RU2778345C2 - Autonomous diagnostic microfluid platform with integrated magnetic microparticles for active mixing of reagents, equipped with one-sided valve system, controlled by operator by means of pressing on flexible membranes - Google Patents
Autonomous diagnostic microfluid platform with integrated magnetic microparticles for active mixing of reagents, equipped with one-sided valve system, controlled by operator by means of pressing on flexible membranes Download PDFInfo
- Publication number
- RU2778345C2 RU2778345C2 RU2021102563A RU2021102563A RU2778345C2 RU 2778345 C2 RU2778345 C2 RU 2778345C2 RU 2021102563 A RU2021102563 A RU 2021102563A RU 2021102563 A RU2021102563 A RU 2021102563A RU 2778345 C2 RU2778345 C2 RU 2778345C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- reaction chamber
- microfluidic
- chamber
- fluid
- sample
- Prior art date
Links
- 239000012528 membrane Substances 0.000 title claims abstract description 25
- 238000002156 mixing Methods 0.000 title claims description 31
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 24
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 title claims description 20
- 238000003825 pressing Methods 0.000 title claims description 8
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims abstract description 40
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 claims abstract description 22
- 244000052769 pathogens Species 0.000 claims abstract description 21
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 15
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 claims abstract description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 50
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N Iron(II,III) oxide Chemical compound O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 15
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 15
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 claims description 13
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 claims description 11
- 108010091307 Catalytic DNA Proteins 0.000 claims description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 9
- 229910052598 goethite Inorganic materials 0.000 claims description 9
- AEIXRCIKZIZYPM-UHFFFAOYSA-M hydroxy(oxo)iron Chemical compound [O][Fe]O AEIXRCIKZIZYPM-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- 229920001506 Deoxyribozyme Polymers 0.000 claims description 8
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 5
- 230000002934 lysing Effects 0.000 claims description 5
- 238000003795 desorption Methods 0.000 claims description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 3
- 210000002421 Cell Wall Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 claims 5
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 claims 2
- 230000005426 magnetic field effect Effects 0.000 claims 1
- 230000002277 temperature effect Effects 0.000 claims 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 22
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 abstract description 20
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 abstract description 11
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 abstract description 8
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 230000003287 optical Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 20
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 15
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 7
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 7
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 7
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 5
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 4
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 4
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 4
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 description 4
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 description 4
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 4
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 4
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- -1 polydimethylsiloxane Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 101710036216 ATEG_03556 Proteins 0.000 description 1
- 229920002287 Amplicon Polymers 0.000 description 1
- 229920002395 Aptamer Polymers 0.000 description 1
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000001736 Capillaries Anatomy 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 101700011961 DPOM Proteins 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 210000004051 Gastric Juice Anatomy 0.000 description 1
- 208000001786 Gonorrhea Diseases 0.000 description 1
- 206010018612 Gonorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 101710029649 MDV043 Proteins 0.000 description 1
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 1
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 1
- 229940052778 Neisseria meningitidis Drugs 0.000 description 1
- 101710003000 ORF1/ORF2 Proteins 0.000 description 1
- 101700061424 POLB Proteins 0.000 description 1
- 101700030467 Pol Proteins 0.000 description 1
- 101700019476 REV1 Proteins 0.000 description 1
- 101700054624 RF1 Proteins 0.000 description 1
- 235000003534 Saccharomyces carlsbergensis Nutrition 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 229940081969 Saccharomyces cerevisiae Drugs 0.000 description 1
- 210000003296 Saliva Anatomy 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010041925 Staphylococcal infection Diseases 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 229940076185 Staphylococcus aureus Drugs 0.000 description 1
- 210000002700 Urine Anatomy 0.000 description 1
- 208000001756 Virus Disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 238000004026 adhesive bonding Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogens Species 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 1
- 230000004790 biotic stress Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000003749 cleanliness Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 1
- 230000000249 desinfective Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000002032 lab-on-a-chip Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesions Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 239000000696 magnetic material Substances 0.000 description 1
- 230000005389 magnetism Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 201000009906 meningitis Diseases 0.000 description 1
- 238000006452 multicomponent reaction Methods 0.000 description 1
- 229910001172 neodymium magnet Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 101710004466 rgy Proteins 0.000 description 1
- 101710030364 rgy1 Proteins 0.000 description 1
- 101710030359 rgy2 Proteins 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000012258 stirred mixture Substances 0.000 description 1
- 238000004416 surface enhanced Raman spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Настоящее изобретение относится к области инженерных технологий в области медицины и пищевой промышленности. Разработанная микрофлюидная система может применяться в био-, пищевых и медицинских технологиях, в частности, для проведения быстрого ПЦР (полимеразная цепная реакция) анализа пробы или контроля качества пищевой продукции, а также клинических анализов проб пациента в амбулаторных условиях.The present invention relates to the field of engineering technologies in the field of medicine and food industry. The developed microfluidic system can be used in bio-, food and medical technologies, in particular, for fast PCR (polymerase chain reaction) sample analysis or food quality control, as well as clinical analyzes of patient samples on an outpatient basis.
На сегодняшний день для обнаружения патогенов используются различные методы, основанные на оптических и электрохимических принципах [Acharya N, et al. (2006) Complex formation with Rev1 enhances the proficiency of Saccharomyces cerevisiae DNA polymerase zeta for mismatch extension and for extension opposite from DNA lesions. Mol Cell Biol 26(24):9555-63], [Labib M, Zamay AS, Kolovskaya OS, Reshetneva IT, Zamay GS, Kibbee RJ, Sattar SA, Zamay TN, Berezovski MV. Aptamer-based viability impedimetric sensor for bacteria. Anal Chem. 2012 Nov 6;84(21):8966-9. doi: 10.1021/ac302902s. Epub 2012 Oct 22. PMID: 23075417.], [Pandey, Prachi, Vadivelmurugan Irulappan, Muthukumar V. Bagavathiannan, and Muthappa Senthil-Kumar. "Impact of Combined Abiotic and Biotic Stresses on Plant Growth and Avenues for Crop Improvement by Exploiting Physio-Morphological Traits." Frontiers in Plant Science 8, no. April (2017): 1-15. https://doi.org/10.3389/fpls.2017.00537].To date, various methods based on optical and electrochemical principles are used to detect pathogens [Acharya N, et al. (2006) Complex formation with Rev1 enhances the proficiency of Saccharomyces cerevisiae DNA polymerase zeta for mismatch extension and for extension opposite from DNA lesions. Mol Cell Biol 26(24):9555-63], [Labib M, Zamay AS, Kolovskaya OS, Reshetneva IT, Zamay GS, Kibbee RJ, Sattar SA, Zamay TN, Berezovski MV. Aptamer-based viability impedimetric sensor for bacteria. Anal Chem. 2012 Nov 6;84(21):8966-9. doi: 10.1021/ac302902s. Epub 2012 Oct 22. PMID: 23075417.], [Pandey, Prachi, Vadivelmurugan Irulappan, Muthukumar V. Bagavathiannan, and Muthappa Senthil-Kumar. "Impact of Combined Abiotic and Biotic Stresses on Plant Growth and Avenues for Crop Improvement by Exploiting Physio-Morphological Traits." Frontiers in Plant Science 8, no. April (2017): 1-15. https://doi.org/10.3389/fpls.2017.00537].
