RU2776310C2 - Neisseria meningitidis compositions and their application methods - Google Patents
Neisseria meningitidis compositions and their application methods Download PDFInfo
- Publication number
- RU2776310C2 RU2776310C2 RU2018129163A RU2018129163A RU2776310C2 RU 2776310 C2 RU2776310 C2 RU 2776310C2 RU 2018129163 A RU2018129163 A RU 2018129163A RU 2018129163 A RU2018129163 A RU 2018129163A RU 2776310 C2 RU2776310 C2 RU 2776310C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- polypeptide
- lipidated
- gly
- amino acid
- Prior art date
Links
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 title abstract 4
- 229940052778 Neisseria meningitidis Drugs 0.000 title abstract 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title abstract 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract 2
- 230000036647 reaction Effects 0.000 abstract 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 230000000844 anti-bacterial Effects 0.000 abstract 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 abstract 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
Images
Abstract
Description
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯFIELD OF THE INVENTION
Настоящее изобретение касается композиций Neisseria meningitidis и способов их применения.The present invention relates to compositions of Neisseria meningitidis and methods for their use.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE INVENTION
Neisseria meningitidis является грамотрицательной инкапсулированной бактерией, способной вызывать сепсис, менингит и смерть. N. meningitidis может разделяться приблизительно на 13 серогрупп (включая серогруппы А, В, С, Е29, Н, I, K, L, W-135, X, Y и Z) на основе химических и антигенных различий полисахаридных капсул. Болезнь обусловлена, главным образом, пятью из серогрупп (A, B, C, Y и W135).Neisseria meningitidis is a gram-negative encapsulated bacterium that can cause sepsis, meningitis and death. N. meningitidis can be classified into approximately 13 serogroups (including serogroups A, B, C, E29, H, I, K, L, W-135, X, Y, and Z) based on the chemical and antigenic differences of the polysaccharide capsules. The disease is mainly due to five of the serogroups (A, B, C, Y and W135).
Менингококковый менингит является тяжелым заболеванием, способным убивать детей и молодых взрослых людей за несколько часов, несмотря на наличие антибиотиков. Существует потребность в улучшенных иммуногенных композициях против менингококковых серогрупп А, В, С, Y и W135 и/или X.Meningococcal meningitis is a severe disease that can kill children and young adults in a matter of hours, despite the availability of antibiotics. There is a need for improved immunogenic compositions against meningococcal serogroups A, B, C, Y and W135 and/or X.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯBRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION
Для удовлетворения этой и других потребностей настоящее изобретение обеспечивает композиции Neisseria meningitidis и способы их применения.To meet this and other needs, the present invention provides Neisseria meningitidis compositions and methods of using the same.
В одном аспекте изобретение касается выделенного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 71, в которой первые двадцать аминокислотных остатков последовательности не содержат цистеина.In one aspect, the invention relates to an isolated polypeptide comprising an amino acid sequence at least 95% identical to SEQ ID NO: 71, in which the first twenty amino acid residues of the sequence do not contain cysteine.
В одном варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность в позициях 1-184 SEQ ID NO: 71.In one embodiment, the isolated polypeptide comprises the amino acid sequence at positions 1-184 of SEQ ID NO: 71.
В одном варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность в позициях 158-185 SEQ ID NO: 71. В другом варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность в позициях 159-186 SEQ ID NO: 71.In one embodiment, the isolated polypeptide comprises the amino acid sequence at positions 158-185 of SEQ ID NO: 71. In another embodiment, the isolated polypeptide comprises the amino acid sequence at positions 159-186 of SEQ ID NO: 71.
В одном варианте осуществления выделенный полипептид включает, по меньшей мере, 6 смежных аминокислот из аминокислотной последовательности в позициях 185-254 SEQ ID NO: 71.In one embodiment, the isolated polypeptide comprises at least 6 contiguous amino acids from the amino acid sequence at positions 185-254 of SEQ ID NO: 71.
В одном варианте осуществления выделенный полипептид является непирувилированным.In one embodiment, the isolated polypeptide is non-pyruvilated.
В одном варианте осуществления выделенный полипептид является нелипидированным.In one embodiment, the isolated polypeptide is non-lipidated.
В одном варианте осуществления выделенный полипептид является иммуногенным.In one embodiment, the isolated polypeptide is immunogenic.
В одном варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 71.In one embodiment, the isolated polypeptide comprises an amino acid sequence consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 71.
В одном аспекте изобретение касается выделенного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 76, в которой первые двадцать аминокислотных остатков последовательности не содержат цистеина.In one aspect, the invention relates to an isolated polypeptide comprising an amino acid sequence at least 95% identical to SEQ ID NO: 76, in which the first twenty amino acid residues of the sequence do not contain cysteine.
В одном варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76.In one embodiment, the isolated polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 76.
В одном варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, в которой цистеин в позиции 1 делетирован. В другом варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, в которой цистеин в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. В одном варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77.In one embodiment, the isolated polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 76 wherein the cysteine at
В одном варианте осуществления выделенный полипептид является непирувилированным. В одном варианте осуществления выделенный полипептид является нелипидированным. В одном варианте осуществления выделенный полипептид является иммуногенным.In one embodiment, the isolated polypeptide is non-pyruvilated. In one embodiment, the isolated polypeptide is non-lipidated. In one embodiment, the isolated polypeptide is immunogenic.
В другом аспекте изобретение касается иммуногенной композиции, включающей полипептид согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления. В другом аспекте изобретение касается иммуногенной композиции, включающей полипептид согласно любому из описанных авторами вариантов осуществления.In another aspect, the invention relates to an immunogenic composition comprising a polypeptide according to any of the above embodiments. In another aspect, the invention relates to an immunogenic composition comprising a polypeptide according to any of the embodiments described by the authors.
В одном аспекте изобретение касается выделенной нуклеиновокислотной последовательности, кодирующей выделенный полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 71.In one aspect, the invention relates to an isolated nucleic acid sequence encoding an isolated polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 71.
В одном варианте осуществления выделенная нуклеиновокислотная последовательность включает SEQ ID NO: 72.In one embodiment, the isolated nucleic acid sequence comprises SEQ ID NO: 72.
В одном аспекте изобретение касается иммуногенной композиции, включающей выделенный нелипидированный, непирувилированный полипептид ORF2086 из Neisseria meningitidis серогруппы В и по меньшей мере один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135; и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.In one aspect, the invention relates to an immunogenic composition comprising an isolated, non-lipidated, non-pyruvilated ORF2086 polypeptide from Neisseria meningitidis serogroup B and at least one conjugate selected from the group consisting of: a) Neisseria meningitidis serogroup A capsular saccharide conjugate; b) Neisseria meningitidis serogroup C capsular saccharide conjugate; c) Neisseria meningitidis serogroup W135 capsular saccharide conjugate; and d) Neisseria meningitidis serogroup Y capsular saccharide conjugate.
В одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает, по меньшей мере, два конъюгата, выбранных из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135; и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.In one embodiment, the immunogenic composition comprises at least two conjugates selected from the group consisting of: a) Neisseria meningitidis serogroup A capsular saccharide conjugate; b) Neisseria meningitidis serogroup C capsular saccharide conjugate; c) Neisseria meningitidis serogroup W135 capsular saccharide conjugate; and d) Neisseria meningitidis serogroup Y capsular saccharide conjugate.
В одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает, по меньшей мере, три конъюгата, выбранных из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135; и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.In one embodiment, the immunogenic composition comprises at least three conjugates selected from the group consisting of: a) Neisseria meningitidis serogroup A capsular saccharide conjugate; b) Neisseria meningitidis serogroup C capsular saccharide conjugate; c) Neisseria meningitidis serogroup W135 capsular saccharide conjugate; and d) Neisseria meningitidis serogroup Y capsular saccharide conjugate.
В одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135; и конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.In one embodiment, the immunogenic composition comprises a Neisseria meningitidis serogroup A capsular saccharide conjugate; capsular saccharide conjugate of Neisseria meningitidis serogroup C; capsular saccharide conjugate of Neisseria meningitidis serogroup W135; and a Neisseria meningitidis serogroup Y capsular saccharide conjugate.
В одном варианте осуществления полипептид является полипептидом подсемейства А.In one embodiment, the polypeptide is a subfamily A polypeptide.
В одном варианте осуществления Полипептид является полипептидом подсемейства В.In one embodiment, the Polypeptide is a subfamily B polypeptide.
В одном варианте осуществления полипептид является непирувилированным нелипидированным А05.In one embodiment, the polypeptide is non-pyruvilated, non-lipidated A05.
В одном варианте осуществления полипептид является непирувилированным нелипидированным А12.In one embodiment, the polypeptide is non-pyruvilated, non-lipidated A12.
В одном варианте осуществления полипептид является непирувилированным нелипидированным А22.In one embodiment, the polypeptide is non-pyruvilated, non-lipidated A22.
В одном варианте осуществления полипептид является непирувилированным нелипидированным В01.In one embodiment, the polypeptide is non-pyruvilated, non-lipidated B01.
В одном варианте осуществления полипептид является непирувилированным нелипидированным В09.In one embodiment, the polypeptide is non-pyruvilated, non-lipidated B09.
В одном варианте осуществления полипептид является непирувилированным нелипидированным В44.In one embodiment, the polypeptide is non-pyruvilated, non-lipidated B44.
В одном варианте осуществления полипептид является непирувилированным нелипидированным В22.In one embodiment, the polypeptide is non-pyruvilated, non-lipidated B22.
В одном варианте осуществления полипептид является непирувилированным нелипидированным В24.In one embodiment, the polypeptide is non-pyruvilated, non-lipidated B24.
В одном варианте осуществления полипептид является непирувилированным нелипидированным А62.In one embodiment, the polypeptide is non-pyruvilated, non-lipidated A62.
В одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 71 и SEQ ID NO: 75. В одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77.In one embodiment, the polypeptide comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 71 and SEQ ID NO: 75. In one embodiment, the polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 77.
В одном аспекте изобретение касается способа вызывания иммунной реакции против Neisseria meningitidis у млекопитающего. Способ включает введение млекопитающему эффективного количества иммуногенной композиции, включающей выделенный нелипидированный, непирувилированный полипептид ORF2086 из Neisseria meningitidis серогруппы В, и по меньшей мере один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135; и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.In one aspect, the invention relates to a method for inducing an immune response against Neisseria meningitidis in a mammal. The method includes administering to a mammal an effective amount of an immunogenic composition comprising an isolated, non-lipidated, non-pyruvilated ORF2086 polypeptide from Neisseria meningitidis serogroup B, and at least one conjugate selected from the group consisting of: a) Neisseria meningitidis serogroup A capsular saccharide conjugate; b) Neisseria meningitidis serogroup C capsular saccharide conjugate; c) Neisseria meningitidis serogroup W135 capsular saccharide conjugate; and d) Neisseria meningitidis serogroup Y capsular saccharide conjugate.
В одном аспекте изобретение касается способа выработки бактериального антитела против Neisseria meningitidis серогруппы С у млекопитающего. Способ включает введение млекопитающему эффективного количества иммуногенной композиции, включающей выделенный нелипидированный, непирувилированный полипептид ORF2086 из Neisseria meningitidis серогруппы В.In one aspect, the invention relates to a method for generating a bacterial antibody against Neisseria meningitidis serogroup C in a mammal. The method includes administering to a mammal an effective amount of an immunogenic composition comprising an isolated, non-lipidated, non-pyruvilated ORF2086 polypeptide from Neisseria meningitidis serogroup B.
В одном варианте осуществления полипептид состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 71, или аминокислотной последовательности, выбранной из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21, в которой цистеин в позиции 1 делетирован. В другом варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 76. В еще одном варианте осуществления цистеин в позиции 1 полипептида делетирован. В еще одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 77.In one embodiment, the polypeptide consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 71 or an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21, in which the cysteine at
В одном варианте осуществления иммуногенная композиция также включает, по меньшей мере, один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135; и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.In one embodiment, the immunogenic composition also includes at least one conjugate selected from the group consisting of: a) Neisseria meningitidis serogroup A capsular saccharide conjugate; b) Neisseria meningitidis serogroup C capsular saccharide conjugate; c) Neisseria meningitidis serogroup W135 capsular saccharide conjugate; and d) Neisseria meningitidis serogroup Y capsular saccharide conjugate.
В одном аспекте изобретение касается способа выработки бактериального антитела против Neisseria meningitidis серогруппа Y у млекопитающего. Способ включает введение млекопитающему эффективного количества иммуногенной композиции, включающей выделенный нелипидированный, непирувилированный полипептид ORF2086 из Neisseria meningitidis серогруппы В.In one aspect, the invention relates to a method for generating a bacterial antibody against Neisseria meningitidis serogroup Y in a mammal. The method includes administering to a mammal an effective amount of an immunogenic composition comprising an isolated, non-lipidated, non-pyruvilated ORF2086 polypeptide from Neisseria meningitidis serogroup B.
В одном варианте осуществления полипептид состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 71, или аминокислотной последовательности, выбранной из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21, в которой цистеин в позиции 1 делетирован. В другом варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 76. В еще одном варианте осуществления цистеин в позиции 1 полипептида делетирован. В еще одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 77.In one embodiment, the polypeptide consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 71 or an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21, in which the cysteine at
В одном варианте осуществления иммуногенная композиция также включает, по меньшей мере, один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135; и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.In one embodiment, the immunogenic composition also includes at least one conjugate selected from the group consisting of: a) Neisseria meningitidis serogroup A capsular saccharide conjugate; b) Neisseria meningitidis serogroup C capsular saccharide conjugate; c) Neisseria meningitidis serogroup W135 capsular saccharide conjugate; and d) Neisseria meningitidis serogroup Y capsular saccharide conjugate.
В другом аспекте изобретение касается способа выработки бактериального антитела против Neisseria meningitidis у млекопитающего, включая введение млекопитающему эффективного количества иммуногенной композиции, включающей выделенный нелипидированный, непирувилированный полипептид ORF2086 из Neisseria meningitidis серогруппы В и по меньшей мере один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135; и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.In another aspect, the invention relates to a method for generating a bacterial antibody against Neisseria meningitidis in a mammal, comprising administering to the mammal an effective amount of an immunogenic composition comprising an isolated, non-lipidated, non-pyruvilated ORF2086 polypeptide from Neisseria meningitidis serogroup B and at least one conjugate selected from the group consisting of: a) Neisseria meningitidis serogroup A capsular saccharide conjugate; b) Neisseria meningitidis serogroup C capsular saccharide conjugate; c) Neisseria meningitidis serogroup W135 capsular saccharide conjugate; and d) Neisseria meningitidis serogroup Y capsular saccharide conjugate.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУРBRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
Фигура 1: Вариантные нуклеиновокислотные последовательности Р2086.Figure 1: Variant P2086 nucleic acid sequences.
Фигура 2: Вариантные аминокислотные последовательности Р2086. Ствол Gly/Ser в N-концевом хвосте каждого варианта подчеркнут.Figure 2: Variant amino acid sequences of P2086. The Gly/Ser stem in the N-terminal tail of each variant is underlined.
Фигура 3: Структура белка ORF2086Figure 3: ORF2086 protein structure
Фигура 4: Удаление N-концевого Cys в результате ведет к потере экспрессии в Е. coli.Figure 4: Removal of the N-terminal Cys results in loss of expression in E. coli.
Фигура 5: Влияние длины ствола Gly/Ser на экспрессию нелипидированного варианта ORF2086. Последовательность, ассоциированная с белком, обозначенным как В01, представлена в SEQ ID NO: 35. Последовательность, ассоциированная с белком, обозначенным как В44, представлена в SEQ ID NO: 36. Последовательность, ассоциированная с белком, обозначенным как А05, представлена в SEQ ID NO: 37. Последовательность, ассоциированная с белком, обозначенным как А22, представлена в SEQ ID NO: 38. Последовательность, ассоциированная с белком, обозначенным как В22, представлена в SEQ ID NO: 39. Последовательность, ассоциированная с белком, обозначенным как А19, представлена в SEQ ID NO: 40.Figure 5: Effect of Gly/Ser stem length on the expression of the non-lipidated ORF2086 variant. The sequence associated with the protein designated as B01 is shown in SEQ ID NO: 35. The sequence associated with the protein designated as B44 is shown in SEQ ID NO: 36. The sequence associated with the protein designated as A05 is shown in SEQ ID NO: 37. The sequence associated with the protein designated as A22 is shown in SEQ ID NO: 38. The sequence associated with the protein designated as B22 is shown in SEQ ID NO: 39. The sequence associated with the protein designated as A19, shown in SEQ ID NO: 40.
Фигура 6: Высокий уровень экспрессии нелипидированного В09, несмотря на короткий ствол Gly/Ser. Первые две полосы демонстрируют экспрессию N-концевого Cys-делетированного варианта В09 до и после индукции. Третья и четвертая полосы демонстрируют экспрессию N-концевого Cys-положительного варианта В09 до и после индукции. Крайняя правая полоса представляет стандарт молекулярной массы. Аминокислотная последовательность, показанная под изображением, представлена в SEQ ID NO: 41. Нуклеотидная последовательность, представляющая N-концевой Cys-делетированный вариант А22, указанный на фигуре как "А22_001", представлена в последовательности SEQ ID NO: 42, показанной на фигуре под SEQ ID NO: 41. Нуклеотидная последовательность, представляющая N-концевой Cys-делетированный вариант В22, указанный на фигуре как "В22 001", представлена в SEQ ID NO: 52. Нуклеотидная последовательность, представляющая N-концевой Cys-делетированный вариант В09, указанный на фигуре как "В09_004", представлена в SEQ ID NO: 53.Figure 6: High expression of non-lipidated B09 despite short Gly/Ser stem. The first two bands show the expression of the N-terminal Cys-deleted B09 variant before and after induction. The third and fourth lanes show the expression of the N-terminal Cys-positive B09 variant before and after induction. The rightmost bar represents the molecular weight standard. The amino acid sequence shown below is shown in SEQ ID NO: 41. The nucleotide sequence representing the N-terminal Cys-deleted variant of A22, shown as "A22_001" in the figure, is shown in SEQ ID NO: 42, shown in the figure below SEQ ID NO: 41. The nucleotide sequence representing the N-terminal Cys-deleted variant of B22, indicated in the figure as "
Фигура 7: Оптимизация ко донов повышает экспрессию нелипидированных вариантов В22 и А22. Слева показана экспрессия N-концевого Cys-делетированного варианта В22 до (полосы 1 и 3) и после (полосы 2 и 4) индукции IPTG. Справа показана экспрессия N-концевого Cys-делетированного варианта А22 до (полоса 7) и после (полоса 8) индукции IPTG. Полосы 5 и 6 представляют стандарты молекулярной массы.Figure 7: Codon optimization increases the expression of non-lipidated B22 and A22 variants. On the left is the expression of the N-terminal Cys-deleted B22 variant before (
Фигура 8: Вариантные нуклеиново- и аминокислотные последовательности Р2086Figure 8: Variant nucleic and amino acid sequences of P2086
Фигура 9А-9В: Выравнивание последовательности выбранных вариантов дикого типа подсемейств А и В fHBP, обсуждаемых в Примерах 15-19. Следует заметить, что N-конец А62 является на 100% идентичным В09, а его С-конец является на 100% идентичным А22. Показанными последовательностями являются А05 (SEQ ID NO: 13); А12 (SEQ ID NO: 14); A22 (SEQ ID NO: 15); A62 (SEQ ID NO: 70); B09 (SEQ ID NO: 18); B24 (SEQ ID NO: 20); и консенсусная последовательность (SEQ ID NO: 78).Figure 9A-9B: Sequence alignment of selected wild-type variants of fHBP subfamilies A and B discussed in Examples 15-19. It should be noted that the N-terminus of A62 is 100% identical to B09 and its C-terminus is 100% identical to A22. The sequences shown are A05 (SEQ ID NO: 13); A12 (SEQ ID NO: 14); A22 (SEQ ID NO: 15); A62 (SEQ ID NO: 70); B09 (SEQ ID NO: 18); B24 (SEQ ID NO: 20); and a consensus sequence (SEQ ID NO: 78).
ОПРЕДЕЛИТЕЛИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙSEQUENCE DETERMINERS
SEQ ID NO: 1 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант А04 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.SEQ ID NO: 1 represents the DNA sequence for N. meningitidis, serogroup B, variant A04 of gene 2086, which includes a codon encoding the N-terminal Cys.
SEQ ID NO: 2 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант А05 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.SEQ ID NO: 2 represents the DNA sequence for N. meningitidis, serogroup B, variant A05 of gene 2086, which includes a codon encoding the N-terminal Cys.
SEQ ID NO: 3 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант А12 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.SEQ ID NO: 3 shows the DNA sequence for N. meningitidis, serogroup B, variant A12 of gene 2086, which includes a codon encoding the N-terminal Cys.
SEQ ID NO: 4 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант А12-2 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.SEQ ID NO: 4 represents the DNA sequence for N. meningitidis, serogroup B, variant A12-2 of gene 2086, which includes a codon encoding the N-terminal Cys.
SEQ ID NO: 5 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант А22 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.SEQ ID NO: 5 shows the DNA sequence for N. meningitidis, serogroup B, variant A22 of gene 2086, which includes a codon encoding the N-terminal Cys.
SEQ ID NO: 6 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В02 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.SEQ ID NO: 6 shows the DNA sequence for N. meningitidis, serogroup B, variant B02 of gene 2086, which includes a codon encoding the N-terminal Cys.
SEQ ID NO: 7 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В03 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.SEQ ID NO: 7 shows the DNA sequence for N. meningitidis, serogroup B, variant B03 of gene 2086, which includes a codon encoding the N-terminal Cys.
SEQ ID NO: 8 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В09 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.SEQ ID NO: 8 shows the DNA sequence for N. meningitidis, serogroup B, variant B09 of gene 2086, which includes a codon encoding the N-terminal Cys.
SEQ ID NO: 9 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В22 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.SEQ ID NO: 9 shows the DNA sequence for N. meningitidis, serogroup B, variant B22 of gene 2086, which includes a codon encoding the N-terminal Cys.
SEQ ID NO: 10 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В24 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.SEQ ID NO: 10 shows the DNA sequence for N. meningitidis, serogroup B, variant B24 of gene 2086, which includes a codon encoding the N-terminal Cys.
SEQ ID NO: 11 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В44 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.SEQ ID NO: 11 shows the DNA sequence for N. meningitidis, serogroup B, variant B44 of gene 2086, which includes a codon encoding the N-terminal Cys.
SEQ ID NO: 12 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А04, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.SEQ ID NO: 12 provides the amino acid sequence for N. meningitidis, serogroup B, 2086, variant A04, which includes the N-terminal Cys at
SEQ ID NO: 13 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А05, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.SEQ ID NO: 13 provides the amino acid sequence for N. meningitidis, serogroup B, 2086, variant A05, which includes the N-terminal Cys at
SEQ ID NO: 14 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А12, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.SEQ ID NO: 14 provides the amino acid sequence for N. meningitidis serogroup B, 2086 variant A12 which includes the N-terminal Cys at
SEQ ID NO: 15 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А22, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.SEQ ID NO: 15 provides the amino acid sequence for N. meningitidis, serogroup B, 2086, variant A22, which includes the N-terminal Cys at
SEQ ID NO: 16 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В02, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.SEQ ID NO: 16 provides the amino acid sequence for N. meningitidis serogroup B, 2086 variant B02, which includes the N-terminal Cys at
SEQ ID NO: 17 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В03, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.SEQ ID NO: 17 provides the amino acid sequence for N. meningitidis, serogroup B, 2086, variant B03, which includes the N-terminal Cys at
SEQ ID NO: 18 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В09, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.SEQ ID NO: 18 provides the amino acid sequence for N. meningitidis serogroup B, 2086 variant B09 which includes the N-terminal Cys at
SEQ ID NO: 19 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В22, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.SEQ ID NO: 19 provides the amino acid sequence for N. meningitidis, serogroup B, 2086, variant B22, which includes the N-terminal Cys at
SEQ ID NO: 20 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В24, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.SEQ ID NO: 20 provides the amino acid sequence for N. meningitidis, serogroup B, 2086, variant B24, which includes the N-terminal Cys at
SEQ ID NO: 21 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В44, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.SEQ ID NO: 21 provides the amino acid sequence for N. meningitidis, serogroup B, 2086, variant B44, which includes the N-terminal Cys at
SEQ ID NO: 22 представляет последовательность ДНК для прямого праймера, показанную в Примере 2.SEQ ID NO: 22 represents the DNA sequence for the forward primer shown in Example 2.
SEQ ID NO: 23 представляет последовательность ДНК для обратного праймера, показанную в Примере 2.SEQ ID NO: 23 is the reverse primer DNA sequence shown in Example 2.
SEQ ID NO: 24 представляет последовательность ДНК для прямого праймера, показанную в Примере 2, Таблица 1.SEQ ID NO: 24 represents the DNA sequence for the forward primer shown in Example 2, Table 1.
SEQ ID NO: 25 представляет последовательность ДНК для обратного праймера, показанную в Примере 2, Таблица 1.SEQ ID NO: 25 represents the DNA sequence for the reverse primer shown in Example 2, Table 1.
SEQ ID NO: 26 представляет последовательность ДНК для прямого праймера, показанную в Примере 2, Таблица 1.SEQ ID NO: 26 represents the DNA sequence for the forward primer shown in Example 2, Table 1.
SEQ ID NO: 27 представляет последовательность ДНК для обратного праймера, показанную в Примере 2, Таблица 1.SEQ ID NO: 27 represents the DNA sequence for the reverse primer shown in Example 2, Table 1.
SEQ ID NO: 28 представляет последовательность ДНК для ствола Gly/Ser, показанную в Примере 4.SEQ ID NO: 28 represents the DNA sequence for the Gly/Ser stem shown in Example 4.
SEQ ID NO: 29 представляет аминокислотную последовательность для ствола Gly/Ser, показанную в Примере 4, которая кодируется, например, SEQ ID NO: 28.SEQ ID NO: 29 represents the Gly/Ser stem amino acid sequence shown in Example 4, which is encoded for example by SEQ ID NO: 28.
SEQ ID NO: 30 представляет последовательность ДНК для ствола Gly/Ser, показанную в Примере 4.SEQ ID NO: 30 represents the DNA sequence for the Gly/Ser stem shown in Example 4.
SEQ ID NO: 31 представляет аминокислотную последовательность а Ствол Gly/Ser, показанную в Примере 4, которая кодируется, например, SEQ ID NO: 30.SEQ ID NO: 31 represents the amino acid sequence a Gly/Ser stem shown in Example 4, which is encoded by, for example, SEQ ID NO: 30.
SEQ ID NO: 32 представляет последовательность ДНК для ствола Gly/Ser, показанную в Примере 4.SEQ ID NO: 32 represents the DNA sequence for the Gly/Ser stem shown in Example 4.
SEQ ID NO: 33 представляет аминокислотную последовательность для ствола Gly/Ser, которая кодируется, например, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 34.SEQ ID NO: 33 represents the amino acid sequence for the Gly/Ser stem, which is encoded by, for example, SEQ ID NO: 32 and SEQ ID NO: 34.
SEQ ID NO: 34 представляет последовательность ДНК для ствола Gly/Ser, показанную в Примере 4.SEQ ID NO: 34 represents the DNA sequence for the Gly/Ser stem shown in Example 4.
SEQ ID NO: 35 представляет аминокислотную последовательность для N-конца N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В01, показанную на Фигуре 5.SEQ ID NO: 35 provides the amino acid sequence for the N-terminus of N. meningitidis, serogroup B, 2086, variant B01 shown in Figure 5.
SEQ ID NO: 36 представляет аминокислотную последовательность для N-конца N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В44, показанную на Фигуре 5.SEQ ID NO: 36 provides the amino acid sequence for the N-terminus of N. meningitidis, serogroup B, 2086, variant B44 shown in Figure 5.
SEQ ID NO: 37 представляет аминокислотную последовательность для N-конца N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А05, показанную на Фигуре 5.SEQ ID NO: 37 provides the amino acid sequence for the N-terminus of N. meningitidis, serogroup B, 2086, variant A05 shown in Figure 5.
SEQ ID NO: 38 представляет аминокислотную последовательность для N-конца N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А22, показанную на Фигуре 5.SEQ ID NO: 38 provides the amino acid sequence for the N-terminus of N. meningitidis, serogroup B, 2086, variant A22 shown in Figure 5.
SEQ ID NO: 39 представляет аминокислотную последовательность для N-конца N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В22, показанную на Фигуре 5.SEQ ID NO: 39 provides the amino acid sequence for the N-terminus of N. meningitidis, serogroup B, 2086, variant B22 shown in Figure 5.
SEQ ID NO: 40 представляет аминокислотную последовательность для N-конца N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А19, показанную на Фигуре 5.SEQ ID NO: 40 provides the amino acid sequence for the N-terminus of N. meningitidis serogroup B, 2086 variant A19 shown in Figure 5.
SEQ ID NO: 41 представляет аминокислотную последовательность для N-конца а N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант, показанную на Фигуре 6.SEQ ID NO: 41 represents the amino acid sequence for the N-terminus of a N. meningitidis, serogroup B, 2086 variant shown in Figure 6.
SEQ ID NO: 42 представляет последовательность ДНК для N-конца N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А22, показанную на Фигуре 6.SEQ ID NO: 42 represents the DNA sequence for the N-terminus of N. meningitidis, serogroup B, 2086, variant A22 shown in Figure 6.
SEQ ID NO: 43 представляет кодон-оптимизированную последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В44 гена 2086, в которой кодон, кодирующий N-концевой цистеин, делетирован по сравнению с SEQ ID NO: 11. Плазмида pDK087 включает SEQ ID NO: 43.SEQ ID NO: 43 represents a codon-optimized DNA sequence for N. meningitidis, serogroup B, variant B44 of gene 2086, in which the codon encoding the N-terminal cysteine is deleted compared to SEQ ID NO: 11. Plasmid pDK087 includes SEQ ID NO :43.
SEQ ID NO: 44 представляет аминокислотную последовательность для нелипидированной N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В44. SEQ ID NO: 44 идентична SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 21 делетирован. SEQ ID 44 кодируется, например, SEQ ID NO: 43.SEQ ID NO: 44 shows the amino acid sequence for non-lipidated N. meningitidis, serogroup B, 2086, variant B44. SEQ ID NO: 44 is identical to SEQ ID NO: 21 in which the N-terminal cysteine at
SEQ ID NO: 45 представляет кодон-оптимизированную последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В09 гена 2086, в которой кодон, кодирующий N-концевой цистеин, делетирован, и последовательность включает кодоны, кодирующие дополнительную область Gly/Ser, по сравнению с SEQ ID NO: 8. Плазмида рЕВ063 включает SEQ ID NO: 45.SEQ ID NO: 45 shows the codon-optimized DNA sequence for N. meningitidis, serogroup B, variant B09 of gene 2086, in which the codon encoding the N-terminal cysteine is deleted and the sequence includes codons encoding the additional Gly/Ser region compared with SEQ ID NO: 8. Plasmid pEB063 includes SEQ ID NO: 45.
SEQ ID NO: 46 представляет кодон-оптимизированную последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В09 гена 2086, в которой кодон, кодирующий N-концевой цистеин, делетирован по сравнению с SEQ ID NO: 8. Плазмида рЕВ064 включает SEQ ID NO: 46.SEQ ID NO: 46 represents the codon-optimized DNA sequence for N. meningitidis, serogroup B, variant B09 of gene 2086, in which the codon encoding the N-terminal cysteine is deleted compared to SEQ ID NO: 8. Plasmid pEB064 includes SEQ ID NO :46.
SEQ ID NO: 47 представляет кодон-оптимизированную последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В09 гена 2086, в которой кодон, кодирующий N-концевой цистеин, делетирован по сравнению с SEQ ID NO: 8. Плазмида рЕВ065 включает SEQ ID NO: 47.SEQ ID NO: 47 represents a codon-optimized DNA sequence for N. meningitidis, serogroup B, variant B09 of gene 2086, in which the codon encoding the N-terminal cysteine is deleted compared to SEQ ID NO: 8. Plasmid pEB065 includes SEQ ID NO :47.
SEQ ID NO: 48 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В09 гена 2086, в которой кодон, кодирующий N-концевой цистеин, делетирован по сравнению с SEQ ID NO: 8. Плазмида pLA134 включает SEQ ID NO: 48.SEQ ID NO: 48 represents the DNA sequence for N. meningitidis, serogroup B, variant B09 of gene 2086, in which the codon encoding the N-terminal cysteine is deleted compared to SEQ ID NO: 8. Plasmid pLA134 includes SEQ ID NO: 48.
SEQ ID NO: 49 представляет аминокислотную последовательность для нелипидированной N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В09. SEQ ID NO: 49 идентична SEQ ID NO: 18, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 18 делетирован. SEQ ID 49 кодируется, например, последовательностью ДНК, выбранной из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 и SEQ ID NO: 48.SEQ ID NO: 49 shows the amino acid sequence for non-lipidated N. meningitidis, serogroup B, 2086, variant B09. SEQ ID NO: 49 is identical to SEQ ID NO: 18, in which the N-terminal cysteine at
SEQ ID NO: 50 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В09, в которой кодон, кодирующий N-концевой цистеин, делетирован и последовательность включает кодоны, кодирующие дополнительную область Gly/Ser, по сравнению с SEQ ID NO: 18. SEQ ID NO: 50 кодируется, например, SEQ ID NO: 45.SEQ ID NO: 50 represents the amino acid sequence for N. meningitidis, serogroup B, 2086, variant B09, in which the codon encoding the N-terminal cysteine is deleted and the sequence includes codons encoding the additional Gly/Ser region compared to SEQ ID NO : 18. SEQ ID NO: 50 is encoded, for example, SEQ ID NO: 45.
SEQ ID NO: 51 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В44 гена 2086, в которой кодон, кодирующий N-концевой цистеин, делетирован по сравнению с SEQ ID NO: 11. Плазмида pLN056 включает SEQ ID NO: 51.SEQ ID NO: 51 represents the DNA sequence for N. meningitidis, serogroup B, variant B44 of gene 2086, in which the codon encoding the N-terminal cysteine is deleted compared to SEQ ID NO: 11. Plasmid pLN056 includes SEQ ID NO: 51.
SEQ ID NO: 52 представляет последовательность ДНК для N-конца N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В22, показанную на Фигуре 6.SEQ ID NO: 52 represents the DNA sequence for the N-terminus of N. meningitidis, serogroup B, 2086, variant B22 shown in Figure 6.
SEQ ID NO: 53 представляет последовательность ДНК для N-конца N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В09, показанную на Фигуре 6.SEQ ID NO: 53 shows the DNA sequence for the N-terminus of N. meningitidis, serogroup B, 2086, variant B09 shown in Figure 6.
SEQ ID NO: 54 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант А05 гена 2086, в которой кодон, кодирующий N-концевой цистеин, делетирован по сравнению с SEQ ID NO: 2.SEQ ID NO: 54 represents the DNA sequence for N. meningitidis, serogroup B, variant A05 of gene 2086, in which the codon encoding the N-terminal cysteine is deleted compared to SEQ ID NO: 2.
SEQ ID NO: 55 представляет аминокислотную последовательность для нелипидированной N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А05. SEQ ID NO: 55 идентична SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 13 делетирован. SEQ ID NO: 55 кодируется, например, SEQ ID NO: 54.SEQ ID NO: 55 represents the amino acid sequence for non-lipidated N. meningitidis, serogroup B, 2086, variant A05. SEQ ID NO: 55 is identical to SEQ ID NO: 13 in which the N-terminal cysteine at
SEQ ID NO: 56 представляет аминокислотную последовательность серино-глициновой последовательности повтора, как показано в Примере 7.SEQ ID NO: 56 shows the amino acid sequence of the serino-glycine repeat sequence as shown in Example 7.
SEQ ID NO: 57 представляет аминокислотную последовательность для нелипидированной N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В01. SEQ ID NO: 57 идентична SEQ ID NO: 58, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 58 делетирован.SEQ ID NO: 57 shows the amino acid sequence for non-lipidated N. meningitidis, serogroup B, 2086, variant B01. SEQ ID NO: 57 is identical to SEQ ID NO: 58, in which the N-terminal cysteine at
SEQ ID NO: 58 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В01, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.SEQ ID NO: 58 provides the amino acid sequence for N. meningitidis, serogroup B, 2086, variant B01, which includes the N-terminal Cys at
SEQ ID NO: 59 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В15, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.SEQ ID NO: 59 provides the amino acid sequence for N. meningitidis, serogroup B, 2086, variant B15, which includes the N-terminal Cys at
SEQ ID NO: 60 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В16, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.SEQ ID NO: 60 provides the amino acid sequence for N. meningitidis, serogroup B, 2086, variant B16, which includes the N-terminal Cys at
SEQ ID NO: 61 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В22, в которой кодон для N-концевого Cys в аминокислотной позиции 1 SEQ ID NO: 19 заменен на кодон для глицина.SEQ ID NO: 61 represents the DNA sequence for N. meningitidis, serogroup B, 2086, variant B22, in which the codon for N-terminal Cys at
SEQ ID NO: 62 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В22, в которой N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1 SEQ ID NO: 19 заменен на глицин.SEQ ID NO: 62 represents the amino acid sequence for N. meningitidis, serogroup B, 2086, variant B22, in which the N-terminal Cys at
SEQ ID NO: 63 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А22, в которой кодон для N-концевого Cys в аминокислотной позиции 1 SEQ ID NO: 15 заменен на кодон для глицина.SEQ ID NO: 63 represents the DNA sequence for N. meningitidis, serogroup B, 2086, variant A22, in which the codon for N-terminal Cys at
SEQ ID NO: 64 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А22, в которой N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1 SEQ ID NO: 15 заменен на глицин.SEQ ID NO: 64 represents the amino acid sequence for N. meningitidis, serogroup B, 2086, variant A22, in which the N-terminal Cys at
SEQ ID NO: 65 представляет кодон-оптимизированную последовательность ДНК (рЕВ042), кодирующую нелипидированный, непирувилированный полипептид А05.SEQ ID NO: 65 shows a codon-optimized DNA sequence (pEB042) encoding a non-lipidated, non-pyruvilated A05 polypeptide.
SEQ ID NO: 66 представляет аминокислотную последовательность для нелипидированной N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А12. SEQ ID NO: 66 идентична SEQ ID NO: 14, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 14 делетирован. SEQ ID NO: 66 кодируется, например, SEQ ID NO: 67.SEQ ID NO: 66 represents the amino acid sequence for non-lipidated N. meningitidis, serogroup B, 2086, variant A12. SEQ ID NO: 66 is identical to SEQ ID NO: 14, in which the N-terminal cysteine at
SEQ ID NO: 67 представляет кодон-оптимизированную последовательность ДНК для нелипидированного, непирувилированного полипептида А12.SEQ ID NO: 67 provides a codon-optimized DNA sequence for a non-lipidated, non-pyruvilated A12 polypeptide.
SEQ ID NO: 68 представляет аминокислотную последовательность для нелипидированной N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А22. SEQ ID NO: 68 идентична SEQ ID NO: 15, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 15 делетирован. SEQ ID NO: 68 кодируется, например, SEQ ID NO: 69.SEQ ID NO: 68 shows the amino acid sequence for non-lipidated N. meningitidis, serogroup B, 2086, variant A22. SEQ ID NO: 68 is identical to SEQ ID NO: 15, in which the N-terminal cysteine at
SEQ ID NO: 69 представляет кодон-оптимизированную последовательность ДНК для нелипидированного, непирувилированного полипептида А22.SEQ ID NO: 69 shows the codon-optimized DNA sequence for the non-lipidated, non-pyruvilated A22 polypeptide.
SEQ ID NO: 70 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis серогруппа В, 2086, вариант А62, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.SEQ ID NO: 70 provides the amino acid sequence for N. meningitidis serogroup B, 2086, variant A62, which includes the N-terminal Cys at
SEQ ID NO: 71 представляет аминокислотную последовательность для нелипидированной N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А62. SEQ ID NO: 71 идентична SEQ ID NO: 70, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 70 делетирован.SEQ ID NO: 71 shows the amino acid sequence for non-lipidated N. meningitidis, serogroup B, 2086, variant A62. SEQ ID NO: 71 is identical to SEQ ID NO: 70, in which the N-terminal cysteine at
SEQ ID NO: 72 представляет кодон-оптимизированную последовательность ДНК для SEQ ID NO: 71.SEQ ID NO: 72 represents the codon-optimized DNA sequence for SEQ ID NO: 71.
SEQ ID NO: 73 представляет кодон-оптимизированную последовательность ДНК (pDK086) для N. meningitidis, серогруппа В, вариант А05 гена 2086, в которой кодон, кодирующий N-концевой цистеин, делетирован по сравнению с SEQ ID NO: 2.SEQ ID NO: 73 shows the codon-optimized DNA sequence (pDK086) for N. meningitidis, serogroup B, variant A05 of gene 2086, in which the codon encoding the N-terminal cysteine is deleted compared to SEQ ID NO: 2.
SEQ ID NO: 74 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А29, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.SEQ ID NO: 74 provides the amino acid sequence for N. meningitidis, serogroup B, 2086, variant A29, which includes the N-terminal Cys at
SEQ ID NO: 75 представляет аминокислотную последовательность для нелипидированной N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В22. SEQ ID NO: 75 идентична SEQ ID NO: 19, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 19 делетирован.SEQ ID NO: 75 represents the amino acid sequence for non-lipidated N. meningitidis, serogroup B, 2086, variant B22. SEQ ID NO: 75 is identical to SEQ ID NO: 19 in which the N-terminal cysteine at
SEQ ID NO: 76 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А05.SEQ ID NO: 76 represents the amino acid sequence for N. meningitidis, serogroup B, 2086, variant A05.
SEQ ID NO: 77 представляет аминокислотную последовательность для нелипидированной N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А05. SEQ ID NO: 77 идентична SEQ ID NO: 19, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 76 отсутствует.SEQ ID NO: 77 shows the amino acid sequence for non-lipidated N. meningitidis, serogroup B, 2086, variant A05. SEQ ID NO: 77 is identical to SEQ ID NO: 19, in which the N-terminal cysteine at
SEQ ID NO: 78 представляет аминокислотную последовательность для консенсусной последовательности, показанной на ФИГ. 9А-9В.SEQ ID NO: 78 represents the amino acid sequence for the consensus sequence shown in FIG. 9A-9B.
SEQ ID NO: 79 идентична SEQ ID NO: 78, за исключением того, что Cys в позиции 1 SEQ ID NO: 78 отсутствует.SEQ ID NO: 79 is identical to SEQ ID NO: 78 except that there is no Cys at
SEQ ID NO: 80 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В24. SEQ ID NO: 80 идентична SEQ ID NO: 20, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 20 делетирован.SEQ ID NO: 80 represents the amino acid sequence for N. meningitidis, serogroup B, 2086, variant B24. SEQ ID NO: 80 is identical to SEQ ID NO: 20, in which the N-terminal cysteine at
SEQ ID NO: 81 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В24. SEQ ID NO: 81 идентична SEQ ID NO: 20, в которой остатки в позициях 1-3 SEQ ID NO: 20 делетированы.SEQ ID NO: 81 represents the amino acid sequence for N. meningitidis, serogroup B, 2086, variant B24. SEQ ID NO: 81 is identical to SEQ ID NO: 20, in which the residues at positions 1-3 of SEQ ID NO: 20 are deleted.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Если нет иного определения, все применяемые авторами технические и научные термины имеют такие же значения, общепринятые среди специалистов в области, к которой относится это изобретение. Хотя при практическом осуществлении или испытании настоящего изобретения могут применяться способы и материалы, подобные или равноценные описываемым авторами, приемлемые способы и материалы описываются ниже. Материалы, способы и примеры являются лишь иллюстративными и не должны рассматриваться как ограничительные. Все публикации, патенты и другие упомянутые авторами документы включены путем ссылки в их полном объеме.Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used by the authors have the same meanings generally accepted among specialists in the field to which this invention relates. Although methods and materials similar or equivalent to those described by the authors may be used in the practice or testing of the present invention, acceptable methods and materials are described below. The materials, methods, and examples are illustrative only and should not be construed as limiting. All publications, patents and other documents cited by the authors are incorporated by reference in their entirety.
ОпределенияDefinitions
Термин "антиген" в целом касается биологической молекулы, как правило, белка, пептида, полисахарида, липида или конъюгата, который содержит по меньшей мере один эпитоп, с которым может быть выборочно связано родственное антитело; или, в некоторых случаях, иммуногенного вещества, которое может стимулировать выработку антител или вызывать Т-клеточные иммунные реакции, или и то, и другое, в организме животного, включая композиции, вводимые путем инъекции или абсорбируемые организмом животного. Иммунная реакция может быть вызвана для всей молекулы или для одной или нескольких разных частей молекулы (например, эпитопа или гаптена). Этот термин может применяться по отношению к отдельной молекуле или к гомогенной или гетерогенной популяции антигенных молекул. Антиген распознается антителами, Т-клеточными рецепторами или другими элементами специфического гуморального и/или клеточного иммунитета. Термин "антиген" включает все соответствующие антигенные эпитопы. Эпитопы данного антигена могут быть распознаны с применением любого количества способов картирования эпитопов, хорошо известных среди специалистов в данной области. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, N. J. Например, линейные эпитопы могут определяться путем одновременного синтезирования большого количества пептидов на твердых подложках, пептидов, соответствующих частям молекулы белка, и приведения пептидов в реакцию с антителами, пока пептиды остаются прикрепленными к подложкам. Такие технологии известны специалистам в данной области и описываются, например, в Патенте США №4,708,871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23: 709-715, которые включены в данное описание путем ссылки в полном объеме. Подобным образом конформационные эпитопы могут распознаваться путем определения пространственной конформации аминокислот, например, при помощи рентгеновской кристаллографии и двумерного ядерного магнитного резонанса. См., например, Epitope Mapping Protocols, выше. Кроме того, в контексте настоящего изобретения термин "антиген" также может применяться по отношению к белку, включающему модификации, такие, как делеции, добавления и замещения (как правило, консервативного характера, хотя они могут быть и неконсервативными) в природной последовательности, при условии, что белок сохраняет способность к вызыванию иммунологической реакции. Эти модификации могут быть преднамеренными, например, путем сайт-специфического мутагенеза или с применением конкретных процедур синтеза или при помощи генной инженерии, или же могут быть случайными, например, при мутации хозяев, вырабатывающих антигены. Кроме того, антиген может быть извлечен, получен или выделен из микроба, например, бактерии, или может быть целым организмом. Подобным образом определение также включает олигонуклеотид или полинуклеотид, экспрессирующий антиген, например, при иммунизации нуклеиновой кислотой. Также включаются синтетические антигены, например, полиэпитопы, фланкирующие эпитопы и другие рекомбинантные или синтетически полученные антигены (Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23: 2777-2781; Bergmann et al. (1996) J. Immunol. 157: 3242-3249; Suhrbier, A. (1997) Immunol, and Cell Biol. 75: 402-408; Gardner et al. (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, Jun. 28-Jul. 3, 1998).The term "antigen" generally refers to a biological molecule, typically a protein, peptide, polysaccharide, lipid, or conjugate, that contains at least one epitope to which a related antibody can be selectively linked; or, in some cases, an immunogenic substance that can stimulate the production of antibodies or induce T-cell immune responses, or both, in an animal body, including compositions administered by injection or absorbed by the animal body. An immune response may be elicited for the entire molecule, or for one or more different parts of the molecule (eg, epitope or hapten). The term may refer to a single molecule or to a homogeneous or heterogeneous population of antigenic molecules. The antigen is recognized by antibodies, T-cell receptors, or other elements of specific humoral and/or cellular immunity. The term "antigen" includes all relevant antigenic epitopes. Epitopes of a given antigen can be recognized using any of a number of epitope mapping methods well known to those skilled in the art. See, for example, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, N. J. For example, linear epitopes can be determined by simultaneously synthesizing a large number of peptides on solid supports, peptides corresponding to portions of a protein molecule, and reacting the peptides with antibodies until the peptides remain attached to the supports. Such technologies are known to those skilled in the art and are described, for example, in US Patent No. 4,708,871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. sci. USA 81: 3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23: 709-715, which are incorporated herein by reference in their entirety. Similarly, conformational epitopes can be recognized by determining the spatial conformation of amino acids, for example, using x-ray crystallography and two-dimensional nuclear magnetic resonance. See, for example, Epitope Mapping Protocols, supra. In addition, in the context of the present invention, the term "antigen" can also be used in relation to a protein that includes modifications such as deletions, additions and substitutions (generally conservative in nature, although they may be non-conservative) in the natural sequence, provided that the protein retains the ability to elicit an immunological response. These modifications may be intentional, eg, by site-directed mutagenesis, or using specific synthetic procedures or genetic engineering, or may be accidental, eg, by mutation of antigen-producing hosts. In addition, the antigen may be extracted, derived or isolated from a microbe, such as a bacterium, or may be an entire organism. Similarly, the definition also includes an oligonucleotide or polynucleotide expressing an antigen, for example, upon immunization with a nucleic acid. Synthetic antigens are also included, for example, polyepitopes, flanking epitopes, and other recombinant or synthetically derived antigens (Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23: 2777-2781; Bergmann et al. (1996) J. Immunol. 157 : 3242-3249; Suhrbier, A. (1997) Immunol, and Cell Biol 75: 402-408; Gardner et al. (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, Jun. 28-Jul. 3, 1998) .
Термин "консервативные" по отношению к аминокислотным замещениям может применяться на основе сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатического характера задействованных остатков. Например, к неполярным (гидрофобным) аминокислотам относятся аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, триптофан и метионин; к полярным/нейтральным аминокислотам относятся глицин, серии, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин; к положительно заряженным (основным) аминокислотам относятся аргинин, лизин и гистидин; и к отрицательно заряженным (кислотным) аминокислотам относятся аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота. В некоторых вариантах осуществления изменения консервативной аминокислоты меняют первичную последовательность полипептидов ORF2086, но не меняют функцию молекулы. При создании этих мутантов может учитываться индекс гидропатичности аминокислот. Значение индекса гидропатичности аминокислот в обеспечении интерактивной биологической функции на полипептиде в целом осознается специалистами в данной области (Kyte & Doolittle, 1982, J. Mol. Biol., 157(1): 105-32). Известно, что некоторые аминокислоты могут быть замещены другими аминокислотами, имеющими подобный индекс или показатель гидропатичности, и образуемый в результате полипептид все равно обладает подобной биологической активностью. Каждая аминокислота получает свой индекс гидропатичности на основе ее гидрофобности и характеристик заряда. Их показатели таковы: изолейцин (+4,5); валин (+4,2); лейцин (+3,8); фенилаланин (+2,8); цистеин/цистин (+2,5); метионин (+1,9); аланин (+1,8); глицин (-0,4); треонин (-0,7); серии (-0,8); триптофан (-0,9); тирозин (-1,3); пролин (-1,6); гистидин (-3,2); глутамат (-3.5); глутамин (-3.5); аспартат (-3,5); аспарагин (-3,5); лизин (-3.9); и аргинин (-4,5).The term "conservative" with respect to amino acid substitutions may be applied based on the similarity of polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and/or amphipathic nature of the residues involved. For example, non-polar (hydrophobic) amino acids include alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, tryptophan, and methionine; polar/neutral amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine; positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine and histidine; and negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid. In some embodiments, the conservative amino acid changes change the primary sequence of the ORF2086 polypeptides but do not change the function of the molecule. When creating these mutants, the hydropathic index of amino acids can be taken into account. The importance of the amino acid hydropathic index in providing interactive biological function to the polypeptide as a whole is recognized by those skilled in the art (Kyte & Doolittle, 1982, J. Mol. Biol., 157(1): 105-32). It is known that certain amino acids can be substituted with other amino acids having a similar index or hydropathic index and the resulting polypeptide still has similar biological activity. Each amino acid receives its hydropathic index based on its hydrophobicity and charge characteristics. Their indicators are as follows: isoleucine (+4.5); valine (+4.2); leucine (+3.8); phenylalanine (+2.8); cysteine/cystine (+2.5); methionine (+1.9); alanine (+1.8); glycine (-0.4); threonine (-0.7); series (-0.8); tryptophan (-0.9); tyrosine (-1.3); proline (-1.6); histidine (-3.2); glutamate (-3.5); glutamine (-3.5); aspartate (-3.5); asparagine (-3.5); lysine (-3.9); and arginine (-4.5).
Считается, что относительный гидропатический характер аминокислотного остатка определяет вторичную и третичную структуру образуемого в результате полипептида, которая, в свою очередь, определяет взаимодействие полипептида с другими молекулами, такими, как ферменты, субстраты, рецепторы, антитела, антигены и т.п. Специалистам в данной области известно, что аминокислота может быть замещена другой аминокислотой, имеющей подобный индекс гидропатичности, и при этом может быть получен функционально равноценный полипептид. При таких изменениях предпочтение отдается замещению аминокислот, индексы гидропатичности которых находятся в пределах +1-2, особенно предпочтительно - в пределах +/-1, и еще более предпочтительно - в пределах +/-0,5.The relative hydropathic nature of the amino acid residue is believed to determine the secondary and tertiary structure of the resulting polypeptide, which in turn determines the interaction of the polypeptide with other molecules such as enzymes, substrates, receptors, antibodies, antigens, and the like. It is known to those skilled in the art that an amino acid can be substituted with another amino acid having a similar hydropathic index and a functionally equivalent polypeptide can be obtained. With such changes, preference is given to replacing amino acids whose hydropathic indices are in the range of +1-2, particularly preferably in the range of +/-1, and even more preferably in the range of +/-0.5.
Консервативные аминокислотные замещения или вставки также могут осуществляться на основе гидрофильности. Как описывается в Патенте США №4,554,101, включенном в данное описание путем ссылки, наибольшая локальная средняя гидрофильность полипептида, определяемая гидрофильностью прилегающих к нему аминокислот, коррелирует с иммуногенностью и антигенностью, т.е., с биологическими свойствами полипептида. В Патенте США №4,554,101 указывается, что аминокислотные остатки имеют следующие показатели гидрофильности: аргинин (+3,0); лизин (+3,0); аспартат (+3,0±1); глутамат (+3,0±1); серии (+0,3); аспарагин (+0,2); глутамин (+0,2); глицин (0); пролин (-0,5+1); треонин (-0,4); аланин (-0,5); гистидин (-0,5); цистеин (-1,0); метионин (-1,3); валин (-1,5); лейцин (-1,8); изолейцин (-1,8); тирозин (-2,3); фенилаланин (-2,5); триптофан (-3,4). Следует понимать, что аминокислота может быть замещена другой, имеющей подобный показатель гидрофильное™, и при этом может быть получен биологически равноценный, в частности, иммунологически равноценный полипептид. При таких изменениях предпочтительными являются замещения аминокислот, показатели гидрофильное™ которых находятся в пределах ±2; особенно предпочтительно - в пределах ±1; и еще более предпочтительно - в пределах ±0,5. Типичные замещения, при которых учитываются разные из вышеуказанных характеристик, хорошо известны специалистам в данной области, и к ним, помимо прочих, относятся: аргинин и лизин; глутамат и аспартат; серии и треонин; глутамин и аспарагин; и валин, лейцин и изолейцин.Conservative amino acid substitutions or insertions can also be based on hydrophilicity. As described in US Patent No. 4,554,101, incorporated herein by reference, the greatest local average hydrophilicity of the polypeptide, determined by the hydrophilicity of adjacent amino acids, correlates with immunogenicity and antigenicity, i.e., with the biological properties of the polypeptide. US Patent No. 4,554,101 states that amino acid residues have the following hydrophilicity values: arginine (+3.0); lysine (+3.0); aspartate (+3.0±1); glutamate (+3.0±1); series (+0.3); asparagine (+0.2); glutamine (+0.2); glycine (0); proline (-0.5+1); threonine (-0.4); alanine (-0.5); histidine (-0.5); cysteine (-1.0); methionine (-1.3); valine (-1.5); leucine (-1.8); isoleucine (-1.8); tyrosine (-2.3); phenylalanine (-2.5); tryptophan (-3.4). It should be understood that an amino acid may be substituted with another having a similar hydrophilic™ index and a biologically equivalent, in particular immunologically equivalent, polypeptide may be obtained. With such changes, amino acid substitutions are preferred, the hydrophilic values of which are within ± 2; especially preferably within ±1; and even more preferably within ±0.5. Representative substitutions that take into account different of the above characteristics are well known to those skilled in the art and include, but are not limited to: arginine and lysine; glutamate and aspartate; series and threonine; glutamine and asparagine; and valine, leucine and isoleucine.
Термин "эффективное иммуногенное количество" в контексте данного описания означает количество полипептида или композиции, включающей полипептид, которое является эффективным для вызывания иммунной реакции у хозяина - позвоночного. Например, эффективное иммуногенное количество белка rLP2086 согласно этому изобретению означает количество, которое является эффективным при вызывании иммунной реакции у хозяина - позвоночного. Конкретная "эффективная иммуногенная доза или количество" зависит от возраста, массы и медицинского состояния хозяина, а также от способа введения. Соответствующие дозы легко определяются специалистами в данной области.The term "effective immunogenic amount" as used herein means an amount of a polypeptide or a composition comprising a polypeptide that is effective to elicit an immune response in a vertebrate host. For example, an effective immunogenic amount of the rLP2086 protein of this invention means an amount that is effective in eliciting an immune response in a vertebrate host. The specific "effective immunogenic dose or amount" depends on the age, weight, and medical condition of the host, as well as the route of administration. Appropriate doses are readily determined by those skilled in the art.
Термин "ствол Gly/Ser" в контексте данного описания означает ряд остатков Gly и Ser непосредственно после N-концевого Cys остатка белка, кодируемого ORF2086. В стволе Gly/Ser может существовать от 5 до 12 остатков Gly и Ser. Соответственно, ствол Gly/Ser состоит из аминокислот от 2 до 7-13 белка, кодируемого ORF2086. Предпочтительно ствол Gly/Ser состоит из аминокислот от 2 до 7-13 белка, кодируемого ORF2086. Стволы Gly/Ser вариантов Р2086 согласно настоящему изобретению представлены подчеркнутыми последовательностями на Фигуре 2 (SEQ ID NO: 12-21). Как показано авторами, длина ствола Gly/Ser может влиять на устойчивость уровня экспрессии нелипидированного варианта Р2086. В типичном варианте осуществления эффект от влияния на длину ствола Gly/Ser сравнивают с показателями соответствующего варианта дикого типа.The term "trunk Gly/Ser" in the context of this description means a number of Gly and Ser residues immediately after the N-terminal Cys residue of the protein encoded by ORF2086. The Gly/Ser stem can contain from 5 to 12 Gly and Ser residues. Accordingly, the Gly/Ser stem consists of
Термин "иммуногенный" относится к способности антигена или вакцины к вызыванию иммунной реакции, гуморальной или клеточно-опосредованной, или обоих типов.The term "immunogenic" refers to the ability of an antigen or vaccine to elicit an immune response, humoral or cell mediated, or both.
