RU2776477C2

RU2776477C2 - Use of 1-phenyl-2-pyridinylalkyl alcohol derivatives in treatment of mucoviscidosis

Info

Publication number: RU2776477C2
Application number: RU2020123677A
Authority: RU
Inventors: Джино Виллетти; Серена БЕРТОЛИНИ; Клаудио СОРИО
Original assignee: КЬЕЗИ ФАРМАЧЕУТИЧИ С.п.А.
Priority date: 2017-12-28
Filing date: 2018-12-19
Publication date: 2022-07-21

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: present invention relates to the use of a compound of the general formula (I) in the form of (-)enantiomer or its pharmaceutically acceptable inorganic or organic salt for the prevention and/or treatment of mucoviscidosis in a subject, which is characterized by at least one mutation in CFTR gene, which is the cause of incorrect folding and/or processing of CFTR protein. In the formula I, n is 1; R1 is HNSO₂R4, where R4 is linear or branched C1-C4 alkyl; R2 is OR3, where R3 is linear or branched C₁-C₆ alkyl substituted with C₃-C₇ cycloalkyl group.

EFFECT: provision of reliable treatment of mucoviscidosis, which is convenient to use, and which is not related to unjustified undesired effects, including the treatment of subgroups of patients with mucoviscidosis, for which there is no completely satisfactory treatment for today.

(I)

15 cl, 8 dwg, 2 ex

Description

ВведениеIntroduction

Область изобретенияField of invention

Настоящее изобретение относится к применению некоторых производных 1-фенил-2-пиридинилалкилового спирта при лечении муковисцидоза.The present invention relates to the use of certain 1-phenyl-2-pyridinylalkyl alcohol derivatives in the treatment of cystic fibrosis.

Предпосылки изобретенияBackground of the invention

Муковисцидоз (CF) является распространенным летальным генетическим заболеванием, вызываемым мутациями гена, кодирующего трансмембранный регулятор муковисцидоза (CFTR), хлорный канал. Заболевание является мультисистемным заболеванием, характеризующимся недостаточностью поджелудочной железы и хроническими инфекциями дыхательных путей, снижением функции легких, повторными обострениями легких и дыхательной недостаточностью. Заболевание является аутосомно-рецессивным и вызвано снижением уровней и/или недостаточной активностью канала CFTR, ABC-переносчика анионов, который обычно присутствует на апикальной поверхности в эпителиальной мембране многих клеток, включая клетки дыхательных путей (Leier et al., 2012, Cell Physiol. Biochem., vol. 29, p. 775-790; Wainwright et al., 2015, N. Engl. J. Med., vol. 373, p. 220-231; Lambert et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2014, vol. 50, p. 549-558). Нарушение транспорта соли и воды на поверхности эпителиальных клеток, вызванное мутацией CFTR, приводит, в частности, к повышенной секреции слизи, а также к инфекции или воспалению в пораженных органах. На сегодняшний день не существует полностью удовлетворительного лечения муковисцидоза.Cystic fibrosis (CF) is a common lethal genetic disorder caused by mutations in the gene encoding the cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR), chloride channel. The disease is a multisystem disease characterized by pancreatic insufficiency and chronic respiratory tract infections, decreased lung function, recurrent pulmonary exacerbations, and respiratory failure. The disease is autosomal recessive and is caused by decreased levels and/or deficient activity of the CFTR channel, an ABC anion transporter that is normally present at the apical surface in the epithelial membrane of many cells, including airway cells (Leier et al., 2012, Cell Physiol. Biochem ., vol. 29, pp. 775-790; Wainwright et al., 2015, N. Engl. J. Med., vol. 373, pp. 220-231; Lambert et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2014, vol. 50, pp. 549-558). Disruption of salt and water transport on the surface of epithelial cells caused by CFTR mutation leads, in particular, to increased secretion of mucus, as well as infection or inflammation in the affected organs. To date, there is no completely satisfactory treatment for cystic fibrosis.

Хотя в качестве вызывающих муковисцидоз у людей были описаны многие мутации в белке CFTR, мутация, вызывающая делецию фенилаланина 508 (Phe508del; F508del; ΔF508) является самой распространенной мутацией в гене CFTR; около 90% пациентов с муковисцидозом являются гетерозиготными по соответствующей мутации, и почти половина пациентов являются гомозиготными по этой мутации (Kuk et al., 2015, Ther. Adv. Resp. Dis., vol. 9, p. 313-326). Мутация ΔF508 нарушает сворачивание/запускает неправильное сворачивание белка CFTR, приводя к преждевременной деградации транслируемого белка, и, таким образом, является причиной дефекта, который значительно снижает уровни белка в эпителиальной мембране (Blanchard et al., 2014, FASEB J., vol. 28, p. 791-801); кроме того, мутация ΔF508 ухудшает стабильность белка CFTR и воротный механизм ионных каналов (гейтинг): несколько каналов, присутствующих на поверхности клетки, имеют ограниченную активность по транспорту ионов хлора/бикарбоната и, таким образом, имеют функциональные нарушения (Leier et al., выше; Wainwright et al., выше). В то же время были описаны другие мутанты CFTR, где белок CFTR должным образом присутствует на поверхности эпителиальных клеток, но характеризуется дефицитом в его хлорид/бикарбонатном гейтинге/проводимости, например, мутант CFTR G551D (Kuk et al., выше). «Cystic Fibrosis Mutation Database», доступная в интернете по адресу http://www.genet.sickkids.on.ca/app является всеобъемлющей базой данных, предоставляющей обзор известных мутаций CFTR, причастных к муковисцидозу. Согласно указанной базе данных в настоящее время известно более 2000 мутаций CFTR, сгруппированных как миссенс-мутации, фреймшифт мутации, сплайсинговые мутации, нонсенс-мутации, вставка/делеция внутри рамки считывания (in/dels), большие in/dels, мутации промотора, вариации последовательности и мутации еще неизвестного молекулярного действия. Известные мутации обнаружены распределенными по всей открытой рамке считывания гена CFTR (включая 27 экзонов и 26 интронов), а также по промотору и 3’ нетранслируемой области (3’ UTR) гена CFTR. «Вариация последовательности» относится ко всем тем генетическим мутациям, которые известны как таковые, но которые, как было показано, не вызывают заболевания; однако, когда вариация последовательности обнаруживается у одного отдельного человека, невозможно определить, является ли она «не вызывающей заболевание». Вариант последовательности у человека, которая, как было показано, не вызывает заболевания и которая присутствует с частотой аллелей 1%, также называют «полиморфизмом», см. http://www.genet.sickkids.on.ca/app.Although many mutations in the CFTR protein have been described as causing cystic fibrosis in humans, the mutation causing the deletion of phenylalanine 508 (Phe508del; F508del; ΔF508) is the most common mutation in the CFTR gene; about 90% of patients with cystic fibrosis are heterozygous for the corresponding mutation, and almost half of patients are homozygous for this mutation (Kuk et al., 2015, Ther. Adv. Resp. Dis., vol. 9, p. 313-326). The ΔF508 mutation disrupts/triggers misfolding of the CFTR protein, leading to premature degradation of the translated protein, and thus causes a defect that significantly reduces protein levels in the epithelial membrane (Blanchard et al., 2014, FASEB J., vol. 28 , pp. 791-801); in addition, the ΔF508 mutation impairs CFTR protein stability and ion channel gating: several channels present on the cell surface have limited chloride/bicarbonate ion transport activity and thus have functional impairments (Leier et al., supra). ; Wainwright et al., supra). At the same time, other CFTRα mutants have been described where the CFTR protein is properly present on the surface of epithelial cells but is deficient in its chloride/bicarbonate gating/conductivity, such as the CFTR G551D mutant (Kuk et al., supra). The Cystic Fibrosis Mutation Database, available online at http://www.genet.sickkids.on.ca/app, is a comprehensive database providing an overview of the known CFTR mutations implicated in cystic fibrosis. According to this database, more than 2000 CFTR mutations are currently known, grouped as missense mutations, frameshift mutations, splicing mutations, nonsense mutations, in-frame insertion/deletion (in/dels), large in/dels, promoter mutations, variations sequences and mutations of yet unknown molecular action. Known mutations were found distributed throughout the open reading frame of the CFTR gene (including 27 exons and 26 introns), as well as the promoter and 3' untranslated region (3' UTR) of the CFTR gene. "Sequence variation" refers to all those genetic mutations known as such, but which have not been shown to cause disease; however, when a sequence variation is found in one individual, it is not possible to determine whether it is "non-disease-causing". A sequence variant in humans that has not been shown to cause disease and that is present at an allele frequency of 1% is also referred to as a "polymorphism", see http://www.genet.sickkids.on.ca/app.

Выработка слизи, воспаление и уровень цАМФ при муковисцидозеMucus production, inflammation, and cAMP levels in cystic fibrosis

Муковисцидоз, как правило, также характеризуется избыточной выработкой слизи, то есть вязкоупругого биологического материала, который представляет собой композицию компонентов, секретируемых апикально (люминально) эпителиальными и железистыми клетками, и покрывает и защищает апикальные поверхности дыхательных, желудочно-кишечных и репродуктивных эпителиальных путей. Избыточная выработка гликопротеинов слизи («муцинов») и закупорка слизью обычно наиболее губительны в дыхательных путях у пациентов с муковисцидозом. Однако избыточная выработка слизи в настоящее время не понимается как прямая причина дефектного белка CFTR, а скорее как последующее проявление; было показано, что в легких экспрессия генов муцина запускается воспалением, вызванным хронической инфекцией (Kreda et al., Cold Spring Harb. Perspect. Med., 2012, a009589). Воспаление, в свою очередь, вызывается снижением уровня циклического аденозинмонофосфата (цАМФ). Как известно, цАМФ представляет собой молекулу «второго мессенджера», которая генерируется ферментом аденилциклазой и участвует в регуляции различных клеточных процессов, включая расслабление гладких мышц дыхательных путей и высвобождение медиатора воспаления. В организме цАМФ гидролизуется специфическими ферментами семейства фосфодиэстераз (PDE), и, таким образом, активация аденилциклазы и/или ингибирование специфических ферментов PDE представляет собой потенциальный механизм, посредством которого функционируют клетки, включая расслабление гладких мышц дыхательных путей и высвобождение медиаторов воспаления. Были идентифицированы одиннадцать генов семейства PDE (PDE1-11). Из них PDE4, который гидролизует цАМФ, является хорошо изученным ферментом, экспрессируемым во многих воспалительных и иммуномодулирующих клетках. Семейство генов PDE4 состоит из четырех генов (PDE4A, B, C, D), каждый из которых имеет несколько вариантов сплайсинга, и экспрессия PDE4 имеет широкое распределение по тканям, включая мозг, желудочно-кишечный тракт, селезенку, легкое, сердце, яичко, почку и почти все типы воспалительных клеток (Abbott-Banner et al., 2014, Basic Clin. Pharmacol. Toxicol., vol. 114, p. 365-376). В легких цАМФ участвует в регуляции многих функций, связанных с воспалительными клетками, мукоцилиарным клиренсом и ремоделированием фиброзных и легочных сосудов. В частности, высокие уровни цАМФ блокируют активность иммунных и воспалительных клеток, таких как нейтрофилы, Т-лимфоциты и макрофаги (Soto et al., Curr. Opin. Pulm. Med., 2005, vol. 11, p. 129-134).Cystic fibrosis is also typically characterized by excessive production of mucus, i.e., a viscoelastic biological material that is a composite of components secreted apically (luminally) by epithelial and glandular cells and coats and protects the apical surfaces of the respiratory, gastrointestinal, and reproductive epithelial tracts. Excessive production of mucus glycoproteins ("mucins") and mucus blockage are usually most detrimental in the airways of patients with cystic fibrosis. However, excess mucus production is not currently understood as a direct cause of the defective CFTR protein, but rather as a subsequent manifestation; it has been shown that in the lungs, mucin gene expression is triggered by chronic infection-induced inflammation (Kreda et al., Cold Spring Harb. Perspect. Med., 2012, a009589). Inflammation, in turn, is caused by a decrease in the level of cyclic adenosine monophosphate (cAMP). As is known, cAMP is a “second messenger” molecule that is generated by the enzyme adenyl cyclase and is involved in the regulation of various cellular processes, including relaxation of the smooth muscles of the respiratory tract and the release of an inflammatory mediator. In the body, cAMP is hydrolyzed by specific enzymes of the phosphodiesterase (PDE) family, and thus activation of adenyl cyclase and/or inhibition of specific PDE enzymes is a potential mechanism by which cells function, including relaxation of airway smooth muscle and release of inflammatory mediators. Eleven PDE family genes (PDE1-11) have been identified. Of these, PDE4, which hydrolyzes cAMP, is a well-studied enzyme expressed in many inflammatory and immunomodulatory cells. The PDE4 gene family consists of four genes (PDE4A, B, C, D), each with multiple splicing variants, and PDE4 expression has a wide tissue distribution, including brain, gastrointestinal tract, spleen, lung, heart, testis, kidney and almost all types of inflammatory cells (Abbott-Banner et al., 2014, Basic Clin. Pharmacol. Toxicol., vol. 114, p. 365-376). In the lungs, cAMP is involved in the regulation of many functions related to inflammatory cells, mucociliary clearance, and remodeling of fibrous and pulmonary vessels. In particular, high levels of cAMP block the activity of immune and inflammatory cells such as neutrophils, T-lymphocytes and macrophages (Soto et al., Curr. Opin. Pulm. Med., 2005, vol. 11, p. 129-134).

Таким образом, было предположено, что агент, повышающий уровень цАМФ, такой как ингибитор PDE4, мог бы быть полезным при лечении респираторных заболеваний, связанных с избыточной выработкой слизи, таких как ХОБЛ и бронхит (Page et al., Curr. Opin. Pharmacol., 2012, vol. 12, p. 275-286), и, возможно, муковисцидоз. Действительно, было показано, что некоторые ингибиторы PDE4 ингибируют высвобождение воспалительных цитокинов и медиаторов из воспалительных клеток, ингибируют миграционную активность этих клеток и могут даже способствовать их апоптозу (Kawamatawong, J. Thorac. Dis., 2017, vol. 9, p. 1144-1154). Рофлумиласт (3-цикло-пропилметокси-4-дифторметокси-N-[3,5-дихлорпирид-4-ил]-бензамид; Hatzelmann et al., 2001, Pharmacol. Exp. Ther. Vol. 297, p. 267-279) является ингибитором PDE4, который был клинически одобрен для применения у пациентов с ХОБЛ с хроническим бронхитом (например, Beghè et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2013, vol. 188, p. 271-278). Альтернативные ингибиторы PDE4, предлагаемые для лечения заболеваний дыхательных путей, характеризующихся обструкцией дыхательных путей, включают 1-фенил-2-пиридинилалкиленовые спирты и их производные (WO 2008/006509 A1, WO 2009/018909 A2 и WO 2010/089107 A1).Thus, it has been suggested that a cAMP raising agent, such as a PDE4 inhibitor, might be useful in the treatment of mucus-producing respiratory diseases such as COPD and bronchitis (Page et al., Curr. Opin. Pharmacol. , 2012, vol. 12, pp. 275-286), and possibly cystic fibrosis. Indeed, some PDE4 inhibitors have been shown to inhibit the release of inflammatory cytokines and mediators from inflammatory cells, inhibit the migratory activity of these cells, and may even promote their apoptosis (Kawamatawong, J. Thorac. Dis., 2017, vol. 9, p. 1144- 1154). Roflumilast (3-cyclo-propylmethoxy-4-difluoromethoxy-N-[3,5-dichloropyrid-4-yl]-benzamide; Hatzelmann et al., 2001, Pharmacol. Exp. Ther. Vol. 297, p. 267-279 ) is a PDE4 inhibitor that has been clinically approved for use in COPD patients with chronic bronchitis (e.g., Beghè et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2013, vol. 188, p. 271-278) . Alternative PDE4 inhibitors proposed for the treatment of airway diseases characterized by airway obstruction include 1-phenyl-2-pyridinylalkylene alcohols and their derivatives (WO 2008/006509 A1, WO 2009/018909 A2 and WO 2010/089107 A1).

цАМФ-стимулируемая протеинкиназа (PKA) и PKA в свою очередь, активирует белок CFTR (Blanchard et al., 2014, FASEB J., vol. 28, p. 791-801). Таким образом, было высказано предположение, что повышение уровня цАМФ за счет активации аденилциклазы и/или путем ингибирования фосфодиэстеразы может восстановить CFTR-зависимый транспорт ионов в клетках, экспрессирующих эндогенный ΔF508-CFTR; однако такие попытки были в целом неудачными (Schultz et al., 1999, J. Membr. Biol., vol. 170, p. 51-66; Grubb et al., 1993, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., vol. 8, p. 454-460, рассмотрено Blanchard et al., выше).cAMP-stimulated protein kinase (PKA) and PKA in turn activate the CFTR protein (Blanchard et al., 2014, FASEB J., vol. 28, p. 791-801). Thus, it has been suggested that increasing cAMP levels by activating adenyl cyclase and/or by inhibiting phosphodiesterase can restore CFTR-dependent ion transport in cells expressing endogenous ΔF508-CFTR; however, such attempts have been generally unsuccessful (Schultz et al., 1999, J. Membr. Biol., vol. 170, p. 51-66; Grubb et al., 1993, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. , vol.8, pp. 454-460, reviewed by Blanchard et al., supra).

CFTR-модуляторыCFTR modulators

CFTR-зависимый транспорт ионов зависит от количества (правильно свернутого) белка CFTR на клеточной мембране, а также от активности указанного белка CFTR. Ранее были исследованы различные агенты, влияющие на белок CFTR, положительные и отрицательные. Основываясь на этом исследовании фармацевтические активные ингредиенты, которые были протестированы или предложены для воздействия на белок CFTR, можно разделить на отдельные категории: (1) CFTR-корректоры, то есть агенты, которые способствуют коррекции уровней (мутантного) белка CFTR на поверхности клеток, (2) CFTR-потенциаторы, то есть агенты, которые увеличивают функциональность (мутантного) белка CFTR на поверхности клеток, и (3) усилители CFTR, то есть агенты, которые увеличивают уровни CFTR во всех классах мутаций (Miller et al., 2016, Am. J. Respir. Crit. Care Med., vol. 193, A 5574), в одной теоретической модели путем стабилизации мРНК CFTR (Molinski et al., 2017, EMBO Molecular Medicine, vol. 9, p. 1224-1243), хотя термин «усилитель CFTR», как используется в настоящем документе, не ограничивается указанной теоретической моделью. Вместе CFTR-потенциаторы, CFTR-корректоры и усилители CFTR называются «модуляторами CFTR» (Kuk et al., 2015, Ther. Adv. Resp. Dis., vol. 9, p. 313-326; Molinski et al., 2017, EMBO Molecular Medicine, vol. 9, p. 1224-1243). Также были предложены комбинированные терапевтические средства, состоящие из потенциатора и/или корректора и/или усилителя. Недавний прогресс в этой области показал, что надлежащий выбор потенциатора и корректора зависит, среди прочего, от генотипа пациента с муковисцидозом, подлежащего лечению.CFTR-dependent ion transport depends on the amount of (correctly folded) CFTR protein on the cell membrane as well as on the activity of said CFTR protein. Previously, various agents that affect the CFTR protein, positive and negative, have been investigated. Based on this study, pharmaceutical active ingredients that have been tested or proposed to act on the CFTR protein can be divided into separate categories: (1) CFTR correctors, i.e. agents that correct the levels of (mutant) CFTR protein on the cell surface, ( 2) CFTR potentiators, that is, agents that increase the functionality of the (mutant) CFTR protein on the cell surface, and (3) CFTR enhancers, that is, agents that increase CFTR levels in all mutation classes (Miller et al., 2016, Am J. Respir. Crit. Care Med., vol. 193, A 5574), in one theoretical model by stabilizing CFTR mRNA (Molinski et al., 2017, EMBO Molecular Medicine, vol. 9, p. 1224-1243), although the term "CFTR amplifier" as used herein is not limited to this theoretical model. Together, CFTR potentiators, CFTR equalizers, and CFTR amplifiers are referred to as "CFTR modulators" (Kuk et al., 2015, Ther. Adv. Resp. Dis., vol. 9, p. 313-326; Molinski et al., 2017, EMBO Molecular Medicine, vol 9, pp 1224-1243). Combination therapeutic agents have also been proposed, consisting of a potentiator and/or corrector and/or enhancer. Recent progress in this field has shown that the proper choice of potentiator and corrector depends, among other things, on the genotype of the CF patient being treated.

В целом, CFTR-потенциаторы представляют собой агенты, которые влияют на активность белка CFTR; для функционирования этих молекул необходимо, чтобы CFTR как таковой присутствовал на поверхности эпителиальных клеток. Фармацевтический агент ивакафтор (VX 770) является таким потенциатором каналов CFTR с нарушенными хлорид/бикарбонатным гейтингом или проводимостью, но присутствующих на поверхности эпителиальных клеток, таких как мутанта CFTR G551D (гейтирующий мутант) и R117H (мутант проводимости); это увеличивает вероятность открытия таких каналов. Однако ивакафтор является лишь одобренным для фармацевтического использования при лечении нескольких таких специфических мутаций белка CFTR, что представляет небольшую подгруппу пациентов с муковисцидозом (Kuk et al., 2015, Ther. Adv. Resp. Dis., vol. 9, p. 313-326).In general, CFTR potentiators are agents that affect the activity of the CFTR protein; for these molecules to function, CFTR as such must be present on the surface of epithelial cells. The pharmaceutical agent ivacaftor (VX 770) is such a potentiator of CFTR channels with impaired chloride/bicarbonate gating or conductance but present on the surface of epithelial cells, such as the CFTR G551D mutant (gating mutant) and R117H (conductance mutant); this increases the likelihood of opening such channels. However, ivacaftor is only approved for pharmaceutical use in the treatment of a few of these specific CFTR protein mutations, representing a small subset of patients with cystic fibrosis (Kuk et al., 2015, Ther. Adv. Resp. Dis., vol. 9, p. 313-326 ).

Обычно CFTR-корректоры являются агентами, которые могут вызывать увеличение количества молекул CFTR на поверхности эпителиальных клеток; считается, что они действуют как шапероны в процессе сворачивания и/или внутриклеточного транспорта CFTR. Лумакафтор (VX809) является таким CFTR-корректором; однако, сам по себе он до сих пор не был одобрен для фармацевтического использования. В общем, известные CFTR-корректоры не являются цАМФ-зависимыми. Не желая быть связанными с конкретной теорией, в настоящее время предполагается, что некоторые ингибиторы PDE4, такие как рофлумиласт и CFTR-потенциатор ивакафтор (VX-770), вызывают общий стимулирующий нисходящий эффект на активацию CFTR. Согласно настоящему пониманию в данной области техники ингибиторы PDE4, такие как рофлумиласт, однако, как правило, не классифицируются как CFTR-потенциаторы.Typically, CFTR correctors are agents that can cause an increase in the number of CFTR molecules on the surface of epithelial cells; they are thought to act as chaperones in the folding and/or intracellular transport of CFTR. Lumacaftor (VX809) is such a CFTR corrector; however, it has not yet been approved for pharmaceutical use on its own. In general, known CFTR correctors are not cAMP dependent. Without wishing to be bound by a particular theory, it is currently hypothesized that certain PDE4 inhibitors, such as roflumilast and the CFTR potentiator ivacaftor (VX-770), cause a general downstream stimulatory effect on CFTR activation. According to the present understanding in the art, PDE4 inhibitors such as roflumilast, however, are generally not classified as CFTR potentiators.

Также были предприняты попытки объединить использование различных агентов при лечении муковисцидоза или для поиска агентов, которые оказывают более одного желаемого эффекта в ослаблении симптомов или борьбе с причинами муковисцидоза; такие попытки до сих пор сдерживались возникновением побочных эффектов или ограничивались очень маленькими подгруппами пациентов. Некоторые примеры описаны ниже.Attempts have also been made to combine the use of different agents in the treatment of cystic fibrosis or to find agents that have more than one desired effect in relieving the symptoms or combating the causes of cystic fibrosis; such attempts have so far been hampered by side effects or limited to very small subsets of patients. Some examples are described below.

В WO 2015/175773 A1 упоминается использование ингибитора PDE4 в комбинации с одним или несколькими CFTR-потенциаторами, такими как ивакафтор, и/или одним или несколькими CFTR-корректорами, такими как лумакафтор, но не приводятся экспериментальные доказательства какого-либо потенциального преимущества, связано с таким комбинированным применением. Специально для лечения подгруппы пациентов с муковисцидозом, а именно тех, кто гомозиготен по ΔF508 - хотя CFTR-потенциатор ивакафтор (VX 770) был признан терапевтически недостаточным (Kuk et al., 2015, Ther. Adv. Resp. Dis., vol. 9, p. 313-326) - совместное введение ивакафтора (VX 770) с CFTR-корректором лумакафтора (VX809) было признано удовлетворительным (Wainwright et al., 2015, N. Engl. J. Med., vol. 373, p. 220-231). До настоящего времени не было идентифицировано ни одного агента, подходящего для лечения пациентов с муковисцидозом, характеризующихся меньшей величиной мутации в гене CFTR, которая является причиной неправильного процессинга и/или сворачивания белка CFTR, не говоря уже о клиническом развитии.WO 2015/175773 A1 mentions the use of a PDE4 inhibitor in combination with one or more CFTR potentiators such as ivacaftor and/or one or more CFTR correctors such as lumacaftor, but does not provide experimental evidence for any potential benefit associated with this combination. Specifically for the treatment of a subgroup of patients with cystic fibrosis, namely those who are homozygous for ΔF508 - although the CFTR potentiator ivacaftor (VX 770) has been found to be therapeutically inadequate (Kuk et al., 2015, Ther. Adv. Resp. Dis., vol. 9 , p. 313-326) - the co-administration of ivacaftor (VX 770) with the CFTR corrector lumacaftor (VX809) was found to be satisfactory (Wainwright et al., 2015, N. Engl. J. Med., vol. 373, p. 220 -231). So far, no agent has been identified that is suitable for the treatment of patients with cystic fibrosis, characterized by a smaller mutation in the CFTR gene, which causes incorrect processing and/or folding of the CFTR protein, not to mention clinical development.

Несмотря на все еще неполное знание механизмов заболевания муковисцидозом широко распространено мнение, что патология органов при муковисцидозе может быть облегчена путем коррекции дефектов сворачивания и/или дефектов процессинга мутантного CFTR, таким образом восстанавливая функциональную экспрессию мутантного CFTR (такого как ΔF508 CFTR; Lukacs et al., 2012, Trends Mol. Med., vol. 18, p. 81-91).Despite still incomplete knowledge of the disease mechanisms of cystic fibrosis, it is widely believed that organ pathology in cystic fibrosis can be alleviated by correcting the folding and/or processing defects of the mutant CFTR, thereby restoring functional expression of the mutant CFTR (such as ΔF508 CFTR; Lukacs et al. , 2012, Trends Mol. Med., vol. 18, pp. 81-91).

Таким образом, все еще существует потребность в разработке эффективных методов лечения муковисцидоза, как на уровне процессинга CFTR, так и сворачивания и стабильности, так и на уровне активности CFTR (гейтинга/проводимости). В частности, существует потребность в удовлетворительном лечении тех субъектов, которые подвержены или подвержены сниженным процессингу и/или сворачиванию CFTR. Было высказано предположение, что идеальной терапией для муковисцидоза был бы единственный агент, который нормализует сворачивание, процессинг и функционирование мутантного CFTR, чтобы они напоминал таковые у CFTR дикого типа (Rowe et al., Cold Spring Harb. Perspect. Med., 2013, vol. 3, a009761), однако такой агент еще не описан. Например, в WO 2015/175773 A1 упоминается, что CFTR-потенциаторы и/или CFTR-корректоры могут быть использованы в комбинации с некоторыми другими соединениями с in vitro ингибирующей активностью в отношении PDE4, но экспериментальные данные для предложенного комбинированного применения не предоставлены, а однократное использование не является терапевтически эффективным. Поэтому поиск подходящих агентов продолжается.Thus, there is still a need to develop effective treatments for cystic fibrosis, both at the level of CFTR processing, folding and stability, and at the level of CFTR activity (gating/conduction). In particular, there is a need for satisfactory treatment of those subjects who are or are susceptible to reduced CFTR processing and/or folding. It has been suggested that the ideal therapy for cystic fibrosis would be a single agent that normalizes the folding, processing, and function of mutant CFTR to resemble those of wild-type CFTR (Rowe et al., Cold Spring Harb. Perspect. Med., 2013, vol. . 3, a009761), but such an agent has not yet been described. For example, WO 2015/175773 A1 mentions that CFTR potentiators and/or CFTR correctors can be used in combination with certain other compounds with in vitro PDE4 inhibitory activity, but experimental data for the proposed combined use is not provided, but a single use is not therapeutically effective. Therefore, the search for suitable agents continues.

Решаемая задачаProblem being solved

Таким образом, цель настоящего изобретения включает устранение недостатков, имеющихся согласно предшествующему уровню техники. Конкретные цели включают обеспечение надежного лечения муковисцидоза, которое удобно применять и которое не связано с неоправданными нежелательными эффектами, включая лечение подгрупп пациентов с муковисцидозом, для которых на сегодняшний день не существует полностью удовлетворительного лечения. Различные недостатки предшествующего уровня техники определяют дальнейшие цели для улучшения, к которым обращаются изобретатели настоящего изобретения, и эти цели достигаются благодаря достижению, описанному и заявленному в настоящем документе.Thus, the aim of the present invention is to overcome the disadvantages of the prior art. Specific goals include providing a reliable treatment for cystic fibrosis that is convenient to use and that is not associated with undue adverse effects, including the treatment of subgroups of patients with cystic fibrosis for which there is currently no completely satisfactory treatment. Various shortcomings of the prior art define further goals for improvement addressed by the inventors of the present invention, and these goals are achieved due to the achievement described and claimed in this document.

Сущность изобретенияThe essence of the invention

Настоящее изобретение относится к лечению муковисцидоза. В частности, настоящее изобретение может быть использовано для лечения или профилактики муковисцидоза у субъектов, характеризующихся по меньшей мере одной мутацией в гене CFTR, которая является причиной неправильного сворачивания и/или процессинга белка CFTR.The present invention relates to the treatment of cystic fibrosis. In particular, the present invention can be used to treat or prevent cystic fibrosis in subjects having at least one mutation in the CFTR gene that causes misfolding and/or processing of the CFTR protein.

В частности, настоящее изобретение относится к соединению для применения при профилактике и/или лечении муковисцидоза у субъекта, где субъект характеризуется по меньшей мере одной мутацией в гене CFTR, которая является причиной неправильного сворачивания и/или процессинга белка CFTR, и где соединение представляет собой соединение общей формулы (I)In particular, the present invention relates to a compound for use in the prevention and/or treatment of cystic fibrosis in a subject, wherein the subject has at least one mutation in the CFTR gene that causes misfolding and/or processing of the CFTR protein, and wherein the compound is a compound general formula (I)

(I)(I)

где:where:

n обозначает 0 или 1;n is 0 or 1;

R1 и R2 могут быть одинаковыми или разными, и выбраны из группы, включающей:R1 and R2 may be the same or different and are selected from the group consisting of:

- линейный или разветвленный C₁-C₆ алкил, необязательно замещенный одним или несколькими атомами галогена;- linear or branched C ₁ -C ₆ alkyl, optionally substituted with one or more halogen atoms;

- OR3, где R3 представляет собой линейный или разветвленный C₁-C₆ алкил, необязательно замещенный одним или несколькими атомами галогена или C₃-C₇ циклоалкильными группами; и- OR3, where R3 represents a linear or branched C ₁ -C ₆ alkyl, optionally substituted with one or more halogen atoms or C ₃ -C ₇ cycloalkyl groups; and

- HNSO₂R4, где R4 представляет собой линейный или разветвленный C₁-C₄ алкил, необязательно замещенный одним или несколькими атомами галогена,- HNSO ₂ R4, where R4 is a linear or branched C ₁ -C ₄ alkyl optionally substituted with one or more halogen atoms,

- где по меньшей мере один из R1 и R2 представляет собой HNSO₂R4,- where at least one of R1 and R2 is HNSO ₂ R4,

его фармацевтически приемлемые неорганические или органические соли, гидраты, сольваты или аддитивные комплексы,its pharmaceutically acceptable inorganic or organic salts, hydrates, solvates or additive complexes,

и где соединение является (-) энантиомером.and where the compound is the (-) enantiomer.

Предпочтительно, в соединении общей формулы (I) для применения в соответствии с настоящим изобретением, R1 представляет собой HNSO₂R4; R4 соответствует метилу. Предпочтительно, в соединении общей формулы (I) для применения в соответствии с настоящим изобретением, R2 представляет собой OR3; R3 соответствует циклопропилметилу. Предпочтительно, в соединении общей формулы (I) для применения в соответствии с настоящим изобретением, n обозначает 1.Preferably, in the compound of general formula (I) for use in accordance with the present invention, R1 is HNSO ₂ R4; R4 corresponds to methyl. Preferably, in a compound of general formula (I) for use in accordance with the present invention, R2 is OR3; R3 corresponds to cyclopropylmethyl. Preferably, in a compound of general formula (I) for use in accordance with the present invention, n is 1.

В одном варианте осуществления изобретения соединение формулы (I) является соединением, в котором R1 представляет собой HNSO₂R4, где R4 представляет собой метил, R2 представляет собой OR3, где R3 представляет собой циклопропилметил, и n обозначает 0.In one embodiment of the invention, the compound of formula (I) is a compound in which R1 is HNSO ₂ R4 where R4 is methyl, R2 is OR3 where R3 is cyclopropylmethyl and n is 0.

В одном варианте осуществления изобретения соединение формулы (I) является соединением, в котором R1 представляет собой OR3, R2 представляет собой HNSO₂R4, где R4 представляет собой метил, и n обозначает 1.In one embodiment of the invention, the compound of formula (I) is a compound in which R1 is OR3, R2 is HNSO ₂ R4 where R4 is methyl and n is 1.

В одном варианте осуществления изобретения соединение формулы (I) является соединением, в котором R1 представляет собой метил, R2 представляет собой HNSO₂R4, где R4 представляет собой метил, и n обозначает 1.In one embodiment of the invention, the compound of formula (I) is a compound in which R1 is methyl, R2 is HNSO ₂ R4 where R4 is methyl and n is 1.

В одном варианте осуществления изобретения соединение формулы (I) является соединением, в котором оба R1 и R2 представляют собой HNSO₂R4, где R4 представляет собой метил, и n обозначает 0.In one embodiment of the invention, the compound of formula (I) is a compound in which both R1 and R2 are HNSO ₂ R4 where R4 is methyl and n is 0.

В одном варианте осуществления изобретения соединение формулы (I) является соединением, в котором оба R1 и R2 представляют собой HNSO₂R4, где R4 представляет собой метил, и n обозначает 1.In one embodiment of the invention, the compound of formula (I) is a compound in which both R1 and R2 are HNSO ₂ R4 where R4 is methyl and n is 1.

Субъектом, у которого можно предотвратить или лечить муковисцидоз согласно настоящему изобретению, является млекопитающее, предпочтительно, человек.The subject in which cystic fibrosis can be prevented or treated according to the present invention is a mammal, preferably a human.

В настоящем изобретении соединение формулы (I) вводят субъекту. В частности, все аспекты и варианты осуществлений по настоящему изобретению предусматривают, что соединение формулы (I) вводят субъекту, нуждающемуся в этом. Субъектом, нуждающимся в этом, является субъект, для которого характерно наличие по меньшей мере одной мутации в гене CFTR, которая является причиной неправильного сворачивания и/или процессинга белка CFTR, как подробно описано в данном описании.In the present invention, a compound of formula (I) is administered to a subject. In particular, all aspects and embodiments of the present invention provide that the compound of formula (I) is administered to a subject in need thereof. A subject in need of this is one that is characterized by the presence of at least one mutation in the CFTR.beta . gene that causes misfolding and/or processing of the CFTR protein, as detailed herein.