Стоит отдельно отметить такой метод детекции любых молекул и даже их следовых количеств в различных композициях, как поверхностно-усиленная Рамановская спектроскопия. Данный метод позволяет проводить детекцию молекул без использования дополнительных маркерных соединений. Кроме того, нет необходимости в проведении полимеразной реакции, тк используемые приборы позволяют детектировать очень низкие концентрации целевых молекул. Главным и существенным недостатком этого метода является длительность проведения анализа, дороговизна, сложность и крупногабаритность используемого оборудования, которое абсолютно исключает возможность использования этого метода для проведения портативного анализа.It is worth noting separately such a method for detecting any molecules and even their trace amounts in various compositions, such as surface-enhanced Raman spectroscopy. This method allows the detection of molecules without the use of additional marker compounds. In addition, there is no need to carry out a polymerase reaction, since the instruments used allow the detection of very low concentrations of target molecules. The main and significant disadvantage of this method is the duration of the analysis, the high cost, complexity and large size of the equipment used, which absolutely excludes the possibility of using this method for portable analysis.
ПЦР-диагностика является одним из наиболее широко применяемых методов и рутинным методом, используемым в клинической практике. Данный метод удобен тем, что для анализа требуется небольшой объем пробы и реагентов, а полученные результаты позволяют точно определить присутствие патогена. Однако высокая специфичность данного метода позволяет выявлять только ограниченное количество патогенов в пробе, т.е. метод отличается высокой точностью, но низкой универсальностью. Применение мультиплексной ПЦР частично решает проблему универсальности, однако требует сложного протокола проведения реакции. Дополнительно, метод ПЦР-диагностики имеет ряд ограничений, не позволяющих использовать ПЦР-диагностику более широко, например, в клиниках, расположенных на удаленных территориях или в передвижных лабораториях. К таким ограничениям относятся необходимость организации дорогостоящих и габаритных ПЦР-боксов, поддержание высокого класса биологической чистоты лабораторных помещений, а также безусловной высокой квалификации обслуживающего персонала. Эти требования связаны прежде всего с необходимостью предварительной пробоподготовки, трудоемкостью и времязатратностью проведения ПЦР-анализа генетического материала и сопряжены с дороговизной необходимого лабораторного оборудования. Для предотвращения заражения в лабораториях вводится особый режим работы и предписывается проведение регулярной дезинфекции помещений и оборудования.PCR diagnostics is one of the most widely used methods and a routine method used in clinical practice. This method is convenient because the analysis requires a small amount of sample and reagents, and the results obtained allow you to accurately determine the presence of the pathogen. However, the high specificity of this method makes it possible to detect only a limited number of pathogens in a sample; The method is characterized by high accuracy, but low universality. The use of multiplex PCR partially solves the problem of universality, but requires a complex reaction protocol. Additionally, the PCR diagnostic method has a number of limitations that do not allow the use of PCR diagnostics more widely, for example, in clinics located in remote areas or in mobile laboratories. Such limitations include the need to organize expensive and bulky PCR boxes, maintain a high class of biological cleanliness of laboratory facilities, as well as the unconditional high qualification of service personnel. These requirements are associated primarily with the need for preliminary sample preparation, the laboriousness and time-consuming PCR analysis of genetic material, and are associated with the high cost of the necessary laboratory equipment. To prevent infection in laboratories, a special mode of operation is introduced and regular disinfection of premises and equipment is prescribed.
В настоящее время существуют решения по автоматизации и упрощению отдельных стадий ПЦР, таких как смешение жидкостей [Патент РФ №2019131465, 07.10.2019. Микрофлюидный чип смешения // Патент России №2724254. 2019. Бюл №18. / Эпштейн О.П., Тарасов С.А., Никифорова М.В., Сарбашев К.А.] выделение ДНК [Mahalanabis M. и др. An integrated disposable device for DNA extraction and helicase dependent amplification // Biomed. Microdevices. 2010. T. 12. №2. C. 353-359], очистки [Патент РФ №2008138958/13 01.10.2008. Сменный микрофлюидный модуль для автоматизированного выделения и очистки нуклеиновых кислот из биологических образцов и способ выделения и очистки нуклеиновых кислот с его использованием // Патент России №2380418. 2010. Бюл №3./ Ходаков Д.А., Мамаев Д.Д., Филатов И.В., и др.]; и стадий манипуляции генетическим материалом, вплоть до оценки результата проведенного теста [Liu P., Mathies R. A. Integrated microfluidic systems for high-performance genetic analysis // Trends Biotechnol. 2009. T. 27. №10. C. 572-581]. Однако, предложенные решения пока не позволяют полной интеграции всех стадий анализа на одной платформе, сложны в эксплуатации или неприменимы в полевых условиях в силу необходимости оснащения самой платформы дополнительным лабораторным оборудованием для обеспечения движения жидкости по платформе (например, шприцевые инфузионные насосы, пневмонасосы или клапана, магнитные клапана), прецизионного термоциклирования образца (настольные амплификаторы), а также непосредственно детекции протекания реакции (установка для электрофореза и УФ спектрометр). Одним из существующих способов интеграции стадий ПЦР-реакций на единой платформе является концепция "лаборатории на чипе" (lab-on-a-chip / lab-on-a-board, lab-on-a-disc). Подобные устройства/платформы изготовлены на базе микрофлюидного картриджа. Микрофлюидика и такой ее раздел как лаборатории на чипе - научное направление, занимающееся миниатюризацией химических и биологических аналитических методов и приборов. Перемещение жидкостей по каналам обычно осуществляется либо за счет капиллярных сил, явно выраженных в миниатюрных микроканалах, либо за счет искусственно вызванной в них разницы давлений (подачи жидкостей под давлением с использованием шприцевых инфузионных насосов или пневматических контроллеров давления). Преимуществом таких систем является сокращение расхода дорогостоящих реагентов за счет сокращения объемов, необходимых для проведения ПЦР-анализа и детекции, а также упрощенное обращение с малыми количествами жидкости. Подобные диагностические платформы позволяют свести к минимуму влияние человеческого фактора, халатной кросс-контаминации образца и риск заражения обслуживающего персонала, проводящего анализ, а также позволяет использовать такого рода устройства в экспресс-диагностике в непосредственной близости от пациента или предмета исследования (point-of-care diagnostics) и полностью исключает необходимость транспортировки и хранения пробы (сокращение логистической цепочки и ускорения времени постановки диагноза до часов в сравнении с днями).Currently, there are solutions to automate and simplify individual stages of PCR, such as mixing liquids [RF Patent No. 2019131465, 07.10.2019. Microfluidic mixing chip // Patent of Russia No. 2724254. 