RU2779165C2

RU2779165C2 - A new fab fragment of an antibody against human ceacam5

Info

Publication number: RU2779165C2
Application number: RU2020105654A
Authority: RU
Inventors: Хитоси ДОИХАРА; Кадзунори ХИРАЯМА; Хироки СИРАИ
Original assignee: Астеллас Фарма Инк.
Priority date: 2017-07-07
Filing date: 2018-07-06
Publication date: 2022-09-05

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to the field of biotechnology. A Fab fragment of an antibody against human CEACAM5 has been proposed. A conjugate including the specified Fab fragment, a composition and a method for diagnosing cancer using a conjugate are also proposed, in particular, for the diagnosis of colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, thyroid cancer or cancer resulting from metastasis of these malignant neoplasms. In addition, polynucleotides, expression vectors and host cells have been proposed to produce Fab fragments and conjugates according to the invention.

EFFECT: invention provides binding of the Fab fragment to the detectable substance in the absence of weakening of the binding activity against human CEACAM5, as well as accumulation of a conjugate including the Fab fragment in the tumor lesion site for a short time after administration.

36 cl, 4 dwg, 1 tbl, 6 ex

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИFIELD OF TECHNOLOGY

[0001] Настоящее изобретение относится к новому Fab-фрагменту антитела против CEACAM5 человека. Настоящее изобретение также относится к композиции для диагностики, содержащей Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, и к способу диагностики злокачественного новообразования с использованием Fab-фрагмента.[0001] The present invention relates to a novel Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody. The present invention also relates to a diagnostic composition comprising a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody and a method for diagnosing cancer using the Fab fragment.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE INVENTION

[0002] CEA (карциноэмбриональный антиген) или CEACAM (карциноэмбриональная антиген-связанная молекула клеточной адгезии) представляет собой опухолевый маркер, открытый в 1965 г. (J. Exp. Med.; 1965; 121: 439-462; и PNAS; 1969; 64: 161-167), и до настоящего времени было обнаружено 23 СЕА-связанных молекул (BioMed Central Biology; 2010; 8: 12-33). Среди них CEACAM5 редко экспрессируется в нормальных тканях, но экспрессируется в желудочно-кишечном тракте плода или колоректальном раке (BBA; 1990; 1032: 177-189; и Mol. Pathol.; 1999; 52: 174-178). Известно, что CEACAM5 также экспрессируется при раке молочной железы, раке легких и раке щитовидной железы (Diagn. Cytopathol.; 1993; 9: 377-382; Cancer Res.; 1990; 50: 6987-6994; Histopathology; 2000; 37: 530-535).[0002] CEA (carcinoembryonic antigen) or CEACAM (carcinoembryonic antigen-associated cell adhesion molecule) is a tumor marker discovered in 1965 (J. Exp. Med.; 1965; 121: 439-462; and PNAS; 1969; 64: 161-167), and 23 CEA-related molecules have been found to date (BioMed Central Biology; 2010; 8: 12-33). Among them, CEACAM5 is rarely expressed in normal tissues, but is expressed in fetal gastrointestinal tract or colorectal cancer (BBA; 1990; 1032: 177-189; and Mol. Pathol.; 1999; 52: 174-178). It is known that CEACAM5 is also expressed in breast cancer, lung cancer and thyroid cancer (Diagn. Cytopathol.; 1993; 9: 377-382; Cancer Res.; 1990; 50: 6987-6994; Histopathology; 2000; 37: 530 -535).

[0003] Концентрация CEACAM5 в крови у пациентов с колоректальным раком выше, чем у здоровых людей (J. Exp. Med.; 1965; 121: 439-462), и CEACAM5 используется в качестве опухолевого маркера. Согласно гистологическим исследованиям пациентов с колоректальным раком, CEACAM5 высоко экспрессируется в 90% или более тканей (British J. Cancer; 2013; 108: 662-667).[0003] The blood concentration of CEACAM5 in patients with colorectal cancer is higher than in healthy people (J. Exp. Med.; 1965; 121: 439-462), and CEACAM5 is used as a tumor marker. According to histological studies of patients with colorectal cancer, CEACAM5 is highly expressed in 90% or more tissues (British J. Cancer; 2013; 108: 662-667).

[0004] Поскольку раннее метастазирование колоректального рака локализуется в печени, то раннее выявление и лечение метастазов в печени может снизить частоту рецидивов (Cell Mol. Gastroenterol. Hepatol.; 2017; 3: 163-173). В диагностике метастазирования в печени используются КТ (компьютерная томография), МРТ (магнитно-резонансная томография) или ФДГ-ПЭТ (позитронно-эмиссионная томография с фтордезоксиглюкозой). Чувствительность определения КТ, МРТ и ФДГ-ПЭТ составляет 74,4, 80,3 и 81,4%, соответственно, а чувствительность детектирования опухоли размером 1 см или менее снижается до 47,3% для КТ и 60,2% для МРТ (Radiology; 2010; 257: 674-684). МРТ с использованием специфических для печени контрастных веществ также используется, хотя чувствительность детектирования опухоли до 1 см или меньше составляет от 29 до 38% (Radiology; 2005; 237: 89-98).[0004] Since early metastasis of colorectal cancer is localized in the liver, early detection and treatment of liver metastases can reduce the recurrence rate (Cell Mol. Gastroenterol. Hepatol.; 2017; 3: 163-173). In the diagnosis of liver metastasis, CT (computed tomography), MRI (magnetic resonance imaging) or FDG-PET (fluorodeoxyglucose positron emission tomography) are used. The sensitivity of detection of CT, MRI, and FDG-PET is 74.4%, 80.3%, and 81.4%, respectively, and the sensitivity of detecting tumors of 1 cm or less decreases to 47.3% for CT and 60.2% for MRI ( Radiology; 2010; 257: 674-684). MRI using liver-specific contrast agents is also used, although the sensitivity of tumor detection to 1 cm or less is 29 to 38% (Radiology; 2005; 237: 89-98).

[0005] Противоопухолевые агенты или антитела, меченные радиоизотопом металла, используются для диагностики или лечения злокачественных новообразований. Направленное воздействие с использованием антител обладает высокой специфичностью к опухолевым клеткам и вызывает меньше нежелательных явлений. До сих пор некоторые моноклональные антитела, меченные радиоизотопами металлов, клинически применялись для диагностики и лечения (Cancer Control; 2012; 19: 196-203).[0005] Anticancer agents or antibodies labeled with a metal radioisotope are used to diagnose or treat cancers. Targeted exposure using antibodies has a high specificity for tumor cells and causes fewer adverse events. Until now, some monoclonal antibodies labeled with metal radioisotopes have been clinically used for diagnosis and treatment (Cancer Control; 2012; 19: 196-203).

[0006] Между тем, антитела обычно имеют длительный период полужизни в крови и требуют периода от 4 дней до 5 дней для достижения отношения опухоль-кровь, которое обеспечивает отношение сигнал-фон, достаточное для визуализации злокачественного новообразования, после введения в организм (Clin. Pharmacol. Ther.; 2010; 87: 586-592). Также Fc-области антител вызывают фармакологический эффект антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) или комплементзависимой цитотоксичности (CDC) (Glycoconj. J.; 2013; 30: 227-236; и Curr. Opin. Biotechnol.; 2002; 13: 609-614). Кроме того, антитела метаболизируются в печени и поэтому накапливаются в печени, независимо от цели. Тем не менее, с помощью антител трудно обнаружить поражения печени метастазами, так как ранний метастаз колоректального рака локализуется в печени (Clin. Pharmacol. Ther.; 2010; 87: 586-592).[0006] Meanwhile, antibodies generally have a long half-life in the blood and require a period of 4 days to 5 days to achieve a tumor-blood ratio that provides a signal-to-background ratio sufficient to visualize malignancy after administration to the body (Clin. Pharmacol. Ther.; 2010; 87: 586-592). Also, the Fc regions of antibodies cause the pharmacological effect of antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) or complement-dependent cytotoxicity (CDC) (Glycoconj. J.; 2013; 30: 227-236; and Curr. Opin. Biotechnol.; 2002; 13: 609-614) . In addition, antibodies are metabolized in the liver and therefore accumulate in the liver, regardless of the target. However, it is difficult to detect liver metastases with antibodies, since the early metastasis of colorectal cancer is localized in the liver (Clin. Pharmacol. Ther.; 2010; 87: 586-592).

[0007] Фрагменты низкомолекулярных рекомбинантных антител, такие как Fab, scFv и диатело, легко попадают в очаги поражения благодаря их высокому проникновению в ткани и используются в качестве терапевтических антител, поскольку можно ожидать низкозатратного получения с использованием системы экспрессии в E.coli или дрожжах. С другой стороны, об их использовании в качестве диагностического лекарственного средства также сообщалось в связи с их короткими периодами полужизни в крови и особенностями почечной экскреции (Nat. Biotechnol.; 2005; 23: 1126-1136).[0007] Small molecular weight recombinant antibody fragments such as Fab, scFv and diabody are readily introduced into lesions due to their high tissue penetration and are used as therapeutic antibodies since low cost production using an E. coli or yeast expression system can be expected. On the other hand, their use as a diagnostic drug has also been reported due to their short blood half-life and renal excretion characteristics (Nat. Biotechnol.; 2005; 23: 1126-1136).

[0008] M5A (PTL 1), гуманизированное антитело мышиного моноклонального антитела T84.66, известно как антитело против CEACAM5 человека, применяемое для диагностического лекарственного средства. Сообщалось, что M5A, меченное ⁶⁴Cu, требует 22 часов или более после введения для получения подходящих изображений ПЭТ в тесте с использованием мышей с подкожной трансплантацией опухолевых клеток (NPL 1) и попадает в нормальную ткань печени и участок поражения печени на том же уровне через 3 часа после введения и на существенно отличном уровне через 24 часа в тесте с использованием мышиных моделей с метастазированием в печень (NPL 2).[0008] M5A (PTL 1), a humanized T84.66 mouse monoclonal antibody, is known as an anti-human CEACAM5 antibody used for a diagnostic drug. It has been reported that ^64Cu -labeled M5A requires 22 hours or more after administration to obtain suitable PET images in a test using mice with subcutaneous tumor cell transplantation (NPL 1) and enters normal liver tissue and the liver lesion site at the same level through 3 hours after administration and at a significantly different level 24 hours later in the test using mouse models with liver metastasis (NPL 2).

[0009] Что касается фрагмента антитела против CEACAM5 человека, то сообщалось, что CEA-Scan, меченный ^99mTc Fab мышиного моноклонального антитела NP-4, можно использовать для диагностики колоректального рака (NPL 3). Однако поглощение CEA-Scan в области поражения не превышает его поглощения в нормальной печени, и его чувствительность обнаружения для метастазов в печени ниже, чем у FDG-PET (NPL 4). CEA-Scan был одобрен FDA в качестве диагностического препарата для лечения колоректального рака в 1999 году, но больше не продается (NPL 5).[0009] Regarding the anti-human CEACAM5 antibody fragment, it has been reported that CEA-Scan labeled with ^99m Tc Fab of mouse monoclonal antibody NP-4 can be used to diagnose colorectal cancer (NPL 3). However, the uptake of CEA-Scan in the lesion does not exceed its uptake in the normal liver, and its detection sensitivity for liver metastases is lower than that of FDG-PET (NPL 4). CEA-Scan was approved by the FDA as a diagnostic drug for colorectal cancer in 1999 but is no longer sold (NPL 5).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫBIBLIOGRAPHY

ПАТЕНТНАЯ ЛИТЕРАТУРАPATENT LITERATURE

[0010][0010]

PTL 1: международная публикация № WO 2005/086875 PTL 1: International Publication No. WO 2005/086875

НЕПАТЕНТНАЯ ЛИТЕРАТУРАNON-PAtent LITERATURE

[0011][0011]

NPL 1: Bioconjug. Chem.; 2008; 19: 89-96NPL 1: Bioconjug. Chem.; 2008; 19:89-96

NPL 2: PLOS ONE; 2014; 9 (9): e106921NPL 2: PLOS ONE; 2014; 9(9): e106921

NPL 3: Ann. Surg.; 1997; 226: 621-631NPL 3: Ann. Surg.; 1997; 226:621-631

NPL 4: J. Nucl. Med.; 2000; 41: 1657-1663NPL 4: J. Nucl. Med.; 2000; 41: 1657-1663

NPL 5: Kenneth T. Cheng, «99mTc-Arcitumomab», [online], Update: March 17, 2008, Molecular Imaging and Contrast Agent Database, [searched on May 17, 2017], internet <URL:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK23676/> NPL 5: Kenneth T. Cheng, "99mTc-Arcitumomab", [online], Update: March 17, 2008, Molecular Imaging and Contrast Agent Database, [searched on May 17, 2017], internet <URL:https://www .ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK23676/>

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION

ТЕХНИЧЕСКАЯ ПРОБЛЕМАTECHNICAL PROBLEM

[0012] Одновалентные Fab-фрагменты имеют молекулярную массу приблизительно 50 кДа, что меньше, чем у антител (приблизительно 150 кДа), которые вырабатываются почками, а также имеют короткий период полужизни в крови. Следовательно, они достигают отношения опухоль-кровь, которое обеспечивает отношение сигнал-фон, достаточное для того, чтобы можно было обнаружить метастазы в печени и визуализировать злокачественное новообразование в течение 2-32 часов после введения. Они лишены Fc-области, и поэтому они не вызывают ни ADCC, ни CDC. Исходя из этих особенностей, можно ожидать, что Fab-фрагменты будут более эффективными в качестве диагностических лекарственных средств по сравнению с антителами.[0012] Univalent Fab fragments have a molecular weight of approximately 50 kDa, which is less than antibodies (approximately 150 kDa) that are produced by the kidneys, and also have a short half-life in the blood. Therefore, they achieve a tumor-to-blood ratio that provides a signal-to-background ratio sufficient to allow detection of liver metastases and visualization of malignancy within 2-32 hours after administration. They lack an Fc region and therefore do not cause either ADCC or CDC. Based on these features, Fab fragments can be expected to be more effective as diagnostic drugs compared to antibodies.

[0013] Однако активность связывания Fab-фрагментов часто ослабляется из-за того, что они являются небольшими молекулами. Антитела должны быть помечены детектируемым веществом, таким как ПЭТ-индикатор или флуоресцентный краситель, для их использования в качестве диагностических лекарственных средств in vivo. Еще одной проблемой Fab-фрагментов является ослабление их связывающей активности из-за мечения таким веществом.[0013] However, the binding activity of Fab fragments is often weakened due to the fact that they are small molecules. Antibodies must be labeled with a detectable substance, such as a PET tracer or fluorescent dye, for use as in vivo diagnostic drugs. Another problem with Fab fragments is the weakening of their binding activity due to labeling with such a substance.

[0014] Целью настоящего изобретения является предоставление Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека, который полезен для детектирования CEACAM5 человека и, как ожидается, накапливается в участке поражения опухоли в течение короткого времени (например, 4 часа) после введения. Другой целью настоящего изобретения является создание композиции для диагностики, содержащей Fab-фрагмент, которая, как ожидается, позволит ставить диагноз в день введения, и к способу диагностики с использованием этой композиции.[0014] It is an object of the present invention to provide a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody that is useful for detecting human CEACAM5 and is expected to accumulate at the tumor site within a short time (eg, 4 hours) after administration. Another object of the present invention is to provide a diagnostic composition containing a Fab fragment, which is expected to allow diagnosis on the day of administration, and to a diagnostic method using this composition.

РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМЫSOLUTION

[0015] Авторы настоящего изобретения провели значительные тщательные исследования по приготовлению Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека, полезного для детектирования CEACAM5 человека, и, следовательно, получили Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей положениям аминокислот с 1 по 121 SEQ ID NO: 2, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей положениям аминокислот с 1 по 112 SEQ ID NO: 4 (Пример 1), и обнаружили, что: Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека свободен от ослабления связывающей активности против CEACAM5 человека за счет связывания меченого фрагмента (Пример 3); и конъюгат, содержащий Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, накапливается в CEACAM5-положительных опухолевых клетках человека на моделях подкожной трансплантации и на моделях трансплантации печени через 4 часа после введения и позволяет детектировать CEACAM5-положительные опухолевые клетки человека (Примеры 5 и 6). В частности, настоящее изобретение относится к Fab-фрагменту антитела против CEACAM5 человека, который накапливается при злокачественном новообразовании, и к конъюгату, содержащему Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека.[0015] The inventors of the present invention have made considerable thorough studies to prepare an anti-human CEACAM5 antibody Fab useful for detecting human CEACAM5, and therefore have obtained an anti-human CEACAM5 antibody Fab containing a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence, corresponding to amino acid positions 1 to 121 of SEQ ID NO: 2, and a light chain variable region consisting of an amino acid sequence corresponding to amino acid positions 1 to 112 of SEQ ID NO: 4 (Example 1), and found that: Fab fragment of an antibody against human CEACAM5 is free from weakening the binding activity against human CEACAM5 due to the binding of the labeled fragment (Example 3); and the anti-human CEACAM5 antibody Fab conjugate accumulates in CEACAM5-positive human tumor cells in subcutaneous and liver transplant models 4 hours after administration and allows detection of CEACAM5-positive human tumor cells (Examples 5 and 6). In particular, the present invention relates to a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody that accumulates in cancer, and a conjugate containing the Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody.

[0016] Настоящее изобретение включает аспекты, приведенные ниже, как полезные с медицинской или промышленной точки зрения вещества и способы.[0016] The present invention includes the following aspects of medically or industrially useful substances and methods.

[0017] Конкретно, в одном аспекте настоящее изобретение может быть таким, как изложено ниже:[0017] Specifically, in one aspect, the present invention may be as follows:

(1) Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей положениям аминокислот 31-35 последовательности SEQ ID NO: 2, CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей положениям аминокислот 50-66 SEQ ID NO: 2, и CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей положениям аминокислот 99-110 SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей положениям аминокислот 24-38 SEQ ID NO: 4, CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей положениям аминокислот 54-60 SEQ ID NO: 4, и CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей положениям аминокислот 93-101 SEQ ID NO: 4.(1) A Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody comprising a heavy chain fragment comprising a heavy chain variable region comprising a CDR1 consisting of an amino acid sequence corresponding to amino acid positions 31-35 of SEQ ID NO: 2, a CDR2 consisting of an amino acid sequence, corresponding to amino acid positions 50-66 of SEQ ID NO: 2, and a CDR3 consisting of an amino acid sequence corresponding to amino acid positions 99-110 of SEQ ID NO: 2, and a light chain containing a light chain variable region containing a CDR1 consisting of an amino acid sequence, corresponding to amino acid positions 24-38 of SEQ ID NO: 4, a CDR2 consisting of an amino acid sequence corresponding to amino acid positions 54-60 of SEQ ID NO: 4, and a CDR3 consisting of an amino acid sequence corresponding to amino acid positions 93-101 of SEQ ID NO: 4 .

(2) Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека в по п. (1), выбранный из группы, состоящей из следующих (а) и (b):(2) A Fab fragment of the anti-human CEACAM5 antibody in (1) selected from the group consisting of the following (a) and (b):

(a) Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей положениям аминокислот 1-121 последовательности SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей положениям аминокислот 1-112 SEQ ID NO: 4; и(a) A Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody comprising a heavy chain fragment comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence corresponding to amino acid positions 1-121 of SEQ ID NO: 2 and a light chain containing a light chain variable region, consisting of an amino acid sequence corresponding to amino acid positions 1-112 of SEQ ID NO: 4; and

(b) Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, полученную из вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, соответствующей положениям аминокислот 1-121 SEQ ID NO: 2, посредством модификации глутаминовой кислоты в положении аминокислоты 1 SEQ ID NO: 2 в пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей положениям аминокислот 1-112 SEQ ID NO: 4.(b) A Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody comprising a heavy chain fragment comprising a heavy chain variable region derived from a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence corresponding to amino acid positions 1-121 of SEQ ID NO: 2 by modifying glutamic acid at amino acid position 1 of SEQ ID NO: 2 into pyroglutamic acid, and a light chain containing a light chain variable region consisting of an amino acid sequence corresponding to amino acid positions 1-112 of SEQ ID NO: 4.

(3) Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека по п. (2), выбранный из группы, состоящей из следующих (а) и (b):(3) An anti-human CEACAM5 antibody Fab according to (2) selected from the group consisting of the following (a) and (b):

(a) Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4; и(a) a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody comprising a heavy chain fragment consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and a light chain consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4; and

(b) Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, полученный из фрагмента тяжелой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, путем модификации глутаминовой кислоты в положении аминокислоты 1 SEQ ID NO: 2 в пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4.(b) A Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody comprising a heavy chain fragment derived from a heavy chain fragment consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 by modifying the glutamic acid at amino acid position 1 of SEQ ID NO: 2 to pyroglutamic acid , and a light chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.

(4) Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека по п. (3), содержащий фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO.: 4.(4) A Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody according to (3), comprising a heavy chain fragment consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and a light chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO.: 4 .

(5) Конъюгат, содержащий меченый фрагмент и Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека по любому из (1) - (4).(5) A conjugate containing a labeled fragment and a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody according to any one of (1) to (4).

(6) Конъюгат по п. (5), отличающийся тем, что меченый фрагмент представляет собой (i) лиганд и линкер, (ii) лиганд, (iii) флуоресцентный краситель и линкер или (iv) флуоресцентный краситель.(6) The conjugate according to (5), wherein the labeled moiety is (i) a ligand and a linker, (ii) a ligand, (iii) a fluorescent dye and a linker, or (iv) a fluorescent dye.

(7) Конъюгат по п. (6), отличающийся тем, что меченый фрагмент представляет собой (i) лиганд и линкер или (ii) лиганд.(7) The conjugate according to (6), wherein the labeled moiety is (i) a ligand and a linker, or (ii) a ligand.

(8) Конъюгат по п. (7), отличающийся тем, что лиганд представляет собой лиганд, представленный следующей формулой (А):(8) The conjugate according to (7), wherein the ligand is a ligand represented by the following formula (A):

[Химическая Формула 1][Chemical Formula 1]

где волнистая линия представляет собой связывание с Fab-фрагментом антитела против CEACAM5 человека или с линкером.where the wavy line represents the binding to the Fab fragment of the anti-human CEACAM5 antibody or to the linker.

(9) Конъюгат по п. (7), отличающийся тем, что меченый фрагмент представляет собой (i) лиганд и линкер, где лиганд и линкер представляют собой группу, представленную следующей формулой (A'):(9) The conjugate according to (7), wherein the labeled fragment is (i) a ligand and a linker, where the ligand and the linker are a group represented by the following formula (A'):

[Химическая Формула 2][Chemical Formula 2]

где волнистая линия представляет собой связывание с Fab-фрагментом антитела против CEACAM5 человека.where the wavy line represents the binding to the Fab fragment of the anti-human CEACAM5 antibody.

