RU2781448C1 - Pharmaceutical composition for producing a lyophilisate of liver cell culture enriched with hepatocyte growth factor - Google Patents

Abstract

FIELD: pharmaceuticals.

SUBSTANCE: invention relates to the pharmaceutical industry, namely, to production of a pharmaceutical composition for producing a lyophilisate enriched with prolonged-action hepatocyte growth factor (HGF), stimulating the proliferation of liver hepatocytes. Pharmaceutical composition for producing a lyophilisate enriched with prolonged-action hepatocyte growth factor (HGF), stimulating the proliferation of liver hepatocytes, containing a cell population, characterised by using a neonatal rat liver cell culture as a cell population and a source of HGF, and solutions of polyvinylpyrrolidone, sucrose, and albumin are used as a structure-forming agent and prolongator, at a certain ratio of components.

EFFECT: above solution provides a possibility of producing a lyophilisate agent stimulating liver regeneration.

1 cl, 4 dwg, 1 tbl, 2 ex

Description

Изобретение относится к области медицины, фармацевтической промышленности и биотехнологии и касается состава фармацевтической композиции для приготовления лиофилизата культуры клеток печени, обогащенной фактором роста гепатоцитов (HGF). Последний играет ведущую роль в процессе регенерации печени, например, при ее токсическом повреждении или при лечении пациентов с хронической печеночной недостаточностью.The invention relates to the field of medicine, pharmaceutical industry and biotechnology and concerns the composition of a pharmaceutical composition for the preparation of a lyophilisate of a liver cell culture enriched with hepatocyte growth factor (HGF). The latter plays a leading role in the process of liver regeneration, for example, in case of its toxic damage or in the treatment of patients with chronic liver failure.

Известно, что HGF мыши гомологичен HGF человека (Miyazawa К. и др., Biochem. Biophys. Res. Comm. 163 (1989) cc.967-973; Nakamura Т. и др., Nature 342 (1989) cc.440-443; Seki Т. и др., Biochem. and Biophys. Res. Comm. 172 (1990) cc.321-327; Tashiro К. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) cc.3200-3204; Okajima А. и др., Eur. J. Biochem. 193 (1990) cc.375-381), поэтому биоматериалы мышей, вследствие идентичности действия, применяются в качестве, например, иммунотропных препаратов для человека. Также важно отметить, что проводимые работы по оптимизации методов лечения печени млекопитающих имеют своей основной целью дальнейшее их применение в клинической практике.Mouse HGF is known to be homologous to human HGF (Miyazawa K. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 163 (1989) cc. 967-973; Nakamura, T. et al. 443; Seki, T. et al., Biochem. and Biophys. Res. Comm. 172 (1990) cc.321-327; Tashiro, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) cc. 3200-3204; Okajima A. et al., Eur. J. Biochem. 193 (1990) pp. 375-381), therefore, mouse biomaterials, due to the identity of action, are used as, for example, immunotropic drugs for humans. It is also important to note that the ongoing work on optimizing the methods of treating the liver of mammals has as its main goal their further application in clinical practice.

Процесс лиофилизации известен давно и применяется в технологии получения фармацевтических субстанций для обеспечения стабильности готовых лекарств при их хранении и транспортировке. Чаще всего лиофилизация применяется при производстве термолабильных препаратов пептидной природы, которые не переносят действия высоких температур, таких как кортексин, ингарон, спленопид, а также лиофилизированный пептид фактора роста гепатоцитов (HGF), при этом лиофилизат самой культуры клеток печени не известен.The lyophilization process has been known for a long time and is used in the technology of obtaining pharmaceutical substances to ensure the stability of finished drugs during storage and transportation. Most often, lyophilization is used in the production of thermolabile peptide preparations that do not tolerate high temperatures, such as cortexin, ingaron, splenopid, as well as lyophilized hepatocyte growth factor (HGF) peptide, while the lyophilisate of the liver cell culture itself is not known.

Известны способы получения биологически активных веществ из тканей животных применяемых в медицинской практике, такие, как например, лиофилизированный препарат «спленопид», получаемый из селезенки свиней [РФ Патент №2152219 (1998), МПК А61К 35/28; А61К 38/02]. Способ получения препарата заключается в получении пептидов с мол. м. от 400 до 50000 Да из ткани селезенки посредством митогенной стимуляции клеток ткани селезенки в процессе ее отмывки, гомогенизации органа, диспергированием в дистиллированной воде и разрушением клеток замораживанием-размораживанием и ультразвуковой обработкой, отделением экстракта и его ультрафильтрации через фильтры с размером пор с границей раздела 50000 Да. При добавлении к выделенным пептидам наполнителя, препарат получают в лиофилизированной форме, стабильной при хранении в течение двух лет. В качестве биологически активного вещества выступают пептиды в количестве 10-15 мг в дозе. В качестве наполнителя используют желатиноль и раствор гентамицина.Known methods for obtaining biologically active substances from animal tissues used in medical practice, such as, for example, lyophilized drug "splenopid" obtained from the spleen of pigs [RF Patent No. 2152219 (1998), IPC A61K 35/28; A61K 38/02]. The method of obtaining the drug is to obtain peptides with a mol. m. from 400 to 50000 Da from spleen tissue by mitogenic stimulation of spleen tissue cells during its washing, homogenization of the organ, dispersion in distilled water and destruction of cells by freezing-thawing and ultrasonic treatment, separation of the extract and its ultrafiltration through filters with a pore size with a border section 50000 Yes. When a filler is added to the isolated peptides, the preparation is obtained in a lyophilized form, which is stable during storage for two years. As a biologically active substance are peptides in the amount of 10-15 mg per dose. As a filler, gelatinol and a solution of gentamicin are used.

Активным веществом препарата «спленопид» являются пептиды селезенки, которые оказывают иммуномодулирующее действие, но не оказывают стимулирующего влияния на регенерацию тканей. Недостатком лиофилизата «спленопид» является использование в качестве наполнителя раствор гентамицина, который известен широким спектром побочных эффектов в том числе ототоксическим действием вплоть до необратимой глухоты.The active substance of the drug "splenopid" are spleen peptides, which have an immunomodulatory effect, but do not have a stimulating effect on tissue regeneration. The disadvantage of the "splenopid" lyophilizate is the use of a solution of gentamicin as a filler, which is known for a wide range of side effects, including ototoxic effects up to irreversible deafness.