2019. Bulletin #18. / Epstein O.P., Tarasov S.A., Nikiforova M.V., Sarbashev K.A.] DNA extraction [Mahalanabis M. et al. An integrated disposable device for DNA extraction and helicase dependent amplification // Biomed. microdevices. 2010. T. 12. No. 2. C. 353-359], cleaning [RF Patent No. 2008138958/13 01.10.2008. Replaceable microfluidic module for automated extraction and purification of nucleic acids from biological samples and a method for isolation and purification of nucleic acids using it // Patent of Russia No. 2380418. 2010. Bulletin No. 3./ Khodakov D.A., Mamaev D.D., Filatov I.V., et al.]; and stages of manipulation of genetic material, up to the evaluation of the result of the test [Liu P., Mathies R. A. Integrated microfluidic systems for high-performance genetic analysis // Trends Biotechnol. 2009. T. 27. No. 10. C. 572-581]. However, the proposed solutions do not yet allow the full integration of all stages of analysis on one platform, are difficult to operate or are not applicable in the field due to the need to equip the platform itself with additional laboratory equipment to ensure the movement of fluid through the platform (for example, syringe infusion pumps, pneumatic pumps or valves, magnetic valves), precision thermal cycling of the sample (tabletop cyclers), as well as direct detection of the reaction (electrophoresis unit and UV spectrometer). One of the existing ways to integrate the stages of PCR reactions on a single platform is the concept of "laboratory on a chip" (lab-on-a-chip / lab-on-a-board, lab-on-a-disc). Similar devices/platforms are made on the basis of a microfluidic cartridge. Microfluidics and such a section of it as laboratories on a chip is a scientific direction that deals with the miniaturization of chemical and biological analytical methods and instruments. The movement of liquids through the channels is usually carried out either due to capillary forces, clearly expressed in miniature microchannels, or due to an artificially induced pressure difference in them (supplying liquids under pressure using syringe infusion pumps or pneumatic pressure controllers). The advantage of such systems is the reduction in the consumption of expensive reagents by reducing the volumes required for PCR analysis and detection, as well as the simplified handling of small amounts of liquid. Such diagnostic platforms make it possible to minimize the influence of the human factor, negligent cross-contamination of the sample and the risk of infection of the service personnel conducting the analysis, and also allows the use of such devices in express diagnostics in the immediate vicinity of the patient or the subject of the study (point-of-care diagnostics) and completely eliminates the need to transport and store the sample (reducing the logistics chain and accelerating the time to make a diagnosis to hours compared to days).
В научной литературе и патентных архивах существует огромное количество технологий изготовления и конструкций микрофлюидных систем, позволяющих проводить некоторые стадии ПЦР-диагностики выделение, сорбцию и десорбцию ДНК, амплификацию [Mahjoob S., Vafai K., Beer N.R. Rapid microfluidic thermal cycler for polymerase chain reaction nucleic acid amplification // Int. J. Heat Mass Transf. 2008. T. 51. №9-10. C. 2109-2122], [Ahrberg C.D., Manz A., Chung B.G. Polymerase chain reaction in microfluidic devices // Lab Chip.2016. T. 16. №20. C. 3866 3884], гибридизацию и осуществлять анализ результатов теста на компактном носителе [Lui С, Cady N.C., Batt С.A. Nucleic acid-based detection of bacterial pathogens using integrated microfluidic platform systems., 2009. 3713-3744 c], [Khandurina J. и др. Integrated System for Rapid PCR-Based DNA Analysis in Microfluidic Devices // Anal. Chem. 2000. T. 72. №13. C. 2995-3000].In the scientific literature and patent archives, there are a huge number of manufacturing technologies and designs of microfluidic systems that allow for some stages of PCR diagnostics, isolation, sorption and desorption of DNA, amplification [Mahjoob S., Vafai K., Beer N.R. Rapid microfluidic thermal cycler for polymerase chain reaction nucleic acid amplification // Int. J. Heat Mass Transf. 2008. V. 51. No. 9-10. C. 2109-2122], [Ahrberg C.D., Manz A., Chung B.G. Polymerase chain reaction in microfluidic devices // Lab Chip.2016. T. 16. No. 20. C. 3866 3884], hybridization and analysis of test results on a compact carrier [Lui C, Cady N.C., Batt C.A. Nucleic acid-based detection of bacterial pathogens using integrated microfluidic platform systems., 2009. 3713-3744 c], [Khandurina J. et al. Integrated System for Rapid PCR-Based DNA Analysis in Microfluidic Devices // Anal. Chem. 2000. T. 72. No. 13. C. 2995-3000].
Однако, основной проблемой существующих устройств является необходимость использования дополнительного внешнего оборудования, такого как инфузионный насос, амплификатор и трудоемкой детекции положительного ПЦР-результата при помощи установки для электрофореза или УФ спектрометра. Однако применение такого большого числа трудоемких и чувствительных методов в практике походных условий и амбулаторного анализа затруднительно. В результате получаются большие и дорогие приборы, еще менее доступные, чем устройства для ПЦР в реальном времени.However, the main problem of existing devices is the need to use additional external equipment, such as an infusion pump, cycler and time-consuming detection of a positive PCR result using an electrophoresis unit or a UV spectrometer. However, the use of such a large number of time-consuming and sensitive methods in the practice of field conditions and outpatient analysis is difficult. The result is large, expensive instruments that are even less affordable than real-time PCR devices.
