RU2769828C1

RU2769828C1 - Uracil derivatives with antiviral activity against sars-cov-2

Info

Publication number: RU2769828C1
Application number: RU2021139390A
Authority: RU
Inventors: Михаил Станиславович Новиков; Мария Петровна Парамонова; Елена Сергеевна Гуреева; Инна Вадимовна Должикова; Андрей Эдуардович Синявин; Дарья Владимировна Васина; Наталия Петровна Антонова; Надежда Анатольевна Кузнецова; Игорь Андреевич Иванов; Сергей Игоревич Луйксаар; Сергей Анатольевич Золотов; Надежда Леонидовна Лубенец; Елизавета Александровна Токарская; Анастасия Андреевна Захарова; Тимофей Андреевич Ремизов; Олег Васильевич Рубальский; Артем Петрович Ткачук; Владимир Алексеевич Гущин; Наиля Ахатовна Зигангирова; Борис Савельевич Народицкий
Priority date: 2021-12-28
Filing date: 2021-12-28
Publication date: 2022-04-06

Abstract

FIELD: molecular biology.SUBSTANCE: inventions group relates to the field of molecular biology, virology and medicine, namely to new N1,N3-disubstituted uracil derivatives and their pharmaceutically acceptable salts, which have an antiviral effect against SARS-CoV-2. A compound of general formula I or a pharmaceutically acceptable salt thereof is proposed, where: X is alkyl or hydroxyalkyl (C1-C12), Ar is a substituted aromatic group, Ar is an aromatic group, Y is an oxygen atom, R1 is a carboxyl or halogen, in the N3position uracil polymethylene linker may include from 1 to 12 methylene groups.EFFECT: effective inhibition of SARS-CoV-2 replication.4 cl, 14 dwg, 12 ex

Description

Область техникиTechnical field

Группа изобретений относится к области молекулярной биологии, вирусологии и медицины, а именно, к новым N₁,N₃-дизамещенным производным урацила, обладающим противовирусным действием в отношении SARS-CoV-2, и как таковые полезны при лечении и профилактики COVID-19. Это изобретение также относится к применению таких соединений для ингибирования репликации SARS-CoV-2 у млекопитающих, особенно людей, а также к фармацевтической композиции для ингибирования репликации SARS-CoV-2 у млекопитающих.SUBSTANCE: group of inventions relates to the field of molecular biology, virology and medicine, namely, to new N ₁ ,N ₃ -disubstituted uracil derivatives with antiviral activity against SARS-CoV-2, and as such are useful in the treatment and prevention of COVID-19. This invention also relates to the use of such compounds for inhibiting SARS-CoV-2 replication in mammals, especially humans, as well as a pharmaceutical composition for inhibiting SARS-CoV-2 replication in mammals.

Уровень техникиState of the art

Коронавирус SARS-CoV-2, вызвавший глобальную пандемию коронавирус-ассоциированного острого респираторного заболевания (coronavirus-associated acute respiratory disease 19, сокращенно COVID-19), представляет собой третий задокументированный случай проникновения в человеческую популяцию коронавирусов животных. Предыдущие вспышки коронавируса SARS-CoV и MERS хотя и имели угрожающе высокую смертность в 10% и 40% соответственно, но не приводили к гибели более тысячи человек за все время наблюдения. Текущая пандемия с момента проникновения вируса за пределы Китая, насчитывает около 260 млн. заболевших и более 5 млн. погибших. Отсутствие устойчивого коллективного иммунитета в очередной раз привело к лавинообразному росту заболевших и перегрузке систем здравоохранения даже в наиболее развитых странах из-за появления новой генетической линии дельта B.1.617.2. The SARS-CoV-2 coronavirus that caused the global pandemic of coronavirus-associated acute respiratory disease (coronavirus-associated acute respiratory disease 19, abbreviated as COVID-19) is the third documented case of animal coronaviruses entering the human population. Previous outbreaks of the SARS-CoV and MERS coronavirus, although they had an alarmingly high mortality rate of 10% and 40%, respectively, did not lead to the death of more than a thousand people during the entire observation period. The current pandemic, since the virus entered China, has about 260 million cases and more than 5 million deaths. The lack of sustainable herd immunity has once again led to an avalanche of cases and an overload of healthcare systems even in the most developed countries due to the emergence of a new genetic line delta B.1.617.2.

Действенной мерой, способной разгрузить систему здравоохранения от перегрузки и снизить смертность до формирования коллективного иммунитета, остается режим изоляции. К сожалению, даже среди вакцинированных всегда имеются люди, не защищенные вакциной. В силу особенностей иммунитета на фоне быстрой изменчивости вируса, разработка специфических средств профилактики с широким спектром действия становится особенно актуальной задачей.An effective measure capable of unloading the healthcare system from overload and reducing mortality to the formation of herd immunity remains the isolation regime. Unfortunately, even among the vaccinated there are always people who are not protected by the vaccine. Due to the characteristics of immunity against the background of the rapid variability of the virus, the development of specific prophylactic agents with a wide spectrum of action becomes a particularly urgent task.

Клиническая картина COVID-19 показывает, что по меньшей мере в 80% случаев SARS-CoV-2 вызывает относительно легко протекающее заболевание, которое сводится к воспалению верхних и нижних дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта. Тем не менее примерно в 20% случаях развиваются клинически выраженные формы, требующие госпитализации. Описаны и тяжелые формы COVID-19. Для снижения нагрузки на здравоохранение и экономику необходимы как средства терапии, позволяющие сократить период заболевания при легком течении, так и средства, снижающие вероятность развития тяжелого течения, требующего госпитализации.The clinical picture of COVID-19 shows that in at least 80% of cases, SARS-CoV-2 causes a relatively mild disease, which boils down to inflammation of the upper and lower respiratory tract, and the gastrointestinal tract. However, approximately 20% of cases develop clinically significant forms requiring hospitalization. Severe forms of COVID-19 have also been described. To reduce the burden on health care and the economy, both therapies are needed to reduce the period of illness in mild cases, and tools that reduce the likelihood of developing a severe course requiring hospitalization.

Известны соединения, обладающие противовирусной активностью и имеющие в своей структуре урацил [1-5]. Для ряда соединений показана активность в отношении аденовируса человека, цитомегаловируса, а также вируса иммунодефицита человека. Их активность в отношении SARS-CoV-2 в настоящий момент не изучена. Таким образом, в настоящее время отсутствуют доступные специфические противовирусные лекарственные средства на основе производных урацила для специфической терапии COVID-19, а доступные неспецифические методы терапии не демонстрируют удовлетворительных результатов в аспектах эффективности и токсичности. В связи с этим, разработка эффективных и малотоксичных препаратов с прямым действием на репликацию SARS-CoV-2 сохраняет свою актуальность.Compounds are known that have antiviral activity and have uracil in their structure [1-5]. A number of compounds have shown activity against human adenovirus, cytomegalovirus, and human immunodeficiency virus. Their activity against SARS-CoV-2 has not yet been studied. Thus, there are currently no available specific antiviral drugs based on uracil derivatives for specific therapy of COVID-19, and available non-specific therapies do not show satisfactory results in terms of efficacy and toxicity. In this regard, the development of effective and low-toxic drugs with a direct effect on SARS-CoV-2 replication remains relevant.

Раскрытие сущности изобретенияDisclosure of the essence of the invention

Коронавирусное заболевание 2019 г. (COVID-19) первоначально было описано как новое инфекционное респираторное заболевание в конце 2019 г. Новый патогенный коронавирус, коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2), оказался возбудителем COVID-19. Клинические проявления COVID-19 варьируются от бессимптомной инфекции до пневмонии и острого респираторного дистресс-синдрома (ARDS), цитокинового шторма, коагулопатии, тромбоза и ряда других внелегочных синдромов. В некоторых случаях доброкачественное течение болезни может очень быстро ухудшиться в течение второй недели болезни, что часто требует дополнительной интенсивной терапии. Хотя аберрантные иммунные ответы могут приводить к возникновению некоторых патологий COVID-19, очевидно, что высокий уровень репликации вируса на ранней стадии заболевания связан с серьезностью течения заболевания. Таким образом, существует острая потребность в противовирусном средстве, которое не требует парентерального введения и, следовательно, может быть назначено на ранней стадии заболевания. Учитывая текущее понимание патогенеза COVID-19, такая стратегия, включающая раннюю эффективную противовирусную терапию, должна иметь высокую вероятность успеха. Coronavirus disease 2019 (COVID-19) was originally described as a novel infectious respiratory disease in late 2019. A novel pathogenic coronavirus, severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), has been identified as the causative agent of COVID-19. Clinical manifestations of COVID-19 range from asymptomatic infection to pneumonia and acute respiratory distress syndrome (ARDS), cytokine storm, coagulopathy, thrombosis, and a number of other extrapulmonary syndromes. In some cases, the benign course of the disease can deteriorate very quickly during the second week of illness, often requiring additional intensive care. Although aberrant immune responses may lead to some of the pathologies of COVID-19, it is clear that a high level of viral replication early in the course of the disease is associated with the severity of the course of the disease. Thus, there is an urgent need for an antiviral agent that does not require parenteral administration and, therefore, can be administered at an early stage of the disease. Given the current understanding of the pathogenesis of COVID-19, such a strategy, including early effective antiviral therapy, should have a high likelihood of success.

Задачей предлагаемого изобретения является создание новых, высокоэффективных, селективных и малотоксичных антивирусных агентов действующих непосредственно на SARS-CoV-2 для лечения COVID-19. The objective of the present invention is to create new, highly effective, selective and low toxicity antiviral agents acting directly on SARS-CoV-2 for the treatment of COVID-19.

Технический результат заявленного изобретения заключается в том, что созданы новые N₁,N₃- дизамещённые производные урацила, которые обладают противовирусной активностью по отношению к вирусу SARS-CoV-2, в частности способны эффективно ингибировать репликацию SARS-CoV-2.The technical result of the claimed invention lies in the fact that new N ₁ ,N ₃ - disubstituted uracil derivatives have been created that have antiviral activity against the SARS-CoV-2 virus, in particular, they are able to effectively inhibit the replication of SARS-CoV-2.

Технический результат достигается за счет того, что синтезировано соединение, представляющее собой N₁,N₃- дизамещённое производное урацила, отвечающее общей формуле I:The technical result is achieved due to the fact that a compound is synthesized, which is N ₁ ,N ₃ - a disubstituted derivative of uracil, corresponding to the general formula I:

или его фармацевтически приемлемую соль;or a pharmaceutically acceptable salt thereof;

где:where:

X алкил или оксиалкил (С1-С12),X alkyl or hydroxyalkyl (C1-C12),

Ar замещенная ароматическая группа,Ar substituted aromatic group,

Ar ароматическая группа,Ar aromatic group,

Y атом кислорода,Y oxygen atom,

R1 карбоксил или галоген,R1 carboxyl or halogen,

В N₃-положении урацила полиметиленовый линкер может включать от 1 до 12 метиленовых групп.At the N ₃ position of uracil, the polymethylene linker may include from 1 to 12 methylene groups.