Известен способ получения лиофилизата состоящего из фактора роста гепатоцитов (HGF), трегалозы и одного или нескольких соединений, выбранных из группы, состоящей из аргинина, гистидина, лизина, меглюмина, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, пролина, креатина, креатинина, трис(гидроксиметил)метиламина и их фармацевтически приемлемых солей [РФ Патент №2693472 (2015), МПК А61К 9/19, А61К 38/00, А61К 47/18, А61К 47/26]. В этой работе в качестве основного вещества предложена одна из аминокислот на выбор: из аргинина, гистидина или лизина. Данный способ позволяет получить лиофилизат в котором массовое соотношение фактора роста гепатоцитов и трегалозы составляет от 1:4 до 1:460, и массовое соотношение фактора роста гепатоцитов и каждого из указанных одного или нескольких соединений составляет от 1:1 до 1:50 в лиофилизированном составе. Перед лиофилизацией рН водного раствора доводят до 4,5-6,5. Фактор роста гепатоцитов в предлагаемом варианте может быть естественного или искусственного происхождения (полученный с помощью методики генной инженерии или может представлять собой модифицированный фактор роста гепатоцитов, который модифицирован с помощью замены, делеции, добавления или вставки или их комбинации с использованием одного или нескольких, предпочтительно 1-10 аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности встречающегося в природе фактора роста гепатоцитов в таком диапазоне, чтобы модифицированная аминокислотная последовательность сохраняла активность фактора роста гепатоцитов.). Модифицированный фактор роста гепатоцитов может представлять собой таковой, характеризующийся, 80% гомологией по отношению к аминокислотной последовательности встречающегося в природе фактора роста гепатоцитов. В качестве стабилизатора предлагается использовать одно, два или более из представленных веществ на выбор: аргинина, гистидина, лизина, меглюмина, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, пролина, креатина, креатинина, трис(гидроксиметил)метиламина и их фармацевтически приемлемых солей.A known method for producing a lyophilisate consisting of hepatocyte growth factor (HGF), trehalose and one or more compounds selected from the group consisting of arginine, histidine, lysine, meglumine, glutamic acid, aspartic acid, proline, creatine, creatinine, tris(hydroxymethyl) methylamine and their pharmaceutically acceptable salts [RF Patent No. 2693472 (2015), IPC A61K 9/19, A61K 38/00, A61K 47/18, A61K 47/26]. In this work, one of the amino acids to choose from is proposed as the main substance: from arginine, histidine, or lysine. This method allows to obtain a lyophilisate in which the mass ratio of hepatocyte growth factor and trehalose is from 1:4 to 1:460, and the mass ratio of hepatocyte growth factor and each of these one or more compounds is from 1:1 to 1:50 in a lyophilized composition . Before lyophilization, the pH of the aqueous solution is adjusted to 4.5-6.5. The hepatocyte growth factor in the proposed embodiment may be of natural or artificial origin (obtained using a genetic engineering technique or may be a modified hepatocyte growth factor that is modified by substitution, deletion, addition or insertion, or a combination thereof using one or more, preferably 1 -10 amino acid residues in the amino acid sequence of the naturally occurring hepatocyte growth factor in such a range that the modified amino acid sequence retains the activity of the hepatocyte growth factor.). The modified hepatocyte growth factor may be one having 80% homology to the amino acid sequence of naturally occurring hepatocyte growth factor. As a stabilizer, it is proposed to use one, two or more of the presented substances to choose from: arginine, histidine, lysine, meglumine, glutamic acid, aspartic acid, proline, creatine, creatinine, tris(hydroxymethyl)methylamine and their pharmaceutically acceptable salts.

Общая масса лиофилизированного состава по твердым частицам составляет 100,0 частей по массе, содержит от 0,1 до 4,5 частей по массе фактора роста гепатоцитов, от 20,0 до 95,0 частей по массе трегалозы (в пересчете на эквивалентное количество ангидрида трегалозы), и от 1,5 до 60,0 частей по массе соединения (аргинин, гистидин, лизин, меглюмин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, пролин, креатин, креатинин, трис(гидроксиметил)метиламин и/или их фармацевтически приемлемых солей). В одном варианте осуществления при том, что общая масса лиофилизированного состава по твердым частицам составляет 100,0 частей по массе, фактор роста гепатоцитов составляет от 0,3 до 4,4 частей по массе, трегалоза составляет от 30,0 до 94,0 частей по массе и соединения (аргинин, гистидин, лизин, меглюмин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, пролин, креатин, креатинин, трис(гидроксиметил)метиламин и их фармацевтически приемлемые соли) составляет от 3,0 до 59,0 частей по массе. В другом варианте осуществления на фактор роста гепатоцитов составляет от 0,3 до 4,4 частей по массе, трегалоза составляет от 30,0 до 94,0 частей по массе, соединения (аргинин, гистидин, лизин, меглюмин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, пролин, креатин, креатинин, трис(гидроксиметил)метиламин и их фармацевтически приемлемые соли) составляют от 3,0 до 59,0 частей по массе и полисорбат 80 составляет от 0,026 до 0,7 частей по массе.The total weight of the lyophilized formulation on solid particles is 100.0 parts by weight, contains from 0.1 to 4.5 parts by weight of hepatocyte growth factor, from 20.0 to 95.0 parts by weight of trehalose (in terms of the equivalent amount of anhydride trehalose), and from 1.5 to 60.0 parts by weight of a compound (arginine, histidine, lysine, meglumine, glutamic acid, aspartic acid, proline, creatine, creatinine, tris(hydroxymethyl)methylamine and/or their pharmaceutically acceptable salts) . In one embodiment, with the total weight of the lyophilized composition on solid particles being 100.0 parts by weight, hepatocyte growth factor is from 0.3 to 4.4 parts by weight, trehalose is from 30.0 to 94.0 parts by weight and compounds (arginine, histidine, lysine, meglumine, glutamic acid, aspartic acid, proline, creatine, creatinine, tris(hydroxymethyl)methylamine and their pharmaceutically acceptable salts) is from 3.0 to 59.0 parts by weight. In another embodiment, hepatocyte growth factor is from 0.3 to 4.4 parts by weight, trehalose is from 30.0 to 94.0 parts by weight, compounds (arginine, histidine, lysine, meglumine, glutamic acid, aspartic acid , proline, creatine, creatinine, tris(hydroxymethyl)methylamine and their pharmaceutically acceptable salts) are from 3.0 to 59.0 parts by weight and polysorbate 80 is from 0.026 to 0.7 parts by weight.

К недостаткам представленного способа относится использование модифицированного фактор роста гепатоцитов, который не в полной мере гомологичен человеческому, а также то, что лиофилизат содержит, только фактор роста гепатоцитов, без культуры клеток печени. Применение HGF приводит к резкому увеличению (скачку) концентрации фактора роста гепатоцитов в органе мишени и неконтролируемому делению гепатоцитов, что ведет к истощению органа. Еще одним недостатком является наличие большого количества вспомогательных и балластных веществ, варьируемых в большом диапазоне концентраций, порядка 100, что может затруднить проведение качественного и количественного анализа основного действующего вещества. Применение в технологической линии метода фильтрации приводит к потерям активного вещества на фильтре.The disadvantages of the presented method include the use of a modified hepatocyte growth factor, which is not fully homologous to the human one, as well as the fact that the lyophilisate contains only hepatocyte growth factor, without liver cell culture. The use of HGF leads to a sharp increase (jump) in the concentration of hepatocyte growth factor in the target organ and uncontrolled division of hepatocytes, which leads to depletion of the organ. Another disadvantage is the presence of a large number of auxiliary and ballast substances, varying in a wide range of concentrations, about 100, which can make it difficult to conduct a qualitative and quantitative analysis of the main active substance. The use of the filtration method in the production line leads to losses of the active substance on the filter.

Известен способ получения жизнеспособных клеток печени человека, в том числе печеночных стволовых клеток/клеток предшественников, [РФ патент №2346981 (2003), МПК C12N 5/00, C12N 5/08, А61К 35/407, А61Р 1/16, G01N 33/00, А61К 48/00, С12Р 21/02].A known method of obtaining viable human liver cells, including hepatic stem/progenitor cells, [RF patent No. 2346981 (2003), IPC C12N 5/00, C12N 5/08, A61K 35/407, A61P 1/16, G01N 33 /00, A61K 48/00, C12R 21/02].

Согласно патенту, после забора органа, печень промывают стерильным физиологическим раствором и расщепляют перфузатором с использованием буферных растворов. Полученную клеточную суспензию обогащают живыми клетками и центрифугируют. Клетки помещают в криомешки и подвергают замораживанию. Хранят и транспортируют клетки при температуре - 120°С. Получаемая клеточная популяция содержит более 80% жизнеспособных клеток перед криоконсервацией, более 70% жизнеспособных клеток после оттаивания, из которых более 75% являются гепатоцитами.According to the patent, after organ harvesting, the liver is washed with sterile saline and digested with a perfusator using buffer solutions. The resulting cell suspension is enriched with living cells and centrifuged. The cells are placed in cryobags and subjected to freezing. Cells are stored and transported at -120°C. The resulting cell population contains more than 80% of viable cells before cryopreservation, more than 70% of viable cells after thawing, of which more than 75% are hepatocytes.