(10) Конъюгат по п. (9), отличающийся тем, что Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека связан с атомом углерода концевой C(=S)-группы меченого фрагмента через аминогруппу в Fab-фрагменте.(10) The conjugate according to (9), characterized in that the Fab fragment of the anti-human CEACAM5 antibody is linked to the carbon atom of the terminal C(=S) group of the labeled fragment via an amino group in the Fab fragment.

(11) Конъюгат по п. (7), представленный следующей формулой (I):(11) The conjugate according to (7) represented by the following formula (I):

(L-X)_p-Ab (I)(LX) _p -Ab(I)

где Ab представляет собой Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека;where Ab is a Fab fragment of an antibody against human CEACAM5;

L представляет собой лиганд;L is a ligand;

Х представляет собой линкер или связь; иX is a linker or bond; and

р представляет собой натуральное число от 1 до 25.p is a natural number between 1 and 25.

(12) Конъюгат по п. (11), отличающийся тем, что L представляет собой лиганд, представленный следующей формулой (А):(12) The conjugate according to (11), wherein L is a ligand represented by the following formula (A):

[Химическая Формула 3][Chemical Formula 3]

где волнистая линия представляет собой связывание с Х (или Ab, когда Х является связью).where the wavy line represents the binding to X (or Ab when X is a bond).

(13) Конъюгат по пп. (9) или (12), представленный следующей формулой (II):(13) The conjugate according to claims (9) or (12) represented by the following formula (II):

[Химическая Формула 4][Chemical Formula 4]

где Ab представляет собой Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека; иwhere Ab is a Fab fragment of an antibody against human CEACAM5; and

р представляет собой натуральное число от 1 до 25, гдеp is a natural number from 1 to 25, where

Ab связано с атомом углерода концевой C(=S)-группы меченого фрагмента через аминогруппу в Ab.Ab is linked to the carbon atom of the terminal C(=S)-group of the labeled fragment through the amino group in Ab.

(14) Конъюгат по любому из пп. (11) - (13), отличающийся тем, что p представляет собой натуральное число от 1 до 16.(14) The conjugate according to any one of paragraphs. (11) - (13), characterized in that p is a natural number from 1 to 16.

(15) Конъюгат по любому из пп. (11) - (13), отличающийся тем, что р представляет собой натуральное число от 4 до 16.(15) The conjugate according to any one of paragraphs. (11) - (13), characterized in that p is a natural number from 4 to 16.

(16) Конъюгат по любому из пп. (6) - (15), дополнительно содержащий металл.(16) The conjugate according to any one of paragraphs. (6) - (15), additionally containing metal.

(17) Конъюгат по п. (16), отличающийся тем, что металл представляет собой радиоизотоп металла.(17) The conjugate according to (16), wherein the metal is a metal radioisotope.

(18) Конъюгат по п. (16), отличающийся тем, что металл представляет собой ⁸⁹Zr.(18) The conjugate according to (16), wherein the metal is ⁸⁹ Zr.

(19) Конъюгат по пп. (17) или (18) для применения в качестве ПЭТ-индикатора.(19) The conjugate according to claims (17) or (18) for use as a PET indicator.

(20) Полинуклеотид, выбранный из группы, состоящей из следующих (а) и (b):(20) A polynucleotide selected from the group consisting of the following (a) and (b):

(а) полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека (а) по п. (2); и(a) a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment of a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody (a) according to (2); and

(b) полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека (а) по п. (2).(b) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a light chain of a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody (a) according to (2).

(21) Полинуклеотид, выбранный из группы, состоящей из следующих (а) и (b):(21) A polynucleotide selected from the group consisting of the following (a) and (b):

(а) полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по п. (4); и(a) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment of a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody according to (4); and

(b) полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по п. (4).(b) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a light chain of a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody according to (4).

(22) Экспрессирующий вектор, содержащий следующие (а) и/или (b):(22) Expression vector containing the following (a) and/or (b):

(23) Экспрессирующий вектор, содержащий следующие (а) и/или (b):(23) Expression vector containing the following (a) and/or (b):

(24) Клетка-хозяин, выбранная из группы, состоящей из следующих (а) - (d):(24) A host cell selected from the group consisting of the following (a) to (d):

(а) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека (а) по п. (2);(a) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment of a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody (a) according to (2);

(b) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека (а) по п. (2);(b) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain of a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody (a) according to (2);

(c) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека (а) по п. (2), и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека (а) по п. (2); и(c) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment of the Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody (a) according to item (2), and a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a Fab light chain a fragment of an anti-human CEACAM5 antibody (a) according to (2); and

(d) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека (а) по п. (2), и экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека (а) по п. (2).(d) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment of the Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody (a) according to item (2), and an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence, encoding the light chain of the Fab fragment of the anti-human CEACAM5 antibody (a) according to (2).

(25) Клетка-хозяин, выбранная из группы, состоящей из следующих (а) - (d):(25) A host cell selected from the group consisting of the following (a) to (d):

(а) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по п. (4);(a) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment of a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody according to (4);

(b) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по п. (4);(b) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain of a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody according to (4);

(c) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по п. (4), и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека по п. (4); и(c) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the heavy chain fragment of the anti-human CEACAM5 Fab fragment according to (4) and a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the light chain of the Fab fragment of the antibody against human CEACAM5 according to item (4); and

(d) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по п. (4), и экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по п. (4).(d) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment of an anti-human CEACAM5 Fab fragment according to (4) and an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain Fab fragment of the anti-human CEACAM5 antibody according to (4).

(26) Способ получения Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека, включающий стадию культивирования клетки-хозяина, выбранной из группы, состоящей из следующих (a) - (c), для экспрессии Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека:(26) A method for producing an anti-human CEACAM5 antibody Fab, comprising the step of culturing a host cell selected from the group consisting of (a) to (c) to express the anti-human CEACAM5 antibody Fab:

(а) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека (а) по п. (2), и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека (а) по п. (2);(a) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment of the Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody (a) according to item (2), and a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a Fab light chain a fragment of an anti-human CEACAM5 antibody (a) according to (2);

(b) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека (a) по п. (2), и экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 (a) человека по п. (2); и(b) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment of a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody (a) according to item (2), and an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence, encoding the light chain of the Fab fragment of the anti-human CEACAM5 antibody (a) according to (2); and

(c) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека (a) по п. (2), и клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека (a) по п. (2).(c) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment of the Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody (a) according to item (2), and a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing the nucleotide sequence encoding the light chain of the Fab fragment of the anti-human CEACAM5 antibody (a) according to (2).

(27) Способ получения Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека, включающий стадию культивирования клетки-хозяина, выбранной из группы, состоящей из следующих (a) - (c), для экспрессии Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека:(27) A method for producing an anti-human CEACAM5 antibody Fab, comprising the step of culturing a host cell selected from the group consisting of (a) to (c) to express the anti-human CEACAM5 antibody Fab:

(а) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по п. (4), и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека по п. (4);(a) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the heavy chain fragment of the Fab fragment of the anti-human CEACAM5 antibody according to (4) and a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the light chain of the Fab fragment of the antibody against human CEACAM5 according to item (4);

(b) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по п. (4), и экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по п. (4); и(b) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment of an anti-human CEACAM5 Fab fragment according to (4) and an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain Fab fragment of the anti-human CEACAM5 antibody according to (4); and

(c) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по п. (4), и клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по п. (4).(c) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment of the anti-human CEACAM5 antibody Fab fragment according to (4), and a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence a sequence encoding the light chain of the Fab fragment of the anti-human CEACAM5 antibody according to (4).

(28) Способ получения конъюгата, содержащего меченый фрагмент и Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, включающий стадии: получения Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека способом по п. (26) или (27); и ковалентное связывание Fab-фрагмента с меченым фрагментом.(28) A method for producing a conjugate containing a labeled fragment and a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody, comprising the steps of: obtaining a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody by the method of (26) or (27); and covalently linking the Fab fragment to the labeled fragment.

(29) Способ получения конъюгата, содержащего лиганд и Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, включающий стадии: получения Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека способом по п. (26) или (27); и ковалентное связывание Fab-фрагмента с лигандом через линкер или напрямую.(29) A method for producing a conjugate containing a ligand and a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody, comprising the steps of: obtaining a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody by the method of (26) or (27); and covalently linking the Fab fragment to the ligand via a linker or directly.

(30) Способ получения конъюгата, содержащего меченый фрагмент, меченный радиоактивным изотопом металла, и Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, включающий стадии: получения конъюгата, содержащего лиганд и Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, способом по п. 29; и связывание радиоизотопа металла с лигандом конъюгата через координационную связь.(30) A method for producing a conjugate containing a labeled fragment labeled with a radioactive metal isotope and a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody, comprising the steps of: obtaining a conjugate containing a ligand and a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody by the method of claim 29; and linking the metal radioisotope to the conjugate ligand via a coordination bond.

(31) Композиция для диагностики, содержащая конъюгат по любому из пп. (16) - (19) и фармацевтически приемлемый носитель.(31) Composition for diagnosis, containing the conjugate according to any one of paragraphs. (16) - (19) and a pharmaceutically acceptable carrier.

(32) Композиция для диагностики по п. (31), которая представляет собой лекарственное средство для определения клинической стадии заболевания.(32) The diagnostic composition according to (31), which is a clinical staging medicament.

(33) Композиция для диагностики по п. (31) или (32) для применения при диагностике колоректального рака, рака молочной железы, рака легкого, рака щитовидной железы или рака, возникающего в результате метастазирования этих злокачественных новообразований.(33) The diagnostic composition according to (31) or (32) for use in diagnosing colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, thyroid cancer, or cancer resulting from metastasis of these malignancies.

(34) Композиция для диагностики по (33) для применения при диагностике колоректального рака или рака, возникающего в результате метастазирования колоректального рака.(34) The diagnostic composition according to (33) for use in diagnosing colorectal cancer or cancer resulting from metastasis of colorectal cancer.

(35) Композиция для диагностики по п. (34), отличающаяся тем, что рак, возникающий в результате метастазирования колоректального рака, представляет собой метастатический рак печени.(35) The diagnostic composition according to (34), wherein the cancer resulting from metastasis of colorectal cancer is metastatic liver cancer.

(36) Применение конъюгата по любому из пп. (16) - (19) для получения композиции для диагностики колоректального рака, рака молочной железы, рака легкого, рака щитовидной железы или рака, возникающего в результате метастазирования этих злокачественных новообразований.(36) The use of the conjugate according to any one of paragraphs. (16) - (19) to obtain a composition for the diagnosis of colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, thyroid cancer or cancer resulting from metastasis of these malignant neoplasms.

(37) Конъюгат по любому из пп. (16) - (19) для применения при диагностике колоректального рака, рака молочной железы, рака легкого, рака щитовидной железы или рака, возникающего в результате метастазирования этих злокачественных новообразований.(37) The conjugate according to any one of paragraphs. (16) - (19) for use in the diagnosis of colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, thyroid cancer or cancer resulting from metastasis of these malignancies.

(38) Способ диагностики рака ободочной и прямой кишки, рака молочной железы, рака легкого, рака щитовидной железы или рака, возникающего в результате метастазирования этих злокачественных новообразований, включающий введение пациенту конъюгата по любому из пп. (16) - (19).(38) A method for diagnosing colon and rectal cancer, breast cancer, lung cancer, thyroid cancer or cancer resulting from metastasis of these malignant neoplasms, comprising administering to the patient a conjugate according to any one of paragraphs. (16) - (19).

(40) Применение Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по любому из пп. (1) - (4) для получения конъюгата, содержащего меченый фрагмент.(40) The use of a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody according to any one of paragraphs. (1) - (4) to obtain a conjugate containing a labeled fragment.

(41) Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека по п. (39), отличающийся тем, что конъюгат, содержащий меченый фрагмент, представляет собой конъюгат по любому из пп. (5) - (18).(41) Fab-fragment of the anti-human CEACAM5 antibody according to paragraph (39), characterized in that the conjugate containing the labeled fragment is a conjugate according to any one of paragraphs. (5) - (18).

(42) Применение Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по п. (40), отличающееся тем, что конъюгат, содержащий меченый фрагмент, представляет собой конъюгат по любому из пп. (5) - (18).(42) The use of a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody according to paragraph (40), characterized in that the conjugate containing the labeled fragment is a conjugate according to any one of paragraphs. (5) - (18).

ПРЕИМУЩЕСТВЕННЫЕ ЭФФЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯADVANTAGEABLE EFFECTS OF THE INVENTION

[0018] Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению полезен для детектирования CEACAM5 человека и, как ожидается, будет полезен при диагностике рака, такого как колоректальный рак, рак молочной железы, рак легкого, рак щитовидной железы или рак, возникающий в результате метастазирования этих злокачественных новообразований.[0018] The Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention is useful for detecting human CEACAM5 and is expected to be useful in the diagnosis of cancer such as colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, thyroid cancer, or cancer resulting from metastasis of these malignancies.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0019][0019]

[Фиг. 1A] Фиг. 1A представляет собой репрезентативное изображение, полученное с помощью ПЭТ через 4 часа после введения PB009-03 мыши, которой были подкожно трансплантированы в правое плечо клетки линии колоректального рака человека LS174T (клетки, положительные по CEACAM5 человека), в то время как клетки клеточной линии колоректального рака человека HCT-15 (клетки, отрицательные по CEACAM5 человека) подкожно трансплантировали в левое плечо. Поскольку мышь сфотографировали лицевой стороной вниз, правый кружок изображает правое плечо мыши с трансплантированными клетками LS174T, а левый кружок изображает левое плечо мыши с трансплантированными клетками HCT-15. Правая полоса показывает максимальное стандартизированное значение поглощения (SUV-Max) для опухоли.[Fig. 1A] FIG. 1A is a representative PET image obtained 4 hours after PB009-03 injection in a mouse that was subcutaneously transplanted into the right shoulder with human colorectal cancer cell line LS174T (cells positive for human CEACAM5), while the cells of the colorectal cell line human cancer HCT-15 (human CEACAM5 negative cells) was subcutaneously transplanted into the left shoulder. Because the mouse was photographed face down, the right circle depicts the right shoulder of the mouse transplanted with LS174T cells and the left circle depicts the left shoulder of the mouse transplanted with HCT-15 cells. The right bar shows the maximum standardized absorbance value (SUV-Max) for the tumor.

[Фиг. 1B] Фиг. 1B представляет собой график, показывающий результаты анализа изображений, полученных с помощью ПЭТ, через 4 часа, 24 часа и 48 часов после введения PB009-03 мыши, которой были подкожно трансплантировали в правое плечо клетки клеточной линии колоректального рака человека LS174T (клетки, положительные по CEACAM5 человека), в то время как клетки линии колоректального рака человека HCT-15 (клетки, отрицательные по CEACAM5 человека) подкожно трансплантировали в левое плечо. На ординате изображено значение SUV-Max PB009-03, накопленное в месте опухоли. Планки погрешностей на графике показывают среднее значение±среднее стандартное отклонение (среднее±SEM).[Fig. 1B] FIG. 1B is a graph showing the results of analysis of PET images at 4 hours, 24 hours and 48 hours after PB009-03 administration to a mouse that had been subcutaneously transplanted into the right shoulder with cells of the human colorectal cancer cell line LS174T (cells positive for human CEACAM5), while human colorectal cancer line HCT-15 (cells negative for human CEACAM5) were subcutaneously transplanted into the left shoulder. The ordinate shows the SUV-Max PB009-03 value accumulated at the tumor site. The error bars on the graph show the mean ± mean standard deviation (mean ± SEM).

[Фиг. 2A] Фиг. 2A представляет собой репрезентативное изображение, полученное с помощью ПЭТ через 4 часа после введения PB009-03 мыши, которой были трансплантированы в печень клетки LS174T, экспрессирующие люциферазу (клетки, положительные по CEACAM5 человека). Стрелка изображает участок трансплантации клеток. Правая полоса отображает значение SUV-Max.[Fig. 2A] FIG. 2A is a representative PET image 4 hours after PB009-03 administration to a mouse transplanted with luciferase-expressing LS174T cells (human CEACAM5 positive cells) into the liver. The arrow depicts the site of cell transplantation. The right bar displays the SUV-Max value.

[Фиг. 2B] Фиг. 2B представляет собой график, показывающий результаты анализа изображений, полученных с помощью ПЭТ через 4 часа и 24 часа после введения PB009-03 мыши, которой были трансплантированы в печень клетки LS174T, экспрессирующие люциферазу (клетки, положительные по CEACAM5 человека). Ордината изображает соотношение между значениями SUV-Max PB009-03, который накапливаются в печени и опухолевом участке (соотношение опухоль/печень). Планки погрешностей на графике показывают среднее значение±среднее стандартное отклонение (среднее±SEM).[Fig. 2B] FIG. 2B is a graph showing the results of PET image analysis at 4 hours and 24 hours after PB009-03 administration to a mouse transplanted with luciferase-expressing LS174T cells (human CEACAM5 positive cells) into the liver. The ordinate depicts the ratio between the SUV-Max PB009-03 values that accumulate in the liver and the tumor site (tumor/liver ratio). The error bars on the graph show the mean ± mean standard deviation (mean ± SEM).

ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯDESCRIPTION OF EMBODIMENTS

[0020] Далее настоящее изобретение будет описано подробно. Однако настоящее изобретение этим не ограничивается. Научные термины и технические термины, используемые в отношении настоящего изобретения, имеют значения, обычно понятные специалистам в данной области техники, если в настоящем описании не указано иное.[0020] Hereinafter, the present invention will be described in detail. However, the present invention is not limited to this. Scientific terms and technical terms used in connection with the present invention have the meanings commonly understood by those skilled in the art, unless otherwise indicated in this specification.

[0021] Авторы настоящего изобретения провели значительные тщательные исследования по приготовлению антитела против CEACAM5 человека или его антигенсвязывающего фрагмента и, следовательно, успешно получили Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, пригодный для детектирования CEACAM5 человека.[0021] The inventors of the present invention have made considerable thorough studies on the preparation of an anti-human CEACAM5 antibody or an antigen-binding fragment thereof, and therefore successfully obtained an anti-human CEACAM5 antibody Fab fragment suitable for detecting human CEACAM5.

[0022] Базовая структура молекулы антитела является общей среди классов и состоит из тяжелых цепей с молекулярной массой от 50000 до 70000 и легких цепей с молекулярной массой от 20000 до 30000. Тяжелая цепь обычно состоит из полипептидной цепи, содержащей приблизительно 440 аминокислот, имеет структуру, характерную для каждого класса, и называется γ, μ, α, δ, и ε цепями, соответствующими IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. IgG дополнительно содержит IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, которые называются γ1, γ2, γ3 и γ4, соответственно. Легкая цепь обычно состоит из полипептидной цепи, содержащей приблизительно 220 аминокислот, и известна как относящаяся к двум типам, L- и K-типу, которые называются λ и κ цепями, соответственно. Что касается пептидной конфигурации базовой структуры молекулы антитела, две гомологичные тяжелые цепи и две гомологичные легкие цепи связаны через дисульфидные связи (связи S-S) и нековалентные связи с образованием молекулярной массы от 150000 до 190000. Две легкие цепи могут соединяться с любой из тяжелых цепей. Отдельная молекула антитела постоянно состоит из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей.[0022] The basic structure of an antibody molecule is common among classes and consists of heavy chains with a molecular weight of 50,000 to 70,000 and light chains with a molecular weight of 20,000 to 30,000. A heavy chain typically consists of a polypeptide chain containing approximately 440 amino acids, has the structure, characteristic for each class, and are called γ, μ, α, δ, and ε chains corresponding to IgG, IgM, IgA, IgD and IgE. IgG additionally contains IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4, which are called γ1, γ2, γ3 and γ4, respectively. The light chain usually consists of a polypeptide chain containing approximately 220 amino acids and is known to be of two types, L- and K-type, which are called λ and κ chains, respectively. With respect to the peptide configuration of the basic structure of an antibody molecule, two homologous heavy chains and two homologous light chains are linked via disulfide bonds (S-S bonds) and non-covalent bonds to form a molecular weight of 150,000 to 190,000. The two light chains can be linked to any of the heavy chains. A single antibody molecule is permanently composed of two identical light chains and two identical heavy chains.

[0023] Четыре (или пять для μ и ε цепи) и две внутрицепочечные S-S связи присутствуют в тяжелой цепи и легкой цепи, соответственно, и каждая составляет одну петлю на 100-110 аминокислотных остатков. Эта конформация одинакова среди петель и называется структурной единицей или доменом. Как для тяжелой цепи, так и для легкой цепи домен, расположенный в N-концевой области, не имеет постоянной аминокислотной последовательности даже среди препаратов одного и того же класса (подкласса) животных одного и того же вида и поэтому называется вариабельной областью. Соответствующие домены называются вариабельной областью тяжелой цепи (домен V_H) и вариабельной областью легкой цепи (домен V_L). Аминокислотная последовательность в С-концевой области является почти постоянной на уровне класса или подкласса и называется константной областью. Соответствующие домены представлены C_H1, C_H2, C_H3 и C_L.[0023] Four (or five for μ and ε chain) and two intrachain SS bonds are present in the heavy chain and light chain, respectively, and each constitutes one loop of 100-110 amino acid residues. This conformation is the same among loops and is called a structural unit or domain. For both the heavy chain and the light chain, the domain located in the N-terminal region does not have a constant amino acid sequence even among preparations of the same class (subclass) of animals of the same species and is therefore called the variable region. The respective domains are called the heavy chain variable region (V _H domain) and the light chain variable region (V _L domain). The amino acid sequence in the C-terminal region is nearly constant at the class or subclass level and is referred to as the constant region. The respective domains are represented by C _H1 , C _H2 , C _H3 and C _L .

[0024] Специфичность связывания антитела с антигеном зависит от аминокислотной последовательности фрагмента, состоящего из вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи. С другой стороны, биологическая активность, такая как связывание с белками системы комплемента или различными клетками, отражает разницу в структуре между константными областями Ig соответствующих классов. Известно, что вариабельность вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи ограничена по существу тремя небольшими гипервариабельными областями, присутствующими в обеих цепях. Эти области называются областями, определяющими комплементарность (CDR; CDR1, CDR2 и CDR3 по порядку с N-конца). Остальные фрагменты вариабельной области называются каркасными областями (FR) и являются относительно постоянными.[0024] The binding specificity of an antibody to an antigen depends on the amino acid sequence of the fragment consisting of the heavy chain variable region and the light chain variable region. On the other hand, biological activity, such as binding to complement proteins or different cells, reflects the difference in structure between the Ig constant regions of the respective classes. It is known that the variability of the heavy chain and light chain variable regions is essentially limited to three small hypervariable regions present in both chains. These regions are called complementarity determining regions (CDR; CDR1, CDR2 and CDR3 in order from the N-terminus). The remaining fragments of the variable region are called framework regions (FR) and are relatively constant.

