RU2772470C2 - Supporting scaffold based on nanofibrillar cellulose for growing cells - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: present invention relates to biotechnology. The composition and its application are presented, as well as methods and materials for culturing growing cells in a three-dimensional culture. The composition contains mechanically disintegrated anionic nanofibrillar cellulose of plant origin, and this anionic nanofibrillar cellulose is in the form of a hydrogel.

EFFECT: invention is used for efficient cell culture.

25 cl, 2 tbl, 9 dwg, 2 ex

Description

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯFIELD OF THE INVENTION

Настоящее изобретение относится к области систем культивирования клеток и клеточной технологии. Изобретение относится к композициям растительного происхождения для культивирования клеток, содержащим анионную нанофибриллярную целлюлозу.The present invention relates to the field of cell culture systems and cell technology. The invention relates to compositions of plant origin for cell culture containing anionic nanofibrillar cellulose.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИPRIOR ART

Нейрон представляет собой специализированный тип клетки, встречающийся в организмах всех эуметазоев (т.е. всех основных групп животных, кроме губок, пластинчатых и некоторых других вымерших или малоизвестных живых организмов). Так, только губки и некоторые другие более простые животные не имеют нейронов. Характерными особенностями нейрона являются электрическая возбудимость и наличие синапсов, представляющих собой сложные мембранные контакты, через которые сигналы передаются к другим клеткам. Нейроны организма, а также глиальные клетки, которые обеспечивают им структурную и метаболическую поддержку, совместно составляют нервную систему. У позвоночных большая часть нейронов принадлежит центральной нервной системе (ЦНС), но некоторые находятся в периферических ганглиях, и многие сенсорные нейроны расположены в органах чувств, таких как сетчатка и улитка внутреннего уха.The neuron is a specialized cell type found in the organisms of all eumetazoans (i.e., all major groups of animals except sponges, lamellar, and some other extinct or little-known living organisms). So, only sponges and some other simpler animals do not have neurons. The characteristic features of a neuron are electrical excitability and the presence of synapses, which are complex membrane contacts through which signals are transmitted to other cells. The neurons of the body, as well as the glial cells that provide them with structural and metabolic support, together make up the nervous system. In vertebrates, most neurons belong to the central nervous system (CNS), but some are located in peripheral ganglia, and many sensory neurons are located in sensory organs such as the retina and cochlea of the inner ear.

Типичный нейрон подразделяют на три части: сому или тело клетки, дендриты и аксон. Сома обычно компактна; аксон и дендриты представляют собой филаменты, которые из нее выступают. Обычно дендриты обильно ветвятся, с каждым разветвлением становясь тоньше и простирая свои наиболее удаленные ветви на несколько сотен микрометров от сомы. Синаптические сигналы от других нейронов принимаются сомой и дендритами; сигналы к другим нейронам передаются через аксон. Нейроны передают сигналы через химические и электрические синапсы в ходе процесса, известного как нейротрансмиссия, также называемого синаптической передачей.A typical neuron is divided into three parts: the soma or cell body, dendrites, and axon. The soma is usually compact; the axon and dendrites are the filaments that protrude from it. Usually the dendrites branch profusely, becoming thinner with each branching and extending their outermost branches several hundred micrometers from the soma. Synaptic signals from other neurons are received by the soma and dendrites; signals to other neurons are transmitted through the axon. Neurons transmit signals across chemical and electrical synapses in a process known as neurotransmission, also called synaptic transmission.

В большинстве случаев нейроны образуются из стволовых клеток специальных типов. Как правило, нейроны в головном мозге взрослых людей не подвергаются клеточному делению. Так, нейрогенез в значительной степени прекращается в зрелом возрасте в большинстве областей головного мозга. Астроциты представляют собой звездообразные глиальные клетки, для которых также наблюдали превращение в нейроны, благодаря характерной для стволовых клеток плюрипотентности.In most cases, neurons are formed from special types of stem cells. Typically, neurons in the adult brain do not undergo cell division. Thus, neurogenesis largely ceases in adulthood in most areas of the brain. Astrocytes are stellate glial cells that have also been observed to become neurons due to the inherent pluripotency of stem cells.

Конструирование нервной ткани представляет собой новый перспективный способ терапии, и для связанного с нейронами применения были протестированы многие биоматериалы. При конструировании тканей осуществляют разработку биоматериалов с целью улучшения функционирования ткани или органа в организме человека. Конструирование нервной ткани относится к области, где объединение клеток, биоматериалов и факторов роста направлено на создание продукта, который может быть трансплантирован пациентам, страдающим от механического повреждения нерва либо заболеваний центральной или периферической нервной системы. В случае конструирования нервной ткани биоматериалы могут поддерживать рост клеток, поддерживать структуру ткани или улучшать функцию тканей/клеток. Биоматериалы для конструирования нервной ткани должны быть нетоксичными, трехмерными (3D), поддерживать рост клеток желаемого типа и обеспечивать поток питательных веществ.The engineering of neural tissue represents a promising new therapeutic approach, and many biomaterials have been tested for neuronal applications. When constructing tissues, biomaterials are developed to improve the functioning of a tissue or organ in the human body. Nervous tissue engineering refers to the field where the combination of cells, biomaterials and growth factors is aimed at creating a product that can be transplanted to patients suffering from mechanical damage to the nerve or diseases of the central or peripheral nervous system. In the case of neural tissue engineering, biomaterials can support cell growth, maintain tissue structure, or improve tissue/cell function. Biomaterials for the construction of neural tissue must be non-toxic, three-dimensional (3D), support the growth of cells of the desired type and provide a flow of nutrients.

Материалы на основе внеклеточного матрикса (ЕСМ), такие как коллаген, ламинин и фибронектин, чаще всего используются для структур нервных направляющих. В дополнение к этому, широко используемыми группами природных материалов для направления периферических нервов являются материалы на основе гиалуроновой кислоты и альгината. Еще более часто используемыми материалами являются синтетические полимеры. Примерами таковых являются поли(молочная кислота) (PLA), полигликолид, поли(ε-капролактон) (PCL) и сополимеры на их основе, биоразлагаемое стекло и полиэтилентерефталат (PTFE).Extracellular matrix (ECM) based materials such as collagen, laminin and fibronectin are most commonly used for nerve guide structures. In addition, widely used groups of natural materials for guiding peripheral nerves are materials based on hyaluronic acid and alginate. Even more commonly used materials are synthetic polymers. Examples of these are poly(lactic acid) (PLA), polyglycolide, poly(ε-caprolactone) (PCL) and copolymers based on them, biodegradable glass and polyethylene terephthalate (PTFE).

В случае культивирования клеток в трехмерном пространстве (3D) подходящая для культивирования матрица должна обладать способностью имитировать компоненты нативного ЕСМ, чтобы обеспечить каркас, обладающий аналогичными с нативным ЕСМ свойствами, такими как структурная поддержка для клеток и сеть взаимосообщающихся пор для эффективной миграции клеток и эффективного переноса питательных веществ в клетки.In the case of culturing cells in three-dimensional space (3D), a suitable culture matrix should be able to mimic the components of native ECM to provide a scaffold that has similar properties to native ECM, such as structural support for cells and a network of interconnected pores for efficient cell migration and efficient transport. nutrients into cells.

Не так давно появившиеся гидрогели, как синтетического, так и природного происхождения, оказались подходящими каркасами для клеточной 3D-культуры. Сеть взаимосообщающихся пор в гидрогелях обеспечивает удерживание большого количества биологической жидкости, способствуя переносу кислорода, питательных веществ и отходов. Кроме того, большинство гидрогелей могут формироваться в мягких цитосовместимых условиях, а их биологические свойства можно модулировать с использованием химии поверхностных явлений.More recently, hydrogels, both synthetic and natural, have proven to be suitable scaffolds for 3D cell culture. The network of intercommunicating pores in hydrogels allows for the retention of large amounts of biological fluid, facilitating the transport of oxygen, nutrients, and waste. In addition, most hydrogels can be formed under mild cytocompatible conditions, and their biological properties can be modulated using surface chemistry.

Специально разработанные гидрогели с модифицированными механическими, химическими и биологическими свойствами потенциально могут имитировать ЕСМ, что таким образом определяет их пригодность для клеточных 3D-культур. Коммерческими продуктами для 3D-культивирования клеток являются, например, матрицы для клеточных культур PuraMatrix™ (3DM Inc.) и Матригель (BD Biosciences). PuraMatrix™ представляет собой гидрогель, состоящий из самоорганизующихся пептидных нановолокон, который напоминает структуру природного фибриллярного коллагена в ЕСМ с диаметром волокон 5-10 нм. Он также характеризуется высоким содержанием воды, в типичном случае 99,5%. Пептидные гидрогели описаны в US 7449180 и WO 2004/007683. Матригель представляет собой гелеобразную смесь белков, секретируемых опухолевыми клетками мышей. Эта смесь походит на сложную внеклеточную среду, обнаруживаемую во многих тканях, и используется специалистами в области биологии клеток в качестве субстрата для культивирования клеток. Матрица на основе ЕСМ MaxGel™ (Sigma-Aldrich), которая содержит смесь компонентов ЕСМ человека, образует гель при температуре окружающей среды.Specially designed hydrogels with modified mechanical, chemical, and biological properties have the potential to mimic ECM, thus making them suitable for 3D cell cultures. Commercial products for 3D cell culture are, for example, PuraMatrix™ cell culture matrices (3DM Inc.) and Matrigel (BD Biosciences). PuraMatrix™ is a hydrogel composed of self-assembled peptide nanofibers that resembles the structure of natural fibrillar collagen in the ECM with a fiber diameter of 5-10 nm. It also has a high water content, typically 99.5%. Peptide hydrogels are described in US 7449180 and WO 2004/007683. Matrigel is a gel-like mixture of proteins secreted by tumor cells in mice. This mixture resembles the complex extracellular environment found in many tissues and is used by cell biologists as a cell culture substrate. A MaxGel™ ECM-based matrix (Sigma-Aldrich), which contains a mixture of human ECM components, forms a gel at ambient temperature.

Бактериальную целлюлозу (ВС) используют в ранозаживляющих мембранах и в качестве каркаса при культивировании клеток. Ограничением для применения бактериальной целлюлозы при культивировании клеток является структура, присущая ферментируемому материалу: при культивировании, из ВС в ферментере образуются очень плотные пленки на границе раздела «воздух-вода». Образующиеся пленки являются слишком плотными для 3D-культивирования клеток и различных модификаций. При использовании в качестве матрицы для культивирования клеток пористость матрицы на основе ВС следует повысить до значения, которое требуется для адекватного проникновения клеток и формирования кластеров клеток.Bacterial cellulose (BC) is used in wound healing membranes and as a scaffold in cell culture. A limitation for the use of bacterial cellulose in cell culture is the structure inherent in the fermented material: during cultivation, very dense films are formed from the BC in the fermenter at the air-water interface. The resulting films are too dense for 3D cell culture and various modifications. When used as a cell culture matrix, the porosity of the BC-based matrix should be increased to a value that is required for adequate cell penetration and formation of cell clusters.

В US 5254471 описан носитель для культивирования клеток, содержащий ультратонкие волокна. В WO 2009/126980 описаны гидрогели на основе целлюлозы, каркасное вещество которых состоит по существу или полностью из целлюлозы и которые образуются посредством регенерации из органических растворителей. В ЕР1970436 В1 описано вещество-носитель для недифференцированных клеточных культур. В ЕР2633032 В1 описаны композиции растительного происхождения для культивирования и доставки клеток, содержащие нановолокна целлюлозы и/или их производные. ЕР2633033 В1 относится к композициям для культивирования и доставки клеток, содержащим нановолокна целлюлозы и/или их производные на основе микробной целлюлозы. В US9593304B2 описаны материалы для культивирования и переноса стволовых клеток в 3D-культуру. Такие материалы содержат нанофибриллярную целлюлозу в форме непрерывных 3D-структур и представляют собой биосовместимый гидрогель.US 5,254,471 describes a cell culture carrier containing ultrafine fibers. WO 2009/126980 describes cellulose-based hydrogels whose framework material consists essentially or entirely of cellulose and which are formed by regeneration from organic solvents. EP1970436 B1 describes a carrier substance for undifferentiated cell cultures. EP2633032 B1 describes plant-derived cell culture and delivery compositions containing cellulose nanofibers and/or derivatives thereof. EP2633033 B1 relates to cell culture and delivery compositions containing cellulose nanofibers and/or microbial cellulose derivatives thereof. US9593304B2 describes materials for culturing and transferring stem cells to 3D culture. Such materials contain nanofibrillar cellulose in the form of continuous 3D structures and represent a biocompatible hydrogel.

Новые биоматериалы и способы культивирования клеток млекопитающих ex vivo становятся все более необходимыми для изучения физиологии клеток и тканей и для выращивания замещающей ткани для регенеративной медицины, например, в случае трансплантации клеток. Двухмерная (2D) культура представляла собой парадигму типичной клеточной культуры in vitro; тем не менее, продемонстрировано, что клетки ведут себя более естественным образом при культивировании в 3D-средах. Пермиссивные синтетические гидрогели и стимулирующие природные гидрогели снискали популярность в качестве платформ для клеточных 3D-культур; однако, каждая из обеих этих систем все еще имеет ограничения.New biomaterials and methods for culturing mammalian cells ex vivo are becoming increasingly necessary for studying the physiology of cells and tissues and for growing replacement tissue for regenerative medicine, for example in the case of cell transplantation. Two-dimensional (2D) culture was a paradigm of a typical in vitro cell culture; however, cells have been shown to behave more naturally when cultured in 3D media. Permissive synthetic hydrogels and stimulating natural hydrogels have gained popularity as 3D cell culture platforms; however, each of both of these systems still has limitations.

Нанофибриллярная целлюлоза (NFC) представляет собой пригодный материал для 3D-культивирования клеток. NFC гидрогель (GrowDex™, UPM-Kymmene, Helsinki, Finland) на основе сорта природной нанофибриллярной целлюлозы особенно подходит для поддержания, например, образования сфероидов. Однако, типы клеток, которые в естественных условиях имеют тенденцию к росту и распространению, т.е. занимают большое пространство или являются объемными, как нервные клетки, не растут оптимальным образом на нанофибриллярной целлюлозе указанного сорта, а в некоторых случаях рост клеток ограничен.Nanofibrillar cellulose (NFC) is a suitable material for 3D cell culture. NFC hydrogel (GrowDex™, UPM-Kymmene, Helsinki, Finland) based on a variety of natural nanofibrillar cellulose is particularly suitable for supporting eg spheroid formation. However, cell types that naturally tend to grow and spread, ie. occupy a large space or are voluminous, like nerve cells, do not grow optimally on nanofibrillar cellulose of the specified grade, and in some cases cell growth is limited.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯBRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION

2D-Культуры нейронов более просты в обращении, но не имитируют ситуацию in vivo, при которой клетки взаимодействуют друг с другом и с окружающей средой, как в 3D-культурах, например, в 2D-культурах отсутствует тканеспецифичная архитектура (Geckil et al., 2010; Nisbet et al., 2008). Кроме того, нервные клетки имеют более сложную морфологию в 3D, и 3D-структуры могут усиливать созревание и ингибировать пролиферацию нервных клеток, происходящих из стволовых клеток. Таким образом, при разработке in vitro имитирующих in vivo моделей или клеточных продуктов для трансплантационной терапии очень важным является изучение клеток в 3D.2D cultures of neurons are easier to handle, but do not mimic the in vivo situation in which cells interact with each other and with the environment, as in 3D cultures, for example, 2D cultures lack tissue-specific architecture (Geckil et al., 2010 ; Nisbet et al., 2008). In addition, nerve cells have a more complex morphology in 3D, and 3D structures can enhance maturation and inhibit proliferation of stem cell-derived nerve cells. Thus, when developing in vitro mimics or cell products for transplant therapy, it is very important to study the cells in 3D.

Ранее сообщалось, что анионные полимеры могут оказывать поддерживающее действие на нервные клетки (Hoffman, 2002). Авторы настоящего изобретения обнаружили, что анионная нанофибриллярная целлюлоза (aNFC) является более подходящим гидрогелем, чем нативный NFC гидрогель, для поддержания распространения и развития растущих клеток. В качестве примера, нервные клетки человека культивировали с образованием нейронных сетей. Гидрогели на основе aNFC лучше подходили для поддержания нервных клеток и в особенности для отрастания нейритов у одиночных клеток. Это улучшение основывается на двух улучшенных характеристиках гидрогеля: 1) анионном заряде на поверхности нанофибриллярной целлюлозы, индуцирующем перемещение клеток в гидрогелях. Клетки (в особенности нервные) имеют тенденцию воспринимать заряженные группы в фибриллах и распространяться вдоль/по направлению вытянутых фибрилл. 2) Прочность геля у анионного гидрогеля выше по сравнению с нативным сортом. Таким образом, культивирование клеток может быть осуществлено при более низком содержании фибрилл. Более низкое содержание твердых веществ дает возможность для более свободного перемещения клеток и образования отростков в гидрогеле, поскольку фибриллы не препятствуют перемещению клеток или, например, образованию нейритов. Оптимальное содержание твердых веществ в образце aNFC ниже 0,5 масс. %, предпочтительно ниже 0,4 масс. %.It has previously been reported that anionic polymers may have a supportive effect on nerve cells (Hoffman, 2002). The present inventors have found that anionic nanofibrillar cellulose (aNFC) is a more suitable hydrogel than native NFC hydrogel to support proliferation and development of growing cells. As an example, human nerve cells have been cultured to form neural networks. aNFC-based hydrogels were better suited for maintaining nerve cells and especially for neurite outgrowth in single cells. This improvement is based on two improved characteristics of the hydrogel: 1) the anionic charge on the surface of the nanofibrillar cellulose, which induces cell movement in hydrogels. Cells (especially nerve cells) tend to take charge groups in fibrils and spread along/in the direction of elongated fibrils. 2) The gel strength of the anionic hydrogel is higher compared to the native grade. Thus, cell culture can be carried out at a lower fibril content. The lower solids content allows for freer cell movement and outgrowth in the hydrogel because the fibrils do not interfere with cell movement or, for example, neurite formation. The optimum solids content in the aNFC sample is below 0.5 wt. %, preferably below 0.4 wt. %.

Настоящее изобретение относится к композиции для культивирования растущих клеток, причем указанная композиция содержит aNFC растительного происхождения в форме гидрогеля. Более конкретно, изобретение относится к композиции для культивирования растущих клеток, причем указанная композиция содержит 0,05-0,5 масс. % aNFC растительного происхождения в форме гидрогеля.The present invention relates to a composition for culturing growing cells, said composition containing aNFC of plant origin in the form of a hydrogel. More specifically, the invention relates to a composition for culturing growing cells, and said composition contains 0.05-0.5 wt. % aNFC of plant origin in the form of a hydrogel.