Помимо необходимости подключения внешних лабораторных устройств для проведения анализа одной из основных проблем микрофлюидных устройств является диффузионное ограничение перемешивания химических реактивов, вызванное ламинарным характером течения жидкости в небольших микроканалах. Для осуществления перемешивания задействуются длинные каналы в форме меандра, что ведет к вынужденному увеличению объема пробы и реагентов, необходимых для проведения анализа. Существуют концепции искусственного создания завихрений внутри жидкостного потока, целью которых является ускорение перемешивания. Подобные завихрения могут осуществляться посредством создания различных препятствий, бороздок [Chang, С., Yang, R. Electrokinetic mixing in microfluidic systems. Microfluid Nanofluid 3, 501-525 (2007)] и прочих микронеровностей дна микроканалов [Nguyen N-T, Wu Z. Micromixers - a review. J Micromechanics Microengineering. 2005;15(2)]; [L. Capretto, W. Cheng, M. Hill, and X. Zhang, Top Curr Chem V. 304, pp. 27-68 (2011)], а также обратной циркуляции жидкости [Nivedita, N., Ligrani, P. & Papautsky, I. Dean Flow Dynamics in Low-Aspect Ratio Spiral Microchannels. Sci Rep 7, 44072 (2017)]; [Daniel Ahmed, Xiaole Mao, Bala Krishna Juluri and Tony Jun Huang, Microfluid Nanofluid V. 7, pp. 727-731 (2009)] [Ward, K., & Fan, Z.H. (2015). Mixing in microfluidic devices and enhancement methods. Journal of Micromechanics and Microengineering, 25(9), 094001. doi:10.1088/0960-1317/25/9/094001]. Подобные инженерные конструкционные решения позволяют сократить объем и время, необходимые для перемешивания реагентов, но не способны полностью избавить от проблемы возникновения при этом, так называемого "мертвого объема" (death volume), то есть объема реагентов, остающихся в микроканалах и не задействованных непосредственно в протекании реакции.In addition to the need to connect external laboratory devices for analysis, one of the main problems of microfluidic devices is the diffusion limitation of the mixing of chemical reagents caused by the laminar nature of the fluid flow in small microchannels. For mixing, long channels in the form of a meander are used, which leads to a forced increase in the volume of the sample and reagents required for analysis. There are concepts for artificially creating turbulences within a liquid flow, the purpose of which is to accelerate mixing. Such vortices can be carried out by creating various obstacles, grooves [Chang, C., Yang, R. Electrokinetic mixing in microfluidic systems.
Отдельное внимание следует уделить микрофлюидным клапанам. Существует большое количество концепций систем многослойных клапанов, обеспечивающих управление течением жидкостью внутри микрофлюидных платформ. Зачастую они основаны на изгибании мембраны из гибкого материала, перекрывающей течение жидкости в канале, под внешним воздействием системы дополнительных пневматических клапанов, внешних винтов и/или магнитного поля [Park, J. and Park, J.-K. (2019). Integrated microfluidic pumps and valves operated by finger actuation. Lab on a Chip, 18, doi: 10.1039/C9LC00422J] [Chen, D., Mauk, M., Qiu, X., Liu, C., Kim, J., Ramprasad, S., et al. (2010). An integrated, self-contained microfluidic cassette for isolation, amplification, and detection of nucleic acids. Biomedical Microdevices, 12(4), 705-719. doi:10.1007/s10544-010-9423-4] [Le, T.N., Nguyen, V.-A., Bach, G.L., Tran, L.D., & Cao, H.H. (2020). Design and Fabrication of a PDMS-Based Manual Micro-Valve System for Microfluidic Applications. Advances in Polymer Technology, 2020, 1-7. doi: 10.1155/2020/2460212] [Chen, C.-Y., Chen, C.-H., Tu, T.-Y., Lin, C.-M., & Wo, A.M. (2011). Electrical isolation and characteristics of permanent magnet-actuated valves for PDMS microfluidics. Lab Chip, 11(4), 733-737. doi:10.1039/c01c00415d] [Yang, R.-J., Hou, H.-H., Wang, Y.-N., & Fu, L.-M. (2016). Micro-magnetofluidics in microfluidic systems: A review. Sensors and Actuators B: Chemical, 224, 1-15. doi:10.1016/j.snb.2015.10.053]. Функционирование подобных конструкций не является пассивным и требует источников внешнего воздействия (пневматических насосов, источников сжатого воздуха, сильного магнитного поля), что значительно усложняет общую конструкцию системы и лишает ее автономности и портативности. Проведенный обзор известных решений однозначно свидетельствует о большом разнообразии конструкций и систем для манипулирования движением и перемешиванием жидкости внутри микрофлюидной платформы, однако данные конструкции диагностических ПЦР-устройств не могут быть воплощены в портативном формате и для своей работы требуют дополнительного лабораторного оборудования. Это свидетельствует о необходимости создания новой конструкции и метода перемешивания, позволяющих проводить полный цикл ПЦР-диагностики на единой платформе с минимальным расходом химических реагентов на удаленных территориях, вне стен оснащенных лабораторий.Special attention should be paid to microfluidic valves. There are a large number of concepts for layered valve systems that provide fluid control within microfluidic platforms. Often they are based on the bending of a membrane of flexible material that blocks the flow of fluid in the channel, under the external influence of a system of additional pneumatic valves, external screws and / or a magnetic field [Park, J. and Park, J.-K. (2019). Integrated microfluidic pumps and valves operated by finger actuation. Lab on a Chip, 18, doi: 10.1039/C9LC00422J] [Chen, D., Mauk, M., Qiu, X., Liu, C., Kim, J., Ramprasad, S., et al. (2010). An integrated, self-contained microfluidic cassette for isolation, amplification, and detection of nucleic acids. Biomedical Microdevices, 12(4), 705-719. doi:10.1007/s10544-010-9423-4] [Le, T.N., Nguyen, V.-A., Bach, G.L., Tran, L.D., & Cao, H.H. (2020). Design and Fabrication of a PDMS-Based Manual Micro-Valve System for Microfluidic Applications. Advances in Polymer Technology, 2020, 1-7. doi: 10.1155/2020/2460212] [Chen, C.-Y., Chen, C.-H., Tu, T.-Y., Lin, C.-M., & Wo, A.M. (2011). Electrical isolation and characteristics of permanent magnet-actuated valves for PDMS microfluidics. Lab Chip, 11(4), 733-737. doi:10.1039/c01c00415d] [Yang, R.-J., Hou, H.-H., Wang, Y.-N., & Fu, L.-M. (2016). Micro-magnetofluidics in microfluidic systems: A review. Sensors and Actuators B: Chemical, 224, 1-15. doi:10.1016/j.snb.2015.10.053]. The functioning of such structures is not passive and requires sources of external influence (pneumatic pumps, compressed air sources, strong magnetic field), which greatly complicates the overall design of the system and deprives it of autonomy and portability. The review of known solutions unambiguously indicates a wide variety of structures and systems for manipulating the movement and mixing of fluid inside a microfluidic platform, however, these designs of diagnostic PCR devices cannot be implemented in a portable format and require additional laboratory equipment for their operation. This indicates the need to create a new design and mixing method that allows a full cycle of PCR diagnostics to be carried out on a single platform with a minimum consumption of chemicals in remote areas, outside the walls of equipped laboratories.
