RU2769521C1 - (2s,4s)-4-amino-n-(4-fluorophenyl)pyroglutamic acid exhibiting cerebroprotective, nootropic, and antithrombotic action - Google Patents

Abstract

FIELD: chemistry.

SUBSTANCE: invention relates to a new derivative of pyroglutamic acid - (2S,4S)-4-amino-N-(4-fluorophenyl)pyroglutamic acid by the formula 1.

EFFECT: production of a new compound applicable as a cerebral protector with nootropic and antithrombotic activity.

1 cl, 6 tbl, 7 ex

Description

Изобретение относится к области медицины, производному пироглутаминовой кислоты, а именно, (2S,4S)-4-амино-N-(4-фторфенил)пироглутаминовой кислоте формулы 1 его способу получения и применения в качестве церебропротектора, которое может быть использовано для лечения последствий нарушений мозгового кровообращения и профилактики вторичных тромбозов. The invention relates to the field of medicine, a derivative of pyroglutamic acid, namely, (2S,4S)-4-amino-N-(4-fluorophenyl)pyroglutamic acid of formula 1, its method of preparation and use as a cerebroprotector, which can be used to treat the consequences disorders of cerebral circulation and prevention of secondary thrombosis.

Острые и хронические нарушения мозгового кровообращения (НМК) продолжают оставаться ведущей причиной инвалидизации и потери трудоспособности населения. Нарушения мелкой моторики, координации, памяти и обучаемости, развитие тревожно-депрессивных расстройств при нарушениях мозгового кровообращения снижают качество жизни и эффективность лечения пациента, являются целями фармакотерапии [Бойцов С.А., Шальнова С.А., Деев А.Д. Эпидемиологическая ситуация как фактор, определяющий стратегию действий по снижению смертности в Российской Федерации. Терапевтический архив. 2020;92(1):4-9]. Acute and chronic disorders of cerebral circulation (ACI) continue to be the leading cause of disability and disability of the population. Violations of fine motor skills, coordination, memory and learning, the development of anxiety-depressive disorders in cerebrovascular accidents reduce the quality of life and the effectiveness of the treatment of the patient, are the goals of pharmacotherapy [Boitsov S.A., Shalnova S.A., Deev A.D. The epidemiological situation as a factor determining the strategy of action to reduce mortality in the Russian Federation. Therapeutic archive. 2020;92(1):4-9].

Известно значительное число церебропротекторных средств и способов терапии и профилактики поражений головного мозга [Клинические рекомендации по ведению больных с ишемическим инсультом и транзиторными ишемическими атаками. Москва, 2017. 92 c.], в том числе препаратами с нейропротекторным действием, эффективность которых не всегда бывает достаточной [Путилина М.В. Комбинированное применение нейропротекторов в терапии цереброваскулярных заболеваний. Журнал неврологии и психиатрии им. C.C. Корсакова. 2016;116(11):58-63]. Поэтому имеется острая необходимость в разработке новых церебропротекторных средств, оказывающих нейропротекторное действие и положительно влияющих на реологические свойства крови в условиях нарушения мозгового кровообращения. There are a significant number of cerebroprotective agents and methods for the treatment and prevention of brain damage [Clinical guidelines for the management of patients with ischemic stroke and transient ischemic attacks. Moscow, 2017. 92 p.], including drugs with a neuroprotective effect, the effectiveness of which is not always sufficient [Putilina M.V. Combined use of neuroprotectors in the treatment of cerebrovascular diseases. Journal of Neurology and Psychiatry. C.C. Korsakov. 2016;116(11):58-63]. Therefore, there is an urgent need to develop new cerebroprotective agents that have a neuroprotective effect and positively affect the rheological properties of blood in conditions of cerebrovascular accident.

Среди производных пироглутаминовой кислоты известны препараты с противосудорожной, анксиолитической и ноотропной активностью (Таблица 1). При этом среди ближайших структурных аналогов (2S,4S)-4-амино-N-(4-фторфенил)пироглутаминовой кислоты о церебропротекторной активности в условиях нарушения мозгового кровообращения сведения отсутствуют.Among the derivatives of pyroglutamic acid, drugs with anticonvulsant, anxiolytic and nootropic activity are known (Table 1). At the same time, among the closest structural analogues of (2S,4S)-4-amino-N-(4-fluorophenyl)pyroglutamic acid, there is no information on cerebroprotective activity in conditions of cerebrovascular accident.

Наиболее близким аналогом (прототипом) нашего технического решения является соединение фасорацетам, обладающее ноотропной активностью [Malykh A.G., Sadaie M.R. Piracetam and piracetam-like drugs: from basic science to novel clinical applications to CNS disorders. Drugs. 2010;70(3):287-312].The closest analogue (prototype) of our technical solution is a fasoracetam compound with nootropic activity [Malykh A.G., Sadaie M.R. Piracetam and piracetam-like drugs: from basic science to novel clinical applications to CNS disorders. drugs. 2010;70(3):287-312].

Аналогом исследуемого производного пироглутаминовой кислоты по фармакотерапевтическому действию является препарат цитиколин, который является компонентом фосфолипидов мембран клеток, а также предшественником ацетилхолина и применяется в острый и последующие периоды нарушения мозгового кровообращения с целью защиты нервной ткани и ускорения восстановления когнитивных функций [Сергеев Д.В., Домашенко М.А., Пирадов М.А. Цитиколин при ишемическом инсульте: от острого периода к реабилитации. Медицинский совет. 2015. № 18. С. 6-10].An analogue of the studied derivative of pyroglutamic acid in terms of pharmacotherapeutic action is the drug citicoline, which is a component of phospholipids of cell membranes, as well as a precursor of acetylcholine and is used in acute and subsequent periods of cerebrovascular accident in order to protect the nervous tissue and accelerate the recovery of cognitive functions [Sergeev D.V., Domashenko M.A., Piradov M.A. Citicoline in ischemic stroke: from the acute period to rehabilitation. Medical advice. 2015. No. 18. S. 6-10].