Один из аспектов изобретения относится к матрице для культивирования клеток, при этом матрица содержит живые клетки и композицию для культивирования растущих клеток, причем указанная композиция содержит 0,05-0,5 масс. % aNFC растительного происхождения, и клетки присутствуют в указанной матрице в 3D- или 2D-расположении.One aspect of the invention relates to a cell culture matrix, wherein the matrix contains living cells and a composition for culturing growing cells, said composition containing 0.05-0.5 wt. % aNFC of plant origin, and the cells are present in the specified matrix in a 3D or 2D arrangement.

Один из аспектов изобретения относится к способу получения композиции для культивирования растущих клеток, причем указанная композиция содержит 0,05-0,5 масс. % aNFC растительного происхождения в форме гидрогеля, при этом указанный способ включает:One aspect of the invention relates to a method for obtaining a composition for culturing growing cells, and the specified composition contains 0.05-0.5 wt. % aNFC of plant origin in the form of a hydrogel, while this method includes:

а) предоставление aNFC; иa) providing aNFC; and

б) смешивание указанной aNFC с водой.b) mixing said aNFC with water.

Другой аспект относится к способу 3D- или 2D-культивирования клеток или тканей, включающему предоставление композиции для культивирования растущих клеток, причем указанная композиция содержит 0,05-0,5 масс. % aNFC растительного происхождения в форме гидрогеля, инокулирование указанной композиции по меньшей мере одной клеткой и культивирование с получением клеточной массы, либо в форме матрицы, содержащей живые клетки в 3D- или 2D-расположении, которые подвергают культивированию, с получением клеточной массы.Another aspect relates to a method for 3D or 2D cell or tissue culturing, comprising providing a composition for culturing growing cells, said composition containing 0.05-0.5 wt. % aNFC of plant origin in the form of a hydrogel, inoculation of the specified composition with at least one cell and cultivation to obtain a cell mass, or in the form of a matrix containing living cells in a 3D or 2D arrangement, which are subjected to cultivation, to obtain a cell mass.

Согласно другому аспекту композицию, содержащую 0,05-0,5 масс. % aNFC растительного происхождения в форме гидрогеля, применяют для культивирования растущих клеток.According to another aspect, a composition containing 0.05-0.5 wt. % aNFC of plant origin in the form of a hydrogel, used for culturing growing cells.

Характерные признаки данного изобретения представлены в прилагаемой формуле изобретения.Characteristic features of this invention are presented in the attached claims.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВBRIEF DESCRIPTION OF GRAPHICS

На Фиг. 1 показана классификация потерь гидрогеля в образцах: умеренная потеря геля (А) и сильная потеря геля (В). Белые стрелки-указатели указывают на области потери геля. Масштабная линейка на изображениях соответствует 500 мкм. Представлены изображения для образца 0,30%-ной aNFC объемом 60 мкл.On FIG. 1 shows the classification of hydrogel loss in samples: moderate gel loss (A) and severe gel loss (B). White pointer arrows indicate areas of gel loss. The scale bar in the images corresponds to 500 µm. Images are shown for a sample of 0.30% aNFC with a volume of 60 μl.

На Фиг. 2 показаны примеры образцов гидрогеля с хорошим ростом (А), умеренным ростом (В) и слабым ростом (С). Стрелки-указатели на изображениях указывают на отрастание нейритов. Маркерами на изображениях являются DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол) (голубой цвет), MAP-2 (ассоциированный с микротрубочками белок 2) (зеленый цвет) и В-тубулин III (красный цвет). Масштабная линейка на изображениях соответствует 500 мкм. Гидрогелями на изображениях являются aNFC, 0,30%, 60 мкл (A), aNFC, 0,65%, 60 мкл (В) и Growdex, 1,50%, 60 мкл (С).On FIG. 2 shows examples of hydrogel samples with good growth (A), moderate growth (B), and poor growth (C). Pointer arrows on the images indicate neurite outgrowth. Image markers are DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) (blue), MAP-2 (microtubule-associated protein 2) (green), and B-tubulin III (red). The scale bar in the images corresponds to 500 µm. The hydrogels in the images are aNFC, 0.30%, 60 µl (A), aNFC, 0.65%, 60 µl (B) and Growdex, 1.50%, 60 µl (C).

На Фиг. 3 показаны конфокальные изображения клеток, культивированных погруженными внутрь 1,50%-ного гидрогеля Growdex в течение двух недель. Три стека конфокальных изображений (1, 2 и 3) представлены в виде х-проекции максимальной интенсивности сверху вниз (А), проекции максимальной интенсивности сбоку и в виде визуализации в 3D. В плоскости х*у визуализируемая область составляет 377,13 мкм на 377,13 мкм на всех изображениях (А). Высота конфокальных стеков варьирует (z-направление, В). Изображения как А, так и В приведены в одном и том же масштабе. Все представленные изображения получены для образца объемом 60 мкл. Маркерами на изображениях являются DAPI (голубой цвет), МАР-2 (зеленый цвет) и В-тубулин III (красный цвет).On FIG. 3 shows confocal images of cells cultured immersed in 1.50% Growdex hydrogel for two weeks. The three stacks of confocal images (1, 2 and 3) are shown as a top-down maximum intensity x-projection (A), a maximum intensity side projection, and a 3D rendering. In the x*y plane, the rendered area is 377.13 µm by 377.13 µm in all images (A). The height of the confocal stacks varies (z-direction, B). Both A and B are shown at the same scale. All images shown are from a 60 µl sample. Image markers are DAPI (blue), MAP-2 (green), and B-tubulin III (red).

На Фиг. 4 показаны конфокальные изображения клеток, культивированных погруженными внутрь 1,00%-ного гидрогеля Growdex в течение двух недель. Три стека конфокальных изображений (1, 2 и 3) представлены в виде х-проекции максимальной интенсивности сверху вниз (А), проекции максимальной интенсивности сбоку и в виде визуализации в 3D. В плоскости х*у визуализируемая область составляет 377,13 мкм на 377,13 мкм на всех изображениях (А). Высота конфокальных стеков варьирует (z-направление, В). Изображения как А, так и В приведены в одном и том же масштабе. Все представленные изображения получены для образца объемом 60 мкл. Маркерами на изображениях являются DAPI (голубой цвет), МАР-2 (зеленый цвет) и В-тубулин III (красный цвет).On FIG. 4 shows confocal images of cells cultured immersed in 1.00% Growdex hydrogel for two weeks. The three stacks of confocal images (1, 2 and 3) are shown as a top-down maximum intensity x-projection (A), a maximum intensity side projection, and a 3D rendering. In the x*y plane, the rendered area is 377.13 µm by 377.13 µm in all images (A). The height of the confocal stacks varies (z-direction, B). Both A and B are shown at the same scale. All images shown are from a 60 µl sample. Image markers are DAPI (blue), MAP-2 (green), and B-tubulin III (red).

На Фиг. 5 показаны конфокальные изображения клеток, культивированных погруженными внутрь 0,65%-ного гидрогеля на основе aNFC в течение двух недель. Три стека конфокальных изображений (1, 2 и 3) представлены в виде х-проекции максимальной интенсивности сверху вниз (А), проекции максимальной интенсивности сбоку и в виде визуализации в 3D. В плоскости х*у визуализированная область составляет 377,13 мкм на 377,13 мкм на всех изображениях (А). Высота конфокальных стеков варьирует (z-направление, В). Изображения как А, так и В приведены в одном и том же масштабе. Все представленные изображения получены для образца объемом 60 мкл. Маркерами на изображениях являются DAPI (голубой цвет), МАР-2 (зеленый цвет) и В-тубулин III (красный цвет).On FIG. 5 shows confocal images of cells cultured embedded in a 0.65% aNFC-based hydrogel for two weeks. The three stacks of confocal images (1, 2 and 3) are shown as a top-down maximum intensity x-projection (A), a maximum intensity side projection, and a 3D rendering. In the x*y plane, the rendered area is 377.13 µm by 377.13 µm in all images (A). The height of the confocal stacks varies (z-direction, B). Both A and B are shown at the same scale. All images shown are from a 60 µl sample. Image markers are DAPI (blue), MAP-2 (green), and B-tubulin III (red).

На Фиг. 6 показаны конфокальные изображения клеток, культивированных погруженными внутрь 0,45%-ного гидрогеля на основе aNFC в течение двух недель. Три стека конфокальных изображений (1, 2 и 3) представлены в виде х-проекции максимальной интенсивности сверху вниз (А), проекции максимальной интенсивности сбоку и в виде визуализации в 3D. В плоскости х*у визуализированная область составляет 377,13 мкм на 377,13 мкм на всех изображениях (А). Высота конфокальных стеков варьирует (z-направление, В). Изображения как А, так и В приведены в одном и том же масштабе. Изображения 1 и 3 получены для образца объемом 60 мкл, а изображение 2 получено для образца объемом 80 мкл. Маркерами на изображениях являются DAPI (голубой цвет), МАР-2 (зеленый цвет) и В-тубулин III (красный цвет).On FIG. 6 shows confocal images of cells cultured embedded in a 0.45% aNFC-based hydrogel for two weeks. The three stacks of confocal images (1, 2 and 3) are shown as a top-down maximum intensity x-projection (A), a maximum intensity side projection, and a 3D rendering. In the x*y plane, the rendered area is 377.13 µm by 377.13 µm in all images (A). The height of the confocal stacks varies (z-direction, B). Both A and B are shown at the same scale. Images 1 and 3 are from a 60 µl sample, and image 2 is from an 80 µl sample. Image markers are DAPI (blue), MAP-2 (green), and B-tubulin III (red).

На Фиг. 7 показаны конфокальные изображения клеток, культивированных погруженными внутрь 0,30%-ного гидрогеля на основе aNFC в течение двух недель. Три стека конфокальных изображений (1, 2 и 3) представлены в виде х-проекции максимальной интенсивности сверху вниз (А), проекции максимальной интенсивности сбоку и в виде визуализации в 3D. В плоскости х*у визуализированная область составляет 377,13 мкм на 377,13 мкм на всех изображениях (А). Высота конфокальных стеков варьирует (z-направление, В). Изображения как А, так и В приведены в одном и том же масштабе. Изображение 1 получено для образца объемом 60 мкл, а изображения 2 и 3 получены для образца объемом 80 мкл. Маркерами на изображениях являются DAPI (голубой цвет), МАР-2 (зеленый цвет) и В-тубулин III (красный цвет).On FIG. 7 shows confocal images of cells cultured embedded in a 0.30% aNFC-based hydrogel for two weeks. The three stacks of confocal images (1, 2 and 3) are shown as a top-down maximum intensity x-projection (A), a maximum intensity side projection, and a 3D rendering. In the x*y plane, the rendered area is 377.13 µm by 377.13 µm in all images (A). The height of the confocal stacks varies (z-direction, B). Both A and B are shown at the same scale. Image 1 is from a 60 µl sample and images 2 and 3 are from an 80 µl sample. Image markers are DAPI (blue), MAP-2 (green), and B-tubulin III (red).

На Фиг. 8 в увеличенном масштабе показаны изображения отрастания нейритов для агрегатов клеток (Фиг. 4, 1А) в сравнении с одиночными клетками (Фиг. 7, 1А), представленные в виде х-проекции максимальной интенсивности сверху вниз. Маркерами на изображениях являются DAPI (голубой цвет), МАР-2 (зеленый цвет) и В-тубулин III (красный цвет).On FIG. 8 shows enlarged images of neurite outgrowth for cell aggregates (FIG. 4, 1A) compared to single cells (FIG. 7, 1A), presented as a top-down x-projection of maximum intensity. Image markers are DAPI (blue), MAP-2 (green), and B-tubulin III (red).

На Фиг. 9 показано образование имеющих округлую форму сфероидов фибробластов кожи человека (HDF) в гидрогеле GrowDex (Фиг. 9А). В гидрогеле GrowDexT клетки HDF растут в виде кластеров и образуют отростки, и это позволяет предположить, что клетки воспринимают свое окружение (Фиг. 9В).On FIG. 9 shows the formation of rounded human skin fibroblast (HDF) spheroids in GrowDex hydrogel (FIG. 9A). In the GrowDexT hydrogel, HDF cells grow in clusters and form outgrowths, suggesting that the cells sense their environment (FIG. 9B).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Аспекты настоящего изобретения относятся к композициям для культивирования клеток, структурам клеточных 3D-культур и способам их получения и применения при культивировании клеток. Если не указано иное, то термины, использованные в описании и формуле изобретения, имеют значения, обычно применяемые в области культивирования клеток. Конкретно, приведенные далее термины имеют значения, указанные ниже.Aspects of the present invention relate to cell culture compositions, 3D cell culture structures, and methods for their preparation and use in cell culture. Unless otherwise indicated, the terms used in the description and claims have the meanings commonly used in the field of cell culture. Specifically, the following terms have the meanings given below.

Термин «целлюлозная масса» относится к целлюлозным фибриллам, которые выделяют из любого растительного целлюлозного или лигноцеллюлозного исходного материала с использованием химических, механических, термомеханических или химико-термомеханических способов варки целлюлозы, например, крафт-процесс, сульфатный процесс, натронная варка, органосольвентная варка. Целлюлозная масса может быть подвергнута отбеливанию с использованием традиционных способов отбеливания.The term "pulp" refers to cellulose fibrils that are isolated from any plant cellulose or lignocellulosic source material using chemical, mechanical, thermomechanical or chemothermomechanical pulping methods, e.g. The pulp can be bleached using conventional bleaching methods.

Термин «нативная целлюлозная масса» или «нативная целлюлоза» относится в данном описании к любой целлюлозной массе, которая не была химически модифицирована после процесса варки и возможного процесса отбеливания.The term "native pulp" or "native pulp" refers in this specification to any pulp that has not been chemically modified after the pulping process and possibly the bleaching process.

Термин «растительного происхождения» или «целлюлозный материал растительного происхождения» может относиться к древесине, и указанная древесина может быть древесиной хвойного дерева, такого как ель, сосна, пихта, лиственница, дугласова пихта или тсуга, либо древесиной лиственного дерева, такого как береза, осина, тополь, ольха, эвкалипт или акация, либо быть смесью древесины хвойных деревьев и древесины лиственных деревьев. Недревесные материалы растительного происхождения могут происходить, например, из сельскохозяйственных отходов, злаковых или других растительных материалов, таких как солома, листья, кора, семена, шелуха, цветки, растения или плоды хлопчатника, кукурузы, пшеницы, овса, ржи, ячменя, риса, льна, пеньки, манильской пеньки, сизальской пеньки, джута, рами, кенафа, багассы, бамбука или камыша или их смесей.The term "vegetable" or "vegetable cellulosic material" may refer to wood, and said wood may be the wood of a coniferous tree, such as spruce, pine, fir, larch, Douglas fir, or hemlock, or the wood of a hardwood tree, such as birch, aspen, poplar, alder, eucalyptus or acacia, or be a mixture of coniferous and deciduous wood. Non-timber plant materials may, for example, be derived from agricultural waste, cereals or other plant materials such as straw, leaves, bark, seeds, husks, flowers, plants or fruits of cotton, corn, wheat, oats, rye, barley, rice, flax, hemp, manila hemp, sisal hemp, jute, ramie, kenaf, bagasse, bamboo or cane, or mixtures thereof.

Термин «механически дезинтегрированный» относится в данном описании к тому, что для получения нанофибриллярной целлюлозы осуществляют механическую дезинтеграцию целлюлозной массы или окисленного целлюлозного исходного материала с использованием подходящего оборудования, такого как рафинер, дробилка, гомогенизатор, аппарат для получения коллоидной целлюлозы, фрикционная дробилка, ультразвуковой диспергатор, флюидизатор, такой как микрофлюидизатор, макрофлюидизатор или гомогенизатор по типу флюидизатора. Предпочтительно используют механически дезинтегрированную нанофибриллярную целлюлозу.The term “mechanically disintegrated” refers in this specification to mechanical disintegration of pulp or oxidized cellulose starting material using suitable equipment such as refiner, crusher, homogenizer, colloidal cellulose apparatus, friction crusher, ultrasonic to obtain nanofibrillar cellulose. a dispersant, a fluidizer such as a microfluidizer, a macrofluidizer, or a fluidizer-type homogenizer. Preferably, mechanically disintegrated nanofibrillar cellulose is used.

С использованием различных технологий производства разработаны несколько разных сортов нанофибриллярной целлюлозы. Эти сорта обладают разными свойствами, зависящими от способа получения, степени образования волокон и химического состава. Химический состав данных сортов также варьирует. В зависимости от источника исходного материала, например, HW (древесины лиственных деревьев) в сравнении с SW (древесиной хвойных деревьев), конечный продукт - нанофибриллярная целлюлоза - имеет разный полисахаридный состав. Обычно неионные или нативные сорта характеризуются большим диаметром фибрилл, в то время как фибриллы химически модифицированных сортов намного тоньше и образуют непрерывную сеть. Среднечисленный диаметр фибрилл целлюлозной нанофибриллы составляет соответственно от 1 до 200 нм, предпочтительно, чтобы среднечисленный диаметр фибрилл нативных сортов составлял от 1 до 100 нм, а химически модифицированных сортов от 1 до 20 нм. У модифицированных сортов также более узкое распределение по размерам. Для применений с целью культивирования клеток нанофибриллярная целлюлоза предпочтительно является нетоксичной для клеток.Several different grades of nanofibrillar cellulose have been developed using different manufacturing techniques. These varieties have different properties, depending on the method of production, the degree of fiber formation and chemical composition. The chemical composition of these varieties also varies. Depending on the source of the starting material, eg HW (hardwood wood) versus SW (softwood wood), the final product, nanofibrillar cellulose, has a different polysaccharide composition. Typically, non-ionic or native varieties are characterized by a large fibril diameter, while the fibrils of chemically modified varieties are much thinner and form a continuous network. The number average fibril diameter of a cellulose nanofibril is 1 to 200 nm, respectively, preferably the number average fibril diameter of native varieties is 1 to 100 nm, and that of chemically modified varieties is 1 to 20 nm. Modified varieties also have a narrower size distribution. For cell culture applications, the nanofibrillar cellulose is preferably non-toxic to the cells.

Подразумевается, что использованный в данном описании термин «нанофибриллярная целлюлоза» охватывает нанофибриллярные структуры, высвобождаемые из целлюлозных материалов растительного происхождения, таких как целлюлозная масса из древесины лиственных пород или древесины хвойных пород.As used herein, the term "nanofibrillar cellulose" is intended to encompass nanofibrillar structures released from cellulosic materials of plant origin, such as hardwood or softwood pulp.