В данной патентной заявке представлены к рассмотрению метод активного перемешивания многокомпонентной реакционной смеси и необходимая для его функционирования система микрофлюидных клапанов, каналов и реакционных камер. Основой предлагаемой методики является использование полифазных магнитных микрочастиц магнетита и гетита, помещенных во вращательное магнитное поле, для активного перемешивания двух и более компонентной смеси. Для проведения перемешивания требуются непосредственно взвесь магнитных частиц исходя из соотношения 20 мкл взвеси частиц на 300 мкл перемешиваемой смеси, а также система микрофлюидных клапанов и камер с гибкими мембранами, препятствующая неконтролируемому течению жидкости. Преимуществом патентуемого микрофлюидного устройства являются не только активное перемешивание магнитными частицами без создания дополнительного мертвого объема (продемонстрированого ранее в [Chong, W.H., Chin, L.K., Tan, R.L.S., Wang, H., Liu, A.Q., & Chen, H. (2013). Stirring in Suspension: Nanometer-Sized Magnetic Stir Bars. Angewandte Chemie International Edition, 52(33), 8570-8573. doi:10.1002/anie.201303249] [Kitenbergs, G., 
Заявляемый метод и конструкция были продемонстрированы на примере детекции патогенов семейства Enterobacteriaceae (E. coli), которые могут быть расширены для анализа широкого спектра инфекционных заболеваний, стандартизировано детектируемых при помощи ПЦР-анализа, в разрезе персонализированной медицины и экспресс диагностики в пищевом производстве. Новизна предлагаемого аналитического концепта связана с нетривиальным подходом и новой концепцией быстрой и надежной диагностики опасных для здоровья человека микроорганизмов (патогенов), включающей использование высоко специфичных и чувствительных бинарных дезоксирибозимных сенсоров и интеграцию всех этапов анализа биологического материала в единое компактное микрофлюидное устройство. Благодаря применению данного метода разобщенные во времени и пространстве этапы (выделение нуклеиновых кислот из биологических образцов, амплификацию генов мишеней и детекцию продуктов амплификации при использовании бинарных дезоксирибозимных сенсоров) могут быть интегрированы в одном портативном устройстве и может быть создан компактный, портативный и высокочувствительный инструмент для диагностики инфекционных заболеваний, как в клинических, так и в условиях передвижных медицинских, пищевых и прочих биотехнологических лабораторий. Это позволит значительно повысить точность и скорость мониторинга энтеробактерий в продуктах питания и различном сырье, постановки диагноза, а также качество предоставляемых медицинских услуг в удаленных регионах и сложных походных условиях, и в этой связи повысить выявляемость и даже уменьшить смертность от таких инфекционных и вирусных заболеваний как менингит Neisseria meningitidis, MRSA S. aureus мультирезистивный стафилококк, гонорея Neisseria gonohrrea и прочие.The claimed method and design were demonstrated using the example of detection of pathogens of the Enterobacteriaceae (E. coli) family, which can be extended to analyze a wide range of infectious diseases, standardized detected using PCR analysis, in the context of personalized medicine and express diagnostics in food production. The novelty of the proposed analytical concept is associated with a non-trivial approach and a new concept for rapid and reliable diagnostics of microorganisms (pathogens) hazardous to human health, including the use of highly specific and sensitive binary deoxyribozyme sensors and the integration of all stages of biological material analysis into a single compact microfluidic device. Thanks to the use of this method, steps separated in time and space (isolation of nucleic acids from biological samples, amplification of target genes and detection of amplification products using binary deoxyribozyme sensors) can be integrated in one portable device and a compact, portable and highly sensitive tool for diagnostics can be created. infectious diseases, both in clinical and mobile medical, food and other biotechnology laboratories. This will significantly improve the accuracy and speed of monitoring enterobacteria in food and various raw materials, diagnosis, as well as the quality of medical services provided in remote regions and difficult field conditions, and in this regard, increase the detection rate and even reduce mortality from such infectious and viral diseases as meningitis Neisseria meningitidis, MRSA S. aureus multiresistive staphylococcus aureus, gonorrhea Neisseria gonohrrea and others.
Заявляемый способ активного перемешивания и проведения ПЦР-анализа характеризуется следующими свойствами, которые могут быть расценены как технический результат:The claimed method of active mixing and PCR analysis is characterized by the following properties, which can be regarded as a technical result:
1. Метод активного перемешивания при помощи магнитных частиц без задействования длинных диффузионных каналов позволяет значительно сократить объем дорогостоящих реагентов и сократить "мертвого" объем реагентов на более чем 20* % от общего объема использованных реагентов.1. The method of active mixing with the help of magnetic particles without using long diffusion channels can significantly reduce the volume of expensive reagents and reduce the "dead" volume of reagents by more than 20*% of the total volume of used reagents.
*расчетное значение при условии использования микроканалов в форме меандра, длинной в 40 мм, необходимой для осуществления диффузионного перемешивания (Рис. 2 (а) показывает сравнительные геометрические размеры двух типов микрофлюидных систем).*calculated value assuming the use of meander-shaped microchannels, 40 mm long, necessary for diffusion mixing (Fig. 2 (a) shows the comparative geometric dimensions of the two types of microfluidic systems).
2. Методика одновременных перемешивания и сорбции ДНК является универсальной, и позволяет проводить перемешивание любых жидкостей с вязкостью до 4⋅10-3 Па⋅с, а также одновременную сорбцию ДНК на поверхности магнитных микрочастиц.2. The method of simultaneous mixing and sorption of DNA is universal and allows mixing of any liquids with a viscosity of up to 4⋅10 -3 Pa⋅s, as well as simultaneous sorption of DNA on the surface of magnetic microparticles.
3. В конструкции заявляемой микрофлюидной платформы передзагружены жидкости (раствор для выделения ДНК, реакционная камера с помещенным в нее сорбирующим материалом, раствор для амплификации), необходимые для интегрирования четырех стадий ПЦР-анализа (выделение ДНК, очистка ДНК, амплификация и оптический анализ) в единую тест-систему на основе одноразового микрофлюидного картриджа, управление течением жидкости в котором осуществляется посредством нажатия на гибкие мембраны.3. In the design of the proposed microfluidic platform, liquids are preloaded (a solution for DNA extraction, a reaction chamber with an sorbent material placed in it, an amplification solution) necessary for integrating the four stages of PCR analysis (DNA extraction, DNA purification, amplification and optical analysis) into a single test system based on a disposable microfluidic cartridge, the fluid flow in which is controlled by pressing on flexible membranes.
4. Методика активного перемешивания и заявляемая микрофлюидная платформа просты в эксплуатации.4. The method of active mixing and the inventive microfluidic platform are easy to operate.
5. При задействовании заявляемой микрофлюидной платформы длительность проведения ПЦР-анализа от забора пробы до получения результата составляет не более 2,5 часов.5. When using the claimed microfluidic platform, the duration of the PCR analysis from sampling to obtaining the result is no more than 2.5 hours.
