RU2780587C2 - Detection of nucleotide target sequences using different detection temperatures - Google Patents
Detection of nucleotide target sequences using different detection temperatures Download PDFInfo
- Publication number
- RU2780587C2 RU2780587C2 RU2019100495A RU2019100495A RU2780587C2 RU 2780587 C2 RU2780587 C2 RU 2780587C2 RU 2019100495 A RU2019100495 A RU 2019100495A RU 2019100495 A RU2019100495 A RU 2019100495A RU 2780587 C2 RU2780587 C2 RU 2780587C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- detection temperature
- signal
- target nucleotide
- nucleotide sequence
- detection
- Prior art date
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 1554
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 42
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 title claims abstract description 42
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 10
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 claims description 810
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 claims description 226
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 133
- 230000007274 generation of a signal involved in cell-cell signaling Effects 0.000 claims description 128
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 108
- 230000001419 dependent Effects 0.000 claims description 70
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 59
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 claims description 59
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 30
- 230000001809 detectable Effects 0.000 claims description 21
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 12
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 claims description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 31
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 136
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 100
- 241000606153 Chlamydia trachomatis Species 0.000 description 88
- 229940038705 Chlamydia trachomatis Drugs 0.000 description 88
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 86
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 86
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 81
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 81
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 78
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 70
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 67
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 67
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 55
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 49
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 48
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 32
- 241000204051 Mycoplasma genitalium Species 0.000 description 21
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 17
- 239000002585 base Substances 0.000 description 16
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 15
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 15
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 14
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyinosine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 13
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 12
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 11
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 11
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 10
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 10
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 9
- 230000000171 quenching Effects 0.000 description 9
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-N-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 8
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 8
- 102100002074 MTHFR Human genes 0.000 description 7
- 101710033932 MTHFR Proteins 0.000 description 7
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N Rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 7
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 7
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 7
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 7
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 6
- 101700011961 DPOM Proteins 0.000 description 5
- 101710029649 MDV043 Proteins 0.000 description 5
- 101700061424 POLB Proteins 0.000 description 5
- 101700054624 RF1 Proteins 0.000 description 5
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 5
- 230000001965 increased Effects 0.000 description 5
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000239226 Scorpiones Species 0.000 description 4
- 241000589596 Thermus Species 0.000 description 4
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 4
- JNGRENQDBKMCCR-UHFFFAOYSA-N 2-(3-amino-6-iminoxanthen-9-yl)benzoic acid;hydrochloride Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[NH2+])C=C2OC2=CC(N)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O JNGRENQDBKMCCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L MgCl2 Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 101700080605 NUC1 Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 3
- 101700006494 nucA Proteins 0.000 description 3
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N Calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 2
- 102000004150 Flap endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108090000652 Flap endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000005954 Methylenetetrahydrofolate Reductase (NADPH2) Human genes 0.000 description 2
- 108010030837 Methylenetetrahydrofolate Reductase (NADPH2) Proteins 0.000 description 2
- VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N Nile red Chemical compound C1=CC=C2C3=NC4=CC=C(N(CC)CC)C=C4OC3=CC(=O)C2=C1 VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010066717 Q beta Replicase Proteins 0.000 description 2
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N Texas Red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000205188 Thermococcus Species 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N Thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 238000000586 desensitisation Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003260 fluorescence intensity Methods 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive Effects 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- MYFATKRONKHHQL-UHFFFAOYSA-N rhodamine 123 Chemical compound [Cl-].COC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=CC(=[NH2+])C=C2OC2=CC(N)=CC=C21 MYFATKRONKHHQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 1
- OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(dimethylamino)-6-dimethylazaniumylidenexanthen-9-yl]-4-isothiocyanatobenzoate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC(N=C=S)=CC=C1C([O-])=O OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZIDRAQTRIQDX-UHFFFAOYSA-N 6-Carboxy-X-rhodamine Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(C([O-])=O)C=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 WQZIDRAQTRIQDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710036216 ATEG_03556 Proteins 0.000 description 1
- 229960000643 Adenine Drugs 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Natural products NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004381 Amniotic Fluid Anatomy 0.000 description 1
- 229920002287 Amplicon Polymers 0.000 description 1
- 210000001742 Aqueous Humor Anatomy 0.000 description 1
- 241000207208 Aquifex Species 0.000 description 1
- 241000207207 Aquifex pyrophilus Species 0.000 description 1
- 210000003567 Ascitic Fluid Anatomy 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000212384 Bifora Species 0.000 description 1
- 210000000601 Blood Cells Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 Brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000001175 Cerebrospinal Fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 Chromosomes Anatomy 0.000 description 1
- 210000003917 Chromosomes, Human Anatomy 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 229940104302 Cytosine Drugs 0.000 description 1
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N Cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 108010092799 EC 2.7.7.49 Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 210000003608 Feces Anatomy 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 229920002024 GDNA Polymers 0.000 description 1
- LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N Glyoxal Chemical compound O=CC=O LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940015043 Glyoxal Drugs 0.000 description 1
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N Guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006454 Hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 102100005410 LINE-1 retrotransposable element ORF2 protein Human genes 0.000 description 1
- 210000002751 Lymph Anatomy 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000508310 Meiothermus chliarophilus Species 0.000 description 1
- 241000589496 Meiothermus ruber Species 0.000 description 1
- 241000508289 Meiothermus silvanus Species 0.000 description 1
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 210000004080 Milk Anatomy 0.000 description 1
- 101710003000 ORF1/ORF2 Proteins 0.000 description 1
- 229960002378 Oftasceine Drugs 0.000 description 1
- 210000002741 Palatine Tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 108010009711 Phalloidine Proteins 0.000 description 1
- 108010053210 Phycocyanin Proteins 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 description 1
- 101700030467 Pol Proteins 0.000 description 1
- 241001148023 Pyrococcus abyssi Species 0.000 description 1
- 241000522615 Pyrococcus horikoshii Species 0.000 description 1
- 241000205192 Pyrococcus woesei Species 0.000 description 1
- 241000204670 Pyrodictium occultum Species 0.000 description 1
- 108020004412 RNA 3' Polyadenylation Signals Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 229940043267 Rhodamine B Drugs 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 210000003296 Saliva Anatomy 0.000 description 1
- 210000000582 Semen Anatomy 0.000 description 1
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000000952 Spleen Anatomy 0.000 description 1
- 241000205180 Thermococcus litoralis Species 0.000 description 1
- 241000206213 Thermosipho africanus Species 0.000 description 1
- 241000204666 Thermotoga maritima Species 0.000 description 1
- 241000204664 Thermotoga neapolitana Species 0.000 description 1
- 241000015345 Thermus antranikianii Species 0.000 description 1
- 241000589500 Thermus aquaticus Species 0.000 description 1
- 241000589501 Thermus caldophilus Species 0.000 description 1
- 241000589498 Thermus filiformis Species 0.000 description 1
- 241000015334 Thermus igniterrae Species 0.000 description 1
- 241000557726 Thermus oshimai Species 0.000 description 1
- 241001522143 Thermus scotoductus Species 0.000 description 1
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 description 1
- 229940113082 Thymine Drugs 0.000 description 1
- 229940035893 Uracil Drugs 0.000 description 1
- 210000002700 Urine Anatomy 0.000 description 1
- 241000726445 Viroids Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- INCIMLINXXICKS-UHFFFAOYSA-M acridine red 3B Chemical compound [Cl-].C1=CC(=[N+](C)C)C=C2OC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 INCIMLINXXICKS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 1
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003556 assay method Methods 0.000 description 1
- 238000007846 asymmetric PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atoms Chemical group C* 0.000 description 1
- 108091006028 chimera Proteins 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001351 cycling Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 1
- 230000001036 exonucleolytic Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- -1 for example Polymers 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atoms Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000010309 melting process Methods 0.000 description 1
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 244000045947 parasites Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogens Species 0.000 description 1
- KPKZJLCSROULON-QKGLWVMZSA-N phalloidin Chemical compound N1C(=O)[C@@H]([C@@H](O)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C[C@@](C)(O)CO)NC(=O)[C@H](C2)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]3C[C@H](O)CN3C(=O)[C@@H]1CSC1=C2C2=CC=CC=C2N1 KPKZJLCSROULON-QKGLWVMZSA-N 0.000 description 1
- 229920000023 polynucleotide Polymers 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000036678 protein binding Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 1
- 101710004466 rgy Proteins 0.000 description 1
- 101710030364 rgy1 Proteins 0.000 description 1
- 101710030359 rgy2 Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine thiocyanate Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(SC#N)C=C1C(O)=O JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003852 triazoles Chemical class 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 230000003612 virological Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Область изобретенияField of invention
Настоящее изобретение относится к детекции нуклеотидных последовательностей-мишеней с использованием разных температур детекции.The present invention relates to the detection of target nucleotide sequences using different detection temperatures.
Сведения о родственном уровне техникиRelated Art Information
Для детекции нуклеотидных последовательностей-мишеней широко используются способы детекции в режиме реального времени, в которых детекция нуклеотидных последовательностей-мишеней осуществляется совместно с мониторингом амплификации мишеней в режиме реального времени. Как правило, в таких способах детекции в режиме реального времени используют меченые зонды или праймеры, специфически гибридизующиеся с нуклеотидными последовательностями-мишенями. Примеры способов применения гибридизации меченых зондов с нуклеотидными последовательностями-мишенями включают способ с применением "молекулярных маяков", в котором используются имеющие шпилечную структуру зонды с двумя метками (Tyagi et al., Nature Biotechnology, v. 14, MARCH 1996), способ HyBeacon (French D.J. et al., Mol. Cell Probes, 15(6): 363-374 (2001)), способ с применением гибридизационных зондов, в котором используются два зонда, каждый из которых помечен донором и акцептором (Bernad et al., 147-148, Clin. Chem., 2000, 46) и способ Lux (Light Upon extension), в котором используются меченные одиночной меткой олигонуклеотиды (патент США №7537886). В данной области техники также широко применяется TaqMan-способ (патенты США №№5210015 и 5538848), в котором используются зонды с двумя метками и их расщепление под действием 5'-нуклеазной активности ДНК-полимеразы.For the detection of target nucleotide sequences, real-time detection methods are widely used, in which detection of target nucleotide sequences is carried out in conjunction with real-time monitoring of target amplification. Typically, these real-time detection methods use labeled probes or primers that specifically hybridize to target nucleotide sequences. Examples of methods for using hybridization of labeled probes with target nucleotide sequences include the molecular beacon method using hairpin probes with two labels (Tyagi et al., Nature Biotechnology, v. 14, MARCH 1996), the HyBeacon method ( French D. J. et al., Mol. Cell Probes, 15(6): 363-374 (2001)), a hybridization probe method using two probes each labeled with a donor and an acceptor (Bernad et al., 147 -148, Clin. Chem., 2000, 46) and the Lux method (Light Upon extension) using single labeled oligonucleotides (US Pat. No. 7,537,886). Also widely used in the art is the TaqMan method (US Pat. Nos. 5,210,015 and 5,538,848), which uses dual-labeled probes and cleaves them with the 5'-nuclease activity of DNA polymerase.
Примеры способов использования меченых праймеров включают способ с применением праймеров "sunrise" (Sunrise™ - торговая марка фирмы Oncor) (Nazarenko et al., 2516-2521, Nucleic Acids Research, 1997, v. 25, №12 и патент США №6117635), способ с применением праймеров типа "scorpion" (Scorpion™ - торговая марка фирмы D×S Ltd) (Whitcombe et al., 804-807, Nature Biotechnology, v. 17, AUGUST 1999 и патент США №6326145) и способ с применением TSG (target signal generating - генерирующих сигнал от мишени) праймеров (WO 2011/078441).Examples of methods for using labeled primers include the "sunrise" primer method (Sunrise™ is a trademark of Oncor) (Nazarenko et al., 2516-2521, Nucleic Acids Research, 1997, v. 25, No. 12 and US Pat. No. 6,117,635) , the "scorpion" primer method (Scorpion™ is a trademark of DxS Ltd) (Whitcombe et al., 804-807, Nature Biotechnology, v. 17, AUGUST 1999 and US Pat. No. 6,326,145) and the method using TSG (target signal generating) primers (WO 2011/078441).
В качестве альтернативных подходов были предложены способы детекции в режиме реального времени с использованием дуплексов, образующихся в зависимости от присутствия нуклеотидных последовательностей-мишеней: анализ "Invader" (US 5691142, US 6358691 и US 6194149), способ с PTOCE (PTO cleavage and extension - расщеплением и удлинением зондирующего и метящего олигонуклеотида (PTO; от англ. probing and tagging oligonucleotide)) (WO 2012/096523), способ с PCE-SH (PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization - гибридизацией сигнального олигонуклеотида, зависящей от расщепления и удлинения PTO) (WO 2013/115442), способ с PCE-NH (PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization - отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения PTO) (PCT/KR2013/012312).As alternative approaches, real-time detection methods have been proposed using duplexes that are formed depending on the presence of target nucleotide sequences: "Invader" analysis (US 5691142, US 6358691 and US 6194149), PTOCE method (PTO cleavage and extension - cleavage and extension of the probing and tagging oligonucleotide (PTO; from the English probing and tagging oligonucleotide)) (WO 2012/096523), the method with PCE-SH (PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization - hybridization of the signal oligonucleotide, depending on the cleavage and PTO extension) (WO 2013/115442), PCE-NH method (PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization) (PCT/KR2013/012312).
При использовании описанных выше традиционных технологий детекции в режиме реального времени детектируют сигналы, генерируемые флуоресцентными метками при выбранной температуре детекции в процессе амплификации сигнала, ассоциированном или не ассоциированном с амплификацией мишеней. Если в соответствии с традиционными технологиями детекции в режиме реального времени детектируют множество нуклеотидных последовательностей-мишеней в одной реакционной пробирке с использованием метки одного типа, то генерируемые сигналы для нуклеотидных последовательностей-мишеней не отличаются друг от друга. Ввиду этого, в традиционных технологиях детекции в режиме реального времени, как правило, применяют разные типы меток для детекции множества нуклеотидных последовательностей-мишеней. Анализ плавления с использованием разницы в Tпл позволяет детектировать множество нуклеотидных последовательностей-мишеней даже с использованием метки одного типа. Тем не менее анализ плавления имеет серьезные недостатки, заключающиеся в том, что продолжительность его проведения превышает затраты времени в выполняемых в режиме реального времени технологиях и конструирование зондов с разными значениями Tпл становится более затруднительным по мере увеличения числа последовательностей-мишеней.When using the conventional detection technologies described above, signals generated by fluorescent labels at a selected detection temperature during the signal amplification process, associated or not associated with target amplification, are detected in real time. If, according to conventional real-time detection technologies, a plurality of target nucleotide sequences are detected in one reaction tube using the same type of label, the generated signals for the target nucleotide sequences do not differ from each other. In view of this, traditional real-time detection technologies typically use different types of labels to detect multiple target nucleotide sequences. Melting analysis using the difference in T pl allows the detection of multiple target nucleotide sequences even using a label of the same type. However, melt analysis has serious disadvantages in that it is more time consuming than real time technologies and designing probes with different Tm values becomes more difficult as the number of target sequences increases.
Соответственно, если будут разработаны новые способы или подходы, не зависящие от анализа плавления, для детекции множества нуклеотидных последовательностей-мишеней в одном реакционном сосуде с использованием метки одного типа и детектора одного типа, то они дадут возможность детектировать множество нуклеотидных последовательностей-мишеней значительно более удобным образом, с существенно более высокой экономичностью и эффективностью. Помимо этого, сочетание новых способов с другими способами детекции (например, с анализом плавления) даст возможность осуществлять детекцию множества нуклеотидных последовательностей-мишеней в одном реакционном сосуде с использованием метки одного типа с существенно более высокой эффективностью.Accordingly, if new melt assay-independent methods or approaches are developed for detecting multiple target nucleotide sequences in a single reaction vessel using a single type of label and a single type of detector, they will make it possible to detect multiple target nucleotide sequences much more conveniently. way, with significantly higher economy and efficiency. In addition, the combination of new methods with other detection methods (eg melt assay) will enable the detection of multiple target nucleotide sequences in a single reaction vessel using a single type of label with significantly higher efficiency.
По всей этой заявке сделаны ссылки на различные патенты и публикации, и упоминания о них приведены в скобках. Тем самым описание этих патентов и публикаций во всей их полноте включено в эту заявку посредством ссылок с целью более полного описания данного изобретения и состояния области техники, к которой это изобретение имеет отношение.Throughout this application, references are made to various patents and publications, and references to them are given in brackets. Accordingly, the description of these patents and publications in their entirety is incorporated into this application by reference for the purpose of more fully describing the present invention and the state of the art to which this invention pertains.
Сущность изобретенияThe essence of the invention
Авторы настоящего изобретения провели интенсивные исследования с целью разработки новых способов для детекции множества нуклеотидных последовательностей-мишеней в одном реакционном сосуде с использованием метки одного типа и детектора одного типа. В результате авторы изобретения обнаружили, что получение сигналов для нуклеотидных последовательностей-мишеней при скорректированных значениях температуры детекции, результаты детекции которых затем соответствующим образом интерпретируют, тем самым дает возможность детектировать множество нуклеотидных последовательностей-мишеней в одном реакционном сосуде с использованием метки одного типа и детектора одного типа значительно более удобным образом, с существенно более высокой экономичностью и эффективностью.The inventors of the present invention have conducted intensive research to develop new methods for detecting multiple target nucleotide sequences in a single reaction vessel using a single type of label and a single type of detector. As a result, the inventors found that obtaining signals for target nucleotide sequences at corrected detection temperatures, the detection results of which are then interpreted accordingly, thereby makes it possible to detect a plurality of target nucleotide sequences in one reaction vessel using one type of label and one detector. type in a much more convenient way, with significantly higher economy and efficiency.
Соответственно, данным изобретением решается задача разработки способа и набора для детекции двух нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием разных температур детекции.Accordingly, the present invention solves the problem of developing a method and kit for the detection of two target nucleotide sequences in a sample using different detection temperatures.
Другой задачей данного изобретения является разработка способа и набора для генотипирования SNP (single nucleotide polymorphism - однонуклеотидный полиморфизм) нуклеотидной последовательности в образце с использованием разных температур детекции.Another objective of this invention is to develop a method and kit for genotyping SNP (single nucleotide polymorphism - single nucleotide polymorphism) nucleotide sequence in a sample using different detection temperatures.
Еще одной задачей данного изобретения является разработка способа и набора для детекции по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием разных температур детекции.Another object of this invention is to provide a method and kit for detecting at least three target nucleotide sequences in a sample using different detection temperatures.
Следующей задачей данного изобретения является разработка способа и набора для детекции по меньшей мере двух нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием разных температур детекции и анализа плавления.It is a further object of this invention to provide a method and kit for detecting at least two target nucleotide sequences in a sample using different detection temperatures and melting assays.
Еще одной задачей данного изобретения является разработка способа и набора для детекции по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием анализа температур детекции и анализа плавления.Another object of this invention is to provide a method and kit for detecting at least three target nucleotide sequences in a sample using detection temperature analysis and melting analysis.
Другой задачей данного изобретения является разработка пригодного для ввода в компьютер информационного носителя, содержащего инструкции для конфигурирования процессора, с целью осуществления способа определения присутствия двух нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием разных температур детекции.It is another object of the present invention to provide a computer-readable storage medium containing instructions for configuring a processor to carry out a method for detecting the presence of two target nucleotide sequences in a sample using different detection temperatures.
Еще одной задачей данного изобретения является разработка устройства для детекции нуклеотидной последовательности-мишени в образце с использованием разных температур детекции.Another object of this invention is to provide a device for detecting a target nucleotide sequence in a sample using different detection temperatures.
Следующей задачей данного изобретения является разработка компьютерной программы, предназначенной для хранения на пригодном для ввода в компьютер информационном носителе, для конфигурирования процессора, с целью осуществления способа определения присутствия двух нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце.It is a further object of the present invention to provide a computer program for storing on a computer-compatible storage medium for configuring a processor to carry out a method for determining the presence of two target nucleotide sequences in a sample.
Еще одной задачей данного изобретения является разработка пригодного для ввода в компьютер информационного носителя, содержащего инструкции для конфигурирования процессора с целью осуществления способа определения присутствия по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием разных температур детекции.Another object of the present invention is to provide a computer-readable storage medium containing instructions for configuring a processor to perform a method for detecting the presence of at least three target nucleotide sequences in a sample using different detection temperatures.
Другие задачи и преимущества настоящего изобретения станут очевидны из следующего далее подробного описания в сочетании с прилагаемыми формулой изобретения и графическими материалами.Other objects and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description in conjunction with the appended claims and drawings.
Краткое описание графических материаловBrief description of graphic materials
На Фиг. 1а представлены результаты детекции по настоящему изобретению с использованием разных температур детекции в случае детекции нуклеотидной последовательности-мишени (геномной ДНК из Chlamydia trachomatis, СТ), имеющей относительно высокую температуру детекции (72°C), нуклеотидной последовательности-мишени (геномной ДНК из Neisseria gonorrhoeae, NG), имеющей относительно низкую температуру детекции (60°C), и их комбинации. Сигналы для СТ и NG генерировали, используя способ с PTOCE с применением ПЦР (полимеразная цепная реакция) в режиме реального времени.On FIG. 1a shows the detection results of the present invention using different detection temperatures in the case of detection of a target nucleotide sequence (genomic DNA from Chlamydia trachomatis, CT) having a relatively high detection temperature (72°C), a target nucleotide sequence (genomic DNA from Neisseria gonorrhoeae , NG) having a relatively low detection temperature (60°C), and combinations thereof. Signals for CT and NG were generated using the PTOCE method using real-time PCR (polymerase chain reaction).
На Фиг. 1b представлены результаты определения присутствия нуклеотидных последовательностей-мишеней, имеющих относительно низкую температуру детекции, по соотношению между сигналом при относительно высокой температуре детекции и сигналом при относительно низкой температуре детекции.On FIG. 1b shows the results of determining the presence of target nucleotide sequences having a relatively low detection temperature by the ratio between the signal at a relatively high detection temperature and the signal at a relatively low detection temperature.
На Фиг. 1c представлены результаты определения присутствия нуклеотидных последовательностей-мишеней, имеющих относительно низкую температуру детекции, путем построения зависимостей соотношений между сигналом при относительно высокой температуре детекции и сигналом при относительно низкой температуре детекции.On FIG. 1c shows the results of determining the presence of target nucleotide sequences having a relatively low detection temperature by plotting the relationship between the signal at a relatively high detection temperature and the signal at a relatively low detection temperature.
На Фиг. 1d и 1e представлены результаты определения присутствия нуклеотидных последовательностей-мишеней, имеющих относительно низкую температуру детекции, по разнице между сигналом при относительно высокой температуре детекции и сигналом при относительно низкой температуре детекции, при этом сигнал при относительно высокой температуре детекции корректируют с учетом порогового значения и используют для получения данной разницы.On FIG. 1d and 1e show the results of determining the presence of target nucleotide sequences having a relatively low detection temperature by the difference between a signal at a relatively high detection temperature and a signal at a relatively low detection temperature, wherein the signal at a relatively high detection temperature is corrected for a threshold value and used to get this difference.
На Фиг. 2а представлены результаты детекции по настоящему изобретению с использованием разных температур детекции в случае детекции нуклеотидной последовательности-мишени (геномной ДНК из Chlamydia trachomatis, СТ), имеющей относительно высокую температуру детекции (72°C), нуклеотидной последовательности-мишени (геномной ДНК из Neisseria gonorrhoeae, NG), имеющей относительно низкую температуру детекции (60°C), и их комбинации. Сигнал для СТ генерировали, используя TaqMan-способ с ПЦР в режиме реального времени, а сигнал для NG генерировали, используя способ с PTOCE с применением ПЦР в режиме реального времени.On FIG. 2a shows the detection results of the present invention using different detection temperatures in the case of detecting a target nucleotide sequence (genomic DNA from Chlamydia trachomatis, CT) having a relatively high detection temperature (72°C), a target nucleotide sequence (genomic DNA from Neisseria gonorrhoeae , NG) having a relatively low detection temperature (60°C), and combinations thereof. The signal for CT was generated using the TaqMan method with real-time PCR, and the signal for NG was generated using the PTOCE method using real-time PCR.
На Фиг. 2b представлены результаты определения присутствия нуклеотидных последовательностей-мишеней, имеющих относительно низкую температуру детекции, по соотношению между сигналом при относительно высокой температуре детекции и сигналом при относительно низкой температуре детекции.On FIG. 2b shows the results of determining the presence of target nucleotide sequences having a relatively low detection temperature by the ratio between the signal at a relatively high detection temperature and the signal at a relatively low detection temperature.
На Фиг. 2c представлены результаты определения присутствия нуклеотидных последовательностей-мишеней, имеющих относительно низкую температуру детекции, путем построения зависимостей соотношений между сигналом при относительно высокой температуре детекции и сигналом при относительно низкой температуре детекции.On FIG. 2c shows the results of determining the presence of target nucleotide sequences having a relatively low detection temperature by plotting the relationship between the signal at a relatively high detection temperature and the signal at a relatively low detection temperature.
На Фиг. 2d и 2e представлены результаты определения присутствия нуклеотидных последовательностей-мишеней, имеющих относительно низкую температуру детекции, по разнице между сигналом при относительно высокой температуре детекции и сигналом при относительно низкой температуре детекции, при этом сигнал при относительно высокой температуре детекции корректируют с учетом порогового значения и используют для получения данной разницы.On FIG. 2d and 2e show the results of determining the presence of target nucleotide sequences having a relatively low detection temperature by the difference between a signal at a relatively high detection temperature and a signal at a relatively low detection temperature, wherein the signal at a relatively high detection temperature is corrected for a threshold value and used to get this difference.
На Фиг. 3 представлены результаты детекции нуклеотидной последовательности-мишени (геномной ДНК из Chlamydia trachomatis, СТ), имеющей относительно высокую температуру детекции (72°C), нуклеотидной последовательности-мишени (геномной ДНК из Neisseria gonorrhoeae, NG), имеющей относительно низкую температуру детекции (60°C), и их комбинации по данным как ПЦР в режиме реального времени с использованием разных температур детекции, так и анализа плавления. Сигнал для СТ генерировали, используя TaqMan-способ с ПЦР в режиме реального времени, а сигнал для NG генерировали, используя способ с PTOCE-плавлением.On FIG. 3 shows the results of detection of a target nucleotide sequence (genomic DNA from Chlamydia trachomatis, CT) having a relatively high detection temperature (72°C), a target nucleotide sequence (genomic DNA from Neisseria gonorrhoeae, NG) having a relatively low detection temperature (60 °C), and their combinations according to both real-time PCR using different detection temperatures and melting analysis. The CT signal was generated using the TaqMan real-time PCR method, and the NG signal was generated using the PTOCE melt method.
На Фиг. 4a представлены результаты SNP-генотипирования по настоящему изобретению с использованием разных температур детекции с применением ПЦР в режиме реального времени. ДНК, кодирующую MTHFR (метилентетрагидрофолат-редуктаза) (C677T), из генома человека использовали в качестве матриц (последовательностей-мишеней). Осуществляли детекцию гомозиготы дикого типа (СС), мутантной гомозиготы (ТТ) и гетерозиготы (СТ). Все сигналы генерировали, используя способ с PTOCE с применением ПЦР в режиме реального времени.On FIG. 4a shows the results of the SNP genotyping of the present invention using different detection temperatures using real-time PCR. DNA encoding MTHFR (methylenetetrahydrofolate reductase) (C677T) from the human genome was used as templates (target sequences). Wild type homozygote (CC), mutant homozygote (TT) and heterozygote (CT) were detected. All signals were generated using the PTOCE method using real-time PCR.
На Фиг. 4b представлены результаты SNP-генотипирования с использованием соотношения между сигналом при относительно высокой температуре детекции и сигналом при относительно низкой температуре детекции.On FIG. 4b shows the results of SNP genotyping using the ratio between the signal at a relatively high detection temperature and the signal at a relatively low detection temperature.
На Фиг. 5а-5с представлены результаты детекции по настоящему изобретению с использованием разных температур детекции для детекции трех последовательностей-мишеней (геномной ДНК из Neisseria gonorrhoeae (NG), геномной ДНК из Chlamydia trachomatis (СТ) и геномной ДНК из Mycoplasma genitalium (MG)). Сигнал для MG генерировали, используя TaqMan-способ с ПЦР в режиме реального времени, а сигналы для СТ и NG генерировали, используя способ с PTOCE с применением ПЦР в режиме реального времени. "95°C" выбирали в качестве температуры детекции сигнала для MG; "72°C" выбирали в качестве температуры детекции сигнала для СТ, а "60°C" выбирали в качестве температуры детекции сигнала для NG с учетом средств генерации сигнала (signal-generating means).On FIG. 5a-5c show the detection results of the present invention using different detection temperatures to detect three target sequences (genomic DNA from Neisseria gonorrhoeae (NG), genomic DNA from Chlamydia trachomatis (CT), and genomic DNA from Mycoplasma genitalium (MG)). The signal for MG was generated using the TaqMan method with real-time PCR, and the signals for CT and NG were generated using the PTOCE method using real-time PCR. "95°C" was chosen as the signal detection temperature for MG; "72°C" was chosen as the signal detection temperature for CT, and "60°C" was chosen as the signal detection temperature for NG based on signal-generating means.
На Фиг. 5d представлены значения конечный-ΔRFU, рассчитанные с использованием значений RFU (relative fluorescence units - относительные единицы флуоресценции) в конечных точках при 95°C и 72°C, для определения присутствия геномной ДНК СТ.On FIG. 5d shows endpoint-ΔRFU values calculated using RFU (relative fluorescence units) endpoints at 95°C and 72°C to determine the presence of CT genomic DNA.
На Фиг. 5е представлены значения конечный-ΔRFU, рассчитанные с использованием значений RFU в конечных точках при 72°C и 60°C, для определения присутствия геномной ДНК NG.On FIG. 5e shows endpoint-ΔRFU values calculated using endpoint RFU values at 72°C and 60°C to determine the presence of NG genomic DNA.
Подробное описание данного изобретенияDetailed Description of the Invention
Наиболее характерный признак настоящего изобретения касается детекции множества нуклеотидных последовательностей-мишеней с использованием метки одного типа и детектора одного типа в одном реакционном сосуде. В настоящем изобретении используются разные температуры детекции, что дает возможность осуществления детекции множества нуклеотидных последовательностей-мишеней в одном реакционном сосуде, даже применяя метку одного типа. Элементы настоящего изобретения выбраны в соответствии с данным признаком настоящего изобретения и из них выстроен неожиданный способ детекции нуклеотидных последовательностей-мишеней.The most characteristic feature of the present invention relates to the detection of multiple target nucleotide sequences using the same type of label and the same type of detector in the same reaction vessel. The present invention uses different detection temperatures, which makes it possible to carry out the detection of multiple target nucleotide sequences in one reaction vessel, even using the label of the same type. The elements of the present invention are selected in accordance with this feature of the present invention, and from them an unexpected method for detecting target nucleotide sequences is built.
В случае традиционных способов ПЦР в режиме реального времени для детекции двух нуклеотидных последовательностей-мишеней в одном реакционном сосуде требуется применение флуоресцентных меток двух типов или анализа плавления.In the case of traditional real-time PCR methods, the detection of two target nucleotide sequences in one reaction vessel requires the use of two types of fluorescent labels or a melting assay.
В настоящем изобретении используются протоколы ПЦР в режиме реального времени для детекции двух нуклеотидных последовательностей-мишеней с использованием флуоресцентной метки одного типа в одном реакционном сосуде. Альтернативно, настоящее изобретение дает возможность осуществления детекции двух нуклеотидных последовательностей-мишеней посредством детекции одной из двух нуклеотидных последовательностей-мишеней с использованием ПЦР в режиме реального времени, а другой с использованием анализа плавления.The present invention uses real-time PCR protocols to detect two target nucleotide sequences using the same type of fluorescent label in a single reaction vessel. Alternatively, the present invention enables detection of two target nucleotide sequences by detecting one of the two target nucleotide sequences using real-time PCR and the other using melt analysis.
В настоящем изобретении используются данные, полученные авторами изобретения, говорящие о том, что детекция сигналов регулируется температурами в соответствии со средствами генерации сигнала для нуклеотидных последовательностей-мишеней.The present invention uses data obtained by the inventors, saying that the detection of signals is regulated by temperatures in accordance with the signal generation means for target nucleotide sequences.
Например, если в качестве средства генерации сигнала для детекции первой нуклеотидной последовательности-мишени используется гибридизация зонда с нуклеотидной последовательностью-мишенью, то температура, при которой зонд гибридизуется с первой нуклеотидной последовательностью-мишенью, позволяет генерировать и детектировать сигналы, указывающие на присутствие первой нуклеотидной последовательности-мишени. Напротив, температура, при которой данный зонд не гибридизуется с первой нуклеотидной последовательностью-мишенью, не позволяет генерировать и детектировать никакого сигнала. В этом отношении следует принимать во внимание, что имеются температуры, при которых сигнал генерируется, и температуры, при которых сигнал не генерируется, и это зависит от используемых средств генерации сигнала.For example, if probe hybridization to the target nucleotide sequence is used as a means of generating a signal to detect the first target nucleotide sequence, then the temperature at which the probe hybridizes to the first target nucleotide sequence allows signals indicative of the presence of the first nucleotide sequence to be generated and detected. -targets. On the contrary, the temperature at which this probe does not hybridize with the first target nucleotide sequence does not allow generating and detecting any signal. In this regard, it should be taken into account that there are temperatures at which a signal is generated and temperatures at which a signal is not generated, and this depends on the signal generation means used.
При применении таких средств генерации сигнала значения температуры, при которых зонд гибридизуется с первой нуклеотидной последовательностью-мишенью, может служить в качестве температуры детекции для первой нуклеотидной последовательности-мишени. Значения температуры, при которых зонд не гибридизуется с первой нуклеотидной последовательностью-мишенью, не может служить в качестве температуры детекции.With such signal generating means, the temperatures at which the probe hybridizes to the first target nucleotide sequence can serve as the detection temperature for the first target nucleotide sequence. Temperatures at which the probe does not hybridize to the first target nucleotide sequence cannot serve as detection temperatures.
Если гибридизацию зонда используют также для детекции второй нуклеотидной последовательности-мишени, то температуру ее детекции можно определить с учетом наличия температурного диапазона, в котором генерируются или не генерируются сигналы.If probe hybridization is also used to detect a second target nucleotide sequence, then its detection temperature can be determined in terms of the presence of a temperature range in which signals are generated or not generated.
Если значение Tпл зонда, используемого для детекции второй нуклеотидной последовательности-мишени, ниже такового для зонда, используемого для детекции первой нуклеотидной последовательности-мишени, то сигнал для первой нуклеотидной последовательности-мишени можно детектировать при относительно более высокой температуре, при этом сигнал для второй нуклеотидной последовательности-мишени не будет генерироваться. Другими словами, имеется разница в температурах генерирования и детекции сигналов от двух средств генерации сигнала для двух нуклеотидных последовательностей-мишеней.If the Tm value of the probe used to detect the second target nucleotide sequence is lower than that of the probe used to detect the first target nucleotide sequence, then the signal for the first target nucleotide sequence can be detected at a relatively higher temperature, while the signal for the second target nucleotide sequence will not be generated. In other words, there is a difference in the temperatures of signal generation and detection from the two signal generators for the two target nucleotide sequences.
Если в образце одновременно присутствуют две нуклеотидные последовательности-мишени, то имеется температурный диапазон, позволяющий генерировать сигнал для первой нуклеотидной последовательности-мишени и не генерировать сигнала для второй нуклеотидной последовательности-мишени. В то же время в диапазоне температур, находящемся ниже данного температурного диапазона, генерируются сигналы для этих двух нуклеотидных последовательностей-мишеней.If two target nucleotide sequences are simultaneously present in the sample, then there is a temperature range that allows generating a signal for the first target nucleotide sequence and not generating a signal for the second target nucleotide sequence. At the same time, in a temperature range below this temperature range, signals are generated for these two target nucleotide sequences.
Учитывая эти два температурных диапазона, можно определить температуру детекции для каждой из нуклеотидных последовательностей-мишеней. Относительно высокая температура детекции может быть выбрана из первого температурного диапазона, и эту относительно высокую температуру детекции задают первой нуклеотидной последовательности-мишени. Относительно низкая температура детекции может быть выбрана из последнего температурного диапазона, и эту относительно низкую температуру детекции задают второй нуклеиновой кислоте-мишени.Given these two temperature ranges, it is possible to determine the detection temperature for each of the target nucleotide sequences. The relatively high detection temperature may be selected from the first temperature range, and this relatively high detection temperature is set to the first target nucleotide sequence. A relatively low detection temperature may be selected from the latter temperature range, and this relatively low detection temperature is given to the second target nucleic acid.
Согласно настоящему изобретению сигнал при относительно высокой температуре детекции измеряют для определения присутствия первой нуклеотидной последовательности-мишени. Согласно настоящему изобретению детекция при относительно высокой температуре детекции позволяет осуществить способ определения присутствия первой нуклеотидной последовательности-мишени.According to the present invention, the signal at a relatively high detection temperature is measured to determine the presence of the first target nucleotide sequence. According to the present invention, detection at a relatively high detection temperature allows a method for determining the presence of a first target nucleotide sequence.
Важный технический признак настоящего изобретения относится к выявлению сигнала, детектируемого при относительно низкой температуре детекции, для определения присутствия второй нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, используя как сигнал при относительно высокой температуре детекции, так и сигнал при относительно низкой температуре детекции.An important technical feature of the present invention relates to the detection of a signal detected at a relatively low detection temperature to determine the presence of a second target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature using both a signal at a relatively high detection temperature and a signal at a relatively low detection temperature.
Альтернативно, авторы настоящего изобретения рассмотрели возможность того, что первую нуклеотидную последовательность-мишень можно детектировать при относительно высокой температуре детекции, используя разные температуры детекции, а вторую нуклеотидную последовательность-мишень можно детектировать с использованием анализа плавления в качестве другого подхода для генерирования сигнала. Средство генерации сигнала, используемое для анализа плавления, может обеспечить получение сигнала при конкретной температуре в процессе детекции в режиме реального времени. Таким образом, даже если детекцию одной из двух нуклеотидных последовательностей-мишеней осуществляют с использованием анализа плавления, необходимо, чтобы эти две нуклеотидные последовательности-мишени имели разные температуры детекции.Alternatively, the present inventors considered the possibility that the first target nucleotide sequence could be detected at a relatively high detection temperature using different detection temperatures, and the second target nucleotide sequence could be detected using melt assay as another approach for signal generation. The signal generator used for melting analysis can provide a signal at a specific temperature during real-time detection. Thus, even if the detection of one of the two target nucleotide sequences is carried out using a melting assay, it is necessary that the two target nucleotide sequences have different detection temperatures.
Настоящее изобретение может быть воплощено в соответствии с различными аспектами, которые приведены ниже:The present invention can be embodied in accordance with various aspects, which are given below:
(a) детекция двух нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием разных температур детекции;(a) detecting two target nucleotide sequences in a sample using different detection temperatures;
(b) SNP-генотипирование нуклеотидной последовательности в образце с использованием разных температур детекции;(b) SNP genotyping of the nucleotide sequence in the sample using different detection temperatures;
(c) детекция по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием разных температур детекции;(c) detecting at least three target nucleotide sequences in the sample using different detection temperatures;
(d) детекция двух нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием разных температур детекции и анализа плавления; и(d) detection of two target nucleotide sequences in a sample using different detection temperatures and melting assays; and
(e) детекция по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием анализа температур детекции и анализа плавления.(e) detecting at least three target nucleotide sequences in the sample using detection temperature analysis and melting analysis.
I. Детекция двух нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием разных температур детекцииI. Detection of two target nucleotide sequences in a sample using different detection temperatures
Согласно одному из аспектов данного изобретения предложен способ детекции двух нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием разных температур детекции, включающий:According to one aspect of the present invention, there is provided a method for detecting two target nucleotide sequences in a sample using different detection temperatures, comprising:
(a) инкубирование образца с двумя средствами генерации сигнала для детекции двух нуклеотидных последовательностей-мишеней в одном реакционном сосуде и детекцию генерируемого сигнала с использованием детектора одного типа; при этом каждую из нуклеотидных последовательностей-мишеней детектируют с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом одна из двух нуклеотидных последовательностей-мишеней имеет относительно высокую температуру детекции, а другая имеет относительно низкую температуру детекции, определяемую с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом относительно высокая температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, а относительно низкая температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование как сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, так и сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции; при этом сигналы, генерируемые с использованием этих двух средств генерации сигнала, не различаются детектором одного типа; при этом детекцию осуществляют как при относительно высокой температуре детекции, так и при относительно низкой температуре детекции; и(a) incubating the sample with two signal generators to detect two target nucleotide sequences in one reaction vessel and detecting the generated signal using the same type of detector; wherein each of the target nucleotide sequences is detected using an appropriate signal generation means; wherein one of the two target nucleotide sequences has a relatively high detection temperature and the other has a relatively low detection temperature determined using an appropriate signal generation means; wherein the relatively high detection temperature is a temperature that allows signal generation for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature, and the relatively low detection temperature is a temperature that allows generation of a signal for a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature, and a signal for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature; while the signals generated using these two signal generation means are not distinguished by a detector of the same type; wherein detection is carried out both at a relatively high detection temperature and at a relatively low detection temperature; and
(b) определение присутствия двух нуклеотидных последовательностей-мишеней на основе сигналов, детектируемых на стадии (a); при этом (1) присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, определяют на основе сигнала, детектируемого при относительно высокой температуре детекции, а (2) присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, определяют по разнице между сигналом, детектируемым при относительно высокой температуре детекции, и сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции.(b) determining the presence of two target nucleotide sequences based on the signals detected in step (a); wherein (1) the presence of a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature is determined based on the signal detected at a relatively high detection temperature, and (2) the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature is determined by the difference between the signal , detected at a relatively high detection temperature, and a signal detected at a relatively low detection temperature.
В соответствии с традиционными способами применения ПЦР в режиме реального времени, в которых используют кривые амплификации, в данной области техники общеизвестно, что невозможно провести дифференцированную детекцию множества нуклеотидных последовательностей-мишеней, применяя средства генерации сигнала, обеспечивающие получение неразличимых идентичных сигналов.In accordance with conventional real-time PCR applications that use amplification curves, it is well known in the art that it is not possible to differentially detect multiple target nucleotide sequences using signal generation means that produce indistinguishable identical signals.
Настоящее изобретение позволяет преодолеть ограничения, связанные с этим широко распространенным в данной области техники мнением, и приводит к получению неожиданных результатов в отношении детекции нуклеотидных последовательностей-мишеней в значительной степени усовершенствованным способом.The present invention overcomes the limitations associated with this widely held opinion in the art, and leads to unexpected results in relation to the detection of target nucleotide sequences in a greatly improved way.
Настоящее изобретение будет описано более подробно ниже.The present invention will be described in more detail below.
Стадия (a). Инкубирование со средствами генерации сигнала и детекция сигналовStep (a). Incubation with Signal Generator and Signal Detection
В первую очередь, анализируемый образец инкубируют с двумя средствами генерации сигнала для детекции двух нуклеотидных последовательностей-мишеней в одном реакционном сосуде и затем генерируемый сигнал детектируют, используя детектор одного типа. Сигналы, генерируемые двумя средствами генерации сигнала, не различаются детектором одного типа.First, the sample to be analyzed is incubated with two signal generators for detecting two target nucleotide sequences in one reaction vessel, and then the generated signal is detected using the same type of detector. Signals generated by two signal generators are not distinguished by a detector of the same type.
В настоящем изобретении используются средства генерации сигнала с целью генерирования сигналов для нуклеотидных последовательностей-мишеней. Каждую из нуклеотидных последовательностей-мишеней детектируют с использованием соответствующего средства генерации сигнала. Использованный в данном описании термин "средства генерации сигнала" относится к любому веществу, применяемому при генерировании сигналов, указывающих на присутствие нуклеотидных последовательностей-мишеней, включая, например, олигонуклеотиды, метки и ферменты. Альтернативно, использованный в данном описании термин "средства генерации сигнала" можно применять в отношении любых способов, в которых используются данные вещества для генерирования сигналов.The present invention uses signal generation means to generate signals for target nucleotide sequences. Each of the target nucleotide sequences is detected using an appropriate signal generator. As used herein, the term "signal generating means" refers to any substance used in generating signals indicative of the presence of target nucleotide sequences, including, for example, oligonucleotides, labels, and enzymes. Alternatively, the term "signal generating means" as used herein can be applied to any methods that use these substances to generate signals.
Согласно одному из воплощений данного изобретения инкубирование проводят в условиях, допускающих генерирование сигналов с использованием средств генерации сигнала. Такие условия включают температуры, концентрации солей и pH растворов.According to one of the embodiments of the present invention, the incubation is carried out under conditions that allow the generation of signals using signal generation means. Such conditions include temperatures, salt concentrations and pH of solutions.
Примеры олигонуклеотидов, служащих в качестве средств генерации сигнала, включают олигонуклеотиды, предназначенные для специфической гибридизации с нуклеотидными последовательностями-мишенями (например, зонды и праймеры); когда зонды или праймеры, гибридизованные с нуклеотидными последовательностями-мишенями, расщепляются с высвобождением фрагмента, олигонуклеотиды, служащие в качестве средств генерации сигнала, включают захватывающие олигонуклеотиды (capture oligonucleotides), предназначенные для специфической гибридизации с данным фрагментом; когда фрагмент, гибридизованный с захватывающим олигонуклеотидом, удлиняется с образованием удлиненной цепи, олигонуклеотиды, служащие в качестве средств генерации сигнала, включают олигонуклеотиды, предназначенные для специфической гибридизации с данной удлиненной цепью; олигонуклеотиды, служащие в качестве средств генерации сигнала, включают олигонуклеотиды, предназначенные для специфической гибридизации с захватывающим олигонуклеотидом; и олигонуклеотиды, служащие в качестве средств генерации сигнала, включают их комбинации.Examples of oligonucleotides serving as signal generating means include oligonucleotides designed to specifically hybridize to target nucleotide sequences (eg, probes and primers); when probes or primers hybridized to target nucleotide sequences are cleaved to release a fragment, the oligonucleotides serving as signal generating means include capture oligonucleotides designed to specifically hybridize to that fragment; when a fragment hybridized to a capture oligonucleotide is extended to form an extended strand, the oligonucleotides serving as signal generating means include oligonucleotides designed to specifically hybridize to that extended strand; oligonucleotides serving as signal generating means include oligonucleotides designed for specific hybridization with a capture oligonucleotide; and oligonucleotides serving as signal generating means include combinations thereof.
Несмотря на то, что принцип генерирования сигналов является одним и тем же, считается, что средства генерации сигнала, включающие используемые олигонуклеотиды с разными последовательностями, могут быть разными.Although the principle of signal generation is the same, it is believed that the means of signal generation, including used oligonucleotides with different sequences, may be different.
Метка может быть соединена с олигонуклеотидами или может находиться в свободной форме. Метка может встраиваться в продукты удлинения во время реакции удлинения.The label may be linked to oligonucleotides or may be in free form. The label may be incorporated into the elongation products during the elongation reaction.
Когда в процессе генерирования сигналов используют расщепление олигонуклеотидов, примеры фермента включают 5'-нуклеазу и 3'-нуклеазу, в частности, полимеразу нуклеиновых кислот, обладающую 5'-нуклеазной активностью, полимеразу нуклеиновых кислот, обладающую 3'-нуклеазной активностью, или нуклеазу FEN (Flap EndoNuclease - флэп-эндонуклеаза).When oligonucleotide cleavage is used in the signal generation process, examples of the enzyme include a 5'-nuclease and a 3'-nuclease, in particular, a nucleic acid polymerase having a 5'-nuclease activity, a nucleic acid polymerase having a 3'-nuclease activity, or a FEN nuclease. (Flap EndoNuclease - flap endonuclease).
В настоящем изобретении сигналы можно генерировать, по-разному используя различные описанные выше вещества.In the present invention, signals can be generated using various substances described above in various ways.
Согласно одному из воплощений, по меньшей мере одно из двух средств генерации сигнала представляет собой средство генерации сигнала для генерирования сигнала способом, зависящим от образования дуплекса.According to one embodiment, at least one of the two signal generating means is a signal generating means for generating a signal in a duplex dependent manner.
Согласно одному из воплощений средства генерации сигнала для каждой из нуклеотидных последовательностей-мишеней представляют собой средства генерации сигнала для генерирования сигнала способом, зависящим от образования дуплекса.In one embodiment, the signal generating means for each of the target nucleotide sequences are signal generating means for generating a signal in a duplex dependent manner.
Согласно одному из воплощений данный дуплекс включает двухцепочечную нуклеотидную последовательность-мишень.In one embodiment, this duplex comprises a double-stranded target nucleotide sequence.
Использованное в данном описании выражение "генерирование сигнала способом, зависящим от образования дуплекса" в сочетании со средствами генерации сигнала относится к тому, что получение детектируемого сигнала будет зависеть от ассоциации или диссоциации двух молекул нуклеиновой кислоты. Данное выражение означает, что получение сигнала обеспечивается дуплексом (например, дуплексом между содержащим метку детектирующим олигонуклеотидом (detection oligonucleotide) и нуклеотидной последовательностью), образование которого зависит от присутствия нуклеотидной последовательности-мишени. Помимо этого, данное выражение означает, что получение сигнала обеспечивается посредством ингибирования гибридизации при образовании дуплекса (например, дуплексом между содержащим метку детектирующим олигонуклеотидом и нуклеотидной последовательностью), при этом данное ингибирование вызывается образованием другого дуплекса.As used herein, "generating a signal in a manner dependent on duplex formation" in conjunction with signal generation means that the production of a detectable signal will depend on the association or dissociation of two nucleic acid molecules. This expression means that the signal is provided by a duplex (eg, a duplex between a labeled detection oligonucleotide (detection oligonucleotide) and a nucleotide sequence), the formation of which depends on the presence of the target nucleotide sequence. In addition, this expression means that the signal is obtained by inhibiting hybridization upon the formation of a duplex (eg, a duplex between the labeled detection oligonucleotide and the nucleotide sequence), this inhibition being caused by the formation of another duplex.
В частности, сигнал генерируется в результате образования дуплекса между нуклеотидной последовательностью-мишенью и детектирующим олигонуклеотидом, специфически гибридизованным с этой нуклеотидной последовательностью-мишенью.In particular, a signal is generated by the formation of a duplex between a target nucleotide sequence and a detection oligonucleotide specifically hybridized to that target nucleotide sequence.
Использованный в данном описании термин "детектирующий олигонуклеотид" относится к олигонуклеотиду, который вовлечен в генерирование предназначенного для детекции сигнала. Согласно одному из воплощений настоящего изобретения детектирующий олигонуклеотид включает олигонуклеотид, который вовлечен в фактическое генерирование сигнала. Например, гибридизация или отсутствие гибридизации детектирующего олигонуклеотида с другим олигонуклеотидом (например, нуклеотидной последовательностью-мишенью или олигонуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, комплементарную детектирующему олигонуклеотиду) является определяющим признаком генерирования сигнала.As used herein, the term "detection oligonucleotide" refers to an oligonucleotide that is involved in generating a signal to be detected. According to one embodiment of the present invention, the detection oligonucleotide comprises an oligonucleotide that is involved in the actual signal generation. For example, hybridization or non-hybridization of a detection oligonucleotide with another oligonucleotide (eg, a target nucleotide sequence or an oligonucleotide containing a nucleotide sequence complementary to the detection oligonucleotide) is a defining feature of signal generation.
Согласно одному из воплощений настоящего изобретения детектирующий олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну метку.According to one embodiment of the present invention, the detection oligonucleotide contains at least one label.
Сигнал в результате образования дуплекса между нуклеотидной последовательностью-мишенью и детектирующим олигонуклеотидом может генерироваться различными способами, включая способ "scorpion" (Whitcombe et al., Nature Biotechnology, 17: 804-807 (1999)), способ "sunrise" (или Amplifluor) (Nazarenko et al., Nucleic Acids Research, 25(12): 2516-2521 (1997) и патент США №6117635), способ Lux (патент США №7537886), способ Plexor (Sherrill СВ., et al., Journal of the American Chemical Society, 126: 4550-45569 (2004)), способ молекулярных "маяков" (Tyagi et al., Nature Biotechnology, v. 14, MARCH 1996), способ HyBeacon (French D.J. et al., Mol. Cell Probes, 15(6): 363-374 (2001)), способ с применением смежных гибридизационных зондов (Bernard, P.S. et al., Anal. Biochem., 273: 221(1999)) и способ с применением LNA (locked nucleic acid - "закрытая" нуклеиновая кислота) (патент США №6977295).The signal resulting from the formation of a duplex between the target nucleotide sequence and the detection oligonucleotide can be generated by various methods, including the "scorpion" method (Whitcombe et al., Nature Biotechnology, 17: 804-807 (1999)), the "sunrise" method (or Amplifluor) (Nazarenko et al., Nucleic Acids Research, 25(12): 2516-2521 (1997) and US Pat. No. 6,117,635), Lux method (US Pat. No. 7,537,886), Plexor method (Sherrill CB, et al., Journal of the American Chemical Society, 126: 4550-45569 (2004)), molecular beacon method (Tyagi et al., Nature Biotechnology, v. 14, MARCH 1996), HyBeacon method (French D. J. et al., Mol. Cell Probes , 15(6): 363-374 (2001)), the adjacent hybridization probe method (Bernard, P.S. et al., Anal. Biochem., 273: 221(1999)) and the LNA method (locked nucleic acid - "closed" nucleic acid) (US patent No. 6977295).
В частности, такой сигнал генерируется дуплексом, образованным способом, зависящим от расщепления опосредующего олигонуклеотида (mediation oligonucleotide), специфически гибридизованного с нуклеотидной последовательностью-мишенью.In particular, such a signal is generated by a duplex formed in a manner dependent on the cleavage of a mediation oligonucleotide specifically hybridized to a target nucleotide sequence.
Использованный в данном описании термин "опосредующий олигонуклеотид" относится к олигонуклеотиду, который опосредует образование дуплекса, не содержащего нуклеотидной последовательности-мишени.As used herein, the term "mediating oligonucleotide" refers to an oligonucleotide that mediates the formation of a duplex that does not contain a target nucleotide sequence.
Согласно одному из воплощений настоящего изобретения само расщепление опосредующего олигонуклеотида не генерирует сигнала, а в последующие реакции генерирования сигнала после гибридизации и расщепления опосредующего олигонуклеотида вовлечен фрагмент, образованный в результате такого расщепления.According to one of the embodiments of the present invention, the cleavage of the mediating oligonucleotide itself does not generate a signal, and the fragment resulting from such cleavage is involved in subsequent signal generation reactions after hybridization and cleavage of the mediating oligonucleotide.
Согласно одному из воплощений сами гибридизация или расщепление опосредующего олигонуклеотида не генерируют сигнала.In one embodiment, the hybridization or cleavage of the mediating oligonucleotide itself does not generate a signal.
Согласно одному из воплощений настоящего изобретения опосредующий олигонуклеотид включает олигонуклеотид, который гибридизуется с нуклеотидной последовательностью-мишенью и расщепляется с высвобождением фрагмента, опосредуя образование дуплекса. В частности, фрагмент опосредует образование дуплекса в результате удлинения этого фрагмента на захватывающем олигонуклеотиде.According to one embodiment of the present invention, the mediating oligonucleotide comprises an oligonucleotide that hybridizes to a target nucleotide sequence and cleaves to release a fragment, mediating duplex formation. In particular, the fragment mediates the formation of a duplex by extending the fragment on the capture oligonucleotide.
Согласно одному из воплощений настоящего изобретени, опосредующий олигонуклеотид содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок (3'-targeting portion), содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности-мишени, и (2) 5'-концевой тегирующий участок (5-tagging portion), содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную нуклеотидной последовательности-мишени.According to one embodiment of the present invention, the mediating oligonucleotide comprises (1) a 3'-targeting portion containing a hybridizable nucleotide sequence complementary to the target nucleotide sequence, and (2) a 5'-end tagging portion ( 5-tagging portion) containing a nucleotide sequence that is not complementary to the target nucleotide sequence.
Согласно одному из воплощений настоящего изобретения, в результате расщепления опосредующего олигонуклеотида высвобождается фрагмент, и этот фрагмент специфически гибридизуется с захватывающим олигонуклеотидом и удлиняется на захватывающем олигонуклеотиде.According to one embodiment of the present invention, cleavage of the mediating oligonucleotide releases a fragment and the fragment specifically hybridizes to the capture oligonucleotide and extends on the capture oligonucleotide.