Аналогом исследуемого соединения также является антиагрегантный препарат ацетилсалициловая кислота, который рекомендован для профилактики вторичных тромбозов в острый и последующие периоды инфаркта и инсульта [Клинические рекомендации по ведению больных с ишемическим инсультом и транзиторными ишемическими атаками. Москва, 2017. 92 c.].An analogue of the test compound is also the antiplatelet drug acetylsalicylic acid, which is recommended for the prevention of secondary thrombosis in the acute and subsequent periods of myocardial infarction and stroke [Clinical guidelines for the management of patients with ischemic stroke and transient ischemic attacks. Moscow, 2017. 92 p.].

Задача, которую решает предлагаемое изобретение, заключается в разработке нового соединения с высокой церебропротекторной активностью, которое реализуется за счет наличия у патентуемого средства ноотропной и антитромботической активности, что позволит расширить номенклатуру эффективных средств для лечения последствий нарушения мозгового кровообращения и профилактики повторных тромбозов.The problem that the present invention solves is to develop a new compound with high cerebroprotective activity, which is realized due to the presence of nootropic and antithrombotic activity in the patented agent, which will expand the range of effective agents for treating the consequences of cerebrovascular accident and preventing recurrent thrombosis.

Техническим результатом данного изобретения является создание нового химического соединения – (2S,4S)-4-амино-N-(4-фторфенил)пироглутаминовой кислоты (1):The technical result of this invention is the creation of a new chemical compound - (2S,4S)-4-amino-N-(4-fluorophenyl)pyroglutamic acid (1):

Соединение 1, его физико-химические характеристики, биологическая активность, а также способ его получения в литературе не описаны.Compound 1, its physicochemical characteristics, biological activity, as well as the method of its preparation are not described in the literature.

Соединение формулы (1) может быть получено в две стадии из доступного [Krasnov V.P., Bukrina I.M., Zhdanova E.A., Kodess M.I., Korolyova M.A. Synthesis, 1994, 961–964] диметилового эфира (2S,4RS)-4-бром-N-фталоилглутаминовой кислоты (2). The compound of formula (1) can be obtained in two stages from the available [Krasnov V.P., Bukrina I.M., Zhdanova E.A., Kodess M.I., Korolyova M.A. Synthesis, 1994, 961–964] of (2S,4RS)-4-bromo-N-phthaloylglutamic acid dimethyl ester (2).

Соединение 2 вводят в реакцию с 4-фторанилином в ацетонитриле или этаноле. В результате выделяют диметиловый эфир (2S,4S)-4-(4-фторфенил)-N-фталоилглутаминовой кислоты (3), кислотный гидролиз которого в смеси соляной и уксусной кислот приводит к целевому соединению 1.Compound 2 is reacted with 4-fluoroaniline in acetonitrile or ethanol. As a result, (2S,4S)-4-(4-fluorophenyl)-N-phthaloylglutamic acid dimethyl ester (3) is isolated, the acid hydrolysis of which in a mixture of hydrochloric and acetic acids leads to the target compound 1.

Характеристики нового соединения 1 приведены в примерах конкретного выполнения.The characteristics of the new connection 1 are shown in the examples of specific execution.

Структуру полученного соединения подтверждают методами спектроскопии ЯМР ¹H, ¹³С, ¹⁹F и элементного анализа. Индивидуальность соединения подтверждают методами ТСХ и ВЭЖХ.The structure of the obtained compound is confirmed by ¹ H, ¹³ C, ¹⁹ F NMR spectroscopy and elemental analysis. The identity of the compound is confirmed by TLC and HPLC.

Температуры плавления соединения 1 определены на приборе Stuart SMP3 (Barloworld Scientific).Melting points of compound 1 were determined on a Stuart SMP3 instrument (Barloworld Scientific).

Элементный анализ выполнен на автоматическом CHNS-O анализаторе РE 2400 серия II (Perkin Elmer).Elemental analysis was performed on an automatic CHNS-O analyzer RE 2400 series II (Perkin Elmer).

Удельное вращение [(град·мл)/(г·дм)] определяли на поляриметре Perkin Elmer Model 341, концентрация раствора в г/100 мл.Specific rotation [(deg ml)/(g dm)] was determined on a Perkin Elmer Model 341 polarimeter, solution concentration in g/100 ml.

Спектры ЯМР ¹H и ¹³С зарегистрированы на приборе Bruker Avance 500 (500 МГц для ¹Н, 126 МГц для ¹³С) при 24 °С в CDCl₃ с Si(СН₃)₄ в качестве внутреннего стандарта (для соединения 3) и в D₂O c триметилсилилпропансульфонатом натрия (DSS) в качестве внутреннего стандарта (для соединения 1). Спектры ¹⁹F зарегистрированы на приборе Bruker Avance 500 (470 МГц) при 24 °С в CDCl₃ с гексафторбензолом в качестве внутреннего стандарта (для соединения 3) и в D₂O с гексафторбензолом в качестве внешнего стандарта (для соединения 1). Химические сдвиги (δ) приведены в миллионных долях (м.д.), а константы спин-спинового взаимодействия (J) в герцах (Гц).1H and ^13C NMR spectra were recorded ^{on a Bruker Avance 500 instrument (500 MHz for 1 H} , 126 MHz for ¹³ C) at 24°C in CDCl ₃ with Si(CH ₃ ) ₄ as internal standard (for compound 3) and in D ₂ O with sodium trimethylsilylpropanesulfonate (DSS) as an internal standard (for compound 1). ¹⁹ F spectra were recorded on a Bruker Avance 500 instrument (470 MHz) at 24°C in CDCl ₃ with hexafluorobenzene as an internal standard (for compound 3) and in D ₂ O with hexafluorobenzene as an external standard (for compound 1). Chemical shifts (δ) are given in parts per million (ppm) and spin-spin coupling constants (J) in hertz (Hz).