Термины "иммуногенное количество" или "иммунологически эффективное количество" или "доза", которых в контексте данного описания являются взаимозаменяемыми, в целом касаются количества антигена или иммуногенной композиции, достаточного для вызывания иммунной реакции, клеточной (Т-клетки) или гуморальной (В-клетки или антитело) реакции, или обоих типов, согласно измерениям с применением стандартных анализов, известных специалистам в данной области.The terms "immunogenic amount" or "immunologically effective amount" or "dose", which are used interchangeably in the context of this description, generally refer to an amount of an antigen or immunogenic composition sufficient to elicit an immune response, cellular (T-cells) or humoral (B- cell or antibody) reactions, or both, as measured using standard assays known to those skilled in the art.
Термин "иммуногенная композиция" относится к фармацевтической композиции, содержащей антиген, например, микроорганизм или его компонент, причем композиция может применяться для вызывания иммунной реакции у субъекта. Иммуногенные композиции согласно настоящему изобретению могут применяться для лечения человека, восприимчивого к инфекции N. meningidis, с введением иммуногенных композиций системным трансдермальным или мукозальным путем. Такое введение может включать инъекцию внутримышечным (i.m.), внутрибрюшинным (i.p.), внутрикожным (i.d.) или подкожным способами; нанесение в форме пластыря или другого трансдермального средства доставки; или путем мукозального введения через ротовую полость / пищеварительный, дыхательный или мочеполовой тракты. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция может применяться в производстве вакцины или при выработке поликлональных или моноклональных антител, которые могут применяться для пассивной защиты или лечения субъекта.The term "immunogenic composition" refers to a pharmaceutical composition containing an antigen, such as a microorganism or a component thereof, and the composition can be used to elicit an immune response in a subject. The immunogenic compositions of the present invention may be used to treat a human susceptible to N. meningidis infection by administering the immunogenic compositions via the systemic transdermal or mucosal route. Such administration may include injection by intramuscular (i.m.), intraperitoneal (i.p.), intradermal (i.d.), or subcutaneous routes; application in the form of a patch or other transdermal delivery device; or by mucosal administration through the mouth/alimentary, respiratory or genitourinary tracts. In one embodiment, the immunogenic composition may be used in the manufacture of a vaccine or in the production of polyclonal or monoclonal antibodies that may be used to passively protect or treat a subject.
Оптимальное количество компонентов конкретной иммуногенной композиции определяют путем стандартных исследований, включающих наблюдение за соответствующими иммунными реакциями у субъектов. После первоначальной вакцинации субъекты могут получать одну или несколько бустер-иммунизаций с надлежащими интервалами.The optimal amount of components of a particular immunogenic composition is determined by standard studies, including the observation of appropriate immune responses in subjects. Following the initial vaccination, subjects may receive one or more booster immunizations at appropriate intervals.
Термин "выделенный" означает, что материал удаляют из его первоначальной среды (например, естественной среды, если он встречается в природе, или из организма-хозяина, если это рекомбинантное образование, или переносят из одной среды в другую среду). Например, "выделенный" белок или пептид практически не содержит клеточного материала или других загрязняющих белков клеточного или тканевого источника, из которого взят белок, или практически не содержит химических прекурсоров или других химических веществ в случае химического синтеза, или иным образом присутствует в смеси как компонент химической реакции. Согласно настоящему изобретению, белки могут быть выделены из бактериальных клеток или из клеточного дебриса, и, таким образом, они обеспечиваются в форме, применяемой в производстве иммуногенной композиции. Термин "выделенный" или "выделение" может включать очистку, включая, например, способы очистки белков, как описывается авторами. Выражение "практически не содержит клеточного материала" включает композиции полипептида или белка, в которых полипептид или белок отделен от клеточных компонентов клеток, из которых он выделен или получен рекомбинантным путем. Таким образом, белок или пептид, который практически не содержит клеточного материала, включает композиции капсульного полисахарида, белка или пептида, включающие менее, чем приблизительно 30%, 20%, 10%, 5%, 2,5% или 1%, (сухой массы) примесного белка или полисахарида или другого клеточного материала. В случае получения полипептида / белка рекомбинантным путем он предпочтительно практически не содержит культуральной среды, т.е., культуральная среда составляет около 20%, 10% или 5% объема белковой композиции. В случае получения полипептида или белка путем химического синтеза он предпочтительно практически не содержит химических прекурсоров или других химических веществ, т.е., отделен от химических прекурсоров или других химических веществ, участвующих в синтезе белка или полисахарида. Соответственно, такие композиции полипептида или белка включают менее, чем приблизительно 30%, 20%, 10%, 5% (сухой массы) химических прекурсоров или соединений, отличных от нужных фрагментов полипептидов / белков или полисахаридов.The term "isolated" means that the material is removed from its original environment (eg, natural environment if it occurs naturally, or from the host organism if it is a recombinant formation, or transferred from one environment to another environment). For example, an "isolated" protein or peptide is substantially free of cellular material or other contaminating proteins of the cellular or tissue source from which the protein is taken, or substantially free of chemical precursors or other chemicals in the case of chemical synthesis, or is otherwise present in the mixture as a component chemical reaction. According to the present invention, proteins can be isolated from bacterial cells or from cell debris, and thus they are provided in a form used in the manufacture of an immunogenic composition. The term "isolated" or "isolation" may include purification, including, for example, methods for purifying proteins as described by the authors. The expression "substantially free of cellular material" includes compositions of a polypeptide or protein in which the polypeptide or protein is separated from the cellular components of the cells from which it is isolated or recombinantly obtained. Thus, a protein or peptide that is substantially free of cellular material includes capsular polysaccharide, protein, or peptide compositions comprising less than about 30%, 20%, 10%, 5%, 2.5%, or 1%, (dry mass) of contaminant protein or polysaccharide or other cellular material. In the case of recombinant production of the polypeptide/protein, it preferably contains practically no culture medium, i.e., the culture medium is about 20%, 10% or 5% of the volume of the protein composition. In the case of obtaining a polypeptide or protein by chemical synthesis, it preferably contains virtually no chemical precursors or other chemicals, ie, separated from chemical precursors or other chemicals involved in the synthesis of the protein or polysaccharide. Accordingly, such polypeptide or protein compositions include less than about 30%, 20%, 10%, 5% (dry weight) chemical precursors or compounds other than the desired polypeptide/protein or polysaccharide fragments.
Термин "N-концевой хвост" в контексте данного описания относится к N-концевой части белка, кодируемого ORF2086, прикрепляющей белок к клеточной мембране. N-концевой хвост показан в нижней части боковой проекции структуры с Фигуры 3. N-концевой хвост, как правило, включает N-концевые 16 аминокислот белка, кодируемого ORF2086. В некоторых вариантах осуществления N-концевой хвост представляет собой аминокислоты 1-16 любой з последовательностей SEQ ID NO: 12-21. Термин "ORF2086" в контексте данного описания означает открытую рамку считывания 2086 бактерий вида Neisseria. ORF2086 Neisseria, кодируемые из нее белки, фрагменты этих белков и иммуногенные композиции, включающие эти белки, известны специалистам в данной области и описываются, например, в документе WO 2003/063766 и в публикациях патентных заявок США №№ US 20060257413 и US 20090202593, включенных в данное описание путем ссылки в полном объеме.The term "N-terminal tail" in the context of this description refers to the N-terminal portion of the protein encoded by ORF2086, which attaches the protein to the cell membrane. The N-terminal tail is shown in the lower part of the side view of the structure of Figure 3. The N-terminal tail typically includes the N-terminal 16 amino acids of the protein encoded by ORF2086. In some embodiments, the N-terminal tail is amino acids 1-16 of any one of SEQ ID NOs: 12-21. The term "ORF2086" in the context of this description means an open reading frame 2086 bacteria of the species Neisseria. Neisseria ORF2086, its encoded proteins, fragments of these proteins, and immunogenic compositions comprising these proteins are known to those skilled in the art and are described, for example, in document WO 2003/063766 and US Patent Application Publication Nos. US 20060257413 and US 20090202593 included to this description by reference in its entirety.
Термин "Р2086" в целом касается белка, кодируемого ORF2086. Буква "Р" перед "2086" является аббревиатурой для белка ("protein"). Белки Р2086 согласно изобретению могут быть липидированными или нелипидированными. "LP2086" и "Р2086", как правило, означают липидированные и нелипидированные формы белка 2086, соответственно. Белок Р2086 согласно изобретению может быть рекомбинантным. Как правило, "rLP2086" и "rP2086" означают липидированные и нелипидированные формы рекомбинантного белка 2086, соответственно. "2086" также известен как фактор Н-связывающий белок (fHBP) благодаря его способности к связыванию с фактором Н.The term "P2086" generally refers to the protein encoded by ORF2086. The "P" before "2086" is an abbreviation for "protein". The P2086 proteins of the invention may be lipidated or non-lipidated. "LP2086" and "P2086" generally refer to lipidated and non-lipidated forms of the 2086 protein, respectively. The P2086 protein of the invention may be recombinant. Typically, "rLP2086" and "rP2086" refer to lipidated and non-lipidated forms of recombinant 2086 protein, respectively. "2086" is also known as factor H binding protein (fHBP) due to its ability to bind to factor H.
Термин "фармацевтически приемлемый разбавитель, наполнитель и/или носитель" в контексте данного описания охватывает любые и все растворители, диспергаторы, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающий абсорбцию агенты и т.п., совместимые с введением человеку и другим хозяевам - позвоночным. Как правило, фармацевтически приемлемый разбавитель, наполнитель и/или носитель представляет собой разбавитель, наполнитель и/или носитель, утвержденный федеральным регулирующим органом, правительством штата или другим регулирующим органом, или занесенным в Фармакопею США или другую общепризнанную фармакопею в качестве средства для применения на животных, включая человека и отличных от человека млекопитающих. Термин "разбавитель", "наполнитель" и/или "носитель" означает разбавитель, адъювант, наполнитель или основу, с которыми вводят фармацевтическую композицию. Такими фармацевтическими разбавителями, наполнителями и/или носителями могут быть стерильные жидкости, такие, как вода и масла, включая минеральные, животные, растительные или синтетические. Вода, солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина могут применяться в качестве жидких разбавителей, наполнителей и/или носителей, в частности, для инъекционных растворов. Подходящими фармацевтическими разбавителями и/или наполнителями являются крахмал, глюкоза, лактоза, сахароза, желатин, солод, рис, мука, мел, силикагель, стеарат натрия, глицеринмоностеарат, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, вода, этанол и т.п. В случае необходимости композиция также может содержать небольшое количество увлажнителя, объемообразующего агента, эмульгаторов или рН-буферы. Эти композиции могут быть в форме растворов, суспензий, эмульсий, композиций с замедленным высвобождением и т.п. Примеры подходящих фармацевтических разбавителей, наполнителей и/или носителей описываются в публикации "
"Защитная" иммунная реакция означает способность иммуногенной композиции к вызыванию иммунной реакции, гуморальной или клеточно-опосредованной, которая служит для защиты субъекта от инфекции. Обеспечиваемая защита не обязательно должна быть абсолютной, т.е., не требуется полное предотвращение или устранение инфекции, если наблюдается статистически значимое улучшение по сравнению с контрольной популяцией субъектов, например, инфицированных животных, которым не вводили вакцину или иммуногенную композицию. Защита может ограничиваться уменьшением тяжести или замедлением возникновения симптомов инфекции. В целом "защитная иммунная реакция" должна включать вызывание повышение уровня антитела, специфичного к конкретному антигену, по меньшей мере у 50% субъектов, включая определенный уровень измеримых реакций функционального антитела на каждый антиген. В конкретных ситуациях "защитная иммунная реакция" может включать вызывание двухкратного повышения уровня антитела или четырехкратного повышения уровня антитела, специфичного к конкретному антигену, по меньшей мере у 50% субъектов, включая определенный уровень измеримых реакций функционального антитела на каждый антиген. В некоторых вариантах осуществления опсонизирующие антитела коррелируют с защитной иммунной реакцией. Таким образом, защитная иммунная реакция может анализироваться путем измерения процента снижения численности бактерий в анализе бактерицидной активности сыворотки (SBA) или в опсоно-фагоцитарной пробе, например, как описано ниже. Такие анализы также известны специалистам в данной области. Для менингококковых вакцин, например, анализ SBA является общепринятым суррогатным средством защиты. В некоторых вариантах осуществления наблюдается снижение численности бактерий по меньшей мере на 10%, 25%, 50%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более по сравнению с численностью бактерий при отсутствии иммуногенной композиции.A "protective" immune response means the ability of an immunogenic composition to elicit an immune response, humoral or cell-mediated, that serves to protect the subject from infection. The protection provided need not be absolute, i.e., complete prevention or elimination of infection is not required if there is a statistically significant improvement compared to a control population of subjects, such as infected animals that have not received a vaccine or immunogenic composition. Protection may be limited to reducing the severity or slowing the onset of symptoms of the infection. In general, a "protective immune response" should include causing an increase in the level of antibody specific for a particular antigen in at least 50% of subjects, including a certain level of measurable functional antibody responses to each antigen. In specific situations, a "protective immune response" may include causing a two-fold increase in the level of an antibody or a four-fold increase in the level of an antibody specific for a particular antigen in at least 50% of the subjects, including a certain level of measurable functional antibody responses to each antigen. In some embodiments, opsonizing antibodies correlate with a protective immune response. Thus, a protective immune response can be assayed by measuring the percent reduction in bacteria in a serum bactericidal activity (SBA) assay or in an opsonophagocytic assay, for example, as described below. Such assays are also known to those skilled in the art. For meningococcal vaccines, for example, the SBA assay is a commonly accepted surrogate protection. In some embodiments, there is a reduction in bacterial abundance of at least 10%, 25%, 50%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% or more compared to bacterial abundance in the absence of the immunogenic composition.
Термины "белок", "полипептид" и "пептид" относятся к полимеру из аминокислотных остатков и не ограничиваются минимальной длиной продукта. Таким образом, это определение охватывает пептиды, олигопептиды, димеры, мультимеры и т.п. Определение охватывает как белки полной длины, так и их фрагменты. Термины также включают модификации, такие, как делеции, добавления и замещения (которые в целом носят консервативный характер, но могут быть и неконсервативными) в природной последовательности, предпочтительно такие, что белок сохраняет способность к вызыванию иммунологической реакции у животного, которому вводят белок. Также включаются постэкспрессионные модификации, например, гликозилирование, ацетилирование, липидирование, фосфорилирование и т.п.The terms "protein", "polypeptide" and "peptide" refer to a polymer of amino acid residues and are not limited to a minimum product length. Thus, this definition covers peptides, oligopeptides, dimers, multimers, and the like. The definition covers both full-length proteins and their fragments. The terms also include modifications such as deletions, additions and substitutions (which are generally conservative but may be non-conservative) in the natural sequence, preferably such that the protein retains the ability to elicit an immunological response in the animal to which the protein is administered. Also included are post-expression modifications, eg, glycosylation, acetylation, lipidation, phosphorylation, and the like.
Авторами также описываются активные варианты и фрагменты раскрываемых полинуклеотидов и полипептидов. "Варианты" означают по сути подобные последовательности. В контексте данного описания "вариантный полипептид" означает полипептид, полученный из природного белка путем модификации одной или нескольких аминокислот на N-конце и/или С-конце природного белка. Модификация может включать делецию (так называемое срезание) одной или нескольких аминокислот на N-конце и/или С-конце природного белка; делеция и/или добавление одной или нескольких аминокислот в одном или нескольких внутренних сайтах природного белка; или замещение одной или нескольких аминокислот в одном или нескольких сайтах природного белка. Вариантные полипептиды сохраняют нужную биологическую активность природного полипептида, то есть, являются иммуногенными. Описываемый авторами вариант полипептидной или полинуклеотидной последовательности (т.е. SEQ ID NO: 1-25 или 39), как правило, имеет по меньшей мере приблизительно 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности с контрольной последовательностью.The authors also describe active variants and fragments of the disclosed polynucleotides and polypeptides. "Variants" means substantially similar sequences. In the context of this description, "variant polypeptide" means a polypeptide derived from a natural protein by modifying one or more amino acids at the N-terminus and/or C-terminus of the natural protein. The modification may include the deletion (so-called cutting) of one or more amino acids at the N-terminus and/or C-terminus of the natural protein; deletion and/or addition of one or more amino acids at one or more internal sites of a natural protein; or a substitution of one or more amino acids at one or more sites in a natural protein. Variant polypeptides retain the desired biological activity of the natural polypeptide, that is, they are immunogenic. The variant polypeptide or polynucleotide sequence described by the authors (i.e. SEQ ID NO: 1-25 or 39) typically has at least about 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more identity with the control sequence.
Термин "фрагмент" относится к части аминокислотной или нуклеотидной последовательности, включающей указанное количество смежных аминокислотных или нуклеотидных остатков. В конкретных вариантах осуществления описываемый авторами фрагмент полипептида может сохранять биологическую активность полипептида полной длины и, таким образом, быть иммуногенным. Фрагменты полинуклеотида могут кодировать фрагменты белков, сохраняющие биологическую активность белка, и, таким образом, могут быть иммуногенными. В альтернативном варианте фрагменты полинуклеотида, используемые в качестве праймеров ПЦР, как правило, не сохраняют биологическую активность. Таким образом, описываемые авторами фрагменты нуклеотидной последовательности могут включать по меньшей мере приблизительно 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 или 1500 смежных нуклеотидов или составлять полинуклеотид до полной длины. Описываемые авторами фрагменты полипептидной последовательности могут включать по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 400, 425, 450, 475 или 500 смежных аминокислот или до полного количества аминокислот, присутствующих в полипептиде полной длины.The term "fragment" refers to a portion of an amino acid or nucleotide sequence comprising a specified number of contiguous amino acid or nucleotide residues. In specific embodiments, the implementation described by the authors of the fragment of the polypeptide may retain the biological activity of the full length of the polypeptide and, thus, be immunogenic. Polynucleotide fragments may encode protein fragments that retain the biological activity of the protein and thus may be immunogenic. Alternatively, polynucleotide fragments used as PCR primers generally do not retain biological activity. Thus, the nucleotide sequence fragments described by the authors may include at least about 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 or 1500 contiguous nucleotides, or make up the full length polynucleotide. The fragments of the polypeptide sequence described by the authors may include at least 10, 15, 20, 25, 30, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 400, 425, 450, 475, or 500 contiguous amino acids, or up to the total number of amino acids present in a full length polypeptide.
Термин "рекомбинантный" в контексте данного описания означает любой белок, полипептид или клетку, экспрессирующие нужный ген, получаемые с применением способов генной инженерии. Термин "рекомбинантный", применяемый по отношению к белку или полипептиду, означает полипептид, полученный путем экспрессии рекомбинантного полинуклеотида. Белки согласно настоящему изобретению могут быть выделены из природного источника или получены способами генной инженерии. "Рекомбинантная" в контексте данного описания также означает молекулу нуклеиновой кислоты, которая, по причине ее происхождения или манипуляции, не ассоциирована с полным полинуклеотидом, с которым она ассоциируется в природе, или его частью. Термин "рекомбинантный", применяемый по отношению к клетке-хозяину, означает клетку-хозяин, которая включает рекомбинантный полинуклеотид.The term "recombinant" in the context of this description means any protein, polypeptide or cell that expresses the desired gene, obtained using genetic engineering methods. The term "recombinant" when used with respect to a protein or polypeptide means a polypeptide obtained by expression of a recombinant polynucleotide. The proteins of the present invention may be isolated from a natural source or obtained by genetic engineering. "Recombinant" in the context of this description also means a nucleic acid molecule that, due to its origin or manipulation, is not associated with the entire polynucleotide with which it is associated in nature, or part of it. The term "recombinant" as used in relation to a host cell means a host cell that includes a recombinant polynucleotide.
Термин "субъект" означает млекопитающее, птицу, рыбу, пресмыкающееся или любое другое животное. Термин "субъект" также включает человека. Термин "субъект" также включает домашних животных. Неограничивающими примерами домашних животных могут быть: собаки, кошки, свиньи, кролики, крысы, мыши, песчанки, хомяки, морские свинки, хорьки, птицы, змеи, ящерицы, рыбы, черепахи и лягушки. Термин "субъект" также включает домашний скот. Неограничивающими примерами домашнего скота могут быть: альпака, бизон, верблюд, крупный рогатый скот, олени, свиньи, лошади, ламы, мулы, ослы, овцы, козы, кролики, северные олени, яки, куры, гуси и индюки.The term "subject" means a mammal, bird, fish, reptile, or any other animal. The term "subject" also includes a human. The term "subject" also includes pets. Non-limiting examples of pets include: dogs, cats, pigs, rabbits, rats, mice, gerbils, hamsters, guinea pigs, ferrets, birds, snakes, lizards, fish, turtles, and frogs. The term "subject" also includes livestock. Non-limiting examples of livestock can be: alpaca, bison, camel, cattle, deer, pigs, horses, llamas, mules, donkeys, sheep, goats, rabbits, reindeer, yaks, chickens, geese and turkeys.
Термин "млекопитающие" в контексте данного описания означает любое млекопитающее, например, человека, мышь, кролика, нечеловекообразных приматов. В предпочтительном варианте осуществления млекопитающим является человек.The term "mammals" in the context of this description means any mammal, such as humans, mice, rabbits, non-human primates. In a preferred embodiment, the mammal is a human.
Термины "вакцина" или "вакцинная композиция", которые являются взаимозаменяемыми, относятся к фармацевтическим композициям, включающим по меньшей мере одну иммуногенную композицию, вызывающую иммунную реакцию у субъекта.The terms "vaccine" or "vaccine composition", which are used interchangeably, refer to pharmaceutical compositions comprising at least one immunogenic composition that elicits an immune response in a subject.
Общее описаниеgeneral description
Настоящее изобретение также выявляет ранее не выявленные трудности с экспрессией нелипидированных вариантов Р2086 и обеспечивает способы преодоления этих трудностей и их новые композиции. Хотя плазмидные последовательности, кодирующие нелипидированные варианты Р2086, обеспечивали сильную экспрессию нелипидированных вариантов, эти варианты были пирувилированными на N-концевом Cys. Пирувилирование исключает или уменьшает вероятность однородности процесса производства или однородность полипептидов. Авторами изобретения также было обнаружено, что делеция N-концевого Cys из нелипидированных вариантных последовательностей Р2086 позволяет избегать пирувилирования нелипидированных вариантов Р2086. Попытки преодоления пирувилирования путем делеции кодона для N концевого Cys либо устраняли экспрессию, либо приводили к экспрессии нерастворимых вариантов. В альтернативном варианте удаление N-концевого Cys из нелипидированных вариантов Р2086 снижало экспрессию в некоторых вариантах. Однако неожиданно авторами изобретения было обнаружено, что по меньшей мере непирувилированные нелипидированные варианты А05, А12, А22, А62, В01, В09, В22 и В44 могут быть экспрессированы, несмотря на делецию N-концевого цистеинового остатка. Как правило, эти полипептиды могут быть экспрессированы без дополнительных модификаций, помимо делеции Cys, в отличие от соответствующей нелипидированной последовательности дикого типа. См., например, Примеры 2 и 4. Кроме того, авторами изобретения неожиданно было обнаружено, что непирувилированные нелипидированные варианты являются иммуногенными и вырабатывают бактерицидные антитела.The present invention also reveals previously undetected difficulties in the expression of non-lipidated P2086 variants and provides methods for overcoming these difficulties and novel compositions thereof. Although the plasmid sequences encoding the non-lipidated P2086 variants provided strong expression of the non-lipidated variants, these variants were pyruvilated at the N-terminal Cys. Pyruvylation eliminates or reduces the likelihood of homogeneity of the manufacturing process or the homogeneity of polypeptides. The inventors have also found that deletion of the N-terminal Cys from the non-lipidated P2086 variant sequences avoids pyruvylation of the non-lipidated P2086 variants. Attempts to overcome pyruvylation by deleting the codon for the N terminal Cys either abolished expression or resulted in the expression of insoluble variants. Alternatively, removal of the N-terminal Cys from non-lipidated P2086 variants reduced expression in some variants. Surprisingly, however, the inventors found that at least non-pyruvilated, non-lipidated variants of A05, A12, A22, A62, B01, B09, B22 and B44 can be expressed despite deletion of the N-terminal cysteine residue. Typically, these polypeptides can be expressed without further modifications other than deletion of Cys, as opposed to the corresponding non-lipidated wild-type sequence. See, for example, Examples 2 and 4. In addition, the inventors unexpectedly found that non-pyruvilated non-lipidated variants are immunogenic and produce bactericidal antibodies.
Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает два способа преодоления или уменьшения вероятности возникновения этих трудностей, связанных с экспрессией нелипидированных вариантов. Однако настоящее изобретение предусматривает и дополнительные способы. Первый способ состоит в изменении длины ствола Gly/Ser в N-концевом хвосте, непосредственно после N-концевого Cys. Второй способ состоит в оптимизации кодонов в N-концевом хвосте. Однако настоящее изобретение предусматривает и оптимизацию дополнительных кодонов. Эти способы обеспечивают усиленную экспрессию растворимых нелипидированных вариантов Р2086. Например, в одном варианте осуществления усиленную экспрессию растворимых нелипидированных вариантов Р2086 сравнивают с экспрессией соответствующих нелипидированных вариантов дикого типа.Accordingly, the present invention provides two ways to overcome or reduce the likelihood of these difficulties associated with the expression of non-lipidated variants. However, the present invention provides for additional methods. The first way is to change the length of the Gly/Ser stem in the N-terminal tail, immediately after the N-terminal Cys. The second way is to optimize the codons in the N-terminal tail. However, the present invention also provides for the optimization of additional codons. These methods provide enhanced expression of soluble, non-lipidated P2086 variants. For example, in one embodiment, enhanced expression of soluble non-lipidated P2086 variants is compared to the expression of the corresponding non-lipidated wild-type variants.
Выделенные полипептидыIsolated polypeptides
Авторами изобретения неожиданно были открыты выделенные непирувилированные, нелипидированные полипептиды ORF2086. Авторы изобретения также неожиданно было открыто, что полипептиды являются иммуногенными и способными вызывать бактерицидную иммунную реакцию.The inventors surprisingly discovered isolated non-pyruvilated, non-lipidated ORF2086 polypeptides. The inventors have also unexpectedly discovered that the polypeptides are immunogenic and capable of inducing a bactericidal immune response.
В контексте данного описания термин "непирувилированный" относится к полипептиду, не содержащему пирувата. Нелипидированные полипептиды ORF2086, содержащие пируват, обычно демонстрируют сдвиг массы +70 по сравнению с соответствующим полипептидом дикого типа. В одном варианте осуществления полипептид согласно изобретению не демонстрирует сдвига массы +70 по сравнению с соответствующим нелипидированным полипептидом дикого типа при измерении путем масс-спектрометрии. См., например, Пример 10.In the context of this description, the term "non-pyruvilated" refers to a polypeptide that does not contain pyruvate. Non-lipidated ORF2086 polypeptides containing pyruvate typically show a +70 weight shift compared to the corresponding wild-type polypeptide. In one embodiment, the polypeptide of the invention does not show a +70 mass shift compared to the corresponding non-lipidated wild-type polypeptide when measured by mass spectrometry. See, for example, Example 10.
В другом варианте осуществления выделенный непирувилированный, нелипидированный полипептид ORF2086 включает делецию N-концевого цистеинового остатка по сравнению с соответствующим нелипидированным полипептидом ORF2086 дикого типа. Термин "N-концевой цистеин" означает цистеин (Cys) на N-конце или в N-концевом хвосте полипептида. Более конкретно "N-концевой цистеин" в контексте данного описания означает N-концевой цистеин, в котором липопротеины LP2086 являются липидированными трипальмитоиловым липидным хвостом, как известно специалистам в данной области. Например, если взять любую из последовательностей SEQ ID NO: 12 - 21 в качестве контрольной последовательности, N-концевой цистеин располагается в позиции 1. В другом примере, если взять в качестве контрольной последовательности SEQ ID NO: 70, N-концевой цистеин располагается в позиции 1.In another embodiment, the isolated non-pyruvilated, non-lipidated ORF2086 polypeptide comprises a deletion of the N-terminal cysteine residue compared to the corresponding wild-type non-lipidated ORF2086 polypeptide. The term "N-terminal cysteine" means a cysteine (Cys) at the N-terminus or N-terminal tail of a polypeptide. More specifically, "N-terminal cysteine" as used herein means an N-terminal cysteine in which the LP2086 lipoproteins are lipidated with a tripalmitoyl lipid tail, as is known to those skilled in the art. For example, if one takes any of SEQ ID NO: 12 - 21 as a control sequence, the N-terminal cysteine is located at
Термин "нелипидированный полипептид ORF2086 дикого типа" или "нелипидированный полипептид 2086 дикого типа" или "нелипидированный полипептид дикого типа" в контексте данного описания означает полипептид ORF2086, имеющий аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности соответствующей зрелому липидированному полипептиду ORF2086, встречающемуся в природе. Единственное различие между нелипидированными и липидированными молекулами состоит в том, что нелипидированный полипептид ORF2086 дикого типа не липидирован трипальмитоиловым липидным хвостом в N-концевом цистеине.The term "wild-type non-lipidated ORF2086 polypeptide" or "wild-type non-lipidated 2086 polypeptide" or "wild-type non-lipidated polypeptide" as used herein means an ORF2086 polypeptide having an amino acid sequence identical to the amino acid sequence of the corresponding naturally occurring mature lipidated ORF2086 polypeptide. The only difference between non-lipidated and lipidated molecules is that the non-lipidated wild-type ORF2086 polypeptide is not lipidated by the tripalmitoyl lipid tail in the N-terminal cysteine.
Как известно специалистам в данной области, нелипидированная форма 2086 образуется белком, в котором отсутствует первоначальная лидерная последовательность, или лидерной последовательностью, замененной частью последовательности, которая не указывает сайт для ацилирования жирной кислотой в клетке-хозяине. См., например, заявку WO 2003/063766, включенную в данное описание путем ссылки в полном объеме.As known to those skilled in the art, the non-lipidated form of 2086 is formed by a protein lacking the original leader sequence, or a leader sequence replaced by a portion of the sequence that does not indicate a site for fatty acid acylation in the host cell. See, for example, WO 2003/063766, incorporated herein by reference in its entirety.
Примерами нелипидированного ORF2086 могут быть не только вышеописанный нелипидированный полипептид ORF2086 дикого типа, но и полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность согласно любой из последовательностей SEQ ID NO: 12-21, в которой N-концевой Cys делетирован, и полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность согласно любой из последовательностей SEQ ID NO: 12-21, в которой N-концевой Cys замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. Другой пример нелипидированного полипептида ORF2086 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 70, в которой N-концевой Cys делетирован, и полипептид, имеющий аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 70, в которой N-концевой Cys замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. Другие примеры нелипидированного полипептида ORF2086 включают аминокислотные последовательности, выбранные из SEQ ID NO: 44 (В44), SEQ ID NO: 49 (B09), SEQ ID NO: 55 (A05), SEQ ID NO: 57 (B01), SEQ ID NO: 58 (B01), SEQ ID NO: 62 (B22), SEQ ID NO: 64 (A22) и SEQ ID NO: 75 (B22). Другие примеры нелипидированного полипептида ORF2086 включают аминокислотные последовательности, выбранные из SEQ ID NO: 66 (А12), SEQ ID NO: 68 (A22) и SEQ ID NO: 71 (A62). Другие примеры включают SEQ ID NO: 80 (B24) и SEQ ID NO: 81 (B24). Дополнительные примеры нелипидированного полипептида ORF2086 включают аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 76 и SEQ ID NO: 77. В одном варианте осуществления нелипидированный полипептид включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, кодирующей соответствующий нелипидированный полипептид. Например, в типичном варианте осуществления нелипидированный полипептид А62 включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 71.Examples of the non-lipidated ORF2086 include not only the wild-type non-lipidated ORF2086 polypeptide described above, but also polypeptides having an amino acid sequence according to any of SEQ ID NOs: 12-21 in which the N-terminal Cys is deleted, and polypeptides having an amino acid sequence according to any of sequences SEQ ID NO: 12-21, in which the N-terminal Cys is replaced by an amino acid that is not a cysteine residue. Another example of a non-lipidated ORF2086 polypeptide includes a polypeptide having the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 70, in which the N-terminal Cys is deleted, and a polypeptide having the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 70, in which the N-terminal Cys is substituted with an amino acid that is not is a cysteine residue. Other examples of the non-lipidated ORF2086 polypeptide include amino acid sequences selected from SEQ ID NO: 44 (B44), SEQ ID NO: 49 (B09), SEQ ID NO: 55 (A05), SEQ ID NO: 57 (B01), SEQ ID NO: : 58 (B01), SEQ ID NO: 62 (B22), SEQ ID NO: 64 (A22) and SEQ ID NO: 75 (B22). Other examples of the non-lipidated ORF2086 polypeptide include amino acid sequences selected from SEQ ID NO: 66 (A12), SEQ ID NO: 68 (A22), and SEQ ID NO: 71 (A62). Other examples include SEQ ID NO: 80 (B24) and SEQ ID NO: 81 (B24). Additional examples of the non-lipidated ORF2086 polypeptide include the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 76 and SEQ ID NO: 77. In one embodiment, the non-lipidated polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least about 60%, 65%, 70%, 75% , 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100 % is identical to the sequence encoding the corresponding non-lipidated polypeptide. For example, in a typical embodiment, the non-lipidated A62 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least about 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% identical to SEQ ID NO: 71.
Примеры нелипидированного полипептида ORF2086 дикого типа включают полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность согласно любой из последовательностей SEQ ID NO: 12-21, показанную на Фигуре 2, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 и SEQ ID NO: 60. Еще один пример нелипидированного полипептида ORF2086 дикого типа включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 70. Эти типичные нелипидированные полипептиды ORF2086 дикого типа включают N-концевой Cys.Examples of a non-lipidated wild-type ORF2086 polypeptide include those having an amino acid sequence according to any of SEQ ID NO: 12-21 shown in Figure 2, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, and SEQ ID NO: 60. Yet another example The non-lipidated wild-type ORF2086 polypeptide includes a polypeptide having the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 70. These exemplary non-lipidated wild-type ORF2086 polypeptides include an N-terminal Cys.
В контексте данного описания, например, "нелипидированный" полипептид В44 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, и SEQ ID NO: 44. "Нелипидированный дикого типа" полипептид В44 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21. "Непирувилированный нелипидированный" полипептид В44 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, и SEQ ID NO: 44.As used herein, for example, a "non-lipidated" B44 polypeptide includes a polypeptide having an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 21 in which the N-terminal Cys at
В качестве еще одного примера в контексте данного описания "нелипидированный" полипептид В09 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 18, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, SEQ ID NO: 49 и SEQ ID NO: 50. "Нелипидированный дикого типа" полипептид В09 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18. "Непирувилированный нелипидированный" В09 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 18, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, SEQ ID NO: 49 и SEQ ID NO: 50.As another example, in the context of this description, a "non-lipidated" B09 polypeptide includes a polypeptide having an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 18, in which the N-terminal Cys at
В качестве еще одного примера в контексте данного описания "нелипидированный" полипептид А05 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, и SEQ ID NO: 55. Другой пример "нелипидированного" полипептида А05 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой Cys в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. Дополнительный пример "нелипидированного" полипептида А05 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 76. Другой пример "нелипидированного" полипептида А05 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 77. "Нелипидированный дикого типа" А05 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13. "Непирувилированный нелипидированный" А05 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, и SEQ ID NO: 55. Другие примеры "непирувилированного нелипидированного" А05 включают полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой Cys в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком; SEQ ID NO: 76, в которой Cys в позиции 1 делетирован; SEQ ID NO: 76, в которой Cys в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком; и SEQ ID NO: 77.As another example, in the context of this description, a "non-lipidated" A05 polypeptide includes a polypeptide having an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 13, in which the N-terminal Cys at
В контексте данного описания "нелипидированный" полипептид А62 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 70, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, и SEQ ID NO: 71. Другой пример нелипидированного полипептида А62 включает полипептид, имеющий SEQ ID NO: 70, в которой N-концевой Cys в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. "Нелипидированный дикого типа" полипептид А62 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70. "Непирувилированный нелипидированный" А62 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 70, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, и SEQ ID NO: 71. Другой пример непирувилированного нелипидированного полипептида А62 включает полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 70, в которой N-концевой Cys в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. Предпочтительно "непирувилированный нелипидированный" А62 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 71.As used herein, a "non-lipidated" A62 polypeptide includes a polypeptide having an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 70 in which the N-terminal Cys at
В контексте данного описания "нелипидированный" полипептид А12 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:As used herein, a "non-lipidated" A12 polypeptide includes a polypeptide having an amino acid sequence selected from SEQ ID NO:
14, SEQ ID NO: 14, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, и SEQ ID NO: 66. "Нелипидированный дикого типа" полипептид А12 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14. "Непирувилированный нелипидированный" А12 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, и SEQ ID NO: 66.14, SEQ ID NO: 14, wherein the N-terminal Cys at
В контексте данного описания "нелипидированный" А22 полипептид включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 15, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, SEQ ID NO: 64 и SEQ ID NO: 68. "Нелипидированный дикого типа" полипептид А22 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15. "Непирувилированный нелипидированный" А22 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, SEQ ID NO: 64 и SEQ ID NO: 68. Предпочтительно "непирувилированный нелипидированный" А22 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 68.As used herein, a "non-lipidated" A22 polypeptide includes a polypeptide having an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 15, in which the N-terminal Cys at
Термин "делеция" N-концевого Cys в контексте данного описания включает мутацию с делецией N-концевого Cys в отличие от последовательности нелипидированного полипептида дикого типа. Например, "делеция" N-концевого Cys означает удаление аминокислоты Cys из контрольной последовательности, например, из соответствующей последовательности дикого типа, что в результате ведет в уменьшению аминокислотного остатка по сравнению с контрольной последовательностью. Если нет иного описания термины "N-концевой Cys", "N-концевой Cys в позиции 1" и "Cys в позиции 1" являются взаимозаменяемыми.The term "deletion" of an N-terminal Cys as used herein includes a mutation to delete an N-terminal Cys as opposed to a non-lipidated wild-type polypeptide sequence. For example, "deletion" of an N-terminal Cys means the removal of the Cys amino acid from a control sequence, eg, from a corresponding wild-type sequence, resulting in a reduction in amino acid residue compared to the control sequence. Unless otherwise described, the terms "N-terminal Cys", "N-terminal Cys at
В другом варианте осуществления N-концевой Cys замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. Например, в типичном варианте осуществления N-концевой Cys в позиции 1 SEQ ID NO: 12-21 включает замещение C→G в позиции 1. См., например, SEQ ID NO: 62 по сравнению с SEQ ID NO: 19 (В22 дикого типа) и SEQ ID NO: 64 по сравнению с SEQ ID NO: 15 (А22 дикого типа). К типичным аминокислотам для замены N-концевого Cys относится любая отличная от Cys аминокислота, предпочтительно полярная незаряженная аминокислота, например, глицин. В предпочтительном варианте осуществления осуществляют замещение неконсервативным остатком к Cys.In another embodiment, the N-terminal Cys is substituted with an amino acid that is not a cysteine residue. For example, in a typical embodiment, the N-terminal Cys at
Авторами изобретения неожиданно было обнаружено, что экспрессия нелипидированных полипептидов ORF2086 с делецией N-концевого остатка Cys не приводит к обнаруживаемому пирувилированию при измерении при помощи масс-спектрометрии по сравнению с соответствующим нелипидированным полипептидом ORF2086 дикого типа. Примерами непирувилированных нелипидированных полипептидов ORF2086 могут быть имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12 (А04), SEQ ID NO: 13 (А05), SEQ ID NO: 14 (A12), SEQ ID NO: 15 (A22), SEQ ID NO: 16 (B02), SEQ ID NO: 17 (B03), SEQ ID NO: 18 (B09), SEQ ID NO: 19 (B22), SEQ ID NO: 20 (B24), SEQ ID NO: 21 (B44) и SEQ ID NO: 70 (A62), в которой цистеин в позиции 1 делетирован. Другой пример непирувилированного нелипидированного полипептида ORF2086 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58 (В01), в которой цистеин в позиции 1 делетирован. Дополнительные примеры выделенных непирувилированных, нелипидированных полипептидов ORF2086 включают полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 71 и SEQ ID NO: 75. Еще один пример непирувилированного нелипидированного полипептида ORF2086 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57 (В01). Еще один пример выделенного непирувилированного нелипидированного полипептида ORF2086 включает полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 77 (А05); полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 76 (А05), в которой Cys в позиции 1 делетирован; и полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 76 (А05), в которой Cys в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. Другие примеры непирувилированных нелипидированных полипептидов ORF2086 включают имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12 (А04), SEQ ID NO: 13 (A05), SEQ ID NO: 14 (A12), SEQ ID NO: 15 (A22), SEQ ID NO: 58 (B01), SEQ ID NO: 16 (B02), SEQ ID NO: 17 (B03), SEQ ID NO: 18 (B09), SEQ ID NO: 19 (B22), SEQ ID NO: 20 (B24), SEQ ID NO: 21 (B44) и SEQ ID NO: 70 (A62) в которой цистеин в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. Предпочтительно непирувилированный нелипидированный 2086 полипептид включает, по меньшей мере, приблизительно 250, 255 или 260 последовательных аминокислот и не более приблизительно 270, 269, 268, 267, 266, 265, 264, 263, 260, 259, 258, 257, 256 или 255 последовательных аминокислот. Любое минимальное значение может комбинироваться с любым максимальным значением в пределах диапазона. В более предпочтительном варианте полипептид включает, по меньшей мере, 254 или 262 последовательных аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления полипептид включает не более 262 последовательных аминокислот. В других вариантах осуществления полипептид включает не более 254 последовательных аминокислот. В одном варианте осуществления непирувилированный нелипидированный полипептид включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, кодирующей соответствующий непирувилированный нелипидированный полипептид. Например, в типичном варианте осуществления непирувилированный нелипидированный полипептид А62 включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 71.The inventors surprisingly found that expression of non-lipidated ORF2086 polypeptides with deletion of the N-terminal Cys residue did not result in detectable pyruvylation as measured by mass spectrometry compared to the corresponding non-lipidated wild-type ORF2086 polypeptide. Examples of non-pyruvilated, non-lipidated ORF2086 polypeptides may be those having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 12 (A04), SEQ ID NO: 13 (A05), SEQ ID NO: 14 (A12), SEQ ID NO: 15 (A22), SEQ ID NO: 16 (B02), SEQ ID NO: 17 (B03), SEQ ID NO: 18 (B09), SEQ ID NO: 19 (B22), SEQ ID NO: 20 (B24), SEQ ID NO: 21 (B44) and SEQ ID NO: 70 (A62), in which the cysteine at
В одном варианте осуществления выделенный непирувилированный, нелипидированный полипептид ORF2086 кодируется нуклеотидной последовательностью, функционально связанной с экспрессирующей системой, причем экспрессирующая система способна экспрессироваться в бактериальной клетке. В типичном варианте осуществления нуклеотидная последовательность связана с регулирующей последовательностью, контролирующей экспрессию нуклеотидной последовательности.In one embodiment, the isolated non-pyruvilated, non-lipidated ORF2086 polypeptide is encoded by a nucleotide sequence operably linked to an expression system, the expression system being capable of being expressed in a bacterial cell. In a typical embodiment, the nucleotide sequence is linked to a regulatory sequence that controls the expression of the nucleotide sequence.
Подходящие экспрессирующие системы, регулирующие последовательности и бактериальные клетки известны специалистам в данной области. Например, может применяться любой плазмидный вектор экспрессии, например, PET™ (Novogen, Madison Wis.) или PMAL™ (New England Biolabs, Beverly, Mass.) при условии, что полипептид может экспрессироваться в бактериальной клетке. Предпочтительно применяют вектор PET™ для клонирования и экспрессии рекомбинантных белков в Е. coli. В системе PET™ клонированный ген может быть экспрессирован под контролем фагового промотора Т7. Типичными бактериальными клетками являются Pseudomonas fluorescens и, предпочтительно, Е. coli.Suitable expression systems, regulatory sequences and bacterial cells are known to those skilled in the art. For example, any plasmid expression vector may be used, such as PET™ (Novogen, Madison Wis.) or PMAL™ (New England Biolabs, Beverly, Mass.) as long as the polypeptide can be expressed in a bacterial cell. Preferably, the PET™ vector is used to clone and express recombinant proteins in E. coli. In the PET™ system, the cloned gene can be expressed under the control of the T7 phage promoter. Typical bacterial cells are Pseudomonas fluorescens and preferably E. coli.
В одном аспекте изобретение касается непирувилированного нелипидированного полипептида OPvF2086, получаемого описанным способом. Полипептид предпочтительно является выделенным. Изобретение также касается композиций, включающих непирувилированный нелипидированный полипептид ORF2086, получаемый описанным способом. Композиция предпочтительно является иммуногенной композицией. Способ включает экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID N: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 58 и SEQ ID NO: 70, в которой цистеин в позиции 1 делетирован. В другом варианте осуществления способ включает экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, в которой цистеин в позиции 1 делетирован. В еще одном варианте осуществления способ включает экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 58 и SEQ ID NO: 70, в которой цистеин в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. Нуклеотидная последовательность функционально связана с экспрессирующей системой, которая может быть экспрессирована в бактериальной клетке.In one aspect, the invention relates to a non-pyruvilated, non-lipidated OPvF2086 polypeptide obtainable by the method described. The polypeptide is preferably isolated. The invention also concerns compositions comprising a non-pyruvilated, non-lipidated ORF2086 polypeptide obtainable by the method described. The composition is preferably an immunogenic composition. The method includes expression of a nucleotide sequence encoding a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID N: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 58 and SEQ ID NO: 70, in which the cysteine at
В одном варианте осуществления способ включает экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO: 75. В другом варианте осуществления способ включает экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77. В другом варианте осуществления нуклеотидная последовательность выбрана из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69 и SEQ ID NO: 72. Предпочтительно бактериальной клеткой является Е. coli.In one embodiment, the method comprises expressing a nucleotide sequence encoding a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 57, and SEQ ID NO: 75. In another embodiment, the method comprises expressing a nucleotide sequence encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 77. In another embodiment, the nucleotide sequence is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, and SEQ ID NO: 72. Preferably, the bacterial cell is E. coli.
В09, В44, А05: В одном аспекте изобретение касается композиции, включающей первый выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 49 (В09), и второй выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 44 (В44). В предпочтительном варианте осуществления полипептиды являются иммуногенными. В другом предпочтительном варианте осуществления композиция также включает полипептид ORF2086 подсемейства А из серогруппы В N. meningitidis. Предпочтительно полипептид ORF2086 подсемейства А является непирувилированным нелипидированным полипептидом ORF2086 подсемейства А. В типичном варианте осуществления полипептид ORF2086 подсемейства А представляет собой А05, примером которого может быть, например, SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 делетирован, и SEQ ID NO: 55. В другом типичном варианте осуществления композиция включает непирувилированный нелипидированный полипептид А05, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, в которой Cys в позиции 1 делетирован; SEQ ID NO: 76, в которой Cys в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком; и SEQ ID NO: 77.B09, B44, A05: In one aspect, the invention relates to a composition comprising a first isolated polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 49 (B09) and a second isolated polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 44 ( B44). In a preferred embodiment, the polypeptides are immunogenic. In another preferred embodiment, the composition also comprises an ORF2086 subfamily A polypeptide from N. meningitidis serogroup B. Preferably, the subfamily A ORF2086 polypeptide is a non-pyruvilated, non-lipidated subfamily A ORF2086 polypeptide. In a typical embodiment, the subfamily A ORF2086 polypeptide is A05, exemplified by, for example, SEQ ID NO: 13, wherein the N-terminal cysteine at
Полипептидные доменыPolypeptide domains
В другом аспекте изобретение касается способа получения выделенного полипептида. Способ включает экспрессию в бактериальной клетке полипептида, который включает последовательность, имеющую более 90% идентичности с SEQ ID NO: 21, причем вышеупомянутая последовательность включает, по меньшей мере, один домен, выбранный из группы, к которой относятся аминокислоты 13-18 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 21-34 SEQ ID NO: 21 и аминокислоты 70-80 SEQ ID NO: 21, или их комбинация, причем в полипептиде отсутствует N-концевой цистеин. Способ также включает очистку полипептида. Полученный таким способом полипептид включает непирувилированный нелипидированный полипептид ORF2086. Предпочтительно, полипептид является иммуногенным. В предпочтительном варианте осуществления бактериальной клеткой является Е. coli.In another aspect, the invention relates to a method for obtaining an isolated polypeptide. The method includes expression in a bacterial cell of a polypeptide that includes a sequence having more than 90% identity with SEQ ID NO: 21, and the aforementioned sequence includes at least one domain selected from the group that includes amino acids 13-18 of SEQ ID NO : 21, amino acids 21-34 of SEQ ID NO: 21 and amino acids 70-80 of SEQ ID NO: 21, or a combination thereof, wherein the polypeptide lacks an N-terminal cysteine. The method also includes purifying the polypeptide. The polypeptide thus obtained comprises a non-pyruvilated, non-lipidated ORF2086 polypeptide. Preferably, the polypeptide is immunogenic. In a preferred embodiment, the bacterial cell is E. coli.
Примеры полипептидов, которые включают по меньшей мере один домен, выбранный из группы, к которой относятся аминокислоты 13-18 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 21-34 SEQ ID NO: 21 и аминокислоты 70-80 SEQ ID NO: 21 или их комбинация, включают SEQ ID NO: 12 (A04), SEQ ID NO: 13 (A05), SEQ ID NO: 14 (A12), SEQ ID NO: 15 (A22), SEQ ID NO: 16 (B02), SEQ ID NO: 17 (B03), SEQ ID NO: 18 (B09), SEQ ID NO: 19 (B22), SEQ ID NO: 20 (B24) и SEQ ID NO: 21 (B44). Предпочтительно цистеин в позиции 1 этих полипептидов делетирован. В другом варианте осуществления цистеин в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. Другие типичные полипептиды включают SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 62 и SEQ ID NO: 64. Еще один типичный полипептид включает SEQ ID NO: 70 и SEQ ID NO: 71. Еще один типичный полипептид включает SEQ ID NO: 76. Еще один типичный полипептид включает SEQ ID NO: 77. Дополнительные примеры включают SEQ ID NO: 80 (В24) и SEQ ID NO: 81 (B24).Examples of polypeptides that include at least one domain selected from the group consisting of amino acids 13-18 of SEQ ID NO: 21, amino acids 21-34 of SEQ ID NO: 21, and amino acids 70-80 of SEQ ID NO: 21, or a combination thereof , include SEQ ID NO: 12 (A04), SEQ ID NO: 13 (A05), SEQ ID NO: 14 (A12), SEQ ID NO: 15 (A22), SEQ ID NO: 16 (B02), SEQ ID NO : 17 (B03), SEQ ID NO: 18 (B09), SEQ ID NO: 19 (B22), SEQ ID NO: 20 (B24) and SEQ ID NO: 21 (B44). Preferably the cysteine at
В одном типичном варианте осуществления выделенная полипептидная последовательность также включает, по меньшей мере, один домен, выбранный из группы, к которой относятся аминокислоты 96-116 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 158-170 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 172-185 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 187-199 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 213-224 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 226-237 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 239-248 SEQ ID NO: 21 или их комбинация. Примеры полипептидов, которые включают по меньшей мере один домен, выбранный из группы, к которой относятся аминокислоты 13-18 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 21-34 SEQ ID NO: 21 и аминокислоты 70-80 SEQ ID NO: 21 или их комбинация, а также включают по меньшей мере один домен, выбранный из группы, к которой относятся аминокислоты 96-116 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 158-170 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 172-185 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 187-199 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 213-224 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 226-237 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 239-248 SEQ ID NO: 21 или их комбинация, включают SEQ ID NO: 16 (B02), SEQ ID NO: 17 (B03), SEQ ID NO: 18 (B09), SEQ ID NO: 19 (B22), SEQ ID NO: 20 (B24) и SEQ ID NO: 21 (B44). Предпочтительно цистеин в позиции 1 этих полипептидов делетирован. Другие типичные полипептиды включают полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 и SEQ ID NO: 55 и SEQ ID NO: 62.In one exemplary embodiment, the isolated polypeptide sequence also includes at least one domain selected from the group consisting of amino acids 96-116 of SEQ ID NO: 21, amino acids 158-170 of SEQ ID NO: 21, amino acids 172-185 of SEQ ID NO: 21, amino acids 187-199 SEQ ID NO: 21, amino acids 213-224 SEQ ID NO: 21, amino acids 226-237 SEQ ID NO: 21, amino acids 239-248 SEQ ID NO: 21, or a combination thereof. Examples of polypeptides that include at least one domain selected from the group consisting of amino acids 13-18 of SEQ ID NO: 21, amino acids 21-34 of SEQ ID NO: 21, and amino acids 70-80 of SEQ ID NO: 21, or a combination thereof , and also include at least one domain selected from the group that includes amino acids 96-116 of SEQ ID NO: 21, amino acids 158-170 of SEQ ID NO: 21, amino acids 172-185 of SEQ ID NO: 21, amino acids 187- 199 SEQ ID NO: 21, amino acids 213-224 SEQ ID NO: 21, amino acids 226-237 SEQ ID NO: 21, amino acids 239-248 SEQ ID NO: 21, or a combination thereof, include SEQ ID NO: 16 (B02), SEQ ID NO: 17 (B03), SEQ ID NO: 18 (B09), SEQ ID NO: 19 (B22), SEQ ID NO: 20 (B24) and SEQ ID NO: 21 (B44). Preferably the cysteine at
В одном аспекте изобретение касается выделенного полипептида, полученного описанным авторами способом. В одном варианте осуществления выделенный полипептид является непирувилированным нелипидированным полипептид. В другом аспекте изобретение касается иммуногенной композиции, полученной описанным авторами способом.In one aspect, the invention relates to an isolated polypeptide obtained by the method described by the authors. In one embodiment, the isolated polypeptide is a non-pyruvilated, non-lipidated polypeptide. In another aspect, the invention relates to an immunogenic composition obtained by the method described by the authors.
Нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептидыNucleotide sequences encoding polypeptides
В09: В одном аспекте изобретение касается выделенного полипептида, который включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, или SEQ ID NO: 49. Типичные нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID NO: 49, включают последовательности, выбранные из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 и SEQ ID NO: 48. Предпочтительно нуклеотидная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 46. В одном аспекте изобретение касается выделенной нуклеотидной последовательности, включающей SEQ ID NO: 46. В одном аспекте изобретение касается выделенной нуклеотидной последовательности, включающей SEQ ID NO: 47. В одном аспекте изобретение касается выделенной нуклеотидной последовательности, включающей SEQ ID NO: 48.B09: In one aspect, the invention relates to an isolated polypeptide that includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18, in which the N-terminal Cys at
В одном аспекте изобретение касается плазмиды, включающей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 и SEQ ID NO: 45, причем плазмида может экспрессироваться в бактериальной клетке. Подходящие экспрессирующие системы, регулирующие последовательности и бактериальные клетки известны специалистам в данной области, как описывается выше. Предпочтительно бактериальной клеткой является Е. coli.In one aspect, the invention relates to a plasmid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 and SEQ ID NO: 45, and the plasmid can be expressed in a bacterial cell. Suitable expression systems, regulatory sequences and bacterial cells are known to those skilled in the art, as described above. Preferably the bacterial cell is E. coli.
В другом аспекте изобретение касается выделенного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 50. В типичном варианте осуществления SEQ ID NO: 50 кодируется последовательностью SEQ ID NO: 45.In another aspect, the invention relates to an isolated polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 50. In a typical embodiment, SEQ ID NO: 50 is encoded by SEQ ID NO: 45.
В44: В другом аспекте изобретение касается выделенного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой Cys делетирован, или SEQ ID NO: 44. Типичные нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID NO: 44 включают последовательности, выбранные из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 51. Предпочтительно нуклеотидная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 43. В одном аспекте изобретение касается выделенной нуклеотидной последовательности, включающей SEQ ID NO: 43.B44: In another aspect, the invention relates to an isolated polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21, in which the N-terminal Cys is deleted, or SEQ ID NO: 44. Exemplary nucleotide sequences encoding SEQ ID NO: 44 include sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 43 and SEQ ID NO: 51. Preferably, the nucleotide sequence is SEQ ID NO: 43. In one aspect, the invention relates to an isolated nucleotide sequence comprising SEQ ID NO: 43.
А05: В одном аспекте изобретение касается выделенного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13 (А05), в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, или SEQ ID NO: 55. Типичные нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID NO: 55 включают последовательности, выбранные из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 73. Предпочтительно нуклеотидная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 65. В одном аспекте изобретение касается выделенной нуклеотидной последовательности, включающей SEQ ID NO: 54. В одном аспекте изобретение касается выделенной нуклеотидной последовательности, включающей SEQ ID NO: 65. В одном аспекте изобретение касается выделенной нуклеотидной последовательности, включающей SEQ ID NO: 73.A05: In one aspect, the invention relates to an isolated polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 (A05), in which the N-terminal Cys at
А12: В другом аспекте изобретение касается выделенного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14 (А12), в которой N-концевой Cys делетирован, или SEQ ID NO: 66. Типичные нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID NO: 66, включают SEQ ID NO: 67. В одном аспекте изобретение касается выделенной нуклеотидной последовательности, включающей SEQ ID NO: 67.A12: In another aspect, the invention relates to an isolated polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 (A12), in which the N-terminal Cys is deleted, or SEQ ID NO: 66. Exemplary nucleotide sequences encoding SEQ ID NO: 66 , include SEQ ID NO: 67. In one aspect, the invention relates to an isolated nucleotide sequence comprising SEQ ID NO: 67.
А22: В другом аспекте изобретение касается выделенного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15 (А22), в которой N-концевой Cys делетирован, или SEQ ID NO: 68. Типичные нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID NO: 68, включают SEQ ID NO: 69. В одном аспекте изобретение касается выделенной нуклеотидной последовательности, включающей SEQ ID NO: 69.A22: In another aspect, the invention relates to an isolated polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15 (A22), in which the N-terminal Cys is deleted, or SEQ ID NO: 68. Exemplary nucleotide sequences encoding SEQ ID NO: 68 , include SEQ ID NO: 69. In one aspect, the invention relates to an isolated nucleotide sequence comprising SEQ ID NO: 69.
А62: В одном аспекте изобретение касается выделенного полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 71, причем первые 20 аминокислотных остатков последовательности не содержат цистеина. Предпочтительно полипептид включает аминокислотную последовательность, показанную в позициях 1-184 SEQ ID NO: 71. Полипептид предпочтительно является нелипидированным и непирувилированным. В другом варианте осуществления полипептид является иммуногенным.A62: In one aspect, the invention relates to an isolated polypeptide having an amino acid sequence at least 95% identical to SEQ ID NO: 71, wherein the first 20 amino acid residues of the sequence do not contain cysteine. Preferably the polypeptide comprises the amino acid sequence shown at positions 1-184 of SEQ ID NO: 71. The polypeptide is preferably non-lipidated and non-pyruvilated. In another embodiment, the polypeptide is immunogenic.
