания, которые могут правильно считываться полимеразой без снижения экспрессии полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой. «Нуклеотидная последовательность» относится к смысловым и антисмысловым цепям нуклеиновой кислоты, которые существуют в виде отдельных однонитевых цепей или существуют в виде дуплекса. «Рибонуклеиновая кислота» (РНК) включает РНКи (РНК-интерференция), дцРНК (двухцепочечную РНК), миРНК (малую интерферирующую РНК), мРНК (матричную РНК), мкРНК (микроРНК), тРНК (транспортную РНК, которая несет или не несет соответствующую ацилированную аминокислоту), гибридную кДНК, геномную ДНК и ДНК-РНК. «Фрагмент нуклеиновой кислоты», «фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты» или более часто «фрагмент» будет пониматься специалистами в данной области как содержащий геномную последовательность, последовательность рибосомной РНК, последовательность транспортной РНК, последовательность матричной РНК, последовательность оперона и малую инженерно модифицированную нуклеотидную последовательность, где последовательность экспрессирует белок, полипептид или пептид или может быть модифицирована для экспрессии белка, полипептида или пептида.In the present invention, "nucleic acid" refers to a single- or double-stranded polymer of deoxyribonucleic acid or ribonucleic acid bases that read from the 5' to the 3' end. Optionally, the "nucleic acid" may also contain non-natural or altered bases that can be correctly read by the polymerase without reducing the expression of the polypeptide encoded by the nucleic acid. "Nucleotide sequence" refers to sense and antisense nucleic acid strands that exist as separate single strands or exist as a duplex. "Ribonucleic acid" (RNA) includes RNAi (RNA interference), dsRNA (double-stranded RNA), miRNA (small interfering RNA), mRNA (messenger RNA), miRNA (miRNA), tRNA (transfer RNA that carries or does not carry the corresponding acylated amino acid), hybrid cDNA, genomic DNA and DNA-RNA. "Nucleic acid fragment", "nucleic acid sequence fragment" or more commonly "fragment" will be understood by those skilled in the art as containing a genomic sequence, a ribosomal RNA sequence, a transfer RNA sequence, a messenger RNA sequence, an operon sequence, and a small engineered nucleotide sequence, where the sequence expresses a protein, polypeptide or peptide or can be modified to express a protein, polypeptide or peptide.

«Интерферирующая рибонуклеиновая кислота» по настоящему изобретению включает любой тип молекулы РНК, который может подавлять или «выключать» экспрессию гена-мишени, включая в качестве неограничивающих примеров смысловую РНК, антисмысловую РНК, миРНК, мкРНК, дцРНК, шпилечную РНК и т.д. Способы определения функциональных интерферирующих молекул РНК описаны и хорошо известны в данной области.The "interfering ribonucleic acid" of the present invention includes any type of RNA molecule that can repress or "turn off" the expression of a target gene, including but not limited to sense RNA, antisense RNA, siRNA, miRNA, dsRNA, hairpin RNA, etc. Methods for determining functional interfering RNA molecules have been described and are well known in the art.

Интерферирующая рибонуклеиновая кислота по настоящему изобретению может специфически подавлять экспрессию гена-мишени путем связывания с целевой последовательностью в гене-мишени. Связывание происходит из-за спаривания оснований между интерферирующей РНК и комплементарной областью целевой последовательности.The interfering ribonucleic acid of the present invention can specifically suppress the expression of a target gene by binding to a target sequence in the target gene. Binding is due to base pairing between the interfering RNA and the complementary region of the target sequence.

Кроме того, настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты или ее фрагментам, которые гибридизуются (особенно специфически гибридизуются) с полинуклеотидом по настоящему изобретению в «жестких условиях». Как известно специалистам в данной области, молекулы нуклеиновой кислоты или ее фрагменты могут специфически гибридизоваться с другими молекулами нуклеиновой кислоты в определенных условиях. В настоящем изобретении, если две молекулы нуклеиновой кислоты могут образовывать антипараллельную структуру двухцепочечной нуклеиновой кислоты, это указывает, что две молекулы нуклеиновой кислоты могут специфически гибридизоваться друг с другом. Если две молекулы нуклеиновой кислоты демонстрируют полную комплементарность, это указывает, что одна из молекул нуклеиновой кислоты является «комплементарной» другой молекуле нуклеиновой кислоты. В настоящем изобретении, когда каждый нуклеотид одной молекулы нуклеиновой кислоты комплементарен соответствующему нуклеотиду другой молекулы нуклеиновой кислоты, это указывает на то, что две молекулы нуклеиновой кислоты демонстрируют «полную комплементарность». Если две молекулы нуклеиновой кислоты могут гибридизироваться друг с другом с достаточной стабильностью, так что они могут отжигаться и связываться друг с другом, по меньшей мере, при общепринятых условиях с «низкой жесткостью», это указывает, что две молекулы нуклеиновой кислоты являются «минимально комплементарными». Точно так же, если две молекулы нуклеиновой кислоты могут гибридизоваться друг с другом с достаточной стабильностью, так что они могут отжигаться и связываться друг с другом при общепринятых условиях с «высокой жесткостью», это указывает, что две молекулы нуклеиновой кислоты имеют «комплементарность». Отклонение от полной комплементарности допустимо, при условии, что отклонение не полностью препятствует двум молекулам формировать двухцепочечную структуру. Для того чтобы молекула нуклеиновой кислоты действовала в качестве праймера или зонда, необходимо только убедиться, что она имеет достаточную комплементарность по последовательности, так что стабильная двухцепочечная структура может быть сформирована с используемым конкретным растворителем и солью. В настоящем изобретении по существу гомологичной последовательностью является молекула нуклеиновой кислоты, которая может специфически гибридизоваться с комплементарной цепью другой подходящей молекулы нуклеиновой кислоты в очень жестких условиях. Подходящие жесткие условия, способствующие гибридизации ДНК включают, например, обработку 6,0× хлоридом натрия/цитратом натрия (SSC) при приблизительно 45°C, промывание 2,0×SSC при 50°C, и эти условия хорошо известны специалистам в данной области. Например, концентрацию соли на этапе промывания можно выбирать приблизительно от 2,0× SSC, 50°C в условиях низкой жесткости до приблизительно 0,2× SSC, 50°C в условиях высокой жесткости. Кроме того, температурные условия на этапе промывания могут быть индуцированы от комнатной температуры приблизительно от 22°C в условиях низкой жесткости до приблизительно 65°C в очень жестких условиях. Температурные условия и концентрации соли могут изменяться или одна из них может оставаться неизменной, а другая переменная меняется. Предпочтительно, жесткие условия по настоящему изобретению могут заключаться в том, что специфическую гибридизацию с полинуклеотидом по настоящему изобретению проводят при 6× SSC, 0,5% растворе SDS при 65°C, а промывание проводят один раз с использованием каждого из 2× SSC, 0,1% SDS и 1× SSC и 0,1% SDS.In addition, the present invention relates to nucleic acid molecules or fragments thereof, which hybridize (especially specifically hybridize) with the polynucleotide of the present invention under "stringent conditions". As is known to those skilled in the art, nucleic acid molecules or fragments thereof can specifically hybridize with other nucleic acid molecules under certain conditions. In the present invention, if two nucleic acid molecules can form an antiparallel structure of a double-stranded nucleic acid, this indicates that the two nucleic acid molecules can specifically hybridize with each other. If two nucleic acid molecules show complete complementarity, this indicates that one of the nucleic acid molecules is "complementary" to the other nucleic acid molecule. In the present invention, when each nucleotide of one nucleic acid molecule is complementary to the corresponding nucleotide of another nucleic acid molecule, this indicates that the two nucleic acid molecules exhibit "full complementarity". If two nucleic acid molecules can hybridize with each other with sufficient stability such that they can anneal and bind to each other under at least conventional conditions with "low stringency", this indicates that the two nucleic acid molecules are "minimally complementary". ". Similarly, if two nucleic acid molecules can hybridize with each other with sufficient stability such that they can anneal and bind to each other under conventional conditions with "high stringency", this indicates that the two nucleic acid molecules have "complementarity". Deviation from complete complementarity is acceptable, provided that the deviation does not completely prevent the two molecules from forming a double-stranded structure. For a nucleic acid molecule to act as a primer or probe, it is only necessary to ensure that it has sufficient sequence complementarity so that a stable double-stranded structure can be formed with the particular solvent and salt used. In the present invention, a substantially homologous sequence is a nucleic acid molecule that can specifically hybridize to the complementary strand of another suitable nucleic acid molecule under very stringent conditions. Suitable stringent conditions to promote DNA hybridization include, for example, treatment with 6.0× sodium chloride/sodium citrate (SSC) at approximately 45°C, washing with 2.0×SSC at 50°C, and these conditions are well known to those skilled in the art. . For example, the salt concentration in the wash step can be selected from about 2.0×SSC, 50°C under low stringency conditions to about 0.2×SSC, 50°C under high stringency conditions. In addition, the temperature conditions in the washing step can be induced from room temperature from about 22° C. under low stringency conditions to about 65° C. under very harsh conditions. Temperature conditions and salt concentrations may change, or one of them may remain constant while the other variable changes. Preferably, the stringent conditions of the present invention may be that specific hybridization with a polynucleotide of the present invention is carried out at 6x SSC, 0.5% SDS solution at 65°C, and washing is carried out once using each of 2x SSC, 0.1% SDS and 1× SSC and 0.1% SDS.

Термин «элемент сайленсинга» относится к части или области интерферирующей рибонуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидные последовательности или состоит из нуклеотидных последовательностей, комплементарных или, по меньшей мере, частично комплементарных целевой последовательности в гене-мишени, и эта часть или область действует как активная часть интерферирующей рибонуклеиновой кислота, чтобы направлять негативную регуляцию экспрессии гена-мишени. Элемент сайленсинга включает интерферирующую рибонуклеиновую кислоту, которая содержит или состоит из 15 последовательных нуклеотидов, предпочтительно, по меньшей мере, 18 или 19 последовательных нуклеотидов, более предпочтительно, по меньшей мере, из 21 последовательного нуклеотида, даже более предпочтительно, по меньшей мере, из 22, 23, 24 или 25 последовательных нуклеотидов, которые комплементарны целевой последовательности в гене-мишени. В случае предпочтительной интерферирующей рибонуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, элемент сайленсинга может представлять собой двухцепочечную область, содержащую спаренную комплементарную цепь, где, по меньшей мере, одна цепь содержит интерферирующую рибонуклеиновую кислоту, которая содержит или включает нуклеотидные последовательности, комплементарные или, по меньшей мере, частично комплементарные целевой последовательности в гене-мишени. Двухцепочечная область имеет длину, по меньшей мере, приблизительно от 15 до приблизительно 25 пар оснований, или длину приблизительно от 25 до приблизительно 100 пар оснований, или даже длину 3000 пар оснований.The term "silencing element" refers to a portion or region of an interfering ribonucleic acid that contains or consists of nucleotide sequences that are complementary or at least partially complementary to a target sequence in a target gene, and that portion or region acts as an active part of the interfering ribonucleic acid to direct the down regulation of target gene expression. The silencing element includes an interfering ribonucleic acid that contains or consists of 15 consecutive nucleotides, preferably at least 18 or 19 consecutive nucleotides, more preferably at least 21 consecutive nucleotides, even more preferably at least 22 , 23, 24 or 25 consecutive nucleotides that are complementary to the target sequence in the target gene. In the case of a preferred interfering ribonucleic acid of the present invention, the silencing element may be a double-stranded region containing a paired complementary strand, where at least one strand contains an interfering ribonucleic acid that contains or includes nucleotide sequences that are complementary to or at least partially complementary to the target sequence in the target gene. The double-stranded region is at least about 15 to about 25 base pairs long, or about 25 to about 100 base pairs long, or even 3000 base pairs long.

В настоящем изобретении «экспрессия гена-мишени» относится к транскрипции и накоплению транскрипта РНК, кодируемого геном-мишенью, и/или трансляции мРНК в белок.In the present invention, "expression of a target gene" refers to the transcription and accumulation of an RNA transcript encoded by a target gene and/or translation of an mRNA into a protein.

Термин «негативная регуляция» относится к любому из известных в данной области способов для интерферирующей рибонуклеиновой кислоты для снижения уровня транскрипта первичной РНК, мРНК или белка, продуцируемого геном-мишенью. Негативная регуляция относится к ситуации, когда уровень РНК или белка, производимого геном, снижается, по меньшей мере, на 10%, предпочтительно, по меньшей мере, на 33%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 50%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, на 80%. В частности, негативная регуляция относится к ситуации, при которой уровень РНК или белка, продуцируемого геном в клетках насекомых, снижается, по меньшей мере, на 80%, предпочтительно, по меньшей мере, на 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 95% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, по меньшей мере, на 99%, по сравнению с насекомыми с общепринятыми способами борьбы (например, насекомыми, которые не подвергались воздействию интерферирующей рибонуклеиновой кислоты или подвергались воздействию контрольной интерферирующей рибонуклеиновой кислоты). Способы определения снижения уровня РНК или белка хорошо известны в данной области и включают гибридизацию раствора РНК, нозерн-гибридизацию, обратную транскрипцию (например, количественный анализ при помощи ОТ-ПЦР), анализ с помощью микропанели, связывание антител и твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), и Вестерн-блоттинг. В то же время негативная регуляция может также относиться к тому, что уровень РНК или белка снижается настолько, что вызывает детектируемое изменение фенотипа насекомых, такое как гибель клеток, задержку роста и т.д., по сравнению с насекомыми с общепринятыми способами борьбы. Таким образом, общепринятые способы в данной области можно использовать для измерения негативной регуляции посредством фенотипического анализа насекомых.The term "downregulation" refers to any of the methods known in the art for an interfering ribonucleic acid to reduce the level of a primary RNA transcript, mRNA, or protein produced by a target gene. Downregulation refers to a situation where the level of RNA or protein produced by a gene is reduced by at least 10%, preferably at least 33%, more preferably at least 50%, even more preferably, at least 80%. In particular, downregulation refers to a situation in which the level of RNA or protein produced by a gene in insect cells is reduced by at least 80%, preferably at least 90%, more preferably at least 95%, and most preferably at least 99%, compared to insects with conventional control methods (eg, insects that have not been exposed to interfering ribonucleic acid or have been exposed to control interfering ribonucleic acid). Methods for detecting RNA or protein reduction are well known in the art and include RNA solution hybridization, Northern hybridization, reverse transcription (e.g., RT-PCR quantitation), microarray analysis, antibody binding, and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) , and Western blotting. At the same time, down regulation can also refer to the fact that the level of RNA or protein is reduced enough to cause a detectable change in the phenotype of insects, such as cell death, growth stunting, etc., compared to insects with conventional methods of control. Thus, conventional methods in the art can be used to measure downregulation through phenotypic analysis of insects.

В настоящем изобретении «ингибирование экспрессии гена-мишени» относится к снижению или отсутствию (ниже детектируемого порога) уровня белкового продукта и/или мРНК гена-мишени. Специфичность относится к способности ингибировать ген-мишень, не затрагивая другие гены в клетке, и не оказывая никакого воздействия на какой-либо ген в клетке, которая производит молекулы дцРНК.As used herein, "inhibition of target gene expression" refers to a decrease or absence (below a detectable threshold) in the level of a protein product and/or mRNA of a target gene. Specificity refers to the ability to inhibit a target gene without affecting other genes in the cell and without affecting any gene in the cell that produces dsRNA molecules.

В настоящем изобретении «смысловая» РНК относится к транскрипту РНК соответствующей последовательности или фрагменту, который существует в форме мРНК и который может быть переведен в белок с помощью растительной клетки. В настоящем изобретении «антисмысловая» РНК относится к РНК, которая комплементарна всей или части мРНК, в норме производимой в растении. Комплементарность антисмысловой РНК может быть направлена на любую часть транскрипта конкретного гена, т.е. 5'-некодирующую последовательность, 3'-некодирующую последовательность, интрон или кодирующую последовательность. В настоящем изобретении «транскрипт РНК» относится к к продукту транскрипции последовательности ДНК, последовательно катализируемой РНК-полимеразой. Когда транскрипт РНК является полностью комплементарной копией последовательности ДНК, он называется первичным транскриптом, или он может быть РНК, полученной путем посттранскрипционнной обработки первичного транскрипта, и, таким образом, называется зрелой РНК.In the present invention, "sense" RNA refers to an RNA transcript of the corresponding sequence or fragment that exists in the form of mRNA and that can be translated into protein using a plant cell. As used herein, "antisense" RNA refers to RNA that is complementary to all or part of the mRNA normally produced in a plant. The complementarity of the antisense RNA can be directed to any part of the transcript of a particular gene, ie. 5' non-coding sequence, 3' non-coding sequence, intron, or coding sequence. In the present invention, "RNA transcript" refers to a transcription product of a DNA sequence sequentially catalyzed by an RNA polymerase. When an RNA transcript is a fully complementary copy of a DNA sequence, it is called a primary transcript, or it may be RNA obtained by post-transcriptional processing of the primary transcript, and thus is called mature RNA.

В настоящем изобретении молекулы дцРНК могут служить предшественниками активных молекул миРНК, и эти молекулы миРНК направляют транскрипты РНК в комплексы RISC для последующей деградации. Молекула дцРНК, присутствующая в организме или окружающей его среде, может быть поглощена организмом и обработана ферментом, называемым DICER, для получения молекулы миРНК. Альтернативно, молекулу дцРНК можно получать in vivo, то есть она транскрибируется из одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих дцРНК, которые существуют в клетке (например, бактериальной клетке или растительной клетке), и после поглощения более длинного предшественника дцРНК он обрабатывается DICER в клетке-хозяине или предпочтительно в клетке насекомого. дцРНК может быть образована из двух отдельных (смысловой и антисмысловой) цепей РНК, которые спариваются посредством комплементарного спаривания оснований. Альтернативно, дцРНК может быть одной цепью, которая может складываться сама по себе, образуя шпилечную РНК или структуру петли стебля. В случае одной цепи РНК, двухцепочечная область или «стебель» образована двумя областями или сегментами РНК, и эти области или сегменты по сути последовательности с инвертированным повтором друг друга и имеют достаточную комплементарность, чтобы позволить образование двухцепочечной области. В этой «стеблевой области» молекулы может быть один или несколько функциональных двухцепочечных элементов сайленсинга. Область инвертированных повторов, как правило, отделена областью или сегментом, называемым «петлевой» областью в РНК. Эта область может содержать любую нуклеотидную последовательность, которая придает достаточную гибкость, чтобы позволить самоспаривание между фланкирующими комплементарными областями РНК. В основном, область петли по сути одноцепочечная и действует как спейсер между последовательностями с инвертированными повторами.In the present invention, dsRNA molecules can serve as precursors to active siRNA molecules, and these siRNA molecules direct RNA transcripts to RISC complexes for subsequent degradation. A dsRNA molecule present in an organism or its environment can be taken up by the body and processed by an enzyme called DICER to produce an siRNA molecule. Alternatively, the dsRNA molecule can be produced in vivo, i.e., it is transcribed from one or more dsRNA-coding polynucleotides that exist in a cell (e.g., bacterial cell or plant cell) and, after uptake of the longer dsRNA precursor, it is processed by DICER in the host cell or preferably in an insect cell. dsRNA can be formed from two separate (sense and antisense) RNA strands that pair by complementary base pairing. Alternatively, the dsRNA can be a single strand that can fold by itself to form a hairpin RNA or stem loop structure. In the case of a single strand of RNA, a double-stranded region or "stalk" is formed by two regions or segments of RNA, and these regions or segments are essentially inverted repeat sequences of each other and have sufficient complementarity to allow the formation of a double-stranded region. In this "stem region" of the molecule, there may be one or more functional double-stranded silencing elements. The region of inverted repeats is typically separated by a region or segment called the "loop" region in RNA. This region may contain any nucleotide sequence that confers sufficient flexibility to allow self-pairing between flanking complementary RNA regions. Basically, the loop region is essentially single-stranded and acts as a spacer between inverted repeat sequences.

Интерферирующая рибонуклеиновая кислота по настоящему изобретению содержит, по меньшей мере, одну двухцепочечную область, которая, как правило, является элементом сайленсинга интерферирующей рибонуклеиновой кислоты. Он включает смысловую цепь РНК, спаренную путем комплементарного спаривания оснований с антисмысловой цепью РНК, где смысловая цепь молекулы дцРНК включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности, расположенной в транскрипте РНК гена-мишени. Элемент сайленсинга или, по меньшей мере, одна его цепь (когда элемент сайленсинга является двухцепочечным) может быть полностью или частично комплементарна целевой последовательности гена-мишени. «Полностью комплементарный» означает, что все основания нуклеотидной последовательности элемента сайленсинга комплементарны или «совпадают» с основаниями целевой последовательности. Термин «по меньшей мере, частично комплементарный» означает, что совпадают менее 100% оснований элемента сайленсинга и оснований целевой последовательности. Специалисты в данной области поймут, что для того, чтобы опосредовать негативную регуляцию экспрессии гена-мишени, элементу сайленсинга необходимо только, по меньшей мере, частично быть комплементарным целевой последовательности. Известно в данной области, что последовательность РНК со вставкой, делецией и несоответствием по отношению к гену-мишени все еще может быть эффективной в отношении РНКи. Предпочтительно, элемент сайленсинга и целевая последовательность гена-мишени имеют идентичность последовательности, по меньшей мере, 80% или 85%, предпочтительно, идентичность последовательности, по меньшей мере, 90% или 95%, или более предпочтительно, идентичность последовательности, по меньшей мере, 97% или 98%, и даже более предпочтительно, идентичность последовательности, по меньшей мере, 99%. Альтернативно, элемент сайленсинга может содержать 1, 2 или 3 несовпадения по всей длине из 24 частично комплементарных нуклеотидов по сравнению с целевой последовательностью. Специалистам в данной области хорошо известно, что степень комплементарности между элементом сайленсинга и целевой последовательностью варьируется в зависимости от вида насекомых, у которых должна контролироваться экспрессия генов-мишеней, подлежащих подавлению.The interfering ribonucleic acid of the present invention contains at least one double-stranded region, which, as a rule, is a silencing element of the interfering ribonucleic acid. It includes an RNA sense strand complementary base-paired to an antisense RNA strand, where the sense strand of the dsRNA molecule includes a nucleotide sequence that is complementary to a nucleotide sequence located in the target gene's RNA transcript. The silencing element, or at least one strand thereof (when the silencing element is double-stranded), may be fully or partially complementary to the target gene sequence. "Completely complementary" means that all bases of the nucleotide sequence of the silencing element are complementary or "match" the bases of the target sequence. The term "at least partially complementary" means that less than 100% of the bases of the silencing element and the bases of the target sequence match. Those skilled in the art will appreciate that, in order to mediate down regulation of target gene expression, the silencing element only needs to be at least partially complementary to the target sequence. It is known in the art that an RNA sequence with an insertion, deletion, and mismatch with respect to the target gene can still be effective against RNAi. Preferably, the silencing element and the target gene sequence have at least 80% or 85% sequence identity, preferably at least 90% or 95% sequence identity, or more preferably at least 97% or 98%, and even more preferably at least 99% sequence identity. Alternatively, the silencing element may contain 1, 2, or 3 mismatches over the entire length of the 24 partially complementary nucleotides compared to the target sequence. It is well known to those skilled in the art that the degree of complementarity between the silencing element and the target sequence varies depending on the species of insect in which the expression of the target genes to be suppressed is to be controlled.

Целевую последовательность в настоящем изобретении можно выбирать из любой подходящей области или нуклеотидной последовательности гена-мишени или его транскрипта РНК. Например, целевая последовательность может быть расположена внутри 5'UTR или 3'UTR гена-мишени или транскрипта РНК, или в области экзона или интрона гена.The target sequence in the present invention can be selected from any suitable region or nucleotide sequence of the target gene or RNA transcript thereof. For example, the target sequence may be located within the 5'UTR or 3'UTR of a target gene or RNA transcript, or within the exon or intron region of a gene.

Интерферирующая рибонуклеиновая кислота по настоящему изобретению может содержать один или несколько элементов сайленсинга, где каждый элемент сайленсинга содержит нуклеотидную последовательность или состоит из нуклеотидной последовательности, которая, по меньшей мере, частично комплементарна целевой последовательности в гене-мишени, и действует, чтобы подавлять экспрессию гена-мишени после поглощения насекомыми. Термин «множество» означает, по меньшей мере, два, по меньшей мере, три, по меньшей мере, четыре и т.д., и до, по меньшей мере, 10, 15, 20 или, по меньшей мере, 30. Интерферирующая рибонуклеиновая кислота содержит множество копий одного элемента сайленсинга, то есть повторение элемента сайленсинга, который связывается с конкретной целевой последовательностью в конкретном гене-мишени. Элемент сайленсинга в интерферирующей рибонуклеиновой кислоте также может содержать различные нуклеотидные последовательности или состоять из различных нуклеотидных последовательностей, комплементарных другим целевой последовательностям. Должно быть ясно, что комбинация множества копий одного и того же элемента сайленсинга в сочетании с элементами сайленсинга, которые связываются с разными целевыми последовательностями, также входит в объем настоящего изобретения.The interfering ribonucleic acid of the present invention may comprise one or more silencing elements, where each silencing element contains or consists of a nucleotide sequence that is at least partially complementary to the target sequence in the target gene, and acts to suppress the expression of the gene- targets after ingestion by insects. The term "multiple" means at least two, at least three, at least four, etc., and up to at least 10, 15, 20, or at least 30. Interfering a ribonucleic acid contains multiple copies of a single silencing element, that is, a repeat of a silencing element that binds to a particular target sequence in a particular target gene. The silencing element in the interfering ribonucleic acid may also contain different nucleotide sequences or be composed of different nucleotide sequences that are complementary to other target sequences. It should be clear that the combination of multiple copies of the same silencing element in combination with silencing elements that bind to different target sequences is also within the scope of the present invention.

Для того чтобы добиться негативной регуляции определенного гена-мишени у жесткокрылого насекомого в настоящем изобретении, можно получать различные целевые последовательности из одного гена-мишени у одного насекомого. В этом случае элемент сайленсинга в интерферирующей рибонуклеиновой кислоте можно комбинировать в исходном порядке, в котором целевая последовательность существует в гене-мишени, или по сравнению с порядком целевой последовательности в гене-мишени элемент сайленсинга может быть дезорганизован в интерферирующей рибонуклеиновой кислоте и комбинирован случайным образом в любом порядке.In order to down-regulate a particular target gene in a hemipteran insect in the present invention, different target sequences can be obtained from the same target gene in the same insect. In this case, the silencing element in the interfering ribonucleic acid can be combined in the original order in which the target sequence exists in the target gene, or compared to the order of the target sequence in the target gene, the silencing element can be disorganized in the interfering ribonucleic acid and combined randomly in any order.

Альтернативно, разные целевые последовательности представляют собой один ген-мишень, но происходят от разных видов насекомых.Alternatively, different target sequences represent the same target gene but come from different insect species.

Альтернативно, разные целевые последовательности могут быть получены из разных генов-мишеней. Если интерферирующая рибонуклеиновая кислота применяется для предотвращения и/или борьбы с вторжением вредителей, предпочтительно, чтобы различные гены-мишени были выбраны из группы генов, которые регулируют основные биологические функции насекомых, и эти биологические функции в качестве неограничивающих примеров включают выживание, рост, развитие, размножение и патогенность. Гены-мишени могут регулировать одни и те же или разные биологические пути или процессы.Alternatively, different target sequences can be derived from different target genes. If the interfering ribonucleic acid is used to prevent and/or control the invasion of pests, it is preferable that the various target genes be selected from the group of genes that regulate the basic biological functions of insects, and these biological functions include, as non-limiting examples, survival, growth, development, reproduction and pathogenicity. Target genes may regulate the same or different biological pathways or processes.

В настоящем изобретении разные гены, на которые нацелены разные элементы сайленсинга, происходят от одного и того же насекомого. Этот способ можно использовать для усиления атаки против одного насекомого. В частности, разные гены-мишени могут по-разному экспрессироваться на разных стадиях жизненного цикла насекомых, таких как стадия зрелой взрослой особи, стадия незрелой личинки и стадия яйца. Таким образом, интерферирующая рибонуклеиновая кислота по настоящему изобретению может использоваться для предотвращения и/или борьбы с вторжением насекомых в течение более чем одной стадии жизненного цикла насекомых. Альтернативно, разные гены, на которые нацелены разные элементы сайленсинга, происходят от разных насекомых. Таким образом, интерферирующая рибонуклеиновая кислота по настоящему изобретению также может использоваться для предотвращения и/или борьбы с вторжением более чем одного насекомого одновременно.In the present invention, different genes targeted by different silencing elements come from the same insect. This method can be used to increase the attack against a single insect. In particular, different target genes may be expressed differently at different stages of the insect life cycle, such as the mature adult stage, the immature larval stage, and the egg stage. Thus, the interfering ribonucleic acid of the present invention can be used to prevent and/or control insect invasion during more than one stage of the insect life cycle. Alternatively, different genes targeted by different silencing elements come from different insects. Thus, the interfering ribonucleic acid of the present invention can also be used to prevent and/or combat the invasion of more than one insect at the same time.