Также, особо предпочтительные соединения формулы I включают в себя соединения, где наиболее предпочтительными являются:Also, particularly preferred compounds of formula I include compounds where most preferred are:

4-[5-[3-[5-(4-Фторфенокси)пентил]-2,6-диоксо-3,6-дигидропиримидин-1(2H)-ил]пентилокси] бензойной кислоты4-[5-[3-[5-(4-Fluorophenoxy)pentyl]-2,6-dioxo-3,6-dihydropyrimidin-1(2H)-yl]pentyloxy]benzoic acid

илиor

4-[[5-[3-(Антрацен-9-илметил)-2,6-диоксо-3,6-дигидропиримидин-1(2H)-ил]пентил]окси]бензойной кислоты4-[[5-[3-(Anthracen-9-ylmethyl)-2,6-dioxo-3,6-dihydropyrimidin-1(2H)-yl]pentyl]oxy]benzoic acid

илиor

4-[4-[2,6-Диоксо-3-(4-бромнафтил-1-метил)-3,6-дигидропиримидин-1(2H)-ил]бутокси]бензойная кислота4-[4-[2,6-Dioxo-3-(4-bromonaphthyl-1-methyl)-3,6-dihydropyrimidin-1(2H)-yl]butoxy]benzoic acid

Кроме того, настоящее изобретение также относится к применению разработанных соединений для ингибирования репликации SARS-CoV-2 у млекопитающего.In addition, the present invention also relates to the use of the developed compounds for inhibiting the replication of SARS-CoV-2 in a mammal.

Также, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для ингибирования репликации SARS-CoV-2 у млекопитающего, включающей эффективное количество разработанного соединения или его фармацевтически приемлемой соли и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый наполнитель и/или носитель.Also, the present invention relates to a pharmaceutical composition for inhibiting SARS-CoV-2 replication in a mammal, comprising an effective amount of the developed compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof and at least one pharmaceutically acceptable excipient and/or carrier.

В рамках настоящего изобретения признак «фармацевтически приемлемые соли» относится к фармацевтически приемлемым солям, получаемым с помощью присоединения кислоты для соединений из формулы I. Кислоты, которые применяют для получения фармацевтически приемлемых солей для вышеупомянутых основных соединений по этому изобретению, являются такими, которые образуют нетоксичные соли при присоединении кислоты, то есть соли, содержащие фармакологически приемлемые анионы, такие как соли гидрохлорид, гидробромид, гидроиодид, нитрат, сульфат, бисульфат, фосфат, кислый фосфат, ацетат, лактат, цитрат, кислый цитрат, тартрат, битартрат, сукцинат, малеат, фумарат, глюконат, сахарат, бензоат, метансульфонат, этансульфонат, бензолсульфонат, паратолуолсульфонат и памоат [то есть 1,1'-метилен-бис-(2-гидрокси-3-нафтоат)].Within the scope of the present invention, the term “pharmaceutically acceptable salts” refers to pharmaceutically acceptable acid addition salts for the compounds of formula I. acid addition salts, i.e. salts containing pharmacologically acceptable anions such as hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, nitrate, sulfate, bisulfate, phosphate, acid phosphate, acetate, lactate, citrate, acid citrate, tartrate, bitartrate, succinate, maleate salts , fumarate, gluconate, saccharate, benzoate, methanesulfonate, ethanesulfonate, benzenesulfonate, p-toluenesulfonate and pamoate [i.e. 1,1'-methylene-bis-(2-hydroxy-3-naphthoate)].

Изобретение также относится к солям присоединения основания к соединениям из формулы I. Химические основания, которые можно применять в качестве реагентов для получения фармацевтически приемлемых солей присоединения основания к соединениям формулы I, имеющих кислую природу, являются те основания, которые образуют нетоксичные основные соли с такими соединениями. Такие нетоксичные основные соли включают в себя, но не ограничиваются ими, производные от фармакологически приемлемых катионов, таких как катионы щелочных металлов (например, калия и натрия) и катионы щелочноземельных металлов (например, кальция и магния), соли аммония или водорастворимые соли присоединения амина, такого как N-метилглюкамин (меглумин), и низшие иные соли фармацевтически приемлемых органических аминов.The invention also relates to base addition salts to compounds of formula I. Chemical bases which can be used as reagents for the preparation of pharmaceutically acceptable base addition salts to compounds of formula I having an acidic nature are those bases which form non-toxic basic salts with such compounds. . Such non-toxic base salts include, but are not limited to, those derived from pharmacologically acceptable cations such as alkali metal (e.g., potassium and sodium) cations and alkaline earth metal (e.g., calcium and magnesium) cations, ammonium salts, or water-soluble amine addition salts. , such as N-methylglucamine (meglumine), and other lower salts of pharmaceutically acceptable organic amines.

Краткое описание чертежейBrief description of the drawings

На фиг. 1 показана схема синтеза N₁-замещённых производных урацила (цифры на схеме представляют собой сквозную нумерацию соединений, расшифровка которых приведена в примере 1).In FIG. 1 shows the scheme for the synthesis of N ₁ -substituted uracil derivatives (the numbers in the scheme represent the continuous numbering of the compounds, the decoding of which is given in example 1).

На фиг.2 показана схема синтеза соединений Z870, Z871, Z873 и Z874 (цифры на схеме представляют собой сквозную нумерацию соединений, расшифровка которых приведена в примере 2).Figure 2 shows the scheme for the synthesis of compounds Z870, Z871, Z873 and Z874 (numbers in the scheme are continuous numbering of compounds, the decoding of which is given in example 2).

На фиг. 3 показана схема синтез соединения Z876 (цифры на схеме представляют собой сквозную нумерацию соединений, расшифровка которых приведена в примере 3).In FIG. Figure 3 shows the synthesis scheme for the Z876 compound (the numbers in the scheme represent the continuous numbering of the compounds, the interpretation of which is given in example 3).

На фиг.4 показана схема синтез соединения Z601 (цифры на схеме представляют собой сквозную нумерацию соединений, расшифровка которых приведена в примере 4).Figure 4 shows a diagram of the synthesis of the compound Z601 (the numbers in the diagram represent the continuous numbering of the compounds, the decoding of which is given in example 4).

На фиг.5 показана схема синтез соединения Z611. (цифры на схеме представляют собой сквозную нумерацию соединений, расшифровка которых приведена в примере 5).Figure 5 shows the scheme of the synthesis of compound Z611. (numbers in the diagram represent continuous numbering of connections, the decoding of which is given in example 5).

На фиг. 6 показана схема синтез соединения Z875. (цифры на схеме представляют собой сквозную нумерацию соединений, расшифровка которых приведена в примере 6).In FIG. 6 shows a synthesis scheme for compound Z875. (numbers in the diagram represent continuous numbering of connections, the decoding of which is given in example 6).

На фиг.7 показана схема синтез соединения Z1005. (цифры на схеме представляют собой сквозную нумерацию соединений, расшифровка которых приведена в примере 7).Figure 7 shows the scheme of the synthesis of compound Z1005. (numbers in the diagram represent continuous numbering of connections, the decoding of which is given in example 7).

На фиг. 8 показана схема синтез соединения Z1006. (цифры на схеме представляют собой сквозную нумерацию соединений, расшифровка которых приведена в примере 8).In FIG. 8 shows the synthesis scheme for compound Z1006. (numbers in the diagram represent continuous numbering of connections, the decoding of which is given in example 8).

На фиг. 9 показаны химические структуры соединений из тестируемой панели. In FIG. 9 shows the chemical structures of the compounds from the test panel.

На фиг 10 представлена оценка жизнеспособности клеток под действием панели соединений.Figure 10 shows the assessment of cell viability under the influence of the panel of connections.

На фиг. 11 представлена оценка эффективности соединений против SARS-CoV-2 по уровню ингибирования CPE.In FIG. 11 shows the evaluation of the effectiveness of the compounds against SARS-CoV-2 in terms of the level of CPE inhibition.

На фиг. 12 представлена оценка эффективности соединений против SARS-CoV-2 с помощью кПЦР-ОТ по уровню снижения вирусной нагрузки.In FIG. 12 shows the efficacy of compounds against SARS-CoV-2 by qPCR-RT in terms of viral load reduction.

На фиг. 13 представлена оценка эффективности соединений против SARS-CoV-2-индуцированного СРЕ.In FIG. 13 shows an evaluation of the efficacy of the compounds against SARS-CoV-2-induced CPE.

На фиг. 14 представлена оценка эффективности соединений на цикл репликации SARS-CoV-2.In FIG. 14 shows an assessment of the effectiveness of compounds per SARS-CoV-2 replication cycle.

Осуществление изобретенияImplementation of the invention

Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.The implementation of the invention is confirmed by the following examples.

Пример 1. Общая методика синтеза N₁-замещённых производных урацила [1, 3, 4] (фиг.1)]Example 1 General procedure for the synthesis of N_one-substituted derivatives of uracil [1, 3, 4] (figure 1)]

Смесь урацила (53,53 ммоль) и хлорида аммония (0,3 г, 5,60 ммоль) в гексаметилдисилазане (15 мл) кипятили с обратным холодильником в течение 10 ч в инертной среде до получения прозрачного раствора. Избыток силилирующего агента был удален под вакуумом. Остаточное прозрачное масло 2,4-бис (триметил-силилокси) пиримидина растворяли в 100 мл безводного 1,2-дихлорэтана и добавляли соотвевующий бромида (53,53 ммоль). Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником 30 ч, охлаждали до комнатной температуры и обрабатывали 15 мл iPrOH. Выпавший осадок отфильтровывали и дополнительно очищали колоночной хроматографией в смеси EtOH / 1,2-дихлорметан. A mixture of uracil (53.53 mmol) and ammonium chloride (0.3 g, 5.60 mmol) in hexamethyldisilazane (15 mL) was refluxed for 10 hours under an inert atmosphere until a clear solution was obtained. The excess silylating agent was removed under vacuum. The residual clear oil of 2,4-bis(trimethylsilyloxy)pyrimidine was dissolved in 100 ml of anhydrous 1,2-dichloroethane and the appropriate bromide (53.53 mmol) was added. The reaction mixture was refluxed for 30 h, cooled to room temperature, and treated with 15 ml of iPrOH. The precipitate that formed was filtered off and further purified by column chromatography in EtOH/1,2-dichloromethane.

Пример 2. Общая методика синтеза кислот Z870, Z871, Z873 и Z874 (фиг.2).Example 2. General procedure for the synthesis of acids Z870, Z871, Z873 and Z874 (figure 2).