В первом конкретном варианте осуществления изобретения указанный субъект характеризуется по меньшей мере одной мутацией в гене CFTR, которая является причиной неправильного сворачивания белка CFTR. Любые мутации такого рода также упоминаются в настоящем документе как «мутация с нарушением сворачивания», термин, который применим как к уровню белка, так и к уровню нуклеиновой кислоты, которая его кодирует. Этот вариант осуществления включает мутацию ΔF508 по меньшей мере на одном аллеле. Таким образом, предпочтительно, у испытуемого человека, характеризующегося по меньшей мере одной мутацией гена CFTR, по меньшей мере одной мутацией является мутация ΔF508, кодируемая геном CFTR. Более предпочтительно, указанный испытуемый человек, или, точнее, геном испытуемого человека, гомозиготен по мутации ΔF508.In a first specific embodiment of the invention, said subject is characterized by at least one mutation in the CFTR.beta . gene that causes misfolding of the CFTR protein. Any mutations of this kind are also referred to herein as "disfolding mutation", a term that applies to both the level of the protein and the level of the nucleic acid that encodes it. This embodiment includes the ΔF508 mutation on at least one allele. Thus, preferably, in a human test subject having at least one CFTRα gene mutation, at least one mutation is the CFTRα gene-encoded ΔF508 mutation. More preferably, said human subject, or more specifically the subject human genome, is homozygous for the ΔF508 mutation.

Во втором конкретном варианте осуществления изобретения указанный субъект характеризуется по меньшей мере одной мутацией в гене CFTR, которая является причиной неправильного процессинга белка CFTR. Любая мутация такого рода также упоминается в настоящем документе как «мутация процессинга», термин, который применим как к уровню белка, так и к уровню нуклеиновой кислоты, которая его кодирует. Первый и второй конкретные варианты осуществления не обязательно являются взаимоисключающими.In a second specific embodiment of the invention, the specified subject is characterized by at least one mutation in the CFTR gene, which causes incorrect processing of the CFTR protein. Any mutation of this kind is also referred to herein as a "processing mutation", a term that applies to both the level of the protein and the level of the nucleic acid that encodes it. The first and second specific embodiments are not necessarily mutually exclusive.

Предпочтительно, по меньшей мере одна мутация представляет собой геномную мутацию гена CFTR. Предпочтительно, по меньшей мере одна мутация представляет собой мутацию гена CFTR, присутствующую в клетках дыхательных путей указанного субъекта.Preferably, at least one mutation is a genomic mutation of the CFTR gene. Preferably, at least one mutation is a mutation of the CFTR gene present in the cells of the respiratory tract of the specified subject.

В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение, соответствующее общей формуле (I), для применения по настоящему изобретению также обладает ингибирующей активностью в отношении PDE4. Не желая связываться с какой-либо конкретной теорией, однако предусматривается, что ингибирование PDE4 не является необходимым и/или недостаточным для объяснения механизма влияния соединения общей формулы (I) на белок CFTR, кодируемый геном CFTR, имеющим меньшей мере одну мутацию, в соответствии с настоящим изобретением.In some embodiments, the compound of general formula (I) for use in the present invention also has PDE4 inhibitory activity. Without wishing to be bound by any particular theory, however, it is contemplated that inhibition of PDE4 is not necessary and/or insufficient to explain the mechanism of the effect of the compound of general formula (I) on the CFTR protein encoded by the CFTR gene having at least one mutation, in accordance with the present invention.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный субъект страдает от симптомов муковисцидоза в дыхательных путях. В некоторых вариантах указанный субъект страдает от симптомов муковисцидоза в желудочно-кишечном тракте. В некоторых вариантах указанный субъект страдает от симптомов муковисцидоза в дыхательных путях, а также в желудочно-кишечном тракте.In some embodiments of the invention, the specified subject suffers from symptoms of cystic fibrosis in the respiratory tract. In some embodiments, said subject is suffering from symptoms of cystic fibrosis in the gastrointestinal tract. In some embodiments, the specified subject suffers from symptoms of cystic fibrosis in the respiratory tract, as well as in the gastrointestinal tract.

В одном варианте осуществления изобретения соединение общей формулы (I) вводят путем ингаляции.In one embodiment of the invention, the compound of general formula (I) is administered by inhalation.

В одном варианте осуществления изобретения соединение общей формулы (I) вводится с помощью устройства, выбранного из одно- или многодозового ингалятора сухого порошка, ингалятора отмеренных доз и ингалятора мягкого тумана.In one embodiment of the invention, the compound of general formula (I) is administered using a device selected from a single or multiple dose dry powder inhaler, a metered dose inhaler, and a soft mist inhaler.

В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение общей формулы (I) используют или вводят в комбинации по меньшей мере с одним вторым фармацевтически активным компонентом. По меньшей мере один второй фармацевтически активный компонент, предпочтительно, не является соединением общей формулы (I). В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одно второе фармацевтически активное соединение представляет собой CFTR-корректор, такой как, например, лумакафтор. Во втором предпочтительном варианте осуществления изобретения второе фармацевтически активное соединение представляет собой CFTR-потенциатор, такой как, например, ивакафтор. В третьем предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одно второе фармацевтически активное соединение представляет собой комбинацию CFTR-корректора и CFTR-потенциатора; другими словами, как CFTR-корректор, таки и CFTR-потенциатор могут быть введены вместе с соединением по изобретению.In some embodiments, a compound of general formula (I) is used or administered in combination with at least one second pharmaceutically active ingredient. At least one second pharmaceutically active component is preferably not a compound of general formula (I). In one preferred embodiment of the invention, the at least one second pharmaceutically active compound is a CFTR corrector, such as, for example, lumacaftor. In a second preferred embodiment of the invention, the second pharmaceutically active compound is a CFTR potentiator such as, for example, ivacaftor. In a third preferred embodiment of the invention, at least one second pharmaceutically active compound is a combination of a CFTR corrector and a CFTR potentiator; in other words, both the CFTR corrector and the CFTR potentiator may be administered together with the compound of the invention.

Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention

В следующем далее подробном описании представлены конкретные и/или предпочтительные варианты отдельных признаков изобретения. В настоящее изобретение также рассматриваются в качестве особенно предпочтительных вариантов осуществления такие варианты осуществления изобретения, которые создаются путем объединения двух или более конкретных и/или предпочтительных вариантов, описанных для двух или более признаков настоящего изобретения.The following detailed description presents specific and/or preferred embodiments of individual features of the invention. The present invention also contemplates as particularly preferred embodiments those embodiments of the invention which are created by combining two or more specific and/or preferred embodiments described for two or more features of the present invention.

Специалисту в данной области понятно, что изобретению, описанному в настоящем документе, могут быть присущи изменения и модификации, отличные от описанных конкретно. Таким образом, специалисту в данной области техники будет очевидно, что настоящее описание включает все такие вариации и модификации. Описание также включает все объекты, соединения, признаки, стадии, способы или композиции, упомянутые или указанные в настоящем описании, отдельно или вместе, и любые и все комбинации или любые два или более указанных объектов, соединений, признаков, стадий, способов или композиций. Таким образом, если в настоящем документе не указано иное, или контекст не требует иного, ссылка на отдельный объект, соединение, признак, стадию, способ или композицию должна быть принята как охватывающая один и множество (то есть более одного, например, два или более, три или более или все) этих объектов, соединений, признаков, стадий, способов или композиций.The person skilled in the art will appreciate that the invention described herein may be subject to changes and modifications other than those specifically described. Thus, a person skilled in the art will be obvious that the present description includes all such variations and modifications. The description also includes all the objects, compounds, features, steps, methods or compositions mentioned or referred to in the present description, alone or together, and any and all combinations or any two or more of these objects, compounds, features, steps, methods or compositions. Thus, unless otherwise indicated herein, or the context otherwise requires, reference to a single entity, compound, feature, step, method, or composition is to be taken as encompassing one and many (i.e., more than one, e.g., two or more , three or more or all) of these objects, compounds, features, steps, methods or compositions.

Настоящее изобретение не ограничивается конкретными вариантами осуществления, описанными в данном документе, которые предоставлены в данном документе в целях иллюстрации и пояснения. Функционально или иным образом эквивалентные объекты, соединения, признаки, стадии, способы или композиции входят в объем настоящего изобретения.The present invention is not limited to the specific embodiments described herein, which are provided herein for purposes of illustration and explanation. Functionally or otherwise equivalent objects, compounds, features, steps, methods, or compositions are within the scope of the present invention.

Если специально не указано иное или из контекста не требуется иного, каждый вариант осуществления, аспект и пример, описанные в данном документе, должны рассматриваться как применимые и комбинируемые с любым другим вариантом осуществления, аспектом или примером, описанным в настоящем документе.Unless otherwise specifically noted or the context requires otherwise, each embodiment, aspect, and example described herein is to be considered applicable and combinable with any other embodiment, aspect, or example described herein.

Каждый документ, цитируемый в настоящем документе (включая все патенты, патентные заявки, научные публикации, спецификации производителя, инструкции, презентации и т. д.), независимо от того, указаны ли они выше или ниже, настоящим полностью включены в качестве ссылки. Ничто в настоящем документе не должно быть истолковано как признание того, что настоящее изобретение не вправе предшествовать конкретной рекомендации.Every document cited herein (including all patents, patent applications, scientific publications, manufacturer's specifications, instructions, presentations, etc.), whether cited above or below, is hereby incorporated by reference in its entirety. Nothing in this document should be construed as an admission that the present invention is not entitled to precede a specific recommendation.

Если специально не указано иное, все используемые в настоящем документе технические и научные термины имеют то же значение, которое обычно понятно специалистам в данной области (например, в области генетики, молекулярной биологии, экспрессии генов, клеточной биологии, клеточной культуры, медицины, анатомии, гистологии, иммунологии, иммуногистохимии, неорганической и органической химии, химии белка и биохимии). В опубликованных учебниках и обзорных статьях, например, на английском языке, обычно определено значение, общепринятое для специалиста в данной области.Unless otherwise specifically noted, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as is commonly understood by those skilled in the art (e.g., genetics, molecular biology, gene expression, cell biology, cell culture, medicine, anatomy, histology, immunology, immunohistochemistry, inorganic and organic chemistry, protein chemistry and biochemistry). Published textbooks and review articles, for example, in English, usually define the value generally accepted by a person skilled in the art.

Выражение «и/или», например «X и/или Y», следует понимать как означающее «X и Y» или «X или Y», и должны быть приняты для предоставления ясного описания «и», «или» и обоих значений («и» или «или»).The expression "and/or", for example "X and/or Y", should be understood to mean "X and Y" or "X or Y", and should be taken to provide a clear description of "and", "or" and both ("and" or "or").

Как используется в настоящем документе, если не указано иное, термины «около», «прибл.» и «по существу», все они означают приблизительно или почти, и в контексте изложенного в настоящем документе числового значения или диапазона, предпочтительно, обозначают +/-10%, более предпочтительно, +/-5%, вокруг числового значения или диапазона, указанного или заявленного.As used in this document, unless otherwise indicated, the terms "about", "approx." and "essentially", they all mean approximately or almost, and in the context of the numerical value or range set forth herein, preferably means +/-10%, more preferably +/-5%, around the numerical value or range specified or declared.

Во всех случаях, когда дается ссылка на агент, такой как молекула, тогда фармацевтически приемлемые неорганические или органические соли, гидраты, сольваты или их аддитивные комплексы входят в объем настоящего изобретения и полностью охватываются данным описанием, а также самим соответствующим агентом. Таким образом, в изобретение также включены фармацевтические композиции, которые включают агент, описанный в настоящем документе, и фармацевтически приемлемые носители или разбавители, а также способы доставки указанных агентов или композиций пациентам путем введения пациентам таких агентов или композиций.Whenever reference is made to an agent, such as a molecule, then pharmaceutically acceptable inorganic or organic salts, hydrates, solvates, or additive complexes thereof are within the scope of the present invention and are fully covered by this description, as well as by the corresponding agent itself. Thus, the invention also includes pharmaceutical compositions that include an agent described herein and pharmaceutically acceptable carriers or diluents, as well as methods of delivering said agents or compositions to patients by administering such agents or compositions to patients.

Если явно не указано иное, слово «содержит» или варианты, такие как «включает» или «содержащий», используется в контексте настоящего документа чтобы указать, что в дополнение к членам списка, представленного как «содержащие», могут необязательно присутствовать дополнительные члены. Однако в качестве конкретного варианта осуществления настоящего изобретения предполагается, что термин «содержащий» включает в себя возможность отсутствия дополнительных элементов, то есть для цели этого варианта осуществления «содержащий» следует понимать как имеющий значение «состоящий из».Unless explicitly stated otherwise, the word "comprises" or variants such as "includes" or "comprising" is used in the context of this document to indicate that additional members may optionally be present in addition to the members of the list represented as "comprising". However, as a specific embodiment of the present invention, the term "comprising" is intended to include the possibility of the absence of additional elements, i.e., for the purpose of this embodiment, "comprising" should be understood to mean "consisting of".

Если прямо не указано иное, все указания относительных количеств в отношении настоящего изобретения даются на основе мас./мас. Указания на относительные количества компонента, характеризуемого общим термином, предназначены для обозначения общего количества всех конкретных вариантов или элементов, охватываемых указанным общим термином. Если некоторый компонент, определенный родовым термином, определен как присутствующий в некотором относительном количестве, и если этот компонент, кроме того, охарактеризован как конкретный вариант или элемент, охватываемый общим термином, это означает, что никакие другие варианты или элементы, не охватываемые общим термином, дополнительно не присутствуют, так что общее относительное количество компонентов, охватываемых общим термином, превышает указанное относительное количество; более предпочтительно, никакие другие варианты или члены, охватываемые общим термином, вообще не присутствуют.Unless expressly stated otherwise, all indications of relative quantities in relation to the present invention are given on the basis of wt./wt. References to the relative quantities of a component characterized by a general term are intended to indicate the total amount of all specific variants or elements covered by the specified general term. If a component defined by a generic term is defined as being present in some relative amount, and if that component is further characterized as a particular variant or element covered by the general term, this means that no other variants or elements not covered by the general term, are not additionally present, so that the total relative amount of the components covered by the general term exceeds the specified relative amount; more preferably, no other variants or members covered by the general term are present at all.

Термин «агент», как используется в настоящем документе, если не указано иное, обычно относится к соединению или композиции, предпочтительно, к соединению. Агент способен оказывать воздействие на живой организм и/или на клетку живого организма или полученную из живого организма, например, воздействуя на клетку и/или на ткани организма, или в окружающей среде. Физическое состояние агента особо не ограничивается и, если не указано иное, он может находиться в воздухе, воде и/или быть в твердом состоянии. Тип агента конкретно не ограничен, если не указано иное, и, таким образом, агент может представлять собой химическое вещество и/или биомолекулу, такую как белок или нуклеиновая кислота. Конкретные агенты, определенные в настоящем документе, могут быть использованы в настоящем изобретении.The term "agent" as used herein, unless otherwise indicated, generally refers to a compound or composition, preferably a compound. The agent is capable of affecting a living organism and/or a cell of a living organism or derived from a living organism, for example, by acting on a cell and/or tissues of the organism, or in the environment. The physical state of the agent is not particularly limited, and unless otherwise indicated, it may be in air, water, and/or be in a solid state. The type of agent is not particularly limited unless otherwise indicated, and thus the agent may be a chemical and/or a biomolecule such as a protein or nucleic acid. Specific agents defined herein may be used in the present invention.

«Неблагоприятный эффект», как используется в данном документе, представляет собой нежелательное вредное воздействие, возникающее в результате введения агента (лекарственного средства) субъекту. Неблагоприятные эффекты включают, без ограничения, заболеваемость, смертность, изменение массы тела, уровни ферментов, потерю функции или любые патологические изменения, обнаруживаемые на микроскопическом, макроскопическом или физиологическом уровне. Неблагоприятные эффекты могут вызвать обратимые или необратимые изменения, в том числе увеличение или уменьшение восприимчивости человека к другим химическим веществам, пище или процедурам, таким как лекарственные взаимодействия.An "adverse effect" as used herein is an undesirable adverse effect resulting from the administration of an agent (drug) to a subject. Adverse effects include, without limitation, morbidity, mortality, changes in body weight, enzyme levels, loss of function, or any pathological changes detectable at the microscopic, macroscopic, or physiological level. Adverse effects may cause reversible or irreversible changes, including an increase or decrease in an individual's susceptibility to other chemicals, foods, or procedures such as drug interactions.

Термин «аллель» относится к вариантной форме данного гена (или локуса), например, у субъекта, подлежащего лечению согласно настоящему изобретению. Термин применим к субъектам с двумя наборами хромосом, то есть диплоидным субъектам; соответствующие наборы хромосом упоминаются как гомологичные хромосомы. Если оба аллеля в гене (или локусе) на гомологичных хромосомах одинаковы, то аллели и организм являются «гомозиготными» по отношению к этому гену (или локусу). Если аллели разные, то аллели и организм являются «гетерозиготными» по отношению к этому гену.The term "allele" refers to a variant form of a given gene (or locus), for example, in a subject to be treated according to the present invention. The term applies to subjects with two sets of chromosomes, that is, diploid subjects; the corresponding sets of chromosomes are referred to as homologous chromosomes. If both alleles in a gene (or locus) on homologous chromosomes are the same, then the alleles and the organism are "homozygous" for that gene (or locus). If the alleles are different, then the alleles and the organism are "heterozygous" for that gene.

«Аллельный вариант» относится к изменению нормальной последовательности гена. Полное секвенирование генов часто идентифицирует многочисленные аллельные варианты для данного гена."Allelic variant" refers to a change in the normal sequence of a gene. Whole gene sequencing often identifies multiple allelic variants for a given gene.

«Частота аллелей», как используется в настоящем документе, относится к проценту конкретного аллеля в данной популяции. Для частоты аллелей человека, если не указано иное, данная популяция представляет собой общую популяцию людей на дату вступления в силу настоящего описания, независимо от возраста, расы, этнического или географического происхождения."Allelic frequency" as used herein refers to the percentage of a particular allele in a given population. For human allele frequency, unless otherwise indicated, this population is the total human population as of the effective date of this disclosure, regardless of age, race, ethnicity, or geographic origin.

Термин «муковисцидоз», используемый в данном документе, имеет общее значение, используемое в данной области техники, в его самом широком смысле; несмотря на вышесказанное, конкретные аспекты настоящего изобретения направлены на подгруппу субъектов, пораженных «муковисцидозом». Обычно муковисцидоз представляет собой состояние, вызванное наличием у субъекта мутаций гена белка трансмембранного регулятора проводимости муковисцидоза (CFTR), в настоящем понимании обоих генов (аллелей) белка CFTR у субъекта, хотя настоящее изобретение не обязательно ограничено таким пониманием. «Муковисцидоз» обычно диагностируется с помощью потовой пробы и/или генетического тестирования (O’Sullivan et al., 2009, Lancet, vol. 373, p. 1891-1904), например, путем скрининга новорожденных и/или путем тестирования отдельных субъектов, например в случае подозрения со стороны врача (O’Sullivan et al., выше). Термин «муковисцидоз», как используется в настоящем документе, не ограничен конкретным типом или методом диагностики.The term "cystic fibrosis" as used herein has the general meaning used in the art, in its broadest sense; notwithstanding the foregoing, specific aspects of the present invention are directed to a subgroup of subjects affected by "cystic fibrosis". Typically, cystic fibrosis is a condition caused by a subject having mutations in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein gene, in the present understanding of both genes (alleles) of the CFTR protein in the subject, although the present invention is not necessarily limited to such an understanding. "Cystic fibrosis" is usually diagnosed by sweat and/or genetic testing (O'Sullivan et al., 2009, Lancet, vol. 373, p. 1891-1904), for example, by screening newborns and/or by testing individual subjects, for example, in cases of suspicion by a physician (O'Sullivan et al., supra). The term "cystic fibrosis" as used herein is not limited to a particular type or method of diagnosis.

Термин «CFTR», как используется в настоящем документе, обозначает трансмембранный регулятор проводимости муковисцидоза и может обозначать его форму дикого типа, а также любой его мутант, в частности, мутанты с потерей функции, если контекст не требует иного. «CFTR» в настоящем документе также используется для обозначения гена, кодирующего белок CFTR, дикого типа или мутанта.The term "CFTR" as used herein refers to the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and may refer to its wild-type form, as well as any mutant thereof, in particular loss-of-function mutants, unless the context otherwise requires. " CFTR " is also used herein to refer to the gene encoding the CFTR protein, wild type or mutant.

Термин «модулятор CFTR», как используется в настоящем документе, является общим термином, который относится к агенту, который при контакте с клеткой, экспрессирующей CFTR, или с субъектом, может влиять на сворачивания и/или процессинг и/или гейтинг и/или проводимость белка CFTR. Как правило, модулятор CFTR представляет собой агент, нацеленный на дефект, вызванный одной или несколькими мутациями в гене CFTR. Примерами модуляторов CFTR являются CFTR-корректоры, CFTR-потенциаторы и усилители CFTR.The term "CFTR modulator" as used herein is a generic term that refers to an agent that, when in contact with a CFTR expressing cell or subject, can affect folding and/or processing and/or gating and/or conduction. CFTR protein. Typically, a CFTR modulator is an agent that targets a defect caused by one or more mutations in the CFTR gene. Examples of CFTR modulators are CFTR equalizers, CFTR potentiators, and CFTR amplifiers.

Термин «CFTR-корректор», как используется в настоящем документе, относится к агенту, который при контакте с CFTR-экспрессирующей клеткой или с субъектом оказывает влияние на частичное или полное преодоление дефектного процессинга белка, что обычно приводит к уменьшению присутствия CFTR и/или уменьшенному отображению CFTR. Термин не ограничен каким-либо конкретным способом действия или механистическим объяснением.The term "CFTR corrector", as used herein, refers to an agent that, when in contact with a CFTR-expressing cell or subject, has the effect of partially or completely overcoming defective protein processing, which usually results in a decrease in the presence of CFTR and/or reduced display CFTR. The term is not limited to any particular mode of action or mechanistic explanation.

Термин «CFTR-потенциатор», как используется в данном документе, относится к агенту, который при контакте с CFTR-экспрессирующей клеткой или с субъектом оказывает влияние на частичное или полное преодоление сниженной активности CFTR, такой как пониженная проводимость и/или пониженное гейтирование CFTR. Термин не ограничен каким-либо конкретным способом действия или механистическим объяснением.The term "CFTR potentiator" as used herein refers to an agent that, upon contact with a CFTR-expressing cell or subject, has the effect of partially or completely overcoming reduced CFTR activity, such as reduced CFTR conductance and/or reduced gating. The term is not limited to any particular mode of action or mechanistic explanation.

Термины «кодировать», «кодирующий» и тому подобное относятся к свойству, присущему специфическим последовательностям нуклеотидов в полинуклеотиде, таким как ген, кДНК или мРНК, которые служат в качестве матриц для синтеза других полимеров и макромолекул в биологических процессах, имеющих определенную последовательность нуклеотидов (то есть, рРНК, тРНК и мРНК) или определенную последовательность аминокислот и следующие из этого их биологические свойства. Таким образом, ген кодирует белок, если транскрипция и трансляция мРНК, соответствующие этому гену, продуцируют белок в клетке или другой биологической системе. Как кодирующая цепь, нуклеотидная последовательность которой идентична последовательности мРНК, так и некодирующая цепь, используемая в качестве матрицы для транскрипции гена или кДНК, могут указывать на то, что они «кодируют» белок или другой продукт этого гена или кДНК.The terms "encode", "encoding" and the like refer to the property inherent in specific nucleotide sequences in a polynucleotide, such as a gene, cDNA or mRNA, that serve as templates for the synthesis of other polymers and macromolecules in biological processes having a particular nucleotide sequence ( that is, rRNA, tRNA and mRNA) or a specific sequence of amino acids and their resulting biological properties. Thus, a gene encodes a protein if the transcription and translation of the mRNA corresponding to that gene produces a protein in a cell or other biological system. Both a coding strand whose nucleotide sequence is identical to an mRNA sequence and a non-coding strand used as a template for transcription of a gene or cDNA may indicate that they "encode" a protein or other product of that gene or cDNA.

Термины «экспрессировать», «экспрессированный», «экспрессия», «экспрессия гена» и тому подобное, как используется в настоящем документе, относятся к использованию информации от гена при синтезе функционального продукта гена. Экспрессия гена включает по меньшей мере транскрипцию и, необязательно, включает одну из дополнительных функций, необязательно выбранных из открытого списка, включающего редактирование РНК, трансляцию и посттрансляционную модификацию. При определении экспрессии гена определяется наличие продукта экспрессии, такого как нередактированная или отредактированная РНК или даже кодированный белок. Вышеуказанные термины, используемые в связи с конкретным геном или локусом, предназначены для определения экспрессии генетической информации из этого гена или локуса; например, когда указано, что экспрессируется CFTR, подразумевается, что экспрессируется ген CFTR.The terms "express", "expressed", "expression", "gene expression", and the like, as used herein, refer to the use of information from a gene in the synthesis of a functional gene product. Gene expression includes at least transcription and optionally includes one of additional functions, optionally selected from an open list, including RNA editing, translation, and post-translational modification. When determining gene expression, the presence of an expression product is determined, such as unedited or edited RNA, or even an encoded protein. The above terms, when used in connection with a particular gene or locus, are intended to refer to the expression of genetic information from that gene or locus; for example, when it is stated that CFTR is expressed, it is understood that the CFTR gene is expressed.

Как используется в настоящем документе, термин «проточная цитометрия» относится к лазерной или биофизической технологии на основе импеданса, подходящей для подсчета клеток, сортировки клеток, анализа свойств клеток и обнаружения биомаркеров (такого как, в частности, обнаружение молекул клеточной поверхности, таких как кластер дифференцировки (CD) молекул). Для проточной цитометрии требуется наличие клеток в суспензии; чтобы проанализировать прилипшие клетки, их необходимо отделить от субстрата, например, культурального сосуда, к которому они прикрепляются, например, путем ферментативной обработки, такой как трипсинизация, посредством которой они становятся клетками в суспензии. Клетки в суспензии, то есть клетки в потоке жидкости, пропускаются через электронный детектор (проточная цитометрия). Устройство проточной цитометрии анализирует клетку, например, основываясь на определенном рассеянии света каждой клетки. Для проточной цитометрии можно использовать коммерческий проточный цитометр как проточный цитометр FACSAria III (BD Biosciences). Данные, полученные на проточных цитометрах, могут быть построены на графике в одном измерении, чтобы произвести гистограмму, или в двухмерных точечных участках или даже в трех измерениях. Графики могут быть сделаны с использованием шкал выбора, таких как линейный или логарифмический масштаб. Области на этих графиках могут быть последовательно разделены, основываясь на интенсивности флуоресценции, путем создания серии поднаборов, называемых «воротами».As used herein, the term "flow cytometry" refers to an impedance-based laser or biophysical technology suitable for cell counting, cell sorting, cell property analysis, and biomarker detection (such as, in particular, detection of cell surface molecules such as cluster differentiation (CD) molecules). Flow cytometry requires the presence of cells in suspension; in order to analyze adherent cells, they must be separated from the substrate, eg the culture vessel to which they are attached, eg by an enzymatic treatment such as trypsinization, whereby they become cells in suspension. Cells in suspension, that is, cells in a fluid stream, are passed through an electronic detector (flow cytometry). A flow cytometry device analyzes a cell, for example, based on the specific light scattering of each cell. For flow cytometry, a commercial flow cytometer such as the FACSAria III flow cytometer (BD Biosciences) can be used. Data obtained on flow cytometers can be plotted in one dimension to produce a histogram, or in two-dimensional dot plots, or even in three dimensions. Graphs can be made using selectable scales such as linear or log scale. Regions on these plots can be sequentially subdivided based on fluorescence intensity by creating a series of subsets called "gates".

«Активируемая флуоресценцией сортировка клеток» или, взаимозаменяемо, «FACS», как используется в настоящем документе, является специализированным типом проточной цитометрии. FACS является методом сортировки гетерогенной смеси биологических клеток на две или более популяции, основанным на специфических характеристиках рассеяния света и/или флуоресценции каждой клетки. Тип флуорофора, используемого в качестве метки для FACS, конкретно не ограничен; в некоторых вариантах осуществления флуорофоры присоединяются к антителу, которое распознает признак-мишень, такой как белок клеточной поверхности (такой как, в частности, обнаружение молекул клеточной поверхности, таких как молекулы кластерной дифференцировки (CD)). В качестве альтернативы флуорофор может быть присоединен к химическому объекту со сродством к клеточной мембране или другой клеточной структуре. Каждый флуорофор имеет характерный пик возбуждения и длину волны излучения, которые определяются устройством, подходящим для FACS. Может быть использовано коммерческое устройство."Fluorescence-activated cell sorting" or interchangeably "FACS" as used herein is a specialized type of flow cytometry. FACS is a method for sorting a heterogeneous mixture of biological cells into two or more populations based on the specific light scattering and/or fluorescence characteristics of each cell. The type of fluorophore used as a label for FACS is not specifically limited; in some embodiments, the fluorophores are attached to an antibody that recognizes a target trait, such as a cell surface protein (such as, in particular, detection of cell surface molecules such as cluster differentiation (CD) molecules). Alternatively, the fluorophore may be attached to a chemical entity with an affinity for the cell membrane or other cell structure. Each fluorophore has a characteristic excitation peak and emission wavelength, which are determined by a device suitable for FACS. A commercial device may be used.

Термин «гетерологичный», как используется в настоящем документе описывает нечто, состоящее из множества различных элементов.The term "heterologous" as used herein describes something that is made up of many different elements.

Термин «потеря функции» относится к генетической мутации (то есть изменению, присутствующему в мутантном гене и его продукте), то есть мутации в гене (или локусе), которая является причиной того, что продукт такого гена (обычно белок, кодируемый таким геном) не функционирует так же эффективно, как белок соответствующего дикого типа, или что мутация в гене или локусе вызывает экспрессию продукта гена или локуса на разных уровнях, с разным временем жизни, или другую отличительную особенность, которая влияет на функцию или продукцию или время жизни продукта такого гена (или локуса). Важно отметить, что термин «потеря функции» не подразумевает и не требует, чтобы функция была полностью потеряна в отношении белка дикого типа: скорее, этот термин является относительным термином, который указывает на то, что функция мутанта с потерей функции составляет менее 100% (например, менее 90%, менее 80%, менее 70%, менее 60%, менее 50%), чем функция белок дикого типа. Обычно термин «потеря функции» относится к мутации в соответствующем гаплотипе, и его можно использовать независимо от того, кодируется ли вторая копия, которая может дополнять потерю функции, соответствующей другой хромосомой рассматриваемого субъекта. Однако, например, для рецессивных мутаций с потерей функции этот термин может использоваться для конкретного обозначения того, что субъект характеризуется двумя копиями с потерей функции соответствующего гена (или локуса) и, следовательно, не обладает нормальной функциональностью генного продукта. Мутация с потерей функции гена CFTR может быть мутацией, которая влияет на гейтинг и/или проводимость (мутация гейтинга/проводимости) и/или мутацией, которая влияет на сворачивания и/или процессинг (мутация с нарушением сворачивания/процессинга). Примером мутации потери функции гена CFTR является мутация, вызывающая мутацию ΔF508 на уровне белка. Не желая привязываться к какой-либо конкретной теории, ΔF508 мутация белка CFTR обычно считается рецессивной мутацией с потерей функции.The term "loss of function" refers to a genetic mutation (i.e., a change present in a mutated gene and its product), i.e., a mutation in a gene (or locus) that causes that gene's product (usually the protein encoded by that gene) does not function as efficiently as the corresponding wild-type protein, or that a mutation in a gene or locus causes expression of the gene or locus product at different levels, with different lifetimes, or other distinctive feature that affects the function or production or lifetime of that product's product gene (or locus). It is important to note that the term "loss of function" does not imply or require that function be completely lost in relation to the wild-type protein: rather, the term is a relative term that indicates that the function of a loss-of-function mutant is less than 100% ( for example, less than 90%, less than 80%, less than 70%, less than 60%, less than 50%) than the function of the wild-type protein. Typically, the term "loss of function" refers to a mutation in the corresponding haplotype, and can be used regardless of whether a second copy is encoded, which can complement the loss of function corresponding to another chromosome of the subject in question. However, for example, for recessive loss-of-function mutations, the term may be used to specifically mean that the subject has two loss-of-function copies of the corresponding gene (or locus) and therefore does not have the normal functionality of the gene product. A loss-of-function mutation of the CFTR gene can be a mutation that affects gating and/or conductance (gating/conductivity mutation) and/or a mutation that affects folding and/or processing (folding/processing abnormal mutation). An example of a loss-of-function mutation in the CFTR gene is one that causes a ΔF508 mutation at the protein level. Without wishing to be bound by any particular theory, the ΔF508 mutation of the CFTR protein is generally considered to be a recessive loss-of-function mutation.

Термины «мульти» и «многочисленный», как используется в настоящем документе означает множество, то есть любое число из двух или более.The terms "multi" and "multiple" as used herein means a plurality, that is, any number of two or more.

Термин «мутация», как используется в настоящем документе, относится к изменению нуклеотидной последовательности генома организма, вируса или внехромосомной ДНК или других генетических элементов. Термин также распространяется на мутации аминокислотной последовательности, в частности, аминокислотной последовательности гена, который несет по меньшей мере одну (не молчащую) мутацию. Если не указано иное, мутация нуклеотидной последовательности является постоянным изменением. Мутации, присутствующие в зародышевой линии, обычно наследуются. Обычно мутация нуклеотидной последовательности может приводить к множеству различных типов изменений в последовательностях: мутации в генах могут либо не оказывать влияния, либо изменять продукт гена, либо мешать гену функционировать должным образом или полностью. Мутации также могут присутствовать в не генных областях. Если не указано иное, последовательность дикого типа используется в качестве эталонной последовательности для описания мутации. Таким образом, например, когда говорят, что данный мутант характеризуется мутацией положения 508 полипептидной последовательности, это указывает на то, что в положении 508 мутант не имеет той же аминокислоты, что и полипептид дикого типа. Конкретные типы мутаций нуклеотидной последовательности и/или аминокислотной последовательности включают такие изменения, как делеции, замены, добавления, вставки и варианты сплайсинга. Термин «делеция» в отношении нуклеотидной последовательности относится к отсутствию одного или нескольких нуклеотидов в нуклеотидной последовательности. «Делеция» в отношении аминокислотной последовательности относится к отсутствию одного или нескольких аминокислотных остатков в полипептиде. «Добавление» в отношении нуклеотидной последовательности относится к наличию одного или нескольких дополнительных нуклеотидов в нуклеотидной последовательности. «Добавление» в отношении аминокислотной последовательности относится к наличию одного или нескольких дополнительных аминокислотных остатков в соответствующем полипептиде. «Замена» в отношении нуклеотидной последовательности относится к замене одного или нескольких нуклеотидов на другой нуклеотид(ы) в нуклеотидной последовательности. «Замена» в отношении аминокислотной последовательности относится к замене одного или нескольких аминокислотных остатков на другие (и) другие аминокислотные остатки в полипептиде. Добавления, делеции и замены в нуклеотидной последовательности, например в открытой рамке считывания, могут быть 5’-концом, 3’-концом и/или внутренними. Добавления, делеции и замены в полипептиде могут быть у амино-конца, карбокси-конца и/или внутри. «Вставка» в отношении нуклеотидной последовательности и/или полипептидной последовательности представляет собой добавление одного или нескольких нуклеотидов или одного или нескольких аминокислотных остатков, соответственно, конкретно во внутреннем положении соответствующей последовательности. Термин «вариант сплайсинга» используется для описания того, что РНК, кодирующая полипептидную последовательность, сплайсируется иначе, чем соответствующая РНК дикого типа, обычно в результате мутации на уровне нуклеиновой кислоты, что обычно приводит к продукту трансляции полипептида, который отличается от полипептида дикого типа. Термин «вариант сплайсинга» можно использовать не только в отношении соответствующей РНК, но также в отношении соответствующей последовательности ДНК-матрицы (обычно геномной ДНК) и в отношении последовательности полипептида, кодируемого такой РНК.The term "mutation " , as used herein, refers to a change in the nucleotide sequence of an organism's genome, virus or extrachromosomal DNA, or other genetic elements. The term also covers amino acid sequence mutations, in particular the amino acid sequence of a gene that carries at least one (non-silent) mutation. Unless otherwise indicated, mutation of a nucleotide sequence is a permanent change. Mutations present in the germline are usually inherited. In general, mutation of a nucleotide sequence can result in many different types of changes in sequences: mutations in genes can either have no effect, change the gene product, or prevent the gene from functioning properly or completely. Mutations can also be present in non-gene regions. Unless otherwise indicated, the wild type sequence is used as a reference sequence to describe the mutation. Thus, for example, when a given mutant is said to have a mutation at position 508 of the polypeptide sequence, this indicates that at position 508 the mutant does not have the same amino acid as the wild-type polypeptide. Specific types of nucleotide sequence and/or amino acid sequence mutations include changes such as deletions, substitutions, additions, insertions, and splicing variants. The term "deletion" in relation to a nucleotide sequence refers to the absence of one or more nucleotides in a nucleotide sequence. "Deletion" in relation to an amino acid sequence refers to the absence of one or more amino acid residues in a polypeptide. "Addition" in relation to a nucleotide sequence refers to the presence of one or more additional nucleotides in a nucleotide sequence. "Addition" in relation to the amino acid sequence refers to the presence of one or more additional amino acid residues in the corresponding polypeptide. "Substitution" in relation to a nucleotide sequence refers to the replacement of one or more nucleotides with another nucleotide(s) in a nucleotide sequence. "Substitution" in relation to the amino acid sequence refers to the replacement of one or more amino acid residues with other (s) other amino acid residues in the polypeptide. Additions, deletions and substitutions in the nucleotide sequence, for example in the open reading frame, can be 5'-end, 3'-end and/or internal. Additions, deletions, and substitutions in a polypeptide may be at the amino terminus, carboxy terminus, and/or internally. An "insert" in relation to a nucleotide sequence and/or a polypeptide sequence is the addition of one or more nucleotides or one or more amino acid residues, respectively, specifically at an internal position of the corresponding sequence. The term "splicing variant" is used to describe that the RNA encoding a polypeptide sequence is spliced differently than the corresponding wild-type RNA, usually as a result of a mutation at the nucleic acid level, which usually results in a polypeptide translation product that differs from the wild-type polypeptide. The term "splicing variant" can be used not only in relation to the corresponding RNA, but also in relation to the corresponding template DNA sequence (usually genomic DNA) and in relation to the sequence of the polypeptide encoded by such RNA.