Номенклатура, касающаяся нанофибриллярной целлюлозы, не является единообразной, и в литературе применяются противоречивые термины. Например, для нанофибриллярной целлюлозы могли бы быть использованы в качестве синонимов приведенные ниже термины: целлюлозное нановолокно (CNF), состоящая из нанофибрилл целлюлоза, нанофибриллированная целлюлоза (NFC), наноразмерная фибриллированная целлюлоза, микрофибриллярная целлюлоза, целлюлозные микрофибриллы, микрофибриллированная целлюлоза (MFC) и состоящая из фибрилл целлюлоза. Самые мелкие целлюлозные структуры из целлюлозной массы растительного происхождения, такой как целлюлоза древесины, включают молекулы целлюлозы, единичные фибриллы и микрофибриллы. Единицами микрофибрилл являются пучки из единичных фибрилл, образованные в результате физически обусловленной коалесценции, как механизма уменьшения свободной поверхностной энергии. Тем не менее, в данном описании термин «нанофибриллярная целлюлоза» или NFC относится к совокупности целлюлозных нанофибрилл, высвобождаемых из целлюлозной массы или целлюлозного материала, в частности, из единиц микрофибрилл. Их диаметры могут варьировать в зависимости от источника. Целлюлозная нанофибрилла обычно характеризуется большим значением соотношения сторон: длина превышает один микрометр, в то время как диаметр в типичном случае составляет менее 100 нм. Самые мелкие нанофибриллы сходны с так называемыми единичными фибриллами, диаметр которых обычно находится в диапазоне 2-12 нм. Размеры высвобождаемых нанофибрилл или пучков нанофибрилл зависят от исходного материала, каких-либо предварительных обработок и способа дезинтеграции. В нанофибриллярной целлюлозе могут содержаться интактные, не подвергшиеся фибриллированию единицы микрофибрилл. Подразумевается, что использованный в данном описании термин «нанофибриллярная целлюлоза» не охватывает нефибриллярные, стержнеобразные нанокристаллы или нитевидные кристаллы целлюлозы.The nomenclature regarding nanofibrillar cellulose is not uniform and conflicting terms are used in the literature. For example, for nanofibrillar cellulose, the following terms could be used as synonyms: cellulose nanofiber (CNF), nanofibrillated cellulose, nanofibrillated cellulose (NFC), nanofibrillated cellulose, microfibrillated cellulose, cellulose microfibrils, microfibrillated cellulose (MFC), and cellulose fibrils. The smallest cellulosic structures from vegetable pulp, such as wood pulp, include cellulose molecules, single fibrils, and microfibrils. Units of microfibrils are bundles of single fibrils formed as a result of physically conditioned coalescence as a mechanism for reducing the free surface energy. However, as used herein, the term "nanofibrillar cellulose" or NFC refers to the collection of cellulose nanofibrils released from pulp or cellulosic material, in particular microfibril units. Their diameters may vary depending on the source. Cellulosic nanofibril is typically characterized by a large aspect ratio: the length exceeds one micrometer, while the diameter is typically less than 100 nm. The smallest nanofibrils are similar to the so-called single fibrils, the diameter of which is usually in the range of 2-12 nm. The sizes of the released nanofibrils or nanofibril bundles depend on the starting material, any pre-treatments and the method of disintegration. Nanofibrillar cellulose may contain intact, unfibrillated units of microfibrils. As used herein, the term "nanofibrillar cellulose" is intended not to encompass non-fibrillar, rod-shaped nanocrystals, or whiskers of cellulose.

Термин «анионная нанофибриллярная целлюлоза» или «aNFC» относится к нанофибриллярной целлюлозе, которая была подвергнута химической дериватизации, т.е. химически модифицирована с целью придания нанофибриллярной целлюлозе анионных свойств посредством введения на ее поверхность отрицательно заряженных групп. Для aNFC растительного происхождения по изобретению химическую дериватизацию осуществляют до получения NFC, т.е. до проведения механической дезинтеграции целлюлозного исходного материала.The term "anionic nanofibrillar cellulose" or "aNFC" refers to nanofibrillar cellulose that has been chemically derivatized, i. chemically modified to impart anionic properties to nanofibrillar cellulose by introducing negatively charged groups onto its surface. For aNFC of plant origin according to the invention, chemical derivatization is carried out before obtaining NFC, i.e. prior to mechanical disintegration of the cellulosic starting material.

Нанофибриллярной целлюлозой по настоящему изобретению является aNFC. aNFC получают посредством анионизации. Анионизация представляет собой пример химической дериватизации, т.е. пример химической модификации. Анионизация или получение aNFC представляет собой модификацию с целью придания нанофибриллярной целлюлозе анионных свойств посредством введения на ее поверхность отрицательно заряженных групп. Одним из примеров анионизации является анионизация с использованием окисления в присутствии (2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-ил)оксила (TEMPO). Другими примерами являются карбоксиметилирование и сульфонирование. Эти реакции проводят в качестве предварительной обработки целлюлозной массы или другого целлюлозного исходного материала перед проведением механической дезинтеграции или высвобождением нанофибрилл другими способами. В результате осуществления данных способов получают заряженную aNFC. Обычно модификации подвергают весь исходный материал, и возможные количества немодифицированной целлюлозы являются незначительными.The nanofibrillar cellulose of the present invention is aNFC. aNFC is obtained by anionization. Anionization is an example of chemical derivatization, i.e. example of chemical modification. Anionization or obtaining aNFC is a modification to impart anionic properties to nanofibrillar cellulose by introducing negatively charged groups onto its surface. One example of anionization is anionization using oxidation in the presence of (2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-yl)oxyl (TEMPO). Other examples are carboxymethylation and sulfonation. These reactions are carried out as a pre-treatment of the pulp or other cellulosic starting material before mechanical disintegration or release of nanofibrils in other ways. As a result of these methods, a charged aNFC is obtained. Typically, the entire starting material is modified and the possible amounts of unmodified cellulose are negligible.

Согласно одному из воплощений анионная нанофибриллярная целлюлоза растительного происхождения содержит карбоксиметилированную или сульфонированную нанофибриллярную целлюлозу.According to one of the embodiments of the anionic nanofibrillar cellulose of plant origin contains carboxymethylated or sulfonated nanofibrillar cellulose.

Нанофибриллярные целлюлозы, особенно подходящие для применения в настоящем изобретении, выбраны из aNFC растительного происхождения и/или любых комбинаций разных aNFC. Обычно aNFC, используемые в настоящем изобретении, представляют собой нативные целлюлозы, которые были анионизированы, или альтернативно модифицированные целлюлозы, которые анионизированы.Nanofibrillar celluloses particularly suitable for use in the present invention are selected from plant derived aNFCs and/or any combination of different aNFCs. Typically, the aNFCs used in the present invention are native celluloses that have been anionized, or alternatively modified celluloses that have been anionized.

Получение производных целлюлозы физическими методами с получением анионной целлюлозы может быть осуществлено путем физической адсорбции анионных веществ на поверхности целлюлозы.Obtaining cellulose derivatives by physical methods to obtain anionic cellulose can be carried out by physical adsorption of anionic substances on the surface of cellulose.

Дериватизированные сорта обычно получают из отбеленных целлюлозных масс. Любые присутствующие молекулы гемицеллюлозы могут также подвергаться дериватизации в подвергнутых дериватизации сортах NFC.Derivative grades are usually obtained from bleached pulps. Any hemicellulose molecules present may also be derivatized in derivatized NFC varieties.

Примеры получения нанофибриллярной целлюлозы описаны, например, в ЕР2782937А1, где описано карбоксиметилирование, и в WO 2015/015056, где описано окисление.Examples of the preparation of nanofibrillar cellulose are described, for example, in EP2782937A1, where carboxymethylation is described, and in WO 2015/015056, where oxidation is described.

Дериватизированные сорта нанофибриллярной целлюлозы обычно характеризуются меньшим диаметром нанофибрилл и более узкими распределениями по размерам, чем нативные или не дериватизированные сорта нанофибриллярной целлюлозы. Чем меньше размер нанофибрилл, тем больше площадь поверхности и, следовательно, эффективная заряженная поверхность. После подвергания целлюлозы дериватизации она становится более лабильной и удобной для дезинтеграции. Как правило, нанофибриллы меньшего размера, достигнутые посредством анионной дериватизации, полезны для настоящего изобретения.Derivatized grades of nanofibrillar cellulose generally have smaller nanofibril diameters and narrower size distributions than native or non-derivatized grades of nanofibrillar cellulose. The smaller the size of the nanofibrils, the larger the surface area and hence the effective charged surface. After subjecting cellulose to derivatization, it becomes more labile and easier to disintegrate. Generally, the smaller nanofibrils achieved through anionic derivatization are useful for the present invention.

Нанофибриллы дериватизированных сортов нанофибриллярной целлюлозы обычно тоньше, чем у нативной нанофибриллярной целлюлозы. Среднечисленный диаметр нанофибрилл aNFC растительного происхождения может варьировать от 2 до 200 нм или от 2 до 100 нм. Предпочтительно, среднечисленный диаметр для aNFC растительного происхождения составляет 2-20 нм или 2-10 нм, более предпочтительно 3-6 нм. Самые мелкие нанофибриллы сходны с так называемыми единичными фибриллами, диаметр которых обычно составляет 2-12 нм. Приведенные выше значения рассчитаны на основе изображений, полученных с применением криогенной трансмиссионной электронной микроскопии (Cryo-ТЕМ). Размеры нанофибрилл или пучков нанофибрилл зависят от исходного материала и способа дезинтеграции. Выполнить точные измерения длины нанофибриллы довольно сложно. Длина нанофибрилл у aNFC растительного происхождения обычно изменяется в диапазоне от 0,3 до 50 микрометров или от 0,3 до 20 микрометров. Предпочтительно, чтобы длина составляла 0,5-20 микрометров или 0,5-10 микрометров и более предпочтительно 1-10 микрометров или 1-5 микрометров. Длина зависит от применяемого способа анионизации. Приведенные выше значения рассчитаны на основе изображений, полученных с применением электронной микроскопии или атомно-силовой микроскопии (AFM).Nanofibrils of derivatized grades of nanofibrillar cellulose are usually thinner than those of native nanofibrillar cellulose. The number average diameter of plant-derived aNFC nanofibrils can vary from 2 to 200 nm or from 2 to 100 nm. Preferably, the number average diameter for aNFC of plant origin is 2-20 nm or 2-10 nm, more preferably 3-6 nm. The smallest nanofibrils are similar to the so-called single fibrils, which are usually 2-12 nm in diameter. The above values are calculated based on images obtained using cryogenic transmission electron microscopy (Cryo-TEM). The sizes of nanofibrils or nanofibril bundles depend on the starting material and the method of disintegration. It is quite difficult to accurately measure the length of a nanofibril. The length of nanofibrils in aNFC of plant origin usually ranges from 0.3 to 50 micrometers or from 0.3 to 20 micrometers. Preferably, the length is 0.5-20 micrometers or 0.5-10 micrometers, and more preferably 1-10 micrometers or 1-5 micrometers. The length depends on the anionization method used. The above values are calculated based on images obtained using electron microscopy or atomic force microscopy (AFM).

Степень фибриллирования можно оценить исходя из анализа фибрилл, в котором оценивают количество более крупных, подвергшихся только частичному фибриллированию структур. В случае анионной нанофибриллярной целлюлозы растительного происхождения число таких не подвергшихся фибриллированию частиц на один мг сухого образца варьирует от 1 до 10000, предпочтительно от 1 до 5000, наиболее предпочтительно от 1 до 1000. Анализ фибрилл соответственно может быть проведен с использованием метода анализа от FiberLab.The degree of fibrillation can be estimated from fibril analysis, which estimates the number of larger structures that have undergone only partial fibrillation. In the case of plant derived anionic nanofibrillar cellulose, the number of such unfibrillated particles per mg of dry sample ranges from 1 to 10,000, preferably from 1 to 5,000, most preferably from 1 to 1,000. Fibril analysis can accordingly be carried out using the analysis method from FiberLab.

Нанофибриллярная целлюлоза образует структуры гидрогеля с желаемой вязкостью при диспергировании в водной среде, такой как вода. Для образования гидрогеля может быть использован любой подходящий аппарат для смешивания или составления смесей.Nanofibrillar cellulose forms hydrogel structures of desired viscosity when dispersed in an aqueous medium such as water. Any suitable mixing or compounding apparatus may be used to form the hydrogel.

Изучение реологических свойств гидрогелей на основе нанофибриллярной целлюлозы растительного происхождения указывает на обратимое гелеобразование. При высоких уровнях напряжения наблюдается поведение, сходное с поведением жидкости, в то время как при низких уровнях напряжения и в состоянии покоя происходит поэтапный переход к поведению, сходному с поведением твердого тела. Поскольку изменение окружения не вызывает конформационных изменений полимерных цепей гидрогеля нанофибриллярной целлюлозы, прочность геля остается практически постоянной в широких интервалах температур, рН или ионной силы.The study of the rheological properties of hydrogels based on nanofibrillar cellulose of plant origin indicates reversible gelation. At high stress levels, fluid-like behavior is observed, while at low stress levels and at rest, there is a gradual transition to solid-like behavior. Since the change in environment does not cause conformational changes in the polymer chains of the nanofibrillar cellulose hydrogel, the strength of the gel remains practically constant over wide ranges of temperature, pH, or ionic strength.

Жесткость гидрогелей на основе нанофибриллярной целлюлозы можно оценить, исходя из измерений вязкоупругих свойств гелей. Жесткость гидрогелей на основе нанофибриллярной целлюлозы также отражает легкость растекания гидрогелей. При графическом изображении вязкости как функции от приложенного напряжения сдвига резкое уменьшение вязкости наблюдается после превышения значения критического напряжения сдвига (модуль потерь G'' больше динамического модуля упругости G' и, следовательно, тангенс угла потерь более 1).The stiffness of hydrogels based on nanofibrillar cellulose can be estimated from measurements of the viscoelastic properties of the gels. The stiffness of hydrogels based on nanofibrillar cellulose also reflects the ease of spreading of hydrogels. When graphical representation of viscosity as a function of applied shear stress, a sharp decrease in viscosity is observed after exceeding the value of the critical shear stress (loss modulus G'' is greater than the dynamic modulus of elasticity G' and, therefore, the loss tangent is greater than 1).

Ткани являются вязкоупругими материалами и состоят из клеток и ЕСМ. Жесткость или прочность матрикса является одним из многих механических сил, действующих на клетки, и рассматривается как важный медиатор клеточного поведения. Она регулирует передачу сигнала в клетках и оказывает влияние, например, на рост, выживаемость, расположение и подвижность клеток. Оптимальная жесткость варьирует в широких пределах для клеток разных видов. Например, сообщалось, что разные типы клеток печени по-разному реагируют на жесткость матрикса.Tissues are viscoelastic materials and are composed of cells and ECM. The stiffness or strength of the matrix is one of the many mechanical forces acting on cells and is regarded as an important mediator of cellular behavior. It regulates signal transduction in cells and influences, for example, cell growth, survival, arrangement and motility. Optimum stiffness varies widely for different types of cells. For example, it has been reported that different types of liver cells respond differently to matrix stiffness.

Также продемонстрировано, что жесткость отдельных коллагеновых фибрилл может варьировать воспроизводимым образом, и оказывает значительное влияние на клеточный фенотип.It has also been demonstrated that the stiffness of individual collagen fibrils can vary in a reproducible manner, and has a significant effect on the cellular phenotype.

Кроме того, известно, что клетки обладают чувствительностью к механическому воздействию на относительно коротких расстояниях, примерно равных ширине соседней клетки. Следовательно, в ткани клетка вряд ли будет ощущать действие механических сил за пределами своего ближнего соседа. Кроме того, клетки, из которых состоят ткани, обладают способностью к адгезии, прикреплены к некоторой совокупности соседствующих с ними клеток и к окружающему ЕСМ. Большинству клеток, но не всем, адгезия необходима для выживания.In addition, it is known that cells are sensitive to mechanical action at relatively short distances, approximately equal to the width of the neighboring cell. Therefore, in a tissue, a cell is unlikely to feel the action of mechanical forces outside its nearest neighbor. In addition, the cells that make up tissues have the ability to adhere, are attached to a certain set of cells adjacent to them and to the surrounding ECM. Most cells, but not all, require adhesion to survive.

Сообщалось, что нанофибриллярная целлюлоза хорошо выполняет функцию матрицы для клеточных культур. Считается, что сеть целлюлозных нанофибрилл имитирует ЕСМ, поддерживая жизнеспособность и пролиферацию клеток. Жесткость гидрогелей на основе нанофибриллярной целлюлозы можно легко корректировать путем разведения.It has been reported that nanofibrillar cellulose performs well as a matrix for cell cultures. It is believed that the network of cellulose nanofibrils mimics the ECM, maintaining cell viability and proliferation. The stiffness of hydrogels based on nanofibrillar cellulose can be easily adjusted by dilution.

Нанофибриллярная целлюлоза по настоящему изобретению обладает свойствами, которые обеспечивают получение оптимальной матрицы для культивирования клеток и тканей.The nanofibrillar cellulose of the present invention has properties that provide an optimal matrix for culturing cells and tissues.

Имели место затруднения при поддержании и выращивании клеток во всей толще гидрогелей. В настоящем изобретении условия поддержания и роста клеток улучшены. Нанофибриллярная целлюлоза по настоящему изобретению и гидрогель на ее основе обеспечивают оптимальную жесткость или прочность и оптимальную толщину.There were difficulties in maintaining and growing cells in the entire thickness of the hydrogels. In the present invention, the conditions for maintaining and growing cells are improved. The nanofibrillar cellulose of the present invention and the hydrogel based thereon provide optimum stiffness or strength and optimum thickness.

В настоящем изобретении количество нанофибриллярной целлюлозы, необходимое для достижения желаемой жесткости, может быть ниже по сравнению с предшествующим уровнем техники.In the present invention, the amount of nanofibrillar cellulose required to achieve the desired stiffness may be lower than in the prior art.

Нанофибриллярная целлюлоза может иметь динамический модуль упругости в диапазоне от 1 до 40 Па, предпочтительно от 3 до 30, более предпочтительно от 5 до 20, при диспергировании в воде в концентрации 0,5 масс. %.Nanofibrillar cellulose may have a dynamic modulus in the range of 1 to 40 Pa, preferably 3 to 30, more preferably 5 to 20, when dispersed in water at a concentration of 0.5 wt. %.

Согласно одному из воплощений aNFC растительного происхождения имеет тангенс угла потерь более 1, когда диапазон динамического модуля упругости составляет 1-20 Па, предпочтительно 2-10 Па, при диспергировании в воде в концентрации 0,5 масс. %).According to one embodiment, aNFC of plant origin has a loss tangent greater than 1 when the elastic modulus range is 1-20 Pa, preferably 2-10 Pa, when dispersed in water at a concentration of 0.5 wt. %).

Тангенс угла потерь для нанофибриллярной целлюлозы по настоящему изобретению составляет значение менее 0,3, предпочтительно менее 0,25, когда напряжение сдвига менее 0,5 Па.The loss tangent of the nanofibrillar cellulose of the present invention is less than 0.3, preferably less than 0.25, when the shear stress is less than 0.5 Pa.