Недостатком данного изобретения, является то, что для клеток печени предусматривают хранение в парах жидкого азота, что усложняет процедуру хранения и транспортировки данной культуры клеток. Применение возможно только в клиниках имеющих специализированное оборудование для работы с криогенным клеточным материалом. Лиофилизат культуры клеток печени авторами не исследовался.The disadvantage of this invention is that the liver cells provide for storage in liquid nitrogen vapor, which complicates the storage and transportation of this cell culture. Application is possible only in clinics with specialized equipment for working with cryogenic cellular material. The liver cell culture lyophilisate was not studied by the authors.

К недостаткам также следует отнести то, что источником получения гепатоцитов является печень донора или неонатальная печень. Это усложняет процедуру по изъятию органа и является затруднительным для организации промышленного производства препарата.The disadvantages also include the fact that the source of obtaining hepatocytes is the liver of a donor or neonatal liver. This complicates the procedure for the removal of the organ and is difficult to organize the industrial production of the drug.

Наиболее близким (прототип) является способ получения лиофилизата из гепатоцитов человека [Международная заявка WO 2012/154016, МПК А61К 35/48, А61К 35/54, А61К 35/407, C12N 5/073; Каюпов Б.А. и др. «Разработка лиофилизированного препарата из гепатоцитов человека, для лечения печеночной недостаточности» // Клиническая медицина Казахстана. - 2013. - №. 4 (30)].The closest (prototype) is a method of obtaining a lyophilisate from human hepatocytes [International application WO 2012/154016, IPC A61K 35/48, A61K 35/54, A61K 35/407, C12N 5/073; Kayupov B.A. and others. "Development of a lyophilized drug from human hepatocytes for the treatment of liver failure" // Clinical Medicine of Kazakhstan. - 2013. - no. 4 (30)].

Метод получения изолированных гепатоцитов был разработан в середине 60-х годов прошлого столетия, и существует большое количество методов его совершенствования. Известный способ осуществляют следующим образом: в качестве источника материала для получения гепатоцитов человека используют печень плода. Забор материала производится непосредственно после прерывания беременности. Производят аттестацию фетального материала, в соответствии международным стандартам на инфицированность тканей, используемых при проведении терапии фетальными тканями и клетками. Фетальный материал тестируют методом ПЦР на следующие возбудители: chlamydia trachomatis, chlamydia pnevmonica, ureaplasmas urelyticum, ureaplasmas parvum, mycoplasma hominis, mycoplasma genitalium, neiseria gonorrhoeae т.1, neiseria gonorrhoeae т.2, trichomonas vaginalis, cytomegalovirus, gardnerella vaginalis, HSV 1,2 (герпевирус), HSV 16 (папиломавирус), HPV 18 (па- пиломавирус), HSV 6 (герпевирус), Candida albicans, treponema pallidum, toxoplasma gondii, mycobacterium tuberculosis, hepatitis A virus, hepatitis В virus, hepatitis С virus, hepatitis D virus, hepatitis G virus, brucelle species, epshteina Barr virus, salmonella. Методом иммуноферментного анализа (ИФА) фетальный материал исследуется на вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). В основе методики выделения фетальных гепатоцитов лежит комбинированная (механическая и химическая) фрагментация эмбриональной печени. Для дезагрегации ткань печени инкубируют в ферментном растворе, содержащем 0.25%-ный раствор трипсина и 0.05 раствор коллагеназы в соотношении 1:1 в течение 20-30 минут с последующим многократным суспендированием до получения одноклеточной суспензии, далее последнюю трижды отмывают центрифугированием при 700 об/мин. Полученную взвесь первичных диссоциированных клеток культивируют в ростовой среде RPMI+F12 (1:1), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1 мкг/мл инсулина, 10 мкг/мл гентамицина, с добавлением дексаметазона 0.00125 мл/мл, до достижения клеточной культуры конфлюэнтного состояния. Жизнеспособность клеток определяли с использованием витального красителя - трипановая синь: каплю полученной суспензии окрашивали 0,1% раствором трипанового синего. Гепатоциты, подлежащие лиофилизации, выращивают в оптимальных условиях до начала стационарной фазы роста или окончания процесса культивирования в питательной среде, рост должен быть обильным. Среда, используемая для лиофилизации гепатоцитов:The method of obtaining isolated hepatocytes was developed in the mid-60s of the last century, and there are a large number of methods for its improvement. The known method is carried out as follows: as a source of material for obtaining human hepatocytes using the fetal liver. The material is taken immediately after the termination of pregnancy. The fetal material is certified in accordance with international standards for infection of tissues used in therapy with fetal tissues and cells. Fetal material is tested by PCR for the following pathogens: chlamydia trachomatis, chlamydia pnevmonica, ureaplasmas urelyticum, ureaplasmas parvum, mycoplasma hominis, mycoplasma genitalium, neiseria gonorrhoeae v.1, neiseria gonorrhoeae v.2, trichomonas vaginalis, cytomegalovirus, gardnerella vaginalis, HSV 1, 2 (herpevirus), HSV 16 (papillomavirus), HPV 18 (papillomavirus), HSV 6 (herpesvirus), Candida albicans, treponema pallidum, toxoplasma gondii, mycobacterium tuberculosis, hepatitis A virus, hepatitis B virus, hepatitis C virus, hepatitis D virus, hepatitis G virus, brucelle species, epshteina Barr virus, salmonella. By enzyme immunoassay (ELISA) fetal material is examined for the human immunodeficiency virus (HIV). The technique for isolating fetal hepatocytes is based on combined (mechanical and chemical) fragmentation of the embryonic liver. For disaggregation, liver tissue is incubated in an enzyme solution containing 0.25% trypsin solution and 0.05 collagenase solution in a ratio of 1:1 for 20-30 minutes, followed by repeated suspension until a single-cell suspension is obtained, then the latter is washed three times by centrifugation at 700 rpm . The resulting suspension of primary dissociated cells is cultivated in RPMI+F12 (1:1) growth medium containing 10% fetal bovine serum, 1 μg/ml insulin, 10 μg/ml gentamicin, with the addition of dexamethasone 0.00125 ml/ml, until the cell culture reaches confluent states. Cell viability was determined using a vital dye - trypan blue: a drop of the resulting suspension was stained with a 0.1% solution of trypan blue. The hepatocytes to be lyophilized are grown under optimal conditions until the start of the stationary phase of growth or the end of the cultivation process in a nutrient medium, growth should be abundant. Medium used for lyophilization of hepatocytes:

1. Желатин - 1 г; 1. Gelatin - 1 g;

2. Сахароза - 10 мг;2. Sucrose - 10 mg;

3. Вода дистиллированная - 100 мл;3. Distilled water - 100 ml;

4. Молоко обезжиренное;4. Skimmed milk;

5. 6%-ный раствор желатины - 2,5 мл;5. 6% gelatin solution - 2.5 ml;

6. 10%-ный раствор сахарозы - 0,5 мл;6. 10% sucrose solution - 0.5 ml;

7. Сыворотка фетальная - 2,5.7. Fetal serum - 2.5.