Термин «мутант» обычно предназначен для обозначения последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности, которая отличается от последовательности дикого типа. В тех случаях, когда существуют полиморфизмы в последовательности нуклеиновой кислоты, которые, однако, не отражены на уровне соответствующего кодируемого полипептида (молчащие мутации, вырождение генетического кода), термин «мутант» на уровне нуклеиновой кислоты конкретно относится только к тем вариантам нуклеиновых кислот, которые кодируют мутантный полипептид. Мутанты могут содержать разные комбинации мутаций, по отдельности или в комбинации, включая более одной мутации, и разные типы мутаций.The term "mutant" is generally intended to mean a nucleic acid sequence or amino acid sequence that differs from the wild-type sequence. Where there are polymorphisms in the nucleic acid sequence that are not, however, reflected at the level of the corresponding encoded polypeptide (silent mutations, degeneration of the genetic code), the term "mutant" at the nucleic acid level specifically refers only to those nucleic acid variants that encode the mutant polypeptide. Mutants may contain different combinations of mutations, singly or in combination, including more than one mutation, and different types of mutations.

Термин «пептид» согласно изобретению включает олиго- и полипептиды и относится к веществам, содержащим два или более, предпочтительно, 3 или более, предпочтительно, 4 или более, предпочтительно, 6 или более, предпочтительно, 8 или более, предпочтительно, 10 или более, предпочтительно, 13 или более, предпочтительно, более 16, предпочтительно, 21 или более и, предпочтительно, до 8, 10, 20, 30, 40 или 50, в частности, 100 аминокислот, ковалентно связанных с цепью пептидными связями.The term "peptide" according to the invention includes oligo- and polypeptides and refers to substances containing two or more, preferably 3 or more, preferably 4 or more, preferably 6 or more, preferably 8 or more, preferably 10 or more , preferably 13 or more, preferably more than 16, preferably 21 or more and preferably up to 8, 10, 20, 30, 40 or 50, in particular 100 amino acids covalently linked to the chain by peptide bonds.

Термин «белок», предпочтительно, относится к крупным пептидам, предпочтительно, к пептидам с более чем 100 аминокислотными остатками, но обычно термины «пептид», «полипептид» и «белок» являются синонимами и используются в настоящем документе взаимозаменяемо, если только контекст не предписывает иное.The term "protein" preferably refers to large peptides, preferably peptides with more than 100 amino acid residues, but usually the terms "peptide", "polypeptide" and "protein" are synonymous and are used interchangeably herein, unless the context prescribes otherwise.

Термином «фармацевтически приемлемый» обычно описывается, что определенное вещество может быть введено субъекту, необязательно и предпочтительно в комбинации с агентом, без агента, вызывающего невыносимые неблагоприятные эффекты, в используемой дозировке.The term "pharmaceutically acceptable" generally describes that a particular substance can be administered to a subject, optionally and preferably in combination with an agent, without an agent causing intolerable adverse effects, at the dosage used.

Термин «фармацевтически приемлемый носитель» используется для обозначения любого одного или нескольких из растворителей, дисперсионных сред, покрытий, антибактериальных и противогрибковых агентов, изотонических и задерживающих абсорбцию агентов и тому подобное, которые являются физиологически совместимыми и подходят для введения субъекту для методов, описанных в настоящем документе. Примеры таких фармацевтически приемлемых носителей включают, без ограничения, один или несколько, выбранных из воды, солевого раствора, солевого раствора с фосфатным буфером, декстрозы, глицерина, этанола и тому подобного, а также их комбинации. В частности, в случае жидких фармацевтических композиций может быть предпочтительным включение в композицию изотонических агентов, например сахаров, многоатомных спиртов, таких как маннит, сорбит, или хлорида натрия. Фармацевтически приемлемые носители могут дополнительно содержать вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие агенты, консерванты или буферы, которые увеличивают срок годности или эффективность агента. Обычно в композиции по настоящему изобретению содержится фармацевтически приемлемый носитель.The term "pharmaceutically acceptable carrier" is used to refer to any one or more of solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption delaying agents, and the like, which are physiologically compatible and suitable for administration to a subject for the methods described herein. document. Examples of such pharmaceutically acceptable carriers include, without limitation, one or more selected from water, saline, phosphate buffered saline, dextrose, glycerol, ethanol, and the like, and combinations thereof. In particular, in the case of liquid pharmaceutical compositions, it may be preferable to include isotonic agents, for example sugars, polyhydric alcohols such as mannitol, sorbitol, or sodium chloride, in the composition. Pharmaceutically acceptable carriers may further contain adjuvants, such as wetting or emulsifying agents, preservatives or buffers, which increase the shelf life or effectiveness of the agent. Typically, a pharmaceutically acceptable carrier is contained in the composition of the present invention.

Термин «фармацевтически активный агент» относится к агенту, который можно использовать при лечении субъекта, где агент будет полезен, например, для облегчения симптомов заболевания или расстройства. Кроме того, «фармацевтически активный агент» может оказывать положительное или успешное влияние на состояние или болезненное состояние субъекта при введении субъекту в терапевтически эффективном количестве. Предпочтительно, фармацевтически активный агент обладает лечебными свойствами и может вводиться для улучшения, ослабления, облегчения, регресса, задержки начала или уменьшения тяжести одного или нескольких симптомов заболевания или расстройства. Фармацевтически активный агент может обладать профилактическими свойствами и может использоваться для отсрочки начала заболевания или для уменьшения тяжести такого заболевания или патологического состояния. Например, агент по изобретению рассматривается в настоящем документе как фармацевтически активный ингредиент для лечения муковисцидоза, как заявлено. В другом примере фармацевтически активный белок может быть использован для лечения клетки или индивидуума, когда обычно белок экспрессируется не нормально или не на желаемых уровнях, или когда неправильно экспрессируется белок, например, фармацевтически активный белок может компенсировать мутацию или отсутствие достаточно высокой экспрессии путем подачи желаемого белка. Термин «фармацевтически активный пептид или белок» включает в себя целые белки или полипептиды и может также относиться к их фармацевтически активным фрагментам. Он также может включать фармацевтически активные аналоги пептида или белка.The term "pharmaceutically active agent" refers to an agent that can be used in the treatment of a subject, where the agent would be useful, for example, to alleviate the symptoms of a disease or disorder. In addition, a "pharmaceutically active agent" can have a beneficial or beneficial effect on a subject's condition or disease state when administered to the subject in a therapeutically effective amount. Preferably, the pharmaceutically active agent has medicinal properties and may be administered to ameliorate, relieve, alleviate, regress, delay the onset, or lessen the severity of one or more symptoms of the disease or disorder. The pharmaceutically active agent may have prophylactic properties and may be used to delay the onset of a disease or to lessen the severity of such a disease or condition. For example, an agent of the invention is contemplated herein as a pharmaceutically active ingredient for the treatment of cystic fibrosis, as claimed. In another example, a pharmaceutically active protein can be used to treat a cell or individual when the protein is normally not expressed normally or at desired levels, or when the protein is not expressed correctly, e.g., the pharmaceutically active protein can compensate for a mutation or lack of high enough expression by delivering the desired protein. . The term "pharmaceutically active peptide or protein" includes whole proteins or polypeptides and may also refer to their pharmaceutically active fragments. It may also include pharmaceutically active analogs of the peptide or protein.

«Открытая рамка считывания» или «ORF» представляет собой непрерывную полосу кодонов, начинающуюся со стартового кодона и заканчивающуюся стоп-кодоном.An "open reading frame" or "ORF" is a continuous band of codons starting at a start codon and ending at a stop codon.

Когда в настоящем документе указывается, что белок «присутствует», например, в клетке, это подразумевает указание на то, что в клетке существует белок на уровнях, определяемых способами согласно уровню техники. Такой белок, например, белок CFTR, как правило, является продуктом экспрессии гена этой клетки. Таким образом, определение присутствия белка является косвенным способом определения экспрессии соответствующего гена.When this document indicates that the protein is "present", for example, in a cell, this implies an indication that the protein exists in the cell at levels determined by methods according to the prior art. Such a protein, such as the CFTR protein, is typically the gene expression product of that cell. Thus, determining the presence of a protein is an indirect way to determine the expression of the corresponding gene.

Когда в настоящем документе указывается, что белок «отображается», например, на клетке, это подразумевает указание на то, что белок существует на поверхности клетки на уровнях, определяемых способами согласно уровню техники. Таким образом, определение отображения конкретного белка на поверхности клетки представляет собой конкретный способ определения присутствия указанного белка.When this document indicates that the protein is "displayed", for example, on a cell, this implies an indication that the protein exists on the surface of the cell at levels determined by methods according to the prior art. Thus, determining the display of a particular protein on the cell surface is a specific way to determine the presence of said protein.

В соответствии с настоящим изобретением, РНК может кодировать пептид или белок. Соответственно, РНК может содержать кодирующую область (открытую рамку считывания (ORF)), кодирующую пептид или белок. Например, РНК может кодировать и экспрессировать антиген или фармацевтически активный пептид или белок. Если не указано иное, термин РНК может использоваться в настоящем документе как для первичных транскриптов РНК, так и для сплайсированной РНК, включая любые варианты сплайсинга, как описано в данном документе.In accordance with the present invention, RNA may encode a peptide or protein. Accordingly, the RNA may contain a coding region (open reading frame (ORF)) encoding a peptide or protein. For example, the RNA can encode and express an antigen or a pharmaceutically active peptide or protein. Unless otherwise indicated, the term RNA may be used herein for both primary RNA transcripts and spliced RNA, including any splicing variants as described herein.

В соответствии с настоящим изобретением, термин «дыхательные пути» обычно относится к части анатомии дыхательной системы, связанной с процессом дыхания. Таким образом, дыхательные пути включают без ограничения нос, рот, носовую полость, глотку, гортань, надгортанник, трахею, легкие, первичные (главные) бронхи, вторичные (долевые) бронхи, третичные (сегментарные) бронхи, небольшие дыхательные пути (также называемые бронхиолами) и альвеолы (тонкие специализированные структуры, которые функционируют при газообмене).In accordance with the present invention, the term "airway" usually refers to the part of the anatomy of the respiratory system associated with the breathing process. Thus, the airways include, without limitation, the nose, mouth, nasal cavity, pharynx, larynx, epiglottis, trachea, lungs, primary (main) bronchi, secondary (lobar) bronchi, tertiary (segmental) bronchi, small airways (also called bronchioles). ) and alveoli (thin specialized structures that function during gas exchange).

Термин «желудочно-кишечный тракт», как используется в настоящем документе, как правило, относится к набору анатомических структур или серии соединенных органов тела, которые принимают пищу, переваривают ее для извлечения и поглощения энергии и питательных веществ и удаляют оставшиеся отходы в виде фекалий. Желудочно-кишечный тракт млекопитающего включает без ограничения рот, пищевод, желудок и кишечник.The term "gastrointestinal tract" as used herein generally refers to a set of anatomical structures or a series of connected organs in the body that take in food, digest it to extract and absorb energy and nutrients, and eliminate remaining waste products in the form of feces. The gastrointestinal tract of a mammal includes, without limitation, the mouth, esophagus, stomach, and intestines.

Термин «подгруппа» (символ H), как используется в настоящем документе, относится к собственной подгруппе группы G. То есть подгруппа H является собственным подмножеством G (то есть H≠G). Обычно это обозначается как H<G, читается как «H является собственной подгруппой группы G». Если H является подгруппой в G, то G называется надгруппой H. «Подгруппа пациентов» представляет собой подгруппу пациентов, страдающих от состояния. Например, подгруппа пациентов с муковисцидозом является подгруппой всех пациентов с муковисцидозом.The term "subgroup" (symbol H ), as used herein, refers to a subgroup of G 's own group. That is, the subgroup H is a proper subset of G (that is, H ≠ G ). This is usually denoted as H<G, read as "H is a proper subgroup of the group G". If H is a subgroup of G, then G is called a supergroup of H. A "subgroup of patients" is a subgroup of patients suffering from the condition. For example, a subgroup of patients with cystic fibrosis is a subgroup of all patients with cystic fibrosis.

Термины «субъект» и «пациент», как используется в настоящем документе, относятся к млекопитающему. Например, млекопитающими в контексте настоящего изобретения являются люди, приматы, не являющиеся человеком, домашние животные, включая, но не ограничиваясь ими, собак, кошек, овец, крупный рогатый скот, коз, свиней, лошадей и т.д., лабораторные животные, включая, но не ограничиваясь этим, мышей, крыс, кроликов и т.д., а также животные в неволе, такие как животные в зоопарках. Термины «субъект» и «пациент», как используется в настоящем документе, в частности, включают людей. Субъект (человек или животное) имеет два набора хромосом; то есть субъект является диплоидным. Термин «пациент» относится к субъекту, который страдает от состояния, подвергается риску страдания от состояния, страдал от состояния или, по прогнозам, будет страдать от состояния, и который может подвергаться терапии, например, путем введения агента. Состояние пациента может быть хроническим и/или острым. Таким образом, «пациент» также может быть описан как субъект, подвергаемый терапии и/или нуждающийся в терапии.The terms "subject" and "patient" as used herein refer to a mammal. For example, mammals in the context of the present invention include humans, non-human primates, domestic animals including, but not limited to, dogs, cats, sheep, cattle, goats, pigs, horses, etc., laboratory animals, including, but not limited to, mice, rats, rabbits, etc., as well as captive animals such as animals in zoos. The terms "subject" and "patient" as used herein specifically include humans. The subject (human or animal) has two sets of chromosomes; that is, the subject is diploid. The term "patient" refers to a subject who is suffering from a condition, is at risk of suffering from a condition, has suffered from a condition, or is predicted to suffer from a condition, and who may be undergoing therapy, for example, by administering an agent. The patient's condition may be chronic and/or acute. Thus, a "patient" can also be described as a subject undergoing therapy and/or in need of therapy.

Термин «терапия» следует понимать в широком смысле, и он относится к лечению субъекта с целью предотвращения или лечения состояния у субъекта. В предпочтительных вариантах осуществления терапия, в частности, включает введение агента субъекту.The term "therapy" should be understood in a broad sense, and refers to the treatment of a subject to prevent or treat a condition in the subject. In preferred embodiments, the implementation of therapy, in particular, includes the introduction of an agent to the subject.

В контексте настоящего изобретения термин «транскрипция» относится к процессу, в котором генетический код в последовательности ДНК транскрибируется в РНК.In the context of the present invention, the term "transcription" refers to the process in which the genetic code in a DNA sequence is transcribed into RNA.

Термин «трансляция» в соответствии с изобретением относится к процессу, с помощью которого РНК-мессенджер направляет сборку последовательности аминокислот на рибосомах клетки для получения пептида или белка.The term "translation" according to the invention refers to the process by which a messenger RNA directs the assembly of an amino acid sequence on the ribosomes of a cell to produce a peptide or protein.

Термин «дикий тип» используется в настоящем документе для обозначения аллеля, например, гена CFTR, который не связан с муковисцидозом, то есть аллеля, который, как считается, способствует типичному фенотипическому признаку, наблюдаемому в «диких» популяциях субъектов. Аллель, который не является «диким типом», упоминается в настоящем документе как «мутант» или «мутированный» или тому подобное.The term "wild type" is used herein to refer to an allele, for example, the CFTR gene, that is not associated with cystic fibrosis, that is, an allele that is thought to contribute to the typical phenotypic trait seen in "wild" subject populations. An allele that is not "wild type" is referred to herein as "mutant" or "mutated" or the like.

Настоящее изобретение основано на нескольких выводах, которые взаимосвязаны и, таким образом, вместе подтолкнули изобретателей прийти к различным аспектам изобретения, которые все индивидуально описаны далее. Все аспекты настоящего изобретения основаны, среди прочего, на обнаружении того, что соединение формулы (I) может быть использовано для лечения и профилактики муковисцидоза в конкретной подгруппе пациентов.The present invention is based on several findings that are interrelated and thus together led the inventors to arrive at various aspects of the invention, which are all individually described below. All aspects of the present invention are based, among other things, on the discovery that the compound of formula (I) can be used for the treatment and prevention of cystic fibrosis in a specific subgroup of patients.

Новое лечение на конкретной подгруппе пациентовNew treatment for a specific subgroup of patients

В настоящем изобретении предложен новый способ профилактики или лечения конкретной подгруппы пациентов с муковисцидозом. В соответствии с настоящим изобретением предлагается применение соединения, соответствующего общей формуле (I), по настоящему изобретению для лечения муковисцидоза у субъектов, связанных с одной или несколькими мутациями потери функции гена CFTR. Новое применение такого соединения основано на конкретных данных, представленных в настоящем документе.The present invention provides a novel method for the prevention or treatment of a specific subgroup of patients with cystic fibrosis. The present invention provides the use of a compound according to the general formula (I) of the present invention for the treatment of cystic fibrosis in subjects associated with one or more loss-of-function mutations in the CFTR gene. The novel use of such a compound is based on the specific data presented herein.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения пациента, страдающего муковисцидозом, где пациент характеризуется по меньшей мере одной мутацией в гене CFTR, которая является причиной неправильного сворачивания и/или процессинга CFTR, где способ включает введение пациенту эффективного количества соединения общей формулы (I). Термины «пациент» и «субъект» используются в настоящем документе взаимозаменяемо, в частности, применительно к пациенту/субъекту, характеризующемуся по меньшей мере одной мутацией в гене CFTR, которая является причиной неправильного сворачивания и/или процессинга CFTR.The present invention also relates to a method for treating a patient suffering from cystic fibrosis, where the patient is characterized by at least one mutation in the CFTR gene that causes CFTR misfolding and/or processing, where the method includes administering to the patient an effective amount of a compound of general formula (I). The terms "patient" and "subject" are used interchangeably herein, in particular in relation to a patient/subject characterized by at least one mutation in the CFTR gene that causes CFTR misfolding and/or processing.

На фиг. 8 и SEQ ID NO: 1 представлена аминокислотная последовательность белка человека CFTR дикого типа (1480 аминокислот). Учетный номер P13569, версия P13569.3, источник данных UniProtKB: локус CFTR_HUMAN. Не желая быть связанными с какой-либо конкретной теорией, следует понимать, что субъектами, у которых особенно успешными будут профилактика или лечение в соответствии с настоящим изобретением, являются такие субъекты, которые характеризуются по меньшей мере одной мутацией по меньшей мере в одном аллеле белка человека CFTR.In FIG. 8 and SEQ ID NO: 1 shows the amino acid sequence of wild-type human CFTR protein (1480 amino acids). Account number P13569, version P13569.3, UniProtKB data source: CFTR_HUMAN locus. Without wishing to be bound by any particular theory, it is to be understood that subjects in whom prophylaxis or treatment in accordance with the present invention would be particularly successful are those subjects that are characterized by at least one mutation in at least one human protein allele. CFTR.

В качестве вступительного комментария, ввиду недостаточности структурной информации о полноразмерном диком типе и мутантном CFTR, а также сложности дефектов, вызванных некоторыми генетическими мутациями гена CFTR (например, мутация, вызывающая ΔF508), обнаружение лекарственного средства при муковисцидозе в значительной степени основано на фенотипических анализах, основанных на функции канала CFTR. Ценными являются некоторые специфические галоид-чувствительные мутанты флуоресцентного белка, а именно: мутанты желтого флуоресцентного белка (YFP), флуоресценция которых сильно гасится (снижается) йодидом (Jayaraman et al., 2000, J. Biol. Chem., vol. 275, p. 6047-6050), потому что йодид является галогенидом, который эффективно транспортируется CFTR (Rowe et al., Cold Spring Harb. Perspect. Med., 2013 vol. 3, a009761). В дополнение к этому информативными являются иммунофенотипические подходы, которые обнаруживают полное присутствие (мутантного) белка CFTR (например, вестерн-блот) и/или отображение белка CFTR на поверхности клетки (например, иммуноокрашивание, необязательно в сочетании с FACS и/или микроскопией).As an introductory comment, due to the paucity of structural information about full-length wild type and mutant CFTR, and the complexity of defects caused by certain genetic mutations in the CFTR gene (e.g., the mutation causing ΔF508), drug discovery in cystic fibrosis is largely based on phenotypic analyses, based on the CFTR channel function. Some specific halide-sensitive fluorescent protein mutants are valuable, namely: yellow fluorescent protein (YFP) mutants whose fluorescence is strongly quenched (reduced) by iodide (Jayaraman et al., 2000, J. Biol. Chem., vol. 275, p 6047-6050) because iodide is a halide that is efficiently transported by CFTR (Rowe et al., Cold Spring Harb. Perspect. Med., 2013 vol. 3, a009761). In addition, immunophenotypic approaches that detect the complete presence of the (mutant) CFTR protein (eg, Western blot) and/or display of the CFTR protein on the cell surface (eg, immunostaining, optionally in combination with FACS and/or microscopy) are informative.

В отличие от традиционных методов лечения муковисцидоза, таких как антибиотиками, муколитиками, противовоспалительными средствами и, например, небулизированным гипертоническим раствором, которыми лечат проявления заболевания CF, соединение по настоящему изобретению непосредственно устраняет основной дефект анионного канала CFTR. Данные, представленные в примере 2, как обсуждено в настоящем документе, подтверждают тот факт, что, что соединение, соответствующее общей формуле (I), имеет функцию CFTR-корректора. Эти результаты совершенно удивительны: хотя согласно недавно опубликованным литературным данным предполагается, что ингибитор PDE4 рофлумиласт действует как потенциатор белка CFTR, то есть за счет усиления активности мутантного белка CFTR, для которого характерны специфические мутации, обнаруженные у пациентов с муковисцидозом в эпителии дыхательных путей (Blanchard et al., 2014, FASEB J., vol. 28, p. 791-801; Lambert et al. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2014 vol. 50, p. 549-58), не было описано, что известные ингибиторы PDE4 способны корректировать присутствие белка CFTR в клетках пациентов с муковисцидозом или в моделях in vitro, не говоря уже о том, чтобы оказывать причинное действие (для сравнения с настоящим изобретением см. также, например, WO 2015/175773 A1). В данной области техники, как, например, в WO 2015/175773 А1 и в работе Blanchard et al., 2014, выше, не показано никаких доказательств действия предлагаемых ингибиторов PDE4 на уровни белка CFTR, не говоря уже о его коррекции в качестве причинного эффекта, не говоря уже о таких предположениях. Принимая во внимание уровень техники, обнаружение авторами настоящего изобретения, то есть того, что соединения по настоящему изобретению обладают способностью действовать в качестве CFTR-корректоров у субъектов, связанных со специфическими мутациями CFTR, было неожиданным.Unlike conventional treatments for cystic fibrosis, such as antibiotics, mucolytics, anti-inflammatory agents, and, for example, nebulized hypertonic saline, which treat manifestations of CF disease, the compound of the present invention directly corrects the underlying defect in the CFTR anion channel. The data presented in Example 2, as discussed herein, supports the fact that the compound corresponding to the general formula (I) has the function of a CFTR corrector. These results are quite surprising: although recent literature suggests that the PDE4 inhibitor roflumilast acts as a CFTR protein potentiator, i.e., by enhancing the activity of a mutant CFTR protein that is characterized by specific mutations found in patients with cystic fibrosis in the airway epithelium (Blanchard et al., 2014, FASEB J., vol. 28, pp. 791-801; Lambert et al. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2014 vol. 50, pp. 549-58) described that known PDE4 inhibitors are able to correct the presence of the CFTR protein in the cells of patients with cystic fibrosis or in vitro models, not to mention to have a causative effect (for comparison with the present invention, see also, for example, WO 2015/175773 A1) . In the art, as for example in WO 2015/175773 A1 and Blanchard et al., 2014, supra, no evidence has been shown for the proposed PDE4 inhibitors to act on CFTR protein levels, let alone correct it as a causative effect. not to mention such assumptions. In view of the state of the art, the discovery by the inventors of the present invention, that is, that the compounds of the present invention have the ability to act as CFTR correctors in subjects associated with specific CFTR mutations, was unexpected.

В дополнение к этому, пример 1 настоящего описания дает основания для предположения о функции потенциатора соединения общей формулы (I). Кроме того, в примере 1 подтверждается, что известный ингибитор PDE4 рофлумиласт обладает эффектом как CFTR-потенциатор. Согласно литературным данным этот эффект ингибиторов PDE4, таких как рофлумиласт, на муковисцидоз, строго связан с их способностью приводить посредством ингибирования фосфодиэстеразы 4 к увеличению концентрации цАМФ в специфических клеточных компартментах. Эффект рофлумиласта (эталонного ингибитора PDE4) подтверждается в примере 1 в настоящем документе.In addition, Example 1 of the present description gives grounds for suggesting a potentiator function of the compound of general formula (I). Further, in Example 1, the known PDE4 inhibitor roflumilast was confirmed to have an effect as a CFTR potentiator. According to the literature, this effect of PDE4 inhibitors, such as roflumilast, on cystic fibrosis is strongly related to their ability to lead, through inhibition of phosphodiesterase 4, to an increase in the concentration of cAMP in specific cellular compartments. The effect of roflumilast (a reference PDE4 inhibitor) is confirmed in Example 1 herein.

Как подтверждено в примере 1, не только рофлумиласт, но и соединение, соответствующее общей формуле (I), частично восстанавливали активность мутированного CFTR в эпителии дыхательных путей, сходную с потенциатором ивакафтором (ссылка) и известным ингибитором PDE4 рофлумиластом, что свидетельствует о том, что соединение работает как потенциатор.As confirmed in Example 1, not only roflumilast but also the compound corresponding to the general formula (I) partially restored the activity of the mutated CFTR in the airway epithelium, similar to the potentiator ivacaftor (reference) and the known PDE4 inhibitor roflumilast, indicating that the connection works as a potentiator.

Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением соединение общей формулы (I) предназначено для терапии человека или животного, страдающего муковисцидозом или склонного к муковисцидозу. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением у этого человека или животного муковисцидоз можно предотвратить или лечить.Thus, in accordance with the present invention, the compound of general formula (I) is intended for the treatment of a human or animal suffering from cystic fibrosis or susceptible to cystic fibrosis. Thus, in accordance with the present invention, cystic fibrosis in this human or animal can be prevented or treated.

В приведенных в настоящем документе примерах сообщается, что соединение общей формулы (I) может восстанавливать CFTR-зависимый ионный транспорт в клетках, экспрессирующих эндогенный ΔF508-CFTR; и, таким образом, предоставляются доказательства того, что соединение общей формулы (I) оказывает различное и благоприятное действие на ΔF508-CFTR, отличное от ингибиторов PDE4, ранее испытанных в данной области (Schultz et al., 1999, J. Membr. Biol., vol. 170, p. 51-66; Grubb et al., 1993, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., vol. 8, p. 454-460, рассмотрено Blanchard et al., выше).The examples provided herein report that a compound of general formula (I) can restore CFTR-dependent ion transport in cells expressing endogenous ΔF508-CFTR; and thus provides evidence that the compound of general formula (I) has a different and beneficial effect on ΔF508-CFTR than PDE4 inhibitors previously tested in the field (Schultz et al., 1999, J. Membr. Biol. , vol. 170, pp. 51-66; Grubb et al., 1993, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., vol. 8, pp. 454-460, reviewed by Blanchard et al., supra).

Коррекция CFTR и ее экспериментальное обнаружениеCFTR correction and its experimental discovery

Предпочтительно, соединение в соответствии с настоящим изобретением обладает активностью CFTR-корректора. В частности, предпочтительно, соединение обладает активностью CFTR-корректора в клетке или у субъекта, характеризующегося по меньшей мере одной мутацией в гене CFTR, которая является причиной неправильного сворачивания и/или процессинга белка CFTR. В конкретном варианте осуществления изобретения соединение в соответствии с настоящим изобретением является причиной увеличения присутствия и/или поверхностного отображения белка CFTR в клетке такого субъекта.Preferably, the compound of the present invention has CFTR corrector activity. Particularly preferably, the compound has CFTR-corrector activity in a cell or subject characterized by at least one mutation in the CFTR gene that causes misfolding and/or processing of the CFTR protein. In a particular embodiment, a compound of the present invention causes an increase in the presence and/or surface display of a CFTR protein in a cell of such a subject.

В контексте настоящего изобретения присутствие и поверхностное отображение белка CFTR являются важными. Белок CFTR является членом суперсемейства мембранных белков переносчика АТФ-связывающей кассеты (ABC). Белок CFTR дикого типа имеет 1480 аминокислотных остатков (168,142 кДа). Аминокислотная последовательность белка CFTR дикого типа представлена локусом UniProtKB CFTR_HUMAN и показана на фиг. 14. При правильном введении в клеточную мембрану белок CFTR функционирует как хлоридный канал и контролирует регуляцию других транспортных путей. Мутации в этом гене связаны, в частности, с аутосомно-рецессивным расстройством муковисцидозом. Альтернативно сплайсированные варианты транскрипта были описаны, многие из которых являются результатом мутаций в гене CFTR.In the context of the present invention, the presence and surface display of the CFTR protein are important. The CFTR protein is a member of the ATP-binding cassette (ABC) transporter membrane protein superfamily. The wild-type CFTR protein has 1480 amino acid residues (168.142 kDa). The amino acid sequence of the wild-type CFTR protein is represented by the UniProtKB CFTR_HUMAN locus and is shown in FIG. 14. When properly introduced into the cell membrane, the CFTR protein functions as a chloride channel and controls the regulation of other transport pathways. Mutations in this gene are associated, in particular, with the autosomal recessive disorder cystic fibrosis. Alternative spliced transcript variants have been described, many of which are the result of mutations in the CFTR gene.

В настоящем изобретении присутствие белка CFTR в клетке, особенно на клеточной поверхности, может быть скорректировано. Это связано с недавно выявленной и неожиданной функцией соединения общей формулы (I). Действительно, является предпочтительным, а также продемонстрировано экспериментальными примерами в настоящем документе то, что достижение коррекции CFTR является неотъемлемой частью изобретения, заявленного в настоящем документе. Действительно, достижение заявленного терапевтического эффекта является функционально-техническим признаком настоящего изобретения. Приведенные в настоящем документе примеры подтверждают, что указанная функциональная техническая особенность достижима как прямой результат введения соединения общей формулы (I). Другими словами, авторы настоящего изобретения определили, что соединение общей формулы (I) является причиной для достижения коррекции CFTR в клетке или у субъекта, характеризующегося по меньшей мере одной мутацией в гене CFTR, которая является причиной неправильного сворачивания и/или процессинга белка CFTR.In the present invention, the presence of the CFTR protein in the cell, especially on the cell surface, can be corrected. This is due to the recently identified and unexpected function of the compound of general formula (I). Indeed, it is preferred, and also demonstrated by the experimental examples herein, that achieving CFTR correction is an integral part of the invention claimed herein. Indeed, the achievement of the claimed therapeutic effect is a functional and technical feature of the present invention. The examples provided herein confirm that said functional technical feature is achievable as a direct result of the administration of the compound of general formula (I). In other words, the inventors of the present invention have determined that the compound of general formula (I) is the cause to achieve CFTR correction in a cell or subject having at least one mutation in the CFTR gene that causes the CFTR protein to misfold and/or be processed.

Для этой цели в контексте настоящего изобретения может быть определено присутствие белка, такого как белок CFTR. Более предпочтительно, присутствие белка на поверхности клетки, то есть отображение поверхности. Другими словами, определяется, отображается ли белок, такой как белок CFTR, на поверхности клетки.For this purpose, in the context of the present invention, the presence of a protein, such as the CFTR protein, can be determined. More preferably, the presence of the protein on the surface of the cell, i.e. the display of the surface. In other words, it is determined whether a protein, such as the CFTR protein, is displayed on the cell surface.

Клетки, отображающие конкретный белок на клеточной поверхности, могут быть проанализированы, например, с помощью иммунологически активных молекул, таких как специфические антитела и другие иммунореактивные молекулы. Термин «клеточная поверхность» используется в настоящем документе в соответствии с его обычным значением в данной области техники и, таким образом, конкретно включает внешнюю сторону клетки, которая доступна для связывания белками и другими молекулами. Белок отображается на поверхности клетки, если он, по меньшей мере, частично расположен на поверхности указанной клетки и доступен для связывания антигенсвязывающими молекулами, такими как антигенспецифические антитела, добавленные в клетку. В одном варианте осуществления изобретения белок, отображаемый на поверхности клетки, представляет собой цельный мембранный белок, имеющий внеклеточную часть, которая может распознаваться антителом. Термин «внеклеточная часть» или «экзодомен» в контексте настоящего изобретения означает часть молекулы, в частности, белка, которая обращена к внеклеточному пространству клетки и, предпочтительно, доступна снаружи указанной клетки, например, посредством связывающих молекул, таких как антитела, расположенные вне клетки. Предпочтительно, термин относится к одной или нескольким внеклеточным петлям или доменам или их фрагменту. Термин «часть» используется в настоящем документе и относится к непрерывному или прерывному элементу структуры, такой как аминокислотная последовательность. Элемент или часть последовательности белка, предпочтительно, включают по меньшей мере 5, в частности, по меньшей мере 8, по меньшей мере 12, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 30 или по меньшей мере 100 последовательных и/или непоследовательных аминокислот аминокислотной последовательности, составляющей белок.Cells displaying a particular protein on the cell surface can be analyzed, for example, with immunologically active molecules such as specific antibodies and other immunoreactive molecules. The term "cell surface" is used herein in accordance with its usual meaning in the art and thus specifically includes the outside of the cell, which is available for binding by proteins and other molecules. A protein is displayed on the surface of a cell if it is at least partially located on the surface of said cell and is available for binding by antigen-binding molecules such as antigen-specific antibodies added to the cell. In one embodiment of the invention, the protein displayed on the cell surface is a whole membrane protein having an extracellular portion that can be recognized by an antibody. The term "extracellular part" or "exodomain" in the context of the present invention means a part of a molecule, in particular a protein, which faces the extracellular space of a cell and is preferably accessible from the outside of said cell, for example, through binding molecules, such as antibodies located outside the cell . Preferably, the term refers to one or more extracellular loops or domains, or a fragment thereof. The term "part" is used herein and refers to a continuous or discontinuous structural element, such as an amino acid sequence. The element or portion of the protein sequence preferably comprises at least 5, in particular at least 8, at least 12, at least 15, at least 20, at least 30 or at least 100 consecutive and/or inconsistent amino acids of the amino acid sequence that makes up a protein.

Белок, определяемый антителом или другой иммунореактивной молекулой, также может называться антигеном. В некоторых вариантах осуществления клетка по изобретению может характеризоваться отображением - или не отображением - одного или нескольких специфических антигенов. В контексте настоящего изобретения антиген белка CFTR, предпочтительно, отображается на поверхности клетки.A protein defined by an antibody or other immunoreactive molecule may also be referred to as an antigen. In some embodiments, a cell of the invention may be characterized by displaying - or not displaying - one or more specific antigens. In the context of the present invention, the CFTR protein antigen is preferably displayed on the cell surface.