Элемент сайленсинга по настоящему изобретению может быть непрерывной областью интерферирующей рибонуклеиновой кислоты или может быть отделен за счет присутствия линкерной последовательности. Линкерная последовательность может содержать короткую случайную нуклеотидную последовательность, которая не комплементарна какой-либо целевой последовательности или гену-мишени. Линкерная последовательность может быть условно саморасщепляющейся последовательностью РНК, в том числе pH-чувствительным линкером или гидрофобно-чувствительным линкером. Линкер может также содержать нуклеотидную последовательность, эквивалентную интронной последовательности. Линкерная последовательность может иметь длину в диапазоне от 1 пары оснований до приблизительно 10000 пар оснований, при условии, что линкер не ухудшает способность интерферирующей рибонуклеиновой кислоты подавлять экспрессию гена.The silencing element of the present invention may be a contiguous region of interfering ribonucleic acid or may be separated by the presence of a linker sequence. The linker sequence may contain a short random nucleotide sequence that is not complementary to any target sequence or gene. The linker sequence may be a conditionally self-cleaving RNA sequence, including a pH sensitive linker or a hydrophobically sensitive linker. The linker may also contain a nucleotide sequence equivalent to the intron sequence. The linker sequence may range from 1 base pair to about 10,000 base pairs in length, provided that the linker does not impair the ability of the interfering ribonucleic acid to repress gene expression.

В дополнение к одному или нескольким элементам сайленсинга и любым линкерным последовательностям, интерферирующая рибонуклеиновая кислота по настоящему изобретению также может содержать, по меньшей мере, одну дополнительную полинуклеотидную последовательность. Дополнительная полинуклеотидная последовательность выбрана из (1) последовательности, способной защищать интерферирующую рибонуклеиновую кислоту от процессинга РНК; (2) последовательности, влияющей на стабильность интерферирующей рибонуклеиновой кислоты; (3) последовательности, позволяющей связывание белка, что способствовует поглощению интерферирующей рибонуклеиновой кислоты клеткой насекомого; (4) последовательности, способной способствовать крупномасштабному производству интерферирующей рибонуклеиновой кислоты; (5) последовательности, которая действует как аптамер, способный связываться с рецептором или молекулой на поверхности клетки насекомого, чтобы способствовать поглощению; или (6) последовательности, способной катализировать процессинг интерферирующей рибонуклеиновой кислоты в клетке насекомого и, тем самым, повышать эффективность интерферирующей рибонуклеиновой кислоты.In addition to one or more silencing elements and any linker sequences, the interfering ribonucleic acid of the present invention may also contain at least one additional polynucleotide sequence. The additional polynucleotide sequence is selected from (1) a sequence capable of protecting the interfering ribonucleic acid from RNA processing; (2) a sequence affecting the stability of the interfering ribonucleic acid; (3) a sequence that allows protein binding to facilitate uptake of the interfering ribonucleic acid into the insect cell; (4) a sequence capable of promoting large-scale production of interfering ribonucleic acid; (5) a sequence that acts as an aptamer capable of binding to a receptor or molecule on the surface of an insect cell to promote uptake; or (6) a sequence capable of catalyzing the processing of the interfering ribonucleic acid in an insect cell and thereby increasing the efficiency of the interfering ribonucleic acid.

Длина интерферирующей рибонуклеиновой кислоты по настоящему изобретению должна быть достаточной для того, чтобы ее могла поглотить клетка насекомого, и чтобы подавить ген-мишень этого насекомого. Верхний предел длины может зависеть от (1) потребности в поглощении интерферирующей рибонуклеиновой кислоты клеткой насекомого и (2) потребности в переработке интерферирующей рибонуклеиновой кислоты в клетке насекомого, чтобы опосредовать выключение генов через путь РНКи; и длина также может быть определена производственными способами и составами для доставки интерферирующей рибонуклеиновой кислоты в клетку. Предпочтительно, длина интерферирующей рибонуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может составлять от 19 до 10000 нуклеотидов, предпочтительно от 50 до 5000 нуклеотидов, или от 100 до 2500 нуклеотидов, и более предпочтительно от 80 до 2000 нуклеотидов.The length of the interfering ribonucleic acid of the present invention should be sufficient to be taken up by the insect cell and to repress the insect's target gene. The upper limit of length may depend on (1) the need for uptake of the interfering ribonucleic acid into the insect cell and (2) the need for the processing of the interfering ribonucleic acid in the insect cell to mediate gene shutdown via the RNAi pathway; and length can also be determined by manufacturing methods and formulations for delivering interfering ribonucleic acid into a cell. Preferably, the length of the interfering ribonucleic acid of the present invention may be 19 to 10,000 nucleotides, preferably 50 to 5,000 nucleotides, or 100 to 2,500 nucleotides, and more preferably 80 to 2,000 nucleotides.

Интерферирующая рибонуклеиновая кислота по настоящему изобретению может содержать основания ДНК, неприродные основания или неприродные связи остова или модификации сахарид-фосфатных остовов, например, для повышения стабильности во время хранения или повышения устойчивости к деградации нуклеазами. Кроме того, интерферирующая рибонуклеиновая кислота может быть получена специалистом в данной области химическим или ферментативным способом посредством ручной или автоматической реакции. Альтернативно, интерферирующая рибонуклеиновая кислота может быть транскрибирована из кодирующего ее полинуклеотида. Таким образом настоящее изобретение относится к любому из изолированных полинуклеотидов, кодирующих интерферирующую рибонуклеиновую кислоту.The interfering ribonucleic acid of the present invention may contain DNA bases, non-natural bases or non-natural backbone linkages or saccharide-phosphate backbone modifications, for example to increase stability during storage or to increase resistance to degradation by nucleases. In addition, the interfering ribonucleic acid can be produced by a person skilled in the art by a chemical or enzymatic method through a manual or automatic reaction. Alternatively, the interfering ribonucleic acid may be transcribed from the polynucleotide encoding it. Thus, the present invention relates to any of the isolated polynucleotides encoding an interfering ribonucleic acid.

Полинуклеотид по настоящему изобретению может быть вставлен в конструкцию ДНК или вектор, известный в данной области, с помощью общепринятых способов молекулярного клонирования. Конструкция ДНК может быть рекомбинантным ДНК-вектором, таким как бактериальный, вирусный или дрожжевой вектор. Конструкция ДНК является экспрессирующей конструкцией, и полинуклеотид функционально связан, по меньшей мере, с одной регуляторной последовательностью, способной управлять экспрессией полинуклеотидной последовательности. «Регуляторная последовательность» относится к любой нуклеотидной последовательности, способной влиять на экспрессию функционально связанного полинуклеотида, и включает в качестве неограничивающих примеров промоторы, энхансеры и другие природные или синтетические элементы активации транскрипции. Регуляторная последовательность может располагаться на 5'- или 3'-конце полинуклеотидной последовательности. «Функционально связанный» относится к тому, что регуляторная последовательность и полинуклеотидная последовательность функционально связаны между собой, и такая связь позволяет регуляторной последовательности управлять экспрессией полинуклеотида. Функционально связанные элементы могут непрерывно следовать друг за другом или быть разделенными.The polynucleotide of the present invention can be inserted into a DNA construct or vector known in the art using conventional molecular cloning techniques. The DNA construct may be a recombinant DNA vector such as a bacterial, viral or yeast vector. The DNA construct is an expression construct and the polynucleotide is operably linked to at least one regulatory sequence capable of directing the expression of the polynucleotide sequence. "Regulatory sequence" refers to any nucleotide sequence capable of influencing the expression of an operably linked polynucleotide and includes, but is not limited to, promoters, enhancers, and other naturally occurring or synthetic transcription activating elements. The regulatory sequence may be located at the 5' or 3' end of the polynucleotide sequence. "Operably linked" refers to the fact that the regulatory sequence and the polynucleotide sequence are operably linked, and such linkage allows the regulatory sequence to direct the expression of the polynucleotide. Functionally related elements may continuously follow each other or be separated.

Регуляторная последовательность в настоящем изобретении может быть промотором. Предпочтительно, промотор представляет собой промотор, который можно экспрессировать в растении, и «промотор, который можно экспрессировать в растении» относится к промотору, который обеспечивает экспрессию связанного с ним полинуклеотида в растительной клетке. Промотор, который можно экспрессировать в растении, может быть конститутивным промотором. Примеры промоторов, которые непосредственно конститутивно экспрессируются в растениях в качестве неограничивающих примеров включают промотор 35S, полученный из вируса мозаики цветной капусты, промотор кукурузы ubi, промотор гена GOS2 риса и т.п.Альтернативно, промотор, который можно экспрессировать в растении, может быть тканеспецифическим промотором, таким как промотор карбоксилазы PEP, то есть такой промотор направляет экспрессию кодирующей последовательности в некоторых тканях растения, таких как зеленые ткани на уровне, более высоком, чем в других тканях растения (что можно определить по общепринятому тесту РНК). Альтернативно, промотором, который можно экспрессировать в растении, может быть промотор, индуцируемый повреждением. Повреждение-индуцибельный промотор или промотор, который управляет индуцируемым раной профилем экспрессии, относится к тому, что, когда растение подвергается механическим ранениям или ранам от грызущих насекомых, экспрессия полинуклеотида под регуляцией промотора значительно выше, чем в нормальных условиях роста. Примеры индуцируемых повреждением промоторов в качестве неограничивающих примеров включают промоторы генов ингибиторов протеазы картофеля и помидора (pin I и pin II) и гена ингибитора протеазы кукурузы (MPI).The regulatory sequence in the present invention may be a promoter. Preferably, the promoter is a promoter that can be expressed in a plant, and "a promoter that can be expressed in a plant" refers to a promoter that allows the expression of its associated polynucleotide in a plant cell. A promoter that can be expressed in a plant may be a constitutive promoter. Examples of promoters that are directly constitutively expressed in plants include, but are not limited to, the 35S promoter derived from cauliflower mosaic virus, the maize ubi promoter, the rice GOS2 gene promoter, and the like. Alternatively, a promoter that can be expressed in a plant may be tissue specific. a promoter such as the PEP carboxylase promoter, i.e. such a promoter directs the expression of the coding sequence in some plant tissues, such as green tissues, at a level higher than in other plant tissues (as determined by a conventional RNA test). Alternatively, a promoter that can be expressed in a plant may be a lesion inducible promoter. An injury-inducible promoter, or a promoter that drives a wound-induced expression profile, refers to the fact that when a plant is subjected to mechanical or gnawing wounds, the expression of the polynucleotide under the regulation of the promoter is significantly higher than under normal growth conditions. Non-limiting examples of injury-induced promoters include those for the potato and tomato protease inhibitor genes (pin I and pin II) and the maize protease inhibitor (MPI) gene.

Альтернативно, одна или несколько последовательностей терминации транскрипции могут быть включены в экспрессирующую конструкцию по настоящему изобретению. Термин «последовательность терминации транскрипции» включает в себя контрольную последовательность в конце блока транскрипции, которая передает сигналы терминации транскрипции, процессинга 3'-конца и полиаденилирования первичного транскрипта. Дополнительные регуляторные элементы в качестве неограничивающих примеров включают энхансеры транскрипции или трансляции, которые могут быть включены в экспрессирующую конструкцию, например, промотор с двойным энхансером CaMV35S.Alternatively, one or more transcription termination sequences may be included in an expression construct of the present invention. The term "transcriptional termination sequence" includes a control sequence at the end of a transcription block that signals transcription termination, 3' end processing, and polyadenylation of the primary transcript. Additional regulatory elements include, but are not limited to, transcriptional or translational enhancers that can be included in an expression construct, such as the CaMV35S dual enhancer promoter.

Способ получения любой интерферирующей рибонуклеиновой кислоты в настоящем изобретении включает следующие этапы: (1) контактирование полинуклеотида, кодирующего интерферирующую рибонуклеиновую кислоту, или конструкции ДНК, содержащей полинуклеотид, с бесклеточным компонентом; (2) введение полинуклеотида, кодирующего интерферирующую рибонуклеиновую кислоту или конструкцию ДНК, содержащую полинуклеотид (например, путем трансформации, трансфекции или инъекции), в клетку.The method for producing any interfering ribonucleic acid in the present invention includes the following steps: (1) contacting a polynucleotide encoding an interfering ribonucleic acid, or a DNA construct containing a polynucleotide, with a cell-free component; (2) introducing a polynucleotide encoding an interfering ribonucleic acid or a DNA construct containing the polynucleotide (eg, by transformation, transfection, or injection) into the cell.

В настоящем изобретении клетка-хозяин, содержащая любую интерферирующую рибонуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, любой полинуклеотид по настоящему изобретению, или конструкцию ДНК, содержащую полинуклеотид, может быть прокариотической клеткой, включая в качестве неограничивающих примеров грамположительные и грамотрицательные бактериальные клетки; или эукариотической клеткой, включая в качестве неограничивающих примеров дрожжевые клетки или растительные клетки. Предпочтительно, клетка-хозяин представляет собой бактериальную клетку или растительную клетку. Полинуклеотид или конструкция ДНК по настоящему изобретению может существовать или поддерживаться как внехромосомный элемент в клетке-хозяине или может быть стабильно включена в геном клетки-хозяина.In the present invention, a host cell containing any interfering ribonucleic acid of the present invention, any polynucleotide of the present invention, or a DNA construct containing a polynucleotide may be a prokaryotic cell, including, but not limited to, Gram-positive and Gram-negative bacterial cells; or a eukaryotic cell, including but not limited to yeast cells or plant cells. Preferably, the host cell is a bacterial cell or a plant cell. A polynucleotide or DNA construct of the present invention may exist or be maintained as an extrachromosomal element in a host cell, or may be stably incorporated into the host cell's genome.

В настоящем изобретении, когда интерферирующая рибонуклеиновая кислота экспрессируется в клетке-хозяине и/или применяется для профилактики заражения и/или борьбы с заражением насекомыми организма-хозяина, предпочтительно, чтобы интерферирующая рибонуклеиновая кислота не проявляла значительного «нецелевого» эффекта, то есть интерферирующая рибонуклеиновая кислота не влияет на экспрессию нецелевых генов в организме хозяина. Предпочтительно, чтобы выключенный ген не проявлял значительной комплементарности с нуклеотидной последовательностью, отличной от установленной целевой последовательности гена-мишени. Элемент сайленсинга демонстрирует идентичность последовательности, менее чем 30%, более предпочтительно, менее 20%, более предпочтительно, менее 5% и даже более предпочтительно, менее 5% по отношению к любому гену клетки-хозяина или организма-хозяина. Если доступны данные о геномной последовательности организма-хозяина, то можно использовать стандартные инструменты биоинформатики для перекрестной проверки согласованности с элементом сайленсинга. В области с 17 последовательными нуклеотидами, более предпочтительно в области с 18 или 19 последовательными нуклеотидами, и наиболее предпочтительно в области с 19 или 20 или 21 последовательными нуклеотидами, не существует идентичности последовательности между элементом сайленсинга и геном из клетки-хозяина или организма-хозяина.In the present invention, when the interfering ribonucleic acid is expressed in a host cell and/or is used to prevent infection and/or control insect infestation of the host, it is preferable that the interfering ribonucleic acid does not show a significant "off-target" effect, that is, the interfering ribonucleic acid does not affect the expression of non-target genes in the host organism. Preferably, the knocked-out gene does not show significant complementarity with a nucleotide sequence other than the established target gene sequence. The silencing element exhibits less than 30%, more preferably less than 20%, more preferably less than 5%, and even more preferably less than 5% sequence identity to any host cell or host organism gene. If host genomic sequence data is available, then standard bioinformatics tools can be used to cross-check for consistency with the silencing element. In a region of 17 contiguous nucleotides, more preferably in a region of 18 or 19 contiguous nucleotides, and most preferably in a region of 19 or 20 or 21 contiguous nucleotides, there is no sequence identity between the silencing element and the gene from the host cell or host organism.

Нуклеотидная последовательность по настоящему изобретению может включать инвертированные повторы, разделенные «спейсерной последовательностью». Спейсерная последовательность может представлять собой область, включающую любые из следующих нуклеотидных последовательностей, и, если необходимо, нуклеотидные последовательности могут способствовать образованию вторичной структуры между каждым повтором. Спейсерная последовательность является частью смысловой или антисмысловой кодирующей последовательности, используемой для мРНК. Альтернативно, спейсерная последовательность может включать любую комбинацию нуклеотидов или их гомологов, которые могут быть ковалентно связаны с молекулой нуклеиновой кислоты. Спейсерная последовательность может включать нуклеотидную последовательность, по меньшей мере, от 10 до 100 нуклеотидов в длину, или, по меньшей мере, примерно от 100 до 200 нуклеотидов в длину, по меньшей мере, приблизительно от 200 до 400 нуклеотидов в длину, или, по меньшей мере, приблизительно от 200 до 400 нуклеотидов в длину, или приблизительно от 400 до 500 нуклеотидов в длину.The nucleotide sequence of the present invention may include inverted repeats separated by a "spacer sequence". The spacer sequence may be a region including any of the following nucleotide sequences, and if necessary, the nucleotide sequences may contribute to the formation of a secondary structure between each repeat. The spacer sequence is part of the sense or antisense coding sequence used for the mRNA. Alternatively, the spacer sequence may include any combination of nucleotides or homologues thereof that may be covalently linked to the nucleic acid molecule. The spacer sequence may include a nucleotide sequence of at least 10 to 100 nucleotides in length, or at least about 100 to 200 nucleotides in length, at least about 200 to 400 nucleotides in length, or at least about 200 to 400 nucleotides in length, or about 400 to 500 nucleotides in length.

В настоящем изобретении, когда интерферирующая рибонуклеиновая кислота «вводится» в растение, это означает, что это может происходить посредством прямой трансформации, такой как опосредованная Agrobacterium трансформация, бомбардировка частиц, электропорация и т.д.; или введение можно проводить путем скрещивания растения, имеющего гетерологичную нуклеотидную последовательность, с другим растением, так что потомство имеет нуклеотидную последовательность, включенную в их геном. Такие способы селекции хорошо известны специалистам в данной области.In the present invention, when an interfering ribonucleic acid is "introduced" into a plant, this means that it can occur through direct transformation such as Agrobacterium-mediated transformation, particle bombardment, electroporation, etc.; or the introduction may be by crossing a plant having a heterologous nucleotide sequence with another plant such that the progeny has the nucleotide sequence included in their genome. Such selection methods are well known to those skilled in the art.

РастенияPlants

Растения, описанные в настоящем изобретении в качестве неограничивающих примеров, включают сою, пшеницу, ячмень, кукурузу, табак, рис, рапс, хлопок или подсолнечник. В конкретном варианте осуществления растение представляет собой кукурузу. В другом конкретном варианте осуществления растение представляет собой сою.Plants described in the present invention as non-limiting examples include soybean, wheat, barley, corn, tobacco, rice, rapeseed, cotton or sunflower. In a particular embodiment, the plant is corn. In another specific embodiment, the plant is a soybean.

Растения, описанные в настоящем изобретении, могут содержать любой репродуктивный материал или материал для размножения растения, а также могут включать растительные клетки, протопласты растений, растительные тканевые культуры, каллус растений и растительные клетки, которые являются интактными в растении или части растения. «Часть растения» включает зародыши, пыльцу, семяпочки, семена, листья, цветы, ветви, плоды, косточки, колосья, початки, кожуру, стебли, корни, кончики корней и т.п. В конкретном варианте осуществления «часть растения» представляет собой лист, более конкретно, пластинку листа.The plants described herein may contain any plant reproductive or propagation material, and may also include plant cells, plant protoplasts, plant tissue cultures, plant callus, and plant cells that are intact in the plant or plant part. "Part of a plant" includes germs, pollen, ovules, seeds, leaves, flowers, branches, fruits, pits, ears, cobs, skins, stems, roots, root tips, and the like. In a specific embodiment, the "plant part" is a leaf, more specifically, a leaf blade.

КомпозицииCompositions

В настоящем изобретении композиция для предотвращения заражения и/или для борьбы с заражением насекомыми содержит, по меньшей мере, одну интерферирующую рибонуклеиновую кислоту и необязательно, по меньшей мере, один подходящий носитель, эксципиент или разбавитель, где интерферирующая рибонуклеиновая кислота подавляет экспрессию генов-мишеней у насекомого после ее проглатывания насекомым. Интерферирующая рибонуклеиновая кислота содержит или включает, по меньшей мере, один элемент сайленсинга, а элемент сайленсинга представляет собой двухцепочечную область РНК, содержащую спаренные комплементарные цепи, где одна цепь (смысловая цепь) содержит нуклеотидную последовательность, которая, по меньшей мере, частично комплементарна целевой последовательности в гене-мишени. Ген-мишень в качестве неограничивающих примеров включает ген, регулирующий выживание, рост, развитие, размножение и патогенность насекомых. Необязательно, композиция содержит, по меньшей мере, одну клетку-хозяина, клетку-хозяина, содержащую, по меньшей мере, одну интерферирующую рибонуклеиновую кислоту или конструкцию ДНК, кодирующую интерферирующую рибонуклеиновую кислоту, и необязательно, по меньшей мере, один подходящий носитель, эксципиент или разбавитель, где после того как клетка-хозяин поглощена насекомым, интерферирующая рибонуклеиновая кислота подавляет экспрессию гена-мишени у насекомого.In the present invention, the composition for preventing and/or controlling insect infestation comprises at least one interfering ribonucleic acid and optionally at least one suitable carrier, excipient or diluent, wherein the interfering ribonucleic acid suppresses the expression of target genes in insect after it has been ingested by the insect. The interfering ribonucleic acid contains or includes at least one silencing element, and the silencing element is a double-stranded region of RNA containing paired complementary strands, where one strand (sense strand) contains a nucleotide sequence that is at least partially complementary to the target sequence in the target gene. The target gene, as non-limiting examples, includes a gene that regulates the survival, growth, development, reproduction, and pathogenicity of insects. Optionally, the composition comprises at least one host cell, a host cell containing at least one interfering ribonucleic acid or a DNA construct encoding an interfering ribonucleic acid, and optionally at least one suitable carrier, excipient, or a diluent, where after the host cell is engulfed by the insect, the interfering ribonucleic acid represses the expression of the target gene in the insect.

Композиция по настоящему изобретению может быть в любой физической форме, подходящей для введения насекомому. Например, композиция может быть в твердой форме (порошок, осадок или приманка), жидкой форме (в том числе в виде инсектицидного спрея) или форме геля. Композиция может быть краской, пастой или порошком, которые могут быть нанесены на субстрат для защиты субстрата от заражения насекомыми. Композицию можно использовать для защиты любого субстрата или материала, чувствительного к атакам насекомых или повреждению, причиненному насекомыми.The composition of the present invention may be in any physical form suitable for administration to an insect. For example, the composition may be in solid form (powder, pellet, or bait), liquid form (including insecticidal spray), or gel form. The composition may be a paint, paste or powder that can be applied to the substrate to protect the substrate from insect infestation. The composition can be used to protect any substrate or material susceptible to insect attack or damage caused by insects.

Природа эксципиента и физическая форма композиции могут варьироваться в зависимости от природы подлежащего обработке субстрата. Например, композиция может представлять собой жидкость, которой покрывают материал или субстрат или которую распыляют на материал или субстрат, подлежащий обработке, или напечатывают на материале или субстрате, подлежащем обработке; или может быть покрытием или порошком, который наносится на обрабатываемый материал или субстрат.The nature of the excipient and the physical form of the composition may vary depending on the nature of the substrate to be treated. For example, the composition may be a liquid that is coated on the material or substrate, or sprayed onto the material or substrate to be treated, or printed on the material or substrate to be treated; or may be a coating or powder that is applied to the material or substrate to be treated.

В настоящем изобретении композиция может быть в виде приманки. Приманка применяется для привлечения насекомого для контакта с композицией. После того, как насекомое контактирует с ней, композиция затем интернализуется насекомым посредством, например, проглатывания, и опосредует РНКи, тем самым убивая насекомое. Приманка может включать пищу, такую как пища на основе белка, такую как рыба. Борную кислоту также можно использовать в качестве приманки. Приманка может зависеть от вида-мишени. Также можно использовать аттрактант, например, аттрактант может быть феромоном, таким как мужской или женский феромон. Аттрактантные функции привлекают насекомое к контакту с композицией, и могут быть нацелены на конкретное насекомое или могут привлекать весь спектр насекомых, увеличивая шанс этих привлекаемых насекомых контактировать с композицией по настоящему изобретению, тем самым убивая большое количество насекомых. Приманка может быть любой подходящей формы, такой как твердое вещество, паста, осадок или порошок.In the present invention, the composition may be in the form of a bait. The bait is used to attract the insect into contact with the composition. Once the insect contacts it, the composition is then internalized by the insect through, for example, ingestion, and mediates RNAi, thereby killing the insect. The bait may include a food such as a protein-based food such as fish. Boric acid can also be used as bait. The bait may depend on the target species. An attractant may also be used, for example the attractant may be a pheromone such as a male or female pheromone. Attractant functions attract an insect to contact with the composition and may be targeted to a particular insect or may attract a whole range of insects, increasing the chance of these attracted insects to contact the composition of the present invention, thereby killing a large number of insects. The bait may be in any suitable form such as a solid, paste, pellet or powder.

Насекомые также могут принести наживку в сообщество насекомых. Затем приманка может служить источником пищи для других членов сообщества, тем самым обеспечивая эффективный контроль над большим количеством насекомых и, возможно, над всем сообществом насекомых. Приманка также может быть предусмотрена в подходящем «корпусе» или «ловушке».Insects may also provide bait to the insect community. The bait can then serve as a food source for other members of the community, thus providing effective control over a large number of insects and possibly the entire insect community. The bait may also be provided in a suitable "case" or "trap".

Кроме того, композиция при контакте с насекомым может оставаться на эпидермисе насекомого. При очистке, независимо от того, очищает ли себя одно насекомое или очищают насекомые друг друга, эти композиции могут быть проглочены и, таким образом, опосредуют свое действие на насекомых. Это требует от композиции, чтобы она была достаточно стабильной, чтобы даже после воздействия внешних условий окружающей среды в течение периода времени (например, нескольких суток) интерферирующая рибонуклеиновая кислота оставалась интактной и могла опосредовать РНКи.In addition, the composition upon contact with the insect may remain on the epidermis of the insect. When cleaning, whether one insect cleans itself or cleans each other, these compositions can be ingested and thus mediate their effect on the insects. This requires the composition to be sufficiently stable that even after exposure to external environmental conditions for a period of time (eg, several days), the interfering ribonucleic acid remains intact and can mediate RNAi.

В настоящем изобретении композиция может быть представлена в виде спрея. Таким образом, люди-пользователи могут напрямую опрыскивать насекомых композицией. Затем композиция интернализуется насекомым, где она может опосредовать РНК-интерференцию, чтобы бороться с насекомым. Спрей представляет собой преимущественно спрей под давлением/распылительный спрей или спрей с помпой. Эти частицы могут быть подходящего размера, чтобы они прилипали к насекомому, например, прикреплялись к экзоскелету и могли оттуда впитываться.In the present invention, the composition may be in the form of a spray. Thus, human users can directly spray insects with the composition. The composition is then internalized by the insect where it can mediate RNA interference to fight the insect. The spray is advantageously a pressure spray/spray spray or a pump spray. These particles can be of a suitable size so that they stick to the insect, for example, attach to the exoskeleton and can be absorbed from there.