Для успешной лиофилизации плотность в защитной среде должна быть как можно более высокой -10⁹ -10¹⁰ клеток в 1 мл. Полученную суспензию разливают в ампулы или в пенициллиновые флаконы из нейтрального стекла по 1 мл, замораживают при температуре от - 20° до -70°, затем высушивают на аппарате лиофильной сушки. В период высушивания для предотвращения выноса активных веществ добавляли в качестве структурообразователей 6%-ный раствор желатины 2,5 мл и 10%-ный раствор сахарозы 0,5 мл.For successful lyophilization, the density in the protective medium should be as high as possible -10 ⁹ -10 ¹⁰ cells per 1 ml. The resulting suspension is poured into ampoules or 1 ml neutral glass penicillin vials, frozen at a temperature of -20° to -70°, then dried in a freeze-dryer. During the drying period, to prevent the removal of active substances, a 6% gelatin solution (2.5 ml) and a 10% sucrose solution (0.5 ml) were added as structurants.

К недостатку известного лиофилизата, следует отнести то, что в качестве клеток печени использованы только отдельно выделенные гепатоциты, но не культура клеток печени. Сами гепатоциты не производят фактор роста гепатоцитов. Кроме того, согласно изобретению в качестве фактора роста авторы используют инсулин и дексаметазон, а не HGF.The disadvantage of the known lyophilisate is that only separately isolated hepatocytes were used as liver cells, but not a culture of liver cells. Hepatocytes themselves do not produce hepatocyte growth factor. In addition, according to the invention, the authors use insulin and dexamethasone as a growth factor, and not HGF.

Еще одним недостатком является то, что источником получения гепатоцитов является фетальная печень плода. Это усложняет процедуру по изъятию органа и является затруднительным для организации промышленного производства препарата. Для достижения терапевтического эффекта и избегания реакции отторжения клеток, необходимо сопоставление группы крови и резус фактора реципиента и донора, у которого была взята печень для получения гепатоцитов, что делает препарат узконаправленным для конкретного пациента и исключает универсальность его применения. Так как материал забирается у человека, то возникает необходимость в контроле безопасности материала (отсутствие таких возбудителей как: chlamydia trachomatis, chlamydia pnevmonica, ureaplasmas urelyticum, ureaplasmas parvum, mycoplasma hominis, mycoplasma genitalium, neiseria gonorrhoeae т.1, neiseria gonorrhoeae т.2, trichomonas vaginalis, cytomegalovirus, gardnerella vaginalis, HSV 1,2 (герпевирус), HSV 16 (папиломавирус), HPV 18 (папиломавирус), HSV 6 (герпевирус), Candida albicans, treponema pallidum, toxoplasma gondii, mycobacterium tuberculosis, hepatitis A virus, hepatitis В virus, hepatitis С virus, hepatitis D virus, hepatitis G virus, bracelle species, epshteina Ban-virus, salmonella.), что ведет к удорожанию, трудоемкости и длительности процесса производства. Использование трипсина при обработке материала для подготовки клеток ставит под сомнение наличие в лиофилизате фактора роста гепатоцитов в связи с протеолитическим действием фермента.Another disadvantage is that the source of hepatocytes is the fetal liver of the fetus. This complicates the procedure for the removal of the organ and is difficult to organize the industrial production of the drug. To achieve a therapeutic effect and avoid cell rejection, it is necessary to match the blood type and Rh factor of the recipient and the donor from whom the liver was taken to obtain hepatocytes, which makes the drug narrowly targeted for a particular patient and excludes the universality of its use. Since the material is taken from a person, it becomes necessary to control the safety of the material (the absence of such pathogens as: chlamydia trachomatis, chlamydia pnevmonica, ureaplasmas urelyticum, ureaplasmas parvum, mycoplasma hominis, mycoplasma genitalium, neiseria gonorrhoeae v.1, neiseria gonorrhoeae v.2, trichomonas vaginalis, cytomegalovirus, gardnerella vaginalis, HSV 1,2 (herpevirus), HSV 16 (papillomavirus), HPV 18 (papillomavirus), HSV 6 (herpevirus), Candida albicans, treponema pallidum, toxoplasma gondii, mycobacterium tuberculosis, hepatitis A virus, hepatitis B virus, hepatitis C virus, hepatitis D virus, hepatitis G virus, bracelle species, epshteina Ban-virus, salmonella.), which leads to higher cost, labor intensity and length of the production process. The use of trypsin in the processing of material for cell preparation casts doubt on the presence of hepatocyte growth factor in the lyophilisate due to the proteolytic action of the enzyme.

Задачей настоящего изобретения является составление фармацевтической композиции для получения на ее основе устойчивого при хранении лиофилизата обогащенного фактором роста гепатоцитов.The objective of the present invention is to formulate a pharmaceutical composition for obtaining on its basis a storage-stable lyophilisate enriched with hepatocyte growth factor.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение универсального препарата-лиофилизата, стимулирующего регенерацию печени при печеночной недостаточности за счет точного дозирования и постепенного высвобождения биологически активного компонента - HGF, который как раз обеспечивает стимуляцию регенерации клеток печени.The technical result of the invention is to obtain a universal lyophilisate drug that stimulates liver regeneration in liver failure due to accurate dosing and gradual release of the biologically active component - HGF, which just provides stimulation of liver cell regeneration.

Указанный технический результат достигается тем, что фармацевтическая композиция для получения лиофилизата пролонгированного действия, обогащенного фактором роста гепатоцитов HGF, стимулирующая пролиферацию гепатоцитов печени, содержащая клеточную популяцию, отличается тем, что в качестве клеточной популяции и источника HGF, используют культуру клеток печени, а в качестве структурообразователя и пролонгатора растворы поливинилпирролидона, сахарозы и альбумина, при следующем соотношении (масс. части, 10):This technical result is achieved by the fact that the pharmaceutical composition for obtaining a lyophilisate of prolonged action enriched with hepatocyte growth factor HGF, stimulating the proliferation of hepatocytes of the liver, containing a cell population, is characterized in that a liver cell culture is used as a cell population and a source of HGF, and as structurant and prolongator solutions of polyvinylpyrrolidone, sucrose and albumin, in the following ratio (mass parts, 10):

культура клеток печени, содержащая HGFliver cell culture containing HGF 5,05.0 6%-ный раствор поливинилпирролидона6% solution of polyvinylpyrrolidone 2,52.5 10%-ный раствор альбумина10% albumin solution 2,02.0 10%-ный раствор сахарозы10% sucrose solution 0,50.5

Указанный технический результат также достигается тем, что в фармацевтической композиции, в качестве источника клеток печени используют клетки печени неонатальных крысят.This technical result is also achieved by the fact that in the pharmaceutical composition, liver cells of neonatal rat pups are used as a source of liver cells.

Лиофилизат со структурообразующим агентом, полученный из заявляемой фармацевтической композиции, пригоден для приготовления раствора для инъекционного применения для целей лечения печеночной недостаточности, он представляет комплекс в виде культуры клеток печени, обогащенной HGF, а при добавлении фармацевтически приемлемого разбавителя он пригоден для внутривенного введения.The lyophilisate with a structure-forming agent obtained from the claimed pharmaceutical composition is suitable for preparing an injection solution for the treatment of liver failure, it is a complex in the form of a liver cell culture enriched with HGF, and when a pharmaceutically acceptable diluent is added, it is suitable for intravenous administration.