В соответствии с общими принципами клеточной биологии, когда антиген специфически определяется антителом или другой иммунореактивной молекулой, например на поверхности (интактной) клетки (например, с помощью иммуноокрашивания) или в лизате клетки (например, с помощью вестерн-блоттинга), клетка экспрессирует ген, кодирующий антиген (полипептид). Следовательно, обнаружение антигена (полипептида), который отображается на поверхности клетки, является косвенным средством для демонстрации экспрессии гена, кодирующего полипептид. Другим косвенным методом показать, что ген, кодирующий белок, экспрессируется и, таким образом, присутствует в клетке, является вестерн-блот (см., например, пример 2).According to general principles of cell biology, when an antigen is specifically detected by an antibody or other immunoreactive molecule, for example on the surface of an (intact) cell (for example, by immunostaining) or in a cell lysate (for example, by Western blotting), the cell expresses a gene, coding antigen (polypeptide). Therefore, detection of an antigen (polypeptide) that is displayed on the cell surface is an indirect means for demonstrating the expression of a gene encoding a polypeptide. Another indirect method to show that a gene encoding a protein is expressed and thus present in a cell is the Western blot (see, for example, Example 2).

Согласно изобретению антиген отображается на клетке, если уровень экспрессии выше предела обнаружения и/или если уровень экспрессии достаточно высок, чтобы допустить связывание антигенспецифическими антителами, добавленными в клетку. Согласно изобретению полагают, что антиген не экспрессируется в клетке, если уровень экспрессии ниже предела обнаружения и/или если уровень экспрессии слишком низок, чтобы допустить связывание посредством антигенспецифического антитела, добавленного в клетку. Предпочтительно, антиген, экспрессируемый в клетке, экспрессируется или экспонируется, то есть присутствует на поверхности указанной клетки и, таким образом, доступен для связывания антигенспецифическими молекулами, такими как антитела или другие иммунореактивные молекулы, добавленные в клетку. В некоторых случаях также добавляют вторичную молекулу, которая помогает в обнаружении, такую как, например, необязательно меченное вторичное антитело.According to the invention, an antigen is displayed on a cell if the expression level is above the detection limit and/or if the expression level is high enough to allow binding by the antigen-specific antibodies added to the cell. According to the invention, an antigen is not expressed in a cell if the expression level is below the detection limit and/or if the expression level is too low to allow binding by an antigen-specific antibody added to the cell. Preferably, the antigen expressed in the cell is expressed or displayed, ie present on the surface of said cell and thus available for binding by antigen-specific molecules such as antibodies or other immunoreactive molecules added to the cell. In some cases, a secondary molecule is also added to aid in detection, such as, for example, an optionally labeled secondary antibody.

Антитело или другая иммунореактивная молекула может распознавать эпитоп на клетке. Термин «эпитоп» относится к антигенной детерминанте в молекуле, такой как антиген, то есть к части или фрагменту молекулы, которая распознается, то есть связана иммунной системой, например, которая распознается антителом или другой иммунореактивной молекулой. Обнаружение эпитопа, специфичного для какого-либо конкретного антигена, обычно позволяет сделать вывод, что этот конкретный антиген присутствует в анализируемой клетке.An antibody or other immunoreactive molecule can recognize an epitope on a cell. The term "epitope" refers to an antigenic determinant in a molecule, such as an antigen, ie, a portion or fragment of a molecule that is recognized, ie bound by, the immune system, eg, that is recognized by an antibody or other immunoreactive molecule. The detection of an epitope specific for a particular antigen usually leads to the conclusion that this particular antigen is present in the analyzed cell.

В одном варианте осуществления изобретения клетка или образец от субъекта могут характеризоваться иммунофенотипированием. «Иммунофенотипирование» обычно означает, что клетка или образец могут быть охарактеризованы антигенспецифическими молекулами, такими как антитела или другие иммунореактивные молекулы, которые добавляются в клетку для определения наличия антигена. Иммунофенотипирование включает сортировку клеток с использованием различных методов, включая проточную цитометрию, а также аналитические методы для лизированных клеток и лизированных образцов, такие как вестерн-блоттинг. Одним из методов иммунофенотипирования является проточная цитометрия, в частности, FACS: аналит, в частности, белок клеточной поверхности, распознается, как правило, антителом или другой иммунореактивной молекулой. Антитело или другая иммунореактивная молекула либо сами помечены флуорофором, либо распознаются вторичным антителом, помеченным флуорофором, или другой иммунореактивной молекулой, которая добавляется для этой цели.In one embodiment of the invention, a cell or sample from a subject may be characterized by immunophenotyping. "Immunophenotyping" generally means that a cell or sample can be characterized by antigen-specific molecules such as antibodies or other immunoreactive molecules that are added to the cell to determine the presence of an antigen. Immunophenotyping involves sorting cells using a variety of techniques, including flow cytometry, as well as analytical methods for lysed cells and lysed samples, such as Western blotting. One method of immunophenotyping is flow cytometry, in particular FACS: an analyte, in particular a cell surface protein, is usually recognized by an antibody or other immunoreactive molecule. The antibody or other immunoreactive molecule is either itself labeled with a fluorophore or is recognized by a secondary antibody labeled with a fluorophore or other immunoreactive molecule that is added for this purpose.

Характеристика подгруппы пациентовCharacteristics of the subgroup of patients

Настоящее изобретение особенно подходит для подгруппы субъектов, страдающих муковисцидозом, где указанная подгруппа характеризуется конкретным генотипом и конкретным фенотипом. Что касается специфичности генотипа, субъект характеризуется по меньшей мере одной мутацией по меньшей мере в одном аллеле гена CFTR. Что касается специфичности фенотипа, мутация является причиной неправильного сворачивания и/или процессинга белка CFTR. Таким образом, генетическая мутация является мутацией с потерей функции. Было идентифицировано около 2000 мутаций в гене CFTR, которые вызывают фенотип потери функции за счет нарушения транскрипции и/или трансляции, клеточного сворачивания и/или процессинга, и/или гейтинга хлоридных каналов. В общем мутации потери функции гена CFTR были описаны, среди прочего, Rowe et al. (Cold Spring Harb. Perspect. Med., 2013, vol. 3, a009761) и в http://www.genet.sickkids.on.ca/app.The present invention is particularly suitable for a subgroup of subjects suffering from cystic fibrosis, where the specified subgroup is characterized by a specific genotype and a specific phenotype. With regard to genotype specificity, the subject is characterized by at least one mutation in at least one allele of the CFTR gene. With regard to phenotype specificity, the mutation causes the CFTR protein to misfold and/or be processed. Thus, a genetic mutation is a loss-of-function mutation. Approximately 2,000 mutations in the CFTR gene have been identified that cause a loss of function phenotype by disrupting transcription and/or translation, cell folding and/or processing, and/or gating of chloride channels. In general, loss-of-function mutations in the CFTR gene have been described, inter alia, by Rowe et al. (Cold Spring Harb. Perspect. Med., 2013, vol. 3, a009761) and at http://www.genet.sickkids.on.ca/app.

В частности, настоящее изобретение относится к соединению общей формулы (I) для применения при профилактике и/или лечении муковисцидоза у субъекта, где субъект характеризуется по меньшей мере одной мутацией в гене CFTR, которая является причиной неправильного сворачивания и/или процессинга белка CFTR.In particular, the present invention relates to a compound of general formula (I) for use in the prevention and/or treatment of cystic fibrosis in a subject, where the subject is characterized by at least one mutation in the CFTR gene that causes misfolding and/or processing of the CFTR protein.

Таким образом, указанная по меньшей мере одна мутация в гене CFTR не является молчащей мутацией: это мутация с потерей функции, которая является причиной мутации аминокислотной последовательности кодируемого белка CFTR.Thus, said at least one mutation in the CFTR gene is not a silent mutation: it is a loss-of-function mutation that causes a mutation in the amino acid sequence of the encoded CFTR protein.

Хотя было отмечено, что некоторые мутации в гене CFTR являются более частыми у субъектов с североевропейским происхождением или родословной и реже встречаются у субъектов с африканским и азиатским происхождением или родословной (O’Sullivan, et al., 2009, Lancet, vol. 373, p. 1891-1904), настоящее изобретение применимо независимо от возраста, расы, этнического или географического происхождения субъекта, если контекст явно не предписывает иное.Although it has been noted that some mutations in the CFTR gene are more frequent in subjects of Northern European ancestry or ancestry and less common in subjects of African and Asian ancestry or ancestry (O'Sullivan, et al., 2009, Lancet, vol. 373, p . 1891-1904), the present invention is applicable regardless of the age, race, ethnic or geographic origin of the subject, unless the context clearly dictates otherwise.

Настоящее изобретение частично основано на удивительном обнаружении того, что соединение общей формулы (I), определенное в настоящем документе, такое как CHF6001, неожиданно увеличивает присутствие мутированного белка CFTR на уровне клеточной плазматической мембраны. Это показано в примере 2.The present invention is based in part on the surprising discovery that a compound of general formula (I) as defined herein, such as CHF6001, unexpectedly increases the presence of a mutated CFTR protein at the level of the cell's plasma membrane. This is shown in example 2.

В одном варианте осуществления изобретения субъект характеризуется двумя аллелями мутированного CFTR, как описано в настоящем документе. Два мутированных аллеля могут быть одинаковыми или разными. В предпочтительном варианте осуществления два мутантных аллеля имеют по меньшей мере одну мутацию, которая является причиной неправильного сворачивания и/или процессинга белка CFTR.In one embodiment of the invention, the subject is characterized by two alleles of the mutated CFTR, as described herein. The two mutated alleles may be the same or different. In a preferred embodiment, the two mutant alleles have at least one mutation that causes misfolding and/or processing of the CFTR protein.

Субъектом, у которого муковисцидоз может быть предотвращен или излечен в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно, является млекопитающее, более предпочтительно, человек. Примерами животных являются предназначенные на убой животные и другие животные, выращиваемые на ферме, такие как крупный рогатый скот, свиньи, овцы или домашняя птица.The subject in which cystic fibrosis can be prevented or treated according to the present invention is preferably a mammal, more preferably a human. Examples of animals are slaughter animals and other farm animals such as cattle, pigs, sheep or poultry.

У животных, не являющихся людьми, настоящее изобретение применимо к субъектам подгрупп, имеющих видовые гомологи белков CFTR человека, описанные в настоящем документе. В общем, «видовой гомолог» представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислоты или ее мутацию с происхождением, отличным от вида данной последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислоты или ее мутации. Таким образом, видовой гомолог белка человека CFTR представляет собой белок CFTR нечеловеческого вида, а видовой гомолог человеческой мутации ΔF508 у животного, не являющегося человеком, относится к делеции участка белка CFTR животного, не являющегося человеком, которое по гомологии последовательностей соответствует человеческой мутации ΔF508.In non-human animals, the present invention is applicable to subjects of the subgroups having species homologues of the human CFTR proteins described herein. In general, a "species homologue" is a nucleic acid or amino acid sequence, or a mutation thereof, of an origin different from the species of the given nucleic acid or amino acid sequence, or mutation thereof. Thus, the species homologue of a human CFTR protein is a non-human CFTR protein, and the species homologue of a human ΔF508 mutation in a non-human animal refers to a deletion of a portion of the non-human CFTR protein that corresponds in sequence homology to the human ΔF508 mutation.

Тот факт, что соединение по настоящему изобретению способно специфически увеличивать присутствие мутированного белка CFTR (пример 2), предполагает, не желая быть связанным какой-либо конкретной теорией, что молекулярный механизм, отличный от, или, по крайней мере, в дополнение к ингибированию PDE4, отвечает за коррекцию дефекта клеточного процессинга канала CFTR, наблюдаемого при воздействии CHF6001 в примере 2, то есть то, что корректирующая активность CHF6001 в мутированном белке CFTR может быть обусловлена другим механизмом действия. Такой механизм действия еще не полностью выяснен на молекулярном уровне, но это подтверждается научными открытиями, о которых сообщается в настоящем документе.The fact that the compound of the present invention is able to specifically increase the presence of the mutated CFTR protein (Example 2) suggests, without wishing to be bound by any particular theory, that a molecular mechanism other than, or at least in addition to, PDE4 inhibition , is responsible for correcting the defect in cellular processing of the CFTR channel observed upon exposure to CHF6001 in Example 2, ie that the corrective activity of CHF6001 in the mutated CFTR protein may be due to a different mechanism of action. This mechanism of action has not yet been fully elucidated at the molecular level, but this is supported by the scientific findings reported in this paper.

Следовательно, настоящее изобретение может быть использовано для лечения или профилактики муковисцидоза у субъектов, характеризующихся по меньшей мере одной мутацией в гене CFTR, которая является причиной неправильного сворачивания и/или процессинга белка CFTR. В некоторых вариантах осуществления изобретения такие субъекты могут страдать от муковисцидоза в дыхательных путях и/или в желудочно-кишечном тракте. Субъекты, которые получают пользу от лечения или профилактики согласно настоящему изобретению, представляют собой подгруппу пациентов с муковисцидозом. Эта подгруппа, которая определяется как генотипически, так и фенотипически, является узкой и специфической по сравнению с не определенным общим количеством пациентов с муковисцидозом, как указано, например, в WO 2010/089107 A1. В одном варианте осуществления изобретения соединение в соответствии с настоящим изобретением может быть использовано, в частности, для лечения субъектов, страдающих муковисцидозом в дыхательных путях. Пример 2 свидетельствует о том, что соединение по настоящему изобретению особенно подходит для лечения клеток дыхательных путей. Действительно, согласно общеизвестным знаниям, общепризнанно, что разработка лекарств в области муковисцидоза дыхательных путей может в значительной степени основываться на фенотипических анализах, основанных на функции канала CFTR (Rowe et al., Cold Spring Harb. Perspect. Med., 2013 vol. 3, a009761). В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект связан с состоянием, выбранным из воспаления легких. Не желая привязываться к конкретной теории, обычно понимают, что мутация ΔF508 del является мутацией сворачивания.Therefore, the present invention can be used to treat or prevent cystic fibrosis in subjects characterized by at least one mutation in the CFTR gene that causes misfolding and/or processing of the CFTR protein. In some embodiments of the invention, such subjects may suffer from cystic fibrosis in the respiratory tract and/or in the gastrointestinal tract. Subjects who benefit from treatment or prophylaxis according to the present invention are a subgroup of patients with cystic fibrosis. This subgroup, which is defined both genotypically and phenotypically, is narrow and specific compared to an undefined total number of patients with cystic fibrosis, as indicated, for example, in WO 2010/089107 A1. In one embodiment of the invention, the compound according to the present invention can be used, in particular, for the treatment of subjects suffering from cystic fibrosis in the respiratory tract. Example 2 indicates that the compound of the present invention is particularly suitable for the treatment of respiratory tract cells. Indeed, according to common knowledge, it is generally accepted that drug development in the field of respiratory cystic fibrosis can rely heavily on phenotypic analyzes based on the function of the CFTR channel (Rowe et al., Cold Spring Harb. Perspect. Med., 2013 vol. 3, a009761). In some embodiments, the subject is associated with a condition selected from pneumonia. Without wishing to be bound by a particular theory, it is generally understood that the ΔF508 del mutation is a folding mutation.

Субъект характеризуется по меньшей мере одной мутацией, которая характеризуется постоянным изменением нуклеотидной последовательности субъекта, предпочтительно, геномной нуклеотидной последовательности субъекта. Таким образом, предпочтительно, чтобы по меньшей мере одна мутация представляла собой геномную мутацию гена CFTR. Предпочтительно, такая мутация представляет собой мутацию с потерей функции. Более предпочтительно, субъект, которого лечат, характеризуется мутацией потери функции гена CFTR на каждом из аллелей гена CFTR. Другими словами, по меньшей мере, один аллель гена CFTR субъекта не кодирует белок CFTR дикого типа, предпочтительно, оба аллеля гена CFTR субъекта не кодируют белок CFTR дикого типа. Предпочтительно, по меньшей мере один аллель гена CFTR субъекта кодирует белок CFTR, характеризующийся измененными сворачиванием, процессингом, проводимостью или гейтингом по сравнению с белком CFTR дикого типа. Как используется в настоящем документе, белок CFTR, характеризующийся измененными сворачиванием, процессингом, проводимостью или гейтингом по сравнению с белком CFTR дикого типа, может характеризоваться мутацией с потерей функции. Более предпочтительно, оба аллеля гена CFTR субъекта кодируют белок CFTR, характеризующийся измененными сворачиванием, процессингом, проводимостью или гейтингом по сравнению с белком CFTR дикого типа. Два аллеля субъекта, которые кодируют белок CFTR не дикого типа, предпочтительно, белок CFTR, характеризующиеся измененными сворачиванием, процессингом, проводимостью или гейтингом по сравнению с белком CFTR дикого типа, могут быть одинаковыми или разными. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения два аллеля субъекта, которые кодируют белок CFTR не дикого типа, кодируют один и тот же мутант белка CFTR и, необязательно, имеют одну и ту же нуклеотидную последовательность. Таким образом, в некоторых предпочтительных вариантах субъект является гомозиготным по мутации в гене CFTR. Пример 1 и пример 2 показывают, что соединение, соответствующее общей формуле (I), подходит для клеток, гомозиготных по мутации в гене CFTR.The subject is characterized by at least one mutation, which is characterized by a permanent change in the nucleotide sequence of the subject, preferably the genomic nucleotide sequence of the subject. Thus, preferably, at least one mutation is a genomic mutation of the CFTR gene. Preferably, such a mutation is a loss-of-function mutation. More preferably, the subject being treated is characterized by a loss-of-function mutation of the CFTR gene at each of the alleles of the CFTR gene. In other words, at least one allele of the subject's CFTR gene does not encode a wild-type CFTR protein, preferably both alleles of the subject's CFTR gene do not encode a wild-type CFTR protein. Preferably, at least one allele of the subject's CFTR gene encodes a CFTR protein having altered folding, processing, conductance, or gating compared to the wild-type CFTR protein. As used herein, a CFTR protein characterized by altered folding, processing, conductance, or gating compared to a wild-type CFTR protein may be characterized by a loss-of-function mutation. More preferably, both alleles of the subject's CFTR gene encode a CFTR protein having altered folding, processing, conductance, or gating compared to the wild-type CFTR protein. Two subject alleles that encode a non-wild-type CFTR protein, preferably a CFTR protein, characterized by altered folding, processing, conductance, or gating compared to the wild-type CFTR protein, may be the same or different. In one preferred embodiment, the two subject alleles that encode for a non-wild-type CFTR protein encode the same CFTR protein mutant and optionally have the same nucleotide sequence. Thus, in some preferred embodiments, the subject is homozygous for a mutation in the CFTR gene. Example 1 and Example 2 show that the compound corresponding to the general formula (I) is suitable for cells homozygous for a mutation in the CFTR gene.

По меньшей мере одна мутация в гене CFTR выбрана из миссенс мутации (включая вставку или удаление не в кадре), мутации сдвига рамки, мутации сплайсинга, мутации нонсенса, вставки или удаления в рамке (in/del) одной или нескольких аминокислот, мутации промотора, мутации, которая влияет на гликозилирование белка CFTR, или любой другой мутации гена CFTR, которая влияет на белок CFTR. Предпочтительно, мутация представляет собой вставку или делецию в рамке (in/del) одной или нескольких аминокислот. Примером этого является делеция аминокислотного остатка фенилаланина 508 (Phe508, F508), вызванная делецией из 3 нуклеотидов (то есть в рамке). Эта специфическая делеция (ΔF508) вызывает дефект сворачивания белка. Если этот дефект преодолен, как предусмотрено в настоящем изобретении, тогда белок может образовывать функциональный канал CFTR.At least one mutation in the CFTR gene is selected from a missense mutation (including an out-of-frame insertion or deletion), a frameshift mutation, a splicing mutation, a nonsense mutation, an in-frame (in/del) insertion or deletion of one or more amino acids, a promoter mutation, a mutation that affects the glycosylation of the CFTR protein, or any other mutation in the CFTR gene that affects the CFTR protein. Preferably, the mutation is an in-frame (in/del) insertion or deletion of one or more amino acids. An example of this is the deletion of the amino acid residue phenylalanine 508 (Phe508, F508) caused by a 3 nucleotide deletion (ie, in-frame). This specific deletion (ΔF508) causes a protein folding defect. If this defect is overcome, as provided by the present invention, then the protein can form a functional CFTR channel.

По меньшей мере одна мутация гена CFTR может представлять собой мутацию в экзоне 1, или экзоне 2, или экзоне 3, или экзоне 4, или экзоне 5, или экзоне 6, или экзоне 7, или экзоне 8, или экзоне 9, или экзоне 10, или экзоне 11, или экзоне 12, или экзоне 13, или экзоне 14, или экзоне 15, или экзоне 16, или экзоне 17, или экзоне 18, или экзоне 19, или экзоне 20, или экзоне 21, или экзоне 22, или экзоне 23, или экзоне 24, или экзоне 25, или экзоне 26, или экзоне 27 гена CFTR. Альтернативно или дополнительно по меньшей мере одна мутация гена CFTR может представлять собой мутацию внутри интрона 1, или интрона 2, или интрона 3, или интрона 4, или интрона 5, или интрона 6, или интрона 7, или интрона 8, или интрона 9, или интрона 10, или интрона 11, или интрона 12, или интрона 13, или интрона 14, или интрона 15, или интрона 16, или интрона 17, или интрона 18, или интрона 19, или интрона 20, или интрона 21, или интрона 22, или интрона 23, или интрона 24, или интрона 25, или интрона 26 гена CFTR, и/или мутацию, которая перекрывает несколько экзонов и/или интронов. В предпочтительных вариантах осуществления по меньшей мере одна мутация обнаружена в экзоне 11 гена CFTR, то есть в экзоне, кодирующем фенилаланин 508 в CFTR дикого типа (http://www.genet.sickkids.on.ca/CftrDomainPage.html?domainName=NBD1).At least one CFTR gene mutation may be a mutation in exon 1 or exon 2 or exon 3 or exon 4 or exon 5 or exon 6 or exon 7 or exon 8 or exon 9 or exon 10 or exon 11 or exon 12 or exon 13 or exon 14 or exon 15 or exon 16 or exon 17 or exon 18 or exon 19 or exon 20 or exon 21 or exon 22 or exon 23 or exon 24 or exon 25 or exon 26 or exon 27 of the CFTR gene. Alternatively or additionally, at least one CFTR gene mutation may be a mutation within intron 1, or intron 2, or intron 3, or intron 4, or intron 5, or intron 6, or intron 7, or intron 8, or intron 9, or intron 10 or intron 11 or intron 12 or intron 13 or intron 14 or intron 15 or intron 16 or intron 17 or intron 18 or intron 19 or intron 20 or intron 21 or intron 22, or intron 23, or intron 24, or intron 25, or intron 26 of the CFTR gene, and/or a mutation that spans multiple exons and/or introns. In preferred embodiments, at least one mutation is found in exon 11 of the CFTR gene, i.e., exon encoding phenylalanine 508 in wild-type CFTR ).

Предпочтительно, по меньшей мере одна мутация гена CFTR представляет собой нуклеотидную мутацию, которая вызывает мутацию на уровне аминокислотной последовательности в пределах нуклеотидсвязывающего домена (NBD) белка CFTR. NBD содержат ряд высоко консервативных мотивов, которые, по прогнозам, связывают и гидролизуют АТФ. Сайт-направленный мутагенез по этим мотивам показал, что АТФ связывается с обоими NBD, чтобы контролировать гейтинг канала. В предпочтительных вариантах осуществления по меньшей мере одна мутация является причиной мутации на уровне аминокислот в первом (более N-концевом) нуклеотидсвязывающем домене (NBD) белка CFTR. Фенилаланин 508 в CFTR дикого типа обнаружен в первом нуклеотидсвязывающем домене (NBD1; см., http://www.genet.sickkids.on.ca/CftrDomainPage.html?domainName=NBD1).Preferably, at least one CFTR gene mutation is a nucleotide mutation that causes a mutation at the amino acid sequence level within the nucleotide binding domain (NBD) of the CFTR protein. NBDs contain a number of highly conserved motifs that are predicted to bind and hydrolyze ATP. Site-directed mutagenesis in these motifs showed that ATP binds to both NBDs to control channel gating. In preferred embodiments, at least one mutation causes a mutation at the amino acid level in the first (more than N-terminal) nucleotide binding domain (NBD) of the CFTR protein. Phenylalanine 508 in wild type CFTR is found in the first nucleotide binding domain (NBD1; see http://www.genet.sickkids.on.ca/CftrDomainPage.html?domainName=NBD1).

В одном варианте осуществления изобретения субъект, подлежащий лечению в соответствии с настоящим изобретением, характеризуется по меньшей мере одной мутацией в белке CFTR, которая является не только мутацией гейтинга или мутацией проводимости. Во избежание сомнений, хотя фенилаланин 508 в белке CFTR дикого типа находится в NBD1, делеция фенилаланина 508 не только вызывает дефект гейтинга и проводимости, но также и сворачивания белка CFTR, как описано ниже.In one embodiment of the invention, the subject to be treated in accordance with the present invention is characterized by at least one mutation in the CFTR protein, which is not only a gating mutation or a conductance mutation. For the avoidance of doubt, although phenylalanine 508 in the wild-type CFTR protein is in NBD1, deletion of phenylalanine 508 not only causes a defect in gating and conduction, but also in the folding of the CFTR protein, as described below.

В предпочтительных вариантах осуществления изобретения субъект характеризуется отсутствием фенилаланина 508 со ссылкой на последовательность CFTR дикого типа. Фенилаланин 508 может отсутствовать из-за множества различных альтернативных генетических мутаций, и все такие альтернативы включены в настоящее изобретение, если контекст явно не диктует иное. В частности, по меньшей мере одна мутация в гене CFTR, вызывающая отсутствие фенилаланина 508, выбрана из ошибочной мутации (включая вставку или удаление не в рамке), обычно в положении в нуклеотидной последовательности, которая кодирует фенилаланин 508 или выше от этого положения; мутация со сдвигом рамки, обычно в положении в нуклеотидной последовательности, которая кодирует фенилаланин 508 или выше этого положения; мутация сплайсинга, обычно затрагивающая, по меньшей мере, один из экзонов 1-11 и/или интронов 1-10, нонсенс-мутация, обычно в положении в нуклеотидной последовательности, которая кодирует фенилаланин 508 или выше этого положения; вставка или удаление в рамке (in/del) одной или нескольких аминокислот, как правило, в положении в нуклеотидной последовательности, которая кодирует фенилаланин 508 или выше этого положения. Термин «выше» в контексте настоящего изобретения имеет обычное значение в области молекулярной биологии и, когда используется со ссылкой на последовательность нуклеиновых кислот, предназначен для указания положения ближе к 5’ концу этой последовательности нуклеиновых кислот.In preferred embodiments of the invention, the subject is characterized by the absence of phenylalanine 508 with reference to the wild-type CFTR sequence. Phenylalanine 508 may be absent due to many different alternative genetic mutations, and all such alternatives are included in the present invention unless the context clearly dictates otherwise. In particular, at least one mutation in the CFTR gene causing the absence of phenylalanine 508 is selected from a mismutation (including insertion or deletion out of frame), usually at a position in the nucleotide sequence that encodes phenylalanine 508 or higher from that position; a frameshift mutation, usually at a position in the nucleotide sequence that encodes for phenylalanine 508 or above that position; a splicing mutation, usually affecting at least one of exons 1-11 and/or introns 1-10, a nonsense mutation, usually at a position in the nucleotide sequence that encodes phenylalanine 508 or above that position; insertion or deletion in frame (in/del) of one or more amino acids, typically at a position in the nucleotide sequence that encodes for phenylalanine 508 or above that position. The term "above" in the context of the present invention has its usual meaning in the field of molecular biology and, when used with reference to a nucleic acid sequence, is intended to indicate a position closer to the 5' end of that nucleic acid sequence.

В первом конкретном варианте осуществления изобретения указанный субъект характеризуется по меньшей мере одной мутацией в гене CFTR, которая является причиной неправильного сворачивания белка CFTR. Любая мутация такого типа также упоминается в настоящем документе как «мутация с нарушением сворачивания», термин, который применим как к уровню белка, так и к уровню нуклеиновой кислоты, которая его кодирует.In a first specific embodiment of the invention, said subject has at least one mutation in the CFTR gene that causes the CFTR protein to misfold. Any mutation of this type is also referred to herein as a "disfolding mutation", a term that applies to both the level of the protein and the level of the nucleic acid that encodes it.

Если только не исправлено, например, путем введения подходящего CFTR-корректора, мутация с нарушением сворачивания обычно является причиной пониженного присутствия белка CFTR в клетке, в частности, уменьшенного отображения белка CFTR на поверхности клетки. Присутствие белка можно обнаружить, например, с помощью гель-электрофореза и вестерн-блоттинга. Отображение белка на поверхности клетки может быть обнаружено, например, с помощью иммуноокрашивания.Unless corrected, for example by introducing a suitable CFTR corrector, the misfolding mutation usually causes a reduced presence of the CFTR protein in the cell, in particular a reduced display of the CFTR protein on the cell surface. The presence of a protein can be detected, for example, by gel electrophoresis and Western blotting. The display of a protein on the cell surface can be detected, for example, by immunostaining.

Предпочтительно, когда по меньшей мере один аллель (первый аллель) у субъекта, подлежащего лечению в соответствии с настоящим изобретением, характеризуется мутацией сворачивания, тогда второй аллель не является аллелем, который способен транс-дополнять дефект сворачивания, вызванный мутацией сворачивания на первом аллеле (Cormet-Boyaka et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 101, p. 8221-8226). Предпочтительно, в этом варианте осуществления у субъекта, подлежащего лечению в соответствии с настоящим изобретением, кодирован белок CFTR с мутацией сворачивания (одинаковой или разной) на каждом из двух аллелей гена CFTR. Когда мутация с нарушением сворачивания идентична на обоих аллелях, что является предпочтительным, тогда субъект гомозиготен по указанной мутации сворачивания.Preferably, when at least one allele (the first allele) in the subject to be treated in accordance with the present invention is characterized by a folding mutation, then the second allele is not an allele that is capable of trans-complementing the folding defect caused by the folding mutation on the first allele (Cormet -Boyaka et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 101, pp. 8221-8226). Preferably, in this embodiment, the subject to be treated in accordance with the present invention encodes a CFTR protein with a folding mutation (same or different) on each of the two alleles of the CFTR gene. When the unfolding mutation is identical on both alleles, which is preferred, then the subject is homozygous for said folding mutation.

В контексте настоящего изобретения «мутация с нарушением сворачивания» относится к мутации полипептидной последовательности CFTR (и, следовательно, также к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей ее), где мутация полипептидной последовательности CFTR является причиной неэффективного сворачивания полипептида CFTR. Не желая связываться с какой-либо конкретной теорией, в настоящее время понятно, что сворачивание CFTR происходит в эндоплазматическом ретикулуме, ко- и/или посттрансляционно; мутация с нарушением сворачивания представляет собой мутацию, в которой мутантный белок CFTR не сворачивается так же эффективно, как белок CFTR дикого типа, например, из-за одного или нескольких из следующих дефектов: неэффективное образование нативной конформации в эндоплазматической сети (ER), неэффективный выход из ER и/или неэффективное гликозилирование в компартменте Гольджи (Lukacs et al., 2012, Trends Mol. Med., vol. 18, p. 81-91). «Не сворачивается так же эффективно, как белок CFTR дикого типа» означает, что менее 100% отдельных полипептидов CFTR сворачиваются так же эффективно, как белок CFTR дикого типа, даже если определенный процент отдельных полипептидов CFTR действительно должен быть свернут правильно. Не желая привязываться к какой-либо конкретной теории, предполагается, что частично свернутые каналы удаляются посредством ER-ассоциированной деградации (ERAD) через систему убиквитин-протеасома (UPS; Lukacs et al., выше), которая объясняет, почему присутствие и/или поверхностное отображение складывающегося мутанта CFTR обычно составляет менее 100% по сравнению с уровнями присутствия и/или поверхностного отображения белка CFTR дикого типа в соответствующем типе клеток. Хотя первопричина неэффективного сворачивания мутантного CFTR не была окончательно выяснена и не является критической для практики настоящего изобретения, было предположено, что неэффективному сворачиванию способствуют энергетическая нестабильность отдельных доменов белка CFTR, медленная сборка доменов и относительно быстрая кинетика ERAD (Lukacs et al., выше).In the context of the present invention, "misfolding mutation" refers to a mutation of the CFTR polypeptide sequence (and therefore also of the nucleic acid sequence encoding it), where the mutation of the CFTR polypeptide sequence causes the CFTR polypeptide to fold inefficiently. Without wishing to be bound by any particular theory, it is currently understood that CFTR folding occurs in the endoplasmic reticulum co- and/or post-translationally; a misfolding mutation is a mutation in which the mutant CFTR protein does not fold as efficiently as the wild-type CFTR protein, for example, due to one or more of the following defects: inefficient formation of native conformation in the endoplasmic reticulum (ER), inefficient yield from the ER and/or inefficient glycosylation in the Golgi compartment (Lukacs et al., 2012, Trends Mol. Med., vol. 18, p. 81-91). "Does not fold as efficiently as wild-type CFTR protein" means that less than 100% of individual CFTR polypeptides fold as efficiently as wild-type CFTR protein, even though a certain percentage of individual CFTR polypeptides do need to fold correctly. Without wishing to be bound by any particular theory, it is proposed that partially folded channels are removed by ER-associated degradation (ERAD) via the ubiquitin-proteasome system (UPS; Lukacs et al., supra), which explains why the presence and/or surface display of the folding CFTR mutant is typically less than 100% compared to the levels of presence and/or surface display of the wild-type CFTR protein in the respective cell type. Although the underlying cause of inefficient folding of mutant CFTR has not been conclusively elucidated and is not critical to the practice of the present invention, it has been suggested that energetic instability of individual CFTR protein domains, slow domain assembly, and relatively fast ERAD kinetics contribute to inefficient folding (Lukacs et al., supra).

Настоящее изобретение применимо к любому мутанту сворачивания CFTR, если контекст явно не диктует иное. В частности, настоящее изобретение применимо к делеции фенилаланина 508 в отношении человеческого CFTR дикого типа. Эта мутация может упоминаться как ΔF508, ΔPhe508, F508del или Phe508del, или тому подобное. Мутация ΔF508 является наиболее хорошо изученной мутацией с нарушением сворачивания белка CFTR человека. У человека, которого предполагается лечить в соответствии с настоящим изобретением, мутация ΔF508 присутствует по меньшей мере в одном аллеле. Таким образом, предпочтительно, у человека, характеризующегося по меньшей мере одной мутацией гена CFTR, по меньшей мере одна мутация представляет собой ΔPhe508 в гене CFTR. Предпочтительно, когда по меньшей мере один аллель (первый аллель) у субъекта, подлежащего лечению в соответствии с настоящим изобретением, характеризуется мутацией сворачивания ΔPhe508, тогда второй аллель не является аллелем, который способен транс-дополнять дефект сворачивания, вызванный мутацией сворачивания ΔPhe508. В соответствии с вышеизложенным настоящее изобретение, таким образом, относится к применению соединения, соответствующего общей формуле (I), у человека, где геном указанного субъекта человека по меньшей мере кодирует мутацию ΔF508 в белке CFTR.The present invention is applicable to any CFTR folding mutant unless the context clearly dictates otherwise. In particular, the present invention is applicable to the deletion of phenylalanine 508 in relation to wild-type human CFTR. This mutation may be referred to as ΔF508, ΔPhe508, F508del or Phe508del, or the like. The ΔF508 mutation is the most well-studied mutation in human CFTR protein folding. In a person to be treated in accordance with the present invention, the ΔF508 mutation is present in at least one allele. Thus, preferably, in a human having at least one mutation in the CFTR gene, at least one mutation is ΔPhe508 in the CFTR gene. Preferably, when at least one allele (the first allele) in the subject to be treated according to the present invention is characterized by the ΔPhe508 folding mutation, then the second allele is not an allele that is capable of trans-complementing the folding defect caused by the ΔPhe508 folding mutation. In accordance with the foregoing, the present invention thus relates to the use of a compound corresponding to the general formula (I) in a human, wherein said human subject's genome at least encodes a ΔF508 mutation in the CFTR protein.