Согласно одному из воплощений изобретения aNFC растительного происхождения содержит нанофибриллярную целлюлозу, полученную из окисленного целлюлозного исходного материала, имеющую содержание карбоксилатных групп выше 0,75 ммоль/г, предпочтительно 0,75-1,6 ммоль/г, более предпочтительно 0,9-1,2 ммоль/г из расчета на массу целлюлозного исходного материала.According to one of the embodiments of the invention, aNFC of plant origin contains nanofibrillar cellulose obtained from oxidized cellulose starting material, having a content of carboxylate groups above 0.75 mmol/g, preferably 0.75-1.6 mmol/g, more preferably 0.9-1 .2 mmol/g based on the weight of the cellulosic starting material.

Согласно одному из воплощений изобретения aNFC растительного происхождения представляет собой целлюлозу I типа (кристаллическую форму I целлюлозы). Согласно другому воплощению aNFC растительного происхождения также может содержать другие формы целлюлозы. Известно несколько разных кристаллических структур целлюлозы. Структуры соответствуют расположению водородных связей между нитями целлюлозы и внутри них. Природная целлюлоза представляет собой целлюлозу I типа. Целлюлоза в регенерированных целлюлозных фибриллах представляет собой целлюлозу II типа. Целлюлоза высших растений состоит главным образом из субструктурированной целлюлозы Iβ.According to one embodiment of the invention, the plant derived aNFC is type I cellulose (crystal form I of cellulose). According to another embodiment, a plant-derived aNFC may also contain other forms of cellulose. Several different crystal structures of cellulose are known. The structures correspond to the arrangement of hydrogen bonds between and within the cellulose filaments. Natural cellulose is type I cellulose. The cellulose in regenerated cellulose fibrils is type II cellulose. Cellulose of higher plants consists mainly of substructured cellulose Iβ.

Согласно одному из воплощений aNFC растительного происхождения представляет собой окисленную в присутствии TEMPO нанофибриллярную целлюлозу. aNFC растительного происхождения может быть получена методом окисления в присутствии TEMPO, включающим стадии сначала окисления первичных спиртовых групп целлюлозы до альдегидных групп и групп карбоновых кислот путем окисления в присутствии TEMPO с использованием гипохлорита натрия в качестве основного окислителя с получением окисленной целлюлозы, характеризующейся определенным содержанием карбоксильных групп, и затем образования фибрилл из окисленной массы с получением aNFC. aNFC растительного происхождения по изобретению может представлять собой окисленную в присутствии TEMPO нанофибриллярную целлюлозу, имеющую альдегидные группы в количестве меньшем или равном 0,3 ммоль/г, предпочтительно меньшем или равном 0,2 ммоль/г, более предпочтительно меньшем или равном 0,15 ммоль/г из расчета на массу сухого вещества нанофибриллярной целлюлозы.In one embodiment, a plant derived aNFC is nanofibrillar cellulose oxidized in the presence of TEMPO. aNFC of plant origin can be obtained by oxidation in the presence of TEMPO, which includes the steps of first oxidizing the primary alcohol groups of cellulose to aldehyde groups and carboxylic acid groups by oxidation in the presence of TEMPO using sodium hypochlorite as the main oxidant to obtain oxidized cellulose, characterized by a certain content of carboxyl groups , and then the formation of fibrils from the oxidized mass to obtain aNFC. The plant-derived aNFC of the invention may be TEMPO-oxidized nanofibrillar cellulose having aldehyde groups less than or equal to 0.3 mmol/g, preferably less than or equal to 0.2 mmol/g, more preferably less than or equal to 0.15 mmol /g based on the mass of dry matter of nanofibrillar cellulose.

Химический состав или модификацию нанофибриллярной целлюлозы обычно описывают как степень замещения (DS). Получение производных путем анионизации целлюлозного исходного материала, используемого в настоящем изобретении, проводят до достижения определенных уровней степени замещения перед фибриллированием/механической дезинтеграцией. Степень замещения в способе химической дериватизации может варьировать в широких пределах.The chemical composition or modification of nanofibrillar cellulose is usually described as the degree of substitution (DS). Anionization derivatization of the cellulose starting material used in the present invention is carried out to certain levels of degree of substitution prior to fibrillation/mechanical disintegration. The degree of substitution in a chemical derivatization process can vary widely.

Согласно одному из воплощений изобретения aNFC растительного происхождения содержит нанофибриллярную целлюлозу, полученную из анионизированного целлюлозного исходного материала, имеющую степень замещения (ds или DS) по меньшей мере 0,08. Степень замещения для aNFC растительного происхождения обычно находится в диапазоне уровней ds от 0,08 до 0,3. Предпочтительно, степень замещения для aNFC растительного происхождения составляет от 0,1 до 0,25 или более предпочтительно от 0,12 до 0,2. Например, степень замещения может быть равна 0,10, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18 или 0,19. Было установлено, что в настоящем изобретении такие конкретные уровни ds являются предпочтительными, поскольку при таких уровнях ds анионная нанофибриллярная целлюлоза, полученная после механической обработки, обладает оптимальными свойствами. Получали гидрогель высокого качества, обладающий высокой вязкостью и с большим значением соотношения сторон. Помимо этого, необходимую для измельчения энергию поддерживали на среднем уровне.According to one embodiment of the invention, a plant derived aNFC comprises nanofibrillar cellulose derived from an anionized cellulose starting material having a degree of substitution (ds or DS) of at least 0.08. The degree of substitution for plant based aNFCs is typically in the range of ds levels from 0.08 to 0.3. Preferably, the degree of substitution for aNFC of plant origin is from 0.1 to 0.25, or more preferably from 0.12 to 0.2. For example, the degree of substitution may be 0.10, 0.11, 0.12, 0.13, 0.14, 0.15, 0.16, 0.17, 0.18, or 0.19. It has been found that in the present invention, such specific ds levels are preferred because at such ds levels, the anionic nanofibrillar cellulose obtained after mechanical processing has optimal properties. A high quality hydrogel with high viscosity and high aspect ratio was obtained. In addition, the energy required for grinding was maintained at an average level.

Согласно одному из воплощений изобретения aNFC растительного происхождения содержит нанофибриллярную целлюлозу, получаемую из карбоксиметилированного целлюлозного исходного материала, имеющую степень замещения выше 0,1, предпочтительно от 0,1 до 0,3, более предпочтительно от 0,12 до 0,2.According to one embodiment of the invention, a plant-derived aNFC comprises nanofibrillar cellulose derived from carboxymethylated cellulose starting material having a degree of substitution above 0.1, preferably from 0.1 to 0.3, more preferably from 0.12 to 0.2.

Целлюлоза aNFC растительного происхождения может быть получена из целлюлозного материала, источником которого является растительный целлюлозный или лигноцеллюлозный исходный материал, с использованием химических, механических, термомеханических или химико-термомеханических способов варки целлюлозы. Согласно одному неограничивающему воплощению, такой исходный целлюлозный материал не содержит регенерированных целлюлозных фибрилл, где целлюлоза представляет собой целлюлозу II типа, и/или фибриллы вторичной переработки.Cellulose aNFC of plant origin can be obtained from cellulosic material, the source of which is vegetable cellulose or lignocellulosic source material, using chemical, mechanical, thermomechanical or chemothermomechanical methods of pulping. According to one non-limiting embodiment, such a starting cellulose material does not contain regenerated cellulose fibrils, where the cellulose is type II cellulose, and/or recycled fibrils.

Согласно одному неограничивающему аспекту, aNFC растительного происхождения представляет собой не подвергнутую мерсеризации нанофибриллярную целлюлозу.In one non-limiting aspect, a plant derived aNFC is non-mercerized nanofibrillar cellulose.

Термин «гидрогель», или «гель», или «гидрогель на основе нанофибриллярной целлюлозы» относится к водной дисперсии нанофибриллярной целлюлозы, имеющей гомогенную и непрерывную гелевую структуру. Гидрогель может быть образован путем объединения нанофибриллярной целлюлозы, например, с водой, буферным раствором или средой для культивирования клеток либо каким-либо другим водным раствором, возможно дополненным вспомогательными веществами. Термин «гидрогель» применительно к нанофибриллярной целлюлозе относится к форме, в которой водная дисперсия нанофибриллярной целлюлозы имеет тангенс угла потерь менее 1. Гидрогель представляет собой полимерный материал, который проявляет способность набухать и удерживать значительную долю воды в пределах своей структуры, но он не растворяется в воде. Гидрогели на основе NFC образуются спонтанно без образования ковалентных связей; поэтому их прочность без труда может быть изменена, например, в результате разбавления. Гидрогель на основе NFC обладает хорошей суспендирующей емкостью. Гидрогель на основе NFC представляет собой так называемый обратимый или физический гель с вовлечением физического перекрестного сшивания посредством переплетения фибрилл. Взаимодействия в данной сети могут быть нарушены посредством приложения усилия, поэтому гидрогели на основе NFC обладают способностью к разжижению при сдвиге. Вязкоупругие свойства каркаса на основе гидрогеля из нанофибриллярной целлюлозы растительного происхождения значительно отличаются от таковых для каркасов на основе нанофибриллярной целлюлозы из других источников, как например, для каркасов на основе бактериальной целлюлозы.The term "hydrogel" or "gel" or "nanofibrillar cellulose hydrogel" refers to an aqueous dispersion of nanofibrillar cellulose having a homogeneous and continuous gel structure. The hydrogel can be formed by combining the nanofibrillar cellulose with, for example, water, a cell culture buffer or medium, or some other aqueous solution, optionally supplemented with excipients. The term "hydrogel" in relation to nanofibrillar cellulose refers to the form in which an aqueous dispersion of nanofibrillar cellulose has a loss tangent of less than 1. A hydrogel is a polymeric material that exhibits the ability to swell and retain a significant proportion of water within its structure, but it does not dissolve in water. NFC-based hydrogels form spontaneously without the formation of covalent bonds; therefore, their strength can easily be changed, for example, by dilution. The NFC-based hydrogel has good suspending capacity. An NFC-based hydrogel is a so-called reversible or physical gel involving physical cross-linking through fibril entanglement. The interactions in this network can be disrupted by the application of force, so NFC-based hydrogels have the ability to shear thin. The viscoelastic properties of scaffolds based on plant-derived nanofibrillar cellulose hydrogel differ significantly from those of scaffolds based on nanofibrillar cellulose from other sources, such as scaffolds based on bacterial cellulose.

Нанофибриллярная целлюлоза по настоящему изобретению имеет мутность, 20 NTU или менее, предпочтительно 10 NTU или менее, более предпочтительно 6 NTU или менее. Значение мутности может находиться в диапазоне от 20 до 1 NTU, более предпочтительно от 10 до 1 NTU, как например 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, наиболее предпочтительно от 6 до 1 NTU, в воде в концентрации 0,1 масс. %.The nanofibrillar cellulose of the present invention has a haze of 20 NTU or less, preferably 10 NTU or less, more preferably 6 NTU or less. The turbidity value may be in the range of 20 to 1 NTU, more preferably 10 to 1 NTU, such as 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, most preferably 6 to 1 NTU, in water at a concentration 0.1 wt. %.

Согласно одному из аспектов нанофибриллярная целлюлоза имеет мутность, составляющую 20 NTU или менее, предпочтительно 10 NTU или менее, более предпочтительно 6 NTU или менее, предпочтительно значение мутности находится в диапазоне от 20 до 1 NTU, более предпочтительно от 10 до 2 NTU, в воде в концентрации 0,1 масс. %).In one aspect, the nanofibrillar cellulose has a turbidity of 20 NTU or less, preferably 10 NTU or less, more preferably 6 NTU or less, preferably 20 to 1 NTU, more preferably 10 to 2 NTU, in water. at a concentration of 0.1 wt. %).

Мутность можно измерить количественно, используя оптические приборы для измерения мутности. Имеется несколько серийных турбидиметров, общедоступных для количественного измерения мутности. В случае настоящего изобретения используется способ, основанный на нефелометрии. Единицы измерения мутности в случае откалиброванного нефелометра называются нефелометрическими единицами мутности (NTU). Калибровку и регулировку измерительного прибора (турбидиметра) выполняют с использованием стандартных калибровочных образцов, после чего измеряют мутность разбавленного образца NFC.Turbidity can be quantified using optical turbidity instruments. There are several off-the-shelf turbidimeters available for the quantitative measurement of turbidity. In the case of the present invention, a method based on nephelometry is used. Turbidity units in the case of a calibrated nephelometer are called Nephelometric Turbidity Units (NTU). Calibration and adjustment of the meter (turbidimeter) is performed using standard calibration samples, after which the turbidity of the diluted NFC sample is measured.

Конечный продукт обладает отличными гелеобразующими свойствами и прозрачностью, а также гомогенной структурой. Прозрачность обусловлена отсутствием пучков фибрилл, что приводит к гомогенной структуре. Прозрачность конечного гидрогеля на основе нанофибриллярной целлюлозы дает возможность для оптической детекции клеток с помощью световой микроскопии благодаря более низкому рассеянию света. Кроме того, нанофибриллярная целлюлоза не обладает собственной флуоресценцией. Ввиду этого нанофибриллярная целлюлоза по настоящему изобретению обладает улучшенными свойствами с точки зрения визуализации. Применение нанофибриллярной целлюлозы и гидрогеля по настоящему изобретению позволяет осуществлять 3D-визуализацию, которая раньше была невозможна.The final product has excellent gelling properties and transparency, as well as a homogeneous structure. Transparency is due to the absence of fibril bundles, which leads to a homogeneous structure. The transparency of the final hydrogel based on nanofibrillar cellulose allows for optical detection of cells by light microscopy due to lower light scattering. In addition, nanofibrillar cellulose does not exhibit its own fluorescence. In view of this, the nanofibrillar cellulose of the present invention has improved imaging properties. The use of nanofibrillar cellulose and the hydrogel of the present invention allows for 3D imaging that was previously not possible.

Степень кристалличности нанофибриллярной целлюлозы по настоящему изобретению может варьировать от 60% до 80%, предпочтительно от 65 до 75%. Степень кристалличности может составлять, например, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 79% или 80%.The degree of crystallinity of the nanofibrillar cellulose of the present invention may vary from 60% to 80%, preferably from 65 to 75%. The degree of crystallinity may be, for example, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74 %, 75%, 76%, 77%, 78%, 78%, 79% or 80%.

Термин «дисперсия» применительно к нанофибриллярной целлюлозе охватывает как гидрогели на основе нанофибриллярной целлюлозы, так и более разбавленную водную систему, не отвечающую приведенному выше требованию касательно гидрогеля. Дисперсия представляет собой систему, в которой частицы диспергированы в непрерывной фазе, отличающейся от агрегатного состояния самих частиц.The term "dispersion" in relation to nanofibrillar cellulose encompasses both nanofibrillar cellulose hydrogels and a more dilute aqueous system that does not meet the hydrogel requirement above. A dispersion is a system in which particles are dispersed in a continuous phase that differs from the state of aggregation of the particles themselves.

Термин «водная среда» относится к любой водной среде, такой как вода, деионизованная вода, буферный раствор или питательная среда, подходящей для поддержания, транспортировки, выделения, культивирования, размножения, пассирования или дифференцировки клеток или тканей. Водная среда может дополнительно содержать различные вспомогательные вещества, такие как специальные компоненты внеклеточного матрикса, сыворотка, факторы роста, антибиотики, консерванты, пептиды и белки. Как известно в данной области техники, выбор сред для культивирования клеток зависит от типа подлежащих культивированию клеток. Существует большое количество коммерческих сред для культивирования клеток, которые поддерживают рост недифференцированных или дифференцированных клеток. Примеры сред для культивирования клеток, подходящих для применения в настоящем изобретении, включают mTeSR1 (StemCell Technologies), среды для мезенхимальных стволовых клеток (Lonza, Walkersville, MD, №РТ-3001), не содержащую сыворотки или фидера среду (SFM) для культивирования стволовых клеток человеческого эмбриона (hESC) STEMPRO® (Invitrogen), среды Уильямс Е (Invitrogen) и среды для дифференцировки.The term "aqueous medium" refers to any aqueous medium, such as water, deionized water, buffer solution, or nutrient medium, suitable for maintaining, transporting, isolating, culturing, propagating, passage, or differentiating cells or tissues. The aqueous medium may additionally contain various adjuvants such as special extracellular matrix components, serum, growth factors, antibiotics, preservatives, peptides and proteins. As known in the art, the choice of cell culture media depends on the type of cells to be cultured. There are a large number of commercial cell culture media that support the growth of undifferentiated or differentiated cells. Examples of cell culture media suitable for use in the present invention include mTeSR1 (StemCell Technologies), mesenchymal stem cell media (Lonza, Walkersville, MD, No. PT-3001), serum-free or feeder-free media (SFM) for stem cell culture. human embryonic cells (hESC) STEMPRO® (Invitrogen), Williams E medium (Invitrogen) and differentiation media.

Термин «суспендированный» или «суспензия» при использовании в контексте структур 3D-объекта или гидрогеля относится к гетерогенной смеси водной среды и гидрогеля, при этом гидрогель может быть представлен в виде отдельных или взаимосвязанных структур гидрогеля.The term "suspended" or "suspension" when used in the context of 3D object or hydrogel structures refers to a heterogeneous mixture of an aqueous medium and a hydrogel, wherein the hydrogel can be represented as separate or interconnected hydrogel structures.

Термин «матрица для культивирования клеток» относится к системе, содержащей клетки и/или ткань и 3D-объект, причем клетки и/или ткань по меньшей мере частично погружены внутрь указанного объекта в 3D- или 2D-расположении. Обозначения 3D и 2D в контексте клеточных культур относятся к способу расположения клеток, например, 3D может относиться к кластере- или сфероидоподобному расположению, а 2D к расположению в виде одного или нескольких слоев. Термин «матрица для культивирования клеток» также относится к материалу, спроектированному для культивирования клеток и обеспечивающему получение матрицы для роста, которая увеличивает доступную для прикрепления клеток поверхность с тем, чтобы имитировать инфраструктуру ткани.The term "cell culture matrix" refers to a system containing cells and/or tissue and a 3D object, the cells and/or tissue being at least partially embedded within said object in a 3D or 2D arrangement. The designations 3D and 2D in the context of cell cultures refer to the way the cells are arranged, for example, 3D may refer to a cluster- or spheroid-like arrangement, and 2D to an arrangement in one or more layers. The term "cell culture matrix" also refers to a material designed for cell culture that provides a growth matrix that increases the surface area available for cell attachment to mimic tissue infrastructure.