Основным отличием заявляемого изобретения является то, что фармацевтическая композиция и полученный из нее лиофилизат состоят из культуры клеток печени, которые являются естественным источником фактора роста гепатоцитов (HGF), в противоположность лиофилизату, состоящему только из клеток гепатоцитов, как в прототипе. Отличительной особенностью лиофилизата культуры клеток печени является то, что биологически активный компонент лиофилизата, которым является HGF, высвобождается постепенно, тем самым удается избежать резкого скачка повышения концентрации HGF и обеспечить более долговременное действие препарата, чему также способствуют добавленные в композицию и сохранившиеся в сухом лиофилизате поливинилпирролидон, альбумин и сахароза, выступающие в качестве структурообразователя и пролонгатора, кроме того они позволяют предотвратить потерю активных веществ в процессе лиофильной сушки.The main difference of the claimed invention is that the pharmaceutical composition and the lyophilisate obtained from it consist of a culture of liver cells, which are a natural source of hepatocyte growth factor (HGF), as opposed to a lyophilisate consisting only of hepatocyte cells, as in the prototype. A distinctive feature of the liver cell culture lyophilisate is that the biologically active component of the lyophilisate, which is HGF, is released gradually, thereby avoiding a sharp increase in the concentration of HGF and ensuring a longer-term effect of the drug, which is also facilitated by polyvinylpyrrolidone added to the composition and preserved in the dry lyophilisate. , albumin and sucrose, acting as a structurant and prolongator, in addition, they prevent the loss of active substances during freeze-drying.

Еще одним, отличием от прототипа - лиофилизата гепатоцитов является то, что в заявляемом способе лиофилизат культуры клеток печени, обогащенный фактором роста гепатоцитов, получен из клеток печени неонатальных крысят, что позволит исключить необходимость проведение анализов на наличие заболеваний, и позволяет организовать промышленное производство препарата.Another difference from the prototype - hepatocyte lyophilisate is that in the claimed method, the liver cell culture lyophilisate, enriched with hepatocyte growth factor, is obtained from the liver cells of neonatal rat pups, which will eliminate the need for tests for the presence of diseases, and allows organizing industrial production of the drug.

Фактор роста гепатоцитов (HGF) в лиофилизате обеспечивает стимуляцию регенерации клеток печени, универсальность применения, высокую концентрацию активного вещества, точное дозирование, стандартизацию по основному действующему веществу.Hepatocyte growth factor (HGF) in the lyophilisate provides stimulation of liver cell regeneration, versatility of use, high concentration of the active substance, accurate dosing, standardization according to the main active substance.

Состав компонентов предлагаемой фармацевтической композиции культуры клеток печени, обогащенной HGF, подобран экспериментальным путем и выражается в виде массовых частей (10 ч):The composition of the components of the proposed pharmaceutical composition of a liver cell culture enriched with HGF was selected experimentally and is expressed as mass parts (10 h):

культура клеток печени неонатальных крысят в виде тугой взвеси содержащейculture of liver cells of neonatal rat pups in the form of a hard suspension containing

HGFHGF 5,05.0 6%-ный раствор поливинилпирролидона6% solution of polyvinylpyrrolidone 2,52.5 10%-ный раствор альбумина10% albumin solution 2,02.0 10%-ный раствор сахарозы10% sucrose solution 0,50.5

Разработан способ получения лиофилизата культуры клеток печени обогащенного фактором роста гепатоцитов: для этого клетки печени культивируют в течение 5 дней для достижения максимальной пролиферативной активности (максимальное содержание HGF - 76,8 нг/мл), затем клетки печени суспендируют в 9 частях среды высушивания, добавляют структурообразователь и пролонгатор в соответствие с формулой и лиофилизируют.A method has been developed for obtaining a lyophilisate of a liver cell culture enriched with hepatocyte growth factor: for this, liver cells are cultivated for 5 days to achieve maximum proliferative activity (maximum HGF content is 76.8 ng/ml), then liver cells are suspended in 9 parts of the drying medium, add structurant and prolongator in accordance with the formula and freeze-dried.

Заявляемый лиофилизат обладает ростостимулирующей активностью обусловленной наличием в составе фактора роста гепатоцитов HGF и стимулирует пролиферацию гепатоцитов. Универсальность применения препарата достигается за счет гомологичности крысиного HGF человеческому. Терапевтический эффект достигается за счет стимуляции регенерации гепатоцитов, вырабатываемых клетками печени.The claimed lyophilisate has growth-stimulating activity due to the presence of HGF in the hepatocyte growth factor and stimulates the proliferation of hepatocytes. The versatility of the use of the drug is achieved due to the homology of rat HGF to human. The therapeutic effect is achieved by stimulating the regeneration of hepatocytes produced by liver cells.

Для культуры клеток печени, полученной из печени неонатальных крысят, в качестве рабочей среды используют коллагеназу. Оценку жизнеспособности культивируемых клеток печени определяют по увеличению концентрации HGF в среде культивирования. Наибольшая концентрация HGF (76,8 нг/мл) в культуре клеток печени при оптимальной величине рН рабочего раствора 7,6 достигается на 5 сутки, что соответствует максимуму пролиферативной активности эмбриональных клеток печени и, следовательно, оптимальной пригодности клеточного материала. Степень жизнеспособности клеток после выделения и очистки составила в среднем 98,8%. По достижении наибольшей концентрации HGF культуру клеток готовят к лиофилизации, для этого клетки в виде концентрированной взвеси размещают в стерильные пробирки с крышкой по 5 мл. Клетки печени суспендируют в 9 частях среды высушивания, концентрация клеток в готовой суспензии должна составлять 10 об%: [5 мл суспензии культуры клеток печени, содержащей 2 × 10⁶ клеток в 1 мл, а также структурообразователь: 2,5 мл 6% раствора поливинилпирролидона, 10%-ный раствор альбумина (2 мл) и 10%-ный раствор сахарозы (0,5 мл)]. Лиофилизацию проводят при температуре -70°С в круглодонной колбе на 50 мл, время высушивания 24 часа, используют лиофильную сушку BETA 2-8LD plus (Германия). Хранение осуществляют при температуре -70°С.For the culture of liver cells obtained from the liver of neonatal rat pups, collagenase is used as a working medium. The assessment of the viability of cultured liver cells is determined by the increase in the concentration of HGF in the culture medium. The highest concentration of HGF (76.8 ng/ml) in the culture of liver cells at the optimum pH of the working solution of 7.6 is reached on the 5th day, which corresponds to the maximum proliferative activity of embryonic liver cells and, therefore, the optimal suitability of the cell material. The degree of cell viability after isolation and purification averaged 98.8%. Upon reaching the highest concentration of HGF, the cell culture is prepared for lyophilization; for this, the cells in the form of a concentrated suspension are placed in sterile tubes with a 5 ml cap. Liver cells are suspended in 9 parts of the drying medium, the concentration of cells in the finished suspension should be 10 vol%: [5 ml of a liver cell culture suspension containing 2 × 10 ⁶ cells per 1 ml, and also a structurant: 2.5 ml of a 6% solution of polyvinylpyrrolidone , 10% albumin solution (2 ml) and 10% sucrose solution (0.5 ml)]. Lyophilization is carried out at a temperature of -70°C in a 50 ml round bottom flask, drying time is 24 hours, freeze drying BETA 2-8LD plus (Germany) is used. Storage is carried out at a temperature of -70°C.