Более предпочтительно, указанный человек является гомозиготным по мутации ΔPhe508. В этом отношении настоящее изобретение относится к применению соединения, соответствующего общей формуле (I), у человека, где геном указанного субъекта человека кодирует мутацию ΔF508 в обоих геномных аллелях гена, кодирующего белок CFTR. Другими словами, настоящее изобретение относится к применению соединения, соответствующего общей формуле (I), у человека, где указанный субъект человек гомозиготен по ΔF508.More preferably, said individual is homozygous for the ΔPhe508 mutation. In this regard, the present invention relates to the use of a compound corresponding to the general formula (I) in a human, wherein the genome of said human subject encodes a ΔF508 mutation in both genomic alleles of the gene encoding the CFTR protein. In other words, the present invention relates to the use of a compound corresponding to the general formula (I) in a human, wherein said human subject is homozygous for ΔF508.

Настоящее изобретение в равной степени применимо к другим мутантам сворачивания CFTR. Такие другие мутанты сворачивания могут характеризоваться или нет мутацией фенилаланина 508. Субъекты, у которых один аллель (первый аллель) кодирует мутант CFTR, характеризующийся мутацией фенилаланина 508 белка CFTR, а другой аллель, кодирующий второй мутант CFTR, отличается от мутанта, кодируемого первым аллелем, но, предпочтительно, также характеризуется неправильным сворачиванием второго мутанта CFTR, явно включены в подгруппу пациентов в соответствии с предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения.The present invention is equally applicable to other CFTR folding mutants. Such other folding mutants may or may not be characterized by a phenylalanine 508 mutation. Subjects in which one allele (the first allele) encodes a CFTR mutant characterized by a phenylalanine 508 mutation of the CFTR protein and the other allele encoding the second CFTR mutant is different from the mutant encoded by the first allele, but preferably also characterized by misfolding of the second CFTR mutant are explicitly included in the patient subset according to the preferred embodiments of the present invention.

Во втором конкретном варианте осуществления указанный субъект характеризуется по меньшей мере одной мутацией в гене CFTR, которая является причиной неправильного процессинга белка CFTR. Любая мутация такого типа также упоминается в настоящем документе как «мутация процессинга», термин, который применим как к уровню белка, так и к уровню нуклеиновой кислоты, которая его кодирует. Предпочтительно, в этом втором варианте осуществления у субъекта, подлежащего лечению в соответствии с настоящим изобретением, кодирован белок CFTR с мутацией сворачивания (одинаковой или разной) на каждом из двух аллелей гена CFTR. Когда мутация с нарушением сворачивания идентична на обоих аллелях, что является предпочтительным, тогда субъект гомозиготен по указанной мутации сворачивания.In a second specific embodiment, the specified subject is characterized by at least one mutation in the CFTR gene, which causes incorrect processing of the CFTR protein. Any mutation of this type is also referred to herein as a "processing mutation", a term that applies to both the level of the protein and the level of the nucleic acid that encodes it. Preferably, in this second embodiment, the subject to be treated according to the present invention encodes a CFTR protein with a folding mutation (same or different) on each of the two alleles of the CFTR gene. When the unfolding mutation is identical on both alleles, which is preferred, then the subject is homozygous for said folding mutation.

Первый и второй конкретные варианты осуществления не обязательно являются взаимоисключающими. Другими словами, субъект, которого можно лечить в соответствии с настоящим изобретением, может характеризоваться либо мутацией сворачивания, либо мутацией, которая является одновременно мутацией сворачивания и мутацией процессинга (являющейся причиной как для неправильного процессинга, так и для неправильного сворачивания), на одном и том же аллеле или на разных аллелях.The first and second specific embodiments are not necessarily mutually exclusive. In other words, a subject that can be treated in accordance with the present invention may have either a folding mutation or a mutation that is both a folding mutation and a processing mutation (causing both misprocessing and misfolding), on the same the same allele or on different alleles.

Хотя CFTR мутация ΔF508 классифицируется в настоящем документе как «мутант сворачивания», настоящее изобретение не следует понимать как ограничиваемое такой категоризацией, поскольку нельзя исключать, что в научной среде будет предложена повторная категоризация; например, некоторые авторы также предложили классифицировать CFTR мутацию ΔF508 как «мутацию процессинга», см., например, Cormet-Boyaka et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 101, p. 8221-8226.Although the CFTR mutation ΔF508 is classified herein as a "folding mutant", the present invention should not be understood to be limited to such categorization, since it cannot be ruled out that re-categorization will be proposed in the scientific community; for example, some authors have also proposed to classify the CFTR mutation ΔF508 as a "processing mutation", see, for example, Cormet-Boyaka et al., 2004, Proc. Natl. Acad. sci. USA, vol. 101, p. 8221-8226.

Предпочтительно, настоящее изобретение в равной степени применимо к другим мутантам процессинга CFTR. Такие другие мутанты с нарушенным сворачиванием могут или нет характеризоваться мутацией фенилаланина 508. Субъекты, у которых один аллель (первый аллель) кодирует мутант CFTR, характеризующийся мутацией фенилаланина 508 белка CFTR, а другой аллель, кодирующий второй мутант CFTR, отличается от мутанта, кодируемого первым аллелем, но, предпочтительно, характеризуется неправильным процессингом второго мутанта CFTR, явно включен в подгруппу пациента в соответствии с предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения.Preferably, the present invention is equally applicable to other CFTR processing mutants. Such other misfolding mutants may or may not be characterized by a phenylalanine 508 mutation. Subjects in which one allele (the first allele) encodes a CFTR mutant characterized by a phenylalanine 508 mutation of the CFTR protein and the other allele encoding the second CFTR mutant is different from the mutant encoded by the first allele, but preferably characterized by incorrect processing of the second CFTR mutant, is explicitly included in the patient subgroup according to the preferred embodiments of the present invention.

Если только не исправлено, например, путем введения подходящего CFTR-корректора, мутация процессинга может быть причиной пониженного присутствия белка CFTR в клетке, в частности, уменьшенного отображения белка CFTR на поверхности клетки и/или изменения молекулярной массы белка CFTR по сравнению с белком CFTR дикого типа. Отображение белка на поверхности клетки может быть обнаружено, например, с помощью иммуноокрашивания. Присутствие белка и измененную молекулярную массу можно обнаружить, например, с помощью гель-электрофореза и вестерн-блоттинга.Unless corrected, for example by introducing an appropriate CFTR corrector, a processing mutation can cause a reduced presence of the CFTR protein in the cell, in particular a reduced display of the CFTR protein on the cell surface and/or a change in the molecular weight of the CFTR protein compared to the wild CFTR protein. type. The display of a protein on the cell surface can be detected, for example, by immunostaining. The presence of protein and altered molecular weight can be detected, for example, by gel electrophoresis and Western blot.

Обычно CFTR-мутанты процессинга не могут покинуть эндоплазматический ретикулум и быстро деградируют. Один пример человеческого CFTR мутанта процессинга характеризуется заменой аминокислотного остатка гистидина 1085 остатком аргинина (H1085R, Cormet-Boyaka et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 101, p. 8221-8226). Другие мутанты процессинга могут быть идентифицированы и/или они описаны в литературе, и настоящее изобретение также может быть применимо к ним.Typically, CFTR processing mutants cannot leave the endoplasmic reticulum and are rapidly degraded. One example of a human CFTR processing mutant is characterized by the replacement of amino acid residue histidine 1085 with an arginine residue (H1085R, Cormet-Boyaka et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 101, p. 8221-8226). Other processing mutants may be identified and/or described in the literature and the present invention may also be applicable to them.

Предпочтительно, по меньшей мере, одна мутация представляет собой мутацию гена CFTR, присутствующего в клетках дыхательных путей указанного субъекта. Не желая быть связанными с какой-либо конкретной теорией, в настоящее время понятно, что любая неспонтанная мутация, присутствующая в зародышевой линии субъекта, обычно также присутствует в дыхательных путях указанного субъекта. Наличие мутации в дыхательных путях может быть проверено, например, путем взятия образца из дыхательных путей и анализом генной последовательности, например, гена CFTR.Preferably, at least one mutation is a mutation of the CFTR gene present in the cells of the respiratory tract of the specified subject. Without wishing to be bound by any particular theory, it is now understood that any non-spontaneous mutation present in the germline of a subject is usually also present in the respiratory tract of said subject. The presence of a mutation in the respiratory tract can be checked, for example, by taking a sample from the respiratory tract and analyzing the gene sequence, for example, the CFTR gene.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный субъект страдает от симптомов муковисцидоза в дыхательных путях. Симптомы муковисцидоза в дыхательных путях могут включать, без ограничения, одно или несколько из следующих: закупорка дыхательных путей из-за скопления слизи, уменьшение мукоцилиарного клиренса и, как следствие, воспаление, и затруднение дыхания. Не желая привязываться к какой-либо конкретной теории, воспаление и инфекция вызывают травмы и структурные изменения в легких, что приводит к различным симптомам. Другие симптомы муковисцидоза в дыхательных путях могут также включать в себя непрерывный кашель, обильное образование мокроты и снижение способности к физической нагрузке. Не желая привязываться к какой-либо конкретной теории, многие из этих симптомов возникают, когда бактерии, которые обычно населяют густую слизь, выходят из-под контроля и вызывают пневмонию. Другие симптомы муковисцидоза в дыхательных путях могут также включать изменения в архитектуре легких, такие как патология магистральных дыхательных путей (бронхоэктазия), серьезные затруднения дыхания, кашель с кровью (кровохарканье), высокое кровяное давление в легких (легочная гипертензия), сердечная недостаточность, трудности с поступлением достаточного количества кислорода в организм (гипоксия) и дыхательная недостаточность, требующая поддержки с помощью дыхательных масок. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект, страдающий симптомами муковисцидоза в дыхательных путях, инфицирован одним или несколькими из следующих факторов: Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae и Pseudomonas aeruginosa; не исключено совместное заражение другими организмами.In some embodiments of the invention, the specified subject suffers from symptoms of cystic fibrosis in the respiratory tract. Symptoms of cystic fibrosis in the airways may include, without limitation, one or more of the following: blockage of the airways due to accumulation of mucus, decreased mucociliary clearance and consequent inflammation, and difficulty in breathing. Without wishing to be bound by any particular theory, inflammation and infection cause injury and structural changes in the lungs, resulting in a variety of symptoms. Other symptoms of cystic fibrosis in the airways may also include a persistent cough, copious sputum production, and decreased ability to exercise. Without wishing to be bound by any particular theory, many of these symptoms occur when the bacteria that normally inhabit the thick mucus get out of control and cause pneumonia. Other symptoms of cystic fibrosis in the airways may also include changes in the architecture of the lungs, such as abnormalities in the main airways (bronchiectasis), severe breathing difficulties, coughing up blood (hemoptysis), high blood pressure in the lungs (pulmonary hypertension), heart failure, difficulty with supply of sufficient oxygen to the body (hypoxia) and respiratory failure requiring support with breathing masks. In some embodiments, the subject suffering from symptoms of cystic fibrosis in the respiratory tract is infected with one or more of the following: Staphylococcus aureus , Haemophilus influenzae , and Pseudomonas aeruginosa ; co-infection with other organisms is not excluded.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный субъект страдает от симптомов муковисцидоза в желудочно-кишечном тракте. Симптомы муковисцидоза в желудочно-кишечном тракте включают, без ограничения, густые выделения из поджелудочной железы, частичную или полную блокировку экзокринного движения выделений поджелудочной железы в двенадцатиперстную кишку и повреждение поджелудочной железы, часто с болезненным воспалением (панкреатитом) и атрофией экзокринные железы. Термин «муковисцидоз» относится к характерному фиброзу и кистам, которые образуются в поджелудочной железе (Andersen, 1938, Am. J. Dis. Child, vol. 56, p. 344-399), но обычно не ограничиваются симптомами в желудочно-кишечном тракте. Действительно, в некоторых вариантах осуществления указанный субъект страдает от симптомов муковисцидоза в дыхательных путях, а также в желудочно-кишечном тракте.In some embodiments of the invention, the specified subject suffers from symptoms of cystic fibrosis in the gastrointestinal tract. Symptoms of cystic fibrosis in the gastrointestinal tract include, without limitation, thick pancreatic discharge, partial or complete blockage of the exocrine movement of pancreatic secretions into the duodenum, and damage to the pancreas, often with painful inflammation (pancreatitis) and atrophy of the exocrine glands. The term "cystic fibrosis" refers to the characteristic fibrosis and cysts that form in the pancreas (Andersen, 1938, Am. J. Dis. Child, vol. 56, p. 344-399), but is not usually limited to symptoms in the gastrointestinal tract . Indeed, in some embodiments, the implementation of the specified subject suffers from symptoms of cystic fibrosis in the respiratory tract, as well as in the gastrointestinal tract.

В некоторых вариантах субъект, подлежащий лечению в соответствии с настоящим изобретением, страдает муковисцидозом в малых дыхательных путях. Малые дыхательные пути обычно определяются как не хрящевые дыхательные пути с внутренним диаметром <2 мм (Burgel et al., 2009, Eur. Respir. Rev., vol. 18, p. 80-95). Не желая быть связанными с какой-либо конкретной теорией, малые дыхательные пути часто особенно уязвимы, потому что там могут откладываться многие частицы и инфекционные агенты, и потому что их узкий просвет делает их более восприимчивыми к полной обструкции, чем более крупные дыхательные пути. Как правило, заболевание поражает эпителий субъектов, страдающих муковисцидозом в малых дыхательных путях, и у соответствующих субъектов успех может быть достигнут при лечении путем профилактики или терапии, описанных в настоящем документе. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением можно предотвратить или лечить симптомы муковисцидоза в эпителии малых дыхательных путей. Таким образом, в предпочтительных вариантах субъект страдает муковисцидозом в эпителии малых дыхательных путей.In some embodiments, the subject to be treated in accordance with the present invention suffers from cystic fibrosis in the small airways. Small airways are generally defined as non-cartilaginous airways with an internal diameter <2 mm (Burgel et al., 2009, Eur. Respir. Rev., vol. 18, p. 80-95). Without wishing to be bound by any particular theory, small airways are often particularly vulnerable because many particles and infectious agents can be deposited there, and because their narrow lumen makes them more susceptible to complete obstruction than larger airways. Typically, the disease affects the epithelium of subjects suffering from cystic fibrosis in the small airways, and in appropriate subjects, success can be achieved with treatment by prophylaxis or therapy as described herein. Thus, according to the present invention, the symptoms of cystic fibrosis in the small airway epithelium can be prevented or treated. Thus, in preferred embodiments, the subject suffers from cystic fibrosis in the epithelium of the small airways.

В примерах, представленных в настоящем документе, в качестве модели муковисцидоза была использована клеточная линия CFBE41 человека (см., примеры). Как описано ранее, клеточная линия CFBE41 представляет собой клеточную линию человека, которая была получена путем трансформации трахеобронхиальных клеток муковисцидоза (CF) с помощью SV40 и, как сообщалось, является гомозиготной по мутации ΔF508 (Ehrhard et al., 2006, Cell Tissue Res., vol. 323, p. 405-415). Клеточная линия CFBE41 гомозиготна по ΔF508-CFTR по нескольким пассажам в культуре и экспрессирует ряд белков, важных для абсорбции лекарственных средств в легких (например, P-gp, LRP и кавеолин-1). Эта клеточная линия сохраняет, по меньшей мере, некоторые аспекты эпителиальных клеток бронхиального CF человека, такие как способность образовывать электрически плотные клеточные слои с функциональными межклеточными контактами при выращивании в условиях погруженной (но не с воздушной поверхностью) культуры. Следовательно, клеточная линия CFBE41 считается полезной для исследований муковисцидоза, например, путем обработки низкомолекулярными агентами (кандидатами лекарственных средств) и для сбора дополнительной информации о заболевании на клеточном уровне без необходимости первичной культуры (Ehrhard et al., выше).In the examples provided herein, the human CFBE41 cell line was used as a model for cystic fibrosis (see examples). As previously described, the CFBE41 cell line is a human cell line that was generated by transformation of cystic fibrosis (CF) tracheobronchial cells with SV40 and has been reported to be homozygous for the ΔF508 mutation (Ehrhard et al., 2006, Cell Tissue Res., 323, pp. 405-415). The CFBE41 cell line is homozygous for ΔF508-CFTR at several passages in culture and expresses a number of proteins important for lung drug absorption (eg, P-gp, LRP, and caveolin-1). This cell line retains at least some aspects of human bronchial CF epithelial cells, such as the ability to form electrically dense cell layers with functional cell-cell junctions when grown in submerged (but not air-surface) culture conditions. Therefore, the CFBE41 cell line is considered useful for CF studies, for example, by treatment with small molecule agents (drug candidates) and to collect additional information about the disease at the cellular level without the need for primary culture (Ehrhard et al., supra).

Описание соединения для применения в соответствии с настоящим изобретениемDescription of the compound for use in accordance with the present invention

Настоящее изобретение относится к лечению муковисцидоза у субъекта, принадлежащего к конкретной подгруппе пациентов, описанных в настоящем документе, с помощью соединения общей формулы (I)The present invention relates to the treatment of cystic fibrosis in a subject belonging to a specific subgroup of patients described herein, using a compound of General formula (I)

(I)(I)

где:where:

n обозначает 0 или 1;n is 0 or 1;

его фармацевтически приемлемыми неорганическими или органическими солями, гидратами, сольватами или аддитивными комплексами.its pharmaceutically acceptable inorganic or organic salts, hydrates, solvates or additive complexes.

Термин «атомы галогена», как используется в настоящем документе включает фтор, хлор, бром и йод, предпочтительно, хлор.The term "halogen atoms" as used herein includes fluorine, chlorine, bromine and iodine, preferably chlorine.

Как используется в настоящем документе, выражение «линейный или разветвленный C1-Cx алкил», где x обозначает целое число больше чем 1, относится к алкильным группам с прямой и разветвленной цепью, где число атомов углерода находится в диапазоне от 1 до х. Конкретными алкильными группами являются метил, этил, н-пропил, изопропил и трет-бутил. Необязательно, в указанных группах один или несколько атомов водорода могут быть заменены атомами галогена, предпочтительно, хлора или фтора.As used herein, the expression "straight or branched C1-Cx alkyl", where x is an integer greater than 1, refers to straight and branched chain alkyl groups where the number of carbon atoms is in the range from 1 to x. Specific alkyl groups are methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl and tert-butyl. Optionally, in these groups, one or more hydrogen atoms may be replaced by halogen atoms, preferably chlorine or fluorine.

Как используется в настоящем документе, выражение «C3-Cx циклоалкил», где х представляет собой целое число больше 3, относится к циклическим неароматическим углеводородным группам, содержащим от 3 до х кольцевых атомов углерода. Примеры включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и циклогептил. Необязательно, в указанных группах один или несколько атомов водорода могут быть заменены атомами галогена, предпочтительно, хлора или фтора.As used herein, the expression "C3-Cx cycloalkyl", where x is an integer greater than 3, refers to cyclic non-aromatic hydrocarbon groups containing from 3 to x ring carbon atoms. Examples include cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl and cycloheptyl. Optionally, in these groups, one or more hydrogen atoms may be replaced by halogen atoms, preferably chlorine or fluorine.

Специалистам в данной области техники будет очевидно, что соединения общей формулы (I) содержат один асимметричный центр в положении -CHO- и поэтому существуют в виде оптических стереоизомеров.It will be apparent to those skilled in the art that the compounds of general formula (I) contain one asymmetric center at the -CHO- position and therefore exist as optical stereoisomers.

Хотя настоящее изобретение может включать использование рацемата или (-) или (+) энантиомеров, предпочтительно в практически чистой форме, предпочтительными соединениями формулы (I) являются (-)энантиомеры. В примере 2 показано, что (-)энантиомер соединения, соответствующего общей формуле (I), действует как CFTR-корректор. Таким образом, соединение, соответствующее общей формуле (I), представляет собой по существу чистый (-)энантиомер производного 1-фенил-2-пиридинилалкилового спирта.Although the present invention may involve the use of the racemate or the (-) or (+) enantiomers, preferably in substantially pure form, the preferred compounds of formula (I) are the (-) enantiomers. Example 2 shows that the (-) enantiomer of the compound of general formula (I) acts as a CFTR corrector. Thus, the compound corresponding to the general formula (I) is essentially the pure (-) enantiomer of a 1-phenyl-2-pyridinylalkyl alcohol derivative.

Предпочтительными группами соединений общей формулы (I) являются такие, где:Preferred groups of compounds of general formula (I) are those where:

- R1 представляет собой HNSO₂R4, R2 представляет собой OR3, и n обозначает 0;- R1 is HNSO ₂ R4, R2 is OR3 and n is 0;

- R1 представляет собой HNSO₂R4, R2 представляет собой OR3, и n обозначает 1;- R1 is HNSO ₂ R4, R2 is OR3 and n is 1;

- R1 представляет собой HNSO₂R4, где R4 представляет собой метил, R2 представляет собой OR3, где R3 представляет собой циклопропилметил, и n обозначает 0;R1 is HNSO ₂ R4 where R4 is methyl, R2 is OR3 where R3 is cyclopropylmethyl and n is 0;

- R1 представляет собой HNSO₂R4, где R4 представляет собой метил, R2 представляет собой OR3, где R3 представляет собой циклопропилметил, и n обозначает 1;R1 is HNSO ₂ R4 where R4 is methyl, R2 is OR3 where R3 is cyclopropylmethyl and n is 1;

- R1 представляет собой линейный или разветвленный C₁-C₆ алкил, R2 представляет собой HNSO₂R4, и n обозначает 0;- R1 is linear or branched C ₁ -C ₆ alkyl, R2 is HNSO ₂ R4 and n is 0;

- R1 представляет собой метил, R2 представляет собой HNSO₂R4, где R4 представляет собой метил, и n обозначает 0;- R1 is methyl, R2 is HNSO ₂ R4 where R4 is methyl and n is 0;

- R1 представляет собой линейный или разветвленный C₁-C₆ алкил, R2 представляет собой HNSO₂R4, и n обозначает 1;- R1 is linear or branched C ₁ -C ₆ alkyl, R2 is HNSO ₂ R4 and n is 1;

- R1 представляет собой метил, R2 представляет собой HNSO₂R4, где R4 представляет собой метил, и n обозначает 1;- R1 is methyl, R2 is HNSO ₂ R4 where R4 is methyl and n is 1;

- R2 представляет собой линейный или разветвленный C₁-C₆ алкил, R1 представляет собой HNSO₂R4, и n обозначает 0;- R2 is linear or branched C ₁ -C ₆ alkyl, R1 is HNSO ₂ R4 and n is 0;

- R2 представляет собой метил, R1 представляет собой HNSO₂R4, где R4 представляет собой метил, и n обозначает 0;- R2 is methyl, R1 is HNSO ₂ R4, where R4 is methyl and n is 0;

- R2 представляет собой линейный или разветвленный C₁-C₆ алкил, R1 представляет собой HNSO₂R4, и n обозначает 1;- R2 is linear or branched C ₁ -C ₆ alkyl, R1 is HNSO ₂ R4 and n is 1;

- R2 представляет собой метил, R1 представляет собой HNSO₂R4, где R4 представляет собой метил, и n обозначает 1;- R2 is methyl, R1 is HNSO ₂ R4 where R4 is methyl and n is 1;

- R1 представляет собой OR3, R2 представляет собой HNSO₂R4, и n обозначает 0;- R1 is OR3, R2 is HNSO ₂ R4 and n is 0;

- R1 представляет собой OR3, R2 представляет собой HNSO₂R4, и n обозначает 1;- R1 is OR3, R2 is HNSO ₂ R4 and n is 1;

- R1 представляет собой OR3, где R3 представляет собой циклопропилметил, R2 представляет собой HNSO₂R4 и R4 представляет собой метил, и n обозначает 1;- R1 is OR3, where R3 is cyclopropylmethyl, R2 is HNSO ₂ R4 and R4 is methyl and n is 1;

- оба R1 и R2 представляют собой HNSO₂R4, и n обозначает 0;- both R1 and R2 are HNSO ₂ R4 and n is 0;

- оба R1 и R2 представляют собой HNSO₂R4, где R4 представляет собой метил, и n обозначает 0;- both R1 and R2 are HNSO ₂ R4, where R4 is methyl and n is 0;

- оба R1 и R2 представляют собой HNSO₂R4, и n обозначает 1;- both R1 and R2 are HNSO ₂ R4 and n is 1;

- оба R1 и R2 представляют собой HNSO₂R4, где R4 представляет собой метил, и n обозначает 1.- both R1 and R2 are HNSO ₂ R4 where R4 is methyl and n is 1.

Предпочтительно, в соединении общей формулы (I) R1 представляет собой HNSO₂R4; R4 соответствует метилу. Предпочтительно, в соединении общей формулы (I) R2 представляет собой OR3; R3 соответствует циклопропилметилу. Предпочтительно, в соединении общей формулы (I) n обозначает 1.Preferably, in the compound of general formula (I), R1 is HNSO ₂ R4; R4 corresponds to methyl. Preferably, in a compound of general formula (I), R2 is OR3; R3 corresponds to cyclopropylmethyl. Preferably, in a compound of general formula (I), n is 1.

В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения соединение формулы (I) является соединением, в котором R1 представляет собой HNSO₂R4, где R4 представляет собой метил, R2 представляет собой OR3, где R3 представляет собой циклопропилметил, и n обозначает 0.In one preferred embodiment of the invention, the compound of formula (I) is a compound in which R1 is HNSO ₂ R4 where R4 is methyl, R2 is OR3 where R3 is cyclopropylmethyl and n is 0.

В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения соединение формулы (I) является соединением, в котором R1 представляет собой OR3, R2 представляет собой HNSO₂R4, где R4 представляет собой метил, и n обозначает 1 - см. соединение C2 в таблице 1 ниже.In one preferred embodiment of the invention, the compound of formula (I) is a compound in which R1 is OR3, R2 is HNSO ₂ R4 where R4 is methyl and n is 1 - see Compound C2 in Table 1 below.

В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения соединение формулы (I) является соединением, в котором R1 представляет собой метил, R2 представляет собой HNSO₂R4, где R4 представляет собой метил, и n обозначает 1.In one preferred embodiment of the invention, the compound of formula (I) is a compound in which R1 is methyl, R2 is HNSO ₂ R4 where R4 is methyl and n is 1.

В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения соединение формулы (I) является соединением, в котором оба R1 и R2 представляют собой HNSO₂R4, где R4 представляет собой метил, и n обозначает 0.In one preferred embodiment of the invention, the compound of formula (I) is a compound in which both R1 and R2 are HNSO ₂ R4 where R4 is methyl and n is 0.

В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения соединение формулы (I) является соединением, в котором оба R1 и R2 представляют собой HNSO₂R4, где R4 представляет собой метил, и n обозначает 1.In one preferred embodiment of the invention, the compound of formula (I) is a compound in which both R1 and R2 are HNSO ₂ R4 where R4 is methyl and n is 1.

Таким образом, в соответствии с этими предпочтительными вариантами осуществления настоящее изобретение относится к применению соединений, представленных в таблице 1 ниже:Thus, in accordance with these preferred embodiments, the present invention relates to the use of the compounds shown in Table 1 below:

СоединениеCompound Химическое названиеchemical name C1C1 1-(3-Циклопропилметокси-4-дифторметоксифенил)-2-(3,5-дихлорпиридин-4-ил)этиловый эфир 3-циклопропилметокси-4-метансульфониламинобензойной кислоты1-(3-Cyclopropylmethoxy-4-difluoromethoxyphenyl)-2-(3,5-dichloropyridin-4-yl)3-cyclopropylmethoxy-4-methanesulfonylaminobenzoic acid ethyl ester C2C2 1-(3-Циклопропилметокси-4-дифторметоксифенил)-2-(3,5-дихлор-1-оксипиридин-4-ил)этиловый эфир 3-циклопропилметокси-4-метансульфониламинобензойной кислоты (CHF6001)3-Cyclopropylmethoxy-4-methanesulfonylaminobenzoic acid 1-(3-cyclopropylmethoxy-4-difluoromethoxyphenyl)-2-(3,5-dichloro-1-oxypyridin-4-yl)ethyl ester (CHF6001) C3C3 1-(3-Циклопропилметокси-4-дифторметоксифенил)-2-(3,5-дихлор-1-оксипиридин-4-ил)этиловый эфир 4-циклопропилметокси-3-метансульфониламинобензойной кислоты1-(3-Cyclopropylmethoxy-4-difluoromethoxyphenyl)-2-(3,5-dichloro-1-oxypyridin-4-yl)4-cyclopropylmethoxy-3-methanesulfonylaminobenzoic acid ethyl ester C4C4 1-(3-Циклопропил-метокси-4-дифторметоксифенил)-2-(3,5-дихлор-1-оксипиридин-4-ил)этиловый эфир 3,4-бис-метансульфониламинобензойной кислоты1-(3-Cyclopropyl-methoxy-4-difluoromethoxyphenyl)-2-(3,5-dichloro-1-oxypyridin-4-yl) 3,4-bis-methanesulfonylaminobenzoic acid ethyl ester C5C5 1-(3-Циклопропил-метокси-4-дифторметоксифенил)-2-(3,5-дихлор-1-оксипиридин-4-ил)этиловый эфир 3-метансульфониламино-4-метил-бензойной кислоты1-(3-Cyclopropyl-methoxy-4-difluoromethoxyphenyl)-2-(3,5-dichloro-1-oxypyridin-4-yl) 3-methanesulfonylamino-4-methyl-benzoic acid ethyl ester C6C6 1-(3-Циклопропилметокси-4-дифторметоксифенил)-2-(3,5-дихлор-1-оксипиридин-4-ил)этиловый эфир 4-метансульфониламино-3-метил-бензойной кислоты1-(3-Cyclopropylmethoxy-4-difluoromethoxyphenyl)-2-(3,5-dichloro-1-oxypyridin-4-yl)4-methanesulfonylamino-3-methyl-benzoic acid ethyl ester

В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение C2 (CHF6001) является наиболее предпочтительным. CHF6001 также использовали в экспериментальных примерах, показанных в настоящем документе. В литературе соединение С2 также упоминается под названием «[(S)-3,5-дихлор-4-(2-(3-(циклопропилметокси)-4-(дифторметокси)фенил)-2-(3-(циклопропилметокси)-4-(метилсульфонамидо)бензоилокси)этил)-пиридин-1-оксид] (CHF6001)» (Moretti et al. 2015, выше).In some embodiments, Compound C2 (CHF6001) is most preferred. CHF6001 was also used in the experimental examples shown herein. Compound C2 is also referred to in the literature under the name "[(S)-3,5-dichloro-4-(2-(3-(cyclopropylmethoxy)-4-(difluoromethoxy)phenyl)-2-(3-(cyclopropylmethoxy)-4 -(methylsulfonamido)benzoyloxy)ethyl)-pyridine-1-oxide] (CHF6001)" (Moretti et al. 2015, supra).

Таким образом, в соответствии с вышеизложенным, подгруппа пациентов, подвергаемых специфическому лечению соединением в соответствии с общей формулой (I) согласно настоящему изобретению, представлена подгруппой всех субъектов, пораженных муковисцидозом.Thus, in accordance with the above, the subgroup of patients subjected to specific treatment with a compound in accordance with the General formula (I) according to the present invention, is represented by a subgroup of all subjects affected by cystic fibrosis.

Общеизвестно, что белок CFTR активируется цАМФ. Хотя основываясь на этих общих знаниях ранее было высказано предположение, что некоторые ингибиторы PDE4 могут способствовать активации белка CFTR и, следовательно, CFTR-зависимой секреции хлорида при некоторых респираторных заболеваниях (Lambert et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2014, vol. 50, p. 549-558; Liu et al, J. Pharmacol Exp Ther., 2005, vol. 314, p. 846-854), никогда нельзя было показать, что ингибиторы PDE4 в целом могут способствовать активации белка CFTR. Более того, исходя из результатов предшествующего уровня техники, обычно нельзя было ожидать, что ингибирование одних только ингибиторов PDE вылечит муковисцидоз, в частности, скорректирует присутствие белка CFTR или его отображения на поверхности клетки (Blanchard et al., 2014, FASEB J., vol. 28, p. 791-801).It is well known that the CFTR protein is activated by cAMP. Although, based on this general knowledge, it has previously been suggested that certain PDE4 inhibitors may promote CFTR protein activation and hence CFTR-dependent chloride secretion in certain respiratory diseases (Lambert et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. , 2014, vol. 50, pp. 549-558; Liu et al, J. Pharmacol Exp Ther., 2005, vol. 314, pp. 846-854), it has never been shown that PDE4 inhibitors in general can promote activation CFTR protein. Moreover, based on the results of the prior art, inhibition of PDE inhibitors alone could not normally be expected to cure cystic fibrosis, in particular, correct the presence of the CFTR protein or its display on the cell surface (Blanchard et al., 2014, FASEB J., vol. 28, pp. 791-801).

Несмотря на вышесказанное, в некоторых вариантах осуществления изобретения соединение, соответствующее общей формуле (I), для применения в соответствии с настоящим изобретением действительно обладает ингибирующей активностью в отношении PDE4. Не желая связываться с какой-либо конкретной теорией, однако предусматривается, что ингибирование PDE4 не является необходимым и/или недостаточным для объяснения механизма действия соединения общей формулы (I) на мутантный белок CFTR в подгруппе пациентов, подлежащих лечению, особенно при коррекции CFTR. В частности, понятно, что ингибирующая активность по отношению к PDE4 не может полностью объяснить наблюдаемую коррекцию присутствия мутантного CFTR, кодируемого геном CFTR, имеющим по меньшей мере одну мутацию, согласно настоящему изобретению.Notwithstanding the foregoing, in some embodiments, the compound of general formula (I) for use in accordance with the present invention does have PDE4 inhibitory activity. Without wishing to be bound by any particular theory, however, it is contemplated that PDE4 inhibition is not necessary and/or insufficient to explain the mechanism of action of the compound of general formula (I) on the CFTR mutant protein in a subgroup of patients to be treated, especially when correcting CFTR. In particular, it is understood that PDE4 inhibitory activity cannot fully explain the observed correction for the presence of a mutant CFTR encoded by the CFTRα gene having at least one mutation according to the present invention.

Выводы авторов настоящего изобретения весьма удивительны в свете предшествующего уровня техники: когда ингибиторы PDE4 были предварительно испытаны и оценены на предмет их потенциального воздействия на клетки дикого типа и ΔF508-CFTR, было обнаружено, что только ингибиторы PDE4 вызывают минимальную активацию канала; было обнаружено, что они усиливают эффекты как CFTR-корректоров, так и CFTR-потенциаторов, но ничего не было предложено для коррекции CFTR с помощью ингибиторов PDE4, не говоря уже об экспериментальных показаниях (Blanchard et al., 2014, FASEB J., vol. 28, p. 791-801).The present inventors' conclusions are quite surprising in light of the prior art: when PDE4 inhibitors were previously tested and evaluated for their potential effects on wild-type cells and ΔF508-CFTR, only PDE4 inhibitors were found to cause minimal channel activation; they have been found to enhance the effects of both CFTR correctors and CFTR potentiators, but nothing has been proposed to correct CFTR with PDE4 inhibitors, let alone experimental indications (Blanchard et al., 2014, FASEB J., vol. 28, pp. 791-801).

Некоторые ингибиторы PDE4, такие как, в частности, рофлумиласт (Daxas, Takeda Pharmaceuticals, Цюрих, Швейцария), при введении людям ассоциируются с побочными эффектами, в частности с желудочно-кишечными расстройствами, такими как тошнота, диарея, боль в животе, рвота и диспепсия (Moretto et al., 2015, J. Pharmacol. Exper. Ther., 2015, vol. 352, p. 559-567). Хотя было обнаружено, что в процессе разработки настоящего изобретения известный ингибитор PDE4 рофлумиласт может играть роль в модулировании некоторых аспектов ΔF508 белка CFTR, настоящее изобретение, как конкретно заявлено, не сосредоточено на использовании рофлумиласта. В отличие от таких агентов, как рофлумиласт, соединение общей формулы (I) по настоящему изобретению характеризуется минимальными побочными эффектами при введении субъекту. Таким образом, наряду с тем, что муковисцидоз можно лечить или предотвращать у субъекта с помощью соединения по настоящему изобретению, введение такого соединения обычно не вызывает нежелательных побочных эффектов у большинства субъектов. Неблагоприятные эффекты могут возникнуть, например, в начале, при продолжении, увеличении режима приема или при прекращении лечения. Иногда неблагоприятные эффекты могут вызывать осложнения заболевания или процедуры и негативно влиять на его прогноз. Они также могут привести к несоблюдению режима лечения.Some PDE4 inhibitors, such as in particular roflumilast (Daxas, Takeda Pharmaceuticals, Zurich, Switzerland), when administered to humans are associated with side effects, in particular gastrointestinal disturbances such as nausea, diarrhea, abdominal pain, vomiting and dyspepsia (Moretto et al., 2015, J. Pharmacol. Exper. Ther., 2015, vol. 352, p. 559-567). Although it has been found during the development of the present invention that the known PDE4 inhibitor roflumilast may play a role in modulating some aspects of the CFTR protein ΔF508, the present invention is not specifically stated to focus on the use of roflumilast. Unlike agents such as roflumilast, the compound of general formula (I) of the present invention has minimal side effects when administered to a subject. Thus, while cystic fibrosis can be treated or prevented in a subject with a compound of the present invention, administration of such a compound does not typically cause unwanted side effects in most subjects. Adverse effects may occur, for example, at the beginning, with continuation, increase in the regimen, or when treatment is stopped. Sometimes adverse effects can cause complications of the disease or procedure and negatively affect its prognosis. They can also lead to non-adherence to the treatment regimen.

