RU2781308C2 - Long-acting insulin analogues and their derivatives - Google Patents
Long-acting insulin analogues and their derivatives Download PDFInfo
- Publication number
- RU2781308C2 RU2781308C2 RU2021105183A RU2021105183A RU2781308C2 RU 2781308 C2 RU2781308 C2 RU 2781308C2 RU 2021105183 A RU2021105183 A RU 2021105183A RU 2021105183 A RU2021105183 A RU 2021105183A RU 2781308 C2 RU2781308 C2 RU 2781308C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- insulin
- amino acid
- albumin
- chain
- independently selected
- Prior art date
Links
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical class N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 359
- 108010092217 Long-Acting Insulin Proteins 0.000 title claims description 47
- 102000016261 Long-Acting Insulin Human genes 0.000 title claims description 47
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 claims abstract description 120
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims abstract description 115
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims abstract description 114
- 230000036499 Half live Effects 0.000 claims abstract description 36
- 230000001965 increased Effects 0.000 claims abstract description 23
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 7
- 102100001249 ALB Human genes 0.000 claims description 92
- 101710027066 ALB Proteins 0.000 claims description 88
- 229940050528 albumin Drugs 0.000 claims description 88
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 45
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 35
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 33
- 101800000896 Insulin B chain Proteins 0.000 claims description 29
- 102400000454 Insulin B chain Human genes 0.000 claims description 29
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 23
- 108090001092 Clostripain Proteins 0.000 claims description 20
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 19
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 18
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 18
- 229920000023 polynucleotide Polymers 0.000 claims description 17
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 17
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 16
- 101800001819 Insulin A chain Proteins 0.000 claims description 12
- 102400000453 Insulin A chain Human genes 0.000 claims description 12
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 9
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 9
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 8
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 5
- 230000004059 degradation Effects 0.000 claims description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 5
- 230000002934 lysing Effects 0.000 claims description 5
- 229960005261 Aspartic Acid Drugs 0.000 claims description 4
- 229960002989 Glutamic Acid Drugs 0.000 claims description 4
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 4
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 4
- 239000003638 reducing agent Substances 0.000 claims description 4
- JEPNOJXFZHBCTB-ZCUALFGZSA-N Insulin C chain Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)CCC1 JEPNOJXFZHBCTB-ZCUALFGZSA-N 0.000 claims 4
- 206010012601 Diabetes mellitus Diseases 0.000 abstract description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 42
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 33
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 26
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 24
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 24
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 18
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 17
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 16
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 10
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 9
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 9
- 125000000511 arginine group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 9
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 9
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 9
- YZQCXOFQZKCETR-UWVGGRQHSA-N Asp-Phe Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 YZQCXOFQZKCETR-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 8
- DWBZEJHQQIURML-IMJSIDKUSA-N Asp-Ser Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DWBZEJHQQIURML-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 8
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 8
- WNRQPCUGRUFHED-DETKDSODSA-N Humalog Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1.C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 WNRQPCUGRUFHED-DETKDSODSA-N 0.000 description 8
- QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N L-lysyl-L-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 8
- ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 8
- ZOKVLMBYDSIDKG-CSMHCCOUSA-N Lys-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ZOKVLMBYDSIDKG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 8
- HPYDSVWYXXKHRD-VIFPVBQESA-N Tyr-Gly Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=C(O)C=C1 HPYDSVWYXXKHRD-VIFPVBQESA-N 0.000 description 8
- AOLHUMAVONBBEZ-STQMWFEESA-N Tyr-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 AOLHUMAVONBBEZ-STQMWFEESA-N 0.000 description 8
- UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N Val-Glu Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 8
- STTYIMSDIYISRG-WDSKDSINSA-N Val-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O STTYIMSDIYISRG-WDSKDSINSA-N 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 8
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 8
- STKYPAFSDFAEPH-LURJTMIESA-N gly-val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN STKYPAFSDFAEPH-LURJTMIESA-N 0.000 description 8
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 108010051110 tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 8
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 7
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 6
- 108091006822 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- UGOZVNFCFYTPAZ-IOXYNQHNSA-N Levemir Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=2N=CNC=2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=2N=CNC=2)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=2C=CC=CC=2)C(C)C)CSSC[C@@H]2NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)CSSC[C@H](NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H](CSSC1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 UGOZVNFCFYTPAZ-IOXYNQHNSA-N 0.000 description 6
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 6
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 6
- 102000037240 fusion proteins Human genes 0.000 description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 6
- 230000001976 improved Effects 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 6
- 210000003000 Inclusion Bodies Anatomy 0.000 description 5
- 108010089308 Insulin Detemir Proteins 0.000 description 5
- 108010065920 Insulin Lispro Proteins 0.000 description 5
- 229960002068 Insulin Lispro Drugs 0.000 description 5
- 102000003746 Insulin Receptor Human genes 0.000 description 5
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 5
- VOMXSOIBEJBQNF-UTTRGDHVSA-N NovoRapid Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1.C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 VOMXSOIBEJBQNF-UTTRGDHVSA-N 0.000 description 5
- 208000001072 Type 2 Diabetes Mellitus Diseases 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 229960003948 insulin detemir Drugs 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 230000036231 pharmacokinetics Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- KTGFOCFYOZQVRJ-UHFFFAOYSA-N 2-[(2-amino-3-methylpentanoyl)amino]pentanedioic acid Chemical compound CCC(C)C(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCC(O)=O KTGFOCFYOZQVRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- WKXVAXOSIPTXEC-UHFFFAOYSA-N Isoleucyl-Aspartate Chemical compound CCC(C)C(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC(O)=O WKXVAXOSIPTXEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N Lys-Asp Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 4
- 108060006601 PRM1 Proteins 0.000 description 4
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 108010026951 Short-Acting Insulin Proteins 0.000 description 4
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L cacl2 Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 4
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 4
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 4
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- COCFEDIXXNGUNL-RFKWWTKHSA-N Glargine Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(=O)NCC(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 COCFEDIXXNGUNL-RFKWWTKHSA-N 0.000 description 3
- 229940038661 Humalog Drugs 0.000 description 3
- 108010073961 Insulin Aspart Proteins 0.000 description 3
- 108010057186 Insulin Glargine Proteins 0.000 description 3
- 229960002869 Insulin Glargine Drugs 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N L-serine Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Tris Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 3
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 229960004717 insulin aspart Drugs 0.000 description 3
- 108010050259 insulin degludec Proteins 0.000 description 3
- 229960004225 insulin degludec Drugs 0.000 description 3
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 3
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 3
- AUTNXSQEVVHSJK-YVNDNENWSA-N (2S,3S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-carboxybutanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-3-methylpentanoic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O AUTNXSQEVVHSJK-YVNDNENWSA-N 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 1-[(1S,2R,3R,4S,5R,6R)-3-carbamimidamido-6-{[(2R,3R,4R,5S)-3-{[(2S,3S,4S,5R,6S)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-(methylamino)oxan-2-yl]oxy}-4-formyl-4-hydroxy-5-methyloxolan-2-yl]oxy}-2,4,5-trihydroxycyclohexyl]guanidine Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- SNFUTDLOCQQRQD-UHFFFAOYSA-N 2-[(2-amino-4-carboxybutanoyl)amino]-3-methylpentanoic acid Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SNFUTDLOCQQRQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YAJCHEVQCOHZDC-QMMNLEPNSA-N Actrapid Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3N=CNC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@H](C)CC)[C@H](C)CC)[C@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C(N)=O)C1=CNC=N1 YAJCHEVQCOHZDC-QMMNLEPNSA-N 0.000 description 2
- RCHHVVGSTHAVPF-ZPHPLDECSA-N Apidra Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3N=CNC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CNC=N1 RCHHVVGSTHAVPF-ZPHPLDECSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 229960002433 Cysteine Drugs 0.000 description 2
- -1 EP 0368187) Chemical compound 0.000 description 2
- 102000033147 ERVK-25 Human genes 0.000 description 2
- 210000002472 Endoplasmic Reticulum Anatomy 0.000 description 2
- JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N Glu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 2
- 229960000310 ISOLEUCINE Drugs 0.000 description 2
- 206010022489 Insulin resistance Diseases 0.000 description 2
- JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N Inulin Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@]1(OC[C@]2(OC[C@]3(OC[C@]4(OC[C@]5(OC[C@]6(OC[C@]7(OC[C@]8(OC[C@]9(OC[C@]%10(OC[C@]%11(OC[C@]%12(OC[C@]%13(OC[C@]%14(OC[C@]%15(OC[C@]%16(OC[C@]%17(OC[C@]%18(OC[C@]%19(OC[C@]%20(OC[C@]%21(OC[C@]%22(OC[C@]%23(OC[C@]%24(OC[C@]%25(OC[C@]%26(OC[C@]%27(OC[C@]%28(OC[C@]%29(OC[C@]%30(OC[C@]%31(OC[C@]%32(OC[C@]%33(OC[C@]%34(OC[C@]%35(OC[C@]%36(O[C@@H]%37[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O%37)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%36)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%35)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%34)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%33)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%32)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%31)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%30)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%29)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%28)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%27)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%26)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%25)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%24)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%23)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%22)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%21)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%20)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%19)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%18)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%17)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%16)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%15)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%14)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%13)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%12)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%11)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%10)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O9)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O8)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N Kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 208000008466 Metabolic Disease Diseases 0.000 description 2
- 210000000496 Pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 108091005771 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 229960005190 Phenylalanine Drugs 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 2
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl β-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000030788 protein refolding Effects 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N (2R,3R,4R,5R)-2-[(1S,2S,3R,4S,6R)-4,6-diamino-3-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1R)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N 0.000 description 1
- FEUPVVCGQLNXNP-IRXDYDNUSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[(2-aminoacetyl)amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoic acid Chemical compound C([C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FEUPVVCGQLNXNP-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TUTIHHSZKFBMHM-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-[(3-amino-1-carboxy-3-oxopropyl)amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O TUTIHHSZKFBMHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710006746 7.5K Proteins 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N Ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229940112930 Apidra Drugs 0.000 description 1
- QCWJKJLNCFEVPQ-WHFBIAKZSA-N Asn-Gln Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O QCWJKJLNCFEVPQ-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 101710044578 At3g10140 Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 240000008371 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 229940075615 Bacillus subtilis Drugs 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 229960003669 Carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N Carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 208000008787 Cardiovascular Disease Diseases 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- DJHJJVWPFGHIPH-OODMECLYSA-N Chitin Chemical compound O[C@@H]1C(NC(=O)C)[C@H](O)OC(CO)[C@H]1COC[C@H]1C(NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](COC[C@H]2C([C@@H](O)[C@H](O)C(CO)O2)NC(C)=O)C(CO)O1 DJHJJVWPFGHIPH-OODMECLYSA-N 0.000 description 1
- 229960005091 Chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N Chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 229920001405 Coding region Polymers 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- AYKQJQVWUYEZNU-UHFFFAOYSA-N Cysteinyl-Asparagine Chemical compound SCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC(N)=O AYKQJQVWUYEZNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 229960000633 Dextran Sulfate Drugs 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 229920001272 Exogenous DNA Polymers 0.000 description 1
- 239000012541 Fractogel® Substances 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 208000004104 Gestational Diabetes Diseases 0.000 description 1
- ARPVSMCNIDAQBO-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Leucine Chemical compound CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(N)=O ARPVSMCNIDAQBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N Glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 229960003180 Glutathione Drugs 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione Transferase family Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione Transferase family Proteins 0.000 description 1
- PNMUAGGSDZXTHX-BYPYZUCNSA-N Gly-Gln Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O PNMUAGGSDZXTHX-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KGVHCTWYMPWEGN-FSPLSTOPSA-N Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN KGVHCTWYMPWEGN-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 1
- 210000002288 Golgi Apparatus Anatomy 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N HCl Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- MMFKFJORZBJVNF-UWVGGRQHSA-N His-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 MMFKFJORZBJVNF-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 229940088597 Hormone Drugs 0.000 description 1
- 229940103471 Humulin Drugs 0.000 description 1
- 229920001202 Inulin Polymers 0.000 description 1
- 229940029339 Inulin Drugs 0.000 description 1
- 241001202975 Isophanes Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 125000003290 L-leucino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 1
- JYOAXOMPIXKMKK-UHFFFAOYSA-N Leucyl-Glutamine Chemical compound CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCC(N)=O JYOAXOMPIXKMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 210000001672 Ovary Anatomy 0.000 description 1
- 229920001451 Polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- RVQDZELMXZRSSI-IUCAKERBSA-N Pro-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 RVQDZELMXZRSSI-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 1
- 102000007312 Recombinant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010033725 Recombinant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 206010038932 Retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 235000003534 Saccharomyces carlsbergensis Nutrition 0.000 description 1
- 229940081969 Saccharomyces cerevisiae Drugs 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N Silicon carbide Chemical compound [Si+]#[C-] HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005322 Streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 229960001052 Streptozocin Drugs 0.000 description 1
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N Streptozotocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 1
- 210000004304 Subcutaneous Tissue Anatomy 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 description 1
- 101710002875 TYRO3 Proteins 0.000 description 1
- 229960002180 Tetracycline Drugs 0.000 description 1
- OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N Tetracycline Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 229940026454 Tresiba Drugs 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- MFEVVAXTBZELLL-UHFFFAOYSA-N Tyrosyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 MFEVVAXTBZELLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000001058 adult Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 1
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003560 cancer drug Substances 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 1
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 201000010870 diseases of metabolism Diseases 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001516 effect on protein Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 230000005182 global health Effects 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N gly pro Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N glycol Chemical group OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010147 glycylglutamine Proteins 0.000 description 1
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 1
- 230000001771 impaired Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory Effects 0.000 description 1
- 229960000696 insulin glulisine Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 101710030587 ligN Proteins 0.000 description 1
- 101700077585 ligd Proteins 0.000 description 1
- 230000000670 limiting Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 108091022076 maltose binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cells Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000001264 neutralization Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000000275 pharmacokinetic Effects 0.000 description 1
- 101700054060 phoA Proteins 0.000 description 1
- 101710016966 phoA2 Proteins 0.000 description 1
- 229920001583 poly(oxyethylated polyols) Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 108010066381 preproinsulin Proteins 0.000 description 1
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N propylene glycol Substances CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplasts Anatomy 0.000 description 1
- 108091007521 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 229910010271 silicon carbide Inorganic materials 0.000 description 1
- MAKUBRYLFHZREJ-JWBQXVCJSA-M sodium;(2S,3S,4R,5R,6R)-3-[(2S,3R,5S,6R)-3-acetamido-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-4,5,6-trihydroxyoxane-2-carboxylate Chemical compound [Na+].CC(=O)N[C@@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C([O-])=O)O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O MAKUBRYLFHZREJ-JWBQXVCJSA-M 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Область изобретенияField of invention
Настоящее изобретение относится к аналогам инсулина длительного действия и их производным, и более конкретно к аналогам инсулина длительного действия, имеющим увеличенный период полувыведения in vivo, в которых заменена аминокислота в положении 22 В-цепи нативного инсулина, и дополнительно заменены одна или более аминокислот А-цепи или В-цепи нативного инсулина, и к производным аналогов инсулина длительного действия, имеющим дополнительно увеличенный период полувыведения in vivo, в которых альбумин-связывающий домен дополнительно слит с аналогами инсулина длительного действия.The present invention relates to long-acting insulin analogs and derivatives thereof, and more particularly to long-acting insulin analogs having an extended in vivo half-life, in which the amino acid at position 22 of the native insulin B chain is substituted, and one or more amino acids A- chain or B-chain of native insulin, and derivatives of long-acting insulin analogs having an additionally increased in vivo half-life, in which the albumin-binding domain is further fused to long-acting insulin analogs.