В другом варианте осуществления выделенный полипеитид включает фрагмент А62. Типичные фрагменты А62 включает любое количество смежных остатков из SEQ ID NO: 70 или SEQ ID NO: 71. В одном варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность в позициях 158 - 185 SEQ ID NO: 71. В другом варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность в позициях 159 - 186 SEQ ID NO: 71. В одном варианте осуществления полипептид включает, по меньшей мере, 6 смежных аминокислот из аминокислотной последовательности в позициях 185 - 254 SEQ ID NO: 71.In another embodiment, the isolated polypeitide comprises an A62 fragment. Exemplary A62 fragments include any number of contiguous residues from SEQ ID NO: 70 or SEQ ID NO: 71. In one embodiment, the isolated polypeptide comprises the amino acid sequence at positions 158-185 of SEQ ID NO: 71. In another embodiment, the isolated polypeptide comprises the amino acid sequence at positions 159 - 186 of SEQ ID NO: 71. In one embodiment, the polypeptide comprises at least 6 contiguous amino acids from the amino acid sequence at positions 185 - 254 of SEQ ID NO: 71.
В другом аспекте изобретение касается выделенной нуклеиновокислотной последовательности, кодирующей выделенный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 71, при чем первые 20 аминокислотных остатков последовательности не содержат цистеина. Предпочтительно полипептид состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 71. В одном варианте осуществления выделенная нуклеиновокислотная последовательность включает SEQ ID NO: 72.In another aspect, the invention relates to an isolated nucleic acid sequence encoding an isolated polypeptide having an amino acid sequence at least 95% identical to SEQ ID NO: 71, wherein the first 20 amino acid residues of the sequence do not contain cysteine. Preferably, the polypeptide consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 71. In one embodiment, the isolated nucleic acid sequence comprises SEQ ID NO: 72.
В другом аспекте изобретение касается выделенного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 70 (А62), в которой N-концевой Cys делетирован, или SEQ ID NO: 71. Типичные нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID NO: 71, включают SEQ ID NO: 72. В одном аспекте изобретение касается выделенной нуклеотидной последовательности, включающей SEQ ID NO: 72.In another aspect, the invention relates to an isolated polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 70 (A62), in which the N-terminal Cys is deleted, or SEQ ID NO: 71. Exemplary nucleotide sequences encoding SEQ ID NO: 71 include SEQ ID NO: 72. In one aspect, the invention relates to an isolated nucleotide sequence comprising SEQ ID NO: 72.
Иммуногенные композицииImmunogenic compositions
В предпочтительном варианте осуществления описанные авторами композиции, включающие выделенный непирувилированный нелипидированный полипептид ORF2086, являются иммуногенными. Иммуногенные композиции, включающие белок, кодируемый нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria meningitidis, известны специалистам в данной области. Типичные иммуногенные композиции включают описываемые в документе WO 2003/063766 и Публикациях патентных заявок США US 20060257413 и US 20090202593, которые включены в данное описание путем ссылки в полном объеме. Такие описанные авторами иммуногенные композиции включают белок, демонстрирующий бактерицидную активность и обозначенный как белок ORF2086, его иммуногенные части и/или его биологические эквиваленты. Белок ORF2086 означает белок, кодируемый открытой рамкой считывания 2086 вида Neisseria.In a preferred embodiment, the compositions described by the authors, comprising an isolated non-pyruvilated, non-lipidated ORF2086 polypeptide, are immunogenic. Immunogenic compositions comprising a protein encoded by the nucleotide sequence from Neisseria meningitidis ORF2086 are known to those skilled in the art. Exemplary immunogenic compositions include those described in WO 2003/063766 and US Patent Application Publications US 20060257413 and US 20090202593, which are incorporated herein by reference in their entirety. Such immunogenic compositions described by the authors include a protein demonstrating bactericidal activity and designated as the ORF2086 protein, immunogenic portions thereof, and/or biological equivalents thereof. The ORF2086 protein means the protein encoded by the open reading frame 2086 of the Neisseria species.
Белок может быть рекомбинантным белком или выделенным белком из природного вида Neisseria. Например, белки ORF2086 Neisseria могут быть выделены из бактериальных штаммов, например, относящихся к виду Neisseria, включая штаммы Neisseria meningitidis (серогрупп А, В, С, D, W-135, X, Y, Z и 29Е), Neisseria gonorrhoeae и Neisseria lactamica, а также могут быть иммуногенными частями и/или биологическими эквивалентами вышеупомянутых белков.The protein may be a recombinant protein or an isolated protein from a native Neisseria species. For example, Neisseria ORF2086 proteins can be isolated from bacterial strains, such as those of the Neisseria genus, including strains of Neisseria meningitidis (serogroups A, B, C, D, W-135, X, Y, Z, and 29E), Neisseria gonorrhoeae, and Neisseria lactamica, and may also be immunogenic portions and/or biological equivalents of the aforementioned proteins.
Белки ORF2086 включают белки 2086 подсемейства А и белки подсемейства В, их иммуногенные части и/или биологические эквиваленты. Белки 2086 подсемейства А и белки 2086 подсемейства В известны специалистам в данной области; см., например, вышеупомянутую публикацию Fletcher et al., 2004, и Murphy et al., J Infect Dis. 2009 Aug 1; 200(3): 379-89. См. также заявку WO 2003/063766, в которой раскрываются SEQ ID NO с 260 по 278 как представляющие аминокислотные последовательности, ассоциированные с белками 2086 подсемейства А. Кроме того, в документе WO 2003/063766 описываются SEQ ID NO с 279 по 299 как представляющие аминокислотные последовательности, ассоциированные с белками 2086 подсемейства В. Документ WO 2003/063766 включается в данное описание путем ссылки в полном объеме. Белки ORF2086 или их эквиваленты и т.п. могут быть липидированными или нелипидированными. Предпочтительно белок ORF2086 не является липидированным. В альтернативном варианте иммуногенные композиции могут быть комбинациями липидированных и нелипидированных белков ORF2086.ORF2086 proteins include 2086 subfamily A proteins and subfamily B proteins, their immunogenic portions and/or biological equivalents. Subfamily A 2086 proteins and subfamily B 2086 proteins are known to those skilled in the art; see, for example, Fletcher et al., 2004, cited above, and Murphy et al., J Infect Dis. 2009
В (одном) варианте осуществления иммуногенная композиция включает выделенный белок, имеющий по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с белком, кодируемым нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция включает выделенный белок, имеющий по меньшей мере приблизительно 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с белком, кодируемым нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria.In (one) embodiment, the immunogenic composition comprises an isolated protein having at least 95% amino acid sequence identity with the protein encoded by the nucleotide sequence from Neisseria ORF2086. In another embodiment, the immunogenic composition comprises an isolated protein having at least about 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91% , 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% amino acid sequence identity with the protein encoded by the nucleotide sequence from Neisseria ORF2086.
В одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает выделенный белок, имеющий по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с белком подсемейства А, кодируемым нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria. Предпочтительно иммуногенная композиция включает выделенный белок подсемейства А, кодируемый нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria. В некоторых вариантах осуществления полипептид ORF2086 подсемейства А представляет собой вариант А05, А04, А12, А62 или А22. В некоторых вариантах осуществления полипептид ORF2086 подсемейства А представляет собой вариант А05, А12 или А22.In one embodiment, the immunogenic composition comprises an isolated protein having at least 95% amino acid sequence identity with a subfamily A protein encoded by a nucleotide sequence from Neisseria ORF2086. Preferably, the immunogenic composition comprises an isolated subfamily A protein encoded by a nucleotide sequence from Neisseria ORF2086. In some embodiments, the subfamily A ORF2086 polypeptide is an A05, A04, A12, A62, or A22 variant. In some embodiments, the subfamily A ORF2086 polypeptide is an A05, A12, or A22 variant.
Комбинация полипептидов подсемейства А: В одном варианте осуществления композиция включает любую комбинацию полипептидов ORF2086 подсемейства А. Типичные комбинации полипептидов ORF2086 подсемейства А включают, например, А05 и А12; А05 и А22; А05 и А62; А12 и А62; А12 и А22; А22 и А62; А05, А12 и А22; А05, А12 и А62; А12, А22 и А62; и А05, А22 и А62. Предпочтительно полипептид ORF2086 подсемейства А является нелипидированным и непирувилированным.Combination of subfamily A polypeptides: In one embodiment, the composition comprises any combination of subfamily A ORF2086 polypeptides. Exemplary combinations of subfamily A ORF2086 polypeptides include, for example, A05 and A12; A05 and A22; A05 and A62; A12 and A62; A12 and A22; A22 and A62; A05, A12 and A22; A05, A12 and A62; A12, A22 and A62; and A05, A22 and A62. Preferably, the subfamily A ORF2086 polypeptide is non-lipidated and non-pyruvilated.
В другом варианте осуществления иммуногенная композиция включает выделенный белок, имеющий по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с белком подсемейства В, кодируемым нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria. Предпочтительно иммуногенная композиция включает выделенный белок подсемейства В, кодируемый нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria. В некоторых вариантах осуществления белок ORF2086 подсемейства В представляет собой вариант В44, В02, В03, В22, В24 или В09. В некоторых вариантах осуществления белок ORF2086 подсемейства В представляет собой вариант В44, В22 или В09.In another embodiment, the immunogenic composition comprises an isolated protein having at least 95% amino acid sequence identity with a B subfamily protein encoded by a nucleotide sequence from Neisseria ORF2086. Preferably, the immunogenic composition comprises an isolated B subfamily protein encoded by a nucleotide sequence from Neisseria ORF2086. In some embodiments, the subfamily B ORF2086 protein is a B44, B02, B03, B22, B24, or B09 variant. In some embodiments, the subfamily B ORF2086 protein is a B44, B22, or B09 variant.
Комбинация полипептидов подсемейства В: В одном варианте осуществления композиция включает любую комбинацию полипептидов ORF2086 подсемейства В. Типичные комбинации полипептидов ORF2086 подсемейства В включают, например, В09 и В22; В22 и В44; В44 и В09; В01 и В09; В01 и В22; В01 и В44; и В09, В22 и В44; В09 и В24; В22 и В24; В24 и В44; В01 и В24; В02 и В24; В02 и В01; В02 и В09; В02 и В44; В01, В09 и В24; В01, В24 и В44.Combination of Subfamily B Polypeptides: In one embodiment, the composition comprises any combination of subfamily B ORF2086 polypeptides. Exemplary combinations of subfamily B ORF2086 polypeptides include, for example, B09 and B22; B22 and B44; B44 and B09; B01 and B09; B01 and B22; B01 and B44; and B09, B22 and B44; B09 and B24; B22 and B24; B24 and B44; B01 and B24; B02 and B24; B02 and B01; B02 and B09; B02 and B44; B01, B09 and B24; B01, B24 and B44.
В предпочтительном варианте осуществления иммуногенная композиция включает выделенный непирувилированный нелипидированный полипептид, имеющий по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с белком подсемейства В, кодируемым нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria. Например, в некоторых вариантах осуществления белок ORF2086 подсемейства В представляет собой последовательности, выбранные из В44, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 21; В02, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 16; В03, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 17; В22, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 19; В24, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 20; В01, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 58; или вариант В09, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 18, в которой N-концевой Cys делетирован, или их комбинацию.In a preferred embodiment, the immunogenic composition comprises an isolated, non-pyruvilated, non-lipidated polypeptide having at least 95% amino acid sequence identity with a B subfamily protein encoded by a nucleotide sequence from Neisseria ORF2086. For example, in some embodiments, the subfamily B ORF2086 protein is sequences selected from B44, with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21; B02, with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16; B03, with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17; B22, with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19; B24, with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20; B01, with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 58; or variant B09, with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18, in which the N-terminal Cys is deleted, or a combination thereof.
В более предпочтительном варианте иммуногенная композиция включает непирувилированный нелипидированный полипептид В09, непирувилированный нелипидированный полипептид В44 или их комбинации. В одном варианте осуществления композиция включает непирувилированный нелипидированный вариант В09, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 18, в которой N-концевой Cys делетирован, непирувилированный нелипидированный В44, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой Cys делетирован, или их комбинацию. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция включает непирувилированный нелипидированный В09, имеющий последовательность SEQ ID NO: 49, непирувилированный нелипидированный В44, имеющий последовательность SEQ ID NO: 44, или их комбинацию.In a more preferred embodiment, the immunogenic composition comprises a non-pyruvilated non-lipidated B09 polypeptide, a non-pyruvilated non-lipidated B44 polypeptide, or combinations thereof. In one embodiment, the composition comprises a non-pyruvilated, non-lipidated B09 variant having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18, in which the N-terminal Cys is deleted, a non-pyruvilated, non-lipidated B44 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21, in which N -terminal Cys is deleted, or a combination thereof. In another embodiment, the immunogenic composition comprises non-pyruvilated non-lipidated B09 having the sequence of SEQ ID NO: 49, non-pyruvilated non-lipidated B44 having the sequence of SEQ ID NO: 44, or a combination thereof.
В одном аспекте изобретение касается иммуногенной композиции, которая включает полипептид ORF2086 подсемейства В из серогруппы В N. meningitidis, причем полипептид является непирувилированным нелипидированным В44. В44 может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой Cys делетирован, или SEQ ID NO: 44. В одном варианте осуществления композиция также включает второй полипептид ORF2086 подсемейства В из серогруппы В N. meningitidis, причем второй полипептид является непирувилированным нелипидированным В09. В09 может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 18, в которой N-концевой Cys делетирован, или SEQ ID NO: 49. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция является вакциной.In one aspect, the invention relates to an immunogenic composition that comprises an ORF2086 subfamily B polypeptide from N. meningitidis serogroup B, wherein the polypeptide is non-pyruvilated, non-lipidated B44. B44 may include the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21, in which the N-terminal Cys is deleted, or SEQ ID NO: 44. In one embodiment, the composition also includes a second ORF2086 subfamily B polypeptide from N. meningitidis serogroup B, the second the polypeptide is non-pyruvilated, non-lipidated B09. B09 may include the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18, in which the N-terminal Cys is deleted, or SEQ ID NO: 49. In one embodiment, the immunogenic composition is a vaccine.
В другом варианте осуществления композиция включает не более 3-х полипептидов ORF2086 подсемейства В. В еще одном варианте осуществления композиция включает не более 2-х полипептидов ORF2086 подсемейства В.In another embodiment, the composition comprises no more than 3 subfamily B ORF2086 polypeptides. In yet another embodiment, the composition comprises no more than 2 subfamily B ORF2086 polypeptides.
В еще одном варианте осуществления композиция включает не более 1, 2 или 3-х видов варианта ORF2086 подсемейства В. В еще одном варианте осуществления композиция включает не более 1, 2 или 3-х видов варианта ORF2086 подсемейства А.In yet another embodiment, the composition includes no more than 1, 2, or 3 species of a subfamily B ORF2086 variant.
Композиции, включающие полипептид подсемейства В и полипептид подсемейства А: В одном варианте осуществления композиция также включает один или несколько полипептидов ORF2086 подсемейства А. В предпочтительном варианте осуществления композиция включает полипептид А05 подсемейства А. В более предпочтительном варианте полипептид А05 подсемейства А является нелипидированным и непирувилированным. В другом предпочтительном варианте осуществления композиция включает полипептид А62 подсемейства А. В более предпочтительном варианте полипептид А62 подсемейства А является нелипидированным и непирувилированным.Compositions comprising a subfamily B polypeptide and a subfamily A polypeptide: In one embodiment, the composition also comprises one or more subfamily A ORF2086 polypeptides. In a preferred embodiment, the composition comprises an A05 subfamily A polypeptide. In another preferred embodiment, the composition comprises an A62 subfamily A polypeptide. In a more preferred embodiment, the A62 subfamily A polypeptide is non-lipidated and non-pyruvilated.
В еще одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает выделенный белок, имеющий по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с белком подсемейства А, кодируемым нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria, и выделенный белок, имеющий по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с белком подсемейства В, кодируемым нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria.In another embodiment, the immunogenic composition comprises an isolated protein having at least 95% amino acid sequence identity with a subfamily A protein encoded by a nucleotide sequence from Neisseria ORF2086, and an isolated protein having at least 95% amino acid sequence identity with a subfamily B protein, encoded by the nucleotide sequence from Neisseria ORF2086.
Предпочтительно иммуногенная композиция включает выделенный белок подсемейства А, кодируемый нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria, и выделенный белок подсемейства В, кодируемый нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria. В более предпочтительном варианте иммуногенная композиция включает выделенный непирувилированный нелипидированный полипептид ORF2086 подсемейства А и выделенный непирувилированный нелипидированный Полипептид ORF2086 подсемейства В.Preferably, the immunogenic composition comprises an isolated subfamily A protein encoded by a nucleotide sequence from Neisseria ORF2086 and an isolated subfamily B protein encoded by a nucleotide sequence from Neisseria ORF2086. More preferably, the immunogenic composition comprises an isolated non-pyruvilated, non-lipidated subfamily A ORF2086 polypeptide and an isolated, non-pyruvilated, non-lipidated subfamily B ORF2086 polypeptide.
Комбинации: предполагается любая комбинация полипептидов ORF2086. В одном варианте осуществления композиция включает, по меньшей мере, один Полипептид подсемейства А при отсутствии полипептидов подсемейства В. Например, композиция включает только полипептиды подсемейства А. В другом варианте осуществления композиция включает, по меньшей мере, один полипептид подсемейства В при отсутствии полипептидов подсемейства А. Например, композиция включает только полипептиды подсемейства А.Combinations: Any combination of ORF2086 polypeptides is contemplated. In one embodiment, the composition comprises at least one Subfamily A polypeptide in the absence of Subfamily B polypeptides. For example, the composition comprises only Subfamily A polypeptides. In another embodiment, the composition comprises at least one Subfamily B polypeptide in the absence of Subfamily A polypeptides. For example, the composition includes only subfamily A polypeptides.
Иммуногенная композиция может включать любой полипептид подсемейства А или его комбинацию. В некоторых вариантах осуществления полипептид ORF2086 подсемейства А представляет собой вариант А05, А04, А12 или А22. В другом варианте осуществления полипептид ORF2086 подсемейства А включает А62. В предпочтительном варианте осуществления полипептид ORF2086 подсемейства А представляет собой А05, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 13; А04, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 12; А12, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 14; или вариант А22, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 15, в которой N-концевой Cys делетирован, или любую их комбинацию. Еще одна типичная иммуногенная композиция включает комбинацию выделенных непирувилированных нелипидированных полипептидов ORF2086 подсемейства А А05 и А62. Например, иммуногенная композиция может включать полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 55 и полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 71. Еще одна типичная иммуногенная композиция включает комбинацию выделенных непирувилированных нелипидированных Полипептидов ORF2086 подсемейства А А05 и А12. Другая типичная иммуногенная композиция включает комбинацию выделенных непирувилированных нелипидированных полипептидов ORF2086 подсемейства А А12 и А62.The immunogenic composition may include any subfamily A polypeptide or a combination thereof. In some embodiments, the subfamily A ORF2086 polypeptide is an A05, A04, A12, or A22 variant. In another embodiment, the subfamily A ORF2086 polypeptide comprises A62. In a preferred embodiment, the subfamily A ORF2086 polypeptide is A05, with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13; A04, with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12; A12, with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14; or variant A22, with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15, in which the N-terminal Cys is deleted, or any combination thereof. Another exemplary immunogenic composition comprises a combination of isolated non-pyruvilated, non-lipidated ORF2086 subfamily A polypeptides A05 and A62. For example, an immunogenic composition may include a polypeptide having the sequence of SEQ ID NO: 55 and a polypeptide having the sequence of SEQ ID NO: 71. Another exemplary immunogenic composition includes a combination of isolated non-pyruvilated, non-lipidated ORF2086 Subfamily A Polypeptides A05 and A12. Another exemplary immunogenic composition comprises a combination of isolated non-pyruvilated, non-lipidated ORF2086 subfamily A A12 and A62 polypeptides.
Иммуногенная композиция может включать любой из полипептидов подсемейства В или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления белок ORF2086 подсемейства В представляет собой вариант В44, В02, В03, В22, В24 или В09. В предпочтительном варианте осуществления белок ORF2086 подсемейства В представляет собой В44, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 21; В02, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 16; В03, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 17; В22, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 19; В24, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 20; или вариант В09, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 18, в которой N-концевой Cys делетирован, или их комбинацию. Еще одна типичная иммуногенная композиция включает комбинацию выделенных непирувилированных нелипидированных полипептидов ORF2086 подсемейства В В09 и В44. Еще одна типичная иммуногенная композиция включает комбинацию выделенных непирувилированных нелипидированных полипептидов ORF2086 подсемейства В В09 и В22. Другая типичная иммуногенная композиция включает комбинацию выделенных непирувилированных нелипидированных полипептидов ORF2086 подсемейства В В22 и В44. Дополнительная типичная иммуногенная композиция включает комбинацию выделенных непирувилированных нелипидированных полипептидов ORF2086 подсемейства В В09, В22 и В44.The immunogenic composition may include any of the B subfamily polypeptides or a combination thereof. In some embodiments, the subfamily B ORF2086 protein is a B44, B02, B03, B22, B24, or B09 variant. In a preferred embodiment, the subfamily B ORF2086 protein is B44, with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21; B02, with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16; B03, with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17; B22, with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19; B24, with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20; or variant B09, with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18, in which the N-terminal Cys is deleted, or a combination thereof. Another exemplary immunogenic composition comprises a combination of isolated non-pyruvilated, non-lipidated ORF2086 subfamily B B09 and B44 polypeptides. Another exemplary immunogenic composition comprises a combination of isolated non-pyruvilated, non-lipidated ORF2086 subfamily B B09 and B22 polypeptides. Another exemplary immunogenic composition comprises a combination of isolated non-pyruvilated, non-lipidated ORF2086 subfamily B B22 and B44 polypeptides. An additional exemplary immunogenic composition comprises a combination of isolated non-pyruvilated non-lipidated ORF2086 subfamily B09, B22 and B44 polypeptides.
В одном варианте осуществления композиция включает нелипидированный полипептид ORF2086 при отсутствии липидированного полипептида ORF2086. В другом варианте осуществления композиция включает нелипидированный полипептид ORF2086 и по меньшей мере один липидированный полипептид ORF2086.In one embodiment, the composition comprises a non-lipidated ORF2086 polypeptide in the absence of a lipidated ORF2086 polypeptide. In another embodiment, the composition comprises a non-lipidated ORF2086 polypeptide and at least one lipidated ORF2086 polypeptide.
В одном варианте осуществления композиция включает непирувилированный нелипидированный полипептид ORF2086 при отсутствии липидированного полипептида ORF2086. В другом варианте осуществления композиция включает липидированный полипептид ORF2086 и непирувилированный нелипидированный полипептид ORF2086. Например, композиция может включать липидированный полипептид А05, имеющий последовательность SEQ ID NO: 76, и непирувилированный нелипидированный А05, имеющий последовательность SEQ ID NO: 77. Другая типичная композиция включает липидированный полипептид А05, имеющий последовательность SEQ ID NO: 76, и непирувилированный нелипидированный А62, имеющий последовательность SEQ ID NO: 71. Дополнительная типичная композиция включает липидированный полипептид В01, имеющий последовательность SEQ ID NO: 58, и непирувилированный нелипидированный А62, имеющий последовательность SEQ ID NO: 71.In one embodiment, the composition comprises a non-pyruvilated, non-lipidated ORF2086 polypeptide in the absence of a lipidated ORF2086 polypeptide. In another embodiment, the composition comprises a lipidated ORF2086 polypeptide and a non-pyruvilated non-lipidated ORF2086 polypeptide. For example, the composition may include a lipidated A05 polypeptide having the sequence of SEQ ID NO: 76 and a non-pyruvilated non-lipidated A05 having the sequence of SEQ ID NO: 77. Another exemplary composition includes a lipidated A05 polypeptide having the sequence of SEQ ID NO: 76 and a non-pyruvilated non-lipidated A62 having the sequence of SEQ ID NO: 71. An additional exemplary composition includes a lipidated B01 polypeptide having the sequence of SEQ ID NO: 58 and a non-pyruvilated non-lipidated A62 having the sequence of SEQ ID NO: 71.
Типичные комбинации: одна типичная иммуногенная композиция включает комбинацию выделенных нелипидированных полипептидов ORF2086 А05, В09, В22 и В44. Например, иммуногенная композиция может включать непирувилированный нелипидированный полипептид ORF2086 подсемейства А А05 (SEQ ID NO: 55) и выделенные непирувилированные нелипидированные полипептиды ORF2086 подсемейства В В09 (SEQ ID NO: 49), В22 (SEQ ID NO: 75) и B44 (SEQ ID NO: 44).Exemplary Combinations: One exemplary immunogenic composition comprises a combination of isolated non-lipidated ORF2086 polypeptides A05, B09, B22 and B44. For example, the immunogenic composition may include non-pyruvilated non-lipidated ORF2086 subfamily A polypeptide A05 (SEQ ID NO: 55) and isolated non-pyruvilated non-lipidated ORF2086 subfamily B polypeptides B09 (SEQ ID NO: 49), B22 (SEQ ID NO: 75) and B44 (SEQ ID NO: 75). NO: 44).
Другая типичная иммуногенная композиция включает комбинацию выделенных непирувилированных нелипидированных полипептидов ORF2086 подсемейства А А05 и А12 и выделенных непирувилированных нелипидированных полипептидов ORF2086 подсемейства В В22 и В44. Еще одна типичная иммуногенная композиция включает выделенные непирувилированные нелипидированные полипептиды А05, А12, В09 и В44. Еще один пример включает выделенные непирувилированные нелипидированные полипептиды А12, А62, В09 и В44. Еще один пример включает выделенные непирувилированные нелипидированные полипептиды А05, А12, А62, В09 и В44. Другая типичная иммуногенная композиция включает выделенные непирувилированные нелипидированные полипептиды А62 и В09. Другая типичная иммуногенная композиция включает выделенные непирувилированные нелипидированные полипептиды А62 и В44. Другая типичная иммуногенная композиция включает выделенные непирувилированные нелипидированные полипептиды А62, В09 и В44. Другая типичная иммуногенная композиция включает выделенные непирувилированные нелипидированные полипептиды А05, А62 и В44. Другая типичная иммуногенная композиция включает выделенные непирувилированные нелипидированные полипептиды А05, А62, В09 и В44.Another exemplary immunogenic composition comprises a combination of isolated non-pyruvilated non-lipidated ORF2086 subfamily A polypeptides A05 and A12 and isolated non-pyruvilated non-lipidated ORF2086 subfamily B polypeptides B22 and B44. Another exemplary immunogenic composition includes isolated non-pyruvilated, non-lipidated A05, A12, B09 and B44 polypeptides. Another example includes isolated non-pyruvilated non-lipidated A12, A62, B09 and B44 polypeptides. Another example includes isolated non-pyruvilated non-lipidated polypeptides A05, A12, A62, B09 and B44. Another exemplary immunogenic composition includes isolated, non-pyruvilated, non-lipidated A62 and B09 polypeptides. Another exemplary immunogenic composition includes isolated, non-pyruvilated, non-lipidated A62 and B44 polypeptides. Another exemplary immunogenic composition includes isolated, non-pyruvilated, non-lipidated A62, B09, and B44 polypeptides. Another exemplary immunogenic composition includes isolated, non-pyruvilated, non-lipidated A05, A62, and B44 polypeptides. Another exemplary immunogenic composition includes isolated non-pyruvilated non-lipidated polypeptides A05, A62, B09 and B44.
В одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает белок подсемейства А и белок подсемейства В в соотношении 1:1. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция включает любое из следующих соотношений полипептида подсемейства А с полипептидом подсемейства В: 1:1; 1:2; 1:3; 1:4; 1:5; 1:6; 1:7; 1:8; 1:9; или 1:10. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция включает любое из следующих соотношений полипептида подсемейства В с полипептидом подсемейства А: 1:1; 1:2; 1:3; 1:4; 1:5; 1:6; 1:7; 1:8; 1:9; или 1:10.In one embodiment, the immunogenic composition comprises a subfamily A protein and a subfamily B protein in a 1:1 ratio. In another embodiment, the immunogenic composition comprises any of the following ratios of subfamily A polypeptide to subfamily B polypeptide: 1:1; 1:2; 1:3; 1:4; 1:5; 1:6; 1:7; 1:8; 1:9; or 1:10. In another embodiment, the immunogenic composition comprises any of the following ratios of subfamily B polypeptide to subfamily A polypeptide: 1:1; 1:2; 1:3; 1:4; 1:5; 1:6; 1:7; 1:8; 1:9; or 1:10.
Бактерицидные иммунные реакцииBactericidal immune responses
В одном аспекте описанные авторами выделенные полипептиды и композиции вызывают у млекопитающего бактерицидную иммунную реакцию против инфекции любой серогруппы N. meningitidis, такой, как серогруппа, выбранная из числа серогрупп А, В, С, Е29, Н, I, K, L, W-135, X, Y и Z. В предпочтительном варианте осуществления описанные авторами выделенные полипептиды и композиции вызывают у млекопитающего бактерицидную иммунную реакцию против инфекции из серогрупп А, В, С, W-135, Y и/или X.In one aspect, the isolated polypeptides and compositions described by the authors elicit a bactericidal immune response in a mammal against infection by any N. meningitidis serogroup, such as a serogroup selected from serogroups A, B, C, E29, H, I, K, L, W- 135, X, Y and Z. In a preferred embodiment, the isolated polypeptides and compositions described by the authors elicit a bactericidal immune response in a mammal against infection from serogroups A, B, C, W-135, Y and/or X.
В другом аспекте описанные авторами выделенные полипептиды и композиции вызывают у млекопитающего бактерицидную иммунную реакцию против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis. Композиции способны индуцировать бактерицидные антименингококковые антитела после введения млекопитающему и в предпочтительных вариантах осуществления могут индуцировать антитела, являющиеся бактерицидными против штаммов с соответствующими подсемействами. Дополнительная информация о бактерицидных реакциях представлена ниже. См., например, Примеры 6, 11, 12 и 13.In another aspect, the isolated polypeptides and compositions described by the authors elicit a bactericidal immune response against an N. meningitidis serogroup B ORF2086 polypeptide in a mammal. The compositions are capable of inducing bactericidal anti-meningococcal antibodies upon administration to a mammal and, in preferred embodiments, may induce antibodies that are bactericidal against strains with appropriate subfamilies. Additional information on bactericidal reactions is provided below. See, for example, Examples 6, 11, 12 and 13.
В одном варианте осуществления композиции вызывают бактерицидную иммунную реакцию против гетерологичного подсемейства серогруппы В N. meningitidis. Например, композиция, включающая нелипидированный полипептид подсемейства А, может вызывать бактерицидную иммунную реакцию против варианта N. meningitidis подсемейства А серогруппы В и/или против варианта N. meningitidis подсемейства В серогруппы В. См., например, Примеры 18-19.In one embodiment, the compositions elicit a bactericidal immune response against a heterologous serogroup B subfamily of N. meningitidis. For example, a composition comprising a non-lipidated subfamily A polypeptide can elicit a bactericidal immune response against the N. meningitidis subfamily A serogroup B variant and/or against the N. meningitidis subfamily B serogroup B variant. See, for example, Examples 18-19.
В другом аспекте описанные авторами выделенные полипептиды и композиции вызывают бактерицидную иммунную реакцию против по меньшей мере одного из штаммов N. meningitidis серогруппы А, серогруппы В, серогруппы С, серогруппы W135 и/или серогруппы Y. В предпочтительном варианте осуществления композиции вызывают бактерицидную иммунную реакцию по меньшей мере против серогруппы В, серогруппы С и серогруппы Y N. meningitidis. См., например, Пример 21.In another aspect, the isolated polypeptides and compositions described by the authors elicit a bactericidal immune response against at least one of N. meningitidis serogroup A, serogroup B, serogroup C, serogroup W135, and/or serogroup Y strains. In a preferred embodiment, the compositions elicit a bactericidal immune response against at least against N. meningitidis serogroup B, serogroup C, and serogroup Y. See, for example, Example 21.
Бактерицидные антитела являются показателем защиты для человека, и доклинические исследования служат в качестве суррогата, и любая описанная авторами новая потенциально иммуногенная композиция должна вызывать выработку этих функциональных антител.Bactericidal antibodies are an indicator of human protection, and preclinical studies serve as a surrogate, and any new potentially immunogenic composition described by the authors should induce the production of these functional antibodies.
В09: В одном аспекте выделенный нелипидированный полипептид В09 и их иммуногенные композиции, вызывает выработку бактерицидных антител (например, способных связываться) против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis, подсемейство В. В типичном варианте осуществления выделенный непирувилированный нелипидированный полипептид В09, имеющий последовательность SEQ ID NO: 18, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, или SEQ ID NO: 49, и их иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител (например, способных связываться) против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis, подсемейство А или, предпочтительно, подсемейство В. Предпочтительно непирувилированный нелипидированный полипептид В09 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител против варианта АО 5 (SEQ ID NO: 13); варианта В44 (SEQ ID NO: 21); варианта B16 (SEQ ID NO: 60); варианта B24 (SEQ ID NO: 20); варианта B09 (SEQ ID NO: 18) или их комбинации. В типичном варианте осуществления непирувилированный нелипидированный полипептид В09 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител против варианта В44 (SEQ ID NO: 21); варианта В16 (SEQ ID NO: 60); варианта B24 (SEQ ID NO: 20); варианта B09 (SEQ ID NO: 18) или их комбинации. См., например, Пример 11, Пример 12 и Пример 13.B09: In one aspect, the isolated non-lipidated B09 polypeptide and immunogenic compositions thereof, elicits bactericidal antibodies (e.g., capable of binding) against the ORF2086 polypeptide from N. meningitidis serogroup B, subfamily B. In a typical embodiment, the isolated non-pyruvilated, non-lipidated B09 polypeptide having the sequence SEQ ID NO: 18, in which the N-terminal Cys at
В44: В одном аспекте выделенный нелипидированный полипептид В44 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител (например, способных связываться) против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis, подсемейство В. В другом типичном варианте осуществления выделенный непирувилированный нелипидированный полипептид В44, имеющий последовательность SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, или SEQ ID NO: 44 и их иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител (например, способных связываться) против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis, подсемейство В. Предпочтительно непирувилированный нелипидированный полипептид В44 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител против варианта В44 (SEQ ID NO: 21); варианта В16 (SEQ ID NO: 60); варианта B24 (SEQ ID NO: 20); варианта B09 (SEQ ID NO: 18) или их комбинации. См., например, Пример 11. Кроме того, непирувилированный нелипидированный полипептид В44 и его иммуногенные композиции также могут вызывать выработку бактерицидных антител, которые связываются с вариантом В02 (SEQ ID NO: 16). См., например, Пример 12 и Пример 13. Кроме того, непирувилированный нелипидированный полипептид В44 и его иммуногенные композиции также могут вызывать выработку бактерицидных антител, которые связываются с вариантом В03 (SEQ ID NO: 17) и вариантом В15 (SEQ ID NO: 59). См., например, Пример 6.B44: In one aspect, the isolated non-lipidated B44 polypeptide and immunogenic compositions thereof cause the production of bactericidal antibodies (e.g., capable of binding) against the ORF2086 polypeptide from N. meningitidis serogroup B, subfamily B. In another exemplary embodiment, the isolated non-pyruvilated, non-lipidated B44 polypeptide having the sequence SEQ ID NO: 21, in which the N-terminal Cys at
В22: В одном аспекте выделенный нелипидированный полипептид В22 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител (например, способных связываться) против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis, подсемейство В. В еще одном типичном варианте осуществления выделенный непирувилированный нелипидированный полипептид В22, имеющий последовательность SEQ ID NO: 19, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител (например, способных связываться) против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis, подсемейство В. Предпочтительно непирувилированный нелипидированный полипептид В22 вызывает выработку бактерицидных антител против варианта В44 (SEQ ID NO: 21); варианта В16 (SEQ ID NO: 60); варианта B24 (SEQ ID NO: 20); варианта B09 (SEQ ID NO: 18) или их комбинации. См., например, Пример 13.B22: In one aspect, the isolated non-lipidated B22 polypeptide and immunogenic compositions thereof elicit bactericidal antibodies (e.g., capable of binding) against the ORF2086 polypeptide from N. meningitidis serogroup B, subfamily B. In yet another exemplary embodiment, the isolated non-pyruvilated, non-lipidated B22 polypeptide having the sequence SEQ ID NO: 19 wherein the N-terminal Cys at
А05: В одном аспекте выделенный нелипидированный полипептид А05 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител (например, способных связываться) против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis, подсемейство А. В одном варианте осуществления выделенный непирувилированный нелипидированный полипептид А05, имеющий последовательность SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой Cys делетирован, или SEQ ID NO: 55, и их иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител (например, способных связываться) против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis, подсемейство А. В одном варианте осуществления выделенный полипептид А05 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, в которой цистеин в позиции 1 делетирован. В другом варианте осуществления выделенный полипептид А05 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, в которой цистеин в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. В одном варианте осуществления выделенный полипептид А05 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77. Предпочтительно непирувилированный нелипидированный А05 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител против варианта А05 (SEQ ID NO: 13), варианта А22 (SEQ ID NO: 15), варианта A12 (SEQ ID NO: 14) или их комбинации. См., например, Пример 6 и 13.A05: In one aspect, the isolated non-lipidated A05 polypeptide and immunogenic compositions thereof cause the production of bactericidal antibodies (e.g., capable of binding) against the ORF2086 polypeptide from N. meningitidis serogroup B, subfamily A. In one embodiment, the isolated non-pyruvilated, non-lipidated A05 polypeptide having the sequence of SEQ ID NO: 13, in which the N-terminal Cys is deleted, or SEQ ID NO: 55, and their immunogenic compositions cause the production of bactericidal antibodies (eg, capable of binding) against the ORF2086 polypeptide from N. meningitidis serogroup B, subfamily A. In one embodiment, the isolated A05 polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 76 in which the cysteine at
А62: В одном аспекте выделенный нелипидированный полипептид А62 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител (например, способных связываться) против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis, подсемейство А. В одном варианте осуществления выделенный полипептид А62 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70, в которой цистеин в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. В другом варианте осуществления выделенный непирувилированный нелипидированный полипептид А62, имеющий последовательность SEQ ID NO: 70, в которой N-концевой Cys делетирован, или SEQ ID NO: 71, и их иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител (например, способных связываться) против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis, подсемейство А и/или подсемейство В. Например, непирувилированный нелипидированный А62 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител против варианта А05 (SEQ ID NO: 13), варианта А12 (SEQ ID NO: 14), варианта A22 (SEQ ID NO: 15) и варианта A62 (SEQ ID NO: 70). В качестве еще одного примера, непирувилированный нелипидированный А62 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител против варианта А29, варианта В09 и варианта В24. См., например, Примеры 18-19. В другом варианте осуществления непирувилированный нелипидированный А62 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител против варианта В16.A62: In one aspect, the isolated non-lipidated A62 polypeptide and immunogenic compositions thereof elicit bactericidal antibodies (e.g., capable of binding) against the N. meningitidis serogroup B ORF2086 polypeptide, subfamily A. In one embodiment, the isolated A62 polypeptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 70, in which the cysteine at
А12: В одном варианте осуществления выделенный непирувилированный нелипидированный полипептид А12, имеющий последовательность SEQ ID NO: 14, в которой N-концевой Cys делетирован, или SEQ ID NO: 66 и их иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis, подсемейство А и/или подсемейство В. Предпочтительно непирувилированный нелипидированный А12 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител против варианта А05 (SEQ ID NO: 13), варианта А22 (SEQ ID NO: 15), варианта A12 (SEQ ID NO: 14), варианта A62 (SEQ ID NO: 70), варианта A29, вариант B09. См., например, Примеры 18-19.A12: In one embodiment, an isolated non-pyruvilated, non-lipidated A12 polypeptide having the sequence of SEQ ID NO: 14 in which the N-terminal Cys is deleted, or SEQ ID NO: 66 and their immunogenic compositions elicit bactericidal antibodies against the ORF2086 polypeptide from serogroup B N. meningitidis, subfamily A and/or subfamily B. Preferably, non-pyruvilated, non-lipidated A12 and its immunogenic compositions elicit bactericidal antibodies against variant A05 (SEQ ID NO: 13), variant A22 (SEQ ID NO: 15), variant A12 (SEQ ID NO: 14), option A62 (SEQ ID NO: 70), option A29, option B09. See, for example, Examples 18-19.
В одном варианте осуществления выделенный непирувилированный нелипидированный А22 полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 15, в которой N-концевой Cys делетирован, или SEQ ID NO: 68 и их иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител (например, способных связываться) против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis, подсемейство А и/или подсемейство В. Предпочтительно непирувилированный нелипидированный А22 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител против варианта А05 (SEQ ID NO: 13), варианта А22 (SEQ ID NO: 15), варианта A62 (SEQ ID NO: 70), варианта A29. См., например, Примеры 18-19.In one embodiment, an isolated non-pyruvilated, non-lipidated A22 polypeptide having the sequence of SEQ ID NO: 15 in which the N-terminal Cys is deleted, or SEQ ID NO: 68 and their immunogenic compositions elicit bactericidal antibodies (e.g., capable of binding) against the ORF2086 polypeptide from N. meningitidis serogroup B, subfamily A and/or subfamily B. Preferably, non-pyruvilated, non-lipidated A22 and its immunogenic compositions elicit bactericidal antibodies against variant A05 (SEQ ID NO: 13), variant A22 (SEQ ID NO: 15), variant A62 ( SEQ ID NO: 70), option A29. See, for example, Examples 18-19.
Способ вызывания выработки бактерицидных антителMethod for inducing the production of bactericidal antibodies
В одном аспекте изобретение касается способа выработки у млекопитающего бактерицидных антител, специфичных к серогруппе А N. meningitidis. В одном аспекте изобретение касается способа выработки у млекопитающего бактерицидных антител, специфичных к серогруппе С N. meningitidis. В одном аспекте изобретение касается способа выработки у млекопитающего бактерицидных антител, специфичных к серогруппе W135 N. meningitidis. В одном аспекте изобретение касается способа выработки у млекопитающего бактерицидных антител, специфичных к серогруппе X N. meningitidis. В одном аспекте изобретение касается способа выработки у млекопитающего бактерицидных антител, специфичных к серогруппе Y N. meningitidis. В одном аспекте изобретение касается способа выработки у млекопитающего бактерицидных антител, специфичных к серогруппам А, В, С, W-135, X и/или Y N. meningitidis. В одном аспекте изобретение касается способа выработки у млекопитающего бактерицидных антител, специфичных к серогруппе В N. meningitidis. В типичном варианте осуществления способ включает вызывание выработки бактерицидных антител, специфичных к ORF2086 подсемейства В серогруппы В N. meningitidis, ORF2086 подсемейства А серогруппы В N. meningitidis или их комбинации.In one aspect, the invention relates to a method for generating bactericidal antibodies specific for N. meningitidis serogroup A in a mammal. In one aspect, the invention relates to a method for generating bactericidal antibodies specific for N. meningitidis serogroup C in a mammal. In one aspect, the invention relates to a method for generating bactericidal antibodies specific for N. meningitidis serogroup W135 in a mammal. In one aspect, the invention relates to a method for generating bactericidal antibodies specific for N. meningitidis serogroup X in a mammal. In one aspect, the invention relates to a method for generating bactericidal antibodies specific for N. meningitidis serogroup Y in a mammal. In one aspect, the invention relates to a method for generating bactericidal antibodies specific for N. meningitidis serogroups A, B, C, W-135, X and/or Y in a mammal. In one aspect, the invention relates to a method for generating bactericidal antibodies specific for N. meningitidis serogroup B in a mammal. In a typical embodiment, the method includes causing the production of bactericidal antibodies specific for N. meningitidis serogroup B subfamily B ORF2086, N. meningitidis serogroup B subfamily A ORF2086, or combinations thereof.
Способ включает введение млекопитающему эффективного количества выделенного непирувилированного нелипидированного полипептида 2086 или его иммуногенной композиции, как описывается выше. См., например, Примеры 18-19 и 22.The method includes administering to the mammal an effective amount of an isolated, non-pyruvilated, non-lipidated 2086 polypeptide, or an immunogenic composition thereof, as described above. See, for example, Examples 18-19 and 22.
В предпочтительном варианте осуществления способ включает вызывание выработки бактерицидных антител, специфичных к ORF2086 подсемейства В серогруппы В N. meningitidis. Выделенный полипептид или иммуногенная композиция включают непирувилированный нелипидированный полипептид В44. В другом предпочтительном варианте осуществления композиция также включает непирувилированный нелипидированный полипептид В09. В типичном варианте осуществления выделенный полипептид или иммуногенная композиция включают SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 44, или их комбинация. В другом типичном варианте осуществления выделенный полипептид или иммуногенная композиция включают SEQ ID NO: 18, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, или их комбинацию. В еще одном типичном варианте осуществления выделенный полипептид или иммуногенная композиция включают SEQ ID NO: 19, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция для вызывания выработки бактерицидных антител, специфичных к ORF2086 подсемейства В серогруппы В N. meningitidis, включает, по меньшей мере, один из непирувилированных нелипидированных полипептидов А05, А12 и А62. См., например, Пример 19.In a preferred embodiment, the method comprises inducing the production of bactericidal antibodies specific for N. meningitidis subfamily B serogroup B ORF2086. The isolated polypeptide or immunogenic composition comprises a non-pyruvilated, non-lipidated B44 polypeptide. In another preferred embodiment, the composition also includes a non-pyruvilated, non-lipidated B09 polypeptide. In a typical embodiment, the isolated polypeptide or immunogenic composition comprises SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 44, or a combination thereof. In another exemplary embodiment, the isolated polypeptide or immunogenic composition comprises SEQ ID NO: 18 wherein the N-terminal Cys at
В предпочтительном варианте осуществления способ включает вызывание выработки бактерицидных антител, специфичных к ORF2086 подсемейства А серогруппы В N. meningitidis. Выделенный полипептид или иммуногенная композиция включают непирувилированный нелипидированный полипептид А05. В предпочтительном варианте осуществления выделенный полипептид или иммуногенная композиция включают SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован. В другом предпочтительном варианте осуществления композиция также включает непирувилированный нелипидированный полипептид В44. См., например, Пример 6 и 13. В типичном варианте осуществления выделенный полипептид или иммуногенная композиция включают SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 44 или их комбинацию. В предпочтительном варианте осуществления выделенный полипептид или иммуногенная композиция включают SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, или их комбинацию. В другом типичном варианте осуществления выделенный полипептид или иммуногенная композиция включают SEQ ID NO: 77 (А05), SEQ ID NO: 44 (B44) или их комбинацию. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция для вызывания выработки бактерицидных антител, специфичных к ORF2086 подсемейства А серогруппы В N. meningitidis включает, по меньшей мере, один из непирувилированных нелипидированных полипептидов А05, А12 и А62. См., например, Примеры 18-19.In a preferred embodiment, the method comprises inducing the production of bactericidal antibodies specific for N. meningitidis serogroup B subfamily A ORF2086. The isolated polypeptide or immunogenic composition includes a non-pyruvilated, non-lipidated A05 polypeptide. In a preferred embodiment, the isolated polypeptide or immunogenic composition comprises SEQ ID NO: 13 wherein the N-terminal Cys at
Когда типичную иммуногенную композицию, включающую по меньшей мере два непирувилированных нелипидированных полипептида ORF2086, как описывается выше, вводили млекопитающим, авторами изобретения неожиданно было обнаружено, что может возникать синергетическая бактерицидная иммунная реакция против серогруппы В Neisseria meningitidis по сравнению с иммуногенной композицией, включающей один соответствующий непирувилированный нелипидированный полипептид ORF2086. См., например, Пример 19. Соответственно, в одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает, по меньшей мере, первый непирувилированный нелипидированный полипептид ORF2086, действующий синергетически с по меньшей мере вторым пирувилированным нелипидированным полипептидом ORF2086 для вызывания иммунной реакции против серогруппы В Neisseria meningitidis.When a typical immunogenic composition comprising at least two non-pyruvilated, non-lipidated ORF2086 polypeptides, as described above, was administered to mammals, the inventors surprisingly found that a synergistic bactericidal immune response against Neisseria meningitidis serogroup B can occur compared to an immunogenic composition comprising a single corresponding non-pyruvilated nonlipidated ORF2086 polypeptide. See, for example, Example 19. Accordingly, in one embodiment, the immunogenic composition comprises at least a first non-pyruvilated, non-lipidated ORF2086 polypeptide acting synergistically with at least a second pyruvilated, non-lipidated ORF2086 polypeptide to elicit an immune response against Neisseria meningitidis serogroup B.
В другом аспекте изобретение касается способа выработки у млекопитающего бактерицидных антител, специфичных к серогруппе С N. meningitidis. Способ включает введение млекопитающему эффективного количества выделенного непирувилированного нелипидированного полипептида 2086 из N. meningitidis серогруппы В или его иммуногенной композиции, как описывается выше. См., например, Пример 22. В одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 71, или аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21, в которой цистеин в позиции 1 делетирован. В одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 71, или аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21, в которой цистеин в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция также включает, по меньшей мере, один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А, b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С, с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135 и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y. Типичная иммуногенная композиция включает, по меньшей мере, выделенный непирувилированный нелипидированный полипептид А62 и а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А, b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С, с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135 и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.In another aspect, the invention relates to a method for generating bactericidal antibodies specific for N. meningitidis serogroup C in a mammal. The method comprises administering to the mammal an effective amount of an isolated, non-pyruvilated, non-lipidated 2086 polypeptide from N. meningitidis serogroup B, or an immunogenic composition thereof, as described above. See, for example, Example 22. In one embodiment, the polypeptide comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 71 or an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21, in which the cysteine in
В другом аспекте изобретение касается способа выработки у млекопитающего бактерицидных антител, специфичных к серогруппе Y N. meningitidis. Способ включает введение млекопитающему эффективного количества выделенного непирувилированного нелипидированного полипептида 2086 из N. meningitidis серогруппы В или его иммуногенной композиции, как описывается выше. См., например, Пример 22. В одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 71, или аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21, в которой цистеин в позиции 1 делетирован. В одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 71, или аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21, в которой цистеин в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция также включает, по меньшей мере, один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А, b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С, с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135 и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.In another aspect, the invention relates to a method for generating bactericidal antibodies specific for N. meningitidis serogroup Y in a mammal. The method comprises administering to the mammal an effective amount of an isolated, non-pyruvilated, non-lipidated 2086 polypeptide from N. meningitidis serogroup B, or an immunogenic composition thereof, as described above. See, for example, Example 22. In one embodiment, the polypeptide comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 71 or an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21, in which the cysteine in
В другом аспекте изобретение касается способа выработки бактерицидных антител, специфичных к серогруппе X N. meningitidis у млекопитающего. Способ включает введение млекопитающему эффективного количества выделенного непирувилированного нелипидированного полипептида 2086 из N. meningitidis серогруппы В или его иммуногенной композиции, как описывается выше. См., например, Пример 22. В одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 71, или аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21, в которой цистеин в позиции 1 делетирован. В одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 71, или аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21, в которой цистеин в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция также включает, по меньшей мере, один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А, b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С, с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135 и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.In another aspect, the invention relates to a method for generating bactericidal antibodies specific for N. meningitidis serogroup X in a mammal. The method comprises administering to the mammal an effective amount of an isolated, non-pyruvilated, non-lipidated 2086 polypeptide from N. meningitidis serogroup B, or an immunogenic composition thereof, as described above. See, for example, Example 22. In one embodiment, the polypeptide comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 71 or an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21, in which the cysteine in
Когда млекопитающему вводили типичную иммуногенную композицию, включающую четыре непирувилированных нелипидированных полипептида ORF2086 и конъюгат капсульного сахарида каждой из серогрупп Neisseria meningitidis А, С, W135 и Y, как описывается выше, авторами изобретения неожиданно было обнаружено, что может быть вызвана синергетическая бактерицидная иммунная реакция по меньшей мере против серогрупп В, С и Y Neisseria meningitidis по сравнению с иммуногенной композицией, включающей полипептиды ORF2086, в которой конъюгаты капсульного сахарида отсутствуют, и по сравнению с иммуногенной композицией, включающей конъюгат капсульного сахарида каждой из серогрупп Neisseria meningitidis А, С, W135 и Y, в которой полипептид ORF2086 отсутствует. См., например, Пример 22. Соответственно, в одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает, по меньшей мере, один непирувилированный нелипидированный полипептид ORF2086, действующий синергетически с по меньшей мере одним конъюгатом капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А, С, W135 и Y для вызывания иммунной реакции против Neisseria meningitidis. Вызванная иммунная реакция может быть направлена против по меньшей мере одной из серогрупп В, С и Y Neisseria meningitidis. Иммуногенная композиция может включать белок, кодируемый нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria, полинуклеотиды или их эквиваленты в качестве единственного активного иммуногена в иммуногенной композиции. В альтернативном варианте иммуногенная композиция также может включать активные иммуногены, включая другие иммуногенные полипептиды видов Neisseria, или иммунологически активные белки одного или нескольких других микробных патогенов (к которым, помимо прочих относятся, например, вирус, прион, бактерия или грибок) или капсульный полисахарид. Композиции могут включать один или несколько нужных белков, фрагментов или фармацевтических соединений, необходимых для выбранного показания.When a typical immunogenic composition comprising four non-pyruvilated, non-lipidated ORF2086 polypeptides and a capsular saccharide conjugate of each of the Neisseria meningitidis serogroups A, C, W135, and Y, as described above, was administered to a mammal, it was unexpectedly found by the inventors that a synergistic bactericidal immune response of at least against Neisseria meningitidis serogroups B, C, and Y compared with an immunogenic composition comprising ORF2086 polypeptides, in which capsular saccharide conjugates are absent, and compared with an immunogenic composition comprising a capsular saccharide conjugate of each of Neisseria meningitidis serogroups A, C, W135, and Y , in which the ORF2086 polypeptide is absent. See, for example, Example 22. Accordingly, in one embodiment, the immunogenic composition comprises at least one non-pyruvilated, non-lipidated ORF2086 polypeptide acting synergistically with at least one Neisseria meningitidis serogroup A, C, W135, and Y capsular saccharide conjugate to cause immune response against Neisseria meningitidis. The elicited immune response may be directed against at least one of Neisseria meningitidis serogroups B, C, and Y. The immunogenic composition may include the protein encoded by the nucleotide sequence from Neisseria ORF2086, polynucleotides, or their equivalents as the sole active immunogen in the immunogenic composition. Alternatively, the immunogenic composition may also include active immunogens, including other immunogenic polypeptides of Neisseria species, or immunologically active proteins of one or more other microbial pathogens (which include, for example, a virus, prion, bacterium, or fungus) or a capsular polysaccharide. The compositions may include one or more desired proteins, fragments or pharmaceutical compounds required for the selected indication.
Настоящее изобретение предусматривает любую мультиантигенную или поливалентную иммуногенную композицию. Например, иммуногенная композиция может включать комбинации двух или более белков ORF2086, комбинацию белка ORF2086 с одним или несколькими белками Por А, комбинацию белка ORF2086 с полисахаридами и/или конъюгатами полисахаридов meningococcus серогруппы А, С, Y и W135, комбинацию белка ORF2086 с комбинациями meningococcus и pneumococcus или комбинацию любого из вышеупомянутых компонентов в форме, подходящей для нужного введения, например, для мукозального введения. Специалисты в данной области смогут легко составить такие мультиантигенные или поливалентные иммунологические композиции.The present invention provides for any multi-antigen or polyvalent immunogenic composition. For example, an immunogenic composition may include combinations of two or more ORF2086 proteins, a combination of an ORF2086 protein with one or more Por A proteins, a combination of an ORF2086 protein with polysaccharides and/or polysaccharide conjugates of meningococcus serogroup A, C, Y, and W135, a combination of an ORF2086 protein with combinations of meningococcus and pneumococcus or a combination of any of the above components in a form suitable for the desired administration, for example, for mucosal administration. Those skilled in the art will readily formulate such multiantigenic or multivalent immunological compositions.
В одном аспекте изобретение касается иммуногенной композиции, включающей выделенный нелипидированный, непирувилированный полипептид ORF2086 из Neisseria meningitidis серогруппы В, и по меньшей мере один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А, b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С, с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135 и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.In one aspect, the invention relates to an immunogenic composition comprising an isolated, non-lipidated, non-pyruvilated ORF2086 polypeptide from Neisseria meningitidis serogroup B, and at least one conjugate selected from the group consisting of: a) Neisseria meningitidis serogroup A capsular saccharide conjugate, b) capsular Neisseria meningitidis serogroup C saccharide, c) Neisseria meningitidis serogroup W135 capsular saccharide conjugate, and d) Neisseria meningitidis serogroup Y capsular saccharide conjugate.
В одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает выделенный нелипидированный, непирувилированный полипептид ORF2086 из Neisseria meningitidis серогруппы В и по меньшей мере два из конъюгатов. В другом варианте осуществления композиция включает, по меньшей мере, три из конъюгатов. Например, композиции могут включать сахариды из: серогрупп А и С; серогрупп А и W135; серогрупп А и Y; серогрупп С и W135; серогрупп W135 и Y; серогрупп А, С и W135; серогрупп А, С и Y; серогрупп A, W135 и Y; серогрупп С и W135 и Y. Предпочтение отдается композициям, включающим по меньшей мере один сахарид серогруппы С (например, С и Y).In one embodiment, the immunogenic composition comprises an isolated, non-lipidated, non-pyruvilated ORF2086 polypeptide from Neisseria meningitidis serogroup B and at least two of the conjugates. In another embodiment, the composition includes at least three of the conjugates. For example, the compositions may include saccharides from: serogroups A and C; serogroups A and W135; serogroups A and Y; serogroups C and W135; serogroups W135 and Y; serogroups A, C and W135; serogroups A, C and Y; serogroups A, W135 and Y; serogroups C and W135 and Y. Preference is given to compositions comprising at least one saccharide of serogroup C (eg C and Y).
В еще одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает выделенный нелипидированный, непирувилированный полипептид ORF2086 из Neisseria meningitidis серогруппы В и четыре конъюгата, например, конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135; и конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.In yet another embodiment, the immunogenic composition comprises an isolated, non-lipidated, non-pyruvilated ORF2086 polypeptide from Neisseria meningitidis serogroup B and four conjugates, eg, Neisseria meningitidis serogroup A capsular saccharide conjugate; serogroup C Neisseria meningitidis capsular saccharide conjugate; capsular saccharide conjugate of Neisseria meningitidis serogroup W135; and a Neisseria meningitidis serogroup Y capsular saccharide conjugate.