Влияние фармацевтической композиции лиофилизата культуры клеток печени пролонгированного действия, обогащенной HGF, изучали в эксперименте на крысах линии Wistar в течение 6 дней. Моделирование острого токсического повреждения печени выполнены путем подкожного введения четыреххлористого углерода чистого для анализов из расчета 0,5 мг\100 г массы животного по А. Фишеру. Опытным животным осуществляли подкожную инъекцию 0,5 мл лиофилизата культуры клеток печени через 12 часов после введения ССl4. Контрольным животным осуществляли введение физиологического раствора того же объема. Уже на 3 сутки эксперимента результаты показали, что введение лиофилизата приводит к выживанию 53,3% крыс (рфр.=0,2189), в то время как в контрольной группе выжило 40% (рфр=0,0091). К 6-м суткам исследования летальность в контрольной группе составила 100%», в то время как в опытной группе количество умерших особей не менялось с 3-го дня эксперимента, что составило 46,7%.The effect of a pharmaceutical composition of a lyophilizate of a long-acting liver cell culture enriched with HGF was studied in an experiment on Wistar rats for 6 days. Modeling of acute toxic liver damage was performed by subcutaneous injection of pure carbon tetrachloride for analysis at the rate of 0.5 mg\100 g of animal weight according to A. Fischer. Experimental animals were injected subcutaneously with 0.5 ml of a liver cell culture lyophilisate 12 hours after CCl4 administration. Control animals were injected with physiological saline of the same volume. Already on the 3rd day of the experiment, the results showed that the introduction of the lyophilisate leads to the survival of 53.3% of rats (pf = 0.2189), while in the control group 40% survived (pf = 0.0091). By the 6th day of the study, lethality in the control group was 100%, while in the experimental group the number of dead individuals did not change from the 3rd day of the experiment, which amounted to 46.7%.

На фиг. 1 представлена колба объемом 50 мл для проведения лиофилизации;In FIG. 1 shows a 50 ml flask for lyophilization;

На фиг. 2 показана лиофилизированная культура клеток печени, обогащенная HGF устойчивая при хранении;In FIG. 2 shows a lyophilized HGF-enriched liver cell culture that is stable during storage;

На фиг. 3 приведено патоморфологическое исследование морфологической структуры ткани печени, видно токсическое повреждение печени, после введения физраствора на вторые сутки эксперимента;In FIG. 3 shows a pathomorphological study of the morphological structure of the liver tissue, showing toxic damage to the liver after the administration of saline on the second day of the experiment;

На фиг. 4 - морфологическая структура ткани печени, после введения лиофилизата культуры клеток печени на вторые сутки эксперимента.In FIG. 4 - morphological structure of the liver tissue after the introduction of the liver cell culture lyophilisate on the second day of the experiment.

В доступной литературе отсутствуют сведения о способе изготовления фармацевтической композиции для лиофилизата культуры клеток печени, обогащенного HGF, по отличительным признакам заявляемого способа. Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с ближайшим аналогом позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию изобретения «новизна». Заявляемое техническое решение обеспечивает достижение усматриваемого заявителем технического результата, а именно - обеспечение возможности получения фармацевтической композиции лиофилизата культуры клеток печени, с повышенным содержанием концентрации активного вещества - HGF до 240 (198-251) нг/мл, что обеспечивает терапевтический эффект.In the available literature, there is no information on the method of manufacturing a pharmaceutical composition for a liver cell culture lyophilisate enriched with HGF, according to the distinctive features of the proposed method. Comparative analysis of the proposed technical solution with the closest analogue allows us to conclude that the proposed technical solution meets the invention criterion of "novelty". The claimed technical solution ensures the achievement of the technical result envisaged by the applicant, namely, the possibility of obtaining a pharmaceutical composition of a liver cell culture lyophilisate with an increased concentration of the active substance - HGF up to 240 (198-251) ng / ml, which provides a therapeutic effect.

Изложенное позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «изобретательский уровень».The foregoing allows us to conclude that the proposed technical solution meets the criterion of "inventive step".

Фармацевтическая композиция и способ получения фармацевтической композиции лиофилизата культуры клеток печени, обогащенной HGF со структурообразователем, составляющие заявляемое изобретение, предназначены для использования в медицине, а именно в экспериментальной медицине, а также в фармацевтической промышленности. Возможность осуществления предлагаемого технического решениям подтверждена описанными в заявке приемами и средствами, следовательно, заявляемое изобретение соответствует критерию патентоспособности «промышленная применимость». Ниже приведены примеры осуществления изобретения.Pharmaceutical composition and method for producing a pharmaceutical composition of a liver cell culture lyophilizate enriched with HGF with a structurant, constituting the claimed invention, are intended for use in medicine, namely in experimental medicine, as well as in the pharmaceutical industry. The possibility of implementing the proposed technical solutions is confirmed by the methods and means described in the application, therefore, the claimed invention meets the criterion of patentability "industrial applicability". Below are examples of the invention.

Пример 1. Способ изготовления фармацевтической композиции для лиофилизата культуры, клеток печени, обогащенной HGFExample 1. Method for the manufacture of a pharmaceutical composition for a lyophilisate of a culture, liver cells, enriched with HGF

Неонатальным крысятам вводят внутрибрюшинно раствор тиопентал-натрия в виде 2,5% раствора и после наступления наркоза проводят срединную лапаротомию. Печень извлекают и до начала работ в клеточном боксе по получению клеток хранят в стерильной емкости с рабочей питательной средой.Neonatal rat pups are injected intraperitoneally with a solution of sodium thiopental in the form of a 2.5% solution, and after the onset of anesthesia, a median laparotomy is performed. The liver is removed and before the start of work in the cell box to obtain cells, it is stored in a sterile container with a working nutrient medium.

В чашку Петри наливают 1 мл рабочей среды. Длинным пинцетом извлекают органы из емкости с забора в чашку Петри. Разводят коллагеназу, набирают 1 мл среды с коллагеназой в шприц, меняют иглу на инсулиновую. Придерживая ткани пинцетом, равномерно многократно инъецируют коллагеназу по всему объему ткани печени методом инфильтрации. Накрывают чашку другой (одинакового диаметра). Ставят в термостат.Pour 1 ml of working medium into a Petri dish. With long tweezers, organs are removed from the container from the fence into a Petri dish. Collagenase is diluted, 1 ml of medium with collagenase is drawn into a syringe, the needle is changed to insulin. Holding the tissues with tweezers, collagenase is evenly repeatedly injected throughout the entire volume of the liver tissue by infiltration. Cover the cup with another (of the same diameter). Put in a thermostat.

С помощью малого пинцета и лезвия скользящими движениями измельчают ткань печени, пинцетом удаляют сосуды и капсулу. Добавляют раствор коллагеназы, пинцетом зигзагообразными движениями равномерно распределяют взвесь по объему среды. Ставят в термостат на 10 минут.With the help of small tweezers and a blade, the liver tissue is crushed with sliding movements, the vessels and the capsule are removed with tweezers. Collagenase solution is added, the suspension is evenly distributed over the volume of the medium with zigzag movements with tweezers. Put in a thermostat for 10 minutes.

Извлекают из термостата. Повторно измельчают фрагменты и при помощи шприца собирают взвесь из чашки. Далее продавливают макрофрагменты ферментативно обработанной ткани через серию медных сит с постепенно уменьшающимся размером ячеек и через иглу для внутримышечной инъекции. Все клеточные элементы, прилипшие к ситам и стенкам иглы, смывают рабочей средой в пробирку для центрифугирования.Removed from the thermostat. The fragments are crushed again and a suspension is collected from the cup using a syringe. Next, macrofragments of the enzymatically treated tissue are pressed through a series of copper sieves with a gradually decreasing mesh size and through a needle for intramuscular injection. All cellular elements adhering to the sieves and the walls of the needle are washed off with the working medium into a centrifugation tube.

Клеточную взвесь вместе со всеми промывными растворами объединяют в пробирке для центрифугирования. Устанавливают 1700-1800 оборотов, время 5 минут. После центрифугирования при помощи шприца забирают среду с коллагеназой из пробирки. Добавляют в пробирку рабочей среды до прежнего количества, встряхивают, центрифугирование повторяют 2 раза.The cell suspension along with all washing solutions are combined in a centrifuge tube. Set 1700-1800 rpm, time 5 minutes. After centrifugation with a syringe, the medium with collagenase is taken from the tube. Add to the test tube of the working medium to the previous amount, shake, centrifugation is repeated 2 times.