Аналитическая ВЭЖХ выполнена на жидкостном хроматографе «Knauer Smartline-1100», колонка Reprosil (250×4,6 мм), детектирование при длинах волн 220 и 230 нм, элюирование системой гексан-изопропиловый спирт, 80 : 1. Скорость потока 1,0 мл/мин.Analytical HPLC was performed on a Knauer Smartline-1100 liquid chromatograph, Reprosil column (250 × 4.6 mm), detection at wavelengths of 220 and 230 nm, elution with a hexane-isopropyl alcohol system, 80 : 1. Flow rate 1.0 ml /min

Для ТСХ использованы пластинки Sorbfil (OOO «Имид», Россия). Проявление в УФ свете.Sorbfil plates (OOO Imid, Russia) were used for TLC. Developing in UV light.

Исследования in vitro и in vivo были выполнены с использованием беспородных крыс-самцов (Филиал «Столбовая» ГУ НЦБМТ РАМН, Московская обл.), которых содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и корму (ГОСТ Р 51849-2001). Для оценки фармакологических свойств, демонстрирующих церебропротекторный потенциал, а также непосредственно церебропротекторные свойства (2S,4S)-4-амино-N-(4-фторфенил)пироглутаминовой кислоты формулы 1 были использованы следующие методы [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств: под ред. А.Н. Миронова. Ч.1. М.: Гриф и К,2012.944 с.]:In vitro and in vivo studies were performed using outbred male rats (Stolbovaya branch of the State Research Center for Biotechnology and Biotechnology of the Russian Academy of Medical Sciences, Moscow oblast), which were kept under standard vivarium conditions with free access to water and food (GOST R 51849-2001). To evaluate the pharmacological properties that demonstrate the cerebroprotective potential, as well as directly the cerebroprotective properties of (2S,4S)-4-amino-N-(4-fluorophenyl)pyroglutamic acid of formula 1, the following methods were used [Guidelines for conducting preclinical studies of drugs: ed. . A.N. Mironov. Part 1. M.: Grif and K, 2012.944 p.]:

I. Оценка антиагрегантной активности in vitro.I. Assessment of antiplatelet activity in vitro.

1. Оценка влияния исследуемых соединений на степень АДФ-индуцируемой агрегации тромбоцитов in vitro.1. Evaluation of the influence of the studied compounds on the degree of ADP-induced platelet aggregation in vitro.

II. Оценка антитромботической активности in vivo при курсовом введении.II. Evaluation of antithrombotic activity in vivo during course administration.

1. Оценка антитромботической активности на модели артериального тромбоза.1. Evaluation of antithrombotic activity in the model of arterial thrombosis.

2. Оценка антитромботической активности на модели тромбоза глубоких вен.2. Evaluation of antithrombotic activity on the model of deep vein thrombosis.

III. Оценка психотропной активности, при однократном введении интактным животным.III. Evaluation of psychotropic activity, with a single injection to intact animals.

1. Оценка влияния на двигательную и исследовательскую активность в тесте Открытое поле.1. Evaluation of the impact on motor and exploratory activity in the Open Field test.

2. Оценка противотревожной активности в тесте Приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ).2. Evaluation of anti-anxiety activity in the Elevated Plus Maze (EPM) test.

3. Оценка ноотропной активности в тесте «экстраполяционного избавления» (ТЭИ).3. Evaluation of nootropic activity in the test of "extrapolation deliverance" (ETI).

IV. Оценка церебропротекторной активности при лечебном курсовом введении соединения 1 с экспериментальным нарушением мозгового кровообращения (НМК).IV. Evaluation of cerebroprotective activity during therapeutic course administration of compound 1 with experimental cerebrovascular accident (ICD).

1. В тесте Открытое поле: оценка двигательной и исследовательской активности у животных с экспериментальным НМК.1. In the Open Field test: assessment of motor and exploratory activity in animals with experimental NMC.

2. В адгезивном тесте: оценка сенсорно-моторной функции.2. In the adhesive test: assessment of sensory-motor function.

3. В тесте Ротарод: оценка координации движений.3. In the Rotarod test: assessment of motor coordination.

4. В тесте распознавание нового объекта (РНО) и тесте «экстраполяционного избавления» (ТЭИ): оценка когнитивной функции.4. In the test of recognition of a new object (NOR) and the test of "extrapolation escape" (ETI): assessment of cognitive function.

V. У животных с экспериментальным НМК определяли степень АДФ-индуцируемой агрегации тромбоцитов in vitro.V. In animals with experimental NMC, the degree of ADP-induced platelet aggregation was determined in vitro.