В предпочтительном варианте осуществления конъюгат является конъюгатом капсульного сахарида и белка-носителя. Подходящие белки-носители известны специалистам в данной области. Предпочтительно белок-носитель является бактериальным токсином, таким, как токсин дифтерии или столбняка, или их токсоидами или мутантами. В наиболее предпочтительном варианте белком-носителем является CRM197. Например, в одном варианте осуществления композиция включает, по меньшей мере, один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся (а) конъюгат (i) капсульного сахарида серогруппы А N. meningitidis и (ii) CRM197; (b) конъюгат (i) капсульного сахарида серогруппы С N. meningitidis и (ii) CRM197; (с) конъюгат (i) капсульного сахарида серогруппы W135 N. meningitidis и (ii) CRM197; и (d) конъюгат (i) капсульного сахарида серогруппы Y N. meningitidis и (ii) CRM197.In a preferred embodiment, the conjugate is a capsular saccharide-carrier protein conjugate. Suitable carrier proteins are known to those skilled in the art. Preferably the carrier protein is a bacterial toxin, such as diphtheria or tetanus toxin, or toxoids or mutants thereof. In the most preferred embodiment, the carrier protein is CRM 197 . For example, in one embodiment, the composition comprises at least one conjugate selected from the group consisting of (a) a conjugate of (i) a N. meningitidis serogroup A capsular saccharide and (ii) CRM 197 ; (b) a conjugate of (i) N. meningitidis serogroup C capsular saccharide and (ii) CRM 197 ; (c) a conjugate of (i) N. meningitidis serogroup W135 capsular saccharide and (ii) CRM 197 ; and (d) a conjugate of (i) N. meningitidis serogroup Y capsular saccharide and (ii) CRM 197 .
Капсульные сахариды серогрупп А, С, W135 и Y изучены и известны специалистам в данной области. Например, капсульный сахарид серогруппы A meningococcus является гомополимером (α1→6)-связанного N-ацетил-О-маннозамин-1-фосфата, с частичным О-ацетилированием в позициях С3 и С4. Ацетилирование в позиции С-3 может составлять 70-95%. Условия, применяемые для очистки сахарида, в результате могут приводить к де-О-ацетилированию (например, в основных условиях), однако применяются для удерживания ОАс в этой позиции С-3. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 50% (например, по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или более) маннозаминовых остатков в сахаридах серогруппы А являются О-ацетилированными в позиции С-3. Ацетильные группы могут быть заменены блокирующими группами для предотвращения гидролиза, и такие модифицированные сахариды остаются сахаридами серогруппы А в рамках изобретения.The capsular saccharides of serogroups A, C, W135 and Y have been studied and known to those skilled in the art. For example, the meningococcus serogroup A capsular saccharide is a homopolymer of (α1→6)-linked N-acetyl-O-mannosamine-1-phosphate, with partial O-acetylation at the C3 and C4 positions. Acetylation at the C-3 position can be 70-95%. The conditions used to purify the saccharide may result in de-O-acetylation (eg, under basic conditions), but are used to retain the OAc at this C-3 position. In some embodiments, at least 50% (eg, at least 60%, 70%, 80%, 90%, 95% or more) of the mannosamine residues in serogroup A saccharides are O-acetylated at the C-3 position. The acetyl groups may be replaced with blocking groups to prevent hydrolysis, and such modified saccharides remain serogroup A saccharides within the scope of the invention.
Капсульный сахарид серогруппы С является гомополимером (α2→9)-связанной сиаловой кислоты (N-ацетилнейраминовой кислоты). Большинство штаммов серогруппы С имеют О-ацетильные группы в позициях С-7 и/или С-8 сиаловокислотных остатков, но некоторые клинические изоляты не имеют этих О-ацетильных групп.The serogroup C capsular saccharide is a homopolymer of (α2→9)-linked sialic acid (N-acetylneuraminic acid). Most serogroup C strains have O-acetyl groups at the C-7 and/or C-8 positions of the sialic acid residues, but some clinical isolates do not have these O-acetyl groups.
Сахарид серогруппы W135 является полимером дисахаридных единиц сиаловой кислоты - галактозы. Подобно сахариду серогруппы С, он обладает изменчивым О-ацетилированием, но в позициях 7 и 9 сиаловой кислоты. Структура записывается следующим образом: →4)-D-NeupNAc(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→.Saccharide serogroup W135 is a polymer of disaccharide units of sialic acid - galactose. Like the serogroup C saccharide, it has variable O-acetylation, but at
Сахарид серогруппы Y подобен сахариду серогруппы W135, за исключением того, что повторяющаяся дисахаридная единица включает глюкозу вместо галактозы. Структура серогруппы Y записывается следующим образом: →4)-D-NeupNAc(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→. Подобно серогруппе W135, он обладает изменчивым О-ацетилированием в позициях 7 и 9 сиаловой кислоты.The serogroup Y saccharide is similar to the serogroup W135 saccharide except that the disaccharide repeating unit includes glucose instead of galactose. The structure of serogroup Y is written as follows: →4)-D-NeupNAc(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→. Like serogroup W135, it has variable O-acetylation at
Сахариды, применяемые согласно изобретению, могут быть О-ацетилированы, как описывается выше, например, с такой же схемой О-ацетилирования, как та, что наблюдается в природных капсульных сахаридах, или же они могут быть частично или полностью де-О-ацетилированы в одной или нескольких позициях сахаридных колец, или они могут быть гипер-О-ацетилированы относительно природных капсульных сахаридов.The saccharides used according to the invention may be O-acetylated as described above, for example, with the same O-acetylation pattern as that observed in natural capsular saccharides, or they may be partially or completely de-O-acetylated in one or more positions of the saccharide rings, or they may be hyper-O-acetylated relative to natural capsular saccharides.
В одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает выделенный нелипидированный, непирувилированный полипептид ORF2086 из Neisseria meningitidis серогруппы В и по меньшей мере один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А, b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С, с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135 и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y, причем нелипидированный, непирувилированный полипептид ORF2086 включает, по меньшей мере, один из следующих компонентов: В44, В09, А05, В22, А12, А22, А62, В24, В16, В15, и В03. В одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 71 и SEQ ID NO: 75. В другом варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 и SEQ ID NO: 20, в которой цистеин в позиции 1 делетирован. В другом варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 и SEQ ID NO: 20, в которой цистеин в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком.In one embodiment, the immunogenic composition comprises an isolated, non-lipidated, non-pyruvilated ORF2086 polypeptide from Neisseria meningitidis serogroup B and at least one conjugate selected from the group consisting of: a) Neisseria meningitidis serogroup A capsular saccharide conjugate, b) Neisseria meningitidis capsular saccharide conjugate serogroup C, c) Neisseria meningitidis serogroup W135 capsular saccharide conjugate; and d) Neisseria meningitidis serogroup Y capsular saccharide conjugate, wherein the non-lipidated, non-pyruvilated ORF2086 polypeptide comprises at least one of the following: B44, B09, A05, B22, A12, A22, A62, B24, B16, B15, and B03. In one embodiment, the polypeptide comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 71 and SEQ ID NO: 75. In another embodiment, the polypeptide comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 and SEQ ID NO: 20, in which cysteine at
Настоящее изобретение также предусматривает режимы мультииммунизации, при которых любая композиция, применяемая против патогена, может комбинироваться с композициями согласно настоящему изобретению. Например, пациенту, помимо прочих, может вводиться иммуногенная композиция согласно настоящему изобретению и другая иммунологическая композиция для иммунизации против папилломавируса человека (HPV), например, вакцина HPV GARDASIL®, в рамках режима мультииммунизации. Специалисты в данной области легко смогут выбрать иммуногенные композиции для применения в связи с иммуногенными композициями согласно настоящему изобретению с целью разработки и реализации режимов мультииммунизации.The present invention also provides for multi-immunization regimens in which any composition used against a pathogen can be combined with the compositions of the present invention. For example, an immunogenic composition of the present invention and another immunological composition for human papillomavirus (HPV) immunization, such as GARDASIL® HPV vaccine, may be administered to a patient as part of a multi-immunization regimen, among others. Those skilled in the art will readily be able to select immunogenic compositions for use in connection with the immunogenic compositions of the present invention for the purpose of developing and implementing multi-immunization regimens.
Полипептиды ORF2086, фрагменты и эквиваленты могут применяться в качестве компонента композиции иммуногенного конъюгата; в которой один или несколько белков или полипептидов конъюгированы с носителем с целью создания композиции, обладающей иммуногенными свойствами против нескольких серотипов или серотипов N. meningitidis, в частности, серогрупп менингококков, в частности, серогруппы В, и/или против нескольких болезней. В альтернативном варианте один из полипептидов ORF2086 может использоваться как белок-носитель для других иммуногенных полипептидов. Рецептирование таких иммуногенных композиций хорошо известно специалистам в данной области.ORF2086 polypeptides, fragments and equivalents may be used as a component of an immunogenic conjugate composition; wherein one or more proteins or polypeptides are conjugated to a carrier to provide a composition having immunogenic properties against several N. meningitidis serotypes or serotypes, in particular meningococcal serogroups, in particular serogroup B, and/or against several diseases. Alternatively, one of the ORF2086 polypeptides can be used as a carrier protein for other immunogenic polypeptides. The formulation of such immunogenic compositions is well known to those skilled in the art.
Иммуногенные композиции согласно изобретению предпочтительно включают фармацевтически приемлемый наполнитель, разбавители и/или носитель. К подходящим фармацевтически приемлемым наполнителям, носителям и/или разбавителям относятся любые и все традиционные растворители, диспергаторы, наполнители, твердые носители, водные растворы, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие абсорбцию агенты и т.п. Подходящими фармацевтически приемлемыми наполнителями, разбавителями и/или носителями являются, например, один или несколько компонентов, к которым относятся вода, солевой раствор, фосфатно-буферный раствор, декстроза, глицерин, этанол и т.п., а также их комбинации.The immunogenic compositions of the invention preferably include a pharmaceutically acceptable excipient, diluents and/or carrier. Suitable pharmaceutically acceptable excipients, carriers and/or diluents include any and all conventional solvents, dispersants, fillers, solid carriers, aqueous solutions, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption delaying agents, and the like. Suitable pharmaceutically acceptable excipients, diluents and/or carriers are, for example, one or more of water, saline, phosphate buffer, dextrose, glycerol, ethanol, and the like, and combinations thereof.
Фармацевтически приемлемые наполнители, разбавители и/или носители также могут включать в малых количествах вспомогательные вещества, такие, как увлажняющие агенты или эмульгаторы, консерванты или буферы, продлевающие срок хранения иди повышающие эффективность антитела. Приготовление и применение фармацевтически приемлемых наполнителей, разбавителей и/или носителей хорошо известно среди специалистов в данной области. Если какие-либо традиционные среды или носители не являются несовместимыми с активным ингредиентом, предусматривается их применение в иммуногенных композициях согласно настоящему изобретению.Pharmaceutically acceptable excipients, diluents and/or carriers may also include minor amounts of auxiliary substances, such as wetting agents or emulsifiers, preservatives or buffers, to extend the shelf life or increase the effectiveness of the antibody. The preparation and use of pharmaceutically acceptable excipients, diluents and/or carriers is well known to those skilled in the art. If any conventional media or carriers are not incompatible with the active ingredient, their use in the immunogenic compositions of the present invention is contemplated.
Иммуногенные композиции могут вводиться парентерально, например, путем инъекции, подкожно или внутримышечно, а также перорально или интраназально. Способы внутримышечной иммунизации описываются в публикациях Wolff et al. Biotechniques; 11(4): 474-85, (1991) и Sedegah et al. PNAS Vol. 91, pp. 9866-9870, (1994). Другие режимы введения, помимо прочих, предполагают, например, пероральные композиции, пульмональные композиции, суппозитории и трансдермальные аппликаторы. Пероральные композиции, помимо прочих, включают, например, такие традиционно применяемые наполнители, как отвечающие фармацевтическим требованиям маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлоза, карбонат магния и т.п. Предпочтительно иммуногенную композицию вводят внутримышечно.The immunogenic compositions may be administered parenterally, for example by injection, subcutaneously or intramuscularly, or orally or intranasally. Intramuscular immunization methods are described in Wolff et al. biotechniques; 11(4): 474-85, (1991) and Sedegah et al. PNAS Vol. 91, pp. 9866-9870, (1994). Other modes of administration, among others, include, for example, oral compositions, pulmonary compositions, suppositories, and transdermal applicators. Oral compositions, among others, include, for example, conventional excipients such as pharmaceutical grade mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharin, cellulose, magnesium carbonate, and the like. Preferably, the immunogenic composition is administered intramuscularly.
Иммуногенные композиции согласно настоящему изобретению также могут включать один или несколько дополнительных "иммуномодуляторов", которые являются агентами, нарушающими или изменяющими иммунную систему таким образом, что наблюдается либо повышающая регуляция, либо понижающая регуляция гуморального и/или клеточно-опосредованного иммунитета. В одном конкретном варианте осуществления предпочтение отдается повышающей регуляции гуморальной и/или клеточно-опосредованной групп иммунной системы. Примерами некоторых иммуномодуляторов, помимо прочих, могут быть, например, адъювант или цитокин или ISCOMATRIX (CSL Limited, Parkville, Australia), описанный в Патенте США №5,254,339.The immunogenic compositions of the present invention may also include one or more additional "immunomodulators", which are agents that disrupt or alter the immune system in such a way that either upregulation or downregulation of humoral and/or cell-mediated immunity is observed. In one particular embodiment, upregulation of the humoral and/or cell-mediated groups of the immune system is preferred. Examples of some immunomodulators, among others, may be, for example, an adjuvant or cytokine or ISCOMATRIX (CSL Limited, Parkville, Australia) described in US Patent No. 5,254,339.
Неограничивающими примерами адъювантов, которые могут применяться в вакцине согласно настоящему изобретению, могут быть адъювантная система RIBI (Ribi Inc., Hamilton, Mont.), квасцы, минеральные гели, такие, как гидроксид алюминия, эмульсии типа масло в воде, эмульсии типа вода в масле, например, полные и неполные адыованты Фрейнда, блок-сополимер (CytRx, Atlanta Ga.), QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.), адъювант AMPHIGEN®, сапонин, Quil А или другая сапониновая фракция, монофосфорил-липид А и адъювант Авридин липид-амин. Неограничивающими примерами эмульсий типа масло в воде, применяемых в вакцине согласно изобретению, являются модифицированные композиции SEAM62 и SEAM 1/2. Модифицированный SEAM62 является эмульсией типа масло в воде, содержащей 5% (объем/объем) сквалена (Sigma), 1% (объем/объем) детергента SPAN® 85 (ICI Surfactants), 0,7% (объем/объем) детергента polysorbate® 80 (ICI Surfactants), 2,5% (объем/объем) этанола, 200 мкг/мл Quil А, 100 мкг/мл холестерина и 0,5% (объем/объем) лецитина. Модифицированный SEAM 1/2 является эмульсией типа масло в воде, содержащей 5% (объем/объем) сквалена, 1% (объем/объем) детергента SPAN® 85, 0,7% (объем/объем) детергента polysorbate-80, 2,5% (объем/объем) этанола, 100 мкг/мл Quil А и 50 мкг/мл холестерина.Non-limiting examples of adjuvants that can be used in the vaccine of the present invention include the RIBI adjuvant system (Ribi Inc., Hamilton, Mont.), alum, mineral gels such as aluminum hydroxide, oil-in-water emulsions, water-in-water emulsions. oil, e.g. complete and incomplete Freund's adjuvants, block copolymer (CytRx, Atlanta Ga.), QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.), AMPHIGEN® adjuvant, saponin, Quil A or other saponin fraction, monophosphoryl lipid A and adjuvant Avridin lipid amine. Non-limiting examples of oil-in-water emulsions useful in the vaccine of the invention are modified formulations of SEAM62 and
К другим "иммуномодуляторам", которые могут быть включены в вакцину, относятся, например, один или несколько интерлейкинов, интерферонов или другие известные цитокины или хемокины. В одном варианте осуществления адъювант может быть производной циклодекстрина или полианионным полимером, таким, как описанные в патентах США 6,165,995 и 6,610,310, соответственно. Следует понимать, что применяемый иммуномодулятор и/или адъювант зависит от субъекта, которому вводят вакцину или иммуногенную композицию, пути инъекции и предусмотренного количества инъекций.Other "immunomodulators" that may be included in a vaccine include, for example, one or more interleukins, interferons, or other known cytokines or chemokines. In one embodiment, the adjuvant may be a cyclodextrin derivative or a polyanionic polymer such as those described in US Pat. Nos. 6,165,995 and 6,610,310, respectively. It should be understood that the immunomodulator and/or adjuvant used depends on the subject to whom the vaccine or immunogenic composition is administered, the route of injection, and the intended number of injections.
В некоторых вариантах осуществления адъювантом является сапонин. В некоторых вариантах осуществления концентрация сапонина составляет от 1 мкг/мл до 250 мкг/мл; от 5 мкг/мл до 150 мкг/мл; или от 10 мкг/мл до 100 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления концентрация сапонина составляет приблизительно 1 мкг/мл; приблизительно 5 мкг/мл; приблизительно 10 мкг/мл; приблизительно 20 мкг/мл; приблизительно 30 мкг/мл; приблизительно 40 мкг/мл; приблизительно 50 мкг/мл; приблизительно 60 мкг/мл; приблизительно 70 мкг/мл; приблизительно 80 мкг/мл; приблизительно 90 мкг/мл; приблизительно 100 мкг/мл; приблизительно 110 мкг/мл; приблизительно 120 мкг/мл; приблизительно 130 мкг/мл; приблизительно 140 мкг/мл; приблизительно 150 мкг/мл; приблизительно 160 мкг/мл; приблизительно 170 мкг/мл; приблизительно 180 мкг/мл; приблизительно 190 мкг/мл; приблизительно 200 мкг/мл; приблизительно 210 мкг/мл; приблизительно 220 мкг/мл; приблизительно 230 мкг/мл; приблизительно 240 мкг/мл; или приблизительно 250 мкг/мл.In some embodiments, the adjuvant is a saponin. In some embodiments, the concentration of saponin is from 1 μg/ml to 250 μg/ml; from 5 µg/ml to 150 µg/ml; or from 10 µg/ml to 100 µg/ml. In some embodiments, the saponin concentration is about 1 μg/mL; approximately 5 µg/ml; approximately 10 µg/ml; approximately 20 µg/ml; approximately 30 µg/ml; approximately 40 µg/ml; approximately 50 µg/ml; approximately 60 µg/ml; approximately 70 µg/ml; approximately 80 µg/ml; approximately 90 µg/ml; approximately 100 µg/ml; approximately 110 µg/ml; approximately 120 µg/ml; approximately 130 µg/ml; approximately 140 µg/ml; approximately 150 µg/ml; approximately 160 µg/ml; approximately 170 µg/ml; approximately 180 µg/ml; approximately 190 µg/ml; approximately 200 µg/ml; approximately 210 µg/ml; approximately 220 µg/ml; approximately 230 µg/ml; approximately 240 µg/ml; or approximately 250 µg/ml.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления белки согласно изобретению применяют в иммуногенной композиции для перорального введения, которая включает мукозный адъювант и применяется для лечения или профилактики инфекции N. meningitidis у человека. Мукозным адъювантом может быть токсин холеры; однако предпочтительно мукозные адъюванты, отличные от токсина холеры, которые могут применяться в соответствии с настоящим изобретением, включают нетоксичные производные голотоксина холеры, в которых субъединица А представляет собой мутагенизированный, химически модифицированный токсин холеры или подобные белки, получаемые путем модификации аминокислотной последовательности токсина холеры. Примером конкретного токсина холеры, который может быть особенно подходящим для приготовления иммуногенных композиций согласно настоящему изобретению, может быть мутантный голотоксин холеры Е29Н, описываемый в опубликованной международной заявке WO 00/18434, включенной в данное описание путем ссылки в полном объеме. Они могут быть добавлены к полипептидам согласно настоящему изобретению или конъюгированы с ними. Такие же технологии могут применяться к другим молекулам с мукозными адьювантными свойствами или особенностями доставки, таким, как термолабильный токсин (LT) Escherichia coli.In some preferred embodiments, the proteins of the invention are used in an oral immunogenic composition that includes a mucosal adjuvant and is used to treat or prevent N. meningitidis infection in a human. The mucosal adjuvant may be cholera toxin; however, preferably mucosal adjuvants other than cholera toxin that can be used in accordance with the present invention include non-toxic derivatives of cholera holotoxin, in which the A subunit is a mutagenized, chemically modified cholera toxin or similar proteins obtained by modifying the amino acid sequence of cholera toxin. An example of a particular cholera toxin that may be particularly suitable for the preparation of immunogenic compositions according to the present invention would be the E29H mutant cholera toxin described in WO 00/18434, incorporated herein by reference in its entirety. They may be added to or conjugated to the polypeptides of the present invention. The same techniques can be applied to other molecules with mucosal adjuvant properties or delivery features, such as the heat-labile toxin (LT) of Escherichia coli.
Могут применяться и другие соединения с мукозной адъювантной активностью или доставкой, такие, как желчь; поликатионы, такие, как DEAE-декстран и полиорнитин; детергенты, такие, как додецилбензолсульфат натрия; липид-конъюгированные материалы; антибиотики, такие, как стрептомицин; витамин А; и другие соединения, которые изменяют структурную или функциональную целостность поверхности слизистой оболочки. К другим активным в слизистой оболочке соединениям относятся производные микробных структур, такие, как MDP; акридин и циметидин. Также могут применяться STIMULON™ QS-21, MPL и IL-12, как описывается выше.Other compounds with mucosal adjuvant activity or delivery may be used, such as bile; polycations such as DEAE-dextran and polyornithine; detergents such as sodium dodecylbenzenesulfate; lipid-conjugated materials; antibiotics such as streptomycin; vitamin A; and other compounds that alter the structural or functional integrity of the mucosal surface. Other mucosally active compounds include derivatives of microbial structures such as MDP; acridine and cimetidine. STIMULON™ QS-21, MPL and IL-12 may also be used as described above.
Иммуногенные композиции согласно настоящему изобретению могут доставляться в форме ISCOMS (иммуностимулирующих комплексов), ISCOMS, содержащих СТВ, липосомы или инкапсулированных в такие соединения, как акрилаты или поли(DL-лактид-ко-гликозид) для образования микросфер подходящего для адсорбции размера. Белки согласно изобретению также могут быть включены в масляные эмульсии.The immunogenic compositions of the present invention can be delivered in the form of ISCOMS (Immunostimulatory Complexes), ISCOMS containing CTBs, liposomes, or encapsulated in compounds such as acrylates or poly(DL-lactide-co-glycoside) to form microspheres of a suitable size for adsorption. The proteins of the invention can also be included in oil emulsions.
Количество (т.е., доза) иммуногенной композиции, вводимой пациенту, может определяться в соответствии со стандартными технологиями, известными специалистам в данной области, с учетом таких факторов, как конкретный антиген, адъювант (при наличии), возраст, пол, вес, вид, состояние конкретного пациента и путь введения.The amount (i.e., dose) of the immunogenic composition administered to a patient may be determined according to standard techniques known to those skilled in the art, taking into account factors such as the specific antigen, adjuvant (if any), age, sex, weight, type, condition of a particular patient and route of administration.
Например, доза для пациентов-подростков может включать по меньшей мере 0,1 мкг, 1 мкг, 10 мкг или 50 мкг белка ORF2086 Neisseria и не более 80 мкг, 100 мкг, 150 мкг или 200 мкг белка ORF2086 Neisseria. Возможны комбинации любого минимального значения и любого максимального значения для определения соответствующего диапазона.For example, a dose for adolescent patients may include at least 0.1 μg, 1 μg, 10 μg, or 50 μg of Neisseria ORF2086 protein and not more than 80 μg, 100 μg, 150 μg, or 200 μg of Neisseria ORF2086 protein. Combinations of any minimum value and any maximum value are possible to determine the appropriate range.
АдъювантыAdjuvants
Иммуногенные композиции, описываемые авторами, также включают в некоторых вариантах осуществления один или несколько адъювантов. Адъювант является веществом, усиливающим иммунную реакцию при введении вместе с иммуногеном или антигеном. Многие цитокины или лимфокины обладают иммуномодулирующей активностью и, таким образом, могут использоваться в качестве адъювантов, включая, помимо прочих интерлейкины 1-α, 1-β, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 (см., например, Патент США №5,723,127), 13, 14, 15, 16, 17 и 18 (и его мутантные формы); интерфероны - α, β и γ; гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) (см., например, Патент США №5,078,996 и номер доступа АТСС 39900); макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF); гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF); и факторы некроза опухолей α и β.The immunogenic compositions described by the authors also include, in some embodiments, one or more adjuvants. An adjuvant is a substance that enhances the immune response when administered together with an immunogen or antigen. Many cytokines or lymphokines have immunomodulatory activity and thus can be used as adjuvants, including but not limited to interleukins 1-α, 1-β, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 (see, for example, US Patent No. 5,723,127), 13, 14, 15, 16, 17 and 18 (and mutant forms thereof); interferons - α, β and γ; granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) (see, for example, US Patent No. 5,078,996 and accession number ATCC 39900); macrophage colony stimulating factor (M-CSF); granulocyte colony stimulating factor (G-CSF); and tumor necrosis factors α and β.
К другим адъювантам, применяемым с описанными авторами иммуногенными композициями, относятся хемокины, включая, помимо прочих, МСР-1, MIP-1α, MIP-1β и RANTES; адгезивные молекулы, такие, как селектин, например, L-селектин, P-селектин и E-селектин; муциноподобные молекулы, например, CD34, GlyCAM-1 и MadCAM-1; представители семейства интегринов, такие, как LFA-1, VLA-1, Мас-1 и р150.95; представители надсемейства иммуноглобулинов, такие, как РЕСАМ, ICAM, например, ICAM-1, ICAM-2 и ICAM-3, CD2 и LFA-3; костимулирующие молекулы, такие, как В7-1, B7-2, CD40 и CD40L; факторы роста, включая фактор роста сосудов, фактор роста нервов, фактор роста фибробластов, фактор роста эпидермиса, PDGF, BL-1 и фактор роста эндотелия сосудов; рецепторные молекулы, включая Fas, рецептор TNF, Fit, Apo-1, р55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 и DR6; и Caspase (ICE).Other adjuvants used with the immunogenic compositions described by the authors include chemokines, including but not limited to MCP-1, MIP-1α, MIP-1β and RANTES; adhesive molecules such as selectin, eg L-selectin, P-selectin and E-selectin; mucin-like molecules such as CD34, GlyCAM-1 and MadCAM-1; members of the integrin family such as LFA-1, VLA-1, Mac-1 and p150.95; members of the immunoglobulin superfamily such as PECAM, ICAM, eg ICAM-1, ICAM-2 and ICAM-3, CD2 and LFA-3; costimulatory molecules such as B7-1, B7-2, CD40 and CD40L; growth factors including vascular growth factor, nerve growth factor, fibroblast growth factor, epidermal growth factor, PDGF, BL-1 and vascular endothelial growth factor; receptor molecules including Fas, TNF receptor, Fit, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 and DR6; and Caspase (ICE).
Другими примерами адъювантов могут быть, помимо прочих, гидроксид алюминия; фосфат алюминия; STIMULON™ QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, Mass.); MPL™ (3-0-деацилированный монофосфорил-липид A; Corixa, Hamilton, Mont.), 529 (соединение аминоалкилглюкозамина фосфата, Corixa, Hamilton, Mont.), IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, Mass.); GM-CSF (Immunex Corp., Seattle, Wash.); N-ацетил-мурамил-L-теронил-D-изоглутамин (тре-MDP); N-ацетил-нор-мурамил-L-аланил-D-изоглутамин (CGP 11637, под названием нор-MDP); N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилоксиэтиламин) (CGP 19835A, под названием МТР-РЕ); и токсин холеры. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления адъювантом является QS-21.Other examples of adjuvants can be, among others, aluminum hydroxide; aluminum phosphate; STIMULON™ QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, Mass.); MPL™ (3-0-deacylated monophosphoryl lipid A; Corixa, Hamilton, Mont.), 529 (aminoalkylglucosamine phosphate compound, Corixa, Hamilton, Mont.), IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, Mass.); GM-CSF (Immunex Corp., Seattle, Wash.); N-acetyl-muramyl-L-teronyl-D-isoglutamine (tre-MDP); N-acetyl-nor-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamine (CGP 11637, named nor-MDP); N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanine-2-(1'-2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxyethylamine) (CGP 19835A, under the name MTP-PE); and cholera toxin. In some preferred embodiments, the adjuvant is QS-21.
Дополнительные типичные адъюванты включают нетоксичные производные токсина холеры, включая его субъединицу А, и/или конъюгаты или подвергнутые генной инженерии слияния полипептида N. meningitidis с токсином холеры или его субъединицей В ("СТВ"), термоинактивированный агрегат холерного энтеротоксина, грибковые полисахариды, включая шизофиллан, мурамилдипептид, производные мурамилдипептида ("MDP"), форболовые эфиры, термолабильный токсин Е. coli, блок-полимеры или сапонины.Additional exemplary adjuvants include non-toxic derivatives of cholera toxin, including its A subunit, and/or conjugates or genetically engineered fusions of N. meningitidis polypeptide to cholera toxin or its B subunit ("CTV"), heat-inactivated cholera toxin aggregate, fungal polysaccharides, including schizophyllan , muramyl dipeptide, muramyl dipeptide ("MDP") derivatives, phorbol esters, heat-labile E. coli toxin, block polymers, or saponins.
Фосфат алюминия применяют в качестве адъюванта в клинических исследованиях 1-й фазы в концентрации до 0,125 мг/дозу, значительно ниже предела 0,85 мг/дозу, указанного в Своде федеральных постановлений США [610.15 (а)]. Алюминийсодержащие адъюванты широко применяются в лечении людей для усиления иммунной реакции антигенов при внутримышечном или подкожном введении. В некоторых вариантах осуществления концентрация алюминия в иммуногенной композиции составляет от 0,125 мкг/мл до 0,5 мкг/мл; от 0,20 мкг/мл до 0,40 мкг/мл; или от 0,20 мкг/мл до 0,30 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления концентрация алюминия в иммуногенной композиции составляет приблизительно 0,125 мкг/мл; приблизительно 0,15 мкг/мл; приблизительно 0,175 мкг/мл; приблизительно 0,20 мкг/мл; приблизительно 0,225 мкг/мл; приблизительно 0,25 мкг/мл; приблизительно 0,275 мкг/мл; приблизительно 0,30 мкг/мл; приблизительно 0,325 мкг/мл; приблизительно 0,35 мкг/мл; приблизительно 0,375 мкг/мл; приблизительно 0,40 мкг/мл; приблизительно 0,425 мкг/мл; приблизительно 0,45 мкг/мл; приблизительно 0,475 мкг/мл; или приблизительно 0,50 мкг/мл.Aluminum phosphate has been used as an adjuvant in
В предпочтительном варианте осуществления концентрация алюминия в иммуногенной композиции составляет от 0,125 мг/мл до 0,5 мг/мл; от 0,20 мг/мл до 0,40 мг/мл; или от 0,20 мг/мл до 0,30 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления концентрация алюминия в иммуногенной композиции составляет приблизительно 0,125 мг/мл; приблизительно 0,15 мг/мл; приблизительно 0,175 мг/мл; приблизительно 0,20 мг/мл; приблизительно 0,225 мг/мл; приблизительно 0,25 мг/мл; приблизительно 0,275 мг/мл; приблизительно 0,30 мг/мл; приблизительно 0,325 мг/мл; приблизительно 0,35 мг/мл; приблизительно 0,375 мг/мл; приблизительно 0,40 мг/мл; приблизительно 0,425 мг/мл; приблизительно 0,45 мг/мл; приблизительно 0,475 мг/мл; или приблизительно 0,50 мг/мл.In a preferred embodiment, the concentration of aluminum in the immunogenic composition is from 0.125 mg/ml to 0.5 mg/ml; from 0.20 mg/ml to 0.40 mg/ml; or from 0.20 mg/ml to 0.30 mg/ml. In some embodiments, the concentration of aluminum in the immunogenic composition is about 0.125 mg/ml; approximately 0.15 mg/ml; approximately 0.175 mg/ml; approximately 0.20 mg/ml; approximately 0.225 mg/ml; about 0.25 mg/ml; approximately 0.275 mg/ml; about 0.30 mg/ml; about 0.325 mg/ml; approximately 0.35 mg/ml; approximately 0.375 mg/ml; approximately 0.40 mg/ml; approximately 0.425 mg/ml; about 0.45 mg/ml; about 0.475 mg/ml; or approximately 0.50 mg/ml.
Подходящими адъювантами, применяемыми для усиления иммунной реакции, также могут быть, помимо прочих, MPL™ (3-O-деацилированный монофосфорил-липид A, Corixa, Hamilton, MT), описываемый в Патенте США №4,912,094. Также подходящими для использования в качестве адъювантов являются аналоги синтетического липида А или соединения аминоалкилглюкозамин фосфата (AGP) или их производные или аналоги от компании Corixa (Hamilton, MT), а также описываемые в Патенте США №6,113,918. Одним таким AGP является 2-[(R)-3-тетрадеканоилокситетрадеканоиламино]этил 2-дезокси-4-O-фосфоно-3-O-[(R)-3-тетрадеканоилокситетрадеканоил]-2-[(R)-3-тетрадеканоилокситетрадеканоиламино]-b-B-глюкопиранозид, также известный как 529 (ранее известный как RC529). Этот адъювант 529 рецептирован в водной форме (AF) или в форме устойчивой эмульсии (SE).Suitable adjuvants used to enhance the immune response may also be, among others, MPL™ (3-O-deacylated monophosphoryl lipid A, Corixa, Hamilton, MT), described in US Patent No. 4,912,094. Also suitable for use as adjuvants are synthetic lipid A analogs or aminoalkylglucosamine phosphate (AGP) compounds or derivatives or analogs thereof from Corixa (Hamilton, MT) as described in US Patent No. 6,113,918. One such AGP is 2-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoylamino]ethyl 2-deoxy-4-O-phosphono-3-O-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoyl]-2-[(R)-3-tetradecanoyloxytetradecanoylamino ]-b-B-glucopyranoside, also known as 529 (formerly known as RC529). This adjuvant 529 is formulated in aqueous (AF) or stable emulsion (SE) form.
К другим адъювантам относятся мурамилпептиды, такие, как N-ацетил-мурамил-L-треонил-D-изоглутамин (тре-MDP), N-ацетил-нормурамил-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин (МТР-РЕ); эмульсии типа масло в воде, такие, как MF59 (Патент США №6,299,884) (содержащие 5% сквалена, 0,5% polysorbate-80 и 0,5% SPAN 85 (необязательно содержащие различные количества МТР-РЕ) в форме субмикронных частиц, получаемых при помощи микрофлюидизатора, такого, как микрофлюидизатор модели 110Y (Microfluidics, Newton, MA)) и SAF (содержащие 10% сквалена, 0,4% polysorbate-80, 5% PLURONIC-блокированного полимера L121 и тре-MDP, либо микрофлюидизированных в субмикронную эмульсию, либо перемешанных вихревым способом для образования эмульсии с большим размером частиц); неполный адъювант Фрейнда (IFA); соли алюминия (квасцы), такие, как гидроксид алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия; AMPHIGEN; авридин; L121/сквален; D-лактид-полилактид/гликозид; полиолы PLURONIC; убитые клетки Bordetella; сапонины, такие, как Stimulon™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA.), описанные в Патенте США №5,057,540, ISCOMATRIX (CSL Limited, Parkville, Australia), описанные в Патенте США №5,254,339 и иммуностимулирующие комплексы (ISCOMATRIX); Mycobacterium tuberculosis; бактериальные липополисахариды; синтетические полинуклеотиды, такие, как олигонуклеотиды, содержащие мотив CpG (см., например, Патент США №6,207,646); IC-31 (Intercell AG, Vienna, Austria), описанные в европейских патентах №№1,296,713 и 1,326,634; коклюшный токсин (РТ) или его мутант, токсин холеры или его мутант (см., например, Патенты США №№7,285,281, 7,332,174, 7,361,355 и 7,384,640); или термолабильный токсин (LT) Е. coli или его мутант, в частности, LT-K63, LT-R72 (см., например, Патенты США №№6,149,919, 7,115,730 и 7,291,588).Other adjuvants include muramyl peptides such as N-acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamine (tre-MDP), N-acetyl-normuramyl-L-alanine-2-(1'-2'-dipalmitoyl-sn -glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamine (MTP-PE); oil-in-water emulsions such as MF59 (US Patent No. 6,299,884) (containing 5% squalene, 0.5% polysorbate-80 and 0.5% SPAN 85 (optionally containing various amounts of MTP-PE) in the form of submicron particles, prepared with a microfluidizer such as the Model 110Y Microfluidizer (Microfluidics, Newton, MA)) and SAF (containing 10% squalene, 0.4% polysorbate-80, 5% PLURONIC-blocked polymer L121 and tre-MDP, or microfluidized in submicron emulsion, or vortex mixed to form an emulsion with a large particle size); incomplete Freund's adjuvant (IFA); aluminum salts (alum) such as aluminum hydroxide, aluminum phosphate, aluminum sulfate; AMPHIGEN; avridine; L121/squalene; D-lactide-polylactide/glycoside; PLURONIC polyols; dead Bordetella cells; saponins such as Stimulon™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA.) described in US Patent No. 5,057,540, ISCOMATRIX (CSL Limited, Parkville, Australia) described in US Patent No. 5,254,339 and immunostimulatory complexes (ISCOMATRIX); Mycobacterium tuberculosis; bacterial lipopolysaccharides; synthetic polynucleotides such as oligonucleotides containing a CpG motif (see, for example, US Patent No. 6,207,646); IC-31 (Intercell AG, Vienna, Austria), described in European patents No. 1,296,713 and 1,326,634; pertussis toxin (PT) or its mutant, cholera toxin or its mutant (see, for example, US Patent Nos. 7,285,281, 7,332,174, 7,361,355 and 7,384,640); or heat-labile toxin (LT) E. coli or its mutant, in particular, LT-K63, LT-R72 (see, for example, US Patent Nos. 6,149,919, 7,115,730 and 7,291,588).
Способы получения нелипидированных антигенов Р2086Methods for obtaining non-lipidated P2086 antigens
В одном аспекте изобретение касается способа получения непирувилированного нелипидированного полипептида ORF2086. Способ включает экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид ORF2086, в которой N-концевой цистеин делетирован по сравнению с соответствующей последовательностью дикого типа, и нуклеотидная последовательность функционально связана с экспрессирующей системой, которая может быть экспрессирована в бактериальной клетке. К типичным полипептидам, получаемым этим способом, относится любой описанный авторами полипептид. Например, в предпочтительном варианте полипептид имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 70, в которой цистеин в позиции 1 делегирован по сравнению с соответствующей последовательностью дикого типа. В другом предпочтительном варианте осуществления полипептид имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 76, в которой цистеин в позиции 1 делегирован. К дополнительным типичным полипептидам относится полипептид, имеющий аминокислотные последовательности, выбранные из SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 71 и SEQ ID NO: 75. К дополнительным типичным полипептидам относится полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77. Другие примеры включают SEQ ID NO: 80 (В24) и SEQ ID NO: 81 (В24). Способ также включает очистку полипептида.In one aspect, the invention relates to a method for producing a non-pyruvilated, non-lipidated ORF2086 polypeptide. The method includes expression of a nucleotide sequence encoding an ORF2086 polypeptide in which the N-terminal cysteine is deleted compared to the corresponding wild-type sequence, and the nucleotide sequence is operably linked to an expression system that can be expressed in a bacterial cell. Typical polypeptides obtained by this method include any polypeptide described by the authors. For example, in a preferred embodiment, the polypeptide has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 70 wherein the cysteine at
В некоторых вариантах осуществления изобретение обеспечивает способ получения растворимых нелипидированных антигенов Р2086, включающий этапы клонирования нуклеиновокислотной последовательности варианта ORF2086 в вектор экспрессии Е. coli без контрольной последовательности липидизации, преобразования бактерий Е. coli с вектором экспрессии ORF2086, включая экспрессию и выделение экспрессированного белка Р2086. В некоторых вариантах осуществления экспрессия вызывается IPTG.In some embodiments, the invention provides a method for producing soluble, non-lipidated P2086 antigens, comprising the steps of cloning an ORF2086 variant nucleic acid sequence into an E. coli expression vector without a lipidization control sequence, converting E. coli bacteria with an ORF2086 expression vector, including expressing and isolating the expressed P2086 protein. In some embodiments, expression is caused by IPTG.
В некоторых вариантах осуществления кодон для N-концевого Cys варианта ORF2086 делетирован. Примеры таких кодонов включают TGC. В некоторых вариантах осуществления кодон для N-концевого Cys варианта ORF2086 подвергают мутации путем точечного мутагенеза для образования ко дона Ala, Gly или Val. В некоторых вариантах осуществления кодоны Ser и Gly добавляют к N-концевому хвосту варианта ORF2086 для продления ствола Gly/Ser непосредственно после N-концевого Cys. В некоторых вариантах осуществления общее количество остатков Gly и Ser в стволе Gly/Ser составляет по меньшей мере 7, 8, 9, 10, 11 или 12. В некоторых вариантах осуществления кодон для N-концевого Cys делегирован. В некоторых вариантах осуществления N-концевые 7, 8, 9, 10, 11 или 12 остатков являются Gly или Ser.In some embodiments, the codon for the N-terminal Cys variant of ORF2086 has been deleted. Examples of such codons include TGC. In some embodiments, the codon for the N-terminal Cys variant of ORF2086 is mutated by point mutagenesis to form an Ala, Gly, or Val codon. In some embodiments, the Ser and Gly codons are added to the N-terminal tail of the ORF2086 variant to extend the Gly/Ser stem just after the N-terminal Cys. In some embodiments, the total number of Gly and Ser residues in the Gly/Ser stem is at least 7, 8, 9, 10, 11, or 12. In some embodiments, the codon for the N-terminal Cys is delegated. In some embodiments, the N-
В некоторых вариантах осуществления кодоны N-концевого хвоста нелипидированного варианта ORF2086 оптимизируют путем точечного мутагенеза. В некоторых вариантах осуществления N-концевой хвост нелипидированного варианта ORF2086 оптимизируют для приведения в соответствие N-концевому хвосту варианта В09. В некоторых вариантах осуществления кодоны N-концевого хвоста варианта ORF2086 оптимизируют путем точечного мутагенеза, таким образом, чтобы кодон, кодирующий пятую аминокислоту варианта ORF2086, был на 100% идентичным нуклеотидам 13-15 SEQ ID NO: 8, a кодон, кодирующий тринадцатую аминокислоту варианта ORF2086, был на 100% идентичным нуклеотидам 37-39 SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления N-концевой хвост нелипидированного варианта ORF2086 оптимизируют таким образом, чтобы 5' 45 нуклеиновых кислот были на 100% идентичными нуклеиновым кислотам 1-45 SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления N-концевой хвост нелипидированного варианта ORF2086 оптимизируют таким образом, чтобы 5' 42 нуклеиновых кислоты были на 100% идентичными нуклеиновым кислотам 4-45 SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления N-концевой хвост нелипидированного варианта ORF2086 оптимизируют таким образом, чтобы 5' 39 нуклеиновых кислот были на 100% идентичными нуклеиновым кислотам 4-42 SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления N-концевой хвост нелипидированного варианта Р2086 включает, по меньшей мере, одно аминокислотное замещение по сравнению с аминокислотами 1-15 SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления N-концевой хвост нелипидированного варианта Р2086 включает два аминокислотных замещения по сравнению с аминокислотами 1-15 SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления N-концевой хвост нелипидированного варианта Р2086 включает, по меньшей мере, одно аминокислотное замещение по сравнению с аминокислотами 2-15 SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления N-концевой хвост нелипидированного варианта Р2086 включает два аминокислотных замещения по сравнению с аминокислотами 2-15 SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замещения являются консервативными аминокислотными замещениями.In some embodiments, the N-terminal tail codons of the non-lipidated ORF2086 variant are optimized by point mutagenesis. In some embodiments, the N-terminal tail of the non-lipidated ORF2086 variant is optimized to match the N-terminal tail of the B09 variant. In some embodiments, the codons of the N-terminal tail of the ORF2086 variant are optimized by point mutagenesis such that the codon encoding the fifth amino acid of the ORF2086 variant is 100% identical to nucleotides 13-15 of SEQ ID NO: 8, and the codon encoding the thirteenth amino acid of the variant ORF2086 was 100% identical to nucleotides 37-39 of SEQ ID NO: 8. In some embodiments, the N-terminal tail of the non-lipidated ORF2086 variant is optimized so that 5'45 nucleic acids are 100% identical to nucleic acids 1-45 of SEQ ID NO: 8. In some embodiments, the N-terminal tail of the non-lipidated ORF2086 variant is optimized such that the 5'42 nucleic acids are 100% identical to nucleic acids 4-45 of SEQ ID NO: 8. In some embodiments, the N-terminal tail of the non-lipidated ORF2086 variant is optimized so that 5'39 nucleic acids are 100% identical to nucleic acids 4-42 of SEQ ID N O: 8. In some embodiments, the N-terminal tail of the non-lipidated P2086 variant includes at least one amino acid substitution compared to amino acids 1-15 of SEQ ID NO: 18. In some embodiments, the N-terminal tail of the non-lipidated P2086 variant includes two amino acid substitutions compared to amino acids 1-15 of SEQ ID NO: 18. In some embodiments, the N-terminal tail of the non-lipidated P2086 variant includes at least one amino acid substitution compared to amino acids 2-15 of SEQ ID NO: 18. In some embodiments, embodiments, the N-terminal tail of the non-lipidated P2086 variant includes two amino acid substitutions compared to amino acids 2-15 of SEQ ID NO: 18. In some embodiments, the amino acid substitutions are conservative amino acid substitutions.
В некоторых вариантах осуществления кодоны нелипидированного варианта являются оптимизированными для усиления экспрессии. Оптимизация кодонов известна специалистам в данной области. См., например, Sastalla et al. Applied and Environmental Microbiology, vol. 75(7): 2099-2110 (2009) и Coleman et al. Science, vol. 320: 1784 (2008). В некоторых вариантах осуществления оптимизация кодонов включает приведение использования кодона аминокислотной последовательности в соответствие с частотой кодона выбранного организма-хозяина при включении и/или исключении конкретных последовательностей ДНК. В некоторых вариантах осуществления оптимизация кодонов также включает минимизацию соответствующей вторичной структуры мРНК для снижения помех трансляции. В некоторых вариантах осуществления N-концевой хвост подвергнут оптимизации кодона, таким образом, чтобы он включал одну из последовательностей SEQ ID NO: 28, 30, 32 и 34. В некоторых вариантах осуществления ствол Gly/Ser подвергнут оптимизации кодона, таким образом, чтобы он включал любую из последовательностей SEQ ID NO: 28, 30, 32 и 34.In some embodiments, the non-lipidated variant codons are optimized for increased expression. Codon optimization is known to those skilled in the art. See, for example, Sastalla et al. Applied and Environmental Microbiology, vol. 75(7): 2099-2110 (2009) and Coleman et al. science, vol. 320:1784 (2008). In some embodiments, codon optimization includes matching the codon usage of an amino acid sequence to the codon frequency of a selected host organism while including and/or excluding specific DNA sequences. In some embodiments, codon optimization also includes minimizing the corresponding mRNA secondary structure to reduce translation interference. In some embodiments, the N-terminal tail is codon optimized such that it includes one of the sequences of SEQ ID NOS: 28, 30, 32, and 34. In some embodiments, the Gly/Ser stem is codon optimized such that it included any of the sequences of SEQ ID NOS: 28, 30, 32 and 34.
Для лучшего понимания данного изобретения далее представлены примеры. Примеры предназначены лишь для пояснения и не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения.For a better understanding of the present invention, the following are examples. The examples are for illustrative purposes only and should not be construed as limiting the scope of the invention.
Рецептирование иммуногенных композицийFormulation of immunogenic compositions
В некоторых вариантах осуществления иммуногенные композиции согласно изобретению также включают по меньшей мере один из компонентов, к которым относятся адъюванты, буферы, криопротекторы, соли, двухвалентные катионы, неионные детергенты, ингибиторы окисления свободными радикалами, разбавители или носители.In some embodiments, the immunogenic compositions of the invention also include at least one of adjuvants, buffers, cryoprotectants, salts, divalent cations, nonionic detergents, free radical oxidation inhibitors, diluents, or carriers.
Иммуногенные композиции согласно изобретению также могут включать один или несколько консервантов в дополнение к множеству менингококковых белковых антигенов и конъюгатов капсульных полисахаридов - белков. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) требует, чтобы биологические продукты в многодозовых флаконах содержали консервант, лишь с несколькими исключениями. К вакцинным продуктам, содержащим консерванты, относятся вакцины, содержащие хлорид бензетония (сибирская язва), 2-феноксиэтанол (DTaP, HepA, Lyme, Polio (парентеральная)), фенол (Pneumo, Typhoid (парентеральная), Vaccinia) и тимеросал (DTaP, DT, Td, HepB, Hib, Influenza, JE, Mening, Pneumo, Rabies). Консерванты, утвержденные к применению в инъекционных медикаментах, включают, например, хлоробутанол, м-крезол, метилпарабен, пропилпарабен, 2-феноксиэтанол, хлорид бензетония, хлорид бензалкония, бензойная кислота, бензиловый спирт, фенол, тимеросал и нитрат фенилртути.The immunogenic compositions of the invention may also include one or more preservatives in addition to a variety of meningococcal protein antigens and capsular polysaccharide-protein conjugates. The Food and Drug Administration (FDA) requires biologic products in multi-dose vials to contain a preservative, with only a few exceptions. Vaccine products containing preservatives include those containing benzethonium chloride (anthrax), 2-phenoxyethanol (DTaP, HepA, Lyme, Polio (parental)), phenol (Pneumo, Typhoid (parenteral), Vaccinia), and thimerosal (DTaP, DT, Td, HepB, Hib, Influenza, JE, Mening, Pneumo, Rabies). Preservatives approved for use in injectables include, for example, chlorobutanol, m-cresol, methylparaben, propylparaben, 2-phenoxyethanol, benzethonium chloride, benzalkonium chloride, benzoic acid, benzyl alcohol, phenol, thimerosal, and phenylmercury nitrate.
Композиции согласно изобретению также могут включать один или несколько компонентов, к которым относятся буфер, соль, двухвалентный катион, неионный детергент, криопротектор, такой, как сахар, и антиоксидант, такой, как акцептор свободных радикалов или комплексообразующий агент, или любую их множественную комбинацию. Выбор любого одного компонента, например, комплексона, может определять, требуется ли еще какой-либо компонент (например, акцептор). Готовая композиция, рецептированная для введения, должна быть стерильной и/или апирогенной. Специалист в данной области может эмпирическим путем определить, какие комбинации этих и других компонентов будут оптимальными для включения в содержащие консервант иммуногенные композиции согласно изобретению в зависимости от разных факторов, таких, как конкретные требуемые условия хранения и введения.Compositions of the invention may also include one or more of a buffer, a salt, a divalent cation, a non-ionic detergent, a cryoprotectant such as a sugar, and an antioxidant such as a free radical scavenger or complexing agent, or any multiple combination thereof. The choice of any one component, such as a chelating agent, may determine whether any other component (eg, an acceptor) is required. The finished composition formulated for administration must be sterile and/or non-pyrogenic. One skilled in the art can empirically determine which combinations of these and other components will be optimal for inclusion in the preservative-containing immunogenic compositions of the invention depending on various factors such as the specific storage and administration conditions required.
В некоторых вариантах осуществления композиция согласно изобретению, которая является совместимой с парентеральным введением, включает один или несколько физиологически приемлемых буферов, выбранных из группы, к которой, помимо прочих, относятся Tris (триметамин), фосфат, ацетат, борат, цитрат, глицин, гистидин и сукцинат. В некоторых вариантах осуществления композицию буферируют до уровня pH в диапазоне от приблизительно 6,0 до приблизительно 9,0, предпочтительно от приблизительно 6,4 до приблизительно 7,4.In some embodiments, a composition of the invention that is compatible with parenteral administration comprises one or more physiologically acceptable buffers selected from the group consisting of, but not limited to, Tris (trimethamine), phosphate, acetate, borate, citrate, glycine, histidine and succinate. In some embodiments, the composition is buffered to a pH in the range of about 6.0 to about 9.0, preferably about 6.4 to about 7.4.
В некоторых вариантах осуществления желательным может быть регулирование уровня рН иммуногенной композиции или препарата согласно изобретению. Уровень рН композиции согласно изобретению может регулироваться с применением стандартных технологий, известных специалистам в данной области. Уровень рН композиции может регулироваться до показателя от 3,0 до 8,0. В некоторых вариантах осуществления уровень рН композиции может составлять или может регулироваться до показателя от 3,0 до 6,0, от 4,0 до 6,0 или от 5,0 до 8,0. В других вариантах осуществления уровень рН композиции может составлять или может регулироваться до приблизительно 3,0, приблизительно 3,5, приблизительно 4,0, приблизительно 4,5, приблизительно 5,0, приблизительно 5,5, приблизительно 5,8, приблизительно 6,0, приблизительно 6,5, приблизительно 7,0, приблизительно 7,5 или приблизительно 8,0. В некоторых вариантах осуществления уровень рН может составлять или может регулироваться до показателя в диапазоне от 4,5 до 7,5 или от 4,5 до 6,5, от 5,0 до 5,4, от 5,4 до 5,5, от 5,5 до 5,6, от 5,6 до 5,7, от 5,7 до 5,8, от 5,8 до 5,9, от 5,9 до 6,0, от 6,0 до 6,1, от 6,1 до 6,2, от 6,2 до 6,3, от 6,3 до 6,5, от 6,5 до 7,0, от 7,0 до 7,5 или от 7,5 до 8,0. В конкретном варианте осуществления уровень рН композиции составляет приблизительно 5,8.In some embodiments, it may be desirable to adjust the pH of an immunogenic composition or formulation of the invention. The pH level of the composition according to the invention can be adjusted using standard techniques known to those skilled in the art. The pH of the composition can be adjusted to between 3.0 and 8.0. In some embodiments, the pH of the composition may be or may be adjusted to 3.0 to 6.0, 4.0 to 6.0, or 5.0 to 8.0. In other embodiments, the pH of the composition may be or may be adjusted to about 3.0, about 3.5, about 4.0, about 4.5, about 5.0, about 5.5, about 5.8, about 6 .0, about 6.5, about 7.0, about 7.5, or about 8.0. In some embodiments, the pH level can be or can be adjusted to a value in the range from 4.5 to 7.5 or from 4.5 to 6.5, from 5.0 to 5.4, from 5.4 to 5.5 , 5.5 to 5.6, 5.6 to 5.7, 5.7 to 5.8, 5.8 to 5.9, 5.9 to 6.0, 6.0 up to 6.1, 6.1 to 6.2, 6.2 to 6.3, 6.3 to 6.5, 6.5 to 7.0, 7.0 to 7.5, or from 7.5 to 8.0. In a particular embodiment, the pH of the composition is about 5.8.
В некоторых вариантах осуществления композиция согласно изобретению, совместимая с парентеральным введением, включает один или несколько двухвалентных катионов, включая, помимо прочих, MgCl2, CaCl2 и MnCl2 в концентрации от приблизительно 0,1 мМ до приблизительно 10 мМ, причем предпочтение отдается концентрации до приблизительно 5 мМ.In some embodiments, a composition of the invention compatible with parenteral administration comprises one or more divalent cations including, but not limited to, MgCl 2 , CaCl 2 , and MnCl 2 at a concentration of from about 0.1 mM to about 10 mM, with preference being given to a concentration up to about 5 mm.
В некоторых вариантах осуществления композиция согласно изобретению, совместимая с парентеральным введением, включает одну или несколько солей, включая, помимо прочих, хлорид натрия, хлорид калия, сульфат натрия и сульфат калия, присутствующих с ионной силой, которая физиологически приемлема для субъекта при парентеральном введении, и включенных в конечной концентрации для обеспечения выбранной ионной силы или осмолярности в готовой композиции. Конечная ионная сила или осмоляльность композиции определяется несколькими компонентами (например, ионами буферного(ых) соединения(й) и других небуферных солей. Предпочтительная соль, NaCl, присутствует в количестве до приблизительно 250 мМ, причем концентрацию солей выбирают таким образом, чтобы дополнять другие компоненты (например, сахара), чтобы конечная общая осмолярность композиции была совместима с парентеральным введением (например, внутримышечной или подкожной инъекцией) и способствовала долгосрочной устойчивости иммуногенных компонентов иммуногенной композиции в разных диапазонах температур. Бессолевые композиции выдерживают расширенные диапазоны одного или нескольких выбранных криопротекторов для поддержания нужного конечного уровня осмолярности.In some embodiments, a parenteral compatible composition of the invention comprises one or more salts, including but not limited to sodium chloride, potassium chloride, sodium sulfate, and potassium sulfate, present at an ionic strength that is physiologically acceptable to the subject when administered parenterally, and included at a final concentration to provide the selected ionic strength or osmolarity in the finished composition. The final ionic strength or osmolality of the composition is determined by several components (e.g., ions of the buffer(s) compound(s) and other non-buffered salts. The preferred salt, NaCl, is present in amounts up to about 250 mM, with the concentration of the salts chosen to complement the other components (e.g., sugar) so that the final total osmolarity of the composition is compatible with parenteral administration (e.g., intramuscular or subcutaneous injection) and contributes to the long-term stability of the immunogenic components of the immunogenic composition in different temperature ranges Salt-free compositions withstand extended ranges of one or more selected cryoprotectants to maintain the desired final level of osmolarity.
В некоторых вариантах осуществления композиция согласно изобретению, совместимая с парентеральным введением, включает один или несколько криопротекторов, выбранных, помимо прочих, из дисахаридов (например, лактозы, мальтозы, сахарозы или трегалозы) и полигидрокси-углеводородов (например, дульцита, глицерина, маннита и сорбита).In some embodiments, a parenteral compatible composition of the invention comprises one or more cryoprotectants selected from, among others, disaccharides (eg, lactose, maltose, sucrose, or trehalose) and polyhydroxy hydrocarbons (eg, dulcitol, glycerol, mannitol, and sorbitol).
В некоторых вариантах осуществления осмолярность композиции составляет от приблизительно 200 мОсм/л до приблизительно 800 мОсм/л, предпочтительно в диапазоне от приблизительно 250 мОсм/л до приблизительно 500 мОсм/л или от приблизительно 300 мОсм/л до приблизительно 400 мОсм/л. Бессолевая композиция может содержать, например, от приблизительно 5% до приблизительно 25% сахарозы, предпочтительно - от приблизительно 7% до приблизительно 15% или от приблизительно 10% до приблизительно 12% сахарозы. В альтернативном варианте бессолевая композиция может содержать, например, от приблизительно 3% до приблизительно 12% сорбита, предпочтительно - приблизительно от 4% до 7% или от приблизительно 5% до приблизительно 6% сорбита. Если добавляют соль, такую, как хлорид натрия, эффективный диапазон сахарозы или сорбита соответственно снижается. Эти и другие подобные показатели осмоляльности и осмолярности легко определяются специалистами в данной области.In some embodiments, the osmolarity of the composition is from about 200 mOsm/L to about 800 mOsm/L, preferably in the range from about 250 mOsm/L to about 500 mOsm/L, or from about 300 mOsm/L to about 400 mOsm/L. The salt-free composition may contain, for example, from about 5% to about 25% sucrose, preferably from about 7% to about 15%, or from about 10% to about 12% sucrose. Alternatively, the salt-free composition may contain, for example, from about 3% to about 12% sorbitol, preferably from about 4% to 7%, or from about 5% to about 6% sorbitol. If a salt such as sodium chloride is added, the effective range of sucrose or sorbitol is correspondingly reduced. These and other similar indicators of osmolality and osmolarity are readily determined by those skilled in the art.