Носитель композиции по настоящему изобретению представляет собой порошок или гранулу, заряженную статическим электричеством, которое прилипает к насекомому. Необязательно, носитель композиции может содержать магнитные частицы, которые прикрепляются к эпидермису насекомых. Необязательно, носитель композиции содержит металлические частицы, и эти частицы изначально не намагничиваются, но способны становиться магнитно поляризованными при воздействии электрического поля, создаваемого телом насекомого. Предпочтительно, композиция включена в носитель, и носитель увеличивает попадание интерферирующей РНК в организм насекомого. Этот носитель может быть носителем на основе липидов, предпочтительно включающим одно или несколько из следующего: эмульсии «масло-в-воде», мицеллы, холестерин, липополиамины и липосомы. Другие агенты, способствующие проглатыванию конструкции по настоящему изобретению, хорошо известны специалистам в данной области, и включают поликатионы, декстран и катионные липиды, такие как CS096, CS102 и т.п. Необязательно, носитель композиции представляет собой коагулянт нуклеиновых кислот; предпочтительные коагулянты нуклеиновых кислот включают спермидин или протамина сульфат или их производные.The carrier of the composition of the present invention is a powder or granule charged with static electricity that adheres to the insect. Optionally, the carrier composition may contain magnetic particles that attach to the epidermis of insects. Optionally, the composition carrier contains metal particles, and these particles are not initially magnetized, but are capable of becoming magnetically polarized when subjected to an electric field generated by the insect's body. Preferably, the composition is included in a carrier and the carrier increases the entry of the interfering RNA into the insect body. This carrier may be a lipid-based carrier, preferably comprising one or more of the following: oil-in-water emulsions, micelles, cholesterol, lipopolyamines, and liposomes. Other swallowing agents of the construct of the present invention are well known to those skilled in the art and include polycations, dextran, and cationic lipids such as CS096, CS102, and the like. Optionally, the composition carrier is a nucleic acid coagulant; preferred nucleic acid coagulants include spermidine or protamine sulfate or derivatives thereof.

В случае, когда композиция по настоящему изобретению подходит для профилактики заражения и/или для борьбы с заражением растения насекомыми, композиция может включать подходящий сельскохозяйственный носитель. Этим носителем может быть любой материал, который может переносить обрабатываемое растение, этот материал не причиняет чрезмерного вреда окружающей среде или другим существующим в ней организмам, и он позволяет интерферирующей рибонуклеиновой кислоте оставаться эффективной против насекомых. В частности, композицию по настоящему изобретению можно формулировать для доставки к растениям в соответствии с общепринятой практикой, применяемой в индустрии биопестицидов. Композиция может содержать дополнительный компонент, способный выполнять другие функции, включая в качестве неограничивающих примеров (1), усиление или способствование поглощению интерферирующей рибонуклеиновой кислоты клеткой насекомого, и (2) стабилизацию активного компонента композиции. Такой дополнительный компонент, содержащийся в композиции, содержащей интерферирующую рибонуклеиновую кислоту, может быть дрожжевой тРНК или дрожжевой тотальной РНК.Where the composition of the present invention is suitable for preventing and/or controlling insect infestation of a plant, the composition may include a suitable agricultural carrier. The carrier can be any material that can be tolerated by the plant being treated, the material does not cause undue harm to the environment or other organisms present therein, and allows the interfering ribonucleic acid to remain effective against insects. In particular, the composition of the present invention may be formulated for delivery to plants in accordance with common practice in the biopesticide industry. The composition may contain an additional component capable of performing other functions, including, but not limited to, (1) enhancing or facilitating the uptake of an interfering ribonucleic acid into an insect cell, and (2) stabilizing the active component of the composition. Such an additional component contained in the composition containing the interfering ribonucleic acid may be yeast tRNA or yeast total RNA.

Композицию можно формулировать для прямого применения или составлять в виде концентрированной формы первичной композиции, которую следует разбавить перед использованием. Альтернативно, композиция может быть представлена в виде набора; набора, содержащего интерферирующую рибонуклеиновую кислоту в контейнере или клетку-хозяина, содержащую/экспрессирующую интерферирующую рибонуклеиновую кислоту, и подходящий разбавитель или носитель для РНК или клетки-хозяина в отдельном контейнере. В заявке по настоящему изобретению композицию можно применять для растения или любой части растения на любой стадии развития растения, например, композицию применяют для надземной части растения во время выращивания растения в поле; и композицию наносят на семена растений во время хранения или после посадки в почву. В целом, важно получить хороший контроль над насекомыми на ранних стадиях роста растений, так как это период, когда насекомые могут наиболее серьезно повредить растения.The composition can be formulated for direct use or formulated as a concentrated form of the primary composition, which should be diluted before use. Alternatively, the composition may be presented as a kit; a kit containing the interfering ribonucleic acid in a container or a host cell containing/expressing the interfering ribonucleic acid and a suitable diluent or carrier for the RNA or host cell in a separate container. In the application of the present invention, the composition can be applied to the plant or any part of the plant at any stage of plant development, for example, the composition is applied to the aerial part of the plant during the growing of the plant in the field; and the composition is applied to the plant seeds during storage or after planting in the soil. In general, it is important to get good insect control in the early stages of plant growth, as this is the period when insects can most severely damage plants.

В настоящем изобретении композицию можно применять к окружающей среде насекомого различными способами, включая в качестве неограничивающих примеров распыление, опрыскивание, опыление, разбрасывание, поливание, покрытие семян, обработку семян, внесение в почву и внесение в воду для орошения. При обработке растения, восприимчивого к заражению насекомыми, композиция может быть доставлена на растение или часть растения до появления насекомых (в целях профилактики) или после того, как начинают появляться признаки заражения насекомыми (в целях борьбы).In the present invention, the composition can be applied to the insect's environment in a variety of ways, including, but not limited to, spraying, spraying, pollinating, spreading, watering, seed coating, seed treatment, soil application, and irrigation water application. When treating a plant susceptible to insect infestation, the composition may be delivered to the plant or part of the plant before insects appear (for prevention purposes) or after signs of insect infestation begin to appear (for control purposes).

Композицию по настоящему изобретению можно формулировать так, чтобы она содержала, по меньшей мере, одно дополнительное активное средство. Таким образом композиция может быть представлена в виде «набора из нескольких частей», набора, включающего несколько композиций, содержащих интерферирующую рибонуклеиновую кислоту в контейнере и один или несколько подходящих активных ингредиентов, таких как химические или биологические пестициды в отдельном контейнере. Альтернативно, композиция может быть представлена в виде смеси, которая является стабильной, и может использоваться в комбинации друг с другом.The composition of the present invention can be formulated to contain at least one additional active agent. Thus, a composition may be presented as a "multi-part kit", a kit comprising several compositions containing an interfering ribonucleic acid in a container and one or more suitable active ingredients such as chemical or biological pesticides in a separate container. Alternatively, the composition may be presented as a mixture which is stable and may be used in combination with each other.

Подходящие активные ингредиенты, которые могут действовать на интерферирующую рибонуклеиновую кислоту по настоящему изобретению дополняющим образом, в качестве неограничивающих примеров включают следующие: хлорпирифос, аллетрин, ресметрин, тетрабромэтил, диметанол-циклопропанкарбоновая кислота (в основном, содержится в жидкой композиции); а также гидраметилнон, авермектин, хлорпирифос, сульфурамид, гидропрен, фипронил (рецептор ГАМК), изопропилфенилметил карбамат, индоксакарб, новифлумурон (ингибитор синтеза хитина), имипротрин, абамектин (хлоридный канал с глутаминатными воротами), имидилаклоприд (ацетилхолиновый рецептор) (в основном содержится в композиции приманки). Предпочтительно, в отношении здоровья и окружающей среды известным активным ингредиентом является инсектицид, такой как гидраметилнон и абамектин.Suitable active ingredients that can act on the interfering ribonucleic acid of the present invention in a complementary manner include, as non-limiting examples, the following: chlorpyrifos, allethrin, resmethrin, tetrabromoethyl, dimethanol-cyclopropanecarboxylic acid (mainly contained in the liquid composition); as well as hydramethylnon, avermectin, chlorpyrifos, sulfuramide, hydroprene, fipronil (GABA receptor), isopropylphenylmethyl carbamate, indoxacarb, noviflumuron (chitin synthesis inhibitor), imiprotrin, abamectin (chloride channel with glutamate gate), imidilacloprid (acetylcholine receptor) (mainly contains in the composition of the bait). Preferably, from a health and environmental point of view, the known active ingredient is an insecticide such as hydramethylnon and abamectin.

Композицию по настоящему изобретению можно сформулировать так, чтобы она содержала по меньшей мере один дополнительный агрономический агент, такой как гербицид или дополнительный инсектицид. "Дополнительный инсектицид" или "второй инсектицид" относится к инсектициду, отличному от первого или от исходной интерферирующей молекулы РНК из композиции. Необязательно, композиция по настоящему изобретению может быть доставлена в комбинации, по меньшей мере, с одним дополнительным агрономическим агентом (например, гербицидом или вторым инсектицидом). Композиция может быть представлена в комбинации с гербицидом, гербицидом, выбранным из любого гербицида, известного в данной области, такого как глифосат, 2,4-D, имидазолинон, сульфонилкарбамид и бромоксинил. Композиция также может быть представлена в виде комбинации, по меньшей мере, с одним дополнительным инсектицидом, и дополнительный инсектицид, можно выбирать из любого инсектицида, известного в данной области, и/или может содержать интерферирующую рибонуклеиновую кислоту, и интерферирующая рибонуклеиновая кислота действует, подавляя экспрессию гена-мишени у насекомого после того, как насекомое проглотило ее. Вредителем-мишенью является насекомое, и интерферирующая рибонуклеиновая кислота представляет собой любую кислоту, выбранную из интерферирующих рибонуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Дополнительный инсектицид включает интерферирующую рибонуклеиновую кислоту, которая подавляет экспрессию известного гена у любого вредителя-мишени. Исходная интерферирующая рибонуклеиновая кислота и второй или дополнительный инсектицид композиции могут быть нацелены на одних и тех же или разных насекомых. Например, исходная интерферирующая рибонуклеиновая кислота и второй инсектицид могут быть нацелены на различных насекомых или могут быть нацелены на насекомых разных семейств или классов, таких как грибы или нематоды, или насекомые. Специалисты в данной области должны знать, как тестировать синергическое действие интерферирующей рибонуклеиновой кислоты в комбинации с другими агрономическими реагентами. Предпочтительно, композиция содержит первую интерферирующую рибонуклеиновую кислоту и один или несколько дополнительных инсектицидов, каждый из которых токсичен для одного и того же насекомого, где один или несколько дополнительных инсектицидов выбраны из специфического белка клубней картофеля, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus ehlersii, инсектицидного белка Photorhabdus luminescens, инсектицидного белка Bacillus laterosporus, инсектицидного белка Bacillus sphaericus и лигнина. Различные компоненты могут быть доставлены одновременно или последовательно в область или организм, подлежащий лечению.The composition of the present invention can be formulated to contain at least one additional agronomic agent, such as a herbicide or additional insecticide. "Additional insecticide" or "second insecticide" refers to an insecticide other than the first or the original interfering RNA molecule of the composition. Optionally, the composition of the present invention may be delivered in combination with at least one additional agronomic agent (eg, herbicide or second insecticide). The composition may be presented in combination with a herbicide, a herbicide selected from any herbicide known in the art such as glyphosate, 2,4-D, imidazolinone, sulfonylurea and bromoxynil. The composition may also be presented in combination with at least one additional insecticide, and the additional insecticide may be selected from any insecticide known in the art and/or may contain an interfering ribonucleic acid, and the interfering ribonucleic acid acts to suppress the expression target gene in an insect after the insect has ingested it. The target pest is an insect, and the interfering ribonucleic acid is any acid selected from the interfering ribonucleic acids of the present invention. The additional insecticide includes an interfering ribonucleic acid that suppresses the expression of a known gene in any target pest. The parent interfering ribonucleic acid and the second or additional insecticide of the composition may target the same or different insects. For example, the parent interfering ribonucleic acid and the second insecticide may target different insects, or may target insects of different families or classes, such as fungi or nematodes, or insects. Those skilled in the art would know how to test synergistic effects of interfering ribonucleic acid in combination with other agronomic reagents. Preferably, the composition contains the first interfering ribonucleic acid and one or more additional insecticides, each of which is toxic to the same insect, where one or more additional insecticides are selected from a specific potato tuber protein, a Bacillus thuringiensis insecticidal protein, a Xenorhabdus ehlersii insecticidal protein, an insecticidal Photorhabdus luminescens protein, Bacillus laterosporus insecticidal protein, Bacillus sphaericus insecticidal protein and lignin. The various components may be delivered simultaneously or sequentially to the area or organism to be treated.

Способ профилактики вторжения насекомых и/или борьбы с вторжением насекомыхMethod for preventing insect invasion and/or controlling insect invasion

Способ профилактики вторжения насекомых и/или борьбы с вторжением насекомых по настоящему изобретению включает контактирование насекомого с эффективным количеством, по меньшей мере, одной интерферирующей рибонуклеиновой кислоты, где интерферирующая рибонуклеиновая кислота подавляет экспрессию жизненного важного гена-мишени насекомого после того, как поглощается насекомым. Жизненно важным геном-мишенью может быть любой ген насекомого, участвующий в регуляции важного биологического процесса, необходимого насекомому для инициирования или поддержания заражения, включая в качестве неограничивающих примеров выживание, рост, развитие, воспроизводство и патогенность.The method of preventing insect invasion and/or controlling insect invasion of the present invention comprises contacting an insect with an effective amount of at least one interfering ribonucleic acid, wherein the interfering ribonucleic acid represses the expression of a vital target insect gene after being ingested by the insect. A vital target gene can be any insect gene involved in the regulation of an essential biological process required by an insect to initiate or maintain infection, including, but not limited to, survival, growth, development, reproduction, and pathogenicity.

Способ по настоящему изобретению для профилактики вторжения насекомых и/или борьбы с вторжением насекомых на полях сельскохозяйственных культур включает экспрессию эффективного количества интерферирующей рибонуклеиновой кислоты в растении. В случае, когда количество применяется для борьбы с вторжением насекомых, термин "эффективное" относится к количеству или содержанию интерферирующей рибонуклеиновой кислоты, необходимому для оказания фенотипического эффекта на насекомое, с тем чтобы уменьшить количество насекомых, поражающих организмы-хозяева и/или уменьшить ущерб, нанесенный насекомым. Фенотипическим эффектом может быть смерть насекомого, и применение интерферирующей РНК приводит к смерти насекомого, по меньшей мере, в 20%, 30%, 40%, предпочтительно, по меньшей мере, в 50%, 60%, 70%, более предпочтительно, по меньшей мере, в 80% или 90% случаев по сравнению с контрольным насекомым. Фенотипические эффекты могут также в качестве неограничивающих примеров включать препятствование росту насекомых, прекращение кормления и снижение яйценоскости. Таким образом, по сравнению с контрольным насекомым, общее количество насекомых, атакующих организм-хозяин, может быть уменьшено, по меньшей мере, на 20%, 30%, 40%, предпочтительно, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 80% или 90%. Необязательно, ущерб, наносимый насекомым, можно уменьшить, по меньшей мере, на 20%, 30%, 40%, предпочтительно, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 80% или 90% по сравнению с контрольным насекомым. Таким образом, настоящее изобретение можно использовать для достижения контроля над насекомыми, по меньшей мере, на 20%, 30%, 40%, предпочтительно, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, и более предпочтительно, по меньшей мере, на 80% или 90%.The method of the present invention for preventing and/or controlling insect invasion in crop fields comprises expressing an effective amount of an interfering ribonucleic acid in a plant. In the case where the amount is used to control insect invasion, the term "effective" refers to the amount or content of interfering ribonucleic acid necessary to have a phenotypic effect on the insect in order to reduce the number of insects infecting host organisms and/or reduce the damage, inflicted by insects. The phenotypic effect may be insect death, and the use of interfering RNA results in insect death of at least 20%, 30%, 40%, preferably at least 50%, 60%, 70%, more preferably at least 80% or 90% of the time compared to the control insect. Phenotypic effects may also include, but are not limited to, inhibition of insect growth, feeding cessation, and reduced egg production. Thus, compared with the control insect, the total number of insects attacking the host can be reduced by at least 20%, 30%, 40%, preferably at least 50%, 60%, 70 %, more preferably at least 80% or 90%. Optionally, insect damage can be reduced by at least 20%, 30%, 40%, preferably at least 50%, 60%, 70%, more preferably at least 80% or 90% compared to the control insect. Thus, the present invention can be used to achieve insect control of at least 20%, 30%, 40%, preferably at least 50%, 60%, 70%, and more preferably at least , by 80% or 90%.

Способ и композицию по настоящему изобретению можно использовать для ограничения или устранения вторжения жесткокрылых вредителей, в частности Monolepta hieroglyphica, в окружающей среде или на поверхности, где существует любой вредитель-хозяин, симбионт-вредитель или вредитель, путем предоставления одной или нескольких композиций, содержащих молекулы дцРНК по настоящему изобретению, в корме для вредителей. Этот способ особенно полезен для предотвращения нападения насекомых на растения, а вредители определяются как имеющие пищеварительную систему с pH приблизительно от 4,5 до приблизительно 9,5, приблизительно от 5 до приблизительно 9, приблизительно от 6 до приблизительно 7, и приблизительно pH 7,0.The method and composition of the present invention can be used to limit or eliminate the invasion of beetle pests, in particular Monolepta hieroglyphica, in an environment or on a surface where any host pest, pest symbiont or pest exists, by providing one or more compositions containing molecules dsRNA of the present invention, in pest feed. This method is particularly useful in preventing insect attacks on plants, and pests are defined as having a digestive system with a pH of about 4.5 to about 9.5, about 5 to about 9, about 6 to about 7, and about pH 7, 0.

Преимущества по настоящему изобретениюAdvantages of the present invention

Настоящее изобретение относится к полинуклеотиду и способу борьбы с нашествием насекомых, который имеет, по меньшей мере, следующие преимущества:The present invention relates to a polynucleotide and method for controlling insect infestation, which has at least the following advantages:

1. Настоящее изобретение относится впервые ко множеству целевых последовательностей гена-мишени c35112 для борьбы с жесткокрылыми насекомыми-вредителями, Monolepta hieroglyphica, и подтверждает, что ингибитор нуклеиновой кислоты, полученный на основе этих целевых последовательностей, может быть непосредственно использован для контроля вторжения жесткокрылого насекомого-вредителя.1. The present invention relates for the first time to a plurality of target gene sequences c35112 for controlling the beetle insect pest, Monolepta hieroglyphica, and confirms that a nucleic acid inhibitor derived from these target sequences can be directly used to control the invasion of the beetle pest - pest.

2. Высокая специфичность к виду. Целевая последовательность по настоящему изобретению для борьбы с жесткокрылыми насекомыми-вредителями Monolepta hieroglyphica очень специфично действует на Monolepta hieroglyphica и виды, которые тесно связаны с ней и имеют совпадающие последовательности.2. High species specificity. The target sequence of the present invention for controlling the beetle pest Monolepta hieroglyphica acts very specifically on Monolepta hieroglyphica and species that are closely related to it and share sequences.

3. Отсутствует резистентность. Настоящее изобретение не зависит от комбинации конкретных дцРНК и рецепторного белка у насекомого и может эффективно избежать риска, такого как выработка у насекомого устойчивости к белку токсина Bt.3. No resistance. The present invention does not depend on the combination of specific dsRNA and receptor protein in an insect, and can effectively avoid the risk such as developing resistance in the insect to the Bt toxin protein.

4. Технология РНКи, используемая в настоящем изобретении, имеет высокую эффективность и специфичность, а полученная дцРНК может быть непосредственно применена в полевых условиях для борьбы с нашествием жесткокрылых насекомых-вредителей, что удобно, дешево и имеет хорошую экологическую совместимость.4. The RNAi technology used in the present invention has high efficiency and specificity, and the resulting dsRNA can be directly applied in the field to control the invasion of beetle insect pests, which is convenient, cheap, and has good environmental compatibility.

Технические решения по настоящему изобретению будут дополнительно описаны в деталях ниже с помощью прилагаемых чертежей и примеров.The technical solutions of the present invention will be further described in detail below with the help of the accompanying drawings and examples.

Краткое описание чертежейBrief description of the drawings

На фигуре 1 представлена электрофореграмма уровня экспрессии гена-мишени c35112 из полинуклеотида и способа для борьбы с нашествием насекомых по настоящему изобретению;Figure 1 shows an electropherogram of the expression level of the c35112 target gene from a polynucleotide and a method for controlling insect infestation of the present invention;

На фигуре 2 представлена схема рекомбинантного экспрессионного вектора DBNR35112C1, применяемого в полинуклеотиде и способе для борьбы с нашествием насекомых по настоящему изобретению.Figure 2 is a diagram of the DBNR35112C1 recombinant expression vector used in the insect control polynucleotide and method of the present invention.

ПримерыExamples

Следующие конкретные примеры дополнительно иллюстрируют техническое решение полинуклеотида и способа по настоящему изобретению для борьбы с нашествием насекомых.The following specific examples further illustrate the polynucleotide and method of the present invention for controlling insect infestation.

Пример 1: Определение целевой последовательности Monolepta hieroglyphicaExample 1: Target Sequence Determination of Monolepta hieroglyphica

1. Выделение тотальной РНК Monolepta hieroglyphica.1. Isolation of the total RNA of Monolepta hieroglyphica.

В качестве материала использовали червей личинок первого возраста Monolepta hieroglyphica, РНК экстрагировали при помощи общепринятого способа с тризолом, очищали общепринятым способом, и обрабатывали ферментом для ДНК для получения образца тотальной РНК с концентрацией ≥300нг/мкл, общим количеством ≥6 мкг и OD 260/280 1,8-2,2.First instar larval worms Monolepta hieroglyphica were used as material, RNA was extracted using the conventional method with trizol, purified by the conventional method, and treated with DNA enzyme to obtain a total RNA sample with a concentration of ≥300ng/μl, a total amount of ≥6 μg and OD 260/ 280 1.8-2.2.

2. Выделение мРНК и синтез кДНК.2. Isolation of mRNA and synthesis of cDNA.

Магнитные шарики с олиго-dT применяли для выделения мРНК с полиA из образца тотальной РНК, подготовленного выше, а затем синтезировали первую цепь кДНК при помощи случайного гексамера и набора с обратной транскриптазой Invitrogen's Superscript II.Oligo-dT magnetic beads were used to isolate polyA mRNA from the total RNA sample prepared above, and then first strand cDNA was synthesized using a random hexamer and Invitrogen's Superscript II reverse transcriptase kit.

3. Скрининг генов-мишеней3. Screening for target genes

Один образец гена-мишени c35112 Monolepta hieroglyphica был выделен при скрининге при анализе библиотеки личинок из генов с умеренным уровнем экспрессии и, возможно, участвующих в важных метаболических путях, его полноразмерная нуклеотидная последовательность была показана в SEQ ID NO: 1, и его аминокислотная последовательность была показана в SEQ ID NO: 2.One sample of the c35112 target gene of Monolepta hieroglyphica was isolated by screening analysis of a larval library from genes with a moderate level of expression and possibly involved in important metabolic pathways, its full nucleotide sequence was shown in SEQ ID NO: 1, and its amino acid sequence was shown in SEQ ID NO: 2.

4. Выбор целевой последовательности в гене-мишени4. Selection of the target sequence in the target gene

Восемнадцать целевых последовательностей с разными позициями ORF и/или разными длинами выбирали из гена-мишени c35112, как показано в таблице 1.Eighteen target sequences with different ORF positions and/or different lengths were selected from the c35112 target gene as shown in Table 1.

Таблица 1. Информация о последовательностях восемнадцати целевых последовательностейTable 1. Sequence information for the eighteen target sequences

Целевая последовательностьTarget sequence Последовательность No.Sequence no. Целевая последовательностьTarget sequence Последовательность No.Sequence no. Целевая последовательность 1-r1Target sequence 1-r1 SEQ ID NO: 3SEQ ID NO: 3 Целевая последовательность 10-r10Target sequence 10-r10 SEQ ID NO: 12SEQ ID NO: 12 Целевая последовательность 2-r2Target sequence 2-r2 SEQ ID NO: 4SEQ ID NO: 4 Целевая последовательность 11-r11Target sequence 11-r11 SEQ ID NO: 13SEQ ID NO: 13 Целевая последовательность 3-r3Target sequence 3-r3 SEQ ID NO: 5SEQ ID NO: 5 Целевая последовательность 12-r12Target sequence 12-r12 SEQ ID NO: 14SEQ ID NO: 14 Целевая последовательность 4-r4Target sequence 4-r4 SEQ ID NO: 6SEQ ID NO: 6 Целевая последовательность 13-r13Target sequence 13-r13 SEQ ID NO: 15SEQ ID NO: 15 Целевая последовательность 5-r5Target sequence 5-r5 SEQ ID NO: 7SEQ ID NO: 7 Целевая последовательность 14-r14Target sequence 14-r14 SEQ ID NO: 16SEQ ID NO: 16 Целевая последовательность 6-r6Target sequence 6-r6 SEQ ID NO: 8SEQ ID NO: 8 Целевая последовательность 15-r15Target sequence 15-r15 SEQ ID NO: 17SEQ ID NO: 17 Целевая последовательность 7-r7Target sequence 7-r7 SEQ ID NO: 9SEQ ID NO: 9 Целевая последовательность 16-r16Target sequence 16-r16 SEQ ID NO: 18SEQ ID NO: 18 Целевая последовательность 8-r8Target sequence 8-r8 SEQ ID NO: 10SEQ ID NO: 10 Целевая последовательность 17-r17Target sequence 17-r17 SEQ ID NO: 19SEQ ID NO: 19 Целевая последовательность 9-r9Target sequence 9-r9 SEQ ID NO: 11SEQ ID NO: 11 Целевая последовательность 18-r18Target sequence 18-r18 SEQ ID NO: 20SEQ ID NO: 20

Пример 2: Получение дцРНКExample 2: Preparation of dsRNA

Ссылаясь на инструкции набора MEGAscript RNAi компании ThermoFisher, синтезировали дцРНК из указанных выше 18 целевых последовательностей, которые представляют собой r1-дцРНК в r18-дцРНК; размеры продуктов были определены путем агарозного электрофореза с массовой концентрацией 1%, а концентрацию указанных выше r1-дцРНК до r18-дцРНКли определяли с помощью NanoDrop 2000 (Thermo Scientific), соответственно.Referring to the instructions of the ThermoFisher MEGAscript RNAi kit, dsRNA was synthesized from the above 18 target sequences, which are r1-dsRNA in r18-dsRNA; the sizes of the products were determined by agarose electrophoresis with a mass concentration of 1%, and the concentration of the above r1-dsRNA to r18-dsRNAli was determined using NanoDrop 2000 (Thermo Scientific), respectively.

Пример 3: Определение контроля над Monolepta hieroglyphica путем кормления дцРНК.Example 3: Determination of control of Monolepta hieroglyphica by feeding dsRNA.

Выделенные и очищенные дцРНК от r1-дцРНК до r18-дцРНК смешивали раздельно и равномерно добавляли в корм в соотношении 50 мкг/г корма и 5 мкг/г корма (для формулы корма, см.: Development of an artificial diet for the western corn rootworm, Entomologia Experimentalis et Applicata 105:1-11, 2002), и таким образом получали корма от c35112-r1-50 до c35112-r18-50 и корма от c35112-r1-5 до c35112-r18-5 соответственно, где в корма контрольной группы СК добавляли нерелевантную дцРНК (SEQ ID NO: 29), а другие условия были точно такими же. Только что вылупившихся личинок Monolepta hieroglyphica кормили приготовленным кормом, при этом 30 только что вылупившихся личинок с временем инкубации не более 24 часов помещали в каждую чашку, где корма, смешанные с дцРНК, меняли каждые два дня и кормили до тех пор, пока не наступали сутки 12. Смертность насекомых подсчитывали каждые два дня от начала кормления. С начала кормления уровни экспрессии генов-мишеней измеряли на Сутки 0, 4, 8 и 10 определенным способом следующим образом:The isolated and purified dsRNAs from r1-dsRNA to r18-dsRNA were mixed separately and evenly added to the feed at a ratio of 50 µg/g feed and 5 µg/g feed (for the feed formula, see: Development of an artificial diet for the western corn rootworm , Entomologia Experimentalis et Applicata 105:1-11, 2002) and thus obtained food from c35112-r1-50 to c35112-r18-50 and food from c35112-r1-5 to c35112-r18-5 respectively, where in the food SC control group was added irrelevant dsRNA (SEQ ID NO: 29), and other conditions were exactly the same. Newly hatched Monolepta hieroglyphica larvae were fed prepared food, while 30 newly hatched larvae with an incubation time of no more than 24 hours were placed in each dish, where the food mixed with dsRNA was changed every two days and fed until the day 12. Insect mortality was counted every two days from the start of feeding. From the start of feeding, target gene expression levels were measured on Days 0, 4, 8 and 10 in a specific manner as follows:

Этап 301: червей, которым скармливали корма c35112-r1-50 - c35112-r18-50 и корма c35112-r1-5 - c35112-r18-5, собирали на Сутки 0, 4, 8 и 10 соответственно, и криоконсервировали в жидком азоте;Step 301: Worms fed c35112-r1-50 to c35112-r18-50 and c35112-r1-5 to c35112-r18-5 were harvested on Days 0, 4, 8 and 10, respectively, and cryopreserved in liquid nitrogen ;

Этап 302: тотальную РНК вышеуказанных червей экстрагировали с использованием способа с тризолом;Step 302: The total RNA of the above worms was extracted using the Trizol method;

Этап 303: Проводили обратную транскрипцию тотальной РНК вышеуказанных червей с использованием TransGen Biotech ER301-01 для получения кДНК;Step 303: Total RNA of the above worms was reverse transcribed using TransGen Biotech ER301-01 to obtain cDNA;

Этап 304: Убиквитин-C применяли в качестве внутреннего референсного гена для проведения ПЦР-амплификации, и после амплификации 10 мкл амплифицированного продукта подвергали агарозному электрофорезу в геле с массовой концентрацией 1%.Step 304: Ubiquitin-C was used as an internal reference gene for PCR amplification, and after amplification, 10 μl of the amplified product was subjected to agarose gel electrophoresis at a mass concentration of 1%.