VI. Изучение острой токсичности исследуемого соединения.VI. Study of the acute toxicity of the test compound.

Примеры конкретного выполненияSpecific Implementation Examples

Пример 1. Синтез (2S,4S)-4-амино-N-(4-фторфенил)пироглутаминовой кислоты (1)Example 1 Synthesis of (2S,4S)-4-amino-N-(4-fluorophenyl)pyroglutamic acid (1)

Раствор 11,08 г (28,84 ммоль) диметилового эфира (2S,4RS)-4-бром-N-фталоилглутаминовой кислоты (2) и 8,2 мл (86,52 ммоль, 3,0 экв.) 4-фторанилина кипятят в 65 мл ацетонитрила в течение 24 часов. После охлаждения до комнатной температуры отфильтровывают осадок гидробромида амина, фильтрат упаривают, остаток растворяют в хлороформе (250 мл), промывают 1 М HCl (3 раза по 80 мл) и водой (2 раза по 80 мл). Органический слой сушат над Na₂SO₄, упаривают, получают диметиловый эфир 4-(4-фторфенил)-N-фталоилглутаминовой кислоты (11,58 г, 97%) в виде смеси (2S,4S)- и (2S,4R)-изомеров в соотношении 3 : 1. ВЭЖХ: для (2S,4S)-изомера t_R = 15,7 мин, для (2S,4R)-изомера t_R = 14,1 мин.A solution of 11.08 g (28.84 mmol) of (2S,4RS)-4-bromo-N-phthaloylglutamic acid dimethyl ester (2) and 8.2 ml (86.52 mmol, 3.0 eq.) of 4-fluoroaniline boiled in 65 ml of acetonitrile for 24 hours. After cooling to room temperature, the precipitate of amine hydrobromide is filtered off, the filtrate is evaporated, the residue is dissolved in chloroform (250 ml), washed with 1 M HCl (3 times 80 ml) and water (2 times 80 ml). The organic layer was dried over Na ₂ SO ₄ , evaporated to give 4-(4-fluorophenyl)-N-phthaloylglutamic acid dimethyl ester (11.58 g, 97%) as a mixture of (2S,4S)- and (2S,4R) -isomers in the ratio 3 : 1. HPLC: for (2S,4S)-isomer t _R = 15.7 min, for (2S,4R)-isomer t _R = 14.1 min.

Данную смесь кристаллизуют из 95% этилового спирта три раза. Получают 6,62 г (55% в расчёте на соединение 2) диметилового эфира (2S,4S)-4-(4-фторфенил)-N-фталоилглутаминовой кислоты (3) в виде светло-жёлтых кристаллов. Т пл. = 135–136 °С. [α]_D ²⁰ = –35,2 (c 1; CHCl₃). Найдено: С 60,94; Н 4,68; N 6,60; F 4,48. Вычислено для С₂₁Н₁₉N₂О₆F (М = 414,39): С 60,87; Н 4,62; N 6,76; F 4,58. Спектр ЯМР ¹Н (500 МГц, CDCl₃): 2,67 (д.д.д, 1 Н, C³H_B Glu, J = 14,5; 9,2; 4,2 Гц); 2,76 (д.д.д, 1 Н, C³H_A, J = 14,5; 9,6; 4,2 Гц); 3,67 (c, 3 Н, CH₃О); 3,74 (c, 3 Н, CH₃О); 3,96 (уш. д.д, 1 Н, C⁴Н, J = 9,1; 4,3 Гц); 4,03 (уш. с, 1 Н, NH); 5,24 (д.д, 1 Н, С²H, J = 9,6; 4,1 Гц); 6,53 (м, 2 Н, C^2’H, C^6’H); 6,80 (м, 2 Н, C^3’H, C^5’H); 7,76 (м, 2 Н, Phth); 7,87 (м, 2 Н, Phth). Спектр ЯМР ¹³С (126 МГц, CDCl₃): 32,24 (C³); 48,87 (C²); 52,40 (С⁵О₂ СН₃); 53,03 (С¹О₂ СН₃); 55,40 (C⁴); 115,68 (д, C^2’, C^6’, J = 7,6 Гц); 115,69 (д, C^3’, C^5’, J = 22,4 Гц); 123,65 (C^3’’, C^6’’); 131,69 (C^2а’’, C^6а’’); 134,32 (C^4’’, C^5’’); 142,56 (д, C^1’, J = 2,0 Гц); 156,70 (д, C^4’, J = 237,0 Гц); 167,38 (C^2’’, C^7’’); 169,38 (С ¹ О₂СН₃); 173,47 (С ⁵ О₂СН₃). Спектр ЯМР ¹⁹F (470 МГц, CDCl₃): 35,97 (т.т, С^4’F, J = 8,6; 4,3 Гц). ВЭЖХ: t_R = 15,7 мин.This mixture is crystallized from 95% ethanol three times. 6.62 g (55% based on compound 2) of (2S,4S)-4-(4-fluorophenyl)-N-phthaloylglutamic acid dimethyl ester (3) are obtained in the form of light yellow crystals. T pl. = 135–136 °С. [α] _D ²⁰ \u003d -35.2 (c 1; CHCl ₃ ). Found: C 60.94; H 4.68; N 6.60; F4.48. Calculated for C ₂₁ H ₁₉ N ₂ O ₆ F (M = 414.39): C 60.87; H 4.62; N 6.76; F4.58. ¹ H NMR spectrum (500 MHz, CDCl ₃ ): 2.67 (ddd, 1 H, C ³ H _B Glu, J = 14.5; 9.2; 4.2 Hz); 2.76 (ddd, 1 H, C ³ H _A , J = 14.5; 9.6; 4.2 Hz); 3.67 (s, 3 H, CH ₃ O); 3.74 (s, 3 H, CH ₃ O); 3.96 (br. dd, 1 H, C ⁴ H, J = 9.1; 4.3 Hz); 4.03 (br. s, 1 H, NH); 5.24 (dd, 1 H, C ² H, J = 9.6; 4.1 Hz); 6.53 (m, 2 H, C ^2' H, C ^6' H); 6.80 (m, 2H, C ^3' H, C ^5' H); 7.76 (m, 2 H, Phth); 7.87 (m, 2 H, Phth). ¹³ C NMR spectrum (126 MHz, CDCl ₃ ): 32.24 (C ³ ); ^48.87 (C2); 52.40 ( C ⁵ O ₂ CH ₃ ); 53.03 ( C ¹ O ₂ CH ₃ ); 55.40 ( ^C4 ); 115.68 (d, C ^2' , C ^6' , J = 7.6 Hz); 115.69 (d, C ^3' , C ^5' , J = 22.4 Hz); 123.65 (C ^3'' , C ^6'' ); 131.69 (C ^2a'' , C ^6a'' ); 134.32 (C ^4'' , C ^5'' ); 142.56 (d, C ^1' , J = 2.0 Hz); 156.70 (d, C ^4' , J = 237.0 Hz); 167.38 (C2 ^'' , C7 ^'' ); 169.38 ( C ¹ O ₂ CH ₃ ); 173.47 ( C ⁵ O ₂ CH ₃ ). ¹⁹ F NMR spectrum (470 MHz, CDCl ₃ ): 35.97 (t.t., C ^4' F, J = 8.6; 4.3 Hz). HPLC: t _R = 15.7 min.