В некоторых вариантах осуществления композиция согласно изобретению, совместимая с парентеральным введением, включает один или несколько ингибиторов окисления свободных радикалов и/или комплексообразующих агентов. Разные акцепторы свободных радикалов и комплексоны известны специалистам в данной области и могут применяться для описываемых авторами композиций и способов применения. Примеры включают, помимо прочих, этанол, EDTA, комбинацию EDTA/этанола, триэтаноламин, маннит, гистидин, глицерин, цитрат натрия, инозит-гексафосфат, триполифосфат, аскорбиновую кислоту/аскорбат, янтарную кислоту/сукцинат, яблочную кислоту/малеат, десферал, EDDHA и DTPA и различные комбинации двух или более из вышеупомянутых соединений. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере может добавляться невосстанавливающий акцептор свободных радикалов в концентрации, которая эффективно повышает долгосрочную устойчивость композиции. Также в разных комбинациях могут добавляться один или несколько ингибиторов окисления свободных радикалов/комплексонов, такие, как акцептор и двухвалентный катион. Выбор комплексона определяет, требуется ли добавление акцептора.In some embodiments, a parenteral compatible composition of the invention comprises one or more free radical oxidation inhibitors and/or complexing agents. Various free radical scavengers and chelating agents are known to those skilled in the art and can be used for the compositions and methods of use described by the authors. Examples include but are not limited to ethanol, EDTA, EDTA/ethanol combination, triethanolamine, mannitol, histidine, glycerin, sodium citrate, inositol hexaphosphate, tripolyphosphate, ascorbic acid/ascorbate, succinic acid/succinate, malic acid/maleate, desferal, EDDHA and DTPA and various combinations of two or more of the above compounds. In some embodiments, at least a non-reducing free radical scavenger may be added at a concentration that effectively enhances the long-term stability of the composition. One or more inhibitors of free radical/complexon oxidation, such as an acceptor and a divalent cation, can also be added in various combinations. The choice of complexone determines whether the addition of an acceptor is required.
В некоторых вариантах осуществления композиция согласно изобретению, совместимая с парентеральным введением, включает одно или несколько неионных поверхностно-активных веществ, включая, помимо прочих, сложные эфиры жирных кислот полиоксиэтиленсорбита, Polysorbate-80 (TWEEN 80), Polysorbate-60 (TWEEN 60), Polysorbate-40 (TWEEN 40) и Polysorbate-20 (TWEEN 20), алкиловые эфиры полиоксиэтилена, включая, помимо прочих, BRIJ 58, BRIJ 35, а также другие, такие, как TRITON X-100; TRITON X-114, NP40, SPAN 85 и серии PLURONIC неионных поверхностно-активных веществ (например, PLURONIC 121), причем предпочтительными компонентами являются Polysorbate-80 в концентрации от приблизительно 0,001% до приблизительно 2% (более предпочтительно - до приблизительно 0,25%) или Polysorbate-40 в концентрации от приблизительно 0,001% до 1% (более предпочтительно - до приблизительно 0,5%).In some embodiments, a composition of the invention compatible with parenteral administration comprises one or more nonionic surfactants including, but not limited to, fatty acid esters of polyoxyethylene sorbitol, Polysorbate-80 (TWEEN 80), Polysorbate-60 (TWEEN 60), Polysorbate-40 (TWEEN 40) and Polysorbate-20 (TWEEN 20), polyoxyethylene alkyl ethers including but not limited to BRIJ 58, BRIJ 35, and others such as TRITON X-100; TRITON X-114, NP40, SPAN 85, and the PLURONIC series of non-ionic surfactants (e.g., PLURONIC 121), the preferred ingredients being Polysorbate-80 at about 0.001% to about 2% (more preferably up to about 0.25 %) or Polysorbate-40 at a concentration of from about 0.001% to 1% (more preferably up to about 0.5%).
В некоторых вариантах осуществления композиция согласно изобретению включает один или несколько дополнительных стабилизирующих агентов, подходящих для парентерального введения, например, восстановитель, включающий по меньшей мере одну тиольную (-SH) группу (например, цистеин, N-ацетилцистеин, восстановленный глутатион, тиогликолят натрия, тиосульфат, монотиоглицерин или их смеси). В альтернативном или необязательном варианте содержащие консервант иммуногенные композиции согласно изобретению могут быть дополнительно стабилизированы путем удаления кислорода из тары для хранения, защиты композиции от света (например, путем использования посуды из янтарного стекла).In some embodiments, the composition according to the invention includes one or more additional stabilizing agents suitable for parenteral administration, for example, a reducing agent comprising at least one thiol (-SH) group (for example, cysteine, N-acetylcysteine, reduced glutathione, sodium thioglycolate, thiosulfate, monothioglycerol or mixtures thereof). Alternatively or optionally, the preservative-containing immunogenic compositions of the invention may be further stabilized by removing oxygen from the storage container, protecting the composition from light (eg, by using amber glassware).
Содержащие консервант иммуногенные композиции согласно изобретению могут включать один или несколько фармацевтически приемлемых разбавителей, носителей или наполнителей, включая любой наполнитель, который сам по себе не вызывает иммунную реакцию. Подходящими наполнителями, помимо прочих, могут быть макромолекулы, такие, как белки, сахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот, сахароза (Paoletti et al, 2001, Vaccine, 19: 2118), трегалоза, лактоза и агрегаты липидов (такие, как капли масла или липосомы). Такие разбавители, наполнители и/или носители хорошо известны специалистам в данной области. Фармацевтически приемлемые наполнители обсуждаются, например, в публикации Gennaro, 2000, Remington: The Science и Practice of Pharmacy, 20th edition, ISBN:0683306472.The preservative-containing immunogenic compositions of the invention may include one or more pharmaceutically acceptable diluents, carriers, or excipients, including any excipient that does not itself elicit an immune response. Suitable excipients may include, among others, macromolecules such as proteins, saccharides, polylactic acids, polyglycolic acids, polymeric amino acids, amino acid copolymers, sucrose (Paoletti et al, 2001, Vaccine, 19:2118), trehalose, lactose, and lipid aggregates. (such as oil drops or liposomes). Such diluents, excipients and/or carriers are well known to those skilled in the art. Pharmaceutically acceptable excipients are discussed, for example, in Gennaro, 2000, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, ISBN: 0683306472 .
Композиции согласно изобретению могут быть лиофилизированными или рецептированными в водной форме, т.е., в форме растворов или суспензий. Жидкие композиции в предпочтительном варианте могут вводиться непосредственно из фасованной формы и, таким образом, являются идеальными для инъекций без необходимости в восстановлении влагосодержания в водной среде, которое иначе требовалось бы для лиофилизированной композиции согласно изобретению.Compositions according to the invention may be lyophilized or formulated in aqueous form, ie in the form of solutions or suspensions. Liquid compositions may preferably be administered directly from the packaged form and are thus ideal for injection without the need for rehydration in the aqueous medium which would otherwise be required for the lyophilized composition of the invention.
Прямая доставка иммуногенных композиций согласно настоящему изобретению в организм субъекта может выполняться путем парентерального введения (внутримышечно, внутрибрюшинно, внутрикожно, подкожно, внутривенно или в межклеточное пространство ткани); или путем ректального, перорального, вагинального, местного, трансдермального, интраназального, глазного, ушного, пульмонального или другого мукозального введения. В предпочтительном варианте осуществления парентеральное введение осуществляют путем внутримышечной инъекции, например, в бедро или плечо субъекта. Инъекцию выполняют через иглу (например, иглу для подкожных инъекций), однако в альтернативном варианте может применяться безыгольная инъекция. Типичная внутримышечная доза составляет 0,5 мл. Композиции согласно изобретению могут быть рецептированы в разных формах, например, для инъекций в форме жидких растворов или суспензий. В некоторых вариантах осуществления композицию рецептируют в форме порошка или аэрозоля для пульмонального введения, например, при помощи ингалятора. В других вариантах осуществления композиция может быть рецептирована в форме суппозитория или пессария, или для назального, ушного или глазного введения, например, в форме аэрозоля, капель, геля или порошка.Direct delivery of the immunogenic compositions of the present invention to a subject's body may be by parenteral administration (intramuscular, intraperitoneal, intradermal, subcutaneous, intravenous, or interstitial tissue space); or by rectal, oral, vaginal, topical, transdermal, intranasal, ocular, otic, pulmonary or other mucosal administration. In a preferred embodiment, parenteral administration is by intramuscular injection, for example, into the thigh or upper arm of the subject. The injection is performed through a needle (eg, a hypodermic needle), however, needleless injection may alternatively be used. A typical intramuscular dose is 0.5 ml. Compositions according to the invention can be formulated in various forms, for example, for injection in the form of liquid solutions or suspensions. In some embodiments, the composition is formulated in the form of a powder or aerosol for pulmonary administration, eg, via an inhaler. In other embodiments, the composition may be formulated in the form of a suppository or pessary, or for nasal, ear, or ocular administration, for example, in the form of an aerosol, drop, gel, or powder.
Оптимальное количество компонентов для конкретной иммуногенной композиции может определяться путем стандартных исследований, включающих наблюдение за соответствующими иммунными реакциями у субъектов. После первоначальной вакцинации субъекты могут получать одну или несколько бустер-иммунизаций с надлежащими интервалами.The optimal amount of components for a particular immunogenic composition can be determined by standard studies, including the observation of appropriate immune responses in subjects. Following the initial vaccination, subjects may receive one or more booster immunizations at appropriate intervals.
Упаковка и лекарственные формыPackaging and dosage forms
Иммуногенные композиции согласно изобретению могут быть расфасованы в форме единичной дозы или в много дозовой форме (например, 2 дозы, 4 дозы или более). Для многодозовых форм обычно, хотя и не обязательно, предпочтение отдается флаконам перед предварительно заполненными шприцами. К подходящим многодозовым форматам помимо прочих, относятся: от 2 до 10 доз на вместилище при 0,1-2 мл на дозу. В некоторых вариантах осуществления доза составляет 0,5 мл. См., например, Международную патентную заявку WO 2007/127668, включенную в данное описание путем ссылки.The immunogenic compositions of the invention may be packaged in unit dose form or in multi-dose form (eg 2 doses, 4 doses or more). For multi-dose forms, vials are generally, though not necessarily, preferred over pre-filled syringes. Suitable multi-dose formats include, but are not limited to: 2 to 10 doses per receptacle at 0.1-2 ml per dose. In some embodiments, the implementation of the dose is 0.5 ml. See, for example, International Patent Application WO 2007/127668, incorporated herein by reference.
Композиции могут быть расфасованы в флаконы или другую подходящую тару для хранения или могут находиться в предварительно заполненных устройствах для доставки, например, одно- или многокомпонентных шприцах, которые могут поставляться с иглами или без них. Шприц обычно, но не обязательно, содержит единичную дозу содержащей консервант иммуногенной композиции согласно изобретению, хотя также предусматриваются многодозовые предварительно заполненные шприцы. Подобным образом флакон может включать единичную дозу, хотя в альтернативном варианте может включать несколько доз.The compositions may be packaged in vials or other suitable storage containers, or may be in pre-filled delivery devices, such as single or multi-unit syringes, which may be supplied with or without needles. The syringe usually, but not necessarily, contains a single dose of the preservative-containing immunogenic composition of the invention, although multi-dose pre-filled syringes are also contemplated. Similarly, the vial may include a single dose, although it may alternatively include multiple doses.
Объемы эффективных доз могут определяться традиционными способами, хотя типичная доза композиция для инъекций имеет объем 0,5 мл. В некоторых вариантах осуществления дозу рецептируют для введения человеку. В некоторых вариантах осуществления дозу рецептируют для введения взрослому человеку, подростку, ребенку преддошкольного или грудного возраста (т.е., не старше одного года) и в предпочтительных вариантах осуществления вводят путем инъекции.Effective dose volumes can be determined by conventional means, although a typical dose of an injectable composition has a volume of 0.5 ml. In some embodiments, a dose is formulated for administration to a human. In some embodiments, the dose is formulated for administration to an adult, adolescent, preschool or infant (ie, less than one year of age) and in preferred embodiments is administered by injection.
Жидкие иммуногенные композиции согласно изобретению также являются подходящими для восстановления влагосодержания других иммуногенных композиций, присутствующих в лиофилизированной форме. Если иммуногенная композиция предназначена для такого немедленного восстановления влагосодержания, изобретение предусматривает комплект с двумя флаконами, двумя или более предварительно наполненными шприцами или одним или несколькими из тех и других, причем содержимое шприца используют для восстановления влагосодержания содержимого флакона перед инъекцией, или наоборот.Liquid immunogenic compositions according to the invention are also suitable for rehydration of other immunogenic compositions present in lyophilized form. If the immunogenic composition is intended for such immediate rehydration, the invention provides a kit with two vials, two or more pre-filled syringes, or one or more of both, the contents of the syringe being used to rehydrate the contents of the vial prior to injection, or vice versa.
В альтернативном варианте иммуногенные композиции согласно настоящему изобретению подвергают лиофилизации и восстановлению влагосодержания, например, с применением множества способов высушивания замораживанием, хорошо известных среди специалистов в данной области, для образования сухих частиц правильной (например, сферической) формы, таких, как микропеллеты или микросферы, обладающие характеристиками частиц, такими, как средний диаметр, которые могут выбираться и регулироваться путем изменения конкретных способов, применяемых для их изготовления. Иммуногенные композиции также могут включать адъювант, который необязательно может быть приготавливаться в форме отдельных сухих, правильной (например, сферической) формы частиц, таких, как микропеллеты или микросферы, или содержаться в них. В таких вариантах осуществления настоящее изобретение также обеспечивает комплект иммуногенной композиции, включающий первый компонент, включающий стабилизированную, сухую иммуногенную композицию, которая необязательно также включает один или несколько консервантов согласно изобретению и второй компонент, включающий стерильный, водный раствор для восстановления влагосодержания первого компонента. В некоторых вариантах осуществления водный раствор включает один или несколько консервантов и необязательно может включать по меньшей мере один адъювант (см., например, заявку WO 2009/109550 (включенную в данное описание путем ссылки).Alternatively, the immunogenic compositions of the present invention are lyophilized and rehydrated, e.g., using a variety of freeze-drying techniques well known to those skilled in the art, to form dry particles of regular (e.g., spherical) shape, such as micropellets or microspheres, having particle characteristics, such as average diameter, which can be selected and controlled by varying the specific methods used to make them. The immunogenic compositions may also include an adjuvant, which may optionally be formulated into or contained in discrete, dry, regular (eg, spherical) particles such as micropellets or microspheres. In such embodiments, the present invention also provides an immunogenic composition kit comprising a first component comprising a stabilized, dry immunogenic composition that optionally also includes one or more preservatives of the invention and a second component comprising a sterile, aqueous solution to rehydrate the first component. In some embodiments, the implementation of the aqueous solution includes one or more preservatives and may optionally include at least one adjuvant (see, for example, application WO 2009/109550 (included in this description by reference).
В еще одном варианте осуществления тару для многодозового формата выбирают из одной или нескольких групп, к которым, помимо прочих, относятся общая лабораторная стеклянная посуда, колбы, мензурки, мерные цилиндры, ферментаторы, биореакторы, системы для инфузий, трубки, пакеты, банки, флаконы, крышки для флаконов (например, резиновые пробки, навинчивающиеся крышки), ампулы, шприцы, двух- или многокамерные шприцы, пробки шприцев, поршни шприцев, резиновые крышки, пластиковые крышки, стеклянные крышки, картриджи и одноразовые шприц-ручки и т.п. Вместилище согласно настоящему изобретению не ограничивается конкретным материалом и включает такие материалы, как стекло, металлы (например, сталь, нержавеющая сталь, алюминий и т.п.) и полимеры (например, термопласты, эластомеры, термопласты-эластомеры). В конкретном варианте осуществления вместилище подходящего формата представляет собой 5 мл стеклянный флакон Schott Type 1 с бутиловой пробкой. Специалисту в данной области станет понятно, что список вышеизложенных форматов ни в коей мере не является исчерпывающим, а лишь служит в качестве рекомендации для специалиста в отношении различных форматов, доступных с точки зрения настоящего изобретения. Дополнительные форматы, предусмотренные для использования согласно настоящему изобретению, можно найти в опубликованных каталогах от поставщиков и производителей лабораторного оборудования, таких, как United States Plastic Corp.(Lima, ОН), VWR.In yet another embodiment, containers for the multi-dose format are selected from one or more groups that include, but are not limited to, general laboratory glassware, flasks, beakers, graduated cylinders, fermenters, bioreactors, infusion systems, tubes, bags, jars, vials. , vial caps (e.g. rubber stoppers, screw caps), ampoules, syringes, dual or multi-chamber syringes, syringe caps, syringe pistons, rubber caps, plastic caps, glass caps, cartridges and disposable pens, etc. The container of the present invention is not limited to a particular material, and includes materials such as glass, metals (eg steel, stainless steel, aluminum, etc.) and polymers (eg thermoplastics, elastomers, thermoplastic elastomers). In a particular embodiment, a suitably formatted container is a 5
ПРИМЕРЫEXAMPLES
Пример 1: Экспериментальные процедурыExample 1: Experimental Procedures
Сывороточный бактерицидный анализSerum bactericidal assay
Яванских макаков (n = 5/группу) внутримышечно иммунизировали белками rLP2086 или rP2086 (А+В), адсорбированными в А1Р04. Яванские макаки представляют собой пример нечеловекообразных приматов. Животных вакцинировали на 0, 4 и 24 недели и титры ORF2086-специфического IgG и функционального антитела определяли на 0, 4, 6 и 26 недели. Титры ORF2086-специфического IgG в сыворотке определяли против 1-LP2086A и В.Cynomolgus monkeys (n=5/group) were intramuscularly immunized with rLP2086 or rP2086 (A+B) proteins adsorbed in A1PO4. Javan macaques are an example of non-human primates. Animals were vaccinated at 0, 4 and 24 weeks and ORF2086-specific IgG and functional antibody titers were determined at 0, 4, 6 and 26 weeks. Serum ORF2086-specific IgG titers were determined against 1-LP2086A and B.
Титры функционального антитела исследовали с применением сывороточного бактерицидного анализа (SBA) против штаммов Neisseria meningitidis, экспрессирующих LP2086, с последовательностями, гомологичными или гетерологичными содержащимся в вакцине.Functional antibody titers were tested using a serum bactericidal assay (SBA) against strains of Neisseria meningitidis expressing LP2086 with sequences homologous or heterologous to those contained in the vaccine.
Бактерицидные антитела сыворотки у макаков или кроликов, иммунизированных вакциной ORF2086, определяли с применением SBA с комплементом человека. Иммунные сыворотки кроликов или иммунные сыворотки макаков подвергали термоинактивации для устранения внутренней активности комплемента и последовательно подвергали серии разведении 1:2 в PBS Дульбекко с Са2+ и Mg2+ (D-PBS) в 96-луночном микротитровальном планшете для испытания бактерицидной активности сыворотки против штаммов N. meningitidis. Бактерии, используемые для анализа, выращивали в среде GC, дополненной добавкой Келлогга (GCK), и наблюдали по оптической плотности при 650 нм. Бактерии собирали для использования в анализе при конечном показателе оптической плотности OD650 0,50-0,55, разводили в D-PBS и к аналитической смеси добавляли 1000-3000 КОЕ с 20% комплементом человека.Serum bactericidal antibodies in macaques or rabbits immunized with the ORF2086 vaccine were determined using SBA with human complement. Rabbit immune sera or macaque immune sera were thermally inactivated to eliminate intrinsic complement activity and serially subjected to a 1:2 dilution series in Dulbecco's PBS with Ca2+ and Mg2+ (D-PBS) in a 96-well microtiter plate to test the bactericidal activity of the sera against N. meningitidis strains . Bacteria used for analysis were grown in GC medium supplemented with Kellogg's (GCK) and observed by optical density at 650 nm. Bacteria were harvested for use in the assay at a final OD650 of 0.50-0.55, diluted in D-PBS, and 1000-3000 cfu with 20% human complement was added to the assay mixture.
Сыворотку человека без обнаружимой бактерицидной активности использовали в качестве экзогенного источника комплемента. Источники комплементов испытывали на пригодность относительно каждого отдельного испытываемого штамма. Источник комплемента использовали лишь в том случае, если количество бактерий, выживших в контрольных образцах без добавления иммунных сывороток, составляло >75%. Требовалось десять уникальных источников комплементов для выполнения SBA, описываемых в данном исследовании.Human serum without detectable bactericidal activity was used as an exogenous source of complement. Complement sources were tested for suitability with respect to each individual strain tested. A complement source was used only if the number of bacteria surviving in control samples without the addition of immune sera was >75%. Ten unique complement sources were required to perform the SBA described in this study.
После 30 мин инкубации при 37°C с 5% CO2 к реакционной смеси добавляли D-PBS и аликвоты переносили на микрофильтровальные планшеты, заполненные 50% среды GCK. Микрофильтровальные планшеты подвергали фильтрации, инкубировали в течение суток при 37°C с 5% CO2 и микроколонии окрашивали и подсчитывали. Бактерицидные титры сыворотки определяли как интерполированное обратное разбавление сыворотки, которое приводило к 50% снижению КОЕ по сравнению с КОЕ в контрольных лунках без иммунных сывороток. Титр SBA определяют как обратное значение интерполированного разбавления испытываемой сыворотки, которое вызывает 50% снижение численности бактерий после 30 мин инкубации при 37°C. Склонность к цитолизу под действием иммунных сывороток ORF2086 устанавливали при наличии 4-кратного или более повышения титра SBA для иммунных сывороток ORF2086 по сравнению с соответствующим неиммунные сыворотки. Сыворотки, которые были отрицательными по отношению к анализируемому штамму в начальном разведении, относили к титру, соответствующему половине предела обнаружения для пробы (т.е., 4).After 30 min incubation at 37° C. with 5% CO 2 , D-PBS was added to the reaction mixture and aliquots were transferred to microfilter plates filled with 50% GCK medium. Microfilter plates were subjected to filtration, incubated for a day at 37°C with 5% CO 2 and microcolonies were stained and counted. Serum bactericidal titers were defined as the interpolated back dilution of serum that resulted in a 50% reduction in cfu compared to cfu in control wells without immune sera. The SBA titer is defined as the reciprocal of the interpolated dilution of the test serum that causes a 50% reduction in bacteria after 30 minutes of incubation at 37°C. The propensity for cytolysis by ORF2086 immune sera was determined by the presence of a 4-fold or more increase in SBA titer for ORF2086 immune sera compared to the corresponding non-immune sera. Sera that were negative for the test strain at the initial dilution were assigned a titer corresponding to half the detection limit for the sample (ie, 4).
Пример 2: Клонирование и экспрессия нелипидированных вариантов ORF2086Example 2: Cloning and expression of non-lipidated variants of ORF2086
Зрелую аминокислотную последовательность Р2086, соответствующую остаткам 27-286 из N. meningitidis штамма М98250771 (А05), первоначально получали путем ПЦР-амплификации из геномной ДНК. Прямой праймер, имеющий последовательность TGCCATATGAGCAGCGGAAGCGGAAG (SEQ ID NO: 22), был соединен с 5' концом и содержал сайт NdeI для клонирования. Обратный праймер, имеющий последовательность CGGATCCCTACTGTTTGCCGGCGATGC (SEQ ID NO: 23), был соединен с 3' концом гена и содержал терминирующий кодон TAG, за которым следовал сайт рестрикции BamHI. Амплифицированный фрагмент из 799 п.о. сначала клонировали в промежуточный вектор PCR2.1 (Invitrogen, Carlesbac, CA) Эту плазмиду расщепляли при помощи NdeI и BamHI и лигировали в вектор экспрессии рЕТ9а (Novagen, Madison, WI), который был расщеплен при помощи NdeI и BamHI. Образованный в результате вектор pLA100 (который включает SEQ ID NO: 54) экспрессировал зрелый Р2086 подсемейства А05 из штамма М98250771 без N-концевого цистеина (см. SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, или SEQ ID NO: 55), который присутствовал бы в липидированном белке. Штамм-хозяин BLR(DE3) E. coli [F - ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm Δ(srl-recA)306::Tn10 (TetR) (DE3)] (Novagen) использовали для обеспечения экспрессии fHBP.The mature amino acid sequence P2086 corresponding to residues 27-286 from N. meningitidis strain M98250771 (A05) was originally obtained by PCR amplification from genomic DNA. A forward primer having the sequence TGCCATATGAGCAGCGGAAGCGGAAG (SEQ ID NO: 22) was linked to the 5' end and contained an NdeI site for cloning. A reverse primer having the sequence CGGATCCCTACTGTTTGCCGGCGATGC (SEQ ID NO: 23) was fused to the 3' end of the gene and contained a TAG termination codon followed by a BamHI restriction site. Amplified fragment of 799 p. first cloned into a PCR2.1 intermediate vector (Invitrogen, Carlesbac, CA) This plasmid was digested with NdeI and BamHI and ligated into the pET9a expression vector (Novagen, Madison, WI) which was digested with NdeI and BamHI. The resulting pLA100 vector (which includes SEQ ID NO: 54) expressed mature P2086 subfamily A05 from strain M98250771 without the N-terminal cysteine (see SEQ ID NO: 13 in which the N-terminal Cys at
Такие же этапы клонирования применяли для получения N-концевых Cys-делетированных вариантов В02, В03, В09, В22, В24, В44, А04, А12 и А22. N-концевые Cys-содержащие варианты также получали тем де способом с применением прямых праймеров, которые также включали Cys кодон (например, первый кодон SEQ ID NO: 1-11). На основе представленных авторами последовательностей специалист в данной области сможет построить прямой и обратный праймеры для каждого из этих вариантов. Например, указанные ниже праймеры использовали для амплификации нелипидированного варианта В44 с последующим клонированием в рЕТ9а с применением NdeI и BlpI.The same cloning steps were used to generate N-terminal Cys-deleted variants B02, B03, B09, B22, B24, B44, A04, A12 and A22. N-terminal Cys-containing variants were also generated in the same manner using forward primers that also included a Cys codon (eg, the first codon of SEQ ID NOs: 1-11). Based on the sequences provided by the authors, one skilled in the art will be able to construct forward and reverse primers for each of these variants. For example, the following primers were used to amplify a non-lipidated B44 variant followed by cloning into pET9a using NdeI and BlpI.
Результатыresults
Нелипидированные плазмидные последовательности были сильно экспрессированы, однако нелипидированные варианты белка были пирувилированы в N-концевом цистеиновом остатке. См. Примеры 8 и 9, в которых описывается, например, способ экспрессии последовательностей. Для преодоления этого пирувилирования N-концевой Cys кодон был делегирован. См., например. Пример 10. Однако делеция N-концевого Cys исключает экспрессию вариантов А22 и В22. См., например, Фигуру 4. Однако варианты А05, В01 и В44 все же были экспрессированы, несмотря на делецию N-концевого цистеинового остатка. См., например, SEQ ID NO: 13 (А05), в которой N-концевой Cys в позиции 1 делегирован, SEQ ID NO: 35 (В01 N-конец) и SEQ ID NO: 21 (В44), в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован. См., например, Фигуру 5. Кроме того, на экспрессию нелипидированного варианта В09 не влияла делеция N-концевого цистеинового остатка. См., например. Пример 4.The non-lipidated plasmid sequences were highly expressed, however, the non-lipidated protein variants were pyruvilated at the N-terminal cysteine residue. See Examples 8 and 9, which describe, for example, how the sequences are expressed. To overcome this pyruvylation, the N-terminal Cys codon was delegated. See, for example. Example 10 However, deletion of the N-terminal Cys excludes the expression of variants A22 and B22. See, for example, Figure 4. However, variants A05, B01 and B44 were still expressed despite the deletion of the N-terminal cysteine residue. See, for example, SEQ ID NO: 13 (A05) in which the N-terminal Cys at
Пример 3: Влияние ствола Gly/Ser на экспрессию нелипидироваиного вариантаExample 3 Effect of the Gly/Ser stem on the expression of a non-lipid variant
Чтобы определить, почему варианты В44 А05, В01 и В44 экспресировались при отсутствии N-концевого Cys, а варианты А22 и В22 не экспрессировались, последовательности этих вариантов выравнивали. Варианты В44 А05, В01 и В44 имеют продленный ряд из 10 или 11 остатков Gly и Ser непосредственно после N-концевого Cys (т.е., ствол Gly/Ser). Однако варианты А22 и В22 имели только ствол Gly/Ser, состоявший из 6 остатков Gly и Ser. Соответственно, ствол Gly/Ser вариантов А22 и В22 был продлен вставкой дополнительных остатков Gly и Ser.To determine why the B44 variants A05, B01 and B44 were expressed in the absence of the N-terminal Cys, while the A22 and B22 variants were not expressed, the sequences of these variants were aligned. Variants B44 A05, B01 and B44 have an extended row of 10 or 11 Gly and Ser residues immediately after the N-terminal Cys (ie, Gly/Ser stem). However, variants A22 and B22 had only the Gly/Ser stem, which consisted of 6 Gly and Ser residues. Accordingly, the Gly/Ser stem of variants A22 and B22 was extended by the insertion of additional Gly and Ser residues.
Длинные варианты ствола Gly/Ser получали с применением способов, описанных в Примере 2, используя прямые праймеры, кодирующие ствол Gly/Ser с 10 или 11 остатками Gly и Ser.Gly/Ser stem long variants were generated using the methods described in Example 2 using forward primers encoding a Gly/Ser stem with 10 or 11 Gly and Ser residues.
Варианты А22 и В22 N-концевого Cys-делетированного длинного ствола Gly/Ser (10-11 остатков Gly/Ser) демонстрировали повышенную экспрессию относительно вариантов А22 и В22 N-концевой Cys-делетированного короткого ствола Gly/Ser (6 остатков Gly/Ser). Однако эти уровни экспрессии все же были сниженными по сравнению с уровнями экспрессии вариантов А05, В01 и В44.Variants A22 and B22 of the N-terminal Cys-deleted Gly/Ser long stem (10-11 Gly/Ser residues) were overexpressed relative to the A22 and B22 variants of the N-terminal Cys-deleted Gly/Ser short stem (6 Gly/Ser residues) . However, these expression levels were still reduced compared to the expression levels of variants A05, B01 and B44.
Пример 4; Оптимизация кодоновExample 4; Codon optimization
На экспрессию нелипидированного варианта В09 не влияла делеция N-концевого цистеинового остатка (см. SEQ ID NO: 18, в которой цистеин в позиции 1 делегирован, или SEQ ID NO: 49). См., например. Фигуру 6. Оценка последовательности варианта В09 продемонстрировала, что вариант В09 имеет ствол Gly/Ser, состоящий из 6 остатков Gly и Ser, подобный стволу Gly/Ser вариантов А22 и В22. Действительно, N-концевые хвосты вариантов В09 и А22 идентичны на уровне аминокислот. Однако N-концевые хвосты вариантов В09 и А22 (SEQ ID NO: 53 и 42, соответственно) отличаются на уровне нуклеиновых кислот двумя нуклеиновыми кислотами: нуклеиновыми кислотами 15 и 39 SEQ ID NO: 8. См., например, Фигуру 6. Первые 14 аминокислот N-концевого хвоста варианта В22 идентичны вариантам В09 и А22, и N-концевой хвост варианта В22 отличается только в 15-й аминокислоте. Нуклеиновые кислоты 1-42 варианта В22 идентичны нуклеиновым кислотам 1-42 варианта А22. Нуклеиновые кислоты 1 - 42 варианта В22 (см. SEQ ID NO: 52) идентичны нуклеиновым кислотам 1-42 варианта В09 (см. SEQ ID NO: 53), за исключением различий в нуклеиновых кислотах 15 и 39 при оптимальном выравнивании. Соответственно, вариант В22 отличается от варианта В09 в аминокислотах 15 и 39 SEQ ID NO: 8. В последнем предложении содержится опечатка, и правильно было бы указать, что вариант В22 отличается от варианта В09 в нуклеиновых кислотах 15 и 39 SEQ ID NO: 8.The expression of the non-lipidated B09 variant was not affected by the deletion of the N-terminal cysteine residue (see SEQ ID NO: 18 in which the cysteine at
Чтобы определить, влияют ли различия в нуклеиновых кислотах на уровень экспрессии варианта В09 по сравнению с вариантами А22 и В22, варианты А22 и В22 подвергали точечной мутации для включения нуклеиновых кислот 15 и 39 в соответствующие ко доны для Gly5 и Gly 13. Включение этих молчащих мутаций нуклеиновых кислот значительно повышало экспрессию N-концевых Cys-делетированных вариантов А22 и В22 до уровня, подобного показателю N-концевого Cys-делетированного варианта В09. См., например, Фигуру 7. Соответственно, оптимизация кодонов для соответствия варианта В09 может повышать экспрессию N-концевых Cys-делетированных нелипидированных вариантов Р2086.To determine whether differences in nucleic acids affect the level of expression of the B09 variant compared to the A22 and B22 variants, the A22 and B22 variants were point mutated to insert
Дальнейший анализ нелипидированных вариантных последовательностей указывает на дополнительную оптимизацию кодонов в стволе Gly/Ser для улучшения экспрессии. Соответственно, дополнительные нелипидированные варианты строили с применением способа согласно Примеру 2 с использованием прямых праймеров, включающих такие кодон-оптимизированные последовательности. Прямые праймеры, используемые для получения оптимизированного ствол Gly/Sers включают любые из следующих последовательностей:Further analysis of non-lipidated variant sequences indicates additional codon optimization in the Gly/Ser stem to improve expression. Accordingly, additional non-lipidated variants were constructed using the method of Example 2 using forward primers containing such codon-optimized sequences. The forward primers used to obtain the optimized stem of Gly/Sers include any of the following sequences:
Пример 5: Оптимизация иммуногенной композицииExample 5 Optimization of the Immunogenic Composition
Рецептированные вакцины от ISCOMATRIX вызывали быструю иммунную реакцию, которая в результате приводила к снижению количества доз, необходимых для достижения более, чем 4-кратного повышения скорости реакции, измеряемой с применением сывороточного бактерицидного анализа. Группы из пяти макаков-резусов подвергали иммунизации различными композициями двухвалентной нелипидированной вакцины rP2086. Вакцина включала непирувилированный нелипидированный вариант А05 (SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делегирован, или SEQ ID NO: 55, кодируемая SEQ ID NO: 54) и непирувилированный нелипидированный вариант В44 (SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, или SEQ ID NO: 44, кодируемая SEQ ID NO: 51). Единицы количества адъюванта следующие: А1Р04 составляет 250 мкг, ISCOMATRIX составляет от 10 до 100 мкг. Единицы количества адъюванта для А1Р04, показанные в Таблицах 2-5, представлены в миллиграммах и, таким образом, указываются как 0,25 (мг) в отличие от 250 мкг.The formulated vaccines from ISCOMATRIX elicited a rapid immune response resulting in a reduction in the number of doses required to achieve a greater than 4-fold increase in response rate as measured using a serum bactericidal assay. Groups of five rhesus monkeys were immunized with different compositions of the bivalent non-lipidated rP2086 vaccine. The vaccine included non-pyruvilated, non-lipidated variant A05 (SEQ ID NO: 13, in which the N-terminal Cys at
Протокол иммунизации предусматривал 0, 4 и 24 нед. с кровопусканием на 0, 4, 6 и 26 неделях. Не наблюдалось повышения титров SBA после введения первой дозы ни в одной из групп. После введения второй дозы повышение титров SBA и количество респондеров, определяемое по 4-кратному повышению титра SBA относительно исходного показателя, наблюдалось для композиций, содержащих адъювант ISCOMATRIX. В Таблицах 2 и 3 представлены GMT SBA, наблюдаемые для штамма fHBP подсемейств А и В, соответственно. GMT SBA для композиций ISCOMATRIX были в 3-19 и 4-24 раза выше, чем наблюдаемые для композиции AlPO4 для штаммов подсемейств А и В, соответственно. Повышенные титры также наблюдались после введения третьей дозы для композиций ISCOMATRIX с повышением в 13-95 и 2-10 раз для штамма fHBP подсемейств А и В, соответственно, по сравнению с композицией AlPO4. Анализ показателей ответа, определяемых по четырехкратному или большему повышению титра SBA относительно исходного показателя обнаружил подобную тенденцию (Таблицы 4 и 5).The immunization protocol included 0, 4 and 24 weeks. with bloodletting at 0, 4, 6 and 26 weeks. There was no increase in SBA titers after the first dose in any of the groups. After the second dose, an increase in SBA titers and the number of responders, as defined by a 4-fold increase in SBA titer from baseline, was observed for formulations containing the ISCOMATRIX adjuvant. Tables 2 and 3 show the GMT SBA observed for the fHBP strain of subfamilies A and B, respectively. The SBA GMTs for the ISCOMATRIX formulations were 3-19 and 4-24 times higher than those observed for the AlPO 4 formulation for subfamily A and B strains, respectively. Elevated titers were also observed after the third dose for the ISCOMATRIX formulations, with increases of 13-95 and 2-10 fold for the fHBP strain subfamilies A and B, respectively, compared to the AlPO 4 formulation. Analysis of response rates, defined as a fourfold or greater increase in SBA titer from baseline, found a similar trend (Tables 4 and 5).
Пример 6: Иммунологическая защита, обеспечиваемая липидированными и нелипидированными вариантамиExample 6: Immunological protection provided by lipidated and non-lipidated variants
Рекомбинантно экспрессированный нелипидированный вариант Р2086 (В44) обеспечивает широкую защиту, измеряемую по SBA против штаммов, представляющих различные варианты fHBP (от приблизительно 85% до приблизительно <92% ID) последовательностей LP2086. Эти показатели реакции получали для нелипидированной вакцины, рецептированной с AlPO4. См. Таблицу 6, в которой представлены показатели реакции SBA на штамм MnB fHBP подсемейства В, вызванной двухвалентной вакциной fHBP. Нелипидированная вакцина (представленная знаком "-" под колонкой "липидирование") включала 1 мкг на белок непирувилированного нелипидированного варианта А05 (SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован) и непирувилированного нелипидированного варианта В44 (SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делегирован).The recombinantly expressed non-lipidated variant P2086 (B44) provides broad protection as measured by SBA against strains representing various fHBP variants (from about 85% to about <92% ID) of the LP2086 sequences. These response rates were obtained for the non-lipidated vaccine formulated with AlPO 4 . See Table 6, which shows the response rates of SBA to the MnB strain fHBP subfamily B, caused by a bivalent fHBP vaccine. The non-lipidated vaccine (represented by a "-" sign under the lipidation column) included 1 μg per protein of the non-pyruvilated non-lipidated variant A05 (SEQ ID NO: 13 in which the N-terminal Cys at
В альтернативном варианте рекомбинантпо экспрессированный нелипидировапный вариант Р2086 (В44) вызывает большую иммунную реакцию, измеряемую по титру SBA, по сравнению с липидированным вариантом (В01) против штаммов, включающих подобные (>92% ID) и различные (<92% ID) последовательности LP2086. Более высокие показатели реакции (определяемые четырехкратным или большим повышением в титрах SBA относительно исходного показателя) наблюдали для вакцины, содержащей нелипидированный rP2086 В44 по сравнению с вакциной, содержащей липидированный rLP2086 B01 (Таблица 6).Alternatively, the recombinantly expressed non-lipidated P2086 variant (B44) elicits a greater immune response, as measured by SBA titer, compared to the lipidated variant (B01) against strains containing similar (>92% ID) and different (<92% ID) LP2086 sequences. . Higher response rates (defined as a fourfold or greater increase in SBA titers from baseline) were observed for the vaccine containing the non-lipidated rP2086 B44 compared to the vaccine containing the lipidated rLP2086 B01 (Table 6).
Согласно Таблице 6, нелипидированный В44 является предпочтительным компонентом fHBP подсемейства B в композиции для обеспечения широкой защиты (например, через выработку бактерицидных антител) против многих вариантных штаммов LP2086.According to Table 6, non-lipidated B44 is the preferred component of subfamily B fHBP in the formulation to provide broad protection (eg, via bactericidal antibody production) against many LP2086 variant strains.
Неожиданно авторами изобретения было обнаружено, что штаммы LP2086 варианта В09 имеют наименьшую вероятность положительных показателей реакции SBA в отношении гетерологичных (отличных от В09) полипептидов ORF2086. В частности, авторами изобретения было обнаружено, что LP2086 В09 является исключением с точки зрения аналитического штамма, против которого иммуногенная композиция А05/В44, описанная в Таблице 6 вызывала выработку бактерицидных антител. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению включает полипептид В09, в частности, в контексте композиции, включающей более одного полипептида ORF2086 подсемейства В. В предпочтительном варианте осуществления иммуногенная композиция, которая включает нелипидированный В44, также может включать нелипидированный полипептид В09.Surprisingly, the inventors found that B09 variant LP2086 strains have the lowest likelihood of positive SBA responses for heterologous (other than B09) ORF2086 polypeptides. In particular, the inventors have found that LP2086 B09 is an exception in terms of the assay strain against which the A05/B44 immunogenic composition described in Table 6 elicited bactericidal antibodies. Thus, in a preferred embodiment, an immunogenic composition of the invention comprises a B09 polypeptide, particularly in the context of a composition comprising more than one subfamily B ORF2086 polypeptide. In a preferred embodiment, an immunogenic composition that comprises non-lipidated B44 may also include a non-lipidated B09 polypeptide.
Пример 7: Оптимизация кодонов вариантов В44 и В09Example 7 Codon Optimization of Variants B44 and B09
Хотя показатели уровня экспрессии, достигаемые согласно представленным выше примерам, были во многих случаях достаточными, требовалась дальнейшая оптимизация, и приготавливали и испытывали экспрессионные последовательности Е. coli, включающие дополнительную оптимизацию кодонов по всей длине белка. Было обнаружено, что одна такая улучшенная последовательность для экспрессии отличного от цистеина белка В44 является нуклеиновокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 43. Как показано в Примере 9, экспрессионная последовательность, содержащая SEQ ID NO: 43, продемонстрировала усиленную экспрессию по сравнению с показателем неоптимизированной последовательности дикого типа.Although the expression levels achieved according to the examples above were sufficient in many cases, further optimization was required, and E. coli expression sequences were prepared and tested, including additional optimization of codons along the entire length of the protein. One such improved sequence for expressing the non-cysteine B44 protein was found to be the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 43. As shown in Example 9, the expression sequence containing SEQ ID NO: 43 showed enhanced expression compared to unoptimized wild-type sequence.
Экспрессия N-концевого Cys-делетированного белка В09 была улучшена путем применения смены кодона с вышеупомянутой оптимизированной последовательности В44 (SEQ ID NO: 43) на В09 (SEQ ID NO: 48). Для создания оптимизированных последовательностей В09 оптимизированную последовательность ДНК В44 (SEQ ID NO: 43) сначала сопоставляли с последовательностью ДНК аллеля В09 (SEQ ID NO: 48). Полная нелипидированная кодирующая последовательность аллеля В09 (SEQ ID NO: 48) была оптимизирована таким образом, чтобы отражать изменения кодона, наблюдаемые в оптимизированном аллеле В44 (SEQ ID NO: 43), всюду, где аминокислоты между В44 (SEQ ID NO: 44) и В09 (SEQ ID NO: 49) были идентичными. Последовательности кодонов в аллеле В09, соответствующие идентичным аминокислотам между аллелем В09 и аллелем В44, были изменены таким образом, чтобы отражать кодон, используемый в оптимизированной последовательности В44 (SEQ ID NO: 43). Последовательности кодонов для аминокислот, которые являются различными между В09 (SEQ ID NO: 49) и В44 (SEQ ID NO: 44), были неизменными в последовательности ДНК В09.Expression of the N-terminal Cys-deleted B09 protein was improved by applying a codon change from the above optimized sequence B44 (SEQ ID NO: 43) to B09 (SEQ ID NO: 48). To generate optimized B09 sequences, the optimized B44 DNA sequence (SEQ ID NO: 43) was first matched to the DNA sequence of the B09 allele (SEQ ID NO: 48). The complete non-lipidated coding sequence for the B09 allele (SEQ ID NO: 48) was optimized to reflect the codon changes seen in the optimized B44 allele (SEQ ID NO: 43) wherever the amino acids between B44 (SEQ ID NO: 44) and B09 (SEQ ID NO: 49) were identical. The codon sequences in the B09 allele corresponding to identical amino acids between the B09 allele and the B44 allele were changed to reflect the codon used in the optimized B44 sequence (SEQ ID NO: 43). The codon sequences for amino acids that are different between B09 (SEQ ID NO: 49) and B44 (SEQ ID NO: 44) were unchanged in the B09 DNA sequence.
Кроме того, аминокислотная последовательность нелипидированного В44 (SEQ ID NO: 44) содержит два последовательных серино-глициновых повтора (S-G-G-G-G) (SEQ ID NO: 56) (см. также аминокислоты с 2 по 6 SEQ ID NO: 44) на ее N-конце, в то время как аллель В09 содержит только один серино-глициновый повтор на N-конце (см. аминокислоты с 2 по 6 и аминокислоты с 7 по 11 SEQ ID NO: 49). Два серино-глициновых повтора на N-конце В44 (аминокислоты с 2 по 6 и аминокислоты с 7 по 11 SEQ ID NO: 44) также имеют разную частоту использования кодона (см. нуклеотиды с 4 по 18 и нуклеотиды с 19 по 33 SEQ ID NO: 43), и различные комбинации оптимизированного серино-глицинового повтора В44 (например, либо нуклеотиды с 4 по 18 SEQ ID NO: 43, либо нуклеотиды с 19 по 33 SEQ ID NO: 43, или их комбинация) применяли к последовательности ДНК В09 (SEQ ID NO: 48, например, к нуклеотидами с 4 по 18 SEQ ID NO: 48) с целью исследования влияния на экспрессию рекомбинантного белка.In addition, the amino acid sequence of non-lipidated B44 (SEQ ID NO: 44) contains two consecutive serine-glycine repeats (S-G-G-G-G) (SEQ ID NO: 56) (see also
Строили три разных варианта оптимизированного В09: SEQ ID NO: 45 содержит оба серино-глициновых повтора (GS1 и GS2) (нуклеиновые кислоты с 4 по 33 SEQ ID NO: 43) из оптимизированного В44, SEQ ID NO: 46 содержит GS1 (нуклеиновые кислоты с 4 по 18 SEQ ID NO: 43) и SEQ ID NO: 47 содержит GS2 (нуклеиновые кислоты с 19 по 33 SEQ ID NO: 43). ДНК для всех из вышеупомянутых кодон-оптимизированных последовательностей химически синтезировали с применением стандартных для данной области химических способов. Полученную в результате ДНК клонировали в соответствующие плазмидные векторы экспрессии и испытывали на экспрессию в клетках-хозяевах Е. Coli, как описывается в Примерах 8 и 9.Three different variants of optimized B09 were built: SEQ ID NO: 45 contains both serine-glycine repeats (GS1 and GS2) (
Пример 8: Способ экспрессии ORF2086, вариант В09Example 8 ORF2086 Expression Method Variant B09
Клетки Е. coli штамма K-12 (производные W3110 дикого типа (CGSC4474) с делениями в recA, fhuA и araA) преобразовывали плазмидой pEB063, которая включает SEQ ID NO: 45, рЕВ064, которая включает SEQ ID NO: 46, плазмидой рЕВ065, которая включает SEQ ID NO: 47, или плазмидой pLA134, которая включает SEQ ID NO: 48. Предпочтительные модификации штамма K-12 могут применяться для ферментации, но не требуются для экспрессии белков.E. coli strain K-12 cells (wild-type derivatives of W3110 (CGSC4474) with divisions in recA, fhuA and araA) were transformed with plasmid pEB063, which includes SEQ ID NO: 45, pEB064, which includes SEQ ID NO: 46, with plasmid pEB065, which includes SEQ ID NO: 47, or plasmid pLA134, which includes SEQ ID NO: 48. Preferred modifications of strain K-12 can be used for fermentation, but are not required for protein expression.
Клетки инокулировали в определенную среду с солями глюкозы. После 8 часов инкубации при 37°C применяли линейную подачу глюкозы и инкубацию продолжали в течение дополнительных 3 часов. К культуре добавляли изопропил P-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) до конечной концентрации 0,1 мМ с последующей 12-часовой инкубацией при 37°С. Клетки собирали путем центрифугирования при 16000 xg в течение 10 минут и подвергали лизису путем добавления комплекта для лизиса клеток Easy-Lyse™ от Lienco Technologies (St. Louis, МО) и загрузочный буфер. Осветленные лизаты подвергали анализу на экспрессию В09 путем окрашивания Кумасси гелей SDS-PAGE и/или вестерн-блоттинга с количественным определением при помощи сканирующего денситометра. Результаты сканирующей денситометрии представлены ниже в Таблице 7:The cells were inoculated into a defined medium with glucose salts. After 8 hours of incubation at 37° C., a linear supply of glucose was applied and incubation was continued for an additional 3 hours. Isopropyl P-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) was added to the culture to a final concentration of 0.1 mM, followed by a 12 hour incubation at 37°C. Cells were harvested by centrifugation at 16,000 xg for 10 minutes and lysed by adding the Easy-Lyse™ cell lysis kit from Lienco Technologies (St. Louis, MO) and loading buffer. Clarified lysates were analyzed for B09 expression by Coomassie staining of SDS-PAGE gels and/or Western blotting and quantitation with a scanning densitometer. The results of scanning densitometry are presented below in Table 7:
Пример 9: Способ экспрессии ORF2086 варианта В44Example 9 Expression Method for ORF2086 Variant B44
Клетки Е. coli штамма В (BLR(DE3), Novagen) преобразовывали плазмидой pLN056, которая включает SEQ ID NO: 51. Клетки Е. coli штамма K-12 (производная W3110 дикого типа) преобразовывали плазмидой pDK087, которая включает SEQ ID NO: 43. Клетки инокулировали в определенную среду с солями глюкозы. После 8 часов инкубации при 37°C применяли линейную подачу глюкозы и инкубацию продолжали в течение дополнительных 3 часов. К культуре добавляли изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) до конечной концентрации 0,1 мМ с последующей 12-часовой инкубацией при 37°C. Клетки собирали путем центрифугирования при 16000 xg в течение 10 минут и подвергали лизису путем добавления комплекта для лизиса клеток Easy-Lyse™ от Lienco Technologies (St. Louis, МО) и загрузочный буфер. Супернатанты подвергали анализу на экспрессию В09 путем окрашивания Кумасси гелей SDS-PAGE и/или вестерн-блоттинга, с количественным определением при помощи сканирующего денситометра. Результаты сканирующей денситометрии представлены ниже в Таблице 8:E. coli strain B (BLR(DE3), Novagen) cells were transformed with plasmid pLN056, which includes SEQ ID NO: 51. E. coli strain K-12 (wild-type derivative W3110) were transformed with plasmid pDK087, which includes SEQ ID NO: 43. Cells were inoculated into a defined medium with glucose salts. After 8 hours of incubation at 37° C., a linear supply of glucose was applied and incubation was continued for an additional 3 hours. Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) was added to the culture to a final concentration of 0.1 mM followed by a 12 hour incubation at 37°C. Cells were harvested by centrifugation at 16,000 xg for 10 minutes and lysed by adding the Easy-Lyse™ cell lysis kit from Lienco Technologies (St. Louis, MO) and loading buffer. Supernatants were analyzed for B09 expression by Coomassie staining of SDS-PAGE gels and/or Western blot, and quantified using a scanning densitometer. The results of scanning densitometry are presented below in Table 8:
Пример 10: ПирувилированиеExample 10 Pyruvylation
Представленный пример демонстрирует, что N-концевой цистеиновый остаток нелипидированных белков ORF2086 может стать пирувилированным при экспрессии, например, в Е. coli.The present example demonstrates that the N-terminal cysteine residue of non-lipidated ORF2086 proteins can become pyruvialized when expressed in, for example, E. coli.
Накопление гетерологичного белка во время образования вариантов А05 (SEQ ID NO: 13) и В44 (SEQ ID NO: 21) наблюдали при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращением фаз (RP-HPLC). Это разделение осуществляли во взаимодействии с квадрупольным времяпролетным масс-спектрометром (QTOF-MS) для обеспечения средства наблюдения за образованием связанных с продуктом вариантов.Accumulation of the heterologous protein during the formation of variants A05 (SEQ ID NO: 13) and B44 (SEQ ID NO: 21) was monitored by reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC). This separation was performed in conjunction with a quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF-MS) to provide a means of monitoring the formation of product-related variants.
После экспрессии в Е. coli В и/или клетках-хозяевах K-12 продукты, полученные в результате этих ферментации подвергали процедуре очистки, во время которой наблюдали модификацию продукта. Деконволюция масс-спектров характеризовала варианты как демонстрирующие сдвиги масс +70 Да по сравнению с природными продуктами 27640 и 27572 Да для А05 и В44, соответственно.After expression in E. coli B and/or K-12 host cells, the products resulting from these fermentations were subjected to a purification procedure during which product modification was observed. Deconvolution of the mass spectra characterized the variants as showing +70 Da mass shifts compared to the natural products of 27640 and 27572 Da for A05 and B44, respectively.
В опубликованной литературе указывается, что сдвиг массы +70 Да ранее наблюдался в белках и объяснялся пирувилированием амино-концевого остатка.The published literature indicates that a +70 Da mass shift has previously been observed in proteins and has been attributed to pyruvylation of the amino-terminal residue.
Присутствие и расположение пируватной группы подтверждали с использованием данных масс-спектральной фрагментации (MS/MS). Данные показывали, что модификация происходила на амино-концевом цистеиновом остатке, т.е., аминокислоте в позиции 1 согласно А05 и В44. Для А05 процент пирувилированных полипептидов составлял приблизительно 30% но сравнению с общим количеством полипептидов А05 (SEQ ID NO: 13). Для В44 процент пирувилированных полипептидов составлял приблизительно 25% по сравнению с общим количеством полипептидов В44 (SEQ ID NO: 21).The presence and location of the pyruvate group was confirmed using mass spectral fragmentation (MS/MS) data. The data showed that the modification occurred at the amino-terminal cysteine residue, ie, the amino acid at
Когда А05 (SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делегирован, или SEQ ID NO: 55) и варианты В44 (SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делегирован, или SEQ ID NO: 44), которые не содержат амино-концевого цистеина, очищали, обнаружимого пирувилирования (+70 Да) не наблюдалось.When A05 (SEQ ID NO: 13, in which the N-terminal Cys at
Пример 11: Иммуногенность В09 и В44, отдельно и в комбинации 5-10 групп макаков-резусов подвергали иммунизации вариантом В09 (SEQ ID NO: 49, кодируемая SEQ ID NO: 48) или вариантом В44 (SEQ ID NO: 44, кодируемая SEQ ID NO: 43), или А05, В09 и В44 (SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 49, кодируемая SEQ ID NO: 48 и SEQ ID NO: 44, кодируемая SEQ ID NO: 43, соответственно), рецептированным с 250 мкг А1Р04 на дозу. Обезьян вакцинировали внутримышечным путем на 0, 4 и 8 неделях с использованием 10 мкг каждого из нелипидированных fHBP отдельно или в комбинации, как представлено в Таблице 9 и 10. Образцы сыворотки 0 и 12 недель анализировали в SBA против штаммов MnB с вариантами fHBP подсемейства А или подсемейства В. К респондерам относили животных с 4-кратным повышением титра. Испытанный вариант В44 был оптимизированной последовательностью (SEQ ID NO: 43), и широкие показатели реакции, которые наблюдались в предыдущих исследованиях (см. таблицу выше), поддерживались для оптимизированной последовательности (Таблица 9) вакцины В44 отдельно или в комбинации с В09. Вакцина В09 отдельно (Таблица 10) также может вызывать широкие перекрестные иммунные реакции (Таблица 10).Example 11: Immunogenicity B09 and B44, alone and in combination 5-10 groups of rhesus monkeys were immunized with variant B09 (SEQ ID NO: 49, encoded by SEQ ID NO: 48) or variant B44 (SEQ ID NO: 44, encoded by SEQ ID NO: 43), or A05, B09 and B44 (SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 49, coded by SEQ ID NO: 48 and SEQ ID NO: 44, coded by SEQ ID NO: 43, respectively), formulated with 250 mcg A1P04 per dose. Monkeys were vaccinated intramuscularly at
Макаков-резусов (n=10) подвергали иммунизации внутримышечно на 0, 4 и 8 недели с использованием 10 мкг каждого из нелипидированных fHBP отдельно или в комбинации, как показано в колонке «Вакцина» в композиции с 250 мкг AlPO4. Образцы сыворотки 0 и 10 недель анализировали в SBA относительно штаммов MnB, перечисленных в таблице. К респондерам относили животных с 4-кратным повышением титра.Rhesus monkeys (n=10) were immunized intramuscularly at
Таблица 9 показывает, например, что композиция, включающая комбинацию непирувилированного нелипидированного В44, В09 и А05 демонстрирует большую перекрестную защиту против испытываемых вариантов по сравнению с перекрестной защитой от композиции, включающей только В44. С учетом результатов, показанных в данной заявке, включая, в частности, Таблицу 6 и Таблицу 9 вместе, композиции, включающие В44, В09 и А05, отдельно или в комбинации, представляют предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения. В частности, описываются композиции, включающие В44 и В09. Такая композиция предпочтительно также включает полипептид подсемейства А, в частности, А05.Table 9 shows, for example, that a composition comprising a combination of non-pyruvilated, non-lipidated B44, B09, and A05 exhibited greater cross protection against the test variants compared to a composition comprising B44 alone. In view of the results shown in this application, including, in particular, Table 6 and Table 9 together, compositions comprising B44, B09 and A05, alone or in combination, represent preferred embodiments of the present invention. In particular, compositions are described that include B44 and B09. Such a composition preferably also includes a subfamily A polypeptide, in particular A05.