Смесь 1.416 ммоль 1-замещенного урацила (4) и 0.29 г (2.098 ммоль) K₂CO₃ в растворе 10 мл ДМФА перемешивали при 80°C в течение 1 ч, добавляли 1.40 ммоль метиловый эфир 4-(4-бромбутокси)бензойной кислоты (5) или 4-(5-бромпентилокси)бензойной кислоты (6) и перемешивали при той же температуре в течение 24 ч. Затем реакционную массу упарили в вакууме, остаток экстрагировали 1,2-дихлорэтаном (4 × 25 мл) и экстракт упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали флэш-хроматографией с последующим упариванием элюента при пониженном давлении. Остаток растворили в смеси этанол (50 мл) и вода (30 мл), добавили 0.3 г (7.500 ммоль) NaOH и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение двух суток. Этанол упарили при пониженном давлении, остаток разбавили водой (200 мл) и подкислили соляной кислотой до значения рН 2. Выпавший осадок отфильтровали, сушили на воздухе и продукт кристаллизовали из смеси этилацетат–гексан (2:1).A mixture of 1.416 mmol of 1-substituted uracil (4) and 0.29 g (2.098 mmol) of K ₂ CO ₃ in a solution of 10 ml of DMF was stirred at 80°C for 1 h, 1.40 mmol of 4-(4-bromobutoxy)benzoic acid methyl ester was added (5) or 4-(5-bromopentyloxy)benzoic acid (6) and stirred at the same temperature for 24 h. Then the reaction mass was evaporated in a vacuum, the residue was extracted with 1,2-dichloroethane (4 × 25 ml) and the extract was evaporated under reduced pressure. The residue was purified by flash chromatography, followed by evaporation of the eluent under reduced pressure. The residue was dissolved in a mixture of ethanol (50 ml) and water (30 ml), 0.3 g (7.500 mmol) of NaOH was added, and the resulting mixture was stirred at room temperature for two days. Ethanol was evaporated under reduced pressure, the residue was diluted with water (200 ml) and acidified with hydrochloric acid to pH 2. The precipitate formed was filtered off, dried in air, and the product was crystallized from an ethyl acetate–hexane mixture (2:1).

Пример 3. Синтез соединения Z876 (фиг.3).Example 3 Synthesis of compound Z876 (FIG. 3).

Смесь 0.5 г (1.643 ммоль) 1-(антрацен-9-илметил)урацила (7) [5] и 0.29 г (2.098 ммоль) K₂CO₃ в растворе 10 мл ДМФА перемешивали при 80°C в течение 1 ч, добавляли 0.48 г (1.594 ммоль) метилового эфира 4-(5-бромпентилокси)бензойной кислоты (6) и перемешивали при той же температуре в течение 24 ч. Затем реакционную массу упарили в вакууме, остаток экстрагировали 1,2-дихлорэтаном (4 × 25 мл) и экстракт упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали флэш-хроматографией с последующим упариванием элюента при пониженном давлении. Остаток растворили в смеси этанол (50 мл) и вода (20 мл), добавили 0.3 г (7.500 ммоль) NaOH и полученную смесь перемешивали при 60 °C в течение двух суток. Этанол упарили при пониженном давлении, остаток разбавили водой (200 мл) и подкислили соляной кислотой до значения рН 2. Выпавший осадок отфильтровали, сушили на воздухе и продукт кристаллизовали из смеси этилацетат–гексан (3:1).A mixture of 0.5 g (1.643 mmol) 1-(anthracen-9-ylmethyl)uracil (7) [5] and 0.29 g (2.098 mmol) K₂CO₃ in a solution of 10 ml of DMF was stirred at 80°C for 1 h, 0.48 g (1.594 mmol) of 4-(5-bromopentyloxy)benzoic acid methyl ester (6) and stirred at the same temperature for 24 h. Then the reaction mass was evaporated in a vacuum, the residue was extracted with 1,2-dichloroethane (4 × 25 ml) and the extract was evaporated under reduced pressure. The residue was purified by flash chromatography, followed by evaporation of the eluent under reduced pressure. The residue was dissolved in a mixture of ethanol (50 ml) and water (20 ml), 0.3 g (7.500 mmol) of NaOH was added, and the resulting mixture was stirred at 60°C for two days. Ethanol was evaporated under reduced pressure, the residue was diluted with water (200 ml) and acidified with hydrochloric acid to pH 2. The precipitate formed was filtered off, dried in air, and the product was crystallized from an ethyl acetate–hexane mixture (3:1).

Пример 4. Синтез соединения Z601 (фиг.4).Example 4 Synthesis of Compound Z601 (FIG. 4).

Смесь 0.4 г (1.586 ммоль) 1-(нафтил-1-метил)урацила (1) [1] и 0.35 г (2.532 ммоль) K₂CO₃ в растворе 10 мл ДМФА перемешивали при 80°C в течение 1 ч, добавляли 0.44 г (1.532 ммоль) метилового эфира 4-(4-бромбутокси)бензойной кислоты (2) и перемешивали при той же температуре в течение 24 ч. Затем реакционную массу упарили в вакууме, остаток обработали 100 мл воды, экстрагировали 1,2-дихлорэтаном (4 × 25 мл) и экстракт упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали флэш-хроматографией с последующим упариванием элюента при пониженном давлении. Остаток растворили в смеси этанол (50 мл) и вода (30 мл), добавили 0.35 г (8.750 ммоль) NaOH и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение двух суток. Этанол упарили при пониженном давлении, остаток разбавили водой (200 мл) и подкислили соляной кислотой до значения рН 2. Выпавший осадок отфильтровали, сушили на воздухе и продукт кристаллизовали из смеси этилацетат–гексан (2 : 1).A mixture of 0.4 g (1.586 mmol) of 1-(naphthyl-1-methyl)uracil (1) [1] and 0.35 g ( _2.532 mmol) _of K2CO3 in a solution of 10 mL of DMF was stirred at 80°C for 1 h, 0.44 g (1.532 mmol) of 4-(4-bromobutoxy)benzoic acid methyl ester (2) and stirred at the same temperature for 24 h. Then the reaction mass was evaporated in a vacuum, the residue was treated with 100 ml of water, extracted with 1,2-dichloroethane (4×25 ml) and the extract was evaporated under reduced pressure. The residue was purified by flash chromatography, followed by evaporation of the eluent under reduced pressure. The residue was dissolved in a mixture of ethanol (50 ml) and water (30 ml), 0.35 g (8.750 mmol) of NaOH was added, and the resulting mixture was stirred at room temperature for two days. Ethanol was evaporated under reduced pressure, the residue was diluted with water (200 mL) and acidified with hydrochloric acid to pH 2. The precipitate formed was filtered off, dried in air, and the product was crystallized from an ethyl acetate–hexane (2 : 1) mixture.

Пример 5. Синтез соединения Z611 (фиг.5)Example 5 Synthesis of Compound Z611 (FIG. 5)

Смесь 0.5 г (1.643 ммоль) 1-(антрацен-9-илметил)урацила (3) [2] и 0.29 г (2.098 ммоль) K₂CO₃ в растворе 10 мл ДМФА перемешивали при 80°C в течение 1 ч, добавляли 0.56 г (1.666 ммоль) метилового эфира 1-бром-(6-бромгексилокси)бензола (4) и перемешивали при той же температуре в течение 24 ч. Затем реакционную массу упарили в вакууме, остаток экстрагировали 1,2-дихлорэтаном (4 × 25 мл) и экстракт упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали флэш-хроматографией с последующим упариванием элюента при пониженном давлении. Остаток кристаллизовали из смеси этилацетат–гексан (3 : 1).A mixture of 0.5 g (1.643 mmol) _of 1-(anthracen-9-ylmethyl)uracil ( ₃ ) [2] and 0.29 g (2.098 mmol) of K2CO3 in a solution of 10 ml of DMF was stirred at 80°C for 1 h; 0.56 g (1.666 mmol) of 1-bromo-(6-bromohexyloxy)benzene methyl ester (4) and stirred at the same temperature for 24 h. ml) and the extract was evaporated under reduced pressure. The residue was purified by flash chromatography, followed by evaporation of the eluent under reduced pressure. The residue was crystallized from an ethyl acetate–hexane mixture (3 : 1).

Пример 6. Синтез соединения Z875 (фиг.6)Example 6 Synthesis of Compound Z875 (FIG. 6)

Смесь 0.5 г (1.416 ммоль) 1-[5-(4-бромфенокси)пентил]урацила (5) [3] и 0.3 г (2.171 ммоль) K₂CO₃ в растворе 10 мл ДМФА перемешивали при 80°C в течение 1 ч, охладили до комнатной температуры, добавили 0.32 г (1.397 ммоль) метилового эфира 4-(4-бромбутокси)бензойной кислоты (6) и перемешивали при той же температуре в течение 24 ч. Затем реакционную массу упарили в вакууме, остаток обработали 100 мл воды, экстрагировали 1,2-дихлорэтаном (4 × 25 мл) и экстракт упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали флэш-хроматографией с последующим упариванием элюента при пониженном давлении. Остаток растворили в смеси этанол (50 мл) и вода (30 мл), добавили 0.3 г (7.500 ммоль) NaOH и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение двух суток. Этанол упарили при пониженном давлении, остаток разбавили водой (200 мл) и подкислили соляной кислотой до значения рН 2. Выпавший осадок отфильтровали, сушили на воздухе и продукт кристаллизовали из смеси этилацетат–гексан (3 : 1).A mixture of 0.5 g (1.416 mmol) of 1-[5-(4-bromophenoxy)pentyl]uracil (5) [3] and 0.3 g (2.171 mmol) of K ₂ CO ₃ in a solution of 10 ml of DMF was stirred at 80°C for 1 h, cooled to room temperature, 0.32 g (1.397 mmol) of 4-(4-bromobutoxy)benzoic acid methyl ester (6) was added and stirred at the same temperature for 24 h. Then the reaction mass was evaporated in a vacuum, the residue was treated with 100 ml water was extracted with 1,2-dichloroethane (4×25 ml) and the extract was evaporated under reduced pressure. The residue was purified by flash chromatography, followed by evaporation of the eluent under reduced pressure. The residue was dissolved in a mixture of ethanol (50 ml) and water (30 ml), 0.3 g (7.500 mmol) of NaOH was added, and the resulting mixture was stirred at room temperature for two days. Ethanol was evaporated under reduced pressure, the residue was diluted with water (200 mL) and acidified with hydrochloric acid to pH 2. The precipitate formed was filtered off, dried in air, and the product was crystallized from an ethyl acetate–hexane (3 : 1) mixture.

Пример 7. Синтез соединения Z1005 (фиг.7)Example 7 Synthesis of Compound Z1005 (Figure 7)

Смесь 0.4 г (1.586 ммоль) 1-(нафтил-2-метил)урацила (7) [1] и 0.35 г (2.532 ммоль) K₂CO₃ в растворе 10 мл ДМФА перемешивали при 80°C в течение 1 ч, добавляли 0.44 г (1.532 ммоль) метилового эфира 4-(4-бромбутокси)бензойной кислоты (2) и перемешивали при той же температуре в течение 24 ч. Затем реакционную массу упарили в вакууме, остаток обработали 100 мл воды, экстрагировали 1,2-дихлорэтаном (4 × 25 мл) и экстракт упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали флэш-хроматографией с последующим упариванием элюента при пониженном давлении. Остаток растворили в смеси этанол (50 мл) и вода (30 мл), добавили 0.35 г (8.750 ммоль) NaOH и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение двух суток. Этанол упарили при пониженном давлении, остаток разбавили водой (200 мл) и подкислили соляной кислотой до значения рН 2. Выпавший осадок отфильтровали, сушили на воздухе и продукт кристаллизовали из смеси этилацетат–гексан (2:1).A mixture of 0.4 g (1.586 mmol) 1-(naphthyl-2-methyl)uracil (7) [one] and 0.35 g (2.532 mmol) K₂CO₃ in a solution of 10 ml of DMF was stirred at 80°C for 1 h, 0.44 g (1.532 mmol) of 4-(4-bromobutoxy)benzoic acid methyl ester (2) and stirred at the same temperature for 24 h. Then the reaction mass was evaporated in a vacuum, the residue was treated with 100 ml of water, extracted with 1,2-dichloroethane (4 × 25 ml), and the extract was evaporated under reduced pressure. The residue was purified by flash chromatography, followed by evaporation of the eluent under reduced pressure. The residue was dissolved in a mixture of ethanol (50 ml) and water (30 ml), 0.35 g (8.750 mmol) NaOH was added, and the resulting mixture was stirred at room temperature for two days. Ethanol was evaporated under reduced pressure, the residue was diluted with water (200 ml) and acidified with hydrochloric acid to pH 2. The precipitate formed was filtered off, dried in air, and the product was crystallized from an ethyl acetate–hexane mixture (2:1).