Надосадочную жидкость удаляют до уровня осажденной клеточной взвеси. Повторно добавляют в пробирки рабочую среду, проводят центрифугирование при 1500 об/мин в течение 30 сек. Затем следует этап разделения в градиенте фиколла, добиваясь удаления клеточного детрита, элементов крови, крупных фрагментов. В каждую пробирку с клеточной взвесью добавляют фиколл в уменьшающейся концентрации. После центрифугирования клеточную взвесь собирают и повторно отмывают рабочей средой (5 минут при 1700 об/мин). Подсчет жизнеспособности клеток проводят с помощью теста на исключение красителя. В суспензию клеток добавляют 0,4%-ный водный раствор трипанового синего (Sigma,CIIIA) и в камере Фукса-Розенталя подсчитывают число неокрашенных и окрашенных клеток. Культивирование эмбриональных клеток печени проводят в течении 5 суток при оптимальной величины рН рабочих растворов 7,6.The supernatant is removed to the level of the precipitated cell suspension. The working medium is re-added to the tubes, centrifugation is carried out at 1500 rpm for 30 seconds. This is followed by the stage of separation in the ficoll gradient, achieving the removal of cellular detritus, blood elements, and large fragments. Decreasing concentration of ficoll is added to each tube with cell suspension. After centrifugation, the cell suspension is collected and washed again with working medium (5 minutes at 1700 rpm). Cell viability was calculated using a dye exclusion test. A 0.4% aqueous solution of trypan blue (Sigma, CIIIA) is added to the cell suspension, and the number of unstained and stained cells is counted in a Fuchs-Rosenthal chamber. Cultivation of embryonic liver cells is carried out for 5 days at the optimum pH value of the working solutions of 7.6.

Определение HGF в среде культивирования в динамике, предложенное нами, позволяет независимо от календарного срока культивирования выявить максимум пролиферативной активности эмбриональных клеток печени и, тем самым, обеспечить оптимальную пригодность клеточного материала. При оценке жизнеспособности культивируемых клеток печени по предлагаемому способу было выявлено, что содержание HGF менялось в динамике исследования:The determination of HGF in the culture medium in dynamics, proposed by us, makes it possible, regardless of the calendar period of cultivation, to reveal the maximum proliferative activity of embryonic liver cells and, thereby, to ensure the optimal suitability of the cellular material. When assessing the viability of cultured liver cells according to the proposed method, it was found that the content of HGF changed in the course of the study:

среда после центрифугирования клеток (супернатант)- 0,76 (0,57-1,09) нг/мл;medium after cell centrifugation (supernatant) - 0.76 (0.57-1.09) ng/ml;

среда культивирования через 2-е суток - 24,3 (18-25,6) нг/мл;cultivation medium after 2 days - 24.3 (18-25.6) ng/ml;

среда культивирования через 5 суток - 76,8 (68,4-80) нг/мл;cultivation medium after 5 days - 76.8 (68.4-80) ng/ml;

среда культивирования через 6 суток - 40,2 (36,1-41) нг/мл.cultivation medium after 6 days - 40.2 (36.1-41) ng/ml.

Из приведенных данных следует, что на 5-е сутки культивирования содержание HGF было максимальным. Выявлено достоверное увеличение количества регуляторного пептида на 5-е сутки до 76,8 (68,4-80) нг/мл против 24,3 (18- 25,6) нг/мл на 2-е сутки (р_U=0,003).From the above data it follows that on the 5th day of cultivation, the content of HGF was maximum. A significant increase in the amount of the regulatory peptide on the 5th day to 76.8 (68.4-80) ng/ml versus 24.3 (18-25.6) ng/ml on the 2nd day was revealed (p _U = 0.003) .

При достижении наибольшей концентрации HGF в среде культивирования оценивают жизнеспособность клеток печени и готовят клетки к лиофилизации. Степень жизнеспособности клеток после выделения и очистки составляет 98,8 (98,3-99,3)%.Upon reaching the highest concentration of HGF in the culture medium, the viability of liver cells is assessed and the cells are prepared for lyophilization. The degree of cell viability after isolation and purification is 98.8 (98.3-99.3)%.

После последнего промывания надосадочную жидкость удаляют и готовят клетки к лиофилизации. Клетки в виде концентрированной взвеси размещают в стерильные пробирки с крышечкой по 5 мл.After the last wash, the supernatant is removed and the cells are prepared for lyophilization. Cells in the form of a concentrated suspension are placed in sterile tubes with a cap of 5 ml.

Клетки печени суспендируют в 9 частях среды высушивания, концентрация клеток в готовой суспензии должна составлять 10 об%. Клеточную суспензию дозируют во флаконы из нейтрального стекла слоем не более 1 см, закрывают стерильными резиновыми пробками и при температуре не более 8°С транспортируют к месту высушивания.Liver cells are suspended in 9 parts of the drying medium, the concentration of cells in the finished suspension should be 10 vol%. The cell suspension is dosed into neutral glass vials with a layer of no more than 1 cm, closed with sterile rubber stoppers and transported to the place of drying at a temperature of no more than 8°C.

Лиофилизация фармацевтической композицииLyophilization of the pharmaceutical composition

Лиофилизацию проводят, используя лиофильную сушку BETA 2-8LD plus (Германия, 2013 г) с воздушным охлаждением, с каскадной холодильной установкой, мощность охлаждения 2 × 0,51 кВт, хладагент не содержащий CFC- и H-CFC-фреонов. Лиофилизацию выполняют в колбах по 50 мл - (фиг. 1). На этапе сублимационной сушки 5 мл суспензии культуры клеток печени, содержащей 2 × 10⁶ клеток в 1 мл, а также 2,5 мл структурообразователя - 6%-ного раствора поливинилпирролидона, и 10%-ный раствор альбумина (2 мл) с 10%-ным раствором сахарозы (0,5 мл), замораживают до температуры (-70°С) в круглодонной колбе на 50 мл и помещают в рабочую камеру устройства, время высушивания 24 часа. Хранение осуществляют при температуре -70°С.Freeze-drying is carried out using a BETA 2-8LD plus freeze-dryer (Germany, 2013) with air cooling, with a cascade refrigeration unit, cooling power 2 × 0.51 kW, refrigerant free of CFC- and H-CFC-freons. Lyophilization is performed in flasks of 50 ml - (Fig. 1). At the stage of freeze-drying, 5 ml of a suspension of a liver cell culture containing 2 × 10 ⁶ cells in 1 ml, as well as 2.5 ml of a structurant - a 6% solution of polyvinylpyrrolidone, and a 10% solution of albumin (2 ml) with 10% sucrose solution (0.5 ml), frozen to a temperature (-70°C) in a 50 ml round-bottom flask and placed in the working chamber of the device, drying time 24 hours. Storage is carried out at a temperature of -70°C.

В результате получена лиофилизированная культура клеток печени, обогащенная HGF устойчивая при хранении - фиг. 2., с содержанием концентрации активного вещества - HGF до 240 (198-251) нг/мл. Проводят оценку уровня фактора роста гепатоцитов в лиофилизированных образцах. Содержание HGF в среде после 5-ти суток культивирования составляет 76,8 (68,4-80) нг/мл, в лиофилизате 240 (198-251) нг/мл. Для оценки количества HGF используют метод твердофазного иммуноферментного анализа с использованием иммуноферментного анализатора Stat Fax-2000 (Awareness tehnology INC USA). В работе используют иммуноферментные наборы для специфического определения и измерения HGF (HGF ELISA Kit Biosource, Бельгия) в сыворотке крови крысы, в супернатанте, среде клеточных культур, лиофилизате, буферных растворах.As a result, a lyophilized liver cell culture enriched with HGF was obtained, which is stable during storage - fig. 2., with the concentration of the active substance - HGF up to 240 (198-251) ng / ml. The level of hepatocyte growth factor in lyophilized samples is assessed. The content of HGF in the medium after 5 days of cultivation is 76.8 (68.4-80) ng/ml, in the lyophilisate 240 (198-251) ng/ml. To assess the amount of HGF using the method of enzyme-linked immunosorbent assay using enzyme immunoassay analyzer Stat Fax-2000 (Awareness technology INC USA). In this work, enzyme immunoassay kits for the specific determination and measurement of HGF (HGF ELISA Kit Biosource, Belgium) in rat blood serum, in supernatant, cell culture medium, lyophilisate, and buffer solutions are used.