Термин «клеточная культура» или «культивирование клеток» относится к поддержанию, транспортировке, выделению, культивированию, размножению, пассированию или дифференцировке клеток или тканей. Клетки могут находиться в любой конфигурации, например, в виде отдельных клеток, монослоев, кластеров клеток или сфероидов либо в виде ткани.The term "cell culture" or "cell culture" refers to the maintenance, transport, isolation, cultivation, propagation, passaging or differentiation of cells or tissues. The cells may be in any configuration, for example, as single cells, monolayers, clusters of cells or spheroids, or as a tissue.

Термин «растущая клетка» относится к клетке, которая в естественных условиях имеет тенденцию к росту, ветвлению и распространению, т.е. занимает большое пространство или является объемной. Растущая клетка может расти, например, используя образующиеся отростки или выступающие части, и/или используя выступающие части/отростки для перемещения, например, в матрикс. Растущая клетка может использовать отростки или выступающие части также для образования каркасов или сетей. Примерами растущих клеток являются нервные клетки, которые растут в том смысле, что они отращивают нейриты. Ветвление дендритов представляет собой многостадийный биологический процесс, посредством которого нейроны образуют новые дендритные деревья и ветви для создания новых синапсов. Эндотелиальные клетки, которые образуют выстилки кровеносных сосудов и лимфатических сосудов, также можно считать растущими клетками. Многие типы клеток млекопитающих могут агрегировать и дифференцироваться в многоклеточные 3D-сфероиды при культивировании в суспензии или неадгезивном окружении. Растущие клетки вместо образования сфероидов перемещаются и растут.The term "growing cell" refers to a cell that naturally tends to grow, branch and spread, i. occupies a large space or is voluminous. A growing cell can grow, for example, using the resulting processes or protrusions, and/or using the protrusions/protrusions to move, for example, into the matrix. A growing cell may also use processes or protrusions to form scaffolds or networks. Examples of growing cells are nerve cells, which grow in the sense that they grow neurites. Dendritic branching is a multi-stage biological process by which neurons form new dendritic trees and branches to create new synapses. Endothelial cells, which form the lining of blood vessels and lymphatic vessels, can also be considered growing cells. Many mammalian cell types can aggregate and differentiate into multicellular 3D spheroids when cultured in suspension or non-adherent environment. Growing cells instead of forming spheroids move and grow.

Термин «нервная клетка» или «нейрон» относится к трем основным фенотипам клеток ЦНС, т.е. нейронам, глиальным клеткам и астроцитам. «Нейрит» или «отросток нейрона» относится к любой выступающей части клеточного тела нейрона. Эта выступающая часть может представлять собой или аксон, или дендрит. Термин «отрастание нейритов» относится к ключевому процессу во время миграции и дифференцировки нейронов. Сложная внутриклеточная передача сигнала вовлечена в инициацию отрастания и последующего удлинения нейритов. На образование сложных нейронных сетей сильно влияет ветвление аксонов. Предпочтительно, чтобы клетками, используемыми в данном изобретении, были нервные клетки. Термин «нейроноподобные клетки» относится к клеткам, которые не считаются зрелыми нейронами. Термин «нейроноподобный» означает, что эти клетки обладают свойствами, схожими со свойствами нейронов, например, способностью к высвобождению нейромедиатора с использованием везикул.The term "nerve cell" or "neuron" refers to the three main phenotypes of CNS cells, i. neurons, glial cells and astrocytes. "Neurite" or "neuronal outgrowth" refers to any protruding part of the cell body of a neuron. This protruding part can be either an axon or a dendrite. The term "neurite outgrowth" refers to a key process during neuronal migration and differentiation. Complex intracellular signaling is involved in the initiation of regrowth and subsequent elongation of neurites. The formation of complex neural networks is strongly influenced by axon branching. Preferably, the cells used in the present invention are nerve cells. The term "neuron-like cells" refers to cells that are not considered mature neurons. The term "neuron-like" means that these cells have properties similar to those of neurons, such as the ability to release a neurotransmitter using vesicles.

Термин «эндотелиальные клетки» относится к клеткам сосудистого эндотелия, которые находятся в непосредственном контакте с кровью, и к лимфатическим эндотелиальным клеткам, которые находятся в непосредственном контакте с лимфой.The term "endothelial cells" refers to vascular endothelial cells that are in direct contact with blood and lymphatic endothelial cells that are in direct contact with lymph.

Производное нанофибриллярной целлюлозы может представлять собой любое химически или физически модифицированное производное нанофибриллярной целлюлозы или пучки нанофибрилл. Химическая модификация может быть основана, например, на реакции карбоксиметилирования, окисления, эфиризации или этерификации молекул целлюлозы. Описанная модификация может быть проведена до, после или во время получения нанофибриллярной целлюлозы. В результате проведения некоторых модификаций могут быть получены NFC материалы, которые разлагаются в организме человека. Производное может содержать стимулирующие рост белки, присоединенные ковалентными связями или посредством слабых связей либо с использованием адсорбции.The nanofibrillar cellulose derivative may be any chemically or physically modified nanofibrillar cellulose derivative or nanofibril bundles. The chemical modification may be based, for example, on the reactions of carboxymethylation, oxidation, etherization or esterification of cellulose molecules. The described modification can be carried out before, after or during the production of nanofibrillar cellulose. As a result of some modifications, NFC materials can be obtained that decompose in the human body. The derivative may contain growth-promoting proteins attached by covalent bonds or through weak bonds or using adsorption.

Микробиологическая чистота нанофибриллярной целлюлозы и гидрогелей, содержащих ее, является существенным показателем для проведения культивирования клеток. Поэтому нанофибриллярная целлюлоза может быть подвергнута стерилизации перед проведением экспериментов по культивированию клеток в гидрогелевой форме. Помимо этого, важно свести к минимуму загрязнение продукта микроогранизмами до и во время фибриллирования. Перед фибриллированием целесообразно проводить отбор целлюлозной массы с целлюлозного завода в асептических условиях незамедлительно после стадии отбеливания, когда эта масса все еще остается стерильной.The microbiological purity of nanofibrillar cellulose and hydrogels containing it is an essential indicator for cell culture. Therefore, nanofibrillar cellulose can be sterilized before cell culture experiments in hydrogel form. In addition, it is important to minimize microbial contamination of the product before and during fibrillation. Prior to fibrillation, it is expedient to take the pulp from the pulp mill under aseptic conditions immediately after the bleaching step, when the pulp is still sterile.

Известно, что макромолекулы целлюлозы являются молекулами, обладающими очень высокой химической стабильностью. Гидролиз целлюлозы требует применения жестких условий, и обычно используют сильные кислоты, подобные 56%-ной серной кислоте.Cellulose macromolecules are known to be very chemically stable molecules. The hydrolysis of cellulose requires harsh conditions, and strong acids like 56% sulfuric acid are commonly used.

Размеры отдельных целлюлозных нанофибрилл у нанофибриллярной целлюлозы близки к размерам фибрилл коллагена в ЕСМ, т.е. 4-10 нм. Поэтому гидрогели на основе NFC можно использовать в качестве матрицы для клеточных 3D-культур.The sizes of individual cellulose nanofibrils in nanofibrillar cellulose are close to the sizes of collagen fibrils in ECM; 4-10 nm. Therefore, NFC-based hydrogels can be used as a matrix for 3D cell cultures.

В экспериментах с культивированием клеток по настоящему изобретению используют химически модифицированную aNFC, образующую оптически прозрачные гидрогели. Подробное описание материалов представлено в разделе «Примеры, материалы и методы». Концентрацию aNFC в гидрогеле адаптируют к концентрации, подходящей для клеток, подлежащих культивированию. Концентрация aNFC в общем объеме может варьировать в диапазоне 0,05-3% (масс./об.) в зависимости, например, от типа клеток и клеточной линии. При культивировании нервных клеток может быть использован диапазон 0,05-0,5% (масс/об.), например, концентрации в масс/об., составляющие 0,05%, 0,055%, 0,06%, 0,065%, 0,07%, 0,075%, 0,08%, 0,085%, 0,09%, 0,095%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45% или 0,5%. Предпочтительно, чтобы данный диапазон составлял 0,05-0,35% (масс/об.).The cell culture experiments of the present invention use chemically modified aNFC to form optically clear hydrogels. A detailed description of the materials is presented in the "Examples, materials and methods" section. The concentration of aNFC in the hydrogel is adapted to a concentration suitable for the cells to be cultured. The concentration of aNFC in the total volume may vary in the range of 0.05-3% (w/v) depending on, for example, cell type and cell line. When culturing nerve cells, a range of 0.05-0.5% (w/v) can be used, for example, w/v concentrations of 0.05%, 0.055%, 0.06%, 0.065%, 0 .07%, 0.075%, 0.08%, 0.085%, 0.09%, 0.095%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0, 35%, 0.4%, 0.45% or 0.5%. Preferably, this range is 0.05-0.35% (w/v).

Нанофибриллярная целлюлоза или ее производное по настоящему изобретению может содержать химически или физически модифицированные производные нанофибриллярной целлюлозы или пучки нанофибрилл.The nanofibrillar cellulose or a derivative thereof of the present invention may contain chemically or physically modified nanofibrillar cellulose derivatives or nanofibril bundles.

Нанофибриллярная целлюлоза, описанная в данном изобретении, не является тем же материалом, что и так называемые нитевидные кристаллы целлюлозы, которые также известны как: нитевидные нанокристаллы целлюлозы, нанокристаллы целлюлозы, наностержни целлюлозы, стержневидные микрокристаллы целлюлозы или нанопроволоки целлюлозы. В некоторых случаях для описания обоих видов материалов используется одинаковая терминология, например, в работе Kuthcarlapati и др. (2008), где исследуемый материал назван «целлюлозным нановолокном», хотя он явно относился к нитевидным нанокристаллам целлюлозы. Обычно эти материалы не содержат аморфных сегментов в составе такой фибриллярной структуры, как нанофибриллы целлюлозы, которые приводят к образованию более жесткой структуры. Кроме того, нитевидные кристаллы целлюлозы короче нанофибрилл целлюлозы; в типичном случае их длина составляет менее одного микрометра.The nanofibrillar cellulose described in this invention is not the same material as the so-called cellulose whiskers, which are also known as: cellulose nanocrystal whiskers, cellulose nanocrystals, cellulose nanorods, cellulose rod-like microcrystals or cellulose nanowires. In some cases, the same terminology is used to describe both types of materials, for example, in Kuthcarlapati et al. (2008), where the material under study is called “cellulose nanofiber”, although it clearly refers to filamentous cellulose nanocrystals. Typically, these materials do not contain amorphous segments within the fibrillar structure such as cellulose nanofibrils, which result in a more rigid structure. In addition, cellulose filiform crystals are shorter than cellulose nanofibrils; they are typically less than one micrometer long.

Термин «изделие для культивирования клеток» относится к любому изделию, подходящему для культивирования клеток, включая одно- и многолуночные планшеты, такие как 6-, 12-, 96-, 384- и 1536-луночные планшеты, банки, чашки Петри, колбы, многослойные колбы, химические стаканы, плоские чашки, роллерные флаконы, кассеты, такие как разделенные на камеры и многокамерные кассеты для культивирования, пробирки, покровные стекла, пакеты, мембраны, полые волокна, гранулы и микроносители, чашки, вращающиеся бутылки, перфузионные камеры, шприцы, биореакторы и ферментеры.The term "cell culture article" refers to any article suitable for cell culture, including single and multi-well plates such as 6-, 12-, 96-, 384-, and 1536-well plates, jars, petri dishes, flasks, multilayer flasks, beakers, flat dishes, roller bottles, cassettes such as chambered and multi-chamber culture cassettes, test tubes, coverslips, bags, membranes, hollow fibers, granules and microcarriers, dishes, rotating bottles, perfusion chambers, syringes , bioreactors and fermenters.

Термин «формирование» относится к формированию композиции, возможно во вспомогательном материале или на его поверхности. Формирование может быть осуществлено методами 3D-печати, вращения, распыления, нанесения капель, растекания, нанесения покрытия или пропитки с одновременным или последующим перекрестным сшиванием, предпочтительно формирование композиции непосредственно в условиях перекрестного сшивания или химического взаимодействия.The term "formation" refers to the formation of the composition, possibly in the auxiliary material or on its surface. The formation can be carried out by 3D printing, rotation, spraying, dropping, spreading, coating or impregnation with simultaneous or subsequent cross-linking, preferably forming the composition directly under conditions of cross-linking or chemical interaction.

Термин «сформированная матрица» относится к матрице, которая имеет такую форму, как проволока, 3D-шнур, трубка, ячейка, гранула, лист, сеть, покрытие, прослойка или пропитка.The term "formed matrix" refers to a matrix that has a shape such as a wire, 3D cord, tube, mesh, pellet, sheet, network, coating, interlayer, or impregnation.

Термин «совместное культивирование» относится к культивированию клеток, при котором в одной и той же матрице для культивирования одновременно культивируют более одного типа разных клеток. Совместное культивирование дает возможность использовать разные типы клеток в одной системе для обработки. В настоящем изобретении по меньшей мере два типа клеток разного происхождения можно культивировать в качестве совместной культуры.The term "co-culture" refers to the cultivation of cells in which more than one type of different cells are cultured simultaneously in the same culture matrix. Co-cultivation makes it possible to use different types of cells in the same system for processing. In the present invention, at least two types of cells of different origin can be cultivated as a co-culture.

Термин «печать» относится к способу получения структур и образцов, содержащих aNFC в качестве печатного материала, посредством 3D-печати, лазерной печати, экструзии, формования или электроспиннинга.The term "printing" refers to a method for obtaining structures and samples containing aNFC as a printing material, through 3D printing, laser printing, extrusion, molding or electrospinning.

Композиция для культивирования клеток, матрица для культивирования клеток или изделие по настоящему изобретению могут дополнительно содержать подходящие вспомогательные вещества, выбранные из группы, состоящей из питательных веществ, буферных агентов, рН индикаторов, компонентов внеклеточного матрикса, сыворотки, факторов роста, антибиотиков, консервантов, пептидов и белков.The cell culture composition, cell culture matrix or article of the present invention may further contain suitable excipients selected from the group consisting of nutrients, buffering agents, pH indicators, extracellular matrix components, serum, growth factors, antibiotics, preservatives, peptides. and proteins.

В зависимости от клеточной линии и предполагаемого применения культивируемых клеток культивирование может быть осуществлено в 2D- или 3D-формате. Клетки диспергируют или инокулируют на поверхности 3D-объекта или изделия либо в 3D-объекте или изделии, что обеспечивает рост клеток в 2D- или 3D-формате на структурах гидрогеля и проникновение размножающихся клеток и внеклеточных структур культивируемых клеток внутрь структур гидрогеля.Depending on the cell line and the intended use of the cultured cells, culture can be performed in 2D or 3D format. Cells are dispersed or inoculated on the surface of a 3D object or article or in a 3D object or article, which allows cells to grow in 2D or 3D format on hydrogel structures and penetration of proliferating cells and extracellular structures of cultured cells into hydrogel structures.

Согласно одному из воплощений клетки, полученные из клеточной культуры, содержащей композицию по настоящему изобретению, можно использовать, например, для приготовления клеточных моделей заболеваний центральной нервной системы, 3D-печатных структур, в особенности для нервных клеток, для лечения травм спинного мозга, для диагностики болезни Альцгеймера или болезни Паркинсона, либо для тестирования лекарственных средств в клеточной культуре.According to one of the embodiments, cells obtained from a cell culture containing the composition of the present invention can be used, for example, for the preparation of cellular models of diseases of the central nervous system, 3D printed structures, especially for nerve cells, for the treatment of spinal cord injuries, for the diagnosis Alzheimer's disease or Parkinson's disease, or for drug testing in cell culture.

Удаление целлюлозных нанофибрилл может быть осуществлено, например, с использованием смесей ферментов, содержащих все ферменты, необходимые для полного разложения молекул целлюлозы, а также других происходящих из древесины компонентов, присутствующих в ней, таких как гемицеллюлозы. Надлежащими ферментами являются, например, разработанные для рассматриваемой NFC смеси ферментов и имеющиеся в продаже препараты целлюлаз-гемицеллюлаз. Состав смеси может варьировать в зависимости от химического состава исходного материала, используемого для получения NFC. Например, когда для получения NFC используют древесную березовую массу, смесь включает в себя по меньшей мере интактные эндо- и экзоцеллюлазы или их части, эндо-ксиланазы, β-D-гликозидазы и β-D-ксилозидазы. Для гидролиза NFC, полученной из древесины хвойных пород, эту смесь необходимо дополнить по меньшей мере эндо-маннаназами и β-D-маннозидазами. Преимущество разработанных смесей, компонентами которых являются очищенные ферменты, заключается в том, что они не содержат дополнительных белков или других нежелательных компонентов, таких как обладающие побочными активностями компоненты, дербис после культивирования микроорганизмов или остатки культуральной жидкости, что очень часто встречается в случае имеющихся в продаже ферментных препаратов. Особенно опасно, если такой препарат содержит протеазы, которые могут воздействовать на поверхности культивируемых клеток. Имеющиеся в продаже ферментные смеси, предназначенные для проведения полного гидролиза растительных материалов, тоже могут быть использованы для гидролиза NFC, но более предпочтительно после по меньшей мере стадии грубой очистки, такой как очистка с использованием гель-фильтрации или диализа. Независимо от ферментного препарата, представляющего собой либо разработанную, либо имеющуюся в продаже смесь, компоненты выбирают такими, чтобы они могли оптимально гидролизовать NFC, например, с точки зрения рН, температуры и ионной силы. В продаже имеются препараты, которые действуют либо при кислотных значениях рН (рН 3,5-5), либо при основных значениях рН (рН 6-8), и при температурах от комнатной температуры и вплоть до 60-80°С. Очень часто клетки выращивают при температуре 37°С, которая является оптимальной для большинства целлюлаз и гемицеллюлаз.Removal of cellulose nanofibrils can be carried out, for example, using mixtures of enzymes containing all the enzymes necessary for the complete decomposition of the cellulose molecules, as well as other wood-derived components present in it, such as hemicelluloses. Suitable enzymes are, for example, enzyme mixtures developed for the NFC in question and commercially available preparations of cellulases-hemicellulases. The composition of the mixture may vary depending on the chemical composition of the starting material used to obtain NFC. For example, when birch wood pulp is used to produce NFC, the mixture includes at least intact endo- and exo-cellulases or portions thereof, endo-xylanases, β-D-glycosidases, and β-D-xylosidases. For the hydrolysis of NFC obtained from softwood, this mixture must be supplemented with at least endo-mannanases and β-D-mannosidases. The advantage of the developed mixtures, the components of which are purified enzymes, is that they do not contain additional proteins or other undesirable components, such as components with side activities, derby after culturing microorganisms or culture liquid residues, which is very common in the case of commercially available enzyme preparations. It is especially dangerous if such a preparation contains proteases that can affect the surfaces of cultured cells. Commercially available enzyme mixtures designed to carry out complete hydrolysis of plant materials can also be used for NFC hydrolysis, but more preferably after at least a rough purification step, such as purification using gel filtration or dialysis. Regardless of the enzyme preparation, which is either a developed or commercially available mixture, the components are chosen such that they can optimally hydrolyze the NFC, for example, in terms of pH, temperature and ionic strength. Commercially available preparations that act either at acidic pH values (pH 3.5-5) or basic pH values (pH 6-8), and at temperatures from room temperature up to 60-80°C. Very often, cells are grown at 37° C., which is optimal for most cellulases and hemicellulases.