Пример 8. Синтез соединения Z1006 (фиг.8)Example 8 Synthesis of Compound Z1006 (FIG. 8)

Смесь 0.4 г (1.502 ммоль) 1-(4-бромнафтил-1-метил)урацила (8) [1] и 0.3 г (2.171 ммоль) K₂CO₃ в растворе 10 мл ДМФА перемешивали при 80°C в течение 1 ч, добавляли 0.43 г (1.497 ммоль) метилового эфира 4-(4-бромбутокси)бензойной кислоты (2) и перемешивали при той же температуре в течение 24 ч. Затем реакционную массу упарили в вакууме, остаток обработали 100 мл воды, экстрагировали 1,2-дихлорэтаном (4 × 25 мл) и экстракт упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали флэш-хроматографией с последующим упариванием элюента при пониженном давлении. Остаток растворили в смеси этанол (50 мл) и вода (30 мл), добавили 0.3 г (7.500 ммоль) NaOH и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение двух суток. Этанол упарили при пониженном давлении, остаток разбавили водой (200 мл) и подкислили соляной кислотой до значения рН 2. Выпавший осадок отфильтровали, сушили на воздухе и продукт кристаллизовали из смеси этилацетат–гексан (2 : 1). A mixture of 0.4 g (1.502 mmol) of 1-(4-bromonaphthyl-1-methyl)uracil (8) [1] and 0.3 g (2.171 mmol) of K ₂ CO ₃ in a solution of 10 ml of DMF was stirred at 80°C for 1 h , 0.43 g (1.497 mmol) of 4-(4-bromobutoxy)benzoic acid methyl ester (2) was added and stirred at the same temperature for 24 h. -dichloroethane (4×25 ml) and the extract was evaporated under reduced pressure. The residue was purified by flash chromatography, followed by evaporation of the eluent under reduced pressure. The residue was dissolved in a mixture of ethanol (50 ml) and water (30 ml), 0.3 g (7.500 mmol) of NaOH was added, and the resulting mixture was stirred at room temperature for two days. Ethanol was evaporated under reduced pressure, the residue was diluted with water (200 mL) and acidified with hydrochloric acid to pH 2. The precipitate formed was filtered off, dried in air, and the product was crystallized from an ethyl acetate–hexane (2 : 1) mixture.

Пример 9. Методы анализа синтезированных соединений Example 9 Methods for Analyzing Synthesized Compounds

1Н ЯМР-спектры соединений регистрировали на спектрометре Bruker Avance 400 (400 МГц) в DMSO-d6 с использованием тетраметилсилана в качестве внутреннего стандарта. В описании спектров использованы следующие стандартные сокращения: м.д., миллионные доли; уш., уширенный; с, синглет; д, дублет; дд, дублет дублетов; ддд, дублет дублет дублетов; т, триплет; к, квартет; м, мультиплет). Температуры плавления веществ определяли в стеклянных капиллярах на приборе Mel-Temp 3.0 (Laboratory Devices Inc., US). Тонкослойную хроматографию выполняли на пластинах Merck TLC Silica gel 60 F254 с проявлением в ультрафиолетовом свете с использованием УФ-лампы VL-6.LC (Франция) при длине волны 254 нм.1H NMR spectra of the compounds were recorded on a Bruker Avance 400 spectrometer (400 MHz) in DMSO-d6 using tetramethylsilane as an internal standard. The following standard abbreviations are used in the description of the spectra: ppm, parts per million; ear., broadened; s, singlet; e, doublet; dd, doublet of doublets; ddd, doublet doublet of doublets; t, triplet; k, quartet; m, multiplet). The melting points of substances were determined in glass capillaries on a Mel-Temp 3.0 instrument (Laboratory Devices Inc., US). Thin layer chromatography was performed on Merck TLC Silica gel 60 F254 plates with UV development using a VL-6.LC UV lamp (France) at a wavelength of 254 nm.

4-[5-[3-[5-(4-Фторфенокси)пентил]-2,6-диоксо-3,6-дигидропиримидин-1(24-[5-[3-[5-(4-Fluorophenoxy)pentyl]-2,6-dioxo-3,6-dihydropyrimidine-1(2 HH )-ил]пентилокси]бензойная кислота (Z870))-yl]pentyloxy]benzoic acid (Z870)

Выход 88%, Т.пл. 133-135 °C, R _f 0.54 (i-PrOH-этилацетат-NH₄OH, 9:6:5); Спектр ¹H ЯМР (ДМСО-d₆), d, м.д.: 1.38-1.46 (4H, м, CH₂ × 2), 1.60-1.75 (8H, м, CH₂ × 4), 3.62-4.08 (8H, м, CH₂ × 4), 5.60 (1H, д, J = 7.8 Гц, урацил H-5), 6.87 (2H, д, J = 9 Гц, H-3’, H-5’), 6.91 (2Н, д, J = 8.9 Гц, H-3”, H-5”), 6.99 (2Н, д, J = 7.9 Гц, H-2”, H-6”), 7.40 (2H, д, J = 8.9 Гц, H-2’, H-6’), 7.59 (1H, д, J = 7.8 Гц, урацил H-6).Yield 88%, m.p. 133-135 °C, R _f 0.54 ( i -PrOH-ethyl acetate-NH ₄ OH, 9:6:5); 1H NMR spectrum (DMSO-d ₆ ), d, ^ppm : 1.38-1.46 (4H, m, CH ₂ × 2), 1.60-1.75 (8H, m, CH ₂ × 4), 3.62-4.08 ( 8H, m, CH ₂ × 4), 5.60 (1H, d, J = 7.8 Hz, uracil H-5), 6.87 (2H, d, J = 9 Hz, H-3', H-5'), 6.91 (2Н, d, J = 8.9 Hz, H-3”, H-5”), 6.99 (2Н, d, J = 7.9 Hz, H-2”, H-6”), 7.40 (2H, d, J = 8.9 Hz, H-2', H-6'), 7.59 (1H, d, J = 7.8 Hz, uracil H-6).

4-[5-[3-[5-(2-Бромфенокси)пентил]-2,6-диоксо-3,6-дигидропиримидин-1(24-[5-[3-[5-(2-Bromophenoxy)pentyl]-2,6-dioxo-3,6-dihydropyrimidine-1(2 HH )-ил]пентилокси]бензойная кислота (Z871).)-yl]pentyloxy]benzoic acid (Z871).

Выход 84%, Т.пл. 91-92 °C, R _f 0.55 (i-PrOH-этилацетат-NH₄OH, 9:6:5); Спектр ¹H ЯМР (ДМСО-d₆), d, м.д.: 1.36-1.45 (4H, м, CH₂ × 2), 1.61-1.77 (8H, м, CH₂ × 4), 3.60-4.07 (8H, м, CH₂ × 4), 5.56 (1H, д, J = 7.8 Гц, урацил H-5), 6.86 (1H, т, J = 6.8 Гц, Н-4’), 6.74 (1H, д, J = 8.8 Гц, H-3”, H-5”), 7.07 (1H, д, J = 8.2 Гц, H-6’), 7.01 (2H, д, J = 8.8 Гц, H-2”, H-6”), 7.31 (1H, т, J = 7.0 Гц, H-5’), 7.54 (1H, д, J = 7.9 и 1.4 Гц, H-3’), 7.65 (1H, д, J = 7.8 Гц, урацил H-6).Yield 84%, m.p. 91-92 °C, R _f 0.55 ( i -PrOH-ethyl acetate-NH ₄ OH, 9:6:5); 1H NMR spectrum (DMSO-d ₆ ), d, ^ppm : 1.36-1.45 (4H, m, CH ₂ × 2), 1.61-1.77 (8H, m, CH ₂ × 4), 3.60-4.07 ( 8H, m, CH ₂ × 4), 5.56 (1H, d, J = 7.8 Hz, uracil H-5), 6.86 (1H, t, J = 6.8 Hz, Н-4'), 6.74 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-3”, H-5”), 7.07 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-6'), 7.01 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-2”, H -6”), 7.31 (1H, t, J = 7.0 Hz, H-5'), 7.54 (1H, d, J = 7.9 and 1.4 Hz, H-3'), 7.65 (1H, d, J = 7.8 Hz, uracil H-6).

4-[4-[3-[3-(4-Бромфенокси)пропил]-2,6-диоксо-3,6-дигидропиримидин-1(24-[4-[3-[3-(4-Bromophenoxy)propyl]-2,6-dioxo-3,6-dihydropyrimidine-1(2 HH )-ил]бутокси]бензойная кислота (Z873).)-yl]butoxy]benzoic acid (Z873).

Выход 79%, Т.пл. 122-124 °C, R _f 0.51 (i-PrOH-этилацетат-NH₄OH, 9:6:5); Спектр ¹H ЯМР (ДМСО-d₆), d, м.д.: ¹H NMR (DMSO-d ₆), d, м.д.: 1.58 (2H, кв, J = 7.3 Гц, CH₂), 1.66 (2H, кв, J = 7.5 Гц, CH₂), 2.01 (2H, кв, J = 6.2 Гц, CH₂), 3.69 (2H, т, J = 7.1 Гц, N⁽¹⁾CH₂), 3.89 (2H, т, J = 6.4 Гц, OCH₂), 3.99 (2H, т, J = 6.7 Гц, N⁽³⁾CH₂), 4.09 (2H, т, J = 5.9 Гц, OCH₂), 5.53 (1H, д, J = 7.8 Гц, урацил H-5), 6.72 (1H, д, J = 8.8 Гц, H-3”, H-5”), 6.87 (2H, д, J = 9.0 Гц, H-3’, H-5’), 7.04 (2H, д, J = 8.8 Гц, H-2”, H-6”), 7.43 (2H, д, J = 8.9 Гц, H-2’, H-6’), 7.62 (1H, д, J = 7.8 Гц, урацил H-6).Yield 79%, m.p. 122-124 °C, R _f 0.51 ( i -PrOH-ethyl acetate-NH ₄ OH, 9:6:5); ¹ H NMR spectrum (DMSO-d ₆ ), d, ppm: ¹ H NMR (DMSO- d ₆ ), d, ppm: 1.58 (2H, q, J = 7.3 Hz, CH ₂ ), 1.66 (2H, q, J = 7.5 Hz, _CH2 ), 2.01 (2H, q, J = 6.2 Hz, _CH2 ), 3.69 (2H, t, J = 7.1 Hz, N ⁽¹⁾ _CH2 ), 3.89 (2H, t, J = 6.4 Hz, _OCH2 ), 3.99 (2H, t, J = 6.7 Hz, N ⁽³⁾ _CH2 ), 4.09 (2H, t, J = 5.9 Hz, _OCH2 ), 5.53 ( 1H, d, J = 7.8 Hz, uracil H-5), 6.72 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-3”, H-5”), 6.87 (2H, d, J = 9.0 Hz, H- 3', H-5'), 7.04 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-2”, H-6”), 7.43 (2H, d, J = 8.9 Hz, H-2', H-6 '), 7.62 (1H, d, J = 7.8 Hz, uracil H-6).