Согласно одному из воплощений настоящего изобретения опосредующий олигонуклеотид, гибридизованный с нуклеотидными последовательностями-мишенями, расщепляется с высвобождением фрагмента, и этот фрагмент специфически гибридизуется с захватывающим олигонуклеотидом, и этот фрагмент удлиняется с образованием удлиненной цепи, что приводит к образованию удлиненного дуплекса между удлиненной цепью и захватывающим олигонуклеотидом, обеспечивая получение сигнала, указывающего на присутствие нуклеотидной последовательности-мишени.According to one embodiment of the present invention, a mediating oligonucleotide hybridized to target nucleotide sequences is cleaved to release a fragment, and the fragment specifically hybridizes to the capture oligonucleotide, and the fragment is extended to form an extended chain, resulting in an extended duplex between the extended chain and the capture oligonucleotide, providing a signal indicating the presence of the target nucleotide sequence.
Согласно одному из воплощений настоящего изобретения, если используют третий олигонуклеотид, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную удлиненной цепи, то в результате гибридизации третьего олигонуклеотида и удлиненной цепи образуется дуплекс другого типа, обеспечивая получение сигнала, указывающего на присутствие нуклеотидной последовательности-мишени.According to one embodiment of the present invention, if a third oligonucleotide is used containing a hybridizable nucleotide sequence that is complementary to the extended strand, hybridization of the third oligonucleotide and the extended strand produces a different type of duplex, providing a signal indicative of the presence of the target nucleotide sequence.
Согласно одному из воплощений настоящего изобретения, если используют третий олигонуклеотид, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную захватывающему олигонуклеотиду, то образование дуплекса между данным третьим олигонуклеотидом и захватывающим олигонуклеотидом ингибируется в результате образования дуплекса между удлиненной цепью и захватывающим олигонуклеотидом, приводя к получению сигнала, указывающего на присутствие нуклеотидной последовательности-мишени.According to one embodiment of the present invention, if a third oligonucleotide is used containing a hybridizable nucleotide sequence complementary to the capture oligonucleotide, then duplex formation between the third oligonucleotide and the capture oligonucleotide is inhibited by duplex formation between the extended strand and the capture oligonucleotide, resulting in a signal indicative of the presence of the target nucleotide sequence.
Согласно одному из воплощений настоящего изобретения, фрагмент, удлиненная цепь, захватывающий олигонуклеотид, третий олигонуклеотид или их комбинация могут работать в качестве детектирующего олигонуклеотида.According to one of the embodiments of the present invention, a fragment, an extended chain capture oligonucleotide, a third oligonucleotide, or a combination thereof can work as a detecting oligonucleotide.
Сигнал от дуплекса, образованного способом, зависящим от расщепления опосредующего олигонуклеотида, может генерироваться различными способами, включая способ с PTOCE (расщеплением и удлинением PTO) (WO 2012/096523), способ с PCE-SH (гибридизацией сигнального олигонуклеотида, зависящей от расщепления и удлинения PTO) (WO 2013/115442) и способ с PCE-NH (отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения PTO) (PCT/KR2013/012312).The signal from a duplex formed in a manner dependent on the cleavage of a mediating oligonucleotide can be generated in a variety of ways, including the PTOCE (PTO cleavage and extension) method (WO 2012/096523), the PCE-SH (signal oligonucleotide cleavage and extension dependent hybridization PTO) (WO 2013/115442) and the PCE-NH method (no hybridization dependent on PTO cleavage and extension) (PCT/KR2013/012312).
Со ссылкой на термины, описанные в приведенных выше ссылках, соответствующими примерами олигонуклеотидов являются следующие: опосредующий олигонуклеотид, который соответствует зондирующему и метящему олигонуклеотиду (PTO), захватывающий олигонуклеотид, который соответствует захватывающему и матричному олигонуклеотиду (СТО; capturing and templating oligonucleotide) и третий олигонуклеотид, который соответствует сигнальному олигонуклеотиду (SO; signaling oligonucleotide) или гибридизующемуся олигонуклеотиду (НО; hybridization oligonucleotide), соответственно. SO, НО, СТО, удлиненная цепь или их комбинация могут взять на себя роль детектирующего олигонуклеотида.With reference to the terms described in the above references, relevant examples of oligonucleotides are as follows: a mediating oligonucleotide that corresponds to a probe and tagging oligonucleotide (PTO), a capture oligonucleotide that corresponds to a capture and template oligonucleotide (CTO; capturing and templating oligonucleotide) and a third oligonucleotide , which corresponds to a signaling oligonucleotide (SO; signaling oligonucleotide) or a hybridizing oligonucleotide (HO; hybridization oligonucleotide), respectively. SO, HO, CTO, an extended chain, or a combination thereof can take on the role of a detecting oligonucleotide.
Сигнал от дуплекса, образованного способом, зависящим от расщепления опосредующего олигонуклеотида, включает сигнал, получение которого обеспечивается посредством ингибирования образования другого дуплекса дуплексом, образованным способом, зависящим от расщепления опосредующего олигонуклеотида (например, способом с PCE-NH).A signal from a duplex formed in a manner dependent on the cleavage of the mediating oligonucleotide includes a signal obtained by inhibiting the formation of another duplex by a duplex formed in a manner dependent on the cleavage of the mediating oligonucleotide (eg, the PCE-NH method).
Например, когда сигнал от дуплекса, образованного способом, зависящим от расщепления опосредующего олигонуклеотида, генерируют способом с PTOCE, средство генерации сигнала содержит располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид и зондирующий и метящий олигонуклеотид (PTO), содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности-мишени, захватывающий и матричный олигонуклеотид (СТО), подходящую метку и матричную полимеразу нуклеиновых кислот, обладающую 5'-нуклеазной активностью. PTO содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности-мишени, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную нуклеотидной последовательности-мишени. СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка PTO, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку PTO.For example, when a signal from a duplex formed in a manner dependent on the cleavage of a mediating oligonucleotide is generated by the PTOCE method, the signal generating means comprises an "upstream" oligonucleotide and a probe and labeling oligonucleotide (PTO) containing a hybridizable nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence a target, a capture and template oligonucleotide (CTO), a suitable label, and a nucleic acid template polymerase having 5'-nuclease activity. The PTO contains (1) a 3' target recognition region containing a hybridizing nucleotide sequence complementary to the target nucleotide sequence and (2) a 5' tag region containing a nucleotide sequence not complementary to the target nucleotide sequence. The CTO contains in the 3'→5' direction (1) a capture region containing a nucleotide sequence complementary to the 5'-terminal tag region or a portion of the 5'-terminal tag region of the PTO, and (2) a template region containing a nucleotide sequence not complementary to 5 the '-terminal tagging region and the 3'-terminal target recognition region of the PTO.
Конкретный пример генерирования сигналов способом с PTOCE включает стадии:A specific example of signal generation by the PTOCE method includes the steps:
(a) гибридизации нуклеотидной последовательности-мишени с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом и PTO; (b) приведения в контакт продукта со стадии (a) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления PTO; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление PTO ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка PTO; (c) гибридизации фрагмента, высвободившегося из PTO, с СТО; при этом фрагмент, высвободившийся из PTO, гибридизуется с захватывающим участком СТО; и (d) осуществления реакции удлинения с использованием продукта со стадии (c) и матричной полимеразы нуклеиновых кислот; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется и образуется удлиненный дуплекс; причем удлиненный дуплекс имеет величину Tпл, регулируемую (1) последовательностью и/или длиной этого фрагмента, (2) последовательностью и/или длиной СТО либо (3) последовательностью и/или длиной фрагмента и последовательностью и/или длиной СТО; при этом удлиненный дуплекс обеспечивает получение сигнала от мишени посредством (1) по меньшей мере одной метки, соединенной с фрагментом и/или СТО, (2) метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, (3) метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения и метки, соединенной с фрагментом и/или СТО, или (4) интеркалирующей метки; и (e) детекции удлиненного дуплекса путем измерения сигнала от мишени при предварительно заданной температуре, при которой удлиненный дуплекс сохраняет свою двухцепочечную форму; тем самым присутствие удлиненного дуплекса указывает на присутствие нуклеотидной последовательности-мишени. В этом случае способ дополнительно включает повторение всех или некоторых из стадий (a)-(e) с денатурацией между повторяющимися циклами.(a) hybridization of the target nucleotide sequence with the upstream oligonucleotide and PTO; (b) contacting the product from step (a) with an enzyme having 5'-nuclease activity under conditions suitable for cleavage of PTO; wherein the upstream oligonucleotide or its extended chain induces cleavage of the PTO by an enzyme having 5'-nuclease activity such that the cleavage releases a fragment containing the 5'-tag site or a portion of the 5'-tag site of the PTO; (c) hybridizing the fragment released from PTO with CTO; in this case, the fragment released from PTO hybridizes with the capturing CRT site; and (d) performing an extension reaction using the product from step (c) and a nucleic acid matrix polymerase; in this case, the fragment hybridized with the capturing CTO site is elongated and an elongated duplex is formed; wherein the extended duplex has a Tm value controlled by (1) the sequence and/or length of the fragment, (2) the sequence and/or length of the CTO, or (3) the sequence and/or length of the fragment and the sequence and/or length of the CTO; while the extended duplex provides a signal from the target through (1) at least one label connected to the fragment and/or CTO, (2) a label embedded in the extended duplex during the extension reaction, (3) a label embedded in the extended duplex during the extension reaction and the label connected to the fragment and/or CTO, or (4) an intercalating label; and (e) detecting the extended duplex by measuring the signal from the target at a predetermined temperature at which the extended duplex retains its double stranded form; thus, the presence of an extended duplex indicates the presence of a target nucleotide sequence. In this case, the method further comprises repeating all or some of steps (a)-(e) with denaturation between repeated cycles.
Во фразе "денатурация между повторяющимися циклами" термин "денатурация" означает разделение молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты на молекулы одноцепочечной нуклеиновой кислоты.In the phrase "denaturation between repeated cycles", the term "denaturation" means the separation of a double-stranded nucleic acid molecule into single-stranded nucleic acid molecules.
На стадии (a) способа с PTOCE вместо располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида для амплификации нуклеотидной последовательности-мишени можно использовать комплект праймеров. В этом случае способ дополнительно включает повторение всех или некоторых из стадий (а)-(е) с денатурацией между повторяющимися циклами.In step (a) of the PTOCE method, instead of the upstream oligonucleotide, a primer set can be used to amplify the target nucleotide sequence. In this case, the method further comprises repeating all or some of steps (a)-(e) with denaturation between repeated cycles.
Способ с PTOCE можно классифицировать как способ, при котором фрагмент PTO, гибридизованный с СТО, удлиняется с образованием удлиненной цепи, и эту удлиненную цепь затем детектируют. Способ с PTOCE характеризуется тем, что детекцию образования удлиненной цепи осуществляют, используя дуплекс между удлиненной цепью и СТО.The PTOCE method can be classified as a method in which a PTO fragment hybridized with CTO is extended to form an extended chain, and this extended chain is then detected. The PTOCE method is characterized in that the detection of the formation of an extended chain is carried out using a duplex between the extended chain and CTO.
Существует другой подход для детекции образования удлиненной цепи. Например, детекцию образования удлиненной цепи можно осуществлять, используя олигонуклеотид, специфически гибридизованный с удлиненной цепью (например, как в способе с PCE-SH). В этом способе получение сигнала может обеспечиваться посредством (1) метки, соединенной с олигонуклеотидом, специфически гибридизованным с удлиненной цепью, (2) метки, соединенной с олигонуклеотидом, специфически гибридизованным с удлиненной цепью, и метки, соединенной с фрагментом PTO, (3) метки, соединенной с олигонуклеотидом, специфически гибридизованным с удлиненной цепью, и метки, встраиваемой в удлиненную цепь во время реакции удлинения, или (4) метки, соединенной с олигонуклеотидом, специфически гибридизованным с удлиненной цепью, и интеркалирующим красителем. Альтернативно, получение сигнала может обеспечиваться посредством (1) метки, соединенной с удлиненной цепью, или (2) интеркалирующего красителя.There is another approach for detecting the formation of an elongated chain. For example, detection of the formation of an extended chain can be performed using an oligonucleotide specifically hybridized to an extended chain (eg, as in the PCE-SH method). In this method, signal generation can be provided by (1) a label linked to an oligonucleotide specifically hybridized to an extended chain, (2) a label linked to an oligonucleotide specifically hybridized to an extended chain, and a label linked to a PTO fragment, (3) a label coupled to an oligonucleotide specifically hybridized to an extended chain and a label inserted into the extended chain during the extension reaction, or (4) a label coupled to an oligonucleotide specifically hybridized to an extended chain and an intercalating dye. Alternatively, signal acquisition can be provided by (1) a label connected to an extended chain, or (2) an intercalating dye.
Альтернативно, детекцию образования удлиненной цепи осуществляют другим способом, при котором детектируют ингибирование гибридизации СТО с олигонуклеотидом, способным к специфической гибридизации с СТО (например, как в способе с PCE-NH). Такое ингибирование считается показателем присутствия нуклеотидной последовательности-мишени. Получение сигнала может обеспечиваться посредством (1) метки, соединенной с олигонуклеотидом, способным к гибридизации с СТО, (2) метки, соединенной с СТО, (3) метки, соединенной с олигонуклеотидом, способным к гибридизации с СТО, и метки, соединенной с СТО, или (4) интеркалирующей метки.Alternatively, the detection of the formation of an extended chain is carried out by another method, in which the inhibition of CTO hybridization with an oligonucleotide capable of specific hybridization with CTO is detected (for example, as in the PCE-NH method). Such inhibition is considered to be indicative of the presence of the target nucleotide sequence. Signal generation can be provided by (1) a label linked to an oligonucleotide capable of hybridizing to CTO, (2) a label linked to CTO, (3) a label linked to an oligonucleotide capable of hybridizing to CTO, and a label linked to CTO , or (4) an intercalating label.
Согласно одному из воплощений олигонуклеотид, способный к специфической гибридизации с СТО, имеет последовательность, перекрывающуюся с фрагментом PTO.In one embodiment, an oligonucleotide capable of specific hybridization with CTO has a sequence that overlaps with a PTO fragment.
Согласно одному из воплощений детектирующий олигонуклеотид включает олигонуклеотид, способный к специфической гибридизации с удлиненной цепью (например, как в способе с PCE-SH), и олигонуклеотид, способный к специфической гибридизации с СТО (например, как в способе с PCE-NH). Согласно одному из воплощений детектирующий олигонуклеотид включает удлиненную цепь, образованную во время реакции, или СТО.In one embodiment, the detection oligonucleotide comprises an oligonucleotide capable of specific chain extension hybridization (eg, as in the PCE-SH method) and an oligonucleotide capable of specific hybridization with CTO (eg, as in the PCE-NH method). According to one embodiment, the detection oligonucleotide comprises an extended chain formed during the reaction, or CTO.
Способы на основе PTOCE обычно включают образование удлиненной цепи в зависимости от присутствия нуклеотидной последовательности-мишени. Термин "способ на основе PTOCE" используется в данном описании в предположении, что он охватывает различные способы получения сигналов, включающие образование удлиненной цепи посредством расщепления и удлинения PTO.PTOCE-based methods typically involve the formation of an extended chain depending on the presence of the target nucleotide sequence. The term "PTOCE-based method" is used herein on the assumption that it encompasses various signaling methods, including the formation of an extended chain by PTO cleavage and extension.
Пример генерирования сигналов с использованием способов на основе PTOCE включает стадии: (а) гибридизации нуклеотидной последовательности-мишени с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом и PTO; (b) приведения в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления PTO; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление PTO ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка PTO; (c) гибридизации фрагмента, высвободившегося из PTO, с СТО, при этом фрагмент, высвободившийся из PTO, гибридизуется с захватывающим участком СТО; (d) осуществления реакции удлинения с использованием продукта со стадии (c) и матричной полимеразы нуклеиновых кислот; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с образованием удлиненной цепи; и (e) детекции образования удлиненной цепи путем детекции сигнала, генерируемого в зависимости от присутствия удлиненной цепи. На стадии (a) вместо располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида для амплификации нуклеотидной последовательности-мишени можно использовать комплект праймеров. В этом случае способ дополнительно включает повторение всех или некоторых из стадий (a)-(e) с денатурацией между повторяющимися циклами.An example of signal generation using PTOCE-based methods includes the steps of: (a) hybridizing a target nucleotide sequence with an upstream oligonucleotide and PTO; (b) contacting the product from step (a) with an enzyme having 5'-nuclease activity under conditions suitable for cleavage of PTO; wherein the upstream oligonucleotide or its extended chain induces cleavage of the PTO by an enzyme having 5'-nuclease activity such that the cleavage releases a fragment containing the 5'-tag site or a portion of the 5'-tag site of the PTO; (c) hybridizing the PTO-released fragment with CTO, wherein the PTO-released fragment hybridizes to the CTO capture site; (d) performing an extension reaction using the product from step (c) and a nucleic acid matrix polymerase; wherein the fragment hybridized to the capturing CTO site is elongated to form an elongated chain; and (e) detecting the formation of an extended chain by detecting a signal generated depending on the presence of the extended chain. In step (a), instead of the upstream oligonucleotide, a primer set can be used to amplify the target nucleotide sequence. In this case, the method further comprises repeating all or some of steps (a)-(e) with denaturation between repeated cycles.
Согласно одному из воплощений сигнал, генерируемый в результате образования дуплекса, включает сигналы, индуцируемые посредством гибридизации с образованием дуплекса (например, гибридизации с образованием дуплекса как такового или гибридизации третьего олигонуклеотида), или посредством ингибирования гибридизации третьего олигонуклеотида вследствие образования дуплекса.In one embodiment, the signal generated by duplex formation includes signals induced by duplex hybridization (e.g., duplex hybridization per se or third oligonucleotide hybridization), or by inhibition of third oligonucleotide hybridization due to duplex formation.
Согласно одному из воплощений средства генерации сигнала для каждой из нуклеотидных последовательностей-мишеней представляют собой средства генерации сигнала с использованием образования дуплекса способом, зависящим от расщепления опосредующего олигонуклеотида, специфически гибридизованного с нуклеотидной последовательностью-мишенью.In one embodiment, the signal generating means for each of the target nucleotide sequences are signal generating means using duplex formation in a manner dependent on cleavage of a mediating oligonucleotide specifically hybridized to the target nucleotide sequence.
Согласно одному из воплощений, по меньшей мере одно из двух средств генерации сигнала представляет собой средство генерации сигнала для генерирования сигнала способом, зависящим от расщепления детектирующего олигонуклеотида.According to one embodiment, at least one of the two signal generating means is a signal generating means for generating a signal in a manner dependent on the cleavage of the detection oligonucleotide.
В частности, сигнал генерируется в результате гибридизации детектирующего олигонуклеотида с нуклеотидной последовательностью-мишенью и затем расщепления детектирующего олигонуклеотида.In particular, the signal is generated by hybridizing the detection oligonucleotide to the target nucleotide sequence and then cleaving the detection oligonucleotide.
Сигнал, полученный в результате гибридизации детектирующего олигонуклеотида с нуклеотидной последовательностью-мишенью и затем расщепления детектирующего олигонуклеотида, может генерироваться различными способами, включая способ с применением TaqMan-зондов (патент США №5210015 и патент США №5538848).The signal resulting from hybridization of the detection oligonucleotide to the target nucleotide sequence and then cleavage of the detection oligonucleotide can be generated in various ways, including the TaqMan probe method (US Pat. No. 5,210,015 and US Pat. No. 5,538,848).
Если сигнал генерируется с использованием способа с применением TaqMan-зондов, то средства генерации сигнала включают комплект праймеров для амплификации нуклеотидной последовательности-мишени, TaqMan-зонд, имеющий подходящую метку (например, систему двух взаимодействующих меток (interactive dual label)), и полимеразу нуклеиновых кислот, обладающую 5'-нуклеазной активностью. TaqMan-зонд, гибридизованный с нуклеотидной последовательностью-мишенью, расщепляется в процессе амплификации мишени и генерирует сигнал, указывающий на присутствие нуклеотидной последовательности-мишени.If the signal is generated using the TaqMan probe method, then the means for generating the signal include a primer set for amplifying the target nucleotide sequence, a TaqMan probe having an appropriate label (e.g., an interactive dual label system), and nucleic acid polymerase. acids with 5'-nuclease activity. A TaqMan probe hybridized to a target nucleotide sequence is cleaved during target amplification and generates a signal indicating the presence of the target nucleotide sequence.
Конкретный пример генерирования сигнала с использованием способа с применением TaqMan-зондов включает стадии: (а) гибридизации комплекта праймеров и TaqMan-зонда, имеющего подходящую метку (например, систему двух взаимодействующих меток), с нуклеотидной последовательностью-мишенью; (b) амплификации нуклеотидной последовательности-мишени с использованием продукта со стадии (а) и полимеразы нуклеиновых кислот, обладающей 5'-нуклеазной активностью, при этом TaqMan-зонд расщепляется с высвобождением этой метки; и (c) детекции генерирования сигнала от высвободившейся метки.A specific example of generating a signal using the TaqMan probe method comprises the steps of: (a) hybridizing a primer set and a TaqMan probe having a suitable label (eg, a dual co-label system) to a target nucleotide sequence; (b) amplifying the target nucleotide sequence using the product from step (a) and a nucleic acid polymerase having 5'-nuclease activity, wherein the TaqMan probe is cleaved to release the label; and (c) detecting the generation of a signal from the released label.
В частности, сигнал генерируется в результате расщепления детектирующего олигонуклеотида способом, зависящим от расщепления опосредующего олигонуклеотида, специфически гибридизованного с нуклеотидной последовательностью-мишенью.In particular, the signal is generated by cleaving the detection oligonucleotide in a manner dependent on the cleavage of the mediating oligonucleotide specifically hybridized to the target nucleotide sequence.
Согласно одному из воплощений настоящего изобретения, если опосредующий олигонуклеотид, гибридизованный с нуклеотидными последовательностями-мишенями, расщепляется с высвобождением фрагмента, то этот фрагмент специфически гибридизуется с детектирующим олигонуклеотидом и этот фрагмент индуцирует расщепление детектирующего олигонуклеотида.According to one embodiment of the present invention, if a mediating oligonucleotide hybridized to target nucleotide sequences is cleaved to release a fragment, then that fragment specifically hybridizes to a detection oligonucleotide and that fragment induces cleavage of the detection oligonucleotide.
Согласно одному из воплощений настоящего изобретения, если опосредующий олигонуклеотид, гибридизованный с нуклеотидными последовательностями-мишенями, расщепляется с высвобождением фрагмента, то этот фрагмент удлиняется с расщеплением детектирующего олигонуклеотида, содержащего гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную захватывающему олигонуклеотиду.According to one embodiment of the present invention, if a mediating oligonucleotide hybridized to target nucleotide sequences is cleaved to release a fragment, then that fragment is extended to cleave a detection oligonucleotide containing a hybridizable nucleotide sequence complementary to the capture oligonucleotide.
Сигнал, полученный в результате расщепления детектирующего олигонуклеотида способом, зависящим от расщепления опосредующего олигонуклеотида, может генерироваться различными способами, включая анализ «Invader» (патент США № US 5691142), способ с РСЕС (РТО cleavage and extension-dependent cleavage - расщеплением, зависящим от удлинения и расщепления РТО) (WO 2012/134195) и способ, описанный в патенте США №7309573. В частности, способ, описанный в патенте США №7309573, можно рассматривать как один из способов на основе РТОСЕ, в котором используется генерирование сигналов в результате расщепления, и в данном способе образование удлиненной цепи можно детектировать посредством детекции расщепления олигонуклеотида, специфически гибридизованного с СТО в результате образования удлиненной цепи. В анализе «Invader» образуется фрагмент в результате расщепления опосредующего олигонуклеотида и индуцируются последующие реакции расщепления без какого-либо удлинения данного фрагмента.The signal resulting from the cleavage of the detection oligonucleotide in a manner dependent on the cleavage of the mediating oligonucleotide can be generated in a variety of ways, including the Invader assay (US Patent No. US 5,691,142), the PCEC (PTO cleavage and extension-dependent cleavage) method. elongation and splitting PTO) (WO 2012/134195) and the method described in US patent No. 7309573. In particular, the method described in U.S. Patent No. 7,309,573 can be considered as one of the PTOCE-based methods that uses signal generation from cleavage, and in this method, the formation of an extended chain can be detected by detecting cleavage of an oligonucleotide specifically hybridized with CTO in the result of the formation of an elongated chain. In the "Invader" assay, a fragment is generated by cleavage of a mediating oligonucleotide and subsequent cleavage reactions are induced without any extension of the fragment.
Согласно одному из воплощений настоящего изобретения, если сигнал генерируется способом, зависящим от расщепления детектирующего олигонуклеотида, то в результате расщепления детектирующего олигонуклеотида индуцируется изменение сигнала или высвобождается меченый фрагмент, предназначенный для детекции.According to one embodiment of the present invention, if a signal is generated in a manner dependent on cleavage of the detection oligonucleotide, then cleavage of the detection oligonucleotide will induce a signal change or release a labeled fragment for detection.
Если средство генерации сигнала генерирует сигнал посредством одновременного расщепления детектирующего олигонуклеотида и образования дуплекса, то такое средство генерации сигнала может рассматриваться как средство генерации сигнала, обеспечивающее получение сигнала посредством расщепления, при условии, что его используют для генерирования сигнала посредством расщепления.If the signal generating means generates a signal by simultaneously cleaving the detection oligonucleotide and forming a duplex, then such signal generating means can be considered as a signal generating means providing a signal by cleavage, provided that it is used to generate a signal by cleavage.
Согласно одному из воплощений генерирование сигналов способом, зависящим от расщепления детектирующего олигонуклеотида, используется для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции. Если сигнал генерируется посредством расщепления детектирующего олигонуклеотида, то высвободившуюся в результате расщепления метку можно детектировать при любых температурах. Таким образом, сигнал, генерируемый в результате расщепления детектирующего олигонуклеотида, не может быть применен для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, требуя ограничения температуры детекции.In one embodiment, generating signals in a manner dependent on the cleavage of the detection oligonucleotide is used for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature. If the signal is generated by cleavage of the detection oligonucleotide, then the label released as a result of cleavage can be detected at any temperature. Thus, the signal generated by cleavage of the detection oligonucleotide cannot be applied to a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature, requiring detection temperature to be limited.
Согласно одному из воплощений генерирование сигнала, зависящее от расщепления детектирующего олигонуклеотида, используют исключительно для одной нуклеотидной последовательности-мишени. Если генерирование сигнала, зависящее от расщепления детектирующего олигонуклеотида, используют для обеих из двух нуклеотидных последовательностей-мишеней, то эти две нуклеотидные последовательности-мишени невозможно дифференцированно детектировать в зависимости от температуры детекции.In one embodiment, signal generation dependent on cleavage of the detection oligonucleotide is used exclusively for one target nucleotide sequence. If signal generation dependent on the cleavage of the detection oligonucleotide is used for both of the two target nucleotide sequences, then the two target nucleotide sequences cannot be differentially detected depending on the detection temperature.
Согласно одному из воплощений данного изобретения средство генерации сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, представляет собой средство генерации сигнала с использованием расщепления детектирующего олигонуклеотида, а средство генерации сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, представляет собой средство генерации сигнала с использованием образования дуплекса.According to one embodiment of the present invention, the signal generating means for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature is a signal generating means using detection oligonucleotide cleavage, and the signal generating means for a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature is means for generating a signal using duplexing.
Согласно одному из воплощений данного изобретения средство генерации сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, представляет собой средство генерации сигнала с использованием расщепления детектирующего олигонуклеотида, а средство генерации сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, представляет собой средство генерации сигнала с использованием образования дуплекса способом, зависящим от расщепления опосредующего олигонуклеотида, специфически гибридизованного с нуклеотидной последовательностью-мишенью.According to one embodiment of the present invention, the signal generating means for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature is a signal generating means using detection oligonucleotide cleavage, and the signal generating means for a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature is means for generating a signal using duplex formation in a manner dependent on cleavage of a mediating oligonucleotide specifically hybridized to a target nucleotide sequence.
Согласно одному из воплощений детектирующий олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну метку.According to one embodiment, the detection oligonucleotide contains at least one label.
Согласно одному из воплощений настоящего изобретения детектирующий олигонуклеотид может состоять по меньшей мере из одного олигонуклеотида. Согласно одному из воплощений настоящего изобретения, если детектирующий олигонуклеотид состоит из множества олигонуклеотидов, то он может иметь метку в различных вариантах. Например, один олигонуклеотид среди множества олигонуклеотидов может иметь по меньшей мере одну метку, все олигонуклеотиды из множества могут иметь по меньшей мере одну метку или одна часть олигонуклеотидов может иметь по меньшей мере одну метку, а другая часть может не иметь метки.According to one embodiment of the present invention, the detection oligonucleotide may consist of at least one oligonucleotide. According to one of the embodiments of the present invention, if the detecting oligonucleotide consists of a plurality of oligonucleotides, then it can be labeled in various ways. For example, one oligonucleotide among a plurality of oligonucleotides may have at least one tag, all of the oligonucleotides in a plurality may have at least one tag, or one portion of the oligonucleotides may have at least one tag and another portion may be unlabeled.
Сигналы, генерируемые двумя средствами генерации сигнала, не различаются детектором одного типа. Термин "сигналы не различаются детектором одного типа" означает, что сигналы невозможно отличить друг от друга при использовании детектора одного типа ввиду того, что они имеют идентичные или по существу идентичные свойства сигналов (например, оптические свойства, длину волны излучения и электрический сигнал). Например, если для двух нуклеотидных последовательностей-мишеней используют одну и ту же метку (например, FAM (карбоксифлуоресцеин)), а для детекции на длине волны излучения от FAM используют детектор одного типа, то сигналы невозможно дифференцированно детектировать.Signals generated by two signal generators are not distinguished by a detector of the same type. The term "signals cannot be distinguished by the same type of detector" means that the signals cannot be distinguished from each other using the same type of detector due to the fact that they have identical or substantially identical signal properties (for example, optical properties, radiation wavelength, and electrical signal). For example, if the same label (eg, FAM (carboxyfluorescein)) is used for two target nucleotide sequences, and the same type of detector is used for detection at the FAM wavelength, then signals cannot be differentially detected.
Использованный в данном описании термин "сигнал одного типа" относится к сигналам с идентичными или по существу идентичными свойствами сигналов (например, оптическими свойствами, длиной волны излучения и электрическим сигналом). Например, FAM и CAL Fluor 610 генерируют сигналы разных типов.As used herein, the term "signal of the same type" refers to signals with identical or substantially identical signal properties (eg, optical properties, radiation wavelength, and electrical signal). For example, FAM and CAL Fluor 610 generate different types of signals.
Использованный в данном описании термин "детектор одного типа" относится к средству детекции сигнала одного типа. В детекторе, содержащем несколько каналов (например, фотодиодов) для сигналов нескольких разных типов, каждый канал (например, фотодиод) соответствует "детектору одного типа".As used herein, the term "single type detector" refers to a means for detecting a single type of signal. In a detector containing multiple channels (eg, photodiodes) for several different types of signals, each channel (eg, photodiode) corresponds to a "detector of the same type".
Согласно одному из воплощений данного изобретения два средства генерации сигнала содержат идентичную метку, и сигналы от этой метки не различаются детектором одного типа.According to one embodiment of the present invention, the two signal generating means contain an identical label, and the signals from this label are not distinguished by a detector of the same type.
Метка, используемая в настоящем изобретении, включает различные метки, известные в данной области техники. Например, метка, используемая в настоящем изобретении, включает одиночную метку, систему двух взаимодействующих меток, интеркалирующий краситель и встраиваемую метку.The label used in the present invention includes various labels known in the art. For example, the label used in the present invention includes a single label, a system of two interacting labels, an intercalating dye, and an embedded label.
Одиночная метка включает, например, флуоресцентную метку, люминесцентную метку, хемилюминесцентную метку, электрохимическую метку и металлическую метку. Согласно одному из воплощений одиночная метка обеспечивает получение иного сигнала (например, сигнала иной интенсивности) в зависимости от ее присутствия в двойной цепи или одиночной цепи. Согласно одному из воплощений одиночная метка представляет собой флуоресцентную метку. Предпочтительные типы и сайты связывания одиночных флуоресцентных меток, используемых в данном изобретении, описаны в патентах США №№7537886 и 7348141, идеи которых включены в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте. Например, одиночная флуоресцентная метка включает JOE (2',7'-диметокси-4',5'-дихлорофлуоресцеин), FAM, TAMRA (тетраметилродамин), ROX (6-карбокси-Х-родамин) и метку на основе флуоресцеина. Одиночная метка может быть присоединена к олигонуклеотидам различными методами. Например, метку присоединяют к зондам через спейсер, содержащий атомы углерода (например, 3-углеродный спейсер, 6- углеродный спейсер или 12-углеродный спейсер).The single label includes, for example, a fluorescent label, a luminescent label, a chemiluminescent label, an electrochemical label, and a metal label. In one embodiment, a single tag provides a different signal (eg, a different signal intensity) depending on its presence in the dual strand or single strand. According to one embodiment, the single label is a fluorescent label. Preferred types and binding sites of single fluorescent labels used in this invention are described in US patent No. 7537886 and 7348141, the ideas of which are incorporated into this description by reference in its entirety. For example, a single fluorescent label includes JOE (2',7'-dimethoxy-4',5'-dichlorofluorescein), FAM, TAMRA (tetramethylrhodamine), ROX (6-carboxy-X-rhodamine), and a fluorescein-based label. A single label can be attached to oligonucleotides by various methods. For example, the label is attached to the probes through a spacer containing carbon atoms (eg, a 3-carbon spacer, a 6-carbon spacer, or a 12-carbon spacer).
В качестве репрезентативной системы взаимодействующих меток система меток при FRET (fluorescence resonance energy transfer - резонансном переносе энергии флуоресценции) включает в себя флуоресцентную репортерную молекулу (донорную молекулу) и молекулу-гаситель (акцепторную молекулу). При FRET донор энергии является флуоресцентным, а акцептор энергии может быть флуоресцентным или не быть флуоресцентным. Для другой формы систем взаимодействующих меток донор энергии не является флуоресцентным, например, является хромофором, а акцептор энергии является флуоресцентным. Для еще одной формы систем взаимодействующих меток донор энергии является люминесцентным, например биолюминесцентным, хемилюминесцентным, электрохемилюминесцентным, а акцептор является флуоресцентным. Система взаимодействующих меток включает двойную метку на основе "контакт-опосредованного гашения" (Salvatore et al., Nucleic Acids Research, 2002 (30), №21, e122 и Johansson et al., J. Am. Chem. Soc, 2002 (124), pp. 6950-6956). Система взаимодействующих меток включает любую систему меток, в которой изменение сигнала индуцируется взаимодействием между по меньшей мере двумя молекулами (например, красителя).As a representative system of interacting labels, the FRET (fluorescence resonance energy transfer) label system includes a fluorescent reporter molecule (donor molecule) and a quencher molecule (acceptor molecule). In FRET, the energy donor is fluorescent and the energy acceptor may or may not be fluorescent. For another form of interacting label systems, the energy donor is non-fluorescent, eg, is a chromophore, and the energy acceptor is fluorescent. For yet another form of cooperating label systems, the energy donor is luminescent, eg bioluminescent, chemiluminescent, electrochemiluminescent, and the acceptor is fluorescent. The interactive label system includes a dual label based on "contact-mediated quenching" (Salvatore et al., Nucleic Acids Research, 2002 (30), no. 21, e122 and Johansson et al., J. Am. Chem. Soc, 2002 (124 ), pp. 6950-6956). An interacting label system includes any label system in which a signal change is induced by an interaction between at least two molecules (eg a dye).
Репортерная молекула и молекула-гаситель для применения в настоящем изобретении могут включать любые молекулы, известные в данной области техники. Примерами их являются: Су2™ (506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), кальцеин (517), FITC (флуоресцеинизотиоцианат) (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), родамин 110 (520), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), родамин 123 (529), Magnesium Green™ (531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOT01 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (тетраметилродамин-изотиоцианат) (572), Magnesium Orange™ (575), фикоэритрин R&B (575), родамин-фаллоидин (575), Calcium Orange™ (576), пиронин Y (580), родамин В (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), техасский красный (615), нильский красный (628), Y0-PR0™-3 (631), YOYO™-3 (631), R-фикоцианин (642), С-фикоцианин (648), TO-PRO™-3 (660), ТОТО3 (660), DiD DilC(5) (665), Су5™ (670), тиадикарбоцианин (671), Су5.5 (694), HEX (556), ТЕТ (536), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), флуоресцеин (520), флуоресцеин-С3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) и Quasar 705 (610). Числа в скобках представляют собой длину волны, соответствующую максимуму излучения, в нанометрах. Предпочтительно, чтобы репортерная молекула и молекула-гаситель включали JOE, FAM, TAMRA, ROX и другую метку на основе флуоресцеина.The reporter molecule and quencher molecule for use in the present invention may include any molecule known in the art. Examples of these are: Cy2™ (506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), calcein (517), FITC (fluorescein isothiocyanate) (518), FluorX™ (519), Alexa™ ( 520), Rhodamine 110 (520), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green™ (531) , Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOT01 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 ( 568), BODIPY564/570 (570), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (tetramethylrhodamine isothiocyanate) (572), Magnesium Orange™ (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin ( 575), Calcium Orange™ (576), Pyronine Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Texas Red (615), Nile Red (628), Y0-PR0™-3 (631), YOYO™-3 (631), R-Phycocyanin (642), C- phycocyanin (648), TO-PRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™ (670), thiadicarbocyanine (671), Cy5.5 (694), HEX (556 ), TET (536), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), fluorescein (520), fluorescein-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) and Quasar 705 (610). The numbers in parentheses are the wavelength corresponding to the emission maximum, in nanometers. Preferably, the reporter molecule and the quencher molecule include JOE, FAM, TAMRA, ROX, and another fluorescein-based label.
Подходящая флуоресцентная молекула и подходящие пары репортер-гаситель описаны в ряде публикаций, которые приведены ниже: Pesce et al., editors, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, Color and Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R.P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th Edition (Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996); патенты США №№3996345 и 4351760.A suitable fluorescent molecule and suitable reporter-quencher pairs are described in a number of publications, which are listed below: Pesce et al., editors, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, Color and Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R.P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th Edition (Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996); U.S. Patent Nos. 3,996,345 and 4,351,760.
Стоит отметить, что в настоящем изобретении может быть использована нефлуоресцентная молекула-гаситель (например, "черный" гаситель или темный гаситель), способная гасить флуоресценцию в широком диапазоне длин волн или на конкретной длине волны.It is worth noting that a non-fluorescent quencher molecule (eg, "black" quencher or dark quencher) capable of quenching fluorescence over a wide range of wavelengths or at a specific wavelength can be used in the present invention.
В системе генерирования сигналов, содержащей молекулы репортера и гасителя, термин "репортер" охватывает донора FRET, а термин "гаситель" охватывает другого партнера (акцептора) FRET. Например, в качестве репортера используют краситель на основе флуоресцеина, а в качестве гасителя краситель на основе родамина.In a signal generating system comprising reporter and quencher molecules, the term "reporter" encompasses the FRET donor and the term "quencher" encompasses the other FRET partner (acceptor). For example, a fluorescein-based dye is used as a reporter, and a rhodamine-based dye is used as a quencher.
Система двух взаимодействующих меток может быть соединена с одной цепью дуплекса. Если данная цепь, содержащая систему двух взаимодействующих меток, переходит в одноцепочечное состояние, то она формирует шпильку или принимает структуру случайного клубка, индуцируя гашение между двумя взаимодействующими метками в этой системе. Если эта цепь формирует дуплекс, гашение ослабляется. Альтернативно, если система двух взаимодействующих меток соединена с нуклеотидами, расположенными близко друг к другу в этой цепи, то гашение между двумя взаимодействующими метками в этой системе происходит. Если эта цепь формирует дуплекс и затем расщепляется, то гашение ослабляется.A system of two cooperating labels can be connected to one duplex chain. If a given chain, containing a system of two interacting labels, goes into a single-stranded state, then it forms a hairpin or adopts a random coil structure, inducing quenching between the two interacting labels in this system. If this circuit forms a duplex, quenching is attenuated. Alternatively, if a system of two interacting labels is connected to nucleotides that are close to each other in this chain, then quenching between the two interacting labels in this system occurs. If this strand forms a duplex and then splits, then the quenching is weakened.
Каждая из двух взаимодействующих меток в этой системе может быть соединена с каждой из двух цепей дуплекса. Образование дуплекса индуцирует гашение, а денатурация дуплекса приводит к отсутствию гашения. Альтернативно, если одна из двух цепей расщепляется, то это может приводить к отсутствию гашения.Each of the two cooperating labels in this system can be connected to each of the two duplex circuits. Duplex formation induces quenching, and duplex denaturation results in no quenching. Alternatively, if one of the two strands is split, then this may result in no quenching.
Примеры интеркалирующих красителей для применения в данном изобретении включают SYBR™ Green I, PO-PRO™-1, BO-PRO™-1, SYTO™43, SYTO™44, SYTO™45, SYTOX™Blue, POPO™-1, POPO™-3, BOBO™-1, BOBO™-3, LO-PRO™-1, JO-PRO YO-PRO™1, TO-PRO™1, SYTO™11, SYTO™13, SYTO™15, SYTO™16, SYTO™20, SYTO™23, TOTO™-3, YOYO™3, GelStar™ и триазоловый оранжевый. Эти интеркалирующие красители специфически интеркалируют в двухцепочечные молекулы нуклеиновых кислот, генерируя сигналы.Examples of intercalating dyes for use in this invention include SYBR™ Green I, PO-PRO™-1, BO-PRO™-1, SYTO™43, SYTO™44, SYTO™45, SYTOX™Blue, POPO™-1, POPO ™-3, BOBO™-1, BOBO™-3, LO-PRO™-1, JO-PRO YO-
В способе генерирования сигналов можно использовать встраиваемую метку путем встраивания метки в процессе удлинения праймера (например, в способе Plexor; Sherrill СВ., et al., Journal of the American Chemical Society, 126: 4550-45569 (2004)). Встраиваемую метку также можно использовать для генерирования сигнала дуплексом, образованным способом, зависящим от расщепления опосредующего олигонуклеотида, гибридизованного с нуклеотидной последовательностью-мишенью.An insertable label can be used in the signal generation method by inserting the label during primer extension (eg Plexor method; Sherrill CB, et al., Journal of the American Chemical Society, 126: 4550-45569 (2004)). An insertable label can also be used to generate a signal with a duplex formed in a manner dependent on cleavage of a mediating oligonucleotide hybridized to a target nucleotide sequence.
Обычно встраиваемая метка может быть соединена с нуклеотидами. Также можно использовать нуклеотид, содержащий неприродное основание.Typically, the tag to be inserted can be linked to nucleotides. A nucleotide containing a non-natural base can also be used.
Использованный в данном описании термин "неприродное основание" относится к производным природных оснований, таких как аденин (А), гуанин (G), тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U), которые способны к образованию связанных водородными связями пар оснований. Использованный в данном описании термин "неприродное основание" включает в себя основания, характеризующиеся другими картинами образования пар оснований по сравнению с природными основаниями как исходными соединениями (mother compounds), как описано, например, в патентах США №№5432272, 5965364, 6001983 и 6037120. Образование пар оснований между неприродными основаниями заключается в образовании двух или трех водородных связей, как и у природных оснований. Образование пар оснований между неприродными основаниями также происходит с учетом специфичности. Конкретные примеры неприродных оснований включают следующие основания в комбинациях пар оснований изо-С/изо-G, изо-dC/изо-dG, К/Х, H/J и M/N (см. патент США №7422850).As used herein, the term "non-natural base" refers to derivatives of naturally occurring bases such as adenine (A), guanine (G), thymine (T), cytosine (C), and uracil (U) that are capable of forming hydrogen bonded pairs. grounds. As used herein, the term "non-natural base" includes bases having different base-pairing patterns compared to natural bases as mother compounds, as described, for example, in US Pat. Base pairing between non-natural bases consists in the formation of two or three hydrogen bonds, as with natural bases. Base pairing between non-natural bases also occurs with specificity in mind. Specific examples of non-natural bases include the following base pair combinations of iso-C/iso-G, iso-dC/iso-dG, K/X, H/J, and M/N (see US Pat. No. 7,422,850).
Если сигнал генерируют способом с РТОСЕ, то нуклеотид, встраиваемый в процессе реакции удлинения, может иметь первое неприродное основание, а СТО может содержать нуклеотид, имеющий второе неприродное основание, обладающее аффинностью специфического связывания с первым неприродным основанием.If the signal is generated by the PTOCE method, then the nucleotide inserted during the extension reaction may have a first non-natural base, and the CTO may contain a nucleotide having a second non-natural base having a specific binding affinity for the first non-natural base.
Использованный в данном описании термин "нуклеиновая кислота-мишень", "нуклеотидная последовательность-мишень" или "последовательность-мишень" относится к нуклеотидной последовательности, представляющей интерес для детекции или количественного определения. Нуклеотидная последовательность-мишень содержит последовательность в форме одиночной цепи, а также в форме двойной цепи. Нуклеотидная последовательность-мишень содержит последовательность, изначально присутствующую в образце нуклеиновой кислоты, а также последовательность, заново образованную в реакциях.As used herein, the term "target nucleic acid", "target nucleotide sequence" or "target sequence" refers to a nucleotide sequence of interest for detection or quantification. The target nucleotide sequence contains the sequence in single strand form as well as in double strand form. The target nucleotide sequence contains the sequence originally present in the nucleic acid sample, as well as the sequence newly formed in the reactions.
Нуклеотидная последовательность-мишень может включать любые молекулы ДНК (гДНК (геномная ДНК) и кДНК (комплементарная ДНК)), РНК и их гибриды (химерную нуклеиновую кислоту). Последовательность может быть представлена или в двухцепочечной, или в одноцепочечной форме. Если нуклеиновая кислота в качестве исходного вещества является двухцепочечной, то предпочтительно перевести эти две цепи в одноцепочечную или частично одноцепочечную форму. Известные способы разделения цепей включают, но не ограничиваются этим, нагревание, обработку щелочью, формамидом, мочевиной и глиоксалем, ферментативные методы (например, действие геликаз) и связывание белков. Например, разделения цепей можно достичь посредством нагревания при температуре, изменяющейся в диапазоне от 80°С до 105°С. Общие методы осуществления такой обработки приведены в Joseph Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).The target nucleotide sequence may include any DNA molecules (gDNA (genomic DNA) and cDNA (complementary DNA)), RNA and their hybrids (chimeric nucleic acid). The sequence may be presented in either double-stranded or single-stranded form. If the nucleic acid starting material is double-stranded, it is preferable to convert the two strands to a single-stranded or partially single-stranded form. Known methods of chain separation include, but are not limited to, heating, treatment with alkali, formamide, urea and glyoxal, enzymatic methods (for example, the action of helicases) and protein binding. For example, chain separation can be achieved by heating at a temperature ranging from 80°C to 105°C. General methods for performing such processing are given in Joseph Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).
Если в качестве исходного материала используют мРНК, то перед проведением стадии отжига необходимо провести стадию обратной транскрипции, детали которой можно найти в Joseph Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); и Noonan K.F. et al., Nucleic Acids Res., 16: 10366 (1988). Для проведения обратной транскрипции можно использовать олигонуклеотид dT в качестве праймера, способный гибридизоваться с поли(А)-хвостом мРНК, случайные праймеры или мишень-специфичные праймеры.If mRNA is used as the starting material, a reverse transcription step must be performed prior to the annealing step, details of which can be found in Joseph Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); and Noonan K.F. et al. Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988). For reverse transcription, the dT oligonucleotide can be used as a primer capable of hybridizing to the mRNA poly(A) tail, random primers, or target-specific primers.
Нуклеотидная последовательность-мишень включает любую природную нуклеиновую кислоту прокариотического, эукариотического (например, из простейших и паразитов, грибов, дрожжей, высших растений, низших и высших животных, в том числе млекопитающих и человека), вирусного (например, из вирусов герпеса, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), вируса гриппа, вируса Эпштейна-Барр, вируса гепатита, полиовируса и т.д.) или вироидного происхождения. Молекула нуклеиновой кислоты также может представлять собой молекулу любой нуклеиновой кислоты, которая была получена или может быть получена методами рекомбинантной ДНК или химическим синтезом. Таким образом, нуклеотидная последовательность может быть обнаружена в природе или может не встречаться в природе. Нуклеотидная последовательность-мишень может включать известные или неизвестные последовательности.The target nucleotide sequence includes any natural nucleic acid prokaryotic, eukaryotic (for example, from protozoa and parasites, fungi, yeasts, higher plants, lower and higher animals, including mammals and humans), viral (for example, from herpes viruses, immunodeficiency virus human (HIV), influenza virus, Epstein-Barr virus, hepatitis virus, poliovirus, etc.) or viroid origin. The nucleic acid molecule can also be any nucleic acid molecule that has been or can be obtained by recombinant DNA techniques or chemical synthesis. Thus, a nucleotide sequence may or may not occur naturally. The target nucleotide sequence may include known or unknown sequences.
Использованный в данном описании термин "образец" относится к любой клетке, ткани или жидкости из биологического источника либо любой другой среды, которую можно предпочтительно оценить согласно данному изобретению, включая вирус, бактерии, ткань, клетку, кровь, сыворотку крови, плазму крови, лимфу, молоко, мочу, фекалии, внутриглазную жидкость, слюну, семенную жидкость, экстракты головного мозга, спинномозговую жидкость (SCF), аппендикс, экстракты ткани селезенки и миндалин, амниотическую жидкость, асцитическую жидкость и небиологические образцы (например, пищу и воду). Помимо этого, образец включает молекулы существующих в природе нуклеиновых кислот, выделенных из биологических источников, и молекулы синтетических нуклеиновых кислот.As used herein, the term "sample" refers to any cell, tissue, or fluid from a biological source, or any other medium that may preferably be assessed in accordance with this invention, including virus, bacteria, tissue, cell, blood, blood serum, blood plasma, lymph , milk, urine, feces, intraocular fluid, saliva, seminal fluid, brain extracts, cerebrospinal fluid (SCF), appendix, spleen and tonsil tissue extracts, amniotic fluid, ascitic fluid, and non-biological samples (eg, food and water). In addition, the sample includes naturally occurring nucleic acid molecules isolated from biological sources and synthetic nucleic acid molecules.
Согласно одному из воплощений данного изобретения стадию (а) проводят в процессе амплификации сигнала одновременно с амплификацией нуклеиновой кислоты.According to one embodiment of the present invention, step (a) is carried out during signal amplification simultaneously with nucleic acid amplification.
В настоящем изобретении сигнал, генерируемый средством генерации сигнала, может быть амплифицирован одновременно с амплификацией мишени. Альтернативно, данный сигнал может быть амплифицирован вообще без амплификации мишени.In the present invention, the signal generated by the signal generating means can be amplified simultaneously with the amplification of the target. Alternatively, a given signal can be amplified without target amplification at all.
Согласно одному из воплощений данного изобретения генерирование сигнала осуществляют в способе, включающем амплификацию сигнала вместе с амплификацией мишени.According to one embodiment of the present invention, signal generation is carried out in a method comprising signal amplification together with target amplification.
Согласно одному из воплощений данного изобретения амплификацию мишеней осуществляют с использованием ПЦР (полимеразная цепная реакция). ПЦР широко применяется в данной области техники для амплификации мишеней, включая в себя циклы, состоящие из денатурации последовательности-мишени, отжига (гибридизации) данной последовательности-мишени с праймерами и удлинения праймеров (Mullis et al., патенты США №№4683195, 4683202 и 4800159; Saiki et al., (1985) Science, 230, 1350-1354). Сигнал может быть амплифицирован посредством совместного применения описанных выше способов генерирования сигнала (например, TaqMan-способа и способов на основе РТОСЕ) с методом ПЦР. Согласно одному из воплощений настоящего изобретения предложено получение сигналов с использованием метода ПЦР в режиме реального времени. Согласно одному из воплощений амплификацию нуклеотидной последовательности-мишени осуществляют с использованием ПЦР (полимеразная цепная реакция); LCR (ligase chain reaction - лигазная цепная реакция; см. Wiedmann М., et al., "Ligase chain reaction (LCR) - overview and applications". PCR Methods and Applications, 1994 Feb, 3(4): S51-64), GLCR (gap filling LCR - LCR с заполнением бреши; см. WO 90/01069, ЕР 439182 и WO 93/00447), Q-beta (Q-beta replicase amplification - амплификации с использованием Q-бета-репликазы; см. Cahill P., et al., Clin. Chem., 37(9): 1482-5 (1991); патент США №5556751), SDA (strand displacement amplification - амплификация с замещением цепей; см. G.T. Walker et al., Nucleic Acids Res., 20(7): 1691-1696 (1992), EP 497272), NASBA (nucleic acid sequence-based amplification -амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот; см. Compton, J. Nature, 350 (6313): 912 (1991)), ТМА (transcription-mediated amplification -транскрипционно-опосредованная амплификация; см. Hofmann W.P. et al., J. Clin. Virol., 32(4): 289-93 (2005); патент США №5888779) или RCA (rolling circle amplification - амплификация по типу катящегося кольца; см. Hutchison С.А. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102: 17332-17336 (2005)).According to one of the embodiments of the present invention, the amplification of targets is carried out using PCR (polymerase chain reaction). PCR is widely used in the art for target amplification, including cycles consisting of target sequence denaturation, annealing (hybridization) of the target sequence with primers, and primer extension (Mullis et al., US Pat. Nos. 4,683,195, 4,683,202 and 4800159; Saiki et al., (1985) Science, 230, 1350-1354). The signal can be amplified by combining the signal generation methods described above (eg, the TaqMan method and PTOCE-based methods) with the PCR method. According to one embodiment of the present invention, signaling is provided using a real-time PCR method. According to one of the embodiments, the amplification of the target nucleotide sequence is carried out using PCR (polymerase chain reaction); LCR (ligase chain reaction - ligase chain reaction; see Wiedmann M., et al., "Ligase chain reaction (LCR) - overview and applications". PCR Methods and Applications, 1994 Feb, 3(4): S51-64) , GLCR (gap filling LCR - gap filling LCR; see WO 90/01069, EP 439182 and WO 93/00447), Q-beta (Q-beta replicase amplification - amplification using Q-beta replicase; see Cahill P., et al., Clin. Chem., 37(9): 1482-5 (1991); US Pat. No. 5,556,751), SDA (strand displacement amplification; see G. T. Walker et al., Nucleic Acids Res., 20(7): 1691-1696 (1992), EP 497272), NASBA (nucleic acid sequence-based amplification; see Compton, J. Nature, 350 (6313): 912 (1991)), TMA (transcription-mediated amplification - transcription-mediated amplification; see Hofmann W. P. et al., J. Clin. Virol., 32(4): 289-93 (2005); US patent No. 5888779) or RCA (rolling circle amplification - amplification by type of rolling ring; see Hutchison S.A. et al., Proc. Natl. Acad. sci. USA, 102: 17332-17336 (2005)).
Используя описанные выше способы амплификации, можно амплифицировать последовательности-мишени путем повторения серии реакций с изменением или без изменения температуры. Один элемент (unit) процесса амплификации, включающий повторение серии реакций, называется "циклом". Элементом циклов может быть названо число повторений или время, в зависимости от способов амплификации.Using the amplification methods described above, target sequences can be amplified by repeating a series of reactions with or without temperature change. One element (unit) of the amplification process, including the repetition of a series of reactions, is called a "cycle". The element of cycles can be called the number of repetitions or time, depending on the amplification methods.
Например, детекцию сигналов можно осуществить в каждом цикле амплификации, нескольких выбранных циклах или в конечной точке реакции. Согласно одному из воплощений, если сигналы детектируют по меньшей мере для двух циклов, то детекцию сигнала в отдельном цикле можно осуществить при всех температурах детекции или при некоторых выбранных температурах детекции. Согласно одному из воплощений данного изобретения детекцию осуществляют при относительно высокой температуре детекции для циклов с нечетными номерами и при относительно высокой температуре детекции для циклов с четными номерами.For example, signal detection can be performed at each amplification cycle, a few selected cycles, or at the end point of the reaction. According to one embodiment, if signals are detected for at least two cycles, then signal detection in a single cycle can be performed at all detection temperatures or at some selected detection temperatures. According to one embodiment of the present invention, detection is carried out at a relatively high detection temperature for odd-numbered cycles and at a relatively high detection temperature for even-numbered cycles.
Согласно одному из воплощений данного изобретения инкубирование проводят в условиях, позволяющих осуществлять амплификацию мишени, равно как и генерирование сигнала с использованием средств генерации сигнала.According to one of the embodiments of the present invention, the incubation is carried out under conditions that allow the amplification of the target, as well as signal generation using signal generation means.
Согласно одному из воплощений данного изобретения стадию (а) проводят в процессе амплификации сигнала без амплификации нуклеиновой кислоты.According to one embodiment of the present invention, step (a) is carried out in a signal amplification process without nucleic acid amplification.