К 6,62 г (15,97 ммоль) диметилового эфира (2S,4S)-4-(4-фторфенил)-N-фталоилглутаминовой кислоты (3) приливают 30 мл конц. водн. HCl и 30 мл ледяной уксусной кислоты. Кипятят в течение 12 часов, упаривают досуха, остаток обрабатывают 20% HCl при перемешивании (30 мл), после выдерживания при 0…+10 °С в течение ночи отфильтровывают осадок фталевой кислоты, фильтрат упаривают досуха, остаток высушивают в вакууме, растворяют в 95% водном этиловом спирте (20 мл) и добавляют пиридин (1,4 мл). После охлаждения в холодильнике (0…+10 °С) в течение ночи отфильтровывают осадок, промывают на фильтре 95% водным этиловым спиртом, сушат в вакууме при 120 °С в течение 3 часов. Получают 2,49 г (65% в расчёте на соединение 3) соединения 1 в виде бесцветного твердого вещества. Т пл = 233–236 °С (с разл.). [α]_D ²⁰ = –42,4 (c 1; H₂O). Найдено: С 55,41; Н 4,61; N 11,71; F 7,77. Вычислено для С₁₁Н₁₁N₂О₃F (М = 238,22): С 55,46; Н 4,65; N 11,76; F 7,98. Спектр ЯМР ¹Н (500 МГц, D₂O): 2,15 (д.д.д, 1 Н, C³H_B, J = 13,2; 9,3; 8,4 Гц); 3,08 (д.д.д, 1 Н, C³H_A, J = 13,2; 9,0; 7,2 Гц); 4,37 (т, 1 Н, C⁴H, J = 9,3 Гц); 4,77 (т, 1 Н, C²H, J = 7,4 Гц); 7,22 (м, 2 Н, C^3’H, C^5’H); 7,42 (м, 2 Н, C^2’H, C^6’H). Спектр ЯМР ¹³С (126 МГц, D₂O): 30,79 (C³); 53,46 (C⁴); 64,57 (C²); 118,81 (д, C^3’, C^5’, J = 23,0 Гц); 127,78 (д, C^2’, C^6’, J = 8,8 Гц); 135,33 (д, C^1’, J = 2,9 Гц); 163,66 (д, C^4’, J = 244,5 Гц); 172,78 (C⁵); 179,04 (CО₂Н). Спектр ЯМР ¹⁹F (470 МГц, D₂O): 47,82 (т.т, С^4’F, J = 8,7; 4,8 Гц).30 ml of conc. aq. HCl and 30 ml of glacial acetic acid. Boil for 12 hours, evaporate to dryness, the residue is treated with 20% HCl with stirring (30 ml), after keeping at 0 ... + 10 ° C overnight, the precipitate of phthalic acid is filtered off, the filtrate is evaporated to dryness, the residue is dried in a vacuum, dissolved in 95 % aqueous ethyl alcohol (20 ml) and add pyridine (1.4 ml). After cooling in a refrigerator (0…+10 °C) overnight, the precipitate is filtered off, washed on the filter with 95% aqueous ethyl alcohol, and dried in vacuum at 120 °C for 3 hours. 2.49 g (65% based on compound 3) of compound 1 are obtained in the form of a colorless solid. Тmelt = 233–236 °С (decomp.). [α] _D ²⁰ \u003d -42.4 (c 1; H ₂ O). Found: C 55.41; H 4.61; N 11.71; F 7.77. Calculated for C ₁₁ H ₁₁ N ₂ O ₃ F (M = 238.22): C 55.46; H 4.65; N 11.76; F 7.98. ¹ H NMR spectrum (500 MHz, D ₂ O): 2.15 (ddd, 1 H, C ³ H _B , J = 13.2; 9.3; 8.4 Hz); 3.08 (ddd, 1 H, C ³ H _A , J = 13.2; 9.0; 7.2 Hz); 4.37 (t, 1 H, C ⁴ H, J = 9.3 Hz); 4.77 (t, 1 H, C ² H, J = 7.4 Hz); 7.22 (m, 2H, C ^3' H, C ^5' H); 7.42 (m, 2 H, C ^2' H, C ^6' H). ¹³ C NMR spectrum (126 MHz, D ₂ O): 30.79 (C ³ ); ^53.46 (C4); ^64.57 (C2); 118.81 (d, C ^3' , C ^5' , J = 23.0 Hz); 127.78 (d, C ^2' , C ^6' , J = 8.8 Hz); 135.33 (d, C ^1' , J = 2.9 Hz); 163.66 (d, C ^4' , J = 244.5 Hz); ^172.78 (C5); 179.04 (CO ₂ H). ¹⁹ F NMR spectrum (470 MHz, D ₂ O): 47.82 (t.t., C ^4' F, J = 8.7; 4.8 Hz).