Предшествующий уровень техникиPrior Art
Диабет представляет собой метаболическое заболевание, отличающееся высокими уровнями глюкозы, и развивается в результате сочетания генетических факторов и факторов окружающей среды. Диабет включает диабет 1-го типа, диабет 2-го типа, гестационный диабет и другие состояния, которые вызывают гипергликемию. Диабет подразумевает нарушение метаболизма, при котором поджелудочная железа продуцирует недостаточные количества инсулина или при котором клетки организма человека не способны соответствующим образом отвечать на инсулин, и, таким образом, их способность поглощать глюкозу нарушается. В результате, глюкоза накапливается в крови.Diabetes is a metabolic disease characterized by high glucose levels and develops as a result of a combination of genetic and environmental factors. Diabetes includes
Диабет 1-го типа, также называемый инсулинозависимым сахарным диабетом (IDDM - от англ. insulin-dependent diabetes mellitus) и юношеским диабетом, обусловлен разрушением бета-клеток, приводящим к абсолютному дефициту инсулина. С другой стороны, диабет 2-го типа, известный как инсулиннезависимый сахарный диабет (NIDDM - от англ. non-insulin dependent diabetes mellitus) и приобретенный диабет, ассоциирован с преобладающей инсулинорезистентностью и, таким образом, относительным дефицитом инсулина и/или преобладающим дефектом секреции инсулина с инсулинорезистентностью.
В частности, диабет ассоциирован с разными осложнениями, такими как сердечно-сосудистое заболевание и ретинопатия, и, вследствие этого, представляет собой заболевание, которое становится очень тяжелым, если не оказывается надлежащий контроль течения заболевания, как например, контроль уровня глюкозы в крови. Ожидается, что мировой рынок лекарственных средств против диабета расширится с $ 41,7 миллиарда в 2015 году до $ 66,1 миллиардов к 2022 году, и, как ожидается, станет вторым по величине после рынка противораковых лекарственных средств. Глобально, имеется 422 миллиона взрослых людей с диабетом в 2014 году, что составляет 8,5% всего взрослого населения, почти в два раза больше, по сравнению с 4,5% в 1980 году (ВОЗ (Всемирная организация здравоохранения), 2016 год). Кроме того, общие всемирные расходы на здравоохранение из-за диабета оцениваются на уровне $ 673 миллиардов, и ожидается, что число пациентов с диабетом в возрасте 20-79 лет будет увеличиваться до примерно 620 миллионов к 2040 году.In particular, diabetes is associated with various complications such as cardiovascular disease and retinopathy, and therefore is a disease that becomes very severe if the course of the disease is not properly controlled, such as blood glucose control. The global diabetes drug market is expected to expand from $41.7 billion in 2015 to $66.1 billion by 2022, and is expected to become the second largest market after cancer drugs. Globally, there were 422 million adults with diabetes in 2014, representing 8.5% of the total adult population, almost double the number from 4.5% in 1980 (WHO (World Health Organization), 2016) . In addition, total global health care costs due to diabetes are estimated at $673 billion, and the number of diabetic patients aged 20-79 is expected to rise to around 620 million by 2040.
Наиболее репрезентативные способы лечения диабета включают способ введения инсулина для контроля уровня глюкозы в крови пациента до нормального уровня. Инсулин представляет собой гормон, регулирующий уровень глюкозы в крови, который секретируется в поджелудочной железе человека. Он функционирует, осуществляя перенос избытка глюкозы в крови к клеткам, снабжая клетки энергией и поддерживая уровни глюкозы в крови на нормальных уровнях.The most representative methods of treating diabetes include the method of administering insulin to control the patient's blood glucose to normal levels. Insulin is a blood glucose regulating hormone secreted by the human pancreas. It functions by transporting excess glucose in the blood to the cells, supplying the cells with energy, and maintaining blood glucose levels at normal levels.
Когда была разработана технология изготовления рекомбинантных белков, множество препаратов инсулина было выпущено в продажу. Препараты инсулина можно широко подразделить на пять типов в соответствии с их действием. Среди данных препаратов, инсулин короткого действия, который демонстрирует самое быстрое действие, отличается тем, что он демонстрирует быструю эффективность, начинает действовать через 1-20 минут и демонстрирует самую высокую эффективность, спустя примерно 1 час, и его эффективность сохраняется в течение 3-5 часов. Типичные препараты короткого действия включают инсулин аспарт (NovoRapid®), инсулин лизпро (Humalog®) и инсулин глулизин (Apidra®). Инсулин, который демонстрирует второе по быстроте действие, представляет собой регулярный инсулин. Регулярный инсулин начинает снижать уровни глюкозы в крови через 30 минут после введения и демонстрирует самую высокую эффективность через 2-4 часа, и его эффективность сохраняется в течение 6-8 часов. Типичные препараты регулярного инсулина включают Actrapid®, Humilin® R, Hypurin Neutral и т.п. Инсулин средней продолжительности действия представляет собой вещество, полученное посредством добавления протамина или цинка для замедления его действия. Данный инсулин начинает действовать через примерно 1 час 30 минут после инъекции, и его эффективность достигает самого высокого уровня через 4-2 часов и сохраняется в течение 16-24 часов. Типичные препараты средней продолжительности действия включают Protaphane®, Humulin® NPH и Hypurin Isophane®. Инсулин комбинированного действия получают посредством предварительного смешивания инсулина короткого действия или регулярного инсулина с инсулином средней продолжительности действия, таким образом, что два данных вида инсулина можно легко вводить посредством одной единственной инъекции. Имеющиеся в продаже препараты инсулина комбинированного действия включают NovoMix® 30 (30% инсулина аспарт и 70% протамин-кристаллического инсулина аспарт), Humalog®Mix 25 (25% инсулина лизпро и 75% протаминовой суспензии инсулина лизпро) и Humalog®Mix 50 (50% инсулина лизпро и 50% протаминовой суспензии инсулина лизпро). Наконец, инсулин длительного действия инъецируют один раз или два раза в сутки, и его эффективность сохраняется в течение вплоть до 24 часов. Он обычно используется в качестве базального инсулина, и имеющиеся в продаже препараты инсулина длительного действия включают La nt us® (инсулин гларгин, ЕР 0368187), Leve mir® (инсулин детемир, США 5750497) и Tresiba® (инсулин деглудек, США 7615532).When the technology for making recombinant proteins was developed, many insulin preparations were put on the market. Insulin preparations can be broadly classified into five types according to their action. Among these drugs, the short-acting insulin, which shows the fastest action, is characterized by the fact that it shows rapid effectiveness, begins to act after 1-20 minutes and shows the highest efficiency after about 1 hour, and its effectiveness lasts for 3-5 minutes. hours. Typical short acting formulations include insulin aspart ( NovoRapid® ), insulin lispro ( Humalog® ) and insulin glulisine ( Apidra® ). The insulin that shows the second fastest action is regular insulin. Regular insulin begins to lower
Инсулин используют в разных применениях, в зависимости от его действия. Для диабета 1-го типа помимо регулярного инсулина или инсулина короткого действия нужно вводить инсулин длительного действия, и для диабета 2-го типа, при котором требуется инсулинотерапия, регулярный инсулин или инсулин короткого действия можно вводить вместе с инулином длительного действия или можно также вводить только инсулин длительного действия.Insulin is used in different applications, depending on its action. For
Как описано выше, введение инсулина представляет собой наиболее типичный способ лечения диабета. Однако, инсулины длительного действия являются неудобными тем, что они должны вводиться один раз или два раза в сутки, поскольку их период полувыведения еще не является достаточно длительным. Это причиняет неудобство пациентам с диабетом, которые самостоятельно вводят инсулин посредством инъекции.As described above, administration of insulin is the most typical method of treating diabetes. However, long-acting insulins are inconvenient in that they must be administered once or twice a day because their half-life is not yet long enough. This causes inconvenience to diabetic patients who self-administer insulin by injection.
В настоящее время коммерческие препараты базального инсулина представляют собой главным образом композиции для ежесуточного введения, и не существует препарата, обладающего улучшенным удобством введения, по сравнению с данными препаратами. В Novo Nordisk разработали аналог инсулина (США №2011/0092419 А1), имеющий увеличенный период полувыведения in vivo, за счет введения мутации в последовательность инсулина, таким образом, чтобы обладать устойчивостью к протеазам in vivo, и также разработали инсулин, имеющий дополнительно увеличенный период полувыведения, посредством ацилирования аналога инсулина (WO 2009/115469, WO 2011/161125), но данный инсулин может быть использован в качестве композиции для ежесуточного введения. В Hanmi Pharmaceuticals разработали инсулин, имеющий увеличенный период полувыведения в результате конъюгирования области Fc с аналогом инсулина (KR 10-2015-0087130). Однако, способ получения инсулина, разработанный Hanmi Pharmaceuticals, является сложным, поскольку инсулин и Fc получают по отдельности и подвергают ПЭГилированию.At present, commercial basal insulin formulations are mainly daily administration formulations, and there is no formulation that has improved ease of administration compared to these formulations. Novo Nordisk has developed an insulin analog (US No. 2011/0092419 A1) having an extended in vivo half-life by introducing a mutation in the insulin sequence so as to be protease resistant in vivo, and has also developed an insulin having a further extended in vivo half-life. half-life by acylation of an insulin analog (WO 2009/115469, WO 2011/161125), but this insulin can be used as a composition for daily administration. Hanmi Pharmaceuticals has developed an insulin having an extended half-life by conjugating an Fc region to an insulin analog (KR 10-2015-0087130). However, the method for producing insulin developed by Hanmi Pharmaceuticals is complicated because insulin and Fc are prepared separately and subjected to PEGylation.
Таким образом, настоящее изобретение предназначено для устранения описанных выше проблем для минимизации неудобства, с которым встречаются, когда число инъекций является большим при применении традиционного базального инсулина, разработки инсулина, время действия которого увеличено, и также улучшения способа его получения.Thus, the present invention aims to overcome the problems described above, to minimize the inconvenience encountered when the number of injections is large with conventional basal insulin, to develop an insulin whose action time is extended, and also to improve the method of its preparation.
Альбумин представляет собой наиболее многочисленный белок в крови, и оказывает действие на in vivo фармакокинетику многих лекарственных средств, и, вследствие этого, многие исследования проводились для осуществления контроля аффинности связывания лекарственных средств в отношении альбумина при разработке нового лекарственного средства. Например, для разработки инсулина длительного действия в Novo Nordisk разработали препарат (инсулин детемир, инсулин деглудек), который может всасываться из подкожной ткани (участок введения) в кровь с пониженной скоростью, посредством ацилирования инсулина жирной кислотой, обладающей аффинностью связывания в отношении альбумина. Аффинность связывания жирных кислот в отношении альбумина демонстрирует высокую корреляцию со скоростью всасывания инсулина. Когда инсулин ацилирован жирной кислотой, обладающей высокой аффинностью связывания в отношении альбумина, период полувыведения инсулина увеличивается. Например, инсулин детемир связывается с альбумином в крови, таким образом, увеличивая свой период полувыведения. Когда человеческий инсулин вводили внутривенно, он имел период полувыведения 2,4 минуты, тогда как инсулин детемир имел период полувыведения от 18 до 25 минут, который был по меньшей мере в 10 раз длительнее. Инсулин деглудек обладал повышенной в 2,4 раза аффинностью связывания в отношении альбумина, по сравнению с инсулином детемир, и, таким образом, имел увеличенный период полувыведения.Albumin is the most abundant protein in the blood, and has an effect on the in vivo pharmacokinetics of many drugs, and therefore, many studies have been carried out to control the binding affinity of drugs for albumin in the development of a new drug. For example, to develop long-acting insulin, Novo Nordisk developed a drug (insulin detemir, insulin degludec) that can be absorbed from the subcutaneous tissue (injection site) into the blood at a reduced rate by acylation of insulin with a fatty acid that has a binding affinity for albumin. The binding affinity of fatty acids for albumin shows a high correlation with the rate of insulin absorption. When insulin is acylated with a fatty acid having a high binding affinity for albumin, the half-life of insulin is increased. For example, insulin detemir binds to albumin in the blood, thus increasing its half-life. When human insulin was administered intravenously, it had a half-life of 2.4 minutes, while insulin detemir had a half-life of 18 to 25 minutes, which was at least 10 times longer. Insulin degludec had a 2.4-fold increased binding affinity for albumin compared to insulin detemir and thus had an extended half-life.
Однако, ацилированный инсулин обладает аффинностью связывания (Kd), составляющей несколько мМ (Biochem. J. 312, 725-731 (1995)) в отношении альбумина, и, таким образом, не имеет улучшенных фармакокинетических профилей, по сравнению с композициями для ежесуточного введения. Соответственно, настоящее изобретение предназначено для максимизации эффекта увеличения периода полувыведения, вызываемого альбумином, посредством использования альбумин-связывающего домена (ABD - от англ. albumin-binding domain), чья аффинность связывания в отношении альбумина достигает уровней пМ.However, acylated insulin has a binding affinity (Kd) of a few mM (Biochem. J. 312, 725-731 (1995)) for albumin and thus does not have improved pharmacokinetic profiles compared to formulations for daily administration. . Accordingly, the present invention is intended to maximize the effect of increasing half-life caused by albumin by using an albumin-binding domain (ABD) whose binding affinity for albumin reaches pM levels.
Соответственно, авторы настоящего изобретения сделали всесторонние попытки разработать инсулин длительного действия, имеющий улучшенный период долговечности, который устраняет неудобство, заключающееся в частом введении инсулина пациентам с диабетом, и, в результате, обнаружили, что производное аналога инсулина, полученное посредством замены одной или более аминокислот А-цепи и В-цепи нативного инсулина и дополнительно слияния альбумин-связывающего домена, имеет значимо увеличенный период полувыведения in vivo, осуществляя, таким образом, настоящее изобретение.Accordingly, the present inventors have made extensive efforts to develop a long-acting insulin having an improved longevity period that eliminates the inconvenience of frequently administering insulin to diabetic patients, and as a result, found that an insulin analog derivative obtained by substituting one or more amino acids A-chain and B-chain of native insulin and further fusion of the albumin-binding domain, has a significantly increased half-life in vivo, thus implementing the present invention.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Техническая проблемаTechnical problem
Цель настоящего изобретения заключается в предложении нового аналога инсулина, который демонстрирует устойчивость к расщеплению под действием клострипаина, а также увеличенный период полувыведения in vivo, нуклеотида, кодирующего данный аналог, вектора, содержащего данный нуклеотид, и рекомбинантного микроорганизма, имеющего введенный в него данный вектор.The purpose of the present invention is to provide a novel insulin analog that exhibits resistance to cleavage by clostripain, as well as an increased half-life in vivo, of a nucleotide encoding this analog, a vector containing this nucleotide, and a recombinant microorganism having this vector introduced into it.