6. Детекция наличия биологических патогенов в пробе подтверждается визуально по изменению цвета раствора с прозрачного на коричневатый.6. Detection of the presence of biological pathogens in the sample is confirmed visually by the change in color of the solution from clear to brownish.
7. Заявленная методика теста может быть применена как в условиях стационарных лаборатории, так и в полевых условиях передвижных лабораторий и клиник.7. The claimed test method can be applied both in stationary laboratories and in the field of mobile laboratories and clinics.
В конструкции заявленной аналитической системы проведено интегрирование четырех стадий анализа (выделение ДНК, очистка ДНК, амплификация и оптический анализ) в единую тест-систему на основе одноразового микрофлюидного картриджа, управление течением жидкости, в котором осуществляется посредством нажатия оператора на гибкие мембраны, детекция наличия биологических патогенов в пробе подтверждается визуально по изменению цвета раствора. Предлагаемая аналитическая платформа позволит минимизировать объем используемых реагентов и сократить время манипуляции образцами, что, как следствие, позволит снизить возможность загрязнения образцов и контаминацию лаборатории или помещения, в котором проводится анализ, ДНК патогенных образцов. Риск заражения персонала при этом сведен к минимуму или полностью отсутствует. Это позволит увеличить надежность и биологическую безопасность теста, а также значительно снизить стоимость проведения подобных анализов.In the design of the claimed analytical system, four stages of analysis (DNA isolation, DNA purification, amplification and optical analysis) were integrated into a single test system based on a disposable microfluidic cartridge, fluid flow control, which is carried out by pressing the operator on flexible membranes, detection of the presence of biological pathogens in the sample is confirmed visually by changing the color of the solution. The proposed analytical platform will minimize the amount of reagents used and reduce the time of sample manipulation, which, as a result, will reduce the possibility of sample contamination and contamination of the laboratory or room in which the analysis is carried out with DNA of pathogenic samples. In this case, the risk of infection of personnel is minimized or completely absent. This will increase the reliability and biological safety of the test, as well as significantly reduce the cost of such analyzes.
Список изображений:Image List:
Рис. 1. Принципиальная схема устройства микрофлюидной платформы с указанием необходимых камерами для проведения пробоподготовки и непосредственно ПЦР-анализа.Rice. 1. Schematic diagram of the microfluidic platform with indication of the necessary chambers for sample preparation and direct PCR analysis.
Рис. 2.Rice. 2.
(а) Сравнение геометрических размеров микрофлюидных платформ, эксплуатирующих метод диффузионного перемешивания с каналами в форме меандров (вверху) и реакционной камеры с активным перемешиванием магнитными частицами во вращающемся магнитном поле и мертвым объемом, сведенным к минимуму (внизу);(a) Comparison of the geometric dimensions of microfluidic platforms using the diffusion mixing method with meander-shaped channels (top) and the reaction chamber with active mixing by magnetic particles in a rotating magnetic field and dead volume minimized (bottom);
(б) Фотография реальной автономной микрофлюидной платформы для активного перемешивания реагентов при помощи интеграции магнитных частиц в центральную реакционную камеру, оснащенная системой односторонних клапанов, управляемых оператором посредством нажатия пальцем на гибкие мембраны.(b) Photo of a real self-contained microfluidic platform for active mixing of reagents by integrating magnetic particles into a central reaction chamber, equipped with a system of one-way valves controlled by the operator by pressing flexible membranes with a finger.
Рис. 3 Конструкция пассивного одностороннего микрофлюидного клапана, пропускающего жидкость строго в одном направлении и представляющего из себя многослойную конструкцию (1), состоящую из двух жестких заготовок из полиметилметакрилата (ПММА, прозрачные) и гибкой мембраны из полидиметилсилоксана (ПДМС) с прорезями (помечена красным).Rice. Fig. 3 The design of a passive one-way microfluidic valve that allows fluid to flow in exactly one direction and is a multilayer structure (1) consisting of two rigid blanks made of polymethyl methacrylate (PMMA, transparent) and a flexible membrane made of polydimethylsiloxane (PDMS) with slots (marked in red).
(2) - Общий вид клапана после склейки, присоединенного к реакционной камере и пропускающего жидкость строго в одном направлении.(2) - General view of the valve after gluing, attached to the reaction chamber and passing the liquid in exactly one direction.
(3)-(5) - Схема перекачивания жидкости посредством нажатия на гибкую мембрану реакционной камеры сначала по нижней заготовке ПММА, изгибание гибкой мембраны (3, выноска), перетекание жидкости в верхнюю заготовку ПММА (4) и возвращение жидкости в нижнюю заготовку через сквозное отверстие в мембране (5). Повышение давления с обратной стороны клапана вдавливает гибкую мембрану в стопор в нижней заготовке и клапан остается закрытым.(3)-(5) - Scheme of pumping liquid by pressing the flexible membrane of the reaction chamber, first along the lower PMMA blank, bending the flexible membrane (3, callout), flowing the liquid into the upper PMMA blank (4) and returning the liquid to the lower blank through the through hole in the membrane (5). Increasing pressure from the back of the valve presses the flexible diaphragm into the stop in the lower workpiece and the valve remains closed.
Рис. 4. Демонстрация работы и фотография системы, схематично представленной на Рис. 3: нажатие оператором на гибкую мембрану реакционной камеры приводит к повышению давления в системе и выдавливанию жидкости в каналы микрофлюидного клапана. Микрофлюидный клапан работает по типу флюидного "диода", пропуская жидкость только в одном направлении.Rice. 4. Demonstration of work and a photograph of the system, schematically presented in Fig. 3: The operator presses the flexible membrane of the reaction chamber to pressurize the system and force liquid into the channels of the microfluidic valve. The microfluidic valve works like a fluid "diode", allowing fluid to flow in only one direction.
Рис. 5.Rice. 5.
(а) Визуализация морфологии микрочастиц магнетита при помощи сканирующего электронного микроскопа, используемых для метода активного перемешивания.(a) Visualization of the morphology of magnetite microparticles using a scanning electron microscope used for the active mixing method.
(б) Демонстрация магнитной активности синтезированных магнитных микрочастиц магнетита.(b) Demonstration of the magnetic activity of the synthesized magnetic magnetite microparticles.
Рис. 6.Rice. 6.
(а) Пример вращения магнитных частиц в реакционной камере при скорости вращения магнитного поля в 2500 об/мин; (б) осаждение и концентрация магнитных микрочастиц внутри реакционной камеры при помощи постоянного магнита.(a) An example of the rotation of magnetic particles in the reaction chamber at a magnetic field rotation speed of 2500 rpm; (b) deposition and concentration of magnetic microparticles inside the reaction chamber using a permanent magnet.