Соединение 1 из 70% водного этилового спирта кристаллизуется в виде дигидрата. Найдено: С 48,49; Н 5,51; N 10,11. Вычислено для С₁₁Н₁₁N₂О₃F × 2 H₂O (М = 274,25): С 48,18; Н 5,51; N 10,21. Спектры ЯМР ¹Н (500 МГц, D₂O) и ¹⁹F (470 МГц, D₂O) идентичны спектрам безводной формы.Compound 1 from 70% aqueous ethyl alcohol crystallizes as a dihydrate. Found: C 48.49; H 5.51; N 10.11. Calculated for C ₁₁ H ₁₁ N ₂ O ₃ F × 2 H ₂ O (M = 274.25): C 48.18; H 5.51; N 10.21. The NMR spectra ^{of 1} H (500 MHz, D ₂ O) and ¹⁹ F (470 MHz, D ₂ O) are identical to the spectra of the anhydrous form.

Пример 2. Влияние (2S,4S)-4-амино-N-(4-фторфенил)пироглутаминовой кислоты (1) на степень АДФ-индуцируемой агрегации тромбоцитов in vitroExample 2. Effect of (2S,4S)-4-amino-N-(4-fluorophenyl)pyroglutamic acid (1) on the degree of ADP-induced platelet aggregation in vitro

Антиагрегантную активность оценивали по степени АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов после инкубации 270 мкл плазмы (богатой тромбоцитами) с изучаемым соединением (в объеме 30 мкл), в диапазоне его молярных конечных концентраций 1×10⁻⁵ М – 1×10⁻⁸ М, а также с препаратом сравнения (ацетилсалициловая кислота, АСК) в аналогичных концентрациях. Плазму получали из крови интактных крыс. В качестве контроля использовали дистиллированную воду. Препаратом сравнения выступала ацетилсалициловая кислота (АСК), как антиагрегантное средство, обладающее наиболее оптимальным соотношением эффективности и безопасности, и широко применяемое в клинической практике. Соединение 1 снижало степень агрегации тромбоцитов в концентрации 10⁻⁷ М на 30%, 10⁻⁶ М на 29,8% и 10⁻⁵ М на 37,8% относительно контроля, что сопоставимо с показателями препарата сравнения и даже их немного превышает (Таблица 2).Antiplatelet activity was assessed by the degree of ADP-induced platelet aggregation after incubation of 270 µl of plasma (platelet-rich) with the studied compound (in a volume of 30 µl), in the range of its molar final concentrations 1 × 10 ⁻⁵ M – 1 × 10 ⁻⁸ M, and also with the reference drug (acetylsalicylic acid, ASA) in similar concentrations. Plasma was obtained from the blood of intact rats. Distilled water was used as a control. The reference drug was acetylsalicylic acid (ASA), as an antiplatelet agent with the most optimal ratio of efficacy and safety, and widely used in clinical practice. Compound 1 reduced the degree of platelet aggregation at a concentration of 10 ⁻⁷ M by 30%, 10 ⁻⁶ M by 29.8% and 10 ⁻⁵ M by 37.8% relative to the control, which is comparable with the performance of the reference drug and even slightly exceeds them ( Table 2).

Пример 3. Оценка антитромботической активности (2S,4S)-4-амино-N-(4-фторфенил)пироглутаминовой кислоты (1) in vivo на модели артериального тромбоза и тромбоза глубоких венExample 3 Evaluation of the antithrombotic activity of (2S,4S)-4-amino-N-(4-fluorophenyl)pyroglutamic acid (1) in vivo in an arterial and deep vein thrombosis model

Антитромботическую активность производного пироглутаминовой кислоты оценивали на моделях артериального (аппликация хлорида железа (III) на адвентицию сонной артерии) и венозного (перевязкой нижней полой вены) тромбозов, при курсовом профилактическом (3 дня, 1 раз в сутки, последнее введение осуществляли за 60 минут до моделирования тромбоза) пероральном введении в дозе 27 мг/кг.The antithrombotic activity of a pyroglutamic acid derivative was evaluated on models of arterial (application of iron (III) chloride on the adventitia of the carotid artery) and venous (ligation of the inferior vena cava) thrombosis, with a prophylactic course (3 days, 1 time per day, the last injection was carried out 60 minutes before modeling of thrombosis) oral administration at a dose of 27 mg/kg.

В условиях формирования артериального тромба в сонной артерии при аппликации FeCl₃ было выявлено, что исследуемое производное пироглутаминовой кислоты 1 и препарат сравнения ацетилсалициловая кислота вызывали значительное пролонгирование формирования тромба (Таблица 3). При оценке массы венозного тромба через 24 часа, после перевязки нижней полой вены (выше слияния бедренных вен) было отмечено, что при предварительном введении соединения 1, а также препарата сравнения при перевязке нижней полой вены масса извлекаемого из сосуда тромба была меньше, чем в контрольной группе. Данные результаты полностью согласуются с полученными на предыдущем этапе и указывают на наличие антиагрегантной и антитромботической активности патентуемого соединения 1.Under the conditions of formation of an arterial thrombus in the carotid artery with the application of FeCl ₃ , it was found that the studied derivative of pyroglutamic acid 1 and the reference drug acetylsalicylic acid caused a significant prolongation of the formation of a thrombus (Table 3). When assessing the mass of the venous thrombus 24 hours after ligation of the inferior vena cava (above the confluence of the femoral veins), it was noted that with the preliminary administration of compound 1, as well as the reference drug, when ligating the inferior vena cava, the mass of the thrombus extracted from the vessel was less than in the control group. These results are fully consistent with those obtained at the previous stage and indicate the presence of antiplatelet and antithrombotic activity of the patented compound 1.