Общеизвестно, что определенные ферменты, целлюлазы, способны гидролизовать [бета]-(1-4)-связи в целлюлозе. Например, эндо-1,4-β-глюканазы (EG), которые катализируют расщепление цепей целлюлозы в случайных положениях вдали от концов цепи; экзоглюканазы или экзоцеллобиогидролазы (СВН), которые катализируют расщепление целлюлозы путем отделения молекул с обоих концов цепи с образованием димеров целлобиозы; и [бета]-глюкозидазы (BGL), которые катализируют гидролиз образуемых олигосахаридов и звеньев целлобиозы (образуемых в результате действия EG и СВН) до глюкозы. Соответственно, можно провести ферментативный гидролиз целлюлозных нанофибрилл до глюкозы с использованием целлюлаз (Ahola и др., 2008). Для полного гидролиза NFC до мономерных Сахаров необходимо, чтобы смесь ферментов содержала также эндо-действующие гемицеллюлазы, такие как ксиланазы и маннаназы, и β-D-гликозидазы, β-D-ксилозидазы и -D-маннозидазы. Когда целью является только частичный гидролиз, например, для снижения вязкости гидрогеля, то в состав смеси ферментов могут быть включены эндоглюканазы в избытке и целлобиогидролазы в меньшем количестве, или они могут вообще отсутствовать. В последнем случае в эту смесь могут быть включены гемицеллюлазы, поскольку они усиливают гидролитическое действие целлюлаз. Ферментативный гидролиз целлюлозы может быть применен в системах для культивирования клеток, содержащих целлюлозные нанофибриллы, по разным причинам. В результате гидролиза гидрогеля на основе NFC вязкость таких сред резко снижается, и структуры культивируемых клеток становятся легко доступными, например, для окрашивания. Кроме того, после гидролиза клеточные структуры могут быть перенесены или трансплантированы без целлюлозосодержащего материала. Продукт разложения, глюкоза, как правило, нетоксичен для клеток и может быть использован в качестве питательного вещества при культивировании клеток.It is well known that certain enzymes, cellulases, are able to hydrolyze [beta]-(1-4)-bonds in cellulose. For example, endo-1,4-β-glucanases (EG), which catalyze the cleavage of cellulose chains at random positions away from chain ends; exoglucanases or exocellobiohydrolases (SHC), which catalyze the breakdown of cellulose by separating molecules from both ends of the chain to form cellobiose dimers; and [beta]-glucosidases (BGL), which catalyze the hydrolysis of the resulting oligosaccharides and cellobiose units (formed by the action of EG and SHC) to glucose. Accordingly, it is possible to carry out enzymatic hydrolysis of cellulose nanofibrils to glucose using cellulases (Ahola et al., 2008). Complete hydrolysis of NFCs to monomeric sugars requires that the enzyme mixture also contain endo-acting hemicellulases such as xylanases and mannanases, and β-D-glycosidases, β-D-xylosidases and β-D-mannosidases. When the goal is only partial hydrolysis, for example, to reduce the viscosity of the hydrogel, then the mixture of enzymes may include endoglucanases in excess and cellobiohydrolases in a smaller amount, or they may be completely absent. In the latter case, hemicellulases can be included in this mixture, since they enhance the hydrolytic action of the cellulases. Enzymatic hydrolysis of cellulose can be applied in cell culture systems containing cellulose nanofibrils for various reasons. As a result of the hydrolysis of the NFC-based hydrogel, the viscosity of such media sharply decreases, and the structures of cultured cells become easily accessible, for example, for staining. In addition, after hydrolysis, cell structures can be transferred or transplanted without cellulose-containing material. The degradation product, glucose, is generally non-toxic to cells and can be used as a nutrient in cell culture.

В случае ферментативного гидролиза, например, с использованием целлюлазы для разрушения гидрогеля на основе NFC (включая aNFC), фермент может быть инактивирован или удален из системы культивирования клеток. Специалист в состоянии без труда выбрать любой соответствующий способ инактивации или удаления фермента. Примеры подходящих методов включают инактивацию ингибиторами или нейтрализующими антителами и удаление целлюлазы путем промывки, фильтрования, аффинной очистки или любого другого способа, который подходит для выбранного применения. Инактивация или удаление фермента предохраняет от наличия активного фермента, который способен разрушить структуру геля на основе NFC, в том случае, когда клетки культивируют в матрице на основе NFC после обработки ферментом. Удаление фермента также может потребоваться для некоторых последующих применений культивируемых клеток.In the case of enzymatic hydrolysis, for example, using cellulase to break down an NFC-based hydrogel (including aNFC), the enzyme can be inactivated or removed from the cell culture system. The person skilled in the art can easily select any appropriate method for inactivating or removing the enzyme. Examples of suitable methods include inactivation with inhibitors or neutralizing antibodies and removal of cellulase by washing, filtration, affinity purification, or any other method that is suitable for the chosen application. Inactivation or removal of the enzyme prevents the presence of an active enzyme that is capable of degrading the NFC-based gel structure when cells are cultured in an NFC-based matrix after treatment with the enzyme. Removal of the enzyme may also be required for some subsequent uses of cultured cells.

Согласно одному предпочтительному воплощению, композицию ферментативно обрабатывают целлюлазой в течение периода времени, достаточного по меньшей мере для частичного высвобождения клеточной массы. Согласно другому предпочтительному воплощению целлюлазу инактивируют или удаляют из клеточной массы после ферментативной обработки.According to one preferred embodiment, the composition is enzymatically treated with cellulase for a period of time sufficient to at least partially release the cell mass. According to another preferred embodiment, the cellulase is inactivated or removed from the cell mass after the enzymatic treatment.

За дифференцировкой клеток можно следить по результатам экспрессии какого-либо маркерного гена, известного в данной области техники. Например, в зависимости от конкретного применения и типа клеток можно использовать маркеры ранних или поздних генов.Cell differentiation can be monitored by the expression of any marker gene known in the art. For example, early or late gene markers may be used depending on the particular application and cell type.

Гидрогель на основе aNFC по настоящему изобретению представляет собой «прямой продукт гомогенизации указанных нанофибрилл целлюлозы», например, полученный в результате гомогенизации фибрилл влажной целлюлозной массы под высоким давлением. В водном окружении целлюлозные нанофибриллы по настоящему изобретению образуют непрерывную сеть гидрогеля из диспергированных нанофибрилл или пучков нанофибрилл. Этот гель образуют сильно гидратированные фибриллы, которые переплетены между собой даже при очень низких концентрациях. Фибриллы также могут взаимодействовать посредством образования водородных связей. Стабильные гидрогели с содержанием целлюлозных нанофибрилл всего 0,3-0,5 масс. % (полученные посредством механической дезинтеграции) могут образовываться без добавления каких-либо суспендирующих или загущающих агентов. Действительно, непосредственным продуктом данного способа является разбавленный гидрогель на основе нанофибриллярной целлюлозы. Прозрачный гидрогель на основе NFC получают аналогичным способом гомогенизации химически модифицированной (окисленной в присутствии TEMPO) целлюлозной массы.The aNFC-based hydrogel of the present invention is a "direct product of the homogenization of said cellulose nanofibrils", for example, obtained by high pressure homogenization of wet pulp fibrils. In an aqueous environment, the cellulose nanofibrils of the present invention form a continuous hydrogel network of dispersed nanofibrils or nanofibril bundles. This gel is formed by highly hydrated fibrils that are intertwined with each other even at very low concentrations. Fibrils can also interact through the formation of hydrogen bonds. Stable hydrogels with a content of cellulose nanofibrils of only 0.3-0.5 wt. % (obtained by mechanical disintegration) can be formed without the addition of any suspending or thickening agents. Indeed, the direct product of this method is a diluted hydrogel based on nanofibrillar cellulose. A transparent hydrogel based on NFC is obtained by a similar method of homogenization of chemically modified (oxidized in the presence of TEMPO) cellulose mass.

Не все виды микрофибриллированной целлюлозы ведут себя аналогичным образом, даже подпадая под категорию «микрофибриллированная целлюлоза». То есть, не все виды микрофибриллированной целлюлозы обладают идентичными свойствами и признаками. Кроме того, способ, которым получают виды микрофибриллированной целлюлозы, существенно влияет на свойства конечного продукта. Следовательно, тот факт, что целлюлозу подвергают механической дезинтеграции, имеет особое значение и влияет на получаемую структуру целлюлозных нанофибрилл.Not all types of microfibrillated cellulose behave in the same way, even falling under the category of "microfibrillated cellulose". That is, not all types of microfibrillated cellulose have identical properties and features. In addition, the way in which types of microfibrillated cellulose are obtained significantly affects the properties of the final product. Therefore, the fact that cellulose is subjected to mechanical disintegration is of particular importance and affects the resulting structure of cellulose nanofibrils.

Выводыfindings

Ранее сообщалось, что анионные полимеры могут оказывать поддерживающее действие на нервные клетки. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что гидрогель, приготовленный из aNFC, является более подходящим для поддержания распространения и развития растущих клеток. В качестве примера авторы настоящего изобретения культивировали нервные клетки человека с образованием нейронных сетей. Гидрогели на основе aNFC лучше подходили для поддержания нервных клеток, и особенно для отрастания нейритов у одиночных клеток. Это улучшение по сравнению с гидрогелями предшествующего уровня техники основывается на двух улучшенных характеристиках гидрогеля: 1) анионном заряде на поверхности нанофибриллярной целлюлозы, индуцирующем перемещение клеток в гидрогелях (поскольку клетки имеют тенденцию воспринимать заряженные группы в фибриллах и распространяться вдоль/по направлению вытянутых фибрилл), и 2) прочность геля у анионного гидрогеля выше по сравнению с нативным сортом (поскольку диаметр и размер фибрилл меньше, а количество нанофибрилл больше при том же содержании твердых веществ). Таким образом, культивирование клеток может быть осуществлено при более низком содержании фибрилл. Более низкое содержание твердых веществ дает возможность для более свободного перемещения клеток в гидрогеле, поскольку фибриллы не препятствуют перемещению. Оптимальное содержание твердых веществ в aNFC ниже 0,5 масс. %, предпочтительно ниже 0,4 масс. %.It has previously been reported that anionic polymers can have a supportive effect on nerve cells. The inventors of the present invention have found that a hydrogel prepared from aNFC is more suitable for supporting the expansion and development of growing cells. As an example, the present inventors cultured human nerve cells to form neural networks. aNFC-based hydrogels were better suited for maintaining nerve cells, and especially for neurite outgrowth in single cells. This improvement over prior art hydrogels is based on two improved hydrogel characteristics: 1) an anionic charge on the surface of the nanofibrillar cellulose inducing cell movement in hydrogels (because cells tend to take up charged groups in fibrils and propagate along/in the direction of elongated fibrils), and 2) the gel strength of the anionic hydrogel is higher compared to the native grade (because the diameter and size of the fibrils are smaller and the number of nanofibrils is larger for the same solids content). Thus, cell culture can be carried out at a lower fibril content. The lower solids content allows for freer movement of cells in the hydrogel, since the fibrils do not impede movement. The optimum solids content of aNFC is below 0.5 wt. %, preferably below 0.4 wt. %.

ПРИМЕРЫEXAMPLES

Приведенные далее примеры представляют собой иллюстрации воплощений настоящего изобретения, описанных выше, и они не предназначены для ограничения каким-либо образом данного изобретения.The following examples are illustrative of the embodiments of the present invention described above and are not intended to limit the present invention in any way.

Пример 1. Тестирование гидрогелей на основе нанофибриллярной целлюлозы с использованием нервных клеток человекаExample 1 Testing of Nanofibrillar Cellulose Hydrogels Using Human Nerve Cells

Материалы и методыMaterials and methods

Нервные клетки человека культивировали в течение 2 недель инкапсулированными в гидрогели на основе нанофибриллярной целлюлозы. В экспериментах использовали клетки, представляющие собой нейроны человека, предварительно дифференцированные из линии стволовых клеток человеческого эмбриона Regea 08/023 (Lappalainen и др., 2010;

и др., 2014). Кратко, дифференцировку hESC в нервные клетки осуществляли путем переноса кластеров hESC, содержащих приблизительно 3000 клеток, в шестилуночные планшеты со сверхнизким прикреплением (Nunc, Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY, USA) и культивирования клеток в виде плавающих агрегатов, нейросфер, в нейтральной среде для дифференцировки, содержащей смесь 1:1 DMEM/F12 (модифицированная Дульбекко среда Игла с питательной смесью Хэма F12; Gibco, Invitrogen, Finland) и нейробазальной среды, дополненную 2 мМ GlutaMax™, 1хВ27, 1xN2 (Gibco), основным фактором роста фибробластов в концентрации 20 нг/мл (bFGF, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) и пенициллином/стрептомицином в количестве 25 ед./мл (Cambrex, Belgium). Эту среду заменяли три раза в неделю и сферы механически разбивали один раз в неделю. Нейросферы культивировали в течение восьми недель, получая чистую популяцию нейронов.Human nerve cells were cultured for 2 weeks encapsulated in hydrogels based on nanofibrillar cellulose. Cells representing human neurons previously differentiated from the human embryonic stem cell line Regea 08/023 were used in the experiments (Lappalainen et al., 2010;

et al., 2014). Briefly, hESC differentiation into neural cells was accomplished by transferring hESC clusters containing approximately 3,000 cells into ultra-low attachment six-well plates (Nunc, Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY, USA) and culturing the cells as floating aggregates, neurospheres, in neutral medium. for differentiation containing a 1:1 mixture of DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium with Ham's F12 nutrient mixture; Gibco, Invitrogen, Finland) and neurobasal medium supplemented with 2 mM GlutaMax™, 1xB27, 1xN2 (Gibco), a major fibroblast growth factor in 20 ng/mL (bFGF, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) and 25 U/mL penicillin/streptomycin (Cambrex, Belgium). This medium was changed three times a week and the spheres were mechanically broken once a week. Neurospheres were cultured for eight weeks, obtaining a pure population of neurons.

Получение анионной NFCGetting Anionic NFC

aNFC получали из отбеленной целлюлозной массы путем гомогенизации под высоким давлением, используя для фибриллирования промышленный флюидизатор. Исходный материал отбирали с целлюлозного завода в асептических условиях и тщательно очищали перед гомогенизацией на стерильном оборудовании. Таким образом, микробиологическую чистоту поддерживали на протяжении всего процесса получения. Перед фибриллированием проводили анионную модификацию очищенного материала. Анионная модификация основана на окислении целлюлозной массы. Благодаря этой модификации упрощается процесс дезинтеграции целлюлозной массы до целлюлозных нанофибрилл. Кроме того, в результате данной реакции активации на поверхности aNFC появляются функциональные альдегидные и карбоксильные группы, которые повышают гидрофильность этого материала. Такие модификации описаны в WO 09/084566 и JP 20070340371. Окисленную целлюлозную массу тщательно очищали после химической модификации. Перед фибриллированием очищенные фибриллы разбавляли стерильной водой сверхвысокого качества. Концентрация NFC в полученном гидрогеле обычно составляет 1-2 масс. %. Гидрогель на основе NFC автоклавировали (121°С/20 мин) непосредственно после фибриллирования.aNFC was obtained from bleached pulp by high pressure homogenization using an industrial fluidizer for fibrillation. The starting material was taken from the pulp mill under aseptic conditions and thoroughly purified before being homogenized in sterile equipment. Thus, microbiological purity was maintained throughout the production process. Before fibrillation, the purified material was anionically modified. Anionic modification is based on the oxidation of the pulp. Thanks to this modification, the process of disintegration of the cellulose mass to cellulose nanofibrils is simplified. In addition, as a result of this activation reaction, functional aldehyde and carboxyl groups appear on the surface of aNFC, which increase the hydrophilicity of this material. Such modifications are described in WO 09/084566 and JP 20070340371. The oxidized pulp was thoroughly purified after chemical modification. Before fibrillation, the purified fibrils were diluted with ultra-high quality sterile water. The concentration of NFC in the obtained hydrogel is usually 1-2 wt. %. The NFC-based hydrogel was autoclaved (121°C/20 min) immediately after fibrillation.

Осмотическое уравновешиваниеOsmotic balancing

Перед проведением экспериментов по культивированию клеток материал гидрогелей инкубировали в присутствии среды для культивирования клеток в течение 5 часов при комнатной температуре для осмотического уравновешивания с окружающей средой. Пипеткой отбирали аликвоты гидрогелей объемом от 500 мкл до 1 мл в круглодонную пробирку типа эппендорф емкостью 2 мл. Поверх гидрогелей медленно добавляли по 1 мл среды для культивирования клеток. После инкубирования пробирки центрифугировали (5 мин, 1500 об/мин) и избыток среды (примерно 1 мл) сверху удаляли. Инкапсулирование клетокPrior to cell culture experiments, the hydrogel material was incubated in the presence of cell culture medium for 5 hours at room temperature for osmotic balancing with the environment. Aliquots of hydrogels from 500 μl to 1 ml were taken with a pipette into a 2-ml Eppendorf-type round-bottom tube. On top of the hydrogels, 1 ml of cell culture medium was slowly added. After incubation, the tubes were centrifuged (5 min, 1500 rpm) and excess medium (about 1 ml) was removed from the top. Cell Encapsulation

Предварительно дифференцированные нейросферы отбирали в пробирки типа эппендорф и среду для культивирования клеток удаляли. Используя Tryple Select (Invitrogen, 12563-011) проводили ферментативное разъединение клеток с образованием суспензии, состоящей из небольших агрегатов клеток и отдельных клеток. Количество и жизнеспособность клеток в суспензии рассчитывали с использованием счетчика клеток Countess (Invitrogen) и трипанового синего (1:1). Плотность используемых клеток составляла 5 миллионов клеток на 1 мл гидрогеля. Рассчитанное количество клеточной суспензии отбирали пипеткой в пробирку типа эппендорф, центрифугировали (5 мин, 1500 об./мин) и среду для культивирования клеток удаляли. Клеточный осадок ресуспендировали в 50 мкл свежей среды для культивирования клеток и, используя пипетку, добавляли в виде небольших капель внутрь гидрогеля (750 мкл). Клетки смешивали с гидрогелем посредством медленного пипетирования вверх и вниз, а также перемешивания кончиком пипетки до тех пор, пока смесь не представлялась гомогенной. После этого аликвоты смеси вносили в лунки 96-луночного планшета. Поверх культур добавляли по 150 мкл среды для культивирования клеток.The predifferentiated neurospheres were collected in Eppendorf tubes and the cell culture medium was removed. Using Tryple Select (Invitrogen, 12563-011), the cells were enzymatically dissociated to form a suspension consisting of small cell aggregates and individual cells. The number and viability of cells in suspension were calculated using a Countess cell counter (Invitrogen) and trypan blue (1:1). The cell density used was 5 million cells per 1 ml of hydrogel. The calculated amount of the cell suspension was pipetted into an Eppendorf tube, centrifuged (5 min, 1500 rpm), and the cell culture medium was removed. The cell pellet was resuspended in 50 µl of fresh cell culture medium and added as small drops into the hydrogel (750 µl) using a pipette. The cells were mixed into the hydrogel by slow up and down pipetting and agitation with the pipette tip until the mixture appeared homogeneous. Thereafter, aliquots of the mixture were added to the wells of a 96-well plate. 150 µl of cell culture medium was added on top of the cultures.