[0025] Область между доменом C_H1 и доменом C_H2 константной области тяжелой цепи антитела называется шарнирной областью. Эта область богата пролиновыми остатками и содержит множество межцепочечных S-S связей, которые соединяют две тяжелые цепи. Например, шарнирные области человеческого IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 содержат 2, 4, 11 и 2 остатка цистеина, соответственно, которые образуют S-S-связи между тяжелыми цепями. Шарнирная область является областью, очень чувствительной к протеолитическому ферменту, такому как папаин или пепсин. В случае расщепления антитела папаином тяжелые цепи расщепляются в положении на N-конце от S-S связей между тяжелыми цепями шарнирной области и, таким образом, разлагаются на два Fab-фрагмента и один фрагмент Fc. Fab-фрагмент состоит из легкой цепи и фрагмента тяжелой цепи, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, домен C_H1 и часть шарнирной области. Fab-фрагмент содержит вариабельные области и обладает антигенсвязывающей активностью.[0025] The region between the C _H1 domain and the C _H2 domain of an antibody heavy chain constant region is called the hinge region. This region is rich in proline residues and contains many interchain SS bonds that connect two heavy chains. For example, the hinge regions of human IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 contain 2, 4, 11, and 2 cysteine residues, respectively, which form SS bonds between heavy chains. The hinge region is an area highly sensitive to a proteolytic enzyme such as papain or pepsin. In the case of cleavage of the antibody with papain, the heavy chains are cleaved at the N-terminal position from the SS links between the heavy chains of the hinge region and thus decomposed into two Fab fragments and one Fc fragment. The Fab fragment consists of a light chain and a heavy chain fragment containing the heavy chain variable region, the C _H1 domain, and part of the hinge region. The Fab fragment contains variable regions and has antigen-binding activity.

[0026] <Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению>[0026] <Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention>

Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению включает Fab-фрагмент, имеющий следующую особенность:The Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention includes a Fab fragment having the following feature:

Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей положениям аминокислот 1-121 SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей положениям аминокислот 1-112 SEQ ID NO: 4.A Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody comprising a heavy chain fragment comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence corresponding to amino acid positions 1-121 of SEQ ID NO: 2 and a light chain containing a light chain variable region consisting of an amino acid sequence corresponding to amino acid positions 1-112 of SEQ ID NO: 4.

[0027] Любая константная область Igγ1, Igγ2, Igγ3 или Igγ4 и т. д. может быть выбрана в качестве константной области тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления константная область тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению представляет собой константную область Igγ1 человека.[0027] Any constant region of Igγ1, Igγ2, Igγ3, or Igγ4, etc., can be selected as the heavy chain constant region of the anti-human CEACAM5 Fab fragment of the present invention. In one embodiment, the Fab heavy chain constant region of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention is a human Igγ1 constant region.

[0028] Любая константная область Igλ или Igκ может быть выбрана в качестве константной области легкой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления константная область легкой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению представляет собой константную область Igκ человека.[0028] Any Igλ or Igκ constant region can be selected as the light chain constant region of the Fab fragment of the anti-human CEACAM5 antibody of the present invention. In one embodiment, the light chain constant region of the Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention is a human Igκ constant region.

[0029] В одном варианте осуществления Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению представляет собой следующий Fab-фрагмент:[0029] In one embodiment, the Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention is the following Fab fragment:

Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4.A Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody comprising a heavy chain fragment consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2 and a light chain consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 4.

[0030] В случае экспрессии антитела, включая Fab-фрагмент, в клетках, известно, что антитело подвергается посттрансляционной модификации. Примеры посттрансляционной модификации включают в себя отщепление С-концевого лизина тяжелой цепи карбоксипептидазой, модификацию N-концевого глутамина или глутаминовой кислоты тяжелой цепи и легкой цепи в пироглутаминовую кислоту путем пироглутамилирования, гликозилирования, окисления, дезамидирования и гликирования. Известно, что такая посттрансляционная модификация встречается в различных антителах (J. Pharm. Sci., 2008; 97: 2426-2447).[0030] When an antibody, including a Fab fragment, is expressed in cells, the antibody is known to undergo post-translational modification. Examples of post-translational modification include cleavage of the C-terminal lysine of the heavy chain with carboxypeptidase, modification of the N-terminal glutamine or glutamic acid of the heavy chain and light chain to pyroglutamic acid by pyroglutamylation, glycosylation, oxidation, deamidation and glycation. Such a post-translational modification is known to occur in various antibodies (J. Pharm. Sci., 2008; 97: 2426-2447).

[0031] Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению также может включать Fab-фрагмент, полученный в результате посттрансляционной модификации. Примеры Fab-фрагментов антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению, которые могут быть получены в результате посттрансляционной модификации, включают Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, имеющий пироглутамилированную по N-концу тяжелую цепь. В данной области известно, что такая посттрансляционная модификация с помощью N-концового пироглутамилирования не имеет заметного влияния на активность антитела (Anal. Biochem., 2006; 348: 24-39).[0031] The Fab fragment of the anti-human CEACAM5 antibody of the present invention may also include a Fab fragment resulting from post-translational modification. Examples of Fab fragments of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention that can be obtained by post-translational modification include a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody having an N-terminally pyroglutamilated heavy chain. It is known in the art that such post-translational modification by N-terminal pyroglutamylation has no measurable effect on antibody activity (Anal. Biochem., 2006; 348: 24-39).

[0032] В одном варианте осуществления Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению представляет собой Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, имеющий следующую особенность:[0032] In one embodiment, the Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention is a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody having the following feature:

Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, полученную из вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, соответствующей положениям аминокислот 1-121 последовательности SEQ ID NO: 2, посредством модификации глутаминовой кислоты в положении аминокислоты 1 SEQ ID NO: 2 в пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей положениям аминокислот 1-112 SEQ ID NO: 4.A Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody comprising a heavy chain fragment comprising a heavy chain variable region derived from a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence corresponding to amino acid positions 1-121 of SEQ ID NO: 2 by modifying glutamic acid at position amino acids 1 of SEQ ID NO: 2 into pyroglutamic acid, and a light chain containing a light chain variable region consisting of an amino acid sequence corresponding to amino acid positions 1-112 of SEQ ID NO: 4.

[0033] В другом варианте осуществления Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению представляет собой Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, имеющий следующую особенность:[0033] In another embodiment, the Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention is a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody having the following feature:

Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, полученный из фрагмента тяжелой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, путем модификации глутаминовой кислоты в положении аминокислоты 1 SEQ ID NO: 2 в пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4.A Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody comprising a heavy chain fragment derived from a heavy chain fragment consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 by modifying the glutamic acid at amino acid position 1 of SEQ ID NO: 2 to pyroglutamic acid, and a light a chain consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.

[0034] Настоящее изобретение также включает в себя Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, имеющий следующую особенность:[0034] The present invention also includes a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody having the following feature:

Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей положениям аминокислот 31-35 последовательности SEQ ID NO: 2, CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей положениям аминокислот 50-66 SEQ ID NO: 2, и CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей положениям аминокислот 99-110 SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей положениям аминокислот 24-38 SEQ ID NO: 4, CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей положениям аминокислот 54-60 SEQ ID NO: 4, и CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей положениям аминокислот 93-101 SEQ ID NO: 4.A Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody comprising a heavy chain fragment comprising a heavy chain variable region comprising a CDR1 consisting of an amino acid sequence corresponding to amino acid positions 31-35 of SEQ ID NO: 2, a CDR2 consisting of an amino acid sequence corresponding to the amino acid positions 50-66 of SEQ ID NO: 2, and a CDR3 consisting of an amino acid sequence corresponding to amino acid positions 99-110 of SEQ ID NO: 2, and a light chain containing a light chain variable region containing a CDR1 consisting of an amino acid sequence corresponding to amino acid positions 24-38 of SEQ ID NO: 4, a CDR2 consisting of the amino acid sequence corresponding to amino acid positions 54-60 of SEQ ID NO: 4, and a CDR3 consisting of the amino acid sequence corresponding to amino acid positions 93-101 of SEQ ID NO: 4.

[0035] Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению связывается с CEACAM5 человека. Способ измерения активности связывания полученного Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека с CEACAM5 человека включает такие методы, как анализ с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) и ИФА. В случае использования, например, анализа с помощью SPR, константа скорости ассоциации (ka), константа скорости диссоциации (kd) и константа диссоциации (KD) могут быть измерены с использованием Biacore T200 (GE Healthcare Japan Corp.), набора с иммобилизацией биотина Biotin CAPture Kit (GE Healthcare Japan Corp.) и биотинилированного CEACAM5 человека на сенсорном чипе и добавления туда последовательно разведенного Fab-фрагмента.[0035] The Fab fragment of the anti-human CEACAM5 antibody of the present invention binds to human CEACAM5. The method for measuring the binding activity of the obtained anti-human CEACAM5 antibody Fab fragment to human CEACAM5 includes methods such as surface plasmon resonance (SPR) analysis and ELISA. When using, for example, SPR analysis, association rate constant (ka), dissociation rate constant (kd), and dissociation constant (KD) can be measured using Biacore T200 (GE Healthcare Japan Corp.), Biotin immobilization kit CAPture Kit (GE Healthcare Japan Corp.) and biotinylated human CEACAM5 on a sensor chip and adding a serially diluted Fab fragment there.

[0036] Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению может быть легко получен специалистами в данной области с использованием метода, известного в данной области, на основе информации о последовательности фрагмента тяжелой цепи и легкой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению, раскрытой в настоящем описании. Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению можно получить способом, описанным, например, в «Способе получения Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению», упомянутом позже, но не ограничиваясь этим.[0036] The Fab fragment of the anti-human CEACAM5 antibody of the present invention can be easily obtained by those skilled in the art using a method known in the art based on the sequence information of the heavy chain and light chain fragment of the Fab fragment of the anti-human CEACAM5 antibody of the present invention. invention disclosed in the present description. A Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention can be obtained by the method described, for example, in "Method for producing a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention", mentioned later, but not limited to this.

[0037] <Конъюгат по настоящему изобретению>[0037] <Conjugate of the present invention>

Конъюгат по настоящему изобретению представляет собой конъюгат, содержащий меченый фрагмент и Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению.The conjugate of the present invention is a conjugate containing a labeled fragment and a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention.

[0038] «Меченый фрагмент» представляет собой (i) лиганд и линкер, (ii) лиганд, (iii) флуоресцентный краситель и линкер или (iv) флуоресцентный краситель. Определенная форма представляет собой (i) лиганд и линкер или (ii) лиганд, содержащий металл. Определенная форма представляет собой (iii) флуоресцентный краситель и линкер. Определенная форма представляет собой (i) лиганд и линкер. Лиганд «меченого фрагмента» может дополнительно содержать металл. Определенная форма представляет собой (i) лиганд и линкер, содержащий металл, или (ii) лиганд, составляющий его, и другая форма представляет собой (i) лиганд, образующий хелатный комплекс с металлом, и линкер, или (ii) лиганд, образующий хелатный комплекс с металлом.[0038] A "labeled fragment" is (i) a ligand and a linker, (ii) a ligand, (iii) a fluorescent dye and a linker, or (iv) a fluorescent dye. The defined form is (i) a ligand and a linker, or (ii) a metal-containing ligand. The defined form is (iii) a fluorescent dye and a linker. The defined form is (i) a ligand and a linker. The "tagged fragment" ligand may additionally contain a metal. The specific form is (i) a ligand and a metal-containing linker, or (ii) a ligand constituting it, and the other form is (i) a metal chelating ligand and a linker, or (ii) a chelating ligand metal complex.

[0039] Конъюгат по настоящему изобретению, содержащий металл, флуоресцентный краситель или неметаллический радиоизотоп, может быть использован в различных контрастных средах и тому подобном и используется, например, в контрастной среде МРТ, ПЭТ-индикатре и флуоресцентно меченном молекулярном визуализирующем агенте.[0039] The conjugate of the present invention containing a metal, a fluorescent dye, or a non-metal radioisotope can be used in various contrast media and the like, and is used, for example, in an MRI contrast medium, a PET indicator, and a fluorescently labeled molecular imaging agent.

[0040] В настоящем описании «металл» означает ион парамагнитного металла или радиоизотоп металла. Металл конкретно ничем не ограничен при условии, что металл образует координационную связь с каждым лигандом. Соответствующая известная комбинация лиганда и металла выбирается в соответствии с целью использования конъюгата.[0040] As used herein, "metal" means a paramagnetic metal ion or a radioisotope of a metal. The metal is not particularly limited as long as the metal forms a coordination bond with each ligand. An appropriate known combination of ligand and metal is selected according to the intended use of the conjugate.

[0041] Ион парамагнитного металла подходящим образом используется в контрастной среде МРТ. Примеры формы иона парамагнитного металла включают, но не ограничиваются ими, Fe²⁺, Fe³⁺, Cu²⁺, Ni²⁺, Rh²⁺, Co²⁺, Gd³⁺, Eu³⁺, Dy³⁺, Tb³⁺, Pm³⁺, Nd³⁺, Tm³⁺, Ce³⁺, Y³⁺, Ho³⁺, Er³⁺, La³⁺, Yb³⁺, Mn³⁺, и Mn²⁺. Определенной формой является Gd³⁺, Mn³⁺, Mn²⁺, Fe²⁺, или Fe³⁺. Определенной формой является Mn³⁺ или Mn²⁺. В этом случае галоген или тому подобное можно использовать в качестве противоаниона в конъюгате. Альтернативно, противоанион может представлять собой C(=O)O^- лиганда. Конъюгат может дополнительно иметь противокатион, такой как Na⁺.[0041] The paramagnetic metal ion is suitably used in an MRI contrast medium. Examples of the paramagnetic metal ion shape include, but are not limited to, Fe ²⁺ , Fe ³⁺ , Cu ²⁺ , Ni ²⁺ , Rh ²⁺ , Co ²⁺ , Gd ³⁺ , Eu ³⁺ , Dy ³⁺ , Tb ^{3 +} , Pm ³⁺ , Nd ³⁺ , Tm ³⁺ , Ce ³⁺ , Y ³⁺ , Ho ³⁺ , Er ³⁺ , La ³⁺ , Yb ³⁺ , Mn ³⁺ , and Mn ²⁺ . A specific form is Gd ³⁺ , Mn ³⁺ , Mn ²⁺ , Fe ²⁺ , or Fe ³⁺ . The specific form is Mn ³⁺ or Mn ²⁺ . In this case, a halogen or the like can be used as the counter anion in the conjugate. Alternatively, the counter anion may be a C( ⁼ O)O ligand. The conjugate may additionally have a counter cation such as Na ⁺ .

[0042] Радиоизотоп металла используется, например, в ПЭТ-индикаторе. Примеры формы радиоизотопа металла включают, но не ограничиваются ими, ⁸⁹Zr, ⁵¹Mn, ⁵²Fe, ⁶⁰Cu, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁷²As, ^99mTc, и ¹¹¹In. Определенная форма представляет собой ⁸⁹Zr, ⁶⁰Cu, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ^99mTc, или ¹¹¹In. Определенная форма представляет собой радиоизотоп циркония. Определенная форма представляет собой ⁸⁹Zr.[0042] A metal radioisotope is used, for example, in a PET tracer. Examples of the metal radioisotope form include, but are not limited to, ⁸⁹ Zr, ⁵¹ Mn, ⁵² Fe, ⁶⁰ Cu, ⁶⁷ Ga, ⁶⁸ Ga, ⁷² As, ^99m Tc, and ¹¹¹ In. The defined form is ⁸⁹ Zr, ⁶⁰ Cu, ⁶⁷ Ga, ⁶⁸ Ga, ^99m Tc, or ¹¹¹ In. A certain form is a radioisotope of zirconium. The specific shape is ⁸⁹ Zr.

[0043] «Лиганд» представляет собой группу, способную образовывать хелатный комплекс с металлом в этом конъюгате, и означает группу, состоящую из хелатирующего агента в определенной форме. Составляющая группа представляет собой группу, образующую связь в результате удаления протона из хелатирующего агента.[0043] "Ligand" is a group capable of forming a chelate complex with the metal in this conjugate, and means a group consisting of a chelating agent in a certain form. A constituent group is a group that forms a bond by removing a proton from a chelating agent.

[0044] «Хелатирующий агент» представляет собой соединение, которое может образовывать координационную связь с металлом.[0044] A "chelating agent" is a compound that can form a coordination bond with a metal.

[0045] Примеры «хелатирующего агента» включают сидерофор и не сидерофор. Примеры определенной формы включают MAG3 (меркаптоацетил-глицил-глицил-глицин, CAS №: 66516-09-4) и его известные реакционноспособные производные. Примеры сидерофора включают сидерофор типа гидроксамовой кислоты, типа катехина и типа смешанного лиганда. Примеры сидерофоров типа гидроксамовой кислоты включают феррихром, дефероксамин (DFO), представленный следующей формулой:[0045] Examples of a "chelating agent" include siderophore and non-siderophore. Examples of the defined form include MAG3 (mercaptoacetyl-glycyl-glycyl-glycine, CAS No: 66516-09-4) and known reactive derivatives thereof. Examples of the siderophore include a hydroxamic acid type, a catechin type, and a mixed ligand type siderophore. Examples of hydroxamic acid type siderophores include ferrichrome, deferoxamine (DFO), represented by the following formula:

[0046][0046]

[Химическая Формула 5][Chemical Formula 5]

,

,

фузаринин С, орнибактин, родоторуловая кислота и их известные реакционноспособные производные. Примеры сидерофоров катехинового типа включают энтеробактин, бациллибактин, вибриобактин и их известные реакционноспособные производные. Примеры сидерофора лиганда смешанного типа включают азотобактин, пиовердин, иерсиниабактин и их известные реакционноспособные производные. В случае сидерофора DFO может реагировать через его реакционноспособную функциональную группу -NH₂ с линкером или Fab-фрагментом, и сидерофор, отличный от DFO, также может реагировать через его реакционноспособную функциональную группу, такую как карбоксигруппа, гидроксигруппа или аминогруппа с линкером или Fab-фрагментом способом, обычно используемым специалистами в данной области.fusarinin C, ornibactin, rhodotorulic acid and their known reactive derivatives. Examples of catechin-type siderophores include enterobactin, bacillibactin, vibriobactin and known reactive derivatives thereof. Examples of the mixed-type siderophore ligand include azotobactin, pyoverdin, yersiniabactin, and known reactive derivatives thereof. In the case of a siderophore, DFO can react through its reactive functional group -NH ₂ with a linker or Fab fragment, and a siderophore other than DFO can also react through its reactive functional group such as a carboxy group, hydroxy group or amino group with a linker or Fab fragment. in a manner commonly used by those skilled in the art.

[0047] Примеры не сидерофора включают DTPA (диэтилентриаминпентауксусная кислота, CAS №: 67-43-6), DTPA-BMA (1,7-бис(метилкарбамоилметил)-1,4,7-триазагептан-1,4,7-триуксусная кислота, CAS №: 119895-95-3), EOB-DTPA (этоксибензил-DTPA,2-[[(2S)-2-[бис(карбоксиметил)амино]-3-(4-этоксифенил) пропил]-[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]уксусная кислота), TTHA (триэтилентетрамингексауксусная кислота, CAS №: 869-52-3), DO3A (1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7-триуксусная кислота, CAS №: 217973-03-0), HP-DO3A (10-(2-гидроксипропил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7-триуксусная кислота, CAS №: 120041-08-9), DOTA (1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусная кислота, CAS №: 60239-18-1) и их известные реакционноспособные производные.[0047] Examples of a non-siderophore include DTPA (diethylenetriaminepentaacetic acid, CAS No: 67-43-6), DTPA-BMA (1,7-bis(methylcarbamoylmethyl)-1,4,7-triazaheptane-1,4,7-triacetic acid, CAS No: 119895-95-3), EOB-DTPA (ethoxybenzyl-DTPA,2-[[(2S)-2-[bis(carboxymethyl)amino]-3-(4-ethoxyphenyl)propyl]-[2 -[bis(carboxymethyl)amino]ethyl]amino]acetic acid), TTHA (triethylenetetraminehexaacetic acid, CAS no: 869-52-3), DO3A (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetic acid, CAS no: 217973-03-0), HP-DO3A (10-(2-hydroxypropyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetic acid, CAS no: 120041-08- 9), DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid, CAS no: 60239-18-1) and their known reactive derivatives.

[0048] Соединения и конъюгаты, описанные в настоящем документе, также охватывают свободные формы и их соли, если не указано иное. В этом контексте «его соль» представляет собой соль, которая может быть образована соединением или конъюгатом, который может образовывать соль присоединения кислоты или соль с основанием, в зависимости от типа заместителя в соединении или конъюгате. Их конкретные примеры включают соли присоединения кислоты с неорганическими кислотами, такими как соляная кислота, бромоводородная кислота, йодоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота и фосфорная кислота, или органические кислоты, такие как муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, щавелевая кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, фумаровая кислота, малеиновая кислота, молочная кислота, яблочная кислота, миндальная кислота, винная кислота, дибензоилвинная кислота, дитолуоилвинная кислота, лимонная кислота, метансульфокислота, этансульфокислота, бензолсульфокислота, п-толуолсульфокислота, аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; соли с неорганическими основаниями, такими как натрий, калий, магний, кальций и алюминий, или органическими основаниями, такими как метиламин, этиламин, этаноламин, лизин и орнитин; соли с различными аминокислотами и производными аминокислот, такими как ацетиллейцин; и соли аммония. Например, DFO существует в виде метансульфоната дефероксамина или в виде других солей. DTPA существует как в свободной форме, так и в виде натриевой соли.[0048] The compounds and conjugates described herein also cover free forms and their salts, unless otherwise indicated. In this context, "its salt" is a salt that can be formed by a compound or conjugate, which can form an acid addition salt or a salt with a base, depending on the type of substituent in the compound or conjugate. Specific examples thereof include acid addition salts with inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, sulfuric acid, nitric acid and phosphoric acid, or organic acids such as formic acid, acetic acid, propionic acid, oxalic acid, malonic acid. acid, succinic acid, fumaric acid, maleic acid, lactic acid, malic acid, mandelic acid, tartaric acid, dibenzoyltartaric acid, ditoluoyltartaric acid, citric acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, aspartic acid, and glutamic acid; salts with inorganic bases such as sodium, potassium, magnesium, calcium and aluminum or organic bases such as methylamine, ethylamine, ethanolamine, lysine and ornithine; salts with various amino acids and amino acid derivatives such as acetyleucine; and ammonium salts. For example, DFO exists as deferoxamine methanesulfonate or other salts. DTPA exists both in free form and as a sodium salt.