Пример 4. Оценка психотропной активности (2S,4S)-4-амино-N-(4-фторфенил)пироглутаминовой кислоты (1), при однократном введении интактным животнымExample 4. Evaluation of the psychotropic activity of (2S,4S)-4-amino-N-(4-fluorophenyl)pyroglutamic acid (1), with a single injection to intact animals

Влияние соединения 1 на психоэмоциональное состояние интактных животных (двигательную и ориентировочно-исследовательскую активность) оценивали в тестах Открытое поле (ОП), на уровень тревоги в тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ) и на сохранность памятного следа в «Тесте экстраполяционного избавления» (ТЭИ), после его однократного перорального введения в дозе 27 мг/кг.The effect of compound 1 on the psycho-emotional state of intact animals (motor and orienting-exploratory activity) was assessed in the Open Field (OP) tests, on the level of anxiety in the Elevated Plus Maze (EPM) test, and on the preservation of the memory trace in the Extrapolation Exemption Test ( TEI), after its single oral administration at a dose of 27 mg/kg.

Влияние на поведенческую активностьImpact on behavioral activity

В тесте «Открытое поле» двигательная активность животных (количество пройденных секторов), которым вводили патентуемое соединение 1, значимо не отличалась от регистрируемой у животных контрольной группы, но их показатели ориентировочно-исследовательской активности (суммарное количество стоек и обследований отверстий) были выше, чем у контрольных животных (Таблица 4).In the "Open field" test, the motor activity of animals (the number of sectors passed through), which were injected with patented compound 1, did not significantly differ from that recorded in animals of the control group, but their indicators of orienting-exploratory activity (total number of racks and examinations of holes) were higher than in control animals (Table 4).

Противотревожное действиеAnti-anxiety action

Тест приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ) используется для изучения поведения грызунов в условиях переменной стрессогенности (при свободном выборе комфортных условий), позволяет оценить уровень тревожности животного и применяется для выявления соединений с анксиолитической активностью. Животные, которым вводили соединение 1, более чем в 3 раза дольше пребывали в открытых рукавах установки в сравнении с контрольной группой (Таблица 4), что свидетельствует о снижении уровня тревоги и подавлении чувства страха. The elevated plus maze (EPM) test is used to study the behavior of rodents under conditions of variable stress (with a free choice of comfortable conditions), allows you to assess the level of anxiety of the animal and is used to identify compounds with anxiolytic activity. Animals treated with compound 1 stayed more than 3 times longer in the open sleeves of the device compared to the control group (Table 4), which indicates a decrease in the level of anxiety and the suppression of fear.

Ноотропная активностьNootropic activity

Результаты теста экстраполяционного избавления (ТЭИ) свидетельствуют о положительном влиянии соединения 1 на формирование и сохранение памятного следа. Животные, которым вводили патентуемое соединение 1, быстрее справлялись с решением экстраполяционной задачи и избавлялись от влияния аверсивной среды (на уровне препарат сравнения фенибут). Под действием соединения 1 латентный период подныривания сокращался на 69% относительно контрольной группы животных (Таблица 4), что позволяет предположить наличие ноотропной активности соединения 1. The results of the extrapolation escape test (ETI) indicate a positive effect of compound 1 on the formation and preservation of a memory trace. Animals that were injected with the patented compound 1 coped with the solution of the extrapolation problem faster and got rid of the influence of the aversive environment (at the level of the reference drug phenibut). Under the influence of compound 1, the latent period of diving was reduced by 69% relative to the control group of animals (Table 4), which suggests the presence of nootropic activity of compound 1.

Полученные результаты показывают наличие не только антитромботического, но и выраженного противотревожного и ноотропного действия у соединения 1. Можно предположить, что вещество с такими свойствами может оказаться эффективным при нарушении мозгового кровообращения, следствием которого часто являются когнитивные и тревожные расстройства.The obtained results show the presence of not only antithrombotic, but also a pronounced antianxiety and nootropic action in compound 1. It can be assumed that a substance with such properties can be effective in cerebrovascular accident, which often results in cognitive and anxiety disorders.

Пример 5. Оценка церебропротекторной активности (2S,4S)-4-амино-N-(4-фторфенил)пироглутаминовой кислоты (1) при лечебном курсовом введении животным с нарушением мозгового кровообращенияExample 5. Evaluation of the cerebroprotective activity of (2S,4S)-4-amino-N-(4-fluorophenyl)pyroglutamic acid (1) during therapeutic course administration to animals with impaired cerebral circulation

Нарушение мозгового кровообращения (НМК) моделировали одномоментной необратимой окклюзией общих сонных артерий. Через 24 часа, после операции была проведена оценка уровня неврологического дефицита и распределение по группам. В исследование не включали животных, проявляющих выраженный неврологический дефицит по шкале Combs and D'Alecy. После распределения по группам, исследуемое соединение и референтные препараты вводили перорально в течение 7 дней. Cerebrovascular accident (CVD) was modeled by simultaneous irreversible occlusion of the common carotid arteries. 24 hours after the operation, the level of neurological deficit was assessed and grouped. The study did not include animals showing severe neurological deficits according to the Combs and D'Alecy scale. After grouping, test compound and reference drugs were administered orally for 7 days.

Церебропротекторную активность (2S,4S)-4-амино-N-(4-фторфенил)пироглутаминовой кислоты (1) оценивали по двигательной и исследовательской активности, сенсорно-моторной и когнитивной функции после лечебного 7 дневного курсового введения у животных с нарушением мозгового кровообращения.The cerebroprotective activity of (2S,4S)-4-amino-N-(4-fluorophenyl)pyroglutamic acid (1) was assessed by motor and exploratory activity, sensory-motor and cognitive function after a 7-day therapeutic course of administration in animals with impaired cerebral circulation.

Оценка влияния на двигательную и исследовательскую активность в тесте Открытое поле.Evaluation of the impact on motor and exploratory activity in the Open Field test.