Каждую обработку в вышеупомянутом эксперименте повторяли 5 раз, и статистические результаты были показаны на фигуре 1 и в Таблице 2. В таблице 2, «-50» в номере материала означает, что 50 мкг соответствующей дцРНК содержится в одном грамме корма, т.е. указанное выше «50 мкг/г корма»; «-5» означает, что 5 мкг соответствующей дцРНК содержится в одном грамме корма, т.е. указанное выше «5 мкг/г корма». Например, «r1-дцРНК-50» означает, что 50 мкг r1-дцРНК содержалось в одном грамме корма. «DAI» относится к количеству суток после кормления.Each treatment in the above experiment was repeated 5 times, and the statistical results were shown in Figure 1 and Table 2. In Table 2, "-50" in the material number means that 50 μg of the respective dsRNA is contained in one gram of feed, i.e. the above "50 µg/g feed"; "-5" means that 5 µg of the corresponding dsRNA is contained in one gram of food, i.e. the above "5 µg/g feed". For example, "r1-dsRNA-50" means that 50 µg of r1-dsRNA was contained in one gram of food. "DAI" refers to the number of days after feeding.

Результаты измерения экспрессия гена-мишени на фигуре 1 показывают, что дцРНК целевых последовательностей r3 и r4 (50 мкг/г питания) оказывала значительное ингибирующее действие на экспрессию гена-мишени c35112 у Monolepta hieroglyphica, экспрессия гена-мишени c35112 была значительно подавлена на сутки 4 кормления, и экспрессия c35112 почти не определялась на сутки 10.The results of measuring the expression of the target gene in figure 1 show that dsRNA of the target sequences r3 and r4 (50 μg/g nutrition) had a significant inhibitory effect on the expression of the c35112 target gene in Monolepta hieroglyphica, the expression of the c35112 target gene was significantly suppressed on day 4 feeding, and the expression of c35112 was almost not determined on day 10.

Результаты кормления дцРНК в таблице 2 показывают, что дцРНК целевых последовательностей r1-r18 гена-мишени c35112 оказывает очевидное летальное воздействие на Monolepta hieroglyphica, и в большинстве повторов на двенадцатые сутки кормления почти не было выживших личинок.The dsRNA feeding results in Table 2 show that the dsRNA target sequences r1-r18 of the target gene c35112 have a clear lethal effect on Monolepta hieroglyphica and most repeats had almost no surviving larvae on the twelfth day of feeding.

Таблица 2: Результаты коэффициента выживаемости Monolepta hieroglyphica в тесте кормления дцРНКTable 2: Survival Rate Results of Monolepta hieroglyphica in the dsRNA Feeding Test

Материал No.Material No. DAI0DAI0 DAI2DAI2 DAI4DAI4 DAI6DAI6 DAI8DAI8 DAI10DAI10 DAI12DAI12 CK-дцРНКCK-dsRNA 100%±0%100%±0% 100%±0%100%±0% 96%±5%96%±5% 96%±5%96%±5% 92%±8%92%±8% 87%±10%87%±10% 85%±12%85%±12% r1-дцРНК-50r1-dsRNA-50 100%±0%100%±0% 98%±4%98%±4% 92%±6%92%±6% 81%±11%81%±11% 58%±15%58%±15% 32%±16%32%±16% 8%±10%8%±10% r1-дцРНК-5r1-dsRNA-5 100%±0%100%±0% 100%±0%100%±0% 94%±6%94%±6% 85%±9%85%±9% 75%±14%75%±14% 52%±10%52%±10% 30%±16%30%±16% r2-дцРНК-50r2-dsRNA-50 100%±0%100%±0% 100%±0%100%±0% 90%±6%90%±6% 78%±8%78%±8% 47%±7%47%±7% 27%±12%27%±12% 12%±6%12%±6% r2-дцРНК-5r2-dsRNA-5 100%±0%100%±0% 98%±2%98%±2% 97%±4%97%±4% 89%±6%89%±6% 72%±12%72%±12% 49%±9%49%±9% 25%±15%25%±15% r3-дцРНК-50r3-dsRNA-50 100%±0%100%±0% 98%±4%98%±4% 88%±7%88%±7% 71%±10%71%±10% 45%±9%45%±9% 19%±15%19%±15% 8%±5%8%±5% r3-дцРНК-5r3-dsRNA-5 100%±0%100%±0% 100%±0%100%±0% 93%±7%93%±7% 89%±7%89%±7% 77%±14%77%±14% 56%±18%56%±18% 28%±10%28%±10% r4-дцРНК-50r4-dsRNA-50 100%±0%100%±0% 97%±3%97%±3% 92%±6%92%±6% 75%±8%75%±8% 50%±8%50%±8% 25%±12%25%±12% 12%±8%12%±8% r4-дцРНК-5r4-dsRNA-5 100%±0%100%±0% 98%±3%98%±3% 89%±8%89%±8% 79%±10%79%±10% 70%±10%70%±10% 50%±10%50%±10% 30%±15%30%±15% r5-дцРНК-50r5-dsRNA-50 100%±0%100%±0% 100%±0%100%±0% 86%±10%86%±10% 68%±15%68%±15% 35%±12%35%±12% 10%±8%10%±8% 5%±5%5%±5% r5-дцРНК-5r5-dsRNA-5 100%±0%100%±0% 100%±0%100%±0% 92%±10%92%±10% 85%±15%85%±15% 65%±12%65%±12% 51%±16%51%±16% 22%±10%22%±10% r6-дцРНК-50r6-dsRNA-50 100%±0%100%±0% 98%±4%98%±4% 91%±7%91%±7% 81%±9%81%±9% 46%±12%46%±12% 20%±8%20%±8% 8%±6%8%±6% r6-дцРНК-5r6-dsRNA-5 100%±0%100%±0% 100%±0%100%±0% 95%±6%95%±6% 86%±12%86%±12% 70%±13%70%±13% 55%±15%55%±15% 28%±10%28%±10% r7-дцРНК-50r7-dsRNA-50 100%±0%100%±0% 94%±5%94%±5% 90%±8%90%±8% 82%±8%82%±8% 67%±8%67%±8% 38%±12%38%±12% 12%±8%12%±8% r7-дцРНК-5r7-dsRNA-5 100%±0%100%±0% 100%±0%100%±0% 92%±6%92%±6% 82%±12%82%±12% 67%±14%67%±14% 49%±11%49%±11% 31%±14%31%±14% r8-дцРНК-50r8-dsRNA-50 100%±0%100%±0% 100%±0%100%±0% 93%±7%93%±7% 77%±6%77%±6% 55%±10%55%±10% 28%±9%28%±9% 16%±5%16%±5% r8-дцРНК-5r8-dsRNA-5 100%±0%100%±0% 100%±0%100%±0% 88%±6%88%±6% 80%±10%80%±10% 65%±12%65%±12% 50%±12%50%±12% 25%±15%25%±15% r9-дцРНК-50r9-dsRNA-50 100%±0%100%±0% 98%±2%98%±2% 86%±8%86%±8% 70%±10%70%±10% 50%±10%50%±10% 25%±10%25%±10% 10%±10%10%±10% r9-дцРНК-5r9-dsRNA-5 100%±0%100%±0% 100%±0%100%±0% 95%±6%95%±6% 82%±8%82%±8% 59%±10%59%±10% 41%±13%41%±13% 27%±12%27%±12% r10-дцРНК-50r10-dsRNA-50 100%±0%100%±0% 100%±0%100%±0% 88%±10%88%±10% 79%±8%79%±8% 63%±11%63%±11% 50%±9%50%±9% 18%±12%18%±12% r10-дцРНК-5r10-dsRNA-5 100%±0%100%±0% 100%±0%100%±0% 96%±5%96%±5% 89%±6%89%±6% 65%±10%65%±10% 52%±12%52%±12% 25%±10%25%±10% r11-дцРНК-50r11-dsRNA-50 100%±0%100%±0% 95%±6%95%±6% 86%±7%86%±7% 67%±12%67%±12% 50%±12%50%±12% 32%±11%32%±11% 10%±10%10%±10% r11-дцРНК-5r11-dsRNA-5 100%±0%100%±0% 100%±0%100%±0% 96%±4%96%±4% 89%±6%89%±6% 65%±10%65%±10% 52%±11%52%±11% 27%±10%27%±10% r12-дцРНК-50r12-dsRNA-50 100%±0%100%±0% 95%±7%95%±7% 81%±7%81%±7% 80%±9%80%±9% 63%±14%63%±14% 33%±7%33%±7% 10%±5%10%±5% r12-дцРНК-5r12-dsRNA-5 100%±0%100%±0% 99%±1%99%±1% 83%±7%83%±7% 74%±14%74%±14% 44%±8%44%±8% 41%±5%41%±5% 17%±9%17%±9% r13-дцРНК-50r13-dsRNA-50 100%±0%100%±0% 97%±4%97%±4% 81%±6%81%±6% 72%±7%72%±7% 57%±14%57%±14% 30%±12%30%±12% 17%±14%17%±14% r13-дцРНК-5r13-dsRNA-5 100%±0%100%±0% 99%±2%99%±2% 82%±7%82%±7% 77%±10%77%±10% 48%±6%48%±6% 43%±11%43%±11% 28%±10%28%±10% r14-дцРНК-50r14-dsRNA-50 100%±0%100%±0% 98%±2%98%±2% 94%±4%94%±4% 73%±11%73%±11% 62%±9%62%±9% 31%±11%31%±11% 17%±7%17%±7% r14-дцРНК-5r14-dsRNA-5 100%±0%100%±0% 99%±1%99%±1% 89%±8%89%±8% 67%±8%67%±8% 59%±12%59%±12% 45%±10%45%±10% 29%±3%29%±3% r15-дцРНК-50r15-dsRNA-50 100%±0%100%±0% 97%±2%97%±2% 81%±6%81%±6% 66%±12%66%±12% 50%±12%50%±12% 38%±12%38%±12% 9%±12%9%±12% r15-дцРНК-5r15-dsRNA-5 100%±0%100%±0% 99%±1%99%±1% 82%±8%82%±8% 74%±13%74%±13% 48%±7%48%±7% 46%±6%46%±6% 21%±6%21%±6% r16-дцРНК-50r16-dsRNA-50 100%±0%100%±0% 98%±3%98%±3% 92%±6%92%±6% 74%±10%74%±10% 62%±14%62%±14% 27%±7%27%±7% 14%±8%14%±8% r16-дцРНК-5r16-dsRNA-5 100%±0%100%±0% 99%±1%99%±1% 81%±4%81%±4% 63%±14%63%±14% 51%±12%51%±12% 47%±10%47%±10% 29%±6%29%±6% r17-дцРНК-50r17-dsRNA-50 100%±0%100%±0% 97%±2%97%±2% 90%±5%90%±5% 85%±13%85%±13% 64%±9%64%±9% 25%±5%25%±5% 18%±6%18%±6% r17-дцРНК-5r17-dsRNA-5 100%±0%100%±0% 96%±5%96%±5% 85%±9%85%±9% 77%±10%77%±10% 62%±8%62%±8% 41%±12%41%±12% 20%±5%20%±5% r18-дцРНК-50r18-dsRNA-50 100%±0%100%±0% 100%±0%100%±0% 85%±7%85%±7% 82%±6%82%±6% 47%±13%47%±13% 31%±13%31%±13% 14%±6%14%±6% r18-дцРНК-5r18-dsRNA-5 100%±0%100%±0% 97%±4%97%±4% 85%±8%85%±8% 83%±6%83%±6% 43%±13%43%±13% 36%±10%36%±10% 28%±10%28%±10%

Пример 4: Неожиданные технические эффекты интерференции экспрессии одного и того же гена у разных насекомых.Example 4: Unexpected technical effects of interference in the expression of the same gene in different insects.

Белок частицы распознавания сигнала 54кДа принадлежит к одной из пептидных цепей в комплексе частиц распознавания сигнала. Его основная функция заключается в том, что когда секретируемый в данный момент белок выходит из рибосомы, белок частицы распознавания сигнала 54кДа быстро связывается с сигнальной последовательностью ранее секретированного белка и переносит его на мембранный белок, связанный с цепью транслокации. Соответствующая литература показала, что вмешательство в экспрессию гена, кодирующего белок частицы распознавания сигнала 54кДа, может иметь летальные эффекты для ряда жесткокрылых насекомых; например, как сообщает Julia Ulrich et al. (2015), когда ген, кодирующий белок у Tribolium castaneum, подвергался РНК-интерференции путем инъекции (инъекция последовательности, код iB_00404), было выявлено, что почти все Tribolium castaneum погибли в течение 4 суток после инъекции. Дополнительно, как сообщает Avet-Rochex et al. (2010), когда ген, кодирующий белок у Drosophila, подвергался РНК-интерференции путем инъекции (Таблица 1), результаты показали, что почти все Drosophila погибли после инъекции.The 54 kDa signal recognition particle protein belongs to one of the peptide chains in the signal recognition particle complex. Its main function is that when the currently secreted protein exits the ribosome, the 54kD signal recognition particle protein quickly binds to the signal sequence of the previously secreted protein and transfers it to the membrane protein associated with the translocation chain. The relevant literature has shown that interference with the expression of the gene encoding the 54 kDa signal recognition particle protein can have lethal effects in a number of beetles; for example, as reported by Julia Ulrich et al. (2015), when the gene encoding a protein in Tribolium castaneum was subjected to RNA interference by injection (sequence injection, code iB_00404), it was found that almost all Tribolium castaneum died within 4 days after injection. Additionally, as reported by Avet-Rochex et al. (2010), when a gene encoding a protein in Drosophila was subjected to RNA interference by injection (Table 1), the results showed that almost all Drosophila died after the injection.

На основании вышеуказанных выше сообщений в литературе и высокой последовательности гомологии, провели скрининг гена, кодирующего белок у Monolepta hieroglyphica, и выбирали последовательность M1, показанную в SEQ ID NO: 30, в соответствующем положении согласно последовательности, введенной в Tribolium castaneum и Drosophila. Также была выбрана последовательность M2, показанная в SEQ ID NO: 31, в несоответствующем положении. Использовали способ кормления дцРНК (соотношение корма 50 мкг/г) в примере 3 по настоящему изобретению для определения способности контроля Monolepta hieroglyphica. Как показано в таблице 3, экспериментальные результаты показали, что ни последовательность M1 в соответствующем положении, ни последовательность M2 в несоответствующем положении не оказали очевидного летального эффекта на Monolepta hieroglyphica, который был в основном таким же, как и в контроле. Аналогичные экспериментальные результаты подтверждены в WO 2018/026770, в котором после получения группы транскрипции, применяли для проверки РНКи летальных генов нематод и дрозофил, то есть, согласно известным летальным генам у нематод и дрозофил, соответствующий ген у корневых червей кукурузы подвергался РНКи, и в принципе не наблюдали очевидного летального эффекта. По сути, технические эффекты интерференции экспрессии одного и того же гена у разных насекомых непредсказуемы, и не обязательно связаны с техническими эффектами известной интерференции и гомологии последовательностей.Based on the above literature reports and high sequence homology, the gene encoding the protein in Monolepta hieroglyphica was screened, and the M1 sequence shown in SEQ ID NO: 30 was selected at the appropriate position according to the sequence introduced in Tribolium castaneum and Drosophila. The M2 sequence shown in SEQ ID NO: 31 was also selected in the wrong position. The dsRNA feeding method (food ratio 50 μg/g) in Example 3 of the present invention was used to determine the ability to control Monolepta hieroglyphica. As shown in Table 3, the experimental results showed that neither the M1 sequence at the respective position nor the M2 sequence at the mismatched position had an obvious lethal effect on Monolepta hieroglyphica, which was basically the same as the control. Similar experimental results are confirmed in WO 2018/026770, in which, after obtaining a transcription group, RNAi of nematode and Drosophila lethal genes were used to test, that is, according to the known lethal genes in nematodes and Drosophila, the corresponding gene in maize rootworms was subjected to RNAi, and in In principle, no obvious lethal effect was observed. As such, the technical effects of interference in the expression of the same gene in different insects are unpredictable, and are not necessarily related to the technical effects of known interference and sequence homology.

Таблица 3: Результаты уровня летальности в тесте кормления дцРНК у Monolepta hieroglyphicaTable 3: Mortality rate results in the dsRNA feeding test in Monolepta hieroglyphica

Материал No.Material No. DAI4DAI4 DAI6DAI6 DAI8DAI8 DAI10DAI10 DAI12DAI12 DAI14DAI14 CK-дцРНКCK-dsRNA 96%±6%96%±6% 85%±9%85%±9% 75%±16%75%±16% 71%±16%71%±16% 69%±13%69%±13% 69%±14%69%±14% M1-дцРНК-50M1-dsRNA-50 98%±3%98%±3% 92%±6%92%±6% 89%±7%89%±7% 83%±9%83%±9% 69%±15%69%±15% 63%±18%63%±18% M2-дцРНК-50M2-dsRNA-50 91%±8%91%±8% 88%±10%88%±10% 84%±11%84%±11% 76%±13%76%±13% 69%±15%69%±15% 67%±17%67%±17%

Пример 5: Конструирование растительного экспрессионного вектораExample 5: Construction of a Plant Expression Vector

Синтезировали две экспрессионные кассеты в соответствии с последовательностью p35S-RX-tNos-p35S-Hpt-tNos (X был 1-18), и лигировали с растительным экспрессионным вектором с использованием EcoRV и BamHI, и полученные векторы были названы DBNR35112CX (X был 1-18), где схематическая диаграмма вектора DBNR35112C1 показана на фигуре 2 (Kan: ген канамицина; RB: правая граница; pr35S: промотор вируса мозаики цветной капусты 35S (SEQ ID NO: 21); R1 (SEQ ID NO: 22): обратная комлементарная последовательность нуклеотидной последовательности r1 (r1 - целевая последовательность 1 гена-мишени c35112, SEQ ID NO: 3)+спейсерная последовательность (SEQ ID NO: 23)+нуклеотидная последовательность r1; tNos: терминатор гена нопалинсинтазы (SEQ ID NO: 24); Hpt: ген гигромицин фосфотрансферазы (SEQ ID NO: 25); LB: левая граница).Two expression cassettes were synthesized according to the sequence p35S-RX-tNos-p35S-Hpt-tNos (X was 1-18) and ligated to a plant expression vector using EcoRV and BamHI and the resulting vectors were named DBNR35112CX (X was 1-18). 18), where a schematic diagram of the DBNR35112C1 vector is shown in figure 2 (Kan: kanamycin gene; RB: right border; pr35S: cauliflower mosaic virus 35S promoter (SEQ ID NO: 21); R1 (SEQ ID NO: 22): reverse complementary r1 nucleotide sequence (r1 - target gene c35112 target sequence 1, SEQ ID NO: 3) + spacer sequence (SEQ ID NO: 23) + r1 nucleotide sequence; tNos: nopaline synthase gene terminator (SEQ ID NO: 24); Hpt : hygromycin phosphotransferase gene (SEQ ID NO: 25); LB: left border).

Рекомбинантным экспрессионным вектором DBNR35112C1 были трансформированы компетентные клетки E.coli T1 с помощью способа теплового шока, при котором условия теплового шока были: 50 мкл компетентных клеток E.coli T1, 10 мкл ДНК-плазмиды (рекомбинантный экспрессионный вектор DBNR35112C1), водяная баня 42°C на 30 секунд; встряхивание культуры при 37°C в течение 1 часа (встряхивание на шейкере при 100 об./мин.); затем культивировали при 37°C в течение 12 часов на твердой чашке LB, содержащей 50 мг/л канамицина (триптон 10 г/л, экстракт дрожжей 5 г/л, NaCl 10 г/л, агар 15 г/л, pH доведен до 7,5 с помощью NaOH). Белые колонии отбирали и культивировали в течение ночи при 37°C в жидкой среде LB (триптон 10 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, NaCl 10 г/л, Канамицин 50 мг/л, pH доведен до 7,5 с помощью NaOH). Плазмиды экстрагировали щелочным способом: бактериальный раствор центрифугировали при 12000 об./мин. в течение 1 минуты, супернатант удаляли, и осажденные бактериальные клетки суспендировали с помощью 100 мкл предварительно охлажденного льдом Раствора I (25 мМ трис-HCl, 10 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), 50 мМ глюкоза, pH 8,0); Добавляли 200 мкл свежеприготовленного Раствора II (0,2M NaOH, 1% SDS (додецилсульфат натрия)), пробирку переворачивали 4 раза для перемешивания и помещали на лед в течение 3-5 минут; добавляли 150 мкл охлажденного на льду Раствора III (3M ацетат калия, 5M уксусная кислота), тщательно перемешивали и помещали на лед на 5-10 минут; после центрифугировали в течение 5 минут при температуре 4°C и скорости вращения 12000 об./мин. К супернатанту добавляли, равномерно перемешивая, 2 объема абсолютного этанола и выдерживали при комнатной температуре в течение 5 минут; центрифугировали в течение 5 минут при температуре 4°C и скорости вращения 12000 об./мин., супернатант удаляли, осадок отмывали этанолом с 70% содержанием (об./об.) и сушили на воздухе. Добавляли 30 мкл TE (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, pH 8,0), содержащего РНКазу (20 мкг/мл), для растворения осадка; расщепление РНК проводили на водяной бане при 37°C в течение 30 минут; хранили для дальнейшего использования при -20°C. Выделенные плазмиды были секвенированы и идентифицированы при помощи ПЦР, и результаты показали, что рекомбинантный экспрессионный вектор DBNR35112C1 сконструирован верно.Competent E. coli T1 cells were transformed with the recombinant expression vector DBNR35112C1 using the heat shock method, in which the heat shock conditions were: 50 μl of competent E. coli T1 cells, 10 μl of DNA plasmid (DBNR35112C1 recombinant expression vector), water bath 42° C for 30 seconds; shaking the culture at 37°C for 1 hour (shaking on a shaker at 100 rpm); then cultured at 37°C for 12 hours on a solid LB plate containing 50 mg/l kanamycin (tryptone 10 g/l, yeast extract 5 g/l, NaCl 10 g/l, agar 15 g/l, pH adjusted to 7.5 with NaOH). White colonies were selected and cultured overnight at 37°C in liquid LB medium (tryptone 10 g/l, yeast extract 5 g/l, NaCl 10 g/l, Kanamycin 50 mg/l, pH adjusted to 7.5 with NaOH). Plasmids were extracted by the alkaline method: the bacterial solution was centrifuged at 12,000 rpm. within 1 minute, the supernatant was removed and the precipitated bacterial cells were suspended with 100 μl of ice-cold Solution I (25 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 50 mM glucose, pH 8.0); 200 µl of freshly prepared Solution II (0.2M NaOH, 1% SDS (sodium dodecyl sulfate)) was added, the tube was inverted 4 times for mixing and placed on ice for 3-5 minutes; 150 μl of ice-cold Solution III (3M potassium acetate, 5M acetic acid) was added, mixed thoroughly and placed on ice for 5-10 minutes; after centrifugation for 5 minutes at a temperature of 4°C and a rotation speed of 12,000 rpm. To the supernatant was added, with uniform stirring, 2 volumes of absolute ethanol and kept at room temperature for 5 minutes; centrifuged for 5 minutes at 4° C. and 12,000 rpm, the supernatant was removed, the precipitate was washed with 70% (v/v) ethanol and dried in air. 30 μl of TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) containing RNase (20 μg/ml) was added to dissolve the precipitate; RNA digestion was carried out in a water bath at 37°C for 30 minutes; stored for further use at -20°C. The isolated plasmids were sequenced and identified by PCR, and the results indicated that the DBNR35112C1 recombinant expression vector was correctly designed.

Рекомбинантные экспрессионный векторы DBNR35112C2 в DBNR35112C18 конструировали в соответствии с вышеуказанным способом, и их векторные структуры были: Kan: ген канамицина; RB: правая граница; pr35S: промотор вируса мозаики цветной капусты 35S (SEQ ID NO: 21); RX: нуклеотидная последовательность rX (rX представляла собой целевую последовательность X гена-мишени c35112, X составлял от 2 до 18)+спейсерная последовательность (SEQ ID NO: 23)+последовательность, обратно комплементарная нуклеотидной последовательности rX; tNos: терминатор гена нопалинсинтазы (SEQ ID NO: 24); Hpt: ген гигромицин фосфотрансферазы (SEQ ID NO: 25); LB: левая граница. Рекомбинантными экспрессионными векторами DBNR35112C2 в DBNR35112C18 трансформировали компетентные клетки E.coli T1 с помощью способа теплового шока, плазмиды экстрагировали щелочным способом.DBNR35112C2 recombinant expression vectors in DBNR35112C18 were constructed according to the above method and their vector structures were: Kan: kanamycin gene; RB: right border; pr35S: cauliflower mosaic virus 35S promoter (SEQ ID NO: 21); RX: rX nucleotide sequence (rX was the target X sequence of the c35112 target gene, X was 2 to 18) + spacer sequence (SEQ ID NO: 23) + reverse complementary sequence to the rX nucleotide sequence; tNos: nopaline synthase gene terminator (SEQ ID NO: 24); Hpt: hygromycin phosphotransferase gene (SEQ ID NO: 25); LB: left border. Recombinant expression vectors DBNR35112C2 into DBNR35112C18 were transformed into competent E. coli T1 cells using the heat shock method, plasmids were extracted by the alkaline method.

Пример 6: Трансформация Agrobacterium рекомбинантным экспрессионным векторомExample 6: Transformation of Agrobacterium with a Recombinant Expression Vector

Agrobacterium LBA4404 (Invitrgen, Чикаго, США, каталожный номер: 18313-015) были трансформированы правильно сконструированными рекомбинантными экспрессионными векторами от DBNR35112C1 до DBNR35112C18 с помощью способа с жидким азотом, в котором условиями трансформации были: 100 мкл ДНК Agrobacterium LBA4404, 3 мкл ДНК плазмиды (рекомбинантный экспрессионный вектор); помещали в жидкий азот в течение 10 минут, затем на теплую водяную баню при 37°C в течение 10 минут; трансформированные Agrobacterium LBA4404 инокулировали в тестовую пробирку с LB при температуре 28°C и скорости вращения 200 об./мин. в течение 2 часов, затем наносили на чашку с LB, содержащую 50 мкг/л рифампицина и 100 мкг/л канамицина, выращивали до получения положительного моноклона, моноклональную культуру отбирали и выделяли ее плазмиду, рекомбинантные экспрессионные векторы от DBNR35112C1 до DBNR35112C18 подвергали ферментному расщеплению с использованием ферментов рестрикции EcoRV и BamHI для проведения подтверждения расщепления ферментами, и результаты показали, что рекомбинантные экспрессионные векторы DBNR35112C1-DBNR35112C18 были полностью правильными.Agrobacterium LBA4404 (Invitrgen, Chicago, USA, catalog number: 18313-015) were transformed with properly designed recombinant expression vectors DBNR35112C1 to DBNR35112C18 using the liquid nitrogen method, in which the transformation conditions were: 100 µl Agrobacterium LBA4404 DNA, 3 µl plasmid DNA (recombinant expression vector); placed in liquid nitrogen for 10 minutes, then in a warm water bath at 37°C for 10 minutes; the transformed Agrobacterium LBA4404 was inoculated into the LB test tube at 28°C and 200 rpm. for 2 hours, then applied to a LB dish containing 50 μg/l rifampicin and 100 μg/l kanamycin, grown to obtain a positive monoclone, the monoclonal culture was selected and its plasmid isolated, recombinant expression vectors from DBNR35112C1 to DBNR35112C18 were subjected to enzymatic cleavage with using the restriction enzymes EcoRV and BamHI to perform enzyme digestion confirmation, and the results showed that the recombinant expression vectors DBNR35112C1-DBNR35112C18 were completely correct.