Если сигнал генерируют с использованием способов, включающих расщепление олигонуклеотида, то такой сигнал может быть амплифицирован вообще без амплификации мишени. Например, стадия (а) может быть проведена с амплификацией сигналов, но без амплификации последовательностей-мишеней согласно способу СРТ (cycling probe technology - технология циклического зонда) (Duck Р, et al., Biotechniques, 9: 142-148 (1990)), анализу «Invader» (патенты США №№6358691 и 6194149), способам на основе РТОСЕ (например, способу с PCE-SH, способу с PCE-NH и способу с РСЕС) или способу CER (cyclic exonucleolytic reaction - циклическая экзонуклеолитическая реакция) (WO 2011/037306).If a signal is generated using methods involving cleavage of an oligonucleotide, then such a signal can be amplified without amplifying the target at all. For example, step (a) can be carried out with signal amplification but without amplification of target sequences according to the CPT (cycling probe technology) method (Duck P, et al., Biotechniques, 9: 142-148 (1990)) , Invader assay (US Pat. Nos. 6,358,691 and 6,194,149), PTOCE-based methods (e.g., PCE-SH method, PCE-NH method, and PCEC method), or CER method (cyclic exonucleolytic reaction) (WO 2011/037306).
Используя описанные выше способы амплификации сигналов, можно амплифицировать сигналы путем повторения серии реакций с изменением или без изменения температуры. Один элемент процесса амплификации, включающий повторение серии реакций, называется "циклом". Элементом циклов может быть названо число повторений или время, в зависимости от способов амплификации.Using the signal amplification methods described above, it is possible to amplify signals by repeating a series of reactions with or without temperature change. One element of the amplification process, involving the repetition of a series of reactions, is called a "cycle". The element of cycles can be called the number of repetitions or time, depending on the amplification methods.
Например, генерирование и детекция сигналов могут быть осуществлены для каждого цикла амплификации, для нескольких выбранных циклов или в конечной точке реакции.For example, the generation and detection of signals can be performed for each amplification cycle, for several selected cycles, or at the end point of the reaction.
Амплификацию нуклеотидной последовательности-мишени осуществляют с использованием средства амплификации мишени, включающего комплект праймеров для амплификации и полимеразу нуклеиновых кислот.Amplification of the target nucleotide sequence is carried out using a target amplification tool comprising a set of amplification primers and a nucleic acid polymerase.
Согласно одному из воплощений настоящего изобретения можно использовать полимеразу нуклеиновых кислот, обладающую нуклеазной активностью (например, 5'-нуклеазной активностью или 3'-нуклеазной активностью). Согласно одному из воплощений настоящего изобретения можно использовать полимеразу нуклеиновых кислот, не обладающую нуклеазной активностью.According to one embodiment of the present invention, a nucleic acid polymerase having nuclease activity (eg, 5'-nuclease activity or 3'-nuclease activity) can be used. According to one embodiment of the present invention, a nucleic acid polymerase lacking nuclease activity can be used.
Полимераза нуклеиновых кислот, используемая в настоящем изобретении, представляет собой термостабильную ДНК-полимеразу, полученную из ряда бактериальных видов, включая Thermus aquaticus (Taq), Themnus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermus flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species 205, Thermus species sps 17, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus и Aquifex aeolieus. В частности, термостабильная ДНК-полимераза представляет собой Taq полимеразу.The nucleic acid polymerase used in the present invention is a thermostable DNA polymerase derived from a number of bacterial species, including Thermus aquaticus (Taq), Themnus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermus flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species 205, Thermus species sps 17, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi , Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus and Aquifex aeolieus. In particular, the thermostable DNA polymerase is Taq polymerase.
Согласно одному из воплощений настоящего изобретения амплификацию нуклеотидной последовательности-мишени осуществляют с использованием асимметричной ПЦР. Соотношение праймеров может быть выбрано с учетом расщепления или гибридизации располагающихся "вниз по течению" олигонуклеотидов.According to one embodiment of the present invention, amplification of the target nucleotide sequence is carried out using asymmetric PCR. The ratio of primers can be selected to accommodate cleavage or hybridization of downstream oligonucleotides.
В процессе или после инкубирования (взаимодействия) образца с двумя средствами генерации сигнала с целью генерирования сигнала, генерируемый сигнал детектируют, используя детектор одного типа.During or after the sample is incubated (interacted) with two signal generating means to generate a signal, the generated signal is detected using the same type of detector.
Одна из двух нуклеотидных последовательностей-мишеней имеет относительно высокую температуру детекции, а другая имеет относительно низкую температуру детекции, определяемую с использованием соответствующего средства генерации сигнала.One of the two target nucleotide sequences has a relatively high detection temperature and the other has a relatively low detection temperature, determined using an appropriate signal generator.
Использованное в данном описании выражение "нуклеотидная последовательность-мишень имеет температуру детекции, определяемую с использованием соответствующиего средства генерации сигнала" относится к тому, что нуклеотидная последовательность-мишень детектируется при температуре детекции, предварительно заданной для данной нуклеотидной последовательности-мишени, что позволяет детектировать генерируемый сигнал от средства генерации сигнала, разработанного для генерирования сигнала при данной температуре детекции.As used herein, "a target nucleotide sequence has a detection temperature determined using an appropriate signal generation means" refers to the fact that the target nucleotide sequence is detected at a detection temperature predetermined for that target nucleotide sequence, allowing the generated signal to be detected. from a signal generator designed to generate a signal at a given detection temperature.
Согласно одному из воплощений настоящего изобретения одну температуру детекции, определяемую с использованием соответствующего средства генерации сигнала, задают одной нуклеотидной последовательности-мишени.According to one embodiment of the present invention, one detection temperature, determined using an appropriate signal generation means, is given to one target nucleotide sequence.
Относительно высокая температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, а относительно низкая температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование как сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, так и сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции.A relatively high detection temperature is a temperature capable of generating a signal for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature, and a relatively low detection temperature is a temperature capable of generating both a signal for a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature and a signal for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature.
Один из признаков настоящего изобретения заключается в дифференцированном определении присутствия двух нуклеотидных последовательностей-мишеней путем детектирования при разных температурах детекции сигналов, указывающих на присутствие этих двух нуклеотидных последовательностей-мишеней.One feature of the present invention is to differentiate the presence of two target nucleotide sequences by detecting at different detection temperatures signals indicating the presence of the two target nucleotide sequences.
Согласно одному из воплощений, температуры детекции для нуклеотидных последовательностей-мишеней предварительно задаются с учетом температурного диапазона, допускающего генерирование сигнала с использованием средств генерации сигнала.According to one embodiment, detection temperatures for target nucleotide sequences are pre-set to a temperature range that allows signal generation using signal generating means.
В настоящем изобретение используется тот факт, что имеется конкретный температурный диапазон, допускающий генерирование сигнала способом, зависящим от средства генерации сигнала.The present invention takes advantage of the fact that there is a specific temperature range that allows a signal to be generated in a manner dependent on the means of signal generation.
Например, если средство генерации сигнала генерирует сигнал в результате гибридизации (или ассоциации) двух молекул нуклеиновой кислоты и не генерирует сигнала при отсутствии их гибридизации (или при их диссоциации), то сигнал генерируется при температурах, допускающих гибридизацию двух молекул нуклеиновой кислоты, однако, никакого сигнала не генерируется при температурах, при которых не происходит гибридизации двух молекул нуклеиновой кислоты. Соответственно, имеется конкретный температурный диапазон, допускающий генерирование сигнала (т.е. детекцию сигнала), и другой температурный диапазон, не допускающий генерирования сигнала. Температурные диапазоны зависят от величины Тпл для гибрида из двух молекул нуклеиновой кислоты, применяемых в качестве средств генерации сигнала.For example, if the signal generating means generates a signal as a result of hybridization (or association) of two nucleic acid molecules and does not generate a signal in the absence of their hybridization (or in their dissociation), then the signal is generated at temperatures that allow hybridization of the two nucleic acid molecules, however, no no signal is generated at temperatures at which hybridization of two nucleic acid molecules does not occur. Accordingly, there is a specific temperature range allowing signal generation (ie, signal detection) and another temperature range not allowing signal generation. The temperature ranges depend on the Tm value for the hybrid of two nucleic acid molecules used as signal generating means.
Если применяют способ генерирования сигнала с использованием фрагмента с меткой, высвободившегося после расщепления, то детекцию такого сигнала теоретически можно осуществлять при любой температуре (например, 30-99°С).If a method of generating a signal using a labeled fragment released after cleavage is used, then the detection of such a signal can theoretically be carried out at any temperature (for example, 30-99°C).
Температуру детекции выбирают из температурного диапазона, допускающего генерирование сигнала с использованием такого средства генерации сигнала.The detection temperature is selected from a temperature range that allows signal generation using such signal generation means.
Термин "диапазон температур детекции" используется в данной заявке для конкретного описания температурного диапазона, допускающего генерирование сигнала (т.е. детекцию сигнала).The term "detection temperature range" is used in this application to specifically describe the temperature range that allows signal generation (ie, signal detection).
Если имеются разные диапазоны температур детекции в зависимости от средств генерации сигнала для двух нуклеотидных последовательностей-мишеней, то в качестве относительно высокой температуры детекции может быть выбран неперекрывающийся диапазон температур детекции. Нуклеотидную последовательность-мишень, детектируемую с использованием средства генерации сигнала, обеспечивающего относительно высокую температуру детекции, определяют как нуклеотидную последовательность-мишень, имеющую относительно высокую температуру детекции. В качестве относительно низкой температуры детекции может быть выбран перекрывающийся диапазон температур детекции. Нуклеотидную последовательность-мишень, детектируемую с использованием средства генерации сигнала, обеспечивающего относительно низкую температуру детекции и не обеспечивающего относительно высокой температуры детекции, определяют как нуклеотидную последовательность-мишень, имеющую относительно низкую температуру детекции.If there are different detection temperature ranges depending on the signal generation means for the two target nucleotide sequences, then a non-overlapping detection temperature range can be selected as the relatively high detection temperature. A target nucleotide sequence detected using a signal generating means providing a relatively high detection temperature is defined as a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature. An overlapping range of detection temperatures can be selected as the relatively low detection temperature. A target nucleotide sequence detected using a signal generating means providing a relatively low detection temperature and not providing a relatively high detection temperature is defined as a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature.
Согласно одному из воплощений область неперекрывания и область перекрывания невозможно различимо отличить друг от друга. Например, сигнал, обеспечиваемый нуклеотидной последовательностью-мишенью, имеющей относительно низкую температуру детекции, может генерироваться с намного более низкой интенсивностью при относительно высокой температуре детекции, выбранной для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции. В этом случае проблема ложного сигнала, обусловленная сигналом, обеспечиваемым нуклеотидной последовательностью-мишенью, имеющей относительно низкую температуру детекции, при относительно высокой температуре детекции может быть преодолена путем соответствующего выбора референсного значения (reference value) для определения значимости сигналов, детектируемых при относительно высокой температуре детекции.According to one embodiment, the non-overlapping region and the overlapping region cannot be distinguishably distinguished from each other. For example, a signal provided by a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature may be generated at a much lower intensity at a relatively high detection temperature selected for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature. In this case, the problem of a false signal caused by a signal provided by a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature at a relatively high detection temperature can be overcome by appropriate selection of a reference value to determine the significance of signals detected at a relatively high detection temperature. .
Согласно одному из воплощений, температуры детекции могут быть предварительно заданы с учетом неперекрывающегося диапазона температур детекции и перекрывающегося диапазона температур детекции среди температур детекции.According to one embodiment, the detection temperatures may be predetermined considering a non-overlapping detection temperature range and an overlapping detection temperature range among the detection temperatures.
Согласно одному из воплощений, температуры детекции, заданные для нуклеотидных последовательностей-мишеней, отличаются друг от друга по меньшей мере на 2°С, 3°С, 4°С, 5°С, 7°С, 8°С, 9°С, 10°С, 11°С, 12°С, 15°С или 20°С.According to one of the embodiments, the detection temperatures given for the target nucleotide sequences differ from each other by at least 2°C, 3°C, 4°C, 5°C, 7°C, 8°C, 9°C , 10°C, 11°C, 12°C, 15°C or 20°C.
Согласно настоящему изобретению, температура для детекции присутствия каждой из нуклеотидных последовательностей-мишеней может быть установлена с учетом средств генерации сигнала.According to the present invention, the temperature for detecting the presence of each of the target nucleotide sequences can be set in consideration of signal generation means.
Согласно одному из воплощений данного изобретения для одной из двух нуклеотидных последовательностей-мишеней задают относительно высокую температуру детекции, а для другой задают относительно низкую температуру детекции, и затем конструируют средства генерации сигнала, подходящие для данных температур детекции, после чего проводят стадию (а).According to one embodiment of the present invention, one of the two target nucleotide sequences is set to a relatively high detection temperature, and the other is set to a relatively low detection temperature, and then signal generation means suitable for these detection temperatures are designed, followed by step (a).
Согласно одному из воплощений, относительно высокая температура детекции и относительно низкая температура детекции, при которых осуществляют детекцию, могут быть заданы предварительно. Например, для относительно высокой температуры детекции и относительно низкой температуры детекции предварительно задают 72°С и 60°С, соответственно, и затем конструируют средства генерации сигнала, подходящие для данных температур детекции, после чего проводят стадию (а).According to one embodiment, the relatively high detection temperature and the relatively low detection temperature at which detection is performed can be predetermined. For example, a relatively high detection temperature and a relatively low detection temperature are pre-set to 72°C and 60°C, respectively, and then the signal generation means suitable for these detection temperatures are designed, followed by step (a).
Согласно одному из воплощений, сначала конструируют средства генерации сигнала для двух нуклеотидных последовательностей-мишеней, а затем для этих двух нуклеотидных последовательностей-мишеней устанавливают температуры детекции, после чего проводят стадию (а).According to one of the embodiments, the means for generating a signal for two target nucleotide sequences are first designed, and then detection temperatures are set for these two target nucleotide sequences, after which step (a) is carried out.
Согласно одному из воплощений данного изобретения, если средство генерации сигнала генерирует сигнал способом, зависящим от образования дуплекса, то температуру детекции выбирают с учетом величины Тпл дуплекса.According to one embodiment of the present invention, if the signal generating means generates a signal in a manner dependent on the formation of a duplex, then the detection temperature is selected taking into account the Tm value of the duplex.
Согласно одному из воплощений данного изобретения, если средство генерации сигнала генерирует сигнал способом, зависящим от образования дуплекса, то температуру детекции регулируют путем корректировки величины Тпл дуплекса.According to one embodiment of the present invention, if the signal generating means generates a signal in a manner dependent on duplex formation, then the detection temperature is controlled by adjusting the Tm value of the duplex.
Например, если сигнал генерируют с использованием детектирующего олигонуклеотида, специфически гибридизованного с нуклеотидной последовательностью-мишенью (например, зондом Lux, зондом "молекулярный маяк", зондом HyBeacon и смежным гибридизационным зондом), то детекцию сигнала успешно осуществляют при предварительно заданной температуре путем корректировки величины Тпл для олигонуклеотида. Если используют праймер типа "scorpion", то детекцию сигнала успешно осуществляют при предварительно заданной температуре путем корректировки величины Тпл для той части, которая подлежит гибридизации с удлиненной цепью.For example, if a signal is generated using a detection oligonucleotide specifically hybridized to a target nucleotide sequence (e.g., a Lux probe, a molecular beacon probe, a HyBeacon probe, and an adjacent hybridization probe), then signal detection is successfully performed at a predetermined temperature by adjusting the T value pl for the oligonucleotide. If a "scorpion" type primer is used, signal detection is successfully performed at a predetermined temperature by adjusting the Tm value for the portion to be hybridized to the extended chain.
Если сигнал генерируется дуплексом, образованным в зависимости от присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, то детекцию сигнала успешно осуществляют при предварительно заданной температуре путем корректировки величины Тпл дуплекса. Например, если сигнал генерируется способом с РТОСЕ, то детекцию сигнала успешно осуществляют при предварительно заданной температуре путем корректировки величины Тпл удлиненного дуплекса, образованного в результате удлинения фрагмента РТО на СТО.If the signal is generated by a duplex formed depending on the presence of the target nucleotide sequence, then the detection of the signal is successfully carried out at a predetermined temperature by adjusting the Tm value of the duplex. For example, if the signal is generated by the PTOCE method, then the signal detection is successfully performed at a predetermined temperature by adjusting the Tm value of the extended duplex formed by extending the PTO fragment on the CTO.
Способы на основе РТОСЕ имеют преимущества, заключающиеся в легкости корректировки величин Тпл дуплекса или третьего гибрида, гибридизация которого зависит от дуплекса. PTOCE -based methods have the advantage of easily adjusting the Tm values of a duplex or a third hybrid whose hybridization is dependent on the duplex.
Согласно одному из воплощений данного изобретения, если средство генерации сигнала генерирует сигнал способом, зависящим от расщепления детектирующего олигонуклеотида, то температуру детекции выбирают произвольным образом. Другими словами, может быть выбрана любая температура при условии, что можно детектировать сигнал, генерируемый в результате расщепления детектирующего олигонуклеотида. Как описано выше, если сигнал генерируется способом, зависящим от расщепления детектирующего олигонуклеотида, то метку, высвободившуюся в результате такого расщепления, можно детектировать при разных температурах.According to one embodiment of the present invention, if the signal generating means generates a signal in a manner dependent on the cleavage of the detecting oligonucleotide, then the detection temperature is chosen arbitrarily. In other words, any temperature can be chosen as long as the signal generated by cleavage of the detection oligonucleotide can be detected. As described above, if the signal is generated in a manner dependent on the cleavage of the detection oligonucleotide, then the label released by such cleavage can be detected at different temperatures.
Согласно одному из воплощений, если сигнал генерируется способом, зависящим от расщепления детектирующего олигонуклеотида, то температуру детекции выбирают такой, чтобы она представляла собой самую относительно высокую температуру детекции.According to one embodiment, if the signal is generated in a manner dependent on the cleavage of the detection oligonucleotide, then the detection temperature is chosen to be the relatively highest detection temperature.
Как обсуждалось выше, температуру детекции определяют с учетом диапазона температур детекции в зависимости от средства генерации сигнала. Поэтому детекцию сигнала при конкретной температуре детекции можно описать следующим образом: детекция при относительно высокой температуре детекции предназначена для детекции нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, и детекция при относительно низкой температуре детекции предназначена для детекции как нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, так и для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции.As discussed above, the detection temperature is determined taking into account the range of detection temperatures depending on the means of signal generation. Therefore, signal detection at a specific detection temperature can be described as follows: detection at a relatively high detection temperature is for detecting a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature, and detection at a relatively low detection temperature is for detecting as a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature. low detection temperature, and for the target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature.
Например, если оба сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, и нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, генерируются способом с РТОСЕ, то сигнал для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, генерируется удлиненным дуплексом, имеющим величину Тпл, подходящую для относительно высокой температуры детекции, а сигнал для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, генерируется удлиненным дуплексом, имеющим величину Тпл, подходящую для относительно низкой температуры детекции. Если сигнал детектируют при относительно высокой температуре детекции, то удлиненный дуплекс, имеющий величину Тпл, подходящую для относительно низкой температуры детекции, диссоциирует с переходом в одиночную цепь, и поэтому никакого сигнала не генерируется, тем самым детектируется только сигнал для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции. Если сигнал детектируют при относительно низкой температуре детекции, то и удлиненный дуплекс, имеющий величину Тпл, подходящую для относительно высокой температуры детекции, и удлиненный дуплекс, имеющий величину Тпл, подходящую для относительно низкой температуры детекции, оба сохраняют свою форму дуплекса, тем самым детектируются оба сигнала, и сигнал для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, и сигнал для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции.For example, if both signals for a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature and a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature are generated by the PTOCE method, then a signal for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature is generated by an extended a duplex having a Tm suitable for a relatively high detection temperature, and a signal for a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature is generated by an extended duplex having a Tm suitable for a relatively low detection temperature. If a signal is detected at a relatively high detection temperature, then an elongated duplex having a Tm value suitable for a relatively low detection temperature dissociates into a single strand, and therefore no signal is generated, thereby only the signal for the target nucleotide sequence is detected, having a relatively high detection temperature. If a signal is detected at a relatively low detection temperature, both the elongated duplex having a Tm suitable for a relatively high detection temperature and the elongated duplex having a Tm suitable for a relatively low detection temperature both retain their duplex shape, thereby both signals are detected, a signal for a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature and a signal for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature.
В другом примере, если сигнал для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, генерируется TaqMan-способом, а сигнал для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, генерируется способом с РТОСЕ, то получение сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, обеспечивается высвободившейся флуоресцентной меткой, а получение сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, обеспечивается удлиненным дуплексом, имеющим величину Тпл, подходящую для относительно низкой температуры детекции. Если сигнал детектируют при относительно высокой температуре детекции, то удлиненный дуплекс, имеющий величину Тпл, подходящую для относительно низкой температуры детекции, диссоциирует с переходом в одиночную цепь, и поэтому никакого сигнала не генерируется, тем самым детектируется только сигнал от высвободившейся флуоресцентной метки для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции. Если сигнал детектируют при относительно низкой температуре детекции, то детектируется не только сигнал, обеспечиваемый удлиненным дуплексом, имеющим величину Тпл, подходящую для относительно низкой температуры детекции, но также сигнал от высвободившейся флуоресцентной метки, тем самым детектируются оба сигнала, и сигнал для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, и сигнал для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции.In another example, if a signal for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature is generated by the TaqMan method, and a signal for a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature is generated by the PTOCE method, then generating a signal for the target nucleotide sequence , having a relatively high detection temperature, is provided by the released fluorescent label, and signaling for a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature is provided by an elongated duplex having a Tm value suitable for a relatively low detection temperature. If a signal is detected at a relatively high detection temperature, then an elongated duplex having a Tm value suitable for a relatively low detection temperature dissociates into a single strand, and therefore no signal is generated, thereby only the signal from the released fluorescent label for the nucleotide is detected. a target sequence having a relatively high detection temperature. If the signal is detected at a relatively low detection temperature, then not only the signal provided by the extended duplex having a Tm value suitable for the relatively low detection temperature is detected, but also the signal from the released fluorescent label, thereby detecting both signals and the signal for the nucleotide sequence - a target having a relatively low detection temperature and a signal for the target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature.
Детектор, используемый в настоящем изобретении, включает любые средства, способные детектировать сигналы. Например, если используют сигналы флуоресценции, то в качестве детекторов можно применять фотодиоды, подходящие для детекции сигналов флуоресценции. Детекция с применением детектора одного типа означает, что детекцию осуществляют, используя детектор, способный детектировать сигнал одного типа, или используя любой канал (т.е. фотодиод) детектора, содержащего несколько каналов (т.е. фотодиодов).The detector used in the present invention includes any means capable of detecting signals. For example, if fluorescence signals are used, then photodiodes suitable for detecting fluorescence signals can be used as detectors. Detection using a single type of detector means that detection is performed using a detector capable of detecting a single type of signal, or using any channel (ie, photodiode) of a detector containing multiple channels (ie, photodiodes).
Согласно одному из воплощений, термин "генерирование сигналов" включает в себя "генерирование или гашение сигналов" и "усиление или ослабление сигналов" от меток.According to one embodiment, the term "signal generation" includes "signal generation or blanking" and "signal amplification or attenuation" from tags.
Стадия (b). Определение присутствия нуклеотидных последовательностей-мишенейStep (b). Determining the presence of target nucleotide sequences
После детекции сигнала присутствие двух нуклеотидных последовательностей-мишеней определяют на основе сигнала, детектируемого на стадии (а).After signal detection, the presence of the two target nucleotide sequences is determined based on the signal detected in step (a).
Присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, определяют на основе сигнала, детектируемого при относительно высокой температуре детекции. Присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, определяют по разнице между сигналом, детектируемым при относительно высокой температуре детекции, и сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции.The presence of a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature is determined based on the signal detected at the relatively high detection temperature. The presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature is determined by the difference between the signal detected at a relatively high detection temperature and the signal detected at a relatively low detection temperature.
Сигналы, используемые для определения присутствия мишени, имеют различные характеристики сигналов с точки зрения детекции сигнала, например, интенсивность сигнала (например, величину RFU (относительных единиц флуоресценции) или, в случае проведения амплификации, величины RFU для конкретного цикла, для выбранных циклов или в конечной точке), форму (или картину) изменения сигнала или значение Ct (threshold cycle - пороговый цикл) либо величины, получаемые в результате математической обработки этих характеристик.The signals used to detect the presence of a target have different signal characteristics in terms of signal detection, such as signal intensity (e.g., RFU (relative fluorescence units) value or, in the case of amplification, RFU values for a particular cycle, for selected cycles, or in end point), the shape (or picture) of the change in the signal or the value of C t (threshold cycle - threshold cycle) or values obtained as a result of mathematical processing of these characteristics.
Согласно одному из воплощений данного изобретения, если кривую амплификации получают с использованием ПЦР в режиме реального времени, то для определения присутствия мишени можно выбирать и использовать различные величины сигналов (или характеристики) из кривой амплификации (интенсивность, значение Ct или данные кривой амплификации).According to one embodiment of the present invention, if an amplification curve is obtained using real-time PCR, then different signal values (or characteristics) from the amplification curve (intensity, C t value, or amplification curve data) can be selected and used to determine the presence of a target.
Характеристики сигнала, полученного при относительно высокой температуре детекции, можно использовать как таковые для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции.The characteristics of a signal obtained at a relatively high detection temperature can be used as such to determine the presence of a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature.
Альтернативно, для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, можно использовать модифицированный сигнал, получаемый в результате математической обработки характеристик сигнала.Alternatively, to determine the presence of a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature, a modified signal resulting from mathematical processing of signal characteristics can be used.
Характеристики сигналов при относительно высокой температуре детекции как таковые и относительно низкой температуре детекции как таковые можно использовать для получения разницы между сигналами при относительно высокой температуре детекции и относительно низкой температуре детекции.The characteristics of the signals at a relatively high detection temperature as such and a relatively low detection temperature as such can be used to obtain the difference between signals at a relatively high detection temperature and a relatively low detection temperature.
Альтернативно, один или оба сигнала при относительно высокой температуре детекции и относительно низкой температуре детекции можно модифицировать, проводя математическую обработку характеристик сигнала, и использовать для получения разницы между сигналами при относительно высокой температуре детекции и относительно низкой температуре детекции.Alternatively, one or both signals at a relatively high detection temperature and a relatively low detection temperature can be modified by mathematical processing of the signal characteristics and used to obtain the difference between the signals at a relatively high detection temperature and a relatively low detection temperature.
Согласно одному из воплощений, термин "сигнал" в сочетании с фразой "сигналы, детектируемые при относительно высокой температуре детекции и относительно низкой температуре детекции" включает в себя не только сигнал, получаемый при температуре детекции как таковой, но также и модифицированный сигнал, получаемый в результате математической обработки данного сигнала.According to one embodiment, the term "signal" in combination with the phrase "signals detected at a relatively high detection temperature and a relatively low detection temperature" includes not only the signal obtained at the detection temperature per se, but also the modified signal obtained in the result of mathematical processing of this signal.
Согласно одному из воплощений, если проводят математическую обработку, то характеристики сигнала должны представлять собой характеристики, легко поддающиеся математической обработке. В конкретном воплощении математическая обработка включает вычисление (например, операции сложения, умножения, вычитания и деления), проводимое в отношении сигналов, или получение других величин на основе сигналов. Сигналы, используемые для определения присутствия нуклеотидных последовательностей-мишеней по настоящему изобретению обычно представляют собой значимый сигнал. Другими словами, эти сигналы представляют собой сигнал, который генерируется в зависимости от присутствия нуклеотидных последовательностей-мишеней. Вместе с тем, если рассчитывают разницу между сигналом, детектируемым при относительно высокой температуре детекции, и сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции, то для расчета такой разницы можно использовать незначимый сигнал, такой как фоновые сигналы. В этом отношении следует понимать, что сигналы, используемые для определения присутствия нуклеотидных последовательностей-мишеней, охватывают не только значимые сигналы, но также и незначимые сигналы, при условии, что они могут быть использованы для расчета данной разницы или включены в способ определения.According to one of the embodiments, if mathematical processing is carried out, then the characteristics of the signal should be characteristics that can be easily mathematically processed. In a particular embodiment, mathematical processing includes calculation (eg, addition, multiplication, subtraction, and division operations) performed on the signals, or deriving other quantities from the signals. The signals used to determine the presence of the target nucleotide sequences of the present invention usually represent a significant signal. In other words, these signals are a signal that is generated depending on the presence of target nucleotide sequences. However, if the difference between a signal detected at a relatively high detection temperature and a signal detected at a relatively low detection temperature is calculated, then an insignificant signal such as background signals can be used to calculate such a difference. In this regard, it should be understood that the signals used to determine the presence of target nucleotide sequences cover not only significant signals, but also non-significant signals, provided that they can be used to calculate this difference or included in the method of determination.
Согласно одному из воплощений, значимость детектируемых сигналов можно определить, используя пороговое значение. Например, пороговое значение предварительно задают на основании отрицательного контроля, учитывая фоновые сигналы детектора, чувствительность или используемую метку, а затем можно определять значимость сигналов от образцов.According to one embodiment, the significance of the detected signals can be determined using a threshold value. For example, a threshold value is pre-set based on a negative control, considering detector background signals, sensitivity, or label used, and then the significance of the signals from the samples can be determined.
Если сигнал (т.е. значимый сигнал) детектируется при относительно высокой температуре детекции, то это означает, что нуклеотидная последовательность-мишень, имеющая относительно высокую температуру детекции, присутствует.If a signal (ie, a significant signal) is detected at a relatively high detection temperature, this means that a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature is present.
Незначимый сигнал также может быть представлен в данном описании выражением "отсутствие сигнала" или "отсутствие детекции сигнала".A non-significant signal can also be represented herein by "no signal" or "no signal detected".
Использованный в данном описании термин "на основе сигнала" в сочетании с определением присутствия нуклеотидных последовательностей-мишеней означает, что присутствие нуклеотидных последовательностей-мишеней определяют непосредственно или опосредованно, используя или модифицируя сигналы, генерируемые от средств генерации сигнала, в том числе используя численные значения для сигналов или их модифицированных вариантов, используя присутствие/отсутствие сигналов и сравнивая сигнал с порогом. Не подразумевается никакого различия между терминами "на основе сигнала" и "с использованием сигнала", и эти термины будут применены взаимозаменяемо.As used herein, the term "signal-based" in conjunction with determining the presence of target nucleotide sequences means that the presence of target nucleotide sequences is determined directly or indirectly using or modifying signals generated from signal generating means, including using numerical values for signals or their modified variants, using the presence/absence of signals and comparing the signal with a threshold. No distinction is intended between the terms "signal-based" and "using a signal" and the terms will be used interchangeably.
Использованный в данном описании термин "определение на основе сигнала" со ссылкой на определение присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, может включать определение присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, с учетом значимости сигнала, детектируемого при относительно высокой температуре детекции.As used herein, the term "signal-based determination" with reference to determining the presence of a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature may include determining the presence of a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature, given the significance of the signal detected at a relatively high detection temperature. high temperature detection.
Согласно данному изобретению присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, определяют на основе сигнала, детектируемого при относительно высокой температуре детекции, и сигнала, детектируемого при относительно низкой температуре детекции.According to the present invention, the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature is determined based on a signal detected at a relatively high detection temperature and a signal detected at a relatively low detection temperature.
Если сигнал детектируют при относительно низкой температуре детекции, то указанный сигнал как таковой не позволяет определить присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции. Причина этого заключается в том, что при относительно низкой температуре детекции может детектироваться сигнал для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции.If a signal is detected at a relatively low detection temperature, then said signal as such does not allow the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature to be detected. The reason for this is that at a relatively low detection temperature, a signal for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature can be detected.
Данный признак настоящего изобретения относится к использованию сигнала, детектируемого при относительно высокой температуре детекции, для анализа сигнала, детектируемого при относительно низкой температуре детекции.This feature of the present invention relates to the use of a signal detected at a relatively high detection temperature to analyze a signal detected at a relatively low detection temperature.
Интересно отметить, что авторы настоящего изобретения обнаружили, что если сигналы, указывающие на присутствие одной нуклеотидной последовательности-мишени, детектируют в одном реакционном сосуде при двух предварительно заданных температурах детекции, то имеет место изменение сигнала согласно определенной(ому) закономерности (правилу).It is interesting to note that the present inventors have found that if signals indicating the presence of one target nucleotide sequence are detected in the same reaction vessel at two predetermined detection temperatures, then the signal changes according to a certain pattern (rule).
Например, изменение сигналов между сигналом, детектируемым при относительно высокой температуре детекции, и сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции, для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, демонстрирует определенную(ое) закономерность (правило). Например, интенсивности этих сигналов могут быть идентичными или по существу идентичными либо интенсивности этих сигналов могут быть разными, но в конкретном диапазоне при двух температурах детекции.For example, a signal change between a signal detected at a relatively high detection temperature and a signal detected at a relatively low detection temperature for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature exhibits a certain pattern (rule). For example, the intensities of these signals may be identical or substantially identical, or the intensities of these signals may be different but within a specific range at the two detection temperatures.
Данный признак настоящего изобретения относится к применению этих наблюдений для детекции нуклеотидных последовательностей-мишеней.This feature of the present invention relates to the use of these observations for the detection of target nucleotide sequences.
Поскольку сигналы для нуклеотидной последовательности-мишени в одном реакционном сосуде детектируют, используя только различие в температурах детекции (например, без какого-либо изменения количества мишени или без каких-либо изменений условий, относящихся к буферной системе), то имеется определенная(ое) закономерность (правило) изменения сигналов для этих двух температур детекции. Беря за основу эту определенную(ое) закономерность (правило) изменения сигналов, сигнал, детектируемый при относительно высокой температуре детекции, можно использовать для анализа сигнала, детектируемого при относительно низкой температуре детекции.Since the signals for the target nucleotide sequence in the same reaction vessel are detected using only the difference in detection temperatures (for example, without any change in the amount of target or without any changes in the conditions related to the buffer system), there is a certain pattern (rule) signal changes for these two detection temperatures. Based on this particular signal pattern (rule), a signal detected at a relatively high detection temperature can be used to analyze a signal detected at a relatively low detection temperature.
Согласно одному из воплощений способ по настоящему изобретению осуществляют в условиях, которые допускают наличие определенной(ого) закономерности (правила) изменения сигналов для нуклеотидной последовательности-мишени в случае двух температур детекции.According to one of the embodiments of the method of the present invention is carried out under conditions that allow the existence of a certain pattern (rule) of signal changes for the target nucleotide sequence in the case of two detection temperatures.
Согласно одному из воплощений присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, определяют способом, при котором сигнал, детектируемый при относительно низкой температуре детекции, анализируют с использованием сигнала, детектируемого при относительно высокой температуре детекции, чтобы проверить, содержит ли сигнал, детектируемый при относительно низкой температуре детекции, сигнал, предоставляемый нуклеотидной последовательностью-мишенью, имеющей относительно низкую температуру детекции.According to one embodiment, the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature is determined by a method in which a signal detected at a relatively low detection temperature is analyzed using a signal detected at a relatively high detection temperature to check whether the signal contains a signal detected at a relatively high detection temperature. at a relatively low detection temperature, a signal provided by a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature.
Для анализа сигнала, детектируемого при относительно низкой температуре детекции, с использованием сигнала, детектируемого при относительно высокой температуре детекции, можно получить значение разницы между сигналом, детектируемым при относительно высокой температуре детекции, и сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции, и затем провести ее анализ.In order to analyze a signal detected at a relatively low detection temperature using a signal detected at a relatively high detection temperature, a difference value between a signal detected at a relatively high detection temperature and a signal detected at a relatively low detection temperature can be obtained, and then carried out analysis.
Согласно одному из воплощений данного изобретения, величина (или вклад) сигнала, поступающего от нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, в сигнале, детектируемом при относительно низкой температуре детекции, может быть получена в соответствии с принципом использования сигнала при относительно высокой температуре детекции.According to one embodiment of the present invention, the magnitude (or contribution) of a signal from a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature to a signal detected at a relatively low detection temperature can be obtained according to the principle of using a signal at a relatively high temperature detection.
Согласно одному из воплощений, присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, определяют по разнице между сигналом, детектируемым при относительно высокой температуре детекции, и сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции.In one embodiment, the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature is determined by the difference between a signal detected at a relatively high detection temperature and a signal detected at a relatively low detection temperature.
Например, (1) если в образце присутствует только нуклеотидная последовательность-мишень, имеющая относительно высокую температуру детекции, то сигнал детектируют как при относительно высокой температуре детекции, так и при относительно низкой температуре детекции. Сигнал, детектируемый при относительно высокой температуре детекции, скорее всего будет отличаться от сигнала, детектируемого при относительно низкой температуре детекции. Такая разница, вполне вероятно, будет находиться в пределах конкретного диапазона, по той причине, что все условия, за исключением температур детекции, являются общими. Если рассчитанная для образца разница попадает в пределы конкретного диапазона, то сигнал, детектируемый при относительно низкой температуре детекции, будет обусловлен только нуклеотидной последовательностью-мишенью, имеющей относительно высокую температуру детекции. Другими словами, можно сделать заключение, что нуклеотидная последовательность-мишень, имеющая относительно низкую температуру детекции, в образце отсутствует.For example, (1) if only a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature is present in the sample, then a signal is detected at both the relatively high detection temperature and the relatively low detection temperature. A signal detected at a relatively high detection temperature is likely to be different from a signal detected at a relatively low detection temperature. Such a difference is likely to be within a specific range, for the reason that all conditions, with the exception of detection temperatures, are common. If the difference calculated for the sample falls within a specific range, then the signal detected at a relatively low detection temperature will be due to only the target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature. In other words, it can be concluded that the target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature is absent from the sample.
(2) Если в образце присутствуют как нуклеотидная последовательность-мишень, имеющая относительно высокую температуру детекции, так и нуклеотидная последовательность-мишень, имеющая относительно низкую температуру детекции, то сигналы детектируют как при относительно высокой температуре детекции, так и при относительно низкой температуре детекции. Разница между этими сигналами становится более заметной, чем разница в случае (1), поскольку присутствует нуклеотидная последовательность-мишень, имеющая относительно низкую температуру детекции. Используя эту разницу, можно определить присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции.(2) If both a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature and a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature are present in the sample, signals are detected at both the relatively high detection temperature and the relatively low detection temperature. The difference between these signals becomes more pronounced than the difference in case (1) because there is a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature. Using this difference, the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature can be determined.
(3) Если в образце присутствует нуклеотидная последовательность-мишень, имеющая относительно низкую температуру детекции, то сигнал детектируется при относительно низкой температуре детекции и не детектируется при относительно высокой температуре детекции. Отсутствие детекции сигнала при относительно высокой температуре детекции указывает на отсутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, поэтому можно считать, что сигнал, детектируемый при относительно низкой температуре детекции, обусловлен нуклеотидной последовательностью-мишенью, имеющей относительно низкую температуру детекции, на основании чего можно определить присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции.(3) If a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature is present in the sample, then a signal is detected at a relatively low detection temperature and not detected at a relatively high detection temperature. The absence of signal detection at a relatively high detection temperature indicates the absence of a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature, so it can be considered that a signal detected at a relatively low detection temperature is due to a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature based on which can determine the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature.
Альтернативно, в случае (3) такую разницу можно получить, используя незначимый сигнал (например, фоновый сигнал), детектируемый при относительно высокой температуре детекции. В этом альтернативном варианте разница вполне вероятно будет заметно отличаться от разницы в случае (1), на основании чего можно определить присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции.Alternatively, in case (3), such a difference can be obtained using an insignificant signal (eg background signal) detected at a relatively high detection temperature. In this alternative, the difference is likely to be markedly different from the difference in case (1), based on which the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature can be determined.
Разница между сигналами, детектируемыми при температурах детекции, может быть получена в соответствии с широким разнообразием подходов.The difference between signals detected at detection temperatures can be obtained according to a wide variety of approaches.
Использованный в данном описании термин "разница" в сочетании с выражением "на основе (или с использованием) разницы между сигналами" включает в себя не только разницу, получаемую в результате математической обработки сигналов как таковых или модифицированных сигналов, но также разницу, обусловленную присутствием и отсутствием сигналов. Например, эта разница может быть получена путем вычисления соотношения между сигналом, детектируемым при относительно высокой температуре детекции, и сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции, или путем вычитания этих сигналов. Альтернативно, эту разницу можно получить, модифицируя сигнал при температуре детекции и сравнивая его с сигналом при другой температуре детекции. Разница между сигналом, детектируемым при относительно высокой температуре детекции, и сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции, может быть выражена различным образом. Например, такую разницу можно выразить в виде численных значений, в виде наличия/отсутствия сигнала или в виде графика с характеристиками сигнала.As used herein, the term "difference" in combination with the expression "based on (or using) the difference between the signals" includes not only the difference resulting from the mathematical processing of signals as such or modified signals, but also the difference due to the presence and lack of signals. For example, this difference can be obtained by calculating the ratio between the signal detected at a relatively high detection temperature and the signal detected at a relatively low detection temperature, or by subtracting these signals. Alternatively, this difference can be obtained by modifying the signal at the detection temperature and comparing it with the signal at a different detection temperature. The difference between a signal detected at a relatively high detection temperature and a signal detected at a relatively low detection temperature can be expressed in various ways. For example, such a difference can be expressed as numerical values, as presence/absence of a signal, or as a graph with signal characteristics.
Согласно одному из воплощений данного изобретения разница между сигналом, детектируемым при относительно высокой температуре детекции, и сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции, включает разницу, получаемую в результате математической обработки сигнала, детектируемого при относительно высокой температуре детекции, и сигнала, детектируемого при относительно низкой температуре детекции.According to one embodiment of the present invention, the difference between a signal detected at a relatively high detection temperature and a signal detected at a relatively low detection temperature includes the difference obtained by mathematical processing of a signal detected at a relatively high detection temperature and a signal detected at a relatively low temperature detection.
Согласно одному из воплощений данного изобретения, если сигнал не детектируется при относительно высокой температуре детекции, то определение присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, проводят на основе сигнала, детектируемого при относительно низкой температуре детекции, с учетом отсутствия детекции сигнала при относительно высокой температуре детекции. Это воплощение относится к тому, что использование разницы, обусловленной присутствием и отсутствием сигналов при двух температурах детекции, позволяет провести определение присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции.According to one embodiment of the present invention, if a signal is not detected at a relatively high detection temperature, then the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature is determined based on the signal detected at a relatively low detection temperature, taking into account the absence of signal detection at a relatively low detection temperature. high temperature detection. This embodiment refers to the fact that the use of the difference due to the presence and absence of signals at two detection temperatures, allows the determination of the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature.
Согласно одному из воплощений, фоновый сигнал, детектируемый при относительно высокой температуре детекции, можно принимать за "0" или "1" для расчета разницы.According to one embodiment, the background signal detected at a relatively high detection temperature can be taken as "0" or "1" to calculate the difference.
Согласно одному из воплощений, если в ходе вычисления получают отрицательное значение, то его преобразуют в абсолютную величину и используют, получая разницу.According to one of the embodiments, if a negative value is obtained during the calculation, then it is converted to an absolute value and used to obtain the difference.
Согласно одному из воплощений данного изобретения, сигнал для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, является расчетным параметром для анализа сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции.According to one embodiment of the present invention, a signal for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature is a predictive parameter for analyzing a signal for a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature.
Сигналы для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, и разница между сигналом, детектируемым при относительно высокой температуре детекции, и сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции, могут иметь разные размерности или единицы измерения либо могут иметь одинаковые размерности или единицы измерения.Signals for determining the presence of a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature and the difference between a signal detected at a relatively high detection temperature and a signal detected at a relatively low detection temperature may have different dimensions or units, or may have the same dimensions or units.
Использованный в данном описании термин "определение на основе разницы" включает в себя определение исходя из наличия/отсутствия разницы, определение исходя из величины или диапазона для разницы с численным значением и определение исходя из графического представления этой разницы. Кроме того, "определение на основе разницы" включает получение какой-либо величины (например, Ct) для нуклеиновой кислоты-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, на основе данной разницы.As used herein, the term "difference-based determination" includes determination based on the presence/absence of a difference, determination based on a value or range for a difference with a numerical value, and determination based on a graphical representation of that difference. In addition, "determining based on the difference" includes deriving a value (eg, C t ) for a target nucleic acid having a relatively low detection temperature based on the difference.
Использованный в данном описании термин "на основе разницы" в сочетании с определением присутствия нуклеотидных последовательностей-мишеней означает, что присутствие нуклеотидных последовательностей-мишеней определяют непосредственно или опосредованно, используя или модифицируя разницу между сигналами, в том числе используя численные значения для разницы или ее модифицированных вариантов, используя наличие/отсутствие сигналов и сравнивая разницу с порогом. Не подразумевается никакого различия между терминами "на основе разницы" и "с использованием разницы", и эти термины будут применены взаимозаменяемо.As used herein, the term “difference-based” in conjunction with determining the presence of target nucleotide sequences means that the presence of target nucleotide sequences is determined directly or indirectly using or modifying the difference between signals, including using numerical values for the difference or its modified options using the presence/absence of signals and comparing the difference with a threshold. No distinction is intended between the terms "based on the difference" and "using the difference" and these terms will be used interchangeably.
Математическую обработку сигналов можно выполнить, используя различные методы вычислений и их модификации.Mathematical processing of signals can be performed using various calculation methods and their modifications.
Согласно одному из воплощений данного изобретения математическая обработка сигналов для получения разницы между сигналами представляет собой вычисление отношения сигнала, детектируемого при относительно низкой температуре детекции, к сигналу, детектируемому при относительно высокой температуре детекции. Согласно одному из воплощений данного изобретения математическая обработка сигналов для получения разницы между сигналами представляет собой вычисление отношения сигнала, детектируемого при относительно высокой температуре детекции, к сигналу, детектируемому при относительно низкой температуре детекции.According to one embodiment of the present invention, mathematical processing of signals to obtain a difference between signals is the calculation of the ratio of the signal detected at a relatively low detection temperature to the signal detected at a relatively high detection temperature. According to one embodiment of the present invention, mathematical processing of signals to obtain a difference between signals is the calculation of the ratio of the signal detected at a relatively high detection temperature to the signal detected at a relatively low detection temperature.
Использованный в данном описании термин "отношение" означает зависимость между двумя числами. Используя это отношение, можно определить присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции. Если отношение сигнала, детектируемого при относительно низкой температуре детекции, к сигналу, детектируемому при относительно высокой температуре детекции, является значащим, то называют индикатором присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции. Например, если отношение интенсивности сигнала в конечной точке, детектируемого при относительно низкой температуре детекции, к интенсивности сигнала в конечной точке, детектируемого при относительно высокой температуре детекции, является значащим (например, возрастание интенсивности в конечной точке), то это указывает на присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции.Used in this description, the term "relationship" means the relationship between two numbers. Using this ratio, the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature can be determined. If the ratio of the signal detected at a relatively low detection temperature to the signal detected at a relatively high detection temperature is significant, then it is called an indicator of the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature. For example, if the ratio of the intensity of the signal at the endpoint detected at a relatively low detection temperature to the intensity of the signal at the endpoint detected at a relatively high detection temperature is significant (for example, an increase in intensity at the endpoint), then this indicates the presence of a nucleotide sequence target having a relatively low detection temperature.
Математическую обработку можно выполнить по-разному.Mathematical processing can be done in different ways.
Математическую обработку можно выполнить с применением ЭВМ. Например, сигналы можно подвергнуть математической обработке в процессоре, находящемся в детекторе или в устройстве для проведения ПЦР в режиме реального времени. Альтернативно, математическую обработку сигналов можно выполнить вручную, в частности, в соответствии с предварительно заданным алгоритмом.Mathematical processing can be performed using a computer. For example, the signals can be mathematically processed in a processor in a detector or in a real-time PCR device. Alternatively, the mathematical signal processing can be performed manually, in particular according to a predetermined algorithm.
Согласно одному из воплощений данного изобретения, в зависимости от подходов к получению разницы, для анализа того, является ли полученное значение разницы указанием на присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, может быть применено понятие порога. Например, порог задают предварительно с учетом разности, полученной для стандартного образца, содержащего нуклеиновую кислоту-мишень, имеющую относительно высокую температуру детекции, и нуклеиновую кислоту-мишень, имеющую относительно низкую температуру детекции. Для определения порога можно дополнительно учитывать отрицательный контроль, чувствительность или вид используемой метки.According to one of the embodiments of the present invention, depending on the approaches to obtaining a difference, the concept of a threshold can be applied to analyze whether the obtained difference value is indicative of the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature. For example, the threshold is predetermined considering the difference obtained for a standard sample containing a target nucleic acid having a relatively high detection temperature and a target nucleic acid having a relatively low detection temperature. To determine the threshold, you can additionally take into account the negative control, sensitivity or type of label used.
Согласно одному из воплощений данного изобретения, в зависимости от подходов к получению разницы, присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, можно определить, используя значение полученной разницы как таковой. Например, сигнал при относительно высокой температуре детекции, можно умножить на значение порога, а затем можно получить разницу между сигналом после умножения и сигналом при относительно низкой температуре детекции. В частности, порог задают предварительно с учетом разницы, полученной для стандартного образца, содержащего нуклеиновую кислоту-мишень, имеющую относительно высокую температуру детекции, и нуклеиновую кислоту-мишень, имеющую относительно низкую температуру детекции.According to one of the embodiments of the present invention, depending on the approaches to obtaining a difference, the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature can be determined using the value of the obtained difference as such. For example, a signal at a relatively high detection temperature can be multiplied by a threshold value, and then the difference between the signal after multiplication and the signal at a relatively low detection temperature can be obtained. Specifically, the threshold is predetermined in view of the difference obtained between a standard sample containing a target nucleic acid having a relatively high detection temperature and a target nucleic acid having a relatively low detection temperature.
Согласно одному из воплощений данного изобретения порог задается пользователем или автоматически.According to one embodiment of the present invention, the threshold is set by the user or automatically.
В одном из воплощений, если разница между сигналами при относительно высокой температуре детекции и относительно низкой температуре детекции для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, увеличивается, то это с большой долей вероятности снизит ошибки детекции при использовании порога.In one embodiment, if the difference between signals at a relatively high detection temperature and a relatively low detection temperature for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature is increased, then this is more likely to reduce detection errors when thresholding is used.
В одном из воплощений, если сигналы, предоставляемые нуклеотидной последовательностью-мишенью, имеющей относительно высокую температуру детекции, проявляют закономерность (правило), демонстрирующую(ее) небольшую разницу или отсутствие какой-либо разницы для двух температур детекции, то сигнал, детектируемый при относительно высокой температуре детекции, можно использовать без дополнительных модификаций как при вычислении разницы, так и при определении присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, с использованием данной разности.In one embodiment, if the signals provided by a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature exhibit a pattern (rule) showing little or no difference for the two detection temperatures, then the signal detected at the relatively high detection temperature can be used without further modification both in calculating the difference and in determining the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature using this difference.
В конкретном воплощении, если сигналы проявляют закономерность (правило), демонстрирующую(ее) разницу в пределах конкретного диапазона, то сигнал при относительно высокой температуре детекции может быть подвергнут модификации, отражающей разницу при определении присутствия нуклеотидной последовательности-мишени.In a specific embodiment, if the signals show a pattern (rule) showing a difference within a specific range, then the signal at a relatively high detection temperature can be modified to reflect the difference in determining the presence of the target nucleotide sequence.
Референсное значение представляет собой значение, отражающее закономерность (правило) изменения сигнала при разных температурах.The reference value is a value that reflects the pattern (rule) of signal changes at different temperatures.
Согласно одному из воплощений данного изобретения референсное значение представляет собой значение, отражающее закономерность (правило) изменения в сигналах при двух разных температурах детекции для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции.According to one of the embodiments of the present invention, the reference value is a value reflecting the pattern (rule) of change in signals at two different detection temperatures for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature.
Например, если сигналы при относительно высокой температуре детекции и относительно низкой температуре детекции для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, являются идентичными или по существу идентичными, и величину разницы в сигналах при этих двух температурах детекции рассчитывают путем вычитания сигналов, то референсное значение для сигналов при этих двух температурах детекции для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, равно "0". В другом примере, если величину разницы в сигналах при двух температурах детекции рассчитывают путем деления сигналов, то референсное значение для сигналов при этих двух температурах детекции для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, равно "1".For example, if the signals at a relatively high detection temperature and a relatively low detection temperature for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature are identical or substantially identical, and the amount of difference in signals at the two detection temperatures is calculated by subtracting the signals, then the reference the value for signals at these two detection temperatures for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature is "0". In another example, if the magnitude of the difference in signals at two detection temperatures is calculated by dividing the signals, then the reference value for signals at the two detection temperatures for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature is "1".
Вместе с тем, если сигналы при относительно высокой температуре детекции и относительно низкой температуре детекции для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, отличаются друг от друга, и величину разницы в этих двух сигналах рассчитывают путем вычитания сигналов, то референсное значение является положительной величиной или отрицательной величиной, отличной от "0", для сигналов при этих двух температурах детекции для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции. В другом примере, если величину разницы в сигналах при двух температурах детекции рассчитывают путем деления сигналов, то референсное значение будет выше или ниже 1, кроме "1", для сигналов при этих двух температурах детекции для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции.However, if the signals at a relatively high detection temperature and a relatively low detection temperature for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature differ from each other, and the amount of difference in the two signals is calculated by subtracting the signals, then the reference value is positive. a value or a negative value other than "0" for signals at these two detection temperatures for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature. In another example, if the magnitude of the difference in signals at two detection temperatures is calculated by dividing the signals, then the reference value will be greater than or less than 1 other than "1" for signals at the two detection temperatures for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature .
В конкретном воплощении, если сигналы при относительно высокой температуре детекции и относительно низкой температуре детекции для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, отличаются друг от друга, то величина разницы в этих двух сигналах попадает в конкретный диапазон.In a specific embodiment, if the signals at a relatively high detection temperature and a relatively low detection temperature for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature differ from each other, then the magnitude of the difference in the two signals falls within a specific range.
В конкретном воплощении, разница в сигналах при относительно высокой температуре детекции и относительно низкой температуре детекции, предоставляемая нуклеотидной последовательностью-мишенью, имеющей относительно высокую температуру детекции, может быть выражена через референсное значение. В конкретном воплощении референсное значение в случае, когда сигналы при относительно высокой температуре детекции и относительно низкой температуре детекции, предоставляемые нуклеотидной последовательностью-мишенью, имеющей относительно высокую температуру детекции, отличаются друг от друга, может отличаться более чем на 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5%, 10%, 12%, 15%, 20% или 30% по сравнению с референсным значением в случая, когда эти два сигнала являются одинаковыми.In a particular embodiment, the difference in signals at a relatively high detection temperature and a relatively low detection temperature provided by a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature can be expressed in terms of a reference value. In a specific embodiment, the reference value in the case where signals at a relatively high detection temperature and a relatively low detection temperature provided by a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature differ from each other may differ by more than 0.5%, 1%. , 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7 .5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5%, 10%, 12%, 15%, 20% or 30% compared to the reference value when the two signals are the same.
В одном из воплощений, если разница между сигналами при относительно высокой температуре детекции и относительно низкой температуре детекции для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, увеличивается, то большим преимуществом будет уменьшение ошибок детекции при определении присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, путем использования референсного значения для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции.In one embodiment, if the difference between the signals at a relatively high detection temperature and a relatively low detection temperature for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature is increased, then it would be a great advantage to reduce detection errors when determining the presence of a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature. low detection temperature, by using a reference value for the target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature.
В конкретном воплощении, референсное значение для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, можно использовать при определении присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, если референсное значение для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, рассчитанное, исходя из сигналов при этих двух температурах детекции, отличается более чем на 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5%, 10%, 12%, 15%, 20% или 30% по сравнению с референсным значением для случая, когда эти два сигнала являются одинаковыми.In a particular embodiment, a reference value for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature may be used in determining the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature if the reference value for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature calculated , based on signals at these two detection temperatures, differs by more than 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5% , 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5%, 10%, 12%, 15%, 20% or 30% compared to the reference value for the case when the two signals are the same.
Согласно одному из воплощений, если сравнение проводят для определения возможности использования референсного значения, то это референсное значение рассчитывают путем деления сигналов. Согласно одному из воплощений способ вычисления референсного значения для определения возможности использования референсного значения может быть одним и тем же способом вычисления референсного значения для детекции нуклеотидной последовательности-мишени или отличаться от него.According to one of the embodiments, if the comparison is carried out to determine the possibility of using a reference value, then this reference value is calculated by dividing the signals. According to one of the embodiments, the method of calculating the reference value to determine the possibility of using the reference value may be the same method of calculating the reference value for detection of the target nucleotide sequence or different from it.
Согласно одному из воплощений референсное значение используют для определения нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, на основе разницы между сигналом, детектируемым при относительно высокой температуре детекции, и сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции. В частности, референсное значение относится к нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции.In one embodiment, the reference value is used to determine a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature based on the difference between a signal detected at a relatively high detection temperature and a signal detected at a relatively low detection temperature. In particular, the reference value refers to a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature.