Макаков-резусов (п=5) подвергали иммунизации внутримышечно на 0, 4 и 8 недели с использованием 10 мкг каждого из нелипидированных fHBP отдельно или в комбинации как показано в колонке «Вакцина» в композиции с 250 мкг AlPO4. Образцы сыворотки 0 и 10 недель анализировали в SBA относительно штаммов MnB, перечисленных в таблице. К респондерам относили животных с 4-кратным повышением титра.Rhesus monkeys (n=5) were immunized intramuscularly at
Пример 12: Иммунологическая защита, обеспечиваемая липидированнымн и нелипидированными вариантами последовательностиExample 12: Immunological protection conferred by lipidated and non-lipidated sequence variants
Двадцать самок новозеландских кроликов-альбиносов, 2,5-3,5 кг, полученных от Charles River Canada, предварительно отбирали с применением цельноклеточного анализа ELISA и 10 животных прошли отбор для этого исследования на основе их низких фоновых титров против испытываемых штаммов, представляющих варианты fHBP В02 (SEQ ID NO: 16) и В44 (SEQ ID NO: 21) (Таблица 11). Группы из трех животных внутримышечно иммунизировали 100 мкг каждого белка, рецептированного с 50 мкг ISCOMATRIX на 0,5 мл дозу на 0, 4 и 9 недели (Таблица 12). Группу 1 вакцинировали нелипидированным В44 (SEQ ID NO: 44). Включали контрольную группу, которую вакцинировали липидированным В01, рецептированным с AlPO4 (250 мкг). Кроликов подвергали кровопусканию на 0, 4, 9 и 10 неделях. Отдельные образцы сыворотки 10-й недели подготавливали и анализировали с применением сывороточного бактерицидного анализа против многих штаммов менингококков серогруппы В из fHBP подсемейства В.Twenty female New Zealand albino rabbits, 2.5-3.5 kg, obtained from Charles River Canada, were preselected using whole cell ELISA and 10 animals were selected for this study based on their low background titers against test strains representing fHBP variants. B02 (SEQ ID NO: 16) and B44 (SEQ ID NO: 21) (Table 11). Groups of three animals were intramuscularly immunized with 100 μg of each protein formulated with 50 μg of ISCOMATRIX per 0.5 ml dose at
Протокол иммунизации: недели 0, 4, 9; протокол кровопускания: недели 0, 4, 9, 10 Сывороточный бактерицидный анализ (SBA): Сывороточный бактерицидный анализ (SBA) на основе микроколоний против многих штаммов менингококков серогруппы В (Таблица 13) проводили на отдельных образцах сыворотки. Человеческую сыворотку от доноров брали как источник комплемента для штамма, испытываемого при анализе. Опосредованные комплементом антителозависимые бактерицидные титры интерполировались и выражались как обратные показатели разбавления испытываемой сыворотки, убивающей 50% менингококковых клеток в пробе. Пределом обнаружения анализа был титр SBA 4. Титр SBA <4 получал номер 2. Рассчитывали и сравнивали повышение титров SBAA ≥4 раза в 10-недельных образцах сыворотки по сравнению с титрами до иммунизации.Immunization protocol:
Активность бактериального антитела в сыворотке, измеряемая в SBA представляет иммунологический имитатор защиты от менингококковой болезни. Способность иммунизации нелипидированным rfHBP к вызыванию выработки бактерицидных антител у кроликов определяли по SBA. SBA измеряет уровень антител в образцах сыворотки путем имитации опосредованного комплементом бактериального лизиса, который происходит естественным путем. Образцы сыворотки кроликов, собранные на 10-й неделе, анализировали с использованием SBA против штаммов с В44 fHBP или В02 fHBP. Как показано в Таблице 13, через неделю после третьей иммунизации (10-я неделя все образцы сыворотки демонстрировали бактерицидную активность против обоих испытываемых штаммов. (Таблица 13). У новозеландских кроликов нелипидированный В44 (SEQ ID NO: 44) был более иммуногенным, чем нелипидированный В01 против этих штаммов. Нелипидированный В44 (SEQ ID NO: 44), рецептированный с адъювантом iscomatrix, против этих штаммов давал титры, сравнимые с показателями липидированного В01, рецептированного с фосфатом алюминия. Образцы сыворотки кролика до иммунизации, как правило, не демонстрировали ранее существовавшей бактерицидной активности против испытываемых штаммов.Serum bacterial antibody activity as measured by SBA represents an immunological mimic of protection against meningococcal disease. The ability of immunization with non-lipidated rfHBP to induce bactericidal antibodies in rabbits was determined by SBA. SBA measures antibody levels in serum samples by mimicking complement-mediated bacterial lysis that occurs naturally. Serum samples from rabbits collected at week 10 were analyzed using SBA against strains with B44 fHBP or B02 fHBP. As shown in Table 13, one week after the third immunization (week 10), all serum samples showed bactericidal activity against both test strains. (Table 13). In New Zealand rabbits, non-lipidated B44 (SEQ ID NO: 44) was more immunogenic than non-lipidated B01 against these strains Non-lipidated B44 (SEQ ID NO: 44) formulated with iscomatrix adjuvant produced titres against these strains comparable to those of lipidated B01 formulated with aluminum phosphate Rabbit serum samples prior to immunization generally showed no pre-existing bactericidal activity against the tested strains.
Пример 13: Иммуногенность шести пелипидированных фактор Н-связывающих белков у новозеландских кроликов-альбиносов.Example 13: Immunogenicity of six pelipidated factor H-binding proteins in New Zealand albino rabbits.
Группы из 5 кроликов подвергали иммунизации нелипидированными вариантами fHBP, как описано в Таблице 14. Вакцины вводили на 0, 4 и 9 неделях. Образцы сыворотки кроликов, собранные на 0 и 10 неделях, подвергали анализу с использованием SBA против штаммов с гомологичными и гетерологичными последовательностями fHBP. Таблица 14 показывает процент респондеров после третьей иммунизации. Через неделю после третьей иммунизации (10-я неделя) все образцы сыворотки демонстрировали бактерицидную активность против гомологичных штаммов, а также других испытываемых штаммов того же подсемейства fHBP. Образцы сыворотки кроликов до иммунизации, как правило, не демонстрировали ранее существовавшей бактерицидной активности против испытываемых штаммов.Groups of 5 rabbits were immunized with non-lipidated fHBP variants as described in Table 14. Vaccines were administered at 0, 4 and 9 weeks. Serum samples from rabbits collected at weeks 0 and 10 were analyzed using SBA against strains with homologous and heterologous fHBP sequences. Table 14 shows the percentage of responders after the third immunization. One week after the third immunization (week 10), all serum samples showed bactericidal activity against homologous strains as well as other tested strains of the same fHBP subfamily. Serum samples from rabbits prior to immunization generally did not show pre-existing bactericidal activity against the strains tested.
Используемые белки MnB fHBPMnB fHBP proteins used
Испытываемые варианты в Таблице 14:Variants tested in Table 14:
Пример 14:Example 14:
> нелипидированный А05 (SEQ ID NO: 55)> non-lipidated A05 (SEQ ID NO: 55)
> pEB042 (SEQ ID NO: 65)> pEB042 (SEQ ID NO: 65)
> нелипидированный All (SEQ ID NO: 66)> non-lipidized All (SEQ ID NO: 66)
> pEB043 (SEQ ID NO: 67)> pEB043 (SEQ ID NO: 67)
> нелипидированный А22 (SEQ ID NO: 68)> non-lipidated A22 (SEQ ID NO: 68)
> pEB058 (SEQ ID NO: 69)> pEB058 (SEQ ID NO: 69)
> A62 (SEQ ID NO: 70). GenBank: ACI46789.1> A62 (SEQ ID NO: 70). GenBank: ACI46789.1
> нелипидированный А62 (SEQ ID NO: 71)> non-lipidated A62 (SEQ ID NO: 71)
> pLA164 (SEQ ID NO: 72)> pLA164 (SEQ ID NO: 72)
> pDK086 (SEQ ID NO: 73)> pDK086 (SEQ ID NO: 73)
> A29 (SEQ ID NO: 74)> A29 (SEQ ID NO: 74)
> нелипидированный В22 (SEQ ID NO: 75)> non-lipidated B22 (SEQ ID NO: 75)
> нелипидированный А05 (SEQ ID NO: 76) (pPW102)> non-lipidated A05 (SEQ ID NO: 76) (pPW102)
> нелипидированный А05 (SEQ ID NO: 77)> non-lipidated A05 (SEQ ID NO: 77)
Жонсенсус (SEQ ID NO: 78)Jonsensus (SEQ ID NO: 78)
> Консенсус (SEQ ID NO: 79)> Consensus (SEQ ID NO: 79)
Пример 15: Образование нелипидированных вариантов подсемейства А r0zP2086Example 15 Generation of non-lipidated r0zP2086 subfamily A variants
Клонирование нелипидированных генов fHBPCloning of non-lipidated fHBP genes
Кодирующую последовательность нелипидированного белка А05 fHBP (SEQ ID NO: 55) сопоставляли с последовательностью В44 с оптимизированной экспрессией (SEQ ID NO: 43). В местах, где их аминокислоты были идентичными, кодон из В44 (SEQ ID NO: 43) использовали для замещения в гене А05. Оптимизированную последовательность синтезировали заново в Celtek Genes, добавляя сайты рестрикционной эндонуклеазы NdeI и BamHI на N- и С-концах, соответственно. Полученный в результате ген (SEQ ID NO: 65) субклонировали в pET30a в этих сайтах.The coding sequence for the non-lipidated fHBP A05 protein (SEQ ID NO: 55) was aligned with the expression optimized B44 sequence (SEQ ID NO: 43). Where their amino acids were identical, a codon from B44 (SEQ ID NO: 43) was used for substitution in the A05 gene. The optimized sequence was resynthesized in Celtek Genes by adding NdeI and BamHI restriction endonuclease sites at the N- and C-terminus, respectively. The resulting gene (SEQ ID NO: 65) was subcloned into pET30a at these sites.
Рекомбинантный нелипидированный А12 fHBP (SEQ ID NO: 66) экспрессировали из рЕВ043 (SEQ ID NO: 67). Экспрессию аллеля А12 оптимизировали с применением технологий Blue Heron. Этот ген был оптимизирован с применением такого же процесса, как для А05 (рЕВ042). Кроме того, оптимизированные с применением Blue Heron амино-концевые кодоны В44 SGGGGSGGGG (аминокислотные остатки с 2 по 11 SEQ ID NO: 44) заменяли природные кодоны А12 SSGGGG (аминокислотные остатки с 1 по 6 SEQ ID NO: 66). Оптимизированную последовательность синтезировали заново в Celtek Genes, добавляя сайты рестрикционной эндонуклеазы NdeI и BamHI на N- и С-концах, соответственно. Полученный в результате ген (SEQ ID NO: 67) субклонировали в pET30a в этих сайтах.Recombinant non-lipidated A12 fHBP (SEQ ID NO: 66) was expressed from pEB043 (SEQ ID NO: 67). Expression of the A12 allele was optimized using Blue Heron technologies. This gene was optimized using the same process as for A05 (pEB042). In addition, Blue Heron-optimized B44 SGGGGSGGGG amino-terminal codons (
Рекомбинантный нелипидированный А22 fHBP (SEQ ID NO: 68) экспрессировали из рЕВ058 (SEQ ID NO: 69). Этот ген был оптимизирован с применением такого же процесса, как для рЕВ042. Кроме того, оптимизированные с применением Blue Heron амино-концевые кодоны В44 SGGGG (аминокислотные остатки с 2 по 6 SEQ ID NO: 44) заменяли природные кодоны А22 SSGGGG (аминокислотные остатки с 1 по 6 SEQ ID NO: 68). Оптимизированную последовательность синтезировали заново в Celtek Genes, добавляя сайты рестрикционной эндонуклеазы Ndel и BamHI на N- и С-концах, соответственно. Полученный в результате ген (SEQ ID NO: 69) субклонировали в pET30a в этих сайтах.Recombinant non-lipidated A22 fHBP (SEQ ID NO: 68) was expressed from pEB058 (SEQ ID NO: 69). This gene was optimized using the same process as for pEB042. In addition, Blue Heron-optimized B44 SGGGG amino-terminal codons (
Рекомбинантный А62 fHBP (SEQ ID NO: 71) экспрессировали из pLA164 (SEQ ID NO: 72). Аллель А62_002 из штамма 0167/03 подвергали ПЦР-амплификации с праймерами, содержащими сайты рестрикционной эндонуклеазы NdeI и BamHI на N- и С-концах, соответственно. Полученный в результате ген (SEQ ID NO: 72) субклонировали в pET30a в этих сайтах.Recombinant A62 fHBP (SEQ ID NO: 71) was expressed from pLA164 (SEQ ID NO: 72). The A62_002 allele from strain 0167/03 was subjected to PCR amplification with primers containing NdeI and BamHI restriction endonuclease sites at the N- and C-termini, respectively. The resulting gene (SEQ ID NO: 72) was subcloned into pET30a at these sites.
Пример 16: Экспрессия, ферментация и очистка белков rP2086 подсемейства А экспрессионных штаммов Е. coliExample 16 Expression, Fermentation and Purification of rP2086 Subfamily A Proteins of E. coli Expression Strains
BLR(DE3) Е. coli В recA-, трансформированный с использованием pLA164 (SEQ ID NO: 72), использовали для экспрессии А62 (SEQ ID NO: 71). Плазмиду рЕВ042 (SEQ ID NO: 65) преобразовывали в BD643 хозяина Е. coli (W3110:DE3 ΔrecA ΔfhuA ΔaraA) для получения штамма BD660 для экспрессии А05 (SEQ ID NO: 55). Экспрессию А22 (SEQ ID NO: 68) осуществляли из штамма BD592, который состоит из плазмиды рЕВ058 (SEQ ID NO: 69), находящейся в BD559 хозяина (который также представляет W3110:DE3 ΔrecA ΔfhuA ΔaraA). И наконец, плазмиду рЕВ043 (SEQ ID NO: 67) преобразовывали в BD483 хозяина (W3110:DE3 ΔrecA) для получения штамма BD540 для экспрессии А12 (SEQ ID NO: 66).E. coli BLR(DE3) B recA- transformed with pLA164 (SEQ ID NO: 72) was used to express A62 (SEQ ID NO: 71). Plasmid pEB042 (SEQ ID NO: 65) was converted into E. coli host BD643 (W3110:DE3 ΔrecA ΔfhuA ΔaraA) to obtain a BD660 strain for A05 expression (SEQ ID NO: 55). Expression of A22 (SEQ ID NO: 68) was performed from strain BD592, which consists of plasmid pEB058 (SEQ ID NO: 69) found in host BD559 (which also represents W3110:DE3 ΔrecA ΔfhuA ΔaraA). Finally, plasmid pEB043 (SEQ ID NO: 67) was converted into host BD483 (W3110:DE3 ΔrecA) to obtain a BD540 strain for A12 expression (SEQ ID NO: 66).
ФерментацияFermentation
Экспрессионные штаммы ферментировали в минимальной среде на основе глюкозы. Суточную заквасочную культуру инокулировали в десятилитровые ферментаторы, работающие при 37°С, аэрация 1 vvm с контролем каскада d0 при 20%. Когда порция глюкозы исчерпывалась из среды (при ~ OD600=15), начинали ограничивающую линейную подачу глюкозы при 3,8 г/л/ч. Подачу продолжали до индукции 0,1 мМ IPTG и в течение последующего периода экспрессии белка. Для экспрессии А05 (SEQ ID NO: 55), штамм BD660 индуцировали при OD600=25 и ферментацию продолжали в течение 7 часов после индукции (HPI). Экспрессии А22 (SEQ ID NO: 68) и А12 (SEQ ID NO: 66) из штаммов BD592 и BD540, соответственно, достигали путем индукции при OD600=40 и ферментации в течение 24 HPI. В конце ферментации суспензию клеток собирали путем центрифугирования.The expression strains were fermented in a minimal glucose-based medium. The daily starter culture was inoculated into ten liter fermenters operating at 37° C.,
А62 (SEQ ID NO: 71)A62 (SEQ ID NO: 71)
Белки rP2086 получают как растворимые белки в цитоплазме штаммов Е. coli. Растворимый цитоплазматический экстракт обычно получают путем размораживания замороженных клеток, экспрессирующих конкретный вариант подсемейства А rP2086 в гипотоническом буфере (10 мМ Hepes-NaOH pH 7,4 с содержанием ингибиторов протеазы) и разрушения клеток в микрофлюидизаторе при ~ 20000 psi. РНКазу и ДНКазу добавляют для разложения нуклеиновых кислот и цитоплазматический экстракт собирают в виде супернатанта после центрифугирования с низкой скоростью для удаления любых неразрушенных клеток, а затем з высокой скоростью (≥ 100000 xg) для удаления мембран, стенок клеток и других крупных субклеточных компонентов. Цитоплазматический экстракт подвергают дальнейшему осветлению путем последовательного регулирования до 25%, а затем 50% насыщенного сульфата аммония и удаления осажденного материала после каждого регулирования путем центрифугирования на низкой скорости. Низкомолекулярные ионные компоненты клеток затем удаляют путем адсорбирования rP2086 в 50% насыщенном сульфате аммония в буфере из 10 мМ Hepes-NaOH, pH 7,4, 1 мМ Na2EDTA на колонку гидрофобного взаимодействия (фенилсефарозу приобретали у GE Healthcare) с последующим элюированием rP2086 путем линейного снижения концентрации сульфата аммония до 0% с использованием буфера 10 мМ Hepes-NaOH, pH 7,4, 1 мМ Na2EDTA. Большинство отрицательно заряженных белков затем удаляют путем регулирования содержащих rP2086 фракций до буфера прогона 10 мМ Tris-HCl, pH 8.6, 1 мМ Na2EDTA объединенных фракций через анионообменную колонку (ТМАЕ приобретали у EMD), уравновешенную тем же буфером. Затем rP2086 подвергают дальнейшей очистке путем хроматографии на керамическом гидроксиапатите (от BioRad) путем обмена буфера, содержащего rP2086, на 10 мМ Hepes-NaOH, pH 7,4, содержащего 1 мМ фосфата натрия, адсорбирующего белок в керамический гидроксиапатит, с дальнейшим элюированием с линейным градиентом фосфата натрия до 250 мМ при pH 7,4. Вышеперечисленные отдельные операции часто бывают достаточными для получения достаточного выхода представителей rP2086 подсемейства А. Однако, поскольку уровень экспрессии может колебаться в 10-кратных пределах при экспрессии rP2086 на нижнем конце диапазона или в случае необходимости в высокоочищенном rP2086 (при высокой концентрации для структурного определения ЯМР), добавляют следующие дополнительные отдельные операции: хроматофокусирование с последующей хроматографией на керамическом гидроксиапатите. Буфер, содержащий белок rP2086 с предыдущего гидроксиапатитного этапа меняют на 25 мМ Tris-ацетат, pH 8,3, и белок адсорбируют на колонку для хроматофокусирования РВЕ94 (от GE Healthcare), уравновешенную тем же буфером, а затем элюируют буфером полибуфер 94-ацетатом, pH 6. Белки rP2086 элюируются при ~pI, и фракции, содержащие белок, объединяют. Буфер содержащих rP2086 фракций затем меняют на 10 мМ Hepes-NaOH, pH 7,4, содержащий 1 мМ фосфата натрия, и адсорбируют и элюируют, как указано выше. Представители rP2086 подсемейства А, полученные с применением этого процесса, как правило, на >95% гомогенны согласно SDS-PAGE-анализу, чаще всего - на >99% гомогенны.The rP2086 proteins are obtained as soluble proteins in the cytoplasm of E. coli strains. A soluble cytoplasmic extract is typically prepared by thawing frozen cells expressing a specific rP2086 subfamily A variant in hypotonic buffer (10 mM Hepes-NaOH pH 7.4 containing protease inhibitors) and disrupting the cells in a microfluidizer at ~20,000 psi. RNase and DNase are added to degrade nucleic acids and the cytoplasmic extract is collected as supernatant after centrifugation at low speed to remove any intact cells and then at high speed (≥ 100,000 xg) to remove membranes, cell walls and other large subcellular components. The cytoplasmic extract is subjected to further clarification by successively adjusting to 25% and then 50% saturated ammonium sulfate and removing the precipitated material after each adjustment by low speed centrifugation. The low molecular weight ionic components of the cells are then removed by adsorbing rP2086 in 50% saturated ammonium sulfate in 10 mM Hepes-NaOH, pH 7.4, 1 mM Na 2 EDTA buffer on a hydrophobic interaction column (phenylsepharose purchased from GE Healthcare) followed by eluting rP2086 by linear decrease in the concentration of ammonium sulfate to 0% using buffer 10 mm Hepes-NaOH, pH 7.4, 1 mm Na 2 EDTA. Most of the negatively charged proteins are then removed by adjusting the rP2086 containing fractions to run buffer 10 mM Tris-HCl, pH 8.6, 1 mM Na 2 EDTA pooled fractions through an anion exchange column (TMAE purchased from EMD) equilibrated with the same buffer. rP2086 was then further purified by ceramic hydroxyapatite chromatography (from BioRad) by exchanging buffer containing rP2086 with 10 mM Hepes-NaOH, pH 7.4 containing 1 mM sodium phosphate adsorbing the protein into ceramic hydroxyapatite, followed by linear elution. sodium phosphate gradient up to 250 mM at pH 7.4. The above single operations are often sufficient to obtain a sufficient yield of the rP2086 subfamily A. However, since the expression level can fluctuate up to 10-fold when rP2086 is expressed at the lower end of the range, or if highly purified rP2086 is needed (at high concentration for structural NMR determination) , add the following additional separate operations: chromatofocusing followed by chromatography on ceramic hydroxyapatite. The buffer containing the rP2086 protein from the previous hydroxyapatite step was changed to 25 mM Tris-acetate, pH 8.3, and the protein was adsorbed onto a PBE94 chromatofocusing column (from GE Healthcare) equilibrated with the same buffer, and then eluted with buffer polybuffer 94-acetate,
А05, А12 и А22 (SEQ ID NO: 55, 66 и 68, соответственно)A05, A12 and A22 (SEQ ID NOs: 55, 66 and 68, respectively)
В конце ферментации суспензию клеток восстанавливают путем непрерывного центрифугирования и ресуспендируют до ~1/4 первоначального объема ферментации в 20 мМ Tris, 5 мМ EDTA, pH 6,0. Лизиса суспензии клеток достигают путем гомогенизации под высоким давлением (2 прогона, 4000-9000 psi). К гомогенату добавляют DADMAC до конечной концентрации 0,5%. Раствор перемешивают при 15-25°C в течение 60 минут, на протяжении которых образуется тяжелый осадок. Раствор осветляют путем непрерывного центрифугирования. Белки (А05, А12 и А22) очищают с применением двух этапов хроматографии с последующей окончательной заменой буфера. Уровень рН фугата регулируют до 5,5 и фугат подают на колонку GigaCap-S (CEX). Белок связывают со смолой, а затем элюируют с применением градиента хлорида натрия. К пулу с колонки CEX добавляют цитрат натрия до конечной концентрации 1,5 М и раствор подают на колонку Phenyl-650M (HIC). Белок связывают со смолой, а затем элюируют с применением ступенчатого градиента цитрата натрия. Пул HIC, содержащий очищенный белок, меняют на буфер готового лекарственного вещества путем диафильтрации. Применяют ультрафильтрационную кассету 5 кДа регенерированного ацетата целлюлозы. Заданная концентрация белка составляет 1,5-2,0 мг/мл. Диафильтрованный ретентат фильтруют через фильтр 0,2 микрона перед помещением в бутылки для хранения. Лекарственное вещество хранят при -70°C.At the end of the fermentation, the cell suspension is reconstituted by continuous centrifugation and resuspended to ~1/4 of the original fermentation volume in 20 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 6.0. Lysis of the cell suspension is achieved by high pressure homogenization (2 runs, 4000-9000 psi). DADMAC is added to the homogenate to a final concentration of 0.5%. The solution is stirred at 15-25° C. for 60 minutes during which a heavy precipitate forms. The solution is clarified by continuous centrifugation. Proteins (A05, A12 and A22) are purified using two chromatography steps followed by a final buffer exchange. The pH of the centrate is adjusted to 5.5 and the centrate is applied to a GigaCap-S (CEX) column. The protein is bound to the resin and then eluted using a sodium chloride gradient. Sodium citrate was added to the CEX column pool to a final concentration of 1.5 M and the solution was applied to a Phenyl-650M (HIC) column. The protein is bound to the resin and then eluted using a sodium citrate step gradient. The HIC pool containing the purified protein is exchanged for the finished drug buffer by diafiltration. A 5 kDa regenerated cellulose acetate ultrafiltration cassette is used. The target protein concentration is 1.5-2.0 mg/ml. The diafiltered retentate is filtered through a 0.2 micron filter before being bottled for storage. The medicinal substance is stored at -70°C.
Пример 17: Сывороточный бактерицидный анализExample 17: Serum bactericidal assay
Титры функционального антитела исследовали с применением сывороточного бактерицидного анализа (SBA) против штаммов Neisseria meningitidis дикого типа или подвергнутых инженерии серогруппы В, экспрессирующих fHBP, с последовательностями, гомологичными или гетерологичными содержащимся в вакцине. Бактерицидные антитела сыворотки у кроликов, иммунизированных вакцинами rP2086, определяли, используя SBA с комплементом человека. Иммунные сыворотки кроликов подвергали термоинактивации для устранения внутренней активности комплемента и последовательно подвергали серии разведении 1:2 в PBS Дульбекко с Са2+ и Mg2+ (D-PBS) в 96-луночном микротитровальном планшете для испытания бактерицидной активности сыворотки против штаммов N. meningitidis. Для комбинированных исследований подвергнутых инженерии штаммов соответствующие сыворотки смешивали в соотношении 1:1 перед описанными выше последовательными разведениями, таким образом, что эффективная концентрация каждого компонент составляла половину от той, которая была при испытании каждого в отдельности. Бактерии, используемые для анализа, выращивали в среде GC, дополненной добавкой Келлогга (GCK), и наблюдали по оптической плотности при 650 нм. Бактерии собирали для использования в анализе при конечном показателе оптической плотности OD650 0,50-0,55, разводили в D-PBS и к аналитической смеси добавляли 1000-3000 КОЕ. Сыворотку человека без обнаружимой бактерицидной активности использовали в качестве экзогенного источника комплемента. Источники комплементов испытывали на пригодность относительно каждого отдельного испытываемого штамма. Для изогенных штаммов одну сыворотку человека определяли и отбирали для SBA против всех изогенных штаммов. Источник комплемента использовали лишь в том случае, если количество бактерий, выживших в контрольных образцах без добавления иммунных сывороток, составляло >75%. После 30 минут инкубации при 37°C с 5% CO2 и перемешивания при 700 об/мин на вибростенде к реакционной смеси добавляли D-PBS и аликвоты переносили на микрофильтровальные планшеты, предварительно заполненные 50% среды GCK для штаммов дикого типа и 100% среды GCK для подвергнутых инженерии штаммов. Микрофильтровальные планшеты подвергали фильтрации, инкубировали в течение суток при 37°C с 5% CO2 и микроколонии окрашивали и подсчитывали. Бактерицидные титры сыворотки определяли как интерполированное обратное разбавление сыворотки, которое приводило к 50% снижению КОЕ по сравнению с КОЕ в контрольных лунках без иммунных сывороток. Склонность к цитолизу под действием иммунных сывороток против rP2086 устанавливали при наличии 4-кратного или более повышения титра SBA для иммунных сывороток против rP2086 по сравнению с соответствующим неиммунные сыворотки. Сыворотки, которые были отрицательными по отношению к анализируемому штамму в начальном разведении, относили к титру, соответствующему половине предела обнаружения для пробы.Functional antibody titers were assayed using a serum bactericidal assay (SBA) against wild-type or engineered serogroup B strains of Neisseria meningitidis expressing fHBP with sequences homologous or heterologous to those contained in the vaccine. Serum bactericidal antibodies in rabbits immunized with rP2086 vaccines were determined using SBA with human complement. Rabbit immune sera were thermally inactivated to eliminate intrinsic complement activity and serially subjected to a 1:2 dilution series in Dulbecco's PBS with Ca2+ and Mg2+ (D-PBS) in a 96-well microtiter plate to test the bactericidal activity of the sera against N. meningitidis strains. For combined studies of engineered strains, the respective sera were mixed in a 1:1 ratio before the serial dilutions described above, so that the effective concentration of each component was half that of each tested separately. The bacteria used for analysis were grown in GC medium supplemented with Kellogg's (GCK) and observed by optical density at 650 nm. Bacteria were harvested for use in the assay at a final OD 650 of 0.50-0.55, diluted in D-PBS, and 1000-3000 CFU were added to the assay mixture. Human serum without detectable bactericidal activity was used as an exogenous source of complement. Complement sources were tested for suitability with respect to each individual strain tested. For isogenic strains, one human serum was determined and selected for SBA against all isogenic strains. A complement source was used only if the number of bacteria surviving in control samples without the addition of immune sera was >75%. After 30 minutes incubation at 37° C. with 5% CO 2 and shaking at 700 rpm on a shaker, D-PBS was added to the reaction mixture and aliquots were transferred to microfilter plates prefilled with 50% GCK medium for wild type strains and 100% medium GCK for engineered strains. Microfilter plates were subjected to filtration, incubated for a day at 37°C with 5% CO 2 and microcolonies were stained and counted. Serum bactericidal titers were defined as the interpolated back dilution of serum that resulted in a 50% reduction in cfu compared to cfu in control wells without immune sera. The propensity for cytolysis by anti-rP2086 immune sera was determined by the presence of a 4-fold or more increase in SBA titer for anti-rP2086 immune sera compared to the corresponding non-immune sera. Sera that were negative with respect to the analyzed strain at the initial dilution were referred to a titer corresponding to half the detection limit for the sample.
Пример 18: Иммуногенность нелипидированных вариантов белков rP2086 подсемейства АExample 18: Immunogenicity of non-lipidated variants of rP2086 subfamily A proteins
Самок новозеландского кролика-альбиноса (2,5-3,5 кг), полученных от Charles River (Канада), использовали в двух исследованиях. Для первого исследования группы из 3 кроликов подвергали иммунизации с использованием 30 мкг или 3 мкг каждой из композиций fHBP липидированного А05 или нелипидированного А05. Для второго исследования пять кроликов / группу внутримышечно иммунизировали в правую заднюю конечность вариантами rP2086A в количестве 20 мкг/мл с добавлением 500 мкг/мл А1Р04 (0,5 мл/дозу/два места). Животных вакцинировали на 0, 4 и 9 неделях, подвергали кровопусканию на 0 и 6 неделях и обескровливали на 10-й неделе. Титры специфического к LP2086 бактериального антитела определяли на 0, 6 и 10-й неделях.Female albino New Zealand rabbits (2.5-3.5 kg) obtained from Charles River (Canada) were used in two studies. For the first study, groups of 3 rabbits were immunized with 30 μg or 3 μg of each of the lipidated A05 or non-lipidated A05 fHBP formulations. For the second study, five rabbits/group were intramuscularly immunized in the right hind limb with rP2086A variants at 20 μg/ml supplemented with 500 μg/ml A1PO4 (0.5 ml/dose/two places). Animals were vaccinated at 0, 4 and 9 weeks, bled at 0 and 6 weeks, and bled at 10 weeks. The titers of LP2086-specific bacterial antibody were determined at 0, 6 and 10 weeks.
Цель этих исследований состояла в моделировании сниженной реакции, которую наблюдали в иммунологически интактных популяциях, например, у новорожденных. Сначала сравнивали низкую и высокую дозу (30 vs 3 мкг каждого антигена на дозу) вакцин, содержащих липидированный А05 (SEQ ID NO: 13) или нелипидированный А05 (SEQ ID NO: 55) (Таблицы 15А и 15В). Низкие дозы применяли таким образом, чтобы были различимы отличия в скорости реакции между вакцинами. Анализ SBA проводили с использованием двух наборов штаммов. Первый набор состоял из штаммов дикого типа, вызывающих инвазивную болезнь. Второй набор представлял подвергнутый генной инженерии штамм с тем же фоном и отличающийся только последовательностью fHBP, которая экспресировалась следующим образом: штамм N. meningitidis PMB3556, экспрессирующий вариант В24 fHBP, подвергали инженерии, таким образом, чтобы его эндогенный ген fhbp был заменен на гены, кодирующие другие варианты fHBP. Последовательности строили таким образом, чтобы "включен" был только участок, кодирующий ORF, а окружающий генетический фон оставался интактным. Таким образом, анализ SBA с использованием этого набора позволял оценить реакционную способность против различных белков fHBP подсемейства А, экспрессируемых на одинаковом уровне и с одинаковым генетическим фоном, с использованием одного источника человеческого комплемента. Все штаммы имели уровень экспрессии fHBP выше порога, определяемого согласно публикации Jiang et al (2010). Как показано в Таблицах 15А и 15В, и высокие, и низкие дозы липидированной А05-содержащей вакцины обеспечивали широкую защиту по разным генетически различным вариантам подсемейства А, в то время, как сниженная реакция наблюдалась при обеих дозах для вакцины, содержащей нелипидированный вариант А05. Таким образом, это непосредственное сравнение обнаружило, что, хотя нелипидированный вариант А05 обеспечивает перекрестную защиту по экспрессирующим подсемейство А штаммам, он не является настолько иммуногенным, как липидированный вариант, который с большей вероятностью образует естественную конфигурацию (Таблицы 15А и 15В).The aim of these studies was to model the reduced response that has been observed in immunologically intact populations such as neonates. First, the low and high dose (30
Для следующего исследования уровень дозы повышали до 10 мкг для каждого нелипидированного варианта подсемейства А для оценки потенциала каждого в обеспечении широкой защиты против штаммов подсемейства А. Анализ SBA обнаружил, что все эти повышенные дозы сывороток кроликов, иммунизированных нелипидированными вариантами fHBP А05 (SEQ ID NO: 55), А62 (SEQ ID NO: 71), A12 (SEQ ID NO: 66) и А22 (SEQ ID NO: 68) индуцировали титры к штаммам дикого типа, экспрессирующим гомологичные и гетерологичные варианты подсемейства А, указывая, что все обеспечивали перекрестную защиту при этой низкой дозе в пределах подсемейства А. Таким образом, наблюдали, что вакцина N2C1 (А05) может генерировать антитела, способные убивать вариантные штаммы N1C2 (А22) и N2C2 (A12) и, подобным образом, вакцины из этих других групп могут убивать штаммы с противоположными вариантами. В этих условиях наблюдалось, что варианты А05 и А62 обеспечивали наивысшие показатели SBA-респондеров по штаммам (Таблица 16). Соответственно, демонстрируется защитный эффект по этим вариантам.For the next study, the dose level was increased to 10 μg for each non-lipidated subfamily A variant to evaluate the potential of each to provide broad protection against subfamily A strains. SBA analysis found that all of these elevated doses were from rabbit sera immunized with non-lipidated fHBP A05 variants (SEQ ID NO: 55), A62 (SEQ ID NO: 71), A12 (SEQ ID NO: 66), and A22 (SEQ ID NO: 68) induced titers against wild-type strains expressing homologous and heterologous subfamily A variants, indicating that all provided crossover protection at this low dose within the A subfamily. Thus, it has been observed that the N2C1 (A05) vaccine can generate antibodies capable of killing the N1C2 (A22) and N2C2 (A12) variant strains and, similarly, vaccines from these other groups can kill strains with opposite variants. Under these conditions, variants A05 and A62 were observed to provide the highest rates of SBA responders by strain (Table 16). Accordingly, the protective effect of these variants is demonstrated.
Таблицы 15А и 15В. Средние геометрические значения титров SBA против штаммов N. meningitidis группы В сывороток, взятых до и после (PD3 = 10 недель) иммунизации кроликов (n=3) с 30 или 3 мкг вакцин, содержащих липидированный или нелипидированный А05. Верхние строки (обозначение "штаммы дикого типа") Таблиц 15А и 15В представляют активность против клинических изолятов. Нижние строки (обозначение "изогенные штаммы") Таблиц 15А и 15В представляют активность против набора изогенных штаммов, которые были подвергнуты инженерии на основе исходного штамма N. meningitidis (PMB3556), таким образом, чтобы весь ORF его эндогенного fHBP был заменен на варианты А05 (SEQ ID NO: 13), А22 (SEQ ID NO: 15), A29 (SEQ ID NO: 74) или А12 (SEQ ID NO: 14).Tables 15A and 15B. Geometric mean titers of SBA against strains of N. meningitidis group B of sera taken before and after (PD3 = 10 weeks) immunization of rabbits (n=3) with 30 or 3 µg of vaccines containing lipidated or non-lipidated A05. The top rows (designation "wild-type strains") of Tables 15A and 15B represent activity against clinical isolates. The bottom rows (labeled "isogenous strains") of Tables 15A and 15B represent the activity against a set of isogenic strains that were engineered from the original N. meningitidis strain (PMB3556) such that the entire ORF of its endogenous fHBP was replaced by A05 variants ( SEQ ID NO: 13), A22 (SEQ ID NO: 15), A29 (SEQ ID NO: 74) or A12 (SEQ ID NO: 14).
Таблица 16. Процент респондеров, демонстрирующих по меньшей мере 4-кратное повышение уровня SBA GMT относительно фона, из образцов 10-недельной сыворотки, взятой у кроликов, иммунизированных 10 мкг нелипидированных вариантов fHBP подсемейства А против штаммов, экспрессирующих варианты fHBP A05, А62, А 12 или А22.Table 16. Percentage of responders showing at least a 4-fold increase in SBA GMT from baseline from 10-week-old sera from rabbits immunized with 10 µg of non-lipidated subfamily A fHBP variants against strains expressing fHBP variants A05, A62, A 12 or A22.
Перекрестная защита также наблюдалась для всех вариантов при применении набора изогенных штаммов, как описано выше, в повышенной дозе 10 мкг, с образцами сыворотки кроликов, иммунизированных вариантом А62 (SEQ ID NO: 71), демонстрирующими наибольшую перекрестную реактивность, с последующим применением антисывороток A05 (Таблица 17). Кроме того, образцы сыворотки кроликов, иммунизированных вариантом А62 (SEQ ID NO: 71) демонстрировали способность к реакции как с исходным штаммом РМВ3556, так и с переключенным штаммом В09 (Таблица 18), что указывало на то, что перекрестная реактивность распространяется на белки подсемейства В. Оказалось, что А62 состоит из доменов подсемейства А (А22) и подсемейства В (В09) (Фигура 9).Cross-protection was also observed for all variants when using the set of isogenic strains as described above at an increased dose of 10 μg, with sera from rabbits immunized with variant A62 (SEQ ID NO: 71) showing the greatest cross-reactivity, followed by application of A05 antisera ( Table 17). In addition, sera samples from rabbits immunized with variant A62 (SEQ ID NO: 71) showed reactivity with both the original strain PMB3556 and the switch strain B09 (Table 18), indicating that cross-reactivity extends to subfamily proteins B. It turned out that A62 consists of subfamily A (A22) and subfamily B (B09) domains (Figure 9).
Таблица 17. Изогенные "переключенные" штаммы подвергали инженерии на основе исходного штамма N. meningitidis (РМВ3556), таким образом, чтобы весь ORF его эндогенного fHBP (вариант В24) был заменен на варианты A05 (SEQ ID NO: 13), A22 (SEQ ID NO: 15), A29 (SEQ ID NO: 74) или А12 (SEQ ID NO: 14). KA3011 является отрицательным контрольным штаммом (т.е., исходным РМВ3556, ген fhbp которого был делегирован). Среднегеометрические титры SBA (n=5) образцов сыворотки (взятых до или через 10 недель после иммунизации кроликов тремя дозами по 10 мкг нелипидированных вариантов fHBP подсемейства А) против этих штаммов показаны в верхних строках. Процент респондеров, демонстрирующих по меньшей мере 4-кратное повышение реакции относительно фона, показан в нижних строках.Table 17. Isogenic "switched" strains were engineered from the original N. meningitidis strain (PMB3556) so that the entire ORF of its endogenous fHBP (variant B24) was replaced with variants A05 (SEQ ID NO: 13), A22 (SEQ ID NO: 15), A29 (SEQ ID NO: 74) or A12 (SEQ ID NO: 14). KA3011 is a negative control strain (i.e., the original PMB3556 whose fhbp gene was deleted). Geometric mean SBA titers (n=5) of serum samples (taken before or 10 weeks after immunization of rabbits with three 10 μg doses of non-lipidated subfamily A fHBP variants) against these strains are shown in the top rows. The percentage of responders showing at least a 4-fold increase in response relative to background is shown in the bottom rows.
Таблица 18. Среднегеометрические титры SBA образцов сыворотки (взятых до или через 10 недель после иммунизация кроликов (n=5) с 10 мкг нелипидированных белков подсемейства А (А62 (SEQ ID NO: 71); А05 (SEQ ID NO: 55); A12 (SEQ ID NO: 66); A22 (SEQ ID NO: 68)) против двух изогенных штаммов подсемейства В.Table 18. Geometric mean SBA titers of serum samples (taken before or 10 weeks after immunization of rabbits (n=5) with 10 µg of non-lipidated subfamily A proteins (A62 (SEQ ID NO: 71); A05 (SEQ ID NO: 55); A12 (SEQ ID NO: 66); A22 (SEQ ID NO: 68)) against two isogenic strains of subfamily B.
Пример 19: Оценка влияния комбинирования образцов сыворотки против нелипидированных белков подсемейства А на SBAExample 19 Evaluation of the Effect of Combining Serum Samples Against Nonlipidated Subfamily A Proteins on SBA
Комбинации сыворотки исследовали для оценки влияния на охват защиты. Испытывали пары образцов сыворотки до и после вакцинации для подтверждения отсутствия неспецифического цитолиза, вызванного в результате комбинирования сыворотки. Кратность повышения GM рассчитывали для отдельных образцов сыворотки и для комбинаций сыворотки по 4-м изогенным штаммам, которые представляли разнообразие в пределах подсемейства А. Обнаруживали кратное повышение для некоторых из испытанных комбинаций, что свидетельствовало о том, что охват защиты может быть расширен путем включения большего количества вариантов подсемейства А (Таблица 19). Оптимальными комбинациями являются А05 (SEQ ID NO: 55) с А62 (SEQ ID NO: 71) или А62 (SEQ ID NO: 71) с А12 (SEQ ID NO: 66) (Таблица 20).Serum combinations were studied to evaluate the impact on protection coverage. Pairs of serum samples were tested before and after vaccination to confirm the absence of non-specific cytolysis caused by the combination of serum. The fold increase in GM was calculated for individual serum samples and for combinations of sera across 4 isogenic strains that represented diversity within the A subfamily. the number of subfamily A variants (Table 19). The optimal combinations are A05 (SEQ ID NO: 55) with A62 (SEQ ID NO: 71) or A62 (SEQ ID NO: 71) with A12 (SEQ ID NO: 66) (Table 20).
Таблица 19. Титры SBA образцов сыворотки респондеров с наивысшими показателями каждой вакцинной группы повторно испытывали по отношению к набору изогенных штаммов, как показано в Таблице 17. Образцы сыворотки испытывали в смесях 1:1 для определения степени синергетической активности.Table 19 SBA titers of the highest performing responder sera samples of each vaccine group were retested against a set of isogenic strains as shown in Table 17. Serum samples were tested in 1:1 mixtures to determine the degree of synergistic activity.
Таблица 20. Кратность повышения для образцов сыворотки, испытываемых в комбинации по сравнению с каждым, испытываемым в отдельности (рассчитанная по Таблице 19).Table 20. Factor of increase for serum samples tested in combination compared to each tested separately (calculated from Table 19).
Результаты, представленные выше в Примерах 18-19, показывают, что нелипидированные белки подсемейства А являются иммуногенными и могут обеспечивать защиту от инфицирования штаммами N. meningitidis с гомологичными или гетерологичными вариантами. Представленные здесь данные демонстрируют, что выбранные нелипидированные варианты подсемейства А сохраняют иммуногенность и обеспечивают перекрестную защиту от гетерологичных штаммов, хотя эти показатели реакции ниже, чем для липидированных вариантов. Авторами также было продемонстрировано, что антиген rP2086 A62 (SEQ ID NO: 71), имеющий подобие последовательности с подсемейством В (См., например. Фигура 9), может обеспечивать защиту от разных подсемейств, поскольку вакцина A62 (SEQ ID NO: 71) может убивать штаммы, экспрессирующие варианты В09 или В24 подсемейства В).The results presented in Examples 18-19 above indicate that the non-lipidated subfamily A proteins are immunogenic and can confer protection against infection by strains of N. meningitidis with homologous or heterologous variants. The data presented here demonstrate that the selected non-lipidated subfamily A variants retain immunogenicity and provide cross-protection against heterologous strains, although these response rates are lower than for lipidated variants. The authors also demonstrated that the rP2086 A62 antigen (SEQ ID NO: 71), which has sequence similarity with subfamily B (See, for example, Figure 9), can provide protection against different subfamilies, since the A62 vaccine (SEQ ID NO: 71) can kill strains expressing variants B09 or B24 of subfamily B).
Представленные выше данные показывают, что нелипидированные варианты подсемейства А способны не только демонстрировать синергизм, наблюдаемый для комбинаций липидированных fHBP, но и могут обеспечивать защиту от вариантов подсемейства В.The data presented above indicate that non-lipidated subfamily A variants are able not only to exhibit the synergy seen with combinations of lipidated fHBPs, but can also confer protection against subfamily B variants.
Пример 20: Оценка иммуногенности комбинации фактор Н-связывающих белков и четырехвалентной вакцины менингококкового конъюгата у новозеландских кроликов-альбиносовExample 20 Evaluation of the Immunogenicity of a Combination of Factor H-Binding Proteins and a Quadrivalent Meningococcal Conjugate Vaccine in Albino New Zealand Rabbits
Исследование проводили на новозеландских кроликах-альбиносах, имеющих массу в пределах 2,5-3,5 кг, полученных от Charles River, Канада (Таблица 21). Перед началом исследования 55 кроликов подвергали предварительному отбору на наличие антител с применением цельноклеточных анализов ELISA против штаммов А05 и В02. После отбора кроликов с относительно высокими титрами антитела (титры специфического IgG<350) вакцинировали внутримышечно в задние конечности, 0,5 мл в каждое место (1,0 мл на дозу, см. Таблицу 22) на 0, 4 и 9 неделях. Каждая группа включала три кролика. Кроликов подвергали кровопусканию на 0, 4, 6 и 9 неделях и обескровливали на 10-й неделе. Подготавливали образцы сыворотки и образцы сыворотки 0 и 10 недель подвергали анализу на SBA. Конъюгатную менингококковую вакцину (MENVEO®, конъюгатная менингококковая вакцина (Группы А, С, Y и W-135) олигосахарида дифтерии CRM197, Novartis), двухвалентный rLP2086 и четырехвалентный нелипидированный варианты и их комбинации изготавливали согласно Таблицам 23-26.The study was carried out on New Zealand albino rabbits weighing between 2.5-3.5 kg obtained from Charles River, Canada (Table 21). Prior to the start of the study, 55 rabbits were prescreened for antibodies using whole cell ELISA assays against strains A05 and B02. After selection, rabbits with relatively high antibody titers (specific IgG <350 titers) were vaccinated intramuscularly in the hind limbs, 0.5 ml at each site (1.0 ml per dose, see Table 22) at 0, 4 and 9 weeks. Each group included three rabbits. Rabbits were bled at 0, 4, 6 and 9 weeks and bled at 10 weeks. Serum samples were prepared and 0 and 10 week serum samples were analyzed for SBA. Meningococcal conjugate vaccine (MENVEO®, meningococcal conjugate vaccine (Groups A, C, Y and W-135) diphtheria oligosaccharide CRM 197 , Novartis), bivalent rLP2086 and tetravalent non-lipidated variants and combinations thereof were prepared according to Tables 23-26.
а Кроликов содержали в соответствии с установленными указаниями Институционального комитета по уходу за животными и их использованию. a Rabbits were kept in accordance with the established guidelines of the Institutional Committee for the Care and Use of Animals.
План исследования показан в Таблице 22.The study design is shown in Table 22.
Сведения о композицииComposition information
Таблица 25. Анализ данныхTable 25. Data analysis
Нелипидированный четырехвалентный белок (В22, В09, А05 и В44) наблюдали на устойчивость в течение 6 часов при 2-8°С после комбинирования с MENVEO®.The non-lipidated tetravalent protein (B22, B09, A05 and B44) was observed for stability for 6 hours at 2-8°C after combination with MENVEO®.
Пример 21: Сывороточный бактерицидный анализ (SBA)Example 21: Serum bactericidal assay (SBA)
Сывороточный бактерицидный анализ (SBA) на основе микроколоний против множественных менингококковых штаммов серогрупп В, С и Y (Таблица 27) проводили на отдельных образцах сыворотки. Человеческую сыворотку от доноров брали как источник комплемента для штамма, испытываемого при анализе. Опосредованные комплементом антителозависимые бактерицидные титры интерполировались и выражались как обратные показатели разбавления испытываемой сыворотки, убивающей 50% менингококковых клеток в пробе. Пределом обнаружения анализа был титр SBA 4. Титр SBA <4 получал номер 2. Рассчитывали и сравнивали повышение титров SBA ≥ 4 раза в 10-недельных образцах сыворотки по сравнению с титрами до иммунизации.Serum bactericidal assay (SBA) based on microcolonies against multiple meningococcal strains of serogroups B, C and Y (Table 27) was performed on separate serum samples. Human serum from donors was taken as a source of complement for the strain tested in the analysis. Complement-mediated antibody-dependent bactericidal titers were interpolated and expressed as the reciprocal of the test serum dilution killing 50% of the meningococcal cells in the sample. The limit of detection of the assay was an SBA titer of 4. An SBA titer of <4 was given a number of 2. The ≥ 4-fold increase in SBA titers in 10-week serum samples compared to pre-immunization titers was calculated and compared.
Пример 22; Иммуногенность комбинации липидированных или нелипидированных фактор Н-связывающих белков и конъюгатной вакцины у новозеландских кроликов-альбиносовExample 22; Immunogenicity of a combination of lipidated or non-lipidated factor H-binding proteins and a conjugate vaccine in New Zealand albino rabbits
Сывороточное бактериальное антитело представляет иммунологический имитатор защиты от менингококковой болезни. Вызывает ли иммунизация липидированными, нелипидированными rfHBP, четырехвалентными конъюгатными вакцинами, отдельно или в комбинации, выработку бактерицидных антител у кроликов, определяли по SBA. SBA измеряет уровень антител в образцах сыворотки путем имитации опосредованного комплементом бактериального лизиса, который происходит естественным путем. У человека титр SBA 1:4 считается обеспечивающим защиту; четырехкратное повышение титра в сравнении показателей до и после иммунизации также считается иммунологически релевантной иммунной реакцией. Образцы сыворотки кроликов, собранные на 0 и 10 неделях, подвергали анализу на SBA против штаммов разных менингококковых серогрупп. Как показано в Таблице 28 (высокая доза) и 29 (низкая доза), через неделю после третьей иммунизации (10-я неделя) четырехвалентные конъюгатные вакцины вызывали реакцию SBA только против испытываемых штаммов MnC и MnY. Все остальные образцы сыворотки демонстрировали бактерицидную активность против гомологичных штаммов, а также других испытываемых штаммов того же подсемейства fHBP, как в вакцинных композициях. Следует заметить, что иммунизация липидированными А05/В01 (SEQ ID NO: 13 и 58, соответственно) по отдельности в дозах по 30 мкг вызывала максимальную выработку бактерицидных антител против гомологичных штаммов, а также против других испытываемых штаммов обоих подсемейств fHBP (Таблица 28). Подобным образом иммунизация нелипидированными А05/В09/В22/В44 (SEQ ID NO: 55, 49, 75 и 44, соответственно) по отдельности также вызывала выработку бактерицидных антител против штаммов нескольких менингококковых серогруппа, даже несмотря на то, что титры SBA были в 3-15 раз ниже по сравнению с липидированной двухвалентной вакциной (Таблица 30). 100%-й показатель респондеров (≥ 4-кратное повышение титра SBA) достигался против всех штаммов различных серогрупп для липидированного fHBP, высокой дозы нелипидированного fHBP и всех комбинаций.Serum bacterial antibody is an immunological mimic of protection against meningococcal disease. Whether immunization with lipidated, non-lipidated rfHBP, quadrivalent conjugate vaccines, alone or in combination, produces bactericidal antibodies in rabbits was determined by SBA. SBA measures antibody levels in serum samples by mimicking complement-mediated bacterial lysis that occurs naturally. In humans, an SBA titer of 1:4 is considered to be protective; a fourfold increase in titer compared to before and after immunization is also considered an immunologically relevant immune response. Serum samples from rabbits collected at weeks 0 and 10 were analyzed for SBA against strains of different meningococcal serogroups. As shown in Tables 28 (high dose) and 29 (low dose), one week after the third immunization (week 10), the quadrivalent conjugate vaccines elicited an SBA response only against the MnC and MnY strains tested. All other serum samples showed bactericidal activity against the homologous strains as well as other tested strains of the same fHBP subfamily as in the vaccine compositions. It should be noted that immunization with lipidated A05/B01 (SEQ ID NOS: 13 and 58, respectively) alone at 30 μg doses induced the maximum production of bactericidal antibodies against homologous strains as well as against other tested strains of both fHBP subfamilies (Table 28). Similarly, immunization with non-lipidated A05/B09/B22/B44 (SEQ ID NOS: 55, 49, 75, and 44, respectively) alone also elicited bactericidal antibodies against strains of several meningococcal serogroups, even though SBA titers were 3 -15 times lower compared to the lipidated bivalent vaccine (Table 30). A 100% responder rate (≥ 4-fold increase in SBA titer) was achieved against all strains of various serogroups for lipidated fHBP, high dose non-lipidated fHBP, and all combinations.
Образцы сыворотки кроликов до иммунизации не демонстрировали ранее существовавшей бактерицидной активности против испытываемых штаммов. Кроликов NZW (n=3) вакцинировали на 0, 4 и 8 недели с применением 0,5 мл вакцины, внутримышечно; данные нед. 10Serum samples from rabbits prior to immunization showed no pre-existing bactericidal activity against the strains tested. NZW rabbits (n=3) were vaccinated at
Образцы сыворотки кроликов до иммунизации не демонстрировали ранее существовавшей бактерицидной активности против испытываемых штаммов. Кроликов NZW (n=3) вакцинировали на 0, 4 и 8 неделях с применением 0,5 мл вакцины, внутримышечно; данные нед. 10Serum samples from rabbits prior to immunization showed no pre-existing bactericidal activity against the strains tested. NZW rabbits (n=3) were vaccinated at 0, 4 and 8 weeks with 0.5 ml of vaccine, IM; weekly data ten
Кроликов NZQ (n=3) вакцинировали на 0, 4 и 8 неделях с применением 0,5 мл вакцины, внутримышечно; данные нед. 10NZQ rabbits (n=3) were vaccinated at 0, 4 and 8 weeks with 0.5 ml of vaccine, IM; weekly data ten
Лнпидировапный fHBP вызывал более высокие титры SBA по сравнению с нелипидированным fHBP.Llipidated fHBP induced higher SBA titers compared to nonlipidated fHBP.
Липидированный fHBP при 30 мкг на дозу вызывал в 3-15 раз более высокие титры SBA ко всем испытываемым штаммам менингококков В, С и Y. Нелипидированный fHBP при 30 мкг на дозу вызывал в 4-23 раза более высокие титры SBA ко всем испытываемым штаммам менингококков В, С и Y (Таблицы 28-29).Lipidized fHBP at 30 µg per dose induced 3-15 times higher SBA titers to all meningococcal B, C and Y strains tested. Non-lipidated fHBP at 30 µg per dose induced 4-23 times higher SBA titers to all meningococcal strains tested B, C and Y (Tables 28-29).
Титрование дозы достигали с применением fHBP, конъюгатной вакцины или комбинацийDose titration was achieved with fHBP, conjugate vaccine, or combinations
При более высокой дозе конъюгатной вакцины fHBP или их комбинации повышали реакцию SBA по сравнению с более низкой дозой (Таблицы 28-30). Одна доза конъюгатной вакцины для человека вызывала 2-8-кратное повышение титров SBA против штаммов менингококков С и Y по сравнению с одной десятой дозы конъюгатной вакцины. Липидированный fHBP при 30 мкг на дозу вызывал 2-4-кратное повышение титров SBA против всех испытываемых штаммов по сравнению с 3 мкг на дозу. Нелипидированный fHBP при 30 мкг на дозу вызывал 4-15-кратное повышение титров SBA против всех штаммов менингококков серогрупп В, С и Y по сравнению с 3 мкг на дозу.At a higher dose of the fHBP conjugate vaccine, or a combination thereof, increased the SBA response compared to a lower dose (Tables 28-30). A single human dose of the conjugate vaccine produced a 2-8-fold increase in SBA titers against meningococcal C and Y strains compared to one-tenth the dose of the conjugate vaccine. Lipidized fHBP at 30 μg per dose caused a 2-4 fold increase in SBA titers against all strains tested compared to 3 μg per dose. Non-lipidated fHBP at 30 μg per dose caused a 4-15-fold increase in SBA titers against all strains of serogroups B, C and Y meningococci compared to 3 μg per dose.
Синергетические реакции SBA при комбинации fHBP и конъюгатных вакцинSynergistic reactions of SBA in combination of fHBP and conjugate vaccines
Существует тенденция в сторону повышения реакций SBA против штаммов менингококков серогрупп С и Y при применении комбинации конъюгатной вакцины и fHBP по сравнению с применением любого из компонентов в отдельности с добавлением более низкой дозы липидированного или нелипидированного fHBP (Таблица 29). В данном исследовании функциональную активность против штаммов нескольких менингококковых серогрупп оценивали с использованием сыворотки новозеландских кроликов-альбиносов, иммунизированных рекомбинантным липидированным или нелипидированным fHBP в композиции с AlPO4 и конъюгатной вакциной отдельно или в комбинации. Кролики, получавшие конъюгатную вакцину, демонстрировали реакцию SBA только против штаммов менингококков серогрупп С и Y, но не штаммов серогруппы В. Липидированный или нелипидированный fHBP в композиции с AlPO4 вызывали выработку сывороточных антител, которые были бактерицидными против штаммов всех испытываемых менингококковых серогрупп.There is a trend towards increased SBA responses against serogroups C and Y meningococcal strains with the combination of the conjugate vaccine and fHBP compared with either component alone with the addition of a lower dose of lipidated or non-lipidated fHBP (Table 29). In this study, functional activity against strains of several meningococcal serogroups was evaluated using sera from New Zealand albino rabbits immunized with recombinant lipidated or non-lipidated fHBP in combination with AlPO 4 and a conjugate vaccine alone or in combination. Rabbits treated with the conjugate vaccine showed an SBA response only against strains of meningococcal serogroups C and Y, but not strains of serogroup B. Lipidated or non-lipidated fHBP formulated with AlPO 4 produced serum antibodies that were bactericidal against strains of all meningococcal serogroups tested.
Новозеландские кролики-альбиносы, получавшие три дозы липидированного или нелипидированного fHBP в композиции с AlPO4, вырабатывали сывороточные антитела, которые были бактерицидными против испытываемых штаммов менингококков серогрупп В, С и Y. 100%-й показатель респондеров (≥ 4-кратное повышение титра SBA) достигался против всех испытываемых штаммов, за исключением низкодозовой нелипидированной группы.Albino New Zealand rabbits treated with three doses of lipidated or non-lipidated fHBP formulated with AlPO 4 produced serum antibodies that were bactericidal against the strains of serogroups B, C and Y meningococci tested. 100% responder rate (≥ 4-fold increase in SBA titer ) was achieved against all strains tested except for the low-dose, non-lipidated group.
Липидированный fHBP вызывал большие титры бактериального антитела по сравнению с нелипидированными формами. Явная реакция на дозу наблюдалась при липидированном или нелипидированном fHBP и конъюгатной вакцине отдельно или в комбинациях.Lipidated fHBP elicited higher bacterial antibody titers compared to non-lipidated forms. A clear dose response has been observed with lipidated or non-lipidated fHBP and conjugate vaccine alone or in combination.