[0049] Определенная форма «хелатирующего агента» для использования в контрастной среде МРТ представляет собой хелатирующий агент сидерофора или не сидерофора, описанный выше.[0049] A specific form of "chelating agent" for use in MRI contrast medium is the siderophore or non-siderophore chelating agent described above.

[0050] Определенная форма «хелатирующего агента» для применения в ПЭТ-индикаторе представляет собой хелатирующий агент на основе сисдерофора или не сидерофора, описанного выше. Определенная форма представляет собой MAG3. Определенная форма представляет собой DFO.[0050] A specific form of "chelating agent" for use in a PET tracer is a siderophore or non-siderophore chelating agent described above. The specific shape is MAG3. A specific form is DFO.

[0051] Примеры определенной формы «хелатирующего агента», состоящего из лиганда, содержащегося в конъюгате по настоящему изобретению, включают DFO, DTPA, DTPA-BMA, EOB-DTPA, DO3A, HP-DO3A, и DOTA. Определенная форма представляет собой DFO, DTPA, или DOTA. Определенная форма представляет собой DFO.[0051] Examples of a specific form of "chelating agent" consisting of the ligand contained in the conjugate of the present invention include DFO, DTPA, DTPA-BMA, EOB-DTPA, DO3A, HP-DO3A, and DOTA. The specific form is DFO, DTPA, or DOTA. A specific form is DFO.

[0052] «Линкер» представляет собой группу, которая создает расстояние между Fab-фрагментов антитела против CEACAM5 человека и лигандом. Примеры определенной формы «линкера» в конъюгате включают следующую формулу:[0052] A "linker" is a group that creates a distance between Fab fragments of an anti-human CEACAM5 antibody and a ligand. Examples of the specific form of the "linker" in the conjugate include the following formula:

[0053][0053]

[Химическая Формула 6][Chemical Formula 6]

(далее обозначается как -C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-), -CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)- и -C(=O)-(C_1-20алкилен)-C(=O)-. В этом контексте «C_1-20алкилен» представляет собой линейный или разветвленный алкилен, содержащий от 1 до 20 атомов углерода. Определенная форма С_1-20алкилена представляет собой С_1-10алкилен или С_1-2алкилен. Определенной формой С_1-20алкилена является этилен. Определенной формой является -C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-. Определенной формой является -C(=O)-C₂H₄-C(=O)-. Примеры реагента, который можно использовать для образования линкера, включают HO-C(=O)-(C_1-20алкилен)-C(=O)-OH, янтарную кислоту и п-фенилендиизотиоцианат.(hereinafter referred to as -C(=S)-NH-(1,4-phenylene)-NH-C(=S)-), -CH2-(1,4-phenylene)-NH-C(=S)- and -C(=O)-(C _1-20 alkylene)-C(=O)-. In this context, "C _1-20 alkylene" is a linear or branched alkylene containing from 1 to 20 carbon atoms. A specific form of C _1-20 alkylene is C _1-10 alkylene or C _1-2 alkylene. A specific form of C _1-20 alkylene is ethylene. The defined form is -C(=S)-NH-(1,4-phenylene)-NH-C(=S)-. A specific form is -C(=O)-C ₂ H ₄ -C(=O)-. Examples of a reagent that can be used to form a linker include HO-C(=O)-(C _1-20 alkylene)-C(=O)-OH, succinic acid, and p-phenylenediisothiocyanate.

[0054] Конъюгат по настоящему изобретению, содержащий флуоресцентный краситель, можно использовать в качестве флуоресцентно меченного молекулярного визуализирующего агента.[0054] A conjugate of the present invention containing a fluorescent dye can be used as a fluorescently labeled molecular imaging agent.

[0055] Краситель, имеющий максимум поглощения и максимум излучения на длине волны ближнего инфракрасного диапазона (650-1000 нм), обычно используемый при фотоизображении, может быть использован в качестве флуоресцентного красителя для применения в конъюгате по настоящему изобретению. Примеры определенной формы флуоресцентного красителя включают соединения цианина и индоцианина. Примеры определенной формы включают IRDye800CW (LI-COR, Inc.), Cy (Molecular Probes, Inc.), Alexa Fluor, BODIPY, и DyLight (Thermo Fisher Scientific Inc.), CF790 (Biotium, Inc.), DY (Dyomics GmbH), HiLyte Fluor 680 и HiLyte Fluor 750 (AnaSpec Inc.), и PULSAR650, и QUASAR670 (LGC Biosearch Technologies). Определенная форма представляет собой IRDye800CW. Флуоресцентный краситель может реагировать через его карбоксигруппу, гидроксигруппу, аминогруппу или тому подобное или через активную группу, вводимую способом, обычно используемым специалистами в данной области техники, с Fab-фрагментом или линкером. Определенная форма флуоресцентного красителя, имеющего введенную активную группу, представляет собой флуоресцентный краситель, этерифицированный N-гидроксисукцинимидной (NHS) группой. Например, NHS-эфиры IRDye800CW, упомянутые выше, являются коммерчески доступными, и их можно использовать.[0055] A dye having an absorption maximum and an emission maximum at a near infrared wavelength (650-1000 nm) commonly used in photographic imaging can be used as a fluorescent dye for use in the conjugate of the present invention. Examples of a specific form of fluorescent dye include cyanine and indocyanine compounds. Specific shape examples include IRDye800CW (LI-COR, Inc.), Cy (Molecular Probes, Inc.), Alexa Fluor, BODIPY, and DyLight (Thermo Fisher Scientific Inc.), CF790 (Biotium, Inc.), DY (Dyomics GmbH) ), HiLyte Fluor 680 and HiLyte Fluor 750 (AnaSpec Inc.), and PULSAR650, and QUASAR670 (LGC Biosearch Technologies). The specific form is the IRDye800CW. The fluorescent dye may be reacted through its carboxy group, hydroxy group, amino group, or the like, or through an active group introduced in a manner commonly used by those skilled in the art, with a Fab fragment or a linker. A specific form of a fluorescent dye having an introduced active group is a fluorescent dye esterified with an N-hydroxysuccinimide (NHS) group. For example, the IRDye800CW NHS esters mentioned above are commercially available and can be used.

[0056] Конъюгат по настоящему изобретению, содержащий неметаллический радиоизотоп, можно использовать в качестве ПЭТ-индикатора.[0056] The conjugate of the present invention containing a non-metallic radioisotope can be used as a PET tracer.

[0057] Примеры неметаллического радиоизотопа для использования в конъюгате по настоящему изобретению включают ¹⁸F, ¹¹C, ¹⁵O и ¹³N. Определенная форма представляет собой ¹⁸F. Например, N-сукцинимидил-4-[¹⁸F]фторбензойная кислота ([¹⁸F] SFB) может быть использована для связывания соединения, содержащего неметаллический радиоизотоп.[0057] Examples of a non-metallic radioisotope for use in the conjugate of the present invention include ¹⁸ F, ¹¹ C, ¹⁵ O, and ¹³ N. A defined form is ¹⁸ F. For example, N-succinimidyl-4-[ ¹⁸ F]fluorobenzoic acid ([ ¹⁸ F] SFB) can be used to bind a compound containing a non-metallic radioisotope.

[0058] Связывание Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 по настоящему изобретению с меченым фрагментом может быть соответствующим образом выполнено специалистами в данной области с использованием известного подхода. Например, меченый фрагмент может быть связана с одной или более аминогруппами (например, N-концевой аминогруппой и аминогруппой аминокислотной боковой цепи), одной или более тиольными группами (например, тиольной группой аминокислотной боковой цепи) или одной или более карбоксильными группами (например, С-концевыми карбоксильными группами и аминокислотной боковой цепи) Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению. Определенная форма конъюгата по настоящему изобретению представляет собой конъюгат, в котором меченый фрагмент связан с одной или более аминогруппами Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению.[0058] Coupling of the Fab fragment of an anti-CEACAM5 antibody of the present invention to a labeled fragment can be appropriately performed by those skilled in the art using a known approach. For example, a labeled fragment may be linked to one or more amino groups (e.g., the N-terminal amino group and the amino group of an amino acid side chain), one or more thiol groups (e.g., the thiol group of an amino acid side chain), or one or more carboxyl groups (e.g., C -terminal carboxyl groups and amino acid side chain) of the Fab fragment of the anti-human CEACAM5 antibody of the present invention. A specific form of the conjugate of the present invention is a conjugate in which the labeled moiety is linked to one or more amino groups of the Fab fragment of the anti-human CEACAM5 antibody of the present invention.

[0059] Когда меченый фрагмент представляет собой лиганд и линкер, конъюгат по настоящему изобретению можно получить путем взаимодействия хелатирующего агента, образующего лиганд, с веществом, полученным в результате реакции Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению с линкером. Он может быть получен путем взаимодействия Fab-фрагмента антитела против СЕАСАМ человека по настоящему изобретению с веществом, полученным в результате реакции хелатирующего агента, образующего лиганд, с линкером. В качестве примера реакции вещество, полученное в результате реакции аминогруппы хелатирующего агента с линкером, реагирует с одной или более аминогруппами (например, N-концевой аминогруппой и аминогруппой боковой цепи лизина) Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению. Когда меченый фрагмент представляет собой лиганд, он может быть получен путем взаимодействия хелатирующего агента, образующего лиганд, с Fab-фрагментом антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению. В качестве примера реакции хелатирующий агент реагирует с одной или более аминогруппами (например, N-концевой аминогруппой и аминогруппой боковой цепи лизина) Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению. Реакция синтеза тиомочевины путем добавления изотиоцианата к амину, реакция синтеза амида путем добавления карбоновой кислоты к амину или тому подобное могут быть использованы при получении конъюгата по настоящему изобретению. Реакция может быть осуществлена путем применения метода, известного специалистам в данной области. Соединение лиганда, заранее связанного с линкером, может быть использовано в качестве исходного материала. Примеры соединения лиганда, связанного с линкером, включают в себя соединение p-SCN-Bn-DFO (DFO, замещенный п-изотиоцианофениламинотиокарбонильной группой, CAS №: 1222468-90-7), представленное следующей формулой:[0059] When the labeled fragment is a ligand and a linker, the conjugate of the present invention can be obtained by reacting a ligand-forming chelating agent with a substance obtained by reacting a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention with a linker. It can be obtained by reacting a Fab fragment of an anti-human CEACAM antibody of the present invention with a material obtained by reacting a ligand-forming chelating agent with a linker. As an example of the reaction, a substance obtained by reacting the amino group of a chelating agent with a linker reacts with one or more amino groups (e.g., the N-terminal amino group and the amino group of a lysine side chain) of the Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention. When the labeled fragment is a ligand, it can be obtained by reacting a ligand-forming chelating agent with a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention. As an example of the reaction, the chelating agent reacts with one or more amino groups (eg, the N-terminal amino group and the amino group of the lysine side chain) of the Fab fragment of the anti-human CEACAM5 antibody of the present invention. A thiourea synthesis reaction by adding isothiocyanate to an amine, an amide synthesis reaction by adding a carboxylic acid to an amine, or the like can be used in preparing the conjugate of the present invention. The reaction can be carried out by applying a method known to those skilled in the art. The connection of the ligand previously associated with the linker can be used as a starting material. Examples of a linker-bound ligand compound include p-SCN-Bn-DFO (DFO substituted with p-isothiocyanophenylaminothiocarbonyl group, CAS No: 1222468-90-7) represented by the following formula:

[0060][0060]

[Химическая Формула 7][Chemical Formula 7]

,

,

DTPA, замещенный п-изотиоцианобензильной группой (p-SCN-Bn-DTPA, CAS №: 102650-30-6), DOTA, замещенный п-изотиоцианобензильной группой (p-SCN-Bn-DOTA, CAS №: 127985-74 -4) и p-SCN-Bn-CHX-A''-DTPA([(R)-2-амино-3-(4-изотиоцианатофенил)пропил]-транс-(S, S)-циклогексан-1,2)-диамин-пентауксусная кислота, CAS №: 157380-45-5).DTPA substituted with p-isothiocyanobenzyl group (p-SCN-Bn-DTPA, CAS no: 102650-30-6), DOTA substituted with p-isothiocyanobenzyl group (p-SCN-Bn-DOTA, CAS no: 127985-74-4 ) and p-SCN-Bn-CHX-A''-DTPA([(R)-2-amino-3-(4-isothiocyanatophenyl)propyl]-trans-(S, S)-cyclohexane-1,2)- diamine-pentaacetic acid, CAS no: 157380-45-5).

[0061] Конъюгат по настоящему изобретению может быть получен в виде, например, конъюгата, содержащего Fab-фрагмент, связанный по меньшей мере с одним меченым фрагментом через аминогруппы, путем взаимодействия одной или более аминогрупп (например, N-концевой аминогруппы и аминогруппы аминокислотной боковой цепи) Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению с меченым фрагментом, имеющим группу изоциановой кислоты.[0061] The conjugate of the present invention can be obtained in the form of, for example, a conjugate containing a Fab fragment associated with at least one labeled fragment through amino groups, by interaction of one or more amino groups (for example, an N-terminal amino group and an amino group of an amino acid side chain) of a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention with a labeled fragment having an isocyanic acid group.

[0062] Металл (ион парамагнитного металла или радиоизотоп металла) может быть добавлен к Fab-фрагменту антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению, связанному, по меньшей мере, с одним меченым фрагментом, полученной способом получения конъюгата по настоящему изобретению, содержащего металл.[0062] A metal (a paramagnetic metal ion or a metal radioisotope) can be added to a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention bound to at least one labeled fragment obtained by the method for producing a conjugate of the present invention containing a metal.

[0063] Конъюгат по настоящему изобретению представляет собой конъюгат, содержащий Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению, связанный по меньшей мере с одним меченым фрагментом. Определенной формой конъюгата по настоящему изобретению является Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, связанный с 1-25 мечеными фрагментами. Определенной формой является Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, связанный с 1-23 мечеными фрагментами. Определенной формой является Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, связанный с 1-16 мечеными фрагментами. Определенной формой является Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, связанный с 1-11 мечеными фрагментами. Определенной формой является Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, связанный с 1-10 мечеными фрагментами. Определенной формой является Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, связанный с 1-9 мечеными фрагментами. Определенной формой является Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, связанный с 4-23 мечеными фрагментами. Определенной формой является Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, связанный с 4-16 мечеными фрагментами. Определенной формой является Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, связанный с 4-10 мечеными фрагментами. Определенной формой является Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, связанный с 4-9 мечеными фрагментами. Определенной формой является Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, связанный с 3-23 мечеными фрагментами. Определенной формой является Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, связанный с 3-16 мечеными фрагментами. Определенной формой является Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, связанный с 3-10 мечеными фрагментами. Определенной формой является Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, связанный с 3-9 мечеными фрагментами. Определенной формой конъюгата по настоящему изобретению является Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, связанный, по меньшей мере, с одним меченым фрагментом, дополнительно содержащим металл. Определенная форма конъюгата по настоящему изобретению может представлять собой смесь конъюгатов, различающихся по количеству связанных меченых фрагментов.[0063] The conjugate of the present invention is a conjugate containing a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention linked to at least one labeled fragment. A specific form of the conjugate of the present invention is a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody linked to 1-25 labeled fragments. A specific form is the Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody linked to 1-23 labeled fragments. A specific form is a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody linked to 1-16 labeled fragments. A specific form is the Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody linked to 1-11 labeled fragments. A specific form is a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody linked to 1-10 labeled fragments. A specific form is a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody linked to 1-9 labeled fragments. A specific form is the Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody linked to 4-23 labeled fragments. A specific form is the Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody linked to 4-16 labeled fragments. A specific form is a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody linked to 4-10 labeled fragments. A specific form is the Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody linked to 4-9 labeled fragments. A specific form is a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody linked to 3-23 labeled fragments. A specific form is a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody linked to 3-16 labeled fragments. A specific form is a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody linked to 3-10 labeled fragments. A specific form is the Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody linked to 3-9 labeled fragments. A specific form of the conjugate of the present invention is a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody linked to at least one labeled fragment additionally containing a metal. The specific form of the conjugate of the present invention may be a mixture of conjugates differing in the number of associated labeled fragments.

[0064] В одном варианте осуществления конъюгат по настоящему изобретению представляет собой конъюгат, содержащий меченый фрагмент и Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению.[0064] In one embodiment, the conjugate of the present invention is a conjugate containing a labeled fragment and a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention.

[0065] В определенном варианте осуществления конъюгат по настоящему изобретению представляет собой конъюгат, в котором меченый фрагмент представляет собой (i) лиганд и линкер или (ii) лиганд.[0065] In a specific embodiment, the conjugate of the present invention is a conjugate in which the labeled moiety is (i) a ligand and a linker, or (ii) a ligand.

[0066] В определенном варианте осуществления конъюгат по настоящему изобретению представляет собой конъюгат, в котором меченый фрагмент представляет собой (i) лиганд и линкер или (ii) лиганд, и лиганд представляет собой лиганд, представленный следующей формулой (A):[0066] In a particular embodiment, the conjugate of the present invention is a conjugate wherein the labeled moiety is (i) a ligand and a linker, or (ii) a ligand, and the ligand is a ligand represented by the following formula (A):

[0067][0067]

[Химическая Формула 8][Chemical Formula 8]

[0068] В определенном варианте осуществления конъюгат по настоящему изобретению представляет собой конъюгат, в котором меченый фрагмент представляет собой (i) лиганд и линкер, а лиганд и линкер представляют собой группу, представленную следующей формулой (A'):[0068] In a specific embodiment, the conjugate of the present invention is a conjugate wherein the labeled moiety is (i) a ligand and a linker and the ligand and linker are a group represented by the following formula (A'):

[0069][0069]

[Химическая формула 9][Chemical formula 9]

[0070] В определенном варианте осуществления конъюгат по настоящему изобретению представляет собой конъюгат, в котором меченый фрагмент представляет собой группу, представленную формулой (A'), и Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека связан с атомом углерода концевой C(=S)-группы меченого фрагмента через аминогруппу в Fab-фрагменте.[0070] In a specific embodiment, the conjugate of the present invention is a conjugate wherein the labeled fragment is a group represented by formula (A') and the Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody is linked to the carbon atom of the terminal C(=S) group labeled fragment through the amino group in the Fab fragment.

[0071] В определенном варианте осуществления конъюгат по настоящему изобретению представляет собой конъюгат, представленный следующей формулой (I):[0071] In a certain embodiment, the conjugate of the present invention is a conjugate represented by the following formula (I):

(L-X)_p-Ab (I)(LX) _p -Ab(I)

где Ab представляет собой Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению;where Ab is a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention;

L представляет собой лиганд;L is a ligand;

Определенная форма р представляет собой натуральное число от 1 до 23. Определенная форма представляет собой натуральное число от 1 до 16. Определенная форма представляет собой натуральное число от 1 до 11. Определенная форма представляет собой натуральное число от 1 до 10. Определенная форма представляет собой натуральное число от 1 до 9. Определенная форма представляет собой натуральное число от 4 до 23. Определенная форма представляет собой натуральное число от 4 до 16. Определенная форма представляет собой натуральное число от 4 до 10. Определенная форма представляет собой натуральное число от 4 до 9. Определенная форма представляет собой натуральное число от 3 до 23. Определенная форма представляет собой натуральное число от 3 до 16. Определенная форма представляет собой натуральное число от 3 до 10. Определенная форма представляет собой натуральное число от 3 до 9.The definite form of p is the natural number from 1 to 23 The definite form is the natural number from 1 to 16 The definite form is the natural number from 1 to 11 The definite form is the natural number from 1 to 10 The definite form is the natural number a number from 1 to 9. The definite form is a natural number from 4 to 23. The definite form is a natural number from 4 to 16. The definite form is a natural number from 4 to 10. The definite form is a natural number from 4 to 9. The definite form is the natural number from 3 to 23. The definite form is the natural number from 3 to 16. The definite form is the natural number from 3 to 10. The definite form is the natural number from 3 to 9.

[0072] В определенном варианте осуществления конъюгат по настоящему изобретению представляет собой конъюгат формулы (I), где L представляет собой лиганд, представленный следующей формулой (A):[0072] In a certain embodiment, the conjugate of the present invention is a conjugate of formula (I), where L is a ligand represented by the following formula (A):

[0073][0073]

[Химическая Формула 10][Chemical Formula 10]

[0074] В определенном варианте осуществления конъюгат формулы (I) представляет собой конъюгат, представленный следующей формулой (II):[0074] In a certain embodiment, the conjugate of formula (I) is a conjugate represented by the following formula (II):

[0075][0075]

[Химическая формула 11][Chemical Formula 11]

где Ab представляет собой Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению; иwhere Ab is a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention; and

Ab связано с атомом углерода концевой C(=S) группы меченого фрагмента через аминогруппу в Ab.Ab is linked to the carbon atom of the terminal C(=S) group of the labeled fragment through the amino group in Ab.

[0076] В определенном варианте осуществления конъюгат по настоящему изобретению представляет собой конъюгат формулы (I), дополнительно содержащий металл. Определенная форма металла представляет собой радиоизотоп металла. Определенная форма радиоизотопа металла представляет собой ⁸⁹Zr.[0076] In a specific embodiment, the conjugate of the present invention is a conjugate of formula (I), further containing a metal. A certain form of the metal is a radioisotope of the metal. A specific form of the radioisotope of the metal is ⁸⁹ Zr.

[0077] В определенном варианте осуществления конъюгат по настоящему изобретению представляет собой конъюгат формулы (II), дополнительно содержащий металл. Определенная форма металла представляет собой радиоизотоп металла. Определенная форма радиоизотопа металла представляет собой ⁸⁹Zr.[0077] In a certain embodiment, the conjugate of the present invention is a conjugate of formula (II), further containing a metal. A certain form of the metal is a radioisotope of the metal. A specific form of the radioisotope of the metal is ⁸⁹ Zr.