Подготовку контрольных 2D-образцов с покрытием на основе ламинина и контрольных инкапсулированных 3D-образцов PuraMatrix выполняли так, как опубликовано ранее (

и др., 2014).The preparation of laminin-coated 2D control samples and PuraMatrix encapsulated 3D control samples was performed as previously published (

et al., 2014).

Культивирование клетокCell culture

Клетки культивировали в течение двух недель инкапсулированными в гидрогель. В качестве культуральной среды использовали нейтральную среду для дифференцировки (NMD), содержащую смесь DMEM/F12:нейробазальная среда (1:1), дополненную 2 мМ GlutaMax™, 1хВ27, 1xN2 и пенициллином/стрептомицином в количестве 25 ед./мл. Три раза в неделю заменяли 100 мкл среды для культивирования клеток. За культурами следили, используя фазово-контрастный микроскоп. Стабильность гидрогелей в процессе культивирования клеток оценивали визуально. Культуры для визуализации с применением конфокального микроскопа готовили в 96-луночных планшетах MatTek со стеклянным дном №1.5, Part No: P96G-1.5-5-F.Cells were cultured for two weeks encapsulated in a hydrogel. Neutral differentiation medium (NMD) containing DMEM/F12:neurobasal medium (1:1) supplemented with 2 mM GlutaMax™, 1xB27, 1xN2 and penicillin/streptomycin at 25 U/mL was used as culture medium. Three times a week, 100 μl of cell culture medium was replaced. Cultures were monitored using a phase contrast microscope. The stability of hydrogels during cell culture was assessed visually. Cultures for confocal imaging were prepared in MatTek 96-well glass bottom No. 1.5 plates, Part No: P96G-1.5-5-F.

Иммуноцитохимический анализ, визуализация и получение изображенийImmunocytochemical analysis, visualization and imaging

Иммуноцитохимический анализ проводили так, как опубликовано ранее (Koivisto и др., 2017). В качестве первичных антител использовали антитело к ассоциированному с микротрубочками белку 2 (МАР2) (АВ5622, Merck Millipore, Germany) и моноклональное антитело к β-тубулину III (Т8660, Sigma-Aldrich Finland Оу, Finland). После окрашивания осуществляли визуализацию культур, используя инвертированный микроскоп Olympus IX51 с цифровой камерой Olympus DP30BW (Olympus Corporation, Japan), оснащенной объективом с 4-кратным увеличением. Изображения в оттенках серого обрабатывали, используя Adobe Photoshop CS4 (версию 11, Adobe Systems Inc. CA).Immunocytochemical analysis was performed as previously published (Koivisto et al., 2017). Anti-microtubule associated protein 2 (MAP2) antibody (AB5622, Merck Millipore, Germany) and monoclonal antibody to β-tubulin III (T8660, Sigma-Aldrich Finland Oy, Finland) were used as primary antibodies. After staining, the cultures were visualized using an Olympus IX51 inverted microscope with an Olympus DP30BW digital camera (Olympus Corporation, Japan) equipped with a 4x objective. Grayscale images were processed using Adobe Photoshop CS4 (version 11, Adobe Systems Inc. CA).

Стеки подробных конфокальных 3D-изображений получали с применением конфокального блока Zeiss LSM 780, установленного в инвертированный микроскоп Cell Observer (Carl Zeiss, Germany), используя объектив с 25-кратным увеличением (числовая апертура (N.A.)=0,80; Zeiss LD LCI Plan-Apochromat, Carl Zeiss) с глицерином. Полученные с использованием конфокального микроскопа данные деконволютировали, применяя программное обеспечение Huygens Essential (Huygens compute engine 15.10.1p564b, Scientific Volume Imaging (SVI, Netherlands)), и визуализировали, применяя программу ImageJ (версию 1.39, Национальный институт здоровья, США).Stacks of detailed 3D confocal images were obtained using a Zeiss LSM 780 confocal unit mounted in an inverted Cell Observer microscope (Carl Zeiss, Germany) using a 25x objective (numerical aperture (N.A.)=0.80; Zeiss LD LCI Plan -Apochromat, Carl Zeiss) with glycerin. Data obtained using a confocal microscope were deconvoluted using Huygens Essential software (Huygens compute engine 15.10.1p564b, Scientific Volume Imaging (SVI, Netherlands)), and visualized using ImageJ software (version 1.39, National Institutes of Health, USA).

Результатыresults

Общий обзор экспериментаGeneral overview of the experiment

Подготовка образцов, разбавление гидрогелей, посев клеток и культивирование клеток были успешно проведены для обоих изученных гидрогелей (Growdex и aNFC). Все протестированные гидрогели поддерживали выживаемость и рост нейронов в течение двух недель. Также успешно была проведена подготовка образцов для визуализации несмотря на то, что имела место потеря некоторого количества геля. Оба изученных гидрогеля обладали хорошими визуальными свойствами при визуализации флуоресценции, а гидрогели на основе aNFC также хорошо подходили для фазово-контрастной визуализации благодаря прозрачности.Sample preparation, hydrogel dilution, cell seeding, and cell culture were successfully performed for both hydrogels studied (Growdex and aNFC). All tested hydrogels supported the survival and growth of neurons for two weeks. Sample preparation for imaging was also successful, although there was some loss of gel. Both hydrogels studied had good visual properties in fluorescence imaging, and aNFC-based hydrogels were also well suited for phase contrast imaging due to their transparency.

Обращение с гидрогелями при подготовке 3D-культурHandling Hydrogels in 3D Culture Preparation

Обращение с гидрогелем Growdex очень походило на предыдущие эксперименты авторов изобретения (согласно более ранним сообщениям UPM). Материал Growdex слегка затруднительно пипетировать и перемешивать для образования гомогенного образца. Прилагаемые наконечники для пипеток с низким уровнем адгезии, сконструированные на объем 1 мл, облегчали обращение. Также прилагались инструкции по внесению пипеткой клеточной суспензии в виде капель внутрь гидрогеля, что оказывало положительный эффект на гомогенность образцов.The handling of Growdex hydrogel was very similar to previous experiments by the inventors (according to earlier UPM reports). Growdex material is slightly difficult to pipette and mix to form a homogeneous sample. The included low-adhesion pipette tips, designed for 1 ml volume, facilitated handling. Also included were instructions for pipetting the cell suspension as drops into the hydrogel, which had a positive effect on the homogeneity of the samples.

В отличие от Growdex новые гидрогели на основе aNFC было очень легко пипетировать и перемешивать. По сравнению с предыдущими экспериментами наблюдалось значительное улучшение удобства использования гидрогелей для пользователя.Unlike Growdex, the new aNFC-based hydrogels were very easy to pipette and mix. Compared to previous experiments, there was a significant improvement in the usability of the hydrogels for the user.

Рост нейронов внутри гидрогелейGrowth of neurons inside hydrogels

Образование нейронной сети оценивали после 2-х недельного периода культивирования, используя иммуноцитохимическое окрашивание на маркеры нейронов. Визуализацию образцов осуществляли с использованием широкопольного флуоресцентного микроскопа, оснащенного объективом с небольшим увеличением. Культуры подразделяли на три категории: как характеризующиеся хорошим, умеренным и слабым ростом нейритов согласно количеству видимых нейритов (Фиг. 1). Во всех образцах клетки демонстрировали хорошую выживаемость, даже в тех случаях, когда наблюдалось очень слабое отрастание нейритов (визуальный анализ).Neural network formation was assessed after a 2 week culture period using immunocytochemical staining for neuronal markers. Samples were visualized using a wide field fluorescent microscope equipped with a low magnification objective. Cultures were categorized into three categories: good, moderate, and poor neurite outgrowth according to the number of visible neurites (FIG. 1). In all samples, the cells showed good survival, even in cases where very little neurite outgrowth was observed (visual analysis).

В общем, для образцов меньшего объема (60 мкл) продемонстрирован более хороший рост нейронов, что можно наблюдать по уменьшению количества образцов со слабым ростом. В целом наилучшие результаты были отмечены для aNFC (0,30%).In general, the smaller volume samples (60 µl) showed better neuronal growth, which can be seen from the decrease in the number of samples with poor growth. In general, the best results were noted for aNFC (0.30%).

На основании этих результатов можно сделать следующее заключение.Based on these results, the following conclusion can be drawn.

1. Наилучшей композицией для нервных клеток человека была таковая с самой низкой концентрацией aNFC (0,30%).1. The best composition for human nerve cells was the one with the lowest aNFC concentration (0.30%).

2. Образование нейронной сети более стабильно осуществляется в образце меньшего объема (60 мкл).2. The formation of a neural network is more stable in a sample of a smaller volume (60 μl).

Анализ 3D-культур с применением конфокальной микроскопииAnalysis of 3D cultures using confocal microscopy

Для более детальной визуализации клеточной сети использовали конфокальное формирование изображений. Все исследуемые материалы были пригодны для анализа с применением конфокальной микроскопии, и никаких проблем с фоном или собственной флуоресценцией не возникало. В незначительном количестве образцов вымывание антител осуществлялось не полностью, что можно было наблюдать в виде ярких точек в гидрогеле. Гидрогели Growdex поддерживали в основном отрастание нейритов у агрегатов клеток, в то время как гидрогели на основе aNFC также поддерживали рост нейритов у одиночных клеток.For more detailed visualization of the cell network, confocal imaging was used. All test materials were suitable for analysis using confocal microscopy, and there were no problems with background or intrinsic fluorescence. In a small number of samples, antibody washout was not complete, which could be observed as bright dots in the hydrogel. Growdex hydrogels supported mainly neurite outgrowth in cell aggregates, while aNFC-based hydrogels also supported neurite outgrowth in single cells.

Примечание: исходный размер

одного блока гидрогеля составлял примерно 5 мкм, а высота (z) примерно 3 мкм. Конфокальная система не может охватить весь блок как одно изображение. Поэтому представленные изображения взяты из меньших по размеру выбранных областей блоков гидрогелей. Кроме того, некоторые очень хорошие области клеток и сетей, видимые с помощью флуоресцентной визуализации в режиме широкого поля, были недоступны при визуализации с использованием конфокального микроскопа. Это хорошо известные ограничивающие факторы в системах визуализации с применением систем конфокального формирования изображений.Note: original size

one block of hydrogel was about 5 µm, and the height (z) was about 3 µm. The confocal system cannot cover the entire block as one image. Therefore, the presented images are taken from the smaller selected areas of the hydrogel blocks. In addition, some very good areas of cells and networks seen with wide field fluorescence imaging were not available with confocal imaging. These are well-known limiting factors in imaging systems using confocal imaging systems.

Growdex, 1,50%Growdex, 1.50%

Массовое отрастание нейритов в основном наблюдалось для агрегатов клеток (Фиг. 3, стеки 1 и 2). В некоторых агрегатах отмечалось меньшее количество нейритов (Фиг. 3, стек 3).Massive neurite outgrowth was mainly observed for cell aggregates (Fig. 3, stacks 1 and 2). In some aggregates, a smaller number of neurites was noted (Fig. 3, stack 3).

Growdex, 1,00%Growdex, 1.00%

Почти аналогичные результаты отмечали при сравнении Growdex, 1,50%, и Growdex, 1,00%. Отрастание нейритов наблюдали для агрегатов клеток (Фиг. 4, стеки 1-3). Степень отрастания нейритов варьировала среди агрегатов. В некоторых образцах неполное вымывание антител было причиной появления ярких флуоресцентных точек (Фиг. 4, стек 2).Almost similar results were noted when comparing Growdex, 1.50%, and Growdex, 1.00%. Neurite outgrowth was observed for cell aggregates (FIG. 4, stacks 1-3). The degree of neurite outgrowth varied among the aggregates. In some samples, incomplete washout of antibodies caused bright fluorescent dots to appear (FIG. 4, stack 2).

aNFC, 0,65%aNFC, 0.65%

Гидрогель на основе aNFC, 0,65%, поддерживал отрастание нейритов для агрегатов (Фиг. 5, стеки 1 и 3), а также рост нейритов у одиночных клеток (Фиг. 5, стек 2). aNFC, 0,45%The aNFC-based hydrogel, 0.65%, supported neurite outgrowth for aggregates (FIG. 5, stacks 1 and 3) as well as neurite outgrowth in single cells (FIG. 5, stack 2). aNFC, 0.45%

Гидрогель на основе aNFC, 0,45%, поддерживал отрастание нейритов для агрегатов (Фиг. 6, стеки 1 и 3), а также рост нейритов у одиночных клеток (Фиг. 6, стеки 2 и 3). aNFC, 0,30%The aNFC-based hydrogel, 0.45%, supported neurite outgrowth for aggregates (FIG. 6, stacks 1 and 3) as well as neurite outgrowth in single cells (FIG. 6, stacks 2 and 3). aNFC, 0.30%

Гидрогель на основе aNFC, 0,30%, очень хорошо поддерживал рост нейритов у одиночных клеток (Фиг. 7, стек 1) и поддерживал массовое отрастание нейритов для агрегатов клеток (Фиг. 7, стеки 2 и 3).The aNFC-based hydrogel, 0.30%, very well supported neurite outgrowth in single cells (FIG. 7, stack 1) and supported massive neurite outgrowth for cell aggregates (FIG. 7, stacks 2 and 3).

На основании этих результатов можно сделать следующее заключение.Based on these results, the following conclusion can be drawn.

1. Гидрогели на основе aNFC лучше подходили для поддержания отрастания нейритов у одиночных клеток.1. aNFC-based hydrogels were better suited to support neurite outgrowth in single cells.

2. Значительное отрастание нейритов также обнаруживали для агрегатов клеток в случае как гидрогелей Growdex, так и гидрогелей на основе aNFC.2. Significant neurite outgrowth was also found for cell aggregates for both Growdex hydrogels and aNFC-based hydrogels.

3. Объем гидрогеля (80 мкл или 60 мкл) не оказывал никакого влияния на качество визуализации.3. Hydrogel volume (80 µl or 60 µl) had no effect on imaging quality.

Обращение с обоими гидрогелями было выполнено успешно, и получение гомогенной суспензии клеток внутри матрицы гидрогеля оказалось возможным. Гидрогели на основе aNFC было намного легче приготовить. Во время проведения иммуноцитохимического окрашивания имела место потеря некоторого количества геля, но ни один из образцов не был полностью утрачен в этом эксперименте. Данный эффект был ярко выражен для образцов меньшего объема (60 мкл).Handling of both hydrogels was successful and obtaining a homogeneous cell suspension within the hydrogel matrix was possible. The aNFC-based hydrogels were much easier to prepare. Some gel was lost during the immunocytochemical staining, but none of the samples were completely lost in this experiment. This effect was pronounced for samples of smaller volume (60 μl).

И гидрогели Growdex, и гидрогели на основе aNFC содержали значительные количества живых нейронов через 2 недели культивирования. Оба гидрогеля содержали агрегаты нервных клеток с сильным отрастанием нейритов. В самых лучших случаях образованные сети заполняли целиком блок гидрогеля (Фиг. 2, А).Both Growdex hydrogels and aNFC-based hydrogels contained significant numbers of living neurons after 2 weeks of culture. Both hydrogels contained aggregates of nerve cells with a strong outgrowth of neurites. In the best cases, the formed networks filled the entire block of the hydrogel (Fig. 2, A).

Основное различие, наблюдаемое между двумя исследуемыми гидрогелями, состояло в росте одиночных клеток и отрастании у них нейритов. Гидрогели Growdex в основном поддерживали отрастание нейритов только у агрегатов клеток (Фиг. 8А), в то время как гидрогели на основе aNFC также поддерживали рост нейритов у отдельных клеток (Фиг. 8 В). Для одиночных нейронов требуется больше времени для образования 3D-сетей. Таким образом, можно предположить, что в этих случаях для наблюдения за образованием более сильных сетей было бы полезно пролонгирование времени культивирования.The main difference observed between the two hydrogels studied was the growth of single cells and the outgrowth of neurites in them. Growdex hydrogels mainly supported neurite outgrowth in cell aggregates only (Fig. 8A), while aNFC-based hydrogels also supported neurite outgrowth in single cells (Fig. 8B). Single neurons take longer to form 3D networks. Thus, it can be assumed that in these cases, in order to observe the formation of stronger networks, it would be useful to prolong the cultivation time.

В зависимости от применения оба типа отрастания нейритов могут рассматриваться как полезные. На основании опыта авторов изобретения можно сказать, что эти гели продемонстрировали очень хорошие возможности в отношении поддержания отрастания нейритов, одного из самых важных признаков при 3D-культивировании нервных клеток.Depending on the application, both types of neurite outgrowth can be considered beneficial. Based on the experience of the inventors, it can be said that these gels have demonstrated very good capabilities in terms of supporting neurite outgrowth, one of the most important features in 3D nerve cell culture.

Растущие клетки лучше растут в aNFC по сравнению с нативным сортом, который используется в настоящее время. Клетки любят располагаться в направлении заряженных фибрилл. Более низкое содержание твердых веществ в анионном гидрогеле обеспечивает более свободное перемещение клеток. Анионные гидрогели могли бы предпочтительно использоваться в приложениях, где необходимы сети для функциональных клеток.Growing cells grow better in aNFC compared to the native variety currently in use. Cells like to settle down in the direction of the charged fibrils. The lower solids content of the anionic hydrogel allows for freer cell movement. Anionic hydrogels could preferably be used in applications where networks for functional cells are needed.