Существует тенденция в сторону повышения реакций SBA против штаммов менингококков серогрупп С и Y между конъюгатной вакциной и fHBP, в частности, при добавлении низких доз белков.There is a trend towards increased SBA responses against strains of meningococcal serogroups C and Y between conjugate vaccine and fHBP, particularly when low doses of proteins are added.
Пример 23: Оценка иммуногенности комбинаций нелипидированных фактор Н-связывающих белков у новозеландских кроликов-альбиносовExample 23 Evaluation of the immunogenicity of combinations of non-lipidated factor H-binding proteins in New Zealand albino rabbits
Исследования проводили на новозеландских кроликах-альбиносах весом 2,5-3,5 кг, полученных от Charles River, Канада (Таблица 31). Кроликов вакцинировали внутримышечно в заднюю конечность, 0,5 мл в каждое место (1,0 мл на дозу, см. Таблицу 32) на 0, 4 и 9 неделях. Идентификационные номера последовательностей для каждого из исследованных антигенов представлены в Таблице 33. Использовали 10 кроликов на группу. Кроликов подвергали кровопусканию на 0 и 6 неделях и обескровливали на 10-й неделе. Подготавливали образцы сыворотки и образцы сыворотки 0 и 10 недель подвергали анализу в SBA против ряда изолятов N. meningitidis.Studies were carried out on New Zealand albino rabbits weighing 2.5-3.5 kg obtained from Charles River, Canada (Table 31). Rabbits were vaccinated intramuscularly in the hind limb, 0.5 ml at each site (1.0 ml per dose, see Table 32) at 0, 4 and 9 weeks. Sequence identification numbers for each of the tested antigens are shown in Table 33. 10 rabbits per group were used. Rabbits were bled at 0 and 6 weeks and bled at 10 weeks. Serum samples were prepared and 0 and 10 week serum samples were analyzed in SBA against a range of N. meningitidis isolates.
a Кроликов содержали в соответствии с установленными указаниями Институционального комитета по уходу за животными и их использованию a Rabbits were kept in accordance with the established guidelines of the Institutional Committee for the Care and Use of Animals.
Кроликов вакцинировали внутримышечно (0, 4 и 9 недели) и подвергали кровопусканию (О, 6 и 10 недели) для приготовления образцов сыворотки для анализа SBARabbits were vaccinated intramuscularly (0, 4 and 9 weeks) and bled (0, 6 and 10 weeks) to prepare serum samples for SBA analysis
В Таблице 34 представлены показатели иммунной реакции у кроликов на смеси нелипидированных белков fHBP по сравнению с иммунной реакцией на пару липидированных антигенов rLP2086-A05 и rLP2086-B01. Образцы сыворотки кролика до иммунизации, как правило, не демонстрировали ранее существовавшей бактерицидной активности против испытываемых штаммов. Иммунная реакция представлена как процент животных в каждой экспериментальной группе, которые реагировали на соответствующие комбинации антигенов fHBP после третьей иммунизации с повышением титра SBA ≥ 4 раза. Анализ SBA осуществляли, используя заданные штаммы N. meningitidis, которые либо экспрессируют варианты fHBP, идентичные иммуногену вакцины (А05, А12), либо экспрессируют гетерологичные варианты fHBP (А22, В16, В24). Сравнительная идентичность аминокислотной последовательности варианта А22 fHBP имеет до 15% отличия от исследованных вариантов подсемейства А. Подобным образом сравнительная идентичность аминокислотной последовательности вариантов fHBP В 16 и В24 имеет до 12% отличия от вариантов подсемейства В, включенных в качестве антигенов.Table 34 shows the immune response in rabbits to a mixture of non-lipidated fHBP proteins compared with the immune response to a pair of lipidated antigens rLP2086-A05 and rLP2086-B01. Rabbit serum samples prior to immunization generally did not show pre-existing bactericidal activity against the strains tested. The immune response is presented as the percentage of animals in each experimental group that responded to the respective combinations of fHBP antigens after the third immunization with an increase in SBA titer ≥ 4 times. SBA analysis was performed using target N. meningitidis strains that either express vaccine immunogen identical fHBP variants (A05, A12) or express heterologous fHBP variants (A22, B16, B24). The comparative amino acid sequence identity of the A22 fHBP variant has up to 15% difference from the studied subfamily A variants. Similarly, the comparative amino acid sequence identity of the fHBP variants B16 and B24 has up to 12% difference from the B subfamily variants included as antigens.
а 10 животных на группу; все композиции рецептировали с адъювантом AlPO4 (250 мкг/дозу) a 10 animals per group; all formulations were formulated with AlPO 4 adjuvant (250 µg/dose)
В группах кроликов, иммунизированных 10 мкг каждого испытываемого варианта rP2086, образцы сыворотки животных, получавших комбинацию А05+А62+В09+В44, демонстрировали наивысший показатель бактерицидной реакции. Реакция SBA была несколько сниженной у животных, получавших только по 5 мкг той же смеси четырех нелипидированных вариантов fHBP. Другие 4-валентные группы антигенов rHBP в дозах 5 мкг проявляли себя так же, как и комбинация нелипидированных А05+А62+В09+В44. Из испытанных 4-валентных комбинаций образцы сыворотки из экспериментальной группы, включавшей по 5 мкг нелипидированных вариантов fHBP А 12+А62+В09+В44, имели наилучшие показатели реакции SBA для выбранных анализируемых штаммов. Показатель реакции на пятивалентную нелипидированную комбинацию из А05+А 12+А62+В09+В44 был несколько лучшим по сравнению с реакцией на любую из испытанных 4-валентных комбинаций.In groups of rabbits immunized with 10 μg of each rP2086 variant tested, serum samples from animals treated with the A05+A62+B09+B44 combination showed the highest bactericidal response. The SBA response was somewhat reduced in animals treated with only 5 μg of the same mixture of four non-lipidated fHBP variants. Other 4-valent groups of rHBP antigens at doses of 5 μg behaved in the same way as the combination of non-lipidated A05+A62+B09+B44. Of the 4-valent combinations tested, serum samples from the experimental group containing 5 μg of non-lipidated fHBP variants A 12+A62+B09+B44 had the best SBA response for the selected strains analyzed. The response rate to the pentavalent non-lipidated combination of A05+A12+A62+B09+B44 was slightly better than the response to any of the tested 4-valent combinations.
--->--->
Список последовательностей Sequence list
<110> PFIZER INC.<110> PFIZER INC.
Anderson, Annaliesa S. Anderson, Annaliesa S.
Hoiseth, Susan K. Hoiseth, Susan K.
Jansen, Kathrin U. Jansen, Kathryn U.
Mark, Ruppen E. Mark, Ruppen E.
Justin, Moran K. Justin, Moran K.
<120> КОМПОЗИЦИИ NEISSERIA MENINGITIDIS И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ <120> NEISSERIA MENINGITIDIS COMPOSITIONS AND METHODS OF THEIR APPLICATION
<130> PC071917<130> PC071917
<160> 81 <160> 81
<170> PatentIn, версия 3.5 <170> PatentIn version 3.5
<210> 1<210> 1
<211> 780<211> 780
<212> ДНК <212> DNA
<213> Neisseria meningitidis (группа B) <213> Neisseria meningitidis (Group B)
<400> 1<400> 1
tgcagcagcg gaggcggagg cggcggtgtc gccgccgaca tcggcacggg gcttgccgat 60tgcagcagcg gaggcgggagg cggcggtgtc gccgccgaca tcggcacggg gcttgccgat 60
gcactaactg cgccgctcga ccataaagac aaaggtttga aatccctgac attggaagac 120gcactaactg cgccgctcga ccataaagac aaaggtttga aatccctgac attggaagac 120
tccattcccc aaaacggaac actgaccctg tcggcacaag gtgcggaaaa aactttcaaa 180tccattcccc aaaacggaac actgaccctg tcggcacaag gtgcggaaaa aactttcaaa 180
gccggcgaca aagacaacag cctcaacacg ggcaaactga agaacgacaa aatcagccgc 240gccggcgaca aagacaacag cctcaacacg ggcaaactga agaacgacaa aatcagccgc 240
ttcgacttcg tgcaaaaaat cgaagtggac ggacaaacca tcacactggc aagcggcgaa 300ttcgacttcg tgcaaaaaat cgaagtggac ggacaaacca tcacactggc aagcggcgaa 300
tttcaaatat acaaacagga ccactccgcc gtcgttgccc tacagattga aaaaatcaac 360tttcaaatat acaaacagga ccactccgcc gtcgttgccc tacagattga aaaaatcaac 360
aaccccgaca aaatcgacag cctgataaac caacgctcct tccttgtcag cggtttgggc 420aaccccgaca aaatcgacag cctgataaac caacgctcct tccttgtcag cggtttgggc 420
ggagaacata ccgccttcaa ccaactgccc ggcgacaaag ccgagtatca cggcaaagca 480ggagaacata ccgccttcaa ccaactgccc ggcgacaaag ccgagtatca cggcaaagca 480
ttcagctccg acgatgccgg cggaaaactg acctatacca tagattttgc cgccaaacag 540ttcagctccg acgatgccgg cggaaaactg acctatacca tagattttgc cgccaaacag 540
ggacacggca aaatcgaaca cctgaaaaca cccgagcaaa atgtcgagct tgccgccgcc 600ggacacggca aaatcgaaca cctgaaaaca cccgagcaaa atgtcgagct tgccgccgcc 600
gaactcaaag cagatgaaaa atcacacgcc gtcattttgg gcgacacgcg ctacggcagc 660gaactcaaag cagatgaaaa atcacacgcc gtcattttgg gcgacacgcg ctacggcagc 660
gaagaaaaag gcacttacca cctcgccctt ttcggcgacc gcgcccaaga aatcgccggc 720gaagaaaaag gcacttacca cctcgccctt ttcggcgacc gcgcccaaga aatcgccggc 720
tcggcaaccg tgaagatagg ggaaaaggtt cacgaaatcg gcatcgccgg caaacagtag 780tcggcaaccg tgaagatagg ggaaaaggtt cacgaaatcg gcatcgccgg caaacagtag 780
<210> 2<210> 2
<211> 786<211> 786
<212> ДНК <212> DNA
<213> Neisseria meningitidis (группа B) <213> Neisseria meningitidis (Group B)
<400> 2<400> 2
tgcagcagcg gaagcggaag cggaggcggc ggtgtcgccg ccgacatcgg cacagggctt 60tgcagcagcg gaagcggaag cggaggcggc ggtgtcgccg ccgacatcgg cacagggctt 60
gccgatgcac taactgcgcc gctcgaccat aaagacaaag gtttgaaatc cctgacattg 120gccgatgcac taactgcgcc gctcgaccat aaagacaaag gtttgaaatc cctgacattg 120
gaagactcca tttcccaaaa cggaacactg accctgtcgg cacaaggtgc ggaaaaaact 180gaagactcca tttcccaaaa cggaacactg accctgtcgg cacaaggtgc ggaaaaaact 180
ttcaaagtcg gcgacaaaga caacagtctc aatacaggca aattgaagaa cgacaaaatc 240ttcaaagtcg gcgacaaaga caacagtctc aatacaggca aattgaagaa cgacaaaatc 240
agccgcttcg actttgtgca aaaaatcgaa gtggacggac aaaccatcac gctggcaagc 300agccgcttcg actttgtgca aaaaatcgaa gtggacggac aaaccatcac gctggcaagc 300
ggcgaatttc aaatatacaa acaggaccac tccgccgtcg ttgccctaca gattgaaaaa 360360
atcaacaacc ccgacaaaat cgacagcctg ataaaccaac gctccttcct tgtcagcggt 420atcaacaacc ccgacaaaat cgacagcctg ataaaccaac gctccttcct tgtcagcggt 420
ttgggcggag aacataccgc cttcaaccaa ctgcccagcg gcaaagccga gtatcacggc 480ttgggcggag aacataccgc cttcaaccaa ctgcccagcg gcaaagccga gtatcacggc 480
aaagcattca gctccgacga tgccggcgga aaactgacct ataccataga ttttgccgcc 540aaagcattca gctccgacga tgccggcgga aaactgacct ataccataga ttttgccgcc 540
aaacagggac acggcaaaat cgaacacctg aaaacacccg agcagaatgt cgagcttgcc 600aaacagggac acggcaaaat cgaacacctg aaaacacccg agcagaatgt cgagcttgcc 600
tccgccgaac tcaaagcaga tgaaaaatca cacgccgtca ttttgggcga cacgcgctac 660tccgccgaac tcaaagcaga tgaaaaatca cacgccgtca ttttgggcga cacgcgctac 660
ggcagcgaag aaaaaggcac ttaccacctc gctcttttcg gcgaccgagc ccaagaaatc 720ggcagcgaag aaaaaggcac ttaccacctc gctcttttcg gcgaccgagc ccaagaaatc 720
gccggctcgg caaccgtgaa gataagggaa aaggttcacg aaatcggcat cgccggcaaa 780gccggctcgg caaccgtgaa gataagggaa aaggttcacg aaatcggcat cgccggcaaa 780
cagtag 786cagtag 786
<210> 3<210> 3
<211> 765<211> 765
<212> ДНК <212> DNA
<213> Neisseria meningitidis (группа B) <213> Neisseria meningitidis (Group B)
<400> 3<400> 3
tgcagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cggggcttgc cgatgcacta 60tgcagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cggggcttgc cgatgcacta 60
accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc 120accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc 120
aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180
gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt 240gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt 240
caaatcgaag tggacggaca aaccatcacg ctggcaagcg gcgaatttca aatatacaaa 300caaatcgaag tggacggaca aaccatcacg ctggcaagcg gcgaatttca aatatacaaa 300
cagaaccact ccgccgtcgt tgccctacag attgaaaaaa tcaacaaccc cgacaaaatc 360cagaaccact ccgccgtcgt tgccctacag attgaaaaaa tcaacaaccc cgacaaaatc 360
gacagcctga taaaccaacg ctccttcctt gtcagcggtt tgggcggaga acataccgcc 420gacagcctga taaaccaacg ctccttcctt gtcagcggtt tgggcggaga acataccgcc 420
ttcaaccaac tgcctgacgg caaagccgag tatcacggca aagcattcag ctccgacgac 480ttcaaccaac tgcctgacgg caaagccgag tatcacggca aagcattcag ctccgacgac 480
ccgaacggca ggctgcacta ctccattgat tttaccaaaa aacagggtta cggcagaatc 540ccgaacggca ggctgcacta ctccattgat tttaccaaaa aacagggtta cggcagaatc 540
gaacacctga aaacgcccga gcagaatgtc gagcttgcct ccgccgaact caaagcagat 600gaacacctga aaacgcccga gcagaatgtc gagcttgcct ccgccgaact caaagcagat 600
gaaaaatcac acgccgtcat tttgggcgac acgcgctacg gcggcgaaga aaaaggcact 660gaaaaatcac acgccgtcat tttggggcgac acgcgctacg gcggcgaaga aaaaggcact 660
taccacctcg cccttttcgg cgaccgcgcc caagaaatcg ccggctcggc aaccgtgaag 720taccacctcg cccttttcgg cgaccgcgcc caagaaatcg ccggctcggc aaccgtgaag 720
ataagggaaa aggttcacga aatcggcatc gccggcaaac agtag 765ataagggaaa aggttcacga aatcggcatc gccggcaaac agtag 765
<210> 4<210> 4
<211> 765<211> 765
<212> ДНК <212> DNA
<213> Neisseria meningitidis (группа B) <213> Neisseria meningitidis (Group B)
<400> 4<400> 4
tgcagcagcg gagggggcgg tgtcgccgcc gacattggtg cggggcttgc cgatgcacta 60tgcagcagcg gagggggcgg tgtcgccgcc gacattggtg cggggcttgc cgatgcacta 60
accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc 120accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc 120
aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180
gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt 240gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt 240
caaatcgaag tggacggaca aaccatcacg ctggcaagcg gcgaatttca aatatacaaa 300caaatcgaag tggacggaca aaccatcacg ctggcaagcg gcgaatttca aatatacaaa 300
cagaaccact ccgccgtcgt tgccctacag attgaaaaaa tcaacaaccc cgacaaaatc 360cagaaccact ccgccgtcgt tgccctacag attgaaaaaa tcaacaaccc cgacaaaatc 360
gacagcctga taaaccaacg ctccttcctt gtcagcggtt tgggcggaga acataccgcc 420gacagcctga taaaccaacg ctccttcctt gtcagcggtt tgggcggaga acataccgcc 420
ttcaaccaac tgcctgacgg caaagccgag tatcacggca aagcattcag ctccgacgac 480ttcaaccaac tgcctgacgg caaagccgag tatcacggca aagcattcag ctccgacgac 480
ccgaacggca ggctgcacta ctccattgat tttaccaaaa aacagggtta cggcagaatc 540ccgaacggca ggctgcacta ctccattgat tttaccaaaa aacagggtta cggcagaatc 540
gaacacctga aaacgcccga gcagaatgtc gagcttgcct ccgccgaact caaagcagat 600gaacacctga aaacgcccga gcagaatgtc gagcttgcct ccgccgaact caaagcagat 600
gaaaaatcac acgccgtcat tttgggcgac acgcgctacg gcggcgaaga aaaaggcact 660gaaaaatcac acgccgtcat tttggggcgac acgcgctacg gcggcgaaga aaaaggcact 660
taccacctcg cccttttcgg cgaccgcgcc caagaaatcg ccggctcggc aaccgtgaag 720taccacctcg cccttttcgg cgaccgcgcc caagaaatcg ccggctcggc aaccgtgaag 720
ataagggaaa aggttcacga aatcggcatc gccggcaaac agtag 765ataagggaaa aggttcacga aatcggcatc gccggcaaac agtag 765
<210> 5<210> 5
<211> 765<211> 765
<212> ДНК <212> DNA
<213> Neisseria meningitidis (группа B) <213> Neisseria meningitidis (Group B)
<400> 5<400> 5
tgcagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cggggcttgc cgatgcacta 60tgcagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cggggcttgc cgatgcacta 60
accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc 120accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc 120
aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180
gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt 240gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt 240
caaatcgaag tggacgggca gctcattacc ttggagagcg gagagttcca aatatacaaa 300caaatcgaag tggacgggca gctcattacc ttggagagcg gagagttcca aatatacaaa 300
caggaccact ccgccgtcgt tgccctacag attgaaaaaa tcaacaaccc cgacaaaatc 360caggaccact ccgccgtcgt tgccctacag attgaaaaaa tcaacaaccc cgacaaaatc 360
gacagcctga taaaccaacg ctccttcctt gtcagcggtt tgggtggaga acataccgcc 420gacagcctga taaaccaacg ctccttcctt gtcagcggtt tgggtggaga acataccgcc 420
ttcaaccaac tgcccagcgg caaagccgag tatcacggca aagcattcag ctccgacgat 480ttcaaccaac tgcccagcgg caaagccgag tatcacggca aagcattcag ctccgacgat 480
gctggcggaa aactgaccta taccatagat ttcgccgcca aacagggaca cggcaaaatc 540gctggcggaa aactgaccta taccatagat ttcgccgcca aacagggaca cggcaaaatc 540
gaacacttga aaacacccga gcaaaatgtc gagcttgcct ccgccgaact caaagcagat 600gaacacttga aaacacccga gcaaaatgtc gagcttgcct ccgccgaact caaagcagat 600
gaaaaatcac acgccgtcat tttgggcgac acgcgctacg gcggcgaaga aaaaggcact 660gaaaaatcac acgccgtcat tttggggcgac acgcgctacg gcggcgaaga aaaaggcact 660
taccacctcg cccttttcgg cgaccgcgcc caagaaatcg ccggctcggc aaccgtgaag 720taccacctcg cccttttcgg cgaccgcgcc caagaaatcg ccggctcggc aaccgtgaag 720
ataagggaaa aggttcacga aatcggcatc gccggcaaac agtag 765ataagggaaa aggttcacga aatcggcatc gccggcaaac agtag 765
<210> 6<210> 6
<211> 792<211> 792
<212> ДНК <212> DNA
<213> Neisseria meningitidis (группа B) <213> Neisseria meningitidis (Group B)
<400> 6<400> 6
tgcagcagcg gaggcggcgg aagcggaggc ggcggtgtcg ccgccgacat cggcgcgggg 60tgcagcagcg gaggcggcgg aagcgggaggc ggcggtgtcg ccgccgacat cggcgcgggg 60
cttgccgatg cactaaccgc accgctcgac cataaagaca aaggtttgaa atccctgaca 120cttgccgatg cactaaccgc accgctcgac cataaagaca aaggtttgaa atccctgaca 120
ttggaagact ccatttccca aaacggaaca ctgaccctgt cggcacaagg tgcggaaaga 180ttggaagact ccatttccca aaacggaaca ctgaccctgt cggcacaagg tgcggaaaga 180
actttcaaag ccggcgacaa agacaacagt ctcaacacag gcaaactgaa gaacgacaaa 240actttcaaag ccggcgacaa agacaacagt ctcaacacag gcaaactgaa gaacgacaaa 240
atcagccgct tcgactttat ccgtcaaatc gaagtggacg ggcagctcat taccttggag 300atcagccgct tcgactttat ccgtcaaatc gaagtggacg ggcagctcat taccttggag 300
agcggagagt tccaagtgta caaacaaagc cattccgcct taaccgccct tcagaccgag 360agcggagagt tccaagtgta caaacaaagc cattccgcct taaccgccct tcagaccgag 360
caagtacaag actcggagca ttccgggaag atggttgcga aacgccagtt cagaatcggc 420caagtacaag actcggagca ttccgggaag atggttgcga aacgccagtt cagaatcggc 420
gacatagtgg gcgaacatac atcttttgac aagcttccca aagacgtcat ggcgacatat 480gacatagtgg gcgaacatac atcttttgac aagcttccca aagacgtcat ggcgacatat 480
cgcgggacgg cgttcggttc agacgatgcc ggcggaaaac tgacctacac catagatttc 540cgcgggacgg cgttcggttc agacgatgcc ggcggaaaac tgacctacac catagatttc 540
gccgccaagc agggacacgg caaaatcgaa catttgaaat cgcctgaact caatgttgac 600gccgccaagc agggacacgg caaaatcgaa catttgaaat cgcctgaact caatgttgac 600
ctggccgccg ccgatatcaa gccggatgaa aaacaccatg ccgtcatcag cggttccgtc 660ctggccgccg ccgatatcaa gccggatgaa aaacaccatg ccgtcatcag cggttccgtc 660
ctttacaacc aagccgagaa aggcagttac tctctaggca tctttggcgg gcaagcccag 720ctttacaacc aagccgagaa aggcagttac tctctaggca tctttggcgg gcaagcccag 720
gaagttgccg gcagcgcgga agtggaaacc gcaaacggca tacgccatat cggtcttgcc 780gaagttgccg gcagcgcgga agtggaaacc gcaaacggca tacgccatat cggtcttgcc 780
gccaagcaat aa 792gccaagcaat aa 792
<210> 7<210> 7
<211> 768<211> 768
<212> ДНК <212> DNA
<213> Neisseria meningitidis (группа B) <213> Neisseria meningitidis (Group B)
<400> 7<400> 7
tgcagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cggggcttgc cgatgcacta 60tgcagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cggggcttgc cgatgcacta 60
accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc 120accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc 120
aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180
gacagcctta atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgtttcga ctttatccgt 240gacagcctta atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgtttcga ctttatccgt 240
caaatcgaag tggacgggca gctcattacc ttggagagcg gagagttcca agtgtacaaa 300caaatcgaag tggacgggca gctcattacc ttggagagcg gagagttcca agtgtacaaa 300
caaagccatt ccgccttaac cgcccttcag accgagcaag aacaagatcc agagcattcc 360caaagccatt ccgccttaac cgcccttcag accgagcaag aacaagatcc agagcattcc 360
gggaagatgg ttgcgaaacg ccggttcaaa atcggcgaca tagcgggcga acatacatct 420gggaagatgg ttgcgaaacg ccggttcaaa atcggcgaca tagcggggcga acatacatct 420
tttgacaagc ttcccaaaga cgtcatggcg acatatcgcg ggacggcgtt cggttcagac 480tttgacaagc ttcccaaaga cgtcatggcg acatatcgcg ggacggcgtt cggttcagac 480
gatgccggcg gaaaactgac ctatactata gattttgctg ccaaacaggg acacggcaaa 540gatgccggcg gaaaactgac ctatactata gattttgctg ccaaacaggg acacggcaaa 540
atcgaacatt tgaaatcgcc cgaactcaat gtcgagcttg ccaccgccta tatcaagccg 600atcgaacatt tgaaatcgcc cgaactcaat gtcgagcttg ccaccgccta tatcaagccg 600
gatgaaaaac accatgccgt catcagcggt tccgtccttt acaatcaaga cgagaaaggc 660gatgaaaaac accatgccgt catcagcggt tccgtccttt acaatcaaga cgagaaaggc 660
agttactccc tcggtatctt tggcgggcaa gcccaggaag ttgccggcag cgcggaagtg 720agttactccc tcggtatctt tggcgggcaa gccaggaag ttgccggcag cgcggaagtg 720
gaaaccgcaa acggcataca ccatatcggt cttgccgcca agcaataa 768gaaaccgcaa acggcataca ccatatcggt cttgccgcca agcaataa 768
<210> 8<210> 8
<211> 768<211> 768
<212> ДНК <212> DNA
<213> Neisseria meningitidis (группа B) <213> Neisseria meningitidis (Group B)
<400> 8<400> 8
tgcagcagcg gagggggcgg tgtcgccgcc gacatcggtg cggggcttgc cgatgcacta 60tgcagcagcg gagggggcgg tgtcgccgcc gacatcggtg cggggcttgc cgatgcacta 60
accgcaccgc tcgaccataa agacaaaggt ttgcagtctt taacgctgga tcagtccgtc 120accgcaccgc tcgaccataa agacaaaggt ttgcagtctt taacgctgga tcagtccgtc 120
aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180
gacagcctta atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt 240gacagcctta atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt 240
caaatcgaag tggacgggaa gctcattacc ttggagagcg gagagttcca agtgtacaaa 300caaatcgaag tggacgggaa gctcattacc ttggagagcg gagagttcca agtgtacaaa 300
caaagccatt ccgccttaac cgcccttcag accgagcaag tacaagactc ggaggattcc 360caaagccatt ccgccttaac cgcccttcag accgagcaag tacaagactc ggaggattcc 360
gggaagatgg ttgcgaaacg ccagttcaga atcggcgaca tagcgggcga acatacatct 420gggaagatgg ttgcgaaacg ccagttcaga atcggcgaca tagcgggcga acatacatct 420
tttgacaagc ttcccaaagg cggcagtgcg acatatcgcg ggacggcgtt cggttcagac 480tttgacaagc ttcccaaagg cggcagtgcg acatatcgcg ggacggcgtt cggttcagac 480
gatgctggcg gaaaactgac ctatactata gatttcgccg ccaagcaggg acacggcaaa 540gatgctggcg gaaaactgac ctatactata gatttcgccg ccaagcaggg acacggcaaa 540
atcgaacatt tgaaatcgcc cgaactcaat gtcgagcttg ccaccgccta tatcaagccg 600atcgaacatt tgaaatcgcc cgaactcaat gtcgagcttg ccaccgccta tatcaagccg 600
gatgaaaaac gccatgccgt tatcagcggt tccgtccttt acaaccaaga cgagaaaggc 660gatgaaaaac gccatgccgt tatcagcggt tccgtccttt acaaccaaga cgagaaaggc 660
agttactccc tcggtatctt tggcgggcaa gcccaggaag ttgccggcag cgcggaagtg 720agttactccc tcggtatctt tggcgggcaa gccaggaag ttgccggcag cgcggaagtg 720
gaaaccgcaa acggcataca ccatatcggt cttgccgcca agcagtaa 768gaaaccgcaa acggcataca ccatatcggt cttgccgcca agcagtaa 768
<210> 9<210> 9
<211> 768<211> 768
<212> ДНК <212> DNA
<213> Neisseria meningitidis (группа B) <213> Neisseria meningitidis (Group B)
<400> 9<400> 9
tgcagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cggtgcttgc cgatgcacta 60tgcagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cggtgcttgc cgatgcacta 60
accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc 120accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc 120
aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180
gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt 240gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt 240
caaatcgaag tggacgggca gctcattacc ttggagagcg gagagttcca agtgtacaaa 300caaatcgaag tggacgggca gctcattacc ttggagagcg gagagttcca agtgtacaaa 300
caaagccatt ccgccttaac cgcccttcag accgagcaag tacaagattc ggagcattca 360caaagccatt ccgccttaac cgcccttcag accgagcaag tacaagattc ggagcattca 360
gggaagatgg ttgcgaaacg ccagttcaga atcggcgata tagcgggtga acatacatct 420gggaagatgg ttgcgaaacg ccagttcaga atcggcgata tagcgggtga acatacatct 420
tttgacaagc ttcccgaagg cggcagggcg acatatcgcg ggacggcatt cggttcagac 480tttgacaagc ttcccgaagg cggcagggcg acatatcgcg ggacggcatt cggttcagac 480
gatgccagtg gaaaactgac ctacaccata gatttcgccg ccaagcaggg acacggcaaa 540gatgccagtg gaaaactgac ctacaccata gatttcgccg ccaagcaggg acacggcaaa 540
atcgaacatt tgaaatcgcc agaactcaat gttgacctgg ccgcctccga tatcaagccg 600atcgaacatt tgaaatcgcc agaactcaat gttgacctgg ccgcctccga tatcaagccg 600
gataaaaaac gccatgccgt catcagcggt tccgtccttt acaaccaagc cgagaaaggc 660gtaaaaaac gccatgccgt catcagcggt tccgtccttt acaaccaagc cgagaaaggc 660
agttactctc taggcatctt tggcgggcaa gcccaggaag ttgccggcag cgcagaagtg 720agttactctc taggcatctt tggcgggcaa gccaggaag ttgccggcag cgcagaagtg 720
gaaaccgcaa acggcatacg ccatatcggt cttgccgcca agcagtaa 768gaaaccgcaa acggcatacg ccatatcggt cttgccgcca agcagtaa 768
<210> 10<210> 10
<211> 768<211> 768
<212> ДНК <212> DNA
<213> Neisseria meningitidis (группа B) <213> Neisseria meningitidis (Group B)
<400> 10<400> 10
tgcagcagcg gagggggtgg tgtcgccgcc gacatcggtg cggggcttgc cgatgcacta 60tgcagcagcg gagggggtgg tgtcgccgcc gacatcggtg cggggcttgc cgatgcacta 60
accgcaccgc tcgaccataa agacaaaggt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc 120accgcaccgc tcgaccataa agacaaaggt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc 120
aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggt 180aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggt 180
gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgtttcga ctttatccgc 240gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgtttcga ctttatccgc 240
caaatcgaag tggacgggca gctcattacc ttggagagtg gagagttcca agtatacaaa 300caaatcgaag tggacgggca gctcattacc ttggagagtg gagagttcca agtatacaaa 300
caaagccatt ccgccttaac cgcctttcag accgagcaaa tacaagattc ggagcattcc 360caaagccatt ccgccttaac cgcctttcag accgagcaaa tacaagattc ggagcattcc 360
gggaagatgg ttgcgaaacg ccagttcaga atcggcgaca tagcgggcga acatacatct 420gggaagatgg ttgcgaaacg ccagttcaga atcggcgaca tagcgggcga acatacatct 420
tttgacaagc ttcccgaagg cggcagggcg acatatcgcg ggacggcgtt cggttcagac 480tttgacaagc ttcccgaagg cggcagggcg acatatcgcg ggacggcgtt cggttcagac 480
gatgccggcg gaaaactgac ctacaccata gatttcgccg ccaagcaggg aaacggcaaa 540gatgccggcg gaaaactgac ctacaccata gatttcgccg ccaagcaggg aaacggcaaa 540
atcgaacatt tgaaatcgcc agaactcaat gtcgacctgg ccgccgccga tatcaagccg 600atcgaacatt tgaaatcgcc agaactcaat gtcgacctgg ccgccgccga tatcaagccg 600
gatggaaaac gccatgccgt catcagcggt tccgtccttt acaaccaagc cgagaaaggc 660gatggaaaac gccatgccgt catcagcggt tccgtccttt acaaccaagc cgagaaaggc 660
agttactccc tcggtatctt tggcggaaaa gcccaggaag ttgccggcag cgcggaagtg 720agttactccc tcggtatctt tggcggaaaa gccggaag ttgccggcag cgcggaagtg 720
aaaaccgtaa acggcatacg ccatatcggc cttgccgcca agcaataa 768aaaaccgtaa acggcatacg ccatatcggc cttgccgcca agcaataa 768
<210> 11<210> 11
<211> 792<211> 792
<212> ДНК <212> DNA
<213> Neisseria meningitidis (группа B) <213> Neisseria meningitidis (Group B)
<400> 11<400> 11
tgcagcagcg gaggcggcgg aagcggaggc ggcggtgtcg ccgccgacat cggcgcgggg 60tgcagcagcg gaggcggcgg aagcgggaggc ggcggtgtcg ccgccgacat cggcgcgggg 60
cttgccgatg cactaaccgc accgctcgac cataaagaca aaggtttgaa atccctgaca 120cttgccgatg cactaaccgc accgctcgac cataaagaca aaggtttgaa atccctgaca 120
ttggaagact ccatttccca aaacggaaca ctgaccctgt cggcacaagg tgcggaaaga 180ttggaagact ccatttccca aaacggaaca ctgaccctgt cggcacaagg tgcggaaaga 180
actttcaaag ccggcgacaa agacaacagt ctcaacacag gcaaactgaa gaacgacaaa 240actttcaaag ccggcgacaa agacaacagt ctcaacacag gcaaactgaa gaacgacaaa 240
atcagccgct tcgactttat ccgtcaaatc gaagtggacg ggcagctcat taccttggag 300atcagccgct tcgactttat ccgtcaaatc gaagtggacg ggcagctcat taccttggag 300
agcggagagt tccaagtgta caaacaaagc cattccgcct taaccgccct tcagaccgag 360agcggagagt tccaagtgta caaacaaagc cattccgcct taaccgccct tcagaccgag 360
caagtacaag actcggagca ttccgggaag atggttgcga aacgccagtt cagaatcggc 420caagtacaag actcggagca ttccgggaag atggttgcga aacgccagtt cagaatcggc 420
gacatagtgg gcgaacatac atcttttggc aagcttccca aagacgtcat ggcgacatat 480gacatagtgg gcgaacatac atcttttggc aagcttccca aagacgtcat ggcgacatat 480
cgcgggacgg cgttcggttc agacgatgcc ggcggaaaac tgacctacac catagatttc 540cgcgggacgg cgttcggttc agacgatgcc ggcggaaaac tgacctacac catagatttc 540
gccgccaagc agggacacgg caaaatcgaa catttgaaat cgccagaact caatgttgac 600gccgccaagc agggacacgg caaaatcgaa catttgaaat cgccagaact caatgttgac 600
ctggccgccg ccgatatcaa gccggatgaa aaacaccatg ccgtcatcag cggttccgtc 660ctggccgccg ccgatatcaa gccggatgaa aaacaccatg ccgtcatcag cggttccgtc 660
ctttacaacc aagccgagaa aggcagttac tctctaggca tctttggcgg gcaagcccag 720ctttacaacc aagccgagaa aggcagttac tctctaggca tctttggcgg gcaagcccag 720
gaagttgccg gcagcgcgga agtggaaacc gcaaacggca tacgccatat cggtcttgcc 780gaagttgccg gcagcgcgga agtggaaacc gcaaacggca tacgccatat cggtcttgcc 780
gccaagcaat aa 792gccaagcaat aa 792
<210> 12<210> 12
<211> 259<211> 259
<212> PRT<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (группа B) <213> Neisseria meningitidis (Group B)
<400> 12<400> 12
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Thr Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Thr
1 5 10 15 1 5 10 15
Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly
20 25 30 20 25 30
Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Pro Gln Asn Gly Thr Leu Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Pro Gln Asn Gly Thr Leu
35 40 45 35 40 45
Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Ala Gly Asp Lys Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Ala Gly Asp Lys
50 55 60 50 55 60
Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg
65 70 75 80 65 70 75 80
Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu
85 90 95 85 90 95
Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val
100 105 110 100 105 110
Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu
115 120 125 115 120 125
Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr
130 135 140 130 135 140
Ala Phe Asn Gln Leu Pro Gly Asp Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Ala Phe Asn Gln Leu Pro Gly Asp Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala
145 150 155 160 145 150 155 160
Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe
165 170 175 165 170 175
Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu
180 185 190 180 185 190
Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser
195 200 205 195 200 205
His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly
210 215 220 210 215 220
Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly
225 230 235 240 225 230 235 240
Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala
245 250 255 245 250 255
Gly Lys Gln Gly Lys Gln
<210> 13<210> 13
<211> 261<211> 261
<212> PRT<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (группа B) <213> Neisseria meningitidis (Group B)
<400> 13<400> 13
Cys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Cys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile
1 5 10 15 1 5 10 15
Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp
20 25 30 20 25 30
Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly
35 40 45 35 40 45
Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Val Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Val Gly
50 55 60 50 55 60
Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile
65 70 75 80 65 70 75 80
Ser Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Ser Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile
85 90 95 85 90 95
Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala
100 105 110 100 105 110
Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp
115 120 125 115 120 125
Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu
130 135 140 130 135 140
His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly
145 150 155 160 145 150 155 160
Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile
165 170 175 165 170 175
Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr
180 185 190 180 185 190
Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu
195 200 205 195 200 205
Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu
210 215 220 210 215 220
Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile
225 230 235 240 225 230 235 240
Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly
245 250 255 245 250 255
Ile Ala Gly Lys Gln Ile Ala Gly Lys Gln
260 260
<210> 14<210> 14
<211> 254<211> 254
<212> PRT<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (группа B) <213> Neisseria meningitidis (Group B)
<400> 14<400> 14
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1 5 10 15 1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln
20 25 30 20 25 30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35 40 45 35 40 45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50 55 60 50 55 60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65 70 75 80 65 70 75 80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe
85 90 95 85 90 95
Gln Ile Tyr Lys Gln Asn His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Gln Ile Tyr Lys Gln Asn His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu
100 105 110 100 105 110
Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser
115 120 125 115 120 125
Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu
130 135 140 130 135 140
Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp
145 150 155 160 145 150 155 160
Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly
165 170 175 165 170 175
Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu
180 185 190 180 185 190
Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu
195 200 205 195 200 205
Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala
210 215 220 210 215 220
Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys
225 230 235 240 225 230 235 240
Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln
245 250 245 250
<210> 15<210> 15
<211> 254<211> 254
<212> PRT<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (группа B) <213> Neisseria meningitidis (Group B)
<400> 15<400> 15
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1 5 10 15 1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln
20 25 30 20 25 30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35 40 45 35 40 45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50 55 60 50 55 60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65 70 75 80 65 70 75 80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85 90 95 85 90 95
Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu
100 105 110 100 105 110
Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser
115 120 125 115 120 125
Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu
130 135 140 130 135 140
Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp
145 150 155 160 145 150 155 160
Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly
165 170 175 165 170 175
His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu
180 185 190 180 185 190
Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu
195 200 205 195 200 205
Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala
210 215 220 210 215 220
Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys
225 230 235 240 225 230 235 240
Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln
245 250 245 250
<210> 16<210> 16
<211> 263<211> 263
<212> PRT<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (группа B) <213> Neisseria meningitidis (Group B)
<400> 16<400> 16
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp
1 5 10 15 1 5 10 15
Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys
20 25 30 20 25 30
Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn
35 40 45 35 40 45
Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Arg Thr Phe Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Arg Thr Phe Lys Ala
50 55 60 50 55 60
Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys
65 70 75 80 65 70 75 80
Ile Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu
85 90 95 85 90 95
Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser
100 105 110 100 105 110
Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser
115 120 125 115 120 125
Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Val Gly Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Val Gly
130 135 140 130 135 140
Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr
145 150 155 160 145 150 155 160
Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr
165 170 175 165 170 175
Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu
180 185 190 180 185 190
Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro
195 200 205 195 200 205
Asp Glu Lys His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln
210 215 220 210 215 220
Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln
225 230 235 240 225 230 235 240
Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His
245 250 255 245 250 255
Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
260 260
<210> 17<210> 17
<211> 255<211> 255
<212> PRT<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (группа B) <213> Neisseria meningitidis (Group B)
<400> 17<400> 17
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1 5 10 15 1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln
20 25 30 20 25 30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35 40 45 35 40 45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50 55 60 50 55 60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65 70 75 80 65 70 75 80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85 90 95 85 90 95
Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu
100 105 110 100 105 110
Gln Glu Gln Asp Pro Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Arg Gln Glu Gln Asp Pro Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Arg
115 120 125 115 120 125
Phe Lys Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Phe Lys Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu
130 135 140 130 135 140
Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp
145 150 155 160 145 150 155 160
Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln
165 170 175 165 170 175
Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Glu Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Glu
180 185 190 180 185 190
Leu Ala Thr Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys His His Ala Val Ile Leu Ala Thr Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys His His Ala Val Ile
195 200 205 195 200 205
Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu
210 215 220 210 215 220
Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val
225 230 235 240 225 230 235 240
Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245 250 255 245 250 255
<210> 18<210> 18
<211> 255<211> 255
<212> PRT<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (группа B) <213> Neisseria meningitidis (Group B)
<400> 18<400> 18
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1 5 10 15 1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln
20 25 30 20 25 30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35 40 45 35 40 45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50 55 60 50 55 60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65 70 75 80 65 70 75 80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Lys Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Glu Val Asp Gly Lys Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85 90 95 85 90 95
Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu
100 105 110 100 105 110
Gln Val Gln Asp Ser Glu Asp Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Gln Val Gln Asp Ser Glu Asp Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln
115 120 125 115 120 125
Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu
130 135 140 130 135 140
Pro Lys Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Pro Lys Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp
145 150 155 160 145 150 155 160
Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln
165 170 175 165 170 175
Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Glu Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Glu
180 185 190 180 185 190
Leu Ala Thr Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys Arg His Ala Val Ile Leu Ala Thr Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys Arg His Ala Val Ile
195 200 205 195 200 205
Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu
210 215 220 210 215 220
Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val
225 230 235 240 225 230 235 240
Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245 250 255 245 250 255
<210> 19<210> 19
<211> 255<211> 255
<212> PRT<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (группа B) <213> Neisseria meningitidis (Group B)
<400> 19<400> 19
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Val Leu Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Val Leu
1 5 10 15 1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln
20 25 30 20 25 30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35 40 45 35 40 45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50 55 60 50 55 60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65 70 75 80 65 70 75 80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85 90 95 85 90 95
Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu
100 105 110 100 105 110
Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln
115 120 125 115 120 125
Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu
130 135 140 130 135 140
Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp
145 150 155 160 145 150 155 160
Asp Ala Ser Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Asp Ala Ser Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln
165 170 175 165 170 175
Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp
180 185 190 180 185 190
Leu Ala Ala Ser Asp Ile Lys Pro Asp Lys Lys Arg His Ala Val Ile Leu Ala Ala Ser Asp Ile Lys Pro Asp Lys Lys Arg His Ala Val Ile
195 200 205 195 200 205
Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu
210 215 220 210 215 220
Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val
225 230 235 240 225 230 235 240
Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245 250 255 245 250 255
<210> 20<210> 20
<211> 255<211> 255
<212> PRT<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (группа B) <213> Neisseria meningitidis (Group B)
<400> 20<400> 20
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1 5 10 15 1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln
20 25 30 20 25 30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35 40 45 35 40 45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50 55 60 50 55 60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65 70 75 80 65 70 75 80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85 90 95 85 90 95
Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu
100 105 110 100 105 110
Gln Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Gln Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln
115 120 125 115 120 125
Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu
130 135 140 130 135 140
Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp
145 150 155 160 145 150 155 160
Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln
165 170 175 165 170 175
Gly Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Gly Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp
180 185 190 180 185 190
Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile
195 200 205 195 200 205
Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu
210 215 220 210 215 220
Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val
225 230 235 240 225 230 235 240
Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245 250 255 245 250 255
<210> 21<210> 21
<211> 263<211> 263
<212> PRT<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (группа B) <213> Neisseria meningitidis (Group B)
<400> 21<400> 21
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp
1 5 10 15 1 5 10 15
Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys
20 25 30 20 25 30
Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn
35 40 45 35 40 45
Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Arg Thr Phe Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Arg Thr Phe Lys Ala
50 55 60 50 55 60
Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys
65 70 75 80 65 70 75 80
Ile Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu
85 90 95 85 90 95
Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser
100 105 110 100 105 110
Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser
115 120 125 115 120 125
Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Val Gly Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Val Gly
130 135 140 130 135 140
Glu His Thr Ser Phe Gly Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Glu His Thr Ser Phe Gly Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr
145 150 155 160 145 150 155 160
Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr
165 170 175 165 170 175
Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu
180 185 190 180 185 190
Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro
195 200 205 195 200 205
Asp Glu Lys His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln
210 215 220 210 215 220
Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln
225 230 235 240 225 230 235 240
Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His
245 250 255 245 250 255
Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
260 260
<210> 22<210> 22
<211> 26<211> 26
<212> ДНК <212> DNA
<213> Искусственная <213> Artificial
<220><220>
<223> Синтетическая нуклеотидная последовательность: прямой праймер <223> Synthetic nucleotide sequence: forward primer
<400> 22<400> 22
tgccatatga gcagcggaag cggaag 26tgccatatga gcagcggaag cggaag 26
<210> 23<210> 23
<211> 27<211> 27
<212> ДНК <212> DNA
<213> Искусственная <213> Artificial
<220><220>
<223> Синтетическая нуклеотидная последовательность: обратный праймер <223> Synthetic nucleotide sequence: reverse primer
<400> 23<400> 23
cggatcccta ctgtttgccg gcgatgc 27cggatcccta ctgtttgccg gcgatgc 27
<210> 24<210> 24
<211> 49<211> 49
<212> ДНК <212> DNA
<213> Искусственная <213> Artificial
<220><220>
<223> Синтетическая нуклеотидная последовательность: прямой праймер <223> Synthetic nucleotide sequence: forward primer
<400> 24<400> 24
tttcttcccg ggaaggagat atacatatgt gcagcagcgg aggcggcgg 49tttcttcccg ggaaggagat atacatatgt gcagcagcgg aggcggcgg 49
<210> 25<210> 25
<211> 38<211> 38
<212> ДНК <212> DNA
<213> Искусственная <213> Artificial
<220><220>
<223> Синтетическая нуклеотидная последовательность: обратный праймер <223> Synthetic nucleotide sequence: reverse primer
<400> 25<400> 25
tttcttgctc agcattattg cttggcggca agaccgat 38ttttcttgctc agcattattg cttggcggca agaccgat 38
<210> 26<210> 26
<211> 46<211> 46
<212> ДНК <212> DNA
<213> Искусственная <213> Artificial
<220><220>
<223> Синтетическая нуклеотидная последовательность: прямой праймер <223> Synthetic nucleotide sequence: forward primer
<400> 26<400> 26
tttcttcccg ggaaggagat atacatatga gcagcggagg cggcgg 46tttcttcccg ggaaggagat atacatatga gcagcggagg cggcgg 46
<210> 27<210> 27
<211> 38<211> 38
<212> ДНК <212> DNA
<213> Искусственная <213> Artificial
<220><220>
<223> Синтетическая нуклеотидная последовательность: обратный праймер <223> Synthetic nucleotide sequence: reverse primer
<400> 27<400> 27
tttcttgctc agcattattg cttggcggca agaccgat 38ttttcttgctc agcattattg cttggcggca agaccgat 38
<210> 28<210> 28
<211> 36<211> 36
<212> ДНК <212> DNA
<213> Искусственная <213> Artificial
<220><220>
<223> Синтетическая нуклеотидная последовательность <223> Synthetic nucleotide sequence
<400> 28<400> 28
atgagctctg gaggtggagg aagcgggggc ggtgga 36atgagctctg gaggtggagg aagcgggggc ggtgga 36
<210> 29<210> 29
<211> 12<211> 12
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная <213> Artificial
<220><220>
<223> Синтетическая аминокислотная последовательность <223> Synthetic amino acid sequence
<400> 29<400> 29
Met Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Met Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 1 5 10
<210> 30<210> 30
<211> 33<211> 33
<212> ДНК <212> DNA
<213> Искусственная <213> Artificial
<220><220>
<223> Синтетическая нуклеотидная последовательность <223> Synthetic nucleotide sequence
<400> 30<400> 30
atgagctctg gaagcggaag cgggggcggt gga 33atgagctctg gaagcggaag cggggggcggt gga 33
<210> 31<210> 31
<211> 11<211> 11
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная <213> Artificial
<220><220>
<223> Синтетическая аминокислотная последовательность <223> Synthetic amino acid sequence
<400> 31<400> 31
Met Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Met Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 1 5 10
<210> 32<210> 32
<211> 21<211> 21
<212> ДНК <212> DNA
<213> Искусственная <213> Artificial
<220><220>
<223> Синтетическая нуклеотидная последовательность <223> Synthetic nucleotide sequence
<400> 32<400> 32
atgagctctg gaggtggagg a 21atgagctctg gaggtggagg a 21
<210> 33<210> 33
<211> 7<211> 7
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная <213> Artificial
<220><220>
<223> Синтетическая аминокислотная последовательность <223> Synthetic amino acid sequence
<400> 33<400> 33
Met Ser Ser Gly Gly Gly Gly Met Ser Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 fifteen
<210> 34<210> 34
<211> 21<211> 21
<212> ДНК <212> DNA
<213> Искусственная <213> Artificial
<220><220>
<223> Синтетическая нуклеотидная последовательность <223> Synthetic nucleotide sequence
<400> 34<400> 34
atgagcagcg ggggcggtgg a 21atgagcagcg ggggcggtgg a 21
<210> 35<210> 35
<211> 28<211> 28
<212> PRT<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (группа B) <213> Neisseria meningitidis (Group B)
<400> 35<400> 35
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr Ala Asp Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr Ala Asp
1 5 10 15 1 5 10 15
Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
20 25 20 25
<210> 36<210> 36
<211> 28<211> 28
<212> PRT<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (группа B) <213> Neisseria meningitidis (Group B)
<400> 36<400> 36
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp
1 5 10 15 1 5 10 15
Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
20 25 20 25
<210> 37<210> 37
<211> 27<211> 27
<212> PRT<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (группа B) <213> Neisseria meningitidis (Group B)
<400> 37<400> 37
Cys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Cys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile
1 5 10 15 1 5 10 15
Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
20 25 20 25
<210> 38<210> 38
<211> 23<211> 23
<212> PRT<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (группа B) <213> Neisseria meningitidis (Group B)
<400> 38<400> 38
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1 5 10 15 1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
20 twenty
<210> 39<210> 39
<211> 23<211> 23
<212> PRT<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (группа B) <213> Neisseria meningitidis (Group B)
<400> 39<400> 39
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Val Leu Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Val Leu
1 5 10 15 1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
20 twenty
<210> 40<210> 40
<211> 23<211> 23
<212> PRT<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (группа B) <213> Neisseria meningitidis (Group B)
<400> 40<400> 40
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1 5 10 15 1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
20 twenty
<210> 41<210> 41
<211> 15<211> 15
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная <213> Artificial
<220><220>
<223> Синтетическая аминокислотная последовательность <223> Synthetic amino acid sequence
<220><220>
<221> ДРУГИЕ ОСОБЕННОСТИ <221> OTHER FEATURES
<222> (15)..(15)<222> (15)..(15)
<223> X является G или V <223> X is G or V
<400> 41<400> 41
Met Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Xaa Met Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Xaa
1 5 10 15 1 5 10 15
<210> 42<210> 42
<211> 45<211> 45
<212> ДНК <212> DNA
<213> Искусственная <213> Artificial
<220><220>
<223> Синтетическая нуклеотидная последовательность <223> Synthetic nucleotide sequence
<400> 42<400> 42
atgagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cgggg 45atgagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cgggg 45
<210> 43<210> 43
<211> 789<211> 789
<212> ДНК <212> DNA
<213> Искусственная <213> Artificial
<220><220>
<223> Синтетическая нуклеотидная последовательность <223> Synthetic nucleotide sequence
<400> 43<400> 43
agctctggag gtggaggaag cgggggcggt ggagttgcag cagacattgg agcaggatta 60agctctggag gtggaggaag cgggggcggt ggagttgcag cagacattgg agcaggatta 60
gcagatgcac tgacggcacc gttggatcat aaagacaaag gcttgaaatc gcttacctta 120gcagatgcac tgacggcacc gttggatcat aaagacaaag gcttgaaatc gcttacctta 120
gaagattcta tttcacaaaa tggcaccctt accttgtccg cgcaaggcgc tgaacgtact 180gaagattcta tttcacaaaa tggcaccctt accttgtccg cgcaaggcgc tgaacgtact 180
tttaaagccg gtgacaaaga taatagctta aatacaggta aactcaaaaa tgataaaatc 240tttaaagccg gtgacaaaga taatagctta aatacaggta aactcaaaaa tgataaaatc 240
tcgcgttttg atttcattcg tcaaatcgaa gtagatggcc aacttattac attagaaagc 300tcgcgttttg atttcattcg tcaaatcgaa gtagatggcc aacttattac attagaaagc 300
ggtgaattcc aagtatataa acaatcccat tcagcactta cagcattgca aaccgaacag 360ggtgaattcc aagtatataa acaatcccat tcagcactta cagcattgca aaccgaacag 360
gtccaagact cagaacattc cggcaaaatg gtagctaaac gtcaattccg catcggtgac 420gtccaagact cagaacattc cggcaaaatg gtagctaaac gtcaattccg catcggtgac 420
attgtcggtg aacatacaag cttcggaaaa ttaccaaaag atgtgatggc gacctatcgc 480attgtcggtg aacatacaag cttcggaaaa ttaccaaaag atgtgatggc gacctatcgc 480
ggtacggcat ttggatcaga tgatgcaggc ggtaaattaa cttatacaat tgactttgca 540ggtacggcat ttggatcaga tgatgcaggc ggtaaattaa cttatacaat tgactttgca 540
gcaaaacaag gacatggcaa aattgaacat ttaaaatctc ccgaacttaa cgtagatctc 600gcaaaacaag gacatggcaa aattgaacat ttaaaatctc ccgaacttaa cgtagatctc 600
gcagcagcag atattaaacc agatgaaaaa caccacgcag tcatttcagg ttcagtttta 660gcagcagcag atattaaacc agatgaaaaa caccacgcag tcatttcagg ttcagtttta 660
tacaatcagg cagaaaaagg ttcgtactct ttaggtattt ttggcgggca agctcaagaa 720tacaatcagg cagaaaaagg ttcgtactct ttaggtattt ttggcggggca agctcaagaa 720
gttgcaggta gcgcagaagt agaaacggca aatggcattc gtcacattgg gttagcggcg 780gttgcaggta gcgcagaagt agaaacggca aatggcattc gtcacattgg gttagcggcg 780
aaacaataa 789aaacaataa 789
<210> 44<210> 44
<211> 262<211> 262
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная <213> Artificial
<220><220>
<223> Синтетическая аминокислотная последовательность <223> Synthetic amino acid sequence
<400> 44<400> 44
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile
1 5 10 15 1 5 10 15
Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp
20 25 30 20 25 30
Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly
35 40 45 35 40 45
Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Arg Thr Phe Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Arg Thr Phe Lys Ala Gly
50 55 60 50 55 60
Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile
65 70 75 80 65 70 75 80
Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile
85 90 95 85 90 95
Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala
100 105 110 100 105 110
Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly
115 120 125 115 120 125
Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Val Gly Glu Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Val Gly Glu
130 135 140 130 135 140
His Thr Ser Phe Gly Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg His Thr Ser Phe Gly Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg
145 150 155 160 145 150 155 160
Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr
165 170 175 165 170 175
Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys
180 185 190 180 185 190
Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp
195 200 205 195 200 205
Glu Lys His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala
210 215 220 210 215 220
Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu
225 230 235 240 225 230 235 240
Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His Ile Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His Ile
245 250 255 245 250 255
Gly Leu Ala Ala Lys Gln Gly Leu Ala Ala Lys Gln
260 260
<210> 45<210> 45
<211> 780<211> 780
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная <213> Artificial
<220><220>
<223> Синтетическая нуклеотидная последовательность <223> Synthetic nucleotide sequence
<400> 45<400> 45
agctctggag gtggaggaag cgggggcggt ggagttgcag cagacattgg agcaggatta 60agctctggag gtggaggaag cgggggcggt ggagttgcag cagacattgg agcaggatta 60
gcagatgcac tgacggcacc gttggatcat aaagacaaag gcttgcagtc gcttacctta 120gcagatgcac tgacggcacc gttggatcat aaagacaaag gcttgcagtc gcttacctta 120
gatcagtctg tcaggaaaaa tgagaaactt aagttggcgg cgcaaggcgc tgaaaaaact 180gatcagtctg tcaggaaaaa tgagaaactt aagttggcgg cgcaaggcgc tgaaaaaact
tatggaaacg gtgacagctt aaatacaggt aaactcaaaa atgataaagt ctcgcgtttt 240tatggaaacg gtgacagctt aaatacaggt aaactcaaaa atgataaagt ctcgcgtttt 240
gatttcattc gtcaaatcga agtagatggc aagcttatta cattagaaag cggtgaattc 300gatttcattc gtcaaatcga agtagatggc aagcttatta cattagaaag cggtgaattc 300
caagtatata aacaatccca ttcagcactt acagcattgc aaaccgaaca ggtccaagac 360360
tcagaagatt ccggcaaaat ggtagctaaa cgtcaattcc gcatcggtga cattgcgggt 420tcagaagatt ccggcaaaat ggtagctaaa cgtcaattcc gcatcggtga cattgcgggt 420
gaacatacaa gcttcgacaa attaccaaaa ggcggcagtg cgacctatcg cggtacggca 480gaacatacaa gcttcgacaa attaccaaaa ggcggcagtg cgacctatcg cggtacggca 480
tttggatcag atgatgcagg cggtaaatta acttatacaa ttgactttgc agcaaaacaa 540tttggatcag atgatgcagg cggtaaatta acttatacaa ttgactttgc agcaaaaacaa 540
ggacatggca aaattgaaca tttaaaatct cccgaactta acgtagagct cgcaaccgca 600ggacatggca aaattgaaca tttaaaatct cccgaactta acgtagagct cgcaaccgca 600
tatattaaac cagatgaaaa acgccacgca gtcatttcag gttcagtttt atacaatcag 660tatattaaac cagatgaaaa acgccacgca gtcatttcag gttcagtttt atacaatcag 660
gacgaaaaag gttcgtactc tttaggtatt tttggcgggc aagctcaaga agttgcaggt 720gacgaaaaag gttcgtactc tttaggtatt tttggcgggc aagctcaaga agttgcaggt 720
agcgcagaag tagaaacggc aaatggcatt caccacattg ggttagcggc gaaacaataa 780agcgcagaag tagaaacggc aaatggcatt caccacattg ggttagcggc gaaacaataa 780
<210> 46<210> 46
<211> 765<211> 765
<212> ДНК <212> DNA
<213> Искусственная <213> Artificial
<220><220>
<223> Синтетическая нуклеотидная последовательность <223> Synthetic nucleotide sequence
<400> 46<400> 46
agctctggag gtggaggagt tgcagcagac attggagcag gattagcaga tgcactgacg 60agctctggag gtggaggagt tgcagcagac attggagcag gattagcaga tgcactgacg 60
gcaccgttgg atcataaaga caaaggcttg cagtcgctta ccttagatca gtctgtcagg 120gcaccgttgg atcataaaga caaaggcttg cagtcgctta ccttagatca gtctgtcagg 120
aaaaatgaga aacttaagtt ggcggcgcaa ggcgctgaaa aaacttatgg aaacggtgac 180aaaaatgaga aacttaagtt ggcggcgcaa ggcgctgaaa aaacttatgg aaacggtgac 180
agcttaaata caggtaaact caaaaatgat aaagtctcgc gttttgattt cattcgtcaa 240agcttaaata caggtaaact caaaaatgat aaagtctcgc gttttgattt cattcgtcaa 240
atcgaagtag atggcaagct tattacatta gaaagcggtg aattccaagt atataaacaa 300atcgaagtag atggcaagct tattacatta gaaagcggtg aattccaagt atataaacaa 300
tcccattcag cacttacagc attgcaaacc gaacaggtcc aagactcaga agattccggc 360tcccattcag cacttacagc attgcaaacc gaacaggtcc aagactcaga agattccggc 360
aaaatggtag ctaaacgtca attccgcatc ggtgacattg cgggtgaaca tacaagcttc 420aaaatggtag ctaaacgtca attccgcatc ggtgacattg cgggtgaaca tacaagcttc 420
gacaaattac caaaaggcgg cagtgcgacc tatcgcggta cggcatttgg atcagatgat 480gacaaattac caaaaggcgg cagtgcgacc tatcgcggta cggcatttgg atcagatgat 480
gcaggcggta aattaactta tacaattgac tttgcagcaa aacaaggaca tggcaaaatt 540540
gaacatttaa aatctcccga acttaacgta gagctcgcaa ccgcatatat taaaccagat 600gaacatttaa aatctcccga acttaacgta gagctcgcaa ccgcatatat taaaccagat 600
gaaaaacgcc acgcagtcat ttcaggttca gttttataca atcaggacga aaaaggttcg 660gaaaaacgcc acgcagtcat ttcaggttca gttttataca atcaggacga aaaaggttcg 660
tactctttag gtatttttgg cgggcaagct caagaagttg caggtagcgc agaagtagaa 720tactctttag gtatttttgg cgggcaagct caagaagttg caggtagcgc agaagtagaa 720
acggcaaatg gcattcacca cattgggtta gcggcgaaac aataa 765acggcaaatg gcattcacca cattgggtta gcggcgaaac aataa 765
<210> 47<210> 47
<211> 765<211> 765
<212> ДНК <212> DNA
<213> Искусственная <213> Artificial
<220><220>
<223> Синтетическая нуклеотидная последовательность <223> Synthetic nucleotide sequence
<400> 47<400> 47
agcagcgggg gcggtggagt tgcagcagac attggagcag gattagcaga tgcactgacg 60agcagcgggg gcggtggagt tgcagcagac attggagcag gattagcaga tgcactgacg 60
gcaccgttgg atcataaaga caaaggcttg cagtcgctta ccttagatca gtctgtcagg 120gcaccgttgg atcataaaga caaaggcttg cagtcgctta ccttagatca gtctgtcagg 120
aaaaatgaga aacttaagtt ggcggcgcaa ggcgctgaaa aaacttatgg aaacggtgac 180aaaaatgaga aacttaagtt ggcggcgcaa ggcgctgaaa aaacttatgg aaacggtgac 180
agcttaaata caggtaaact caaaaatgat aaagtctcgc gttttgattt cattcgtcaa 240agcttaaata caggtaaact caaaaatgat aaagtctcgc gttttgattt cattcgtcaa 240
atcgaagtag atggcaagct tattacatta gaaagcggtg aattccaagt atataaacaa 300atcgaagtag atggcaagct tattacatta gaaagcggtg aattccaagt atataaacaa 300
tcccattcag cacttacagc attgcaaacc gaacaggtcc aagactcaga agattccggc 360tcccattcag cacttacagc attgcaaacc gaacaggtcc aagactcaga agattccggc 360
aaaatggtag ctaaacgtca attccgcatc ggtgacattg cgggtgaaca tacaagcttc 420aaaatggtag ctaaacgtca attccgcatc ggtgacattg cgggtgaaca tacaagcttc 420
gacaaattac caaaaggcgg cagtgcgacc tatcgcggta cggcatttgg atcagatgat 480gacaaattac caaaaggcgg cagtgcgacc tatcgcggta cggcatttgg atcagatgat 480
gcaggcggta aattaactta tacaattgac tttgcagcaa aacaaggaca tggcaaaatt 540540
gaacatttaa aatctcccga acttaacgta gagctcgcaa ccgcatatat taaaccagat 600gaacatttaa aatctcccga acttaacgta gagctcgcaa ccgcatatat taaaccagat 600
gaaaaacgcc acgcagtcat ttcaggttca gttttataca atcaggacga aaaaggttcg 660gaaaaacgcc acgcagtcat ttcaggttca gttttataca atcaggacga aaaaggttcg 660
tactctttag gtatttttgg cgggcaagct caagaagttg caggtagcgc agaagtagaa 720tactctttag gtatttttgg cgggcaagct caagaagttg caggtagcgc agaagtagaa 720
acggcaaatg gcattcacca cattgggtta gcggcgaaac aataa 765acggcaaatg gcattcacca cattgggtta gcggcgaaac aataa 765
<210> 48<210> 48
<211> 765<211> 765
<212> ДНК <212> DNA