[0078] Конъюгат по настоящему изобретению также включает конъюгат, который представляет собой смесь множества конъюгатов. Например, конъюгат, который представляет собой смесь конъюгата, содержащего меченый фрагмент и не модифицированный посттрансляционно Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению, и конъюгат, содержащий меченый фрагмент и Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению, полученный в результате посттрансляционной модификации Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека, также включены в конъюгат по настоящему изобретению.[0078] The conjugate of the present invention also includes a conjugate that is a mixture of multiple conjugates. For example, a conjugate that is a mixture of a conjugate containing a labeled fragment and a non-translationally modified Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention, and a conjugate containing a labeled fragment and a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention obtained by post-translational Fab modifications of the anti-human CEACAM5 antibody are also included in the conjugate of the present invention.

[0079] Некоторые варианты осуществления конъюгата по настоящему изобретению, который представляет собой смесь множества конъюгатов по настоящему изобретению, будут показаны ниже.[0079] Some embodiments of the conjugate of the present invention, which is a mixture of multiple conjugates of the present invention, will be shown below.

(1) Конъюгат, который представляет собой смесь конъюгата, в котором меченый фрагмент представляет собой лиганд и линкер, представленный формулой (A'), и Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека представляет собой Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4, и конъюгата, в котором меченый фрагмент представляет собой лиганд и линкер, представленный формулой (A'), и Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека представляет собой Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, полученный из фрагмента тяжелой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, с помощью модификации глутамина в положении аминокислоты 1 SEQ ID NO: 2 в пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4.(1) A conjugate which is a mixture of a conjugate in which the labeled fragment is a ligand and a linker represented by formula (A') and the anti-human CEACAM5 antibody Fab is an anti-human CEACAM5 antibody Fab containing a heavy chain fragment , consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and a light chain consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, and a conjugate in which the labeled fragment is a ligand and a linker represented by formula (A'), and The Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody is a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody containing a heavy chain fragment derived from a heavy chain fragment consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 by modifying glutamine at amino acid position 1 of SEQ ID NO: 2 into pyroglutamic acid, and a light chain consisting of an amino acid sequence, represented by SEQ ID NO: 4.

(2) Конъюгат (1), дополнительно содержащий металл.(2) Conjugate (1) additionally containing a metal.

(3) Конъюгат, который представляет собой смесь конъюгата (1), дополнительно содержащего металл, и конъюгата (1), не содержащего металл.(3) A conjugate which is a mixture of a conjugate (1) additionally containing a metal and a conjugate (1) not containing a metal.

(4) Конъюгат (2) или (3), в котором металл представляет собой радиоизотоп металла.(4) Conjugate (2) or (3) wherein the metal is a metal radioisotope.

(5) Конъюгат (4), в котором радиоизотоп металла представляет собой ⁸⁹Zr.(5) Conjugate (4) wherein the metal radioisotope is ⁸⁹ Zr.

[0080] <Полинуклеотид по настоящему изобретению>[0080] <Polynucleotide of the present invention>

Полинуклеотид по настоящему изобретению включает полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению.The polynucleotide of the present invention includes a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment of a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention and a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a light chain of a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention.

[0081] В одном варианте осуществления полинуклеотид по настоящему изобретению представляет собой полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной положениями аминокислот 1-121 SEQ ID NO: 2, или полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной положениями аминокислот 1-112 SEQ ID NO: 4.[0081] In one embodiment, the polynucleotide of the present invention is a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment containing a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence represented by amino acid positions 1-121 of SEQ ID NO: 2, or a polynucleotide, containing a nucleotide sequence encoding a light chain containing a light chain variable region consisting of an amino acid sequence represented by amino acid positions 1-112 of SEQ ID NO: 4.

[0082] Примеры полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной положениями аминокислот 1-121 последовательности SEQ ID NO: 2, включают полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, соответствующую нуклеотидным положениям 1-363 SEQ ID NO: 1.[0082] Examples of a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment containing a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence represented by amino acid positions 1-121 of SEQ ID NO: 2 include a polynucleotide containing a nucleotide sequence corresponding to nucleotide positions 1 -363 SEQ ID NO: 1.

[0083] Примеры полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей положениям аминокислот 1-112 SEQ ID NO: 4, включают полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, соответствующую нуклеотидным положениям 1-336 SEQ ID NO: 3.[0083] Examples of a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain containing a light chain variable region consisting of an amino acid sequence corresponding to amino acid positions 1-112 of SEQ ID NO: 4 include a polynucleotide containing a nucleotide sequence corresponding to nucleotide positions 1-336 SEQ ID NO: 3.

[0084] В предпочтительном варианте осуществления полинуклеотид по настоящему изобретению представляет собой полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, или полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4.[0084] In a preferred embodiment, the polynucleotide of the present invention is a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain consisting of an amino acid the sequence shown by SEQ ID NO: 4.

[0085] Примеры полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, включают полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1.[0085] Examples of a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 include a polynucleotide containing a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.

[0086] Примеры полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4, включают полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 3.[0086] Examples of a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 include a polynucleotide containing a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3.

[0087] Полинуклеотид по настоящему изобретению можно синтезировать с помощью метода синтеза генов, известного в данной области, на основе нуклеотидных последовательностей, сконструированных на основе аминокислотных последовательностей фрагмента тяжелой цепи и легкой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению. Различные способы, известные специалистам в данной области, такие как способы синтеза гена антитела, описанные в международной публикации №. WO 90/07861, можно использовать в качестве таких способов синтеза генов.[0087] The polynucleotide of the present invention can be synthesized using a gene synthesis method known in the art, based on nucleotide sequences designed from the amino acid sequences of the heavy chain fragment and light chain fragment of the Fab fragment of the anti-human CEACAM5 antibody of the present invention. Various methods known to those skilled in the art, such as the antibody gene synthesis methods described in International Publication No. WO 90/07861 can be used as such gene synthesis methods.

[0088] <Экспрессирующий вектор по настоящему изобретению>[0088] <Expression vector of the present invention>

Экспрессирующий вектор по настоящему изобретению включает экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению, экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению, и экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению.The expression vector of the present invention includes an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment of a Fab fragment of an anti-CEACAM5 human antibody of the present invention, an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain of a Fab fragment of an anti-CEACAM5 antibody human of the present invention, and an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment of a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention, and a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain of a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention. invention.

[0089] Экспрессирующий вектор по настоящему изобретению предпочтительно включает экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной положениями аминокислот 1-121 SEQ ID NO: 2, экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной положениями аминокислот 1-112 SEQ ID NO: 4, и экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной положениями аминокислот 1-121 SEQ ID NO: 2, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной положениями аминокислот 1-112 SEQ ID NO: 4.[0089] The expression vector of the present invention preferably includes an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment containing a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence represented by amino acid positions 1-121 of SEQ ID NO: 2, an expression vector , containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain containing a variable region of a light chain consisting of an amino acid sequence represented by amino acid positions 1-112 of SEQ ID NO: 4, and an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a fragment of a heavy chain , containing the variable region of the heavy chain, consisting of the amino acid sequence represented by amino acid positions 1-121 of SEQ ID NO: 2, and a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain, containing the variable region of the light chain, consisting of the amino acid sequence represented by amino acid positions 1-112 of SEQ ID NO: 4.

[0090] Экспрессирующий вектор по настоящему изобретению предпочтительно включает экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4, и экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4.[0090] The expression vector of the present invention preferably includes an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain , consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, and an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light a chain consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.

[0091] Экспрессирующий вектор по настоящему изобретению конкретно ничем не ограничен при условии, что полипептид, кодируемый полинуклеотидом по настоящему изобретению, может продуцироваться в различных клетках-хозяевах прокариотических клеток и/или эукариотических клеток. Примеры таких экспрессирующих векторов включают плазмидные векторы и вирусные векторы (например, аденовирусный и ретровирусный). Предпочтительно можно использовать pEE6.4 или pEE12.4 (Lonza Group AG).[0091] The expression vector of the present invention is not particularly limited as long as the polypeptide encoded by the polynucleotide of the present invention can be produced in various host cells of prokaryotic cells and/or eukaryotic cells. Examples of such expression vectors include plasmid vectors and viral vectors (eg adenoviral and retroviral). Preferably pEE6.4 or pEE12.4 (Lonza Group AG) can be used.

[0092] Экспрессирующий вектор по настоящему изобретению может содержать промотор, функционально связанный с геном, кодирующим фрагмент тяжелой цепи и/или легкую цепь в полинуклеотиде по настоящему изобретению. Примеры промотора для экспрессии Fab-фрагмента по настоящему изобретению в клетке-хозяине включают в себя промотор Trp, промотор lac, промотор recA, промотор λPL, промотор lpp и промотор tac, когда клетка-хозяин представляет собой бактерию рода Escherichia. Примеры промотора для экспрессии в дрожжах включают промотор PH05, промотор PGK, промотор GAP и промотор ADH. Примеры промотора для экспрессии в бактериях рода Bacillus включают промотор SL01, промотор SP02 и промотор penP. Примеры включают промоторы, полученные из вирусов, таких как CMV, RSV и SV40, ретровирусный промотор, актиновый промотор, промотор EF (фактор элонгации) 1α и промотор белка теплового шока, когда хозяин представляет собой эукариотическую клетку, такую как клетка млекопитающего. [0092] The expression vector of the present invention may contain a promoter operably linked to a gene encoding a heavy chain and/or light chain fragment in a polynucleotide of the present invention. Examples of the promoter for expressing the Fab fragment of the present invention in a host cell include the Trp promoter, the lac promoter, the recA promoter, the λPL promoter, the lpp promoter, and the tac promoter when the host cell is a bacterium of the genus Escherichia . Examples of a promoter for expression in yeast include the PH05 promoter, the PGK promoter, the GAP promoter, and the ADH promoter. Examples of a promoter for expression in bacteria of the genus Bacillus include the SL01 promoter, the SP02 promoter, and the penP promoter. Examples include promoters derived from viruses such as CMV, RSV and SV40, a retroviral promoter, an actin promoter, an EF (elongation factor) 1α promoter, and a heat shock protein promoter when the host is a eukaryotic cell such as a mammalian cell.

[0093] В случае использования бактерии, в частности E. coli, в качестве клетки-хозяина, экспрессирующий вектор по настоящему изобретению может дополнительно содержать старт-кодон, стоп-кодон, терминаторную область и реплицируемый блок. С другой стороны, в случае использования дрожжей, клеток животных или клеток насекомых в качестве хозяина экспрессирующий вектор по настоящему изобретению может содержать старт-кодон и стоп-кодон. В этом случае в нем могут содержаться последовательность энхансера, 5'- и 3'-нетранслируемые области гена, кодирующего фрагмент тяжелой цепи и/или легкую цепь по настоящему изобретению, сигнальная последовательность секреции, соединение сплайсинга, сайт полиаденилирования или реплицируемый блок и т. д. Кроме того, обычно используется маркер селекции (например, ген устойчивости к тетрациклину, ген устойчивости к ампициллину, ген устойчивости к канамицину, ген устойчивости к неомицину и ген дигидрофолатредуктазы) в зависимости от цели.[0093] In the case of using a bacterium, in particular E. coli , as a host cell, the expression vector of the present invention may further contain a start codon, a stop codon, a terminator region and a replicable block. On the other hand, when yeast, animal cells or insect cells are used as the host, the expression vector of the present invention may contain a start codon and a stop codon. In this case, it may contain an enhancer sequence, 5' and 3' untranslated regions of a gene encoding a heavy chain and/or light chain fragment of the present invention, a secretion signal sequence, a splicing compound, a polyadenylation site or a replicable block, etc. In addition, a selection marker (eg, tetracycline resistance gene, ampicillin resistance gene, kanamycin resistance gene, neomycin resistance gene, and dihydrofolate reductase gene) is commonly used depending on the target.

[0094] <Трансформированная клетка-хозяин по настоящему изобретению>[0094] <Transformed host cell of the present invention>

Трансформированная клетка-хозяин по настоящему изобретению включает клетку-хозяина, трансформированную экспрессирующим вектором по настоящему изобретению, выбранную из группы, состоящей из следующих (а) - (d):The transformed host cell of the present invention includes a host cell transformed with an expression vector of the present invention selected from the group consisting of the following (a) to (d):

(а) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению;(a) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment of a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention;

(b) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению;(b) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention;

(c) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению; и(c) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment of a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention and a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain of a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody according to the present invention; and

(d) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению, и экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению.(d) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment of a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention and an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain of a Fab fragment anti-human CEACAM5 antibodies of the present invention.

[0095] В одном варианте осуществления трансформированная клетка-хозяин по настоящему изобретению представляет собой клетку-хозяина, трансформированную экспрессирующим вектором по настоящему изобретению, выбранную из группы, состоящей из следующих (а) - (d):[0095] In one embodiment, the transformed host cell of the present invention is a host cell transformed with an expression vector of the present invention selected from the group consisting of the following (a) - (d):

(а) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной положениями аминокислот 1-121 SEQ ID NO: 2;(a) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment containing a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence represented by amino acid positions 1-121 of SEQ ID NO: 2;

(b) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной положениями аминокислот 1-112 последовательности SEQ ID NO: 4;(b) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain containing a light chain variable region consisting of the amino acid sequence represented by amino acid positions 1-112 of SEQ ID NO: 4;

(c) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной положениями аминокислот 1-121 SEQ ID NO: 2, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной положениями аминокислот 1-112 последовательности SEQ ID NO: 4; и(c) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment containing a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence represented by amino acid positions 1-121 of SEQ ID NO: 2, and a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain comprising a light chain variable region consisting of the amino acid sequence represented by amino acid positions 1-112 of SEQ ID NO: 4; and

(d) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной положениями аминокислот 1-121 SEQ ID NO: 2, и экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной положениями аминокислот 1-112 SEQ ID NO: 4.(d) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment containing a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence represented by amino acid positions 1-121 of SEQ ID NO: 2 and the expression vector, containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain containing a light chain variable region consisting of an amino acid sequence represented by amino acid positions 1-112 of SEQ ID NO: 4.

[0096] В одном варианте осуществления трансформированная клетка-хозяин по настоящему изобретению представляет собой клетку-хозяина, трансформированную экспрессирующим вектором по настоящему изобретению, выбранную из группы, состоящей из следующих (а) - (d):[0096] In one embodiment, the transformed host cell of the present invention is a host cell transformed with an expression vector of the present invention selected from the group consisting of the following (a) - (d):

(а) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2;(a) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;

(b) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4;(b) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4;

(c) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленную SEQ ID NO: 4; и(c) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4; and

(d) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, и экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4.(d) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain, consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.

[0097] Предпочтительные примеры трансформированной клетки-хозяина по настоящему изобретению включают клетку-хозяин, трансформированную экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению, и клетку-хозяин, трансформированную экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению, и экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению.[0097] Preferred examples of a transformed host cell of the present invention include a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment of a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention, and a polynucleotide containing a nucleotide sequence, encoding the light chain of a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention, and a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment of a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention, and an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain of a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention.

[0098] Клетка-хозяин, подлежащая трансформации, конкретно ничем не ограничивается при условии, что она совместима с используемым экспрессирующим вектором и может быть трансформирована с помощью экспрессирующего вектора для экспрессии Fab-фрагмента. Их примеры включают различные клетки, такие как природные клетки и искусственно созданные клетки, обычно используемые в области техники настоящего изобретения (например, бактерии (бактерии рода Escherichia и бактерии рода Bacillus), дрожжи (рода Saccharomyces, рода Pichia, и т. д.), клетки животных и клетки насекомых (например, Sf9)) и клеточные линии млекопитающих (например, культивируемые клетки, такие как клетки CHOK1SV, клетки CHO-DG44 и клетки 293). Сама трансформация может быть выполнена известным способом, например, кальцийфосфатным методом или методом электропорации.[0098] The host cell to be transformed is not particularly limited as long as it is compatible with the expression vector used and can be transformed with the expression vector to express the Fab fragment. Examples thereof include various cells such as natural cells and artificial cells commonly used in the technical field of the present invention (for example, bacteria (bacteria of the genus Escherichia and bacteria of the genus Bacillus ), yeast (genus Saccharomyces , genus Pichia , etc.) , animal and insect cells (eg Sf9)) and mammalian cell lines (eg cultured cells such as CHOK1SV cells, CHO-DG44 cells and 293 cells). The transformation itself can be carried out in a known manner, for example by the calcium phosphate method or by the electroporation method.

[0099] <Способ получения Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека в соответствии с настоящим изобретением>[0099] <Method for producing a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody according to the present invention>

Способ получения Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека в соответствии с настоящим изобретением включает стадию культивирования трансформированной клетки-хозяина по настоящему изобретению для экспрессии Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека.The method for producing a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody according to the present invention includes the step of culturing a transformed host cell of the present invention to express the Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody.

[0100] В одном варианте осуществления трансформированная клетка-хозяин по настоящему изобретению, которая должна культивироваться в способе получения Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению, выбрана из группы, состоящей из следующих пунктов (а) - (с):[0100] In one embodiment, the transformed host cell of the present invention to be cultured in the method for producing a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention is selected from the group consisting of the following items (a) to (c):

(а) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению;(a) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment of a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention and a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain of a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody according to the present invention;

(b) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению, и экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению; и(b) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment of a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention and an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain of a Fab fragment anti-human CEACAM5 antibodies of the present invention; and

(c) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению, и клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению.(c) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment of a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention, and a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the light chain of the Fab fragment of the anti-human CEACAM5 antibody of the present invention.

[0101] Определенная форма трансформированной клетки-хозяина по настоящему изобретению, которая должна культивироваться в способе получения Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению, выбрана из группы, состоящей из следующих пунктов (а) - (с):[0101] The specific form of the transformed host cell of the present invention to be cultured in the method for producing an anti-human CEACAM5 antibody Fab of the present invention is selected from the group consisting of the following (a) to (c):

(а) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной положениями аминокислот 1-121 SEQ ID NO: 2, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной положениями аминокислот 1-112 SEQ ID NO: 4;(a) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment containing a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence represented by amino acid positions 1-121 of SEQ ID NO: 2, and a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain comprising a light chain variable region consisting of the amino acid sequence represented by amino acid positions 1-112 of SEQ ID NO: 4;

(b) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной положениями аминокислот 1-121 SEQ ID NO: 2, и экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной положениями аминокислот 1-112 SEQ ID NO: 4; и(b) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment containing a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence represented by amino acid positions 1-121 of SEQ ID NO: 2 and the expression vector, containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain containing a variable region of the light chain, consisting of the amino acid sequence represented by amino acid positions 1-112 of SEQ ID NO: 4; and

(c) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной положениями аминокислот 1-121 SEQ ID NO: 2, и клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной положениями аминокислот 1-112 SEQ ID NO: 4.(c) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment containing a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence represented by amino acid positions 1-121 of SEQ ID NO: 2, and the host cell , transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain containing a light chain variable region consisting of the amino acid sequence represented by amino acid positions 1-112 of SEQ ID NO: 4.

[0102] Определенная форма трансформированной клетки-хозяина по настоящему изобретению, которая должна культивироваться в способе получения Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению, выбрана из группы, состоящей из следующих пунктов (а) - (с):[0102] The specific form of the transformed host cell of the present invention to be cultured in the method for producing an anti-human CEACAM5 antibody Fab of the present invention is selected from the group consisting of the following (a) to (c):

(а) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4;(a) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4;

(b) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, и экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4; и(b) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain, consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4; and

(c) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, и клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4.(c) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing the nucleotide sequence encoding a light chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.

[0103] Используемая трансформированная клетка-хозяин по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой клетку-хозяина, трансформированную экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению, или клетку-хозяина, трансформированную экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению, и экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению.[0103] The transformed host cell of the present invention used is preferably a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment of a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention, and a polynucleotide containing the nucleotide sequence , encoding a light chain of a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention, or a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment of a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention, and an expression vector, containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the light chain of the Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention.

[0104] В способе получения Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека в соответствии с настоящим изобретением трансформированную клетку-хозяина можно культивировать в питательной среде. Питательная среда предпочтительно содержит источник углерода, источник неорганического азота или источник органического азота, необходимый для роста трансформированной клетки-хозяина. Примеры источника углерода включают глюкозу, декстран, растворимый крахмал и сахарозу. Примеры неорганического источника азота или органического источника азота включают соли аммония, нитраты, аминокислоты, кукурузный отвар, пептон, казеин, мясные экстракты, соевую муку и картофельные экстракты. Также при желании в них могут содержаться другие питательные вещества (например, неорганические соли (например, хлорид кальция, дигидрофосфат натрия и хлорид магния), витамины и антибиотики (например, тетрациклин, неомицин, ампициллин и канамицин)).[0104] In the method for producing a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody according to the present invention, the transformed host cell can be cultured in a nutrient medium. The nutrient medium preferably contains a carbon source, an inorganic nitrogen source, or an organic nitrogen source necessary for the growth of the transformed host cell. Examples of the carbon source include glucose, dextran, soluble starch and sucrose. Examples of the inorganic nitrogen source or organic nitrogen source include ammonium salts, nitrates, amino acids, corn water, peptone, casein, meat extracts, soy flour, and potato extracts. They may also contain other nutrients (eg, inorganic salts (eg, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride), vitamins, and antibiotics (eg, tetracycline, neomycin, ampicillin, and kanamycin) if desired).