Еще одна цель настоящего изобретения заключается в предложении нового производного аналога инсулина, которое демонстрирует устойчивость к расщеплению ферментом клострипаин, а также увеличенный период полувыведения in vivo, нуклеотида, кодирующего данное производное аналога, вектора, содержащего данный нуклеотид, и рекомбинантного микроорганизма, имеющего введенный в него данный вектор.Yet another object of the present invention is to provide a novel insulin analog derivative that exhibits resistance to clostripain enzyme degradation as well as an increased in vivo half-life of the nucleotide encoding the analog derivative, a vector containing the nucleotide, and a recombinant microorganism having an inserted given vector.
Еще одна цель настоящего изобретения заключается в предложении способа получения активной формы производного аналога инсулина длительного действия, имеющего увеличенный период полувыведения in vivo.Yet another object of the present invention is to provide a process for the preparation of an active form of a long acting insulin analog derivative having an extended in vivo half-life.
Техническое решениеTechnical solution
Для достижения цели, приведенной выше, согласно настоящему изобретению предложен аналог инсулина, содержащий вариант В-цепи инсулина, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2, аргинин (Arg) в положении аминокислоты 22 В-цепи инсулина замещен лизином (Lys) в нативном инсулине.In order to achieve the above object, the present invention provides an insulin analogue comprising a variant of the insulin B chain represented by the amino acid sequence of
Согласно настоящему изобретению также предложен полинуклеотид, кодирующий аналог инсулина.The present invention also provides a polynucleotide encoding an insulin analogue.
Согласно настоящему изобретению также предложен рекомбинантный вектор, содержащий данный полинуклеотид.The present invention also provides a recombinant vector containing this polynucleotide.
Согласно настоящему изобретению также предложен рекомбинантный микроорганизм, имеющий введенный в него данный рекомбинантный вектор.The present invention also provides a recombinant microorganism having this recombinant vector introduced into it.
Согласно настоящему изобретению также предложено производное аналога инсулина длительного действия, в котором альбумин-связывающий домен слит с аналогом инсулина.The present invention also provides a long acting insulin analogue derivative in which the albumin binding domain is fused to the insulin analogue.
Согласно настоящему изобретению также предложен полинуклеотид, кодирующий производное аналога инсулина.The present invention also provides a polynucleotide encoding an insulin analogue derivative.
Согласно настоящему изобретению также предложен рекомбинантный вектор, который содержит полинуклеотид, кодирующий аналог инсулина, и полинуклеотид, кодирующий альбумин-связывающий домен, содержащий альбумин-связывающий мотив, представленный следующей аминокислотной последовательностью:The present invention also provides a recombinant vector that contains a polynucleotide encoding an insulin analogue and a polynucleotide encoding an albumin-binding domain containing an albumin-binding motif represented by the following amino acid sequence:
GVSDFYKKLIXaKAKTVEGVEALKXbXcl,GVSDFYKKLIX a KAKTVEGVEALKX b X c l,
где:where:
Xa независимо выбран из D и Е,X a is independently selected from D and E,
Xb независимо выбран из D и Е, иX b is independently selected from D and E, and
Хс независимо выбран из А и Е.X c is independently selected from A and E.
Согласно настоящему изобретению также предложен рекомбинантный микроорганизм, имеющий вставленный в него рекомбинантный вектор.The present invention also provides a recombinant microorganism having a recombinant vector inserted therein.
Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения активной формы производного аналога инсулина длительного действия, имеющего увеличенный период полувыведения in vivo, причем способ включает следующие стадии: а) культивирование рекомбинантного микроорганизма; (b) лизис культивированного рекомбинантного микроорганизма, с получением, таким образом, производного аналога инсулина длительного действия; (с) индукция повторного сворачивания полученного производного аналога инсулина длительного действия, с получением, таким образом, препроформы производного аналога инсулина; (d) превращение препроформы производного аналога инсулина в активную форму посредством обработки клострипаином и СрВ; и (е) очистка активной формы производного аналога инсулина длительного действия.The present invention also provides a method for preparing an active form of a long acting insulin analog derivative having an extended in vivo half-life, the method comprising the steps of: a) culturing a recombinant microorganism; (b) lysing the cultured recombinant microorganism, thereby obtaining a long acting insulin analog derivative; (c) inducing refolding of the resulting long acting insulin analogue derivative, thereby obtaining a preproform of the insulin analogue derivative; (d) converting the preproform of the insulin analogue derivative into the active form by treatment with clostripain and CPB; and (e) purifying the active form of the long acting insulin analogue derivative.
Краткое описание графических материаловBrief description of graphic materials
На Фиг. 1 показаны результаты анализа стабильности аналога инсулина, слитого с ABD, сконструированного посредством замены аргинина (Arg) в положении 22 В-цепи инсулина лизином (Lys), посредством обработки клострипаином. Масс-спектрометрия показала, что когда в В-цепи инсулина содержался аргинин (Arg) в положении 22, происходило ее расщепление, а когда аргинин (Arg) был заменен лизином (Lys), расщепления В-цепи не происходило.On FIG. 1 shows the results of stability analysis of an ABD fused insulin analogue constructed by replacing arginine (Arg) at position 22 of the insulin B chain with lysine (Lys) by treatment with clostripain. Mass spectrometry showed that when the insulin B chain contained arginine (Arg) at position 22, it was cleaved, and when arginine (Arg) was replaced by lysine (Lys), the B chain was not cleaved.
На Фиг. 2 показаны результаты анализа экспрессии производных аналога инсулина, слитых с ABD, 1-10 в рекомбинантных E.coli посредством SDS-PAGE (от англ. sodium dodecyl sulphate - polyacrylamide gel electrophoresis - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия). Даже когда одну или более мутаций вводили в последовательность инсулина, сохранялась экспрессия белка в E.coli.On FIG. 2 shows the results of analysis of the expression of insulin analog derivatives fused with ABD, 1-10 in recombinant E. coli by SDS-PAGE (from the English sodium dodecyl sulphate - polyacrylamide gel electrophoresis - polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate). Even when one or more mutations were introduced into the insulin sequence, protein expression was maintained in E. coli.
На Фиг. 3 показаны результаты отслеживания солюбилизации и повторного сворачивания аналога инсулина 4, слитого с ABD, посредством ОФ-ВЭЖХ (Обращенно-фазовая высоко-эффективная жидкостная хроматография). Когда структура белка была несвернута в результате солюбилизации и сопровождалась индукцией повторного сворачивания, наблюдали сдвиг времени удерживания в ОФ-ВЭЖХ вследствие образования трехмерной структуры.On FIG. 3 shows the results of monitoring the solubilization and refolding of
На Фиг. 4 показаны результаты, полученные посредством проведения ферментативной реакции в соответствии с примером настоящего изобретения и подтверждения эффектов повышения эффективности превращения в активную форму инсулина и уменьшения примесей (молекулярная масса основной примеси: 10296 Да; молекулярная масса активной формы инсулина: 11238 Да).On FIG. 4 shows the results obtained by carrying out an enzymatic reaction according to an example of the present invention and confirming the effects of increasing the efficiency of conversion into an active form of insulin and reducing impurities (molecular weight of the main impurity: 10296 Da; molecular weight of the active form of insulin: 11238 Da).
На Фиг. 5 показаны результаты анализа аналога инсулина 4, слитого с ABD, посредством SDS-PAGE после расщепления инсулина клострипаином и СрВ и его очистки.On FIG. 5 shows the results of the SDS-PAGE analysis of
На Фиг. 6 показаны результаты анализа эксклюзионной хроматографии, проводимого для исследования того, образовывался ли гексамер при добавлении цинка и фенола к аналогу инсулина, слитому с ABD, в соответствии с примером настоящего изобретения.On FIG. 6 shows the results of a size exclusion chromatography analysis conducted to investigate whether a hexamer was formed when zinc and phenol were added to an insulin analogue fused with ABD according to an example of the present invention.
На Фиг. 7 показаны результаты оценки способности аналогов инсулина, слитых с ABD, снижать уровень глюкозы в крови в соответствии с примером настоящего изобретения.On FIG. 7 shows the results of evaluating the ability of insulin analogues fused with ABD to lower blood glucose levels in accordance with an example of the present invention.
Наилучший способ осуществления изобретенияBest Mode for Carrying Out the Invention
Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, обычно подразумеваемое одним из средних специалистов в области, к которой принадлежит данное раскрытие. Обычно, номенклатура, используемая в данном документе, и экспериментальные способы, которые будут описаны ниже, хорошо известны и обычно используются в данной области.Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used in this document have the same meaning, usually meant by one of ordinary skill in the field to which this disclosure belongs. Generally, the nomenclature used herein and the experimental methods to be described below are well known and commonly used in the art.
В настоящем изобретении обнаружили, что аналог инулина, в котором аминокислота аргинин (Arg) в положении 22 В-цепи нативного инсулина заменена с аргинина (Arg) на лизин (Lys), и одна или более аминокислот А-цепи или В-цепи нативного инсулина дополнительно заменены, имеет увеличенный период полувыведения in vivo, и, в то же время, может быть легко получен с использованием микроорганизма. Кроме того, обнаружили, что когда альбумин-связывающий домен дополнительно слит с аналогом инсулина, период полувыведения in vivo аналога инсулина может быть дополнительно увеличен.The present invention has found that an inulin analog in which the amino acid arginine (Arg) at position 22 of the native insulin B chain is changed from arginine (Arg) to lysine (Lys) and one or more amino acids of the A chain or B chain of native insulin additionally replaced, has an increased in vivo half-life, and at the same time can be easily obtained using a microorganism. In addition, it has been found that when the albumin-binding domain is further fused to an insulin analog, the in vivo half-life of the insulin analog can be further increased.
Настоящее изобретение включает слитый белок инсулин-ABD, имеющий значимо увеличенный период полувыведения, в котором альбумин-связывающий домен (ABD), обладающий высокой аффинностью связывания в отношении альбумина, слит с нативным инсулином таким образом, что скорость всасывания инсулина в кровь может быть снижена, и таким образом, что стабильность инсулина в крови может быть повышена. Кроме того, настоящее изобретение включает аналог инсулина, в котором аминокислота аргинин (Arg) в положении 22 В-цепи нативного инсулина заменена с аргинина (Arg) на лизин (Lys), и/или заменены одна или более аминокислот А-цепи или В-цепи нативного инсулина, что минимизирует, таким образом, расщепление протеазами или удаление, опосредованное инсулиновым рецептором. Кроме того, настоящее изобретение включает слитый белок аналог инсулина-ABD, в котором указанный разнообразный аналог инсулина слит с альбумин-связывающим доменом (ABD). Данный слитый белок сохраняет присущее инсулину свойство образования гексамера и таким образом может использоваться в разработке препарата и позволяет улучшать скорость всасывания.The present invention includes an insulin-ABD fusion protein having a significantly increased half-life, in which an albumin-binding domain (ABD) having a high binding affinity for albumin is fused to native insulin such that the rate of insulin absorption into the blood can be reduced, and thus that the stability of insulin in the blood can be improved. In addition, the present invention includes an insulin analogue in which the amino acid arginine (Arg) at position 22 of the B chain of native insulin is changed from arginine (Arg) to lysine (Lys), and/or one or more amino acids of the A chain or B- native insulin chain, thus minimizing protease degradation or removal mediated by the insulin receptor. In addition, the present invention includes an insulin analog-ABD fusion protein wherein said diverse insulin analog is fused to an albumin binding domain (ABD). This fusion protein retains insulin's inherent hexamer-forming property and thus can be used in drug development and improve absorption rates.
Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение направлено на аналог инсулина, содержащий вариант В-цепи инсулина, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2, аргинин (Arg) в положении аминокислоты 22 В-цепи инсулина заменен лизином (Lys) в нативном инсулине. Согласно настоящему изобретению, когда аминокислота аргинин (Arg) в положении 22 В-цепи инсулина заменена на лизин (Lys), аналог инсулина может демонстрировать устойчивость к расщеплению ферментом клострипаин, делая возможным превращение инсулина в активную форму под действием фермента клострипаин, отличного от трипсина, в процессе получения аналога инсулина в микроорганизмах или клетках, отличных от организма человека.Thus, in one aspect, the present invention is directed to an insulin analogue comprising the insulin B chain variant represented by the amino acid sequence of
В настоящем изобретении фраза «аналог инсулина, содержащий вариант В-цепи инсулина, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2, аргинин (Arg) в положении аминокислоты 22 В-цепи инсулина заменен лизином (Lys) в нативном инсулине» означает, что аналог инсулина может дополнительно содержать вариант аминокислоты в А-цепи инсулина или В-цепи инсулина помимо замены аргинина (Arg) на лизин (Lys) в положении аминокислоты 22 В-цепи нативного инсулина.In the present invention, the phrase "an insulin analog comprising the insulin B chain variant represented by the amino acid sequence of
В настоящем изобретении аналог инсулина может дополнительно содержать одну или более аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из нижеследующего: (i) замена валина (Val) на лейцин (Leu) в положении аминокислоты 3 А-цепи инсулина, представленной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 4; (ii) замена треонина (Thr) на аспарагиновую кислоту (Asp) в положении аминокислоты 8 А-цепи инсулина, представленной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 4; (iii) замена изолейцина (IIe) на лизин (Lys) в положении аминокислоты 10 А-цепи инсулина, представленной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 4; (iv) замена тирозина (Tyr) на глутаминовую кислоту (Glu) в положении аминокислоты 14 А-цепи инсулина, представленной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 4; (v) замена тирозина (Tyr) на фенилаланин (Phe) в положении аминокислоты 19 А-цепи инсулина, представленной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 4; (vi) замена гистидина (His) на треонин (Thr) в положении аминокислоты 5 варианта В-цепи инсулина, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; (vii) замена серина (Ser) на аспарагиновую кислоту (Asp) в положении аминокислоты 9 варианта В-цепи инсулина, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; (viii) замена глутаминовой кислоты (Glu) на аланин (Ala) в положении аминокислоты 13 варианта В-цепи инсулина, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; (ix) замена лейцина (Leu) на глутамин (Gin) в положении аминокислоты 17 варианта В-цепи инсулина, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; и (х) замена фенилаланина (Phe) на серии (Ser) в положении аминокислоты 24 варианта В-цепи инсулина, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2, но не ограничивается ими.In the present invention, the insulin analogue may further comprise one or more amino acid substitutions selected from the group consisting of the following: (i) a valine (Val) to leucine (Leu) substitution at amino acid position 3 of the insulin A chain represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO four; (ii) replacing threonine (Thr) with aspartic acid (Asp) at amino acid position 8 of the insulin A chain represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO 4; (iii) replacing isoleucine (IIe) with lysine (Lys) at amino acid position 10 of the insulin A chain represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO 4; (iv) replacing tyrosine (Tyr) with glutamic acid (Glu) at amino acid position 14 of the insulin A chain represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO 4; (v) replacing tyrosine (Tyr) with phenylalanine (Phe) at amino acid position 19 of the insulin A chain represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO 4; (vi) replacing histidine (His) with threonine (Thr) at amino acid position 5 of the insulin B chain variant represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO 2; (vii) replacing serine (Ser) with aspartic acid (Asp) at amino acid position 9 of the insulin B chain variant represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO 2; (viii) replacing glutamic acid (Glu) with alanine (Ala) at amino acid position 13 of the insulin B chain variant represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO 2; (ix) replacing leucine (Leu) with glutamine (Gin) at amino acid position 17 of the insulin B chain variant represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO 2; and (x) replacing phenylalanine (Phe) with serie (Ser) at amino acid position 24 of the insulin B chain variant represented by, but not limited to, the amino acid sequence of SEQ ID NO 2.