Рис. 7. Демонстрация протекания стадии детекции и качественного изменения цвета жидкости при наличии патогена E. Coli в пробе (положительной реакции) с прозрачного (нет цвета) на светло-коричневый.Rice. 7. Demonstration of the detection stage and a qualitative change in the color of the liquid in the presence of the E. Coli pathogen in the sample (positive reaction) from transparent (no color) to light brown.
ПримерыExamples
1. Выявление инфицирования пробы Е. Coli1. Detection of E. coli sample infection
Схема используемой микрофлюидной платформы приведена на Рис. 1 и Рис. 2 (б). Она содержит камеры и каналы с гибкой мембраной, в которых уже находится соответствующие аналитические жидкости (раствор для выделения ДНК, реакционная камера с помещенными в нее магнитными частицами, раствор для амплификации). Магнитные микрочастицы с гидродинамичексим радиусом порядка 2-6 μm (Рис. 5) в объеме 20 мкл помещаются в реакционную камеру объемом 300 мкл. Они используются для перемешивания реактивов и проб с вязкостью до 4⋅10-3 Па⋅с в микрофлюидных камерах, следуя за вращающимся магнитным полем (частота вращения >2000 об/мин и магнитная индукция порядка 300-500 мТл) они образуют турбулентные потоки внутри реакционной камеры, захватывая при движении слои жидкости (Рис 6 (а)). Перемешиваемые биологические и аналитические жидкости могут иметь любое происхождение (слюна, желудочный сок, моча, кровь и пр.).The diagram of the used microfluidic platform is shown in Fig. 1 and Fig. 2(b). It contains chambers and channels with a flexible membrane, which already contain the appropriate analytical fluids (solution for DNA extraction, reaction chamber with magnetic particles placed in it, amplification solution). Magnetic microparticles with a hydrodynamic radius of about 2-6 μm (Fig. 5) in a volume of 20 µl are placed in a reaction chamber with a volume of 300 µl. They are used for mixing reagents and samples with a viscosity of up to 4⋅10 -3 Pa⋅s in microfluidic chambers, following a rotating magnetic field (rotation speed >2000 rpm and magnetic induction of the order of 300-500 mT) they form turbulent flows inside the reaction chamber. chambers, capturing liquid layers during movement (Fig. 6 (a)). Mixed biological and analytical fluids can be of any origin (saliva, gastric juice, urine, blood, etc.).
При добавлении 150 мкл химического лизирующего буфера (0,25% раствора додецилсульфата натрия и 50 ммоль раствора гидроксида натрия), 150 мкл биологического образца и активного перемешивания в течение 10 мин при комнатной температуре происходит лизис (разрушение клеточной стенки бактерии и выделение ДНК) и сорбция ДНК на поверхности магнитных частиц. Управление течением жидкости происходит за счет нажатия оператором на гибкие мембраны толщиной 1 мм реакционной камеры и камеры с предзагруженными компонентами (лизирующая жидкость, ПЦР-смесь, этиловый спирт и пр.), Рис. 2 (б). Изгибаясь, мембрана создает дополнительное давление внутри камер, которое заставляет жидкости вытекать из камеры и попадать в систему микроканалов и клапанов. Это позволяет платформе работать при полном отсутствии внешних устройств, обеспечивающих дополнительное давление для манипулирования потоком (регуляторы давления или шприцевые насосы и пр.). Работа односторонних клапанов ("микрофлюидные диоды") продемонстрирована на Рис. 3 и Рис. 4 и обусловлена изгибом тонкой мембраны клапана из полидиметилсилоксана под воздействием внешнего давления и запиранием клапана при возвращении мембраны в исходное положение и приложении давления с обратной стороны.With the addition of 150 µl of a chemical lysis buffer (0.25% sodium dodecyl sulfate solution and 50 mmol sodium hydroxide solution), 150 µl of a biological sample and active stirring for 10 min at room temperature, lysis occurs (destruction of the bacterial cell wall and isolation of DNA) and sorption DNA on the surface of magnetic particles. The liquid flow is controlled by pressing the
После лизиса магнитные частицы удерживаются на дне реакционной камеры с помощью неодимового магнита (Рис. 6 (б)), а вся остальная жидкость сливается в камеру с отработанными реактивами с последующей промывкой частиц этанолом (300 мкл). Поскольку ДНК растворима в воде, десорбция ДНК была организована путем добавления 50 мкл дистиллированной воды в центральную реакционную камеру, с находящимися внутри микрочастицами.After lysis, the magnetic particles are kept at the bottom of the reaction chamber with a neodymium magnet (Fig. 6 (b)), and the rest of the liquid is drained into the chamber with spent reagents, followed by washing of the particles with ethanol (300 µl). Since DNA is water soluble, DNA desorption was arranged by adding 50 µl of distilled water to the central reaction chamber, with microparticles inside.
Стадия циклической амплификации основывается на увеличении количества определенного участка гена, который будет детектирован в последующих стадиях. Для реализации данной стадии, необходимо поддержание определенных температурных режимов с определенными интервалами и последовательностями. Данные условия зависят от используемых в ходе реакции праймеров. В данном случае, температурные режимы, использованные для реакции амплификации: 95°С - 56°С - 72°С. Интервалы изменения и выдержки температур составляли: 95°С - 2 минуты, в качестве предварительного прогрева образца, далее 95°С - 15 секунд, 56°С - 30 секунд, 72°С - 50 секунд. Завершающей температурной стадией цикла является выдержка при температуре 72°С в течение 2 мин для закрепления формирования нового фрагмента. Описанный температурный цикл повторяется минимум 29 раз для достижения концентрации фрагмента ДНК, достаточного для детекции системами на основе дезоксирибозимных наномашин.The stage of cyclic amplification is based on the increase in the amount of a certain region of the gene, which will be detected in subsequent stages. To implement this stage, it is necessary to maintain certain temperature conditions at certain intervals and sequences. These conditions depend on the primers used during the reaction. In this case, the temperature conditions used for the amplification reaction: 95°C - 56°C - 72°C. The intervals for changing and maintaining temperatures were: 95°C - 2 minutes, as a preliminary heating of the sample, then 95°C - 15 seconds, 56°C - 30 seconds, 72°C - 50 seconds. The final temperature stage of the cycle is exposure at a temperature of 72°C for 2 min to consolidate the formation of a new fragment. The described temperature cycle is repeated at least 29 times to reach the DNA fragment concentration sufficient for detection by systems based on deoxyribozyme nanomachines.