[0105] Само культивирование трансформированной клетки-хозяина проводят известным способом. Условия культивирования, например, температура, среднее pH и время культивирования, выбираются соответствующим образом. Когда хозяином является, например, животная клетка, среда MEM (Science; 1952; 122: 501), среда DMEM (Virology; 1959; 8: 396-97), среда RPMI1640 (J. Am. Med. Assoc.; 1967; 199: 519-24), среда 199 (Proc. Soc. Exp. Biol. Med.; 1950; 73: 1-8) или тому подобное, содержащие приблизительно 5-20% эмбриональной бычьей сыворотки, могут использоваться в качестве среды. РН среды предпочтительно составляет приблизительно от 6 до 8. Культивирование обычно проводят при температуре приблизительно от 30 до 40 °С в течение приблизительно от 15 до 336 часов, и при необходимости также можно проводить аэрацию или перемешивание. Когда хозяином является клетка насекомого, то примеры среды включают среду Грейса (PNAS; 1985; 82: 8404-8), содержащую эмбриональную бычью сыворотку. Ее рН предпочтительно составляет приблизительно от 5 до 8. Культивирование обычно проводят при температуре приблизительно от 20 до 40 °С в течение от 15 до 100 часов, и при необходимости также можно проводить аэрацию или перемешивание. Когда хозяином является бактерия, актиномицет, дрожжи или нитчатый гриб, то подходит, например, жидкая среда, содержащая источник питательных веществ, описанный выше. Среда с pH от 5 до 8 является предпочтительной. Когда хозяином является E.coli, предпочтительные примеры среды включают среду LB и среду М9 (Miller et al., Exp. Mol. Genet, Cold Spring Harbor Laboratory; 1972: 431). В таком случае культивирование обычно можно проводить при температуре от 14 до 43 °С в течение приблизительно от 3 до 24 часов с аэрацией или перемешиванием, если необходимо. Когда хозяином является бактерия рода Bacillus, то культивирование обычно можно проводить при температуре от 30 до 40 °С в течение приблизительно от 16 до 96 часов с аэрацией или перемешиванием, если это необходимо. Когда хозяин представляет собой дрожжи, примеры среды включают минимальную среду Burkholder (PNAS; 1980; 77: 4505-8). Желательно, чтобы ее рН составляло от 5 до 8. Культивирование обычно проводят при температуре приблизительно от 20 до 35 °С в течение приблизительно от 14 до 144 часов, и при необходимости также можно проводить аэрацию или перемешивание.[0105] The cultivation of the transformed host cell itself is carried out in a known manner. Culture conditions, such as temperature, average pH, and culture time, are selected accordingly. When the host is, for example, an animal cell, MEM medium (Science; 1952; 122: 501), DMEM medium (Virology; 1959; 8: 396-97), RPMI1640 medium (J. Am. Med. Assoc.; 1967; 199 : 519-24), medium 199 (Proc. Soc. Exp. Biol. Med.; 1950; 73: 1-8) or the like containing about 5-20% fetal bovine serum can be used as the medium. The pH of the medium is preferably about 6 to 8. Cultivation is usually carried out at a temperature of about 30 to 40°C for about 15 to 336 hours, and aeration or agitation can also be carried out if necessary. When the host is an insect cell, examples of the medium include Grace's medium (PNAS; 1985; 82: 8404-8) containing fetal bovine serum. Its pH is preferably about 5 to 8. Cultivation is usually carried out at a temperature of about 20 to 40°C for 15 to 100 hours, and aeration or agitation can also be carried out if necessary. When the host is a bacterium, actinomycete, yeast or filamentous fungus, a liquid medium containing the nutrient source described above is suitable, for example. An environment with a pH of 5 to 8 is preferred. When the host is E. coli , preferred medium examples include LB medium and M9 medium (Miller et al., Exp. Mol. Genet, Cold Spring Harbor Laboratory; 1972: 431). In such a case, cultivation can usually be carried out at 14 to 43°C for about 3 to 24 hours with aeration or agitation as necessary. When the host is a bacterium of the genus Bacillus , culture can generally be carried out at 30 to 40°C for about 16 to 96 hours with aeration or agitation as needed. When the host is yeast, media examples include Burkholder Minimal Medium (PNAS; 1980; 77: 4505-8). Its pH is desirably between 5 and 8. Cultivation is usually carried out at a temperature of about 20 to 35°C for about 14 to 144 hours, and aeration or agitation can also be carried out if necessary.

[0106] Способ получения Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека в соответствии с настоящим изобретением может включать стадию выделения, предпочтительно выделения или очистки экспрессированного Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека, в дополнение к стадии культивирования трансформированной клетки-хозяина по настоящему изобретению для экспрессии Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека. Примеры метода выделения или очистки включают: методы, использующие растворимость, такие как высаливание и метод осаждения растворителем; методы, использующие разницу в молекулярной массе, такие как диализ, ультрафильтрация, гель-фильтрация и электрофорез в додецилсульфат натрий-полиакриламидном геле; методы с использованием заряда, такие как ионообменная хроматография и гидроксилапатитная хроматография; методы, использующие специфическую аффинность, такие как аффинная хроматография; методы, использующие разницу в гидрофобности, такие как высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой; и способы, использующие разницу в изоэлектрической точке, такие как изоэлектрическая фокусировка.[0106] A method for producing a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody according to the present invention may include the step of isolating, preferably isolating or purifying the expressed Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody, in addition to the step of culturing the transformed host cell of the present invention to express the Fab -fragment of an antibody against human CEACAM5. Examples of an isolation or purification method include: solubility methods such as salting out and solvent precipitation methods; methods using differences in molecular weight such as dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis; charge methods such as ion exchange chromatography and hydroxyapatite chromatography; methods using specific affinity, such as affinity chromatography; methods that exploit the difference in hydrophobicity, such as reverse phase high performance liquid chromatography; and methods using the difference in isoelectric point, such as isoelectric focusing.

[0107] <Способ получения конъюгата в соответствии с настоящим изобретением >[0107] <Method for producing a conjugate according to the present invention>

Способ получения конъюгата в соответствии с настоящим изобретением включает стадию ковалентного связывания Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению с меченым фрагментом. Способ получения конъюгата по настоящему изобретению может также включать стадии: культивирования трансформированной клетки-хозяина по настоящему изобретению для экспрессии Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека; и ковалентное связывание Fab-фрагмента с меченым фрагментом. Способ получения конъюгата по настоящему изобретению может также включать стадии: культивирования трансформированной клетки-хозяина по настоящему изобретению для экспрессии Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека; извлечение экспрессированного Fab-фрагмента; и ковалентное связывание Fab-фрагмента с меченым фрагментом. Можно использовать линкер, лиганд или флуоресцентный краситель и т. д. такие, как описано в разделе <Конъюгат по настоящему изобретению>.The method for preparing a conjugate according to the present invention includes the step of covalently linking a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention to a labeled fragment. The method for producing a conjugate of the present invention may also include the steps of: culturing a transformed host cell of the present invention to express a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody; and covalently linking the Fab fragment to the labeled fragment. The method for producing a conjugate of the present invention may also include the steps of: culturing a transformed host cell of the present invention to express a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody; extracting the expressed Fab fragment; and covalently linking the Fab fragment to the labeled fragment. You can use a linker, ligand or fluorescent dye, etc., such as described in <Conjugate of the present invention>.

[0108] В одном варианте осуществления способ получения конъюгата по настоящему изобретению представляет собой способ, включающий стадии: культивирования трансформированной клетки-хозяина по настоящему изобретению для экспрессии Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека; и ковалентное связывание Fab-фрагмента с меченым фрагментом. Определенной формой способа получения конъюгата по настоящему изобретению является способ, включающий стадии: культивирования трансформированной клетки-хозяина по настоящему изобретению для экспрессии Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека; извлечение экспрессированного Fab-фрагмента; и ковалентное связывание Fab-фрагмента с меченым фрагментом.[0108] In one embodiment, a method for producing a conjugate of the present invention is a method comprising the steps of: culturing a transformed host cell of the present invention to express a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody; and covalently linking the Fab fragment to the labeled fragment. A specific form of the method for producing a conjugate of the present invention is a method comprising the steps of: culturing a transformed host cell of the present invention to express a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody; extracting the expressed Fab fragment; and covalently linking the Fab fragment to the labeled fragment.

[0109] Определенной формой способа получения конъюгата по настоящему изобретению является способ, включающий стадии: культивирования трансформированной клетки-хозяина по настоящему изобретению для экспрессии Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека; и i) связывание Fab-фрагмента через линкер с лигандом или ii) ковалентное связывание Fab-фрагмента непосредственно с лигандом. Определенной формой способа получения конъюгата по настоящему изобретению является способ, включающий стадии: культивирования трансформированной клетки-хозяина по настоящему изобретению для экспрессии Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека; извлечение экспрессированного Fab-фрагмента; и i) связывание Fab-фрагмента через линкер с лигандом или ii) ковалентное связывание Fab-фрагмента непосредственно с лигандом.[0109] A specific form of the method for producing a conjugate of the present invention is a method comprising the steps of: culturing a transformed host cell of the present invention to express a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody; and i) linking the Fab fragment via a linker to the ligand, or ii) covalently linking the Fab fragment directly to the ligand. A specific form of the method for producing a conjugate of the present invention is a method comprising the steps of: culturing a transformed host cell of the present invention to express a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody; extracting the expressed Fab fragment; and i) linking the Fab fragment via a linker to the ligand, or ii) covalently linking the Fab fragment directly to the ligand.

[0110] Определенной формой способа получения конъюгата по настоящему изобретению является способ, включающий стадии: культивирования трансформированной клетки-хозяина по настоящему изобретению для экспрессии Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека; ковалентное связывание Fab-фрагмента через линкер или непосредственно с лигандом; и связывание металла с лигандом конъюгата посредством координационной связи (то есть, образуя хелатный комплекс). Определенной формой способа получения конъюгата по настоящему изобретению является способ, включающий стадии: культивирования трансформированной клетки-хозяина по настоящему изобретению для экспрессии Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека; извлечение экспрессированного Fab-фрагмента; ковалентное связывание Fab-фрагмента через линкер или непосредственно с лигандом; и связывание металла с лигандом конъюгата посредством координационной связи.[0110] A specific form of the method for producing a conjugate of the present invention is a method comprising the steps of: culturing a transformed host cell of the present invention to express a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody; covalently linking the Fab fragment through a linker or directly to a ligand; and binding the metal to the ligand of the conjugate via a coordination bond (ie, forming a chelate complex). A specific form of the method for producing a conjugate of the present invention is a method comprising the steps of: culturing a transformed host cell of the present invention to express a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody; extracting the expressed Fab fragment; covalently linking the Fab fragment through a linker or directly to a ligand; and binding the metal to the ligand of the conjugate via a coordination bond.

[0111] Определенной формой способа получения конъюгата по настоящему изобретению является способ, включающий стадии: культивирования трансформированной клетки-хозяина по настоящему изобретению для экспрессии Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека; ковалентное связывание Fab-фрагмента через линкер или непосредственно с лигандом; и связывание радиоизотопа металла с лигандом конъюгата посредством координационной связи (то есть, с образованием хелатного комплекса). Определенной формой способа получения конъюгата по настоящему изобретению является способ, включающий стадии: культивирования трансформированной клетки-хозяина по настоящему изобретению для экспрессии Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека; извлечение экспрессированного Fab-фрагмента; ковалентное связывание Fab-фрагмента через линкер или непосредственно с лигандом; и связывание радиоизотопа металла с лигандом конъюгата через координационную связь.[0111] A specific form of the method for producing a conjugate of the present invention is a method comprising the steps of: culturing a transformed host cell of the present invention to express a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody; covalently linking the Fab fragment through a linker or directly to a ligand; and binding the metal radioisotope to the conjugate ligand via a coordination bond (ie, to form a chelate complex). A specific form of the method for producing a conjugate of the present invention is a method comprising the steps of: culturing a transformed host cell of the present invention to express a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody; extracting the expressed Fab fragment; covalently linking the Fab fragment through a linker or directly to a ligand; and linking the metal radioisotope to the conjugate ligand via a coordination bond.

[0112] Способ получения конъюгата по настоящему изобретению может быть выполнен как способ, включающий две или более стадий, определенных выше как последовательность стадий, или может быть выполнен как способ, включающий по меньшей мере одну из стадий, определенных выше. Например, способ, включающий стадию связывания Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 по настоящему изобретению с меченым фрагментом, и способ, включающий стадию мечения Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 по настоящему изобретению, связанного с меченым фрагментом, с использованием металла, также включен в способ получения конъюгата по настоящему изобретению. Кроме того, способ получения конъюгата по настоящему изобретению включает способ, имеющий различный порядок стадий. Например, способ, включающий мечение лиганда радиоизотопом металла и затем ковалентное связывание лиганда с Fab-фрагментом антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению, также включен в способ получения конъюгата по настоящему изобретению.[0112] The method for producing a conjugate of the present invention may be performed as a method comprising two or more of the steps defined above as a sequence of steps, or may be performed as a method including at least one of the steps defined above. For example, a method comprising the step of linking a Fab fragment of an anti-CEACAM5 antibody of the present invention to a tagged fragment, and a method comprising the step of labeling an Fab fragment of an anti-CEACAM5 antibody of the present invention bound to the tagged fragment using a metal is also included in the method for producing conjugate of the present invention. In addition, the method for producing the conjugate of the present invention includes a method having a different order of steps. For example, a method comprising labeling a ligand with a metal radioisotope and then covalently linking the ligand to a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention is also included in the method for preparing a conjugate of the present invention.

[0113] <Композиция для диагностики и способ диагностики в соответствии с настоящим изобретением>[0113] <Diagnostic composition and diagnostic method according to the present invention>

Настоящее изобретение относится к композиции для диагностики, содержащей конъюгат по настоящему изобретению, содержащий флуоресцентный краситель, радиоизотоп металла или неметаллический радиоизотоп (далее называемый детектируемым конъюгатом по настоящему изобретению). Детектируемый конъюгат по настоящему изобретению может быть приготовлен в соответствии с обычным способом и использован в качестве лекарственного средства для определения клинической стадии заболевания (в частности, для диагностики злокачественного новообразования). Лекарственное средство для определения клинической стадии заболевания означает диагностическое лекарственное средство, способное исследовать степень прогрессирования заболевания. Например, для злокачественного новообразования это означает диагностическое лекарственное средство, способное исследовать его клиническую стадию. Злокачественное новообразование, которое может быть диагностировано композицией для диагностики по настоящему изобретению, выбрано из группы, состоящей из колоректального рака, рака молочной железы, рака легкого, рака щитовидной железы и рака, возникающего в результате метастазирования этих злокачественных новообразований. Злокачественное новообразование предпочтительно представляет собой колоректальный рак или рак, возникающий в результате метастазирования колоректального рака. Злокачественное новообразование, более предпочтительно, представляет собой рак, возникающий в результате метастазирования колоректального рака. Такое злокачественное новообразование включает метастазы в печени.The present invention relates to a diagnostic composition containing a conjugate of the present invention containing a fluorescent dye, a metal radioisotope or a non-metal radioisotope (hereinafter referred to as the detectable conjugate of the present invention). The detectable conjugate of the present invention can be prepared in accordance with the usual method and used as a drug for determining the clinical stage of the disease (in particular, for the diagnosis of malignant neoplasm). A clinical staging drug means a diagnostic drug capable of examining the progression of a disease. For example, for a malignant neoplasm, this means a diagnostic drug capable of examining its clinical stage. The malignancy that can be diagnosed with the diagnostic composition of the present invention is selected from the group consisting of colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, thyroid cancer and cancer resulting from metastasis of these malignancies. The malignancy is preferably a colorectal cancer or a cancer resulting from metastasis of a colorectal cancer. The malignancy is more preferably a cancer resulting from metastasis of colorectal cancer. Such a malignant neoplasm includes liver metastases.

[0114] Количество детектируемого конъюгата по настоящему изобретению, добавляемого для приготовления композиции для диагностики по настоящему изобретению, различается в зависимости от степени симптомов или возраста пациента, используемой лекарственной формы или титра связывания Fab-фрагмент и т. д., например, приблизительно от 0,001 до 100 мг/кг в расчете на массу Fab-фрагмента можно использовать на единицу массы тела пациента.[0114] The amount of the detectable conjugate of the present invention added to prepare the diagnostic composition of the present invention varies depending on the degree of symptoms or age of the patient, the dosage form used or the Fab binding titer, etc., for example, from about 0.001 up to 100 mg/kg based on the weight of the Fab fragment can be used per unit body weight of the patient.

[0115] Примеры лекарственной формы композиции для диагностики по настоящему изобретению могут включать парентеральные агенты, такие как инъекции, и агенты для капельной инфузии. Введение предпочтительно выполняется путем внутривенной инъекции, локальной внутримышечной инъекции в мишень, подкожной инъекции или тому подобного. Для приготовления можно использовать носитель или добавку, подходящую для этих лекарственных форм, в фармацевтически приемлемом диапазоне. Тип фармацевтически приемлемого носителя или добавки конкретно ничем не ограничен, и можно использовать носитель или добавку, хорошо известные специалистам в данной области.[0115] Examples of the dosage form of the diagnostic composition of the present invention may include parenteral agents, such as injections, and drop infusion agents. Administration is preferably by intravenous injection, local intramuscular injection at the target, subcutaneous injection, or the like. For the preparation, you can use a carrier or additive suitable for these dosage forms, in a pharmaceutically acceptable range. The type of pharmaceutically acceptable carrier or additive is not particularly limited, and a carrier or additive well known to those skilled in the art may be used.

[0116] Настоящее изобретение также относится к применению детектируемого конъюгата по настоящему изобретению для производства композиции для диагностики злокачественного новообразования или композиции для определенной стадии в определенной форме. Настоящее изобретение также относится к детектируемому конъюгату по настоящему изобретению для применения при диагностике злокачественного новообразования или для применения при определенной стадии в определенной форме.[0116] The present invention also relates to the use of a detectable conjugate of the present invention for the manufacture of a composition for diagnosing a malignant neoplasm or a composition for a certain stage in a certain form. The present invention also relates to a detectable conjugate of the present invention for use in cancer diagnosis or for use at a specific stage in a specific form.

[0117] Кроме того, настоящее изобретение также относится к способу диагностики злокачественного новообразования, включающему предоперационное или интраоперационное введение детектируемого конъюгата по настоящему изобретению пациенту. В этом контексте «пациент» - это человек или любое другое млекопитающее, нуждающееся в постановке диагноза. Определенная форма представляет собой человека, нуждающегося в постановке диагноза. Эффективное количество детектируемого конъюгата по настоящему изобретению в способе диагностики по настоящему изобретению может быть таким же, как эффективное количество детектируемого конъюгата по настоящему изобретению для композиции, описанной выше. В способе диагностики по настоящему изобретению детектируемый конъюгат по настоящему изобретению предпочтительно вводят путем внутривенной инъекции или тому подобного. Конъюгат по настоящему изобретению для использования в качестве ПЭТ-индикатора можно фотографировать с помощью ПЭТ через 1,5-48 часов, через 2-48 часов в определенной форме, через 4-24 часа в определенной форме, через 4-6 часов в определенной форме или через 1,5-6 часов в определенной форме после введения. В способе диагностики по настоящему изобретению в случае использования флуоресцентно-меченного конъюгата по настоящему изобретению при интраоперационной диагностике конъюгат вводят пациенту, например, за 2-48 часов, предпочтительно за 4 часа до операции.[0117] In addition, the present invention also relates to a method for diagnosing a malignant neoplasm, including preoperative or intraoperative administration of a detectable conjugate of the present invention to a patient. In this context, a "patient" is a human or any other mammal in need of a diagnosis. A certain form represents a person in need of a diagnosis. The effective amount of the detectable conjugate of the present invention in the diagnostic method of the present invention may be the same as the effective amount of the detectable conjugate of the present invention for the composition described above. In the diagnostic method of the present invention, the detectable conjugate of the present invention is preferably administered by intravenous injection or the like. The conjugate of the present invention for use as a PET indicator can be photographed with PET after 1.5-48 hours, after 2-48 hours in a certain form, after 4-24 hours in a certain form, after 4-6 hours in a certain form or 1.5-6 hours in a certain form after administration. In the diagnostic method of the present invention, in the case of using the fluorescently labeled conjugate of the present invention in intraoperative diagnosis, the conjugate is administered to the patient, for example, 2-48 hours, preferably 4 hours before surgery.

[0118] В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение также относится к применению Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению для получения конъюгата по настоящему изобретению. В определенном варианте осуществления настоящее изобретение также относится к применению Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению для получения композиции для диагностики, содержащей конъюгат по настоящему изобретению.[0118] In an alternative embodiment, the present invention also relates to the use of a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention to obtain a conjugate of the present invention. In a specific embodiment, the present invention also relates to the use of a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody of the present invention to prepare a diagnostic composition comprising a conjugate of the present invention.

[0119] Настоящее изобретение в целом описано выше. Конкретные примеры будут предоставлены в настоящем описании для справки, чтобы получить дополнительное понимание. Однако они приведены в иллюстративных целях и не ограничивают настоящее изобретение.[0119] The present invention has been generally described above. Specific examples will be provided in the present description for reference in order to gain further understanding. However, they are provided for illustrative purposes and do not limit the present invention.

ПРИМЕРЫEXAMPLES

[0120] (Пример 1: Получение Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека)[0120] (Example 1: Obtaining a Fab fragment of an anti-human CEACAM5 antibody)

Антитело, имеющее вариабельные области, которые, как ожидается, не будут ослаблять аффинность, даже при связывании меченого фрагмента, было сконструировано с использованием молекулярной модели гуманизированного антитела, сконструированного в соответствии с публикацией (Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics; 2014; 82: 1624-1635) после гуманизации мышиного антитела против CEACAM5 человека, T84.66, со ссылкой на метод, описанный в публикации (Protein Eng. Des. Sel.; 2004; 17: 481-489).An antibody having variable regions that are not expected to impair affinity, even when binding a labeled fragment, was constructed using a humanized antibody molecular model constructed according to a publication (Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics; 2014; 82: 1624-1635) after humanizing a mouse anti-human CEACAM5 antibody, T84.66, with reference to the method described in (Protein Eng. Des. Sel.; 2004; 17: 481-489).

[0121] Ген, кодирующий сигнальную последовательность (Protein Engineering; 1987; 1: 499-505), и ген Fab-области Igγ1 человека (состоящий из нуклеотидной последовательности, соответствующей положениям нуклеотидов 364-678 SEQ ID NO: 1) были связаны с 5'-областью и 3'-областью, соответственно, гена вариабельной области тяжелой цепи антитела, и этот ген фрагмента тяжелой цепи был вставлен в вектор GS pEE6.4 (Lonza Group AG). Кроме того, ген, кодирующий сигнальную последовательность и ген константной области Igκ человека (состоящий из нуклеотидной последовательности, соответствующей положениям нуклеотидов 337- 657 SEQ ID NO: 3), были связаны с 5'-областью и 3'-областью, соответственно, гена вариабельной области легкой цепи антитела, и этот ген легкой цепи был вставлен в GS-вектор pEE12.4 (Lonza Group AG). Вышеупомянутые векторы pEE, соответственно, содержащие вставки фрагмента тяжелой цепи и гена легкой цепи антитела, расщепляли рестриктазами NotI и PvuI и лигировали с использованием набора для лигирования TAKARA Ligation Kit Ver 2.1 (Takara Bio Inc.) для конструирования вектора GS, содержащего обе вставки гена фрагмента тяжелой цепи и гена легкой цепи.[0121] A gene encoding a signal sequence (Protein Engineering; 1987; 1: 499-505) and a human Igγ1 Fab region gene (consisting of a nucleotide sequence corresponding to nucleotide positions 364-678 of SEQ ID NO: 1) were linked to 5 '-region and 3'-region, respectively, of the antibody heavy chain variable region gene, and this heavy chain fragment gene was inserted into the pEE6.4 GS vector (Lonza Group AG). In addition, the gene encoding the signal sequence and the human Igκ constant region gene (consisting of the nucleotide sequence corresponding to nucleotide positions 337-657 of SEQ ID NO: 3) were linked to the 5'-region and 3'-region, respectively, of the variable antibody light chain region, and this light chain gene was inserted into the pEE12.4 GS vector (Lonza Group AG). The above pEE vectors, respectively, containing the antibody heavy chain fragment and light chain gene inserts were digested with NotI and PvuI and ligated using the TAKARA Ligation Kit Ver 2.1 (Takara Bio Inc.) to construct a GS vector containing both fragment gene inserts. heavy chain and light chain gene.