Согласно одному из воплощений данного изобретения референсное значение можно применять для анализа возможности указания полученной разницы на присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции.According to one of the embodiments of the present invention, the reference value can be used to analyze whether the obtained difference indicates the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature.
Согласно одному из воплощений данного изобретения референсное значение можно применять для получения разницы между сигналом при относительно высокой и сигналом при относительно низкой температуре детекции. Например, значение сигнала при относительно высокой температуре детекции можно умножить или поделить на референсное значение для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, и затем можно получить разницу между помноженным или поделенным значением сигнала и значением сигнала при относительно низкой температуре детекции. В другом примере, значение сигнала при относительно низкой температуре детекции можно умножить или поделить на референсное значение для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, и затем можно получить разницу между помноженным или поделенным значением сигнала и значением сигнала при относительно высокой температуре детекции.According to one embodiment of the present invention, the reference value can be used to obtain the difference between a signal at a relatively high and a signal at a relatively low detection temperature. For example, a signal value at a relatively high detection temperature can be multiplied or divided by a reference value for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature, and the difference between the multiplied or divided signal value and the signal value at a relatively low detection temperature can then be obtained. In another example, a signal value at a relatively low detection temperature can be multiplied or divided by a reference value for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature, and the difference between the multiplied or divided signal value and the signal value at a relatively high detection temperature can then be obtained.
Согласно одному из воплощений данного изобретения референсное значение используют для определения порога. Согласно одному из воплощений данного изобретения референсное значение используют в качестве порога с модификацией или без модификации данного значения. Термины "порог" и "референсное значение", использованные в данном описании для определения присутствия нуклеотидных последовательностей-мишеней посредством анализа разницы между сигналами, могут иметь одинаковое значение или смысл.According to one embodiment of the present invention, the reference value is used to determine the threshold. According to one of the embodiments of the present invention, the reference value is used as a threshold with or without modification of this value. The terms "threshold" and "reference value" used herein to determine the presence of target nucleotide sequences by analyzing the difference between signals may have the same meaning or meaning.
Альтернативно, если референсное значение применяют для получения разницы между сигналом при относительно высокой и сигналом при относительно низкой температуре детекции, то можно использовать дополнительное значение порога для определения значимости данной разницы, т.е. для определения возможности указания данной разницы на присутствие нуклеиновой кислоты-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции.Alternatively, if the reference value is used to obtain the difference between the signal at a relatively high and the signal at a relatively low detection temperature, then an additional threshold value can be used to determine the significance of this difference, i. to determine whether this difference can be indicated by the presence of a target nucleic acid having a relatively low detection temperature.
Согласно одному из воплощений, если присутствует нуклеотидная последовательность-мишень, имеющая относительно высокую температуру детекции, то референсное значение используют для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции.In one embodiment, if a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature is present, then the reference value is used to determine the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature.
Случай, при котором присутствует нуклеотидная последовательность-мишень, имеющая относительно высокую температуру детекции, включает случай, при котором детектируют значимый сигнал, указывающий на присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции.A case in which a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature is present includes a case in which a significant signal is detected indicating the presence of a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature.
Согласно одному из воплощений, если нуклеотидная последовательность-мишень, имеющая относительно высокую температуру детекции, отсутствует, то для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, возможно используют референсное значение.In one embodiment, if a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature is absent, then a reference value may be used to determine the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature.
Случай, при котором отсутствует нуклеотидная последовательность-мишень, имеющая относительно высокую температуру детекции, включает случай, при котором детектируется только сигнал с интенсивностью, аналогичной интенсивности фонового сигнала.A case in which there is no target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature includes a case in which only a signal with an intensity similar to that of the background signal is detected.
Согласно одному из воплощений данного изобретения, для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, в таком способе используют референсное значение, полученное посредством (1) инкубирования нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, со средством генерации сигнала для детекции нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, в другом реакционном сосуде, нежели реакционный сосуд на стадии (а), (2) детекции сигналов как при относительно высокой температуре детекции, так и при относительно низкой температуре детекции и (3) затем получения разницы между сигналом, детектируемым при относительно высокой температуре детекции, и сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции.According to one embodiment of the present invention, in order to determine the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature, such a method uses a reference value obtained by (1) incubating a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature with signal generation means for detecting a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature in a different reaction vessel than the reaction vessel in step (a), (2) detecting signals at both a relatively high detection temperature and a relatively low detection temperature, and (3) then obtaining a difference between a signal detected at a relatively high detection temperature and a signal detected at a relatively low detection temperature.
Согласно одному из воплощений разница между сигналом, детектируемым при относительно высокой температуре детекции, и сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции, полученная выше в пункте (3), представляет собой некоторое значение, и это значение используют в качестве референсного значения с модификацией или без модификации.According to one embodiment, the difference between the signal detected at a relatively high detection temperature and the signal detected at a relatively low detection temperature obtained in (3) above is a value, and this value is used as a reference value with or without modification. modifications.
Согласно одному из воплощений референсное значение может быть получено путем вычисления соотношения между сигналом, детектируемым при относительно высокой температуре детекции, и сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции, или путем вычитания этих сигналов. Согласно одному из воплощений данного изобретения референсное значение получают путем вычисления соотношения между сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции, и сигналом, детектируемым при относительно высокой температуре детекции. Согласно одному из воплощений данного изобретения референсное значение получают путем вычисления соотношения между сигналом, детектируемым при относительно высокой температуре детекции, и сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции.According to one embodiment, the reference value can be obtained by calculating the ratio between the signal detected at a relatively high detection temperature and the signal detected at a relatively low detection temperature, or by subtracting these signals. According to one embodiment of the present invention, the reference value is obtained by calculating the ratio between the signal detected at a relatively low detection temperature and the signal detected at a relatively high detection temperature. According to one embodiment of the present invention, the reference value is obtained by calculating the ratio between the signal detected at a relatively high detection temperature and the signal detected at a relatively low detection temperature.
Согласно одному из воплощений способы вычисления разницы для сигналов от образца и разницы для получения референсного значения могут быть одинаковыми или разными. Например, первый может быть осуществлен путем вычитания этих двух сигналов, а последний путем деления этих двух сигналов. Альтернативно, и первый и последний способы могут быть осуществлены путем деления этих двух сигналов с получением значения отношения.According to one embodiment, the methods for calculating the difference for the signals from the sample and the difference for obtaining the reference value may be the same or different. For example, the former can be done by subtracting the two signals and the latter by dividing the two signals. Alternatively, both the first and last methods can be implemented by dividing the two signals to obtain a ratio value.
Согласно одному из воплощений данного изобретения средства генерации сигнала для получения референсного значения могут быть такими же, как и для детекции нуклеотидной последовательности-мишени.According to one embodiment of the present invention, the means for generating a signal for obtaining a reference value may be the same as for detecting a target nucleotide sequence.
В случае нуклеотидной последовательности-мишени референсные значения могут быть получены в различных реакционных условиях, включая количество компонента (например, нуклеотидной последовательности-мишени, средств генерации сигнала, ферментов или дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP)), pH буфера или продолжительность реакции. Согласно одному из воплощений данного изобретения референсное значение может быть получено в реакционных условиях, достаточных для получения насыщенного сигнала по завершении реакции. Согласно одному из воплощений данного изобретения разница между сигналами, полученными при вычислении референсного значения, лежит в пределах конкретного диапазона, и референсное значение выбирают в пределах этого конкретного диапазона или с указанием на этот конкретный диапазон. Согласно одному из воплощений данного изобретения референсное значение может быть выбрано в соответствии с максимальным или минимальным значением конкретного диапазона или с указанием на максимальное или минимальное значение этого конкретного диапазона. В частности, референсное значение можно модифицировать с учетом стандартной вариации референсных значений, полученных в различных условиях, приемлемых диапазонов ошибок, специфичности или чувствительности.In the case of a target nucleotide sequence, reference values can be obtained under various reaction conditions, including the amount of component (eg, target nucleotide sequence, signal generators, enzymes, or deoxynucleotide triphosphates (dNTPs)), buffer pH, or reaction time. According to one of the embodiments of the present invention, the reference value can be obtained under reaction conditions sufficient to obtain a saturated signal at the end of the reaction. According to one of the embodiments of the present invention, the difference between the signals obtained when calculating the reference value lies within a specific range, and the reference value is selected within this specific range or indicating this specific range. According to one of the embodiments of the present invention, the reference value may be selected in accordance with the maximum or minimum value of a particular range, or indicating the maximum or minimum value of that particular range. In particular, the reference value can be modified to take into account the standard variation of the reference values obtained under different conditions, acceptable error ranges, specificity or sensitivity.
Согласно одному из воплощений данного изобретения референсные значения могут быть получены в одинаковых реакционных условиях, используемых для образца, включая количество компонентов (ферментов или праймеров для амплификации, если они применяются), рН буфера, способ проведения реакции. Согласно одному из воплощений данного изобретения референсные значения могут быть получены с использованием процесса амплификации сигнала одновременно с амплификацией нуклеиновой кислоты или без амплификации нуклеиновой кислоты.According to one embodiment of this invention, reference values can be obtained under the same reaction conditions used for the sample, including the amount of components (enzymes or amplification primers, if used), buffer pH, reaction method. According to one embodiment of the present invention, reference values can be obtained using a signal amplification process concurrently with nucleic acid amplification or without nucleic acid amplification.
Согласно одному из воплощений данного изобретения, если имеется значимое различие между референсным значением и разницей, полученной для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, то тогда считают, что нуклеотидная последовательность-мишень, имеющая относительно низкую температуру детекции, присутствует. Референсное значение может быть выражено с использованием величины такого же типа, как и разница, полученная для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции (например, как соотношение значений интенсивностей сигналов в конечной точке).According to one embodiment of the present invention, if there is a significant difference between the reference value and the difference obtained to determine the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature, then the target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature is considered to be present. The reference value can be expressed using the same type of value as the difference obtained to determine the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature (eg, as a ratio of endpoint signal intensities).
В конкретном примере, если соотношение значения интенсивности сигнала в конечной точке, детектируемого при относительно высокой температуре детекции, и значения интенсивности сигнала в конечной точке, детектируемого при относительно низкой температуре детекции, составляет 1,8, а референсное значение составляет 1,1, то можно сделать заключение, что имеется значимое различие между референсным значением и разницей, полученной для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции. Это указывает на присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции.In a specific example, if the ratio of the signal intensity value at the end point detected at a relatively high detection temperature and the signal intensity value at the end point detected at a relatively low detection temperature is 1.8, and the reference value is 1.1, then you can conclude that there is a significant difference between the reference value and the difference obtained to determine the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature. This indicates the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature.
Согласно одному из воплощений, если разница для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, равна референсному значению или превышает его, то тогда считают, что нуклеотидная последовательность-мишень, имеющая относительно низкую температуру детекции, присутствует.According to one embodiment, if the difference to determine the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature is equal to or greater than the reference value, then the target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature is considered to be present.
Согласно одному из воплощений, если разница для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, является такой же, как референсное значение или меньше его, то тогда считают, что нуклеотидная последовательность-мишень, имеющая относительно низкую температуру детекции, присутствует.In one embodiment, if the difference to determine the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature is the same as or less than the reference value, then the target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature is considered to be present.
Альтернативно, референсное значение можно использовать для расчета разницы между сигналом, детектируемым при относительно высокой температуре детекции, и сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции. Например, разницу для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, рассчитывают таким образом, что сигнал (например, в RFU), детектируемый при относительно высокой температуре детекции, умножают (или делят) на референсное значение для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, и затем результат умножения (или деления) вычитают из сигнала (например, в RFU), детектируемого при относительно низкой температуре детекции. Если разница имеет значение больше (или меньше) "0" или некоторого предварительно заданного значения, то можно считать, что нуклеотидная последовательность-мишень, имеющая относительно низкую температуру детекции, присутствует.Alternatively, the reference value can be used to calculate the difference between a signal detected at a relatively high detection temperature and a signal detected at a relatively low detection temperature. For example, the difference to determine the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature is calculated such that the signal (for example, in RFU) detected at a relatively high detection temperature is multiplied (or divided) by the reference value for the target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature, and then the result of the multiplication (or division) is subtracted from the signal (eg, in RFU) detected at a relatively low detection temperature. If the difference is greater than (or less than) "0" or some predetermined value, then a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature can be considered to be present.
В другом примере, разницу для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, рассчитывают таким образом, что сигнал (например, в RFU), детектируемый при относительно низкой температуре детекции, умножают (или делят) на референсное значение для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, и затем результат умножения (или деления) вычитают из сигнала (например, в RFU), детектируемого при относительно высокой температуре детекции. Если разница имеет значение больше (или меньше) "0" или некоторого предварительно заданного значения, то можно считать, что нуклеотидная последовательность-мишень, имеющая относительно низкую температуру детекции, присутствует.In another example, the difference to determine the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature is calculated such that the signal (for example, in RFU) detected at a relatively low detection temperature is multiplied (or divided) by the reference value for the nucleotide sequence target having a relatively high detection temperature, and then the result of the multiplication (or division) is subtracted from the signal (eg in RFU) detected at the relatively high detection temperature. If the difference is greater than (or less than) "0" or some predetermined value, then a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature can be considered to be present.
Согласно одному из воплощений предварительно заданное значение может выступать в роли порога.In one embodiment, the predetermined value may act as a threshold.
Согласно одному из воплощений референсное значение используют для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, когда детектируют сигнал для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, или когда разницу между сигналами при относительно высокой температуре детекции и относительно низкой температуре детекции получают с помощью математических вычислений.In one embodiment, the reference value is used to determine the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature when a signal is detected for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature, or when the difference between signals at a relatively high detection temperature and a relatively low temperature detections are obtained by mathematical calculations.
Согласно одному из воплощений, если сигналы генерируют в режиме реального времени совместно с амплификацией мишени с использованием ПЦР, то математическая обработка сигналов включает вычисления соотношения интенсивности сигнала, детектируемого при относительно высокой температуре детекции, и интенсивности сигнала, детектируемого при относительно низкой температуре детекции, в каждом цикле амплификации. На основании результатов вычислений строят график зависимости (такого соотношения) от числа циклов и используют для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции.According to one of the embodiments, if the signals are generated in real time in conjunction with target amplification using PCR, then mathematical signal processing includes calculating the ratio of the signal intensity detected at a relatively high detection temperature and the intensity of the signal detected at a relatively low detection temperature, in each amplification cycle. Based on the results of the calculations, a plot (of this ratio) versus the number of cycles is plotted and used to determine the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature.
Согласно одному из воплощений, если сигналы генерируют в режиме реального времени совместно с амплификацией мишени с использованием ПЦР, то величина Ct относится к сигналу для детекции мишени.According to one of the embodiments, if the signals are generated in real time in conjunction with the amplification of the target using PCR, then the value of C t refers to the signal for target detection.
Значение Ct для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, можно определить, используя сигналы, детектируемые при относительно высокой температуре детекции и при относительно низкой температуре детекции, как приведено в качестве примера ниже. Сначала для анализируемого образца проводят ПЦР в режиме реального времени и получают сигналы, детектируемые при относительно высокой температуре детекции и при относительно низкой температуре детекции, после чего получают кривые амплификации для этих двух температур детекции.The C t value for a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature can be determined using signals detected at a relatively high detection temperature and at a relatively low detection temperature, as exemplified below. First, real-time PCR is performed on the analyzed sample and signals are obtained at a relatively high detection temperature and at a relatively low detection temperature, and then amplification curves are obtained for these two detection temperatures.
(а) В случае детектирования при относительно высокой температуре детекции, если не не получают никакого значения Ct для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, то можно считать, что нуклеотидная последовательность-мишень, имеющая относительно высокую температуру детекции, отсутствует. Затем, из кривой амплификации, полученной при относительно низкой температуре детекции, рассчитывают значение Ct для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции. Если нуклеотидная последовательность-мишень, имеющая относительно низкую температуру детекции, также отсутствует, то не получают никакого значения Ct для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции.(a) In the case of detection at a relatively high detection temperature, if no C t value is obtained for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature, then the target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature can be considered to be absent. Then, from the amplification curve obtained at the relatively low detection temperature, the C t value for the target nucleotide sequence having the relatively low detection temperature is calculated. If a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature is also absent, then no C t value is obtained for the target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature.
(b) В случае детектирования при относительно высокой температуре детекции, если получают значение Ct для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, то тогда рассчитывают отношение значения RFU, полученного при относительно низкой температуре детекции, к значению RFU, полученному при относительно высокой температуре детекции, в цикле, для которого получают значение Ct. Также рассчитывают отношения значений RFU, полученных в циклах, следующих за циклом, для которого значение Ct получено. (1) Если все отношения значений RFU находятся ниже референсного значения (например, значения, полученного с использованием только нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, как описано выше), то считают, что нуклеотидная последовательность-мишень, имеющая относительно низкую температуру детекции, отсутствует. Поэтому не получают никакого значения Ct для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции. (2) Если все отношения значений RFU находятся выше референсного значения, то значение Ct, рассчитанное из кривой амплификации, полученной при относительно низкой температуре детекции, принимают за значение Ct для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции. (3) Если отношение значений RFU в цикле, для которого значение Ct получено, находится ниже референсного значения, а отношение значений RFU после некоторого конкретного цикла находится выше референсного значения, то этот конкретный цикл принимают за значение Ct для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции.(b) In the case of detection at a relatively high detection temperature, if a C t value is obtained for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature, then the ratio of the RFU value obtained at a relatively low detection temperature to the RFU value obtained at a relatively high detection temperature is calculated. high detection temperature, in the cycle for which the value of C t is obtained. The ratios of the RFU values obtained in the cycles following the cycle for which the C t value was obtained are also calculated. (1) If all ratios of RFU values are below a reference value (e.g., a value obtained using only a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature as described above), then the target nucleotide sequence having a relatively low temperature is considered detection is missing. Therefore, no C t value is obtained for a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature. (2) If all ratios of RFU values are above the reference value, then the C t value calculated from the amplification curve obtained at a relatively low detection temperature is taken as the C t value for the target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature. (3) If the ratio of RFU values in the cycle for which the C t value is obtained is below the reference value, and the ratio of RFU values after some particular cycle is above the reference value, then this particular cycle is taken as the C t value for the target nucleotide sequence, having a relatively low detection temperature.
Если рассчитанные отношения являются такими же, как референсное значение, то определение может быть сделано произвольным образом. Например, в приведенных выше примерах описывается, что такое определение выполняют, учитывая, будут ли данные отношения ниже или не ниже референсных значений. Помимо этого, такое определение может быть выполнено с учетом того, будут ли данные отношения выше или не выше референсных значений.If the calculated ratios are the same as the reference value, then the determination can be made arbitrarily. For example, the above examples describe that such a determination is made considering whether these ratios will be below or not below the reference values. In addition, such a determination can be made taking into account whether these ratios will be higher or not higher than the reference values.
Значение Ct для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, можно рассчитать альтернативным образом так, как приведено ниже: для каждого цикла рассчитывают отношение значения RFU, полученного при относительно низкой температуре детекции, к значению RFU, полученному при относительно высокой температуре детекции; и затем рассчитывают значение Ct с учетом порогового значения.The C t value for a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature can alternatively be calculated as follows: for each cycle, calculate the ratio of the RFU value obtained at a relatively low detection temperature to the RFU value obtained at a relatively high detection temperature ; and then calculate the value of C t considering the threshold value.
Значение Ct для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, можно рассчитать альтернативным образом так, как приведено ниже: значение RFU, полученное при относительно высокой температуре детекции в каждом цикле, модифицируют, используя референсное значение для каждого цикла; для каждого цикла рассчитывают отношение значения RFU, полученного при относительно низкой температуре детекции, к модифицированному значению RFU; и затем рассчитывают значение Ct.The C t value for a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature can be alternatively calculated as follows: the RFU value obtained at the relatively high detection temperature in each cycle is modified using the reference value for each cycle; for each cycle, the ratio of the RFU value obtained at a relatively low detection temperature to the modified RFU value is calculated; and then calculate the value of C t .
Согласно одному из воплощений данного изобретения, в результате использования сигнала, детектируемого при относительно высокой температуре детекции, получают квалификационное значение (qualifying value) для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, а в результате указанного использования разности получают квалификационное значение для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции.According to one of the embodiments of the present invention, as a result of using a signal detected at a relatively high detection temperature, a qualifying value is obtained (qualifying value) for determining the presence of a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature, and as a result of this use of the difference, a qualification value is obtained for determining the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature.
Согласно одному из воплощений данного изобретения, в результате использования разности получают квалификационное значение для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, и такое квалификационное значение получают в результате (1) математической обработки сигнала, детектируемого при относительно высокой температуре детекции, и сигнала, детектируемого при относительно низкой температуре детекции, или (2) использования сигнала, детектируемого при относительно низкой температуре детекции, с учетом отсутствия детекции какого-либо сигнала при относительно высокой температуре детекции, если данный сигнал не детектируется при относительно высокой температуре детекции.According to one embodiment of the present invention, by using the difference, a qualification value is obtained for determining the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature, and such qualification value is obtained by (1) mathematical processing of a signal detected at a relatively high detection temperature, and a signal detected at a relatively low detection temperature, or (2) using a signal detected at a relatively low detection temperature, taking into account that no signal is detected at a relatively high detection temperature if that signal is not detected at a relatively high detection temperature.
Квалификационные значения можно подвергнуть дальнейшей математической обработке с получением модифицированных значений. Квалификационные значения используют для определения присутствия двух нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце.Qualification values can be subjected to further mathematical processing to obtain modified values. Qualification values are used to determine the presence of two target nucleotide sequences in a sample.
Согласно одному из воплощений, один реакционный сосуд дополнительно содержит по меньшей мере один дополнительный комплект, при этом каждый из них содержит два дополнительных средства генерации сигнала, для детекции других нуклеотидных последовательностей-мишеней, нежели эти две нуклеотидные последовательности-мишени; при этом сигналы, генерируемые каждым комплектом из двух средств генерации сигнала в таком сосуде, различаются, и эти сигналы детектируют, используя, соответственно, детекторы разных типов. Например, если в двух средствах генерации сигнала на стадии (а) используется метка FAM, а в двух дополнительных средствах генерации сигнала используется метка Quasar 570, то сигналы, генерируемые FAM-меченными средствами генерации сигнала в сосуде, отличаются от сигналов, генерируемых Quasar 570-меченными средствами генерации сигнала, и поэтому для детекции двух разных типов излучения необходимы детекторы двух типов.According to one of the embodiments, one reaction vessel further contains at least one additional set, each of which contains two additional means of generating a signal, for the detection of target nucleotide sequences other than these two target nucleotide sequences; the signals generated by each set of two signal generating means in such a vessel are different, and these signals are detected using different types of detectors, respectively. For example, if the two signal generators in step (a) use the FAM label, and the two additional signal generators use the Quasar 570 label, then the signals generated by the FAM-labeled signal generators in the vessel are different from the signals generated by the Quasar 570. labeled by means of signal generation, and therefore two types of detectors are needed to detect two different types of radiation.
Согласно одному из воплощений данного изобретения две нуклеотидные последовательности-мишени содержат нуклеотидную вариацию, и одна из этих двух нуклеотидных последовательностей-мишеней содержит нуклеотидную вариацию одного типа, а другая содержит нуклеотидную вариацию другого типа.According to one embodiment of the present invention, two target nucleotide sequences comprise a nucleotide variation, and one of the two target nucleotide sequences contains one type of nucleotide variation and the other contains a different type of nucleotide variation.
Термин "нуклеотидная вариация", использованный в данном описании, относится к любым одиночным или множественным нуклеотидным заменам, делециям или вставкам в последовательности ДНК в конкретном положении среди непрерывных сегментов ДНК, которые в других случаях являются одинаковыми в последовательности. Такие непрерывные сегменты ДНК включают ген или любую другую часть хромосомы. Такие нуклеотидные вариации могут быть результатом мутации или представлять собой вариации полиморфных аллелей. Например, нуклеотидная вариация, детектируемая в настоящем изобретении, включает SNP (однонуклеотидный полиморфизм), мутацию, делецию, вставку, замену и транслокацию. Примером нуклеотидной вариации являются многочисленные вариации в геноме человека (например, вариации в гене MTHFR (метилентетрагидрофолат-редуктаза)), вариации, вовлеченные в возникновение лекарственной устойчивости у патогенных микроорганизмов, и вызывающие онкогенез вариации. Термин "нуклеотидная вариация", использованный в данном описании, включает в себя любую вариацию в конкретном положении в нуклеотидной последовательности. Другими словами, термин нуклеотидная вариация включает в себя дикий тип и любой его мутантный тип в конкретном положении в нуклеотидной последовательности.The term "nucleotide variation" as used herein refers to any single or multiple nucleotide substitutions, deletions or insertions in a DNA sequence at a particular position among contiguous DNA segments that are otherwise the same in sequence. Such continuous segments of DNA include a gene or any other part of a chromosome. Such nucleotide variations may be the result of a mutation or represent variations in polymorphic alleles. For example, the nucleotide variation detected in the present invention includes SNP (single nucleotide polymorphism), mutation, deletion, insertion, substitution, and translocation. Nucleotide variation is exemplified by numerous variations in the human genome (eg, variations in the MTHFR (methylenetetrahydrofolate reductase) gene), variations involved in drug resistance in pathogens, and tumorigenesis-causing variations. The term "nucleotide variation" as used herein includes any variation at a particular position in a nucleotide sequence. In other words, the term nucleotide variation includes the wild type and any mutant type thereof at a particular position in the nucleotide sequence.
Согласно одному из воплощений данного изобретения, нуклеотидная вариация, детектируемая в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой SNP (однонуклеотидный полиморфизм).According to one embodiment of the present invention, the nucleotide variation detected in accordance with the present invention is a SNP (single nucleotide polymorphism).
Согласно одному из воплощений данного изобретения, один из SNP-содержащих аллелей имеет относительно высокую температуру детекции, а другой имеет относительно низкую температуру детекции, определяемую с использованием соответствующих средств генерации сигнала.According to one of the embodiments of the present invention, one of the SNP-containing alleles has a relatively high detection temperature, and the other has a relatively low detection temperature, determined using appropriate signal generation means.
Преимущества настоящего изобретения становятся более заметными в случае детекции SNP.The advantages of the present invention become more noticeable in the case of SNP detection.
Если температура детекции для аллеля дикого типа является относительно высокой температурой детекции, а температура детекции для мутантного аллеля является относительно низкой температурой детекции, и образец представляет собой мутантную гомозиготу, то сигнал не будет детектироваться при относительно высокой температуре детекции и сигнал будет детектироваться при относительно высокой температуре детекции. Такой образец будет идентифицирован, как не содержащий аллеля дикого типа и содержащий аллель мутантного типа. В то же время, даже если для образца с мутантной гомозиготой генерируется ложный сигнал при относительно высокой температуре детекции, то результат вычисления разницы между сигналом, детектируемым при относительно высокой температуре детекции, и сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции, для определения присутствия SNP-содержащего аллеля, имеющего относительно низкую температуру детекции, позволяет проверить, является ли сигнал, детектируемый при относительно высокой температуре детекции, ложноположительным сигналом или нет. Причина заключается в том, что гетерозигота по SNP содержит аллель дикого типа и мутантный аллель в соотношении 1:1.If the detection temperature for the wild-type allele is a relatively high detection temperature, and the detection temperature for a mutant allele is a relatively low detection temperature, and the sample is a homozygous mutant, then the signal will not be detected at the relatively high detection temperature and the signal will be detected at the relatively high temperature detection. Such a sample will be identified as containing no wild-type allele and containing a mutant-type allele. At the same time, even if a sample with a homozygous mutant generates a false signal at a relatively high detection temperature, the result of calculating the difference between a signal detected at a relatively high detection temperature and a signal detected at a relatively low detection temperature to determine the presence of SNP- containing an allele having a relatively low detection temperature makes it possible to check whether a signal detected at a relatively high detection temperature is a false positive signal or not. The reason is that the SNP heterozygous contains the wild-type allele and the mutant allele in a 1:1 ratio.
II. SNP-генотипирование с использованием разных температур детекцииII. SNP genotyping using different detection temperatures
Согласно другому аспекту данного изобретения предложен способ SNP-генотипирования нуклеотидной последовательности в образце с использованием разных температур детекции, включающий:According to another aspect of the present invention, there is provided a method for SNP genotyping of a nucleotide sequence in a sample using different detection temperatures, comprising:
(а) инкубирование образца, содержащего нуклеотидную последовательность, содержащую сайт SNP (однонуклеотидного полиморфизма), и средство генерации сигнала для детекции SNP-содержащих аллелей в одном реакционном сосуде, и детекцию генерируемого сигнала с использованием детектора одного типа; при этом каждый из SNP-содержащих аллелей детектируют с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом один из SNP-содержащих аллелей имеет относительно высокую температуру детекции, а другой имеет относительно низкую температуру детекции, определяемую с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом относительно высокая температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование сигнала для SNP-содержащего аллеля, имеющего относительно высокую температуру детекции, а относительно низкая температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование как сигнала для SNP-содержащего аллеля, имеющего относительно низкую температуру детекции, так и сигнала для SNP-содержащего аллеля, имеющего относительно высокую температуру детекции; при этом сигналы, генерируемые такими средствами генерации сигнала, не различаются детектором одного типа; при этом детекцию осуществляют как при относительно высокой температуре детекции, так и при относительно низкой температуре детекции; и(a) incubating a sample containing a nucleotide sequence containing an SNP (single nucleotide polymorphism) site and a signal generating means for detecting SNP-containing alleles in the same reaction vessel, and detecting the generated signal using the same type of detector; wherein each of the SNP-containing alleles is detected using an appropriate signal generating means; wherein one of the SNP-containing alleles has a relatively high detection temperature and the other has a relatively low detection temperature determined using an appropriate signal generation means; wherein the relatively high detection temperature is a temperature that allows signal generation for an SNP-containing allele having a relatively high detection temperature, and the relatively low detection temperature is a temperature that allows generation of a signal for an SNP-containing allele having a relatively low detection temperature, and a signal for an SNP-containing allele having a relatively high detection temperature; while the signals generated by such signal generation means are not distinguished by a detector of the same type; wherein detection is carried out both at a relatively high detection temperature and at a relatively low detection temperature; and
(b) определение SNP-генотипа по разнице между сигналом, детектируемым при относительно высокой температуре детекции, и сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции, на стадии (а).(b) determining the SNP genotype by the difference between the signal detected at a relatively high detection temperature and the signal detected at a relatively low detection temperature in step (a).
Поскольку настоящее изобретение в целом следует первому аспекту данного изобретения, описанному выше, общие для них части описания опущены, чтобы избежать излишнего дублирования, приводящего к усложнению данного описания. При обращении к описаниям для первого аспекта, с целью описания этого аспекта, следует иметь в виду, что стадия (b) этого аспекта частично отличается от стадии (b) первого аспекта. Поэтому, специалистам в данной области техники будет понятно, что некоторые части описания для первого аспекта могут быть непосредственно использованы в описаниях для стадии (b) этого аспекта, а другие части описания могут быть использованы в описаниях для стадии (b) этого аспекта с изменениями.Since the present invention generally follows the first aspect of the present invention described above, parts of the description common to them are omitted in order to avoid unnecessary duplication leading to the complication of this description. When referring to the descriptions for the first aspect, in order to describe this aspect, it should be borne in mind that stage (b) of this aspect is partially different from stage (b) of the first aspect. Therefore, those skilled in the art will appreciate that some parts of the description for the first aspect may be directly used in the descriptions for step (b) of that aspect, while other parts of the description may be used in the descriptions for step (b) of this aspect, with modifications.
Стадия (а). Инкубирование со средствами генерации сигнала и детекция сигналовStage (a). Incubation with Signal Generator and Signal Detection
В первую очередь, образец, содержащий нуклеотидную последовательность, содержащую сайт SNP (однонуклеотидного полиморфизма), инкубируют со средством генерации сигнала для детекции SNP-содержащих аллелей в одном реакционном сосуде и затем генерируемый сигнал детектируют, используя детектор одного типа. Сигналы, генерируемые средствами генерации сигнала, не различаются детектором одного типа.First, a sample containing a nucleotide sequence containing an SNP (single nucleotide polymorphism) site is incubated with a signal generating means for detecting SNP-containing alleles in one reaction vessel, and then the generated signal is detected using a single type detector. Signals generated by signal generation means are not distinguished by a detector of the same type.
Нуклеотидная последовательность, содержащая сайт SNP, может включать пару хромосом человека.The nucleotide sequence containing the SNP site may include a pair of human chromosomes.
Один из SNP-содержащих аллелей имеет относительно высокую температуру детекции, а другой имеет относительно низкую температуру детекции, определяемую с использованием соответствующего средства генерации сигнала, при этом относительно высокая температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование сигнала для SNP-содержащего аллеля, имеющего относительно высокую температуру детекции, а относительно низкая температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование как сигнала для SNP-содержащего аллеля, имеющего относительно низкую температуру детекции, так и сигнала для SNP-содержащего аллеля, имеющего относительно высокую температуру детекции.One of the SNP-containing alleles has a relatively high detection temperature, and the other has a relatively low detection temperature determined using an appropriate signal generation means, the relatively high detection temperature being a temperature capable of generating a signal for an SNP-containing allele having a relatively high a detection temperature, and a relatively low detection temperature is a temperature capable of generating both a signal for an SNP-containing allele having a relatively low detection temperature and a signal for an SNP-containing allele having a relatively high detection temperature.
Согласно одному из воплощений данного изобретения стадию (а) проводят в процессе амплификации сигнала одновременно с амплификацией нуклеиновой кислоты.According to one embodiment of the present invention, step (a) is carried out during signal amplification simultaneously with nucleic acid amplification.
Согласно одному из воплощений данного изобретения стадию (а) проводят в процессе амплификации сигнала без амплификации нуклеиновой кислоты.According to one embodiment of the present invention, step (a) is carried out in a signal amplification process without nucleic acid amplification.
Стадия (b). Определение SNP-генотипаStep (b). Determination of the SNP genotype
После детекции сигнала проводят SNP-генотипирование на основе разницы между сигналом, детектируемым при относительно высокой температуре детекции и сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции, на стадии (а).After signal detection, SNP genotyping is performed based on the difference between a signal detected at a relatively high detection temperature and a signal detected at a relatively low detection temperature in step (a).
Настоящее изобретение позволяет проводить SNP-генотипирование только на основе разницы между сигналом, детектируемым при относительно высокой температуре детекции, и сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции, без определения присутствия SNP-содержащего аллеля, имеющего относительно высокую температуру детекции.The present invention allows SNP genotyping based only on the difference between a signal detected at a relatively high detection temperature and a signal detected at a relatively low detection temperature without detecting the presence of an SNP-containing allele having a relatively high detection temperature.
Согласно одному из воплощений указанную разницу получают путем математической обработки сигнала, детектируемого при относительно высокой температуре детекции, и сигнала, детектируемого при относительно низкой температуре детекции.According to one embodiment, said difference is obtained by mathematical processing of a signal detected at a relatively high detection temperature and a signal detected at a relatively low detection temperature.
Согласно одному из воплощений, данную разницу получают путем вычисления соотношения между сигналами, детектируемыми при относительно высокой температуре детекции, и сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции.According to one embodiment, this difference is obtained by calculating the ratio between the signals detected at a relatively high detection temperature and the signal detected at a relatively low detection temperature.
Согласно одному из воплощений, для расчета указанной разницы используют фоновый сигнал, детектируемый при относительно высокой температуре детекции.According to one embodiment, the background signal detected at a relatively high detection temperature is used to calculate said difference.
Согласно одному из воплощений, фоновый сигнал, детектируемый при относительно высокой температуре детекции, можно принимать за "0" или "1" для расчета данной разницы.According to one embodiment, the background signal detected at a relatively high detection temperature can be taken as "0" or "1" to calculate this difference.
Согласно одному из воплощений, если в ходе вычисления получают отрицательное значение, то его преобразуют в абсолютную величину и используют, получая разницу.According to one of the embodiments, if a negative value is obtained during the calculation, then it is converted to an absolute value and used to obtain the difference.
Согласно одному из воплощений данного изобретения стадию (b) для определения SNP-генотипа проводят без определения присутствия SNP-содержащего аллеля, имеющего относительно высокую температуру детекции. SNP-генотипирование проводят, используя разницу между сигналом, детектируемым при относительно высокой температуре детекции, и сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции.According to one embodiment of the present invention, step (b) for determining the SNP genotype is carried out without determining the presence of an SNP-containing allele having a relatively high detection temperature. SNP genotyping is performed using the difference between the signal detected at a relatively high detection temperature and the signal detected at a relatively low detection temperature.
Причина, по которой не требуется определения присутствия SNP-содержащего аллеля, имеющего относительно высокую температуру детекции, заключается в том, что имеется три SNP-генотипа, и гетерозигота по SNP содержит аллель дикого типа и мутантный аллель в соотношении 1:1. Сочетая данную причину с принципом настоящего изобретения, можно проводить SNP-генотипирование без определения присутствия SNP-содержащего аллеля, имеющего относительно высокую температуру детекции.The reason why it is not necessary to determine the presence of an SNP-containing allele having a relatively high detection temperature is that there are three SNP genotypes, and the SNP heterozygous contains the wild-type allele and the mutant allele in a 1:1 ratio. Combining this reason with the principle of the present invention, SNP genotyping can be performed without detecting the presence of an SNP-containing allele having a relatively high detection temperature.
Согласно одному из воплощений данного изобретения образец с гомозиготой, содержащей аллель с SNP, имеющий относительно высокую температуру детекции, демонстрирует разницу (например, отношение) в пределах конкретного диапазона, образец с гетерозиготой демонстрирует разницу (например, отношение) в пределах другого конкретного диапазона, и образец с гомозиготой, содержащей аллель с SNP, имеющий относительно низкую температуру детекции, демонстрирует разницу (например, отношение) в пределах иного конкретного диапазона.According to one embodiment of the present invention, a homozygous sample containing an SNP allele having a relatively high detection temperature exhibits a difference (e.g. ratio) within a specific range, a heterozygous sample exhibits a difference (e.g. ratio) within another specific range, and a sample with a homozygote containing an allele with an SNP having a relatively low detection temperature shows a difference (eg, ratio) within another specific range.
Согласно одному из воплощений данного изобретения конкретный диапазон для каждого SNP-генотипа может быть связан с референсным значением для каждого такого SNP-генотипа.According to one embodiment of the present invention, a specific range for each SNP genotype can be associated with a reference value for each such SNP genotype.
Согласно одному из воплощений данного изобретения, для определения SNP-генотипа в данном способе используется по меньшей мере одно из референсных значений для гомозиготы, в состав которой входит SNP-содержащий аллель, имеющий относительно высокую температуру детекции, для гомозиготы, в состав которой входит SNP-содержащий аллель, имеющий относительно низкую температуру детекции, и для гетерозиготы.According to one of the embodiments of the present invention, to determine the SNP genotype, this method uses at least one of the reference values for a homozygote, which includes an SNP-containing allele having a relatively high detection temperature, for a homozygote, which includes an SNP- containing an allele having a relatively low detection temperature, and for a heterozygote.
Согласно одному из воплощений данного изобретения, для определения SNP-генотипа в данном способе используются все три референсных значения. Согласно одному из воплощений данного изобретения, для определения SNP-генотипа в данном способе используются по меньшей мере два референсных значения для гомозиготы, в состав которой входит SNP-содержащий аллель, имеющий относительно высокую температуру детекции, и для гетерозиготы.According to one of the embodiments of the present invention, all three reference values are used in this method to determine the SNP genotype. According to one embodiment of the present invention, at least two reference values are used in this method to determine the SNP genotype for a homozygote that includes an SNP-containing allele having a relatively high detection temperature and for a heterozygote.
Согласно одному из воплощений, для проведения SNP-генотипирования в данном способе используется референсное значение, полученное посредством (1) инкубирования гомозиготы, в состав которой входит SNP-содержащий аллель, имеющий относительно высокую температуру детекции, со средством генерации сигнала для детекции SNP-содержащего аллеля, имеющего относительно высокую температуру детекции, в другом реакционном сосуде, нежели реакционный сосуд на стадии (а), (2) детекции сигналов как при относительно высокой температуре детекции, так и при относительно низкой температуре детекции, и (3) затем получения разницы между сигналом, детектируемым при относительно высокой температуре детекции, и сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции.According to one of the embodiments, for carrying out SNP genotyping, this method uses a reference value obtained by (1) incubating a homozygote, which includes an SNP-containing allele having a relatively high detection temperature, with a signal generation device for detecting an SNP-containing allele having a relatively high detection temperature in a different reaction vessel than the reaction vessel in (a), (2) detecting signals at both a relatively high detection temperature and a relatively low detection temperature, and (3) then obtaining a difference between the signal , detected at a relatively high detection temperature, and a signal detected at a relatively low detection temperature.
Согласно одному из воплощений, для проведения SNP-генотипирования в данном способе используется референсное значение, полученное посредством (1) инкубирования гетерозиготы, в состав которой входит как SNP-содержащий аллель, имеющий относительно высокую температуру детекции, так и SNP-содержащий аллель, имеющий относительно низкую температуру детекции, с соответствующими средствами генерации сигнала, в другом реакционном сосуде, нежели реакционный сосуд на стадии (а), (2) детекции сигналов как при относительно высокой температуре детекции, так и при относительно низкой температуре детекции, и (3) затем получения разницы между сигналом, детектируемым при относительно высокой температуре детекции, и сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции.According to one of the embodiments, for carrying out SNP genotyping in this method, a reference value obtained by (1) incubating a heterozygote, which includes both an SNP-containing allele having a relatively high detection temperature, and an SNP-containing allele having a relatively high detection temperature, is used in this method. low detection temperature, with appropriate signal generation means, in a different reaction vessel than the reaction vessel in step (a), (2) detecting signals at both a relatively high detection temperature and a relatively low detection temperature, and (3) then obtaining difference between a signal detected at a relatively high detection temperature and a signal detected at a relatively low detection temperature.
Согласно одному из воплощений, для проведения SNP-генотипирования в данном способе используется референсное значение, полученное посредством (1) инкубирования гомозиготы, в состав которой входит SNP-содержащий аллель, имеющий относительно низкую температуру детекции, со средством генерации сигнала для детекции SNP-содержащего аллеля, имеющего относительно низкую температуру детекции, в другом реакционном сосуде, нежели реакционный сосуд на стадии (а), (2) детекции сигналов как при относительно высокой температуре детекции, так и при относительно низкой температуре детекции, и (3) затем получения разницы между сигналом, детектируемым при относительно высокой температуре детекции, и сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции.According to one of the embodiments, for carrying out SNP genotyping, this method uses a reference value obtained by (1) incubating a homozygote, which includes an SNP-containing allele having a relatively low detection temperature, with a signal generation device for detecting an SNP-containing allele having a relatively low detection temperature in a different reaction vessel than the reaction vessel in (a), (2) detecting signals at both a relatively high detection temperature and a relatively low detection temperature, and (3) then obtaining a difference between the signal , detected at a relatively high detection temperature, and a signal detected at a relatively low detection temperature.
Согласно одному из воплощений, для SNP-генотипирования образца рассчитывают разницу между сигналом, детектируемым при относительно высокой температуре детекции, и сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции, и сравнивают с референсными значениями для каждого SNP-генотипа.In one embodiment, for SNP genotyping of a sample, the difference between the signal detected at a relatively high detection temperature and the signal detected at a relatively low detection temperature is calculated and compared to reference values for each SNP genotype.
Согласно одному из воплощений референсное значение может быть получено путем вычисления соотношения между сигналами, детектируемыми при относительно высокой температуре детекции, и сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции.According to one embodiment, the reference value can be obtained by calculating the ratio between the signals detected at a relatively high detection temperature and the signal detected at a relatively low detection temperature.
Согласно одному из воплощений данного изобретения референсное значение может быть получено в реакционных условиях, достаточных для получения насыщенного сигнала по завершении реакции. Например, чтобы получить референсное значение для гетерозиготы, в состав которой входят как SNP-содержащий аллель, имеющий относительно высокую температуру детекции, так и SNP-содержащий аллель, имеющий относительно низкую температуру детекции, реакционные условия, как например, содержание каждого SNP-содержащего аллеля, выбирают таким образом, чтобы по завершении реакции получить насыщенный сигнал для каждого SNP-содержащего аллеля. Согласно одному из воплощений данного изобретения разница между сигналами, полученными при вычислении референсного значения, лежит в конкретном диапазоне, и референсное значение выбирают в пределах этого конкретного диапазона или с указанием на этот конкретный диапазон.According to one of the embodiments of the present invention, the reference value can be obtained under reaction conditions sufficient to obtain a saturated signal at the end of the reaction. For example, to obtain a reference value for a heterozygote that includes both an SNP-containing allele having a relatively high detection temperature and an SNP-containing allele having a relatively low detection temperature, reaction conditions such as the content of each SNP-containing allele , are chosen so that upon completion of the reaction, a saturated signal is obtained for each SNP-containing allele. According to one of the embodiments of the present invention, the difference between the signals obtained when calculating the reference value lies in a specific range, and the reference value is selected within this specific range or indicating this specific range.
Если температура детекции для аллеля дикого типа представляет собой относительно высокую температуру детекции, температура детекции для мутантного аллеля представляет собой относительно низкую температуру детекции, и соотношение между сигналами, детектируемыми при относительно высокой температуре детекции и относительно низкой температуре детекции, рассчитывают для получения разницы, то образец с гомозиготой дикого типа показывает соотношение в пределах конкретного диапазона, а образец с гетерозиготой показывает соотношение в пределах другого конкретного диапазона.If the detection temperature for the wild-type allele is a relatively high detection temperature, the detection temperature for the mutant allele is a relatively low detection temperature, and the ratio between the signals detected at the relatively high detection temperature and the relatively low detection temperature is calculated to obtain a difference, then the sample with a homozygous wild-type shows a ratio within a specific range, and a sample with a heterozygote shows a ratio within another specific range.
Например, образец с гомозиготой дикого типа показывает соотношение приблизительно 1,0, а образец с SNP-гетерозиготой показывает соотношение приблизительно 2,0.For example, a homozygous wild-type sample shows a ratio of about 1.0, and a heterozygous SNP sample shows a ratio of about 2.0.
Если образец относится к мутантной гомозиготе, то для вычисления соотношения между сигналом, детектируемым при относительно высокой температуре детекции, и сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции, можно использовать фоновый сигнал, детектируемый при относительно высокой температуре детекции. В этом случае, рассчитанное соотношение может показывать величину, значительно большую 2,0, что указывает на то, что SNP-генотип образца относится к мутантной гомозиготе. Альтернативно, рассчитанное соотношение может показывать величину, принадлежащую конкретному диапазону соотношения (например, приблизительно 9,0), который демонстрирует образец с мутантной гомозиготой.If the sample is homozygous mutant, then the background signal detected at the relatively high detection temperature can be used to calculate the ratio between the signal detected at a relatively high detection temperature and the signal detected at a relatively low detection temperature. In this case, the calculated ratio may show a value significantly greater than 2.0, indicating that the sample's SNP genotype is homozygous mutant. Alternatively, the calculated ratio may indicate a value belonging to a specific ratio range (eg, about 9.0) that a sample with a homozygous mutant exhibits.
Кроме того, даже если для образца с мутантной гомозиготой при относительно высокой температуре детекции генерируется ложный сигнал, то данное соотношение будет показывать величину, значительно большую 2,0, что указывает на то, что SNP-генотип образца относится к мутантной гомозиготе.In addition, even if a false signal is generated for a sample with a mutant homozygote at a relatively high detection temperature, this ratio will show a value significantly greater than 2.0, indicating that the SNP genotype of the sample belongs to the mutant homozygote.
Таким образом, что касается SNP-генотипа, то настоящее изобретение позволяет определить SNP-генотип посредством использования только разницы между сигналом, детектируемым при относительно высокой температуре детекции, и сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции.Thus, with regard to the SNP genotype, the present invention makes it possible to determine the SNP genotype by using only the difference between the signal detected at a relatively high detection temperature and the signal detected at a relatively low detection temperature.
Согласно одному из воплощений указанная разница предусматривает получение квалификационного значения путем математической обработки сигнала, детектируемого при относительно высокой температуре детекции, и сигнала, детектируемого при относительно низкой температуре детекции.According to one of the embodiments, this difference provides for obtaining a qualifying value by mathematical processing of the signal detected at a relatively high detection temperature, and the signal detected at a relatively low detection temperature.
Согласно одному из воплощений референсное значение получают, используя стандартный образец, содержащий гомозиготу дикого типа, мутантную гомозиготу или гетерозиготу, и используют для анализа разницы, полученной для тестируемых образцов.According to one embodiment, a reference value is obtained using a standard sample containing a wild-type homozygote, a mutant homozygote, or a heterozygote, and is used to analyze the difference obtained for the test samples.
III. Детекция по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием разных температур детекцииIII. Detection of at least three target nucleotide sequences in a sample using different detection temperatures
Согласно еще одному аспекту данного изобретения предложен способ детекции по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием разных температур детекции, включающий:According to another aspect of the present invention, there is provided a method for detecting at least three target nucleotide sequences in a sample using different detection temperatures, comprising:
(a) инкубирование образца по меньшей мере с тремя средствами генерации сигнала для детекции по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней в одном реакционном сосуде и детекцию генерируемого сигнала с использованием детектора одного типа; при этом каждую из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней детектируют с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом каждая из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней имеет свою температуру детекции, определяемую с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование не только сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей данную температуру детекции, но также и сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей более высокую температуру детекции, чем данная температура детекции; при этом сигналы, генерируемые этими средствами генерации сигнала, не различаются детектором одного типа; при этом детекцию осуществляют при каждой из разных температур детекции; и(a) incubating the sample with at least three signal generating means for detecting at least three target nucleotide sequences in one reaction vessel and detecting the generated signal using the same type of detector; wherein each of the at least three target nucleotide sequences is detected using an appropriate signal generation means; wherein each of the at least three target nucleotide sequences has its own detection temperature determined using an appropriate signal generation means; wherein the detection temperature is a temperature capable of generating not only a signal for a target nucleotide sequence having a given detection temperature, but also a signal for a target nucleotide sequence having a detection temperature higher than the given detection temperature; while the signals generated by these signal generation means are not distinguished by a detector of the same type; wherein the detection is carried out at each of the different detection temperatures; and
(b) определение присутствия по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней на основе сигналов, детектируемых на стадии (а); при этом, если определяют присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей конкретную температуру детекции, среди по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней, то присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей данную конкретную температуру детекции, определяют по разнице между сигналом, детектируемым при одной или более температурах детекции, превышающих данную конкретую температуру детекции, и сигналом, детектируемым при данной конкретной температуре детекции; при этом, если данная конкретная температура детекции является самой относительно высокой температурой детекции среди температур детекции, то присутствие нуклеотидной последовательности-мишени определяют на основе сигнала, детектируемого при данной конкретной температуре детекции.(b) determining the presence of at least three target nucleotide sequences based on the signals detected in step (a); wherein, if the presence of a target nucleotide sequence having a specific detection temperature is determined among at least three target nucleotide sequences, then the presence of a target nucleotide sequence having this specific detection temperature is determined by the difference between the signal detected at one or more detection temperatures exceeding that particular detection temperature and a signal detected at that particular detection temperature; wherein, if the particular detection temperature is the relatively highest detection temperature among the detection temperatures, then the presence of the target nucleotide sequence is determined based on the signal detected at that particular detection temperature.
Поскольку настоящее изобретение в целом следует первому аспекту данного изобретения, описанному выше, общие для них части описания опущены, чтобы избежать излишнего дублирования, приводящего к усложнению данного описания.Since the present invention generally follows the first aspect of the present invention described above, parts of the description common to them are omitted in order to avoid unnecessary duplication leading to the complication of this description.
Стадия (а). Инкубирование со средствами генерации сигнала и детекция сигналовStage (a). Incubation with Signal Generator and Signal Detection
В первую очередь, анализируемый образец инкубируют по меньшей мере с тремя средствами генерации сигнала для детекции по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней в одном реакционном сосуде и затем генерируемый сигнал детектируют, используя детектор одного типа. Сигналы, генерируемые по меньшей мере тремя средствами генерации сигнала не различаются детектором одного типа.First, the sample to be analyzed is incubated with at least three signal generating means for detecting at least three target nucleotide sequences in one reaction vessel, and then the generated signal is detected using the same type of detector. Signals generated by at least three signal generating means are not distinguished by a detector of the same type.
Количество нуклеотидных последовательностей-мишеней, подлежащих детектированию в соответствии с настоящим изобретением, не ограничено и включает более чем 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10 нуклеотидных последовательностей-мишеней в одном реакционном сосуде.The number of target nucleotide sequences to be detected in accordance with the present invention is not limited and includes more than 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10 target nucleotide sequences in one reaction vessel.
Каждую из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней детектируют с использованием соответствующего средства генерации сигнала. Каждая из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней имеет свою температуру детекции, определяемую с использованием соответствующего средства генерации сигнала.Each of the at least three target nucleotide sequences is detected using an appropriate signal generator. Each of the at least three target nucleotide sequences has its own detection temperature, which is determined using an appropriate signal generator.
Согласно одному из воплощений, температуры детекции, установленные для нуклеотидных последовательностей-мишеней, отличаются друг от друга по меньшей мере на 2°C, 3°C, 4°C, 5°C, 7°C, 8°C, 9°C, 10°C, 11°C, 12°C, 15°C или 20°C.According to one of the embodiments, the detection temperatures set for the target nucleotide sequences differ from each other by at least 2°C, 3°C, 4°C, 5°C, 7°C, 8°C, 9°C , 10°C, 11°C, 12°C, 15°C or 20°C.
Одна из нуклеотидных последовательностей-мишеней имеет самую относительно высокую температуру детекции. Средство генерации сигнала, способное обеспечивать получение сигнала при самой относительно высокой температуре детекции, используют для детекции нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей самую относительно высокую температуру детекции.One of the target nucleotide sequences has the relatively highest detection temperature. A signal generating means capable of obtaining a signal at the relatively high detection temperature is used to detect the target nucleotide sequence having the relatively high detection temperature.
Температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование не только сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей данную температуру детекции, но также и сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей более высокую температуру детекции, чем данная температура детекции. Детекцию осуществляют при каждой из разных температур детекции.The detection temperature is a temperature capable of generating not only a signal for a target nucleotide sequence having a given detection temperature, but also a signal for a target nucleotide sequence having a higher detection temperature than the given detection temperature. Detection is carried out at each of the different detection temperatures.
Согласно одному из воплощений стадию (а) проводят в процессе амплификации сигнала одновременно с амплификацией нуклеиновой кислоты.According to one embodiment, step (a) is carried out during signal amplification simultaneously with amplification of the nucleic acid.
Согласно одному из воплощений стадию (а) проводят в процессе амплификации сигнала без амплификации нуклеиновой кислоты.According to one embodiment, step (a) is performed during signal amplification without nucleic acid amplification.
Согласно одному из воплощений, по меньшей мере одно из средств генерации сигнала представляет собой средство генерации сигнала для генерирования сигнала способом, зависящим от образования дуплекса.According to one embodiment, at least one of the signal generating means is a signal generating means for generating a signal in a duplexing dependent manner.
Согласно одному из воплощений средства генерации сигнала для каждой из нуклеотидных последовательностей-мишеней представляют собой средства генерации сигнала для генерирования сигнала способом, зависящим от образования дуплекса.In one embodiment, the signal generating means for each of the target nucleotide sequences are signal generating means for generating a signal in a duplex dependent manner.
Согласно одному из воплощений сигнал генерируется в результате образования дуплекса между нуклеотидной последовательностью-мишенью и детектирующим олигонуклеотидом, специфически гибридизованным с данной нуклеотидной последовательностью-мишенью. Согласно одному из воплощений сигнал генерируется дуплексом, образованным способом, зависящим от расщепления опосредующего олигонуклеотида, специфически гибридизованного с нуклеотидной последовательностью-мишенью.In one embodiment, the signal is generated by the formation of a duplex between the target nucleotide sequence and a detection oligonucleotide specifically hybridized to the target nucleotide sequence. In one embodiment, the signal is generated by a duplex formed in a manner dependent on cleavage of a mediating oligonucleotide specifically hybridized to a target nucleotide sequence.
Согласно одному из воплощений данного изобретения средства генерации сигнала для каждой из нуклеотидных последовательностей-мишеней представляют собой средства генерации сигнала с использованием образования дуплекса способом, зависящим от расщепления опосредующего олигонуклеотида, специфически гибридизованного нуклеотидной последовательностью-мишенью.According to one embodiment of the present invention, the signal generating means for each of the target nucleotide sequences are signal generating means using duplex formation in a manner dependent on cleavage of a mediating oligonucleotide specifically hybridized with the target nucleotide sequence.
Согласно одному из воплощений, по меньшей мере одно из средств генерации сигнала представляет собой средство генерации сигнала для генерирования сигнала способом, зависящим от расщепления детектирующего олигонуклеотида.According to one embodiment, at least one of the signal generating means is a signal generating means for generating a signal in a manner dependent on the cleavage of the detection oligonucleotide.