На последующей стадии детекции в реакционную камеру впрыскиваются гибридизационные зонды на основе дезоксирибозимов с высокой селективностью на основе последовательности генома E. coli (NC 004547) в объеме 50 мкл, которые специфично связываются с ампликонами ДНК кишечной палочки при помощи маркеров, и изменяют при этом цвет. Процедура детекции осуществляется путем наблюдения за изменением цвета от бесцветного (нет патогена) до коричневатого (присутствие бактерии в пробе в количестве, превышающем или равном пределу детекции), которое можно констатировать невооруженным глазом. Результат анализа будет качественным - изменение цвета будет указывать на наличие или отсутствие в биологическом образце определяемого патогена. Чувствительность проведения анализа >10 бактерий Е. coli в пробе. Пример результата проверки как в пробирке, так и на микрофлюидной платформе приведен на Рис. 7 (справа).In the subsequent detection step, hybridization probes based on deoxyribozymes with high selectivity based on the E. coli genome sequence (NC 004547) in a volume of 50 µl are injected into the reaction chamber, which specifically bind to E. coli DNA amplicons using markers and change color. The detection procedure is carried out by observing a color change from colorless (no pathogen) to brownish (the presence of bacteria in the sample in an amount greater than or equal to the detection limit), which can be ascertained by the naked eye. The result of the analysis will be qualitative - a color change will indicate the presence or absence of the pathogen being determined in the biological sample. Assay sensitivity >10 E. coli per sample. An example of the test result both in vitro and on the microfluidic platform is shown in Fig. 7 (right).
2. Подтверждение отсутствия контаминации пробы патогеном (Е. coli)2. Confirmation of the absence of contamination of the sample with a pathogen (E. coli)
Схема теста идентична описанному в п. 1. При этом в результате теста после введения дезоксирибозимных сенсоров в реакционную камеру цвет и прозрачность содержимого камеры не изменяется (остается прозрачным, бесцветным). Пример результата проверки приведен на Рис. 7 (слева).The test scheme is identical to that described in
Claims (32)
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2021102563A RU2021102563A (en) | 2022-08-04 |
| RU2778345C2 true RU2778345C2 (en) | 2022-08-17 |
Family
ID=
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU221186U1 (en) * | 2023-04-20 | 2023-10-24 | Общество с ограниченной ответственностью "Биодайв" | CARTRIDGE FOR MOLECULE DETECTION |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2380418C1 (en) * | 2008-10-01 | 2010-01-27 | Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН | Replaceable microfluid module for automated recovery and purification of nucleic acids from biological samples and method for recovery and purification nucleic acids with using thereof |
| RU164923U1 (en) * | 2015-11-23 | 2016-09-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) | CARTRIDGE FOR ANALYSIS OF INDUCED BLOOD Platelet Aggregation by Impedance Aggregometry Method |
| WO2017048975A1 (en) * | 2015-09-17 | 2017-03-23 | The Regents Of The University Of California | Droplet-trapping devices for bioassays and diagnostics |
| RU2732235C2 (en) * | 2014-09-07 | 2020-09-14 | Селексис С.А. | Microfluidic methods and cartridges for cell separation |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2380418C1 (en) * | 2008-10-01 | 2010-01-27 | Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН | Replaceable microfluid module for automated recovery and purification of nucleic acids from biological samples and method for recovery and purification nucleic acids with using thereof |
| RU2732235C2 (en) * | 2014-09-07 | 2020-09-14 | Селексис С.А. | Microfluidic methods and cartridges for cell separation |
| WO2017048975A1 (en) * | 2015-09-17 | 2017-03-23 | The Regents Of The University Of California | Droplet-trapping devices for bioassays and diagnostics |
| RU164923U1 (en) * | 2015-11-23 | 2016-09-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) | CARTRIDGE FOR ANALYSIS OF INDUCED BLOOD Platelet Aggregation by Impedance Aggregometry Method |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU221186U1 (en) * | 2023-04-20 | 2023-10-24 | Общество с ограниченной ответственностью "Биодайв" | CARTRIDGE FOR MOLECULE DETECTION |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yin et al. | Integrated microfluidic systems with sample preparation and nucleic acid amplification | |
| Fu et al. | A microfluidic chip based on surfactant-doped polydimethylsiloxane (PDMS) in a sandwich configuration for low-cost and robust digital PCR | |
| Kadimisetty et al. | Fully 3D printed integrated reactor array for point-of-care molecular diagnostics | |
| Jiang et al. | A continuous-flow high-throughput microfluidic device for airborne bacteria PCR detection | |
| Park et al. | Advances in microfluidic PCR for point-of-care infectious disease diagnostics | |
| Cady et al. | Real-time PCR detection of Listeria monocytogenes using an integrated microfluidics platform | |
| Shin et al. | Magnetic droplet manipulation platforms for nucleic acid detection at the point of care | |
| US6878755B2 (en) | Automated microfabrication-based biodetector | |
| JP2022001055A (en) | System and method for executing biological assay | |
| Borysiak et al. | NAIL: Nucleic Acid detection using Isotachophoresis and Loop-mediated isothermal amplification | |
| US10589270B2 (en) | Digital fluid sample separation apparatus and methods for one-step quantitative sample analysis | |
| CN111704994A (en) | Nucleic acid detection chip and detection method | |
| US20080125330A1 (en) | Real-Time Pcr Detection of Microorganisms Using an Integrated Microfluidics Platform | |
| WO2015160863A1 (en) | Portable nucleic acid analysis systemand high-performance microfluidic electroactive polymer actuators | |
| Ouyang et al. | Pressure-modulated selective electrokinetic trapping for direct enrichment, purification, and detection of nucleic acids in human serum | |
| EP2143491A1 (en) | Device for analysing a chemical or biological sample | |
| CN107723210B (en) | Novel micro-fluidic chip device for nucleic acid detection | |
| Basha et al. | Towards multiplex molecular diagnosis—A review of microfluidic genomics technologies | |
| Kim et al. | On-site extraction and purification of bacterial nucleic acids from blood samples using an unpowered microfluidic device | |
| Petersen et al. | Toward next generation clinical diagnostic instruments: scaling and new processing paradigms | |
| US20160001284A1 (en) | Fluidic Interfacing System and Assembly | |
| RU2778345C2 (en) | Autonomous diagnostic microfluid platform with integrated magnetic microparticles for active mixing of reagents, equipped with one-sided valve system, controlled by operator by means of pressing on flexible membranes | |
| Zhong et al. | iso-μmGene: an isothermal amplification-based portable microfluidic system for simple, reliable and flexibly multiplexed genetic identification and quantification | |
| Lee et al. | Automated Platform for Rapid and Reproducible Sample Preparations in Point-of-Care (POC) Molecular Diagnostics | |
| US8808643B1 (en) | Fluidics platform and method for sample preparation and analysis |