4-[5-[3-[5-(3,5-Диметилфенокси)пентил]-2,6-диоксо-3,6-дигидропиримидин-1(24-[5-[3-[5-(3,5-Dimethylphenoxy)pentyl]-2,6-dioxo-3,6-dihydropyrimidine-1(2 HH )-ил]пентилокси]бензойная кислота (Z874).)-yl]pentyloxy]benzoic acid (Z874).

Выход 81%, Т.пл. 103.5-105 °C, R _f 0.57 (i-PrOH-этилацетат-NH₄OH, 9:6:5); Спектр ¹H ЯМР (ДМСО-d₆), d, м.д.: 1.36-1.44 (4H, м, CH₂ × 2), 1.59-1.73 (8H, м, CH₂ × 4), 2.24 (6H, с, CH₃ × 2), 3.64-4.09 (8H, м, CH₂ × 4), 5.55 (1H, д, J = 7.9 Гц, урацил H-5), 6.51 (2H, с, H-2’, H-6’), 6.53 (1H, с, H-4’), 6.74 (1H, д, J = 8.9 Гц, H-3”, H-5”), 6.99 (2H, д, J = 8.8 Гц, H-2”, H-6”), 7.64 (1H, д, J = 7.8 Гц, урацил H-6).Yield 81%, m.p. 103.5-105 °C, R _f 0.57 ( i -PrOH-ethyl acetate-NH ₄ OH, 9:6:5); 1H NMR spectrum (DMSO-d ₆ ), d, ^ppm : 1.36-1.44 (4H, m, CH ₂ × 2), 1.59-1.73 (8H, m, CH ₂ × 4), 2.24 (6H, s, CH ₃ × 2), 3.64–4.09 (8H, m, CH ₂ × 4), 5.55 (1H, d, J = 7.9 Hz, uracil H-5), 6.51 (2H, s, H-2', H-6'), 6.53 (1H, s, H-4'), 6.74 (1H, d, J = 8.9 Hz, H-3”, H-5”), 6.99 (2H, d, J = 8.8 Hz , H-2”, H-6”), 7.64 (1H, d, J = 7.8 Hz, uracil H-6).

4-[[5-[3-(Антрацен-9-илметил)-2,6-диоксо-3,6-дигидропиримидин-1(24-[[5-[3-(Anthracen-9-ylmethyl)-2,6-dioxo-3,6-dihydropyrimidine-1(2 HH )-ил]пентил]окси]бензойная кислота (Z876).)-yl]pentyl]oxy]benzoic acid (Z876).

Выход 76%, Т.пл. 173-176 °C, R _f 0.52 (i-PrOH-этилацетат-NH₄OH, 9:6:5); Спектр ¹H ЯМР (CDCl₃), d, м.д.: 1.31 (2H, квин, J = 6.8 Гц, CH₂), 1.59 (2H, квин, J = 7.6 Гц, CH₂), 1.67 (2H, квин, J = 7.6 Гц, CH₂), 3.54 (2H, т, J = 7.1 Гц, NCH₂), 3.77 (2H, т, J = 6.1 Гц, OCH₂), 5.68 (1H, д, J = 7.8 Гц, урацил H-5), 6.13 (2Н, с, СН₂), 6.72 (1H, д, J = 8.8 Гц, H-3’, H-5’), 6.92 (1H, т, J = 7.6 Гц, урацил H-6), 7.00 (2H, д, J = 8.8 Гц, H-2’, H-6’), 7.45 (2H, т, J = 6.8 Гц, H-3”, H-6”), 7.54 (2H, т, J = 6.8 Гц, H-2”, H-7”), 7.98 (2H, д, J = 8.3 Гц, H-1”, H-8”), 8.41 (1H, c, H-10”), 8.53 (2H, д, J = 9.1 Гц, H-4”, H-5”).Yield 76%, m.p. 173-176 °C, R _f 0.52 ( i -PrOH-ethyl acetate-NH ₄ OH, 9:6:5); 1H NMR spectrum ( _CDCl3 ), d, ^ppm : 1.31 (2H, quint, J = 6.8 Hz, _CH2 ), 1.59 (2H, quint, J = 7.6 Hz, _CH2 ), 1.67 (2H, quine, J = 7.6 Hz, _CH2 ), 3.54 (2H, t, J = 7.1 Hz, _NCH2 ), 3.77 (2H, t, J = 6.1 Hz, _OCH2 ), 5.68 (1H, d, J = 7.8 Hz, uracil H-5), 6.13 (2Н, s, _CH2 ), 6.72 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-3', H-5'), 6.92 (1H, t, J = 7.6 Hz , uracil H-6), 7.00 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-2', H-6'), 7.45 (2H, t, J = 6.8 Hz, H-3”, H-6”) , 7.54 (2H, t, J = 6.8 Hz, H-2”, H-7”), 7.98 (2H, d, J = 8.3 Hz, H-1”, H-8”), 8.41 (1H, s , H-10”), 8.53 (2H, d, J = 9.1 Hz, H-4”, H-5”).

4-[4-[2,6-Диоксо-3-(нафтил-1-метил)-3,6-дигидропиримидин-1(24-[4-[2,6-Dioxo-3-(naphthyl-1-methyl)-3,6-dihydropyrimidine-1(2 HH )-ил]бутокси]бензойная кислота (Z601))-yl]butoxy]benzoic acid (Z601)

Выход 76%, Т.пл. 183-184.5 °C, R _f 0.52 (i-PrOH-этилацетат-NH₄OH, 9:6:5); Спектр ¹H ЯМР (CDCl₃), d, м.д.: 1.67 (2H, квин, J = 8.2 Гц, CH₂), 1.88 (2Н, квин, J = 7.9 Гц, CH₂), 4.01-4.08 (4Н, м, СН₂ × 2), 5.32 (2Н, с, СН₂), 5.64 (1Н, д, J = 8.1 Гц, урацил H-5), 6.91 (1H, д, J = 8.9 Гц, H-3’, H-5’), 6.99 (1H, д, J = 7.9 Гц, урацил H-6), 7.36-7.48 (2Н, м, ароматические Н), 7.50-7.57 (2Н, м, ароматические Н), 7.87-7.95 (3Н, м, ароматические Н), 8.03 (2H, д, J = 8.9 Гц, H-2’, H-6’).Yield 76%, m.p. 183-184.5 °C, R _f 0.52 ( i -PrOH-ethyl acetate-NH ₄ OH, 9:6:5); 1H NMR spectrum ( _CDCl3 ), d, ^ppm : 1.67 (2H, quint, J = 8.2 Hz, _CH2 ), 1.88 (2Н, quint, J = 7.9 Hz, _CH2 ), 4.01–4.08 ( 4H, m, CH ₂ × 2), 5.32 (2H, s, CH ₂ ), 5.64 (1H, d, J = 8.1 Hz, uracil H-5), 6.91 (1H, d, J = 8.9 Hz, H- 3', H-5'), 6.99 (1H, d, J = 7.9 Hz, uracil H-6), 7.36-7.48 (2H, m, aromatic H), 7.50-7.57 (2H, m, aromatic H), 7.87-7.95 (3H, m, aromatic H), 8.03 (2H, d, J = 8.9 Hz, H-2', H-6').

1-(Антрацен-9-илметил)-3-[6-(4-бромфенокси)гексил]урацил (Z611)1-(Anthracen-9-ylmethyl)-3-[6-(4-bromophenoxy)hexyl]uracil (Z611)

Выход 66%, Т.пл. 109.5-111 °C, R _f 0.68 (1,2-дихлорэтан-этилацетат, 1:1); Спектр ¹H ЯМР (CDCl₃), d, м.д.: 1.31 (2H, квин, J = 6.8 Гц, CH₂), 1.59 (2H, квин, J = 7.6 Гц, CH₂), 1.67 (2H, квин, J = 7.6 Гц, CH₂), 3.54 (2H, т, J = 7.1 Гц, NCH₂), 3.77 (2H, т, J = 6.1 Гц, OCH₂), 5.68 (1H, д, J = 7.8 Гц, урацил H-5), 6.13 (2Н, с, СН₂), 6.72 (1H, д, J = 8.8 Гц, H-3’, H-5’), 6.93 (1H, т, J = 7.6 Гц, урацил H-6), 7.37 (2H, д, J = 8.8 Гц, H-2’, H-6’), 7.45 (2H, т, J = 6.8 Гц, H-3”, H-6”), 7.54 (2H, т, J = 6.8 Гц, H-2”, H-7”), 7.98 (2H, д, J = 8.3 Гц, H-1”, H-8”), 8.41 (1H, c, H-10”), 8.53 (2H, д, J = 9.1 Гц, H-4”, H-5”).Yield 66%, m.p. 109.5-111 °C, R _f 0.68 (1,2-dichloroethane-ethyl acetate, 1:1); 1H NMR spectrum ( _CDCl3 ), d, ^ppm : 1.31 (2H, quint, J = 6.8 Hz, _CH2 ), 1.59 (2H, quint, J = 7.6 Hz, _CH2 ), 1.67 (2H, quine, J = 7.6 Hz, _CH2 ), 3.54 (2H, t, J = 7.1 Hz, _NCH2 ), 3.77 (2H, t, J = 6.1 Hz, _OCH2 ), 5.68 (1H, d, J = 7.8 Hz, uracil H-5), 6.13 (2Н, s, _CH2 ), 6.72 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-3', H-5'), 6.93 (1H, t, J = 7.6 Hz , uracil H-6), 7.37 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-2', H-6'), 7.45 (2H, t, J = 6.8 Hz, H-3”, H-6”) , 7.54 (2H, t, J = 6.8 Hz, H-2”, H-7”), 7.98 (2H, d, J = 8.3 Hz, H-1”, H-8”), 8.41 (1H, s , H-10”), 8.53 (2H, d, J = 9.1 Hz, H-4”, H-5”).