В настоящем изобретении аналог инсулина может иметь увеличенный период полувыведения in vivo, по сравнению с нативным инсулином. Период полувыведения in vivo может длиться на протяжении предпочтительно по меньшей мере 48 часов, более предпочтительно по меньшей мере 72 часов.In the present invention, the insulin analog may have an increased in vivo half-life compared to native insulin. The in vivo half-life may be preferably at least 48 hours, more preferably at least 72 hours.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на полинуклеотид, кодирующий аналог инсулина. В еще одном аспекте настоящее изобретение направлено на рекомбинантный вектор, содержащий данный полинуклеотид. В еще одном аспекте настоящее изобретение направлено на рекомбинантный микроорганизм, имеющий введенный в него рекомбинантный вектор.In another aspect, the present invention is directed to a polynucleotide encoding an insulin analog. In another aspect, the present invention is directed to a recombinant vector containing this polynucleotide. In yet another aspect, the present invention is directed to a recombinant microorganism having a recombinant vector introduced into it.
Между тем, настоящее изобретение направлено на производное аналога инсулина длительного действия, в котором альбумин-связывающий домен слит с аналогом инсулина. Производное аналога инсулина длительного действия, слитого с альбумин-связывающим доменом, обладает сравнительно высокой аффинностью в отношении альбумина.Meanwhile, the present invention is directed to a long-acting insulin analog derivative in which an albumin-binding domain is fused to an insulin analog. A long-acting insulin analog derivative fused to an albumin-binding domain has a relatively high affinity for albumin.
В одном примере настоящего изобретения альбумин-связывающий домен может содержать альбумин-связывающий мотив, представленный следующей аминокислотной последовательностью:In one example of the present invention, the albumin binding domain may comprise an albumin binding motif represented by the following amino acid sequence:
GVSDFYKKLIXaKAKTVEGVEALKXbXcl,GVSDFYKKLIX a KAKTVEGVEALKX b X c l,
где:where:
Ха независимо выбран из D и Е,X a is independently selected from D and E,
Xb независимо выбран из D и Е, иX b is independently selected from D and E, and
Хс независимо выбран из А и Е.X c is independently selected from A and E.
В одном примере настоящего изобретения Ха представляет собой D, Xb представляет собой D, и Хс представляет собой А.In one example of the present invention, X a is D, X b is D, and X c is A.
В одном примере настоящего изобретения альбумин-связывающий домен может содержать следующую аминокислотную последовательность:In one example of the present invention, the albumin binding domain may comprise the following amino acid sequence:
LAX3AKX6X7ANX10ELDX14Y-[BM]-LX43X44LP,LAX 3 AKX 6 X 7 ANX 10 ELDX 1 4 Y -[BM]-LX 43 X 44 LP,
где:where:
[ВМ] представляет собой альбумин-связывающий мотив, как определено в предыдущем абзаце,[BM] is an albumin-binding motif as defined in the previous paragraph,
Х3 независимо выбран из С, Е, Q и S;X 3 is independently selected from C, E, Q and S;
Х6 независимо выбран из С, Е и S;X 6 is independently selected from C, E and S;
Х7 независимо выбран из А и S;X 7 is independently selected from A and S;
Х10езависимо выбран из A, R и S;X 10 is independently selected from A, R and S;
Х14 независимо выбран из А, С, K и S;X 14 is independently selected from A, C, K and S;
Х43 независимо выбран из А и K; иX 43 is independently selected from A and K; and
Х44 независимо выбран из А, Е и S.X 44 is independently selected from A, E and S.
Альбумин-связывающий домен может быть представлен аминокислотными последовательностями, выбранными из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6-13, но не ограничивается ими. Альбумин-связывающий домен может предпочтительно быть представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 6.The albumin-binding domain can be represented by amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 6-13, but is not limited to them. The albumin binding domain may preferably be represented by the amino acid sequence of
В настоящем изобретении предпочтительно, чтобы альбумин-связывающий домен был слит с С-концом А-цепи в инсулине или аналоге инсулина В-цепь - С -цепь - А-цепь в отношении эффективности повторного сворачивания белка, эффективности ферментативной реакции и активности полученного производного инсулина или производных аналога инсулина. В связи с этим, линкер может быть введен между инсулином (или аналогом инсулина) и альбумин-связывающим доменом.In the present invention, it is preferable that the albumin-binding domain be fused to the C-terminus of the A chain in insulin or insulin analog B chain - C chain - A chain in terms of protein refolding efficiency, enzymatic reaction efficiency and activity of the resulting insulin derivative or derivatives of an insulin analog. In this regard, a linker can be inserted between the insulin (or insulin analog) and the albumin-binding domain.
Функция производного аналога инсулина длительного действия согласно настоящему изобретению варьирует в зависимости от трехмерной структуры производного. Таким образом, возможно вносить небольшие изменения в аминокислотную последовательность производного аналога инсулина длительного действия согласно настоящему изобретению, не влияя на функцию данного производного. Таким образом, настоящее изобретение включает варианты альбумин-связывающего домена или производного аналога инсулина длительного действия, которые сохраняют свойство связывания альбумина или высокую устойчивость к ферментативному расщеплению. Например, аминокислотные остатки, принадлежащие к конкретной функциональной группе аминокислотных остатков (например, гидрофобность, гидрофильность, полярность и т.д.), могут быть заменены другими аминокислотными остатками, принадлежащими к той же функциональной группе.The function of the long-acting insulin analogue derivative of the present invention varies depending on the three-dimensional structure of the derivative. Thus, it is possible to make small changes in the amino acid sequence of the long acting insulin analog derivative of the present invention without affecting the function of the derivative. Thus, the present invention includes variants of an albumin-binding domain or a long-acting insulin analogue derivative that retain albumin-binding property or high resistance to enzymatic degradation. For example, amino acid residues belonging to a particular functional group of amino acid residues (eg, hydrophobicity, hydrophilicity, polarity, etc.) can be replaced by other amino acid residues belonging to the same functional group.
В том виде, в котором они используются в данном документе, термины «альбумин-связывающий» и «аффинность связывания в отношении альбумина» относятся к свойству полипептида или белка, которое можно тестировать посредством применения технологии поверхностного плазмонного резонанса, как например, с помощью прибора Biacore. Например, аффинность связывания альбумина можно тестировать в эксперименте, в котором альбумин или его фрагмент иммобилизуют на сенсорном чипе прибора, и образец, содержащий полипептид или белок, подлежащий тестированию, пропускают через чип.As used herein, the terms "albumin-binding" and "binding affinity for albumin" refer to a property of a polypeptide or protein that can be tested using surface plasmon resonance technology, such as the Biacore instrument. . For example, albumin binding affinity can be tested in an experiment in which albumin or a fragment thereof is immobilized on a sensor chip of the instrument and a sample containing the polypeptide or protein to be tested is passed through the chip.
В качестве альтернативы, полипептид или белок, подлежащий тестированию, иммобилизуют на сенсорном чипе прибора, и образец, содержащий альбумин или его фрагмент, пропускают через чип. В связи с этим, альбумин может представлять собой альбумин сыворотки, происходящей из млекопитающего, как например, альбумин сыворотки человека. Специалисты в данной области могут интерпретировать результаты, полученные с помощью таких экспериментов, для установления количественного показателя аффинности связывания полипептида или белка в отношении альбумина. Если количественный показатель является желательным, например, для определения значения KD для взаимодействия, могут быть также использованы методы поверхностного плазмонного резонанса. Величины связывания могут, например, быть определены на приборе Biacore 2000 (Biacore АВ). Альбумин подходящим образом иммобилизован на измерительном сенсорном чипе, и образцы полипептида или белка, чья аффинность подлежит определению, получают посредством серийного разведения и инъецируют в случайном порядке. Значения KD можно, затем, рассчитывать на основании результатов, используя, например, 1:1 модель связывания Ленгмюра программного обеспечения BIAevaluation 4.1, предоставленного производителем прибора.Alternatively, the polypeptide or protein to be tested is immobilized on the instrument's sensor chip and a sample containing albumin or a fragment thereof is passed through the chip. In this regard, the albumin may be serum albumin derived from a mammal, such as human serum albumin. Those skilled in the art can interpret the results obtained from such experiments to quantify the binding affinity of a polypeptide or protein for albumin. If a quantitative indicator is desired, for example, to determine the K D value for the interaction, surface plasmon resonance techniques can also be used. Binding values can, for example, be determined on a Biacore 2000 instrument (Biacore AB). Albumin is suitably immobilized on a measurement sensor chip and samples of the polypeptide or protein whose affinity is to be determined are obtained by serial dilution and injected at random. K D values can then be calculated from the results using, for example, the 1:1 Langmuir binding model of the BIAevaluation 4.1 software provided by the instrument manufacturer.
В одном воплощении настоящего изобретения альбумин, с которым связывается производное аналога инсулина длительного действия, может быть выбран из альбумина сыворотки человека, альбумина сыворотки крысы, альбумина сыворотки яванского макака и альбумина сыворотки мыши, но не ограничивается ими.In one embodiment of the present invention, the albumin to which the long-acting insulin analogue derivative binds can be selected from, but not limited to, human serum albumin, rat serum albumin, cynomolgus monkey serum albumin, and mouse serum albumin.
В одном конкретном воплощении альбумин, с которым связывается производное аналога инсулина длительного действия, представляет собой альбумин сыворотки человека.In one particular embodiment, the albumin to which the long acting insulin analog derivative binds is human serum albumin.
Аналог инсулина и альбумин-связывающий домен связаны друг с другом пептидной связью; полипептидным линкером; или непептидильным линкером, выбранным из группы, состоящей из полиэтилен гликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахаридов, декстрана, простого поливинилэтилового эфира, биоразлагаемых полимеров, жирных кислот, нуклеотидов, липидных полимеров, хитина, гиалуроновой кислоты и их комбинаций, но не ограничиваются ими.The insulin analog and the albumin-binding domain are linked to each other by a peptide bond; a polypeptide linker; or a non-peptidyl linker selected from the group consisting of polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol-propylene glycol copolymer, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol, polysaccharides, dextran, polyvinyl ethyl ether, biodegradable polymers, fatty acids, nucleotides, lipid polymers, chitin, hyaluronic acid, and their combinations, but are not limited to them.
В настоящем изобретении линкер, состоящий из повтора последовательности (GGGGS)n (где n представляет собой целое число, находящееся в интервале от 1 до 6), может быть вставлен между аналогом инсулина и альбумин-связывающим доменом. Это основано на результатах экспериментов, указывающих на то, что когда линкер не был введен, выход повторного сворачивания был низким, а когда два или более повторов последовательности (GGGGS) были введены, отсутствовало значимое различие в выходе повторного сворачивания. Между тем, при увеличении числа (n) повторов данной последовательности, скорость превращения в активную форму инсулина под действием клострипаина повышалась, но фармакокинетика in vivo аналога инсулина не подвергалась значимому влиянию. Принимая во внимание все описанные выше результаты, линкер предпочтительно состоит из 2-4 повторов последовательности GGGGS.In the present invention, a linker consisting of a sequence repeat (GGGGS) n (where n is an integer ranging from 1 to 6) can be inserted between the insulin analog and the albumin-binding domain. This is based on experimental results indicating that when the linker was not introduced, the refolding yield was low, and when two or more sequence repeats (GGGGS) were introduced, there was no significant difference in the refolding yield. Meanwhile, by increasing the number (n) of repeats of this sequence, the rate of conversion to the active form of insulin under the action of clostripaine increased, but the in vivo pharmacokinetics of the insulin analog was not significantly affected. Considering all the results described above, the linker preferably consists of 2-4 repeats of the GGGGS sequence.
Таким образом, в настоящем изобретении аналог инсулина и альбумин-связывающий домен могут быть связаны друг с другом полипептидным линкером, и полипептидный линкер может содержать (GGGGS)n (где n представляет собой целое число, находящееся в интервале от 1 до 6), но не ограничивается ими. Предпочтительно, полипептидный линкер может быть представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 5.Thus, in the present invention, the insulin analog and the albumin-binding domain may be linked to each other by a polypeptide linker, and the polypeptide linker may contain (GGGGS) n (where n is an integer ranging from 1 to 6), but not limited to them. Preferably, the polypeptide linker may be the amino acid sequence of
В еще одном аспекте настоящее изобретение направлено на рекомбинантный вектор, который содержит: полинуклеотид, кодирующий аналог инсулина; и полинуклеотид, кодирующий альбумин-связывающий домен, содержащий альбумин-связывающий мотив, представленный следующей аминокислотной последовательностью:In yet another aspect, the present invention is directed to a recombinant vector that contains: a polynucleotide encoding an insulin analogue; and a polynucleotide encoding an albumin-binding domain containing an albumin-binding motif represented by the following amino acid sequence:
GVSDFYKKLIXaKAKTVEGVEALKXbXcl,GVSDFYKKLIX a KAKTVEGVEALKX b X c l,
где:where:
Ха независимо выбран из D и Е,X a is independently selected from D and E,
Xb независимо выбран из D и Е, иX b is independently selected from D and E, and
Xc независимо выбран из А и Е.X c is independently selected from A and E.
В одном воплощении настоящего изобретения альбумин-связывающий домен может содержать следующую аминокислотную последовательность:In one embodiment of the present invention, the albumin binding domain may comprise the following amino acid sequence:
LAX3AKX6X7ANX1oELDX14Y-[BM]-LX43X44LP, где:LAX 3 AKX 6 X 7 ANX 1o ELDX 14 Y-[BM]-LX 43 X 44 LP, where:
[ВМ] представляет собой альбумин-связывающий мотив, как определено в предыдущем абзаце,[BM] is an albumin-binding motif as defined in the previous paragraph,
Х3 независимо выбран из С, Е, Q и S;X 3 is independently selected from C, E, Q and S;
X6 независимо выбран из С, Е и S;X 6 is independently selected from C, E and S;
Х7 независимо выбран из А и S;X 7 is independently selected from A and S;
Х10 независимо выбран из A, R и S;X 10 is independently selected from A, R and S;
Х14 независимо выбран из А, С, K и S;X 14 is independently selected from A, C, K and S;
Х43 независимо выбран из А и K; иX 43 is independently selected from A and K; and
Х44 независимо выбран из А, Е и S.X 44 is independently selected from A, E and S.
Альбумин-связывающий домен может быть представлен аминокислотными последовательностями, выбранными из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6-13, но не ограничивается ими. Альбумин-связывающий домен может предпочтительно быть представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 6.The albumin-binding domain can be represented by amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 6-13, but is not limited to them. The albumin binding domain may preferably be represented by the amino acid sequence of
В настоящем изобретении полинуклеотид, кодирующий аналог инсулина, и нуклеотид, кодирующий альбумин-связывающий домен, можно вводить в рекомбинантный вектор таким образом, чтобы аналог инсулина и альбумин-связывающий домен могли экспрессироваться в виде слитого белка.In the present invention, a polynucleotide encoding an insulin analog and a nucleotide encoding an albumin-binding domain can be introduced into a recombinant vector such that the insulin analog and the albumin-binding domain can be expressed as a fusion protein.