[0122] Антитело экспрессировали двумя типами способов, с помощью транзиторной экспрессии и конститутивной экспрессии, используя вышеупомянутый GS-вектор, содержащий обе вставки гена фрагмента тяжелой цепи и гена легкой цепи. Для транзиторной экспрессии клетки Expi293F (Thermo Fisher Scientific Inc.), культивированные до приблизительно 3000000 клеток/мл в среде экспрессии Expi293 (Thermo Fisher ScientificInc.), трансфецировали вышеупомянутым вектором GS, содержащим обе вставки гена фрагмента тяжелой цепи и гена легкой цепи с использованием набора для трансфекции ExpiFectamine 293 (Thermo Fisher Scientific Inc.) и культивировали в течение 5-7 дней. Культуральный супернатант очищали с использованием KappaSelect (GE Healthcare Japan Corp.) для получения Fab-фрагмента. Для конститутивной экспрессии клетки CHOK1SV (Lonza Group AG) трансфецировали линейным вектором, полученным с использованием PvuI из вышеупомянутого GS-вектора, содержащего обе вставки гена фрагмента тяжелой цепи и гена легкой цепи, путем электропорации с использованием Gene Pulser (Bio-Rad Laboratories Inc.). На следующий день после трансфекции добавляли метионинсульфоксимин с последующим культивированием в течение 5-7 дней. Клетки инокулировали в полутвердую среду, содержащую метилцеллюлозу. После образования колонии клетки, имеющие высокий уровень экспрессии Fab-фрагмента, получали с использованием ClonePix FL (Molecular Devices, LLC). Культуральный супернатант клеток очищали с использованием Capto L (GE Healthcare Japan Corp.), Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare Japan Corp.) и BioPro S75 (YMC Co., Ltd.) для получения Fab-фрагмента.[0122] The antibody was expressed in two types of ways, transient expression and constitutive expression, using the aforementioned GS vector containing both heavy chain fragment gene and light chain gene inserts. For transient expression, Expi293F cells (Thermo Fisher Scientific Inc.) cultured to approximately 3,000,000 cells/mL in Expi293 expression medium (Thermo Fisher ScientificInc.) were transfected with the aforementioned GS vector containing both heavy chain fragment gene and light chain gene inserts using the kit for transfection with ExpiFectamine 293 (Thermo Fisher Scientific Inc.) and cultured for 5-7 days. The culture supernatant was purified using KappaSelect (GE Healthcare Japan Corp.) to obtain a Fab fragment. For constitutive expression, CHOK1SV cells (Lonza Group AG) were transfected with a linear PvuI-derived vector from the aforementioned GS vector containing both heavy chain fragment and light chain gene inserts by electroporation using a Gene Pulser (Bio-Rad Laboratories Inc.) . The next day after transfection, methionine sulfoximine was added, followed by cultivation for 5-7 days. Cells were inoculated into a semi-solid medium containing methylcellulose. After colony formation, cells having a high level of Fab expression were obtained using ClonePix FL (Molecular Devices, LLC). The cell culture supernatant was purified using Capto L (GE Healthcare Japan Corp.), Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare Japan Corp.) and BioPro S75 (YMC Co., Ltd.) to obtain a Fab fragment.

[0123] Нуклеотидная последовательность, кодирующая фрагмент тяжелой цепи приготовленного Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека (обозначенный как PB009-01), представлена в SEQ ID NO: 1, а кодированная аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 2. Нуклеотидная последовательность, кодирующая легкую цепь PB009-01, представлена в SEQ ID NO: 3, а аминокислотная последовательность, кодированная таким образом, представлена в SEQ ID NO: 4. Вариабельная область тяжелой цепи PB009-01 состоит из аминокислотной последовательности, соответствующей положениям аминокислот 1-121 SEQ ID NO: 2, а CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи состоят из аминокислотных последовательностей, соответствующих положениям аминокислот 31-35, 50-66 и 99-110, соответственно, SEQ ID NO: 2. Вариабельная область легкой цепи PB009-01 состоит из аминокислотной последовательности, соответствующей положениям аминокислот 1-112 SEQ ID NO: 4, а CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи состоят из аминокислотных последовательностей, соответствующей положениям аминокислот 24-38, 54-60 и 93-101, соответственно, SEQ ID NO: 4.[0123] The nucleotide sequence encoding the heavy chain fragment of the prepared anti-human CEACAM5 Fab fragment (designated as PB009-01) is shown in SEQ ID NO: 1, and the encoded amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2. Nucleotide sequence encoding light chain PB009-01 is shown in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence thus encoded is shown in SEQ ID NO: 4. The heavy chain variable region of PB009-01 consists of the amino acid sequence corresponding to amino acid positions 1-121 of SEQ ID NO: 2, and the heavy chain CDR1, CDR2, and CDR3 consist of amino acid sequences corresponding to amino acid positions 31-35, 50-66, and 99-110, respectively, SEQ ID NO: 2. The PB009-01 light chain variable region consists of the amino acid sequence corresponding to amino acid positions 1-112 of SEQ ID NO: 4, and light chain CDR1, CDR2 and CDR3 are composed of amino acid sequences spines corresponding to amino acid positions 24-38, 54-60 and 93-101, respectively, SEQ ID NO: 4.

[0124] Вариабельные области и последовательности CDR определяли в соответствии с нумерацией Kabat (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda).[0124] Variable regions and CDR sequences were determined according to Kabat numbering (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda).

[0125] (Пример 2: Получение конъюгата Fab-фрагмента)[0125] (Example 2: Preparation of a Fab Fragment Conjugate)

p-SCN-Bn-DFO (DFO, замещенный п-изотиоцианофениламинотиокарбонильной группой) (Macrocyclics, Inc.) использовали для связывания хелатирующего агента DFO с Fab-фрагментом PB009-01. 1/5 количества 0,1 М раствора карбоната натрия (рН 9,0) добавляли к раствору Fab-фрагмента, доведенному до 1 мг/мл с помощью фосфатно-буферного солевого раствора (рН 7,4). Туда добавляли p-SCN-Bn-DFO в конечной концентрации 1 мг/мл и проводили реакцию при 37 °С в течение 1,5 часов. После реакции Fab-фрагмент, связанный с DFO через линкер (-C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-) (обозначенный как PB009-02), очищали с использованием Amicon Ultra 3K-0,5 мл центрифужного фильтра (Merck Millipore).p-SCN-Bn-DFO (DFO substituted with a p-isothiocyanophenylaminothiocarbonyl group) (Macrocyclics, Inc.) was used to couple the chelating agent DFO to the Fab fragment of PB009-01. 1/5 of a 0.1 M sodium carbonate solution (pH 9.0) was added to a solution of the Fab fragment adjusted to 1 mg/ml with phosphate buffered saline (pH 7.4). p-SCN-Bn-DFO was added thereto at a final concentration of 1 mg/ml, and the reaction was carried out at 37°C for 1.5 hours. After the reaction, the Fab fragment linked to DFO via a linker (-C(=S)-NH-(1,4-phenylene)-NH-C(=S)-) (designated as PB009-02) was purified using Amicon Ultra 3K-0.5 ml centrifuge filter (Merck Millipore).

[0126] Количество лигандов, образованных DFO, связанным с PB009-02, было подтверждено масс-спектрометрией. PB009-02 обессоливали, используя колонку микрообессоливания MassPREP (Waters Corp.), и измерения проводили с использованием масс-спектрометра SYNAPT G2 (Waters Corp.). В результате была подтверждена молекула, в которой по меньшей мере от 3 до 10 лигандов, образованных DFO, были связаны с одним PB009-01.[0126] The number of ligands formed by DFO associated with PB009-02 was confirmed by mass spectrometry. PB009-02 was desalted using a MassPREP microdesalting column (Waters Corp.) and measured using a SYNAPT G2 mass spectrometer (Waters Corp.). As a result, a molecule was confirmed in which at least 3 to 10 DFO-formed ligands were bound to one PB009-01.

[0127] (Пример 3: Оценка активности связывания)[0127] (Example 3: Evaluation of Binding Activity)

Для того чтобы измерить детальную активность связывания PB009-02, анализ проводили с помощью SPR. В этом примере Fab-фрагмент M5A (обозначаемый как M5A-Fab), гуманизированного антитела T84.66, использовали в качестве сравнительного Fab-фрагмента. M5A-Fab, связанный с DFO через линкер (называемый M5A-Fab-DFO), получали с использованием способа, описанного в Примере 2.In order to measure the detailed binding activity of PB009-02, the analysis was performed using SPR. In this example, the M5A Fab fragment (referred to as M5A-Fab) of the humanized T84.66 antibody was used as a comparative Fab fragment. M5A-Fab linked to DFO via a linker (called M5A-Fab-DFO) was prepared using the method described in Example 2.

[0128] Анализ методом SPR проводился с использованием Biacore T200 (GE Healthcare Japan Corp.). 10 мкг/мл человеческого CEACAM5 (R & D Systems, Inc.), биотинилированного с помощью набора Biotin CAPture, серии S (GE Healthcare Japan Corp.) и набора-NH₂ для мечения биотином (Dojindo Laboratories), добавляли к поверхности сенсорного чипа со скоростю потока 5 мкл/мин в течение 2 минут и иммобилизовали на нем. PB009-01, PB009-02, M5A-Fab и M5A-Fab-DFO разбавляли раствором HBS-EP+ (GE Healthcare Japan Corp.) последовательно 6 раз в 2-кратном соотношении от 400 нМ и добавляли по 100 мкл каждого в канал при скорости потока 50 мкл/мин. В этой системе измерения константа диссоциации (KD) PB009-01, PB009-02, M5A-Fab или M5A-Fab-DFO для CEACAM5 человека была рассчитана с использованием программного обеспечения для анализа данных (BIA Evaluation, GE Healthcare Japan Corp.). В результате, как показано в таблице, приведенной ниже, активность связывания M5A-Fab была ослаблена связыванием DFO, тогда как активность связывания PB009-01 не ослаблялась связыванием DFO.[0128] SPR analysis was performed using Biacore T200 (GE Healthcare Japan Corp.). 10 µg/mL human CEACAM5 (R&D Systems, Inc.) biotinylated with the Biotin CAPture kit, S series (GE Healthcare Japan Corp.) and biotin labeling-NH ₂ kit (Dojindo Laboratories) was added to the surface of the sensor chip with a flow rate of 5 μl/min for 2 minutes and immobilized on it. PB009-01, PB009-02, M5A-Fab and M5A-Fab-DFO were diluted with HBS-EP+ (GE Healthcare Japan Corp.) solution 6 times sequentially at 2x 400 nM and 100 µl of each was added to the channel at a speed flow 50 µl/min. In this measurement system, the dissociation constant (KD) of PB009-01, PB009-02, M5A-Fab, or M5A-Fab-DFO for human CEACAM5 was calculated using data analysis software (BIA Evaluation, GE Healthcare Japan Corp.). As a result, as shown in the table below, M5A-Fab binding activity was attenuated by DFO binding, while PB009-01 binding activity was not attenuated by DFO binding.

[0129][0129]

[Таблица 1][Table 1]

Fab fab KD (M) KD(M) Fab, связанный с DFOFab associated with DFO KD (M) KD(M) PB009-01 PB009-01 1.7E-10 1.7E-10 PB009-02 PB009-02 6.1E-10 6.1E-10 M5A-Fab M5A-Fab 1.6E-101.6E-10 M5A-Fab-DFO M5A-Fab-DFO 9.6E-09 9.6E-09

[0130] (Пример 4: Мечение ⁸⁹Zr конъюгата Fab-фрагмента, связанного с DFO) [0130] (Example 4: ⁸⁹ Zr labeling of DFO-related Fab fragment conjugate)

⁸⁹Zr был приобретен как Zr-оксалат у 3D Imaging LLC. 20 мкл Zr-оксалата (2,6 мКи) нейтрализовали 10 мкл 2 М карбоната натрия. Затем к нему добавляли 20 мкл 5 мг/мл гентизиновой кислоты. Кроме того, туда добавляли 110 мкл 20 мМ HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты), содержащей 0,05% полисорбата 80. К нему добавляли 40 мкл 10 мг/мл PB009-02 и оставляли реакцию при комнатной температуре в течение 30 минут, а затем дополнительно подвергали реакции при 37°C в течение 30 минут. После реакции PB009-02, меченный ⁸⁹Zr (обозначенный как PB009-03), очищали с использованием центрифужного фильтра Amicon Ultra 10K-0,5 мл (Merck Millipore). ⁸⁹ Zr was purchased as Zr-oxalate from 3D Imaging LLC. 20 µl of Zr-oxalate (2.6 mCi) was neutralized with 10 µl of 2 M sodium carbonate. Then, 20 μl of 5 mg/ml gentisic acid was added thereto. In addition, 110 µl of 20 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) containing 0.05% polysorbate 80 was added thereto. temperature for 30 minutes, and then further subjected to reaction at 37°C for 30 minutes. After the reaction, PB009-02 labeled with ⁸⁹ Zr (designated as PB009-03) was purified using an Amicon Ultra 10K-0.5 ml centrifuge filter (Merck Millipore).

[0131] (Пример 5: Контрастная оценка конъюгата в модели подкожного ксенотрансплантата)[0131] (Example 5: Conjugate Contrast Evaluation in a Subcutaneous Xenograft Model)

1х10⁶ клеток клеточной линии колоректального рака человека LS174T (ATCC®; CL-188) были подкожно ксенотрансплантированы в виде клеток, положительных по CEACAM5 человека, в правое плечо иммунодефицитной мыши (мышь NOG; Taconic Biosciences), и 5х10⁶ клеток клеточной линии колоректального рака человека HCT-15 (ATCC®; CCL-225) подкожно ксенотрансплантировали как клетки, отрицательные по CEACAM5 человека, в левое плечо. Этот пример был выполнен при N=3. После того, как объем опухоли достигал приблизительно 300 мм³, внутривенно вводили PB009-03 (приблизительно 20 мкг, приблизительно 120 мкКи). Фотографии были сделаны с помощью ПЭТ через 4 часа, 24 часа и 48 часов после введения PB009-03, и был измерен SUV-Max участка опухоли. В результате, как показано на Фиг.1А, было показано, что PB009-03 накапливается в клетках LS174T (клетки, положительные по CEACAM5 человека) больше, чем в клетках HCT-15 (клетки, отрицательные по CEACAM5 человека) через 4 часа после введения. Как показано на Фиг. 1B, было обнаружено, что PB009-03 позволяет детектировать опухолевые клетки, положительные по CEACAM5 человека, через 4 часа и 48 часов после введения.1 x 10 ⁶ cells of the human colorectal cancer cell line LS174T (ATCC®; CL-188) were xenografted subcutaneously as human CEACAM5 positive cells into the right arm of an immunodeficient mouse (NOG mouse; Taconic Biosciences), and 5 x ^{10 6} cells of the colorectal cancer cell line human HCT-15 (ATCC®; CCL-225) were xenografted subcutaneously as human CEACAM5 negative cells into the left shoulder. This example was run with N=3. After the tumor volume reached approximately 300 mm ³ , PB009-03 was administered intravenously (approximately 20 μg, approximately 120 μCi). Photographs were taken with PET at 4 hours, 24 hours and 48 hours after PB009-03 injection, and the SUV-Max of the tumor site was measured. As a result, as shown in FIG. 1A, PB009-03 was shown to accumulate in LS174T cells (human CEACAM5 positive cells) more than in HCT-15 cells (human CEACAM5 negative cells) 4 hours after injection. . As shown in FIG. 1B, PB009-03 was found to allow detection of human CEACAM5 positive tumor cells at 4 hours and 48 hours after administration.

[0132] (Пример 6: Контрастная оценка конъюгата в модели трансплантации в печень)[0132] (Example 6: Conjugate Conjugate Contrast Evaluation in a Liver Transplant Model)

1х10⁶ клеток LS174T, экспрессирующих люциферазу, трансплантировали в печень иммунодефицитной мыши (мышь NSG; The Jackson Laboratory) под наркозом. Этот пример был выполнен при N=6. Приживление клеток в печени было подтверждено экспрессией люциферазы в качестве показателя с использованием системы визуализации IVIS (PerkinElmer, Inc.). Затем PB009-03 (приблизительно 14 мкг, приблизительно 100 мкКи), приготовленный таким же образом, как в Примере 4, вводили туда внутривенно. Фотографии были сделаны PET через 4 часа и 24 часа после введения PB009-03. SUV-Max печени и опухоли LS174T (которая относится к состоянию, когда трансплантированные клетки LS174T были трансплантированы в печень) измеряли для расчета отношения SUV-Max опухоли к SUV-Max печени. В результате, как показано на Фиг.2А, показано, что PB009-03 накапливается в опухоли LS174T, трансплантированной в печень, через 4 часа после введения. Соотношения сигнала опухоль-печень через 4 часа и 24 часа после введения соответствовали значениям, представленным на Фиг. 2B. На их основе было обнаружено, что PB009-03 позволяет детектировать опухолевые клетки, положительные по CEACAM5 человека, присутствующие в печени через 4 часа и 24 часа после введения.1x10 ⁶ luciferase-expressing LS174T cells were transplanted into the liver of an immunodeficient mouse (NSG mouse; The Jackson Laboratory) under anesthesia. This example was run with N=6. Cell engraftment in the liver was confirmed by luciferase expression as an index using the IVIS imaging system (PerkinElmer, Inc.). Then, PB009-03 (approximately 14 μg, approximately 100 μCi) prepared in the same manner as in Example 4 was intravenously administered there. Photographs were taken by PET 4 hours and 24 hours after PB009-03 administration. Liver SUV-Max and LS174T tumor (which refers to the state when transplanted LS174T cells were transplanted into the liver) were measured to calculate the ratio of tumor SUV-Max to liver SUV-Max. As a result, as shown in FIG. 2A, PB009-03 was shown to accumulate in the liver transplanted LS174T tumor 4 hours after administration. Tumor-liver signal ratios at 4 hours and 24 hours after administration corresponded to the values shown in FIG. 2b. Based on these, it was found that PB009-03 allows detection of human CEACAM5 positive tumor cells present in the liver 4 hours and 24 hours after administration.

ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬINDUSTRIAL APPLICABILITY

[0133] Ожидается, что Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека по настоящему изобретению и конъюгат, содержащий Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, будут полезны для диагностики злокачественного новообразования, выбранного из группы, состоящей из колоректального рака, рака молочной железы, рака легкого, рака щитовидной железы и рака, возникающего в результате метастазирования этих злокачественных новообразований.[0133] An anti-human CEACAM5 antibody Fab of the present invention and a conjugate containing an anti-human CEACAM5 antibody Fab are expected to be useful in diagnosing a cancer selected from the group consisting of colorectal cancer, breast cancer, lung cancer , thyroid cancer, and cancer resulting from metastasis of these malignancies.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В СВОБОДНОЙ ФОРМЕFREE FORM SEQUENCE LIST

[0134] Числовой субтитр <223> в приведенном ниже списке последовательностей будет описывать «Искусственную последовательность». В частности, нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO: 1 и 3 в списке последовательностей, представляют собой нуклеотидные последовательности фрагмента тяжелой цепи и легкой цепи, соответственно, PB009-01. Аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 2 и 4, представляют собой аминокислотные последовательности фрагмента тяжелой цепи и легкой цепи, кодируемые SEQ ID NO: 1 и 3, соответственно.[0134] The numeric subtitle <223> in the sequence listing below will describe "Artificial Sequence". In particular, the nucleotide sequences shown by SEQ ID NO: 1 and 3 in the sequence listing are the nucleotide sequences of the heavy chain fragment and the light chain fragment, respectively, of PB009-01. The amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2 and 4 are the heavy chain and light chain fragment amino acid sequences encoded by SEQ ID NOs: 1 and 3, respectively.

--->--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ SEQUENCE LIST

<110> Астеллас Фарма Инк.<110> Astellas Pharma Inc.