4-[[5-[3-[5-(4-бромфенокси)пентил]-2,6-диоксо-3,6-дигидропиримидин-1(24-[[5-[3-[5-(4-bromophenoxy)pentyl]-2,6-dioxo-3,6-dihydropyrimidine-1(2 HH )-ил]метил]бензойная кислота (Z875))-yl]methyl]benzoic acid (Z875)

Выход 77%, Т.пл. 186-187 °C, R _f 0.52 (i-PrOH-этилацетат-NH₄OH, 9:6:5); Спектр ¹H ЯМР (ДМСО-D₆), d, м.д.: 1.37 (2H, квин, J = 8.1 Гц, CH₂), 1.33-1.74 (4H, м, СН₂ × 2), 3.74 (2H, т, J = 7.0 Гц, NCH₂), 3.91 (2H, т, J = 6.6 Гц, OCH₂), 5.04 (2Н, с, ArСН₂), 5.76 (1H, д, J = 7.8 Гц, урацил H-5), 6.76 (1H, д, J = 9.1 Гц, H-3’, H-5’), 7.34 (1H, д, J = 8.3 Гц, H-3”, H-5”), 7.41 (2H, д, J = 8.8 Гц, H-2’, H-6’), 7.76 (1H, д, J = 7.8 Гц, урацил H-6), 7.88 (2H, д, J = 8.3 Гц, H-2”, H-6”).Yield 77%, m.p. 186-187 °C, R _f 0.52 ( i -PrOH-ethyl acetate-NH ₄ OH, 9:6:5); 1H NMR spectrum (DMSO-D ₆ ), d, ^ppm : 1.37 (2H, quin, J = 8.1 Hz, _CH2 ), 1.33–1.74 (4H, m, CH ₂ × 2), 3.74 (2H , t, J = 7.0 Hz, _NCH2 ), 3.91 (2H, t, J = 6.6 Hz, _OCH2 ), 5.04 (2Н, s, _ArCH2 ), 5.76 (1H, d, J = 7.8 Hz, uracil H -5), 6.76 (1H, d, J = 9.1 Hz, H-3', H-5'), 7.34 (1H, d, J = 8.3 Hz, H-3”, H-5”), 7.41 ( 2H, d, J = 8.8 Hz, H-2', H-6'), 7.76 (1H, d, J = 7.8 Hz, uracil H-6), 7.88 (2H, d, J = 8.3 Hz, H- 2”, H-6”).

4-[4-[2,6-Диоксо-3-(нафтил-2-метил)-3,6-дигидропиримидин-1(24-[4-[2,6-Dioxo-3-(naphthyl-2-methyl)-3,6-dihydropyrimidine-1(2 HH )-ил]бутокси]бензойная кислота (Z1005))-yl]butoxy]benzoic acid (Z1005)

Выход 72%, Т.пл. 143.5-145 °C, R _f 0.52 (i-PrOH-этилацетат-NH₄OH, 9:6:5); Спектр ¹H ЯМР (ДМСО-D₆), d, м.д.: 1,47 (2H, квин, J = 7,9 Гц, CH₂); 1,70 (2H, квин, J = 7,3 Гц, CH₂); 3,75 (2H, т, J = 7,3 Гц, NCH₂); 3,89 (2H, т, J = 6,4 Гц, OCH₂); 5,15 (2H, c, ArCH₂); 5,77 (1H, д, J = 7,9 Гц, урацил H-5); 6,84 (2H, д, J = 9,0 Гц, H-3’, H-5’); 7,40 (2H, д, J = 9,1 Гц, H-2’, H-6’); 7,41-7,48 (3H, ароматические H); 7,73 (1H, c, H-1”); 7,76 (1H, д, J = 7,9 Гц, урацил H-6); 7,82-7,86 (3H, м, ароматические H).Yield 72%, m.p. 143.5-145 °C, R _f 0.52 ( i -PrOH-ethyl acetate-NH ₄ OH, 9:6:5); ¹ H NMR spectrum (DMSO-D ₆ ), d, ppm: 1.47 (2H, quin, J = 7.9 Hz, CH ₂ ); 1.70 (2H, quint, J = 7.3 Hz, CH ₂ ); 3.75 (2H, t, J =7.3 Hz, NCH ₂ ); 3.89 (2H, t, J =6.4 Hz, OCH ₂ ); 5.15 (2H, s, ArCH ₂ ); 5.77 (1H, d, J = 7.9 Hz, uracil H-5); 6.84 (2H, d, J = 9.0 Hz, H-3', H-5'); 7.40 (2H, d, J = 9.1 Hz, H-2', H-6'); 7.41-7.48 (3H, aromatic H); 7.73 (1H, s, H-1”); 7.76 (1H, d, J = 7.9 Hz, uracil H-6); 7.82-7.86 (3H, m, aromatic H).

4-[4-[2,6-Диоксо-3-(4-бромнафтил-1-метил)-3,6-дигидропиримидин-1(24-[4-[2,6-Dioxo-3-(4-bromonaphthyl-1-methyl)-3,6-dihydropyrimidine-1(2 HH )-ил]бутокси]бензойная кислота (Z1006))-yl]butoxy]benzoic acid (Z1006)

Выход 69%, Т.пл. 195.5-197.5 °C, R _f 0.52 (i-PrOH-этилацетат-NH₄OH, 9:6:5); Спектр ¹H ЯМР (CDCl₃), d, м.д.: 1.73 (2H, квин, J = 8.0 Гц, CH₂), 1.88 (2Н, квин, J = 7.9 Гц, CH₂), 3.92 (2H, т, J = 6.4 Гц, NCH₂); 4.03 (2H, т, J = 7.5 Гц, OCH₂), 5.34 (2Н, с, ArСН₂), 5.63 (1Н, д, J = 8.0 Гц, урацил H-5), 6.75 (1H, д, J = 9.1 Гц, H-3’, H-5’), 6.97 (1Н, д, J = 7.9 Гц, ароматические Н), 7.19 (1Н, д, J = 7.6 Гц, ароматические Н), 7.34 (2H, д, J = 9.0 Гц, H-2’, H-6’), 7.57-7.65 (2Н, м, ароматические Н), 7.76 (1H, д, J = 7.7 Гц, урацил H-6), 7.94 (1Н, дд, J = 7.7 и 1.4 Гц, ароматические Н), 8.32 (1Н, дд, J = 7.8 и 1.4 Гц, ароматические Н).Yield 69%, m.p. 195.5-197.5 °C, R _f 0.52 ( i -PrOH-ethyl acetate-NH ₄ OH, 9:6:5); 1H NMR spectrum ( _CDCl3 ), d, ^ppm : 1.73 (2H, quin, J = 8.0 Hz, _CH2 ), 1.88 (2Н, quin, J = 7.9 Hz, _CH2 ), 3.92 (2H, t, J = 6.4 Hz, _NCH2 ); 4.03 (2H, t, J = 7.5 Hz, _OCH2 ), 5.34 (2H, s, _ArCH2 ), 5.63 (1H, d, J = 8.0 Hz, uracil H-5), 6.75 (1H, d, J = 9.1 Hz, H-3', H-5'), 6.97 (1Н, d, J = 7.9 Hz, aromatic Н), 7.19 (1Н, d, J = 7.6 Hz, aromatic Н), 7.34 (2H, d, J = 9.0 Hz, H-2', H-6'), 7.57-7.65 (2Н, m, aromatic Н), 7.76 (1H, d, J = 7.7 Hz, uracil H-6), 7.94 (1Н, dd , J = 7.7 and 1.4 Hz, aromatic Н), 8.32 (1Н, dd, J = 7.8 and 1.4 Hz, aromatic Н).

Пример 10. Определение цитотоксичности in vitro.Example 10 Determination of cytotoxicity in vitro.

Клетки Vero E6 (ATCC CRL-1586) культивировали при 37⁰С и 5% CO2, в полной ростовой среде DMEM (Gibco, США), дополненной 10% эмбриональной бычьей сывороткой (FBS; HyClone, США), 1× GlutaMAX и 1× pen-strep solution (Gibco, США). Оценка токсичности соединений проводили методом скрининга библиотеки соединений (фиг. 9). Для этого клетки Vero E6 высевали в 96-луночные планшеты (2×10⁴клеток/лунку) в полной ростовой среде DMEM за сутки до эксперимента. Затем, раствор, содержащий не более 100 мкМ каждого соединения, добавляли к монослою клеток. Планшеты инкубировали в течение 72 ч при 37⁰С и 5% CO2. После этого, в лунки добавляли раствор МТТ (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide, 0.5 мг/мл; ПанЭко, Россия), с последующей инкубацией в течение 4 ч. МТТ метод использовали для измерения клеточной метаболической активности в качестве индикатора жизнеспособности, пролиферации и цитотоксичности клеток. Далее, из лунок отбирали супернатант и растворяли выпавшие кристаллы формазана в ДМСО (диметилсульфоксид; ПанЭко, Россия). Оптическую плотность измеряли при 590 нм с использованием планшетного ридера SPECTROstar Nano microplate reader (BMG LABTECH).Vero E6 cells (ATCC CRL-1586) were cultured at 37 ^° C and 5% CO2, in complete DMEM growth medium (Gibco, USA) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; HyClone, USA), 1× GlutaMAX and 1× pen-strep solution (Gibco, USA). Compound toxicity was assessed by the compound library screening method (FIG. 9). For this, Vero E6 cells were seeded in 96-well plates (2×10 ⁴ cells/well) in complete DMEM growth medium one day before the experiment. Then, a solution containing not more than 100 μM of each compound was added to the cell monolayer. The plates were incubated for 72 hours at 37 ^° C and 5% CO2. After that, a solution of MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide, 0.5 mg/mL; PanEco, Russia) was added to the wells, followed by incubation for 4 h. used to measure cellular metabolic activity as an indicator of cell viability, proliferation and cytotoxicity. Next, the supernatant was taken from the wells and the precipitated formazan crystals were dissolved in DMSO (dimethyl sulfoxide; PanEco, Russia). Optical density was measured at 590 nm using a SPECTROstar Nano microplate reader (BMG LABTECH).

При исследовании жизнеспособности клеток Vero E6 под действием изучаемых аналогов урацила было выяснено, что практически все соединения обладают низкой цитотоксичностью. 50% цитотоксическая концентрация (СС₅₀) находилась выше 100 мкМ (фиг. 10). Незначительное снижение (около 20%) жизнеспособности клеток наблюдали под действием 100 мкМ соединения Z875. Средний цитотоксический эффект проявили соединения Z872 и Z1007, для которых значение СС₅₀ составило ≥ 25 мкМ.When studying the viability of Vero E6 cells under the influence of the studied uracil analogues, it was found that almost all compounds have low cytotoxicity. The 50% cytotoxic concentration (CC ₅₀ ) was above 100 μM (FIG. 10). A slight decrease (about 20%) in cell viability was observed with 100 μM compound Z875. Compounds Z872 and Z1007 showed an average cytotoxic effect, for which the SS ₅₀ value was ≥ 25 μM.

Пример 11. Исследование антивирусного эффекта против SARS-CoV-2.Example 11 Study of the antiviral effect against SARS-CoV-2.