Другое описание альбумин-связывающего домена, введенного в рекомбинантный вектор, перекрывается с описанием альбумин-связывающего домена производного аналога инсулина длительного действия, и, таким образом, опущено. Кроме того, полинуклеотид, кодирующий полипептидный линкер, может быть включен между полинуклеотидом, кодирующим аналог инсулина, и полинуклеотидом, кодирующим альбумин-связывающий домен. Описание полипептидного линкера также перекрывается с описанием полипептидного линкера производного аналога инсулина длительного действия, и, таким образом, его подробное описание будет опущено для того, чтобы избежать избыточности.Another description of the albumin-binding domain introduced into the recombinant vector overlaps with the description of the albumin-binding domain of the long-acting insulin analogue derivative, and is thus omitted. In addition, a polynucleotide encoding a polypeptide linker may be interposed between a polynucleotide encoding an insulin analogue and a polynucleotide encoding an albumin-binding domain. The description of the polypeptide linker also overlaps with the description of the long acting insulin analog derivative polypeptide linker, and thus its detailed description will be omitted in order to avoid redundancy.
Между тем, описание альбумин-связывающего мотива и альбумин-связывающего домена (или альбумин-связывающего полипептида) истолковывается как включающее содержание, раскрытое в выложенной для всеобщего ознакомления публикации корейского патента №10-2015-0058454, соответствующей WO 2014048977.Meanwhile, the description of the albumin-binding motif and albumin-binding domain (or albumin-binding polypeptide) is construed to include the content disclosed in Korean Patent Publication Laid Out No. 10-2015-0058454 corresponding to WO 2014048977.
Рекомбинантный вектор согласно настоящему изобретению может быть сконструирован в качестве вектора для общепринятого клонирования или экспрессии, и может быть сконструирован в качестве вектора для применения прокариотической или эукариотической клетки в качестве клетки-хозяина.The recombinant vector of the present invention can be designed as a vector for conventional cloning or expression, and can be designed as a vector for using a prokaryotic or eukaryotic cell as a host cell.
В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «вектор» относится к рекомбинантному вектору, способному экспрессировать целевой белок в соответствующей клетке-хозяине, который представляет собой генетическую конструкцию, включающую существенные регуляторные факторы, функционально связанные, для обеспечения экспрессии вставки нуклеиновой кислоты. Согласно настоящему изобретению можно получать рекомбинантный вектор, который включает нуклеиновую кислоту, кодирующую аналог инсулина и/или производное аналога инсулина. Аналог инсулина и/или производное аналога инсулина по настоящему изобретению можно получать в рекомбинантном микроорганизме, в который введен рекомбинантный вектор посредством трансформации или трансфекции, посредством лизиса и очистки культивируемого рекомбинантного микроорганизма.As used herein, the term "vector" refers to a recombinant vector capable of expressing a target protein in an appropriate host cell, which is a genetic construct incorporating essential regulatory factors operably linked to allow expression of a nucleic acid insert. acids. According to the present invention, a recombinant vector can be produced which includes a nucleic acid encoding an insulin analog and/or an insulin analog derivative. The insulin analog and/or insulin analog derivative of the present invention can be produced in a recombinant microorganism into which a recombinant vector is introduced by transformation or transfection, by lysing and purifying the cultured recombinant microorganism.
В настоящем изобретении нуклеиновая кислота, кодирующая аналог инсулина и производное аналога, функционально связана с последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты. В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «функционально связан» относится к функциональной связи между последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты (например, промотором, сигнальной последовательностью, сайтом связывания рибосом, последовательностью терминации транскрипции и т.д.) и другой нуклеотидной последовательностью, и, таким образом, регуляторная последовательность может контролировать транскрипцию и/или трансляцию другой нуклеотидной последовательности.In the present invention, a nucleic acid encoding an insulin analog and a derivative of the analog is operably linked to a nucleic acid expression control sequence. As used herein, the term "operably linked" refers to a functional relationship between a nucleic acid expression control sequence (e.g., promoter, signal sequence, ribosome binding site, transcription termination sequence, etc.) and another nucleotide sequence, and thus the regulatory sequence can control transcription and/or translation of another nucleotide sequence.
В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «промотор» относится к нетранслируемой последовательности нуклеиновой кислоты, расположенной выше кодирующей области, которая включает сайт связывания полимеразы, и обладает активностью инициации транскрипции гена, расположенного ниже промотора, в мРНК, а именно, сайт ДНК, с которым связывается полимераза и инициирует транскрипцию гена, и он расположен в 5' области участка инициации транскрипции мРНК.As used herein, the term "promoter" refers to an untranslated nucleic acid sequence located upstream of a coding region that includes a polymerase binding site and has the activity of initiating transcription of a gene downstream of the promoter into mRNA, namely , the DNA site to which polymerase binds and initiates gene transcription, and is located in the 5' region of the mRNA transcription initiation site.
Например, когда вектор по настоящему изобретению представляет собой рекомбинантный вектор, и в качестве клетки-хозяина используется прокариотическая клетка, обычно включены сильный промотор, способный стимулировать транскрипцию (такой как промотор tac, промотор lac, промотор lacUV5, промотор Ipp, промотор plλ, промотор pRλ, промотор rac5, промотор amp, промотор recA, промотор SP6, промотор trp, промотор trc, промотор phoA, промотор araBAD, промотор Т5 и промотор Т7), сайт связывания рибосом для инициации трансляции и последовательности терминации транскрипции/трансляции.For example, when the vector of the present invention is a recombinant vector and a prokaryotic cell is used as the host cell, a strong promoter capable of stimulating transcription (such as tac promoter, lac promoter, lacUV5 promoter, Ipp promoter, plλ promoter, pRλ promoter) is usually included. , rac5 promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter, trc promoter, phoA promoter, araBAD promoter, T5 promoter and T7 promoter), ribosome binding site for translation initiation and transcription/translation termination sequences.
Кроме того, вектор, который может быть использован в настоящем изобретении, может быть получен посредством манипуляций с плазмидами (например, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, рМЕ290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFRI, pHV14, серия pGEX, серия pET, серия pPICZα, pUC19 и т.д.), фагами (например, λgt4λB, λCharon, λΔz1, M13 и т.д.) или вирусами (например, SV40 и т.д.), которые обычно используются в данной области, но, не ограничиваясь ими.In addition, a vector that can be used in the present invention can be obtained by manipulation of plasmids (e.g., pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFRI , pHV14, pGEX series, pET series, pPICZα series, pUC19 etc.), phages (e.g. λgt4λB, λCharon, λΔz1, M13 etc.) or viruses (e.g. SV40 etc.), which are commonly used in this field, but not limited to them.
Между тем, когда вектор по настоящему изобретению представляет собой рекомбинантный вектор, и эукариотическую клетку используют в качестве клетки-хозяина, можно использовать промоторы, происходящие из геномов клеток млекопитающего (например, промотор металлотионеина), промоторы, происходящие из вирусов млекопитающего (например, поздний промотор аденовируса, 7,5K промотор вируса осповакцины, промотор SV40, промотор цитомегаловируса и tk промотор HSV (от англ. Herpes Simplex Virus - вирус простого герпеса)), и, в общем, вектор включает полиаденилированную последовательность (например, терминатор гормона роста крупного рогатого скота и полиаденилированную последовательность, происходящую из SV40) в качестве последовательности терминации транскрипции.Meanwhile, when the vector of the present invention is a recombinant vector and a eukaryotic cell is used as a host cell, promoters derived from mammalian cell genomes (for example, metallothionein promoter), promoters derived from mammalian viruses (for example, late promoter adenovirus, 7.5K vaccinia virus promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus promoter, and tk promoter of HSV (from the English Herpes Simplex Virus - herpes simplex virus)), and, in general, the vector includes a polyadenylated sequence (for example, a bovine growth hormone terminator and a polyadenylated sequence derived from SV40) as a transcription termination sequence.
Кроме того, рекомбинантный вектор по настоящему изобретению включает ген устойчивости к антибиотику, обычно используемый в данной области в качестве селективного маркера, и может включать, например, гены устойчивости к ампициллину, гентамицину, карбенициллину, хлорамфениколу, стрептомицину, канамицину, генетицину, неомицину или тетрациклину.In addition, the recombinant vector of the present invention includes an antibiotic resistance gene commonly used in the art as a selectable marker, and may include, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neomycin, or tetracycline resistance genes. .
Рекомбинантный вектор по настоящему изобретению может дополнительно включать другую последовательность для облегчения очистки выделенных целевых белков, а именно, аналога инсулина и/или производного аналога инсулина. Последовательность, подлежащая дополнительному включению, может представлять собой последовательность метки для очистки белка, например, глутатион-5-трансферазу (Pharmacia, США), мальтоза-связывающий белок (NEB, США), FLAG (IBI, США), 6-гистидин и т.д., но виды последовательности, необходимой для очистки целевых белков, не ограничиваются ими. Слитые белки, экспрессируемые рекомбинантным вектором, включая указанную выше последовательность метки, могут быть очищены посредством аффинной хроматографии. Например, когда подвергают слиянию глутатион S-трансферазу, можно использовать глутатион, который представляет собой субстрат данного фермента, и когда используется 6-гистидиновая метка, желательный целевой белок может быть с легкостью собран посредством колонки Ni-NTA. Рекомбинантный микроорганизм, трансформированный вектором, может быть сконструирован, используя рекомбинантный вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий аналог инсулина и/или производное аналога инсулина.The recombinant vector of the present invention may further include another sequence to facilitate purification of isolated target proteins, namely an insulin analog and/or an insulin analog derivative. The sequence to be further included may be a protein purification tag sequence, e.g. glutathione-5-transferase (Pharmacia, USA), maltose binding protein (NEB, USA), FLAG (IBI, USA), 6-histidine, etc .d., but the kinds of sequence needed to purify target proteins are not limited to them. Fusion proteins expressed by the recombinant vector, including the above tag sequence, can be purified by affinity chromatography. For example, when glutathione S-transferase is fused, glutathione, which is a substrate of this enzyme, can be used, and when a 6-histidine tag is used, the desired target protein can be easily collected through a Ni-NTA column. A vector-transformed recombinant microorganism can be constructed using a recombinant vector containing a polynucleotide encoding an insulin analog and/or an insulin analog derivative.
В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «трансформация» относится к способу введения ДНК в клетку-хозяина и получения ДНК, реплицируемой в ней, в виде хромосомного фактора или посредством выполнения хромосомной интеграции, которая является явлением искусственного осуществления генетического изменения посредством введения экзогенной ДНК в клетку.As used herein, the term "transformation" refers to a method of introducing DNA into a host cell and obtaining DNA that replicates therein, either as a chromosomal factor or by performing chromosomal integration, which is the phenomenon of artificially effecting genetic change. by introducing exogenous DNA into the cell.
Способ трансформации, используемый в настоящем изобретении, может представлять собой любой способ трансформации, и его можно легко осуществлять в соответствии с общепринятым способом, используемым в данной области. Примеры обычно используемого способа трансформации могут включать способ осаждения с использованием CaCl2, способ Hanahan с улучшенной эффективностью, используя диметилсульфоксид (ДМСО) в качестве восстанавливающего агента в способе осаждения с использованием CaCl2, электропорацию, способ осаждения с использованием CaPO4, способ слияния протопластов, способ перемешивания с использованием карбидокремниевого волокна, способ трансформации, опосредованной агробактериями, способ трансформации с использованием ПЭГ (полиэтиленгликоль), трансформации, опосредованные сульфатом декстрана, липофектамином и сушкой/давлением, и т.д.The transformation method used in the present invention may be any transformation method, and it can be easily carried out in accordance with the conventional method used in this field. Examples of the commonly used transformation method may include the CaCl 2 precipitation method, the Hanahan method with improved efficiency using dimethyl sulfoxide (DMSO) as a reducing agent in the CaCl 2 precipitation method, electroporation, the CaPO 4 precipitation method, the protoplast fusion method, agitation method using silicon carbide fiber, agrobacterium mediated transformation method, PEG (polyethylene glycol) transformation method, dextran sulfate, lipofectamine and drying/pressure mediated transformation, etc.
Способ трансформации рекомбинантным вектором, включающим нуклеиновую кислоту, кодирующую аналог инсулина и/или производное аналога инсулина согласно настоящему изобретению, может не ограничиваться данными способами, но любой способ трансформации или трансфекции, обычно используемый в данной области, можно использовать без ограничения.The method for transformation with a recombinant vector comprising a nucleic acid encoding an insulin analog and/or an insulin analog derivative of the present invention may not be limited to these methods, but any transformation or transfection method commonly used in the art can be used without limitation.
Рекомбинантный трансформант по настоящему изобретению может быть получен посредством введения рекомбинантного вектора, включающего нуклеиновую кислоту, кодирующую аналог инсулина и/или производное аналога инсулина, в клетку-хозяина.The recombinant transformant of the present invention can be obtained by introducing a recombinant vector comprising a nucleic acid encoding an insulin analog and/or an insulin analog derivative into a host cell.
Соответствующий хозяин, подлежащий использованию в настоящем изобретении, может особым образом не ограничиваться при условии, что он может экспрессировать нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению. Примеры соответствующего хозяина могут включать бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, как например, Е. coii, бактерии, принадлежащие к роду Bacillus, как например, Bacillus subtilis, бактерии, принадлежащие к роду Pseudomonas, как например, Pseudomonas putida, дрожжи, как например Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae и Schizosaccharomyces pombe, клетку насекомого, как например Spodoptera frugiperda (SF9), и животные клетки, такие как СНО (от англ. -Chinese Hamster Ovary - яичник китайского хомячка), COS и BSC, но не ограничиваются ими.An appropriate host to be used in the present invention may not be particularly limited as long as it can express the nucleic acid of the present invention. Examples of a suitable host may include bacteria belonging to the genus Escherichia, such as E. coii, bacteria belonging to the genus Bacillus, such as Bacillus subtilis, bacteria belonging to the genus Pseudomonas, such as Pseudomonas putida, yeast, such as Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe, insect cell such as Spodoptera frugiperda (SF9), and animal cells such as but not limited to CHO (Chinese Hamster Ovary), COS and BSC.
Согласно настоящему изобретению также предложена композиция для лечения диабета, содержащая аналог инсулина или производное аналога инсулина.The present invention also provides a composition for the treatment of diabetes comprising an insulin analog or an insulin analog derivative.
Согласно настоящему изобретению также предложен способ лечения диабета, включающий стадию введения аналога инсулина или производного аналога инсулина субъекту, нуждающемуся в контроле уровня глюкозы в крови.The present invention also provides a method for treating diabetes, comprising the step of administering an insulin analog or insulin analog derivative to a subject in need of blood glucose control.
Согласно настоящему изобретению также предложен аналог инсулина или производное аналога инсулина для применения в лечении диабета.The present invention also provides an insulin analog or derivative of an insulin analog for use in the treatment of diabetes.
Согласно настоящему изобретению также предложено применение аналога инсулина или производного аналога инсулина для изготовления лекарственного средства для лечения диабета.The present invention also provides the use of an insulin analogue or a derivative of an insulin analogue for the manufacture of a medicament for the treatment of diabetes.
Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения активной формы производного аналога инсулина длительного действия, имеющего увеличенный период полувыведения in vivo, причем способ включает следующие стадии: (а) культивирование рекомбинантного микроорганизма; (b) лизис культивируемого рекомбинантного микроорганизма, с получением, таким образом, производного аналога инсулина длительного действия; (с) индукция повторного сворачивания полученного производного аналога инсулина длительного действия, с получением, таким образом, препроформы производного аналога инсулина; (d) превращение препроформы производного аналога инсулина в активную форму посредством обработки клострипаином и СрВ; и (е) очистка активной формы производного аналога инсулина длительного действия.The present invention also provides a method for preparing an active form of a long-acting insulin analogue derivative having an extended in vivo half-life, the method comprising the steps of: (a) culturing a recombinant microorganism; (b) lysing the cultured recombinant microorganism, thereby obtaining a long acting insulin analogue derivative; (c) inducing refolding of the resulting long acting insulin analogue derivative, thereby obtaining a preproform of the insulin analogue derivative; (d) converting the preproform of the insulin analogue derivative into the active form by treatment with clostripain and CPB; and (e) purifying the active form of the long acting insulin analogue derivative.
ПримерыExamples
Далее в данном документе, настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры. Специалисту, обладающему средней квалификацией в данной области, будет очевидно, что данные примеры представлены исключительно в иллюстративных целях, и не должны истолковываться как ограничивающие объем настоящего изобретения.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. One of ordinary skill in the art will recognize that these examples are for illustrative purposes only and should not be construed as limiting the scope of the present invention.
В приведенных ниже примерах аналог инсулина, слитый с ABD, используют в том же значении, как производное аналога инсулина длительного действия в настоящем изобретении.In the examples below, an insulin analogue fused to ABD is used in the same meaning as the long-acting insulin analogue derivative in the present invention.
Пример 1: Конструирование экспрессионного вектора и штамма с инсулином, слитым с ABDExample 1: Construction of an expression vector and strain with insulin fused to ABD
Человеческий инсулин синтезируется в форме пре-про-инсулина, препоследовательность отщепляется в эндоплазматическом ретикулуме, и проинсулин обрабатывается в аппарате Гольджи и эндоплазматическом ретикулуме, с образованием, таким образом, зрелого инсулина. На основе данного факта, для получения рекомбинантного инсулина способом экспрессии белка проинсулина в Е. coli и затем удаления С-цепи обработкой трипсином, конструировали проинсулин. Для повышения эффективности экспрессии проинсулина в E.coli и эффективности очистки, метку слияния включали в N-конец, и проводили оптимизацию кодонов.Human insulin is synthesized in the form of pre-pro-insulin, the presequence is cleaved off in the endoplasmic reticulum, and proinsulin is processed in the Golgi apparatus and endoplasmic reticulum, thus forming mature insulin. Based on this fact, to obtain recombinant insulin by the method of expressing proinsulin protein in E. coli and then removing the C chain by trypsin treatment, proinsulin was designed. To improve the efficiency of proinsulin expression in E. coli and the efficiency of purification, a fusion tag was included at the N-terminus and codon optimization was performed.
Число участков инсулина, с которыми может быть слит альбумин-связывающий домен (ABD), теоретически равно четырем. Однако, N-конец А-цепи представляет собой положение, важное для активности инсулина, и, вследствие этого, его исключали из положений слияния. Несмотря на то, что N-конец В-цепи важен для образования гексамера инсулина, он был включен в положения слияния, поскольку активность инсулина могла сохраняться. Если ABD слит между В-цепью и С-цепью, он может оказывать действие на сворачивание белка. Таким образом, конструкцию инсулина конструировали или в порядке В-С-А или порядке А-С-В в качестве структуры кандидата. Наконец, генные структуры для экспрессии следующих трех форм инсулина, слитого с ABD, конструировали следующим образом:The number of insulin sites to which an albumin-binding domain (ABD) can be fused is theoretically four. However, the N-terminus of the A chain is a position important for insulin activity, and as a result, it was excluded from the fusion positions. Although the N-terminus of the B chain is important for the formation of the insulin hexamer, it was included in the fusion positions because insulin activity could be maintained. If ABD is fused between the B chain and the C chain, it may have an effect on protein folding. Thus, the insulin construct was designed either in B-C-A order or A-C-B order as a candidate structure. Finally, gene structures for the expression of the following three forms of insulin fused to ABD were constructed as follows:
Ndel - Метка слияния - В-цепь - С-цепь - А-цепь - Линкер - ABD - EcoRI,Ndel - Fusion mark - B-strand - C-strand - A-strand - Linker - ABD - EcoRI,
Ndel - Метка слияния - ABD - Линкер - В-цепь - С-цепь - А-цепь - EcoRI иNdel - Fusion tag - ABD - Linker - B-strand - C-strand - A-strand - EcoRI and
Ndel - Метка слияния - А- цепь - С- цепь - В- цепь - линкер - ABD - EcoRI.Ndel - Fusion label - A-chain - C-chain - B-chain - linker - ABD - EcoRI.
В качестве экспрессионного вектора использовали вектор pJ401(DNA 2.0). Вектор расщепляли рестриктазами Ndel и EcoRI, и затем ДНК-фрагменты разделяли посредством электрофореза в 1%-ном агарозном геле. Генетические структуры для экспрессии слитых белков ABD и ДНК-фрагменты, полученные из экспрессионного вектора, как описано выше, лигировали друг с другом, используя ДНК-лигазу Т4, конструируя, таким образом, плазмиды. Далее, каждой из данных плазмид трансформировали Е. coli BL21(DE3) способом на основе хлорида кальция. Отбирали трансформированные штаммы, обладающие устойчивостью к канамицину, и из них выделяли ДНК. То, была ли ДНК правильно вставлена, определяли способом анализа на основе расщепления эндонуклеазами рестрикции.The pJ401(DNA 2.0) vector was used as an expression vector. The vector was digested with Ndel and EcoRI, and then the DNA fragments were separated by electrophoresis in 1% agarose gel. The genetic structures for expressing the ABD fusion proteins and the DNA fragments obtained from the expression vector as described above were ligated to each other using T4 DNA ligase, thus constructing plasmids. Next, each of these plasmids was transformed into E. coli BL21(DE3) by the calcium chloride method. Transformed strains with kanamycin resistance were selected and DNA was isolated from them. Whether the DNA was correctly inserted was determined by the restriction endonuclease digestion analysis method.
Когда конструировали ген, имеющий следующую структуру: Ndel - метка слияния - ABD - Линкер - В-цепь - С-цепь - А-цепь - EcoRI, его определяли ненадлежащим из-за очень низкого выхода повторного сворачивания белка. Кроме того, когда конструировали ген, имеющий следующую структуру Ndel - метка слияния - А-цепь - С-цепь - В-цепь - Линкер - ABD - EcoRI, слитый с ABD инсулин обладал активностью инсулина, но он демонстрировал низкий выход повторного сворачивания и выход ферментативной обработки, таким образом, он считался неподходящим в качестве способа получения активной формы инсулина. Таким образом, среди данных трех форм инсулина, слитого с ABD, структуру Ndel - метка слияния - В-цепь - С-цепь - А-цепь - линкер - ABD - EcoRI выбирали и использовали в последующем эксперименте.When a gene having the following structure was constructed: Ndel - fusion mark - ABD - Linker - B chain - C chain - A chain - EcoRI, it was determined to be inadequate due to the very low yield of protein refolding. In addition, when a gene having the following structure was constructed Ndel - fusion mark - A-chain - C-chain - B-chain - Linker - ABD - EcoRI, insulin fused to ABD had insulin activity, but it showed a low refolding yield and yield enzymatic processing, thus, it was considered unsuitable as a method for obtaining the active form of insulin. Thus, among these three forms of insulin fused to ABD, the structure Ndel-fusion mark-B-chain-C-chain-A-chain-linker-ABD-EcoRI was chosen and used in the subsequent experiment.
Между А-цепью и альбумин-связывающим доменом (ABD) вставляли линкер, состоящий из 1-6 повторов последовательности (GGGGS). В данном случае, когда линкер не вводили, выход повторного сворачивания был очень низким, но когда вводили линкер, состоящий из двух или более повторов последовательности (GGGGS), не было значимого различия в выходе повторного сворачивания. Между тем, при увеличении n в последовательности (GGGGS)n, скорость превращения в активную форму инсулина под действием клострипаина повышалась, но фармакокинетика in vivo инсулина значимо не подвергалась воздействию. Принимая во внимание все описанные выше результаты, конструировали линкер, состоящий из 2-4 повторов последовательности GGGGS.A linker consisting of 1-6 repeats of the sequence (GGGGS) was inserted between the A chain and the albumin binding domain (ABD). In this case, when no linker was introduced, the refold yield was very low, but when a linker consisting of two or more sequence repeats (GGGGS) was administered, there was no significant difference in the refold yield. Meanwhile, with increasing n in the sequence (GGGGS) n , the rate of conversion to the active form of insulin under the action of clostripaine increased, but the in vivo pharmacokinetics of insulin was not significantly affected. Taking into account all the results described above, a linker was designed consisting of 2-4 repeats of the GGGGS sequence.
Аминокислотные последовательности каждого из фрагментов для инсулина, слитого с ABD, используемого в настоящем изобретении, показаны ниже в Таблице 1.The amino acid sequences of each of the fragments for the ABD fused insulin used in the present invention are shown in Table 1 below.
Пример 2: Конструирование аналогов инсулина, слитых с ABD, имеющих модифицированные аминокислотные последовательности инсулинаExample 2: Construction of insulin analogs fused to ABD having modified insulin amino acid sequences
Для получения инсулина, используя рекомбинантные Е. coli, необходим способ превращения проинсулина в активную форму посредством применения трипсина. Однако, трипсин расщепляет двухосновные аминокислоты с высокой эффективностью и также расщепляет единичные аминокислоты, такие как лизин (Lys) или аргинин (Arg), осложняя получение желательной активной формы инсулина. Кроме того, последовательность ABD также включает некоторое количество остатков лизина (Lys) и аргинина (Arg), дополнительно осложняя получение желательного инсулина, слитого с ABD, обладающего активностью, посредством применения трипсина.In order to produce insulin using recombinant E. coli, a method is needed to convert proinsulin to its active form through the use of trypsin. However, trypsin cleaves dibasic amino acids with high efficiency and also cleaves single amino acids such as lysine (Lys) or arginine (Arg), making it difficult to obtain the desired active form of insulin. In addition, the ABD sequence also includes a number of lysine (Lys) and arginine (Arg) residues, further complicating the production of the desired insulin fused to ABD having activity through the use of trypsin.
По этой причине, клострипаин использовали в качестве фермента, способного заменять трипсин для индукции превращения в активную форму. В данном случае, когда клострипаин взаимодействовал с инсулином, слитым с ABD, происходило расщепление аргинина (Arg) в положении 22 В-цепи инсулина. Для решения данной проблемы аргинин (Arg) в положении 22 В-цепи заменяли лизином (Lys). В данном случае расщепление в положении 22 В-цепи инсулина под действием клострипаина значимо уменьшалось и, таким образом, активная форма слитого с ABD инсулина могла быть эффективно получена (Фиг. 1).For this reason, clostripain has been used as an enzyme capable of replacing trypsin to induce conversion to the active form. In this case, when clostripaine interacted with insulin fused to ABD, arginine (Arg) at position 22 of the insulin B chain was cleaved. To solve this problem, arginine (Arg) at position 22 of the B chain was replaced by lysine (Lys). In this case, the cleavage at position 22 of the insulin B chain by clostripain was significantly reduced, and thus the active form of ABD-fused insulin could be efficiently obtained (FIG. 1).
Помимо мутации, как описано выше, дополнительные мутации вводили в инсулин, слитый с ABD, для дополнительного увеличения стабильности и in vivo периода полувыведения инсулина, слитого с ABD. Пять аминокислот в каждой из А-цепи и В-цепи заменяли, и замененные положения показаны ниже в Таблице 2.In addition to the mutation as described above, additional mutations were introduced into ABD-fused insulin to further increase the stability and in vivo half-life of ABD-fused insulin. Five amino acids in each of the A chain and the B chain were changed and the changed positions are shown below in Table 2.
Оптимизацию кодонов для экспрессии генов в Е. coli проводили, используя алгоритм GeneArt, и синтезировали гены, имеющие замененные аминокислоты.Codon optimization for gene expression in E. coli was performed using the GeneArt algorithm and genes having amino acid substitutions were synthesized.
Плазмиды, сконструированные как описано выше, вводили в Е, coil BL21 (DE3) таким же образом, как описано в Примере 1, конструируя, таким образом, штаммы Е, coii.Plasmids constructed as described above were introduced into E, coil BL21 (DE3) in the same manner as described in Example 1, thus constructing E, coii strains.
Пример 3: Экспрессия аналогов инсулина, слитых с ABDExample 3: Expression of insulin analogs fused to ABD
Для экспрессии аналогов инсулина, слитых с ABD, каждый из рекомбинантных штаммов Е. coli инокулировали в 100 мл среды LB и культивировали при встряхивании при 37°С в течение 16 часов, и культуры использовали в качестве культур для посева. 2 л среды LB добавляли в 7-л ферментер (New Brunswick BioFlo), стерилизовали и затем инокулировали с культурой для посева. Культивирование проводили в условиях температуры 35°С, скорости потока воздуха 3 об/об/мин и скорости перемешивания 1000 об/мин, и рН во время культивирования поддерживали на уровне 6,8 с помощью аммония и фосфорной кислоты. В момент времени, в который источник углерода в среде истощался, начинали подачу и в тот же момент времени экспрессию белка индуцировали IPTG (от англ. isopropylthiogalactoside - изопропилтиогалактозид). Дополнительное культивирование проводили в течение 10 часов после индукции экспрессии, и рекомбинантные штаммы выделяли, используя центрифугу.For the expression of insulin analogs fused to ABD, each of the recombinant E. coli strains was inoculated into 100 ml of LB medium and cultured with shaking at 37° C. for 16 hours, and the cultures were used as seed cultures. 2 L of LB medium was added to a 7 L fermentor (New Brunswick BioFlo), sterilized and then inoculated with the seed culture. Cultivation was carried out under conditions of temperature of 35°C, air flow rate of 3 rpm and stirring speed of 1000 rpm, and the pH during cultivation was maintained at 6.8 with ammonium and phosphoric acid. At the time point at which the carbon source in the medium was depleted, the supply was started and at the same time point, protein expression was induced by IPTG (from the English isopropylthiogalactoside - isopropylthiogalactoside). Additional cultivation was carried out for 10 hours after the induction of expression, and recombinant strains were isolated using a centrifuge.
Аналоги инсулина, слитые с ABD, экспрессировали в виде телец включения в штамме Е, coli, и даже когда аминокислотные мутации вводили в домены инсулина, уровни экспрессии обнаруживались в векторной системе, используемой в настоящем изобретении (Фиг. 2).Insulin analogues fused to ABD were expressed as inclusion bodies in the E coli strain, and even when amino acid mutations were introduced into the insulin domains, expression levels were found in the vector system used in the present invention (FIG. 2).