Пример 7: Получение трансгенных растений кукурузыExample 7 Production of Transgenic Maize Plants

Согласно общепринятому способу заражения Agrobacterium, незрелые зародыши выращиваемой в асептических условиях кукурузы сорта Z31 (Z31) совместно культивировали с трансформированными Agrobacterium, описанными в примере 6, для переноса Т-ДНК (включающей нуклеотидную последовательность RX, последовательность промотора вируса мозаики цветной капусты 35S, ген Hpt и последовательность терминатора Nos) из рекомбинантных экспрессионных векторов от DBNR35112C1 до DBNR35112C18, сконструированных в примере 5, в геном кукурузы, тем самым получая растения кукурузы с перенесенной нуклеотидной последовательностью RX (X был 1-18); одновременно в качестве контроля использовали растения кукурузы дикого типа.According to the conventional method of infecting Agrobacterium, immature embryos of aseptically grown Z31 (Z31) corn cultivars were co-cultured with the transformed Agrobacterium described in Example 6 for T-DNA transfer (comprising the RX nucleotide sequence, the Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter sequence, the Hpt gene and a Nos terminator sequence) from the recombinant expression vectors DBNR35112C1 to DBNR35112C18 constructed in Example 5 into the maize genome, thereby obtaining maize plants with a transferred RX nucleotide sequence (X was 1-18); at the same time, wild-type corn plants were used as controls.

Что касается трансформации кукурузы, опосредованной Agrobacterium, в кратком изложении, незрелые зародыши выделяли из кукурузы и незрелые зародыши контактировали с суспензией Agrobacterium, где Agrobacterium были способны доставлять нуклеотидную последовательность RX, по меньшей мере, к одной из клеток незрелого зародыша (этап 1: этап заражения). На этом этапе незрелые зародыши были предпочтительно погружены в суспензию Agrobacterium (OD 660=от 0,4 до 0,6, инфекционная среда (MS соль 4,3 г/л, MS витамин, казеин 300 мг/л, сахароза 68,5 г/л, глюкоза 36 г/л, ацетосирингон (AS) 40 мг/л, 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-D) 1 мг/, pH 5,3)) для начала инокуляции. Незрелые зародыши совместно культивировали с Agrobacterium в течение периода времени (3 суток) (этап 2: этап совместного культивирования). Предпочтительно, незрелые зародыши помещали в твердую среду (MS соль 4,3 г/л, MS витамины, казеин 300 мг/л, сахароза 20 г/л, глюкоза 10 г/л, ацетосирингон (AS) 100 мг/л, 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) 1 мг/л, агар 8 г/л, pH 5,8) после этапа заражения. После этого этапа совместного культивирования может быть необязательный этап «восстановления». На этапе «восстановления» среда восстановления (MS соль 4,3 г/л, MS витамины, казеин 300 мг/л, сахароза 30 г/л, 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-D) 1 мг/л, растительный гель 3 г/л, pH 5,8) содержала, по меньшей мере, один антибиотик (цефалоспорин), который, как известно, подавляет рост Agrobacterium, без добавления селективного агента для трансформанта растений (стадия 3: стадия восстановления). Предпочтительно, незрелые зародыши культивировали на твердой среде, содержащей антибиотик, но без селективного агента для уничтожения Agrobacterium и обеспечивали период восстановления для инфицированных клеток. Затем инокулированные незрелые зародыши культивировали на среде, содержащей селективный агент (гигромицин) и выбирали растущий трансформированный каллус (этап 4: этап селекции). Предпочтительно, незрелые зародыши культивировали на твердой среде (MS соль 4,3 г/л, MS витамины, казеин 300 мг/л, сахароза 30 г/л, гигромицин 50 мг/л, 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-D) 1 мг/л, растительный гель 3 г/л, pH 5,8), содержащей селективный агент, что приводит к селективному росту трансформированных клеток. Затем каллус регенерировали в растение (этап 5: этап регенерации). Предпочтительно, каллус, выращенный на среде, содержащей селективный агент, культивировали на твердых средах (среда для дифференцировки MS и среда для укоренения MS) для регенерации растения.With regard to Agrobacterium mediated transformation of maize, in brief, immature embryos were isolated from maize and immature embryos were contacted with an Agrobacterium suspension where the Agrobacterium were able to deliver the RX nucleotide sequence to at least one of the cells of the immature embryo (step 1: infection step ). At this stage, immature embryos were preferably immersed in Agrobacterium suspension (OD 660=0.4 to 0.6, infection medium (MS salt 4.3 g/l, MS vitamin, casein 300 mg/l, sucrose 68.5 g /l, glucose 36 g/l, acetosyringone (AS) 40 mg/l, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) 1 mg/, pH 5.3)) to start the inoculation. Immature embryos were co-cultured with Agrobacterium for a period of time (3 days) (step 2: co-culture step). Preferably, immature embryos are placed in solid medium (MS salt 4.3 g/l, MS vitamins, casein 300 mg/l, sucrose 20 g/l, glucose 10 g/l, acetosyringone (AS) 100 mg/l, 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) 1 mg/l, agar 8 g/l, pH 5.8) after the infection step. After this co-culture step, there may be an optional "recovery" step. At the “recovery” stage, recovery medium (MS salt 4.3 g/l, MS vitamins, casein 300 mg/l, sucrose 30 g/l, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) 1 mg/l, vegetable gel 3 g/l, pH 5.8) contained at least one antibiotic (cephalosporin) known to inhibit the growth of Agrobacterium without the addition of a plant transformant selective agent (step 3: recovery step). Preferably, immature embryos are cultured on a solid medium containing an antibiotic but without a selective agent to kill Agrobacterium and a recovery period is allowed for the infected cells. Then, the inoculated immature embryos were cultured on a medium containing a selective agent (hygromycin), and the growing transformed callus was selected (step 4: selection step). Preferably, immature embryos were cultured on a solid medium (MS salt 4.3 g/l, MS vitamins, casein 300 mg/l, sucrose 30 g/l, hygromycin 50 mg/l, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4- D) 1 mg/l, vegetable gel 3 g/l, pH 5.8) containing a selective agent, which results in the selective growth of the transformed cells. The callus was then regenerated into a plant (step 5: regeneration step). Preferably, the callus grown on the medium containing the selective agent is cultured on solid media (MS differentiation medium and MS rooting medium) to regenerate the plant.

Отобранные устойчивые каллусы переносили в среду для дифференцировки MS (MS соль 4,3 г/л, MS витамины, казеин 300 мг/л, сахароза 30 г/л, 6-бензиламинопурин 2 мг/л, гигромицин 50 мг/л, растительный гель 3 г/л, pH 5,8) и культивировали при 25°C для дифференцировки. Дифференцированные сеянцы переносили на среду для укоренения MS (MS соль 2,15 г/л, MS витамины, казеин 300 мг/л, сахароза 30 г/л, индол-3-уксусная кислота 1 мг/л, растительный гель 3 г/л, pH 5,8), культивировали при 25°C до высоты примерно 10 см, затем перемещали в теплицу и культивировали до плодоношения. В теплице продолжали выращивание при 28°C в течение 16 часов, а затем при 20°C в течение 8 часов в сутки.Selected resistant calli were transferred to MS differentiation medium (MS salt 4.3 g/l, MS vitamins, casein 300 mg/l, sucrose 30 g/l, 6-benzylaminopurine 2 mg/l, hygromycin 50 mg/l, vegetable gel 3 g/l, pH 5.8) and cultured at 25°C for differentiation. Differentiated seedlings were transferred to MS rooting medium (MS salt 2.15 g/l, MS vitamins, casein 300 mg/l, sucrose 30 g/l, indole-3-acetic acid 1 mg/l, vegetable gel 3 g/l , pH 5.8), cultivated at 25°C to a height of about 10 cm, then transferred to a greenhouse and cultivated until fruiting. In the greenhouse continued cultivation at 28°C for 16 hours, and then at 20°C for 8 hours a day.

Пример 8: Получение трансгенных растений соиExample 8: Production of transgenic soybean plants

Согласно общепринятому способу заражения Agrobacterium, ткань семядольного узла ткани стерильно культивируемого сорта сои Zhonghuang 13 совместно культивировали с трансформированными Agrobacterium, описанными в примере 6, для переноса Т-ДНК (включающей нуклеотидную последовательность RX, последовательность промотора вируса мозаики цветной капусты 35S, ген Hpt и последовательность терминатора Nos) из рекомбинантных экспрессионных векторов от DBNR35112C1 до DBNR35112C18 в геном сои, тем самым получая растения сои с перенесенной нуклеотидной последовательностью RX (X составляет 1-18); и одновременно в качестве контроля использовали растения сои дикого типа.According to the conventional Agrobacterium infection method, the cotyledon node tissue of the sterile cultured soybean variety Zhonghuang 13 was co-cultured with the transformed Agrobacterium described in Example 6 for T-DNA transfer (comprising the RX nucleotide sequence, the Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter sequence, the Hpt gene and the terminator Nos) from recombinant expression vectors DBNR35112C1 to DBNR35112C18 into the soybean genome, thereby obtaining soybean plants with a transferred RX nucleotide sequence (X is 1-18); and at the same time, wild-type soybean plants were used as controls.

Для трансформации сои, опосредованной Agrobacterium, в кратком изложении, зрелые семена сои проращивали в среде для проращивания сои (B5 соль 3,1 г/л, витамин B5, сахароза 20 г/л, агар 8 г/л, pH 5,6), Семена высевали на среду для проращивания и культивировали в следующих условиях: температура 25±1°С; фотопериод (свет/темнота) составил 16/8 часов. После 4-6 суток прорастания выбирали асептические всходы сои с увеличенными семядольными узлами ярко-зеленого цвета, срезали гипокотили на 3-4 мм ниже семядольных узлов, срезали семядоли продольно, затем удаляли верхушечные почки, боковые почки и корни семян. Снова использовали скальпель для ранения семядольного узла, и раненая ткань семядольного узла контактировала с суспензией Agrobacterium, где Agrobacterium могли передавать нуклеотидную последовательность RX в поврежденную ткань семядольного узла (Этап 1: этап заражения). На этом этапе ткань семядольного узла предпочтительно погружали в суспензию Agrobacterium (OD 660=от 0,5 до 0,8, инфекционная среда (MS соль 2,15 г/л, витамин B5, сахароза 20 г/л, глюкоза 10 г/л, ацетилсирингон (AS) 40 мг/л, 2-морфолинэтансульфоновая кислота (MES) г/л, зеатин (ZT) 2 мг/л, pH5,3) для начала инокуляции. Ткань семядольного узла и Agrobacterium совместно культивировали в течение определенного периода (3 суток) (Этап 2: Этап совместного культивирования). Предпочтительно, после этапа заражения ткань узла семядоли помещали в твердую среду (MS соль 4,3 г/л, витамин B5, сахароза 20 г/л, глюкоза 10 г/л, 2-морфолинэтансульфоновая кислота (MES) 4 г/л, зеатин 2 мг/л, агар 8 г/л, pH 5,6). После этой стадии совместного культивирования может быть необязательный этап «восстановления». На этапе «восстановления», восстановительная среда (B5 соль 3,1 г/л, витамины B5, 2-морфолинэтансульфоновая кислота (MES) 1 г/л, сахароза 30 г/л, зеатин (ZT) 2 мг/л, агар 8 г/л, цефалоспорин 150 мг/л, глутаминовая кислота 100 мг/л, аспарагиновая кислота 100 мг/л, pH 5,6) содержала, по меньшей мере, один антибиотик (цефалоспорин), который, как известно, ингибирует рост Agrobacterium, и не содержала селективный агент для трансформанта растений (стадия 3: стадия восстановления). Предпочтительно, регенерированную тканевую массу узла семядолей культивировали на твердой среде с антибиотиком, но без селективного агента, для уничтожения Agrobacterium и обеспечения периода восстановления инфицированных клеток. Затем регенерированную тканевую массу узла семядолей культивировали на среде, содержащей селективный агент (гигромицин), и выбирали растущий трансформированный каллус (этап 4: этап отбора). Предпочтительно, регенерированную тканевую массу узла семядолей культивировали на твердой среде для скрининга с селективным агентом (B5 соль 3,1 г/л, витамин B5, 2-морфолинэтансульфоновая кислота (MES) 1 г/л, сахароза 30 г/л, 6-бензиламинопурин (6-БАП) 1 мг/л, агар 8 г/л, цефалоспорин 150 мг/л, глутаминовая кислота 100 мг/л, аспарагиновая кислота 100 мг/л, гигромицин 50 мг/л, pH 5,6), что приводило к селективному росту трансформированной клетки. Затем трансформированная клетка была преобразована в растение (этап 5: этап регенерации); предпочтительно регенерированную тканевую массу семядольного узла, выращенную на среде, содержащей селективный агент, культивировали на твердых средах (среда для дифференцировки B5 и среда для укоренения B5) для регенерации растения.For Agrobacterium mediated transformation of soybean, in brief, mature soybean seeds were germinated in soybean germination medium (B5 salt 3.1 g/l, vitamin B5, sucrose 20 g/l, agar 8 g/l, pH 5.6) , Seeds were sown on the medium for germination and cultivated under the following conditions: temperature 25±1°C; photoperiod (light/dark) was 16/8 hours. After 4-6 days of germination, aseptic soybean seedlings with enlarged bright green cotyledon nodes were selected, hypocotyls were cut 3-4 mm below the cotyledon nodes, the cotyledons were cut longitudinally, then the apical buds, lateral buds and seed roots were removed. Again a scalpel was used to injure the cotyledon node, and the wounded tissue of the cotyledon node was contacted with a suspension of Agrobacterium, where Agrobacterium could transfer the RX nucleotide sequence to the injured tissue of the cotyledon node (Step 1: infection step). At this point, the cotyledon node tissue was preferably immersed in Agrobacterium suspension (OD 660=0.5 to 0.8, infectious medium (MS salt 2.15 g/l, vitamin B5, sucrose 20 g/l, glucose 10 g/l , acetylsyringone (AS) 40 mg/l, 2-morpholineethanesulfonic acid (MES) g/l, zeatin (ZT) 2 mg/l, pH5.3) to start inoculation Cotyledon node tissue and Agrobacterium were co-cultured for a certain period ( 3 days) (Step 2: Co-culture step) Preferably, after the infection step, the cotyledon node tissue was placed in solid medium (MS salt 4.3 g/l, vitamin B5, sucrose 20 g/l, glucose 10 g/l, 2 -morpholinethanesulfonic acid (MES) 4 g/l, zeatin 2 mg/l, agar 8 g/l, pH 5.6) After this co-culture step, there may be an optional "recovery" step. In the "recovery" step, reducing medium (B5 salt 3.1 g/l, vitamins B5, 2-morpholinethanesulfonic acid (MES) 1 g/l, sucrose 30 g/l, zeatin (ZT) 2 mg/l, agar 8 g/l, cephalosporin 150 mg/l l, glu tamic acid 100 mg/l, aspartic acid 100 mg/l, pH 5.6) contained at least one antibiotic (cephalosporin) known to inhibit the growth of Agrobacterium and did not contain a selective agent for the plant transformant (step 3: recovery stage). Preferably, the regenerated tissue mass of the cotyledon node was cultured on a solid medium with an antibiotic but no selective agent to kill Agrobacterium and allow the infected cells to recover. Then, the regenerated tissue mass of the cotyledon node was cultured on a medium containing a selective agent (hygromycin), and the growing transformed callus was selected (step 4: selection step). Preferably, the regenerated tissue mass of the cotyledon node was cultured on a solid screening medium with a selective agent (B5 salt 3.1 g/l, vitamin B5, 2-morpholineethanesulfonic acid (MES) 1 g/l, sucrose 30 g/l, 6-benzylaminopurine (6-BAP) 1 mg/l, agar 8 g/l, cephalosporin 150 mg/l, glutamic acid 100 mg/l, aspartic acid 100 mg/l, hygromycin 50 mg/l, pH 5.6), which resulted in selective growth of the transformed cell. Then, the transformed cell was transformed into a plant (step 5: regeneration step); preferably, the regenerated cotyledon node tissue mass grown on the medium containing the selective agent is cultured on solid media (B5 differentiation medium and B5 rooting medium) to regenerate the plant.

Отобранную устойчивую тканевую массу переносили на среду для дифференцировки В5 (B5 соль 3,1 г/л, витамины B5, 2-морфолинэтансульфоновая кислота (MES) 1 г/л, сахароза 30 г/л, зеатин (ZT) 1 мг/л, агар 8 г/л, цефалоспорин 150 мг/л, глутаминовая кислота 50 мг/л, аспарагиновая кислота 50 мг/л, гиббереллин 1 мг/л, ауксин 1 мг/л, гигромицин 50 мг/л, pH 5,6) и культивировали при 25°C для дифференцировки. Дифференцированные сеянцы переносили на среду для укоренения B5 (B5 соль 3,1 г/л, витамины B5, 2-морфолинэтансульфоновая кислота (MES) 1 г/л, сахароза 30 г/л, агар 8 г/л, цефалоспорин 150 мг/л, индол-3-масляная кислота (IBA) 1 мг/л), культивировали в среде для укоренения при 25°C до высоты примерно 10 см, переносили в теплицу и культивировали до плодоношения. В теплице выращивание проводили при 26°C в течение 16 часов, а затем при 20°C в течение 8 часов в сутки.The selected stable tissue mass was transferred to the B5 differentiation medium (B5 salt 3.1 g/l, vitamins B5, 2-morpholineethanesulfonic acid (MES) 1 g/l, sucrose 30 g/l, zeatin (ZT) 1 mg/l, agar 8 g/l, cephalosporin 150 mg/l, glutamic acid 50 mg/l, aspartic acid 50 mg/l, gibberellin 1 mg/l, auxin 1 mg/l, hygromycin 50 mg/l, pH 5.6) and cultured at 25°C for differentiation. Differentiated seedlings were transferred to B5 rooting medium (B5 salt 3.1 g/l, vitamins B5, 2-morpholineethanesulfonic acid (MES) 1 g/l, sucrose 30 g/l, agar 8 g/l, cephalosporin 150 mg/l , indole-3-butyric acid (IBA) 1 mg/l), cultivated in rooting medium at 25°C to a height of about 10 cm, transferred to a greenhouse and cultivated until fruiting. In the greenhouse, cultivation was carried out at 26°C for 16 hours and then at 20°C for 8 hours per day.

Пример 9: Подтверждение трансгенных растений кукурузы и сои посредством TaqManExample 9 Confirmation of transgenic corn and soybean plants by TaqMan

Приблизительно 100 мг листьев растений кукурузы с перенесенными нуклеотидными последовательностями RX (X составляло 1-18) брали раздельно в качестве образцов, и выделяли их геномную ДНК при помощи набора DNeasy Plant Maxi от Qiagen, соответственно, и количество копий нуклеотидных последовательностей RX определяли путем определения количества копий гена Hpt с помощью способа количественной ПЦР с флуоресцентным зондом Taqman. При этом растения кукурузы дикого типа использовали в качестве контроля и проводили детекцию и анализ в соответствии с вышеуказанными способами. Эксперимент повторяли 3 раза и брали среднее значение. Конкретный способ определения количества копий гена Hpt был следующим:Approximately 100 mg of leaves of corn plants with transferred RX nucleotide sequences (X was 1-18) were taken separately as samples, and their genomic DNA was isolated using the DNeasy Plant Maxi kit from Qiagen, respectively, and the copy number of RX nucleotide sequences was determined by quantitation copies of the Hpt gene using the Taqman fluorescent probe quantitative PCR method. Meanwhile, wild-type corn plants were used as a control, and detection and analysis were carried out in accordance with the above methods. The experiment was repeated 3 times and the average value was taken. The specific method for determining the number of copies of the Hpt gene was as follows:

Этап 901: 100 мг каждого листа растения кукурузы с перенесенной нуклеотидной последовательностью RX и дикого типа брали раздельно и измельчали до гомогената с жидким азотом в ступке, соответственно, и для каждого образца брали 3 повтора;Step 901: 100 mg of each leaf of corn plant with the transferred nucleotide sequence of RX and wild type were taken separately and ground to homogenate with liquid nitrogen in a mortar, respectively, and 3 repetitions were taken for each sample;

Этап 902: выделяли геномную ДНК вышеуказанного образца с использованием мини-набора DNeasy Plant от Qiagen, согласно руководству к продукту для конкретного способа;Step 902: Genomic DNA of the above sample was isolated using the DNeasy Plant mini kit from Qiagen, according to the method specific product manual;

Этап 903: Использовали NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) для измерения концентрации геномной ДНК вышеуказанного образца;Step 903: Used NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) to measure the concentration of genomic DNA of the above sample;

Этап 904: концентрация геномной ДНК вышеуказанного образца была скорректирована до одинакового значения концентрации, и диапазон значений составлял от 80 до 100 нг/мкл;Step 904: The concentration of the genomic DNA of the above sample was adjusted to the same concentration value, and the range of values was from 80 to 100 ng/µl;

Этап 905: Способ количественной ПЦР с флуоресцентным зондом Taqman применяли для определения количества копий образца, идентифицированный образец с известным количеством копий использовали в качестве стандартного продукта, и образец кукурузы дикого типа использовали в качестве контроля, для каждого образца было взято 3 повтора, и брали среднее значение.Step 905: The Taqman fluorescent probe quantitative PCR method was used to determine the number of copies of a sample, the identified sample with a known copy number was used as a standard product, and a wild-type corn sample was used as a control, 3 replicates were taken for each sample, and the average was taken. meaning.

Последовательности праймеров и зондов для флуоресцентной количественной ПЦР:Primer and probe sequences for fluorescent quantitative PCR:

следующие праймеры и зонды использовали для детекции нуклеотидной последовательности Hpt:The following primers and probes were used to detect the Hpt nucleotide sequence:

Праймер 1: cagggtgtcacgttgcaaga как показано в SEQ ID NO: 26 в списке последовательностей;Primer 1: cagggtgtcacgttgcaaga as shown in SEQ ID NO: 26 in the sequence listing;

Праймер 2: ccgctcgtctggctaagatc как показано в SEQ ID NO: 27 в списке последовательностей;Primer 2: ccgctcgtctggctaagatc as shown in SEQ ID NO: 27 in the sequence listing;

Зонд 1: tgcctgaaaccgaactgcccgctg как показано в SEQ ID NO: 28 в списке последовательностей;Probe 1: tgcctgaaaccgaactgcccgctg as shown in SEQ ID NO: 28 in the sequence listing;

Система для реакции ПЦР:System for PCR reaction:

JumpStart^™ Taq ReadyMix^™ (Sigma) - 10 мклJumpStart ^™ Taq ReadyMix ^™ (Sigma) - 10 µl

50× смесь праймер/зонд - 1 мкл50× primer/probe mix - 1 µl

Геномная ДНК - 3 мклGenomic DNA - 3 µl

Вода (ddH₂O) - 6 мклWater (ddH ₂ O) - 6 µl

50× смесь праймер/зонд содержала 45 мкл каждого праймера в концентрации 1 мМ, 50 мкл зонда в концентрации 100 мкМ, и 860 мкл буфера TE 1×, ее хранили в центрифужной пробирке при 4°C.The 50× primer/probe mixture contained 45 µl of each primer at 1 mM, 50 µl of probe at 100 µM, and 860 µl of 1× TE buffer, and was stored in a centrifuge tube at 4°C.

Условия реакции ПЦР:PCR reaction conditions:

ЭтапStage ТемператураTemperature ВремяTime 911911 95°C95°C 5 мин5 minutes 912912 95°C95°C 30 сек30 sec 913913 60°C60°C 1 мин1 minute 914914 Возвращение на этап 912, повторение в течение 40 цикловReturn to step 912, repeat for 40 cycles

Данные анализировали с использованием программного обеспечения SDS2.3 (Applied Biosystems).Data were analyzed using SDS2.3 software (Applied Biosystems).

Путем анализа экспериментальных результатов количества копий гена Hpt было подтверждено, что нуклеотидные последовательности RX были интегрированы в хромосому тестируемых растений кукурузы, соответственно, и однокопийные трансгенные растения кукурузы были получены из растений кукурузы с перенесенными нуклеотидными последовательностями RX (X составляло 1-18).By analyzing the experimental results of the number of copies of the Hpt gene, it was confirmed that the RX nucleotide sequences were integrated into the chromosome of the tested corn plants, respectively, and single-copy transgenic corn plants were obtained from corn plants with transferred RX nucleotide sequences (X was 1-18).

В соответствии с вышеописанным способом использования TaqMan для проверки трансгенных растений кукурузы, были детектированы и проанализированы трансгенные растения сои. Путем анализа экспериментальных результатов по количеству копий гена Hpt было подтверждено, что нуклеотидные последовательности RX были интегрированы в хромосому тестируемых растений сои, а однокопийные трансгенные растения сои были получены из растений сои с перенесенными нуклеотидными последовательностями RX (X составляло 1-18).In accordance with the above method of using TaqMan to test transgenic corn plants, transgenic soybean plants were detected and analyzed. By analyzing the experimental results on the number of copies of the Hpt gene, it was confirmed that the RX nucleotide sequences were integrated into the chromosome of the tested soybean plants, and single-copy transgenic soybean plants were obtained from soybean plants with transferred RX nucleotide sequences (X was 1-18).

Пример 10: Идентификация инсектицидного действия трансгенной кукурузы на Monolepta hieroglyphica.Example 10: Identification of the insecticidal effect of transgenic corn on Monolepta hieroglyphica.

Растения кукурузы, трансформированные с помощью нуклеотидных последовательностей RX (X составлял 1-18), тестировали на устойчивость к насекомым на Monolepta hieroglyphica.Maize plants transformed with the RX nucleotide sequences (X was 1-18) were tested for insect resistance on Monolepta hieroglyphica.

Этап 1001: Выбирали 10 растений каждого из однокопийных трансформантов кукурузы от DBNR35112C1 до DBNR35112C18 (RX-M), идентифицированных как положительные с помощью taqman, и 3 растения из трансформантов кукурузы (NGM1), идентифицированных как отрицательные с помощью taqman, соответственно; кукурузу дикого типа использовали одновременно в качестве контроля (СК1); и высаживали их в теплицу до стадии трилистника;Step 1001: 10 plants of each of the single copy corn transformants DBNR35112C1 to DBNR35112C18 (RX-M) identified as positive by taqman and 3 plants from the corn transformants (NGM1) identified as negative by taqman, respectively, were selected; wild-type corn was used simultaneously as a control (CK1); and planted them in a greenhouse to the stage of a shamrock;

Этап 1002: брали материалы, описанные в этапе 1001, с каждого саженца был взят третий нежный лист, разрезан на 1×2 см, чтобы удалить листовую пластинку главной жилки, и листовую пластинку выкладывали в чашке Петри, покрытой влажной фильтровальной бумагой;Step 1002: The materials described in Step 1001 were taken, a third tender leaf was taken from each seedling, cut into 1×2 cm to remove the lamina of the main vein, and the lamina was laid out in a Petri dish covered with moist filter paper;

Этап 1003: 10 недавно вылупившихся личинок Monolepta hieroglyphica с временем инкубации не более чем 24 часа помещали в каждую чашку Петри, и закрывали крышку чашки Петри, чашку Петри помещали в бокс для биопроб с увлажняющей марлей на дне, и бокс для биопроб помещали в камеру для биоанализа с температурой 24±2°C, с режимом день/ночь 24/0, и влажностью 70-80% (т.е. «биоанализ»);Step 1003: 10 newly hatched Monolepta hieroglyphica larvae with an incubation time of not more than 24 hours were placed in each Petri dish, and the lid of the Petri dish was closed, the Petri dish was placed in a bioassay box with moistening gauze at the bottom, and the bioassay box was placed in the chamber for bioassay with temperature 24±2°C, day/night 24/0, and humidity 70-80% (i.e. "bioassay");

Этап 1004: учитывая, что недавно вылупившиеся личинки Monolepta hieroglyphica были слабыми и склонными к механическим повреждениям, чашку Петри поддерживали как можно более неподвижной в течение суток инокуляции и первые сутки после инокуляции;Step 1004: Given that the newly hatched Monolepta hieroglyphica larvae were weak and prone to mechanical damage, the Petri dish was kept as still as possible during the day of inoculation and the first day after inoculation;

Этап 1005: с суток 2 инокуляции подсчитывали количество выживших Monolepta hieroglyphica снаружи чашки Петри каждые сутки до конца суток 16; выживших в чашке Петри Monolepta hieroglyphica переносили в чашку Петри со свежими листьями каждые 2 суток, и результаты экспериментов показаны в таблице 4.Step 1005: From day 2 of inoculation, the number of surviving Monolepta hieroglyphica outside the petri dish was counted every day until the end of day 16; Monolepta hieroglyphica survivors in the Petri dish were transferred to the Petri dish with fresh leaves every 2 days, and the results of the experiments are shown in Table 4.