В работе использовали следующие штаммы SARS-CoV-2 – PMVL-30 (EPI_ISL_872643, B.1.1.141) и “дельта” вариант (B.1.617.2). Вирусы были изолированы из назо/орофарингеального смыва и прошли три последовательных пассажа на клетках Vero E6. Первоначально, проводили скрининговое исследование панели соединений на наличие антивирусного эффекта против «дикого штамма» SARS-CoV-2 PMVL-30. Для этого клетки Vero E6 высевали в 96-луночные планшеты (2×10⁴ клеток/лунку) в полной ростовой среде DMEM за сутки до эксперимента. К клеткам добавляли различные разведения соединений (100, 25, 6.25 мкМ) и инкубировали в течение 1 ч при 37⁰С и 5% CO₂. После этого, производили заражение клеток SARS-CoV-2 при 100TCID₅₀ (50% тканевая инфекционная доза). Планшеты инкубировали в течение 72 ч при 37⁰С и 5% CO₂. Вирус-индуцированный цитопатический эффект (СРЕ) оценивали с помощью МТТ метода, как описано ранее [11, 12]. После обнаружения соединений, которые активно ингибируют SARS-CoV-2, проводили дополнительные исследования их противовирусной активности в отношении “дельта” варианта SARS-CoV-2 как описано выше. Антивирусный эффект для лидерных соединений был также исследован с помощью ПЦР по уровню снижения вирусной нагрузки SARS-CoV-2.We used the following SARS-CoV-2 strains: PMVL-30 (EPI_ISL_872643, B.1.1.141) and the “delta” variant (B.1.617.2). Viruses were isolated from naso/oropharyngeal washings and underwent three consecutive passages on Vero E6 cells. Initially, a panel of compounds was screened for antiviral effect against wild-type SARS-CoV-2 PMVL-30. For this, Vero E6 cells were seeded in 96-well plates (2×10 ⁴ cells/well) in complete DMEM growth medium one day before the experiment. Different dilutions of the compounds (100, 25, 6.25 μM) were added to the cells and incubated for 1 h at 37 ⁰ C and 5% CO ₂ . Thereafter, SARS-CoV-2 cells were infected at 100TCID ₅₀ (50% tissue infectious dose). The plates were incubated for 72 hours at 37 ^° C and 5% CO ₂ . The virus-induced cytopathic effect (CPE) was assessed using the MTT method, as described previously [11, 12]. After the discovery of compounds that actively inhibit SARS-CoV-2, additional studies were carried out on their antiviral activity against the “delta” variant of SARS-CoV-2 as described above. The antiviral effect for the leader compounds was also investigated by PCR in terms of the level of reduction in the viral load of SARS-CoV-2.

Для 11 соединений была проведена оценка противовирусного действия против SARS-CoV-2 с использованием клеток Vero E6. Скрининг панели ингибиторов на обнаружение их антивирусной активности проводили с использованием 100 мкМ концентрации соединений, против SARS-CoV-2-индуцированного цитопатического эффекта (СРЕ). Обнаружено, что практически все соединения способны на 90-100% блокировать СРЕ (фиг. 11). Однако, наличие метила в N5 положении урацила в соединении Z872 приводило к полной потери антивирусной активности. Ввиду того, что соединение Z1007 при 100 мкМ обладает наиболее высокой токсичностью по отношению к клеткам Vero E6, его противовирусная активность была оценена при 25 мкМ, для которой ингибирование СРЕ составило в среднем 23,3%. Eleven compounds were evaluated for antiviral activity against SARS-CoV-2 using Vero E6 cells. Screening of a panel of inhibitors for detection of their antiviral activity was performed using a 100 μM concentration of compounds against SARS-CoV-2-induced cytopathic effect (CPE). Almost all compounds were found to be able to block CPE by 90-100% (FIG. 11). However, the presence of methyl at the N5 position of uracil in compound Z872 resulted in a complete loss of antiviral activity. Since the compound Z1007 at 100 μM has the highest toxicity against Vero E6 cells, its antiviral activity was evaluated at 25 μM, for which CPE inhibition averaged 23.3%.

Дополнительно, противовирусный эффект был подтвержден с помощью ПЦР. Наиболее активные соединения из представленных панелей, приводили к значительному снижению вирусной нагрузки SARS-CoV-2. Соединение Z876 снижало нагрузку примерно на три порядка, в то время как для остальных наблюдалось падение нагрузки в среднем на два порядка в супернатанте SARS-CoV-2 инфицированных клеток Vero E6 (фиг. 12). Additionally, the antiviral effect was confirmed by PCR. The most active compounds from the presented panels led to a significant decrease in the viral load of SARS-CoV-2. Compound Z876 reduced load by about three orders of magnitude, while the rest showed a load drop of an average of two orders of magnitude in the supernatant of SARS-CoV-2 infected Vero E6 cells (Fig. 12).

Противовирусная активность наиболее активных соединений из исследуемой панели была протестирована в анализе цитопатогенного эффекта (CPE) в культуре клеток Vero E6 против “дельта” варианта SARS-CoV-2 линии B.1.617.2, для определения их полуингибирующих концентраций (IC₅₀). В результате было обнаружено, что соединения активно ингибируют СРЕ SARS-CoV-2, со значениями IC₅₀ от 31.57 до 4.53 мкМ (фиг. 13). Наиболее высокая ингибирующая активность наблюдалась для соединений Z611, Z870 и Z876, для которых значения IC₅₀не превышали 10 мкМ. Соединения Z611 и Z876 имеют родственную структуру с наличием антрацена в линкерной части в положении N1 урацила. Основным отличием соединения Z870 от схожих по структуре соединений из данной панели, являлось наличие фторфеноксипентильного заместителя, в то время как другие соединения содержали бромфеноксипентильный заместитель. The antiviral activity of the most active compounds from the panel under study was tested in a cytopathogenic effect (CPE) assay in Vero E6 cell culture against the delta variant of SARS-CoV-2 line B.1.617.2 to determine their semi-inhibitory concentrations (IC ₅₀ ). As a result, the compounds were found to actively inhibit SARS-CoV-2 CPE, with IC ₅₀ values ranging from 31.57 to 4.53 μM (FIG. 13). The highest inhibitory activity was observed for compounds Z611, Z870 and Z876, for which IC ₅₀ values did not exceed 10 μM. Compounds Z611 and Z876 have a related structure with the presence of an anthracene in the linker portion at the N1 position of uracil. The main difference between compound Z870 and structurally similar compounds from this panel was the presence of a fluorophenoxypentyl substituent, while other compounds contained a bromophenoxypentyl substituent.

Пример 12. Исследование влияния соединений на стадии цикла репликации SARS-CoV-2Example 12 Investigation of the effect of compounds at the stage of the SARS-CoV-2 replication cycle

Был проведен анализ по определению на какой стадии жизненного цикла SARS-CoV-2 соединения проявляют эффект [13]. Клетки Vero E6 высевали в 96-луночные планшеты (3×10⁴ клеток/лунку). Клетки инфицировали SARS-CoV-2 PMVL-30 при MOI 0.1 (множественность инфекции), а затем инкубировали еще 1 ч. Далее, вирусный инокулят удаляли, и клетки дважды промывали ростовой средой DMEM. Через 1 ч после инокуляции, к инфицированным клеткам добавляли соединения из исследуемой библиотеки в концентрации 25 мкМ в указанные моменты времени с последующей инкубацией при 37⁰С и 5% СО₂ в течение 16 ч после инокуляции (один жизненный цикл вируса). Супернатант из лунок отбирали и анализировали с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Для определения вирусной нагрузки SARS-CoV-2, использовали набор «SARS-CoV-2 FRT» (НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, Россия) с последующей постановкой и анализом на QuantStudio 5 (Applied Biosystems) или CFX96 Touch (Bio-Rad).Относительное количество РНК SARS-CoV-2 определяли с помощью калибровочной прямой, для построения которой при каждой постановке анализа тестировали калибровочные стандарты. Калибровочные стандарты представляли собой рекомбинантные конструкции амплифицируемого фрагмента генома SARS-CoV-2 с известной концентрацией.An analysis was carried out to determine at what stage of the life cycle of SARS-CoV-2 compounds show an effect [13]. Vero E6 cells were seeded in 96-well plates (3×10 ⁴ cells/well). Cells were infected with SARS-CoV-2 PMVL-30 at an MOI of 0.1 (multiplicity of infection) and then incubated for another 1 h. Next, the viral inoculum was removed and the cells were washed twice with DMEM growth medium. 1 h after inoculation, compounds from the test library were added to infected cells at a concentration of 25 μM at the indicated time points, followed by incubation at 37 ⁰ C and 5% CO ₂ for 16 h after inoculation (one virus life cycle). The supernatant from the wells was collected and analyzed by real-time RT-PCR. To determine the viral load of SARS-CoV-2, we used the SARS-CoV-2 FRT kit (N.F. Gamaleya National Research Center for Epidemiology and Microbiology, Russia) with subsequent setup and analysis on QuantStudio 5 (Applied Biosystems) or CFX96 Touch (Bio- Rad). The relative amount of SARS-CoV-2 RNA was determined using a calibration line, for the construction of which calibration standards were tested during each analysis. Calibration standards were recombinant constructs of an amplified fragment of the SARS-CoV-2 genome at a known concentration.

Чтобы выяснить противовирусный механизм действия соединений из исследуемой панели, были проведены эксперименты позволяющие определить на какой стадии (стадиях) репликации вируса SARS-CoV-2 они проявляют свою противовирусную активность. Для этого к культуре клеток Vero E6 добавляли 25 мкМ соединений в разные моменты времени репликации вируса, включая прикрепление и проникновение вируса (entry), пост-проникновение и в течение всей вирусной инфекции. Для этого исследования SARS-CoV-2 “дикий тип” был выбран в качестве примера пандемического коронавируса человека. В этом анализе клетки Vero E6 были инфицированы SARS-CoV-2 при MOI равном 0.1, с последующим измерением количества копий вируса через 16 ч после инфекции в супернатанте клеточной культуры методом количественной ПЦР. Результаты ПЦР показали, что исследуемые соединения не подавляют репликацию вируса на стадии прикрепления и проникновения вируса (фиг. 14). Однако, данный анализ показал, что соединения действуют на стадии после проникновения вируса и в течение всей вирусной инфекции, снижая вирусную нагрузку на несколько порядков. Кроме этого, полученные данные свидетельствуют о том, что данные соединения могут быть эффективными в качестве профилактических и лечебных средств при COVID-19. To find out the antiviral mechanism of action of the compounds from the panel under study, experiments were carried out to determine at what stage (stages) of SARS-CoV-2 virus replication they exhibit their antiviral activity. To do this, 25 μM compounds were added to the Vero E6 cell culture at different times of virus replication, including virus attachment and entry (entry), post-penetration, and throughout the viral infection. For this study, wild-type SARS-CoV-2 was chosen as an example of a human pandemic coronavirus. In this assay, Vero E6 cells were infected with SARS-CoV-2 at an MOI of 0.1, followed by measurement of virus copy number 16 h post-infection in cell culture supernatant by qPCR. PCR results showed that the test compounds did not suppress viral replication at the stage of viral attachment and entry (FIG. 14). However, this analysis showed that the compounds act at the stage after the entry of the virus and during the entire viral infection, reducing the viral load by several orders of magnitude. In addition, the data obtained suggest that these compounds may be effective as prophylactic and therapeutic agents for COVID-19.

В результате проведенных исследований открыт новый класс ненуклеозидных ингибиторов репродукции SARS-CoV-2, обладающих высоким противовирусным эффектом in vitro, включая антивирусную активность против “дельта” варианта SARS-CoV-2. Приведенные примеры подтверждают выполнение поставленной задачи, а именно, создание новых, высокоэффективных, селективных и малотоксичных антивирусных агентов для лечения новой коронавирусной инфекции COVID-19.As a result of the research, a new class of non-nucleoside inhibitors of SARS-CoV-2 reproduction was discovered, which have a high antiviral effect in vitro , including antiviral activity against the “delta” variant of SARS-CoV-2. The above examples confirm the fulfillment of the task, namely, the creation of new, highly effective, selective and low-toxic antiviral agents for the treatment of the new coronavirus infection COVID-19.