Согласно одному из воплощений сигнал генерируется в результате гибридизации детектирующего олигонуклеотида с нуклеотидной последовательностью-мишенью и затем расщепления детектирующего олигонуклеотида. Согласно одному из воплощений сигнал генерируется в результате расщепления детектирующего олигонуклеотида способом, зависящим от расщепления опосредующего олигонуклеотида, специфически гибридизованного с нуклеотидной последовательностью-мишенью.In one embodiment, the signal is generated by hybridization of the detection oligonucleotide to the target nucleotide sequence and then cleavage of the detection oligonucleotide. In one embodiment, the signal is generated by cleaving the detection oligonucleotide in a manner dependent on the cleavage of the mediating oligonucleotide specifically hybridized to the target nucleotide sequence.
Согласно одному из воплощений, генерирование сигнала способом, зависящим от расщепления детектирующего олигонуклеотида, используют для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей самую относительно высокую температуру детекции, среди по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней.According to one embodiment, generating a signal in a manner dependent on the cleavage of the detection oligonucleotide is used for the target nucleotide sequence having the highest relatively high detection temperature among the at least three target nucleotide sequences.
Согласно одному из воплощений данного изобретения средство генерации сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей самую относительно высокую температуру детекции, представляет собой средство генерации сигнала с использованием расщепления детектирующего олигонуклеотида, а средства генерации сигнала для других нуклеотидных последовательностей-мишеней представляют собой средства генерации сигнала с использованием образования дуплекса.According to one embodiment of the present invention, the signal generating means for the target nucleotide sequence having the highest detection temperature is the signal generating means using cleavage of the detection oligonucleotide, and the signal generating means for the other target nucleotide sequences are the signal generating means using duplex formation.
Согласно одному из воплощений данного изобретения средство генерации сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей самую относительно высокую температуру детекции, представляет собой средство генерации сигнала с использованием расщепления детектирующего олигонуклеотида, а средства генерации сигнала для других нуклеотидных последовательностей-мишеней представляют собой средства генерации сигнала с использованием образования дуплекса способом, зависящим от расщепления опосредующего олигонуклеотида, специфически гибридизованного с нуклеотидной последовательностью-мишенью.According to one embodiment of the present invention, the signal generating means for the target nucleotide sequence having the highest detection temperature is the signal generating means using cleavage of the detection oligonucleotide, and the signal generating means for the other target nucleotide sequences are the signal generating means using forming a duplex in a manner dependent on cleavage of a mediating oligonucleotide specifically hybridized to a target nucleotide sequence.
Согласно одному из воплощений данного изобретения, в результате расщепления опосредующего олигонуклеотида высвобождается фрагмент, и этот фрагмент опосредует образование дуплекса или расщепление детектирующего олигонуклеотида путем удлинения данного фрагмента на захватывающем олигонуклеотиде.According to one embodiment of the present invention, cleavage of the mediating oligonucleotide releases a fragment, and the fragment mediates duplex formation or cleavage of the detection oligonucleotide by extending the fragment on the capture oligonucleotide.
Согласно одному из воплощений данного изобретения по меньшей мере три средства генерации сигнала содержат идентичную метку, и сигналы от этой метки не различаются детектором одного типа.According to one embodiment of the present invention, at least three signal generating means contain an identical label, and the signals from this label are not distinguished by a detector of the same type.
Согласно одному из воплощений данного изобретения, если средство генерации сигнала генерирует сигнал способом, зависящим от образования дуплекса, то температуру детекции выбирают на основе величины Тпл дуплекса.According to one embodiment of the present invention, if the signal generating means generates a signal in a manner dependent on duplex formation, then the detection temperature is selected based on the Tm value of the duplex.
Согласно одному из воплощений данного изобретения, если средство генерации сигнала генерирует сигнал способом, зависящим от расщепления детектирующего олигонуклеотида, то температуру детекции выбирают произвольным образом. Согласно одному из воплощений данного изобретения, средство генерации сигнала с использованием расщепления детектирующего олигонуклеотида может обеспечивать использование самой относительно высокой температуры детекции.According to one embodiment of the present invention, if the signal generating means generates a signal in a manner dependent on the cleavage of the detecting oligonucleotide, then the detection temperature is chosen arbitrarily. According to one of the embodiments of the present invention, the means for generating a signal using the cleavage of the detection oligonucleotide can ensure that the relatively high detection temperature is used.
Согласно одному из воплощений, температуры детекции для нуклеотидных последовательностей-мишеней предварительно задают с учетом температурного диапазона, допускающего генерирование сигнала данными средствами генерации сигнала.According to one embodiment, the detection temperatures for the target nucleotide sequences are pre-set to a temperature range that allows signal generation by the given signal generation means.
Согласно одному из воплощений температуру детекции для каждой нуклеотидной последовательности-мишени предварительно задают с учетом температурного диапазона, допускающего генерирование сигнала с использованием средства генерации сигнала для детекции каждой нуклеотидной последовательности-мишени. Температуры детекции можно предварительно задавать с учетом неперекрывающегося диапазона температур детекции и перекрывающегося диапазона температур детекции и из температур детекции.In one embodiment, the detection temperature for each target nucleotide sequence is predetermined to a temperature range that allows signal generation using a signal generator to detect each target nucleotide sequence. The detection temperatures can be pre-set considering the non-overlapping detection temperature range and the overlapping detection temperature range and from the detection temperatures.
Детекцию при конкретной температуре детекции осуществляют с целью детектирования сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей данную температуру детекции, но также и сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей более высокую температуру детекции, чем данная температура детекции. Детекцию при самой относительно высокой температуре детекции осуществляют с целью детектирования сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей самую относительно высокую температуру детекции.Detection at a specific detection temperature is performed to detect a signal for a target nucleotide sequence having a given detection temperature, but also a signal for a target nucleotide sequence having a higher detection temperature than the given detection temperature. Detection at the relatively high detection temperature is performed in order to detect a signal for the target nucleotide sequence having the relatively high detection temperature.
Например, если нуклеотидные последовательности-мишени содержат три последовательности-мишени, и для этих трех последовательностей-мишеней задают температуры детекции 72°C, 60°C и 50°C, соответственно, то детекция при 50°C включает не только детекцию сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей температуру детекции 50°C, но также детекцию сигналов для нуклеотидных последовательностей-мишеней, имеющих температуру детекции 70°C и 60°C, соответственно.For example, if the target nucleotide sequences contain three target sequences, and these three target sequences are set to detection temperatures of 72°C, 60°C, and 50°C, respectively, then detection at 50°C includes not only signal detection for the nucleotide a target sequence having a detection temperature of 50°C, but also signal detection for target nucleotide sequences having a detection temperature of 70°C and 60°C, respectively.
Один из признаков настоящего изобретения относится к дифференцированному определению присутствия по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней путем детектирования при разных температурах детекции сигналов, указывающих на присутствие этих по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней.One feature of the present invention relates to differentiated detection of the presence of at least three target nucleotide sequences by detecting at different detection temperatures signals indicative of the presence of the at least three target nucleotide sequences.
Стадия (b). Определение присутствия по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишенейStep (b). Determining the presence of at least three target nucleotide sequences
После детекции сигнала присутствие по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней определяют на основе сигнала, детектируемого на стадии (а).After signal detection, the presence of at least three target nucleotide sequences is determined based on the signal detected in step (a).
Согласно одному из воплощений присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей конкретную температуру детекции, определяют способом, при котором сигнал, детектируемый при данной конкретной температуре детекции, анализируют с использованием сигнала, детектируемого при температурах детекции, превышающих данную конкретную температуру детекции, чтобы проверить, содержит ли сигнал, детектируемый при данной конкретной температуре детекции, сигнал, предоставляемый нуклеотидной последовательностью-мишенью, имеющей данную конкретную температуру детекции, или нет.According to one embodiment, the presence of a target nucleotide sequence having a specific detection temperature is determined by a method in which a signal detected at that specific detection temperature is analyzed using a signal detected at detection temperatures above that specific detection temperature to check whether it contains a signal detectable at that particular detection temperature, a signal provided by a target nucleotide sequence having that particular detection temperature, or not.
Если необходимо определить присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей конкретную температуру детекции, среди по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней, то присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей данную конкретную температуру детекции, определяют по разнице между сигналом, детектируемым при одной или более температурах детекции, превышающих данную конкретную температуру детекции, и сигналом, детектируемым при данной конкретной температуре детекции. Если данная конкретная температура детекции является самой относительно высокой температурой детекции среди температур детекции, то присутствие нуклеотидной последовательности-мишени определяют на основе сигнала, детектируемого при данной конкретной температуре детекции.If it is necessary to determine the presence of a target nucleotide sequence having a particular detection temperature among at least three target nucleotide sequences, then the presence of a target nucleotide sequence having that particular detection temperature is determined by the difference between the signal detected at one or more detection temperatures exceeding this particular detection temperature, and the signal detected at this particular detection temperature. If this particular detection temperature is the relatively highest detection temperature among the detection temperatures, then the presence of the target nucleotide sequence is determined based on the signal detected at that particular detection temperature.
Согласно одному из воплощений указанная разница представляет собой разницу, получаемую в результате математической обработки сигнала, детектируемого при одной или более температурах детекции, превышающих данную конкретную температуру детекции, и сигнала, детектируемого при данной конкретной температуре детекции.In one embodiment, said difference is the difference resulting from mathematical processing of a signal detected at one or more detection temperatures above a given specific detection temperature and a signal detected at that particular detection temperature.
Согласно одному из воплощений, если сигнал не детектируется при температурах детекции, превышающих данную конкретную температуру детекции, то определение присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей данную конкретную температуру детекции, осуществляют на основе сигнала, детектируемого при данной конкретной температуре детекции, с учетом отсутствия детекции сигнала при температурах детекции, превышающих данную конкретную температуру детекции. Это воплощение относится к тому, что использование разницы, обусловленной присутствием и отсутствием сигналов, позволяет провести определение присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей данную конкретную температуру детекции.According to one embodiment, if no signal is detected at detection temperatures above a given specific detection temperature, then determining the presence of a target nucleotide sequence having that particular detection temperature is based on the signal detected at that particular detection temperature, taking into account the absence of signal detection. at detection temperatures above that particular detection temperature. This embodiment refers to the fact that the use of the difference due to the presence and absence of signals, allows the determination of the presence of the target nucleotide sequence having this particular detection temperature.
Например, исходя из того, что нуклеотидные последовательности-мишени содержат четыре последовательности-мишени, для этих четырех последовательностей-мишеней задают температуры детекции 72°C, 60°C, 50°C и 40°C, соответственно, и на стадии (а) детектируют сигналы при температурах детекции 60°C, 50°C и 40°C. Если необходимо определить присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей температуру детекции 40°C, то присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей данную конкретную температуру детекции (40°C) определяют, используя разницу между сигналом, детектируемым при одной или более температурах детекции (60°C и 50°C), превышающих данную конкретную температуру детекции (40°C), и сигналом, детектируемым при данной конкретной температуре детекции. Более наглядно, для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей температуру детекции 40°C, можно использовать разницу между сигналом, детектируемым при 60°C, и сигналом, детектируемым при 40°C, разницу между сигналом, детектируемым при 50°C, и сигналом, детектируемым при 40°C, или обе эти разницы.For example, based on the fact that the target nucleotide sequences contain four target sequences, detection temperatures are set for these four target sequences of 72°C, 60°C, 50°C and 40°C, respectively, and in step (a) detect signals at detection temperatures of 60°C, 50°C and 40°C. If it is necessary to determine the presence of a target nucleotide sequence having a detection temperature of 40°C, then the presence of a target nucleotide sequence having this particular detection temperature (40°C) is determined using the difference between the signal detected at one or more detection temperatures (60°C C and 50°C) exceeding that particular detection temperature (40°C) and the signal detected at that particular detection temperature. More clearly, to determine the presence of a target nucleotide sequence having a detection temperature of 40°C, the difference between the signal detected at 60°C and the signal detected at 40°C, the difference between the signal detected at 50°C and signal detected at 40°C, or both of these differences.
Присутствие нуклеотидных последовательностей-мишеней, имеющих другие температуры детекции (т.е. 60°C и 50°C), может быть определено соответственно так, как изложено выше.The presence of target nucleotide sequences having other detection temperatures (ie 60°C and 50°C) can be determined, respectively, as described above.
Термин "разница между сигналом, детектируемым при одной или более температурах детекции, превышающих данную конкретную температуру детекции, и сигналом, детектируемым при данной конкретной температуре детекции" подразумевает, что данную разницу получают для сигналов при двух температурах детекции. Один из этих сигналов представляет собой сигнал, детектируемый при одной из температур детекции, превышающих данную конкретную температуру детекции, а другой представляет собой сигнал, детектируемым при данной конкретной температуре детекции. Если число температур детекции, превышающих данную конкретную температуру детекции, больше двух, то и число полученных разниц может быть больше двух.The term "difference between a signal detected at one or more detection temperatures above a given particular detection temperature and a signal detected at that particular detection temperature" implies that this difference is obtained for signals at two detection temperatures. One of these signals is a signal detected at one of the detection temperatures above that particular detection temperature, and the other is a signal detected at that particular detection temperature. If the number of detection temperatures exceeding this particular detection temperature is greater than two, then the number of obtained differences may be greater than two.
Термин "разница между сигналом, детектируемым при одной или более температурах детекции, и сигналом, детектируемым при данной конкретной температуре детекции" подразумевает не только разницу между сигналами, детектируемыми при двух температурах детекции, но также разницу, получаемую с использованием разницы между сигналами при этих двух температурах детекции, и сигналом, детектируемым при другой температуре детекции.The term "difference between the signal detected at one or more detection temperatures and the signal detected at that particular detection temperature" means not only the difference between the signals detected at two detection temperatures, but also the difference obtained using the difference between the signals at these two detection temperatures. detection temperatures, and a signal detected at a different detection temperature.
Альтернативно, согласно одному из воплощений присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей конкретную температуру детекции (60°C), определяют, используя разницу, получаемую в результате математической обработки сигнала, детектируемого при одной или более температурах детекции (72°C), превышающих данную конкретную температуру детекции (60°C), и сигнала, детектируемого при данной конкретной температуре детекции. В случае отсутствия детекции сигнала при более высокой температуре детекции (72°C), для вычисления данной разницы можно использовать фоновый сигнал.Alternatively, in one embodiment, the presence of a target nucleotide sequence having a specific detection temperature (60°C) is determined using the difference resulting from mathematical processing of a signal detected at one or more detection temperatures (72°C) above that specific detection temperature. detection temperature (60°C), and the signal detected at that particular detection temperature. If no signal is detected at a higher detection temperature (72°C), the background signal can be used to calculate this difference.
Согласно одному из воплощений, при отсутствии детекции сигнала при температуре детекции (72°C), превышающей конкретную температуру детекции (60°C), присутствие нуклеотидной лоследовательности-мишени, имеющей данную конкретную температуру детекции (60°C), определяют, используя сигнал, детектируемый при данной конкретной температуре детекции (60°C) с учетом отсутствия детекции сигнала при температуре детекции (72°C), превышающей данную конкретную температуру детекции (60°C).According to one embodiment, in the absence of signal detection at a detection temperature (72°C) higher than a specific detection temperature (60°C), the presence of a target nucleotide sequence having that specific detection temperature (60°C) is determined using a signal detectable at this specific detection temperature (60°C) considering no signal detection at a detection temperature (72°C) higher than this specific detection temperature (60°C).
Если сигнал детектируют при самой высокой температуре детекции (72°C), то можно сделать заключение, что присутствует нуклеотидная последовательность-мишень, имеющая самую относительно высокую температуру детекции.If a signal is detected at the highest detection temperature (72° C.), then it can be concluded that a target nucleotide sequence having the highest relatively high detection temperature is present.
Согласно одному из воплощений, если необходимо определить присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей конкретную температуру детекции, среди по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней, то присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей данную конкретную температуру детекции, определяют, используя разницу между сигналом, детектируемым при температуре детекции, непосредственно более высокой, чем данная конкретная температура детекции, и сигналом, детектируемым при данной конкретной температуре детекции.According to one of the embodiments, if it is necessary to determine the presence of a target nucleotide sequence having a specific detection temperature among at least three target nucleotide sequences, then the presence of a target nucleotide sequence having this specific detection temperature is determined using the difference between the signal detected at a detection temperature immediately higher than that particular detection temperature and a signal detectable at that particular detection temperature.
Согласно одному из воплощений, использованием разницы включает использование разницы, получаемой в результате математической обработки сигнала, детектируемого при температуре детекции, непосредственно более высокой, чем данная конкретная температура детекции, и сигнала, детектируемого при данной конкретной температуре детекции.According to one embodiment, using the difference includes using the difference resulting from mathematical processing of a signal detected at a detection temperature immediately higher than a given specific detection temperature and a signal detected at that particular detection temperature.
Согласно одному из воплощений, если сигнал не детектируется при температуре детекции, непосредственно более высокой, чем конкретная температура детекции, то использование разницы включает использование сигнала, детектируемого при данной конкретной температуре детекции, с учетом отсутствия детекции сигнала при температуре детекции, непосредственно более высокой, чем данная конкретная температура детекции.According to one embodiment, if no signal is detected at a detection temperature immediately higher than the specific detection temperature, then using the difference includes using the signal detected at that specific detection temperature, taking into account no signal detection at a detection temperature immediately higher than this particular detection temperature.
Например, если необходимо определить присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей температуру детекции 40°C, то присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей данную конкретную температуру детекции, определяют, используя разницу между сигналом, детектируемым при температуре детекции (50°C), непосредственно более высокой, чем данная конкретная температура детекции (40°C), и сигналом, детектируемым при данной конкретной температуре детекции.For example, if it is necessary to determine the presence of a target nucleotide sequence having a detection temperature of 40°C, then the presence of a target nucleotide sequence having this particular detection temperature is determined using the difference between the signal detected at the detection temperature (50°C) directly over higher than this specific detection temperature (40°C) and a signal detected at this specific detection temperature.
Согласно одному из воплощений, для определения того, указывают ли сигналы, детектируемые при температурах детекции 50°C и 40°C, на присутствие нуклеотидных последовательностей-мишеней, имеющих температуры детекции 50°C и 40°C, необходимо использовать референсное значение.In one embodiment, a reference value must be used to determine whether signals detected at detection temperatures of 50°C and 40°C indicate the presence of target nucleotide sequences having detection temperatures of 50°C and 40°C.
Согласно одному из воплощений данного изобретения, в зависимости от подходов к получению разницы, для анализа того, является ли полученное значение разницы указанием на присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей конкретную температуру детекции, может быть применено понятие порога.According to one of the embodiments of the present invention, depending on the approaches to obtaining a difference, the concept of a threshold can be applied to analyze whether the obtained difference value is indicative of the presence of a target nucleotide sequence having a particular detection temperature.
Согласно одному из воплощений данного изобретения, в зависимости от подходов к получению разницы, присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей конкретную температуру детекции, можно определить, используя значение самой полученной разницы. Например, предварительное указание порогового значения для получения разницы является примером воплощения такого непосредственного использования самой разницы.According to one of the embodiments of the present invention, depending on the approaches to obtaining a difference, the presence of a target nucleotide sequence having a particular detection temperature can be determined using the value of the obtained difference itself. For example, pre-specifying a threshold to obtain a difference is an example of implementing such a direct use of the difference itself.
Согласно одному из воплощений данного изобретения референсное значение используют для определения присутствия нуклеотидных последовательностей-мишеней.According to one embodiment of the present invention, the reference value is used to determine the presence of target nucleotide sequences.
В конкретном воплощении разница в сигналах при данной конкретной температуре детекции и температуре детекции, превышающей данную конкретную температуру детекции, предоставляемая нуклеотидной последовательностью-мишенью, имеющей температуру детекции, превышающую данную конкретную температуру детекции, может быть выражена через референсное значение.In a particular embodiment, the difference in signals at that particular detection temperature and a detection temperature above that particular detection temperature provided by a target nucleotide sequence having a detection temperature above that particular detection temperature can be expressed in terms of a reference value.
В конкретном воплощении, референсное значение для случая, когда сигналы при конкретной температуре детекции и температуре детекции, превышающей данную конкретную температуру детекции, предоставляемые нуклеотидной последовательностью-мишенью, имеющей температуру детекции, превышающую данную конкретную температуру детекции, отличаются друг от друга, может отличаться более чем на 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5%, 10%, 12%, 15%, 20% или 30% по сравнению с референсным значением для случая, когда эти два сигнала являются одинаковыми.In a particular embodiment, the reference value for the case where the signals at a particular detection temperature and a detection temperature above that particular detection temperature provided by a target nucleotide sequence having a detection temperature above that particular detection temperature differ from each other may differ by more than by 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6 .5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5%, 10%, 12%, 15%, 20% or 30% compared to the reference value for the case, when the two signals are the same.
В конкретном воплощении, референсное значение для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей температуру детекции, превышающую конкретную температуру детекции, можно использовать при определении присутствия этой нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей конкретную низкую температуру детекции, если референсное значение для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей температуру детекции, превышающую данную конкретную температуру детекции, рассчитанное, исходя из сигналов при этих двух температурах детекции, может отличаться более чем на 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5%, 10%, 12%, 15%, 20% или 30% по сравнению с референсным значением для случая, когда эти два сигнала являются одинаковыми.In a particular embodiment, a reference value for a target nucleotide sequence having a detection temperature greater than a particular detection temperature may be used in determining the presence of that target nucleotide sequence having a particular low detection temperature if the reference value for a target nucleotide sequence having a detection temperature exceeding this particular detection temperature calculated from signals at these two detection temperatures may differ by more than 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5 %, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5%, 10%, 12%, 15%, 20% or 30% compared to the reference value when the two signals are the same.
Согласно одному из воплощений, если сравнение проводят для определения возможности использования референсного значения, то это референсное значение рассчитывают путем деления сигналов. Согласно одному из воплощений способ вычисления референсного значения для определения возможности использования референсного значения может быть одним и тем же способом вычисления референсного значения для детекции нуклеотидной последовательности-мишени или отличаться от него.According to one of the embodiments, if the comparison is carried out to determine the possibility of using a reference value, then this reference value is calculated by dividing the signals. According to one of the embodiments, the method of calculating the reference value for determining the possibility of using the reference value may be the same or different from the method for calculating the reference value for detecting the target nucleotide sequence.
Согласно одному из воплощений, если сигналы для множества нуклеотидных последовательностей-мишеней детектируют при температуре детекции, превышающей конкретную температуру детекции, то референсное значение для множества нуклеотидных последовательностей-мишеней используют с учетом закономерности изменения сигнала при измененных температурах детекции для множества нуклеотидных последовательностей-мишеней.According to one embodiment, if signals for a plurality of target nucleotide sequences are detected at a detection temperature higher than a specific detection temperature, then a reference value for a plurality of target nucleotide sequences is used, taking into account the pattern of signal change at changed detection temperatures for a plurality of target nucleotide sequences.
Согласно одному из воплощений, если присутствует нуклеотидная последовательность-мишень, имеющая температуру детекции, превышающую конкретную температуру детекции, то референсное значение используют для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей данную конкретную температуру детекции.In one embodiment, if a target nucleotide sequence is present having a detection temperature greater than a particular detection temperature, then the reference value is used to determine the presence of a target nucleotide sequence having that particular detection temperature.
Случай, когда присутствует нуклеотидная последовательность-мишень, имеющая температуру детекции, превышающую конкретную температуру детекции, включает случай, когда при температуре детекции, превышающей данную конкретную температуру детекции, детектируют значимый сигнал, указывающий на присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей температуру детекции, превышающую данную конкретную температуру детекции.A case where a target nucleotide sequence is present having a detection temperature greater than a specific detection temperature includes a case where a significant signal is detected at a detection temperature greater than that particular detection temperature, indicating the presence of a target nucleotide sequence having a detection temperature greater than a given detection temperature. specific detection temperature.
Согласно одному из воплощений, если нуклеотидная последовательность-мишень, имеющая температуру детекции, превышающую конкретную температуру детекции, отсутствует, то референсное значение возможно используют для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей данную конкретную температуру детекции.In one embodiment, if there is no target nucleotide sequence having a detection temperature above a particular detection temperature, then the reference value is optionally used to determine the presence of a target nucleotide sequence having that particular detection temperature.
Случай, когда нуклеотидная последовательность-мишень, имеющая температуру детекции, превышающую конкретную температуру детекции, отсутствует, включает случай, когда детектируют только сигнал с интенсивностью, аналогичной интенсивности фонового сигнала.The case where there is no target nucleotide sequence having a detection temperature higher than the specific detection temperature includes the case where only a signal with an intensity similar to that of the background signal is detected.
Референсные значения могут быть предварительно получены для всех комбинаций или для некоторых отдельных комбинаций нуклеотидных последовательностей-мишеней. Согласно одному из воплощений данного изобретения референсное значение представляет собой разницу между сигналами при температурах детекции, полученных для указанных выше комбинаций.Reference values can be previously obtained for all combinations or for some individual combinations of target nucleotide sequences. According to one of the embodiments of the present invention, the reference value is the difference between the signals at the detection temperatures obtained for the above combinations.
Согласно одному из воплощений данного изобретения референсное значение может быть получено в реакционных условиях, достаточных для получения насыщенного сигнала по завершении реакции. Например, чтобы получить референсное значение для комбинации из двух нуклеотидных последовательностей-мишеней, реакционные условия, как например, содержание каждой нуклеотидной последовательности-мишени, выбирают таким образом, чтобы по завершении реакции получить насыщенный сигнал для каждой нуклеотидной последовательности-мишени. Согласно одному из воплощений данного изобретения разница между сигналами, полученными при вычислении референсного значения, лежит в конкретном диапазоне, и референсное значение выбирают в пределах этого конкретного диапазона или с указанием на этот конкретный диапазон.According to one of the embodiments of the present invention, the reference value can be obtained under reaction conditions sufficient to obtain a saturated signal at the end of the reaction. For example, to obtain a reference value for a combination of two target nucleotide sequences, reaction conditions, such as the content of each target nucleotide sequence, are chosen such that upon completion of the reaction, a saturated signal is obtained for each target nucleotide sequence. According to one of the embodiments of the present invention, the difference between the signals obtained when calculating the reference value lies in a specific range, and the reference value is selected within this specific range or indicating this specific range.
Референсные значения можно использовать для определения значимости разницы, полученной для образца, с учетом способа получения разницы и практических результатов детекции. Референсные значения можно использовать для получения разницы для образца, тем самым они вовлечены в определение присутствия нуклеиновой кислоты-мишени.Reference values can be used to determine the significance of the difference obtained for the sample, taking into account the way the difference was obtained and the practical results of detection. Reference values can be used to make a difference for a sample, thus being involved in determining the presence of a target nucleic acid.
Согласно одному из воплощений данного изобретения, для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей конкретную температуру детекции, в данном способе используют по меньшей мере одно референсное значение из референсных значений, полученных посредством (1) инкубирования всех комбинаций нуклеотидных последовательностей-мишеней, имеющих температуры детекции выше данной конкретной температуры детекции, с соответствующими средствами генерации сигнала в другом реакционном сосуде, нежели реакционный сосуд на стадии (а), (2) детекции сигналов не только при одной или более температурах детекции, превышающих данную конкретную температуру детекции, но также и при данной конкретной температуре детекции, и (3) затем получения разницы между сигналом, детектируемым при одной или более температурах детекции, превышающих данную конкретную температуру детекции, и сигналом, детектируемым при данной конкретной температуре детекции.According to one embodiment of the present invention, to determine the presence of a target nucleotide sequence having a particular detection temperature, the method uses at least one reference value from among the reference values obtained by (1) incubating all combinations of target nucleotide sequences having detection temperatures above this particular detection temperature, with appropriate means of generating a signal in a reaction vessel other than the reaction vessel in step (a), (2) of detecting signals not only at one or more detection temperatures above that particular detection temperature, but also at a given a specific detection temperature, and (3) then obtaining a difference between a signal detected at one or more detection temperatures above that particular detection temperature and a signal detected at that particular detection temperature.
Если согласно настоящему изобретению предполагается детектировать по меньшей мере три нуклеотидные последовательности-мишени, то с учетом различных комбинаций нуклеотидных последовательностей-мишеней с разной комбинацией двух температур детекции, выбранных для детекции сигналов, могут быть получены различные референсные значения.If at least three target nucleotide sequences are to be detected according to the present invention, different reference values can be obtained by considering different combinations of target nucleotide sequences with a different combination of two detection temperatures selected for signal detection.
Согласно одному из воплощений данного изобретения присутствие нуклеотидных последовательностей-мишеней определяют в порядке их температур детекции, начиная от нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей самую высокую температуру детекции, до нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей самую низкую температуру детекции, и в зависимости от способов определения присутствия мишени выбирают подходящие референсные значения и их используют.According to one embodiment of the present invention, the presence of target nucleotide sequences is determined in the order of their detection temperatures, starting from the target nucleotide sequence having the highest detection temperature to the target nucleotide sequence having the lowest detection temperature, and depending on the methods for determining the presence targets choose appropriate reference values and use them.
В приведенном выше примере, для получения референсного значения для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей конкретную температуру детекции (40°C), все комбинации (т.е. нуклеотидную последовательность-мишень, имеющую температуру детекции 60°C, нуклеотидную последовательность-мишень, имеющую температуру детекции 50°C, и комбинацию нуклеотидных последовательностей-мишеней, имеющих температуры детекции 60°C и 50°C) нуклеотидных последовательностей-мишеней, имеющих температуры детекции (60°C и 50°C), превышающие данную конкретную температуру детекции (40°C), инкубируют со средствами генерации сигнала для генерирования сигналов; сигналы детектируют не только при одной или более температурах детекции (60°C и 50°C), превышающих данную конкретную температуру детекции (40°C), но также и при данной конкретной температуре детекции (40°C); и затем сигнал, детектируемый при одной или более температурах детекции, превышающих данную конкретную температуру детекции, и сигнал, детектируемый при данной конкретной температуре детекции, используют для получения разницы между данными сигналами. В соответствии с этим же способом получают референсные значения для определения присутствия нуклеотидных последовательностей-мишеней, имеющих другие температуры детекции (т.е. 60°C и 50°C).In the above example, in order to obtain a reference value for determining the presence of a target nucleotide sequence having a specific detection temperature (40°C), all combinations (i.e., a target nucleotide sequence having a detection temperature of 60°C, a target nucleotide sequence , having a detection temperature of 50°C, and a combination of target nucleotide sequences having detection temperatures of 60°C and 50°C) of target nucleotide sequences having detection temperatures (60°C and 50°C) above this particular detection temperature ( 40° C.), incubated with signal generating means to generate signals; signals are detected not only at one or more detection temperatures (60°C and 50°C) above this particular detection temperature (40°C), but also at this particular detection temperature (40°C); and then, a signal detected at one or more detection temperatures above that particular detection temperature and a signal detected at that particular detection temperature are used to obtain a difference between these signals. According to the same method, reference values are obtained to determine the presence of target nucleotide sequences having different detection temperatures (ie 60°C and 50°C).
Альтернативно, для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей конкретную температуру детекции, в данном способе дополнительно используют по меньшей мере одно референсное значение из референсных значений, полученных посредством (1) инкубирования всех комбинаций нуклеотидных последовательностей-мишеней, имеющих температуры детекции выше данной конкретной температуры детекции, с соответствующими средствами генерации сигнала в другом реакционном сосуде, нежели реакционный сосуд на стадии (а), (2) детекции сигналов как при температуре детекции, непосредственно более высокой, чем данная конкретная температура детекции, так и при данной конкретной температуре детекции, и (3) затем получения разницы между сигналом, детектируемым при температуре детекции, непосредственно более высокой, чем данная конкретная температура детекции, и сигналом, детектируемым при данной конкретной температуре детекции, для получения разницы между сигналами.Alternatively, to determine the presence of a target nucleotide sequence having a particular detection temperature, the method further uses at least one reference value from among the reference values obtained by (1) incubating all combinations of target nucleotide sequences having detection temperatures above that particular temperature. detection, with appropriate signal generation means in a different reaction vessel than the reaction vessel in step (a), (2) detecting signals both at a detection temperature immediately higher than that particular detection temperature and at that particular detection temperature, and (3) then obtaining a difference between a signal detected at a detection temperature immediately higher than that particular detection temperature and a signal detected at that particular detection temperature to obtain a difference between the signals.
В приведенном выше примере, для получения референсного значения с целью определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей данную конкретную температуру детекции (40°C), все комбинации (т.е. нуклеотидную последовательность-мишень, имеющую температуру детекции 60°C, нуклеотидную последовательность-мишень, имеющую температуру детекции 50°C, и комбинацию нуклеотидных последовательностей-мишеней, имеющих температуры детекции 60°C и 50°C) нуклеотидных последовательностей-мишеней, имеющих температуры детекции (60°C и 50°C), превышающие данную конкретную температуру детекции (40°C), инкубируют со средствами генерации сигнала для генерирования сигналов; сигналы детектируют как при температуре детекции (50°C), непосредственно более высокой, чем данная конкретная температура детекции (40°C), так и при данной конкретной температуре детекции (40°C); и затем сигнал, детектируемый при температуре детекции (50°C), непосредственно более высокой, чем данная конкретная температура детекции, и сигнал, детектируемый при данной конкретной температуре детекции (40°C), используют для получения разницы между данными сигналами. В соответствии с этим же способом получают референсные значения для определения присутствия нуклеотидных последовательностей-мишеней, имеющих другие температуры детекции (т.е. 60°C и 50°C).In the above example, in order to obtain a reference value to determine the presence of a target nucleotide sequence having a given specific detection temperature (40°C), all combinations (i.e. a target nucleotide sequence having a detection temperature of 60°C, a nucleotide sequence - a target having a detection temperature of 50°C and a combination of target nucleotide sequences having detection temperatures of 60°C and 50°C) of target nucleotide sequences having detection temperatures (60°C and 50°C) above this particular temperature detection (40°C), incubated with signal generation means to generate signals; signals are detected both at a detection temperature (50°C) immediately higher than this particular detection temperature (40°C) and at this particular detection temperature (40°C); and then, a signal detected at a detection temperature (50°C) immediately higher than that particular detection temperature and a signal detected at that particular detection temperature (40°C) are used to obtain a difference between these signals. According to the same method, reference values are obtained to determine the presence of target nucleotide sequences having different detection temperatures (ie 60°C and 50°C).
Согласно одному из воплощений данного изобретения референсное значение получают путем вычисления соотношения между сигналами, детектируемыми при одной из температур детекции, превышающей конкретную температуру детекции, и при данной конкретной температуре детекции, или путем выполнения операции вычитания в отношении этих сигналов. Согласно одному из воплощений данного изобретения референсное значение получают путем вычисления отношения сигнала, детектируемого при конкретной температуре детекции, к сигналу, детектируемому при одной из температур детекции, превышающей данную конкретную температуру детекции. Согласно одному из воплощений данного изобретения референсное значение получают путем вычисления отношения сигнала, детектируемого при одной из температур детекции, превышающей конкретную температуру детекции, к сигналу, детектируемому при данной конкретной температуре детекции.According to one embodiment of the present invention, the reference value is obtained by calculating the ratio between the signals detected at one of the detection temperatures above a particular detection temperature and at that particular detection temperature, or by performing a subtraction operation on these signals. According to one embodiment of the present invention, the reference value is obtained by calculating the ratio of the signal detected at a particular detection temperature to the signal detected at one of the detection temperatures above that particular detection temperature. According to one embodiment of the present invention, the reference value is obtained by calculating the ratio of the signal detected at one of the detection temperatures above a particular detection temperature to the signal detected at that particular detection temperature.
Согласно одному из воплощений, если с использованием референсного значения получают значение порога для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей конкретную температуру детекции, то его можно получить, используя конкретное референсное значение или некоторые референсные значения из референсных значений, полученных для различных комбинаций нуклеотидных последовательностей-мишеней. Например, если анализируют возможное отсутствие одной нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей температуру детекции, превышающую конкретную температуру детекции, то для определения порога применяют референсные значения, полученные для комбинации нуклеотидных последовательностей-мишеней, не содержащих эту нуклеотидную последовательность-мишень.According to one of the embodiments, if a threshold value is obtained using a reference value for determining the presence of a target nucleotide sequence having a specific detection temperature, then it can be obtained using a specific reference value or some reference values from the reference values obtained for various combinations of nucleotide sequences - targets. For example, if the possible absence of a single target nucleotide sequence having a detection temperature higher than a particular detection temperature is analyzed, then reference values obtained for a combination of target nucleotide sequences not containing that target nucleotide sequence are used to determine the threshold.
В одном из воплощений, если детектируют по меньшей мере три нуклеотидные последовательности-мишени, то для проверки присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей конкретную температуру детекции, предварительно получают стандартный образец, содержащий комбинации нуклеотидных последовательностей-мишеней за исключением нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей данную конкретную температуру детекции, и затем получают референсные значения. С учетом данных референсных значений получают значение порога для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей данную конкретную температуру детекции.In one embodiment, if at least three target nucleotide sequences are detected, then in order to check for the presence of a target nucleotide sequence having a particular detection temperature, a standard sample is preliminarily obtained containing combinations of target nucleotide sequences with the exception of the target nucleotide sequence having a given specific detection temperature, and then get the reference values. Based on these reference values, a threshold value is obtained for determining the presence of a target nucleotide sequence having this particular detection temperature.
Согласно одному из воплощений, использование сигнала, детектируемого при конкретной температуре детекции, включает получение квалификационного значения для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей самую относительно высокую температуру детекции, а использование разницы включает получение квалификационного значения для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей данную конкретную температуру детекции.According to one of the embodiments, the use of a signal detected at a particular detection temperature includes obtaining a qualification value for determining the presence of a target nucleotide sequence having the highest relatively high detection temperature, and using the difference includes obtaining a qualification value for determining the presence of a target nucleotide sequence having a given specific detection temperature.
Согласно одному из воплощений данного изобретения, использование разницы включает получение квалификационного значения для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей конкретную температуру детекции, и данное квалификационное значение получают в результате (1) математической обработки сигнала, детектируемого при одной или более температурах детекции, превышающих данную конкретную температуру детекции, и сигнала, детектируемого при данной конкретной температуре детекции, или (2) использования сигнала, детектируемого при данной конкретной температуре детекции, с учетом отсутствия детекции сигнала при одной или более температурах детекции, превышающих данную конкретную температуру детекции, если данный сигнал не детектируется при одной или более температурах детекции, превышающих данную конкретную температуру детекции.According to one embodiment of the present invention, the use of the difference includes obtaining a qualification value for determining the presence of a target nucleotide sequence having a particular detection temperature, and this qualification value is obtained as a result of (1) mathematical processing of a signal detected at one or more detection temperatures exceeding this a specific detection temperature, and a signal detectable at that particular detection temperature, or (2) using a signal detectable at that particular detection temperature, considering no signal detection at one or more detection temperatures above that particular detection temperature, if that signal is not is detected at one or more detection temperatures above that particular detection temperature.
Согласно одному из воплощений данного изобретения стадию (b) проводят, сначала определяя присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей самую относительно высокую температуру детекции, а затем последовательно определяя присутствие нуклеотидных последовательностей-мишеней, имеющих относительно более низкие температуры детекции, в порядке убывания.According to one embodiment of the invention, step (b) is carried out by first detecting the presence of the target nucleotide sequence having the highest relatively high detection temperature, and then sequentially detecting the presence of target nucleotide sequences having relatively lower detection temperatures, in descending order.
Согласно одному из воплощений, один реакционный сосуд дополнительно содержит по меньшей мере один дополнительный комплект, при этом каждый из них содержит по меньшей мере три дополнительных средства генерации сигнала, для детекции других нуклеотидных последовательностей-мишеней, нежели по меньшей мере эти три нуклеотидные последовательности-мишени; при этом сигналы, генерируемые каждым комплектом из по меньшей мере трех средств генерации сигнала в таком сосуде, различаются, и эти сигналы детектируют, используя, соответственно, детекторы разных типов.According to one of the embodiments, one reaction vessel further contains at least one additional set, each of which contains at least three additional signal generating means, for the detection of other target nucleotide sequences than at least these three target nucleotide sequences. ; however, the signals generated by each set of at least three signal generating means in such a vessel are different, and these signals are detected using, respectively, detectors of different types.
Согласно одному из воплощений данного изобретения нуклеотидные последовательности-мишени содержат нуклеотидную вариацию (в частности, SNP).According to one of the embodiments of the present invention, the target nucleotide sequences contain a nucleotide variation (in particular, a SNP).
IV. Детекция двух нуклеотидных последовательностей-мишеней с использованием разных температур детекции и анализа плавленияIV. Detection of two target nucleotide sequences using different detection temperatures and melting analysis
Согласно следующему аспекту данного изобретения предложен способ детекции двух нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием разных температур детекции и анализа плавления, включающий:According to a further aspect of the present invention, there is provided a method for detecting two target nucleotide sequences in a sample using different detection temperatures and melting assays, comprising:
(a) инкубирование образца с двумя средствами генерации сигнала для детекции двух нуклеотидных последовательностей-мишеней в одном реакционном сосуде и детекцию генерируемого сигнала с использованием детектора одного типа; при этом каждую из нуклеотидных последовательностей-мишеней детектируют с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом одна из двух нуклеотидных последовательностей-мишеней имеет относительно высокую температуру детекции, а другая имеет относительно низкую температуру детекции, определяемую с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом относительно высокая температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, а относительно низкая температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование как сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, так и сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции; при этом сигналы, генерируемые этими двумя средствами генерации сигнала, не различаются детектором одного типа; при этом детекцию осуществляют при относительно высокой температуре детекции;(a) incubating the sample with two signal generators to detect two target nucleotide sequences in one reaction vessel and detecting the generated signal using the same type of detector; wherein each of the target nucleotide sequences is detected using an appropriate signal generation means; wherein one of the two target nucleotide sequences has a relatively high detection temperature and the other has a relatively low detection temperature determined using an appropriate signal generation means; wherein the relatively high detection temperature is a temperature that allows signal generation for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature, and the relatively low detection temperature is a temperature that allows generation of a signal for a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature, and a signal for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature; however, the signals generated by these two signal generation means are not distinguished by a detector of the same type; wherein the detection is carried out at a relatively high detection temperature;
(b) проведение анализа плавления для продукта инкубирования со стадии (а) в диапазоне температур для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции; и(b) performing a melt analysis on the incubation product from step (a) over a temperature range to determine the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature; and
(c) определение присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, на основе сигнала, детектируемого на стадии (а), и присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, с использованием результата анализа плавления со стадии (b).(c) determining the presence of a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature based on the signal detected in step (a) and the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature using the result of the melting analysis from step (b) .
Стадия (а). Инкубирование со средствами генерации сигнала и детекция сигналовStage (a). Incubation with Signal Generator and Signal Detection
В первую очередь, анализируемый образец инкубируют со средствами генерации сигнала для детекции двух нуклеотидных последовательностей-мишеней в одном реакционном сосуде и затем генерируемый сигнал детектируют, используя детектор одного типа. Сигналы, генерируемые этими двумя средствами генерации сигнала, не различаются детектором одного типа.First, the sample to be analyzed is incubated with signal generating means for detecting two target nucleotide sequences in one reaction vessel, and then the generated signal is detected using the same type of detector. The signals generated by these two signal generators are not distinguished by the same type of detector.
Каждую из нуклеотидных последовательностей-мишеней детектируют с использованием соответствующего средства генерации сигнала. Одна из двух нуклеотидных последовательностей-мишеней имеет относительно высокую температуру детекции, а другая имеет относительно низкую температуру детекции, определяемую с использованием соответствующего средства генерации сигнала.Each of the target nucleotide sequences is detected using an appropriate signal generator. One of the two target nucleotide sequences has a relatively high detection temperature, and the other has a relatively low detection temperature, determined using an appropriate signal generator.
Согласно одному из воплощений настоящего изобретения нуклеотидную последовательность-мишень, имеющую относительно высокую температуру детекции, детектируют с применением способа детекции в режиме реального времени с использованием своей температуры детекции, а нуклеотидную последовательность-мишень, имеющую относительно низкую температуру детекции, детектируют с использованием анализа плавления.According to one embodiment of the present invention, a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature is detected using a real-time detection method using its detection temperature, and a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature is detected using a melting assay.
Детекцию на стадии (а) проводят при относительно высокой температуре детекции, а не при относительно низкой температуре детекции.Detection in step (a) is carried out at a relatively high detection temperature rather than a relatively low detection temperature.
Средство генерации сигнала, допускающее генерирование сигнала в процессе анализа плавления, выбирают для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции.A signal generating means capable of generating a signal during a melting assay is selected for a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature.
Согласно одному из воплощений, поскольку в средстве генерации сигнала, предназначенном для анализа плавления, применяется гибридизация и денатурация дуплекса, то может генерироваться сигнал, зависящий от реакционных условий на стадии (а).According to one embodiment, since hybridization and duplex denaturation are used in the signal generating tool for melting analysis, a signal can be generated depending on the reaction conditions in step (a).
Согласно одному из воплощений средство генерации сигнала для генерирования сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, должно быть сконструировано таким образом, чтобы не генерировать никакого сигнала при относительно высокой температуре детекции.According to one embodiment, the signal generating means for generating a signal for a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature should be designed so as not to generate any signal at a relatively high detection temperature.
Согласно четвертому аспекту данного изобретения средство генерации сигнала для генерирования сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, может генерировать сигнал или не генерировать сигнала, зависящего от реакционных условий на стадии (а). Даже если сигнал для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, может генерироваться в конкретных реакционных условиях, то такой генерируемый сигнал не детектируется, поскольку детекцию сигнала проводят при относительно высокой температуре детекции на стадии (а).According to a fourth aspect of the present invention, a signal generating means for generating a signal for a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature may or may not generate a signal depending on the reaction conditions in step (a). Even if a signal for a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature can be generated under specific reaction conditions, such generated signal is not detected because signal detection is carried out at a relatively high detection temperature in step (a).
Ввиду того, что сигнал для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, может генерироваться и детектироваться на стадии (b), то генерирования данного сигнала на стадии (а) не добиваются.Since a signal for a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature can be generated and detected in step (b), generation of this signal in step (a) is not achieved.
Согласно одному из воплощений, средство генерации сигнала для анализа плавления не включает средство, генерирующее сигнал с использованием расщепления меченых зондов или меченого дуплекса. Поскольку в анализе плавления используют величину Тпл для гибридных структур, то следует не допускать расщепления детектируемых гибридных структур. При наличии расщепления может не происходить образования пиков плавления или возможно значительное снижение чувствительности детекции. Помимо этого, сигнал в результате такого расщепления, вероятно, будет ложноположительным сигналом для способа детекции в режиме реального времени.According to one embodiment, the signal generating means for melting analysis does not include signal generating means using cleavage of labeled probes or labeled duplex. Since the melting assay uses the Tm value for hybrid structures, splitting of detectable hybrid structures should be avoided. In the presence of cleavage, no melting peaks may occur, or a significant decrease in detection sensitivity may occur. In addition, the signal resulting from such splitting is likely to be a false positive signal for the real-time detection method.
Стадию (а) проводят в условиях, допускающих генерирование по меньшей мере сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции.Step (a) is carried out under conditions capable of generating at least a signal for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature.
Согласно одному из воплощений стадию (а) проводят в процессе амплификации сигнала одновременно с амплификацией нуклеиновой кислоты.According to one embodiment, step (a) is carried out during signal amplification simultaneously with amplification of the nucleic acid.
Согласно одному из воплощений стадию (а) проводят в процессе амплификации сигнала без амплификации нуклеиновой кислоты.According to one embodiment, step (a) is carried out during signal amplification without nucleic acid amplification.
Согласно одному из воплощений, по меньшей мере одно из средств генерации сигнала представляет собой средство генерации сигнала для генерирования сигнала способом, зависящим от образования дуплекса.According to one embodiment, at least one of the signal generating means is a signal generating means for generating a signal in a duplexing dependent manner.
Согласно одному из воплощений средства генерации сигнала для каждой из нуклеотидных последовательностей-мишеней представляют собой средство генерации сигнала для генерирования сигнала способом, зависящим от образования дуплекса.According to one embodiment, the signal generating means for each of the target nucleotide sequences is a signal generating means for generating a signal in a duplex dependent manner.
Согласно одному из воплощений сигнал генерируется в результате образования дуплекса между нуклеотидной последовательностью-мишенью и детектирующим олигонуклеотидом, специфически гибридизованным с данной нуклеотидной последовательностью-мишенью. Согласно одному из воплощений сигнал генерируется дуплексом, образованным способом, зависящим от расщепления опосредующего олигонуклеотида, специфически гибридизованного с нуклеотидной последовательностью-мишенью.In one embodiment, the signal is generated by the formation of a duplex between the target nucleotide sequence and a detection oligonucleotide specifically hybridized to the target nucleotide sequence. In one embodiment, the signal is generated by a duplex formed in a manner dependent on cleavage of a mediating oligonucleotide specifically hybridized to a target nucleotide sequence.
Согласно одному из воплощений, по меньшей мере одно из средств генерации сигнала представляет собой средство генерации сигнала для генерирования сигнала способом, зависящим от расщепления детектирующего олигонуклеотида. Согласно одному из воплощений сигнал генерируется в результате гибридизации детектирующего олигонуклеотида с нуклеотидной последовательностью-мишенью и затем расщепления детектирующего олигонуклеотида. Согласно одному из воплощений сигнал генерируется в результате расщепления детектирующего олигонуклеотида способом, зависящим от расщепления опосредующего олигонуклеотида, специфически гибридизованного с нуклеотидной последовательностью-мишенью.According to one embodiment, at least one of the signal generating means is a signal generating means for generating a signal in a manner dependent on the cleavage of the detection oligonucleotide. In one embodiment, the signal is generated by hybridization of the detection oligonucleotide to the target nucleotide sequence and then cleavage of the detection oligonucleotide. In one embodiment, the signal is generated by cleaving the detection oligonucleotide in a manner dependent on the cleavage of the mediating oligonucleotide specifically hybridized to the target nucleotide sequence.
Согласно одному из воплощений, средства генерации сигнала для каждой из нуклеотидных последовательностей-мишеней представляют собой средство генерации сигнала с использованием образования дуплекса способом, зависящим от расщепления опосредующего олигонуклеотида, специфически гибридизованного с нуклеотидной последовательностью-мишенью.According to one embodiment, the signal generating means for each of the target nucleotide sequences is a signal generating means using duplex formation in a manner dependent on cleavage of a mediating oligonucleotide specifically hybridized to the target nucleotide sequence.
Согласно одному из воплощений генерирование сигнала способом, зависящим от расщепления детектирующего олигонуклеотида, используют для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции.In one embodiment, signal generation in a manner dependent on the cleavage of the detection oligonucleotide is used for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature.
В частности, использование генерирования сигнала способом, зависящим от расщепления детектирующего олигонуклеотида, для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, имеет очень большое преимущество по следующим причинам: (1) температуру детекции можно выбирать в относительно широком температурном диапазоне; (2) можно выбрать гораздо более высокую температуру по сравнению с подходами с применением гибридизации; и (3) можно обеспечить отсутствие сигнала при проведении анализа плавления, выбирая подходящие средства генерации сигнала и реакционные условия (например, путем выбора средств генерации сигнала, не способных обеспечивать получение сигналов в результате только гибридизации без расщепления, или выбора условий, допускающих расщепление большей части детектирующих олигонуклеотидов).In particular, the use of generating a signal in a manner dependent on cleavage of the detection oligonucleotide for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature is very advantageous for the following reasons: (1) the detection temperature can be selected over a relatively wide temperature range; (2) a much higher temperature can be chosen compared to hybridization approaches; and (3) it is possible to ensure that there is no signal in a melting assay by selecting appropriate signal generating means and reaction conditions (e.g., by selecting signal generating means that are not capable of producing signals from hybridization alone without cleavage, or by choosing conditions that allow most of the cleavage to occur). detection oligonucleotides).
Средство генерации сигнала для генерирования сигнала способом, зависящим от образования дуплекса (например, с применением "молекулярного маяка"), также может обеспечивать получение сигнала в результате расщепления под действием 5'-нуклеазы, зависящего от реакционных условий. Средство генерации сигнала может рассматриваться как средство генерации сигнала, способное обеспечивать получение сигнала посредством расщепления, при условии, что его используют для генерирования сигнала посредством расщепления.A signal generating means for generating a signal in a manner dependent on duplex formation (eg, using a "molecular beacon") can also generate a signal from cleavage by 5'-nuclease, depending on the reaction conditions. A signal generating means can be considered as a signal generating means capable of obtaining a signal by splitting, provided that it is used to generate a signal by splitting.
Согласно одному из воплощений, средство генерации сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, представляет собой средство генерации сигнала с использованием расщепления детектирующего олигонуклеотида, а средство генерации сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, представляет собой средство генерации сигнала с использованием образования дуплекса.According to one embodiment, the signal generating means for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature is a signal generating means using detection oligonucleotide cleavage, and the signal generating means for a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature is a means signal generation using duplexing.
Согласно одному из воплощений, средство генерации сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, представляет собой средство генерации сигнала с использованием расщепления детектирующего олигонуклеотида, а средство генерации сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, генерирует сигнал посредством дуплекса, образованного способом, зависящим от расщепления опосредующего олигонуклеотида, специфически гибридизованного с данной нуклеотидной последовательностью-мишенью.According to one embodiment, the signal generating means for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature is a signal generating means using detection oligonucleotide cleavage, and the signal generating means for a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature generates a signal by a duplex formed in a manner dependent on the cleavage of a mediating oligonucleotide specifically hybridized to a given target nucleotide sequence.
Согласно одному из воплощений два средства генерации сигнала содержат идентичную метку, и сигналы от этой метки не различаются детектором одного типа.According to one of the embodiments, the two signal generating means contain an identical label, and the signals from this label are not distinguished by a detector of the same type.
После инкубирования (взаимодействия) образца с двумя средствами генерации сигнала для генерирования сигнала генерируемый сигнал детектируют, используя детектор одного типа. Детекцию проводят при относительно высокой температуре детекции, допускающей генерирование сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции.After incubating (interacting) the sample with two signal generating means to generate a signal, the signal generated is detected using the same type of detector. Detection is carried out at a relatively high detection temperature, allowing the generation of a signal for the target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature.
Стадия (b). Анализ плавленияStep (b). Melting analysis
После этого проводят анализ плавления продукта инкубирования со стадии (а) в диапазоне температур для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции.After that, a melting analysis of the incubation product from step (a) is carried out in a temperature range to determine the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature.
В настоящей заявке описывается проведение стадии (b) после детекции на стадии (а) только для удобного описания. С учетом принципа, лежащего в основе настоящего изобретения, будет понятно, что стадию (b) можно проводить до детекции на стадии (а). Поэтому способ, включающий стадию (b) до детекции на стадии (а), также включен в объем настоящего изобретения.The present application describes performing step (b) after detection in step (a) for convenience of description only. In view of the principle underlying the present invention, it will be understood that step (b) can be carried out prior to detection in step (a). Therefore, a method including step (b) prior to detection in step (a) is also included within the scope of the present invention.
Стадию (b) можно проводить, используя различные способы анализа плавления, известные специалисту в данной области техники. Подразумевается, что термин "анализ плавления", использованный в данном описании, охватывает не только анализ плавления в узком смысле, но также и анализ гибридизации, если не указано иное. Анализ плавления в узком смысле относится к способу, при котором диссоциацию дуплексов измеряют в условия увеличения жесткости, осуществляемого путем корректировки температур. Анализ гибридизации в узком смысле относится к способу, при котором ассоциацию дуплексов измеряют в условиях уменьшения жесткости, осуществляемого путем корректировки температур жесткости. Подразумевается, что термин "кривая плавления" или "пик кривой плавления", использованный в данном описании, охватывает не только кривую плавления или пик кривой плавления из анализа плавления в узком смысле, но также и кривой гибридизации или пика кривой гибридизации из анализа гибридизации, если не указано иное. Кривая плавления или кривая гибридизации может быть получена с использованием традиционных технологий, например, так, как описано в патентах США №№6174670 и 5789167; Drobyshev et al., Gene 188: 45 (1997); Kochinsky and Mirzabekov, Human Mutation, 19: 343 (2002); Livehits et al., J. Biomol. Structure Dynam., 11: 783 (1994) и Howell et al., Nature Biotechnology, 17: 87 (1999). Например, кривая плавления или кривая гибридизации может представлять собой графическое изображение или отображение изменения выходного сигнала в зависимости от изменения такого параметра, как жесткость условий гибридизации. Можно построить график зависимости выходного сигнала непосредственно от параметра гибридизации. В типичном случае кривая плавления или кривая гибридизации будут характеризоваться выходным сигналом, например флуоресценцией, который указывает на относительное количество дуплексной структуры (то есть на степень гибридизации), отложенным по оси Y, и параметром гибридизации, отложенным по оси X.Step (b) can be carried out using various melt analysis methods known to the person skilled in the art. The term "melt assay" as used herein is intended to cover not only melt assay in the narrow sense, but also hybridization assay, unless otherwise indicated. Melting analysis in the narrow sense refers to a method in which the dissociation of duplexes is measured under conditions of increasing stiffness, carried out by adjusting the temperatures. Hybridization analysis in the narrow sense refers to a method in which the association of duplexes is measured under conditions of reduced stringency by adjusting the stringency temperatures. The term "melt curve" or "melt curve peak" as used herein is intended to cover not only a melt curve or melt curve peak from a melt assay in the narrow sense, but also a hybridization curve or hybridization curve peak from a hybridization assay if not otherwise specified. The melt curve or hybridization curve can be obtained using conventional techniques, for example as described in US Pat. Nos. 6,174,670 and 5,789,167; Drobyshev et al., Gene 188: 45 (1997); Kochinsky and Mirzabekov, Human Mutation, 19: 343 (2002); Livehits et al., J. Biomol. Structure Dynam., 11: 783 (1994) and Howell et al., Nature Biotechnology, 17: 87 (1999). For example, a melting curve or a hybridization curve may be a graphical representation or display of the change in the output depending on a change in a parameter such as the stringency of the hybridization conditions. You can plot the output signal directly against the hybridization parameter. Typically, a melting curve or hybridization curve will be characterized by an output signal, such as fluorescence, which is indicative of the relative amount of duplex structure (i.e., degree of hybridization) plotted on the y-axis and the hybridization parameter plotted on the x-axis.