Таблица 4. Экспериментальные результаты кормления Monolepta hieroglyphica листьями трансформантов кукурузыTable 4. Experimental results of feeding Monolepta hieroglyphica with leaves of maize transformants

Материал No.Material No. Коэффициент выживаемости of Monolepta hieroglyphica через каждые 2 суток после биоанализаSurvival rate of Monolepta hieroglyphica every 2 days after bioassay DAI2DAI2 DAI4DAI4 DAI6DAI6 DAI8DAI8 DAI10DAI10 DAI12DAI12 DAI14DAI14 DAI16DAI16 CK1CK1 100%±0%100%±0% 91%±4%91%±4% 92%±6%92%±6% 89%±5%89%±5% 82%±10%82%±10% 78%±9%78%±9% 76%±12%76%±12% 72%±10%72%±10% NGM1NGM1 100%±0%100%±0% 96%±0%96%±0% 92%±4%92%±4% 88%±4%88%±4% 83%±13%83%±13% 80%±10%80%±10% 78%±11%78%±11% 75%±9%75%±9% R1-MR1-M 100%±0%100%±0% 97%±4%97%±4% 98%±2%98%±2% 78%±8%78%±8% 64%±12%64%±12% 41%±11%41%±11% 32%±12%32%±12% 20%±11%20%±11% R2-MR2-M 100%±0%100%±0% 96%±5%96%±5% 92%±4%92%±4% 84%±6%84%±6% 66%±11%66%±11% 42%±10%42%±10% 33%±9%33%±9% 43%±10%43%±10% R3-MR3-M 100%±0%100%±0% 97%±4%97%±4% 87%±6%87%±6% 75%±8%75%±8% 63%±14%63%±14% 47%±14%47%±14% 33%±8%33%±8% 21%±12%21%±12% R4-MR4-M 100%±0%100%±0% 93%±4%93%±4% 87%±8%87%±8% 81%±6%81%±6% 65%±13%65%±13% 66%±12%66%±12% 41%±10%41%±10% 28%±10%28%±10% R5-MR5-M 100%±0%100%±0% 95%±3%95%±3% 88%±8%88%±8% 76%±12%76%±12% 62%±10%62%±10% 45%±10%45%±10% 31%±9%31%±9% 25%±10%25%±10% R6-MR6-M 100%±0%100%±0% 99%±1%99%±1% 96%±3%96%±3% 87%±8%87%±8% 65%±15%65%±15% 69%±9%69%±9% 52%±10%52%±10% 21%±11%21%±11% R7-MR7-M 100%±0%100%±0% 91%±5%91%±5% 93%±4%93%±4% 77%±10%77%±10% 62%±14%62%±14% 66%±12%66%±12% 54%±10%54%±10% 22%±13%22%±13% R8-MR8-M 100%±0%100%±0% 99%±2%99%±2% 92%±5%92%±5% 77%±11%77%±11% 72%±10%72%±10% 49%±10%49%±10% 36%±9%36%±9% 27%±10%27%±10% R9-MR9-M 100%±0%100%±0% 100%±0%100%±0% 98%±2%98%±2% 88%±9%88%±9% 72%±13%72%±13% 53%±11%53%±11% 30%±10%30%±10% 26%±9%26%±9% R10-MR10-M 100%±0%100%±0% 99%±2%99%±2% 99%±1%99%±1% 85%±10%85%±10% 67%±14%67%±14% 62%±12%62%±12% 52%±10%52%±10% 26%±10%26%±10% R11-MR11-M 100%±0%100%±0% 98%±2%98%±2% 92%±5%92%±5% 84%±9%84%±9% 73%±12%73%±12% 67%±10%67%±10% 38%±12%38%±12% 33%±15%33%±15% R12-MR12-M 100%±0%100%±0% 94%±4%94%±4% 90%±7%90%±7% 86%±10%86%±10% 68%±10%68%±10% 49%±9%49%±9% 44%±9%44%±9% 33%±10%33%±10% R13-MR13-M 100%±0%100%±0% 100%±0%100%±0% 94%±4%94%±4% 75%±10%75%±10% 60%±12%60%±12% 57%±10%57%±10% 39%±10%39%±10% 27%±10%27%±10% R14-MR14-M 100%±0%100%±0% 97%±2%97%±2% 87%±6%87%±6% 86%±12%86%±12% 61%±15%61%±15% 52%±12%52%±12% 36%±12%36%±12% 18%±12%18%±12% R15-MR15-M 100%±0%100%±0% 92%±5%92%±5% 90%±6%90%±6% 77%±12%77%±12% 69%±12%69%±12% 59%±10%59%±10% 45%±9%45%±9% 25%±10%25%±10% R16-MR16-M 100%±0%100%±0% 96%±2%96%±2% 89%±5%89%±5% 77%±11%77%±11% 75%±14%75%±14% 66%±11%66%±11% 51%±9%51%±9% 26%±9%26%±9% R17-MR17-M 100%±0%100%±0% 92%±3%92%±3% 91%±4%91%±4% 89%±9%89%±9% 71%±13%71%±13% 64%±12%64%±12% 37%±10%37%±10% 21%±10%21%±10% R18-MR18-M 100%±0%100%±0% 93%±4%93%±4% 90%±5%90%±5% 84%±10%84%±10% 75%±10%75%±10% 41%±10%41%±10% 58%±12%58%±12% 24%±9%24%±9%

Результаты экспериментов в таблице 4 показали, что растения кукурузы, трансформированные с помощью нуклеотидных последовательностей RX (X было от 1 до 18), имели хорошее ингибирующее действие на Monolepta hieroglyphica, и коэффициент выживаемости Monolepta hieroglyphica на Сутки 16 (коэффициент выживаемости=количество выживших насекомых/количество испытанных насекомых) составил примерно 30%.The results of the experiments in Table 4 showed that maize plants transformed with the RX nucleotide sequences (X was 1 to 18) had a good inhibitory effect on Monolepta hieroglyphica, and the survival rate of Monolepta hieroglyphica at Day 16 (survival rate=number of surviving insects/ the number of tested insects) was approximately 30%.

Пример 11: Определение инсектицидных эффектов трансгенной сои на Monolepta hieroglyphica.Example 11: Determination of insecticidal effects of transgenic soybean on Monolepta hieroglyphica.

Растения сои, трансформированные с помощью нуклеотидных последовательностей RX (X составлял 1-18), тестировали на устойчивость к насекомым на Monolepta hieroglyphica.Soybean plants transformed with RX nucleotide sequences (X was 1-18) were tested for insect resistance on Monolepta hieroglyphica.

Этап 1101: Выбирали 10 растений каждого из однокопийных трансформантов сои от DBNR35112C1 до DBNR35112C18 (RX-S), идентифицированных как положительные с помощью taqman, и 3 растения из трансформантов сои (NGM2), идентифицированных как отрицательные с помощью taqman, соответственно; сою дикого типа использовали одновременно в качестве контроля (СК2); и высаживали их в теплицу до выращивания трех настоящих листов;Step 1101: 10 plants each of single copy soybean transformants DBNR35112C1 to DBNR35112C18 (RX-S) identified as positive by taqman and 3 plants from soybean transformants (NGM2) identified as negative by taqman, respectively; wild-type soybean was used simultaneously as a control (CK2); and planted them in a greenhouse until three true leaves were grown;

Этап 1102: брали материалы, описанные в этапе 1101, от каждого проростка был взят кусок настоящего листа размером примерно 2×2 см и выкладывали в чашке Петри, покрытой влажной фильтровальной бумагой;Step 1102: the materials described in step 1101 were taken, a piece of true leaf measuring approximately 2×2 cm was taken from each seedling and laid out in a Petri dish covered with moist filter paper;

Этап 1103: 15 недавно вылупившихся личинок Monolepta hieroglyphica с временем инкубации не более, чем 24 часа помещали в каждую чашку, и закрывали крышку чашки Петри, чашку Петри помещали в бокс для биопроб с увлажняющей марлей на дне, и бокс для биопроб помещали в камеру для биоанализа с температурой 24±2°C, с режимом день/ночь 24/0, и влажностью 70-80%;Step 1103: 15 newly hatched Monolepta hieroglyphica larvae with an incubation time of not more than 24 hours were placed in each dish, and the lid of the Petri dish was closed, the Petri dish was placed in the bioassay box with moistening gauze at the bottom, and the bioassay box was placed in the chamber for bioassay with temperature 24±2°C, day/night mode 24/0, and humidity 70-80%;

Этап 1104: учитывая, что недавно вылупившиеся личинки Monolepta hieroglyphica были слабыми и склонными к механическим повреждениям, чашку Петри поддерживали как можно более неподвижной в течение суток инокуляции и первые сутки после инокуляции;Step 1104: given that the newly hatched Monolepta hieroglyphica larvae were weak and prone to mechanical damage, the petri dish was kept as still as possible during the day of inoculation and the first day after inoculation;

Этап 1105: с суток 2 инокуляции подсчитывали количество выживших Monolepta hieroglyphica снаружи чашки Петри каждые сутки до конца суток 16; выживших в чашке Петри Monolepta hieroglyphica переносили в чашку Петри со свежими листьями каждые 2 суток, и результаты экспериментов показаны в таблице 5.Step 1105: From day 2 of inoculation, the number of surviving Monolepta hieroglyphica outside the petri dish was counted every day until the end of day 16; Monolepta hieroglyphica survivors in the Petri dish were transferred to the Petri dish with fresh leaves every 2 days, and the results of the experiments are shown in Table 5.

Таблица 5. Экспериментальные результаты кормления Monolepta hieroglyphica листьями трансформантов соиTable 5. Experimental results of feeding Monolepta hieroglyphica with leaves of soybean transformants

Материал No.Material No. Коэффициент выживаемости Monolepta hieroglyphica
каждые два дня после биоанализаMonolepta hieroglyphica survival rate
every two days after bioassay DAI2DAI2 DAI4DAI4 DAI6DAI6 DAI8DAI8 DAI10DAI10 DAI12DAI12 DAI14DAI14 DAI16DAI16 CK2CK2 100%±0%100%±0% 91%±4%91%±4% 91%±5%91%±5% 88%±5%88%±5% 82%±10%82%±10% 78%±9%78%±9% 78%±12%78%±12% 75%±8%75%±8% NGM2NGM2 100%±0%100%±0% 96%±0%96%±0% 92%±4%92%±4% 88%±4%88%±4% 85%±10%85%±10% 81%±9%81%±9% 75%±10%75%±10% 73%±8%73%±8% R1-SR1-S 100%±0%100%±0% 98%±3%98%±3% 87%±5%87%±5% 83%±9%83%±9% 74%±6%74%±6% 65%±8%65%±8% 43%±10%43%±10% 25%±6%25%±6% R2-SR2-S 100%±0%100%±0% 99%±1%99%±1% 87%±4%87%±4% 79%±8%79%±8% 69%±8%69%±8% 56%±10%56%±10% 44%±9%44%±9% 18%±11%18%±11% R3-SR3-S 100%±0%100%±0% 96%±5%96%±5% 87%±6%87%±6% 81%±10%81%±10% 70%±16%70%±16% 62%±10%62%±10% 47%±12%47%±12% 23%±12%23%±12% R4-SR4-S 100%±0%100%±0% 97%±3%97%±3% 86%±8%86%±8% 79%±9%79%±9% 74%±12%74%±12% 56%±9%56%±9% 44%±8%44%±8% 20%±14%20%±14% R5-SR5-S 100%±0%100%±0% 100%±0%100%±0% 87%±9%87%±9% 82%±8%82%±8% 67%±9%67%±9% 50%±10%50%±10% 41%±10%41%±10% 24%±9%24%±9% R6-SR6-S 100%±0%100%±0% 99%±2%99%±2% 93%±7%93%±7% 83%±8%83%±8% 71%±9%71%±9% 60%±12%60%±12% 38%±6%38%±6% 21%±12%21%±12% R7-SR7-S 100%±0%100%±0% 99%±2%99%±2% 89%±8%89%±8% 85%±6%85%±6% 79%±10%79%±10% 64%±8%64%±8% 39%±10%39%±10% 27%±9%27%±9% R8-SR8-S 100%±0%100%±0% 96%±3%96%±3% 90%±6%90%±6% 83%±8%83%±8% 79%±10%79%±10% 54%±8%54%±8% 46%±9%46%±9% 25%±12%25%±12% R9-SR9-S 100%±0%100%±0% 96%±4%96%±4% 87%±8%87%±8% 80%±9%80%±9% 76%±8%76%±8% 58%±6%58%±6% 54%±6%54%±6% 20%±18%20%±18% R10-SR10-S 100%±0%100%±0% 96%±3%96%±3% 88%±9%88%±9% 85%±11%85%±11% 78%±6%78%±6% 65%±10%65%±10% 30%±12%30%±12% 27%±12%27%±12% R11-SR11-S 100%±0%100%±0% 96%±2%96%±2% 89%±8%89%±8% 84%±12%84%±12% 79%±5%79%±5% 50%±9%50%±9% 49%±8%49%±8% 21%±10%21%±10% R12-SR12-S 100%±0%100%±0% 97%±1%97%±1% 85%±10%85%±10% 78%±9%78%±9% 65%±9%65%±9% 59%±11%59%±11% 42%±10%42%±10% 27%±10%27%±10% R13-SR13-S 100%±0%100%±0% 95%±3%95%±3% 92%±8%92%±8% 83%±8%83%±8% 74%±10%74%±10% 63%±10%63%±10% 42%±11%42%±11% 27%±14%27%±14% R14-SR14-S 100%±0%100%±0% 98%±2%98%±2% 90%±8%90%±8% 84%±7%84%±7% 66%±9%66%±9% 52%±8%52%±8% 38%±12%38%±12% 20%±9%20%±9% R15-SR15-S 100%±0%100%±0% 96%±3%96%±3% 94%±6%94%±6% 78%±6%78%±6% 69%±10%69%±10% 57%±9%57%±9% 44%±12%44%±12% 16%±11%16%±11% R16-SR16-S 100%±0%100%±0% 95%±4%95%±4% 86%±10%86%±10% 87%±7%87%±7% 80%±12%80%±12% 59%±10%59%±10% 40%±9%40%±9% 22%±15%22%±15% R17-SR17-S 100%±0%100%±0% 99%±1%99%±1% 94%±9%94%±9% 83%±6%83%±6% 75%±10%75%±10% 66%±9%66%±9% 41%±13%41%±13% 20%±13%20%±13% R18-SR18-S 100%±0%100%±0% 97%±3%97%±3% 92%±8%92%±8% 89%±4%89%±4% 82%±9%82%±9% 52%±7%52%±7% 44%±8%44%±8% 34%±12%34%±12%

Результаты экспериментов в таблице 5 показали, что растения сои, трансформированные с помощью нуклеотидных последовательностей RX (X было от 1 до 18), имели хорошее ингибирующее действие на Monolepta hieroglyphica, и коэффициент выживаемости Monolepta hieroglyphica на Сутки 16 (коэффициент выживаемости=количество выживших насекомых/количество тестируемых насекомых) составил не более 35%.The results of the experiments in Table 5 showed that soybean plants transformed with RX nucleotide sequences (X was 1 to 18) had a good inhibitory effect on Monolepta hieroglyphica, and Monolepta hieroglyphica survival rate at Day 16 (survival rate=number of surviving insects/ the number of tested insects) was no more than 35%.

Пример 12: КомпозицияExample 12: Composition

Формула приемлемого носителя для пестицида с дцРНК (система 1 л): 50 мМ NaHPO4 (pH7,0), 10 мМ β-меркаптоэтанол, 10 мМ ЭДТА, 0,1% (массовая доля) натрий цэтил сульфонат, 0,1% (массовая доля) простой эфир полиэтиленгликоль октилфенила, с добавлением H₂O до 1 л.Acceptable carrier formula for dsRNA pesticide (1 L system): 50 mM NaHPO4 (pH7.0), 10 mM β-mercaptoethanol, 10 mM EDTA, 0.1% (w/w) sodium cethyl sulfonate, 0.1% (w/w) share) polyethylene glycol ether of octylphenyl, with the addition of H ₂ O to 1 l.

Вышеупомянутая формула была формулой буфера, и требовалось только напрямую добавить любую очищенную дцРНК в буфер, при условии, что конечная концентрация удовлетворяет требованиям, таким как 50 мг/л. Его также можно было бы подготовить в виде концентрированного состава по мере необходимости.The above formula was a buffer formula, and it was only required to directly add any purified dsRNA to the buffer, provided that the final concentration satisfies the requirement, such as 50 mg/L. It could also be prepared as a concentrated formulation as required.

Таким образом, настоящее изобретение относится впервые к гену-мишени c35112 и его целевой последовательности для борьбы с жесткокрылыми насекомыми-вредителями Monolepta hieroglyphica, и трансгенным растениям (кукуруза и соя), полученным по технологии РНКи; в трансгенные растения вводят с последовательность дцРНК, образованную целевой последовательностью, и они могут контролировать вторжение Monolepta hieroglyphica, они эффективны и специфичны и могут избегать риска, такого как то, что Monolepta hieroglyphica генерирует устойчивость к белкам токсина Bt. При этом они обладают хорошей экологичностью, удобством и низкой стоимостью.Thus, the present invention relates for the first time to the target gene c35112 and its target sequence for the control of beetle insect pests Monolepta hieroglyphica, and transgenic plants (corn and soybeans) obtained by RNAi technology; transgenic plants are introduced with a dsRNA sequence formed by the target sequence, and they can control the invasion of Monolepta hieroglyphica, they are efficient and specific, and can avoid the risk such that Monolepta hieroglyphica generates resistance to Bt toxin proteins. At the same time, they have good environmental friendliness, convenience and low cost.

Наконец, следует отметить, что приведенные выше примеры используются только для иллюстрации технических решений по настоящему изобретению, а не для их ограничения. Хотя настоящее изобретение было описано в деталях со ссылкой на предпочтительные примеры, специалисты в данной области должны понимать, что технические решения по настоящему изобретению могут быть подвергнуты модификации или эквивалентным заменам без отступления от сущности и объема технических решений по настоящему изобретению.Finally, it should be noted that the above examples are used only to illustrate the technical solutions of the present invention and not to limit them. Although the present invention has been described in detail with reference to preferred examples, those skilled in the art should understand that the technical solutions of the present invention may be subject to modification or equivalent substitutions without departing from the spirit and scope of the technical solutions of the present invention.

--->--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ SEQUENCE LIST

<110>BEIJING DABEINONG BIOTECHNOLOGY CO., LTD.<110>BEIJING DABEINONG BIOTECHNOLOGY CO., LTD.

<120>Полинуклеотид и способ борьбы с вторжением насекомых<120>Polynucleotide and insect control method

<130>IEC190006PCT<130>IEC190006PCT

<150>CN 201810550207.4<150>CN 201810550207.4

<151>2018-05-31<151>2018-05-31

<160>31<160>31

<170>SIPOSequenceListing 1.0<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1<210>1

<211>2994<211>2994

<212>ДНК<212>DNA

<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica

<400>1<400>1

caagagccac gtataaaaca aggttacaga ttttggacaa ctcaaaaaat agtgatgtgt 60caagagccac gtataaaaca aggttacaga ttttggacaa ctcaaaaaat agtgatgtgt 60

ttataattcg tgtcatttca agaagattaa acaaaaattg ctggataata acccttaaaa 120ttataattcg tgtcatttca agaagattaa acaaaaattg ctggataata acccttaaaa 120

atgccacttc gattagatat aaagagaagg ctaacagccc gttcagaccg ggttaaatgc 180atgccacttc gattagatat aaagagaagg ctaacagccc gttcagaccg ggttaaatgc 180

gtggatcttc atccgacaga accctggatg ttatgttctc tgtacagtgg aaatataaat 240gtggatcttc atccgacaga accctggatg ttatgttctc tgtacagtgg aaatataaat 240

gtctggaata ctgaaaatca acaactggtt aaaacttttg aagtatgtga catacctgtt 300gtctggaata ctgaaaatca acaactggtt aaaacttttg aagtatgtga catacctgtt 300

agagctgcaa agtttgtacc tagaaagaac tggattgtca gtggttcaga tgatatgcag 360agagctgcaa agtttgtacc tagaaagaac tggattgtca gtggttcaga tgatatgcag 360

ataagagttt ttaactacaa tacactagac agggtacact ctttcgaagc ccattcagat 420ataagagttt ttaactacaa tacactagac agggtacact ctttcgaagc ccattcagat 420

tatgtgaggt ctattgtggt acatccaaca caaccatata ttttaacaag tagtgatgat 480tatgtgaggt ctattgtggt acatccaaca caaccatata ttttaacaag tagtgatgat 480

atgcttatca aactgtggaa ctgggaaaag gcatgggctt gtcagcaagt gtttgaagga 540atgcttatca aactgtggaa ctgggaaaag gcatgggctt gtcagcaagt gtttgaagga 540

catactcatt atattatgca aattgcaata aatcccaaag acaacaatac atttgccagt 600catactcatt atattatgca aattgcaata aatcccaaag acaacaatac atttgccagt 600

gcatctctag atagaacatt aaaagtgtgg cagctaggtg catcaacagc taacttcact 660gcatctctag atagaacatt aaaagtgtgg cagctaggtg catcaacagc taacttcact 660

cttgaagggc atgagaaagg tgtcaattgt gtagactact accacggagg tgataaaccc 720cttgaagggc atgagaaagg tgtcaattgt gtagactact accacgggagg tgataaaccc 720

tatataatat caggagccga tgataggttg gtcaaaatct gggattacca aaataaaaca 780tatataatat caggagccga tgataggttg gtcaaaatct gggattacca aaataaaaca 780

tgtgttcaaa ccttagaagg acatggtcaa aatgttactg ctgtcttttt ccatccagaa 840tgtgttcaaa ccttagaagg acatggtcaa aatgttactg ctgtcttttt ccatccagaa 840

cttccagttg ctcttacggg aagtgaagat ggtacagtga gaatatggca tgcaaatacc 900cttccagttg ctcttacggg aagtgaagat ggtacagtga gaatatggca tgcaaatacc 900

catcgactgg aaagtacctt aaattatgga tttgaaaggg tttggaccat ttgttgctta 960catcgactgg aaagtacctt aaattatgga tttgaaaggg tttggaccat ttgttgctta 960

aaaggaagta ataatgtggc attgggttat gacgagggta gtattcttgt taaagttggt 10201020

agagaagaac cagctgttag tatggatgcc agtggtggta aaattatttg ggctaggcac 1080agagaagaac cagctgttag tatggatgcc agtggtggta aaattatttg ggctaggcac 1080

tcagaactcc aacaagccaa tcttaaggca ttgcctgaag gtgctgaaat aaaagatgga 1140tcagaactcc aacaagccaa tcttaaggca ttgcctgaag gtgctgaaat aaaagatgga 1140

gaacgacttc cagtatctgt aaaggatatg ggtgcctgtg aaatctatcc tcaaaccatt 1200gaacgacttc cagtatctgt aaaggatatg ggtgcctgtg aaatctatcc tcaaaccatt 1200

caacacaatc ccaatggtcg ttttgtagtt gtgtgtggag atggtgaata tataatttac 1260caacacaatc ccaatggtcg ttttgtagtt gtgtgtggag atggtgaata tataatttac 1260

actgccatgg ccttacgtaa caaagcattt ggaagtgcac aagaattcgt ttgggcccaa 1320actgccatgg ccttacgtaa caaagcattt ggaagtgcac aagaattcgt ttgggcccaa 1320

gattctagtg aatatgctat tagagaatca ggatctacta taaggatatt taaaaatttc 1380gattctagtg aatatgctat tagagaatca ggatctacta taaggatatt taaaaatttc 1380

aaagaaaaga aaaatttcaa gtctgatttt ggagctgaag gtatatatgg gggttacctt 1440aaagaaaaga aaaatttcaa gtctgatttt ggagctgaag gtatatatgg gggttacctt 1440

ttgggagtca aatctgtttc tgggttaact ttctatgatt gggatacact tgatttggtt 1500ttgggagtca aatctgtttc tgggttaact ttctatgatt gggatacact tgatttggtt 1500

agaaggattg agatacaacc aaaagctgtc tattggtcag atagtggaaa gttggtatgt 1560agaaggattg agatacaacc aaaagctgtc tattggtcag atagtggaaa gttggtatgt 1560

ttggccaccg aagatagtta ttttatttta tcatatgatg ctgatgaagt gcaaaaagct 1620ttggccaccg aagatagtta ttttatttta tcatatgatg ctgatgaagt gcaaaaagct 1620

aaagataata atcaagttgc tgacgatggt gtggaatctg cattcaacct tttaggagaa 1680aaagataata atcaagttgc tgacgatggt gtggaatctg cattcaacct tttaggagaa 1680

atcaacgaat ctgttagaac aggcctatgg gtaggtgatt gtttcatcta cacaaatgct 1740atcaacgaat ctgttagaac aggcctatgg gtaggtgatt gtttcatcta cacaaatgct 1740

gtgaatcgta tcaattactt tgtaggaggt gaactagtaa ctatcgcaca cttggatcgt 1800gtgaatcgta tcaattactt tgtaggaggt gaactagtaa ctatcgcaca cttggatcgt 1800

ccattgtacg tcttgggtta tgtgcccaaa gacgatcgtt tgtatctagt agataaagag 1860ccattgtacg tcttgggtta tgtgcccaaa gacgatcgtt tgtatctagt agataaagag 1860

ttacgagttg tcagctacca attgcttctt tcagtactcg aatatcagac agctgttatg 1920ttacgagttg tcagctacca attgcttctt tcagtactcg aatatcagac agctgttatg 1920

aggagggact tcccaacagc agatagagta ctaccgtcta tacctaaaga gcacagaaca 1980aggagggact tcccaacagc agatagagta ctaccgtcta tacctaaaga gcacagaaca 1980

agggtagcac atttcttaga aaagcaaggt tttaaacaac aagctttagc tgtaagttcc 2040agggtagcac atttcttaga aaagcaaggt tttaaacaac aagctttagc tgtaagttcc 2040

gatcccgaac atagattcga actcgctgtg gcattagaag acctgaatac agctaaaatt 2100gatcccgaac atagattcga actcgctgtg gcattagaag acctgaatac agctaaaatt 2100

ctagcacaag aggctaacaa tccacaaaag tggagccaat tagctgatct agctgctggc 2160ctagcacaag aggctaacaa tccacaaaag tggagccaat tagctgatct agctgctggc 2160

acaaataatg tagaactagc aaaagaatgc atgcagaaag cccaagattt tggtggatta 2220acaaataatg tagaactagc aaaagaatgc atgcagaaag cccaagattt tggtggatta 2220

ttacttctag ccactagttc gggagatgaa tcattagtcc gtacattagg tgaaacaaca 2280ttacttctag ccactagttc gggagatgaa tcattagtcc gtacattagg tgaaacaaca 2280

caagctgagg gcaaacataa tttagccttc ctttctcatt tcttggtagg agatttagac 2340caagctgagg gcaaacataa tttagccttc ctttctcatt tcttggtagg agatttagac 2340

aagtgtctag atattttagt aagtacagga aggttgccag aagctgcgtt tttcgccaga 2400aagtgtctag atattttagt aagtacagga aggttgccag aagctgcgtt tttcgccaga 2400

tcttatcttc ccgataaaat ttctgaagtt gtagaattgt ggaggacaca attatcaact 2460tcttatcttc ccgataaaat ttctgaagtt gtagaattgt ggaggacaca attatcaact 2460

ataaatcaaa aagccggaca aagtttagcc gatcctaaaa attatgaaaa tctatttccc 2520ataaatcaaa aagccggaca aagtttagcc gatcctaaaa attatgaaaa tctatttccc 2520

ggtcttcaac aagcattgtc ggcacagaaa tttttggaac agaacaaaca gttgccacct 2580ggtcttcaac aagcattgtc ggcacagaaa tttttggaac agaacaaaca gttgccacct 2580

gcatttatgg ctccttctat tgttcccaac caagatagaa atgttatagc cgaagcggag 2640gcatttatgg ctccttctat tgttcccaac caagatagaa atgttatagc cgaagcggag 2640

gcacagttaa agaatagtgg aacttcatca aatttgttca gtgccccacc ttcagcagaa 2700gcacagttaa agaatagtgg aacttcatca aatttgttca gtgccccacc ttcagcagaa 2700

acttctagga atgttataga atcagtacca caaaataagc cctcagaaga tttatcaaac 2760acttctagga atgttataga atcagtacca caaaataagc cctcagaaga tttatcaaac 2760

agggtgttat tagatcaaga tgatgatgat gacatagact tggatttgga tggcgtcaat 2820agggtgttat tagatcaaga tgatgatgat gacatagact tggatttgga tggcgtcaat 2820

attgacgata acatcgatac aactgatatc aacttggatg atgatttgct gagtgattaa 2880attgacgata acatcgatac aactgatatc aacttggatg atgatttgct gagtgattaa 2880

aaataacttt ttttactatt ttagtattaa tctgtatatt attcattcct aatttttaag 2940aaataacttt ttttactatt ttagtattaa tctgtatatt attcattcct aatttttaag 2940

aaaataaatt atgtaagata atgttttatt aactaaaata tggtaattca aaac 2994aaaataaatt atgtaagata atgttttatt aactaaaata tggtaattca aaac 2994