Список использованных источников информации.List of sources of information used.

1. Novikov M.S., Babkov D.A., Paramonova M.P., Khandazhinskaya A.L., Ozerov A.A., Chizhov A.O., Andrei G., Snoeck R., Balzarini J., Seley-Radtke K.L. Synthesis and anti-HCMV activity of 1-[ω-(phenoxy)alkyl]uracil derivatives and analogues thereof. Bioorg. Med. Chem., 2013, 21 (14), 4151–4157.1. Novikov M.S., Babkov D.A., Paramonova M.P., Khandazhinskaya A.L., Ozerov A.A., Chizhov A.O., Andrei G., Snoeck R., Balzarini J., Seley-Radtke K.L. Synthesis and anti-HCMV activity of 1-[ω-(phenoxy)alkyl]uracil derivatives and analogues thereof. Bioorg. Med. Chem., 2013, 21(14), 4151–4157.

2. Novikov M.S., Babkov D.A., Paramonova M.P., Chizhov A.O., Khandazhinskaya A.L., Seley-Radtke K.L. A highly facile approach to the synthesis of novel 2-(3-benzyl-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-1-yl)-N-phenylacetamides. Tetrahedron Lett., 2013, 54 (6), 576-578.2. Novikov M.S., Babkov D.A., Paramonova M.P., Chizhov A.O., Khandazhinskaya A.L., Seley-Radtke K.L. A highly facile approach to the synthesis of novel 2-(3-benzyl-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-1-yl)-N-phenylacetamides. Tetrahedron Lett., 2013, 54(6), 576-578.

3. Paramonova M.P., Babkov D.A., Valuev-Elliston V.T., Ivanov A.V., Kochetkov S.N., Pannecouque C., Balzarini J., Novikov M.S. Synthesis and Anti-HIV-1 Activity of 1-[ω-(Phenoxy)alkyl- and -alkenyl]uracil Derivatives. Pharmaceutical Chemistry J. 2013, 47 (9), 459-463.3. Paramonova M.P., Babkov D.A., Valuev-Elliston V.T., Ivanov A.V., Kochetkov S.N., Pannecouque C., Balzarini J., Novikov M.S. Synthesis and Anti-HIV-1 Activity of 1-[ω-(Phenoxy)alkyl- and -alkenyl]uracil Derivatives. Pharmaceutical Chemistry J. 2013, 47(9), 459-463.

4. Paramonova M.P., Ozerov A.A., Chizhov A.O., Snoeck R., Andrei G., Khandazhinskaya A.L., Novikov M.S. Synthesis of uracil-coumarin conjugates as potential inhibitors of virus replication. Mendeleev Commun., 2019, 29 (6), 638-639.4. Paramonova M.P., Ozerov A.A., Chizhov A.O., Snoeck R., Andrei G., Khandazhinskaya A.L., Novikov M.S. Synthesis of uracil-coumarin conjugates as potential inhibitors of virus replication. Mendeleev Commun., 2019, 29 (6), 638-639.

5. Malik V., Singh P., Kumar S. Regioselective synthesis of 1-allyl- and 1-arylmethyl uracil and thymine derivatives. Tetrahedron, 2005, 61 (16), 4009-4014.5. Malik V., Singh P., Kumar S. Regioselective synthesis of 1-allyl- and 1-arylmethyl uracil and thymine derivatives. Tetrahedron, 2005, 61(16), 4009-4014.

6. Driouich, JS., Cochin, M., Lingas, G. et al. Favipiravir antiviral efficacy against SARS-CoV-2 in a hamster model. Nat Commun 12, 1735 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-21992-w.6. Driouich, J.S., Cochin, M., Lingas, G. et al. Favipiravir antiviral efficacy against SARS-CoV-2 in a hamster model. Nat Commun 12, 1735 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-21992-w.

7. Suzanne J. F. Kaptein, Sofie Jacobs, at al., Favipiravir at high doses has potent antiviral activity in SARS-CoV-2−infected hamsters, whereas hydroxychloroquine lacks activity. Proceedings of the National Academy of Sciences Oct 2020, 117 (43) 26955-26965; DOI: 10.1073/pnas.2014441117.7. Suzanne J. F. Kaptein, Sofie Jacobs, at al., Favipiravir at high doses has potent antiviral activity in SARS-CoV-2−infected hamsters, whereas hydroxychloroquine lacks activity. Proceedings of the National Academy of Sciences Oct 2020, 117 (43) 26955-26965; DOI: 10.1073/pnas.2014441117.

8. Williamson, B.N., Feldmann, F., Schwarz, B. et al. Clinical benefit of remdesivir in rhesus macaques infected with SARS-CoV-2. Nature 585, 273–276 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2423-5.8. Williamson, B.N., Feldmann, F., Schwarz, B. et al. Clinical benefit of remdesivir in rhesus macaques infected with SARS-CoV-2. Nature 585, 273–276 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2423-5.

9. Cox, R.M., Wolf, J.D. & Plemper, R.K. Therapeutically administered ribonucleoside analogue MK-4482/EIDD-2801 blocks SARS-CoV-2 transmission in ferrets. Nat Microbiol 6, 11–18 (2021). https://doi.org/10.1038/s41564-020-00835-2.9. Cox, R.M., Wolf, J.D. & Plemper, R.K. Therapeutically administered ribonucleoside analogue MK-4482/EIDD-2801 blocks SARS-CoV-2 transmission in ferrets. Nat Microbiol 6, 11–18 (2021). https://doi.org/10.1038/s41564-020-00835-2.

10. Goldberg E, Ben Zvi H, Sheena L, Sofer S, Krause I, Sklan EH, Shlomai A. A real-life setting evaluation of the effect of remdesivir on viral load in COVID-19 patients admitted to a large tertiary centre in Israel. Clin Microbiol Infect. 2021 Jun;27(6):917.e1-917.e4. doi: 10.1016/j.cmi.2021.02.029. Epub 2021 Mar 9. PMID: 33705849; PMCID: PMC7939997.10. Goldberg E, Ben Zvi H, Sheena L, Sofer S, Krause I, Sklan EH, Shlomai A. A real-life setting evaluation of the effect of remdesivir on viral load in COVID-19 patients admitted to a large tertiary center in israel. Clin Microbiol Infect. 2021 Jun;27(6):917.e1-917.e4. doi: 10.1016/j.cmi.2021.02.029. Epub 2021 Mar 9. PMID: 33705849; PMCID: PMC7939997.

11. Altaf, I., Nadeem, M.F., Hussain, N. et al. An in vitro antiviral activity of iodine complexes against SARS-CoV-2. Arch Microbiol 203, 4743–4749 (2021). https://doi.org/10.1007/S00203-021-02430-3.11. Altaf, I., Nadeem, M.F., Hussain, N. et al. An in vitro antiviral activity of iodine complexes against SARS-CoV-2. Arch Microbiol 203, 4743–4749 (2021). https://doi.org/10.1007/S00203-021-02430-3.

12. De Meyer S, Bojkova D, Cinatl J, Van Damme E, Buyck C, Van Loock M, Woodfall B, Ciesek S. Lack of antiviral activity of darunavir against SARS-CoV-2. Int J Infect Dis. 2020 Aug;97:7-10. doi: 10.1016/j.ijid.2020.05.085. Epub 2020 May 29. PMID: 32479865; PMCID: PMC7258847. https://doi.org/10.1016/j.ijid.2020.05.085.12. De Meyer S, Bojkova D, Cinatl J, Van Damme E, Buyck C, Van Loock M, Woodfall B, Ciesek S. Lack of antiviral activity of darunavir against SARS-CoV-2. Int J Infect Dis. 2020 Aug;97:7-10. doi: 10.1016/j.ijid.2020.05.085. Epub 2020 May 29. PMID: 32479865; PMCID: PMC7258847. https://doi.org/10.1016/j.ijid.2020.05.085.

13. Yuan, S., Yin, X., Meng, X. et al. Clofazimine broadly inhibits coronaviruses including SARS-CoV-2. Nature 593, 418–423 (2021). https://doi.org/10.1038/s41586-021-03431-4 https://doi.org/10.1038/s41586-021-03431-4.13. Yuan, S., Yin, X., Meng, X. et al. Clofazimine broadly inhibits coronaviruses including SARS-CoV-2. Nature 593, 418–423 (2021). https://doi.org/10.1038/s41586-021-03431-4 https://doi.org/10.1038/s41586-021-03431-4.

Claims

1. Соединение, представляющее собой N₁,N₃-дизамещённое производное урацила, отвечающее общей формуле I:1. A compound that is an N ₁ ,N ₃ -disubstituted derivative of uracil, corresponding to the general formula I:

или его фармацевтически приемлемая соль, где:or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein:

X - алкил или оксиалкил (С1-С12),X - alkyl or hydroxyalkyl (C1-C12),

Ar - замещенная ароматическая группа,Ar is a substituted aromatic group,

Ar - ароматическая группа,Ar - aromatic group,

Y - атом кислорода,Y is an oxygen atom,

R1 - карбоксил или галоген,R1 - carboxyl or halogen,

2. Соединение по п.1 или его фармацевтически приемлемая соль, где соединение выбрано из группы, включающей:2. The compound of claim 1, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein the compound is selected from the group consisting of:

4-[5-[3-[5-(4-фторфенокси)пентил]-2,6-диоксо-3,6-дигидропиримидин-1(2H)-ил]пентилокси] бензойную кислоту,4-[5-[3-[5-(4-fluorophenoxy)pentyl]-2,6-dioxo-3,6-dihydropyrimidin-1(2H)-yl]pentyloxy]benzoic acid,

4-[[5-[3-(антрацен-9-илметил)-2,6-диоксо-3,6-дигидропиримидин-1(2H)-ил]пентил]окси]бензойную кислоту,4-[[5-[3-(anthracen-9-ylmethyl)-2,6-dioxo-3,6-dihydropyrimidin-1(2H)-yl]pentyl]oxy]benzoic acid,

4-[4-[2,6-диоксо-3-(4-бромнафтил-1-метил)-3,6-дигидропиримидин-1(2H)-ил]бутокси]бензойную кислоту.4-[4-[2,6-dioxo-3-(4-bromonaphthyl-1-methyl)-3,6-dihydropyrimidin-1(2H)-yl]butoxy]benzoic acid.

3. Применение соединения по пп.1, 2 для ингибирования репликации SARS-CoV-2 у млекопитающего.3. Use of a compound according to claims 1, 2 for inhibiting the replication of SARS-CoV-2 in a mammal.

4. Фармацевтическая композиция для ингибирования репликации SARS-CoV-2 у млекопитающего, включающая эффективное количество соединения по пп.1, 2 или его фармацевтически приемлемой соли и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый наполнитель и/или носитель.4. Pharmaceutical composition for inhibiting SARS-CoV-2 replication in a mammal, comprising an effective amount of a compound according to claims 1, 2 or a pharmaceutically acceptable salt thereof and at least one pharmaceutically acceptable excipient and/or carrier.