Описание анализа кривой плавления (гибридизации) и анализа пиков плавления (гибридизации) будет приведено со ссылкой на описания патента США №8039215.A description of the analysis of the melting curve (hybridization) and the analysis of the peaks of melting (hybridization) will be given with reference to the description of US patent No. 8039215.
В анализе плавления используют величины "Тпл". Использованный в данном описании термин "Тпл" относится к температуре плавления, при которой половина популяции двухцепочечных молекул нуклеиновой кислоты диссоциирована до одноцепочечных молекул. Величина Тпл определяется длиной и содержанием G/C-пар в гибридизованных нуклеотидах. Величину Тпл можно рассчитать традиционными методами, такими как правило Уоллеса (R.B. Wallace et al., Nucleic Acids Research, 6: 3543-3547 (1979)) и метод ближайших соседей (SantaLucia J. Jr., et al., Biochemistry, 35: 3555-3562 (1996); Sugimoto N., et al., Nucleic Acids Res., 24: 4501-4505 (1996)).In the analysis of melting use the value of "T pl ". As used herein, the term " Mp " refers to the melting point at which half of the population of double-stranded nucleic acid molecules is dissociated to single-stranded molecules. The value of T pl is determined by the length and content of G/C-pairs in the hybridized nucleotides. The Tm value can be calculated by conventional methods such as the Wallace rule (RB Wallace et al., Nucleic Acids Research, 6: 3543-3547 (1979)) and the nearest neighbor method (SantaLucia J. Jr., et al., Biochemistry, 35 : 3555-3562 (1996); Sugimoto N., et al., Nucleic Acids Res., 24: 4501-4505 (1996)).
Согласно одному из воплощений стадию (b) проводят, детектируя сигналы, генерируемые при увеличении температур (анализ плавления в узком смысле). Альтернативно, стадию (b) проводят, детектируя сигналы, генерируемые при уменьшении температур (анализ гибридизации в узком смысле).According to one embodiment, step (b) is carried out by detecting signals generated by increasing temperatures (melting analysis in the narrow sense). Alternatively, step (b) is carried out by detecting signals generated by decreasing temperatures (narrow hybridization analysis).
Согласно одному из воплощений средство генерации сигнала, используемое для анализа плавления, включает любое средство генерации сигнала с использованием образования дуплекса в диапазоне температур. Кроме того, для анализа плавления, среди средств генерации сигнала для способов детекции в режиме реального времени, скорее используются средства, генерирующие сигналы в результате гибридизации детектирующего олигонуклеотида, чем в результате реакции расщепления.According to one embodiment, the signal generating means used for melting analysis includes any signal generating means using duplexing over a range of temperatures. In addition, for the analysis of melting, among the signal generating means for real-time detection methods, means generating signals as a result of hybridization of the detection oligonucleotide rather than as a result of a cleavage reaction are used.
Согласно одному из воплощений стадию (b) проводят с использованием средства генерации сигнала для генерирования сигнала способом, зависящим от образования дуплекса. В частности, стадию (b) проводят с использованием средства генерации сигнала, генерирующего сигнал в результате образования дуплекса способом, зависящим от расщепления опосредующего олигонуклеотида, специфически гибридизованного с нуклеотидной последовательностью-мишенью.According to one embodiment, step (b) is carried out using a signal generating means to generate a signal in a manner dependent on duplex formation. In particular, step (b) is carried out using a signal generating means that generates a signal as a result of the formation of a duplex in a manner dependent on the cleavage of a mediating oligonucleotide specifically hybridized to a target nucleotide sequence.
Сигнал от дуплекса, образованного способом, зависящим от расщепления опосредующего олигонуклеотида, может генерироваться различными способами, включая способ с РТОСЕ-плавлением (WO 2012/096523), способ с PCE-SH-плавлением (WO 2013/115442) и способ с PCE-NH-плавлением (PCT/KR2013/012312). Способ с РТОСЕ-плавлением, способ с PCE-SH-плавлением и способ с PCE-NH-плавлением соответствуют способу на основе РТОСЕ с анализом плавления, способу с PCE-SH с анализом плавления и способу с PCE-NH с анализом плавления, соответственно. Среди способов на основе РТОСЕ, для анализа плавления на стадии (b) применяются способы, в которых в результате расщепления не генерируется никакого сигнала.The signal from a duplex formed in a manner dependent on the cleavage of the mediating oligonucleotide can be generated in various ways, including the PTOCE melt method (WO 2012/096523), the PCE-SH melt method (WO 2013/115442), and the PCE-NH method. - melting (PCT/KR2013/012312). The PTOCE melt method, the PCE-SH melt method, and the PCE-NH melt method correspond to the PTOCE melt analysis method, the PCE-SH melt analysis method, and the PCE-NH melt analysis method, respectively. Among the PTOCE-based methods, for melting analysis in step (b), methods are used in which no signal is generated as a result of cleavage.
Способ с РТОСЕ-плавлением, способ с PCE-SH-плавлением и способ с РСЕ-NH-плавлением также описаны в более ранних патентных документах.The PTOCE melt method, the PCE-SH melt method, and the PCE-NH melt method are also described in earlier patent documents.
Стадии (а)-(b), проводимые с использованием способа с РТОСЕ-плавлением, представляют собой следующие стадии:Steps (a) to (b) carried out using the PTOCE melt method are the following steps:
(а) гибридизации нуклеотидной последовательности-мишени с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом и РТО; (b) приведения в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РТО; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО; (с) гибридизации фрагмента, высвободившегося из РТО, с СТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО; (d) осуществления реакции удлинения с использованием продукта со стадии (с) и матричной полимеразы нуклеиновых кислот; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется и образуется удлиненный дуплекс; причем удлиненный дуплекс имеет величину Тпл, регулируемую (1) последовательностью и/или длиной этого фрагмента, (2) последовательностью и/или длиной СТО либо (3) последовательностью и/или длиной фрагмента и последовательностью и/или длиной СТО; (е) плавления удлиненного дуплекса в диапазоне температур с получением сигнала от мишени, указывающего на присутствие удлиненного дуплекса; при этом сигнал от мишени обеспечивается посредством (1) по меньшей мере одной метки, соединенной с фрагментом и/или СТО, (2) метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, (3) метки, встраиваемой в удлиненный дуплекс во время реакции удлинения, и метки, соединенной с фрагментом и/или СТО, или (4) интеркалирующей метки; и (f) детекции удлиненного дуплекса путем измерения сигнала от мишени; тем самым присутствие удлиненного дуплекса указывает на присутствие нуклеотидной последовательности-мишени.(a) hybridization of the target nucleotide sequence with the upstream oligonucleotide and PTO; (b) contacting the product from step (a) with an enzyme having 5'-nuclease activity under conditions suitable for cleavage of the PTO; wherein the upstream oligonucleotide or its extended chain induces cleavage of the PTO by an enzyme having 5'-nuclease activity such that the cleavage releases a fragment containing a 5' tag site or a portion of a 5' tag site of the PTO; (c) hybridizing the fragment released from PTO with CTO; in this case, the fragment released from the RTO hybridizes with the capturing CRT site; (d) performing an extension reaction using the product from step (c) and a nucleic acid matrix polymerase; in this case, the fragment hybridized with the capturing CTO site is elongated and an elongated duplex is formed; wherein the extended duplex has a Tm value controlled by (1) the sequence and/or length of the fragment, (2) the sequence and/or length of the CTO, or (3) the sequence and/or length of the fragment and the sequence and/or length of the CTO; (e) melting the extended duplex over a temperature range to produce a target signal indicative of the presence of the extended duplex; wherein the signal from the target is provided by (1) at least one label connected to the fragment and/or CTO, (2) a label embedded in the elongated duplex during the extension reaction, (3) a label embedded in the elongated duplex during the reaction extension, and a label connected to the fragment and/or CTO, or (4) an intercalating label; and (f) detecting an extended duplex by measuring the signal from the target; thus, the presence of an extended duplex indicates the presence of a target nucleotide sequence.
В этом случае способ с РТОСЕ-плавлением дополнительно включает повторение всех или некоторых из стадий (a)-(f) с денатурацией между повторяющимися циклами. На стадии (а) способа с РТОСЕ-плавлением можно использовать комплект праймеров для амплификации нуклеотидной последовательности-мишени вместо располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида. В этом случае способ дополнительно включает повторение всех или некоторых из стадий (a)-(f) с денатурацией между повторяющимися циклами.In this case, the PTOCE melt process further comprises repeating all or some of steps (a) to (f) with denaturation between repeated cycles. In step (a) of the PTOCE melt method, a primer set can be used to amplify the target nucleotide sequence in place of the upstream oligonucleotide. In this case, the method further comprises repeating all or some of steps (a)-(f) with denaturation between repeated cycles.
Стадии (а)-(b) по настоящему изобретению, проводимые с использованием способов на основе РТОСЕ с плавлением представляют собой следующие стадии:Steps (a)-(b) of the present invention, carried out using PTOCE melt-based methods, are the following steps:
(а) гибридизации нуклеотидной последовательности-мишени с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом и РТО; (b) приведения в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РТО; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО; (с) гибридизации фрагмента, высвободившегося из РТО, с СТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО; (d) осуществления реакции удлинения с использованием продукта со стадии (с) и матричной полимеразы нуклеиновых кислот; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с образованием удлиненной цепи; и (е) проведения анализа плавления в диапазоне температур посредством детекции сигнала, генерируемого в зависимости от присутствия удлиненной цепи.(a) hybridization of the target nucleotide sequence with the upstream oligonucleotide and PTO; (b) contacting the product from step (a) with an enzyme having 5'-nuclease activity under conditions suitable for cleavage of the PTO; wherein the upstream oligonucleotide or its extended chain induces cleavage of the PTO by an enzyme having 5'-nuclease activity such that the cleavage releases a fragment containing a 5' tag site or a portion of a 5' tag site of the PTO; (c) hybridizing the fragment released from PTO with CTO; in this case, the fragment released from the RTO hybridizes with the capturing CRT site; (d) performing an extension reaction using the product from step (c) and a nucleic acid matrix polymerase; wherein the fragment hybridized to the capturing CTO site is elongated to form an elongated chain; and (e) performing a melting analysis over a range of temperatures by detecting a signal generated depending on the presence of the extended chain.
Стадия (с). Определение присутствия нуклеотидных последовательностей-мишенейStage (s). Determining the presence of target nucleotide sequences
И наконец, присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, определяют, используя сигнал, детектируемый на стадии (а), а присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, определяют, используя результат анализа плавления на стадии (b).Finally, the presence of a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature is determined using the signal detected in step (a), and the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature is determined using the result of the melting analysis in step (b ).
Согласно одному из воплощений данного изобретения нуклеотидные последовательности-мишени содержат нуклеотидную вариацию (в частности, SNP).According to one of the embodiments of the present invention, the target nucleotide sequences contain a nucleotide variation (in particular, a SNP).
Неожиданные результаты по настоящему изобретению могут быть получены тогда, когда средство генерации сигнала для генерирования сигнала в результате расщепления при детекции в режиме реального времени, объединяют со средством генерации сигнала для генерирования сигнала посредством дуплекса, образованного способом, зависящим от расщепления опосредующего олигонуклеотида, гибридизованного с нуклеотидной последовательностью-мишенью, в случае анализа плавления. В этом случае средство генерации сигнала, вовлеченное в образование дуплекса и генерирующее сигнал непосредственно с использованием расщепления, следует исключить при проведении анализа плавления.Surprising results of the present invention can be obtained when a signal generating means for generating a signal as a result of real-time detection cleavage is combined with a signal generating means for generating a signal by means of a duplex formed in a manner dependent on the cleavage of a mediating oligonucleotide hybridized to a nucleotide the target sequence, in the case of a melt analysis. In this case, the signal generating means involved in the formation of the duplex and generating the signal directly using cleavage should be excluded from the melt analysis.
Следует отметить, что настоящее изобретение осуществляют, комбинируя способ с применением средств генерации сигнала для генерирования сигнала в результате расщепления (например, TaqMan-способ), в качестве способа в режиме реального времени, и способа на основе РТОСЕ с использованием плавления, в качестве анализа плавления, обеспечивая получение наиболее убедительных результатов.It should be noted that the present invention is carried out by combining a signal generation method for signal generation by cleavage (for example, TaqMan method) as a real-time method and a PTOCE-based method using melt as a melt analysis. providing the most convincing results.
Согласно одному из воплощений в результате использования сигнала, детектируемого на стадии (а), получают квалификационное значение для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции.In one embodiment, using the signal detected in step (a), a qualification value is obtained to determine the presence of a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature.
Согласно одному из воплощений данного изобретения нуклеотидные последовательности-мишени содержат нуклеотидную вариацию (в частности, SNP).According to one of the embodiments of the present invention, the target nucleotide sequences contain a nucleotide variation (in particular, a SNP).
V. Детекция по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней с использованием разных температур детекции и анализа плавленияV. Detection of at least three target nucleotide sequences using different detection temperatures and melting assays
Согласно еще одному аспекту данного изобретения предложен способ детекции по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием анализа температур детекции и анализа плавления, включающий:According to another aspect of the present invention, there is provided a method for detecting at least three target nucleotide sequences in a sample using detection temperature analysis and melting analysis, comprising:
(а) инкубирование образца по меньшей мере с тремя средствами генерации сигнала для детекции по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней в одном реакционном сосуде и детекцию генерируемого сигнала с использованием детектора одного типа; при этом каждую из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней детектируют с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом каждая из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней имеет свою температуру детекции, определяемую с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование сигнала не только для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей данную температуру детекции, но также и сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей более высокую температуру детекции, чем данная температура детекции; при этом сигналы, генерируемые этими средствами генерации сигнала, не различаются детектором одного типа; при этом некоторые из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней детектируют с использованием анализа температур детекции, и детекцию осуществляют как при температуре детекции для указанных некоторых из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней, так и при одной или более температурах детекции, превышающих данные температуры детекции;(a) incubating the sample with at least three signal generators to detect at least three target nucleotide sequences in one reaction vessel and detecting the generated signal using one type of detector; wherein each of the at least three target nucleotide sequences is detected using an appropriate signal generation means; wherein each of the at least three target nucleotide sequences has its own detection temperature determined using an appropriate signal generation means; wherein the detection temperature is a temperature capable of generating a signal not only for a target nucleotide sequence having a given detection temperature, but also a signal for a target nucleotide sequence having a higher detection temperature than the given detection temperature; while the signals generated by these signal generation means are not distinguished by a detector of the same type; wherein some of the at least three target nucleotide sequences are detected using a detection temperature analysis, and detection is performed both at a detection temperature for said some of the at least three target nucleotide sequences and at one or more detection temperatures that are higher than the data detection temperature;
(b) проведение анализа плавления для продукта инкубирования со стадии (а) в диапазоне температур для определения присутствия других нуклеотидных последовательностей-мишеней, отличающихся от указанных некоторых из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней; и(b) performing a melting analysis on the incubation product from step (a) over a temperature range to determine the presence of other target nucleotide sequences other than said some of the at least three target nucleotide sequences; and
(c) определение (1) присутствия указанных некоторых из нуклеотидных последовательностей-мишеней на основе сигнала, детектируемого на стадии (а); при этом, если определяют присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей конкретную температуру детекции, среди указанных некоторых из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней, то присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей данную конкретную температуру детекции, определяют по разнице между сигналом, детектируемым при одной или более температурах детекции, превышающих данную конкретную температуру детекции, и сигналом, детектируемым при данной конкретной температуре детекции; при этом, если данная конкретная температура детекции является самой относительно высокой температурой детекции среди температур детекции, то присутствие этой нуклеотидной последовательности-мишени определяют на основе сигнала, детектируемого при данной конкретной температуре детекции; и (2) присутствия других нуклеотидных последовательностей-мишеней, отличающихся от указанных некоторых из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней, определяемых по результату анализа плавления на стадии (b).(c) determining (1) the presence of said some of the target nucleotide sequences based on the signal detected in step (a); wherein if the presence of a target nucleotide sequence having a specific detection temperature is determined among said some of the at least three target nucleotide sequences, then the presence of a target nucleotide sequence having this specific detection temperature is determined by the difference between the signal detected at one or more detection temperatures above that particular detection temperature and a signal detectable at that particular detection temperature; wherein, if this particular detection temperature is the highest relatively high detection temperature among the detection temperatures, then the presence of that target nucleotide sequence is determined based on the signal detected at that particular detection temperature; and (2) the presence of other target nucleotide sequences other than said some of the at least three target nucleotide sequences determined by the result of the melt analysis in step (b).
Поскольку настоящее изобретение в целом следует аспектам данного изобретения от первого до четвертого, описанным выше, общие для них части описания опущены, чтобы избежать излишнего дублирования, приводящего к усложнению данного описания.Since the present invention generally follows the first to fourth aspects of the present invention described above, the common parts of the description are omitted to avoid unnecessary duplication leading to the complication of this description.
Стадия (а). Инкубирование со средствами генерации сигнала и детекция сигналовStage (a). Incubation with Signal Generator and Signal Detection
В первую очередь, анализируемый образец инкубируют по меньшей мере с тремя средствами генерации сигнала для детекции по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней в одном реакционном сосуде и затем генерируемый сигнал детектируют, используя детектор одного типа. Сигналы, генерируемые по меньшей мере тремя средствами генерации сигнала, не различаются детектором одного типа.First, the analyzed sample is incubated with at least three signal generating means for detecting at least three target nucleotide sequences in one reaction vessel, and then the generated signal is detected using the same type of detector. The signals generated by the at least three signal generation means are not distinguished by the same type of detector.
Одна из нуклеотидных последовательностей-мишеней имеет самую относительно высокую температуру детекции. Для детекции нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей самую относительно высокую температуру детекции, используют средство генерации сигнала, способное обеспечить получение сигнала при самой относительно высокой температуре детекции.One of the target nucleotide sequences has the relatively highest detection temperature. To detect the target nucleotide sequence having the relatively high detection temperature, a signal generating means capable of obtaining a signal at the relatively high detection temperature is used.
В настоящем изобретении некоторые из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней детектируют с использованием анализа температур детекции, а другие детектируют с использованием анализа плавления.In the present invention, some of the at least three target nucleotide sequences are detected using detection temperature analysis and others are detected using melting analysis.
Термин "некоторые" в выражении "некоторые из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней" включает в себя "одну или более" мишеней. Использованный в данном описании термин "анализ температур детекции" относится к способу детекции в режиме реального времени, включающему детекцию при разных температурах, для детекции нуклеотидной последовательности-мишени, если не указано иное.The term "some" in the expression "some of the at least three target nucleotide sequences" includes "one or more" targets. As used herein, the term "detection temperature analysis" refers to a real-time detection method, including detection at different temperatures, to detect a target nucleotide sequence, unless otherwise indicated.
Средства генерации сигнала, предназначенные для генерирования сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, анализируемой с использованием анализа плавления, могут генерировать или не генерировать такой сигнал в зависимости от реакционных условий на стадии (а). Ввиду того, что сигнал для нуклеотидной последовательности-мишени, анализируемой с использованием анализа плавления, может генерироваться и детектироваться на стадии (b), то генерирования данного сигнала на стадии (а) не добиваются.Signal generation means for generating a signal for the target nucleotide sequence analyzed using the melt assay may or may not generate such a signal, depending on the reaction conditions in step (a). In view of the fact that a signal for the target nucleotide sequence analyzed using the melting assay can be generated and detected in step (b), generation of this signal in step (a) is not achieved.
Для каждой из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней необходимо использовать средство генерации сигнала, имеющее температуру детекции, отличающуюся от других.For each of the at least three target nucleotide sequences, it is necessary to use a signal generating means having a different detection temperature from the others.
Согласно одному из воплощений, поскольку в средстве генерации сигнала, предназначенном для анализа плавления, применяется гибридизация и денатурация дуплекса, то может генерироваться сигнал, зависящий от реакционных условий на стадии (а).According to one embodiment, since hybridization and duplex denaturation is used in the signal generating tool for melting analysis, a signal can be generated depending on the reaction conditions in step (a).
Согласно одному из воплощений стадию (а) проводят в условиях, подходящих для генерирования по меньшей мере сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, анализируемой с использованием анализа температур детекции.In one embodiment, step (a) is carried out under conditions suitable for generating at least a signal for the target nucleotide sequence being analyzed using detection temperature analysis.
Согласно одному из воплощений выбор нуклеотидных последовательностей-мишеней, анализируемых с использованием анализа температур детекции, проводят с учетом температур детекции. В частности, в первую очередь выбирают нуклеотидную последовательность-мишень, имеющую самую высокую температуру детекции, а затем выбирают некоторые последовательности в порядке убывания температур детекции.In one embodiment, the selection of target nucleotide sequences to be analyzed using detection temperature analysis is based on detection temperatures. Specifically, the target nucleotide sequence having the highest detection temperature is selected first, and then some sequences are selected in descending order of detection temperatures.
Согласно одному из воплощений стадию (а) проводят в процессе амплификации сигнала одновременно с амплификацией нуклеиновой кислоты.According to one embodiment, step (a) is carried out during signal amplification simultaneously with amplification of the nucleic acid.
Согласно одному из воплощений стадию (а) проводят в процессе амплификации сигнала без амплификации нуклеиновой кислоты.According to one embodiment, step (a) is carried out during signal amplification without nucleic acid amplification.
Согласно одному из воплощений, по меньшей мере одно из средств генерации сигнала представляет собой средство генерации сигнала для генерирования сигнала способом, зависящим от образования дуплекса.According to one embodiment, at least one of the signal generating means is a signal generating means for generating a signal in a duplexing dependent manner.
Согласно одному из воплощений, средства генерации сигнала для каждой из нуклеотидных последовательностей-мишеней представляют собой средства генерации сигнала для генерирования сигнала в результате образования дуплекса.According to one embodiment, the signal generating means for each of the target nucleotide sequences are signal generating means for generating a signal as a result of duplex formation.
Согласно одному из воплощений сигнал генерируется в результате образования дуплекса между нуклеотидной последовательностью-мишенью и детектирующим олигонуклеотидом, специфически гибридизованным с данной нуклеотидной последовательностью-мишенью. Согласно одному из воплощений сигнал генерируется дуплексом, образованным способом, зависящим от расщепления опосредующего олигонуклеотида, специфически гибридизованного с нуклеотидной последовательностью-мишенью.In one embodiment, the signal is generated by the formation of a duplex between the target nucleotide sequence and a detection oligonucleotide specifically hybridized to the target nucleotide sequence. In one embodiment, the signal is generated by a duplex formed in a manner dependent on cleavage of a mediating oligonucleotide specifically hybridized to a target nucleotide sequence.
Согласно одному из воплощений данного изобретения средства генерации сигнала для каждой из нуклеотидных последовательностей-мишеней представляют собой средства генерации сигнала с использованием образования дуплекса способом, зависящим от расщепления опосредующего олигонуклеотида, специфически гибридизованного с нуклеотидной последовательностью-мишенью.According to one embodiment of the present invention, the signal generating means for each of the target nucleotide sequences are signal generating means using duplex formation in a manner dependent on cleavage of a mediating oligonucleotide specifically hybridized to the target nucleotide sequence.
Согласно одному из воплощений, по меньшей мере одно из средств генерации сигнала представляет собой средство генерации сигнала для генерирования сигнала способом, зависящим от расщепления детектирующего олигонуклеотида. Согласно одному из воплощений сигнал генерируется в результате гибридизации детектирующего олигонуклеотида с нуклеотидной последовательностью-мишенью и затем расщепления детектирующего олигонуклеотида. Согласно одному из воплощений сигнал генерируется в результате расщепления детектирующего олигонуклеотида способом, зависящим от расщепления опосредующего олигонуклеотида, специфически гибридизованного с нуклеотидной последовательностью-мишенью.According to one embodiment, at least one of the signal generating means is a signal generating means for generating a signal in a manner dependent on the cleavage of the detection oligonucleotide. In one embodiment, the signal is generated by hybridization of the detection oligonucleotide to the target nucleotide sequence and then cleavage of the detection oligonucleotide. In one embodiment, the signal is generated by cleaving the detection oligonucleotide in a manner dependent on the cleavage of the mediating oligonucleotide specifically hybridized to the target nucleotide sequence.
Согласно одному из воплощений генерирование сигнала способом, зависящим от расщепления детектирующего олигонуклеотида, используют только для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей самую относительно высокую температуру детекции, среди по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней.According to one embodiment, signal generation in a manner dependent on the cleavage of the detection oligonucleotide is used only for the target nucleotide sequence having the highest relatively high detection temperature among the at least three target nucleotide sequences.
Согласно одному из воплощений данного изобретения, средство генерации сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей самую относительно высокую температуру детекции, представляет собой средство генерации сигнала с использованием расщепления детектирующего олигонуклеотида, а средства генерации сигнала для других нуклеотидных последовательностей-мишеней представляют собой средства генерации сигнала с использованием образования дуплекса.According to one embodiment of the present invention, the signal generating means for the target nucleotide sequence having the highest detection temperature is the signal generating means using the detection oligonucleotide cleavage, and the signal generating means for the other target nucleotide sequences are the signal generating means with using duplex formation.
Согласно одному из воплощений данного изобретения, средство генерации сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей самую относительно высокую температуру детекции, представляет собой средство генерации сигнала с использованием детектирующего олигонуклеотида, а средства генерации сигнала для других нуклеотидных последовательностей-мишеней представляют собой средства генерации сигнала с использованием образования дуплекса способом, зависящим от расщепления опосредующего олигонуклеотида, специфически гибридизованного с нуклеотидной последовательностью-мишенью.According to one embodiment of the present invention, the signal generating means for the target nucleotide sequence having the highest detection temperature is the signal generating means using the detection oligonucleotide, and the signal generating means for the other target nucleotide sequences are the signal generating means using forming a duplex in a manner dependent on cleavage of a mediating oligonucleotide specifically hybridized to a target nucleotide sequence.
Например, сигнал для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей самую относительно высокую температуру детекции, генерируют с использованием TaqMan-способа, а сигналы для других нуклеотидных последовательностей-мишеней генерируют с использованием способа с РТОСЕ, способа с PCE-SH или способа с PCE-NH.For example, a signal for the target nucleotide sequence having the highest relatively high detection temperature is generated using the TaqMan method, and signals for other target nucleotide sequences are generated using the PTOCE method, the PCE-SH method, or the PCE-NH method.
Согласно одному из воплощений данного изобретения, по меньшей мере три средства генерации сигнала содержат идентичную метку, и сигналы от данной метки не различаются детектором одного типа.According to one embodiment of the present invention, at least three signal generating means contain an identical label, and signals from a given label are not distinguished by a detector of the same type.
Количество нуклеотидных последовательностей-мишеней, подлежащих детектированию в соответствии с настоящим изобретением, не ограничено и включает более чем 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10 нуклеотидных последовательностей-мишеней в одном реакционном сосуде.The number of target nucleotide sequences to be detected in accordance with the present invention is not limited and includes more than 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10 target nucleotide sequences in one reaction vessel.
После инкубирования (взаимодействия) образца по меньшей мере с тремя средствами генерации сигнала с целью генерирования сигнала, генерируемый сигнал детектируют, используя детектор одного типа. Согласно одному из воплощений некоторые из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней детектируют с использованием анализа температур детекции и детекцию осуществляют как при температуре детекции указанных некоторых из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней, так и при одной или более температурах детекции, превышающих данные температуры детекции.After incubating (interacting) the sample with at least three signal generating means to generate a signal, the generated signal is detected using a detector of the same type. In one embodiment, some of the at least three target nucleotide sequences are detected using a detection temperature assay, and detection is performed both at the detection temperature of said some of the at least three target nucleotide sequences and at one or more detection temperatures above the data. detection temperature.
Согласно одному из воплощений сигналы детектируют при всех температурах детекции, необходимых для проведения анализа температур детекции.According to one embodiment, the signals are detected at all detection temperatures necessary to perform a detection temperature analysis.
Генерируемый сигнал детектируют, используя детектор одного типа. Каждая из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней имеет свою температуру детекции, определяемую с использованием соответствующего средства генерации сигнала. Температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование сигнала не только для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей данную температуру детекции, но также и сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей более высокую температуру детекции, чем данная температура детекции.The generated signal is detected using one type of detector. Each of the at least three target nucleotide sequences has its own detection temperature, which is determined using an appropriate signal generator. The detection temperature is a temperature capable of generating a signal not only for a target nucleotide sequence having a given detection temperature, but also a signal for a target nucleotide sequence having a higher detection temperature than the given detection temperature.
Согласно одному из воплощений нуклеотидные последовательности-мишени, подлежащие детектированию с использованием анализа температур детекции, имеют более высокие температуры детекции, чем детектируемые с использованием анализа плавления.In one embodiment, target nucleotide sequences to be detected using detection temperature analysis have higher detection temperatures than those detected using melt analysis.
Стадия (b). Анализ плавленияStep (b). Melting analysis
Для определения присутствия других нуклеотидных последовательностей-мишеней, нежели указанные некоторые из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней, проводят анализ плавления для продукта инкубирования со стадии (а) в диапазоне температур.To determine the presence of target nucleotide sequences other than the specified some of the at least three target nucleotide sequences, a melting analysis is performed on the incubation product from step (a) over a range of temperatures.
В настоящей заявке описывается проведение стадии (b) после детекции на стадии (а) только для удобного описания. С учетом принципа, лежащего в основе настоящего изобретения, будет понятно, что стадию (b) можно проводить до детекции на стадии (а). Поэтому способ, включающий стадию (b) до детекции на стадии (а), также включен в объем настоящего изобретения.The present application describes performing step (b) after detection in step (a) for convenience of description only. In view of the principle underlying the present invention, it will be understood that step (b) can be carried out prior to detection in step (a). Therefore, a method including step (b) prior to detection in step (a) is also included within the scope of the present invention.
Согласно одному из воплощений стадию (b) проводят с использованием средства генерации сигнала для генерирования сигнала способом, зависящим от образования дуплекса. В частности, стадию (b) проводят в соответствии со способом на основе РТОСЕ с использованием плавления.According to one embodiment, step (b) is carried out using a signal generating means to generate a signal in a manner dependent on duplex formation. In particular, step (b) is carried out according to the PTOCE method using melting.
Стадия (с). Определение присутствия нуклеотидных последовательностей-мишенейStage (s). Determining the presence of target nucleotide sequences
И наконец, присутствие по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце определяют, используя сигнал, детектируемый на стадии (а), и результат анализа плавления на стадии (b).Finally, the presence of at least three target nucleotide sequences in the sample is determined using the signal detected in step (a) and the result of the melt analysis in step (b).
Присутствие некоторых из нуклеотидных последовательностей-мишеней определяют, используя сигнал, детектируемый на стадии (а). Если определяют присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей конкретную температуру детекции, среди указанных некоторых из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней, то присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей данную конкретную температуру детекции, определяют, используя разницу между сигналом, детектируемым при одной или более температурах детекции, превышающих данную конкретную температуру детекции, и сигналом, детектируемым при данной конкретной температуре детекции. Если конкретная температура детекции является самой относительно высокой температурой детекции среди температур детекции, то присутствие нуклеотидной последовательности-мишени определяют, используя сигнал, детектируемый при данной конкретной температуре детекции.The presence of some of the target nucleotide sequences is determined using the signal detected in step (a). If the presence of a target nucleotide sequence having a particular detection temperature is determined among said some of the at least three target nucleotide sequences, then the presence of a target nucleotide sequence having that particular detection temperature is determined using the difference between the signal detected at one or more detection temperatures than a given specific detection temperature, and a signal detected at that particular detection temperature. If a particular detection temperature is the relatively highest detection temperature among the detection temperatures, then the presence of the target nucleotide sequence is determined using the signal detected at that particular detection temperature.
Согласно одному из воплощений, в данном способе дополнительно используют референсное значение для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей конкретную температуру детекции, полученное посредством (1) инкубирования всех комбинаций нуклеотидных последовательностей-мишеней, имеющих температуры детекции, превышающие данную конкретную температуру детекции, со средствами генерации сигнала в другом реакционном сосуде, нежели реакционный сосуд на стадии (а), (2) детекции сигналов не только при одной или более температурах детекции, превышающих данную конкретную температуру детекции, но также и при данной конкретной температуре детекции, и (3) затем получения разницы между сигналом, детектируемым при одной или более температурах детекции, превышающих данную конкретную температуру детекции, и сигналом, детектируемым при данной конкретной температуре детекции.According to one embodiment, the method further uses a reference value to determine the presence of a target nucleotide sequence having a particular detection temperature, obtained by (1) incubating all combinations of target nucleotide sequences having detection temperatures greater than that particular detection temperature with means generating a signal in a different reaction vessel than the reaction vessel in step (a), (2) detecting signals not only at one or more detection temperatures above that particular detection temperature, but also at that particular detection temperature, and (3) then obtaining a difference between a signal detected at one or more detection temperatures above that particular detection temperature and a signal detected at that particular detection temperature.
Альтернативно, в данном способе дополнительно используют референсное значение для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей конкретную температуру детекции, полученное посредством (1) инкубирования всех комбинаций нуклеотидных последовательностей-мишеней, имеющих температуры детекции, превышающие данную конкретную температуру детекции, со средствами генерации сигнала в другом реакционном сосуде, нежели реакционный сосуд на стадии (а), (2) детекции сигналов как при температуре детекции, непосредственно более высокой, чем данная конкретная температура детекции, так и при данной конкретной температуре детекции, и (3) затем получения разницы между сигналом, детектируемым при температуре детекции, непосредственно более высокой, чем данная конкретная температура детекции, и сигналом, детектируемым при данной конкретной температуре детекции.Alternatively, the method further uses a reference value to determine the presence of a target nucleotide sequence having a particular detection temperature, obtained by (1) incubating all combinations of target nucleotide sequences having detection temperatures greater than that particular detection temperature, with signal generation means in different reaction vessel than the reaction vessel in step (a), (2) detecting signals both at a detection temperature immediately higher than that particular detection temperature and at that particular detection temperature, and (3) then obtaining a difference between the signal detected at a detection temperature directly higher than that particular detection temperature, and a signal detectable at that particular detection temperature.
Согласно одному из воплощений, если для получения разницы между сигналами или получения референсных значений для нуклеотидных последовательностей-мишеней, детектируемых с использованием анализа температур детекции, требуется детекция сигналов при температурах детекции для нуклеотидных последовательностей-мишеней, детектируемых с использованием анализа плавления, то могут быть собраны и использованы сигналы при температурах детекции для нуклеотидных последовательностей-мишеней, детектируемых с применением анализа плавления.According to one embodiment, if signal detection at detection temperatures for target nucleotide sequences detected using melt analysis is required to obtain a difference between signals or to obtain reference values for target nucleotide sequences detected using detection temperature analysis, then and used signals at detection temperatures for target nucleotide sequences detected using melt assay.
Присутствие других нуклеотидных последовательностей-мишеней, отличающихся от некоторых из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней, подлежащих определению с использованием анализа температур детекции, определяют по результату анализа плавления на стадии (b).The presence of other target nucleotide sequences different from some of the at least three target nucleotide sequences to be determined using detection temperature analysis is determined from the result of the melt analysis in step (b).
Согласно одному из воплощений стадию (d) проводят, сначала определяя присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей самую относительно высокую температуру детекции, а затем последовательно определяя присутствие нуклеотидных последовательностей-мишеней, имеющих относительно более низкие температуры детекции, в порядке убывания.In one embodiment, step (d) is carried out by first detecting the presence of the target nucleotide sequence having the highest relatively high detection temperature, and then sequentially detecting the presence of the target nucleotide sequences having relatively lower detection temperatures in descending order.
Согласно одному из воплощений, определение присутствия нуклеотидной последовательности-мишени с использованием анализа плавления можно применять при определении присутствия нуклеотидной последовательности мишени с использованием анализа температур детекции (например, для выбора референсных значений).In one embodiment, determining the presence of a target nucleotide sequence using a melt assay can be used in determining the presence of a target nucleotide sequence using detection temperature analysis (eg, to select reference values).
Если в режиме реального времени детектируют по меньшей мере три нуклеотидные последовательности-мишени, то генерирование сигналов в результате используют только для одной нуклеотидной последовательности-мишени. Что касается других нуклеотидных последовательностей-мишеней, то для улучшения эффективности и быстроты выполнения анализа можно применять способы на основе РТОСЕ.If at least three target nucleotide sequences are detected in real time, then signal generation is used for only one target nucleotide sequence as a result. For other target nucleotide sequences, PTOCE-based methods can be used to improve the efficiency and speed of the assay.
Согласно одному из воплощений данного изобретения нуклеотидные последовательности-мишени содержат нуклеотидную вариацию (в частности, SNP).According to one of the embodiments of the present invention, the target nucleotide sequences contain a nucleotide variation (in particular, a SNP).
VI. Наборы для детекции нуклеотидных последовательностей-мишеней с использованием нескольких температур детекцииVI. Kits for the detection of target nucleotide sequences using multiple detection temperatures
Согласно другому аспекту данного изобретения предложен набор для детекции двух нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием разных температур детекции, содержащий:According to another aspect of the present invention, there is provided a kit for detecting two target nucleotide sequences in a sample using different detection temperatures, comprising:
(a) два средства генерации сигнала для детекции двух нуклеотидных последовательностей-мишеней; при этом каждую из нуклеотидных последовательностей-мишеней детектируют с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом одна из двух нуклеотидных последовательностей-мишеней имеет относительно высокую температуру детекции, а другая имеет относительно низкую температуру детекции, определяемую с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом относительно высокая температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, а относительно низкая температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование как сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, так и сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции; при этом сигналы, генерируемые этими двумя средствами генерации сигнала, не различаются детектором одного типа; при этом детекцию осуществляют как при относительно высокой температуре детекции, так и при относительно низкой температуре детекции; и(a) two signal generating means for detecting two target nucleotide sequences; wherein each of the target nucleotide sequences is detected using an appropriate signal generation means; wherein one of the two target nucleotide sequences has a relatively high detection temperature and the other has a relatively low detection temperature determined using an appropriate signal generation means; wherein the relatively high detection temperature is a temperature that allows signal generation for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature, and the relatively low detection temperature is a temperature that allows generation of a signal for a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature, and a signal for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature; however, the signals generated by these two signal generation means are not distinguished by a detector of the same type; wherein detection is carried out both at a relatively high detection temperature and at a relatively low detection temperature; and
(b) инструкцию, в которой описан аспект I способа по настоящему изобретению, озаглавленный как "Детекция двух нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием разных температур детекции".(b) instructions describing aspect I of the method of the present invention, entitled "Detection of two target nucleotide sequences in a sample using different detection temperatures".
Согласно еще одному аспекту данного изобретения предложен набор для SNP-генотипирования нуклеотидной последовательности в образце с использованием разных температур детекции, содержащий:According to another aspect of the present invention, there is provided a kit for SNP genotyping of a nucleotide sequence in a sample using different detection temperatures, comprising:
(a) средство генерации сигнала для детекции SNP-содержащих аллелей; при этом каждый из SNP-содержащих аллелей детектируют с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом один из SNP-содержащих аллелей имеет относительно высокую температуру детекции, а другой имеет относительно низкую температуру детекции, определяемую с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом относительно высокая температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование сигнала для SNP-содержащего аллеля, имеющего относительно высокую температуру детекции, а относительно низкая температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование как сигнала для SNP-содержащего аллеля, имеющего относительно низкую температуру детекции, так и сигнала для SNP-содержащего аллеля, имеющего относительно высокую температуру детекции; при этом сигналы, генерируемые средствами генерации сигнала не различаются детектором одного типа; при этом детекцию осуществляют как при относительно высокой температуре детекции, так и при относительно низкой температуре детекции; и(a) means for generating a signal for detecting SNP-containing alleles; wherein each of the SNP-containing alleles is detected using an appropriate signal generating means; wherein one of the SNP-containing alleles has a relatively high detection temperature and the other has a relatively low detection temperature determined using an appropriate signal generation means; wherein the relatively high detection temperature is a temperature that allows signal generation for an SNP-containing allele having a relatively high detection temperature, and the relatively low detection temperature is a temperature that allows generation of a signal for an SNP-containing allele having a relatively low detection temperature, and a signal for an SNP-containing allele having a relatively high detection temperature; in this case, the signals generated by the signal generation means are not distinguished by a detector of the same type; wherein detection is carried out both at a relatively high detection temperature and at a relatively low detection temperature; and
(b) инструкцию, в которой описан аспект II способа по настоящему изобретению, озаглавленный как "SNP-генотипирование с использованием разных температур детекции".(b) a manual describing aspect II of the method of the present invention, entitled "SNP genotyping using different detection temperatures".
Согласно следующему аспекту данного изобретения предложен набор для детекции по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием разных температур детекции, содержащий:According to a further aspect of the present invention, there is provided a kit for detecting at least three target nucleotide sequences in a sample using different detection temperatures, comprising:
(а) по меньшей мере три средства генерации сигнала для детекции по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней; при этом каждую из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней детектируют с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом каждая из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней имеет свою температуру детекции, определяемую с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование не только сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей данную температуру детекции, но также и сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей более высокую температуру детекции, чем данная температура детекции; при этом сигналы, генерируемые этими средствами генерации сигнала, не различаются детектором одного типа; при этом детекцию осуществляют при каждой из этих разных температур детекции; и(a) at least three signal generating means for detecting at least three target nucleotide sequences; wherein each of the at least three target nucleotide sequences is detected using an appropriate signal generation means; wherein each of the at least three target nucleotide sequences has its own detection temperature determined using an appropriate signal generation means; wherein the detection temperature is a temperature capable of generating not only a signal for a target nucleotide sequence having a given detection temperature, but also a signal for a target nucleotide sequence having a detection temperature higher than the given detection temperature; while the signals generated by these signal generation means are not distinguished by a detector of the same type; wherein detection is carried out at each of these different detection temperatures; and
(b) инструкцию, в которой описан аспект III способа по настоящему изобретению, озаглавленный как "Детекция по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием разных температур детекции".(b) instructions describing aspect III of the method of the present invention, entitled "Detection of at least three target nucleotide sequences in a sample using different detection temperatures".
Согласно еще одному аспекту данного изобретения предложен набор для детекции двух нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием разных температур детекции и анализа плавления, содержащий:According to another aspect of the present invention, there is provided a kit for detecting two target nucleotide sequences in a sample using different detection temperatures and a melting assay, comprising:
(а) два средства генерации сигнала для детекции двух нуклеотидных последовательностей-мишеней; при этом каждую из нуклеотидных последовательностей-мишеней детектируют с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом одна из двух нуклеотидных последовательностей-мишеней имеет относительно высокую температуру детекции, а другая имеет относительно низкую температуру детекции, определяемую с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом относительно высокая температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, а относительно низкая температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование как сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, так и сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции; при этом сигналы, генерируемые этими двумя средствами генерации сигнала, не различаются детектором одного типа; при этом детекцию осуществляют при относительно высокой температуре детекции; при этом средство генерации сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, представляет собой средство генерации сигнала с использованием расщепления детектирующего олигонуклеотида, а средство генерации сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, представляет собой средство генерации сигнала с использованием образования дуплекса; и(a) two signal generators for detecting two target nucleotide sequences; wherein each of the target nucleotide sequences is detected using an appropriate signal generation means; wherein one of the two target nucleotide sequences has a relatively high detection temperature and the other has a relatively low detection temperature determined using an appropriate signal generation means; wherein the relatively high detection temperature is a temperature that allows signal generation for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature, and the relatively low detection temperature is a temperature that allows generation of a signal for a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature, and a signal for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature; however, the signals generated by these two signal generation means are not distinguished by a detector of the same type; wherein the detection is carried out at a relatively high detection temperature; wherein the signal generating means for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature is a signal generating means using detection oligonucleotide cleavage, and the signal generating means for a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature is a signal generating means with using duplex formation; and
(b) инструкцию, в которой описан аспект IV способа по настоящему изобретению, озаглавленный как "Детекция двух нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием разных температур детекции и анализа плавления".(b) instructions describing aspect IV of the method of the present invention, entitled "Detection of two target nucleotide sequences in a sample using different detection temperatures and melting assay".
Согласно другому аспекту данного изобретения предложен набор для детекции по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием разных температур детекции и анализа плавления, содержащий:According to another aspect of the present invention, there is provided a kit for detecting at least three target nucleotide sequences in a sample using different detection temperatures and melting assays, comprising:
(a) по меньшей мере три средства генерации сигнала для детекции по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней; при этом каждую из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней детектируют с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом каждая из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней имеет свою температуру детекции, определяемую с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование не только сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей данную температуру детекции, но также и сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей более высокую температуру детекции, чем данная температура детекции; при этом сигналы, генерируемые этими средствами генерации сигнала, не различаются детектором одного типа; при этом некоторые из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней детектируют с использованием анализа температур детекции и детекцию осуществляют как при температуре детекции для указанных некоторых из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней, так и при одной или более температурах детекции, превышающих данные температуры детекции; при этом средство генерации сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей самую относительно высокую температуру детекции, представляет собой средство генерации сигнала с использованием расщепления детектирующего олигонуклеотида, а средства генерации сигнала для других нуклеотидных последовательностей-мишеней представляют собой средства генерации сигнала с использованием образования дуплекса; и(a) at least three signal generating means for detecting at least three target nucleotide sequences; wherein each of the at least three target nucleotide sequences is detected using an appropriate signal generation means; wherein each of the at least three target nucleotide sequences has its own detection temperature determined using an appropriate signal generation means; wherein the detection temperature is a temperature capable of generating not only a signal for a target nucleotide sequence having a given detection temperature, but also a signal for a target nucleotide sequence having a detection temperature higher than the given detection temperature; while the signals generated by these signal generation means are not distinguished by a detector of the same type; wherein some of the at least three target nucleotide sequences are detected using a detection temperature assay, and detection is performed both at a detection temperature for said some of the at least three target nucleotide sequences and at one or more detection temperatures above these temperatures detection; wherein the signal generating means for the target nucleotide sequence having the highest relatively high detection temperature is signal generating means using detection oligonucleotide cleavage, and the signal generating means for other target nucleotide sequences are signal generating means using duplex formation; and
(b) инструкцию, в которой описывается аспект V способа по настоящему изобретению, озаглавленный как "Детекция по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней с использованием разных температур детекции и анализа плавления".(b) instructions describing aspect V of the method of the present invention, entitled "Detection of at least three target nucleotide sequences using different detection temperatures and melting assays".
Поскольку наборы по данному изобретению готовят для осуществления способов по настоящему изобретению, общие для них части описания опущены, чтобы избежать излишнего дублирования, приводящего к усложнению данного описания.Since the kits of this invention are prepared for the implementation of the methods of the present invention, parts of the description common to them are omitted to avoid unnecessary duplication leading to the complication of this description.
Все наборы по настоящему изобретению, описанные выше, возможно могут включать в себя реагенты, необходимые для проведения амплификации мишени с использованием реакций ПЦР (например, ПЦР-реакций), такие как буферы, кофакторы ДНК-полимераз и дезоксирибонуклеотид-5-трифосфаты. Возможно, что данные наборы также могут включать в себя молекулы различных полинуклеотидов, обратную транскриптазу, различные буферы и реагенты, и антитела, ингибирующие ДНК-полимеразную активность. Наборы также могут включать в себя реагенты, необходимые для проведения реакций положительного и отрицательного контроля. Оптимальные количества реагентов для использования в данной реакции могут быть легко определены специалистом в данной области техники на основе информации, содержащейся в настоящем описании. Компоненты набора могут находиться в отдельных контейнерах, или в одном контейнере могут находиться несколько компонентов.All kits of the present invention described above may optionally include reagents necessary to carry out target amplification using PCR reactions (eg, PCR reactions), such as buffers, DNA polymerase cofactors, and deoxyribonucleotide-5-triphosphates. It is possible that these kits may also include molecules of various polynucleotides, reverse transcriptase, various buffers and reagents, and antibodies that inhibit DNA polymerase activity. The kits may also include the reagents needed to run the positive and negative control reactions. The optimal amounts of reactants to use in a given reaction can be readily determined by one of ordinary skill in the art based on the information contained herein. The components of a set may be in separate containers, or there may be multiple components in the same container.
Инструкции для описания или практического осуществления способов по настоящему изобретению могут быть записаны на подходящем носителе. Например, инструкции могут быть напечатаны на такой основе, как бумага и пластик. В других воплощениях инструкции могут быть представлены в виде файла с данными для электронного хранения, присутствующего на подходящем пригодном для ввода в компьютер информационном носителе, таком как CD-ROM и дискета. В следующих воплощениях инструкции с руководством к действию могут быть не представлены в наборе, но при этом должна быть предусмотрена возможность получения инструкций из удаленного источника, например, через интернет. Примером этого воплощения является набор, в который входит веб-адрес, где можно просмотреть инструкции и/или с которого эти инструкции могут быть загружены.Instructions for describing or practicing the methods of the present invention may be recorded on a suitable medium. For example, instructions may be printed on a substrate such as paper and plastic. In other embodiments, the instructions may be in the form of an electronically stored data file present on a suitable computer-readable storage medium such as a CD-ROM and floppy disk. In the following embodiments, instructions with a guide to action may not be provided in the set, but it should be possible to receive instructions from a remote source, for example, via the Internet. An example of this embodiment is a set that includes a web address where the instructions can be viewed and/or from which the instructions can be downloaded.
VII. Информационный носитель и устройство для детекции нуклеотидных последовательностей-мишеней с использованием нескольких температур детекцииVII. Information Carrier and Device for Detection of Target Nucleotide Sequences Using Multiple Detection Temperatures
Поскольку информационный носитель, устройство и компьютерная программа по настоящему изобретению, описанные ниже, предназначены для осуществления способов по настоящему изобретению с использованием компьютера, общие для них части описания опущены, чтобы избежать излишнего дублирования, приводящего к усложнению данного описания.Since the storage medium, device, and computer program of the present invention described below are intended to carry out the methods of the present invention using a computer, parts of the description common to them are omitted to avoid unnecessary duplication leading to the complication of this description.
Согласно другому аспекту данного изобретения предложен пригодный для ввода в компьютер информационный носитель, содержащий инструкции для конфигурирования процессора с целью осуществления способа определения присутствия двух нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием разных температур детекции, (способа) включающего:According to another aspect of the present invention, there is provided a computer-readable storage medium containing instructions for configuring a processor to perform a method for detecting the presence of two target nucleotide sequences in a sample using different detection temperatures, (method) comprising:
(a) получение как сигнала, детектируемого при относительно высокой температуре детекции, так и сигнала, детектируемого при относительно низкой температуре детекции; при этом каждую из нуклеотидных последовательностей-мишеней детектируют с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом генерируемый сигнал детектируют, используя детектор одного типа; при этом одна из двух нуклеотидных последовательностей-мишеней имеет относительно высокую температуру детекции, а другая имеет относительно низкую температуру детекции, определяемую с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом относительно высокая температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, а относительно низкая температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование как сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, так и сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции; и(a) obtaining both a signal detectable at a relatively high detection temperature and a signal detectable at a relatively low detection temperature; wherein each of the target nucleotide sequences is detected using an appropriate signal generation means; wherein the generated signal is detected using the same type of detector; wherein one of the two target nucleotide sequences has a relatively high detection temperature and the other has a relatively low detection temperature determined using an appropriate signal generation means; wherein the relatively high detection temperature is a temperature that allows signal generation for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature, and the relatively low detection temperature is a temperature that allows generation of a signal for a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature, and a signal for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature; and
(b) определение присутствия двух нуклеотидных последовательностей-мишеней на основе полученного сигнала; при этом (1) присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, определяют на основе сигнала, детектируемого при относительно высокой температуре детекции, а (2) присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, определяют по разнице между сигналом, детектируемым при относительно высокой температуре детекции, и сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции.(b) determining the presence of two target nucleotide sequences based on the received signal; wherein (1) the presence of a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature is determined based on the signal detected at a relatively high detection temperature, and (2) the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature is determined by the difference between the signal , detected at a relatively high detection temperature, and a signal detected at a relatively low detection temperature.
Согласно одному из воплощений, если нуклеотидная последовательность-мишень, имеющая относительно высокую температуру детекции, присутствует, то референсное значение для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, используют для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции.In one embodiment, if a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature is present, then a reference value for the target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature is used to determine the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature.
Согласно одному из воплощений настоящего изобретения референсное значение для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, хранят на пригодном для ввода в компьютер информационном носителе. Согласно одному из воплощений настоящего изобретения пригодный для ввода в компьютер информационный носитель содержит инструкции для ввода референсного значения при осуществлении данного способа. Согласно одному из воплощений настоящего изобретения пригодный для ввода в компьютер информационный носитель дополнительно содержит инструкции для конфигурирования процессора с целью осуществления способа получения референсного значения.According to one embodiment of the present invention, a reference value for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature is stored on a computer-readable storage medium. According to one embodiment of the present invention, a computer-readable medium contains instructions for entering a reference value in carrying out the method. According to one embodiment of the present invention, the computer-readable storage medium further comprises instructions for configuring the processor to perform the method for obtaining the reference value.
Согласно другому аспекту данного изобретения предложена компьютерная программа, предназначенная для хранения на пригодном для ввода в компьютер информационном носителе, для конфигурирования процессора с целью осуществления способа определения присутствия двух нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце, (способа) включающего:According to another aspect of the present invention, there is provided a computer program for storing on a computer-readable storage medium for configuring a processor for performing a method for determining the presence of two target nucleotide sequences in a sample, (method) comprising:
(a) получение как сигнала, детектируемого при относительно высокой температуре детекции, так и сигнала, детектируемого при относительно низкой температуре детекции; при этом каждую из нуклеотидных последовательностей-мишеней детектируют с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом генерируемый сигнал детектируют, используя детектор одного типа; при этом одна из двух нуклеотидных последовательностей-мишеней имеет относительно высокую температуру детекции, а другая имеет относительно низкую температуру детекции, определяемую с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом относительно высокая температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, а относительно низкая температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование как сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, так и сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции; и(a) obtaining both a signal detectable at a relatively high detection temperature and a signal detectable at a relatively low detection temperature; wherein each of the target nucleotide sequences is detected using an appropriate signal generation means; wherein the generated signal is detected using the same type of detector; wherein one of the two target nucleotide sequences has a relatively high detection temperature and the other has a relatively low detection temperature determined using an appropriate signal generation means; wherein the relatively high detection temperature is a temperature that allows signal generation for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature, and the relatively low detection temperature is a temperature that allows generation of a signal for a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature, and a signal for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature; and
(b) определение присутствия двух нуклеотидных последовательностей-мишеней на основе полученного сигнала; при этом (1) присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, определяют на основе сигнала, детектируемого при относительно высокой температуре детекции, а (2) присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, определяют по разнице между сигналом, детектируемым при относительно высокой температуре детекции, и сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции.(b) determining the presence of two target nucleotide sequences based on the received signal; wherein (1) the presence of a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature is determined based on the signal detected at a relatively high detection temperature, and (2) the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature is determined by the difference between the signal , detected at a relatively high detection temperature, and a signal detected at a relatively low detection temperature.
Согласно еще одному аспекту данного изобретения предложена компьютерная программа, хранящаяся на пригодном для ввода в компьютер информационном носителе, для конфигурирования процессора с целью осуществления описанного выше способа детекции двух нуклеотидных последовательностей-мишеней.According to another aspect of the present invention, there is provided a computer program stored on a computer-readable storage medium for configuring a processor to perform the method described above for detecting two target nucleotide sequences.