<210>2<210>2

<211>919<211>919

<212>Белок<212>Protein

<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica

<400>2<400>2

Met Pro Leu Arg Leu Asp Ile Lys Arg Arg Leu Thr Ala Arg Ser AspMet Pro Leu Arg Leu Asp Ile Lys Arg Arg Leu Thr Ala Arg Ser Asp

1 5 10 15 1 5 10 15

Arg Val Lys Cys Val Asp Leu His Pro Thr Glu Pro Trp Met Leu CysArg Val Lys Cys Val Asp Leu His Pro Thr Glu Pro Trp Met Leu Cys

20 25 30 20 25 30

Ser Leu Tyr Ser Gly Asn Ile Asn Val Trp Asn Thr Glu Asn Gln GlnSer Leu Tyr Ser Gly Asn Ile Asn Val Trp Asn Thr Glu Asn Gln Gln

35 40 45 35 40 45

Leu Val Lys Thr Phe Glu Val Cys Asp Ile Pro Val Arg Ala Ala LysLeu Val Lys Thr Phe Glu Val Cys Asp Ile Pro Val Arg Ala Ala Lys

50 55 60 50 55 60

Phe Val Pro Arg Lys Asn Trp Ile Val Ser Gly Ser Asp Asp Met GlnPhe Val Pro Arg Lys Asn Trp Ile Val Ser Gly Ser Asp Asp Met Gln

65 70 75 8065 70 75 80

Ile Arg Val Phe Asn Tyr Asn Thr Leu Asp Arg Val His Ser Phe GluIle Arg Val Phe Asn Tyr Asn Thr Leu Asp Arg Val His Ser Phe Glu

85 90 95 85 90 95

Ala His Ser Asp Tyr Val Arg Ser Ile Val Val His Pro Thr Gln ProAla His Ser Asp Tyr Val Arg Ser Ile Val Val His Pro Thr Gln Pro

100 105 110 100 105 110

Tyr Ile Leu Thr Ser Ser Asp Asp Met Leu Ile Lys Leu Trp Asn TrpTyr Ile Leu Thr Ser Asp Asp Met Leu Ile Lys Leu Trp Asn Trp

115 120 125 115 120 125

Glu Lys Ala Trp Ala Cys Gln Gln Val Phe Glu Gly His Thr His TyrGlu Lys Ala Trp Ala Cys Gln Gln Val Phe Glu Gly His Thr His Tyr

130 135 140 130 135 140

Ile Met Gln Ile Ala Ile Asn Pro Lys Asp Asn Asn Thr Phe Ala SerIle Met Gln Ile Ala Ile Asn Pro Lys Asp Asn Asn Thr Phe Ala Ser

145 150 155 160145 150 155 160

Ala Ser Leu Asp Arg Thr Leu Lys Val Trp Gln Leu Gly Ala Ser ThrAla Ser Leu Asp Arg Thr Leu Lys Val Trp Gln Leu Gly Ala Ser Thr

165 170 175 165 170 175

Ala Asn Phe Thr Leu Glu Gly His Glu Lys Gly Val Asn Cys Val AspAla Asn Phe Thr Leu Glu Gly His Glu Lys Gly Val Asn Cys Val Asp

180 185 190 180 185 190

Tyr Tyr His Gly Gly Asp Lys Pro Tyr Ile Ile Ser Gly Ala Asp AspTyr Tyr His Gly Gly Asp Lys Pro Tyr Ile Ile Ser Gly Ala Asp Asp

195 200 205 195 200 205

Arg Leu Val Lys Ile Trp Asp Tyr Gln Asn Lys Thr Cys Val Gln ThrArg Leu Val Lys Ile Trp Asp Tyr Gln Asn Lys Thr Cys Val Gln Thr

210 215 220 210 215 220

Leu Glu Gly His Gly Gln Asn Val Thr Ala Val Phe Phe His Pro GluLeu Glu Gly His Gly Gln Asn Val Thr Ala Val Phe Phe His Pro Glu

225 230 235 240225 230 235 240

Leu Pro Val Ala Leu Thr Gly Ser Glu Asp Gly Thr Val Arg Ile TrpLeu Pro Val Ala Leu Thr Gly Ser Glu Asp Gly Thr Val Arg Ile Trp

245 250 255 245 250 255

His Ala Asn Thr His Arg Leu Glu Ser Thr Leu Asn Tyr Gly Phe GluHis Ala Asn Thr His Arg Leu Glu Ser Thr Leu Asn Tyr Gly Phe Glu

260 265 270 260 265 270

Arg Val Trp Thr Ile Cys Cys Leu Lys Gly Ser Asn Asn Val Ala LeuArg Val Trp Thr Ile Cys Cys Leu Lys Gly Ser Asn Asn Val Ala Leu

275 280 285 275 280 285

Gly Tyr Asp Glu Gly Ser Ile Leu Val Lys Val Gly Arg Glu Glu ProGly Tyr Asp Glu Gly Ser Ile Leu Val Lys Val Gly Arg Glu Glu Pro

290 295 300 290 295 300

Ala Val Ser Met Asp Ala Ser Gly Gly Lys Ile Ile Trp Ala Arg HisAla Val Ser Met Asp Ala Ser Gly Gly Lys Ile Ile Trp Ala Arg His

305 310 315 320305 310 315 320

Ser Glu Leu Gln Gln Ala Asn Leu Lys Ala Leu Pro Glu Gly Ala GluSer Glu Leu Gln Gln Ala Asn Leu Lys Ala Leu Pro Glu Gly Ala Glu

325 330 335 325 330 335

Ile Lys Asp Gly Glu Arg Leu Pro Val Ser Val Lys Asp Met Gly AlaIle Lys Asp Gly Glu Arg Leu Pro Val Ser Val Lys Asp Met Gly Ala

340 345 350 340 345 350

Cys Glu Ile Tyr Pro Gln Thr Ile Gln His Asn Pro Asn Gly Arg PheCys Glu Ile Tyr Pro Gln Thr Ile Gln His Asn Pro Asn Gly Arg Phe

355 360 365 355 360 365

Val Val Val Cys Gly Asp Gly Glu Tyr Ile Ile Tyr Thr Ala Met AlaVal Val Val Cys Gly Asp Gly Glu Tyr Ile Ile Tyr Thr Ala Met Ala

370 375 380 370 375 380

Leu Arg Asn Lys Ala Phe Gly Ser Ala Gln Glu Phe Val Trp Ala GlnLeu Arg Asn Lys Ala Phe Gly Ser Ala Gln Glu Phe Val Trp Ala Gln

385 390 395 400385 390 395 400

Asp Ser Ser Glu Tyr Ala Ile Arg Glu Ser Gly Ser Thr Ile Arg IleAsp Ser Ser Glu Tyr Ala Ile Arg Glu Ser Gly Ser Thr Ile Arg Ile

405 410 415 405 410 415

Phe Lys Asn Phe Lys Glu Lys Lys Asn Phe Lys Ser Asp Phe Gly AlaPhe Lys Asn Phe Lys Glu Lys Lys Asn Phe Lys Ser Asp Phe Gly Ala

420 425 430 420 425 430

Glu Gly Ile Tyr Gly Gly Tyr Leu Leu Gly Val Lys Ser Val Ser GlyGlu Gly Ile Tyr Gly Gly Tyr Leu Leu Gly Val Lys Ser Val Ser Gly

435 440 445 435 440 445

Leu Thr Phe Tyr Asp Trp Asp Thr Leu Asp Leu Val Arg Arg Ile GluLeu Thr Phe Tyr Asp Trp Asp Thr Leu Asp Leu Val Arg Arg Ile Glu

450 455 460 450 455 460

Ile Gln Pro Lys Ala Val Tyr Trp Ser Asp Ser Gly Lys Leu Val CysIle Gln Pro Lys Ala Val Tyr Trp Ser Asp Ser Gly Lys Leu Val Cys

465 470 475 480465 470 475 480

Leu Ala Thr Glu Asp Ser Tyr Phe Ile Leu Ser Tyr Asp Ala Asp GluLeu Ala Thr Glu Asp Ser Tyr Phe Ile Leu Ser Tyr Asp Ala Asp Glu

485 490 495 485 490 495

Val Gln Lys Ala Lys Asp Asn Asn Gln Val Ala Asp Asp Gly Val GluVal Gln Lys Ala Lys Asp Asn Asn Gln Val Ala Asp Asp Gly Val Glu

500 505 510 500 505 510

Ser Ala Phe Asn Leu Leu Gly Glu Ile Asn Glu Ser Val Arg Thr GlySer Ala Phe Asn Leu Leu Gly Glu Ile Asn Glu Ser Val Arg Thr Gly

515 520 525 515 520 525

Leu Trp Val Gly Asp Cys Phe Ile Tyr Thr Asn Ala Val Asn Arg IleLeu Trp Val Gly Asp Cys Phe Ile Tyr Thr Asn Ala Val Asn Arg Ile

530 535 540 530 535 540

Asn Tyr Phe Val Gly Gly Glu Leu Val Thr Ile Ala His Leu Asp ArgAsn Tyr Phe Val Gly Gly Glu Leu Val Thr Ile Ala His Leu Asp Arg

545 550 555 560545 550 555 560

Pro Leu Tyr Val Leu Gly Tyr Val Pro Lys Asp Asp Arg Leu Tyr LeuPro Leu Tyr Val Leu Gly Tyr Val Pro Lys Asp Asp Arg Leu Tyr Leu

565 570 575 565 570 575

Val Asp Lys Glu Leu Arg Val Val Ser Tyr Gln Leu Leu Leu Ser ValVal Asp Lys Glu Leu Arg Val Val Ser Tyr Gln Leu Leu Leu Ser Val

580 585 590 580 585 590

Leu Glu Tyr Gln Thr Ala Val Met Arg Arg Asp Phe Pro Thr Ala AspLeu Glu Tyr Gln Thr Ala Val Met Arg Arg Asp Phe Pro Thr Ala Asp

595 600 605 595 600 605

Arg Val Leu Pro Ser Ile Pro Lys Glu His Arg Thr Arg Val Ala HisArg Val Leu Pro Ser Ile Pro Lys Glu His Arg Thr Arg Val Ala His

610 615 620 610 615 620

Phe Leu Glu Lys Gln Gly Phe Lys Gln Gln Ala Leu Ala Val Ser SerPhe Leu Glu Lys Gln Gly Phe Lys Gln Gln Ala Leu Ala Val Ser Ser

625 630 635 640625 630 635 640

Asp Pro Glu His Arg Phe Glu Leu Ala Val Ala Leu Glu Asp Leu AsnAsp Pro Glu His Arg Phe Glu Leu Ala Val Ala Leu Glu Asp Leu Asn

645 650 655 645 650 655

Thr Ala Lys Ile Leu Ala Gln Glu Ala Asn Asn Pro Gln Lys Trp SerThr Ala Lys Ile Leu Ala Gln Glu Ala Asn Asn Pro Gln Lys Trp Ser

660 665 670 660 665 670

Gln Leu Ala Asp Leu Ala Ala Gly Thr Asn Asn Val Glu Leu Ala LysGln Leu Ala Asp Leu Ala Ala Gly Thr Asn Asn Val Glu Leu Ala Lys

675 680 685 675 680 685

Glu Cys Met Gln Lys Ala Gln Asp Phe Gly Gly Leu Leu Leu Leu AlaGlu Cys Met Gln Lys Ala Gln Asp Phe Gly Gly Leu Leu Leu Leu Ala

690 695 700 690 695 700

Thr Ser Ser Gly Asp Glu Ser Leu Val Arg Thr Leu Gly Glu Thr ThrThr Ser Ser Gly Asp Glu Ser Leu Val Arg Thr Leu Gly Glu Thr Thr

705 710 715 720705 710 715 720

Gln Ala Glu Gly Lys His Asn Leu Ala Phe Leu Ser His Phe Leu ValGln Ala Glu Gly Lys His Asn Leu Ala Phe Leu Ser His Phe Leu Val

725 730 735 725 730 735

Gly Asp Leu Asp Lys Cys Leu Asp Ile Leu Val Ser Thr Gly Arg LeuGly Asp Leu Asp Lys Cys Leu Asp Ile Leu Val Ser Thr Gly Arg Leu

740 745 750 740 745 750

Pro Glu Ala Ala Phe Phe Ala Arg Ser Tyr Leu Pro Asp Lys Ile SerPro Glu Ala Ala Phe Phe Ala Arg Ser Tyr Leu Pro Asp Lys Ile Ser

755 760 765 755 760 765

Glu Val Val Glu Leu Trp Arg Thr Gln Leu Ser Thr Ile Asn Gln LysGlu Val Val Glu Leu Trp Arg Thr Gln Leu Ser Thr Ile Asn Gln Lys

770 775 780 770 775 780

Ala Gly Gln Ser Leu Ala Asp Pro Lys Asn Tyr Glu Asn Leu Phe ProAla Gly Gln Ser Leu Ala Asp Pro Lys Asn Tyr Glu Asn Leu Phe Pro

785 790 795 800785 790 795 800

Gly Leu Gln Gln Ala Leu Ser Ala Gln Lys Phe Leu Glu Gln Asn LysGly Leu Gln Gln Ala Leu Ser Ala Gln Lys Phe Leu Glu Gln Asn Lys

805 810 815 805 810 815

Gln Leu Pro Pro Ala Phe Met Ala Pro Ser Ile Val Pro Asn Gln AspGln Leu Pro Pro Ala Phe Met Ala Pro Ser Ile Val Pro Asn Gln Asp

820 825 830 820 825 830

Arg Asn Val Ile Ala Glu Ala Glu Ala Gln Leu Lys Asn Ser Gly ThrArg Asn Val Ile Ala Glu Ala Glu Ala Gln Leu Lys Asn Ser Gly Thr

835 840 845 835 840 845

Ser Ser Asn Leu Phe Ser Ala Pro Pro Ser Ala Glu Thr Ser Arg AsnSer Ser Asn Leu Phe Ser Ala Pro Pro Ser Ala Glu Thr Ser Arg Asn

850 855 860 850 855 860

Val Ile Glu Ser Val Pro Gln Asn Lys Pro Ser Glu Asp Leu Ser AsnVal Ile Glu Ser Val Pro Gln Asn Lys Pro Ser Glu Asp Leu Ser Asn

865 870 875 880865 870 875 880

Arg Val Leu Leu Asp Gln Asp Asp Asp Asp Asp Ile Asp Leu Asp LeuArg Val Leu Leu Asp Gln Asp Asp Asp Asp Asp Ile Asp Leu Asp Leu

885 890 895 885 890 895

Asp Gly Val Asn Ile Asp Asp Asn Ile Asp Thr Thr Asp Ile Asn LeuAsp Gly Val Asn Ile Asp Asp Asn Ile Asp Thr Thr Asp Ile Asn Leu

900 905 910 900 905 910

Asp Asp Asp Leu Leu Ser AspAsp Asp Asp Leu Leu Ser Asp

915 915

<210>3<210>3

<211>361<211>361

<212>ДНК<212>DNA

<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica

<400>3<400>3

aggtgtcaat tgtgtagact actaccacgg aggtgataaa ccctatataa tatcaggagc 60aggtgtcaat tgtgtagact actaccacgg aggtgataaa ccctatataa tatcaggagc 60

cgatgatagg ttggtcaaaa tctgggatta ccaaaataaa acatgtgttc aaaccttaga 120cgatgatagg ttggtcaaaa tctgggatta ccaaaataaa acatgtgttc aaaccttaga 120

aggacatggt caaaatgtta ctgctgtctt tttccatcca gaacttccag ttgctcttac 180aggacatggt caaaatgtta ctgctgtctt tttccatcca gaacttccag ttgctcttac 180

gggaagtgaa gatggtacag tgagaatatg gcatgcaaat acccatcgac tggaaagtac 240gggaagtgaa gatggtacag tgagaatatg gcatgcaaat acccatcgac tggaaagtac 240

cttaaattat ggatttgaaa gggtttggac catttgttgc ttaaaaggaa gtaataatgt 300cttaaattat ggatttgaaa gggtttggac catttgttgc ttaaaaggaa gtaataatgt 300

ggcattgggt tatgacgagg gtagtattct tgttaaagtt ggtagagaag aaccagctgt 360ggcattgggt tatgacgagg gtagtattct tgttaaagtt ggtagagaag aaccagctgt 360

t 361t 361

<210>4<210>4

<211>423<211>423

<212>ДНК<212>DNA

<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica

<400>4<400>4

gaaaatcaac aactggttaa aacttttgaa gtatgtgaca tacctgttag agctgcaaag 60gaaaatcaac aactggttaa aacttttgaa gtatgtgaca tacctgttag agctgcaaag 60

tttgtaccta gaaagaactg gattgtcagt ggttcagatg atatgcagat aagagttttt 120tttgtaccta gaaagaactg gattgtcagt ggttcagatg atatgcagat aagagttttt 120

aactacaata cactagacag ggtacactct ttcgaagccc attcagatta tgtgaggtct 180aactacaata cactagacag ggtacactct ttcgaagccc attcagatta tgtgaggtct 180

attgtggtac atccaacaca accatatatt ttaacaagta gtgatgatat gcttatcaaa 240attgtggtac atccaacaca accatatatt ttaacaagta gtgatgatat gcttatcaaa 240

ctgtggaact gggaaaaggc atgggcttgt cagcaagtgt ttgaaggaca tactcattat 300ctgtggaact gggaaaaggc atgggcttgt cagcaagtgt ttgaaggaca tactcattat 300

attatgcaaa ttgcaataaa tcccaaagac aacaatacat ttgccagtgc atctctagat 360attatgcaaa ttgcaataaa tcccaaagac aacaatacat ttgccagtgc atctctagat 360

agaacattaa aagtgtggca gctaggtgca tcaacagcta acttcactct tgaagggcat 420agaacattaa aagtgtggca gctaggtgca tcaacagcta acttcactct tgaagggcat 420

gag 423gag 423

<210>5<210>5

<211>571<211>571

<212>ДНК<212>DNA

<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica

<400>5<400>5

gtctgatttt ggagctgaag gtatatatgg gggttacctt ttgggagtca aatctgtttc 60gtctgatttt ggagctgaag gtatatatgg gggttacctt ttgggagtca aatctgtttc 60

tgggttaact ttctatgatt gggatacact tgatttggtt agaaggattg agatacaacc 120tgggttaact ttctatgatt gggatacact tgatttggtt agaaggattg agatacaacc 120

aaaagctgtc tattggtcag atagtggaaa gttggtatgt ttggccaccg aagatagtta 180aaaagctgtc tattggtcag atagtggaaa gttggtatgt ttggccaccg aagatagtta 180

ttttatttta tcatatgatg ctgatgaagt gcaaaaagct aaagataata atcaagttgc 240ttttatttta tcatatgatg ctgatgaagt gcaaaaagct aaagataata atcaagttgc 240

tgacgatggt gtggaatctg cattcaacct tttaggagaa atcaacgaat ctgttagaac 300tgacgatggt gtggaatctg cattcaacct tttaggagaa atcaacgaat ctgttagaac 300

aggcctatgg gtaggtgatt gtttcatcta cacaaatgct gtgaatcgta tcaattactt 360aggcctatgg gtaggtgatt gtttcatcta cacaaatgct gtgaatcgta tcaattactt 360

tgtaggaggt gaactagtaa ctatcgcaca cttggatcgt ccattgtacg tcttgggtta 420tgtaggaggt gaactagtaa ctatcgcaca cttggatcgt ccattgtacg tcttgggtta 420

tgtgcccaaa gacgatcgtt tgtatctagt agataaagag ttacgagttg tcagctacca 480tgtgcccaaa gacgatcgtt tgtatctagt agataaagag ttacgagttg tcagctacca 480

attgcttctt tcagtactcg aatatcagac agctgttatg aggagggact tcccaacagc 540attgcttctt tcagtactcg aatatcagac agctgttatg aggagggact tcccaacagc 540

agatagagta ctaccgtcta tacctaaaga g 571agatagagta ctaccgtcta tacctaaaga g 571

<210>6<210>6

<211>780<211>780

<212>ДНК<212>DNA

<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica

<400>6<400>6

gcacatttct tagaaaagca aggttttaaa caacaagctt tagctgtaag ttccgatccc 60gcacatttct tagaaaagca aggttttaaa caacaagctt tagctgtaag ttccgatccc 60

gaacatagat tcgaactcgc tgtggcatta gaagacctga atacagctaa aattctagca 120gaacatagat tcgaactcgc tgtggcatta gaagacctga atacagctaa aattctagca 120

caagaggcta acaatccaca aaagtggagc caattagctg atctagctgc tggcacaaat 180caagaggcta acaatccaca aaagtggagc caattagctg atctagctgc tggcacaaat 180

aatgtagaac tagcaaaaga atgcatgcag aaagcccaag attttggtgg attattactt 240aatgtagaac tagcaaaaga atgcatgcag aaagcccaag attttggtgg attattactt 240

ctagccacta gttcgggaga tgaatcatta gtccgtacat taggtgaaac aacacaagct 300ctagccacta gttcgggaga tgaatcatta gtccgtacat taggtgaaac aacacaagct 300

gagggcaaac ataatttagc cttcctttct catttcttgg taggagattt agacaagtgt 360gagggcaaac ataatttagc cttcctttct catttcttgg taggagattt agacaagtgt 360

ctagatattt tagtaagtac aggaaggttg ccagaagctg cgtttttcgc cagatcttat 420ctagatattt tagtaagtac aggaaggttg ccagaagctg cgtttttcgc cagatcttat 420

cttcccgata aaatttctga agttgtagaa ttgtggagga cacaattatc aactataaat 480cttcccgata aaatttctga agttgtagaa ttgtggagga cacaattatc aactataaat 480

caaaaagccg gacaaagttt agccgatcct aaaaattatg aaaatctatt tcccggtctt 540caaaaagccg gacaaagttt agccgatcct aaaaattatg aaaatctatt tcccggtctt 540

caacaagcat tgtcggcaca gaaatttttg gaacagaaca aacagttgcc acctgcattt 600caacaagcat tgtcggcaca gaaatttttg gaacagaaca aacagttgcc acctgcattt 600

atggctcctt ctattgttcc caaccaagat agaaatgtta tagccgaagc ggaggcacag 660atggctcctt ctattgttcc caaccaagat agaaatgtta tagccgaagc ggaggcacag 660

ttaaagaata gtggaacttc atcaaatttg ttcagtgccc caccttcagc agaaacttct 720ttaaagaata gtggaacttc atcaaatttg ttcagtgccc caccttcagc agaaacttct 720

aggaatgtta tagaatcagt accacaaaat aagccctcag aagatttatc aaacagggtg 780aggaatgtta tagaatcagt accacaaaat aagccctcag aagatttatc aaacagggtg 780

<210>7<210>7

<211>174<211>174

<212>ДНК<212>DNA

<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica

<400>7<400>7

atgccacttc gattagatat aaagagaagg ctaacagccc gttcagaccg ggttaaatgc 60atgccacttc gattagatat aaagagaagg ctaacagccc gttcagaccg ggttaaatgc 60

gtggatcttc atccgacaga accctggatg ttatgttctc tgtacagtgg aaatataaat 120gtggatcttc atccgacaga accctggatg ttatgttctc tgtacagtgg aaatataaat 120

gtctggaata ctgaaaatca acaactggtt aaaacttttg aagtatgtga cata 174gtctggaata ctgaaaatca acaactggtt aaaacttttg aagtatgtga cata 174

<210>8<210>8

<211>697<211>697

<212>ДНК<212>DNA

<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica

<400>8<400>8

tgtacctaga aagaactgga ttgtcagtgg ttcagatgat atgcagataa gagtttttaa 60tgtacctaga aagaactgga ttgtcagtgg ttcagatgat atgcagataa gagtttttaa 60

ctacaataca ctagacaggg tacactcttt cgaagcccat tcagattatg tgaggtctat 120ctacaataca ctagacaggg tacactcttt cgaagcccat tcagattatg tgaggtctat 120

tgtggtacat ccaacacaac catatatttt aacaagtagt gatgatatgc ttatcaaact 180tgtggtacat ccaacacaac catatatttt aacaagtagt gatgatatgc ttatcaaact 180

gtggaactgg gaaaaggcat gggcttgtca gcaagtgttt gaaggacata ctcattatat 240gtggaactgg gaaaaggcat gggcttgtca gcaagtgttt gaaggacata ctcattatat 240

tatgcaaatt gcaataaatc ccaaagacaa caatacattt gccagtgcat ctctagatag 300tatgcaaatt gcaataaatc ccaaagacaa caatacattt gccagtgcat ctctagatag 300

aacattaaaa gtgtggcagc taggtgcatc aacagctaac ttcactcttg aagggcatga 360aacattaaaa gtgtggcagc taggtgcatc aacagctaac ttcactcttg aagggcatga 360

gaaaggtgtc aattgtgtag actactacca cggaggtgat aaaccctata taatatcagg 420gaaaggtgtc aattgtgtag actactacca cggaggtgat aaaccctata taatatcagg 420

agccgatgat aggttggtca aaatctggga ttaccaaaat aaaacatgtg ttcaaacctt 480agccgatgat aggttggtca aaatctggga ttaccaaaat aaaacatgtg ttcaaacctt 480

agaaggacat ggtcaaaatg ttactgctgt ctttttccat ccagaacttc cagttgctct 540agaaggacat ggtcaaaatg ttactgctgt ctttttccat ccagaacttc cagttgctct 540

tacgggaagt gaagatggta cagtgagaat atggcatgca aatacccatc gactggaaag 600tacgggaagt gaagatggta cagtgagaat atggcatgca aatacccatc gactggaaag 600

taccttaaat tatggatttg aaagggtttg gaccatttgt tgcttaaaag gaagtaataa 660660

tgtggcattg ggttatgacg agggtagtat tcttgtt 697tgtggcattg ggttatgacg agggtagtat tcttgtt 697

<210>9<210>9

<211>342<211>342

<212>ДНК<212>DNA

<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica

<400>9<400>9

ctgttagtat ggatgccagt ggtggtaaaa ttatttgggc taggcactca gaactccaac 60ctgttagtat ggatgccagt ggtggtaaaa ttatttgggc taggcactca gaactccaac 60

aagccaatct taaggcattg cctgaaggtg ctgaaataaa agatggagaa cgacttccag 120aagccaatct taaggcattg cctgaaggtg ctgaaataaa agatggagaa cgacttccag 120

tatctgtaaa ggatatgggt gcctgtgaaa tctatcctca aaccattcaa cacaatccca 180tatctgtaaa ggatatggggt gcctgtgaaa tctatcctca aaccattcaa cacaatccca 180

atggtcgttt tgtagttgtg tgtggagatg gtgaatatat aatttacact gccatggcct 240atggtcgttt tgtagttgtg tgtggagatg gtgaatatat aatttacact gccatggcct 240

tacgtaacaa agcatttgga agtgcacaag aattcgtttg ggcccaagat tctagtgaat 300tacgtaacaa agcatttgga agtgcacaag aattcgtttg ggcccaagat tctagtgaat 300

atgctattag agaatcagga tctactataa ggatatttaa aa 342atgctattag agaatcagga tctactataa ggatatttaa aa 342