<213> Искусственная <213> Artificial
<220><220>
<223> Синтетическая нуклеотидная последовательность <223> Synthetic nucleotide sequence
<400> 48<400> 48
agcagcggag ggggcggtgt cgccgccgac atcggtgcgg ggcttgccga tgcactaacc 60agcagcggag ggggcggtgt cgccgccgac atcggtgcgg ggcttgccga tgcactaacc 60
gcaccgctcg accataaaga caaaggtttg cagtctttaa cactggatca gtccgtcagg 120gcaccgctcg accataaaga caaaggtttg cagtctttaa cactggatca gtccgtcagg 120
aaaaacgaga aactgaagct ggcggcacaa ggtgcggaaa aaacttatgg aaacggcgac 180aaaaacgaga aactgaagct ggcggcacaa ggtgcggaaa aaacttatgg aaacggcgac 180
agccttaata cgggcaaatt gaagaacgac aaggtcagcc gcttcgactt tatccgtcaa 240agccttaata cgggcaaatt gaagaacgac aaggtcagcc gcttcgactt tatccgtcaa 240
atcgaagtgg acgggaagct cattaccttg gagagcggag agttccaagt gtacaaacaa 300atcgaagtgg acgggaagct cattaccttg gagagcggag agttccaagt gtacaaacaa 300
agccattccg ccttaaccgc ccttcagacc gagcaagtac aagactcgga ggattccggg 360agccattccg ccttaaccgc ccttcagacc gagcaagtac aagactcgga ggattccggg 360
aagatggttg cgaaacgcca gttcagaatc ggcgacatag cgggcgaaca tacatctttt 420aagatggttg cgaaacgcca gttcagaatc ggcgacatag cgggcgaaca tacatctttt 420
gacaagcttc ccaaaggcgg cagtgcgaca tatcgcggga cggcgttcgg ttcagacgat 480gacaagcttc ccaaaggcgg cagtgcgaca tatcgcggga cggcgttcgg ttcagacgat 480
gctggcggaa aactgaccta tactatagat ttcgccgcca agcagggaca cggcaaaatc 540gctggcggaa aactgaccta tactatagat ttcgccgcca agcagggaca cggcaaaatc 540
gaacatttga aatcgcccga actcaatgtc gagcttgcca ccgcctatat caagccggat 600gaacatttga aatcgcccga actcaatgtc gagcttgcca ccgcctatat caagccggat 600
gaaaaacgcc atgccgttat cagcggttcc gtcctttaca accaagacga gaaaggcagt 660660
tactccctcg gtatctttgg cgggcaagcc caggaagttg ccggcagcgc ggaagtggaa 720tactccctcg gtatctttgg cgggcaagcc caggaagttg ccggcagcgc ggaagtggaa 720
accgcaaacg gcatacacca tatcggtctt gccgccaagc agtaa 765accgcaaacg gcatacacca tatcggtctt gccgccaagc agtaa 765
<210> 49<210> 49
<211> 254<211> 254
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная <213> Artificial
<220><220>
<223> Синтетическая аминокислотная последовательность <223> Synthetic amino acid sequence
<400> 49<400> 49
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala
1 5 10 15 1 5 10 15
Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser
20 25 30 20 25 30
Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala
35 40 45 35 40 45
Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr
50 55 60 50 55 60
Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln
65 70 75 80 65 70 75 80
Ile Glu Val Asp Gly Lys Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Glu Val Asp Gly Lys Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln
85 90 95 85 90 95
Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln
100 105 110 100 105 110
Val Gln Asp Ser Glu Asp Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Val Gln Asp Ser Glu Asp Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe
115 120 125 115 120 125
Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro
130 135 140 130 135 140
Lys Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Lys Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp
145 150 155 160 145 150 155 160
Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly
165 170 175 165 170 175
His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Glu Leu His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Glu Leu
180 185 190 180 185 190
Ala Thr Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys Arg His Ala Val Ile Ser Ala Thr Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys Arg His Ala Val Ile Ser
195 200 205 195 200 205
Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly
210 215 220 210 215 220
Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu
225 230 235 240 225 230 235 240
Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245 250 245 250
<210> 50<210> 50
<211> 259<211> 259
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная <213> Artificial
<220><220>
<223> Синтетическая аминокислотная последовательность <223> Synthetic amino acid sequence
<400> 50<400> 50
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile
1 5 10 15 1 5 10 15
Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp
20 25 30 20 25 30
Lys Gly Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Gly Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu
35 40 45 35 40 45
Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly
50 55 60 50 55 60
Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe
65 70 75 80 65 70 75 80
Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Lys Leu Ile Thr Leu Glu Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Lys Leu Ile Thr Leu Glu
85 90 95 85 90 95
Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala
100 105 110 100 105 110
Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu Asp Ser Gly Lys Met Val Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu Asp Ser Gly Lys Met Val
115 120 125 115 120 125
Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser
130 135 140 130 135 140
Phe Asp Lys Leu Pro Lys Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Asp Lys Leu Pro Lys Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala
145 150 155 160 145 150 155 160
Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe
165 170 175 165 170 175
Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu
180 185 190 180 185 190
Leu Asn Val Glu Leu Ala Thr Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys Arg Leu Asn Val Glu Leu Ala Thr Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys Arg
195 200 205 195 200 205
His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly
210 215 220 210 215 220
Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly
225 230 235 240 225 230 235 240
Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Ala Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Ala
245 250 255 245 250 255
Ala Lys Gln Ala Lys Gln
<210> 51<210> 51
<211> 789<211> 789
<212> ДНК <212> DNA
<213> Искусственная <213> Artificial
<220><220>
<223> Синтетическая нуклеотидная последовательность <223> Synthetic nucleotide sequence
<400> 51<400> 51
agcagcggag gcggcggaag cggaggcggc ggtgtcgccg ccgacatcgg cgcggggctt 60agcagcggag gcggcggaag cggaggcggc ggtgtcgccg ccgacatcgg cgcggggctt 60
gccgatgcac taaccgcacc gctcgaccat aaagacaaag gtttgaaatc cctgacattg 120gccgatgcac taaccgcacc gctcgaccat aaagacaaag gtttgaaatc cctgacattg 120
gaagactcca tttcccaaaa cggaacactg accctgtcgg cacaaggtgc ggaaagaact 180gaagactcca tttcccaaaa cggaacactg accctgtcgg cacaaggtgc ggaaagaact 180
ttcaaagccg gcgacaaaga caacagtctc aacacaggca aactgaagaa cgacaaaatc 240ttcaaagccg gcgacaaaga caacagtctc aacacaggca aactgaagaa cgacaaaatc 240
agccgcttcg actttatccg tcaaatcgaa gtggacgggc agctcattac cttggagagc 300agccgcttcg actttatccg tcaaatcgaa gtggacgggc agctcattac cttggagagc 300
ggagagttcc aagtgtacaa acaaagccat tccgccttaa ccgcccttca gaccgagcaa 360ggagagttcc aagtgtacaa acaaagccat tccgccttaa ccgcccttca gaccgagcaa 360
gtacaagact cggagcattc cgggaagatg gttgcgaaac gccagttcag aatcggcgac 420gtacaagact cggagcattc cgggaagatg gttgcgaaac gccagttcag aatcggcgac 420
atagtgggcg aacatacatc ttttggcaag cttcccaaag acgtcatggc gacatatcgc 480atagtgggcg aacatacatc ttttggcaag cttcccaaag acgtcatggc gacatatcgc 480
gggacggcgt tcggttcaga cgatgccggc ggaaaactga cctacaccat agatttcgcc 540gggacggcgt tcggttcaga cgatgccggc ggaaaactga cctacaccat agatttcgcc 540
gccaagcagg gacacggcaa aatcgaacat ttgaaatcgc cagaactcaa tgttgacctg 600gccaagcagg gacacggcaa aatcgaacat ttgaaatcgc cagaactcaa tgttgacctg 600
gccgccgccg atatcaagcc ggatgaaaaa caccatgccg tcatcagcgg ttccgtcctt 660gccgccgccg atatcaagcc ggatgaaaaa caccatgccg tcatcagcgg ttccgtcctt 660
tacaaccaag ccgagaaagg cagttactct ctaggcatct ttggcgggca agcccaggaa 720tacaaccaag ccgagaaagg cagttactct ctaggcatct ttggcgggca agccggaa 720
gttgccggca gcgcggaagt ggaaaccgca aacggcatac gccatatcgg tcttgccgcc 780gttgccggca gcgcggaagt ggaaaccgca aacggcatac gccatatcgg tcttgccgcc 780
aagcaataa 789aagcaataa 789
<210> 52<210> 52
<211> 45<211> 45
<212> ДНК <212> DNA
<213> Искусственная <213> Artificial
<220><220>
<223> Синтетическая нуклеотидная последовательность <223> Synthetic nucleotide sequence
<400> 52<400> 52
atgagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cggtg 45atgagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cggtg 45
<210> 53<210> 53
<211> 45<211> 45
<212> ДНК <212> DNA
<213> Искусственная <213> Artificial
<220><220>
<223> Синтетическая нуклеотидная последовательность <223> Synthetic nucleotide sequence
<400> 53<400> 53
atgagcagcg gagggggcgg tgtcgccgcc gacatcggtg cgggg 45atgagcagcg gagggggcgg tgtcgccgcc gacatcggtg cgggg 45
<210> 54<210> 54
<211> 783<211> 783
<212> ДНК <212> DNA
<213> Искусственная <213> Artificial
<220><220>
<223> Синтетическая нуклеотидная последовательность <223> Synthetic nucleotide sequence
<400> 54<400> 54
agcagcggaa gcggaagcgg aggcggcggt gtcgccgccg acatcggcac agggcttgcc 60agcagcggaa gcggaagcgg aggcggcggt gtcgccgccg acatcggcac agggcttgcc 60
gatgcactaa ctgcgccgct cgaccataaa gacaaaggtt tgaaatccct gacattggaa 120gatgcactaa ctgcgccgct cgaccataaa gacaaaggtt tgaaatccct gacattggaa 120
gactccattt cccaaaacgg aacactgacc ctgtcggcac aaggtgcgga aaaaactttc 180gactccattt cccaaaacgg aacactgacc ctgtcggcac aaggtgcgga aaaaactttc 180
aaagtcggcg acaaagacaa cagtctcaat acaggcaaat tgaagaacga caaaatcagc 240aaagtcggcg acaaagacaa cagtctcaat acaggcaaat tgaagaacga caaaatcagc 240
cgcttcgact ttgtgcaaaa aatcgaagtg gacggacaaa ccatcacgct ggcaagcggc 300cgcttcgact ttgtgcaaaa aatcgaagtg gacggacaaa ccatcacgct ggcaagcggc 300
gaatttcaaa tatacaaaca ggaccactcc gccgtcgttg ccctacagat tgaaaaaatc 360gaatttcaaa tatacaaaca ggaccactcc gccgtcgttg ccctacagat tgaaaaaatc 360
aacaaccccg acaaaatcga cagcctgata aaccaacgct ccttccttgt cagcggtttg 420aacaaccccg acaaaatcga cagcctgata aaccaacgct ccttccttgt cagcggtttg 420
ggcggagaac ataccgcctt caaccaactg cccagcggca aagccgagta tcacggcaaa 480ggcggagaac ataccgcctt caaccaactg cccagcggca aagccgagta tcacggcaaa 480
gcattcagct ccgacgatgc cggcggaaaa ctgacctata ccatagattt tgccgccaaa 540gcattcagct ccgacgatgc cggcggaaaa ctgacctata ccatagattt tgccgccaaa 540
cagggacacg gcaaaatcga acacctgaaa acacccgagc agaatgtcga gcttgcctcc 600cagggacacg gcaaaatcga acacctgaaa acacccgagc agaatgtcga gcttgcctcc 600
gccgaactca aagcagatga aaaatcacac gccgtcattt tgggcgacac gcgctacggc 660gccgaactca aagcagatga aaaatcacac gccgtcattt tgggcgacac gcgctacggc 660
agcgaagaaa aaggcactta ccacctcgct cttttcggcg accgagccca agaaatcgcc 720agcgaagaaa aaggcactta ccacctcgct cttttcggcg accgagccca agaaatcgcc 720
ggctcggcaa ccgtgaagat aagggaaaag gttcacgaaa tcggcatcgc cggcaaacag 780ggctcggcaa ccgtgaagat aagggaaaag gttcacgaaa tcggcatcgc cggcaaacag 780
tag 783Tag 783
<210> 55<210> 55
<211> 260<211> 260
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная <213> Artificial
<220><220>
<223> Синтетическая аминокислотная последовательность <223> Synthetic amino acid sequence
<400> 55<400> 55
Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys
20 25 30 20 25 30
Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly Thr Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly Thr
35 40 45 35 40 45
Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Val Gly Asp Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Val Gly Asp
50 55 60 50 55 60
Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser
65 70 75 80 65 70 75 80
Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr
85 90 95 85 90 95
Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val
100 105 110 100 105 110
Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser
115 120 125 115 120 125
Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His
130 135 140 130 135 140
Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys
145 150 155 160 145 150 155 160
Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp
165 170 175 165 170 175
Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro
180 185 190 180 185 190
Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys
195 200 205 195 200 205
Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys
210 215 220 210 215 220
Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala
225 230 235 240 225 230 235 240
Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile
245 250 255 245 250 255
Ala Gly Lys Gln Ala Gly Lys Gln
260 260
<210> 56<210> 56
<211> 5<211> 5
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная <213> Artificial
<220><220>
<223> Синтетическая аминокислотная последовательность <223> Synthetic amino acid sequence
<400> 56<400> 56
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 fifteen
<210> 57<210> 57
<211> 259<211> 259
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная <213> Artificial
<220><220>
<223> Синтетическая аминокислотная последовательность <223> Synthetic amino acid sequence
<400> 57<400> 57
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr Ala Asp Ile Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr Ala Asp Ile
1 5 10 15 1 5 10 15
Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp
20 25 30 20 25 30
Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly
35 40 45 35 40 45
Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly
50 55 60 50 55 60
Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe
65 70 75 80 65 70 75 80
Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu
85 90 95 85 90 95
Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala
100 105 110 100 105 110
Leu Gln Thr Glu Gln Glu Gln Asp Pro Glu His Ser Glu Lys Met Val Leu Gln Thr Glu Gln Glu Gln Asp Pro Glu His Ser Glu Lys Met Val
115 120 125 115 120 125
Ala Lys Arg Arg Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Ala Lys Arg Arg Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser
130 135 140 130 135 140
Phe Asp Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Asp Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala
145 150 155 160 145 150 155 160
Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe
165 170 175 165 170 175
Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu
180 185 190 180 185 190
Leu Asn Val Asp Leu Ala Val Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys His Leu Asn Val Asp Leu Ala Val Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys His
195 200 205 195 200 205
His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly
210 215 220 210 215 220
Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Glu Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Glu Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly
225 230 235 240 225 230 235 240
Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Ala Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Ala
245 250 255 245 250 255
Ala Lys Gln Ala Lys Gln
<210> 58<210> 58
<211> 260<211> 260
<212> PRT<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (группа B) <213> Neisseria meningitidis (Group B)
<400> 58<400> 58
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr Ala Asp Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr Ala Asp
1 5 10 15 1 5 10 15
Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys
20 25 30 20 25 30
Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn
35 40 45 35 40 45
Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn
50 55 60 50 55 60
Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg
65 70 75 80 65 70 75 80
Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu
85 90 95 85 90 95
Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr
100 105 110 100 105 110
Ala Leu Gln Thr Glu Gln Glu Gln Asp Pro Glu His Ser Glu Lys Met Ala Leu Gln Thr Glu Gln Glu Gln Asp Pro Glu His Ser Glu Lys Met
115 120 125 115 120 125
Val Ala Lys Arg Arg Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Val Ala Lys Arg Arg Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr
130 135 140 130 135 140
Ser Phe Asp Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg Gly Thr
145 150 155 160 145 150 155 160
Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp
165 170 175 165 170 175
Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro
180 185 190 180 185 190
Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Val Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Val Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys
195 200 205 195 200 205
His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys
210 215 220 210 215 220
Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Glu Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Glu Lys Ala Gln Glu Val Ala
225 230 235 240 225 230 235 240
Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu
245 250 255 245 250 255
Ala Ala Lys Gln Ala Ala Lys Gln
260 260
<210> 59<210> 59
<211> 255<211> 255
<212> PRT<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (группа B) <213> Neisseria meningitidis (Group B)
<400> 59<400> 59
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1 5 10 15 1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln
20 25 30 20 25 30
Ser Leu Ile Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ser Leu Ile Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35 40 45 35 40 45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50 55 60 50 55 60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65 70 75 80 65 70 75 80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85 90 95 85 90 95
Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu
100 105 110 100 105 110
Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln
115 120 125 115 120 125
Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu
130 135 140 130 135 140
Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Ser Ser Asp Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Ser Ser Asp
145 150 155 160 145 150 155 160
Asp Ala Gly Gly Lys Leu Ile Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Asp Ala Gly Gly Lys Leu Ile Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln
165 170 175 165 170 175
Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp
180 185 190 180 185 190
Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Glu Lys His His Ala Val Ile Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Glu Lys His His Ala Val Ile
195 200 205 195 200 205
Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu
210 215 220 210 215 220
Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val
225 230 235 240 225 230 235 240
Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245 250 255 245 250 255
<210> 60<210> 60
<211> 255<211> 255
<212> PRT<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (группа B) <213> Neisseria meningitidis (Group B)
<400> 60<400> 60
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1 5 10 15 1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln
20 25 30 20 25 30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35 40 45 35 40 45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50 55 60 50 55 60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65 70 75 80 65 70 75 80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85 90 95 85 90 95
Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu
100 105 110 100 105 110
Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln
115 120 125 115 120 125
Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu
130 135 140 130 135 140
Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp
145 150 155 160 145 150 155 160
Asp Ala Ser Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Asp Ala Ser Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln
165 170 175 165 170 175
Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp
180 185 190 180 185 190
Leu Ala Ala Ser Asp Ile Lys Pro Asp Lys Lys Arg His Ala Val Ile Leu Ala Ala Ser Asp Ile Lys Pro Asp Lys Lys Arg His Ala Val Ile
195 200 205 195 200 205
Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu
210 215 220 210 215 220
Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val
225 230 235 240 225 230 235 240
Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245 250 255 245 250 255
<210> 61<210> 61
<211> 768<211> 768
<212> ДНК <212> DNA
<213> Искусственная <213> Artificial
<220><220>
<223> Синтетическая нуклеиновокислотная последовательность <223> Synthetic nucleic acid sequence
<400> 61<400> 61
ggcagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cggtgcttgc cgatgcacta 60ggcagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cggtgcttgc cgatgcacta 60
accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc 120accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc 120
aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180
gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt 240gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt 240
caaatcgaag tggacgggca gctcattacc ttggagagcg gagagttcca agtgtacaaa 300caaatcgaag tggacgggca gctcattacc ttggagagcg gagagttcca agtgtacaaa 300
caaagccatt ccgccttaac cgcccttcag accgagcaag tacaagattc ggagcattca 360caaagccatt ccgccttaac cgcccttcag accgagcaag tacaagattc ggagcattca 360
gggaagatgg ttgcgaaacg ccagttcaga atcggcgata tagcgggtga acatacatct 420gggaagatgg ttgcgaaacg ccagttcaga atcggcgata tagcgggtga acatacatct 420
tttgacaagc ttcccgaagg cggcagggcg acatatcgcg ggacggcatt cggttcagac 480tttgacaagc ttcccgaagg cggcagggcg acatatcgcg ggacggcatt cggttcagac 480
gatgccagtg gaaaactgac ctacaccata gatttcgccg ccaagcaggg acacggcaaa 540gatgccagtg gaaaactgac ctacaccata gatttcgccg ccaagcaggg acacggcaaa 540
atcgaacatt tgaaatcgcc agaactcaat gttgacctgg ccgcctccga tatcaagccg 600atcgaacatt tgaaatcgcc agaactcaat gttgacctgg ccgcctccga tatcaagccg 600
gataaaaaac gccatgccgt catcagcggt tccgtccttt acaaccaagc cgagaaaggc 660gtaaaaaac gccatgccgt catcagcggt tccgtccttt acaaccaagc cgagaaaggc 660
agttactctc taggcatctt tggcgggcaa gcccaggaag ttgccggcag cgcagaagtg 720agttactctc taggcatctt tggcgggcaa gccaggaag ttgccggcag cgcagaagtg 720
gaaaccgcaa acggcatacg ccatatcggt cttgccgcca agcagtaa 768gaaaccgcaa acggcatacg ccatatcggt cttgccgcca agcagtaa 768
<210> 62<210> 62
<211> 255<211> 255
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная <213> Artificial
<220><220>
<223> Синтетическая аминокислотная последовательность <223> Synthetic amino acid sequence
<400> 62<400> 62
Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Val Leu Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Val Leu
1 5 10 15 1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln
20 25 30 20 25 30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35 40 45 35 40 45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50 55 60 50 55 60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65 70 75 80 65 70 75 80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85 90 95 85 90 95
Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu
100 105 110 100 105 110
Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln
115 120 125 115 120 125
Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu
130 135 140 130 135 140
Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp
145 150 155 160 145 150 155 160
Asp Ala Ser Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Asp Ala Ser Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln
165 170 175 165 170 175
Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp
180 185 190 180 185 190
Leu Ala Ala Ser Asp Ile Lys Pro Asp Lys Lys Arg His Ala Val Ile Leu Ala Ala Ser Asp Ile Lys Pro Asp Lys Lys Arg His Ala Val Ile
195 200 205 195 200 205
Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu
210 215 220 210 215 220
Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val
225 230 235 240 225 230 235 240
Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245 250 255 245 250 255
<210> 63<210> 63
<211> 765<211> 765
<212> ДНК <212> DNA
<213> Искусственная <213> Artificial
<220><220>
<223> Синтетическая нуклеиновокислотная последовательность <223> Synthetic nucleic acid sequence
<400> 63<400> 63
ggcagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cggggcttgc cgatgcacta 60ggcagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cggggcttgc cgatgcacta 60
accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc 120accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc 120
aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180
gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt 240gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt 240
caaatcgaag tggacgggca gctcattacc ttggagagcg gagagttcca aatatacaaa 300caaatcgaag tggacgggca gctcattacc ttggagagcg gagagttcca aatatacaaa 300
caggaccact ccgccgtcgt tgccctacag attgaaaaaa tcaacaaccc cgacaaaatc 360caggaccact ccgccgtcgt tgccctacag attgaaaaaa tcaacaaccc cgacaaaatc 360
gacagcctga taaaccaacg ctccttcctt gtcagcggtt tgggtggaga acataccgcc 420gacagcctga taaaccaacg ctccttcctt gtcagcggtt tgggtggaga acataccgcc 420
ttcaaccaac tgcccagcgg caaagccgag tatcacggca aagcattcag ctccgacgat 480ttcaaccaac tgcccagcgg caaagccgag tatcacggca aagcattcag ctccgacgat 480
gctggcggaa aactgaccta taccatagat ttcgccgcca aacagggaca cggcaaaatc 540gctggcggaa aactgaccta taccatagat ttcgccgcca aacagggaca cggcaaaatc 540
gaacacttga aaacacccga gcaaaatgtc gagcttgcct ccgccgaact caaagcagat 600gaacacttga aaacacccga gcaaaatgtc gagcttgcct ccgccgaact caaagcagat 600
gaaaaatcac acgccgtcat tttgggcgac acgcgctacg gcggcgaaga aaaaggcact 660gaaaaatcac acgccgtcat tttggggcgac acgcgctacg gcggcgaaga aaaaggcact 660
taccacctcg cccttttcgg cgaccgcgcc caagaaatcg ccggctcggc aaccgtgaag 720taccacctcg cccttttcgg cgaccgcgcc caagaaatcg ccggctcggc aaccgtgaag 720
ataagggaaa aggttcacga aatcggcatc gccggcaaac agtaa 765ataagggaaa aggttcacga aatcggcatc gccggcaaac agtaa 765
<210> 64<210> 64
<211> 254<211> 254
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная <213> Artificial
<220><220>
<223> Синтетическая аминокислотная последовательность <223> Synthetic amino acid sequence
<400> 64<400> 64
Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1 5 10 15 1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln
20 25 30 20 25 30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35 40 45 35 40 45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50 55 60 50 55 60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65 70 75 80 65 70 75 80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85 90 95 85 90 95
Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu
100 105 110 100 105 110
Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser
115 120 125 115 120 125
Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu
130 135 140 130 135 140
Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp
145 150 155 160 145 150 155 160
Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly
165 170 175 165 170 175
His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu
180 185 190 180 185 190
Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu
195 200 205 195 200 205
Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala
210 215 220 210 215 220
Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys
225 230 235 240 225 230 235 240
Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln
245 250 245 250
<210> 65<210> 65
<211> 786<211> 786
<212> ДНК <212> DNA
<213> Искусственная последовательность <213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетическая нуклеиновокислотная последовательность <223> Synthetic nucleic acid sequence
<400> 65<400> 65
atgagctctg gaagcggaag cgggggcggt ggagttgcag cagacattgg aacaggatta 60atgagctctg gaagcggaag cgggggcggt ggagttgcag cagacattgg aacaggatta 60
gcagatgcac tgacggcacc gttggatcat aaagacaaag gcttgaaatc gcttacctta 120gcagatgcac tgacggcacc gttggatcat aaagacaaag gcttgaaatc gcttacctta 120
gaagattcta tttcacaaaa tggcaccctt accttgtccg cgcaaggcgc tgaaaaaact 180gaagattcta tttcacaaaa tggcaccctt accttgtccg cgcaaggcgc tgaaaaaact 180
tttaaagtcg gtgacaaaga taatagctta aatacaggta aactcaaaaa tgataaaatc 240tttaaagtcg gtgacaaaga taatagctta aatacaggta aactcaaaaa tgataaaatc 240
tcgcgttttg atttcgtgca aaaaatcgaa gtagatggcc aaaccattac attagcaagc 300tcgcgttttg atttcgtgca aaaaatcgaa gtagatggcc aaaccattac attagcaagc 300
ggtgaattcc aaatatataa acaagaccat tcagcagtcg ttgcattgca aattgaaaaa 360ggtgaattcc aaatatataa acaagaccat tcagcagtcg ttgcattgca aattgaaaaa 360
atcaacaacc ccgacaaaat cgacagcctg ataaaccaac gttccttcct tgtcagcggt 420atcaacaacc ccgacaaaat cgacagcctg ataaaccaac gttccttcct tgtcagcggt 420
ttgggcggtg aacatacagc cttcaaccaa ttaccaagcg gcaaagcgga gtatcacggt 480ttgggcggtg aacatacagc cttcaaccaa ttaccaagcg gcaaagcggga gtatcacggt 480
aaagcattta gctcagatga tgcaggcggt aaattaactt atacaattga ctttgcagca 540aaagcattta gctcagatga tgcaggcggt aaattaactt atacaattga ctttgcagca 540
aaacaaggac atggcaaaat tgaacattta aaaacacccg aacagaacgt agagctcgca 600600
tccgcagaac tcaaagcaga tgaaaaatca cacgcagtca ttttgggtga cacgcgctac 660tccgcagaac tcaaagcaga tgaaaaatca cacgcagtca ttttgggtga cacgcgctac 660
ggcagcgaag aaaaaggtac ttaccactta gctctttttg gcgaccgagc tcaagaaatc 720ggcagcgaag aaaaaggtac ttaccactta gctctttttg gcgaccgagc tcaagaaatc 720
gcaggtagcg caaccgtaaa gataagggaa aaggttcacg aaattgggat cgcgggcaaa 780gcaggtagcg caaccgtaaa gataagggaa aaggttcacg aaattgggat cgcgggcaaa 780
caataa 786catataa 786
<210> 66<210> 66
<211> 258<211> 258
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность <213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетическая аминокислотная последовательность <223> Synthetic amino acid sequence
<400> 66<400> 66
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile
1 5 10 15 1 5 10 15
Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp
20 25 30 20 25 30
Lys Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu
35 40 45 35 40 45
Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly
50 55 60 50 55 60
Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe
65 70 75 80 65 70 75 80
Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala
85 90 95 85 90 95
Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asn His Ser Ala Val Val Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asn His Ser Ala Val Val Ala
100 105 110 100 105 110
Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile
115 120 125 115 120 125
Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala
130 135 140 130 135 140
Phe Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Phe Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe
145 150 155 160 145 150 155 160
Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr
165 170 175 165 170 175
Lys Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Lys Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln
180 185 190 180 185 190
Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His
195 200 205 195 200 205
Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Glu Lys Gly Thr
210 215 220 210 215 220
Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser
225 230 235 240 225 230 235 240
Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly
245 250 255 245 250 255
Lys Gln Lys Gln
<210> 67<210> 67
<211> 780<211> 780
<212> ДНК <212> DNA
<213> Искусственная последовательность <213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетическая нуклеиновокислотная последовательность <223> Synthetic nucleic acid sequence
<400> 67<400> 67
atgagctctg gaggtggagg aagcgggggc ggtggagttg cagcagacat tggagcagga 60atgagctctg gaggtggagg aagcgggggc ggtggagttg cagcagacat tggagcagga 60
ttagcagatg cactgacggc accgttggat cataaagaca aaagtttgca gtcgcttacc 120ttagcagatg cactgacggc accgttggat cataaagaca aaagtttgca gtcgcttacc 120
ttagatcagt ctgtcaggaa aaatgagaaa cttaagttgg cggcgcaagg cgctgaaaaa 180ttagatcagt ctgtcaggaa aaatgagaaa cttaagttgg cggcgcaagg cgctgaaaaa 180
acttatggaa acggtgacag cttaaataca ggtaaactca aaaatgataa agtctcgcgt 240acttatggaa acggtgacag cttaaataca ggtaaactca aaaatgataa agtctcgcgt 240
tttgatttca ttcgtcaaat cgaagtagat ggccaaacca ttacattagc aagcggtgaa 300tttgatttca ttcgtcaaat cgaagtagat ggccaaacca ttacattagc aagcggtgaa 300
ttccaaatat ataaacaaaa ccattcagca gtcgttgcat tgcaaattga aaaaatcaac 360ttccaaatat ataaacaaaa ccattcagca gtcgttgcat tgcaaattga aaaaatcaac 360
aaccccgaca aaatcgacag cctgataaac caacgttcct tccttgtcag cggtttgggc 420aaccccgaca aaatcgacag cctgataaac caacgttcct tccttgtcag cggtttgggc 420
ggtgaacata cagccttcaa ccaattacca gacggcaaag cggagtatca cggtaaagca 480ggtgaacata cagccttcaa ccaattacca gacggcaaag cggagtatca cggtaaagca 480
tttagctcag atgatccgaa cggtaggtta cactattcca ttgactttac caaaaaacaa 540tttagctcag atgatccgaa cggtaggtta cactattcca ttgactttac caaaaaacaa 540
ggatacggca gaattgaaca tttaaaaacg cccgaacaga acgtagagct cgcatccgca 600ggatacggca gaattgaaca tttaaaaacg cccgaacaga acgtagagct cgcatccgca 600
gaactcaaag cagatgaaaa atcacacgca gtcattttgg gtgacacgcg ctacggcggc 660gaactcaaag cagatgaaaa atcacacgca gtcattttgg gtgacacgcg ctacggcggc 660
gaagaaaaag gtacttacca cttagccctt tttggcgacc gcgctcaaga aatcgcaggt 720gaagaaaaag gtacttacca cttagccctt tttggcgacc gcgctcaaga aatcgcaggt 720
agcgcaaccg taaagataag ggaaaaggtt cacgaaattg ggatcgcggg caaacaataa 780agcgcaaccg taaagataag ggaaaaggtt cacgaaattg ggatcgcggg caaacaataa 780
<210> 68<210> 68
<211> 253<211> 253
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность <213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетическая аминокислотная последовательность <223> Synthetic amino acid sequence
<400> 68<400> 68
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala
1 5 10 15 1 5 10 15
Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser
20 25 30 20 25 30
Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala
35 40 45 35 40 45
Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr
50 55 60 50 55 60
Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln
65 70 75 80 65 70 75 80
Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln
85 90 95 85 90 95
Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys
100 105 110 100 105 110
Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe
115 120 125 115 120 125
Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro
130 135 140 130 135 140
Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala
145 150 155 160 145 150 155 160
Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His
165 170 175 165 170 175
Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala
180 185 190 180 185 190
Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly
195 200 205 195 200 205
Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu
210 215 220 210 215 220
Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile
225 230 235 240 225 230 235 240
Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln
245 250 245 250
<210> 69<210> 69
<211> 765<211> 765
<212> ДНК <212> DNA
<213> Искусственная последовательность <213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетическая нуклеиновокислотная последовательность <223> Synthetic nucleic acid sequence
<400> 69<400> 69
atgagctctg gaggtggagg agttgcagca gacattggag caggattagc agatgcactg 60atgagctctg gaggtggagg agttgcagca gacattggag caggattagc agatgcactg 60
acggcaccgt tggatcataa agacaaaagt ttgcagtcgc ttaccttaga tcagtctgtc 120acggcaccgt tggatcataa agacaaaagt ttgcagtcgc ttaccttaga tcagtctgtc 120
aggaaaaatg agaaacttaa gttggcggcg caaggcgctg aaaaaactta tggaaacggt 180aggaaaaatg agaaacttaa gttggcggcg caaggcgctg aaaaaactta tggaaacggt 180
gacagcttaa atacaggtaa actcaaaaat gataaagtct cgcgttttga tttcattcgt 240gacagcttaa atacaggtaa actcaaaaat gataaagtct cgcgttttga tttcattcgt 240
caaatcgaag tagatggcca acttattaca ttagaaagcg gtgaattcca aatatataaa 300caaatcgaag tagatggcca acttattaca ttagaaagcg gtgaattcca aatatataaa 300
caagaccatt cagcagtcgt tgcattgcaa attgaaaaaa tcaacaaccc cgacaaaatc 360caagaccatt cagcagtcgt tgcattgcaa attgaaaaaa tcaacaaccc cgacaaaatc 360
gacagcctga taaaccaacg ttccttcctt gtcagcggtt tgggcggtga acatacagcc 420gacagcctga taaaccaacg ttccttcctt gtcagcggtt tgggcggtga acatacagcc 420
ttcaaccaat taccaagcgg caaagcggag tatcacggta aagcatttag ctcagatgat 480ttcaaccaat taccaagcgg caaagcggag tatcacggta aagcatttag ctcagatgat 480
gcaggcggta aattaactta tacaattgac tttgcagcaa aacaaggaca tggcaaaatt 540540
gaacatttaa aaacacccga acagaacgta gagctcgcat ccgcagaact caaagcagat 600gaacatttaa aaacacccga acagaacgta gagctcgcat ccgcagaact caaagcagat 600
gaaaaatcac acgcagtcat tttgggtgac acgcgctacg gcggcgaaga aaaaggtact 660gaaaaatcac acgcagtcat tttggggtgac acgcgctacg gcggcgaaga aaaaggtact 660
taccacttag ctctttttgg cgaccgagct caagaaatcg caggtagcgc aaccgtaaag 720taccacttag ctctttttgg cgaccgagct caagaaatcg caggtagcgc aaccgtaaag 720
ataagggaaa aggttcacga aattgggatc gcgggcaaac aataa 765ataagggaaa aggttcacga aattgggatc gcgggcaaac aataa 765
<210> 70<210> 70
<211> 255<211> 255
<212> PRT<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (группа B) <213> Neisseria meningitidis (Group B)
<400> 70<400> 70
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1 5 10 15 1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln
20 25 30 20 25 30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35 40 45 35 40 45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50 55 60 50 55 60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65 70 75 80 65 70 75 80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Lys Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Glu Val Asp Gly Lys Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85 90 95 85 90 95
Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu
100 105 110 100 105 110
Gln Val Gln Asp Ser Glu Asp Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Gln Val Gln Asp Ser Glu Asp Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln
115 120 125 115 120 125
Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu
130 135 140 130 135 140
Pro Lys Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Pro Lys Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp
145 150 155 160 145 150 155 160
Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln
165 170 175 165 170 175
Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu
180 185 190 180 185 190
Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile
195 200 205 195 200 205
Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu
210 215 220 210 215 220
Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val
225 230 235 240 225 230 235 240
Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln
245 250 255 245 250 255
<210> 71<210> 71
<211> 254<211> 254
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность <213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетическая аминокислотная последовательность <223> Synthetic amino acid sequence
<400> 71<400> 71
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala
1 5 10 15 1 5 10 15
Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser
20 25 30 20 25 30
Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala
35 40 45 35 40 45
Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr
50 55 60 50 55 60
Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln
65 70 75 80 65 70 75 80
Ile Glu Val Asp Gly Lys Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Glu Val Asp Gly Lys Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln
85 90 95 85 90 95
Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln
100 105 110 100 105 110
Val Gln Asp Ser Glu Asp Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Val Gln Asp Ser Glu Asp Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe
115 120 125 115 120 125
Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro
130 135 140 130 135 140
Lys Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Lys Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp
145 150 155 160 145 150 155 160
Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly
165 170 175 165 170 175
His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu
180 185 190 180 185 190
Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu
195 200 205 195 200 205
Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala
210 215 220 210 215 220
Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys
225 230 235 240 225 230 235 240
Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln
245 250 245 250
<210> 72<210> 72
<211> 768<211> 768
<212> ДНК <212> DNA
<213> Искусственная последовательность <213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетическая нуклеиновокислотная последовательность <223> Synthetic nucleic acid sequence
<400> 72<400> 72
atgagcagcg gagggggcgg tgtcgccgcc gacatcggtg cggggcttgc cgatgcacta 60atgagcagcg gagggggcgg tgtcgccgcc gacatcggtg cggggcttgc cgatgcacta 60
accgcaccgc tcgaccataa agacaaaggt ttgcagtctt taacgctgga tcagtccgtc 120accgcaccgc tcgaccataa agacaaaggt ttgcagtctt taacgctgga tcagtccgtc 120
aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180
gacagcctta atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt 240gacagcctta atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt 240
caaatcgaag tggacgggaa gctcattacc ttggagagcg gagagttcca agtgtacaaa 300caaatcgaag tggacgggaa gctcattacc ttggagagcg gagagttcca agtgtacaaa 300
caaagccatt ccgccttaac cgcccttcag accgagcaag tacaagactc ggaggattcc 360caaagccatt ccgccttaac cgcccttcag accgagcaag tacaagactc ggaggattcc 360
gggaagatgg ttgcgaaacg ccagttcaga atcggcgaca tagcgggcga acatacatct 420gggaagatgg ttgcgaaacg ccagttcaga atcggcgaca tagcgggcga acatacatct 420
tttgacaagc ttcccaaagg cggcagtgcg acatatcgcg ggacggcgtt cggttcagac 480tttgacaagc ttcccaaagg cggcagtgcg acatatcgcg ggacggcgtt cggttcagac 480
gatgctggcg gaaaactgac ctatactata gatttcgccg ccaaacaggg acacggcaaa 540gatgctggcg gaaaactgac ctatactata gatttcgccg ccaaacaggg acacggcaaa 540
atcgaacact tgaaaacacc cgagcaaaat gtcgagcttg cctccgccga actcaaagca 600atcgaacact tgaaaacacc cgagcaaaat gtcgagcttg cctccgccga actcaaagca 600
gatgaaaaat cacacgccgt cattttgggc gacacgcgct acggcggcga agaaaaaggc 660gatgaaaaat cacacgccgt cattttgggc gacacgcgct acggcggcga agaaaaaggc 660
acttaccacc tcgccctttt cggcgaccgc gcccaagaaa tcgccggctc ggcaaccgtg 720acttaccacc tcgccctttt cggcgaccgc gcccaagaaa tcgccggctc ggcaaccgtg 720
aagataaggg aaaaggttca cgaaatcggc atcgccggca aacagtaa 768aagataaggg aaaaggttca cgaaatcggc atcgccggca aacagtaa 768
<210> 73<210> 73
<211> 786<211> 786
<212> ДНК <212> DNA
<213> Искусственная последовательность <213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетическая нуклеиновокислотная последовательность <223> Synthetic nucleic acid sequence
<400> 73<400> 73
atgtccagcg gttcaggcag cggcggtgga ggcgtggcag cagatatcgg aacaggttta 60atgtccagcg gttcaggcag cggcggtgga ggcgtggcag cagatatcgg aacaggttta 60
gcagatgctc tgacagcacc cttagatcac aaagacaaag gacttaaatc actgacattg 120gcagatgctc tgacagcacc cttagatcac aaagacaaag gacttaaatc actgacattg 120
gaagattcta tctcgcaaaa tggtactctc actctttcag cccaaggcgc agaaaaaaca 180gaagattcta tctcgcaaaa tggtactctc actctttcag cccaaggcgc agaaaaaaca 180
tttaaagtag gcgataaaga taactcctta aatacaggta aattaaaaaa tgacaaaatc 240tttaaagtag gcgataaaga taactcctta aatacaggta aattaaaaaa tgacaaaatc 240
tcacggtttg atttcgttca gaaaattgaa gtagatggac aaacgattac attagcaagc 300tcacggtttg atttcgttca gaaaattgaa gtagatggac aaacgattac attagcaagc 300
ggcgaattcc aaatttataa acaagaccat tcagcagtag tagcattaca aatcgaaaaa 360ggcgaattcc aaatttataa acaagaccat tcagcagtag tagcattaca aatcgaaaaa 360
attaacaacc cggacaaaat tgattctctt attaaccaac gctcttttct cgtatcagga 420attaacaacc cggacaaaat tgattctctt attaaccaac gctcttttct cgtatcagga 420
cttggtggtg aacatacagc gtttaatcaa ctgccgtcag gaaaagcaga atatcatggt 480cttggtggtg aacatacagc gtttaatcaa ctgccgtcag gaaaagcaga atatcatggt 480
aaagcatttt catcagacga cgcaggtggc aaactgacct atactattga ctttgcagca 540aaagcatttt catcagacga cgcaggtggc aaactgacct atactattga ctttgcagca 540
aaacagggac atggaaaaat tgaacattta aaaacacccg aacagaacgt agaactggcc 600aaacagggac atggaaaaat tgaacattta aaaacacccg aacagaacgt agaactggcc 600
tcagcagaat tgaaagctga tgaaaaatcc catgcagtaa ttttaggcga tacacgttac 660tcagcagaat tgaaagctga tgaaaaatcc catgcagtaa ttttaggcga tacacgttac 660
ggtagcgaag aaaaaggtac atatcactta gctctttttg gcgatcgtgc tcaagaaatt 720ggtagcgaag aaaaaggtac atatcactta gctctttttg gcgatcgtgc tcaagaaatt 720
gctggttccg caacagttaa aatccgtgaa aaagtacatg aaatcggcat tgcaggtaaa 780gctggttccg caacagttaa aatccgtgaa aaagtacatg aaatcggcat tgcaggtaaa 780
caataa 786catataa 786
<210> 74<210> 74
<211> 262<211> 262
<212> PRT<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (группа B) <213> Neisseria meningitidis (Group B)
<400> 74<400> 74
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp
1 5 10 15 1 5 10 15
Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys
20 25 30 20 25 30
Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Pro Gln Asn Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Pro Gln Asn
35 40 45 35 40 45
Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Ala
50 55 60 50 55 60
Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys
65 70 75 80 65 70 75 80
Ile Ser Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Ser Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr
85 90 95 85 90 95
Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asn His Ser Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asn His Ser
100 105 110 100 105 110
Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile
115 120 125 115 120 125
Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly
130 135 140 130 135 140
Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Gly Asp Lys Ala Glu Tyr His Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Gly Asp Lys Ala Glu Tyr His
145 150 155 160 145 150 155 160
Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Thr Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Thr
165 170 175 165 170 175
Ile Asp Phe Thr Asn Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys Ile Asp Phe Thr Asn Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys
180 185 190 180 185 190
Thr Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Thr Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp
195 200 205 195 200 205
Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu
210 215 220 210 215 220
Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu
225 230 235 240 225 230 235 240
Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile
245 250 255 245 250 255
Gly Ile Ala Gly Lys Gln Gly Ile Ala Gly Lys Gln
260 260
<210> 75<210> 75
<211> 254<211> 254
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность <213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетическая аминокислотная последовательность <223> Synthetic amino acid sequence
<400> 75<400> 75
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Val Leu Ala Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Val Leu Ala
1 5 10 15 1 5 10 15
Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser
20 25 30 20 25 30
Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala
35 40 45 35 40 45
Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr
50 55 60 50 55 60
Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln
65 70 75 80 65 70 75 80
Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln
85 90 95 85 90 95
Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln
100 105 110 100 105 110
Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe
115 120 125 115 120 125
Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro
130 135 140 130 135 140
Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp
145 150 155 160 145 150 155 160
Ala Ser Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly Ala Ser Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly
165 170 175 165 170 175
His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu
180 185 190 180 185 190
Ala Ala Ser Asp Ile Lys Pro Asp Lys Lys Arg His Ala Val Ile Ser Ala Ala Ser Asp Ile Lys Pro Asp Lys Lys Arg His Ala Val Ile Ser
195 200 205 195 200 205
Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly
210 215 220 210 215 220
Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu
225 230 235 240 225 230 235 240
Thr Ala Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln Thr Ala Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245 250 245 250
<210> 76<210> 76
<211> 258<211> 258
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность <213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетическая аминокислотная последовательность <223> Synthetic amino acid sequence
<400> 76<400> 76
Cys Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Thr Gly Cys Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Thr Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu
20 25 30 20 25 30
Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly Thr Leu Thr Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly Thr Leu Thr
35 40 45 35 40 45
Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Val Gly Asp Lys Asp Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Val Gly Asp Lys Asp
50 55 60 50 55 60
Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe
65 70 75 80 65 70 75 80
Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala
85 90 95 85 90 95
Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala
100 105 110 100 105 110
Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile
115 120 125 115 120 125
Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala
130 135 140 130 135 140
Phe Asn Gln Leu Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Phe Asn Gln Leu Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe
145 150 155 160 145 150 155 160
Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala
165 170 175 165 170 175
Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln
180 185 190 180 185 190
Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His
195 200 205 195 200 205
Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Glu Lys Gly Thr
210 215 220 210 215 220
Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser
225 230 235 240 225 230 235 240
Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly
245 250 255 245 250 255
Lys Gln Lys Gln
<210> 77<210> 77
<211> 257<211> 257
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность <213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетическая аминокислотная последовательность <223> Synthetic amino acid sequence
<400> 77<400> 77
Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Thr Gly Leu Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Thr Gly Leu
1 5 10 15 1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Lys Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Lys
20 25 30 20 25 30
Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly Thr Leu Thr Leu Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly Thr Leu Thr Leu
35 40 45 35 40 45
Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Val Gly Asp Lys Asp Asn Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Val Gly Asp Lys Asp Asn
50 55 60 50 55 60
Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe Asp
65 70 75 80 65 70 75 80
Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala Ser Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala Ser
85 90 95 85 90 95
Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu
100 105 110 100 105 110
Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn
115 120 125 115 120 125
Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe
130 135 140 130 135 140
Asn Gln Leu Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Asn Gln Leu Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser
145 150 155 160 145 150 155 160
Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala
165 170 175 165 170 175
Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn
180 185 190 180 185 190
Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala
195 200 205 195 200 205
Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr
210 215 220 210 215 220
His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala
225 230 235 240 225 230 235 240
Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys
245 250 255 245 250 255
Gln Gln
<210> 78<210> 78
<211> 255<211> 255
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность <213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетическая аминокислотная последовательность <223> Synthetic amino acid sequence
<400> 78<400> 78
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1 5 10 15 1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln
20 25 30 20 25 30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35 40 45 35 40 45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50 55 60 50 55 60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65 70 75 80 65 70 75 80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85 90 95 85 90 95
Gln Ile Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Val Ala Leu Gln Thr Glu Gln Ile Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Val Ala Leu Gln Thr Glu
100 105 110 100 105 110
Gln Ile Asn Asn Ser Asp Lys Ser Gly Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Gln Ile Asn Asn Ser Asp Lys Ser Gly Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser
115 120 125 115 120 125
Phe Arg Ile Ser Gly Ile Ala Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Phe Arg Ile Ser Gly Ile Ala Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu
130 135 140 130 135 140
Pro Lys Gly Gly Lys Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Ser Ser Asp Pro Lys Gly Gly Lys Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Ser Ser Asp
145 150 155 160 145 150 155 160
Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln
165 170 175 165 170 175
Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu
180 185 190 180 185 190
Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile
195 200 205 195 200 205
Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu
210 215 220 210 215 220
Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val
225 230 235 240 225 230 235 240
Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln
245 250 255 245 250 255
<210> 79<210> 79
<211> 254<211> 254
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность <213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетическая аминокислотная последовательность <223> Synthetic amino acid sequence
<400> 79<400> 79
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala
1 5 10 15 1 5 10 15
Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser
20 25 30 20 25 30
Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala
35 40 45 35 40 45
Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr
50 55 60 50 55 60
Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln
65 70 75 80 65 70 75 80
Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln
85 90 95 85 90 95
Ile Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Val Ala Leu Gln Thr Glu Gln Ile Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Val Ala Leu Gln Thr Glu Gln
100 105 110 100 105 110
Ile Asn Asn Ser Asp Lys Ser Gly Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Ile Asn Asn Ser Asp Lys Ser Gly Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe
115 120 125 115 120 125
Arg Ile Ser Gly Ile Ala Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Arg Ile Ser Gly Ile Ala Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro
130 135 140 130 135 140
Lys Gly Gly Lys Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Ser Ser Asp Asp Lys Gly Gly Lys Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Ser Ser Asp Asp
145 150 155 160 145 150 155 160
Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly
165 170 175 165 170 175
His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu
180 185 190 180 185 190
Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu
195 200 205 195 200 205
Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala
210 215 220 210 215 220
Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys
225 230 235 240 225 230 235 240
Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln
245 250 245 250
<210> 80<210> 80
<211> 254<211> 254
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность <213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетическая аминокислотная последовательность <223> Synthetic amino acid sequence
<400> 80<400> 80
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala
1 5 10 15 1 5 10 15
Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser
20 25 30 20 25 30
Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala
35 40 45 35 40 45
Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr
50 55 60 50 55 60
Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln
65 70 75 80 65 70 75 80
Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln
85 90 95 85 90 95
Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu Gln
100 105 110 100 105 110
Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe
115 120 125 115 120 125
Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro
130 135 140 130 135 140
Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp
145 150 155 160 145 150 155 160
Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly
165 170 175 165 170 175
Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu
180 185 190 180 185 190
Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile Ser Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile Ser
195 200 205 195 200 205
Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly
210 215 220 210 215 220
Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Lys Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Lys
225 230 235 240 225 230 235 240
Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245 250 245 250
<210> 81<210> 81
<211> 252<211> 252
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность <213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Синтетическая аминокислотная последовательность <223> Synthetic amino acid sequence
<400> 81<400> 81
Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala
1 5 10 15 1 5 10 15
Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser Leu Thr Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser Leu Thr
20 25 30 20 25 30
Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln
35 40 45 35 40 45
Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys
50 55 60 50 55 60
Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu
65 70 75 80 65 70 75 80
Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr
85 90 95 85 90 95
Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu Gln Ile Gln Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu Gln Ile Gln
100 105 110 100 105 110
Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile
115 120 125 115 120 125
Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Glu Gly Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Glu Gly
130 135 140 130 135 140
Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly
145 150 155 160 145 150 155 160
Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly Asn Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly Asn Gly
165 170 175 165 170 175
Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala
180 185 190 180 185 190
Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile Ser Gly Ser Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile Ser Gly Ser
195 200 205 195 200 205
Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe
210 215 220 210 215 220
Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Lys Thr Val Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Lys Thr Val
225 230 235 240 225 230 235 240
Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245 250 245 250
<---<---
Claims (11)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201261609257P | 2012-03-09 | 2012-03-09 | |
| US61/609,257 | 2012-03-09 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014136401A Division RU2665841C2 (en) | 2012-03-09 | 2013-03-06 | Neisseria meningitidis compositions and methods of use thereof |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2018129163A RU2018129163A (en) | 2018-11-09 |
| RU2018129163A3 RU2018129163A3 (en) | 2021-12-29 |
| RU2776310C2 true RU2776310C2 (en) | 2022-07-18 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2223492C2 (en) * | 1998-10-09 | 2004-02-10 | Чирон Корпорейшн | Protein obtained from neisseria meningitidis (variants, its fragment, nucleic acid encoding thereof (variants), probe, primer, composition |
| WO2009104097A2 (en) * | 2008-02-21 | 2009-08-27 | Novartis Ag | Meningococcal fhbp polypeptides |
| US7785608B2 (en) * | 2002-08-30 | 2010-08-31 | Wyeth Holdings Corporation | Immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease |
| WO2011024072A2 (en) * | 2009-08-27 | 2011-03-03 | Novartis Ag | Hybrid polypeptides including meningococcal fhbp sequences |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2223492C2 (en) * | 1998-10-09 | 2004-02-10 | Чирон Корпорейшн | Protein obtained from neisseria meningitidis (variants, its fragment, nucleic acid encoding thereof (variants), probe, primer, composition |
| US7785608B2 (en) * | 2002-08-30 | 2010-08-31 | Wyeth Holdings Corporation | Immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease |
| WO2009104097A2 (en) * | 2008-02-21 | 2009-08-27 | Novartis Ag | Meningococcal fhbp polypeptides |
| WO2011024072A2 (en) * | 2009-08-27 | 2011-03-03 | Novartis Ag | Hybrid polypeptides including meningococcal fhbp sequences |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2739504C2 (en) | Neisseria meningitidis compositions and methods for using them | |
| KR101584871B1 (en) | Non-lipidated variants of neisseria meningitidis orf2086 antigens | |
| US10829521B2 (en) | Neisseria meningitidis composition and methods thereof | |
| RU2776310C2 (en) | Neisseria meningitidis compositions and their application methods | |
| NZ731330B2 (en) | Neisseria meningitidis compositions and methods thereof | |
| NZ747917B2 (en) | Neisseria meningitidis compositions and methods thereof |