Согласно одному из воплощений настоящего изобретения компьютерная программа содержит референсное значение для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции. Согласно одному из воплощений настоящего изобретения компьютерная программа содержит инструкции для ввода референсного значения при осуществлении данного способа. Согласно одному из воплощений настоящего изобретения компьютерная программа дополнительно содержит инструкции для конфигурирования процессора с целью осуществления способа получения референсного значения.According to one embodiment of the present invention, the computer program contains a reference value for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature. According to one of the embodiments of the present invention, the computer program contains instructions for entering a reference value in the implementation of this method. According to one embodiment of the present invention, the computer program further comprises instructions for configuring the processor to implement the method for obtaining the reference value.
Будучи заранее сформулированными в процессоре, программные инструкции действуют, давая команду процессору к выполнению описанного выше способа по настоящему изобретению. Программные инструкции могут содержать инструкцию для получения первого сигнала и второго сигнала, а также инструкцию для определения присутствия двух нуклеотидных последовательностей-мишеней с использованием полученных сигналов.Once formulated in advance in the processor, the program instructions act to instruct the processor to carry out the method of the present invention as described above. The software instructions may include instructions for obtaining the first signal and the second signal, as well as instructions for determining the presence of two target nucleotide sequences using the received signals.
Описанный выше способ по настоящему изобретению осуществляется процессором, таким как процессор в автономном компьютере, в подсоединенном к сети компьютере или в устройстве сбора данных, как например, находящееся в приборе для проведения ПЦР в режиме реального времени.The above-described method of the present invention is carried out by a processor, such as a processor in a stand-alone computer, a computer connected to a network, or a data acquisition device, such as that found in a real-time PCR instrument.
Типы пригодного для ввода в компьютер информационного носителя включают различные информационные носители, такие как CD-R (compact disc-recordable - записываемый компакт-диск), CD-ROM (compact disc read-only memory - компакт-диск, доступный только для чтения), DVD (digital versatile disc - цифровой видеодиск), флэш-память, гибкий диск, жесткий диск, портативный HDD (hard (magnetic) disk drive - жесткий диск), USB (universal serial bus - "универсальная последовательная шина"), магнитная лента, мини-диск, энергонезависимая карта памяти, EEPROM (electrically erasable programmable read-only memory - электрически стираемое перепрограммируемое постоянное запоминающее устройство), оптический диск, оптический информационный носитель, RAM (Random Access Memory - оперативная память), ROM (read-only memory - постоянное запоминающее устройство), системная память и веб-сервер.Types of media that can be entered into a computer include various media such as CD-R (compact disc-recordable), CD-ROM (compact disc read-only memory) , DVD (digital versatile disc - digital video disc), flash memory, floppy disk, hard disk, portable HDD (hard (magnetic) disk drive - hard disk), USB (universal serial bus - "universal serial bus"), magnetic tape , mini disk, non-volatile memory card, EEPROM (electrically erasable programmable read-only memory - electrically erasable reprogrammable read-only memory), optical disk, optical information media, RAM (Random Access Memory - random access memory), ROM (read-only memory read-only memory), system memory, and a web server.
Данные (например, интенсивность, количество циклов амплификации и температура детекции), связанные с сигналами, могут быть получены с использованием нескольких механизмов. Например, данные могут быть собраны процессором, вмонтированным в устройство для сбора данных ПЦР. Данные могут поступать в процессор в режиме реального времени по мере их сбора, или они могут храниться в блоке памяти или буферном запоминающем устройстве и поступать в процессор после завершения эксперимента. Аналогичным образом, набор данных может поступать в отдельную систему, такую как стационарная компьютерная система, посредством сетевого соединения (например, LAN (local area network - локальная вычислительная сеть), VPN (virtual private network - виртуальная частная сеть), интранет и интернет) или прямого соединения (например, USB или другого прямого проводного или беспроводного соединения) с устройством сбора данных, или поступать на съемный носитель данных, такой как CD, DVD, гибкий диск, портативный HDD или тому подобное, в автономную компьютерную систему. Аналогичным образом, набор данных может поступать в серверную вычислительную систему посредством сетевого соединения (например, LAN, VPN, интранета, интернета и беспроводной коммуникационной сети) с клиентом, например, на ноутбук или стационарную компьютерную систему. После получения или сбора данных проводится процесс анализа данных с получением обработанного сигнала, исходя из разницы между сигналами, используемыми для определения присутствия нуклеотидных последовательностей-мишеней в случае, если сигнал детектируют при относительно высокой температуре детекции. Процессор обрабатывает полученные данные, связанные с сигналами, с получением обработанного сигнала, отражающего разницу между сигналами для двух температур детекции. Например, процессор обрабатывает полученные данные с получением отношения сигнала, детектируемого при относительно низкой температуре детекции, к сигналу, детектируемому при относительно высокой температуре детекции.Data (eg, intensity, number of amplification cycles, and detection temperature) associated with signals can be obtained using several mechanisms. For example, data may be collected by a processor embedded in a PCR data collection device. The data may be fed into the processor in real time as it is collected, or it may be stored in a memory block or memory buffer and fed into the processor after the experiment is completed. Similarly, the data set may enter a separate system, such as a stationary computer system, via a network connection (for example, LAN (local area network), VPN (virtual private network), intranet and Internet) or a direct connection (eg, USB or other direct wired or wireless connection) to a data collection device, or be delivered on a removable storage medium such as a CD, DVD, floppy disk, portable HDD, or the like, to a stand-alone computer system. Similarly, the data set may enter the server computing system via a network connection (eg, LAN, VPN, intranet, internet, and wireless communications network) to a client, such as a laptop or desktop computer system. After the acquisition or collection of data, a data analysis process is carried out to obtain a processed signal based on the difference between the signals used to determine the presence of target nucleotide sequences in case the signal is detected at a relatively high detection temperature. The processor processes the received data associated with the signals to obtain a processed signal representing the difference between the signals for the two detection temperatures. For example, the processor processes the received data to obtain a ratio of a signal detected at a relatively low detection temperature to a signal detected at a relatively high detection temperature.
Инструкции для конфигурирования процессора с целью осуществления настоящего изобретения могут быть включены в логическую систему. Инструкции можно загружать и хранить в модуле памяти (например, на жестком диске или другом запоминающем устройстве, таком как локальная или подсоединенная RAM или ROM), однако нахождение инструкций может быть предусмотрено на любом информационном носителе программного обеспечения, таком как портативный HDD, USB, гибкий диск, CD и DVD. Компьютерная программа для реализации настоящего изобретения может быть выполнена с использованием различных языков программирования, таких как С, С++, Java, Visual Basic, VBScript, JavaScript, Perl и XML. Помимо этого, согласно настоящему изобретению можно использовать различные языки и протоколы для внешнего и внутреннего хранения и передачи данных и команд.Instructions for configuring a processor to implement the present invention may be included in a logical system. The instructions may be loaded and stored in a memory module (e.g., a hard disk or other storage device such as local or attached RAM or ROM), however, the instructions may be provided on any software storage medium such as portable HDD, USB, flexible disk, CD and DVD. The computer program for implementing the present invention may be executed using various programming languages such as C, C++, Java, Visual Basic, VBScript, JavaScript, Perl, and XML. In addition, according to the present invention, various languages and protocols can be used for external and internal storage and transmission of data and commands.
Согласно еще одному аспекту данного изобретения предложено устройство для детекции нуклеотидной последовательности-мишени в образце с использованием разных температур детекции, содержащее (а) компьютерный процессор и (b) описанный выше пригодный для ввода в компьютер информационный носитель, соединяемый с компьютерным процессором.According to another aspect of the present invention, there is provided a device for detecting a target nucleotide sequence in a sample using different detection temperatures, comprising (a) a computer processor and (b) a computer-readable storage medium as described above, coupled to the computer processor.
Согласно одному из воплощений данное устройство дополнительно содержит реакционный сосуд для размещения образца и средств генерации сигнала, средство регулирования температуры для регулирования температуры в реакционном сосуде и/или детектор одного типа для детекции сигналов, генерируемых средствами генерации сигнала.According to one embodiment, the apparatus further comprises a reaction vessel for accommodating the sample and signal generating means, a temperature control means for controlling the temperature in the reaction vessel, and/or one type of detector for detecting signals generated by the signal generating means.
Согласно одному из воплощений компьютерный процессор дает возможность детектору одного типа не только детектировать сигналы, генерируемые средствами генерации сигнала при относительно высокой температуре детекции и при относительно низкой температуре детекции, но также рассчитывать разницу между сигналом, детектируемым при относительно высокой температуре детекции, и сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции. Процессор может быть устроен таким образом, чтобы один процессор мог выполнять две функции: управление детекцией при двух температурах детекции и вычисление разницы. Альтернативно, процессорный модуль может быть устроен таким образом, чтобы эти две функции выполняли два процессора, соответственно.According to one embodiment, the computer processor enables one type of detector not only to detect signals generated by the signal generating means at a relatively high detection temperature and at a relatively low detection temperature, but also to calculate the difference between a signal detected at a relatively high detection temperature and a signal detected at a relatively low detection temperature. The processor may be configured such that a single processor can perform two functions: controlling the detection at two detection temperatures and calculating the difference. Alternatively, the processor module may be arranged such that these two functions are performed by two processors, respectively.
Первой существенной особенностью устройства является наличие процессора, дающего возможность устройству детектировать сигналы, генерируемые при двух температурах детекции. Согласно одному из воплощений, если сигнал генерируется одновременно с амплификацией нуклеотидной последовательности-мишени, то устройство содержит процессор, дающий возможность устройству детектировать сигналы, генерируемые при двух температурах детекции в каждом цикле амплификации.The first essential feature of the device is the presence of a processor enabling the device to detect signals generated at two detection temperatures. According to one embodiment, if a signal is generated simultaneously with amplification of the target nucleotide sequence, then the device comprises a processor enabling the device to detect signals generated at two detection temperatures in each amplification cycle.
Второй существенной особенностью устройства является наличие процессора для обработки сигнала, детектируемого при двух температурах детекции, для получения разницы между сигналами. Согласно одному из воплощений разница между сигналами выражается в виде численных значений в результате математической обработки.The second essential feature of the device is the presence of a processor for processing the signal detected at two detection temperatures in order to obtain the difference between the signals. According to one of the embodiments, the difference between the signals is expressed as numerical values as a result of mathematical processing.
Согласно одному из воплощений процессор может быть реализован путем установки программного обеспечения в традиционные устройства для детекции нуклеотидных последовательностей-мишеней (например, в устройство для ПЦР в режиме реального времени). Согласно одному из воплощений устройство содержит процессор, дающий возможность устройству детектировать сигналы по меньшей мере при двух температурах детекции и осуществлять математическую обработку по меньшей мере двух результатов детекции.In one embodiment, the processor may be implemented by installing software in conventional devices for detecting target nucleotide sequences (eg, in a real-time PCR device). According to one embodiment, the device comprises a processor enabling the device to detect signals at at least two detection temperatures and perform mathematical processing on at least two detection results.
Согласно еще одному аспекту данного изобретения предложен пригодный для ввода в компьютер информационный носитель, содержащий инструкции для конфигурирования процессора с целью осуществления способа определения присутствия по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием разных температур детекции, (способа) включающего:According to yet another aspect of the present invention, there is provided a computer-readable storage medium containing instructions for configuring a processor to perform a method for determining the presence of at least three target nucleotide sequences in a sample using different detection temperatures, (method) comprising:
(a) получение сигналов, детектируемых по меньшей мере при трех температурах детекции; при этом каждую из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней детектируют с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом каждая из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней имеет свою температуру детекции, определяемую с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование не только сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей данную температуру детекции, но также и сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей более высокую температуру детекции, чем данная температура детекции; при этом сигналы, генерируемые этимих средствами генерации сигнала, не различаются детектором одного типа; при этом детекцию осуществляют при каждой из разных температур детекции; и(a) obtaining signals detectable at at least three detection temperatures; wherein each of the at least three target nucleotide sequences is detected using an appropriate signal generation means; wherein each of the at least three target nucleotide sequences has its own detection temperature determined using an appropriate signal generation means; wherein the detection temperature is a temperature capable of generating not only a signal for a target nucleotide sequence having a given detection temperature, but also a signal for a target nucleotide sequence having a detection temperature higher than the given detection temperature; while the signals generated by these signal generation means are not distinguished by a detector of the same type; wherein the detection is carried out at each of the different detection temperatures; and
(b) определение присутствия по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней на основе полученного сигнала; при этом, если определяют присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей конкретную температуру детекции, среди по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней, то присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей данную конкретную температуру детекции, определяют по разнице между сигналом, детектируемым при одной или более температурах детекции, превышающих данную конкретную температуру детекции, и сигналом, детектируемым при данной конкретной температуре детекции; при этом, если данная конкретная температура детекции является самой относительно высокой температурой детекции среди температур детекции, то присутствие данной нуклеотидной последовательности-мишени определяют на основе сигнала, детектируемого при данной конкретной температуре детекции.(b) determining the presence of at least three target nucleotide sequences based on the received signal; wherein if the presence of a target nucleotide sequence having a particular detection temperature is determined among at least three target nucleotide sequences, then the presence of a target nucleotide sequence having a particular detection temperature is determined by the difference between the signal detected at one or more detection temperatures exceeding that particular detection temperature and a signal detected at that particular detection temperature; wherein, if the particular detection temperature is the relatively highest detection temperature among the detection temperatures, then the presence of the target nucleotide sequence is determined based on the signal detected at that particular detection temperature.
Согласно одному из воплощений настоящего изобретения референсные значения хранят на пригодном для ввода в компьютер информационном носителе. Согласно одному из воплощений настоящего изобретения пригодный для ввода в компьютер информационный носитель содержит инструкции для ввода референсного значения при осуществлении способа. Согласно одному из воплощений настоящего изобретения пригодный для ввода в компьютер информационный носитель дополнительно содержит инструкции для конфигурирования процессора с целью осуществления способа получения референсных значений.According to one embodiment of the present invention, the reference values are stored on a computer-readable storage medium. According to one embodiment of the present invention, a computer-readable medium contains instructions for entering a reference value in carrying out the method. According to one of the embodiments of the present invention suitable for input into a computer information medium further contains instructions for configuring the processor to implement the method of obtaining reference values.
Согласно еще одному аспекту данного изобретения предложена компьютерная программа, хранящаяся или предназначенная для хранения на пригодном для ввода в компьютер информационном носителе, для конфигурирования процессора с целью осуществления описанного выше способа детекции по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием разных температур детекции.According to another aspect of the present invention, a computer program is provided, stored or intended to be stored on a computer-compatible storage medium, for configuring a processor to perform the method described above for detecting at least three target nucleotide sequences in a sample using different detection temperatures.
Согласно другому аспекту данного изобретения предложен пригодный для ввода в компьютер информационный носитель, содержащий инструкции для конфигурирования процессора с целью осуществления способа SNP-генотипирования нуклеотидной последовательности в образце с использованием разных температур детекции, (способа) включающего:According to another aspect of the present invention, there is provided a computer-readable storage medium containing instructions for configuring a processor to perform a method for SNP genotyping a nucleotide sequence in a sample using different detection temperatures, (method) comprising:
(а) получение как сигнала, детектируемого при относительно высокой температуре детекции, так и сигнала, детектируемого при относительно низкой температуре детекции; при этом каждый из SNP-содержащих аллелей детектируют с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом один из SNP-содержащих аллелей имеет относительно высокую температуру детекции, а другой имеет относительно низкую температуру детекции, определяемую с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом относительно высокая температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование сигнала для SNP-содержащего аллеля, имеющего относительно высокую температуру детекции, а относительно низкая температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование как сигнала для SNP-содержащего аллеля, имеющего относительно низкую температуру детекции, так и сигнала для SNP-содержащего аллеля, имеющего относительно высокую температуру детекции;(a) obtaining both a signal detectable at a relatively high detection temperature and a signal detectable at a relatively low detection temperature; wherein each of the SNP-containing alleles is detected using an appropriate signal generating means; wherein one of the SNP-containing alleles has a relatively high detection temperature and the other has a relatively low detection temperature determined using an appropriate signal generation means; wherein the relatively high detection temperature is a temperature that allows signal generation for an SNP-containing allele having a relatively high detection temperature, and the relatively low detection temperature is a temperature that allows generation of a signal for an SNP-containing allele having a relatively low detection temperature, and a signal for an SNP-containing allele having a relatively high detection temperature;
(b) определение SNP-генотипа по разнице между полученными сигналами.(b) determination of the SNP genotype by the difference between the received signals.
Согласно одному из воплощений настоящего изобретения референсные значения для гомозиготы, в состав которой входит SNP-содержащий аллель, имеющий относительно высокую температуру детекции, и/или гетерозиготы, и/или гомозиготы, в состав которой входит SNP-содержащий аллель, имеющий относительно низкую температуру детекции, хранят на пригодном для ввода в компьютер информационном носителе. Согласно одному из воплощений настоящего изобретения пригодный для ввода в компьютер информационный носитель содержит инструкции для ввода референсного значения при осуществлении способа. Согласно одному из воплощений настоящего изобретения пригодный для ввода в компьютер информационный носитель дополнительно содержит инструкции для конфигурирования процессора с целью осуществления способа получения референсных значений.According to one embodiment of the present invention, reference values for a homozygote containing an SNP-containing allele having a relatively high detection temperature and/or heterozygotes and/or a homozygote containing an SNP-containing allele having a relatively low detection temperature , stored on a medium suitable for input into a computer. According to one embodiment of the present invention, a computer-readable medium contains instructions for entering a reference value in carrying out the method. According to one of the embodiments of the present invention suitable for input into a computer information medium further contains instructions for configuring the processor to implement the method of obtaining reference values.
Согласно еще одному аспекту данного изобретения предложена компьютерная программа, хранящаяся или предназначенная для хранения на пригодном для ввода в компьютер информационном носителе, для конфигурирования процессора с целью осуществления описанного выше способа SNP-генотипирования нуклеотидной последовательности в образце с использованием разных температур детекции.According to another aspect of the present invention, a computer program is provided, stored or intended to be stored on a computer-compatible storage medium, for configuring a processor to perform the method described above for SNP genotyping a nucleotide sequence in a sample using different detection temperatures.
Согласно одному из воплощений настоящего изобретения компьютерная программа содержит референсные значения для гомозиготы, в состав которой входит SNP-содержащий аллель, имеющий относительно высокую температуру детекции, и/или гетерозиготы, и/или гомозиготы, в состав которой входит SNP-содержащий аллель, имеющий относительно низкую температуру детекции. Согласно одному из воплощений настоящего изобретения компьютерная программа содержит инструкции для ввода референсного значения при осуществлении способа. Согласно одному из воплощений настоящего изобретения компьютерная программа дополнительно содержит инструкции для конфигурирования процессора с целью осуществления способа получения референсных значений.According to one of the embodiments of the present invention, the computer program contains reference values for a homozygote, which includes an SNP-containing allele having a relatively high detection temperature, and/or heterozygotes, and/or homozygotes, which includes an SNP-containing allele having a relatively high temperature of detection. low detection temperature. According to one of the embodiments of the present invention, the computer program contains instructions for entering the reference value in the implementation of the method. According to one embodiment of the present invention, the computer program further comprises instructions for configuring the processor to implement the method for obtaining the reference values.
Согласно другому аспекту данного изобретения предложен пригодный для ввода в компьютер информационный носитель, содержащий инструкции для конфигурирования процессора с целью осуществления способа детекции двух нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием разных температур детекции и анализа плавления, (способа) включающего:According to another aspect of the present invention, there is provided a computer-readable storage medium containing instructions for configuring a processor to perform a method for detecting two target nucleotide sequences in a sample using different detection temperatures and melting analysis, (method) comprising:
(a) получение как сигнала при относительно высокой температуре детекции для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, так и сигнала, полученного с использованием анализа плавления в диапазоне температур, для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции; при этом каждую из нуклеотидных последовательностей-мишеней детектируют с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом одна из двух нуклеотидных последовательностей-мишеней имеет относительно высокую температуру детекции, а другая имеет относительно низкую температуру детекции, определяемую с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом относительно высокая температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, а относительно низкая температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование как сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, так и сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции; при этом для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, проводят анализ плавления в диапазоне температур; и(a) obtaining both a signal at a relatively high detection temperature to detect the presence of a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature, and a signal obtained using a temperature range melting assay to detect the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low temperature detection; wherein each of the target nucleotide sequences is detected using an appropriate signal generation means; wherein one of the two target nucleotide sequences has a relatively high detection temperature and the other has a relatively low detection temperature determined using an appropriate signal generation means; wherein the relatively high detection temperature is a temperature that allows signal generation for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature, and the relatively low detection temperature is a temperature that allows generation of a signal for a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature, and a signal for a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature; wherein, to determine the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature, a melting analysis is performed over a temperature range; and
(b) определение присутствия двух нуклеотидных последовательностей-мишеней на основе полученных сигналов; при этом присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, определяют на основе сигнала при относительно высокой температуре детекции, а присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, определяют на основе сигнала, полученного в результате анализа плавления.(b) determining the presence of two target nucleotide sequences based on the received signals; wherein the presence of a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature is determined based on a signal at a relatively high detection temperature, and the presence of a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature is determined based on a signal obtained from a melting assay.
Согласно еще одному аспекту данного изобретения предложена компьютерная программа, хранящаяся или предназначенная для хранения на пригодном для ввода в компьютер информационном носителе, для конфигурирования процессора с целью осуществления описанного выше способа детекции двух нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием разных температур детекции и анализа плавления.According to another aspect of the present invention, a computer program is provided, stored or intended to be stored on a computer-compatible storage medium, for configuring a processor to perform the method described above for detecting two target nucleotide sequences in a sample using different detection temperatures and melting assays.
Согласно другому аспекту данного изобретения предложен пригодный для ввода в компьютер информационный носитель, содержащий инструкции для конфигурирования процессора с целью осуществления способа детекции по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием анализа температур детекции и анализа плавления, (способа) включающего:According to another aspect of the present invention, there is provided a computer-readable storage medium containing instructions for configuring a processor to perform a method for detecting at least three target nucleotide sequences in a sample using detection temperature analysis and melting analysis, (method) comprising:
(а) получение как (1) сигнала при температуре детекции некоторых из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней и при одной или более температурах детекции, превышающих данные температуры детекции, для определения присутствия некоторых из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней, так и (2) сигнала, полученного с использованием анализа плавления в диапазоне температур, для определения присутствия других нуклеотидных последовательностей-мишеней, отличающихся от указанных некоторых из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней; при этом каждую из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней детектируют с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом каждая из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней имеет свою температуру детекции, определяемую с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом данная температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование не только сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей данную температуру детекции, но также и сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей более высокую температуру детекции, чем данная температура детекции; при этом указанные некоторые из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней детектируют с использованием анализа температур детекции и детекцию осуществляют как при температуре детекции указанных некоторых из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней, так и при одной или более температурах детекции, превышающих данные температуры детекции; при этом для определения присутствия других нуклеотидных последовательностей-мишеней, отличающихся от указанных некоторых из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней, проводят анализ плавления в диапазоне температур; и(a) obtaining as (1) a signal at a detection temperature of some of the at least three target nucleotide sequences and at one or more detection temperatures above these detection temperatures to determine the presence of some of the at least three target nucleotide sequences, so and (2) a signal obtained using a temperature range melting assay to determine the presence of other target nucleotide sequences other than said some of the at least three target nucleotide sequences; wherein each of the at least three target nucleotide sequences is detected using an appropriate signal generation means; wherein each of the at least three target nucleotide sequences has its own detection temperature determined using an appropriate signal generation means; this detection temperature is a temperature capable of generating not only a signal for a target nucleotide sequence having a given detection temperature, but also a signal for a target nucleotide sequence having a higher detection temperature than the given detection temperature; wherein said some of the at least three target nucleotide sequences are detected using a detection temperature analysis, and detection is carried out both at a detection temperature of said some of the at least three target nucleotide sequences and at one or more detection temperatures exceeding these temperatures detection; while to determine the presence of other target nucleotide sequences that differ from these some of the at least three target nucleotide sequences, conduct a melting analysis in the temperature range; and
(b) определение (1) присутствия указанных некоторых из нуклеотидных последовательностей-мишеней на основе полученного сигнала; при этом, если определяют присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей конкретную температуру детекции, среди указанных некоторых из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней, то присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей данную конкретную температуру детекции, определяют по разнице между сигналом, детектируемым при одной или более температурах детекции, превышающих данную конкретную температуру детекции, и сигналом, детектируемым при данной конкретной температуре детекции; при этом, если данная конкретная температура детекции является самой относительно высокой температурой детекции среди температур детекции, то присутствие нуклеотидной последовательности-мишени определяют, используя сигнал, детектируемый при данной конкретной температуре детекции; и (2) присутствия других нуклеотидных последовательностей-мишеней, отличающихся от указанных некоторых из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней, на основе сигнала, полученного в результате анализа плавления.(b) determining (1) the presence of said some of the target nucleotide sequences based on the received signal; wherein if the presence of a target nucleotide sequence having a specific detection temperature is determined among said some of the at least three target nucleotide sequences, then the presence of a target nucleotide sequence having this specific detection temperature is determined by the difference between the signal detected at one or more detection temperatures above that particular detection temperature and a signal detectable at that particular detection temperature; wherein, if this particular detection temperature is the relatively highest detection temperature among the detection temperatures, then the presence of the target nucleotide sequence is determined using the signal detected at that particular detection temperature; and (2) the presence of other target nucleotide sequences other than said some of the at least three target nucleotide sequences, based on the signal obtained from the melt assay.
Согласно еще одному аспекту данного изобретения предложена компьютерная программа, хранящаяся или предназначенная для хранения на пригодном для ввода в компьютер информационном носителе, для конфигурирования процессора с целью осуществления описанного выше способа детекции по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием анализа температур детекции и анализа плавления.According to yet another aspect of the present invention, a computer program is provided, stored or intended to be stored on a computer-readable storage medium, for configuring a processor to perform the method described above for detecting at least three target nucleotide sequences in a sample using detection temperature analysis and melting analysis.
Отличительные признаки и преимущества данного изобретения будут обобщены ниже.The features and advantages of the present invention will be summarized below.
(a) Настоящее изобретение, в котором используются разные температуры детекции, дает возможность детектировать множество нуклеотидных последовательностей-мишеней в традиционных методах в режиме реального времени в одном реакционном сосуде даже с применением метки одного типа. При использовании традиционных технологий детекцию множества нуклеотидных последовательностей-мишеней выполняют с использованием анализа плавления после амплификации мишеней. В отличие от этого, для осуществления настоящего изобретения не требуется проведения анализа плавления после амплификации мишеней, в связи с чем продолжительность анализа значительно уменьшается.(a) The present invention, which uses different detection temperatures, makes it possible to detect a plurality of target nucleotide sequences in real time in a single reaction vessel even using the same type of label using traditional methods. With conventional techniques, detection of a plurality of target nucleotide sequences is performed using a melting assay after target amplification. In contrast, the implementation of the present invention does not require a melting assay after target amplification, and therefore the duration of the assay is greatly reduced.
(b) Интересно отметить, что авторы настоящего изобретения обнаружили, что если сигнал для нуклеотидной последовательности-мишени генерируют с использованием средства генерации сигнала, то (1) появляется возможность регулирования детекции сигнала при конкретной температуре в зависимости от типа средства генерации сигнала, и (2), в случае детекции сигнала при двух выбранных температурах детекции, сигналы, детектируемые при этих двух разных температурах детекции, изменяются согласно определенной закономерности. Авторы настоящего изобретения применили эти наблюдения для детекции нуклеотидных последовательностей-мишеней, осуществляя тем самым настоящее изобретение.(b) It is interesting to note that the inventors of the present invention have found that if a signal for a target nucleotide sequence is generated using a signal generating means, then (1) it is possible to adjust the signal detection at a particular temperature depending on the type of signal generating means, and (2 ), in the case of detecting a signal at two selected detection temperatures, the signals detected at these two different detection temperatures change according to a certain pattern. The authors of the present invention applied these observations to the detection of target nucleotide sequences, thereby carrying out the present invention.
(с) В настоящем изобретении с использованием разных температур детекции для каждой из нуклеотидных последовательностей-мишеней к получению неожиданных результатов может приводить применение средства генерации сигнала, используемого для получения сигнала посредством дуплекса, образованного способом, зависящим от расщепления опосредующего олигонуклеотида, специфически гибридизованного с нуклеотидной последовательностью-мишенью (например, в способах на основе РТОСЕ). Во-первых, в способах с использованием опосредующего олигонуклеотида, таких как способы на основе РТОСЕ, можно легко регулировать величину Тпл образованного дуплекса для обеспечения удобного выбора температур детекции. Во-вторых, если при применении способа, обеспечивающего получение сигнала непосредственно от зонда, гибридизованного с нуклеотидной последовательностью-мишенью, вместе с этим используют, для амплификации мишеней, полимеразу, обладающую 5'-нуклеазной активностью, то зонд по всей вероятности будет расщеплен под действием 5'-нуклеазной активности, что может повлиять на интерпретацию сигналов. Поскольку в способах с использованием опосредующего олигонуклеотида, таких как способы на основе РТОСЕ, 5'-нуклеазную активность, как правило, применяют для расщепления опосредующего олигонуклеотида, то такой проблемы, связанной с интерпретацией получаемого в результате сигнала, обычно не возникает. И наконец, в способах с использованием опосредующего олигонуклеотида, таких как способы на основе РТОСЕ, может образовываться дуплекс, имеющий конкретное значение Тпл, поскольку дуплекс имеет последовательность, не зависящую от последовательности нуклеиновой кислоты-мишени. В отличие от этого, в способах с использованием зондов, предназначенных для непосредственной гибридизации с нуклеотидной последовательностью-мишенью, ввиду того, что по меньшей мере одна цепь образованного дуплекса содержит последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности-мишени, может образовываться дуплекс, имеющий непредполагаемую величину Тпл, когда имеется вариацию нуклеотидной последовательности-мишени.(c) In the present invention, using different detection temperatures for each of the target nucleotide sequences, the use of a signal generating means used to generate a signal through a duplex formed in a manner dependent on the cleavage of a mediating oligonucleotide specifically hybridized to a nucleotide sequence can lead to unexpected results. -target (eg, in PTOCE-based methods). First, in methods using a mediating oligonucleotide, such as those based on PTOCE , the Tm of the duplex formed can be easily adjusted to provide a convenient selection of detection temperatures. Secondly, if, when using a method that provides a signal directly from a probe hybridized to a target nucleotide sequence, at the same time, a polymerase with 5'-nuclease activity is used to amplify the targets, then the probe will most likely be cleaved by 5'-nuclease activity, which may affect the interpretation of signals. Since in methods using a mediating oligonucleotide, such as those based on PTOCE, the 5'-nuclease activity is generally used to cleave the mediating oligonucleotide, this problem with the interpretation of the resulting signal usually does not arise. Finally, in methods using a mediating oligonucleotide, such as those based on PTOCE , a duplex having a particular Tm can be formed because the duplex has a sequence independent of the target nucleic acid sequence. In contrast, in methods using probes designed for direct hybridization with a target nucleotide sequence, due to the fact that at least one strand of the formed duplex contains a sequence complementary to the target nucleotide sequence, a duplex can be formed having an unintended T m when there is variation in the target nucleotide sequence.
(d) В одном из воплощений данного изобретения для детекции множества нуклеотидных последовательностей-мишеней с применением разных температур детекции в режиме реального времени к получению неожиданных результатов может приводить сочетание (1), для одной нуклеотидной последовательности-мишени, средства генерации сигнала для генерирования сигнала способом, зависящим от расщепления детектирующего олигонуклеотида (например, TaqMan-способом), и (2), для другой нуклеотидной последовательности-мишени, средства генерации сигнала для получения сигнала посредством дуплекса, образованного способом, зависящим от расщепления опосредующего олигонуклеотида, специфически гибридизованного с данной нуклеотидной последовательностью-мишенью (например, способами на основе РТОСЕ).(d) In one embodiment of the present invention, for detecting a plurality of target nucleotide sequences using different real-time detection temperatures, the combination of (1), for a single target nucleotide sequence, a signal generating means for generating a signal by the method , depending on the cleavage of the detection oligonucleotide (e.g., by the TaqMan method), and (2), for another target nucleotide sequence, a signal generating means for obtaining a signal by means of a duplex formed by the method dependent on the cleavage of the mediating oligonucleotide specifically hybridized to that nucleotide sequence -target (eg, PTOCE-based methods).
В способе с применением расщепления детектирующего олигонуклеотида, как правило, используется фермент, обладающий 5'-нуклеазной активностью (в частности, Taq-полимераза), для расщепления детектирующего олигонуклеотида. В традиционных способах генерирования сигнала с использованием непосредственной гибридизации детектирующих зондов (например, способе "молекулярных маяков", способе с применением гибридизационных зондов или способе Hybeacon) эти детектирующие зонды с большой долей вероятности будут расщепляться под действием фермента, обладающего 5'-нуклеазной активностью (в частности, Taq-полимеразы). Расщепление детектирующих зондов может приводить к уменьшению чувствительности ввиду расходования детектирующих зондов (например, в способе с применением гибридизационных зондов) или к получению ложноположительного сигнала в способах с зависящим от расщепления получением сигнала (например, в способе "молекулярных маяков"). Несмотря на то, что в способах с применением меченых праймеров (например, в способе "sunrise" или способе "scorpion") нет связанных с расщеплением затруднений, как в способах с применением зондов, их недостатки заключаются в том, что саму величину Тпл ампликона необходимо контролировать для регулирования температур детекции. В противоположность этому, поскольку в способах на основе РТОСЕ применяется расщепление опосредующего олигонуклеотида, специфически гибридизованного с нуклеотидной последовательностью-мишенью, на них не оказывает влияния фермент, обладающий 5'-нуклеазной активностью (в частности, Taq-полимераза). Помимо этого, в способах на основе РТОСЕ можно легко регулировать величину Тпл образованного дуплекса для обеспечения удобного выбора температур детекции.The detection oligonucleotide cleavage method generally uses an enzyme having 5'-nuclease activity (particularly Taq polymerase) to cleave the detection oligonucleotide. In traditional signal generation methods using direct hybridization of detection probes (e.g., molecular beacon method, hybridization probe method, or Hybeacon method), these detection probes are very likely to be cleaved by an enzyme having 5'-nuclease activity (in in particular, Taq polymerase). Cleavage of detection probes can result in reduced sensitivity due to consumption of detection probes (eg, hybridization probe method) or false positive signal in split-dependent signal acquisition methods (eg, molecular beacon method). Although tagged primer methods (e.g., the "sunrise" method or "scorpion" method) do not have the cleavage problems of probe methods, they have the disadvantage that the Tm of the amplicon itself must be controlled to control the detection temperatures. In contrast, since PTOCE-based methods use cleavage of a mediating oligonucleotide specifically hybridized to a target nucleotide sequence, they are not affected by an enzyme having 5'-nuclease activity (particularly Taq polymerase). In addition, in PTOCE -based methods, the Tm of the formed duplex can be easily adjusted to provide a convenient choice of detection temperatures.
(e) В одном из воплощений данного изобретения для детекции множества нуклеотидных последовательностей-мишеней в одном реакционном сосуде с использованием детекции в режиме реального времени для некоторых мишеней и анализа плавления для других мишеней могут быть выбраны и применены средства генерации сигнала, соответствующие характеристикам анализируемых нуклеотидных последовательностей-мишеней, которые позволяют детектировать множество нуклеотидных последовательностей-мишеней гораздо более эффективным образом.(e) In one embodiment of the present invention, for the detection of multiple target nucleotide sequences in a single reaction vessel, using real-time detection for some targets and melting analysis for other targets, signal generation means appropriate to the characteristics of the analyzed nucleotide sequences can be selected and applied. -targets, which allow the detection of multiple target nucleotide sequences in a much more efficient manner.
(f) В одном из воплощений данного изобретения для детекции множества нуклеотидных последовательностей-мишеней с использованием детекции в режиме реального времени и анализа плавления средство генерации сигнала для генерирования сигнала способом, зависящим от расщепления детектирующего олигонуклеотида (например, TaqMan-способом), для нуклеотидной последовательности-мишени, детектируемой в режиме реального времени, позволяет детектировать множество нуклеотидных последовательностей-мишеней значительно более удобным образом с существенно более высокой эффективностью. В способе с использованием расщепления детектирующего олигонуклеотида, таком как TaqMan-способ, осуществляется расщепление детектирующего зонда. В некоторых реакционных условиях возможно может происходить расщепление большинства детектирующих зондов. В этом случае отсутствует дуплекс, допускающий генерирование сигнала в анализе плавления, по окончании проводимой в режиме реального времени реакции, в результате чего легко можно выбрать значение Тпл для других нуклеотидных последовательностей-мишеней, подлежащих детекции с использованием анализа плавления.(f) In one embodiment of the present invention for detecting a plurality of target nucleotide sequences using real-time detection and melting analysis, signal generating means for generating a signal in a detection oligonucleotide cleavage dependent method (e.g., TaqMan method) for a nucleotide sequence real-time detectable α-target allows detection of a plurality of target nucleotide sequences in a much more convenient manner with substantially higher efficiency. In a detection oligonucleotide cleavage method, such as the TaqMan method, the detection probe is cleaved. Under some reaction conditions, cleavage of most detection probes may possibly occur. In this case, there is no duplex capable of generating a signal in the melt assay at the end of the real-time reaction, making it easy to select the Tm value for other target nucleotide sequences to be detected using the melt assay.
(g) В одном из воплощений данного изобретения для детекции множества нуклеотидных последовательностей-мишеней с использованием детекции в режиме реального времени и анализа плавления к получению неожиданных результатов может приводить сочетание (1), для одной нуклеотидной последовательности-мишени, средства генерации сигнала для генерирования сигнала способом, зависящим от расщепления детектирующего олигонуклеотида (например, TaqMan-способом), и (2), для другой нуклеотидной последовательности-мишени, средства генерации сигнала для получения сигнала посредством дуплекса, образованного способом, зависящим от расщепления опосредующего олигонуклеотида, специфически гибридизованного с данной нуклеотидной последовательностью-мишенью (например, способами на основе РТОСЕ).(g) In one embodiment of the present invention, for detecting a plurality of target nucleotide sequences using real-time detection and melting analysis, the combination of (1), for a single target nucleotide sequence, a signal generating means for generating a signal may lead to unexpected results. by a method dependent on cleavage of the detection oligonucleotide (e.g., TaqMan method), and (2), for another target nucleotide sequence, a signal generating means for obtaining a signal by means of a duplex formed by a method dependent on cleavage of a mediating oligonucleotide specifically hybridized to that nucleotide the target sequence (eg, PTOCE-based methods).
Как показывают традиционные технологии с применением гибридизации между нуклеотидными последовательностями-мишенями и детектирующими олигонуклеотидами, имеются серьезные проблемы, такие как уменьшение чувствительности (включая уменьшение чувствительности в анализе плавления) ввиду расщепления зондов и генерирования обусловленных этим расщеплением ложных сигналов. Настоящее изобретение полностью свободно от таких проблем. В способах на основе РТОСЕ можно легко регулировать величину Тпл применяемых для детекции дуплексов, так что можно легко выбрать температуры детекции, используемые для детекции в режиме реального времени, и соответствующую пику плавления величину Тпл, используемую для анализа плавления.Conventional technologies using hybridization between target nucleotide sequences and detection oligonucleotides show that there are serious problems such as desensitization (including desensitization in melt assay) due to probe cleavage and generation of false signals due to this cleavage. The present invention is completely free from such problems. In PTOCE -based methods, the Tm value used for duplex detection can be easily adjusted, so that the detection temperatures used for real-time detection and the melt peak-corresponding Tm value used for melt analysis can be easily selected.
Теперь настоящее изобретение будет описано более подробно в примерах. Специалистам в данной области техники будет очевидно, что эти примеры предназначены для более конкретного иллюстрирования, и объем настоящего изобретения, как он изложен в прилагаемой формуле изобретения, не ограничивается данными примерами.Now the present invention will be described in more detail in the examples. Those skilled in the art will appreciate that these examples are intended to be more specific in illustrating and the scope of the present invention as set forth in the appended claims is not limited to these examples.
ПРИМЕРЫEXAMPLES
Пример 1. Детекция двух мишеней с использованием способа с РТОСЕ с применением ПЦР в режиме реального времени, включающего детекцию сигнала при разных температурахExample 1 Detection of Two Targets Using the PTOCE Method Using Real Time PCR Including Signal Detection at Different Temperatures
Далее авторы изобретения исследовали, можно ли в одном реакционном сосуде детектировать две нуклеиновые кислоты-мишени с использованием одного канала детекции и способа с РТОСЕ с применением ПЦР в режиме реального времени, включающего детекцию сигнала при разных температурах.Further, the inventors investigated whether it is possible to detect two target nucleic acids in one reaction vessel using a single detection channel and a real-time PCR PTOCE method involving signal detection at different temperatures.
Для удлинения располагающихся "вверх по течению" праймеров и располагающихся "вниз по течению" праймеров, расщепления РТО и удлинения фрагмента РТО использовали Taq ДНК-полимеразу, обладающую 5'-нуклеазной активностью. В качестве нуклеотидных последовательностей-мишеней использовали геномную ДНК из Neisseria gonorrhoeae (NG) и геномную ДНК из Chlamydia trachomatis (СТ).Taq DNA polymerase with 5'-nuclease activity was used to extend the upstream and downstream primers, cleave the PTO, and extend the PTO fragment. Genomic DNA from Neisseria gonorrhoeae (NG) and genomic DNA from Chlamydia trachomatis (CT) were used as target nucleotide sequences.
Для детекции СТ и NG использовали способ с РТОСЕ с применением ПЦР в режиме реального времени. При наличии мишени РТО расщепляется, и образуется фрагмент РТО. Фрагмент РТО отжигается с захватывающим участком СТО, удлиняется на матричном участке СТО, и образует удлиненный дуплекс с СТО (дуплексный СТО). Образование удлиненного дуплекса обеспечивает получение сигнала, и можно получить кривую амплификации, измеряя сигнал при температуре образования удлиненного дуплекса.For the detection of CT and NG, the PTOCE method was used using real-time PCR. In the presence of a target, the PTO is cleaved and a PTO fragment is formed. The RTO fragment is annealed with the capturing CRT section, elongated on the CRT matrix section, and forms an elongated duplex with the CRT (duplex CRT). The formation of an extended duplex provides a signal, and an amplification curve can be obtained by measuring the signal at the temperature of formation of an extended duplex.
В этом примере "72°С" выбирали в качестве температуры детекции сигнала для СТ, а "60°С" выбирали в качестве температуры детекции сигнала для NG с учетом средств генерации сигнала. Удлиненный дуплекс, образованный в зависимости от присутствия СТ или NG, имеет регулируемое значение Тпл, скорректированное в соответствии с его последовательностью и длиной. В этом примере последовательность и длина удлиненного дуплекса для СТ предназначены для того, чтобы получить сигнал, который генерируется в результате образования дуплекса при 72°С. В то же время, последовательность и длина удлиненного дуплекса для NG предназначены для того, чтобы получить сигнал, который генерируется в результате образования дуплекса при 60°С, но не для получения сигнала при 72°С, поскольку происходит диссоциация и дуплекс не образуется. При температуре детекции 72°С будет генерироваться и детектироваться сигнал для СТ. При температуре детекции 60°С будет генерироваться и детектироваться сигнал для NG, а также сигнал для СТ.In this example, "72°C" was chosen as the signal detection temperature for CT, and "60°C" was chosen as the signal detection temperature for NG, taking into account the signal generation means. The extended duplex, formed depending on the presence of CT or NG, has an adjustable Tm value adjusted according to its sequence and length. In this example, the sequence and length of the extended duplex for the CT are designed to capture the signal that is generated as a result of duplex formation at 72°C. At the same time, the sequence and length of the extended duplex for NG is designed to obtain the signal that is generated by the formation of a duplex at 60°C, but not to obtain a signal at 72°C, since dissociation occurs and no duplex is formed. At a detection temperature of 72°C, a signal for the CT will be generated and detected. At a detection temperature of 60°C, a signal for NG will be generated and detected, as well as a signal for CT.
РТО и СТО блокированы углеродным спейсером по своим 3'-концам, чтобы препятствовать их удлинению. СТО помечен молекулой-гасителем (BHQ-2) и флуоресцентной репортерной молекулой (CAL Fluor Red 610) на своем матричном участке (SEQ ID NO 4 и 8).PTO and CTO are blocked with a carbon spacer at their 3' ends to prevent their elongation. The CTO is labeled with a quencher molecule (BHQ-2) and a fluorescent reporter molecule (CAL Fluor Red 610) on its template region (
Готовили три реакционные пробирки, содержащие СТ, NG, смесь СТ и NG, и одну контрольную без мишени, соответственно.Prepared three reaction tubes containing CT, NG, a mixture of CT and NG, and one control without a target, respectively.
Последовательности располагающегося "вверх по течению" праймера, располагающегося "вниз по течению" праймера, РТО и СТО, использованных в этом примере, представляют собой:The sequences of the upstream primer, downstream primer, PTO and CTO used in this example are:
(I: дезоксиинозин).(I: deoxyinosine).
(Подчеркнутыми буквами отмечен 5'-концевой тегирующий участок РТО).(Underlined letters indicate the 5' PTO tag region).
ПЦР в режиме реального времени проводили в конечном объеме 20 мкл, содержащем нуклеиновую кислоту-мишень (10 пг геномной ДНК из NG, 10 пг геномной ДНК из СТ или смесь 10 пг геномной ДНК из NG и 10 пг геномной ДНК из СТ), 5 пмоль располагающегося "вверх по течению" праймера (SEQ ID NO 1) и 5 пмоль располагающегося "вниз по течению" праймера (SEQ ID NO 2) для амплификации мишени NG, 3 пмоль РТО (SEQ ID NO 3), 1 пмоль СТО (SEQ ID NO 4), 5 пмоль располагающегося "вверх по течению" праймера (SEQ ID NO 5) и 5 пмоль располагающегося "вниз по течению" праймера (SEQ ID NO 6) для амплификации мишени СТ, 3 пмоль РТО (SEQ ID NO 7), 1 пмоль СТО (SEQ ID NO 8) и 10 мкл смеси 2× Master Mix (в конечной концентрации 200 мкМ dNTP, 2 мМ MgCl2, 2 единицы Taq ДНК-полимеразы). Пробирки, содержащие реакционную смесь, помещали в термоциклер для проведения ПЦР в режиме реального времени (CFX96, Bio-Rad) в течение 5 мин при 50°С; реакционную смесь подвергали денатурации в течение 15 мин при 95°С и подвергали 50 циклам по 30 с при 95°С, 60 с при 60°С, 30 с при 72°С. Детекцию сигнала осуществляли при 60°С и 72°С каждого цикла.Real-time PCR was performed in a final volume of 20 µl containing the target nucleic acid (10 pg genomic DNA from NG, 10 pg genomic DNA from CT or a mixture of 10 pg genomic DNA from NG and 10 pg genomic DNA from CT), 5 pmol upstream primer (SEQ ID NO 1) and 5 pmol downstream primer (SEQ ID NO 2) for NG target amplification, 3 pmol PTO (SEQ ID NO 3), 1 pmol CTO (SEQ ID NO 4), 5 pmol upstream primer (SEQ ID NO 5) and 5 pmol downstream primer (SEQ ID NO 6) to amplify the CT target, 3 pmol PTO (SEQ ID NO 7), 1 pmol CTO (SEQ ID NO 8) and 10 µl of 2× Master Mix (final concentration of 200 µM dNTP, 2 mM MgCl 2 , 2 units of Taq DNA polymerase). The tubes containing the reaction mixture were placed in a real-time PCR thermal cycler (CFX96, Bio-Rad) for 5 min at 50°C; the reaction mixture was denatured for 15 min at 95°C and subjected to 50 cycles of 30 s at 95°C, 60 s at 60°C, 30 s at 72°C. Signal detection was carried out at 60°C and 72°C of each cycle.
Как показано на Фиг. 1А, сигналы детектировали при 72°С в присутствии СТ (пробирки 1 и 3). В случае присутствия исключительно NG сигнал детектировали при 60°С, но не при 72°С (пробирка 2). Никакого сигнала не детектировали в отсутствие нуклеиновых кислот-мишеней (пробирка 4). Результаты Фиг. 1А показывают, что при относительно высокой температуре детекции, 72°С, сигнал для СТ, имеющей относительно высокую температуру детекции, генерируется, а сигнал для NG, имеющей относительно низкую температуру детекции, не генерируется. Таким образом, должно быть очевидно, что детекция сигналов при относительно высокой температуре детекции допускала определение по меньшей мере присутствия СТ, имеющей относительно высокую температуру детекции. Кроме того, в случае пробирки 2, использование разницы, обусловленной отсутствием сигнала при относительно высокой температуре детекции и присутствием сигнала при относительно низкой температуре детекции, допускало определение присутствия NG, имеющей относительно низкую температуру детекции.As shown in FIG. 1A, signals were detected at 72° C. in the presence of CT (
Разницу между сигналами, детектируемыми как при относительно высокой температуре детекции, так и при относительно низкой температуре детекции, рассчитывали, используя различные подходы, чтобы исследовать, имеется ли возможность детекции присутствия NG, имеющей относительно низкую температуру детекции, даже в присутствии или в отсутствие сигнала от СТ, имеющей относительно высокую температуру детекции (Фиг. 1В-1Е).The difference between signals detected at both a relatively high detection temperature and a relatively low detection temperature was calculated using different approaches to investigate whether it is possible to detect the presence of NG having a relatively low detection temperature, even in the presence or absence of a signal from CT having a relatively high detection temperature (FIGS. 1B-1E).
На Фиг. 1В показано отношение значений RFU в конечных точках при 72°С и 60°С (все значения RFU получали и экспортировали из данных анализа "Аппроксимация кривой с вычитанием фона" в программном обеспечении прибора). Данное соотношение, в случае присутствия исключительно СТ (пробирка 1), составляло 1,2, однако оно же в присутствии и СТ, и NG (пробирка 3) составляло 2,1. Кроме того, это соотношение в случае присутствия исключительно NG (пробирка 2) и в отсутствие какой-либо нуклеиновой кислоты-мишени (пробирка 4) составляло 36,7 и 0,7, соответственно. Для определения присутствия или отсутствия NG использовали порог 1,5. На основании этого порога подтверждали присутствие NG в пробирках 2 и 3 и отсутствие NG в пробирках 1 и 4. Порог определяли с учетом соотношения в конечной точке для пробирки, содержащей только СТ. Что касается пробирки 2, в которой может быть установлено отсутствие СТ, имеющей относительно высокую температуру детекции, порог для сигнала при относительно низкой температуре детекции может быть установлен независимо, вместо применения значения 1,5.On FIG. 1B shows the ratio of RFU values at the endpoints at 72°C and 60°C (all RFU values were obtained and exported from the data of the Curve Fit with Background Subtraction analysis in the instrument software). This ratio, in the presence of only CT (tube 1), was 1.2, but in the presence of both CT and NG (tube 3) was 2.1. In addition, the ratio in the presence of only NG (tube 2) and in the absence of any target nucleic acid (tube 4) was 36.7 and 0.7, respectively. A threshold of 1.5 was used to determine the presence or absence of NG. Based on this threshold, the presence of NG in
Другой подход с использованием сигналов при 72°С и 60°С заключается в расчете соотношения сигналов флуоресценции при 72°С и 60°С в каждом из циклов и построения зависимости такого соотношения от числа циклов (все значения RFU, обработанные для построения такой зависимости, получали и экспортировали из данных анализа "Без вычитания фона" в программном обеспечении прибора). Для определения присутствия или отсутствия NG использовали порог 0,1. Порог определяли с учетом построенной зависимости для соотношений в случае пробирки, содержащей только СТ. Как показано на Фиг. 1С, присутствие NG выявляли в пробирках 2 и 3, и для NG значения Ct составляли 32,90 и 33,18, соответственно. Никакого значения Ct не получали в случае пробирок 1 и 4. Вместо расчета этих соотношений можно вычесть интенсивность флуоресценции при 60°С из значений интенсивности при 72°С в каждом из циклов и построить зависимость результатов от числа циклов для детекции мишеней.Another approach using signals at 72°C and 60°C is to calculate the ratio of fluorescence signals at 72°C and 60°C in each of the cycles and plot this ratio against the number of cycles (all RFU values processed to plot such a dependence, obtained and exported from the "No background subtraction" analysis data in the instrument software). A threshold of 0.1 was used to determine the presence or absence of NG. The threshold was determined taking into account the constructed dependence for the ratios in the case of a tube containing only ST. As shown in FIG. 1C, the presence of NG was detected in
Применение значений индивидуального порога для анализа сигналов, полученных при 60°С для каждой пробирки, представляет собой другой способ детекции присутствия NG, имеющей относительно низкую температуру детекции, посредством использования сигнала, указывающего на присутствие СТ при относительно высокой температуре детекции. В случае, если такой сигнал детектируется при 72°С, индивидуальный порог для сигнала в случае пробирок при 60°С рассчитывали, умножая каждое значение конечный-RFU при 72°С на значение порога (1,5). Порог (1,5) определяли с учетом соотношения в конечной точке для пробирки, содержащей только СТ (см. Фиг. 1В). В случае, если такой сигнал не детектируется при 72°С, выбирают индивидуальный порог для сигнала в случае пробирок при 60°С и используют с учетом фонового сигнала, чувствительности и вариации сигнала или диапазона ошибок устройства, в соответствии с общими установками порога. В этом примере "200" определяли в качестве индивидуального порога для сигнала при 60°С.Using individual threshold values to analyze signals obtained at 60° C. for each tube is another way to detect the presence of NG having a relatively low detection temperature by using a signal indicating the presence of CT at a relatively high detection temperature. In the event that such a signal is detected at 72°C, the individual signal threshold for the tubes at 60°C was calculated by multiplying each final-RFU value at 72°C by the threshold value (1.5). The threshold (1.5) was determined considering the ratio at the end point for the tube containing only CT (see Fig. 1B). In case no such signal is detected at 72°C, choose an individual signal threshold in the case of tubes at 60°C and use it taking into account the background signal, sensitivity and signal variation or device error range, in accordance with the general threshold settings. In this example, "200" was defined as the individual threshold for the signal at 60°C.
Как показано на Фиг. 1D и Фиг. 1Е, на основании значения индивидуального порога при 60°С подтверждали присутствие NG в пробирке 2 и пробирке 3 и, кроме того, получали для NG значения Ct, составляющие 31,32 и 35,83, соответственно. Никакого значения Ct для NG в пробирках 1 и 4 не получали.As shown in FIG. 1D and FIG. 1E, based on the individual threshold value at 60°C, the presence of NG in
Эти результаты указывают на то, что в способе с РТОСЕ в режиме реального времени, включающем детекцию сигналов при двух температурах, (1) детекция сигналов при относительно высокой температуре детекции допускает детектирование нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, и (2) сигналы, полученные при относительно высокой температуре детекции и при относительно низкой температуре детекции, можно использовать для детектирования нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции.These results indicate that in a real-time PTOCE method involving signal detection at two temperatures, (1) signal detection at a relatively high detection temperature allows detection of a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature, and (2) signals obtained at a relatively high detection temperature and at a relatively low detection temperature can be used to detect a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature.
Таким образом, две нуклеиновые кислоты-мишени можно детектировать в одном реакционном сосуде с использованием одного канала детекции и способа с РТОСЕ с применение ПЦР в режиме реального времени, включающего детекцию сигнала при разных температурах.Thus, two target nucleic acids can be detected in the same reaction vessel using a single detection channel and a PTOCE real-time PCR method involving signal detection at different temperatures.
Пример 2. Детекция двух мишеней с использованием способа с TaqMan/PTOCE с применением ПЦР в режиме реального времени, включающего детекцию сигнала при разных температурах Авторы изобретения исследовали, можно ли в одном реакционном сосуде детектировать две нуклеиновые кислоты-мишени с использованием одного канала детекции и способа с TaqMan/PTOCE с применением ПЦР в режиме реального времени, включающего детекцию сигнала при разных температурах.Example 2 Detection of Two Targets Using the TaqMan/PTOCE Method Using Real Time PCR Including Signal Detection at Different Temperatures with TaqMan/PTOCE using real-time PCR, including signal detection at different temperatures.
Для удлинения располагающихся "вверх по течению" праймеров и располагающихся "вниз по течению" праймеров, расщепления TaqMan-зонда, расщепления РТО и удлинения фрагмента РТО использовали Taq ДНК-полимеразу, обладающую 5'-нуклеазной активностью. В качестве нуклеотидных последовательностей-мишеней использовали геномную ДНК из Neisseria gonorrhoeae (NG) и геномную ДНК из Chlamydia trachomatis (СТ).Taq DNA polymerase with 5'-nuclease activity was used to extend the upstream and downstream primers, cleave the TaqMan probe, cleave the PTO, and extend the PTO fragment. Genomic DNA from Neisseria gonorrhoeae (NG) and genomic DNA from Chlamydia trachomatis (CT) were used as target nucleotide sequences.