<210>10<210>10

<211>139<211>139

<212>ДНК<212>DNA

<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica

<400>10<400>10

aagtctgatt ttggagctga aggtatatat gggggttacc ttttgggagt caaatctgtt 60aagtctgatt ttggagctga aggtatatat gggggttacc ttttgggagt caaatctgtt 60

tctgggttaa ctttctatga ttgggataca cttgatttgg ttagaaggat tgagatacaa 120120

ccaaaagctg tctattggt 139ccaaaagctg tctattggt 139

<210>11<210>11

<211>821<211>821

<212>ДНК<212>DNA

<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica

<400>11<400>11

catatgatgc tgatgaagtg caaaaagcta aagataataa tcaagttgct gacgatggtg 60catatgatgc tgatgaagtg caaaaagcta aagataataa tcaagttgct gacgatggtg 60

tggaatctgc attcaacctt ttaggagaaa tcaacgaatc tgttagaaca ggcctatggg 120tggaatctgc attcaacctt ttaggagaaa tcaacgaatc tgttagaaca ggcctatggg 120

taggtgattg tttcatctac acaaatgctg tgaatcgtat caattacttt gtaggaggtg 180taggtgattg tttcatctac acaaatgctg tgaatcgtat caattacttt gtaggaggtg 180

aactagtaac tatcgcacac ttggatcgtc cattgtacgt cttgggttat gtgcccaaag 240aactagtaac tatcgcacac ttggatcgtc cattgtacgt cttgggttat gtgcccaaag 240

acgatcgttt gtatctagta gataaagagt tacgagttgt cagctaccaa ttgcttcttt 300acgatcgttt gtatctagta gataaagagt tacgagttgt cagctaccaa ttgcttcttt 300

cagtactcga atatcagaca gctgttatga ggagggactt cccaacagca gatagagtac 360cagtactcga atatcagaca gctgttatga ggagggactt cccaacagca gatagagtac 360

taccgtctat acctaaagag cacagaacaa gggtagcaca tttcttagaa aagcaaggtt 420taccgtctat acctaaagag cacagaacaa gggtagcaca tttcttagaa aagcaaggtt 420

ttaaacaaca agctttagct gtaagttccg atcccgaaca tagattcgaa ctcgctgtgg 480ttaaacaaca agctttagct gtaagttccg atcccgaaca tagattcgaa ctcgctgtgg 480

cattagaaga cctgaataca gctaaaattc tagcacaaga ggctaacaat ccacaaaagt 540cattagaaga cctgaataca gctaaaattc tagcacaaga ggctaacaat ccacaaaagt 540

ggagccaatt agctgatcta gctgctggca caaataatgt agaactagca aaagaatgca 600ggagccaatt agctgatcta gctgctggca caaataatgt agaactagca aaagaatgca 600

tgcagaaagc ccaagatttt ggtggattat tacttctagc cactagttcg ggagatgaat 660tgcagaaagc ccaagatttt ggtggattat tacttctagc cactagttcg ggagatgaat 660

cattagtccg tacattaggt gaaacaacac aagctgaggg caaacataat ttagccttcc 720cattagtccg tacattaggt gaaacaacac aagctgaggg caaacataat ttagccttcc 720

tttctcattt cttggtagga gatttagaca agtgtctaga tattttagta agtacaggaa 780tttctcattt cttggtagga gatttagaca agtgtctaga tattttagta agtacaggaa 780

ggttgccaga agctgcgttt ttcgccagat cttatcttcc c 821ggttgccaga agctgcgttt ttcgccagat cttatcttcc c 821

<210>12<210>12

<211>316<211>316

<212>ДНК<212>DNA

<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica

<400>12<400>12

gaattgtgga ggacacaatt atcaactata aatcaaaaag ccggacaaag tttagccgat 60gaattgtgga ggacacaatt atcaactata aatcaaaaag ccggacaaag tttagccgat 60

cctaaaaatt atgaaaatct atttcccggt cttcaacaag cattgtcggc acagaaattt 120cctaaaaatt atgaaaatct atttcccggt cttcaacaag cattgtcggc acagaaattt 120

ttggaacaga acaaacagtt gccacctgca tttatggctc cttctattgt tcccaaccaa 180ttggaacaga acaaacagtt gccacctgca tttatggctc cttctattgt tcccaaccaa 180

gatagaaatg ttatagccga agcggaggca cagttaaaga atagtggaac ttcatcaaat 240gatagaaatg ttatagccga agcggaggca cagttaaaga atagtggaac ttcatcaaat 240

ttgttcagtg ccccaccttc agcagaaact tctaggaatg ttatagaatc agtaccacaa 300ttgttcagtg ccccaccttc agcagaaact tctaggaatg ttatagaatc agtaccacaa 300

aataagccct cagaag 316aataagccct cagaag 316

<210>13<210>13

<211>174<211>174

<212>ДНК<212>DNA

<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica

<400>13<400>13

<210>14<210>14

<211>361<211>361

<212>ДНК<212>DNA

<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica

<400>14<400>14

g 361g 361

<210>15<210>15

<211>334<211>334

<212>ДНК<212>DNA

<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica

<400>15<400>15

ggcattgggt tatgacgagg gtagtattct tgtt 334ggcattgggt tatgacgagg gtagtattct tgtt 334

<210>16<210>16

<211>342<211>342

<212>ДНК<212>DNA

<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica

<400>16<400>16

<210>17<210>17

<211>139<211>139

<212>ДНК<212>DNA

<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica

<400>17<400>17

tctgggttaa ctttctatga ttgggataca cttgatttgg ttagaaggat tgagatacaa 120120

ccaaaagctg tctattggt 139ccaaaagctg tctattggt 139

<210>18<210>18

<211>380<211>380

<212>ДНК<212>DNA

<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica

<400>18<400>18

taccgtctat acctaaagag 380taccgtctat acctaaagag 380

<210>19<210>19

<211>426<211>426

<212>ДНК<212>DNA

<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica

<400>19<400>19

cttccc 426cttccc 426

<210>20<210>20

<211>316<211>316

<212>ДНК<212>DNA

<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica

<400>20<400>20

aataagccct cagaag 316aataagccct cagaag 316

<210>21<210>21

<211>328<211>328

<212>ДНК<212>DNA

<213>Cauliflower mosaic virus<213>Cauliflower mosaic virus

<400>21<400>21

ccattgccca gctatctgtc actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta 60ccattgccca gctatctgtc actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta 60

caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg 120caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg 120

tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac 180tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac 180

gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc 240gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc 240

ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt tggagaggac 300ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt tggagaggac 300

acgctgacaa gctgactcta gcagatct 328acgctgacaa gctgactcta gcagatct 328

<210>22<210>22

<211>872<211>872

<212>ДНК<212>DNA

<213>Искусственная последовательность - нуклеотидная последовательность-R1<213>Artificial sequence - nucleotide sequence-R1

<400>22<400>22

taagtactgc gatcgcgtta acgctttatc acgatacctt ctaccacata tcactaacaa 420taagtactgc gatcgcgtta acgctttatc acgatacctt ctaccacata tcactaacaa 420

catcaacact catcactctc gacgacatcc actcgatcac tactctcaca cgaccgatta 480catcaacact catcactctc gacgacatcc actcgatcac tactctcaca cgaccgatta 480

actcctcatc cacgcggccg cctgcaggag caacagctgg ttcttctcta ccaactttaa 540actcctcatc cacgcggccg cctgcaggag caacagctgg ttcttctcta ccaactttaa 540

caagaatact accctcgtca taacccaatg ccacattatt acttcctttt aagcaacaaa 600caagaatact accctcgtca taacccaatg ccacattatt acttcctttt aagcaacaaa 600

tggtccaaac cctttcaaat ccataattta aggtactttc cagtcgatgg gtatttgcat 660tggtccaaac cctttcaaat ccataattta aggtactttc cagtcgatgg gtatttgcat 660

gccatattct cactgtacca tcttcacttc ccgtaagagc aactggaagt tctggatgga 720gccatattct cactgtacca tcttcacttc ccgtaagagc aactggaagt tctggatgga 720

aaaagacagc agtaacattt tgaccatgtc cttctaaggt ttgaacacat gttttatttt 780aaaagacagc agtaacattt tgaccatgtc cttctaaggt ttgaacacat gttttatttt 780

ggtaatccca gattttgacc aacctatcat cggctcctga tattatatag ggtttatcac 840ggtaatccca gattttgacc aacctatcat cggctcctga tattatatag ggtttatcac 840

ctccgtggta gtagtctaca caattgacac ct 872ctccgtggta gtagtctaca caattgacac ct 872

<210>23<210>23

<211>150<211>150

<212>ДНК<212>DNA

<213>Искусственная последовательность - последовательность спейсера<213>Artificial Sequence - Spacer Sequence

<400>23<400>23

aagtactgcg atcgcgttaa cgctttatca cgataccttc taccacatat cactaacaac 60aagtactgcg atcgcgttaa cgctttatca cgataccttc taccacatat cactaacaac 60

atcaacactc atcactctcg acgacatcca ctcgatcact actctcacac gaccgattaa 120atcaacactc atcactctcg acgacatcca ctcgatcact actctcacac gaccgattaa 120

ctcctcatcc acgcggccgc ctgcaggagc 150ctcctcatcc acgcggccgc ctgcaggagc 150

<210>24<210>24

<211>253<211>253

<212>ДНК<212>DNA

<213>Agrobacterium tumefaciens<213>Agrobacterium tumefaciens

<400>24<400>24

gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 60gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 60

atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 120atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 120

atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 180atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg

gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 240gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 240

atgttactag atc 253atgttactag atc 253

<210>25<210>25

<211>1026<211>1026

<212>ДНК<212>DNA

<213>Salmonella enterica<213>Salmonella enterica

<400>25<400>25

atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac 60atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac 60

agcgtctccg acctgatgca gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat 120agcgtctccg acctgatgca gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat 120

gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat 180gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat 180

cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt 240cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt 240

ggggaattca gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg tgtcacgttg 300ggggaattca gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg tgtcacgttg 300

caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct gttctgcagc cggtcgcgga ggccatggat 360caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct gttctgcagc cggtcgcgga ggccatggat 360

gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga 420gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga 420

atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat 480atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat 480

cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag 540cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag 540

ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc 600ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc 600

tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg 660tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg 660

atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc aacatcttct tctggaggcc gtggttggct 720atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc aacatcttct tctggaggcc gtggttggct 720

tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag cggaggcatc cggagcttgc aggatcgccg 780tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag cggaggcatc cggagcttgc aggatcgccg 780

cggctccggg cgtatatgct ccgcattggt cttgaccaac tctatcagag cttggttgac 840cggctccggg cgtatatgct ccgcattggt cttgaccaac tctatcagag cttggttgac 840

ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga 900ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga 900

gccgggactg tcgggcgtac acaaatcgcc cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc 960gccgggactg tcgggcgtac acaaatcgcc cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc 960

tgtgtagaag tactcgccga tagtggaaac cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag 1020tgtgtagaag tactcgccga tagtggaaac cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag 1020

gaatag 1026gaatag 1026

<210>26<210>26

<211>20<211>20

<212>ДНК<212>DNA

<213>Искусственная последовательность - Праймер 1<213>Artificial Sequence - Primer 1

<400>26<400>26

cagggtgtca cgttgcaaga 20cagggtgtca cgttgcaaga 20

<210>27<210>27

<211>20<211>20

<212>ДНК<212>DNA

<213>Искусственная последовательность - Праймер 2<213>Artificial Sequence - Primer 2

<400>27<400>27

ccgctcgtct ggctaagatc 20ccgctcgtct ggctaagatc 20

<210>28<210>28

<211>24<211>24

<212>ДНК<212>DNA

<213>Искусственная последовательность - Зонд 1<213>Artificial Sequence - Probe 1

<400>28<400>28

tgcctgaaac cgaactgccc gctg 24tgcctgaaac cgaactgccc gctg 24

<210>29<210>29

<211>334<211>334

<212>ДНК<212>DNA

<213>Искусственная последовательность - несоответствующая dsRNA<213>Artificial sequence - mismatched dsRNA

<400>29<400>29

ggaaatcgcc actgctaaga aaaatggaca gaaaaataag agagcggcac ttcaagcact 60ggaaatcgcc actgctaaga aaaatggaca gaaaaataag agagcggcac ttcaagcact 60

caagcggaag aagcggtatg agaaacagtt gcagcagatt gatggaacat tatcaactat 120caagcggaag aagcggtatg agaaacagtt gcagcagatt gatggaacat tatcaactat 120

tgaaatgcag agagaagctt tagagggtgc caacactaat acagctgttc tcacaacaat 180tgaaatgcag agagaagctt tagagggtgc caacactaat acagctgttc tcacaacaat 180

gaaagatgct gcggacgccc tcaaagctgc tcacaaacac atggatgtcg atcaagttca 240gaaagatgct gcggacgccc tcaaagctgc tcacaaacac atggatgtcg atcaagttca 240

tgatatgatg gatgacattg ccgaacagca agatgtagct agagaaattt ctgatgccat 300tgatatgatg gatgacattg ccgaacagca agatgtagct agagaaattt ctgatgccat 300

atccaaccca gttgcatttg gtcatgatat tgat 334atccaaccca gttgcatttg gtcatgatat tgat 334

<210>30<210>30

<211>541<211>541

<212>ДНК<212>DNA

<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica

<400>30<400>30

atttgttgat actagtggta gacataaaca agaagaatca ctatttgaag aaatgttggc 60atttgttgat actagtggta gacataaaca agaagaatca ctatttgaag aaatgttggc 60

agtttctaat gctgtgagac cagataatat tattttcgtt atggatgcaa ctattggtca 120agtttctaat gctgtgagac cagataatat tattttcgtt atggatgcaa ctattggtca 120

agcttgtgag tctcaggcta aagctttcaa agaaaaggta gatgtaggct ctgtaattat 180agcttgtgag tctcaggcta aagctttcaa agaaaaggta gatgtaggct ctgtaattat 180

aacaaaatta gatggacatg caaaaggagg tggtgcactc agtgctgtgg cagccactaa 240aacaaaatta gatggacatg caaaaggagg tggtgcactc agtgctgtgg cagccactaa 240

cagtcctatt atattcattg gtacaggaga acatatagat gacttagaac cttttaaaac 300cagtcctatt atattcattg gtacaggaga acatatagat gacttagaac cttttaaaac 300

aaaacctttc attagtaaat tattaggaat gggtgatata gaaggtttaa ttgataaagt 360360

aaacgaatta aagttagagg ataatgaaga attgttagaa aaaattaaac atgggcaatt 420aaacgaatta aagttagagg ataatgaaga attgttagaa aaaattaaac atgggcaatt 420

cacactcaga gacatgtatg aacagttcca aaatattatg aaaatgggac ctttctcaca 480cacactcaga gacatgtatg aacagttcca aaatattatg aaaatgggac ctttctcaca 480

aataatggga atgatccctg gatttagcca agatttcatg tcaaaaggaa gtgaacaaga 540aataatggga atgatccctg gatttagcca agatttcatg tcaaaaggaa gtgaacaaga 540

a 541a 541

<210>31<210>31

<211>394<211>394

<212>ДНК<212>DNA

<213>Monolepta hieroglyphica<213>Monolepta hieroglyphica

<400>31<400>31

aataatggac agtatgaatg attatgaatt agataaccga gatggtgcaa aattatttac 60aataatggac agtatgaatg attatgaatt agataaccga gatggtgcaa aattatttac 60

aaagcaaaat ggtagagtta ttagagttgc acaagggtct ggtgttacag aaagagaagt 120aaagcaaaat ggtagagtta ttagagttgc acaagggtct ggtgttacag aaagagaagt 120

aaaagatttg atcacgcaat acacgaagtt tgccgccgta gtaaagaaaa tgggcggcat 180aaaagatttg atcacgcaat acacgaagtt tgccgccgta gtaaagaaaa tgggcggcat 180

aaagggtctt tttaaaggcg gcgatatggc taaaaatgtc aatcacaacc aaatggccaa 240aaagggtctt tttaaaggcg gcgatatggc taaaaatgtc aatcacaacc aaatggccaa 240

acttaatcaa caaatggcca agatgatgga tcctcgagtg cttcagcaaa tgggcggcat 300acttaatcaa caaatggcca agatgatgga tcctcgagtg cttcagcaaa tgggcggcat 300

ggctggatta cagaacatga tgagacagct acaagcgggc gcggcaggag gcttgggagg 360ggctggatta cagaacatga tgagacagct acaagcggggc gcggcaggag gcttgggagg 360

tttgggtaac cttatgggtg gttttggagg gaaa 394tttggggtaac cttatggggtg gttttgggagg gaaa 394

<---<---

Claims

1. Изолированный полинуклеотид для борьбы с нашествием жесткокрылых насекомых-вредителей, где полинуклеотид содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из:1. An isolated polynucleotide for combating the invasion of beetle pests, where the polynucleotide contains a polynucleotide sequence selected from:

(b) полинуклеотидной последовательности по меньшей мере из 139 последовательных нуклеотидов из SEQ ID NO: 1; или(b) a polynucleotide sequence of at least 139 consecutive nucleotides from SEQ ID NO: 1; or

(c) любой из полинуклеотидных последовательностей, показанных в SEQ ID NO: от 3 до 20; или(c) any of the polynucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 3 to 20; or

(d) полинуклеотидной последовательности, которая гибридизуется с полинуклеотидной последовательностью, определенной в любом из пунктов от (а) до (c), при жестких условиях; (d) a polynucleotide sequence that hybridizes to a polynucleotide sequence as defined in any of (a) to (c) under stringent conditions;

где, когда жесткокрылое насекомое-вредитель поглощает двухцепочечную РНК, содержащую по меньшей мере одну цепь, комплементарную полинуклеотидной последовательности, рост жесткокрылого насекомого-вредителя ингибируется.wherein when the hemipteran pest consumes a double-stranded RNA containing at least one strand complementary to the polynucleotide sequence, the growth of the hemipteran pest is inhibited.

2. Изолированный полинуклеотид по п. 1, отличающийся тем, что жесткокрылое насекомое-вредитель представляет собой Monolepta hieroglyphica. 2. An isolated polynucleotide according to claim 1, wherein the beetle pest is Monolepta hieroglyphica.

3. Изолированный полинуклеотид по п. 1 или 2, где полинуклеотид дополнительно содержит последовательность, комплементарную полинуклеотидной последовательности, определенной в любом из пунктов от (а) до (c) по п. 1.3. An isolated polynucleotide according to claim 1 or 2, wherein the polynucleotide further comprises a sequence complementary to the polynucleotide sequence defined in any of paragraphs (a) to (c) of paragraph 1.

4. Изолированный полинуклеотид по любому из пп. 1-3, где полинуклеотид дополнительно содержит спейсерную последовательность.4. Isolated polynucleotide according to any one of paragraphs. 1-3, where the polynucleotide additionally contains a spacer sequence.

5. Изолированный полинуклеотид по п. 4, где спейсерная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 23.5. An isolated polynucleotide according to claim 4, wherein the spacer sequence is SEQ ID NO: 23.

6. Экспрессионная кассета, содержащая изолированный полинуклеотид по любому из пп. 1-5.6. Expression cassette containing an isolated polynucleotide according to any one of paragraphs. 1-5.

7. Рекомбинантный экспрессионный вектор, содержащий изолированный полинуклеотид по любому из пп. 1-5.7. Recombinant expression vector containing an isolated polynucleotide according to any one of paragraphs. 1-5.

8. Применение изолированного полинуклеотида по любому из пп. 1-5 для негативной регуляции экспрессии целевой последовательности жесткокрылого насекомого-вредителя или ингибирования роста жесткокрылого насекомого-вредителя, где жесткокрылое насекомое-вредитель представляет собой Monolepta hieroglyphica.8. The use of an isolated polynucleotide according to any one of paragraphs. 1-5 for down-regulating the expression of a target beetle pest sequence or inhibiting the growth of the beetle pest, wherein the beetle pest is Monolepta hieroglyphica .

9. Рибонуклеиновая кислота, характеризующаяся тем, что рибонуклеиновая кислота подавляет экспрессию по меньшей мере одного гена-мишени у насекомого-вредителя Monolepta hieroglyphica после того, как она поглощается насекомым-вредителем, где рибонуклеиновая кислота содержит по меньшей мере один элемент сайленсинга, где элемент сайленсинга представляет собой двухцепочечную область РНК, содержащую соединенные комплементарные цепи, где одна цепь из области двухцепочечной РНК содержит нуклеотидную последовательность или состоит из нуклеотидной последовательности, которая комплементарна целевой последовательности в гене-мишени, и ген-мишень представляет собой полинуклеотидную последовательность, показанной в SEQ ID NO: 1, где целевая последовательность выбрана из:9. Ribonucleic acid, characterized in that the ribonucleic acid suppresses the expression of at least one target gene in the insect pest Monolepta hieroglyphica after it is consumed by the insect pest, where the ribonucleic acid contains at least one silencing element, where the silencing element is a double-stranded RNA region containing connected complementary strands, where one strand from the double-stranded RNA region contains or consists of a nucleotide sequence that is complementary to the target sequence in the target gene, and the target gene is the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO : 1 where the target sequence is chosen from:

(a) полинуклеотидной последовательности по меньшей мере из 139 последовательных нуклеотидов из SEQ ID NO: 1; и(a) a polynucleotide sequence of at least 139 consecutive nucleotides from SEQ ID NO: 1; and

(b) любой из полинуклеотидных последовательностей, показанных в SEQ ID NO: от 3 до 20.(b) any of the polynucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 3 to 20.

10. Рибонуклеиновая кислота по п. 9, где рибонуклеиновая кислота содержит по меньшей мере два элемента сайленсинга, и каждый из элементов сайленсинга содержит нуклеотидную последовательность или состоит из нуклеотидной последовательности, которая комплементарна целевой последовательности в гене-мишени.10. The ribonucleic acid according to claim 9, wherein the ribonucleic acid contains at least two silencing elements, and each of the silencing elements contains or consists of a nucleotide sequence that is complementary to the target sequence in the target gene.

11. Рибонуклеиновая кислота по п. 10, где каждый из элементов сайленсинга содержит отличающуюся нуклеотидную последовательность или состоит из отличающейся нуклеотидной последовательности, которая комплементарна другой целевой последовательности в гене-мишени.11. The ribonucleic acid of claim 10, wherein each of the silencing elements contains a different nucleotide sequence or consists of a different nucleotide sequence that is complementary to another target sequence in the target gene.

12. Рибонуклеиновая кислота по п. 11, где другая целевая последовательность происходит исключительно из гена-мишени или происходит из дополнительного гена-мишени, отличного от гена-мишени.12. The ribonucleic acid of claim 11 wherein the other target sequence is derived exclusively from the target gene or is derived from an additional target gene other than the target gene.

13. Рибонуклеиновая кислота по п. 12, где дополнительный ген-мишень, отличающийся от гена-мишени, получен от того же жесткокрылого насекомого-вредителя или от другого жесткокрылого насекомого-вредителя.13. The ribonucleic acid of claim 12, wherein the additional target gene, different from the target gene, is derived from the same hemipteran pest or from another hemipteran pest.

14. Рибонуклеиновая кислота по п. 13, где жесткокрылое насекомое-вредитель представляет собой Monolepta hieroglyphica.14. The ribonucleic acid of claim 13 wherein the beetle pest is Monolepta hieroglyphica .

15. Рибонуклеиновая кислота по любому из пп. 9-14, где рибонуклеиновая кислота дополнительно содержит спейсерную последовательность.15. Ribonucleic acid according to any one of paragraphs. 9-14, where the ribonucleic acid further comprises a spacer sequence.

16. Рибонуклеиновая кислота по п. 15, где спейсерная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 23.16. The ribonucleic acid of claim 15, wherein the spacer sequence is SEQ ID NO: 23.

17. Композиция для борьбы с нашествием жесткокрылых насекомых-вредителей, содержащая по меньшей мере одну из рибонуклеиновых кислот по любому из пп. 9-16 или клетку-хозяина, которая экспрессирует рибонуклеиновую кислоту по любому из пп. 9-16, и по меньшей мере один подходящий носитель, эксципиент или разбавитель.17. Composition for combating the invasion of beetle pests, containing at least one of the ribonucleic acids according to any one of paragraphs. 9-16 or a host cell that expresses a ribonucleic acid according to any one of paragraphs. 9-16 and at least one suitable carrier, excipient or diluent.

18. Композиция по п. 17, где клетка-хозяин представляет собой бактериальную клетку.18. The composition of claim 17 wherein the host cell is a bacterial cell.

19. Композиция по п. 17 или 18, где жесткокрылое насекомое-вредитель представляет собой Monolepta hieroglyphica.19. The composition according to claim 17 or 18, wherein the beetle pest is Monolepta hieroglyphica .

20. Композиция для борьбы с нашествием жесткокрылых насекомых-вредителей по любому из пп. 17-19, где композиция представляет собой твердое вещество, жидкость или гель.20. Composition for combating the invasion of beetle pests according to any one of paragraphs. 17-19, where the composition is a solid, liquid or gel.

21. Композиция по п. 20, где композиция представляет собой инсектицидный спрей.21. The composition of claim 20, wherein the composition is an insecticidal spray.

22. Композиция для борьбы с нашествием жесткокрылых насекомых-вредителей по любому из пп. 17-21, где композиция дополнительно содержит по меньшей мере один инсектицид, и инсектицид представляет собой химический инсектицид, специфический белок клубней картофеля, инсектицидный белок Bacillus thuringiensis, инсектицидный белок Xenorhabdus ehlersii, инсектицидный белок Photorhabdus luminescens, инсектицидный белок Bacillus laterosporus или инсектицидный белок Bacillus sphaericus.22. Composition for combating the invasion of beetle pests according to any one of paragraphs. 17-21, wherein the composition further comprises at least one insecticide, and the insecticide is a chemical insecticide, a potato tuber specific protein, a Bacillus thuringiensis insecticidal protein, a Xenorhabdus ehlersii insecticidal protein, a Photorhabdus luminescens insecticidal protein, a Bacillus laterosporus insecticidal protein, or a Bacillus sphaericus insecticidal protein .

23. Применение композиции для борьбы с нашествием жесткокрылых насекомых-вредителей по любому из пп. 17-22 для профилактики нашествия или борьбы с нашествием жесткокрылых насекомых-вредителей.23. The use of compositions for combating the invasion of beetle insect pests according to any one of paragraphs. 17-22 for the prevention of invasion or control of the invasion of beetle insect pests.

24. Применение по п. 23, где жесткокрылое насекомое-вредитель представляет собой Monolepta hieroglyphica.24. Use according to claim 23, wherein the beetle pest is Monolepta hieroglyphica .

25. Способ для борьбы с нашествием жесткокрылых насекомых-вредителей, включающий контактирование жесткокрылого насекомого-вредителя с эффективным количеством по меньшей мере одной из интерферирующих рибонуклеиновых кислот по любому из пп. 9-16.25. A method for combating the invasion of beetle insect pests, including contacting beetle insect pest with an effective amount of at least one of the interfering ribonucleic acids according to any one of paragraphs. 9-16.

26. Способ повышения устойчивости растения к Monolepta hieroglyphica и защиты растения от повреждения, вызываемого Monolepta hieroglyphica, включающий введение в растение полинуклеотида по любому из пп. 1-5, или экспрессионной кассеты по п. 6, или рекомбинантного вектора по п. 7, или конструкции, содержащей рибонуклеиновую кислоту по любому из пп. 9-16.26. A method for increasing plant resistance to Monolepta hieroglyphica and protecting a plant from damage caused by Monolepta hieroglyphica , comprising introducing into the plant a polynucleotide according to any one of paragraphs. 1-5, or an expression cassette according to p. 6, or a recombinant vector according to p. 7, or a construct containing a ribonucleic acid according to any one of paragraphs. 9-16.

27. Способ получения устойчивого к Monolepta hieroglyphica растения, включающий введение в растение полинуклеотида по любому из пп. 1-5, или экспрессионной кассеты по п. 6, или рекомбинантного вектора по п. 7, или конструкции, содержащей рибонуклеиновую кислоту по любому из пп. 9-16.27. A method of obtaining a plant resistant to Monolepta hieroglyphica , which includes introducing into the plant a polynucleotide according to any one of paragraphs. 1-5, or an expression cassette according to p. 6, or a recombinant vector according to p. 7, or a construct containing a ribonucleic acid according to any one of paragraphs. 9-16.

28. Способ по любому из пп. 25-27, где растение представляет собой сою, пшеницу, ячмень, кукурузу, табак, рис, рапс, хлопок или подсолнечник.28. The method according to any one of paragraphs. 25-27, wherein the plant is soybean, wheat, barley, corn, tobacco, rice, rapeseed, cotton, or sunflower.