В примере 1 продемонстрировано, что некоторые агенты с известной ингибирующей активностью в отношении PDE4, в частности, соединение общей формулы (I) и рофлумиласт, обладают специфическим действием в качестве CFTR-потенциаторов. Из них соединение общей формулы (I) и рофлумиласт ассоциируются с преимущественным профилем неблагоприятного эффекта, например, у людей.Example 1 demonstrates that certain agents with known PDE4 inhibitory activity, in particular the compound of general formula (I) and roflumilast, have specific action as CFTR potentiators. Of these, the compound of general formula (I) and roflumilast are associated with a predominant adverse effect profile, eg in humans.

Это явное преимущество перед рофлумиластом, который, как показано в примере 1, также может корректировать уровни CFT-F508, но хорошо известно, что он связан с общими неблагоприятными эффектами у субъектов (например, у 1-10% субъектов), включая диарею, потерю веса, тошноту, головную боль, бессонницу, снижение аппетита, боль в животе, ринит, синусит, инфекцию мочевых путей и психические расстройства, включая депрессию (см., например, Daliresp: EPAR - Product Information, European Medicines Agency, Takeda GmbH, 26 September 2013).This is a clear advantage over roflumilast, which, as shown in Example 1, can also correct CFT-F508 levels, but is well known to be associated with general adverse effects in subjects (e.g., 1-10% of subjects), including diarrhea, loss weight gain, nausea, headache, insomnia, decreased appetite, abdominal pain, rhinitis, sinusitis, urinary tract infection, and psychiatric disorders including depression (see e.g. Daliresp: EPAR - Product Information, European Medicines Agency, Takeda GmbH, 26 September 2013).

Таким образом, в поисках агента без эффектов вне цели, который нормализует сворачивание, процесссинг и функцию мутантного CFTR, аналогично CFTR дикого типа (Rowe et al., Cold Spring Harb. Perspect. Med., 2013, vol. 3, a009761), предоставление конкретного применения соединения по настоящему изобретению для лечения или профилактики муковисцидоза у конкретных субъектов является важным достижением.Thus, in search of an agent with no off-target effects that normalizes the folding, processing, and function of mutant CFTR, similar to wild-type CFTR (Rowe et al., Cold Spring Harb. Perspect. Med., 2013, vol. 3, a009761), providing specific use of the compounds of the present invention for the treatment or prevention of cystic fibrosis in specific subjects is an important achievement.

Хорошо установлено, что PDE4 существует в двух различных формах, представляющих различные конформации, которые были обозначены как сайт связывания с высокой аффинностью ролипрама или HPDE4, особенно присутствующей в центральной нервной системе и в париетальных клетках, и сайт связывания с низкой аффинностью ролипрама или LPDE4 (Jacobitz, et al, 1996, Mol. Pharmacol, vol. 50, p. 891-899), обнаруженной в иммунных и воспалительных клетках. Хотя обе формы проявляют каталитическую активность, они различаются по чувствительности к ингибиторам. В частности, соединения с более высокой аффинностью к LPDE4 менее склонны вызывать побочные эффекты, такие как тошнота, рвота и повышенная желудочная секреция. Следовательно, в предпочтительных вариантах осуществления изобретения соединение для применения согласно настоящему изобретению характеризуется высокой селективностью в отношении PDE4, в частности, высокой селективностью в отношении LPDE4. Действительно, в WO 2010/089107 А1 было показано, что соединения, подпадающие под общую формулу (I) настоящего изобретения, имеют превосходную селективность по LPDE4. Преимущественно, соединения по изобретению характеризуются более высокой селективностью по отношению к LPDE4, чем по отношению к HPDE4, полученной путем определения их IC₅₀. В соответствии с настоящим изобретением, IC₅₀ данного агента, обладающего ингибирующей активностью в отношении PDE4, следует определять, как подробно описано в WO 2010/089107 A1. Предпочтительно, соотношение IC₅₀ HPDE4/LPDE4 для соединения для применения в соответствии с настоящим изобретением составляет более 5, предпочтительно, более 10, более предпочтительно, более 20 и, наиболее предпочтительно, более 100.It is well established that PDE4 exists in two distinct forms representing different conformations, which have been designated as a high affinity binding site for rolipram or HPDE4, especially present in the central nervous system and parietal cells, and a low affinity binding site for rolipram or LPDE4 (Jacobitz , et al, 1996, Mol. Pharmacol, vol. 50, pp. 891-899) found in immune and inflammatory cells. Although both forms exhibit catalytic activity, they differ in their sensitivity to inhibitors. In particular, compounds with higher affinity for LPDE4 are less likely to cause side effects such as nausea, vomiting, and increased gastric secretion. Therefore, in preferred embodiments, the compound for use according to the present invention is characterized by high selectivity for PDE4, in particular high selectivity for LPDE4. Indeed, in WO 2010/089107 A1 it has been shown that the compounds falling under the general formula (I) of the present invention have excellent LPDE4 selectivity. Advantageously, the compounds of the invention have a higher selectivity for LPDE4 than for HPDE4 as determined by determining their IC ₅₀ . In accordance with the present invention, the IC ₅₀ of a given PDE4 inhibitory activity agent should be determined as detailed in WO 2010/089107 A1. Preferably, the HPDE4/LPDE4 IC ₅₀ ratio of the compound for use in accordance with the present invention is greater than 5, preferably greater than 10, more preferably greater than 20, and most preferably greater than 100.

Высокая селективность по PDE4 является значительным преимуществом по сравнению с ингибиторами PDE4 первого поколения, такими как ролипрам и пикламиласт, которые ассоциируются с сильными неблагоприятными эффектами, такими как тошнота и рвота и секреция желудочной кислоты, а также улучшением по сравнению с ингибиторами PDE4 второго поколения, такими как как циломиласт и рофлумиласт. Как описано в WO 2010/089107 A1, присутствие сульфонамидных заместителей в бензоатном остатке в соединении общей формулы (I) улучшает активность, и (-)энантиомер соединения общей формулы (I) является фармацевтически успешным по сравнению с соответствующими (+)энантиомерами и рацематами.The high selectivity for PDE4 is a significant advantage over first-generation PDE4 inhibitors such as rolipram and piclamylast, which are associated with strong adverse effects such as nausea and vomiting and gastric acid secretion, and an improvement over second-generation PDE4 inhibitors such as as well as cilomilast and roflumilast. As described in WO 2010/089107 A1, the presence of sulfonamide substituents on the benzoate residue in the compound of general formula (I) improves activity, and the (-) enantiomer of the compound of general formula (I) is pharmaceutically successful compared to the corresponding (+) enantiomers and racemates.

В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение, которое следует использовать согласно настоящему изобретению, представляет собой ингибитор фосфодиэстеразы, который преимущественно не действует в качестве ингибитора цГМФ-зависимой фосфодиэстеразы. В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение, используемое в соответствии с настоящим изобретением, специально не ингибирует фосфодиэстеразу 5 (PDE5), то есть не является специфическим ингибитором PDE5. Таким образом, соединение по настоящему изобретению и его способ действия отличаются от известного ингибитора фосфодиэстеразы 5 (PDE5) силденафила, который ранее был изучен в исследовании in vitro на его потенциальную двойную функцию в качестве корректора и потенциатора CFTR (Leier et al., 2012, Cell Physiol. Biochem., vol. 29, p. 77-790); однако необходимые высокие дозы агента для восстановления CFTR приводят авторов к выводу, что силденафил может не подходить в качестве терапевтического агента для лечения муковисцидоза легких. PDE5 является cGMP-зависимым, а не cAMP-зависимым.In some embodiments, the compound to be used according to the present invention is a phosphodiesterase inhibitor that does not predominantly act as a cGMP-dependent phosphodiesterase inhibitor. In some embodiments of the invention, the compound used in accordance with the present invention does not specifically inhibit phosphodiesterase 5 (PDE5), that is, is not a specific inhibitor of PDE5. Thus, the compound of the present invention and its mode of action differ from the known phosphodiesterase 5 (PDE5) inhibitor sildenafil, which was previously studied in an in vitro study for its potential dual function as a CFTR corrector and potentiator (Leier et al., 2012, Cell Physiol. Biochem., vol. 29, pp. 77-790); however, the required high doses of an agent to restore CFTR lead the authors to the conclusion that sildenafil may not be suitable as a therapeutic agent for the treatment of pulmonary cystic fibrosis. PDE5 is cGMP dependent, not cAMP dependent.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению соединения, соответствующего общей формуле (I), в качестве CFTR-корректора. В предпочтительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к применению соединения, соответствующего общей формуле (I), в качестве корректора мутанта с нарушенным сворачиванием CFTR и/или мутанта процессинга CFTR.In one embodiment, the present invention relates to the use of a compound of general formula (I) as a CFTR corrector. In preferred embodiments, the present invention relates to the use of a compound of general formula (I) as a corrector for a CFTR defolding mutant and/or a CFTR processing mutant.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления соединение, которое следует использовать в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой 1-(3-циклопропилметокси-4-дифторметоксифенил)-2-(3,5-дихлор-1-оксипиридин-4-ил)этиловый эфир 3-циклопропилметокси-4-метансульфониламинобензойной кислоты. Это соответствует соединению C2 в приведенной выше таблице; соответствующее соединение было описано ранее (Armani et al., 2014, J. Med. Chem., vol. 57, p. 793-816; Moretto et al., 2015, J. Pharmacol. Exper. Ther., 2015, vol. 352, p. 559-567), но его прямое действие на мутантный белок CFTR до сих пор не было предположено, не говоря уже об экспериментальных показаниях.In the most preferred embodiment, the compound to be used in accordance with the present invention is 1-(3-cyclopropylmethoxy-4-difluoromethoxyphenyl)-2-(3,5-dichloro-1-oxypyridin-4-yl)ethyl ester 3 -cyclopropylmethoxy-4-methanesulfonylaminobenzoic acid. This corresponds to compound C2 in the table above; the corresponding compound has been described previously (Armani et al., 2014, J. Med. Chem., vol. 57, p. 793-816; Moretto et al., 2015, J. Pharmacol. Exper. Ther., 2015, vol. 352, pp. 559-567), but its direct effect on the mutated CFTR protein has not yet been suggested, let alone experimental evidence.

CHF 6001 в настоящее время разрабатывается для лечения хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) и астмы. Хорошая безопасность и переносимость CHF 6001 у здоровых добровольцев уже была продемонстрирована при ежедневных дозах до 4800 мкг в течение 14 дней (Lucci et al., Eur. Resp. J., 2016, vol. 48, PA4086).CHF 6001 is currently being developed for the treatment of chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and asthma. The good safety and tolerability of CHF 6001 in healthy volunteers has already been demonstrated at daily doses up to 4800 µg for 14 days (Lucci et al., Eur. Resp. J., 2016, vol. 48, PA4086).

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению CHF6001 в качестве CFTR-корректора. В предпочтительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к применению CHF6001 в качестве корректора мутанта сворачивания CFTR и/или мутанта процессинга CFTR.In one embodiment, the present invention relates to the use of CHF6001 as a CFTR corrector. In preferred embodiments, the present invention relates to the use of CHF6001 as a corrector for a CFTR folding mutant and/or a CFTR processing mutant.

Получение соединений, используемых в настоящем изобретенииPreparation of Compounds Used in the Present Invention

Соединение представляет собой соединение общей формулы (I), определенное в настоящем изобретении. Такие соединения, используемые в данном изобретении, и родственные соединения могут быть получены специалистом в данной области техники способами, описанными в WO 2010/089107 A1, WO 2009/018909 A2, или любым другим подходящим способом. В частности, получение соединения, соответствующего общей формуле (I), может включать синтез рацемического спирта, который подвергают конденсации с хиральной кислотой, такой как (S)-напроксен или (S)-ацетилминдальная кислота, с получением, соответственно, диастереомерной смеси, которую разделяют на два отдельных диастереоизомера, соответственно, например, с помощью хроматографии, кристаллизации или других хорошо известных способов, дающих после расщепления, соответственно, энантиомерные спирты, которые при взаимодействии с подходящей бензойной кислотой дают соединения общей формулы (I), все как подробно описано, например, в WO 2010/089107 A1. Дополнительные аспекты и примеры также описаны в WO 2010/089107 A1, и все они применимы к настоящему изобретению.The compound is a compound of general formula (I) defined in the present invention. Such compounds used in this invention and related compounds can be obtained by a person skilled in the art by the methods described in WO 2010/089107 A1, WO 2009/018909 A2, or any other suitable method. In particular, the preparation of a compound corresponding to the general formula (I) may involve the synthesis of a racemic alcohol which is condensed with a chiral acid such as (S)-naproxen or (S)-acetylmandelic acid to obtain, respectively, a diastereomeric mixture which separated into two separate diastereoisomers, respectively, for example, by chromatography, crystallization or other well-known methods, giving after cleavage, respectively, enantiomeric alcohols, which, when reacted with an appropriate benzoic acid, give compounds of general formula (I), all as described in detail, for example, in WO 2010/089107 A1. Additional aspects and examples are also described in WO 2010/089107 A1, all of which are applicable to the present invention.

Композиции, содержащие такие соединения, также могут быть получены способами, описанными в WO 2010/089107 А1, WO 2009/018909 А2, или любым другим подходящим способом.Compositions containing such compounds can also be prepared by the methods described in WO 2010/089107 A1, WO 2009/018909 A2, or any other suitable method.

КомпозицииCompositions

В одном варианте осуществления изобретения соединение, соответствующее общей формуле (I), является по существу чистым. «По существу чистый», как используется в настоящем документе означает, что соединение по меньшей мере на более чем около 97% является хирально чистым, предпочтительно, более чем на 99% и наиболее предпочтительно, более чем на 99,9%.In one embodiment of the invention, the compound corresponding to the general formula (I) is essentially pure. "Substantially pure" as used herein means that the compound is at least more than about 97% chirally pure, preferably greater than 99%, and most preferably greater than 99.9%.

Соединение, соответствующее общей формуле (I), для применения в соответствии с настоящим изобретением может быть составлено в виде фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция содержит соединение, описанное в настоящем документе, как пригодное для использования в настоящем изобретении, и по меньшей мере одну фармацевтически приемлемую соль, буферное вещество, консервант, носитель, разбавитель и/или нейтральное вспомогательное вещество. Термин «фармацевтически приемлемый» описывает что-то нетоксичное и/или то, что по существу не влияет на действие активного ингредиента фармацевтической композиции.The compound corresponding to the general formula (I) for use in accordance with the present invention may be formulated as a pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition contains a compound described herein as suitable for use in the present invention and at least one pharmaceutically acceptable salt, buffer, preservative, carrier, diluent and/or neutral excipient. The term "pharmaceutically acceptable" describes something that is non-toxic and/or that does not substantially interfere with the activity of the active ingredient of a pharmaceutical composition.

Изобретение также охватывает применение фармацевтически приемлемых гидратов, сольватов, аддитивных комплексов, неорганических или органических солей соединения, соответствующего общей формуле (I), например, соли натрия, калия и лизина.The invention also covers the use of pharmaceutically acceptable hydrates, solvates, addition complexes, inorganic or organic salts of a compound according to the general formula (I), for example sodium, potassium and lysine salts.

Фармацевтическая композиция, предпочтительно, является стерильной и, необязательно, содержит один или несколько дополнительных агентов, упомянутых или не упомянутых в настоящем документе.The pharmaceutical composition is preferably sterile and optionally contains one or more additional agents, mentioned or not mentioned herein.

Возможные составы включают в себя, без ограничения, таблетки, желатиновые капсулы, капсулы, таблетки в виде капсулы, гранулы, пастилки и насыпные порошки; водные и неводные растворы, эмульсии, суспензии, сиропы и эликсиры; кремы, гели, пасты, пены, мази, линименты, лосьоны, эмульсии, суспензии, гели, пасты, порошки, спреи и капли; и трансдермальные пластыри. Ингаляционные препараты включают вдыхаемые порошки, такие как сухие порошки, содержащие пропеллент дозирующие аэрозоли или ингаляционные составы, не содержащие пропеллент. Ингаляционные препараты являются предпочтительными в настоящем изобретении для профилактики или лечения муковисцидоза в легких.Possible formulations include, without limitation, tablets, gelatin capsules, capsules, capsule tablets, granules, lozenges, and bulk powders; aqueous and non-aqueous solutions, emulsions, suspensions, syrups and elixirs; creams, gels, pastes, foams, ointments, liniments, lotions, emulsions, suspensions, gels, pastes, powders, sprays and drops; and transdermal patches. Inhalation formulations include inhalable powders such as dry powders, propellant-containing metering aerosols, or propellant-free inhalation formulations. Inhalation preparations are preferred in the present invention for the prevention or treatment of cystic fibrosis in the lungs.

ВведениеIntroduction

В настоящем изобретении соединение формулы (I) вводят субъекту. В частности, все аспекты и варианты осуществления настоящего изобретения предусматривают, что соединение формулы (I) вводят субъекту, нуждающемуся в этом. Субъектом, нуждающимся в этом, является субъект, характеризующийся по меньшей мере одной мутацией в гене CFTR, которая является причиной неправильного сворачивания и/или процессинга белка CFTR, как подробно описано в данном описании.In the present invention, a compound of formula (I) is administered to a subject. In particular, all aspects and embodiments of the present invention provide that the compound of formula (I) is administered to a subject in need thereof. A subject in need thereof is a subject having at least one mutation in the CFTRα gene that causes misfolding and/or processing of the CFTR protein, as detailed herein.

Введение соединения для применения в соответствии с настоящим изобретением может осуществляться в соответствии с потребностями пациента, например, перорально, назально, парентерально, например, подкожно, внутривенно, внутримышечно, внутрикожно и инфузией, путем ингаляции, ректально, вагинально, местно, локально, трансдермально и путем внутриглазного введения.The administration of a compound for use in accordance with the present invention may be according to the needs of the patient, for example, orally, nasally, parenterally, for example, subcutaneously, intravenously, intramuscularly, intradermally and by infusion, by inhalation, rectally, vaginally, topically, topically, transdermally and by intraocular administration.

Для лечения муковисцидоза дыхательных путей соединение для применения по настоящему изобретению, предпочтительно, вводят путем ингаляции. В одном варианте осуществления соединение общей формулы (I) вводят путем ингаляции. Одним из преимуществ ингаляционного пути по сравнению с системным является возможность доставки агента непосредственно в место воздействия, избегая любых системных побочных эффектов, что приводит к более быстрому клиническому ответу и более высокому терапевтическому индексу. Настоящее изобретение, в частности, относится к агентам и фармацевтическим композициям для применения путем ингаляции.For the treatment of cystic fibrosis of the respiratory tract, the compound for use in the present invention is preferably administered by inhalation. In one embodiment, the compound of general formula (I) is administered by inhalation. One advantage of the inhalation route over the systemic route is the ability to deliver the agent directly to the site of exposure, avoiding any systemic side effects, resulting in a faster clinical response and a higher therapeutic index. The present invention particularly relates to agents and pharmaceutical compositions for use by inhalation.

Действительно, соединения для применения согласно настоящему изобретению, такие как, в частности, CHF6001, являются оптимальными для ингаляционной доставки (Armani et al., 2014, J. Med. Chem., vol. 57, p. 793-816). Использование при вдыхании особенно успешно при лечении состояний дыхательных путей, таких как, в настоящем изобретении, муковисцидоз в дыхательных путях.Indeed, compounds for use according to the present invention, such as in particular CHF6001, are optimal for inhalation delivery (Armani et al., 2014, J. Med. Chem., vol. 57, p. 793-816). Inhalation use is particularly successful in the treatment of respiratory conditions such as, in the present invention, cystic fibrosis in the respiratory tract.

Дозировка соединения для применения в соответствии с настоящим изобретением зависит от множества факторов, включая конкретное состояние, которое нужно лечить или предотвращать, тяжесть симптомов, путь введения, частоту интервала дозирования, конкретное используемое соединение, эффективность, токсикологический профиль и фармакокинетический профиль соединения. Когда соединение по настоящему изобретению вводят субъекту путем ингаляции, доза соединения преимущественно составляет от 0,01 до 20 мг/день, предпочтительно, от 0,1 до 10 мг/день, более предпочтительно, от около 0,5 до около 5 мг/день. Хорошая безопасность и переносимость CHF 6001 у здоровых добровольцев уже была продемонстрирована при ежедневных дозах до 4,8 мг в течение 14 дней (Lucci et al., Eur. Resp. J., 2016, vol. 48, PA4086). В одном варианте осуществления изобретения соединение общей формулы (I) вводят один раз в день, но также возможен любой альтернативный режим введения.The dosage of a compound for use in accordance with the present invention depends on a variety of factors, including the particular condition to be treated or prevented, the severity of the symptoms, the route of administration, the frequency of the dosing interval, the particular compound used, the efficacy, the toxicological profile, and the pharmacokinetic profile of the compound. When a compound of the present invention is administered to a subject by inhalation, the dose of the compound is preferably 0.01 to 20 mg/day, preferably 0.1 to 10 mg/day, more preferably about 0.5 to about 5 mg/day . The good safety and tolerability of CHF 6001 in healthy volunteers has already been demonstrated at daily doses up to 4.8 mg for 14 days (Lucci et al., Eur. Resp. J., 2016, vol. 48, PA4086). In one embodiment of the invention, the compound of general formula (I) is administered once a day, but any alternative mode of administration is also possible.

Для введения некоторых ингаляционных препаратов, таких как, например, сухой порошок, могут быть использованы одно- или многодозовые ингаляторы, известные из уровня техники. В этом случае порошок может быть заполнен в желатиновые, пластиковые или другие капсулы, картриджи или блистерные упаковки или в резервуар. Для этой цели к порошкообразным соединениям по изобретению может быть добавлен разбавитель или носитель, обычно нетоксичный и химически инертный по отношению к соединениям по изобретению, например, лактоза или любая другая добавка, подходящая для улучшения вдыхаемой фракции.For the administration of certain inhalation preparations, such as, for example, dry powder, single or multiple dose inhalers known in the art may be used. In this case, the powder may be filled into gelatin, plastic or other capsules, cartridges or blister packs or into a reservoir. For this purpose, a diluent or carrier generally non-toxic and chemically inert to the compounds of the invention, such as lactose or any other additive suitable for improving the respirable fraction, may be added to the powdered compounds of the invention.

Для введения дополнительных некоторых ингаляционных препаратов, таких как, например, ингаляционные аэрозоли, содержащие газ-вытеснитель, такой как гидрофторалканы, соединение для применения согласно настоящему изобретению может содержаться либо в растворе, либо в дисперсной форме. Составы, регулируемые пропеллентом, могут также содержать другие ингредиенты, такие как сорастворители, стабилизаторы и, необязательно, другие наполнители. Ингаляционные составы, не содержащие пропеллент, содержащие соединения по изобретению, могут быть в виде растворов или суспензий в водной, спиртовой или водно-спиртовой среде, и они могут доставляться струйными или ультразвуковыми распылителями, известными из уровня техники, или распылителями с мягким туманом, такими как Respimat^®.For additional administration of some inhalation preparations, such as, for example, inhalation aerosols containing a propellant such as hydrofluoroalkanes, the compound for use according to the present invention may be contained either in solution or in particulate form. The propellant controlled formulations may also contain other ingredients such as co-solvents, stabilizers, and optionally other excipients. Propellant-free inhalation formulations containing compounds of the invention may be in the form of solutions or suspensions in an aqueous, alcoholic or aqueous-alcoholic medium, and they may be delivered by jet or ultrasonic nebulizers known in the art, or soft mist nebulizers such as like ^Respimat® .

КомбинацииCombinations

Соединения по изобретению можно вводить в качестве единственного активного агента или в комбинации с одним или несколькими другими фармацевтически активными ингредиентами.The compounds of the invention may be administered as the sole active agent or in combination with one or more other pharmaceutically active ingredients.

Таким образом, в первом варианте осуществления соединение, соответствующее общей формуле (I), вводят в качестве монотерапии. Монотерапия в данном контексте означает, что дополнительные терапевтические агенты, то есть дополнительные фармацевтически активные компоненты, отличные от соединения, соответствующего общей формуле (I), не являются частью схемы лечения, предусмотренной в соответствии с настоящим изобретением. Действительно, экспериментальные примеры по настоящему изобретению подтверждают тот факт, что, что соединение, соответствующее общей формуле (I), само по себе обладает желаемым терапевтическим эффектом, вызывающим лечение субъекта, который характеризуется по меньшей мере одной мутацией в гене CFTR, которая является причиной неправильного сворачивания и/или процессинга белка CFTR. В этом отношении действие соединений, соответствующих общей формуле (I), по настоящему изобретению заметно отличается от описанных соединений, например, в WO 2015/175773 A1 и Blanchard et al., 2014, FASEB J., vol. 28, p. 791-801.Thus, in the first embodiment, the compound corresponding to the general formula (I) is administered as a monotherapy. Monotherapy in this context means that additional therapeutic agents, i.e. additional pharmaceutically active components other than the compound corresponding to the general formula (I), are not part of the treatment regimen provided in accordance with the present invention. Indeed, the experimental examples of the present invention confirm the fact that the compound corresponding to the general formula (I) itself has the desired therapeutic effect inducing treatment of a subject that is characterized by at least one mutation in the CFTR gene that causes abnormal folding and/or processing of the CFTR protein. In this regard, the action of the compounds according to the general formula (I) according to the present invention differs markedly from those described in, for example, WO 2015/175773 A1 and Blanchard et al., 2014, FASEB J., vol. 28, p. 791-801.

В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение общей формулы (I) используют или вводят в комбинации по меньшей мере с одним вторым фармацевтически активным компонентом. По меньшей мере один второй фармацевтически активный компонент, предпочтительно, не является соединением общей формулы (I). Таким образом, настоящее изобретение также относится к комбинированной терапии, по меньшей мере, с двумя агентами, где по меньшей мере один агент представляет собой соединение, соответствующее общей формуле (Ii), и по меньшей мере один агент не является соединением, соответствующим общей формуле (I). По меньшей мере два агента могут быть составлены вместе или по отдельности.In some embodiments, a compound of general formula (I) is used or administered in combination with at least one second pharmaceutically active ingredient. At least one second pharmaceutically active component is preferably not a compound of general formula (I). Thus, the present invention also relates to combination therapy with at least two agents, where at least one agent is a compound corresponding to the general formula (Ii), and at least one agent is not a compound corresponding to the general formula ( I). The at least two agents may be formulated together or separately.

Пример 1 и пример 2 подтверждают, что комбинированное использование соединения, соответствующего общей формуле (I), по меньшей мере с одним дополнительным агентом может обеспечить терапевтический успех.Example 1 and Example 2 confirm that the combined use of a compound of general formula (I) with at least one additional agent can provide therapeutic success.

По меньшей мере один дополнительный агент конкретно не ограничен и включает низкомолекулярные агенты, а также фармацевтически активные пептиды или белки и нуклеиновые кислоты, кодирующие их, хотя некоторые агенты являются предпочтительными, как указано ниже.At least one additional agent is not specifically limited and includes small molecule agents, as well as pharmaceutically active peptides or proteins and nucleic acids encoding them, although some agents are preferred, as indicated below.

В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одно второе фармацевтически активное соединение представляет собой CFTR-корректор. Указанный CFTR-корректор конкретно не ограничен и может быть выбран из всех соединений и композиций, которые обладают способностью действовать в качестве CFTR-корректоров, определенных в настоящем документе. При этом указанный CFTR-корректор, предпочтительно, представляет собой агент, который не является соединением, соответствующим общей формуле (I). В предпочтительном варианте осуществления указанный CFTR-корректор выбран из группы, включающей лумакафтор, VX-152 (Vertex Pharmaceuticals), VX-440 (Vertex Pharmaceuticals), VX-445 (Vertex Pharmaceuticals), тезакафтор (VX-661, Vertex Pharmaceuticals, см., также Rowe et al., 2017, N. Engl. J. Med., vol. 377, p. 2024-2035), VX-659 (Vertex Pharmaceuticals), FDL 169 (Flatley Discovery Lab), GLPG2222 (Galapagos), PTI-801 (Proteostasis Therapeutics), и, предпочтительно, представляет собой лумакафтор.In one preferred embodiment of the invention, at least one second pharmaceutically active compound is a CFTR corrector. Said CFTR corrector is not particularly limited and may be selected from all compounds and compositions that have the ability to act as CFTR correctors as defined herein. While said CFTR corrector is preferably an agent that is not a compound corresponding to the general formula (I). In a preferred embodiment, said CFTR corrector is selected from the group consisting of lumacaftor, VX-152 (Vertex Pharmaceuticals), VX-440 (Vertex Pharmaceuticals), VX-445 (Vertex Pharmaceuticals), tezacaftor (VX-661, Vertex Pharmaceuticals, cf. , also Rowe et al., 2017, N. Engl. J. Med., vol. 377, p. 2024-2035), VX-659 (Vertex Pharmaceuticals), FDL 169 (Flatley Discovery Lab), GLPG2222 (Galapagos), PTI-801 (Proteostasis Therapeutics), and is preferably lumacaftor.

Во втором предпочтительном варианте осуществления изобретения второе фармацевтически активное соединение представляет собой CFTR-потенциатор. Указанный CFTR-потенциатор конкретно не ограничен и может быть выбран из всех соединений и композиций, которые обладают способностью действовать в качестве CFTR-потенциаторов, определенных в настоящем документе. Указанный CFTR-потенциатор, предпочтительно, представляет собой агент, который не является соединением, соответствующим общей формуле (I). В предпочтительном варианте осуществления указанный CFTR-потенциатор выбран из группы, включающей ивакафтор, QWB251 (в разработке компанией Novartis), VX-561 (ранее CTP-656, Vertex Pharmaceuticals), PTI-808 (Proteostasis Therapeutics), генистеин (De Stefano et al., 2014, Autophagy, vol. 10, p. 2053-2074), и, предпочтительно, представляет собой ивакафтор.In a second preferred embodiment of the invention, the second pharmaceutically active compound is a CFTR potentiator. Said CFTR potentiator is not particularly limited and may be selected from all compounds and compositions that have the ability to act as CFTR potentiators as defined herein. Said CFTR potentiator is preferably an agent which is not a compound according to the general formula (I). In a preferred embodiment, said CFTR potentiator is selected from the group consisting of ivacaftor, QWB251 (in development by Novartis), VX-561 (formerly CTP-656, Vertex Pharmaceuticals), PTI-808 (Proteostasis Therapeutics), genistein (De Stefano et al. ., 2014, Autophagy, vol. 10, pp. 2053-2074), and is preferably ivacaftor.

В третьем предпочтительном варианте осуществления изобретения второе фармацевтически активное соединение представляет собой усилитель CFTR. Указанный усилитель CFTR конкретно не ограничен и может быть выбран из всех соединений и композиций, которые обладают способностью действовать в качестве усилителей CFTR, как определено в настоящем документе. Указанный усилитель CFTR, предпочтительно, представляет собой агент, который не является соединением, соответствующим общей формуле (I). В предпочтительном варианте осуществления указанный CFTR-потенциатор выбран из группы, включающей PTI-CH (Molinski et al., 2017, EMBO Molecular Medicine, vol. 9, p. 1224-1243), PTI-428 (Proteostasis Therapeutics). Известно, что соединения усилители могут обеспечить дополнительное преимущество для субъектов с мутацией ΔF508 в CFTR, и настоящее изобретение обеспечивает комбинированное использование соединения общей формулы (I) и усилителя CFTR у таких и других субъектов.In a third preferred embodiment of the invention, the second pharmaceutically active compound is a CFTR enhancer. Said CFTR enhancer is not particularly limited and may be selected from all compounds and compositions that have the ability to act as CFTR enhancers as defined herein. Said CFTR enhancer is preferably an agent which is not a compound according to the general formula (I). In a preferred embodiment, said CFTR potentiator is selected from the group consisting of PTI-CH (Molinski et al., 2017, EMBO Molecular Medicine, vol. 9, p. 1224-1243), PTI-428 (Proteostasis Therapeutics). It is known that enhancer compounds can provide additional benefit to subjects with a CFTR ΔF508 mutation, and the present invention provides for the combined use of a compound of general formula (I) and a CFTR enhancer in such and other subjects.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения второе фармацевтически активное соединение представляет собой соединение, способное корректировать нуклеотидную последовательность мутантного белка CFTR либо на уровне ДНК (генная терапия), либо на уровне РНК. Соединением второго класса является QR-010 (ProQR Therapeutics).In a further preferred embodiment of the invention, the second pharmaceutically active compound is a compound capable of adjusting the nucleotide sequence of the mutant CFTR protein either at the DNA level (gene therapy) or at the RNA level. The second class compound is QR-010 (ProQR Therapeutics).

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения второе фармацевтически активное соединение представляет собой регулятор протеостаза, предпочтительно, выбранный из цистеамина или его фармацевтически приемлемой соли, такой как, предпочтительно, битратрат цистеамина (битартрат меркаптамина, цистагон®) и галлат эпигаллокатехина (EGCG) или комбинации двух таких регуляторов протеостаза (Tosco et al., Cell Death Differentiation, 2016, vol., 23, p. 1380-1393).In a further preferred embodiment of the invention, the second pharmaceutically active compound is a proteostasis regulator, preferably selected from cysteamine or a pharmaceutically acceptable salt thereof, such as, preferably, cysteamine bitrate (mercaptamine bitartrate, Cystagon®) and epigallocatechin gallate (EGCG) or a combination of the two. proteostasis regulators (Tosco et al., Cell Death Differentiation, 2016, vol., 23, p. 1380-1393).

В дополнительном варианте осуществления второе фармацевтически активное соединение выбрано из агентов, подходящих для лечения проявлений муковисцидоза, предпочтительно выбранных из группы антибиотиков, муколитиков, противовоспалительных агентов и водных солевых растворов, в частности, например, распыленный гипертонический раствор.In a further embodiment, the second pharmaceutically active compound is selected from agents suitable for treating manifestations of cystic fibrosis, preferably selected from the group of antibiotics, mucolytics, anti-inflammatory agents, and aqueous saline solutions, in particular, for example, hypertonic nebulized solution.

В особенно предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, одно второе фармацевтически активное соединение содержит комбинацию CFTR-корректора (отличного от соединения, соответствующего общей формуле (I)) и CFTR-потенциатора (отличного от соединения, соответствующего общей формуле (I)); другими словами, для комбинированной терапии можно предусмотреть как CFTR-корректор, так и CFTR-потенциатор (отличные от соединения, соответствующего общей формуле (I)). Альтернативно, для такой комбинированной терапии может использоваться усилитель CFTR.In a particularly preferred embodiment, the at least one second pharmaceutically active compound comprises a combination of a CFTR corrector (other than the compound of general formula (I)) and a CFTR potentiator (other than the compound of general formula (I)); in other words, both a CFTR corrector and a CFTR potentiator (other than the compound of the general formula (I)) can be provided for the combination therapy. Alternatively, a CFTR enhancer may be used for such combination therapy.

Когда соединение, соответствующее общей формуле (I), составлено вместе по меньшей мере с одним дополнительным агентом, тогда соединение, соответствующее общей формуле (I), и по меньшей мере один дополнительный агент необязательно присутствуют в одной и той же композиции. Таким образом, все композиции, описанные в настоящем документе, могут быть составлены в виде композиций, которые содержат, в дополнение к агенту, соответствующему общей формуле (I), по меньшей мере один дополнительный агент, указанный в настоящем документе. Получение и введение соответствующих композиций входит в объем настоящего изобретения.When a compound corresponding to general formula (I) is formulated together with at least one additional agent, then the compound corresponding to general formula (I) and at least one additional agent are optionally present in the same composition. Thus, all compositions described herein can be formulated as compositions that contain, in addition to the agent corresponding to the general formula (I), at least one additional agent specified in this document. The preparation and administration of appropriate compositions is within the scope of the present invention.