Измерение мутностиTurbidity measurement

Образец нанофибриллярной целлюлозы разбавляли в воде до концентрации ниже точки гелеобразования указанной нанофибриллярной целлюлозы и измеряли мутность разбавленного образца. Мутность образцов нанофибриллярной целлюлозы измеряли в концентрации 0,1%. Для измерений мутности использовали турбидиметр HACH Р2100 с сосудом для измерений емкостью 50 мл. Определяли сухую массу образца нанофибриллярной целлюлозы, и 0,5 г образца из расчета на сухое вещество загружали в сосуд для измерений, который наполняли водопроводной водой до достижения 500 г, и энергично перемешивали путем встряхивания в течение примерно 30 с. Незамедлительно водную смесь распределяли на 5 сосудов для измерений, которые были вставлены в турбидиметр. Для каждого сосуда проводили по три измерения. На основании полученных данных рассчитывали среднее значение и стандартное отклонение, и окончательный результат приводили в единицах NTU. Новый продукт, нанофибриллярная целлюлоза, в вышеупомянутых условиях измерения имел типичное значение мутности ниже 200, предпочтительно ниже 150 NTU.A sample of nanofibrillar cellulose was diluted in water to a concentration below the gel point of said nanofibrillar cellulose, and the turbidity of the diluted sample was measured. The turbidity of nanofibrillar cellulose samples was measured at a concentration of 0.1%. For turbidity measurements, a HACH P2100 turbidimeter with a 50 ml measurement vessel was used. The dry weight of the nanofibrillar cellulose sample was determined, and 0.5 g of the sample on a dry matter basis was loaded into a measuring vessel, which was filled with tap water to reach 500 g, and stirred vigorously by shaking for about 30 seconds. Immediately, the aqueous mixture was dispensed into 5 measuring vessels which were inserted into the turbidimeter. Three measurements were taken for each vessel. Based on the data obtained, the mean value and standard deviation were calculated, and the final result was given in units of NTU. The new product, nanofibrillar cellulose, under the above measurement conditions had a typical turbidity value below 200, preferably below 150 NTU.

Измерения реологических свойствRheological measurements

Для проверки успешности фибриллирования проводили измерения реологических свойств образцов в форме гидрогелей на основе нанофибриллярной целлюлозы, используя ротационный вискозиметр с регулируемым напряжением (ARG2, ТА Instruments, UK), снабженный четырехлопастной лопаткой. Образцы разбавляли деионизованной водой (200 г) до концентрации 0,5 масс. % и смешивали с использованием ручного смесителя. Для данного образца проводили измерение реологических свойств. Диаметры цилиндрической чашки для образца и лопатки составляли 30 мм и 28 мм, соответственно, а длина составляла 42 мм. Варьирование напряжения измеряли в диапазоне напряжения сдвига 0,001-100 Па при частоте 0,1 Гц и 25°С.To verify fibrillation success, the rheological properties of samples in the form of nanofibrillar cellulose hydrogels were measured using a voltage controlled rotational viscometer (ARG2, TA Instruments, UK) equipped with a four-bladed paddle. The samples were diluted with deionized water (200 g) to a concentration of 0.5 wt. % and mixed using a hand mixer. For this sample, the rheological properties were measured. The diameters of the cylindrical sample cup and paddle were 30 mm and 28 mm, respectively, and the length was 42 mm. The voltage variation was measured in the shear stress range of 0.001-100 Pa at a frequency of 0.1 Hz and 25°C.

Пример 2. Тестирование гидрогелей на основе нанофибриллярной целлюлозы с использованием фибробластных клеток кожи человекаExample 2 Testing of Nanofibrillar Cellulose Hydrogels Using Human Skin Fibroblast Cells

Фибробласты кожи человека (HDF) смешивали с гидрогелем на основе NFC GrowDex или гидрогелем на основе анионной NFC GrowDexT. Гидрогели с клетками переносили в 96-луночный планшет в количестве 60 мкл гидрогеля с клетками на одну лунку и поверх гидрогелей добавляли по 100 мкл среды для культивирования клеток (DMEM, дополненной сывороткой). Клетки культивировали при 37°С и 5% СО₂ в течение 7 суток и связанные с ростом свойства (пролиферацию, морфологию, миграцию) анализировали путем визуализации живых клеток с использованием метода светлого поля на автоматизированном микроскопе Cell-IQ (Chip-Man Technologies). Результаты указывают на образование имеющих округлую форму сфероидов HDF в GrowDex (Фиг. 9А). В GrowDexT HDF клетки растут в виде кластеров и образуют отростки, и это позволяет предположить, что клетки воспринимают свое окружение (Фиг. 9В).Human skin fibroblasts (HDF) were mixed with GrowDex NFC hydrogel or GrowDexT anionic NFC hydrogel. Cell hydrogels were transferred to a 96-well plate in the amount of 60 μl of cell hydrogel per well, and 100 μl of cell culture medium (DMEM supplemented with serum) was added on top of the hydrogels. Cells were cultured at 37° C. and 5% CO ₂ for 7 days and growth related properties (proliferation, morphology, migration) were analyzed by live cell imaging using a bright field method on a Cell-IQ automated microscope (Chip-Man Technologies). The results indicate the formation of rounded HDF spheroids in GrowDex (FIG. 9A). In GrowDexT HDF, cells grow in clusters and form outgrowths, suggesting that the cells perceive their environment (FIG. 9B).

ссылкиlinks

Ahola, S., Turon, X., Osterberg, M., Laine, J., Rojas, O.J. 2008. Enzymatic hydrolysis of native cellulose nanofibrils and other cellulose model films: effect of surface structure. Langmuir, 24, 11592-11599.Ahola, S., Turon, X., Osterberg, M., Laine, J., Rojas, O.J. 2008. Enzymatic hydrolysis of native cellulose nanofibrils and other cellulose model films: effect of surface structure. Langmuir, 24, 11592-11599.

Hoffman, A.S., 2002. Hydrogels for biomedical applications. Advanced Drug Delivery Reviews, vol. 54, №1, pp.3-12.Hoffman, A.S., 2002. Hydrogels for biomedical applications. Advanced Drug Delivery Reviews, vol. 54, No. 1, pp. 3-12.

Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S. and Demirci, U. 2010. Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics. Nanomedicine (Lond), 5(3): p.469-84.Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S. and Demirci, U. 2010. Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics. Nanomedicine (Lond), 5(3): p.469-84.

Koivisto, J.Т., Joki, Т., Parraga, J.,

R.,L.,

Salonen, L., Jonkkari, I., et al. 2017. Bioamine-Crosslinked Gellan Gum Hydrogel for Neural Tissue Engineering. Biomedical Materials, February, 1-38. doi:10.1088/1748-605X/aa62b0.Koivisto, J.T., Joki, T., Parraga, J.,

R.,L.,

Salonen, L., Jonkkari, I., et al. 2017. Bioamine-Crosslinked Gellan Gum Hydrogel for Neural Tissue Engineering. Biomedical Materials, February, 1-38. doi:10.1088/1748-605X/aa62b0.

Kuthcarlapati et al., 2008, Metals Materials and Processes, 20(3): 307-314.Kuthcarlapati et al., 2008, Metals Materials and Processes, 20(3): 307-314.

Lappalainen, R.S.,

M.,

L.,

T.J., Hyttinen J.K.,

K., Suuronen, R., Skottman, H., and Narkilahti, S. 2010. Similarly Derived and Cultured hESC Lines Show Variation in Their Developmental Potential towards Neuronal Cells in Long-Term Culture. Regenerative Medicine, 5 (5): 749-62. doi:10.2217/rme.10.58.Lappalainen, RS,

M.,

L.,

TJ, Hyttinen JK,

K., Suuronen, R., Skottman, H., and Narkilahti, S. 2010. Similarly Derived and Cultured hESC Lines Show Variation in Their Developmental Potential towards Neuronal Cells in Long-Term Culture. Regenerative Medicine, 5(5): 749-62. doi:10.2217/rme.10.58.

Nisbet DR, Crompton KE, Home MK et al., 2008. Neural tissue engineering of the CNS using hydrogels. J. Biomed. Mater. Res. В Appl. Biomater., 87: 251-263.Nisbet DR, Crompton KE, Home MK et al., 2008. Neural tissue engineering of the CNS using hydrogels. J Biomed. mater. Res. In Apple. Biomater., 87: 251-263.

L., Joki, Т., Varjola, M., Skottman, H., and Narkilahti, S., 2014. Three-Dimensional Growth Matrix for Human Embryonic Stem Cell-Derived Neuronal Cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 8 (3): 186-94. doi:10.1002/term.1512.

L., Joki, T., Varjola, M., Skottman, H., and Narkilahti, S., 2014. Three-Dimensional Growth Matrix for Human Embryonic Stem Cell-Derived Neuronal Cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 8(3): 186-94. doi:10.1002/term.1512.

Claims (25)

1. Композиция для культивирования растущих клеток, содержащая 0,05-0,5 масс.% механически дезинтегрированной анионной нанофибриллярной целлюлозы растительного происхождения, имеющей степень замещения от 0,08 до 0,3 и динамический модуль упругости в диапазоне от 1 до 40 Пa при диспергировании в воде в концентрации 0,5 масс.%, в форме гидрогеля.1. Composition for cultivation of growing cells, containing 0.05-0.5 wt.% mechanically disintegrated anionic nanofibrillar cellulose of plant origin, having a degree of substitution from 0.08 to 0.3 and a dynamic modulus of elasticity in the range from 1 to 40 Pa at dispersion in water at a concentration of 0.5 wt.%, in the form of a hydrogel. 2. Композиция по п. 1, где у клеток вырастают отростки или выступающие части.2. The composition of claim. 1, where the cells grow processes or protruding parts. 3. Композиция по п. 1 или 2, где клетки представляют собой нервные клетки.3. Composition according to claim 1 or 2, wherein the cells are nerve cells. 4. Композиция по любому из пп. 1-3, содержащая 0,05-0,35 масс.% нанофибриллярной целлюлозы.4. The composition according to any one of paragraphs. 1-3, containing 0.05-0.35 wt.% nanofibrillar cellulose. 5. Композиция по любому из пп. 1-4, где указанная анионная нанофибриллярная целлюлоза растительного происхождения содержит нанофибриллярную целлюлозу, полученную из окисленного целлюлозного исходного материала, имеющую содержание карбоксилатных групп выше 0,5 ммоль/г, предпочтительно 0,5-1,6 ммоль/г, более предпочтительно 0,65-1,4 ммоль/г, еще более предпочтительно 0,75-1,2 ммоль/г из расчета на массу целлюлозного исходного материала.5. The composition according to any one of paragraphs. 1-4, wherein said plant-derived anionic nanofibrillar cellulose comprises nanofibrillar cellulose derived from oxidized cellulose starting material having a carboxylate group content above 0.5 mmol/g, preferably 0.5-1.6 mmol/g, more preferably 0, 65-1.4 mmol/g, even more preferably 0.75-1.2 mmol/g, based on the weight of the cellulosic starting material. 6. Композиция по любому из пп. 1-5, где указанная анионная нанофибриллярная целлюлоза растительного происхождения содержит нанофибриллярную целлюлозу, полученную из карбоксиметилированного целлюлозного исходного материала, имеющую степень замещения выше 0,1, предпочтительно от 0,1 до 0,3, более предпочтительно от 0,12 до 0,2.6. Composition according to any one of paragraphs. 1-5, wherein said plant-derived anionic nanofibrillar cellulose comprises nanofibrillar cellulose derived from carboxymethylated cellulose starting material having a degree of substitution above 0.1, preferably 0.1 to 0.3, more preferably 0.12 to 0.2 . 7. Композиция по любому из пп. 1-6, где указанная анионная нанофибриллярная целлюлоза растительного происхождения содержит нанофибриллярную целлюлозу, полученную из анионизированного целлюлозного исходного материала, имеющую степень замещения от 0,1 до 0,25 или предпочтительно от 0,12 до 0,2.7. The composition according to any one of paragraphs. 1-6, where the specified anionic nanofibrillar cellulose of plant origin contains nanofibrillar cellulose obtained from anionized cellulose starting material, having a degree of substitution from 0.1 to 0.25, or preferably from 0.12 to 0.2. 8. Композиция по любому из пп. 1-7, где указанная анионная нанофибриллярная целлюлоза растительного происхождения представляет собой целлюлозу I типа.8. The composition according to any one of paragraphs. 1-7, where the specified anionic nanofibrillar cellulose of plant origin is a type I cellulose. 9. Композиция по любому из пп. 1-8, где указанная анионная нанофибриллярная целлюлоза растительного происхождения содержит окисленную в присутствии TEMPO ((2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-ил)оксила) нанофибриллярную целлюлозу.9. The composition according to any one of paragraphs. 1-8, where the specified anionic nanofibrillar cellulose of plant origin contains oxidized in the presence of TEMPO ((2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-yl)oxyl) nanofibrillar cellulose. 10. Композиция по любому из пп. 1-9, где указанная анионная нанофибриллярная целлюлоза растительного происхождения содержит карбоксиметилированную или сульфонированную нанофибриллярную целлюлозу.10. The composition according to any one of paragraphs. 1-9, where the specified anionic nanofibrillar cellulose of plant origin contains carboxymethylated or sulfonated nanofibrillar cellulose. 11. Композиция по любому из пп. 1-10, где указанная анионная нанофибриллярная целлюлоза растительного происхождения имеет динамический модуль упругости в диапазоне от 3 до 30, предпочтительно от 5 до 20, при диспергировании в воде в концентрации 0,5 масс.%.11. Composition according to any one of paragraphs. 1-10, where the specified anionic nanofibrillar cellulose of plant origin has a dynamic modulus of elasticity in the range from 3 to 30, preferably from 5 to 20, when dispersed in water at a concentration of 0.5 wt.%. 12. Композиция по любому из пп. 1-11, где указанная анионная нанофибриллярная целлюлоза растительного происхождения имеет тангенс угла потерь менее 0,3, предпочтительно менее 0,25, когда напряжение сдвига составляет менее 0,5 Па.12. The composition according to any one of paragraphs. 1-11, wherein said plant-derived anionic nanofibrillar cellulose has a loss tangent of less than 0.3, preferably less than 0.25, when the shear stress is less than 0.5 Pa. 13. Композиция по любому из пп. 1-12, где указанная анионная нанофибриллярная целлюлоза растительного происхождения имеет тангенс угла потерь более 1, когда диапазон динамического модуля упругости составляет 1-20 Па, предпочтительно 2-10 Па при диспергировании в воде в концентрации 0,5 масс.%.13. The composition according to any one of paragraphs. 1-12, wherein said plant-derived anionic nanofibrillar cellulose has a loss tangent greater than 1 when the elastic modulus range is 1-20 Pa, preferably 2-10 Pa when dispersed in water at a concentration of 0.5 wt.%. 14. Композиция по любому из пп. 1-13, где указанная анионная нанофибриллярная целлюлоза растительного происхождения имеет содержание карбоксилатных групп выше 0,75 ммоль/г, предпочтительно 0,75-1,6 ммоль/г, более предпочтительно 0,9-1,2 ммоль/г из расчета на массу целлюлозного исходного материала.14. The composition according to any one of paragraphs. 1-13, where the specified anionic nanofibrillar cellulose of plant origin has a content of carboxylate groups above 0.75 mmol/g, preferably 0.75-1.6 mmol/g, more preferably 0.9-1.2 mmol/g based on weight of cellulosic starting material. 15. Композиция по любому из пп. 1-14, где указанная анионная нанофибриллярная целлюлоза растительного происхождения имеет мутность 20 NTU (нефелометрических единиц мутности) или менее, предпочтительно 10 NTU или менее, более предпочтительно 6 NTU или менее, предпочтительно значение мутности находится в диапазоне от 20 до 1 NTU, более предпочтительно от 10 до 2 NTU в воде в концентрации 0,1 масс.%.15. The composition according to any one of paragraphs. 1-14, wherein said plant-derived anionic nanofibrillar cellulose has a turbidity of 20 NTU (nephelometric turbidity units) or less, preferably 10 NTU or less, more preferably 6 NTU or less, preferably the turbidity value is in the range of 20 to 1 NTU, more preferably 10 to 2 NTU in water at a concentration of 0.1 wt%. 16. Композиция по любому из пп. 1-15, где указанная композиция является прозрачной.16. The composition according to any one of paragraphs. 1-15, where said composition is transparent. 17. Композиция по любому из пп. 1-16, дополнительно содержащая вспомогательные вещества, выбранные из группы, состоящей из компонентов внеклеточного матрикса, сыворотки, факторов роста и белков.17. The composition according to any one of paragraphs. 1-16, additionally containing excipients selected from the group consisting of components of the extracellular matrix, serum, growth factors and proteins. 18. Матрица для культивирования клеток, содержащая живые клетки и композицию по любому из пп. 1-17, причем клетки присутствуют в указанной матрице в трехмерном или двумерном расположении.18. A cell culture matrix containing living cells and a composition according to any one of paragraphs. 1-17, wherein the cells are present in said matrix in a three-dimensional or two-dimensional arrangement. 19. Способ получения композиции по любому из пп. 1-17 для культивирования растущих клеток, включающий: а) предоставление анионной нанофибриллярной целлюлозы и б) смешивание указанной анионной нанофибриллярной целлюлозы с водой.19. The method of obtaining a composition according to any one of paragraphs. 1-17 for culturing growing cells, comprising: a) providing an anionic nanofibrillar cellulose and b) mixing said anionic nanofibrillar cellulose with water. 20. Способ культивирования клеток, включающий предоставление композиции для культивирования растущих клеток по любому из пп. 1-17 и инокулирование указанной композиции по меньшей мере одной клеткой или матрицы по п. 18 и трехмерное или двумерное культивирование с получением клеточной массы.20. The method of culturing cells, including providing a composition for culturing growing cells according to any one of paragraphs. 1-17 and inoculating said composition with at least one cell or matrix according to claim 18 and 3D or 2D cultivation to obtain a cell mass. 21. Способ трехмерного культивирования тканей, включающий предоставление композиции для культивирования растущих клеток по любому из пп. 1-17 и погружение ткани внутрь указанной композиции или матрицы по п. 18 и культивирование с получением клеточной массы.21. The method of three-dimensional tissue culture, including providing a composition for culturing growing cells according to any one of paragraphs. 1-17 and immersing the tissue inside said composition or matrix according to claim 18 and culturing to obtain a cell mass. 22. Способ по п. 19, где по меньшей мере два типа клеток разного происхождения культивируют в виде совместной культуры.22. The method of claim 19, wherein at least two cell types of different origin are co-cultured. 23. Способ по п. 19 или 20, где композицию ферментативно обрабатывают целлюлазой в течение промежутка времени, достаточного для по меньшей мере частичного высвобождения клеточной массы.23. The method according to claim 19 or 20, wherein the composition is enzymatically treated with cellulase for a period of time sufficient to at least partially release the cell mass. 24. Способ по п. 23, где целлюлазу инактивируют или удаляют из клеточной массы после ферментативной обработки.24. The method of claim 23 wherein the cellulase is inactivated or removed from the cell mass after the enzymatic treatment. 25. Применение композиции по любому из пп. 1-17 для культивирования растущих клеток.25. The use of a composition according to any one of paragraphs. 1-17 for culturing growing cells.

Images