Для детекции СТ использовали TaqMan-способ с применением ПЦР в режиме реального времени. Если СТ присутствует, то TaqMan-зонд расщепляется, и высвобождается меченый фрагмент. Можно получить кривую амплификации, измеряя сигнал от меченого фрагмента. Для детекции NG использовали способ с РТОСЕ с применением ПЦР в режиме реального времени.For the detection of CTs, the TaqMan method was used using real-time PCR. If CT is present, the TaqMan probe is cleaved and the labeled fragment is released. You can get the amplification curve by measuring the signal from the labeled fragment. For detection of NG, the PTOCE method using real-time PCR was used.
В этом примере "72°С" выбирали в качестве температуры детекции сигнала для СТ, а "60°С" выбирали в качестве температуры детекции сигнала для NG с учетом средств генерации сигнала. Удлиненный дуплекс, образованный в зависимости от присутствия NG, имеет регулируемое значение Тпл, скорректированное в соответствии с его последовательностью и длиной. В этом примере последовательность и длина удлиненного дуплекса предназначены для того, чтобы получить сигнал, который генерируется в результате образования дуплекса при 60°С, но не для получения сигнала при 72°С, поскольку происходит диссоциация и дуплекс не образуется. При температуре детекции 72°С будет генерироваться и детектироваться сигнал для СТ. При температуре детекции 60°С будет генерироваться и детектироваться сигнал для NG, а также сигнал для СТ.In this example, "72°C" was chosen as the signal detection temperature for CT, and "60°C" was chosen as the signal detection temperature for NG, taking into account the signal generation means. The elongated duplex formed depending on the presence of NG has an adjustable Tm value adjusted according to its sequence and length. In this example, the sequence and length of the extended duplex is designed to produce the signal that is generated by duplexing at 60°C, but not to produce the signal at 72°C, because dissociation occurs and no duplex is formed. At a detection temperature of 72°C, a signal for the CT will be generated and detected. At a detection temperature of 60°C, a signal for NG will be generated and detected, as well as a signal for CT.
TaqMan-зонд помечен флуоресцентной репортерной молекулой (CAL Fluor Red 610) на своем 5'-конце и молекулой-гасителем (BHQ-2) на своем 3'-конце (SEQ ID NO 9). РТО и СТО блокированы углеродным спейсером по своим 3'-концам, чтобы препятствовать их удлинению. СТО помечен молекулой-гасителем (BHQ-2) и флуоресцентной репортерной молекулой (CAL Fluor Red 610) на своем матричном участке (SEQ ID NO 4).The TaqMan probe is labeled with a fluorescent reporter molecule (CAL Fluor Red 610) at its 5' end and a quencher molecule (BHQ-2) at its 3' end (SEQ ID NO 9). PTO and CTO are blocked with a carbon spacer at their 3' ends to prevent their elongation. The CTO is labeled with a quencher molecule (BHQ-2) and a fluorescent reporter molecule (CAL Fluor Red 610) on its template region (SEQ ID NO 4).
Готовили три реакционные пробирки, содержащие СТ, NG, смесь СТ и NG, и одну контрольную без мишени, соответственно.Prepared three reaction tubes containing CT, NG, a mixture of CT and NG, and one control without a target, respectively.
Последовательности располагающегося "вверх по течению" праймера, располагающегося "вниз по течению" праймера, РТО, СТО и TaqMan-зонда, использованных в этом примере, представляют собой:The sequences of the upstream primer, downstream primer, PTO, CTO and TaqMan probe used in this example are:
(I: дезоксиинозин).(I: deoxyinosine).
(Подчеркнутыми буквами отмечен 5'-концевой тегирующий участок РТО).(Underlined letters indicate the 5' PTO tag region).
ПЦР в режиме реального времени проводили в конечном объеме 20 мкл, содержащем нуклеиновую кислоту-мишень (10 пг геномной ДНК из NG, 10 пг геномной ДНК из СТ или смесь 10 пг геномной ДНК из NG и 10 пг геномной ДНК из СТ), 10 пмоль располагающегося "вверх по течению" праймера (SEQ ID NO 1) и 10 пмоль располагающегося "вниз по течению" праймера (SEQ ID NO 2) для амплификации мишени NG, 5 пмоль РТО (SEQ ID NO 3), 1 пмоль СТО (SEQ ID NO 4), 10 пмоль располагающегося "вверх по течению" праймера (SEQ ID NO 5) и 12 пмоль располагающегося "вниз по течению" праймера (SEQ ID NO 6) для амплификации мишени СТ, 1 пмоль TaqMan-зонда (SEQ ID NO 9) и 10 мкл смеси 2х Master Mix (в конечной концентрации 200 мкМ dNTP, 2 мМ MgCI2, 2 ед. Taq ДНК-полимеразы). Пробирки, содержащие реакционную смесь, помещали в термоциклер для проведения ПЦР в режиме реального времени (CFX96, Bio-Rad) в течение 5 мин при 50°С; реакционную смесь подвергали денатурации в течение 15 мин при 95°С и подвергали 50 циклам по 30 с при 95°С, 60 с при 60°С, 30 с при 72°С. Детекцию сигнала осуществляли при 60°С и 72°С каждого цикла.Real-time PCR was performed in a final volume of 20 µl containing the target nucleic acid (10 pg genomic DNA from NG, 10 pg genomic DNA from CT or a mixture of 10 pg genomic DNA from NG and 10 pg genomic DNA from CT), 10 pmol upstream primer (SEQ ID NO 1) and 10 pmol downstream primer (SEQ ID NO 2) for NG target amplification, 5 pmol PTO (SEQ ID NO 3), 1 pmol CTO (SEQ ID NO 4), 10 pmol upstream primer (SEQ ID NO 5) and 12 pmol downstream primer (SEQ ID NO 6) to amplify the CT target, 1 pmol TaqMan probe (SEQ ID NO 9 ) and 10 µl of 2x Master Mix (final concentration of 200 µM dNTP, 2 mM MgCI2, 2 units of Taq DNA polymerase). The tubes containing the reaction mixture were placed in a real-time PCR thermal cycler (CFX96, Bio-Rad) for 5 min at 50°C; the reaction mixture was denatured for 15 min at 95°C and subjected to 50 cycles of 30 s at 95°C, 60 s at 60°C, 30 s at 72°C. Signal detection was carried out at 60°C and 72°C of each cycle.
Как показано на Фиг. 2А, сигналы детектировали при 72°С в присутствии СТ (пробирки 1 и 3). В случае присутствия исключительно NG сигнал детектировали при 60°С, но не при 72°С (пробирка 2). Никакого сигнала не детектировали в отсутствие нуклеиновых кислот-мишеней (пробирка 4). Результаты Фиг. 2А показывают, что при относительно высокой температуре детекции, 72°С, сигнал для СТ, имеющей относительно высокую температуру детекции, генерируется, а сигнал для NG, имеющей относительно низкую температуру детекции, не генерируется. Таким образом, должно быть очевидно, что детекция сигналов при относительно высокой температуре детекции, допускала определение по меньшей мере присутствия СТ, имеющей относительно высокую температуру детекции. Кроме того, в случае пробирки 2, использование разницы, обусловленной отсутствием сигнала при относительно высокой температуре детекции и присутствием сигнала при относительно низкой температуре детекции, допускало определение присутствия NG, имеющей относительно низкую температуру детекции.As shown in FIG. 2A, signals were detected at 72° C. in the presence of CT (
Разницу между сигналами, детектируемыми как при относительно высокой температуре детекции, так и при относительно низкой температуре детекции, рассчитывали, используя различные подходы, чтобы исследовать, имеется ли возможность детекции присутствия NG, имеющей относительно низкую температуру детекции, даже в присутствии или в отсутствие сигнала от СТ, имеющей относительно высокую температуру детекции (Фиг. 2В-2Е).The difference between signals detected at both a relatively high detection temperature and a relatively low detection temperature was calculated using different approaches to investigate whether it is possible to detect the presence of NG having a relatively low detection temperature, even in the presence or absence of a signal from CT having a relatively high detection temperature (FIGS. 2B-2E).
На Фиг. 2В показано соотношение значений RFU в конечных точках при 72°С и 60°С (все значения RFU получали и экспортировали из данных анализа "Аппроксимация кривой с вычитанием фона" в программном обеспечении прибора). Данное соотношение, в случае присутствия исключительно СТ (пробирка 1), составляло 1,1, однако оно же в присутствии и СТ, и NG (пробирка 3) составляло 1,8. Кроме того, это соотношение в случае присутствия исключительно NG (пробирка 2) и в отсутствие какой-либо нуклеиновой кислоты-мишени (пробирка 4) составляло 1278,0 и 1,0, соответственно. Для определения присутствия или отсутствия NG использовали порог 1,2. На основании этого порога подтверждали присутствие NG в пробирках 2 и 3 и отсутствие NG в пробирках 1 и 4. Порог определяли с учетом соотношения в конечной точке для пробирки, содержащей только СТ. Альтернативно, Что касается пробирки 2, в которой может быть установлено отсутствие СТ, имеющей относительно высокую температуру детекции, порог для сигнала при относительно низкой температуре детекции может быть установлен независимо, вместо применения значения 1,2.On FIG. 2B shows the ratio of RFU values at the endpoints at 72°C and 60°C (all RFU values were obtained and exported from Curve Fit with Background Subtraction analysis data in the instrument software). This ratio, in the presence of only CT (tube 1), was 1.1, but in the presence of both CT and NG (tube 3) was 1.8. In addition, the ratio in the presence of only NG (tube 2) and in the absence of any target nucleic acid (tube 4) was 1278.0 and 1.0, respectively. A threshold of 1.2 was used to determine the presence or absence of NG. Based on this threshold, the presence of NG in
Другой подход с использованием сигналов при 72°С и 60°С заключается в расчете соотношения сигналов флуоресценции при 72°С и 60°С в каждом из циклов и построения зависимости такого соотношения от числа циклов (все значения RFU, обработанные для построения какой зависимости, получали и экспортировали из данных анализа "Без вычитания фона" в программном обеспечении прибора). Для определения присутствия или отсутствия NG использовали порог 0,1. Порог определяли с учетом построенной зависимости для соотношений в случае пробирки, содержащей только СТ. Как показано на Фиг. 2С, присутствие NG выявляли в пробирках 2 и 3, и для NG значения Ct составляли 37,88 и 37,20, соответственно. Никакого значения Ct не получали в случае пробирок 1 и 4. Вместо расчета этих соотношений можно вычесть интенсивность флуоресценции при 60°С из значений интенсивности при 72°С в каждом из циклов и построить зависимость результатов от числа циклов для детекции мишеней.Another approach using signals at 72°C and 60°C is to calculate the ratio of fluorescence signals at 72°C and 60°C in each of the cycles and plot this ratio against the number of cycles (all RFU values processed to build which dependence, obtained and exported from the "No background subtraction" analysis data in the instrument software). A threshold of 0.1 was used to determine the presence or absence of NG. The threshold was determined taking into account the constructed dependence for the ratios in the case of a tube containing only ST. As shown in FIG. 2C, the presence of NG was detected in
Применение значений индивидуального порога для анализа сигналов, полученных при 60°С для каждой пробирки, представляет собой другой способ детекции присутствия NG, имеющей относительно низкую температуру детекции, посредством использования сигнала при относительно высокой температуре детекции. В случае, если такой сигнал, указывающий на присутствие СТ, детектируется при 72°С, индивидуальный порог для сигнала в случае пробирок при 60°С рассчитывали, умножая каждое значение конечного-RFU при 72°С на значение порога (1,2). Порог (1,2) определяли с учетом соотношения в конечной точке для пробирки, содержащей только СТ (см. Фиг. 2В). В случае, если такой сигнал не детектируется при 72°С, выбирают индивидуальный порог для сигнала в случае пробирок при 60°С и используют с учетом фонового сигнала, чувствительности и вариации сигнала или диапазона ошибок устройства, в соответствии с общими установками порога. В этом примере, "200" определяли в качестве индивидуального порога для сигнала при 60°С.The use of individual threshold values to analyze signals obtained at 60° C. for each tube is another way of detecting the presence of NG having a relatively low detection temperature by using a signal at a relatively high detection temperature. In the event that such a signal indicative of the presence of CT is detected at 72°C, an individual threshold for the signal in the case of tubes at 60°C was calculated by multiplying each end-RFU value at 72°C by the threshold value (1.2). The threshold (1,2) was determined considering the ratio at the end point for the tube containing only CT (see Fig. 2B). In case no such signal is detected at 72°C, choose an individual signal threshold in the case of tubes at 60°C and use it taking into account the background signal, sensitivity and signal variation or device error range, in accordance with the general threshold settings. In this example, "200" was defined as the individual threshold for the signal at 60°C.
Как показано на Фиг. 2D и Фиг. 2Е, на основании значения индивидуального порога при 60°С подтверждали присутствие NG в пробирке 2 и пробирке 3 и, кроме того, получали для NG значения Ct, составляющие 36,21 и 37,07, соответственно. Никакого значения Ct для NG в пробирках 1 и 4 не получали.As shown in FIG. 2D and FIG. 2E, based on the individual threshold value at 60°C, the presence of NG in
Эти результаты указывают на то, что в способе с TaqMan/PTOCE в режиме реального времени, включающем детекцию сигналов при двух температурах, (1) детекция сигналов при относительно высокой температуре детекции допускает детектирование нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, и (2) сигналы, полученные при относительно высокой температуре детекции и при относительно низкой температуре детекции, можно использовать для детектирования нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции.These results indicate that in a real-time TaqMan/PTOCE method involving signal detection at two temperatures, (1) signal detection at a relatively high detection temperature allows detection of a target nucleotide sequence having a relatively high detection temperature, and ( 2) signals obtained at a relatively high detection temperature and at a relatively low detection temperature can be used to detect a target nucleotide sequence having a relatively low detection temperature.
Таким образом, две нуклеиновые кислоты-мишени можно детектировать в одном реакционном сосуде с использованием одного канала детекции и способа с TaqMan/PTOCE с применение ПЦР в режиме реального времени, включающего детекцию сигнала при разных температурах.Thus, two target nucleic acids can be detected in the same reaction vessel using a single detection channel and the TaqMan/PTOCE method using real-time PCR, including signal detection at different temperatures.
Пример 3. Детекция двух мишеней с использованием ПЦР в режиме реального времени и анализа плавленияExample 3 Detection of two targets using real-time PCR and melting analysis
Авторы изобретения исследовали, можно ли в одном реакционном сосуде детектировать две нуклеиновые кислоты-мишени с использованием одного канала детекции и сочетания ПЦР в режиме реального времени и анализа плавления.The inventors investigated whether two target nucleic acids could be detected in a single reaction vessel using a single detection channel and a combination of real-time PCR and melt assay.
Для удлинения располагающихся "вверх по течению" праймеров и располагающихся "вниз по течению" праймеров, расщепления TaqMan-зонда, расщепления РТО и удлинения фрагмента РТО использовали Taq ДНК-полимеразу, обладающую 5'-нуклеазной активностью. В качестве нуклеотидных последовательностей-мишеней использовали геномную ДНК из Neisseria gonorrhoeae (NG) и геномную ДНК из Chlamydia trachomatis (СТ).Taq DNA polymerase with 5'-nuclease activity was used to extend the upstream and downstream primers, cleave the TaqMan probe, cleave the PTO, and extend the PTO fragment. Genomic DNA from Neisseria gonorrhoeae (NG) and genomic DNA from Chlamydia trachomatis (CT) were used as target nucleotide sequences.
Для детекции СТ использовали TaqMan-способ с применением ПЦР в режиме реального времени, а для детекции NG использовали анализ с РТОСЕ и плавлением. Если присутствует СТ, то TaqMan-зонд расщепляется, и высвобождается меченый фрагмент. Если присутствует NG, то РТО расщепляется, и образуется фрагмент РТО. Фрагмент РТО отжигается с захватывающим участком СТО, удлиняется на матричный участок СТО, и образуется удлиненный дуплекс с СТО (дуплексный СТО).TaqMan method using real-time PCR was used for CT detection, and PTOCE and melt assay was used for NG detection. If CT is present, the TaqMan probe is cleaved and the labeled fragment is released. If NG is present, then the PTO is cleaved and a PTO fragment is formed. The RTO fragment is annealed with a capturing CRT region, elongated to the CRT matrix region, and an elongated duplex with CRT (duplex CRT) is formed.
Чтобы выполнить детекцию только сигнала флуоресценции, генерируемого в результате расщепления TaqMan-зонда в процессе ПЦР в режиме реального времени, детекцию сигнала флуоресценции осуществляют при температуре, при которой удлиненный дуплекс диссоциирует, то есть не происходит образования дуплекса и не генерируется сигнал от удлиненного дуплекса, образованного посредством РТОСЕ. В процессе плавления измеряют сигнал, получая пик плавления, указывающий на присутствие удлиненного дуплекса, образованного в зависимости от присутствия NG.In order to detect only the fluorescence signal generated by cleavage of the TaqMan probe during real-time PCR, the detection of the fluorescence signal is carried out at a temperature at which the extended duplex dissociates, that is, no duplex is formed and no signal is generated from the extended duplex formed through RTOS. During the melting process, the signal is measured, obtaining a melting peak indicating the presence of an extended duplex formed depending on the presence of NG.
TaqMan-зонд помечен флуоресцентной репортерной молекулой (CAL Fluor Red 610) на своем 5'-конце и молекулой-гасителем (BHQ-2) на своем 3'-конце (SEQ ID NO 9). РТО и СТО блокированы углеродным спейсером по своим 3'-концам, чтобы препятствовать их удлинению. СТО помечен молекулой-гасителем (BHQ-2) и флуоресцентной репортерной молекулой (CAL Fluor Red 610) на своем матричном участке (SEQ ID NO 4).The TaqMan probe is labeled with a fluorescent reporter molecule (CAL Fluor Red 610) at its 5' end and a quencher molecule (BHQ-2) at its 3' end (SEQ ID NO 9). PTO and CTO are blocked with a carbon spacer at their 3' ends to prevent their elongation. CTO is labeled with a quencher molecule (BHQ-2) and a fluorescent reporter molecule (CAL Fluor Red 610) on its template region (SEQ ID NO 4).
Последовательности располагающегося "вверх по течению" праймера, располагающегося "вниз по течению" праймера, РТО, СТО и TaqMan-зонда, использованных в этом примере, представляют собой:The sequences of the upstream primer, downstream primer, PTO, CTO and TaqMan probe used in this example are:
(I: дезоксиинозин).(I: deoxyinosine).
(Подчеркнутыми буквами отмечен 5'-концевой тегирующий участок РТО).(Underlined letters indicate the 5' PTO tag region).
ПЦР в режиме реального времени проводили в конечном объеме 20 мкл, содержащем нуклеиновую кислоту-мишень (10 пг геномной ДНК из NG, 10 пг геномной ДНК из СТ или смесь 10 пг геномной ДНК из NG и 10 пг геномной ДНК из СТ), 10 пмоль располагающегося "вверх по течению" праймера (SEQ ID N0 1) и 10 пмоль располагающегося "вниз по течению" праймера (SEQ ID NO 2) для амплификации мишени NG, 5 пмоль РТО (SEQ ID NO 3), 1 пмоль СТО (SEQ ID N0 4), 10 пмоль располагающегося "вверх по течению" праймера (SEQ ID NO 5) и 12 пмоль располагающегося "вниз по течению" праймера (SEQ ID NO 6) для амплификации мишени СТ, 1 пмоль TaqMan-зонда (SEQ ID NO 9) и 10 мкл смеси 2× Master Mix (в конечной концентрации 200 мкМ dNTP, 2 мМ MgCl2, 2 ед. Taq ДНК- полимеразы). Пробирки, содержащие реакционную смесь, помещали в термоциклер для проведения ПЦР в режиме реального времени (CFX96, Bio-Rad) в течение 5 мин при 50°С; реакционную смесь подвергали денатурации в течение 15 мин при 95°С и подвергали 50 циклам по 30 с при 95°С, 60 с при 60°С, 30 с при 72°С. Детекцию сигнала осуществляли при 72°С каждого цикла. После реакции пробирку помещали на 5 мин при 55°С. Проводили анализ кривой плавления, измеряя сигнал флуоресценции в процессе повышения температуры от 55°С до 95°C с интервалом 0,5°С.Real-time PCR was performed in a final volume of 20 µl containing the target nucleic acid (10 pg genomic DNA from NG, 10 pg genomic DNA from CT or a mixture of 10 pg genomic DNA from NG and 10 pg genomic DNA from CT), 10 pmol upstream primer (SEQ ID NO 1) and 10 pmol downstream primer (SEQ ID NO 2) for NG target amplification, 5 pmol PTO (SEQ ID NO 3), 1 pmol CTO (SEQ ID N0 4), 10 pmol upstream primer (SEQ ID NO 5) and 12 pmol downstream primer (SEQ ID NO 6) to amplify the CT target, 1 pmol TaqMan probe (SEQ ID NO 9 ) and 10 μl of 2x Master Mix (final concentration of 200 μM dNTP, 2 mM MgCl 2 , 2 U Taq DNA polymerase). The tubes containing the reaction mixture were placed in a real-time PCR thermal cycler (CFX96, Bio-Rad) for 5 min at 50°C; the reaction mixture was denatured for 15 min at 95°C and subjected to 50 cycles of 30 s at 95°C, 60 s at 60°C, 30 s at 72°C. Signal detection was performed at 72° C. of each cycle. After the reaction, the tube was placed for 5 min at 55°C. Conducted the analysis of the melting curve, measuring the fluorescence signal in the process of increasing the temperature from 55°C to 95°C with an interval of 0.5°C.
Как показано на Фиг. 3, в присутствии СТ получали кривую амплификации при проведении ПЦР в режиме реального времени, но не наблюдали никакого пика плавления в анализе плавления (пробирка 1). В присутствии NG не получали кривой амплификации при проведении ПЦР в режиме реального времени, однако в анализе плавления наблюдали пик плавления с ожидаемым значением Тпл (66°С) для удлиненного дуплекса, образованного в зависимости от присутствия NG (пробирка 2). В присутствии СТ и NG наблюдали сигналы при проведении как способа ПЦР в режиме реального времени, так и способа с применением анализа плавления (пробирка 3). Никакого сигнала не детектировали в отсутствие нуклеиновых кислот-мишеней (пробирка 4).As shown in FIG. 3, in the presence of CT, an amplification curve was obtained by real-time PCR, but no melting peak was observed in the melting assay (tube 1). In the presence of NG, no real-time PCR amplification curve was obtained, but a melting peak was observed in the melting assay with the expected Tm (66° C.) for the extended duplex formed depending on the presence of NG (tube 2). In the presence of CT and NG, signals were observed using both the real-time PCR method and the melt assay method (tube 3). No signal was detected in the absence of target nucleic acids (tube 4).
Эти результаты указывают на то, что с использованием одного канала детекции можно детектировать несколько нуклеиновых кислот-мишеней, применяя сочетание ПЦР в режиме реального времени и анализа плавления.These results indicate that multiple target nucleic acids can be detected using a single detection channel using a combination of real-time PCR and melt assay.
Пример 4. SNP-генотипирование с применением способа ПЦР в режиме реального времени, включающего детекцию сигнала при разных температурахExample 4 SNP Genotyping Using Real Time PCR Method Including Signal Detection at Different Temperatures
Авторы изобретения исследовали, можно ли применять способ ПЦР в режиме реального времени, включающий детекцию сигналов при разных температурах, для SNP-генотипирования в одном реакционном сосуде с использованием одного канала детекции.The inventors investigated whether a real-time PCR method including signal detection at different temperatures could be used for SNP genotyping in a single reaction vessel using a single detection channel.
Для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера и располагающегося "вниз по течению" праймера, расщепления РТО и удлинения фрагмента РТО использовали Taq ДНК-полимеразу, обладающую 5'-нуклеазной активностью. В качестве нуклеотидных последовательностей-мишеней использовали гомозиготу дикого типа (С), гомозиготу мутантного типа (Т) и гетерозиготу, содержащие ДНК, кодирующую MTHFR (С677Т), из генома человека.Taq DNA polymerase having 5'-nuclease activity was used to extend the upstream primer and the downstream primer, cleave the PTO, and extend the PTO fragment. As target nucleotide sequences, a wild-type homozygote (C), a mutant-type homozygote (T), and a heterozygote containing DNA encoding MTHFR (C677T) from the human genome were used.
Способ с РТОСЕ с применением ПЦР в режиме реального времени использовали для детекции аллеля дикого типа (С) и аллеля мутантного типа (Т), содержащих ДНК, кодирующую MTHFR (С677Т), из генома человека. Если присутствует аллель-мишень, то РТО расщепляется и образуется фрагмент РТО. Фрагмент РТО отжигается с захватывающим участком СТО, удлиняется матричном участке СТО и образуется удлиненный дуплекс с СТО (дуплексный СТО). Образование удлиненного дуплекса обеспечивает получение сигнала, и можно получить кривую амплификации, измеряя сигнал при температуре образования удлиненного дуплекса.The PTOCE real-time PCR method was used to detect the wild-type (C) allele and the mutant-type (T) allele containing DNA encoding MTHFR (C677T) from the human genome. If the target allele is present, the PTO is cleaved and a PTO fragment is formed. The RTO fragment is annealed with the exciting SRT section, elongated in the SRT matrix section, and an elongated duplex with SRT (duplex SRT) is formed. The formation of an extended duplex provides a signal, and an amplification curve can be obtained by measuring the signal at the temperature of formation of an extended duplex.
В этом примере "72°С" выбирали в качестве температуры детекции сигнала для аллеля дикого типа (С), а "55°С" выбирали в качестве температуры детекции сигнала для аллеля мутантного типа (Т) с учетом средств генерации сигнала. Удлиненный дуплекс, образованный в зависимости от присутствия аллеля дикого типа (С) или аллеля мутантного типа (Т), имеет регулируемое значение Тпл, скорректированное в соответствии с его последовательностью и длиной. В этом примере последовательность и длина удлиненного дуплекса для аллеля дикого типа (С) предназначены для того, чтобы получить сигнал, который генерируется в результате образования дуплекса при 72°С. В то же время последовательность и длина удлиненного дуплекса для аллеля мутантного типа (Т) предназначены для того, чтобы получить сигнал, который генерируется в результате образования дуплекса при 55°С, но не для получения сигнала при 72°С, поскольку происходит диссоциация и дуплекс не образуется. При температуре детекции 72°С будет генерироваться и детектироваться сигнал для аллеля дикого типа (С). При температуре детекции 55°С будет генерироваться и детектироваться сигнал для аллеля мутантного типа (Т), а также сигнал для аллеля дикого типа (С).In this example, "72°C" was chosen as the signal detection temperature for the wild-type (C) allele, and "55°C" was chosen as the signal detection temperature for the mutant-type (T) allele, considering the means of generating the signal. The extended duplex, formed depending on the presence of the wild-type (C) or mutant-type (T) allele , has an adjustable Tm value adjusted according to its sequence and length. In this example, the sequence and length of the extended duplex for the wild-type (C) allele is designed to capture the signal that is generated by duplex formation at 72°C. At the same time, the sequence and length of the extended duplex for the mutant-type (T) allele is designed to obtain the signal that is generated as a result of duplex formation at 55°C, but not to obtain the signal at 72°C, since dissociation and duplex occur. is not formed. At a detection temperature of 72° C., a signal for the wild-type (C) allele will be generated and detected. At a detection temperature of 55° C., a signal for the mutant type allele (T) as well as a signal for the wild type allele (C) will be generated and detected.
РТО и СТО блокированы углеродным спейсером по своим 3'-концам, чтобы препятствовать их удлинению. СТО помечен молекулой-гасителем (BHQ-2) и флуоресцентной репортерной молекулой (CAL Fluor Red 610) на своем матричном участке (SEQ ID NO 13 и 15).PTO and CTO are blocked with a carbon spacer at their 3' ends to prevent their elongation. The CTO is labeled with a quencher molecule (BHQ-2) and a fluorescent reporter molecule (CAL Fluor Red 610) on its template region (SEQ ID NOS 13 and 15).
Последовательности располагающегося "вверх по течению" праймера, располагающегося "вниз по течению" праймера, РТО и СТО, использованных в этом примере, представляют собой:The sequences of the upstream primer, downstream primer, PTO and CTO used in this example are:
(I: дезоксиинозин).(I: deoxyinosine).
(Подчеркнутыми буквами отмечен 5'-концевой тегирующий участок РТО).(Underlined letters indicate the 5' PTO tag region).
ПЦР в режиме реального времени проводили в конечном объеме 20 мкл, содержащем нуклеиновую кислоту-мишень (1 нг ДНК, кодирующей MTHFR (С677Т), из генома человека, в случае гомозиготы дикого типа (С), 1 нг ДНК, кодирующей MTHFR (С677Т), из генома человека в случае мутантной (Т) гомозиготы или 1 нг ДНК, кодирующей MTHFR (С677Т), из генома человека в случае гетерозиготы), 5 пмоль располагающегося "вверх по течению" праймера (SEQ ID NO 10) и 5 пмоль располагающегося "вниз по течению" праймера (SEQ ID NO 11), по 3 пмоль каждого РТО (SEQ ID NO 12 и 14), по 1 пмоль каждого СТО (SEQ ID NO 13 и 15) и 10 мкл смеси 2× Master Mix (в конечной концентрации 200 мкМ dNTP, 2 мМ MgCI2, 2 ед. Taq ДНК-полимеразы). Пробирки, содержащие реакционную смесь, помещали в термоциклер для проведения ПЦР в режиме реального времени (CFX96, Bio-Rad) в течение 5 мин при 50°С; реакционную смесь подвергали денатурации в течение 15 мин при 95°С и подвергали 50 циклам по 30 с при 95°С, 60 с при 55°С, 30 с при 72°С. Детекцию сигнала осуществляли при 55°С и 72°С каждого цикла.Real-time PCR was performed in a final volume of 20 µl containing the target nucleic acid (1 ng of DNA encoding MTHFR (C677T) from the human genome, in the case of a homozygous wild-type (C), 1 ng of DNA encoding MTHFR (C677T) , from the human genome in the case of a mutant (T) homozygote, or 1 ng of DNA encoding MTHFR (C677T) from the human genome in the case of a heterozygote), 5 pmol of the upstream primer (SEQ ID NO 10) and 5 pmol of the located " downstream" primer (SEQ ID NO 11), 3 pmol of each PTO (
Как показано на Фиг. 4А, сигналы детектировали при 72°С и 55°С в присутствии гомозиготы дикого типа (С) (пробирка 1) или в присутствии гетерозиготы (пробирка 3). В присутствии мутантной (Т) гомозиготы интенсивный сигнал детектировали при 55°С, но очень слабый сигнал при 72°С (пробирка 2). Никакого сигнала не детектировали в отсутствие нуклеиновых кислот-мишеней (пробирка 4).As shown in FIG. 4A, signals were detected at 72°C and 55°C in the presence of a wild-type homozygote (C) (tube 1) or in the presence of a heterozygote (tube 3). In the presence of the mutant (T) homozygote, a strong signal was detected at 55°C, but a very weak signal at 72°C (tube 2). No signal was detected in the absence of target nucleic acids (tube 4).
На Фиг. 4В показано соотношение значений RFU в конечных точках при 72°С и 55°С (все значения RFU получали и экспортировали из данных анализа "Аппроксимация кривой с вычитанием фона" в программном обеспечении прибора). Соотношение в присутствии гомозиготы дикого типа (С) (пробирка 1) составляло 1,2, а соотношение в присутствии гетерозиготы (пробирка 3) составляло 1,9. Такая разница между этими двумя соотношениями указывает на то, что в пробирке, содержащей гетерозиготу, вместе с аллелем дикого типа (С) присутствует мутантный (Т) аллель. В то же время, соотношение, полученное в случае мутантной (Т) гомозиготы, имело относительно очень высокое значение, поскольку значение RFU при 72°С было низким (пробирка 2). Учитывая тот факт, что аллель дикого типа и мутантный аллель присутствуют в гетерозиготе в соотношении 1:1, слабый сигнал, детектируемый при 72°С в присутствии гомозиготы мутантного типа, может быть оценен как ложноположительный сигнал. Согласно способу по настоящему изобретению для SNP-генотипирования, значение соотношения служит для определения того, является ли сигнал при относительно высокой температуре детекции ложным сигналом или нет.On FIG. 4B shows the ratio of RFU values at the endpoints at 72° C. and 55° C. (all RFU values were obtained and exported from Curve Fit with Background Subtraction analysis data in the instrument software). The ratio in the presence of the homozygous wild type (C) (tube 1) was 1.2 and the ratio in the presence of the heterozygote (tube 3) was 1.9. Such a difference between these two ratios indicates that a mutant (T) allele is present along with the wild-type (C) allele in the test tube containing the heterozygote. At the same time, the ratio obtained in the case of the mutant (T) homozygous was relatively very high, since the RFU value at 72°C was low (tube 2). Given the fact that the wild-type allele and the mutant allele are present in the heterozygote in a ratio of 1:1, a weak signal detected at 72°C in the presence of a mutant-type homozygote can be assessed as a false positive signal. According to the method of the present invention for SNP genotyping, the ratio value serves to determine whether a signal at a relatively high detection temperature is a false signal or not.
Эти результаты указывают на то, что способ с применением ПЦР в режиме реального времени, включающий детекцию сигналов при разных температурах, можно применять для SNP-генотипирования с использованием одного канала детекции, и что разницу в сигналах, полученных при относительно высокой температуре детекции и при относительно низкой температуре детекции, можно использовать для SNP-генотипирования.These results indicate that a real-time PCR method involving signal detection at different temperatures can be applied to SNP genotyping using a single detection channel, and that the difference in signals obtained at a relatively high detection temperature and at a relatively low temperature detection, can be used for SNP genotyping.
Пример 5. Детекция нескольких мишеней с использованием способа с TaqMan/PTOCE с применением ПЦР в режиме реального времени, включающего детекцию сигнала при разных температурахExample 5 Multiple Target Detection Using the TaqMan/PTOCE Method Using Real Time PCR Including Signal Detection at Different Temperatures
Авторы изобретения исследовали, можно ли в одном реакционном сосуде детектировать три нуклеиновых кислоты-мишени с использованием одного канала детекции и способа с TaqMan/PTOCE с применением ПЦР в режиме реального времени, включающего детекцию сигнала при разных температурах.The inventors investigated whether three target nucleic acids could be detected in a single reaction vessel using a single detection channel and a TaqMan/PTOCE real-time PCR method involving signal detection at different temperatures.
Для удлинения располагающихся "вверх по течению" праймеров и располагающихся "вниз по течению" праймеров, расщепления TaqMan-зонда, расщепления РТО и удлинения фрагмента РТО использовали Taq ДНК-полимеразу, обладающую 6'-нуклеазной активностью. В качестве нуклеотидных последовательностей-мишеней использовали геномную ДНК из Neisseria gonorrhoeae (NG), геномную ДНК из Chlamydia trachomatis (СТ) и геномную ДНК из Mycoplasma genitalium (MG).Taq DNA polymerase with 6'-nuclease activity was used to extend the upstream and downstream primers, cleave the TaqMan probe, cleave the PTO, and extend the PTO fragment. Genomic DNA from Neisseria gonorrhoeae (NG), genomic DNA from Chlamydia trachomatis (CT), and genomic DNA from Mycoplasma genitalium (MG) were used as target nucleotide sequences.
Для детекции MG использовали TaqMan-способ с применением ПЦР в режиме реального времени. Для детекции СТ и NG использовали способ с РТОСЕ с применением ПЦР в режиме реального времени.For detection of MG, the TaqMan method was used using real-time PCR. For the detection of CT and NG, the PTOCE method was used using real-time PCR.
В этом примере "95°С" выбирали в качестве температуры детекции сигнала для MG, "72°С" выбирали в качестве температуры детекции сигнала для СТ, а "60°С" выбирали в качестве температуры детекции сигнала для NG с учетом средств генерации сигнала. В этом примере последовательность и длина удлиненного дуплекса СТ или NG предназначены для того, чтобы получить сигнал, который генерируется в результате образования дуплекса при 72°С или 60°С, соответственно, но не для получения сигнала при 95°С, поскольку происходит диссоциация и дуплекс не образуется. При температуре детекции 95°С будет генерироваться и детектироваться сигнал для MG. При температуре детекции 72°С будет генерироваться и детектироваться сигнал для СТ, а также сигнал для MG. Кроме того, при температуре детекции 60°С будет генерироваться и детектироваться сигнал для NG, а также сигнал для MG и СТ.In this example, "95°C" was chosen as the signal detection temperature for MG, "72°C" was chosen as the signal detection temperature for CT, and "60°C" was chosen as the signal detection temperature for NG considering the signal generation means . In this example, the sequence and length of the extended CT or NG duplex are intended to produce the signal that is generated by duplex formation at 72°C or 60°C, respectively, but not to produce the signal at 95°C, since dissociation and duplex is not formed. At a detection temperature of 95°C, a signal for MG will be generated and detected. At a detection temperature of 72°C, a signal for the CT will be generated and detected, as well as a signal for the MG. In addition, at a detection temperature of 60°C, a signal for NG will be generated and detected, as well as a signal for MG and CT.
TaqMan-зонд помечен флуоресцентной репортерной молекулой (CAL Fluor Red 610) на своем 5'-конце и молекулой-гасителем (BHQ-2) на своем 3'-конце (SEQ ID NO 18). РТО и СТО блокированы углеродным спейсером по своим 3'-концам, чтобы препятствовать их удлинению. СТО помечен молекулой-гасителем (BHQ-2) и флуоресцентной репортерной молекулой (CAL Fluor Red 610) на своем матричном участке (SEQ ID NO 4 и 8).The TaqMan probe is labeled with a fluorescent reporter molecule (CAL Fluor Red 610) at its 5' end and a quencher molecule (BHQ-2) at its 3' end (SEQ ID NO 18). PTO and CTO are blocked with a carbon spacer at their 3' ends to prevent their elongation. The CTO is labeled with a quencher molecule (BHQ-2) and a fluorescent reporter molecule (CAL Fluor Red 610) on its template region (
Готовили семь реакционных пробирок, содержащих NG, СТ, MG; смесь NG и СТ, смесь NG и MG, смесь СТ и MG; смесь NG, СТ и MG; и одну контрольную без мишени, соответственно.Prepared seven reaction tubes containing NG, CT, MG; mixture of NG and CT, mixture of NG and MG, mixture of CT and MG; mixture of NG, CT and MG; and one control without a target, respectively.
Последовательности располагающегося "вверх по течению" праймера, располагающегося "вниз по течению" праймера, РТО, СТО и TaqMan-зонда, использованных в этом примере, представляют собой:The sequences of the upstream primer, downstream primer, PTO, CTO and TaqMan probe used in this example are:
(I: дезоксиинозин).(I: deoxyinosine).
(Подчеркнутыми буквами отмечен 5'-концевой тегирующий участок РТО).(Underlined letters indicate the 5' PTO tag region).
ПЦР в режиме реального времени проводили в конечном объеме 20 мкл, содержащем нуклеиновую кислоту-мишень (10 пг геномной ДНК из NG, 10 пг геномной ДНК из СТ, 10 пг геномной ДНК из MG, смесь геномной ДНК из NG и СТ, по 10 пг каждой, смесь геномной ДНК из NG и MG, по 10 пг каждой, смесь геномной ДНК из СТ и MG, по 10 пг каждой, смесь геномной ДНК из NG, СТ и MG, по 10 пг каждой), 5 пмоль располагающегося "вверх по течению" праймера (SEQ ID NO 1) и 5 пмоль располагающегося "вниз по течению" праймера (SEQ ID NO 2) для амплификации мишени NG, 3 пмоль РТО (SEQ ID NO 3), 1 пмоль СТО (SEQ ID NO 4), 5 пмоль располагающегося "вверх по течению" праймера (SEQ ID NO 5) и 5 пмоль располагающегося "вниз по течению" праймера (SEQ ID NO 6) для амплификации мишени СТ, 3 пмоль РТО (SEQ ID NO 7), 1 пмоль СТО (SEQ ID NO 8), 5 пмоль располагающегося "вверх по течению" праймера (SEQ ID NO 16) и 5 пмоль располагающегося "вниз по течению" праймера (SEQ ID NO 17) для амплификации мишени MG, 1 пмоль TaqMan-зонда (SEQ ID NO 18) и 10 мкл смеси 2× Master Mix (в конечной концентрации 200 мкМ dNTP, 2 мМ MgCl2, 2 ед. Taq ДНК-полимеразы). Пробирки, содержащие реакционную смесь, помещали в термоциклер для проведения ПЦР в режиме реального времени (CFX96, Bio-Rad) в течение 5 мин при 50°С; реакционную смесь подвергали денатурации в течение 15 мин при 95°С и подвергали 50 циклам по 30 с при 95°С, 60 с при 60°С, 30 с при 72°С. Детекцию сигнала осуществляли при 60°С, 72°С и 95°С каждого цикла.Real-time PCR was performed in a final volume of 20 µl containing the target nucleic acid (10 pg of genomic DNA from NG, 10 pg of genomic DNA from CT, 10 pg of genomic DNA from MG, a mixture of genomic DNA from NG and CT, 10 pg each each, a mixture of genomic DNA from NG and MG, 10 pg each, a mixture of genomic DNA from CT and MG, 10 pg each, a mixture of genomic DNA from NG, CT and MG, 10 pg each), 5 pmol located "upstream primer (SEQ ID NO 1) and 5 pmol downstream primer (SEQ ID NO 2) for NG target amplification, 3 pmol PTO (SEQ ID NO 3), 1 pmol CTO (SEQ ID NO 4), 5 pmol upstream primer (SEQ ID NO 5) and 5 pmol downstream primer (SEQ ID NO 6) to amplify the CT target, 3 pmol PTO (SEQ ID NO 7), 1 pmol CTO ( SEQ ID NO 8), 5 pmol upstream primer (SEQ ID NO 16) and 5 pmol downstream primer (SEQ ID NO 17) for MG target amplification, 1 pmol TaqMan probe (SEQ ID NO 18) and 10 µl of 2× Master Mix (final concentration of 200 µM dNTP, 2 mM MgCl 2 , 2 u. Taq DNA polymerase). The tubes containing the reaction mixture were placed in a real-time PCR thermal cycler (CFX96, Bio-Rad) for 5 min at 50°C; the reaction mixture was denatured for 15 min at 95°C and subjected to 50 cycles of 30 s at 95°C, 60 s at 60°C, 30 s at 72°C. Signal detection was performed at 60°C, 72°C and 95°C of each cycle.
Как показано на Фиг. 5А, 5В и 5С, сигналы, детектируемые при 95°С, давали авторам изобретения возможность определения по меньшей мере присутствия MG, имеющей самую относительно высокую температуру детекции (95°С), в пробирках 3, 5, 6 и 7.As shown in FIG. 5A, 5B and 5C, signals detected at 95°C enabled the inventors to determine at least the presence of MG having the highest relatively high detection temperature (95°C) in
Использование разницы, обусловленной отсутствием сигнала при самой относительно высокой температуре детекции (95°С) и присутствием сигнала при относительно средней температуре детекции (72°С), давало авторам изобретения возможность определения присутствия СТ, имеющей относительно среднюю температуру детекции (72°С), в пробирках 2 и 4.Using the difference due to the absence of a signal at the relatively highest detection temperature (95°C) and the presence of a signal at a relatively average detection temperature (72°C), enabled the inventors to determine the presence of a CT having a relatively average detection temperature (72°C), in
Кроме того, использование разницы, обусловленной отсутствием сигнала при относительно средней температуре детекции (72°С) и присутствием сигнала при самой относительно низкой температуре детекции (60°С), давало авторам изобретения возможность определения присутствия NG, имеющей самую относительно низкую температуру детекции (60°С), в пробирке 1.In addition, the use of the difference due to the absence of a signal at a relatively average detection temperature (72°C) and the presence of a signal at the relatively lowest detection temperature (60°C) allowed the inventors to determine the presence of NG having the relatively lowest detection temperature (60 °C), in
Разницу между сигналами, детектируемыми при 95°С, 72°С и 60°С, рассчитывали путем вычитания конечного-RFU (конечный-ΔRFU), чтобы исследовать, можно ли идентифицировать совместное присутствие СТ или NG с другими мишенями в одном реакционном сосуде.The difference between the signals detected at 95°C, 72°C and 60°C was calculated by subtracting the final-RFU (final-ΔRFU) to investigate whether the co-presence of CT or NG with other targets in the same reaction vessel can be identified.
На Фиг. 5D показаны значения конечного-ΔRFU, рассчитанные с использованием значений RFU в конечных точках при 95°С и 72°С (все значения RFU получали и экспортировали из данных анализа "Аппроксимация кривой с вычитанием фона" в программном обеспечении прибора). Для определения присутствия СТ использовали порог "300". Порог определяли с учетом конечного-ΔRFU в случае пробирок, не содержащих СТ (пробирки 1, 3 и 5). На основании этого порога подтверждали присутствие СТ в пробирках 2, 4, 6 и 7.On FIG. 5D shows end-ΔRFU values calculated using endpoint RFU values at 95° C. and 72° C. (all RFU values were generated and exported from Background Subtract Curve Fit analysis data in the instrument software). A threshold of "300" was used to determine the presence of STs. The threshold was determined taking into account the final-ΔRFU in the case of tubes not containing CT (
На Фиг. 5Е показаны значения конечного-ΔRFU, рассчитанные с использованием значений RFU в конечных точках при 72°С и 60°С (все значения RFU получали и экспортировали из данных анализа "Аппроксимация кривой с вычитанием фона" в программном обеспечении прибора). Для определения присутствия NG использовали порог "800". Порог определяли с учетом конечного-ΔRFU в случае пробирок, не содержащих NG (пробирки 2, 3 и 6). На основании этого порога подтверждали присутствие NG в пробирках 1, 4, 5 и 7.On FIG. 5E shows endpoint-ΔRFU values calculated using endpoint RFU values at 72°C and 60°C (all RFU values were generated and exported from Background Subtracted Curve Fit analysis data in the instrument software). A threshold of "800" was used to determine the presence of NG. The threshold was determined taking into account the final-ΔRFU in the case of tubes not containing NG (
Эти результаты указывают на то, что в способе с TaqMan/PTOCE в режиме реального времени, включающем детекцию сигналов при трех температурах, (1) детекция сигналов при самой относительно высокой температуре детекции допускает детекцию нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей самую относительно высокую температуру детекции, и (2) разницу, полученную от сигналов при разных температурах детекции, можно использовать для идентификации нуклеотидных последовательностей-мишеней, имеющих температуры детекции ниже самой высокой температуры детекции.These results indicate that in the real-time TaqMan/PTOCE method involving signal detection at three temperatures, (1) signal detection at the relatively highest detection temperature allows detection of the target nucleotide sequence having the relatively high detection temperature, and (2) the difference obtained from signals at different detection temperatures can be used to identify target nucleotide sequences having detection temperatures below the highest detection temperature.
Таким образом, в одном реакционном сосуде можно детектировать несколько нуклеиновых кислот-мишеней с использованием одного канала детекции и способа с TaqMan/PTOCE с применением ПЦР в режиме реального времени, включающего детекцию сигнала при разных температурах.Thus, multiple target nucleic acids can be detected in a single reaction vessel using a single detection channel and a TaqMan/PTOCE real-time PCR method involving signal detection at different temperatures.
Основываясь на описании предпочтительного воплощения настоящего изобретения, следует понимать, что его варианты и модификации, соответствующие сущности изобретения, могут стать очевидными специалистам в данной области техники, и объем данного изобретения следует определять прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.Based on the description of the preferred embodiment of the present invention, it should be understood that its variants and modifications corresponding to the essence of the invention may become apparent to experts in the art, and the scope of this invention should be defined by the attached claims and their equivalents.
--->--->
Перечень последовательностейSequence listing
<110> SEEGENE, INC.<110> SEEGENE, INC.
<120> DETECTION OF TARGET NUCLEIC ACID SEQUENCES USING DIFFERENT<120> DETECTION OF TARGET NUCLEIC ACID SEQUENCES USING DIFFERENT
DETECTION TEMPERATURES DETECTION TEMPERATURES
<130> PP140137<130> PP140137
<150> KR PCT/KR2014/006714<150> KR PCT/KR2014/006714
<151> 2014-07-23<151> 2014-07-23
<150> KR 10-2014-0037310<150> KR 10-2014-0037310
<151> 2014-03-28<151> 2014-03-28
<150> US 61/979,545<150> US 61/979,545
<151> 2014-04-15<151> 2014-04-15
<150> KR PCT/KR2014/004173<150> KR PCT/KR2014/004173
<151> 2014-05-09<151> 2014-05-09
<160> 18<160> 18
<170> KopatentIn 2.0<170> KopatentIn 2.0
<210> 1<210> 1
<211> 37<211> 37
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> NG-F<223> NG-F
<220><220>
<221> misc_feature<221> misc_feature
<222> (22)..(26)<222> (22)..(26)
<223> n denotes deoxyinosine<223> n denotes deoxyinosine
<400> 1<400> 1
tacgcctgct actttcacgc tnnnnngtaa tcagatg 37tacgcctgct actttcacgc tnnnnngtaa tcagatg 37
<210> 2<210> 2
<211> 37<211> 37
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> NG-R<223> NG-R
<220><220>
<221> misc_feature<221> misc_feature
<222> (22)..(26)<222> (22)..(26)
<223> n denotes deoxyinosine<223> n denotes deoxyinosine
<400> 2<400> 2
caatggatcg gtatcactcg cnnnnncgag caagaac 37caatggatcg gtatcactcg cnnnnncgag caagaac 37
<210> 3<210> 3
<211> 34<211> 34
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> NG-PTO<223> NG-PTO
<400> 3<400> 3
gtacgcgata cgggcccctc attggcgtgt ttcg 34gtacgcgata cgggcccctc attggcgtgt ttcg 34
<210> 4<210> 4
<211> 39<211> 39
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> NG-CTO<223> NG-CTO
<400> 4<400> 4
tttttttttt tttttttttg tactgcccgt atcgcgtac 39tttttttttt ttttttttttg tactgcccgt atcgcgtac 39
<210> 5<210> 5
<211> 40<211> 40
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> CT-F<223> CT-F
<220><220>
<221> misc_feature<221> misc_feature
<222> (26)..(30)<222> (26)..(30)
<223> n denotes deoxyinosine<223> n denotes deoxyinosine
<400> 5<400> 5
gagttttaaa atgggaaatt ctggtnnnnn tttgtataac 40gagttttaaa atgggaaatt ctggtnnnnn tttgtataac 40
<210> 6<210> 6
<211> 40<211> 40
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> CT-R<223> CT-R
<220><220>
<221> misc_feature<221> misc_feature
<222> (26)..(30)<222> (26)..(30)
<223> n denotes deoxyinosine<223> n denotes deoxyinosine
<400> 6<400> 6
ccaattgtaa tagaagcatt ggttgnnnnn ttattggaga 40ccaattgtaa tagaagcatt ggttgnnnnn ttattggaga 40
<210> 7<210> 7
<211> 39<211> 39
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> CT-PTO<223> CT-PTO
<400> 7<400> 7
gattacgcga ccgcatcaga agctgtcatt ttggctgcg 39gattacgcga ccgcatcaga agctgtcatt ttggctgcg 39
<210> 8<210> 8
<211> 39<211> 39
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> CT-CTO<223> CT-CTO
<400> 8<400> 8
gcgctggata ccctggacga tatgtgcggt cgcgtaatc 39gcgctggata ccctggacga tatgtgcggt cgcgtaatc 39
<210> 9<210> 9
<211> 26<211> 26
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> CT-P<223> CT-P
<400> 9<400> 9
catcagaagc tgtcattttg gctgcg 26catcagaagc tgtcattttg gctgcg 26
<210> 10<210> 10
<211> 32<211> 32
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> M677-F<223> M677-F
<220><220>
<221> misc_feature<221> misc_feature
<222> (18)..(22)<222> (18)..(22)
<223> n denotes deoxyinosine<223> n denotes deoxyinosine
<400> 10<400> 10
ccaccccgaa gcagggannn nngaggctga cc 32ccaccccgaa gcagggannn nngaggctga cc 32
<210> 11<210> 11
<211> 34<211> 34
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> M677-R<223> M677-R
<220><220>
<221> misc_feature<221> misc_feature
<222> (20)..(24)<222> (20)..(24)
<223> n denotes deoxyinosine<223> n denotes deoxyinosine
<400> 11<400> 11
caagtgatgc ccatgtcggn nnnngccttc acaa 34caagtgatgc ccatgtcggn nnnngccttc acaa 34
<210> 12<210> 12
<211> 37<211> 37
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> M677-W-PTO<223> M677-W-PTO
<400> 12<400> 12
ggtcccgacg ttagctcccg cagacacctt ctccttc 37ggtcccgacg ttagctcccg cagacacctt ctccttc 37
<210> 13<210> 13
<211> 39<211> 39
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> M677-W-CTO<223> M677-W-CTO
<400> 13<400> 13
cctcggtgcc acgccatcgg ttcttctaac gtcgggacc 39cctcggtgcc acgccatcgg ttcttctaac gtcgggacc 39
<210> 14<210> 14
<211> 38<211> 38
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> M677-M-PTO<223> M677-M-PTO
<400> 14<400> 14
acgtcgattc gcactcccgc agacaccttc tccttcaa 38acgtcgattc gcactcccgc agacaccttc tccttcaa 38
<210> 15<210> 15
<211> 38<211> 38
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> M677-M-CTO<223> M677-M-CTO
<400> 15<400> 15
tttttttttt tttttttttt tattctgcga atcgacgt 38tttttttttt tttttttttt tattctgcga atcgacgt 38
<210> 16<210> 16
<211> 38<211> 38
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> MG-F<223> MG-F
<220><220>
<221> misc_feature<221> misc_feature
<222> (23)..(27)<222> (23)..(27)
<223> n denotes deoxyinosine<223> n denotes deoxyinosine
<400> 16<400> 16
aaaacccacg gaaatgatga gannnnnatt ggttctac 38aaaacccacg gaaatgatga gannnnnatt ggttctac 38
<210> 17<210> 17
<211> 41<211> 41
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> MG-R<223> MG-R
<220><220>
<221> misc_feature<221> misc_feature
<222> (27)..(30)<222> (27)..(30)
<223> n denotes deoxyinosine<223> n denotes deoxyinosine
<400> 17<400> 17
ctcgttaatt tacctattcc attttgnnnn nctgataaaa g 41ctcgttaatt tacctattcc attttgnnnn nctgataaaa g 41
<210> 18<210> 18
<211> 28<211> 28
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> MG-P<223> MG-P
<400> 18<400> 18
gagttctttc aagaacagca agaggtgt 28gagttctttc aagaacagca agaggtgt 28
<---<---
Claims (25)
Applications Claiming Priority (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20140037310 | 2014-03-28 | ||
| KR10-2014-0037310 | 2014-03-28 | ||
| US201461979545P | 2014-04-15 | 2014-04-15 | |
| US61/979,545 | 2014-04-15 | ||
| KRPCT/KR2014/004173 | 2014-05-09 | ||
| PCT/KR2014/004173 WO2015147370A1 (en) | 2014-03-28 | 2014-05-09 | Detection of target nucleic acid sequences using different detection temperatures |
| KRPCT/KR2014/006714 | 2014-07-23 | ||
| PCT/KR2014/006714 WO2015147382A1 (en) | 2014-03-28 | 2014-07-23 | Detection of target nucleic acid sequences using different detection temperatures |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016139287A Division RU2678403C2 (en) | 2014-03-28 | 2014-12-09 | Detection of target nucleic acid sequences using different detection temperatures |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2019100495A RU2019100495A (en) | 2019-01-31 |
| RU2019100495A3 RU2019100495A3 (en) | 2022-02-21 |
| RU2780587C2 true RU2780587C2 (en) | 2022-09-28 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2351999C2 (en) * | 2004-04-17 | 2009-04-10 | Самсунг Электроникс Ко., Лтд. | Information record medium, device for recording and/or reproduction of data in and/or from information record medium, method for recording and/or reproduction of data in and/or from information record medium and machine-readable record medium, where program is stored for method realisation |
| RU2417412C2 (en) * | 2006-03-14 | 2011-04-27 | Интел Корпорейшн | Standard analogue interface for multi-core processors |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2351999C2 (en) * | 2004-04-17 | 2009-04-10 | Самсунг Электроникс Ко., Лтд. | Information record medium, device for recording and/or reproduction of data in and/or from information record medium, method for recording and/or reproduction of data in and/or from information record medium and machine-readable record medium, where program is stored for method realisation |
| RU2417412C2 (en) * | 2006-03-14 | 2011-04-27 | Интел Корпорейшн | Standard analogue interface for multi-core processors |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2678403C2 (en) | Detection of target nucleic acid sequences using different detection temperatures | |
| KR102016747B1 (en) | Detection of target nucleic acid sequences using different detection temperatures and reference values | |
| US11859243B2 (en) | Differentiation of signals for target nucleic acid sequences | |
| RU2780587C2 (en) | Detection of nucleotide target sequences using different detection temperatures |