Альтернативно, соединение, соответствующее общей формуле (I), и по меньшей мере один дополнительный агент составляют в отдельных композициях. Это может быть уместным, например, когда предусмотрены разные пути введения и/или разные дозы для соединения, соответствующего общей формуле (I), и по меньшей мере одного дополнительного агента, соответственно, и/или когда могут этого потребовать химические свойства и/или стабильность соединения, соответствующего общей формуле (I), и по меньшей мере одного дополнительного агента. Например, в случаях, когда предполагается вводить соединение, соответствующее общей формуле (I), путем ингаляции, но по меньшей мере один дополнительный агент путем, отличным от ингаляции, являются подходящими отдельные составы или композиции. При этом настоящее изобретение явно также относится к набору частей, который включает как соединение, соответствующее общей формуле (I), так и по меньшей мере один дополнительный агент, в отдельных составах, но предусмотренных для комбинированной терапии, в одно и то же или в разных моментах времени.Alternatively, the compound corresponding to the general formula (I) and at least one additional agent are in separate compositions. This may be appropriate, for example, when different routes of administration and/or different doses are envisaged for the compound corresponding to the general formula (I) and at least one additional agent, respectively, and/or when chemical properties and/or stability may require this. compounds corresponding to the General formula (I), and at least one additional agent. For example, in cases where a compound of general formula (I) is to be administered by inhalation, but at least one additional agent by a route other than inhalation, separate formulations or compositions are suitable. However, the present invention clearly also relates to a set of parts that includes both the compound corresponding to the general formula (I) and at least one additional agent, in separate formulations, but intended for combination therapy, in the same or in different points in time.

В некоторых вариантах осуществления, которые явно сочетаются со всеми вышеприведенными вариантами осуществления изобретения, по меньшей мере одно второе фармацевтически активное соединение выбрано из одного или нескольких антибиотиков, которые можно вводить внутривенно, вдыхая или перорально, вместе или нет с соединением, соответствующим общей формуле (I).In some embodiments that are explicitly compatible with all of the above embodiments of the invention, the at least one second pharmaceutically active compound is selected from one or more antibiotics that can be administered intravenously, inhaled or orally, with or without a compound corresponding to the general formula (I ).

Промышленная применимостьIndustrial Applicability

Настоящее изобретение представляет ценность для лечения пациентов с муковисцидозом. Это применимо к различным отраслям промышленности, включая химическую промышленность, фармацевтическую промышленность, другие отрасли здравоохранения, такие как, например, больницы. Это также имеет последствия для смежных отраслей, например, поскольку речь идет об упаковке и маркировке лекарств и/или диагностике пациентов (генотипирование, фенотипирование).The present invention is of value in the treatment of patients with cystic fibrosis. This applies to various industries, including the chemical industry, the pharmaceutical industry, and other health care industries such as hospitals. This also has implications for related industries, for example when it comes to drug packaging and labeling and/or patient diagnostics (genotyping, phenotyping).

ПримерыExamples

Следующие примеры и фигуры предназначены для иллюстрации некоторых предпочтительных вариантов осуществления изобретения и не должны интерпретироваться для ограничения объема изобретения, который определяется формулой изобретения.The following examples and figures are intended to illustrate certain preferred embodiments of the invention and should not be interpreted to limit the scope of the invention, which is defined by the claims.

Материал и методыMaterial and methods

Линии клетокcell lines

Линия клеток эпителия бронхов человека CF (CFBE41o-), гомозиготная по мутации ΔF508 белка CFTR (Ehrhard et al., 2006, Cell Tissue Res. Vol. 323, p. 405-415; добрый подарок D. C. Gruenert, California Pacific Medical Center Research Institute, San Francisco, CA, USA) и линия эпителиальных клеток бронхов человека 16HBE14o-, дикого типа (wt) для белка CFTR (любезно предоставленная P. Davis, Case Western Reserve University School of Medicine, Cleveland, OH, USA) поддерживались в EMEM (Lonza) с добавлением 10% FBS и 1% Glutamax (Sigma). Для поляризованных монослоев CFBE41o- клетки высевали при плотности 2×10⁴/см² в колбу или в несколько лунок, предварительно покрытых раствором для покрытия фибронектином, состоящим из базальной среды LHC (Gibco, Invitrogen), 10% бычьего сывороточного альбумина (1 мг/мл), 1% бычьего коллагена I (Sigma) и человеческого фибронектина (BD Laboratories) в конечной концентрации 1 мг/мл, перед использованием фильтровали (0,22 мкМ). с помощью реагента диссоциации PET^TM (на дату вступления в силу, имеющегося в продаже у различных коммерческих поставщиков, например, AthenaES), который содержит поливинилпирролидон, EGTA и трипсин в основе HBS.Human bronchial epithelial cell line CF (CFBE41o-) homozygous for the ΔF508 mutation of the CFTR protein (Ehrhard et al., 2006, Cell Tissue Res. Vol. 323, p. 405-415; kind gift from DC Gruenert, California Pacific Medical Center Research Institute , San Francisco, CA, USA) and the 16HBE14o-, wild-type (wt) human bronchial epithelial cell line for CFTR protein (courtesy of P. Davis, Case Western Reserve University School of Medicine, Cleveland, OH, USA) were maintained in EMEM ( Lonza) supplemented with 10% FBS and 1% Glutamax (Sigma). For polarized monolayers, CFBE41o- cells were seeded at a density of 2×10 ⁴ /cm ² in a flask or several wells pre-coated with a fibronectin coating solution consisting of LHC basal medium (Gibco, Invitrogen), 10% bovine serum albumin (1 mg/ ml), 1% bovine collagen I (Sigma) and human fibronectin (BD Laboratories) at a final concentration of 1 mg/ml, filtered (0.22 μM) before use. with PET ^™ dissociation reagent (as of effective date, commercially available from various commercial vendors, eg AthenaES) which contains polyvinylpyrrolidone, EGTA and trypsin in the HBS base.

ВеществаSubstances

CHF6001, ММ 687,54CHF6001, MM 687.54

Рофлумиласт (CHF5152), ММ 403,21Roflumilast (CHF5152), MM 403.21

CHD-051662 (VX809, лумакафтор), ММ 452,41CHD-051662 (VX809, lumacaftor), MM 452.41

CHD-051663 (VX770, ивакафтор), ММ 392,49CHD-051663 (VX770, ivacaftor), MM 392.49

В случае CHF6001 и рофлумиласта исходные растворы готовили, растворяя соединения в ДМСО при 5 мМ. Исходные растворы инкубировали в ультразвуковой ванне в течение 30 минут и затем выдерживали еще 30 минут при температуре 37яяяС. В случае лумакафтора и ивакафтора исходные растворы готовили, растворяя соединения в ДМСО при 5 мМ. Все исходные растворы выдерживали перед использованием при температуре -30яяяС.For CHF6001 and roflumilast, stock solutions were prepared by dissolving the compounds in DMSO at 5 mM. Stock solutions were incubated in an ultrasonic bath for 30 minutes and then incubated for another 30 minutes at 37°C. In the case of lumacaftor and ivacaftor, stock solutions were prepared by dissolving the compounds in DMSO at 5 mM. All stock solutions were kept at -30°C before use.

Проточная цитометрияflow cytometry

CFBE41o- клетки высевали при 1,5×10⁵ клеток/лунку в чашку с 6-лунками в среде EMEM, дополненный 10% FBS и 1 мМ L-глютамина, и выдерживали в инкубаторе при 37°C в течение ночи. На следующий день клетки обрабатывали различными агентами, как указано далее: VRT809 (5 мкМ), CHF6001 (30 нМ), рофлумиласт (50 нМ) или носитель ДМСО. Через 24 ч клетки собирали.CFBE41o cells were seeded at 1.5×10 ⁵ cells/well in a 6-well dish in EMEM supplemented with 10% FBS and 1 mM L-glutamine and kept in an incubator at 37° C. overnight. The next day, cells were treated with various agents as follows: VRT809 (5 μM), CHF6001 (30 nM), roflumilast (50 nM), or vehicle DMSO. Cells were harvested after 24 h.

Специально для обнаружения внеклеточного домена CFTR клетки промывали PBS 1x и последовательно окрашивали моноклональным антителом против CFTR CF3 (Abcam), подходящим для обнаружения внеклеточного домена CFTR. После промывки в течение 30 минут на льду добавляли вторичное козье антимышиное антитело (μ-цепь), конъюгированное с Alexa Fluor-488 (Invitrogen, Карлсбад, США), (1 мкг на 10⁶ клеток).Specifically for the detection of the extracellular domain of CFTR, the cells were washed with PBS 1x and stained sequentially with an anti-CFTR CF3 monoclonal antibody (Abcam) suitable for detecting the extracellular domain of CFTR. After washing for 30 minutes on ice, secondary goat anti-mouse antibody (μ-chain) conjugated to Alexa Fluor-488 (Invitrogen, Carlsbad, USA) (1 μg per 10 ⁶ cells) was added.

В частности, чтобы распознать C-концевую область CFTR, после обработки промывочным буфером для проницаемости согласно производителю (BioLegend) клетки инкубировали (45 минут при комнатной температуре) с поликлональным первичным кроличьим анти-CFTR антителом (Alomone Labs, Иерусалим, Израиль). Для определения вклада неспецифических взаимодействий антитело-клетка поликлональное первичное антитело кролика предварительно инкубировали с блокирующим пептидом (4 мг), соответствующим аминокислотным остаткам 1468-1480 CFTR, расположенным в C-концевом домене CFTR. В качестве вторичного антитела использовали козье антитело против IgG кролика (1,5 мг на образец), конъюгированное с Alexa Fluor (AF) 488 (Life Technologies, Карлсбад, CA).In particular, in order to recognize the C-terminal region of CFTR, after treatment with a permeation wash buffer according to the manufacturer (BioLegend), the cells were incubated (45 minutes at room temperature) with a polyclonal primary rabbit anti-CFTR antibody (Alomone Labs, Jerusalem, Israel). To determine the contribution of non-specific antibody-cell interactions, a rabbit polyclonal primary antibody was preincubated with a blocking peptide (4 mg) corresponding to CFTR amino acid residues 1468-1480 located in the C-terminal domain of CFTR. Goat anti-rabbit IgG (1.5 mg per sample) conjugated to Alexa Fluor (AF) 488 (Life Technologies, Carlsbad, CA) was used as a secondary antibody.

Наконец, клетки дважды промывали и затем анализировали в анализаторе MACSQuant (Miltenyi Biotech, Кельн, Германия), а данные анализировали с помощью FlowJo Software (Tree Star, Inc).Finally, the cells were washed twice and then analyzed in a MACSQuant analyzer (Miltenyi Biotech, Cologne, Germany) and the data was analyzed with FlowJo Software (Tree Star, Inc.).

Процент событий с фоновым шумом (определяемым с помощью изотипа IgM или пептидного сигнала) вычитали, и результат выражали в виде %-ного значения CFTR-положительных клеток. Были также получены геометрические средние значения сигнала в зеленом канале и вычислено соотношение между сигналами, полученными с антителом, специфичным для внеклеточного домена CF3, и с поликлональным антителом (Alomone), соответственно, относительно базового сигнала (MFI).The percentage of events with background noise (determined by IgM isotype or peptide signal) was subtracted and the result was expressed as the % value of CFTR positive cells. Geometric mean values of the signal in the green channel were also obtained and the ratio between the signals obtained with an antibody specific for the extracellular domain of CF3 and with a polyclonal antibody (Alomone), respectively, relative to the base signal (MFI) was calculated.

Чтобы определить возможную цитотоксическую активность вышеуказанных агентов, те же обработанные агентом клетки также анализировали с использованием двойного окрашивания флуоресцентным аннексином V и йодидом пропидия (PI), в котором аннексин V-позитивные/PI-негативные клетки рассматриваются как некротические клетки. После обработки клетки собирали и инкубировали с 2,5 мкл/мл аннексина V-eFluor 450/связывающего буфера 1× (eBioscience, набор для определения апоптоза аннексина V eFluor 450) и оставляли на 10-15 мин при комнатной температуре. Затем клетки инкубировали с 1 мкл PI/300 мкл связывающего буфера и анализировали проточной цитометрией в течение 30 минут, хранили при 4°C в темноте. Сбор данных проводился с использованием MACSQuant, а данные анализировались с помощью программного обеспечения FlowJo.To determine the possible cytotoxic activity of the above agents, the same agent-treated cells were also analyzed using a double stain with fluorescent annexin V and propidium iodide (PI), in which annexin V-positive/PI-negative cells are considered as necrotic cells. After treatment, cells were harvested and incubated with 2.5 μl/ml Annexin V-eFluor 450/binding buffer 1x (eBioscience Annexin V eFluor 450 Apoptosis Kit) and left for 10-15 min at room temperature. The cells were then incubated with 1 μl of PI/300 μl of binding buffer and analyzed by flow cytometry for 30 minutes, stored at 4°C in the dark. Data collection was done using MACSQuant and data was analyzed using FlowJo software.

HS-YFP анализHS-YFP analysis

Активность CFTR в эпителиальных клетках оценивали с помощью желтого флуоресцентного белка (YFP) по протоколу, модифицированному по методу, опубликованному Averna et al. (PLoS One, 2013, том 8, e66089). В соответствии с Averna et al., YFP был чувствителен к галогенидам, и клетки не трансфицировали нуклеиновой кислотой, но указанный YFP, очищенный из рекомбинантного источника, добавляли к супернатантам для проведения анализа; модификация по Averna et al. конкретно касается рекомбинантного источника указанного YFP (здесь экспрессированная E. coli).CFTR activity in epithelial cells was assessed using yellow fluorescent protein (YFP) according to a protocol modified from the method published by Averna et al. (PLoS One, 2013, Volume 8, e66089). According to Averna et al., YFP was halide sensitive and cells were not transfected with nucleic acid, but said YFP, purified from a recombinant source, was added to supernatants for analysis; modification according to Averna et al. refers specifically to the recombinant source of said YFP (here expressed by E. coli ).

Вестерн-блотWestern blot

Клетки CFBE41 и 16HBE14, соответственно, лизировали в буфере для лизиса (50 ммоль/л Трис, 150 ммоль/л NaCl, 1 ммоль/л ЭДТА, 1% Тритон Х-100, рН 7,4), содержащем ингибиторы протеаз (Roche, Inc.). Отделяли всего 10 мкг (16HBE14o-/CFBE41o-) общего белка на полосу с использованием 7,5% (об/об) полиакриламидного электрофореза (PAGE) SDS-гелей и переносили на нитроцеллюлозные мембраны, которые исследовали с помощью моноклонального анти-CFTR антитела (Cell Signaling 2269; согласно информации, предоставленной Cell Signaling, полученной путем иммунизации кроликов синтетическим пептидом, соответствующим аминокислотным остаткам вблизи аминоконца человеческого CFTR) в разведении 1:500 в течение ночи при 4°C. Мембраны повторно зондировали моноклональным анти-актином (Sigma-Aldrich) для нормализации нагрузки белка. Относительные уровни CFTR оценивали денситометрией с использованием программы ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Количество полосы C (понимается как полностью гликозилированная зрелая форма CFTR)) рассчитывается как доля актина для соответствующей полосы движения и указывается как доля от общего количества (полоса C/актин). Обычно полоса C в вестерн-блоттинге указывает, что CFTR правильно свернут и обработан в аппарате Гольджи. Указанные значения выражены как среднее значение+/-SD (n=3). Наборы данных сравнивались с помощью t-теста с использованием GraphPad Prism.CFBE41 and 16HBE14 cells, respectively, were lysed in lysis buffer (50 mmol/L Tris, 150 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, 1% Triton X-100, pH 7.4) containing protease inhibitors (Roche, Inc.). A total of 10 μg (16HBE14o-/CFBE41o-) total protein per lane was separated using 7.5% (v/v) polyacrylamide electrophoresis (PAGE) SDS gels and transferred to nitrocellulose membranes, which were examined with a monoclonal anti-CFTR antibody ( Cell Signaling 2269; according to information provided by Cell Signaling, obtained by immunizing rabbits with a synthetic peptide corresponding to amino acid residues near the amino terminus of human CFTR) at a 1:500 dilution overnight at 4°C. The membranes were repeatedly probed with monoclonal anti-actin (Sigma-Aldrich) to normalize protein loading. Relative CFTR levels were assessed by densitometry using the ImageJ program (http://rsb.info.nih.gov/ij/). The amount of the C band (understood as the fully glycosylated mature form of CFTR)) is calculated as the proportion of actin for the respective lane and reported as a fraction of the total (C band/actin). Typically, the C band on a Western blot indicates that the CFTR is correctly folded and processed in the Golgi apparatus. These values are expressed as mean +/-SD (n=3). The datasets were compared with a t-test using GraphPad Prism.

Анализ трансэпителиального электрического сопротивления (TEER)Transepithelial electrical resistance (TEER) analysis

Трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER) является широко распространенным количественным методом для измерения целостности динамики плотного соединения в моделях клеточных культур эндотелиального и эпителиального монослоев (Srinivasan et al., 2015, J. Lab. Autom., vol. 20, p. 107-126.) Значения TEER, указанные в Омах, являются хорошими показателями целостности клеточных барьеров, например, до оценки агентов на клеточном барьере. Измерения TEER могут выполняться в режиме реального времени без повреждения клетки. Таким образом, экспериментально определенный TEER клеточного монослоя является количественной мерой целостности барьера, а также мерой его проницаемости для ионов. Установка для измерения TEER, как описано в настоящем документе, состоит из клеточного монослоя, культивируемого на полупроницаемой фильтрующей вставке (Costar Transwell®, Corning, США, 12 мм вставка, полиэфирная мембрана 0,4 мкм), которая определяет разделение для апикального и базолатерального компартментов. Поверхности вставки были покрыты раствором для покрытия из фибронектина. Для электрических измерений используются два электрода, один из которых расположен в верхнем отсеке, а другой в нижнем, и электроды разделены клеточным монослоем. Омическое сопротивление рассчитывается по закону Ома как отношение напряжения и тока; подается сигнал напряжения переменного тока (переменного тока) с прямоугольной формой волны. В системе измерения TEER, известной как эпителиальный вольтметр (EVOM; World Precision Instruments, Сарасота, Флорида), использовалась прямоугольная переменная волна с частотой 12,5 Гц. EVOM и его использование показаны на фиг. 7. В системе EVOM имеется диапазон измерения 1-9999 Ω с разрешением 1 Ω и используется пара электродов, известная как пара электродов STX2/«стержень». Каждый стержень пары электродов (шириной 4 мм и толщиной 1 мм) содержит слой серебра/хлорида серебра для измерения напряжения и серебряный электрод для пропускания тока. Процедура измерения включает в себя измерение сопротивления холостого хода (RBLANK) только полупроницаемой мембраны (без клеток) и измерение сопротивления через слой клеток на полупроницаемой мембране (RTOTAL). Удельное сопротивление клетки (RTISSUE) в единицах Ω можно получить в виде:Transepithelial electrical resistance (TEER) is a widely used quantitative method to measure the integrity of tight junction dynamics in endothelial and epithelial monolayer cell culture models (Srinivasan et al., 2015, J. Lab. Autom., vol. 20, p. 107-126. ) TEER values given in ohms are good indicators of the integrity of cellular barriers, for example, prior to evaluating agents on the cellular barrier. TEER measurements can be performed in real time without damaging the cell. Thus, the experimentally determined TEER of a cell monolayer is a quantitative measure of the integrity of the barrier, as well as a measure of its ion permeability. The TEER measurement setup, as described herein, consists of a cell monolayer cultured on a semi-permeable filter insert (Costar Transwell®, Corning, USA, 12 mm insert, 0.4 µm polyester membrane) that defines separation for the apical and basolateral compartments . The surfaces of the insert were coated with a fibronectin coating solution. For electrical measurements, two electrodes are used, one of which is located in the upper compartment and the other in the lower one, and the electrodes are separated by a cell monolayer. Ohmic resistance is calculated according to Ohm's law as the ratio of voltage and current; an alternating current (alternating current) voltage signal with a square waveform is applied. The TEER measurement system, known as the epithelial voltmeter (EVOM; World Precision Instruments, Sarasota, Florida), used a 12.5 Hz square wave alternating wave. The EVOM and its use are shown in FIG. 7. The EVOM system has a measurement range of 1-9999 Ω with a resolution of 1 Ω and uses an electrode pair known as the STX2/rod pair. Each rod of a pair of electrodes (4 mm wide and 1 mm thick) contains a silver/silver chloride layer for measuring voltage and a silver electrode for carrying current. The measurement procedure includes open circuit resistance measurement (RBLANK) of the semipermeable membrane only (without cells) and resistance measurement through the cell layer on the semipermeable membrane (RTOTAL). Cell resistivity (RTISSUE) in units of Ω can be obtained as:

R_ТКАНЬ(Ω)=R_ВСЕГО-R_{КОНТРОЛЬ} R _FABRIC (Ω)=R _TOTAL -R _CONTROL

Значения TEER приводятся в единицах Ω*см² и рассчитываются как:TEER values are given in units of Ω ^* cm2 and are calculated as:

TEER_{ОПРДЕЛЕННЫЙ}= _ТКАНЬ(Ω)*MAREA(см²)TEER SPECIFIED \ _u003d _FABRIC (Ω) * MAREA (cm ² )

Для анализа TEER клетки выращивали за 3-7 дней до экспериментов, и среду меняли два раза в неделю. Некоторые клетки подвергались воздействию агентов следующим образом: либо ингибитор CFTRinh-172 (40 мкМ), либо активаторы CFTR: IBMX (100 мкМ) и форсколин (10 мкМ), VRT 770 (5 мкМ), либо ингибитор ENaC амилорид (200 мкМ) или один из следующих агентов: CHF6001 (30 нМ) или рофлумиласт (50 нМ). Контроли подвергали воздействию ДМСО (1:1000). Агенты добавляли в среду апикально и базально, а TEER измеряли через 10, 30 и 60 минут.For TEER analysis, cells were grown 3-7 days prior to experiments and the medium was changed twice a week. Some cells were exposed to agents as follows: either CFTRinh-172 inhibitor (40 µM) or CFTR activators: IBMX (100 µM) and forskolin (10 µM), VRT 770 (5 µM), or ENaC inhibitor amiloride (200 µM) or one of the following agents: CHF6001 (30 nM) or roflumilast (50 nM). Controls were exposed to DMSO (1:1000). Agents were added to the medium apically and basally, and TEER was measured at 10, 30, and 60 minutes.

ИммунофлюоресценцияImmunofluorescence

Клетки CFBE41o- и 16HBE14o-, соответственно, высевали на предметное стекло и после воздействия агента или носителя дважды промывали PBS 1× и фиксировали параформальдегидом 4% (PFA) в течение 30 минут и хранили в PBS 1× при 4яяяС перед иммуноокрашиванием. Фиксированные клетки дважды промывали PBS 1× и обрабатывали в течение 3 минут 50 нМ NH₄Cl при комнатной температуре, чтобы погасить альдегидную группу. После еще одного этапа промывания клетки пронизывали TRITON X100 0,1% в течение 5 минут и блокировали раствором 1% BSA в течение 30 минут. Антитело против CFTR M3A7, выращенное против эпитопа, соответствующего остаткам 1197-1480 человеческого CFTR (Санта-Крус), добавляли при разведении 1:100 в течение 1 часа, затем клетки окрашивали вторичным антителом против IgG1 488 (1:1000, Санта-Крус) и родамин фаллоидином (1:500) в течение еще одного часа. Наконец, клетки подвергали окрашиванию DAPI (Sigma Aldrich) (1:2000) в течение 1 часа при комнатной температуре, затем предметные стекла анализировали с помощью микроскопа Leica DM6000M с 40-кратным объективом. Изображения были обработаны для яркости и контраста с помощью Adobe Photoshop.CFBE41o- and 16HBE14o- cells, respectively, were seeded on a glass slide and after exposure to agent or vehicle, washed twice with PBS 1× and fixed with paraformaldehyde 4% (PFA) for 30 minutes and stored in PBS 1× at 4°C before immunostaining. Fixed cells were washed twice with PBS 1x and treated for 3 minutes with 50 nM NH ₄ Cl at room temperature to quench the aldehyde group. After another washing step, the cells were permeated with TRITON X100 0.1% for 5 minutes and blocked with a 1% BSA solution for 30 minutes. Anti-CFTR antibody M3A7 raised against an epitope corresponding to residues 1197-1480 of human CFTR (Santa Cruz) was added at a 1:100 dilution for 1 hour, then cells were stained with secondary anti-IgG1 488 (1:1000, Santa Cruz) and rhodamine phalloidin (1:500) for another hour. Finally, the cells were stained with DAPI (Sigma Aldrich) (1:2000) for 1 hour at room temperature, then the slides were analyzed using a Leica DM6000M microscope with a 40x objective. The images have been processed for brightness and contrast using Adobe Photoshop.

Статистический анализStatistical analysis

Статистический анализ выполняли с помощью программного обеспечения Prism5 (GraphPad Software Inc., La Jolla, США). Односторонний анализ ANOVA использовали для сравнения средних величин между группами. Все парные сравнения были выполнены с использованием специального теста Тьюки. Порог значимости p b 0,05 был установлен для всех статистических анализов.Statistical analysis was performed using Prism5 software (GraphPad Software Inc., La Jolla, USA). One-way ANOVA was used to compare means between groups. All pairwise comparisons were performed using Tukey's custom test. A p b 0.05 significance threshold was set for all statistical analyses.

Пример 1: CFTR потенцирующий активность CHF6001Example 1: CFTR potentiating CHF6001 activity

Потенциальное влияние различных агентов на активность CFTR в клетках CFBE41o анализировали с помощью анализа HS-YFP, комбинируя короткое воздействие (10 минут) с агентами следующим образом: CHF6001, рофлумиласт или VRT 770 (5 мкМ), отдельно или в комбинации с предварительной обработкой CFTR VRT809 (5 мкМ) в течение 24 часов. Для концентрации используемых агентов см. фиг. 1.The potential effect of various agents on CFTR activity in CFBE41o cells was analyzed by HS-YFP assay combining short exposure (10 minutes) with agents as follows: CHF6001, roflumilast, or VRT 770 (5 μM), alone or in combination with CFTR VRT809 pretreatment (5 μM) for 24 hours. For the concentration of agents used, see FIG. one.

Результаты показаны на фиг. 1. Эти результаты демонстрируют значительную способность обоих агентов стимулировать активность CFTR.The results are shown in FIG. 1. These results demonstrate the significant ability of both agents to stimulate CFTR activity.

Следует отметить, что после коррекции CFTR CFTR-корректором VRT809 CHF6001 восстанавливал активность CFTR в клетках CFBE41 до уровней, сопоставимых с эталонным соединением VRT 770.It should be noted that after correction of CFTR with the CFTR corrector VRT809 CHF6001 restored CFTR activity in CFBE41 cells to levels comparable to the reference compound VRT 770.

С помощью анализа TEER, показанного на фиг. 2, функциональность апикальных каналов, присутствующих в клетках, определяют путем измерения потока ионов через эпителий в разные моменты времени. Сопротивление уменьшается в зависимости от увеличения количества ионов, которые проходят мембрану через каналы в единицу времени. Чтобы проверить способность CHF6001 и рофлумиласта действовать непосредственно на канал CFTR, анализ TEER был проведен с этими агентами на 16HBE14o- бронхиальных эпителиальных клетках (BEC), выращенных на границе раздела жидкость-жидкость.Using the TEER analysis shown in FIG. 2, the functionality of the apical channels present in the cells is determined by measuring the flux of ions through the epithelium at different time points. The resistance decreases depending on the increase in the number of ions that pass the membrane through the channels per unit time. To test the ability of CHF6001 and roflumilast to act directly on the CFTR channel, a TEER assay was performed with these agents on 16HBE14o-bronchial epithelial cells (BEC) grown at the liquid-liquid interface.

Как показано на фиг. 2А, влияние различных агентов было протестировано на 16HBE14o- клетках, обработанных в течение 10, 30 и 60 минут, соответственно, CFTR-ингибиторами или амилоридом (ингибитор Na⁺ канала). Как и ожидалось, было зарегистрировано увеличение эпителиального сопротивления из-за уменьшенного потока ионов через эпителий. Напротив, CFTR-потенциатор ивакафтор (VRT 770) и IBMX плюс форсколин вызывали значительное снижение трансэндотелиального электрического сопротивления, которое, по оценкам, составило 60-70% по сравнению с контролем.As shown in FIG. 2A, the effects of various agents were tested on 16HBE14o cells treated for 10, 30 and 60 minutes, respectively, with CFTR inhibitors or amiloride (a Na ⁺ channel inhibitor). As expected, an increase in epithelial resistance was recorded due to reduced ion flux through the epithelium. In contrast, the CFTR potentiator ivacaftor (VRT 770) and IBMX plus forskolin caused a significant reduction in transendothelial electrical resistance estimated to be 60-70% compared to control.

Как показано на фигуре 2B, агенты CHF6001 (30 нМ) и рофлумиласт (50 нМ) были протестированы на 16HBE14o- клетках в разные моменты времени. Значения трансэпителиального электрического сопротивления (Ом/см²) были нормализованы до значений ДМСО (установлено на 100%). Измерения проводили через 10, 30 и 60 минут после воздействия соответствующего агента(ов). Ивакафтор (VRT 770), CHF6001 (CHF) и рофлумиласт (ROFL) оказались способными снизить электрическое сопротивление во всех испытанных экспериментальных условиях. Эти данные подтверждают данные, полученные с помощью анализа HS-YFP, и подтверждают роль CHF6001, а также рофлумиласта в качестве CFTR-потенциаторов.As shown in Figure 2B, agents CHF6001 (30 nM) and roflumilast (50 nM) were tested on 16HBE14o cells at different time points. Transepithelial electrical resistance values (Ω/cm ² ) were normalized to DMSO values (set to 100%). Measurements were taken 10, 30 and 60 minutes after exposure to the respective agent(s). Ivacaftor (VRT 770), CHF6001 (CHF) and roflumilast (ROFL) were able to reduce electrical resistance under all experimental conditions tested. These data support those obtained by the HS-YFP assay and support the role of CHF6001 as well as roflumilast as CFTR potentiators.

Таким образом, этот пример подтверждает, что соединение общей формулы (I) (CHF6001) обладает потенцирующей активностью в отношении ΔF508 CFTR CF50 50F508.Thus, this example confirms that the compound of general formula (I) (CHF6001) has a potentiating activity against ΔF508 CFTR CF50 50F508.

Пример 2: Активность CFTR-корректора CHF6001Example 2: Activity of CFTR-corrector CHF6001

Потенциальную корректирующую активность рофлумиласта и соединения общей формулы (I) (CHF6001) оценивали в сравнении с известным корректором CFTR VRT809 в линии эпителиальных клеток бронхов человека CFBE41o- (гомозиготной по мутации ΔF508 белка CFTR) с помощью анализа HS-YFP (фигура 3). Для концентраций используемых агентов см. фиг. 3. Удивительно, но и рофлумиласт, и CHF6001 индуцировали активность CFTR до уровня, равного или превышающего VRT809. Было проверено, может ли восстановление активности CFTR в линии эпителиальных клеток бронхов человека CFBE41o- (гомозиготной по мутации ΔF508 белка CFTR) помощью рофлумиласта и CHF6001, соответственно, быть связано с восстановлением присутствия CFTR на поверхности клетки. Для сравнения был использован известный CFTR-корректор VRT809. Концентрации используемых агентов см. на фиг. 4. Присутствие CFTR оценивали с помощью проточной цитометрии с использованием двух разных антител, которые нацелены на внеклеточный (CF3) и внутриклеточный (Alomone) эпитопы CFTR. Интересно, что как CHF6001, так и рофлумиласт оказались способными восстанавливать присутствие эпитопов CFTR на клетках CFBE41 после 24 часов лечения. Примечательно, что наблюдаемое восстановление сравнимо с тем, которое наблюдалось с контрольным соединением VX809 (см. фиг. 4).The potential corrective activity of roflumilast and the compound of general formula (I) (CHF6001) was evaluated in comparison with the known CFTR corrector VRT809 in the human bronchial epithelial cell line CFBE41o- (homozygous for the CFTR protein ΔF508 mutation) using the HS-YFP assay (Figure 3). For concentrations of agents used, see FIG. 3. Surprisingly, both roflumilast and CHF6001 induced CFTR activity to levels equal to or greater than VRT809. It was tested whether the restoration of CFTR activity in the human bronchial epithelial cell line CFBE41o- (homozygous for the ΔF508 mutation of the CFTR protein) by roflumilast and CHF6001, respectively, could be associated with the restoration of the presence of CFTR on the cell surface. For comparison, the well-known CFTR corrector VRT809 was used. Refer to FIG. 1 for the concentrations of the agents used. 4. The presence of CFTR was assessed by flow cytometry using two different antibodies that target the extracellular (CF3) and intracellular (Alomone) epitopes of CFTR. Interestingly, both CHF6001 and roflumilast were able to restore the presence of CFTR epitopes on CFBE41 cells after 24 hours of treatment. Notably, the observed recovery is comparable to that observed with the control compound VX809 (see FIG. 4).

Общее присутствие белка CFTR также проверяли, подвергая человеческую линию эпителиальных клеток бронхов CFBE41o- (гомозиготную по мутации ΔF508 белка CFTR) воздействию рофлумиласта, VRT809 и CHF6001 (для концентраций: см. фиг. 5), соответственно, а затем клеточному лизису, гель-электрофорезу и вестерн-блоту. Вестерн-блот анализ клеточных лизатов и количественная оценка общей интенсивности сигнала в процентах, подтверждающая повышающую регуляцию белка CFTR, показана на фиг. 5.The total presence of CFTR protein was also tested by subjecting the human bronchial epithelial cell line CFBE41o- (homozygous for the CFTR protein ΔF508 mutation) to roflumilast, VRT809 and CHF6001 (for concentrations: see Fig. 5), respectively, followed by cell lysis, gel electrophoresis and western blot. Western blot analysis of cell lysates and quantification of overall percent signal intensity, confirming upregulation of the CFTR protein, is shown in FIG. 5.

Таким образом, этот пример вместе с примером 1 подтверждают, что соединение общей формулы (I) (CHF6001) обладает активностью как потенциатора, так и корректора в клетках, характеризующихся генотипом CFTR F508del^+/+ (то есть мутация ΔF508 на обоих аллелях гена CFTR).Thus, this example, together with example 1, confirms that the compound of general formula (I) (CHF6001) has both potentiator and corrector activity in cells characterized by the CFTR F508del ^+/+ genotype (i.e., a ΔF508 mutation on both alleles of the CFTR gene) .

Краткое описание фигурBrief description of the figures

Фиг. 1: Активность CFTR-потенциатора оценивалась в клетках CFBE41o- (характеризуемых генотипом CFTR F508del^+/+ (то есть мутация ΔF508 на обоих аллелях гена CFTR)) и выражалась в виде дельта-флуоресценции между нестимулированными и стимулированными клетками после короткого воздействия (10 минут) к CHF6001, рофлумиласту или VRT770 в разных концентрациях по отдельности или после предварительной инкубации (24 ч) с VRT809. Fig. 1 : CFTR potentiator activity was assessed in CFBE41o- cells (characterized by the CFTR F508del ^+/+ genotype (i.e. ΔF508 mutation on both alleles of the CFTR gene)) and expressed as delta fluorescence between unstimulated and stimulated cells after a short exposure (10 minutes) to CHF6001, roflumilast or VRT770 at different concentrations alone or after pre-incubation (24 hours) with VRT809.

Значения являются средними значениями±SEM (n=4). **p≤0,02 *p≤0,05 t-тест (ДМСО в сравнении с обработкой).Values are means±SEM (n=4). **p≤0.02 *p≤0.05 t-test (DMSO versus treatment).

Фиг. 2: A: TEER был выполнен после воздействия на 16HBE14 бронхиальные эпителиальные клетки CFTR-ингибитором (CFTR-inh 172, 40 мкМ), форсколином (10 мкМ)+IBMX (100 мкМ), амилоридом (200 мкМ) или VRT 770 (ивакафтор, 5 мкМ). Fig. 2 : A: TEER was performed after exposure of 16HBE14 bronchial epithelial cells to CFTR inhibitor (CFTR-inh 172, 40 µM), forskolin (10 µM)+IBMX (100 µM), amiloride (200 µM), or VRT 770 (ivacaftor, 5 µM).