Лиофилизат имеет вид пористой массы желто-коричневого цвета, легко растворяется в физиологическом растворе или в воде для инъекций, с образованием жидкости соломенно-желтого цвета с характерным запахом.The lyophilisate has the form of a porous yellow-brown mass, easily soluble in saline or water for injection, with the formation of a straw-yellow liquid with a characteristic odor.

Пример 2. Влияние препарата на летальность при моделировании острого токсического повреждения печениExample 2. The effect of the drug on lethality in modeling acute toxic liver damage

Влияние лиофилизата культуры клеток печени пролонгированного действия, обогащенной HGF изучали в эксперименте на крысах линии Wistar в течение 6 дней. Моделирование острого токсического повреждения печени выполняют путем подкожного введения четыреххлористого углерода чистого для анализов из расчета 0,5 мг\100г массы животного по А. Фишеру. Через сутки после индукции острого токсического повреждения печени животных приписывали к экспериментальным группам методом случайного распределения, таким образом, в исследование вводили животных с индуцированной острой печеночной недостаточностью. Опытным животным - группа 1, осуществляли подкожную инъекцию 0,5 мл лиофилизата культуры клеток печени через 12 часов после введения ССl4. Контрольным животным - группа 2 осуществляли введение физиологического раствора того же объема. На 3 сутки эксперимента результаты показали, что введение лиофилизата приводит к выживанию 53,3% крыс (рфр.=0,2189) в группе 1, в то время как в группе 2 выжило 40% (рфр=0,0091). К 6-м суткам исследования летальность в группе 2 составила 100%, в то время как в группе 1 количество умерших особей не менялось с Зго дня эксперимента, что составило 46,7%.The effect of a lyophilisate of a long-acting liver cell culture enriched with HGF was studied in an experiment on Wistar rats for 6 days. Modeling of acute toxic liver damage is performed by subcutaneous injection of pure carbon tetrachloride for analysis at the rate of 0.5 mg\100 g of animal weight according to A. Fischer. One day after the induction of acute toxic liver injury, the animals were assigned to the experimental groups by random distribution, thus, animals with induced acute liver failure were included in the study. Experimental animals - group 1, were injected subcutaneously with 0.5 ml of a liver cell culture lyophilisate 12 hours after CCl4 administration. Control animals - group 2 were injected with physiological saline of the same volume. On the 3rd day of the experiment, the results showed that the introduction of the lyophilisate leads to the survival of 53.3% of rats (pf = 0.2189) in group 1, while in group 2 40% survived (pf = 0.0091). By the 6th day of the study, lethality in group 2 was 100%, while in group 1 the number of dead individuals did not change from the 3rd day of the experiment, which amounted to 46.7%.

В течение всего времени эксперимента определяли высокий уровень HGF в крови крыс опытной группы (Табл. 1). Уровень HGF на протяжении всего эксперимента у контрольных животных повышался в ответ на повреждение, но в дальнейшем снижался ниже нормальных значений.During the entire time of the experiment, a high level of HGF in the blood of rats of the experimental group was determined (Table 1). The level of HGF throughout the experiment in control animals increased in response to damage, but then decreased below normal values.

Введение лиофилизата повышает выживаемость животных с моделированным острым токсическим поражением печени: Результаты проведенных исследований иллюстрируют фигуры 3 и 4, на которых приведены патоморфологические исследования морфологических структур ткани печени. Фиг. 3 токсическое повреждение печени, введение физ. раствора, вторые сутки эксперимента, где: 1 - очаги коагуляционных центролобулярных и мостовидных некрозов; 2 - участки дискомплексации балочных структур в зонах некрозов; 3 - вакуолизация гепатоцитов. Увеличение 150х. Фиг. 4 - токсическое повреждение печени, введение лиофилизата культуры клеток печени, вторые сутки эксперимента, где: 4 - митозы в гепатоцитах. Увеличение 300х. Окраска гематоксилином и эозином.The introduction of the lyophilisate increases the survival of animals with simulated acute toxic liver damage: The results of the studies are illustrated in figures 3 and 4, which show pathomorphological studies of the morphological structures of the liver tissue. Fig. 3 toxic damage to the liver, the introduction of physical. solution, the second day of the experiment, where: 1 - foci of coagulation centrilobular and bridging necrosis; 2 - areas of discomplexation of beam structures in the zones of necrosis; 3 - vacuolization of hepatocytes. Magnification 150x. Fig. 4 - toxic damage to the liver, the introduction of a lyophilisate of a liver cell culture, the second day of the experiment, where: 4 - mitoses in hepatocytes. Magnification 300x. Stained with hematoxylin and eosin.

Таким образом, получена фармацевтическая композиция для лиофилизата культуры клеток печени, обогащенного HGF. Композиция получена на основе использования методов биотехнологии, и дополнительно содержит структурообразователь и пролонгатор: - 6%-ный раствор поливинилпирролидона, 10%-ный раствор альбумина, 6%-ный раствор сахарозы. Введение лиофилизата культуры клеток печени обогащенного HGF, полученного из фармацевтической композиции, при токсическом повреждении печени у животных позволяет улучшить результаты выживания. Выявлена высокая концентрация HGF в сыворотке крови животных в динамике исследования до 6 суток.Thus, a pharmaceutical composition for a liver cell culture lyophilisate enriched with HGF has been obtained. The composition is obtained on the basis of the use of biotechnology methods, and additionally contains a structurant and a prolongator: - 6% polyvinylpyrrolidone solution, 10% albumin solution, 6% sucrose solution. Administration of HGF-enriched liver cell culture lyophilisate obtained from a pharmaceutical composition in toxic liver injury in animals can improve survival outcomes. A high concentration of HGF in the blood serum of animals was revealed in the dynamics of the study up to 6 days.

Claims (2)

Фармацевтическая композиция для получения лиофилизата, обогащенного фактором роста гепатоцитов HGF пролонгированного действия, стимулирующая пролиферацию гепатоцитов печени, содержащая клеточную популяцию, отличающаяся тем, что в качестве клеточной популяции и источника HGF используют культуру клеток печени неонетальных крысят 2×10⁶ клеток в 1 мл, а в качестве структурообразователя и пролонгатора - растворы поливинилпирролидона, сахарозы и альбумина, при следующем соотношении масс. части, 10:Pharmaceutical composition for producing a lyophilisate enriched with long-acting hepatocyte growth factor HGF, stimulating the proliferation of hepatocytes of the liver, containing a cell population, characterized in that as a cell population and a source of HGF, a liver cell culture of neonatal rat pups 2×10 ⁶ cells per 1 ml is used, and as a structurant and prolongator - solutions of polyvinylpyrrolidone, sucrose and albumin, with the following mass ratio. parts, 10: культура клеток печени, содержащая HGFliver cell culture containing HGF 5,05.0 6%-ный раствор поливинилпирролидона6% solution of polyvinylpyrrolidone 2,52.5 10%-ный раствор альбумина10% albumin solution 2,02.0 10%-ный раствор сахарозы10% sucrose solution 0,50.5

Images