Пример 4: Индукция лизиса клеток и солюбилизации/повторного сворачиванияExample 4: Induction of cell lysis and solubilization/refolding
Каждый из штаммов, экспрессирующих инсулин, слитый с ABD, или аналоги инсулина, слитые с ABD, суспендировали в лизирующем буфере (20 мМ Tris, 10 мМ ЭДТА, 10% сахароза, 0,2 М NaCl, рН 8,0), и клетки лизировали, используя гомогенизатор высокого давления. Лизированные клетки центрифугировали в высокоскоростной центрифуге при 7000 об/мин, и растворимый белок и некоторые обломки клеток удаляли, выделяя, таким образом, осадок, включающий тельце включения. Выделенное тельце включения промывали буфером (содержащим 1% Triton X-100, 0,2 M NaCl и 1 M мочевину) и затем центрифугировали при 7000 об/мин. Осажденное тельце включения дополнительно два раза промывали дистиллированной водой и затем хранили при -80°С до применения.Each of the strains expressing insulin fused to ABD or insulin analogs fused to ABD was suspended in lysis buffer (20 mM Tris, 10 mM EDTA, 10% sucrose, 0.2 M NaCl, pH 8.0) and the cells lysed using a high pressure homogenizer. The lysed cells were centrifuged in a high speed centrifuge at 7000 rpm, and the soluble protein and some cell debris were removed, thus isolating the pellet including the inclusion body. The isolated inclusion body was washed with buffer (containing 1% Triton X-100, 0.2 M NaCl and 1 M urea) and then centrifuged at 7000 rpm. The precipitated inclusion body was washed an additional two times with distilled water and then stored at -80°C until use.
Хранящееся в замороженном виде тельце включения растворяли в солюбилизирующем буфере (25 мМ Tris, 8 М мочевина, 30 мМ цистеин-HCl, рН 10,5) и затем разбавляли в буфере для повторного сворачивания (25 мМ Tris-HCl, рН 10,5) и подвергали повторному сворачиванию при 4°С в течение 16 часов. Происходило ли повторное сворачивание, определяли посредством анализа ОФ-ВЭЖХ. Когда солюбилизированный раствор анализировали посредством ОФ-ВЭЖХ, пик белка наблюдался на уровне примерно 20 минут вследствие высокой гидрофобности, но когда происходило повторное сворачивание, наблюдался сдвиг данного пика к 16 минутам (Фиг. 3). Причина этого состоит в том, что когда протекает повторное сворачивание, гидрофобность снижается, по сравнению с гидрофобностью в солюбилизированном растворе. Повторное сворачивание продолжали до тех пор, пока сдвига пика белка больше не наблюдалось во время анализа посредством ОФ-ВЭЖХ.The frozen inclusion body was dissolved in solubilizing buffer (25 mM Tris, 8 M urea, 30 mM cysteine-HCl, pH 10.5) and then diluted in refolding buffer (25 mM Tris-HCl, pH 10.5) and subjected to refolding at 4°C for 16 hours. Whether refolding occurred was determined by RP-HPLC analysis. When the solubilized solution was analyzed by RP-HPLC, the protein peak was observed at about 20 minutes due to high hydrophobicity, but when refolding occurred, this peak shifted to 16 minutes (FIG. 3). The reason for this is that as the refolding proceeds, the hydrophobicity decreases compared to the hydrophobicity in the solubilized solution. Refolding was continued until no more protein peak shift was observed during RP-HPLC analysis.
Пример 5: Превращение в активную форму посредством применения ферментаExample 5: Conversion to the active form by the use of an enzyme
Для получения инсулина, используя рекомбинантный штамм Е. coli, требуется превращение проинсулина в активную форму посредством применения трипсина. Однако, инсулин, слитый с ABD, или аналог инсулина, слитый с ABD, имеет целый ряд сайтов расщепления трипсином в своей последовательности, и по этой причине клострипаин использовали в качестве фермента, способного заменить трипсин для индукции превращения в активную форму.Insulin production using a recombinant E. coli strain requires the conversion of proinsulin to its active form through the use of trypsin. However, insulin fused to ABD or an insulin analog fused to ABD has a number of trypsin cleavage sites in its sequence and for this reason clostripain has been used as an enzyme capable of replacing trypsin to induce conversion to the active form.
Когда индуцировали превращение в активную форму, используя клострипаин, происходило расщепление в положении 22 В-цепи инсулина, осложняя получение желательной формы инсулина. По данной причине, аналог инсулина, слитый с ABD, полученный посредством замены в положении 22 В-цепи аргинина (Arg) на лизин (Lys), использовали для получения активной формы инсулина.When conversion to the active form was induced using clostripain, cleavage occurred at position 22 of the insulin B chain, making it difficult to obtain the desired form of insulin. For this reason, an insulin analogue fused to ABD, obtained by substitution at position 22 of the B chain of arginine (Arg) with lysine (Lys), was used to prepare the active form of insulin.
Клострипаин содержит цистеин (Cys) в своем активном сайте, и, таким образом, требует восстанавливающих условий для демонстрации ферментативной активности. Кроме того, когда раствор для повторного сворачивания обрабатывают восстанавливающим агентом для сохранения активности клострипаина, дисульфидная связь в области инсулина с высокой долей вероятности будет разорвана. По данной причине, требуется установить условия, которые повышают выход ферментативной реакции без разрыва дисульфидной связи. Таким образом, эксперимент проводили, используя восстанавливающий агент ДТТ, содержащийся в растворе ферментативной реакции.Clostripain contains a cysteine (Cys) at its active site and thus requires reducing conditions to demonstrate enzymatic activity. In addition, when the refolding solution is treated with a reducing agent to maintain clostripain activity, the disulfide bond in the insulin region is highly likely to be broken. For this reason, it is required to establish conditions that increase the yield of the enzymatic reaction without breaking the disulfide bond. Thus, the experiment was carried out using the reducing agent DTT contained in the enzymatic reaction solution.
Поскольку клострипаин существует в виде проформы, для его активации индуцировали авторасщепление. С этой целью сублимированный клострипаин (Worthington, США) растворяли в дистиллированной воде и затем активировали при 4°С в течение 30 минут после добавления активирующего буфера (500 мМ Tris, 50 мМ ДТТ, 25 мМ CaCl2, рН 7,8). Активированный клострипаин добавляли к повторно свернутому белку в концентрации 0,1-5 единиц на мг белка и позволяли взаимодействовать при 25-40°С в течение 2-8 часов. После реакции с клострипаином СрВ добавляли в концентрации 0,001-1 единица на 1 мг белка и давали прореагировать. Ферментативную реакцию останавливали, снижая рН до 3,5 или меньше посредством применения HCl.Because clostripain exists as a proform, autocleavage was induced to activate it. For this purpose, freeze-dried clostripain (Worthington, USA) was dissolved in distilled water and then activated at 4°C for 30 minutes after adding an activating buffer (500 mM Tris, 50 mM DTT, 25 mM CaCl 2 , pH 7.8). Activated clostripain was added to the refolded protein at a concentration of 0.1-5 units per mg of protein and allowed to interact at 25-40°C for 2-8 hours. After the reaction with clostripain, CPB was added at a concentration of 0.001-1 unit per 1 mg of protein and allowed to react. The enzymatic reaction was stopped by lowering the pH to 3.5 or less by applying HCl.
В результате, как можно видеть на Фиг. 4, ферментативная реакция демонстрировала эффекты повышения эффективности превращения в активную форму инсулина и уменьшения примесей.As a result, as can be seen in FIG. 4, the enzymatic reaction showed the effects of increasing the efficiency of converting insulin into active form and reducing impurities.
Пример 6: Очистка инсулина, слитого с ABDExample 6 Purification of Insulin Confluent with ABD
Образец, ферментативно обработанный клострипаином и СрВ, сначала очищали посредством хроматографии на ионообменной смоле, используя Fractogel® EMD COO (М) (Merck) в соответствии с инструкцией ее производителя, и затем дополнительно очищали посредством обращенно-фазовой хроматографии, используя Pharmprep® Р100 RP-18e (Merck) в соответствии с инструкцией ее производителя.The sample enzymatically treated with clostripain and CpB was first purified by ion exchange resin chromatography using Fractogel® EMD COO (M) (Merck) according to its manufacturer's instructions and then further purified by reverse phase chromatography using Pharmprep® P100 RP- 18e (Merck) according to its manufacturer's instructions.
В результате, как может быть видно на Фиг. 5, активная форма беспримесного инсулина, слитого с ABD, могла быть очищена двумя данными способами очистки.As a result, as can be seen in FIG. 5, the active form of pure insulin fused with ABD could be purified by these two purification methods.
Пример 7: Измерение аффинностей связывания аналогов инсулина, слитых с ABD, в отношении альбуминаExample 7: Measurement of the binding affinities of insulin analogues fused to ABD for albumin
Для измерения аффинностей связывания белков - аналогов инсулина, слитых с ABD, в отношении альбумина использовали аналитический метод поверхностный плазмонный резонанс (SPR - от англ. surface plasmon resonance, BIACORE 3000, GE healthcare). Рекомбинантный человеческий сывороточный альбумин иммобилизовали на чипе СМ5 способом связывания аминогрупп, и ABD или аналоги инсулина, слитые с ABD, разведенные до пяти и более концентраций, связывались с ним, и измеряли их аффинности в отношении человеческого сывороточного альбумина.To measure the binding affinities of proteins - analogues of insulin, fused with ABD, in relation to albumin used analytical method surface plasmon resonance (SPR - from the English surface plasmon resonance, BIACORE 3000, GE healthcare). Recombinant human serum albumin was immobilized on the CM5 chip by the amino coupling method, and ABD or insulin analogs fused with ABD diluted to five or more concentrations were bound to it and their affinities for human serum albumin were measured.
В результате, как может быть видно ниже в Таблице 3, аффинности аналогов инсулина в отношении человеческого сывороточного альбумина сохранялись на уровнях пМ, даже при том, что они были ниже, чем аффинность самого ABD.As a result, as can be seen in Table 3 below, the affinities of the insulin analogues for human serum albumin were maintained at pM levels, even though they were lower than the affinity of ABD itself.
Пример 8: Сравнение аффинностей нативного инсулина и аналогов инсулина, слитых с ABD, в отношении инсулинового рецептораExample 8: Comparison of the Affinities of Native Insulin and Insulin Analogs Merged with ABD for the Insulin Receptor
Для измерения афинностей связывания нативного инсулина и аналогов инсулина, слитых с ABD, в отношении инсулинового рецептора, использовали метод анализа поверхностный плазмонный резонанс (SPR, BIACORE 3000, GE healthcare). Инсулиновый рецептор иммобилизовали на чипе СМ5 способом связывания аминогрупп, и каждый из нативного инсулина и аналогов инсулина, слитых с ABD, разведенных до пяти или более концентраций, связывался с ним, и измеряли их аффинности в отношении инсулинового рецептора.Surface plasmon resonance assay (SPR, BIACORE 3000, GE healthcare) was used to measure the binding affinities of native insulin and insulin analogs fused to ABD for the insulin receptor. The insulin receptor was immobilized on the CM5 chip by the amino binding method, and each of native insulin and insulin analogs fused with ABD, diluted to five or more concentrations, was bound to it, and their affinities for the insulin receptor were measured.
В результате, как можно видеть ниже в Таблице 4, аффинности аналогов инсулина, слитых с ABD, уменьшались, по сравнению с аффинностью нативного инсулина. В частности, аффинность аналога 3 демонстрировала наибольшее уменьшение и падала до уровня 19,4% относительно нативного инсулина.As a result, as can be seen in Table 4 below, the affinities of the insulin analogs fused to ABD decreased compared to that of native insulin. In particular, the affinity of
Эффективности аналогов инсулина, слитых с ABD, оценивали в сравнении с эффективностью инсулина гларгин в моделях диабета 1-го типа, индуцируемого стрептозотоцином. Аналоги 1, 3 и 10 исключали из кандидатов, поскольку они демонстрировали способность снижения уровня глюкозы в крови 50% или меньше, в сравнении с инсулином гларгин.The efficacy of insulin analogs fused to ABD was compared with that of insulin glargine in streptozotocin-induced
Пример 9: Синтез гексамераExample 9: Synthesis of a hexamer
Инсулин связывается с цинком in vivo, образуя, вследствие этого, стабильную гексамерную структуру. Свойство инсулина образовывать гексамер также используется в разработке препарата и может играть важную роль в увеличении периода полувыведения in vivo инсулина. Соответственно, будут ли аналоги инсулина, слитые с ABD, сохранять свойство образования гексамеров, анализировали посредством эксклюзионной хроматографии. В результате, было показано, что аналог 4 сохранял способность образовывать гексамер посредством добавления цинка и фенола (Фиг. 6). Образование гексамера также наблюдали во всех аналогах, за исключением аналогов 7, 9 и 10. Таким образом, среди аналогов, имеющих последовательности, показанные в Таблице 2, аналоги 7 и 9 дополнительно исключали из кандидатов.Insulin binds to zinc in vivo, thereby forming a stable hexameric structure. The property of insulin to form a hexamer is also used in drug development and may play an important role in increasing the in vivo half-life of insulin. Accordingly, whether insulin analogs fused to ABD would retain the property of forming hexamers was analyzed by size exclusion chromatography. As a result,
Пример 10: Оценка фармакокинетики in vivo и способности снижения уровня глюкозы в крови аналогов инсулина, слитых с ABDExample 10 Evaluation of in vivo pharmacokinetics and blood glucose lowering ability of insulin analogues fused with ABD
Для оценки in vivo фармакокинетики шести аналогов инсулина, слитых с ABD, каждый из аналогов инсулина вводили подкожно нормальным крысам SD (возраст 6 недель), и затем брали образцы крови в моменты времени 0, 1,4, 8, 24, 48, 72 и 96 часов. Концентрацию каждого аналога инсулина, слитого с ABD, оставшегося в крови в каждый из моментов времени, измеряли, используя ELISA (от англ. enzyme-linked immunosorbent assay - твердофазный иммуноферментный анализ). Кроме того, используя часть отобранных образцов крови, уровни глюкозы в крови в зависимости от времени измеряли с помощью устройства, контролирующего уровень глюкозы в крови.To evaluate the in vivo pharmacokinetics of the six insulin analogs fused to ABD, each of the insulin analogs was administered subcutaneously to normal SD rats (6 weeks of age) and then blood samples were taken at
В результате, как можно видеть ниже в Таблице 5, аналоги инсулина, слитые с ABD, демонстрировали значимо увеличенные периоды полувыведения, по сравнению с нативным инсулином, как известно, имеющим период полувыведения 5 минут. Аналог 11, полученный посредством замены только в положении 22 В-цепи инсулина, демонстрировал период полувыведения 7,2 часов, и аналог 4, демонстрирующий самое большое увеличение периода полувыведения, по оценке имел период полувыведения 9,9 часов.As a result, as can be seen in Table 5 below, insulin analogs fused to ABD exhibited significantly increased half-lives compared to native insulin known to have a half-life of 5 minutes. Analogue 11, obtained by substitution only at position 22 of the insulin B chain, showed a half-life of 7.2 hours, and
Анализировали время, на протяжении которого уровни глюкозы в крови у нормальных животных сохранялись на пониженных уровнях. В результате, было показано, что аналоги 5, 6 и 8 имели увеличенные периоды полувыведения, но поддерживали уровни глюкозы в крови на протяжении короткого периода времени. По сравнению с данными аналогами, аналог 4 обладал наилучшей способностью снижать уровни глюкозы в крови и сохранял свою эффективность на протяжении самого длительного периода времени (Фиг. 7).Analyzed the time during which blood glucose levels in normal animals remained at low levels. As a result,
Несмотря на то, что настоящее изобретение подробно описано со ссылкой на конкретные признаки, специалистам в данной области будет очевидно, что данное описание предназначено исключительно для предпочтительного воплощения и не ограничивает объем настоящего изобретения. Таким образом, существенный объем настоящего изобретения будет определяться прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.Although the present invention has been described in detail with reference to specific features, it will be apparent to those skilled in the art that this description is intended solely for the preferred embodiment and does not limit the scope of the present invention. Thus, the essential scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
Промышленная применимостьIndustrial Applicability
Аналог инсулина или производное аналога инсулина согласно настоящему изобретению обладает преимуществами, по сравнению с традиционным инсулином, аналогами инсулина или другими производными инсулина, заключающимися в том, что он имеет значимо увеличенный период полувыведения in vivo и повышенную стабильность, таким образом, что он может оказывать длительный эффект, даже когда его инъецируют один раз. Таким образом, он может обеспечивать удобство пациентам с диабетом, которые самостоятельно вводят инсулин посредством инъекции.The insulin analog or insulin analog derivative of the present invention has the advantages, over conventional insulin, insulin analogs or other insulin derivatives, in that it has a significantly increased in vivo half-life and improved stability, such that it can provide long-term effect even when injected once. Thus, it can provide convenience to diabetic patients who self-administer insulin by injection.