B: CHF6001 (30 нМ), Рофлумиласт (50 нМ) или VRT770 были испытаны на клетках 16HBE14o- в разные моменты времени. Значения трансэпителиального электрического сопротивления (Ом/см²) 16HBE14o- были нормализованы до значений ДМСО (установлено на 100%). Измерения проводили через 10, 30 и 60 минут после воздействия агента(ов).B: CHF6001 (30 nM), Roflumilast (50 nM) or VRT770 were tested on 16HBE14o- cells at different time points. 16HBE14o- transepithelial electrical resistance (Ω/cm ² ) values were normalized to DMSO values (set to 100%). Measurements were taken 10, 30 and 60 minutes after exposure to the agent(s).

Значения являются средними значениями±SEM (n=3). **p≤0,02 *p≤0,05 t-тест (ДМСО в сравнении с обработкой).Values are means±SEM (n=3). **p≤0.02 *p≤0.05 t-test (DMSO versus treatment).

Фиг. 3. Активность CFTR-корректора оценивали в эпителиальной клеточной линии CFBE41 после 24-часового воздействия CFTR-корректора VRT809 (5 мкМ), CHF6001 и рофлумиласта в указанных дозах. Fig. 3 . The activity of the CFTR corrector was evaluated in the CFBE41 epithelial cell line after 24-hour exposure to the CFTR corrector VRT809 (5 μM), CHF6001, and roflumilast at the indicated doses.

Значения нормализовали для общего содержания клеток и выражали как среднее значение±SEM (n=4) *p≤0,05 t-тест (в сравнении с ДМСО).Values were normalized for total cell content and expressed as mean±SEM (n=4) *p≤0.05 t-test (versus DMSO).

Фиг. 4. Присутствие CFTR в линиях эпителиальных клеток бронхов человека 16HBE14o- (не CF) и CFBE41o- (ΔF508/ΔF508) оценивали с помощью проточной цитометрии после 24-часового воздействия CFTR-корректора VRT809 (5 мкМ) в сравнении с двумя соединениями CHF6001 (30 нМ) или рофлумиластом (50 нМ). Проточную цитометрию проводили после трипсин-опосредованного отделения клеток от культуральной чашки с использованием двух разных антител, которые нацелены на внеклеточный (CF3) и внутриклеточный (Alomone) эпитопы CFTR. Процент CFTR-положительных клеток уже был вычтен из событий, определяемых изотипным или пептидным сигналом IgM. Значения являются средними значениями±SEM (n=4). **p≤0,02 *p≤0,05 t-тест (ДМСО в сравнении с обработкой/16HBE14o- в качестве эталона без CF). Например, столбик в левой части фиг. 4 показывает, что около 30% клеток оказались позитивными в отношении окрашивания антителами. Fig. 4 . The presence of CFTR in human bronchial epithelial cell lines 16HBE14o- (not CF) and CFBE41o- (ΔF508/ΔF508) was assessed by flow cytometry after 24-hour exposure to the CFTR corrector VRT809 (5 μM) in comparison with two compounds CHF6001 (30 nM) or roflumilast (50 nM). Flow cytometry was performed after trypsin-mediated separation of cells from the culture dish using two different antibodies that target extracellular (CF3) and intracellular (Alomone) CFTR epitopes. The percentage of CFTR-positive cells has already been subtracted from events determined by the IgM isotype or peptide signal. Values are means±SEM (n=4). **p≤0.02 *p≤0.05 t-test (DMSO versus treatment/16HBE14o- as reference without CF). For example, the column on the left side of Fig. 4 shows that about 30% of the cells were positive for antibody staining.

Фиг. 5. Присутствие CFTR оценивали с помощью вестерн-блоттинга в линиях эпителиальных клеток бронхов человека 16HBE14o- (не CF) и CFBE41o- (ΔF508/ΔF508) после 24-часового воздействия CFTR-корректора VRT809 (5 мкМ) в сравнении с двумя соединениями CHF6001 и рофлумиластом. Fig. 5 . The presence of CFTR was assessed by Western blotting in human bronchial epithelial cell lines 16HBE14o- (non-CF) and CFBE41o- (ΔF508/ΔF508) after 24-hour exposure to the CFTR corrector VRT809 (5 μM) in comparison with the two compounds CHF6001 and roflumilast.

Вверху: среднее из нескольких экспериментов; относительные уровни CFTR были оценены денситометрией с использованием программы ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Нативное количество полосы С рассчитывается как доля актина для соответствующей полосы движения и представляется как доля от общего количества (полоса С/актин). Указанные значения выражены в виде среднего значения+/-SEM (n=3). Наборы данных сравнивались с помощью t-теста с использованием GraphPad Prism. *p≤0,05 t-тест (в сравнении с ДМСО). % присутствия CFTR установлен на 100 в клетках 16HBE14o- (то есть в клетках без CF).Top: average of several experiments; relative CFTR levels were assessed by densitometry using the ImageJ program (http://rsb.info.nih.gov/ij/). The native amount of C band is calculated as the proportion of actin for the respective lane and is presented as a fraction of the total (C band/actin). These values are expressed as the mean+/-SEM (n=3). The datasets were compared with a t-test using GraphPad Prism. *p≤0.05 t-test (versus DMSO). The % presence of CFTR is set to 100 in 16HBE14o- cells (ie cells without CF).

Внизу: вестерн-блот одного показательного эксперимента.Bottom: Western blot of one representative experiment.

Фиг. 6: Иммунофлуоресцентное окрашивание, выполненное на клетках CFBE41o-, обработанных в течение 24 часов VX809+VX770, CHF6001 и рофлумиластом при различных концентрациях или в несущей среде (ДМСО). Оба ингибитора PDE4 увеличивают присутствие CFTR (один показательный из n=3 экспериментов). Fig. 6 : Immunofluorescent staining performed on CFBE41o- cells treated for 24 hours with VX809+VX770, CHF6001 and roflumilast at various concentrations or in vehicle (DMSO). Both PDE4 inhibitors increase the presence of CFTR (one representative of n=3 experiments).

Фиг. 7: Вольтметр, используемый в примерах, описанных в настоящем документе. Fig. 7 : Voltmeter used in the examples described in this document.

Фиг. 8: Аминокислотная последовательность белка CFTR человека (1480 аминокислот). Учетный номер P13569, версия P13569.3, источник данных UniProtKB: локус CFTR_HUMAN Fig. 8 : Amino acid sequence of the human CFTR protein (1480 amino acids). Account number P13569, version P13569.3, UniProtKB data source: CFTR_HUMAN locus

Фенилаланин 508 отмечен выделением.Phenylalanine 508 is noted for isolation.

--->--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ SEQUENCE LIST

<110> Chiesi Famaceutici Spa<110> Chiesi Famaceutici Spa

<120> ПРИМЕНЕНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ 1-ФЕНИЛ-2-ПИРИДИНИЛАЛКИЛОВОГО СПИРТА ПРИ <120> APPLICATION OF DERIVATIVES

ЛЕЧЕНИИ МУКОВИСЦИДОЗАTREATMENT OF CYSTIC FISSIDOSIS

<130> 1786PCT<130> 1786PCT

<160> 1 <160> 1

<170> PatentIn version 3.5<170>PatentIn version 3.5

<210> 1<210> 1

<211> 1480<211> 1480

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 1<400> 1

Met Gln Arg Ser Pro Leu Glu Lys Ala Ser Val Val Ser Lys Leu Phe Met Gln Arg Ser Pro Leu Glu Lys Ala Ser Val Val Ser Lys Leu Phe

1 5 10 15 1 5 10 15

Phe Ser Trp Thr Arg Pro Ile Leu Arg Lys Gly Tyr Arg Gln Arg Leu Phe Ser Trp Thr Arg Pro Ile Leu Arg Lys Gly Tyr Arg Gln Arg Leu

20 25 30 20 25 30

Glu Leu Ser Asp Ile Tyr Gln Ile Pro Ser Val Asp Ser Ala Asp Asn Glu Leu Ser Asp Ile Tyr Gln Ile Pro Ser Val Asp Ser Ala Asp Asn

35 40 45 35 40 45

Leu Ser Glu Lys Leu Glu Arg Glu Trp Asp Arg Glu Leu Ala Ser Lys Leu Ser Glu Lys Leu Glu Arg Glu Trp Asp Arg Glu Leu Ala Ser Lys

50 55 60 50 55 60

Lys Asn Pro Lys Leu Ile Asn Ala Leu Arg Arg Cys Phe Phe Trp Arg Lys Asn Pro Lys Leu Ile Asn Ala Leu Arg Arg Cys Phe Phe Trp Arg

65 70 75 80 65 70 75 80

Phe Met Phe Tyr Gly Ile Phe Leu Tyr Leu Gly Glu Val Thr Lys Ala Phe Met Phe Tyr Gly Ile Phe Leu Tyr Leu Gly Glu Val Thr Lys Ala

85 90 95 85 90 95

Val Gln Pro Leu Leu Leu Gly Arg Ile Ile Ala Ser Tyr Asp Pro Asp Val Gln Pro Leu Leu Leu Gly Arg Ile Ile Ala Ser Tyr Asp Pro Asp

100 105 110 100 105 110

Asn Lys Glu Glu Arg Ser Ile Ala Ile Tyr Leu Gly Ile Gly Leu Cys Asn Lys Glu Glu Arg Ser Ile Ala Ile Tyr Leu Gly Ile Gly Leu Cys

115 120 125 115 120 125

Leu Leu Phe Ile Val Arg Thr Leu Leu Leu His Pro Ala Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ile Val Arg Thr Leu Leu Leu His Pro Ala Ile Phe Gly

130 135 140 130 135 140

Leu His His Ile Gly Met Gln Met Arg Ile Ala Met Phe Ser Leu Ile Leu His His Ile Gly Met Gln Met Arg Ile Ala Met Phe Ser Leu Ile

145 150 155 160 145 150 155 160

Tyr Lys Lys Thr Leu Lys Leu Ser Ser Arg Val Leu Asp Lys Ile Ser Tyr Lys Lys Thr Leu Lys Leu Ser Ser Arg Val Leu Asp Lys Ile Ser

165 170 175 165 170 175

Ile Gly Gln Leu Val Ser Leu Leu Ser Asn Asn Leu Asn Lys Phe Asp Ile Gly Gln Leu Val Ser Leu Leu Ser Asn Asn Leu Asn Lys Phe Asp

180 185 190 180 185 190

Glu Gly Leu Ala Leu Ala His Phe Val Trp Ile Ala Pro Leu Gln Val Glu Gly Leu Ala Leu Ala His Phe Val Trp Ile Ala Pro Leu Gln Val

195 200 205 195 200 205

Ala Leu Leu Met Gly Leu Ile Trp Glu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Phe Ala Leu Leu Met Gly Leu Ile Trp Glu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Phe

210 215 220 210 215 220

Cys Gly Leu Gly Phe Leu Ile Val Leu Ala Leu Phe Gln Ala Gly Leu Cys Gly Leu Gly Phe Leu Ile Val Leu Ala Leu Phe Gln Ala Gly Leu

225 230 235 240 225 230 235 240

Gly Arg Met Met Met Lys Tyr Arg Asp Gln Arg Ala Gly Lys Ile Ser Gly Arg Met Met Met Lys Tyr Arg Asp Gln Arg Ala Gly Lys Ile Ser

245 250 255 245 250 255

Glu Arg Leu Val Ile Thr Ser Glu Met Ile Glu Asn Ile Gln Ser Val Glu Arg Leu Val Ile Thr Ser Glu Met Ile Glu Asn Ile Gln Ser Val

260 265 270 260 265 270

Lys Ala Tyr Cys Trp Glu Glu Ala Met Glu Lys Met Ile Glu Asn Leu Lys Ala Tyr Cys Trp Glu Glu Ala Met Glu Lys Met Ile Glu Asn Leu

275 280 285 275 280 285

Arg Gln Thr Glu Leu Lys Leu Thr Arg Lys Ala Ala Tyr Val Arg Tyr Arg Gln Thr Glu Leu Lys Leu Thr Arg Lys Ala Ala Tyr Val Arg Tyr

290 295 300 290 295 300

Phe Asn Ser Ser Ala Phe Phe Phe Ser Gly Phe Phe Val Val Phe Leu Phe Asn Ser Ser Ala Phe Phe Phe Ser Gly Phe Phe Val Val Phe Leu

305 310 315 320 305 310 315 320

Ser Val Leu Pro Tyr Ala Leu Ile Lys Gly Ile Ile Leu Arg Lys Ile Ser Val Leu Pro Tyr Ala Leu Ile Lys Gly Ile Ile Leu Arg Lys Ile

325 330 335 325 330 335

Phe Thr Thr Ile Ser Phe Cys Ile Val Leu Arg Met Ala Val Thr Arg Phe Thr Thr Ile Ser Phe Cys Ile Val Leu Arg Met Ala Val Thr Arg

340 345 350 340 345 350

Gln Phe Pro Trp Ala Val Gln Thr Trp Tyr Asp Ser Leu Gly Ala Ile Gln Phe Pro Trp Ala Val Gln Thr Trp Tyr Asp Ser Leu Gly Ala Ile

355 360 365 355 360 365

Asn Lys Ile Gln Asp Phe Leu Gln Lys Gln Glu Tyr Lys Thr Leu Glu Asn Lys Ile Gln Asp Phe Leu Gln Lys Gln Glu Tyr Lys Thr Leu Glu

370 375 380 370 375 380

Tyr Asn Leu Thr Thr Thr Glu Val Val Met Glu Asn Val Thr Ala Phe Tyr Asn Leu Thr Thr Thr Glu Val Val Met Glu Asn Val Thr Ala Phe

385 390 395 400 385 390 395 400

Trp Glu Glu Gly Phe Gly Glu Leu Phe Glu Lys Ala Lys Gln Asn Asn Trp Glu Glu Gly Phe Gly Glu Leu Phe Glu Lys Ala Lys Gln Asn Asn

405 410 415 405 410 415

Asn Asn Arg Lys Thr Ser Asn Gly Asp Asp Ser Leu Phe Phe Ser Asn Asn Asn Arg Lys Thr Ser Asn Gly Asp Asp Ser Leu Phe Phe Ser Asn

420 425 430 420 425 430

Phe Ser Leu Leu Gly Thr Pro Val Leu Lys Asp Ile Asn Phe Lys Ile Phe Ser Leu Leu Gly Thr Pro Val Leu Lys Asp Ile Asn Phe Lys Ile

435 440 445 435 440 445

Glu Arg Gly Gln Leu Leu Ala Val Ala Gly Ser Thr Gly Ala Gly Lys Glu Arg Gly Gln Leu Leu Ala Val Ala Gly Ser Thr Gly Ala Gly Lys

450 455 460 450 455 460

Thr Ser Leu Leu Met Val Ile Met Gly Glu Leu Glu Pro Ser Glu Gly Thr Ser Leu Leu Met Val Ile Met Gly Glu Leu Glu Pro Ser Glu Gly

465 470 475 480 465 470 475 480

Lys Ile Lys His Ser Gly Arg Ile Ser Phe Cys Ser Gln Phe Ser Trp Lys Ile Lys His Ser Gly Arg Ile Ser Phe Cys Ser Gln Phe Ser Trp

485 490 495 485 490 495

Ile Met Pro Gly Thr Ile Lys Glu Asn Ile Ile Phe Gly Val Ser Tyr Ile Met Pro Gly Thr Ile Lys Glu Asn Ile Ile Phe Gly Val Ser Tyr

500 505 510 500 505 510

Asp Glu Tyr Arg Tyr Arg Ser Val Ile Lys Ala Cys Gln Leu Glu Glu Asp Glu Tyr Arg Tyr Arg Ser Val Ile Lys Ala Cys Gln Leu Glu Glu

515 520 525 515 520 525

Asp Ile Ser Lys Phe Ala Glu Lys Asp Asn Ile Val Leu Gly Glu Gly Asp Ile Ser Lys Phe Ala Glu Lys Asp Asn Ile Val Leu Gly Glu Gly

530 535 540 530 535 540

Gly Ile Thr Leu Ser Gly Gly Gln Arg Ala Arg Ile Ser Leu Ala Arg Gly Ile Thr Leu Ser Gly Gly Gln Arg Ala Arg Ile Ser Leu Ala Arg

545 550 555 560 545 550 555 560

Ala Val Tyr Lys Asp Ala Asp Leu Tyr Leu Leu Asp Ser Pro Phe Gly Ala Val Tyr Lys Asp Ala Asp Leu Tyr Leu Leu Asp Ser Pro Phe Gly

565 570 575 565 570 575

Tyr Leu Asp Val Leu Thr Glu Lys Glu Ile Phe Glu Ser Cys Val Cys Tyr Leu Asp Val Leu Thr Glu Lys Glu Ile Phe Glu Ser Cys Val Cys

580 585 590 580 585 590

Lys Leu Met Ala Asn Lys Thr Arg Ile Leu Val Thr Ser Lys Met Glu Lys Leu Met Ala Asn Lys Thr Arg Ile Leu Val Thr Ser Lys Met Glu

595 600 605 595 600 605

His Leu Lys Lys Ala Asp Lys Ile Leu Ile Leu His Glu Gly Ser Ser His Leu Lys Lys Ala Asp Lys Ile Leu Ile Leu His Glu Gly Ser Ser

610 615 620 610 615 620

Tyr Phe Tyr Gly Thr Phe Ser Glu Leu Gln Asn Leu Gln Pro Asp Phe Tyr Phe Tyr Gly Thr Phe Ser Glu Leu Gln Asn Leu Gln Pro Asp Phe

625 630 635 640 625 630 635 640

Ser Ser Lys Leu Met Gly Cys Asp Ser Phe Asp Gln Phe Ser Ala Glu Ser Ser Lys Leu Met Gly Cys Asp Ser Phe Asp Gln Phe Ser Ala Glu

645 650 655 645 650 655

Arg Arg Asn Ser Ile Leu Thr Glu Thr Leu His Arg Phe Ser Leu Glu Arg Arg Asn Ser Ile Leu Thr Glu Thr Leu His Arg Phe Ser Leu Glu

660 665 670 660 665 670

Gly Asp Ala Pro Val Ser Trp Thr Glu Thr Lys Lys Gln Ser Phe Lys Gly Asp Ala Pro Val Ser Trp Thr Glu Thr Lys Lys Gln Ser Phe Lys

675 680 685 675 680 685

Gln Thr Gly Glu Phe Gly Glu Lys Arg Lys Asn Ser Ile Leu Asn Pro Gln Thr Gly Glu Phe Gly Glu Lys Arg Lys Asn Ser Ile Leu Asn Pro

690 695 700 690 695 700

Ile Asn Ser Ile Arg Lys Phe Ser Ile Val Gln Lys Thr Pro Leu Gln Ile Asn Ser Ile Arg Lys Phe Ser Ile Val Gln Lys Thr Pro Leu Gln

705 710 715 720 705 710 715 720

Met Asn Gly Ile Glu Glu Asp Ser Asp Glu Pro Leu Glu Arg Arg Leu Met Asn Gly Ile Glu Glu Asp Ser Asp Glu Pro Leu Glu Arg Arg Leu

725 730 735 725 730 735

Ser Leu Val Pro Asp Ser Glu Gln Gly Glu Ala Ile Leu Pro Arg Ile Ser Leu Val Pro Asp Ser Glu Gln Gly Glu Ala Ile Leu Pro Arg Ile

740 745 750 740 745 750

Ser Val Ile Ser Thr Gly Pro Thr Leu Gln Ala Arg Arg Arg Gln Ser Ser Val Ile Ser Thr Gly Pro Thr Leu Gln Ala Arg Arg Arg Gln Ser

755 760 765 755 760 765

Val Leu Asn Leu Met Thr His Ser Val Asn Gln Gly Gln Asn Ile His Val Leu Asn Leu Met Thr His Ser Val Asn Gln Gly Gln Asn Ile His

770 775 780 770 775 780

Arg Lys Thr Thr Ala Ser Thr Arg Lys Val Ser Leu Ala Pro Gln Ala Arg Lys Thr Thr Ala Ser Thr Arg Lys Val Ser Leu Ala Pro Gln Ala

785 790 795 800 785 790 795 800

Asn Leu Thr Glu Leu Asp Ile Tyr Ser Arg Arg Leu Ser Gln Glu Thr Asn Leu Thr Glu Leu Asp Ile Tyr Ser Arg Arg Leu Ser Gln Glu Thr

805 810 815 805 810 815

Gly Leu Glu Ile Ser Glu Glu Ile Asn Glu Glu Asp Leu Lys Glu Cys Gly Leu Glu Ile Ser Glu Glu Ile Asn Glu Glu Asp Leu Lys Glu Cys

820 825 830 820 825 830

Phe Phe Asp Asp Met Glu Ser Ile Pro Ala Val Thr Thr Trp Asn Thr Phe Phe Asp Asp Met Glu Ser Ile Pro Ala Val Thr Thr Trp Asn Thr

835 840 845 835 840 845

Tyr Leu Arg Tyr Ile Thr Val His Lys Ser Leu Ile Phe Val Leu Ile Tyr Leu Arg Tyr Ile Thr Val His Lys Ser Leu Ile Phe Val Leu Ile

850 855 860 850 855 860

Trp Cys Leu Val Ile Phe Leu Ala Glu Val Ala Ala Ser Leu Val Val Trp Cys Leu Val Ile Phe Leu Ala Glu Val Ala Ala Ser Leu Val Val

865 870 875 880 865 870 875 880

Leu Trp Leu Leu Gly Asn Thr Pro Leu Gln Asp Lys Gly Asn Ser Thr Leu Trp Leu Leu Gly Asn Thr Pro Leu Gln Asp Lys Gly Asn Ser Thr

885 890 895 885 890 895

His Ser Arg Asn Asn Ser Tyr Ala Val Ile Ile Thr Ser Thr Ser Ser His Ser Arg Asn Asn Ser Tyr Ala Val Ile Ile Thr Ser Thr Ser Ser

900 905 910 900 905 910

Tyr Tyr Val Phe Tyr Ile Tyr Val Gly Val Ala Asp Thr Leu Leu Ala Tyr Tyr Val Phe Tyr Ile Tyr Val Gly Val Ala Asp Thr Leu Leu Ala

915 920 925 915 920 925

Met Gly Phe Phe Arg Gly Leu Pro Leu Val His Thr Leu Ile Thr Val Met Gly Phe Phe Arg Gly Leu Pro Leu Val His Thr Leu Ile Thr Val

930 935 940 930 935 940

Ser Lys Ile Leu His His Lys Met Leu His Ser Val Leu Gln Ala Pro Ser Lys Ile Leu His His Lys Met Leu His Ser Val Leu Gln Ala Pro

945 950 955 960 945 950 955 960

Met Ser Thr Leu Asn Thr Leu Lys Ala Gly Gly Ile Leu Asn Arg Phe Met Ser Thr Leu Asn Thr Leu Lys Ala Gly Gly Ile Leu Asn Arg Phe

965 970 975 965 970 975

Ser Lys Asp Ile Ala Ile Leu Asp Asp Leu Leu Pro Leu Thr Ile Phe Ser Lys Asp Ile Ala Ile Leu Asp Asp Leu Leu Pro Leu Thr Ile Phe

980 985 990 980 985 990

Asp Phe Ile Gln Leu Leu Leu Ile Val Ile Gly Ala Ile Ala Val Val Asp Phe Ile Gln Leu Leu Leu Ile Val Ile Gly Ala Ile Ala Val Val

995 1000 1005 995 1000 1005

Ala Val Leu Gln Pro Tyr Ile Phe Val Ala Thr Val Pro Val Ile Ala Val Leu Gln Pro Tyr Ile Phe Val Ala Thr Val Pro Val Ile

1010 1015 1020 1010 1015 1020

Val Ala Phe Ile Met Leu Arg Ala Tyr Phe Leu Gln Thr Ser Gln Val Ala Phe Ile Met Leu Arg Ala Tyr Phe Leu Gln Thr Ser Gln

1025 1030 1035 1025 1030 1035

Gln Leu Lys Gln Leu Glu Ser Glu Gly Arg Ser Pro Ile Phe Thr Gln Leu Lys Gln Leu Glu Ser Glu Gly Arg Ser Pro Ile Phe Thr

1040 1045 1050 1040 1045 1050

His Leu Val Thr Ser Leu Lys Gly Leu Trp Thr Leu Arg Ala Phe His Leu Val Thr Ser Leu Lys Gly Leu Trp Thr Leu Arg Ala Phe

1055 1060 1065 1055 1060 1065

Gly Arg Gln Pro Tyr Phe Glu Thr Leu Phe His Lys Ala Leu Asn Gly Arg Gln Pro Tyr Phe Glu Thr Leu Phe His Lys Ala Leu Asn

1070 1075 1080 1070 1075 1080

Leu His Thr Ala Asn Trp Phe Leu Tyr Leu Ser Thr Leu Arg Trp Leu His Thr Ala Asn Trp Phe Leu Tyr Leu Ser Thr Leu Arg Trp

1085 1090 1095 1085 1090 1095

Phe Gln Met Arg Ile Glu Met Ile Phe Val Ile Phe Phe Ile Ala Phe Gln Met Arg Ile Glu Met Ile Phe Val Ile Phe Phe Ile Ala

1100 1105 1110 1100 1105 1110

Val Thr Phe Ile Ser Ile Leu Thr Thr Gly Glu Gly Glu Gly Arg Val Thr Phe Ile Ser Ile Leu Thr Thr Gly Glu Gly Glu Gly Arg

1115 1120 1125 1115 1120 1125

Val Gly Ile Ile Leu Thr Leu Ala Met Asn Ile Met Ser Thr Leu Val Gly Ile Ile Leu Thr Leu Ala Met Asn Ile Met Ser Thr Leu

1130 1135 1140 1130 1135 1140

Gln Trp Ala Val Asn Ser Ser Ile Asp Val Asp Ser Leu Met Arg Gln Trp Ala Val Asn Ser Ser Ile Asp Val Asp Ser Leu Met Arg

1145 1150 1155 1145 1150 1155

Ser Val Ser Arg Val Phe Lys Phe Ile Asp Met Pro Thr Glu Gly Ser Val Ser Arg Val Phe Lys Phe Ile Asp Met Pro Thr Glu Gly

1160 1165 1170 1160 1165 1170

Lys Pro Thr Lys Ser Thr Lys Pro Tyr Lys Asn Gly Gln Leu Ser Lys Pro Thr Lys Ser Thr Lys Pro Tyr Lys Asn Gly Gln Leu Ser

1175 1180 1185 1175 1180 1185

Lys Val Met Ile Ile Glu Asn Ser His Val Lys Lys Asp Asp Ile Lys Val Met Ile Ile Glu Asn Ser His Val Lys Lys Asp Asp Ile

1190 1195 1200 1190 1195 1200

Trp Pro Ser Gly Gly Gln Met Thr Val Lys Asp Leu Thr Ala Lys Trp Pro Ser Gly Gly Gln Met Thr Val Lys Asp Leu Thr Ala Lys

1205 1210 1215 1205 1210 1215

Tyr Thr Glu Gly Gly Asn Ala Ile Leu Glu Asn Ile Ser Phe Ser Tyr Thr Glu Gly Gly Asn Ala Ile Leu Glu Asn Ile Ser Phe Ser

1220 1225 1230 1220 1225 1230

Ile Ser Pro Gly Gln Arg Val Gly Leu Leu Gly Arg Thr Gly Ser Ile Ser Pro Gly Gln Arg Val Gly Leu Leu Gly Arg Thr Gly Ser

1235 1240 1245 1235 1240 1245

Gly Lys Ser Thr Leu Leu Ser Ala Phe Leu Arg Leu Leu Asn Thr Gly Lys Ser Thr Leu Leu Ser Ala Phe Leu Arg Leu Leu Asn Thr

1250 1255 1260 1250 1255 1260

Glu Gly Glu Ile Gln Ile Asp Gly Val Ser Trp Asp Ser Ile Thr Glu Gly Glu Ile Gln Ile Asp Gly Val Ser Trp Asp Ser Ile Thr

1265 1270 1275 1265 1270 1275

Leu Gln Gln Trp Arg Lys Ala Phe Gly Val Ile Pro Gln Lys Val Leu Gln Gln Trp Arg Lys Ala Phe Gly Val Ile Pro Gln Lys Val

1280 1285 1290 1280 1285 1290

Phe Ile Phe Ser Gly Thr Phe Arg Lys Asn Leu Asp Pro Tyr Glu Phe Ile Phe Ser Gly Thr Phe Arg Lys Asn Leu Asp Pro Tyr Glu

1295 1300 1305 1295 1300 1305

Gln Trp Ser Asp Gln Glu Ile Trp Lys Val Ala Asp Glu Val Gly Gln Trp Ser Asp Gln Glu Ile Trp Lys Val Ala Asp Glu Val Gly

1310 1315 1320 1310 1315 1320

Leu Arg Ser Val Ile Glu Gln Phe Pro Gly Lys Leu Asp Phe Val Leu Arg Ser Val Ile Glu Gln Phe Pro Gly Lys Leu Asp Phe Val

1325 1330 1335 1325 1330 1335

Leu Val Asp Gly Gly Cys Val Leu Ser His Gly His Lys Gln Leu Leu Val Asp Gly Gly Cys Val Leu Ser His Gly His Lys Gln Leu

1340 1345 1350 1340 1345 1350

Met Cys Leu Ala Arg Ser Val Leu Ser Lys Ala Lys Ile Leu Leu Met Cys Leu Ala Arg Ser Val Leu Ser Lys Ala Lys Ile Leu Leu

1355 1360 1365 1355 1360 1365

Leu Asp Glu Pro Ser Ala His Leu Asp Pro Val Thr Tyr Gln Ile Leu Asp Glu Pro Ser Ala His Leu Asp Pro Val Thr Tyr Gln Ile

1370 1375 1380 1370 1375 1380

Ile Arg Arg Thr Leu Lys Gln Ala Phe Ala Asp Cys Thr Val Ile Ile Arg Arg Thr Leu Lys Gln Ala Phe Ala Asp Cys Thr Val Ile

1385 1390 1395 1385 1390 1395

Leu Cys Glu His Arg Ile Glu Ala Met Leu Glu Cys Gln Gln Phe Leu Cys Glu His Arg Ile Glu Ala Met Leu Glu Cys Gln Gln Phe

1400 1405 1410 1400 1405 1410

Leu Val Ile Glu Glu Asn Lys Val Arg Gln Tyr Asp Ser Ile Gln Leu Val Ile Glu Glu Asn Lys Val Arg Gln Tyr Asp Ser Ile Gln

1415 1420 1425 1415 1420 1425

Lys Leu Leu Asn Glu Arg Ser Leu Phe Arg Gln Ala Ile Ser Pro Lys Leu Leu Asn Glu Arg Ser Leu Phe Arg Gln Ala Ile Ser Pro

1430 1435 1440 1430 1435 1440

Ser Asp Arg Val Lys Leu Phe Pro His Arg Asn Ser Ser Lys Cys Ser Asp Arg Val Lys Leu Phe Pro His Arg Asn Ser Ser Ser Lys Cys

1445 1450 1455 1445 1450 1455

Lys Ser Lys Pro Gln Ile Ala Ala Leu Lys Glu Glu Thr Glu Glu Lys Ser Lys Pro Gln Ile Ala Ala Leu Lys Glu Glu Thr Glu Glu

1460 1465 1470 1460 1465 1470

Glu Val Gln Asp Thr Arg Leu Glu Val Gln Asp Thr Arg Leu

1475 1480 1475 1480

<---<---

Claims

1. Применение соединения общей формулы (I) в виде (-)энантиомера1. Use of a compound of general formula (I) as the (-) enantiomer

(I)(I)

где:where:

n обозначает 1;n is 1;

R1 представляет собой HNSO₂R4, где R4 представляет собой линейный или разветвленный C₁-C₄ алкил;R1 represents HNSO ₂ R4, where R4 represents a linear or branched C ₁ -C ₄ alkyl;

R2 представляет собой OR3, где R3 представляет собой линейный или разветвленный C₁-C₆ алкил, замещенный C₃-C₇ циклоалкильной группой;R2 is OR3, where R3 is straight or branched C ₁ -C ₆ alkyl substituted with a C ₃ -C ₇ cycloalkyl group;

или его фармацевтически приемлемой неорганической или органической соли,or a pharmaceutically acceptable inorganic or organic salt thereof,

для профилактики и/или лечения муковисцидоза у субъекта,for the prevention and/or treatment of cystic fibrosis in a subject,

где субъект характеризуется по меньшей мере одной мутацией в гене CFTR, которая является причиной неправильного сворачивания и/или процессинга белка CFTR.wherein the subject is characterized by at least one mutation in the CFTR gene that causes the CFTR protein to misfold and/or be processed.

2. Применение по п.1, где R4 представляет собой метил, R3 представляет собой циклопропилметил.2. Use according to claim 1, wherein R4 is methyl, R3 is cyclopropylmethyl.

3. Применение по любому из предшествующих пунктов, где указанный субъект характеризуется по меньшей мере одной мутацией в гене CFTR, которая является причиной неправильного сворачивания белка CFTR.3. Use according to any one of the preceding claims, wherein said subject has at least one mutation in the CFTR.beta . gene that causes misfolding of the CFTR protein.

4. Применение по любому из предшествующих пунктов, где соединение обладает активностью CFTR-корректора.4. Use according to any one of the preceding claims, wherein the compound has CFTR corrector activity.

5. Применение по любому из предшествующих пунктов, где указанный субъект характеризуется по меньшей мере одной мутацией в гене CFTR, которая является причиной неправильного процессинга белка CFTR.5. Use according to any one of the preceding claims, wherein said subject has at least one mutation in the CFTR.beta. gene that causes the CFTR protein to be misprocessed.

6. Применение по любому из предшествующих пунктов, где по меньшей мере одна указанная мутация представляет собой геномную мутацию гена CFTR, и/или мутация гена CFTR присутствует в клетках дыхательных путей указанного субъекта.6. Use according to any one of the preceding claims, wherein at least one said mutation is a genomic mutation of the CFTR gene and/or the CFTR gene mutation is present in cells of the respiratory tract of said subject.

7. Применение по любому из предшествующих пунктов, где соединение дополнительно обладает ингибирующей активностью в отношении PDE4.7. Use according to any one of the preceding claims, wherein the compound further has PDE4 inhibitory activity.

8. Применение по любому из предшествующих пунктов, где указанным субъектом является человек.8. Use according to any one of the preceding claims, wherein said subject is a human.

9. Применение по п.8, где геном указанного субъекта человека по меньшей мере кодирует мутацию ΔF508 в белке CFTR.9. Use according to claim 8, wherein said human subject's genome at least encodes a ΔF508 mutation in the CFTR protein.

10. Применение по п.8 или 9, где у указанного субъекта человека кодируется мутация ΔF508 в обоих геномных аллелях гена, кодирующего белок CFTR (то есть субъект гомозиготен по ΔF508).10. Use according to claim 8 or 9, wherein said human subject encodes a ΔF508 mutation in both genomic alleles of the gene encoding the CFTR protein (i.e., the subject is homozygous for ΔF508).

11. Применение по любому из предшествующих пунктов, где указанный субъект страдает от симптомов муковисцидоза в дыхательных путях, в желудочно-кишечном тракте или в них обоих.11. Use according to any one of the preceding claims, wherein said subject is suffering from symptoms of cystic fibrosis in the respiratory tract, in the gastrointestinal tract, or both.

12. Применение по любому из предшествующих пунктов, где применение представляет собой введение с помощью ингаляции.12. Use according to any one of the preceding claims, wherein the use is administration by inhalation.

13. Применение по п.12, где указанное соединение вводится с помощью устройства, выбранного из одно- или многодозового ингалятора сухого порошка, ингалятора отмеренных доз и ингалятора мягкого тумана.13. Use according to claim 12, wherein said compound is administered using a device selected from a single or multiple dose dry powder inhaler, a metered dose inhaler, and a soft mist inhaler.

14. Применение по любому из предшествующих пунктов, где применение отличается тем, что указанное соединение используется в комбинации по меньшей мере с одним вторым фармацевтически активным компонентом, выбранным из классов CFTR-корректоров, CFTR-потенциаторов и комбинаций CFTR-корректоров и CFTR-потенциаторов.14. The use according to any of the preceding claims, wherein the use is characterized in that said compound is used in combination with at least one second pharmaceutically active ingredient selected from the classes of CFTR correctors, CFTR potentiators, and combinations of CFTR correctors and CFTR potentiators.

15. Применение по п.14, где указанный второй фармацевтически активный компонент выбран из ивакафтора и лумакафтора.15. Use according to claim 14, wherein said second pharmaceutically active ingredient is selected from ivacaftor and lumacaftor.