<120> НОВЫЙ FAB-ФРАГМЕНТ АНТИТЕЛА ПРОТИВ CEACAM5 ЧЕЛОВЕКА <120> NEW FAB-FRAGMENT OF ANTIBODY AGAINST HUMAN CEACAM5

<130> A18007A00<130> A18007A00

<150> JP 2017-133698<150> JP 2017-133698

<151> 2017-07-07<151> 2017-07-07

<160> 4 <160> 4

<170> PatentIn version 3.5<170>PatentIn version 3.5

<210> 1<210> 1

<211> 678<211> 678

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> ДНК, кодирующая тяжелую цепь Fab PB009-01 <223> DNA encoding the heavy chain of Fab PB009-01

<220><220>

<221> Кодирующая последовательность<221> Coding sequence

<222> (1)..(678)<222> (1)..(678)

<400> 1<400> 1

gaa gtg cag ctg gtg gaa tct ggc ggc gga ctg gtg cag cct ggc gga 48gaa gtg cag ctg gtg gaa tct ggc ggc gga ctg gtg cag cct ggc gga 48

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

tct ctg aga ctg agc tgt gcc gcc agc ggc ttc aac atc cgg gac acc 96tct ctg aga ctg agc tgt gcc gcc agc ggc ttc aac atc cgg gac acc 96

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Arg Asp Thr Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Arg Asp Thr

20 25 30 20 25 30

tac atg cac tgg gtg cgc cag gcc cct ggc aag gga ctg gaa tgg gtg 144tac atg cac tgg gtg cgc cag gcc cct ggc aag gga ctg gaa tgg gtg 144

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45 35 40 45

gcc aga atc gac ccc gcc aac ggc aac agc aga tac gtg ccc aag ttc 192gcc aga atc gac ccc gcc aac ggc aac agc aga tac gtg ccc aag ttc 192

Ala Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Arg Tyr Val Pro Lys Phe Ala Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Arg Tyr Val Pro Lys Phe

50 55 60 50 55 60

cag ggc cgg ttc acc atc agc gcc gac acc agc aga aac acc gcc tac 240cag ggc cgg ttc acc atc agc gcc gac acc agc aga aac acc gcc tac 240

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Arg Asn Thr Ala Tyr Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Arg Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80 65 70 75 80

ctg cag atg aac agc ctg cgg gcc gag gac acc gcc gtg tac tac tgt 288ctg cag atg aac agc ctg cgg gcc gag gac acc gcc gtg tac tac tgt 288

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

gcc ccc ttc ggc tac tac gtg tcc gac tac gcc atg gcc tat tgg ggc 336gcc ccc ttc ggc tac tac gtg tcc gac tac gcc atg gcc tat tgg ggc 336

Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly

100 105 110 100 105 110

cag ggc acc ctc gtg aca gtg tcc tca gcc tcc acc aag ggc cca tcg 384cag ggc acc ctc gtg aca gtg tcc tca gcc tcc acc aag ggc cca tcg 384

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125 115 120 125

gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg 432gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg 432

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140 130 135 140

gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg 480gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg 480

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160 145 150 155 160

tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct 528tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct 528

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175 165 170 175

gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctt agt agc gtg gtg acc gtg 576gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctt agt agc gtg gtg acc gtg 576

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190 180 185 190

ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac 624ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac 624

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205 195 200 205

aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt 672aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt 672

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220 210 215 220

gac tga 678gac-tga-678

Asp asp

225 225

<210> 2<210> 2

<211> 225<211> 225

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

<223> Синтетическая конструкция<223> Synthetic construction

<400> 2<400> 2

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160 145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Asp asp

225 225

<210> 3<210> 3

<211> 657<211> 657

<212> DNA<212> DNA

<220><220>

<223> ДНК, кодирующая легкую цепь антитела<223> DNA encoding an antibody light chain

<220><220>

<222> (1)..(657)<222> (1)..(657)

<400> 3<400> 3

gac atc cag ctg acc cag agc cct agc agc ctg tct gcc agc gtg ggc 48gac atc cag ctg acc cag agc cct agc agc ctg tct gcc agc gtg ggc 48

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

gac aga gtg acc atc acc tgt aga gcc ggc gag agc gtg gac atc ttc 96gac aga gtg acc atc acc tgt aga gcc ggc gag agc gtg gac atc ttc 96

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe

20 25 30 20 25 30

ggc gtg gga ttt ctg cac tgg tat cag cag aag ccc ggc aag gcc ccc 144ggc gtg gga ttt ctg cac tgg tat cag cag aag ccc ggc aag gcc ccc 144

Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45 35 40 45

aag ctg ctg atc tac aga gcc agc aac ctg gaa agc ggc atc ccc agc 192aag ctg ctg atc tac aga gcc agc aac ctg gaa agc ggc atc ccc agc 192

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ser Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ser

50 55 60 50 55 60

aga ttc agc ggc agc ggc tcc aga acc gac ttc acc ctg acc atc agc 240aga ttc agc ggc agc ggc tcc aga acc gac ttc acc ctg acc atc agc 240

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80 65 70 75 80

agc ctg cag ccc gag gac ttc gcc acc tac tac tgc cag cag acc aac 288agc ctg cag ccc gag gac ttc gcc acc tac tac tgc cag cag acc aac 288

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn

85 90 95 85 90 95

gag gac ccc tac acc ttt ggc cag ggc acc aag gtg gaa atc aag cgt 336gag gac ccc tac acc ttt ggc cag ggc acc aag gtg gaa atc aag cgt 336

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110 100 105 110

acg gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag 384acg gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag 384

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125 115 120 125

ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat 432ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat 432

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140 130 135 140

ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg 480ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg 480

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160 145 150 155 160

ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc 528ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc 528

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175 165 170 175

tac agc ctg agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa 576tac agc ctg agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa 576

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190 180 185 190

cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc 624cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc 624

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205 195 200 205

gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tag 657gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tag 657

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 210 215

<210> 4<210> 4

<211> 218<211> 218

<212> Белок<212> Protein

<220><220>

<400> 4<400> 4

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160 145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 210 215

<---<---

Claims

1. Fab-фрагмент анти-CEACAM5 антитела человека, выбранный из группы, состоящей из следующих (а) и (b):1. Fab fragment of a human anti-CEACAM5 antibody selected from the group consisting of the following (a) and (b):

(a) Fab-фрагмент анти-CEACAM5 антитела человека, содержащий(a) Fab fragment of a human anti-CEACAM5 antibody containing

фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей положениям аминокислот 1-121 SEQ ID NO: 2, иa heavy chain fragment comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence corresponding to amino acid positions 1-121 of SEQ ID NO: 2, and

легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей положениям аминокислот 1-112 SEQ ID NO: 4; иa light chain comprising a light chain variable region consisting of an amino acid sequence corresponding to amino acid positions 1-112 of SEQ ID NO: 4; and

(b) Fab-фрагмент анти-CEACAM5 антитела человека, содержащий(b) Fab fragment of a human anti-CEACAM5 antibody containing

фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, полученную из вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, соответствующей положениям аминокислот 1-121 SEQ ID NO: 2, посредством модификации глутаминовой кислоты в положении аминокислоты 1 SEQ ID NO: 2 в пироглутаминовую кислоту, иa heavy chain fragment containing a heavy chain variable region derived from a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence corresponding to amino acid positions 1-121 of SEQ ID NO: 2 by modifying glutamic acid at amino acid position 1 of SEQ ID NO: 2 to pyroglutamic acid , and

легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей положениям аминокислот 1-112 SEQ ID NO: 4.a light chain containing a light chain variable region consisting of an amino acid sequence corresponding to amino acid positions 1-112 of SEQ ID NO: 4.

2. Fab-фрагмент анти-CEACAM5 антитела человека по п.1, выбранный из группы, состоящей из следующих (а) и (b):2. A Fab fragment of an anti-CEACAM5 human antibody according to claim 1, selected from the group consisting of the following (a) and (b):

фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, иa heavy chain fragment consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and

легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4; иa light chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; and

фрагмент тяжелой цепи, полученный из фрагмента тяжелой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, путем модификации глутаминовой кислоты в положении аминокислоты 1 SEQ ID NO: 2 в пироглутаминовую кислоту, иa heavy chain fragment derived from a heavy chain fragment consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 by modifying the glutamic acid at amino acid position 1 of SEQ ID NO: 2 to pyroglutamic acid, and

легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4.a light chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.

3. Fab-фрагмент анти-CEACAM5 антитела человека по п. 2, содержащий фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4.3. A Fab fragment of an anti-CEACAM5 human antibody according to claim 2, containing a heavy chain fragment consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a light chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.

4. Конъюгат для детекции CEACAM-5 человека, содержащий меченый фрагмент и Fab-фрагмент анти-CEACAM5 антитела человека по любому из пп. 1-3,4. A conjugate for the detection of human CEACAM-5 containing a labeled fragment and a Fab fragment of an anti-CEACAM5 human antibody according to any one of paragraphs. 1-3,

где меченый фрагмент представляет собойwhere the labeled fragment is

(i) лиганд и линкер или(i) a ligand and a linker, or

(ii) лиганд, где лиганд представляет собой группу, состоящую из хелатирующего агента.(ii) a ligand, where the ligand is a group consisting of a chelating agent.

5. Конъюгат по п. 4, где хелатирующий агент представляет собой сидерофор или не сидерофор.5. The conjugate of claim 4 wherein the chelating agent is a siderophore or a non-siderophore.

6. Конъюгат по п. 4, где хелатирующий агент представляет собой DFO, DTPA или DOTA.6. The conjugate of claim 4 wherein the chelating agent is DFO, DTPA or DOTA.

7. Конъюгат по п. 4, где лиганд представляет собой лиганд, представленный следующей формулой (А):7. The conjugate of claim 4, wherein the ligand is a ligand represented by the following formula (A):

[Химическая формула 1][Chemical formula 1]

(A),

(A)

где волнистая линия представляет собой связывание с Fab-фрагментом анти-CEACAM5 антитела человека или с линкером.where the wavy line represents binding to the Fab fragment of a human anti-CEACAM5 antibody or to a linker.

8. Конъюгат по п. 4, где меченый фрагмент представляет собой (i) лиганд и линкер,8. The conjugate according to claim 4, where the labeled fragment is (i) a ligand and a linker,

где лиганд и линкер представляют собой группу, представленную следующей формулой (A’):where the ligand and the linker are a group represented by the following formula (A'):

[Химическая Формула 2][Chemical Formula 2]

(A’),

(A'),

где волнистая линия представляет собой связывание с Fab-фрагментом анти-CEACAM5 антитела человека.where the wavy line represents binding to the Fab fragment of a human anti-CEACAM5 antibody.

9. Конъюгат по п. 8, где Fab-фрагмент анти-CEACAM5 антитела человека связан с атомом углерода концевой C(=S)-группы меченого фрагмента через аминогруппу в Fab-фрагменте.9. The conjugate of claim 8, wherein the Fab fragment of the anti-CEACAM5 human antibody is linked to the carbon atom of the terminal C(=S) group of the labeled fragment via an amino group in the Fab fragment.

10. Конъюгат по п. 4, представленный следующей формулой (I):10. The conjugate according to claim 4, represented by the following formula (I):

(L-X)_p-Ab (I),(LX) _p -Ab(I),

где Ab представляет собой Fab-фрагмент анти-CEACAM5 антитела человека;where Ab is a Fab fragment of a human anti-CEACAM5 antibody;

L представляет собой лиганд;L is a ligand;

11. Конъюгат по п. 10, где L представляет собой лиганд, представленный следующей формулой (А):11. The conjugate of claim 10, wherein L is a ligand represented by the following formula (A):

[Химическая Формула 3][Chemical Formula 3]

(A),

(A)

где волнистая линия представляет собой связывание с Х (или Ab, если Х представляет собой связь).where the wavy line represents the binding to X (or Ab if X is a bond).

12. Конъюгат по п. 8 или 11, представленный следующей формулой (II):12. The conjugate according to claim 8 or 11, represented by the following formula (II):

[Химическая Формула 4][Chemical Formula 4]

(II),

(II)

где Ab представляет собой Fab-фрагмент анти-CEACAM5 антитела человека; иwhere Ab is a Fab fragment of a human anti-CEACAM5 antibody; and

р представляет собой натуральное число от 1 до 25,p is a natural number from 1 to 25,

где Ab связано с атомом углерода концевой C(=S)-группы меченого фрагмента через аминогруппу в Ab.where Ab is linked to the carbon atom of the terminal C(=S)-group of the labeled fragment through the amino group in Ab.

13. Конъюгат по любому из пп. 10-12, где р представляет собой натуральное число от 1 до 16.13. The conjugate according to any one of paragraphs. 10-12, where p is a natural number from 1 to 16.

14. Конъюгат по любому из пп. 10-12, р представляет собой натуральное число от 4 до 16.14. The conjugate according to any one of paragraphs. 10-12, p is a natural number from 4 to 16.

15. Конъюгат по любому из пп. 4-14, дополнительно содержащий металл.15. The conjugate according to any one of paragraphs. 4-14, additionally containing metal.

16. Конъюгат по п. 15, где металл представляет собой радиоизотоп металла.16. The conjugate of claim 15 wherein the metal is a radioisotope of a metal.

17. Конъюгат по п. 15, где металл представляет собой ⁸⁹Zr.17. The conjugate of claim 15 wherein the metal is ⁸⁹ Zr.

18. Конъюгат по п. 16 или 17 для применения в качестве ПЭТ-индикатора.18. Conjugate according to claim 16 or 17 for use as a PET indicator.

19. Полинуклеотид, содержащий19. Polynucleotide containing

нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента анти-CEACAM5 антитела человека (а) по п. 1; иa nucleotide sequence encoding the heavy chain fragment of the Fab fragment of the anti-CEACAM5 human antibody (a) according to claim 1; and

нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента анти-CEACAM5 антитела человека (а) по п. 1.a nucleotide sequence encoding the light chain of the Fab fragment of the anti-CEACAM5 human antibody (a) according to claim 1.

20. Полинуклеотид, содержащий20. Polynucleotide containing

нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента анти-CEACAM5 антитела человека по п. 3; иa nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment of the Fab fragment of an anti-CEACAM5 human antibody according to claim 3; and

нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента анти-CEACAM5 антитела человека по п. 3.a nucleotide sequence encoding the light chain of the Fab fragment of the anti-CEACAM5 human antibody according to claim 3.

21. Вектор экспрессии, включающий следующие (а) и (b):21. An expression vector comprising the following (a) and (b):

(а) полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента анти-CEACAM5 антитела человека (а) по п. 1; и(a) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment of a Fab fragment of an anti-CEACAM5 human antibody (a) according to claim 1; and

(b) полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента анти-CEACAM5 антитела человека (а) по п.1.(b) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a light chain of a Fab fragment of an anti-CEACAM5 human antibody (a) according to claim 1.

22. Вектор экспрессии, включающий следующие (а) и (b):22. An expression vector comprising the following (a) and (b):

(а) полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента анти-CEACAM5 антитела человека по п. 3; и(a) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment of a Fab fragment of an anti-CEACAM5 human antibody according to claim 3; and

(b) полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента анти-CEACAM5 антитела человека по п. 3.(b) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a light chain of a Fab fragment of an anti-CEACAM5 human antibody according to claim 3.

23. Клетка-хозяин для получения Fab-фрагмента анти-CEACAM5 антитела человека, где клетка выбрана из группы, состоящей из (a)-(b):23. A host cell for obtaining a Fab fragment of an anti-CEACAM5 human antibody, wherein the cell is selected from the group consisting of (a)-(b):

(a) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим(a) a host cell transformed with an expression vector containing

полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента анти-CEACAM5 антитела человека (а) по п. 1, иa polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a Fab heavy chain fragment of an anti-CEACAM5 human antibody (a) according to claim 1, and

полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмент анти-CEACAM5 антитела человека (а) по п. 1; иa polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain Fab fragment of an anti-CEACAM5 human antibody (a) according to claim 1; and

(b) клетка-хозяин, трансформированная(b) host cell transformed

вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента анти-CEACAM5 антитела человека (а) по п.1, иan expression vector containing a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment of a Fab fragment of an anti-CEACAM5 human antibody (a) according to claim 1, and

вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента анти-CEACAM5 антитела человека (а) по п. 1.an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the light chain of the Fab fragment of the anti-CEACAM5 human antibody (a) according to claim 1.

24. Клетка-хозяин для получения Fab-фрагмента анти-CEACAM5 фрагмента человека, где клетка выбрана из группы, состоящей из (a)-(b):24. A host cell for obtaining a Fab fragment of a human anti-CEACAM5 fragment, wherein the cell is selected from the group consisting of (a)-(b):

полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента анти-CEACAM5 антитела человека по п. 3, иa polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a Fab heavy chain fragment of an anti-CEACAM5 human antibody according to claim 3, and

полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента анти-CEACAM5 антитела человека по п. 3; иa polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain Fab fragment of an anti-CEACAM5 human antibody according to claim 3; and

вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента анти-CEACAM5 антитела человека по п. 3, иan expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment of a Fab fragment of an anti-CEACAM5 human antibody according to claim 3, and

вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента анти-CEACAM5 антитела человека по п. 3.an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain of the Fab fragment of an anti-CEACAM5 human antibody according to claim 3.

25. Способ получения Fab-фрагмента анти-CEACAM5 антитела человека, включающий стадию культивирования клетки-хозяина, выбранной из группы, состоящей из следующих (a)-(c), для экспрессии Fab-фрагмента анти-CEACAM5 антитела человека:25. A method for producing a Fab fragment of an anti-CEACAM5 human antibody, comprising the step of culturing a host cell selected from the group consisting of the following (a) to (c), to express the Fab fragment of an anti-CEACAM5 human antibody:

(а) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим(a) a host cell transformed with an expression vector containing

полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента анти-CEACAM5 антитела человека (а) по п. 1;a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain of a Fab fragment of an anti-CEACAM5 human antibody (a) according to claim 1;

вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента анти-CEACAM5 антитела человека (а) по п. 1, иan expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment of the Fab fragment of the anti-CEACAM5 human antibody (a) according to claim 1, and

вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента анти-CEACAM5 антитела человека (а) по п. 1; и an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the light chain of the Fab fragment of the anti-CEACAM5 human antibody (a) according to claim 1; and

(c) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента анти-CEACAM5 антитела человека (а) по п. 1, и(c) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment of a Fab fragment of an anti-CEACAM5 human antibody (a) according to claim 1, and

клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента анти-CEACAM5 антитела человека (а) по п. 1.a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain of a Fab fragment of an anti-CEACAM5 human antibody (a) according to claim 1.

26. Способ получения Fab-фрагмента анти-CEACAM5 антитела человека, включающий стадию культивирования клетки-хозяина, выбранной из группы, состоящей из следующих (a)-(c), для экспрессии Fab-фрагмента анти-CEACAM5 антитела человека:26. A method for producing a Fab fragment of an anti-CEACAM5 human antibody, comprising the step of culturing a host cell selected from the group consisting of the following (a) to (c) to express the Fab fragment of an anti-CEACAM5 human antibody:

полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента анти-CEACAM5 антитела человека по п. 3;a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain Fab fragment of an anti-CEACAM5 human antibody according to claim 3;

вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента анти-CEACAM5 антитела человека по п.3; иan expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain of a Fab fragment of an anti-CEACAM5 human antibody according to claim 3; and

(c) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента анти-CEACAM5 антитела человека по п. 3, и(c) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a heavy chain fragment of a Fab fragment of an anti-CEACAM5 human antibody according to claim 3, and

клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента анти-CEACAM5 антитела человека по п. 3.a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain of a Fab fragment of an anti-CEACAM5 human antibody according to claim 3.

27. Способ получения конъюгата, содержащего меченый фрагмент, который представляет собой (i) лиганд и линкер или (ii) лиганд, где лиганд представляет собой группу, состоящую из хелатирующего агента, и Fab-фрагмент анти-CEACAM5 антитела человека, где способ включает стадии:27. A method for producing a conjugate containing a labeled fragment that is (i) a ligand and a linker or (ii) a ligand, where the ligand is a group consisting of a chelating agent and a Fab fragment of an anti-CEACAM5 human antibody, where the method includes the steps :

получения Fab-фрагмента анти-CEACAM5 антитела человека способом по п. 25 или 26; иobtaining a Fab fragment of an anti-CEACAM5 human antibody by the method of claim 25 or 26; and

ковалентного связывания Fab-фрагмента с меченым фрагментом.covalently linking the Fab fragment to the labeled fragment.

28. Способ получения конъюгата, содержащего лиганд, который представляет собой группу, состоящую из хелатирующего агента, и Fab-фрагмент анти-CEACAM5 антитела человека, где способ включает стадии:28. A method for producing a conjugate containing a ligand, which is a group consisting of a chelating agent, and a Fab fragment of an anti-CEACAM5 human antibody, where the method includes the steps:

ковалентное связывание Fab-фрагмента с лигандом через линкер или напрямую.covalent binding of the Fab fragment to the ligand via a linker or directly.

29. Способ получения конъюгата, содержащего меченый фрагмент, который представляет собой (i) лиганд и линкер или (ii) лиганд, где лиганд представляет собой группу, состоящую из хелатирующего агента, и мечен радиоактивным изотопом металла, и Fab-фрагмент анти-CEACAM5 антитела человека, где способ включает стадии:29. A method for producing a conjugate containing a labeled fragment that is (i) a ligand and a linker or (ii) a ligand, where the ligand is a group consisting of a chelating agent and is labeled with a radioactive metal isotope, and a Fab fragment of an anti-CEACAM5 antibody human, where the method includes the steps:

получения конъюгата, содержащего лиганд, который представляет собой группу, состоящую из хелатирующего агента, и Fab-фрагмент анти-CEACAM5 антитела человека, способом по п. 28; иobtaining a conjugate containing a ligand, which is a group consisting of a chelating agent, and a Fab fragment of a human anti-CEACAM5 antibody, by the method of claim 28; and

связывания радиоизотопа металла с лигандом конъюгата через координационную связь.binding of a metal radioisotope to a conjugate ligand through a coordination bond.

30. Композиция для диагностики колоректального рака, рака молочной железы, рака легкого, рака щитовидной железы или рака, возникающего в результате метастазирования этих злокачественных новообразований, где композиция содержит конъюгат по любому из пп. 15-18 и фармацевтически приемлемый носитель.30. Composition for the diagnosis of colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, thyroid cancer or cancer resulting from metastasis of these malignant neoplasms, where the composition contains a conjugate according to any one of paragraphs. 15-18 and a pharmaceutically acceptable carrier.

31. Композиция для диагностики по п. 30, которая представляет собой лекарственное средство для определения клинической стадии заболевания.31. The diagnostic composition according to claim 30, which is a drug for determining the clinical stage of the disease.

32. Композиция для диагностики по п. 30 или 31 для применения при диагностике колоректального рака или рака, возникающего в результате метастазирования колоректального рака.32. A diagnostic composition according to claim 30 or 31 for use in diagnosing colorectal cancer or cancer resulting from metastasis of colorectal cancer.

33. Композиция для диагностики по п. 32, где рак, возникающий в результате метастазирования колоректального рака, представляет собой метастатический рак печени.33. The diagnostic composition according to claim 32, wherein the cancer resulting from colorectal cancer metastasis is metastatic liver cancer.

34. Применение конъюгата по любому из пп. 15-18 для получения композиции для диагностики колоректального рака, рака молочной железы, рака легкого, рака щитовидной железы или рака, возникающего в результате метастазирования этих злокачественных новообразований.34. The use of the conjugate according to any one of paragraphs. 15-18 to obtain a composition for the diagnosis of colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, thyroid cancer or cancer resulting from metastasis of these malignant neoplasms.

35. Конъюгат по любому из пп. 15-18 для применения в диагностике колоректального рака, рака молочной железы, рака легкого, рака щитовидной железы или рака, возникающего в результате метастазирования этих злокачественных новообразований.35. The conjugate according to any one of paragraphs. 15-18 for use in diagnosing colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, thyroid cancer, or cancer resulting from metastasis of these malignancies.

36. Способ диагностики колоректального рака, рака молочной железы, рака легкого, рака щитовидной железы или рака, возникающего в результате метастазирования этих злокачественных новообразований, включающий введение пациенту конъюгата по любому из пп. 15-18.36. A method for diagnosing colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, thyroid cancer or cancer resulting from metastasis of these malignant neoplasms, comprising administering to the patient a conjugate according to any one of paragraphs. 15-18.