--->--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙSEQUENCE LIST
<110> DAEWOONG PHARMACEUTICAL CO., LTD.<110> DAEWOONG PHARMACEUTICAL CO., LTD.
<120> АНАЛОГИ ИНСУЛИНА ДЛИТЕЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ И ИХ ПРОИЗВОДНЫЕ<120> LONG-ACTING INSULIN ANALOGUES AND THEIR DERIVATIVES
<130> P17-B266<130> P17-B266
<160> 13<160> 13
<170>KoPatentIn 3.0<170>KoPatentIn 3.0
<210> 1<210> 1
<211> 22<211> 22
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223>Меткаслияния<223>Merge Mark
<400> 1<400> 1
Met AlaThrThrSerThrGlyAsnSerAla His HisHisHisHisHisMet AlaThrThrSerThrGlyAsnSerAla His HisHisHisHisHis
1 5 10 15 1 5 10 15
SerSerGlySerAlaArgSerSerGlySerAlaArg
20 twenty
<210> 2<210> 2
<211> 30<211> 30
<212>Белок<212>Protein
<213> homo sapiens<213> homo sapiens
<400> 2<400> 2
Phe Val AsnGln His LeuCysGlySer His Leu Val GluAlaLeu TyrPhe Val AsnGln His LeuCysGlySer His Leu Val GluAlaLeu Tyr
1 5 10 15 1 5 10 15
Leu Val CysGlyGlu Lys GlyPhePhe Tyr Thr Pro Lys ThrLeu Val CysGlyGlu Lys GlyPhePhe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30 20 25 30
<210> 3<210> 3
<211> 35<211> 35
<212>Белок<212>Protein
<213> homo sapiens<213> homo sapiens
<400> 3<400> 3
ArgArgGluAlaGlu Asp LeuGln Val GlyGln Val GluLeuGlyGlyArgArgGluAlaGlu Asp LeuGln Val GlyGln Val GluLeuGlyGly
1 5 10 15 1 5 10 15
Gly Pro GlyAlaGlySerLeuGln Pro LeuAlaLeuGluGlySerLeuGly Pro GlyAlaGlySerLeuGln Pro LeuAlaLeuGluGlySerLeu
20 25 30 20 25 30
GlnAlaArgGlnAlaArg
35 35
<210> 4<210> 4
<211> 21<211> 21
<212>Белок<212>Protein
<213> homo sapiens<213> homo sapiens
<400> 4<400> 4
Gly Ile Val GluGlnCysCysThrSer Ile CysSerLeu Tyr GlnLeuGly Ile Val GluGlnCysCysThrSer Ile CysSerLeu Tyr GlnLeu
1 5 10 15 1 5 10 15
GluAsn Tyr CysAsnGluAsn Tyr CysAsn
20 twenty
<210> 5<210> 5
<211> 10<211> 10
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Линкер<223> Linker
<400> 5<400> 5
GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer
1 5 10 1 5 10
<210> 6<210> 6
<211> 46<211> 46
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Альбумин-связывающий домен<223> Albumin-binding domain
<400> 6<400> 6
LeuAlaGluAla Lys GluAlaAlaAsnAlaGluLeu Asp Ser Tyr GlyLeuAlaGluAla Lys GluAlaAlaAsnAlaGluLeu Asp Ser Tyr Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Val Ser Asp Phe Tyr Lys LysLeu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val GluVal Ser Asp Phe Tyr Lys LysLeu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30 20 25 30
Gly Val GluAlaLeu Lys Asp Ala Ile LeuAlaAlaLeu ProGly Val GluAlaLeu Lys Asp Ala Ile LeuAlaAlaLeu Pro
35 40 45 35 40 45
<210> 7<210> 7
<211> 46<211> 46
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Сконструированный альбумин-связывающий полипептид<223> Constructed albumin-binding polypeptide
<400> 7<400> 7
LeuAlaGluAla Lys GluAlaAlaAsnAlaGluLeu Asp Ser Tyr GlyLeuAlaGluAla Lys GluAlaAlaAsnAlaGluLeu Asp Ser Tyr Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Val Ser Asp Phe Tyr Lys LysLeu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val GluVal Ser Asp Phe Tyr Lys LysLeu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30 20 25 30
Gly Val GluAlaLeu Lys Asp Glu Ile LeuAlaAlaLeu ProGly Val GluAlaLeu Lys Asp Glu Ile LeuAlaAlaLeu Pro
35 40 45 35 40 45
<210> 8<210> 8
<211> 46<211> 46
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Сконструированный альбумин-связывающий полипептид<223> Constructed albumin-binding polypeptide
<400> 8<400> 8
LeuAlaGluAla Lys GluAlaAlaAsnAlaGluLeu Asp Ser Tyr GlyLeuAlaGluAla Lys GluAlaAlaAsnAlaGluLeu Asp Ser Tyr Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Val Ser Asp Phe Tyr Lys LysLeu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val GluVal Ser Asp Phe Tyr Lys LysLeu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30 20 25 30
Gly Val GluAlaLeu Lys GluAla Ile LeuAlaAlaLeu ProGly Val GluAlaLeu Lys GluAla Ile LeuAlaAlaLeu Pro
35 40 45 35 40 45
<210> 9<210> 9
<211> 46<211> 46
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Сконструированный альбумин-связывающий полипептид<223> Constructed albumin-binding polypeptide
<400> 9<400> 9
LeuAlaGluAla Lys GluAlaAlaAsnAlaGluLeu Asp Ser Tyr GlyLeuAlaGluAla Lys GluAlaAlaAsnAlaGluLeu Asp Ser Tyr Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Val Ser Asp Phe Tyr Lys LysLeu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val GluVal Ser Asp Phe Tyr Lys LysLeu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30 20 25 30
Gly Val GluAlaLeu Lys GluGlu Ile LeuAlaAlaLeu ProGly Val GluAlaLeu Lys GluGlu Ile LeuAlaAlaLeu Pro
35 40 45 35 40 45
<210> 10<210> 10
<211> 46<211> 46
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Сконструированный альбумин-связывающий полипептид<223> Constructed albumin-binding polypeptide
<400> 10<400> 10
LeuAlaGluAla Lys GluAlaAlaAsnAlaGluLeu Asp Ser Tyr GlyLeuAlaGluAla Lys GluAlaAlaAsnAlaGluLeu Asp Ser Tyr Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Val Ser Asp Phe Tyr Lys LysLeu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val GluVal Ser Asp Phe Tyr Lys LysLeu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30 20 25 30
Gly Val GluAlaLeu Lys Asp Ala Ile LeuAlaAlaLeu ProGly Val GluAlaLeu Lys Asp Ala Ile LeuAlaAlaLeu Pro
35 40 45 35 40 45
<210> 11<210> 11
<211> 46<211> 46
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Сконструированный альбумин-связывающий полипептид<223> Constructed albumin-binding polypeptide
<400> 11<400> 11
LeuAlaGluAla Lys GluAlaAlaAsnAlaGluLeu Asp Ser Tyr GlyLeuAlaGluAla Lys GluAlaAlaAsnAlaGluLeu Asp Ser Tyr Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Val Ser Asp Phe Tyr Lys LysLeu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val GluVal Ser Asp Phe Tyr Lys LysLeu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30 20 25 30
Gly Val GluAlaLeu Lys Asp Glu Ile LeuAlaAlaLeu ProGly Val GluAlaLeu Lys Asp Glu Ile LeuAlaAlaLeu Pro
35 40 45 35 40 45
<210> 12<210> 12
<211> 46<211> 46
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Сконструированный альбумин-связывающий полипептид<223> Constructed albumin-binding polypeptide
<400> 12<400> 12
LeuAlaGluAla Lys GluAlaAlaAsnAlaGluLeu Asp Ser Tyr GlyLeuAlaGluAla Lys GluAlaAlaAsnAlaGluLeu Asp Ser Tyr Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Val Ser Asp Phe Tyr Lys LysLeu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val GluVal Ser Asp Phe Tyr Lys LysLeu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30 20 25 30
Gly Val GluAlaLeu Lys GluAla Ile LeuAlaAlaLeu ProGly Val GluAlaLeu Lys GluAla Ile LeuAlaAlaLeu Pro
35 40 45 35 40 45
<210> 13<210> 13
<211> 46<211> 46
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Сконструированный альбумин-связывающий полипептид<223> Constructed albumin-binding polypeptide
<400> 13<400> 13
LeuAlaGluAla Lys GluAlaAlaAsnAlaGluLeu Asp Ser Tyr GlyLeuAlaGluAla Lys GluAlaAlaAsnAlaGluLeu Asp Ser Tyr Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Val Ser Asp Phe Tyr Lys LysLeu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val GluVal Ser Asp Phe Tyr Lys LysLeu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30 20 25 30
Gly Val GluAlaLeu Lys GluGlu Ile LeuAlaAlaLeu ProGly Val GluAlaLeu Lys GluGlu Ile LeuAlaAlaLeu Pro
35 40 45 35 40 45
<---<---
Claims (66)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2018-0092243 | 2018-08-08 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2021105183A RU2021105183A (en) | 2022-09-09 |
| RU2781308C2 true RU2781308C2 (en) | 2022-10-11 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2495131C2 (en) * | 2008-02-19 | 2013-10-10 | Байокон Лимитид | Method to produce recombinant insulin glargine |
| WO2014048977A1 (en) * | 2012-09-25 | 2014-04-03 | Affibody Ab | Albumin binding polzpeptide |
| RU2524150C2 (en) * | 2006-09-22 | 2014-07-27 | Ново Нордиск А/С | Protease-resistant insulin analogues |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2524150C2 (en) * | 2006-09-22 | 2014-07-27 | Ново Нордиск А/С | Protease-resistant insulin analogues |
| RU2495131C2 (en) * | 2008-02-19 | 2013-10-10 | Байокон Лимитид | Method to produce recombinant insulin glargine |
| WO2014048977A1 (en) * | 2012-09-25 | 2014-04-03 | Affibody Ab | Albumin binding polzpeptide |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| KATSOYANNIS P.G. et al., A synthetic human insulin analogue modified at position B-22. [Lys-22-B] human insulin, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1975, Iss.5, p.464-469, WEITZEL G.et al., Structure and activity of insulin, XV[1-5]. Further evidence for the importance of arginine residue B22 in the activity of insulin. Semisyntheses of despentapeptide-(B23 - 30)-insulins varied in B22 using desnonapeptide-(B22 - 30)-insulin and tetrapeptides, Hoppe Seylers Z PhysiolChem, 1977, v.358, n.12, p.1573-1582, * |
| ИНСУЛИНОТЕРАПИЯ, ПОСОБИЕ ДЛЯ ВРАЧЕЙ, под ред. И. И. Дедова, 2004, Москва, 23 с., раздел "ВИДЫ ПРЕПАРАТОВ ИНСУЛИНА. ПУТИ ИХ ПРОИЗВОДСТВА", PAKULA A.A. et al., Genetic analysis of protein stability and function. Anna. Rev. Genet. 1989, v.23, p.289-310, TOKURIKI N. et al., Stability effects of mutations and protein evolvability, Curr. Opin. Struct. Biol., 2009, v.19, n.5, p.596-604, SCHILLING R.J. et al., Degradation of insulin by trypsin and alpha chymotrypsin, Pharmaceutical Research, 1991, v.8, n.6, p.721-727, ORLANDO M., Modification of proteins and low molecular weight substances with hydroxyethyl starch (HES), Inauguraldissertation, Giesen, 2003, p.166, с.15 ZHOU J. et al., Preparation and PEGylation of exendin-4 peptide secreted from yeast Pichia pastoris, European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics, 2009, V. 72, N. 2, p.412-417, CHEN X. et al., Fusion protein linkers: property, design and functionality, Advanced drug delivery reviews, 2013, v. 65, n. 10, p.1357-1369, MA * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102406654B1 (en) | long acting insulin and use thereof | |
| TWI774694B (en) | Insulin analogs with reduced affinity to insulin receptor and use thereof | |
| KR20160101702A (en) | A long acting insulin conjugate or analog thereof | |
| JP4504014B2 (en) | Methods for producing insulinotropic GLP-1 (7-36) polypeptides and / or GLP-1 analogs | |
| CN113105536B (en) | New proinsulin glargine and method for preparing insulin glargine by using same | |
| KR20170026284A (en) | Novel Insulin Analogs and use thereof | |
| CN110305223A (en) | The method that recombination fused in tandem albumen prepares target polypeptides | |
| US11566059B2 (en) | Long-acting insulin analogues and derivatives thereof | |
| KR20190036956A (en) | A long acting single chain insulin analog and a conjugate thereof | |
| RU2781308C2 (en) | Long-acting insulin analogues and their derivatives | |
| Sharma et al. | Recombinant human epidermal growth factor inclusion body solubilization and refolding at large scale using expanded-bed adsorption chromatography from Escherichia coli | |
| CN112522294A (en) | Semi-recombinant preparation method of GLP-1 analogue | |
| RU2781307C2 (en) | Method for production of active form of long-acting insulin analogue derivative, using clostripain | |
| KR102666154B1 (en) | Long-acting Insulin Analog and Derivatives Thereof | |
| CA2937532A1 (en) | N-terminal truncated insulin analogues | |
| US20210230659A1 (en) | Leader Sequence for Higher Expression of Recombinant Proteins | |
| US11655279B2 (en) | Method for producing active form of long-acting insulin analogue derivative using clostripain | |
| KR20200124255A (en) | Porcine trypsin variant | |
| RU2729353C1 (en) | Recombinant plasmid dna pf646 coding hybrid polypeptide containing proinsulin aspart, and strain of bacteria escherichia coli - producer of hybrid polypeptide containing proinsulin aspart | |
| RU2729737C1 (en) | Recombinant plasmid dna of pf882, which codes hybrid polypeptide containing b30-desthreonine-insulin, and strain of bacteria escherichia coli - producer of hybrid polypeptide containing 30-desthreonine-insulin | |
| RU2729381C1 (en) | Recombinant plasmid dna pf644 coding hybrid polypeptide containing proinsulin glargine, and bacterial strain escherichia coli - producer of hybrid polypeptide containing proinsulin glargine | |
| RU2792236C9 (en) | Polypeptide derivative and method for its production |