В тесте Открытое поле животные контрольной группы двигались меньше ложнооперированных. Курсовое введение патентуемого соединения и препарата сравнения фасорацетам способствовало значительному повышению двигательной и исследовательской активностей в тесте Открытое поле (Таблица 5).In the Open Field test, animals of the control group moved less than sham-operated animals. The course introduction of the patented compound and the reference drug fasoracetam contributed to a significant increase in motor and exploratory activities in the Open Field test (Table 5).

Оценка влияния на координацию движений в тесте РотародEvaluation of the influence on the coordination of movements in the Rotarod test

Одномоментная окклюзия общих сонных артерий значительно нарушала координацию движений подопытных животных в тесте Ротарод: среднее время удержания на вращающемся стержне в контрольной группе было на 89% ниже, чем у ложнооперированных (Таблица 5). У животных, которым вводили соединение 1, время удержания на вращающемся стержне было статистически значимо выше (на уровне препаратов сравнения цитиколин и фасорацетам).Simultaneous occlusion of the common carotid arteries significantly disrupted the coordination of movements of experimental animals in the Rotarod test: the average retention time on a rotating rod in the control group was 89% lower than in sham-operated ones (Table 5). In animals treated with compound 1, the retention time on the rotating rod was statistically significantly higher (at the level of reference drugs citicoline and fasoracetam).

Оценка влияния на сенсорно-моторную функцию в адгезивном тестеEvaluation of the effect on sensory-motor function in the adhesive test

У животных с НМК отмечались выраженные сенсорно-моторные нарушения. Так, в адгезивном тесте, животные контрольной группы значительно дольше не обращали внимание на инородный объект (стикер) и не устраняли его с ладонной поверхности передних лап (в 9 и 8, раз соответственно), чем ложнооперированные (Таблица 5). Крысы с НМК, которым вводили соединение 1, значимо быстрее обнаруживали и удаляли инородный предмет (на уровне препарата сравнения цитиколина), что свидетельствует о лучшем восстановлении сенсорно-моторных функций у животных с НМК. Фасорацетам эффекта не давал.Animals with NMC showed pronounced sensory-motor disturbances. So, in the adhesive test, the animals of the control group did not pay attention to the foreign object (sticker) much longer and did not remove it from the palmar surface of the forepaws (by 9 and 8 times, respectively) than the sham-operated ones (Table 5). Rats with NMC, which were administered compound 1, detected and removed a foreign object much faster (at the level of the reference drug citicoline), which indicates a better recovery of sensory-motor functions in animals with NMC. Fasoracetam had no effect.

Оценка влияния на когнитивную функцию в тесте распознавание нового объекта и тесте «экстраполяционного избавления» (ТЭИ)Evaluation of the impact on cognitive function in the test of recognition of a new object and the test of "extrapolative disposal" (ETS)

В тесте распознавание нового объекта в ходе оценки индекса дискриминации, при повторном предъявлении старого объекта вместе с новым, животные с НМК без лечения практически в равной степени уделяли внимание обоим объектам (Таблица 5), что указывает на выраженные нарушения кратковременной памяти. В опытных группах те животные, которым вводили соединение 1, значимо большее время (по сравнению с контролем) уделяли изучению нового объекта (на уровне препарата сравнения цитиколина).In the test for recognition of a new object in the course of assessing the discrimination index, when the old object was repeatedly presented along with the new one, animals with NMC without treatment paid almost equal attention to both objects (Table 5), which indicates severe impairment of short-term memory. In the experimental groups, those animals that were injected with compound 1 devoted significantly more time (compared to control) to the study of a new object (at the level of the reference drug citicoline).

В тесте «экстраполяционного избавления», при воспроизведении выученного навыка через 7 дней после моделирования НМК оценивали влияние проведенной терапии на сохранность памятного следа (долговременную память). В контрольной группе (без лечения) крысы тратили значительное большее количество времени на решение экстраполяционной задачи, по сравнению с группой ложнооперированных (Таблица 5), и только в группе, которой вводили соединение 1, животные значимо быстрее решали задачу экстраполяционного избавления в стрессовых условиях. Это может быть связано с противотревожным действием патентуемого соединения. In the test of "extrapolation deliverance", when reproducing the learned skill 7 days after the simulation of NMC, the effect of the therapy on the preservation of the memory trace (long-term memory) was evaluated. In the control group (without treatment), the rats spent a significantly greater amount of time on the solution of the extrapolation task, compared with the group of sham-operated ones (Table 5), and only in the group that was administered compound 1, the animals solved the extrapolation escape task significantly faster under stressful conditions. This may be due to the anti-anxiety effect of the patented compound.

Пример 6. Оценка влияния на степень агрегации тромбоцитов в условиях экспериментального нарушения мозгового кровообращенияExample 6. Evaluation of the effect on the degree of platelet aggregation in conditions of experimental cerebrovascular accident

После лечебного 7 дневного курсового введения (2S,4S)-4-амино-N-(4-фторфенил)пироглутаминовой кислоты (1) у животных с нарушением мозгового кровообращения оценивали степень АДФ-индуцируемой агрегации тромбоцитов.After therapeutic 7-day course administration of (2S,4S)-4-amino-N-(4-fluorophenyl)pyroglutamic acid (1) in animals with impaired cerebral circulation, the degree of ADP-induced platelet aggregation was assessed.

АДФ-индуцируемая агрегация тромбоцитов у животных с нарушением мозгового кровообращения, была значительно выше, чем в группе без лечения (Таблица 6). Нормальная функция тромбоцитов наблюдалась только в группах, животным которых вводили соединение 1 или препарат сравнения – ацетилсалициловую кислоту. ADP-induced platelet aggregation in animals with impaired cerebral circulation was significantly higher than in the group without treatment (Table 6). The normal function of platelets was observed only in the groups, the animals of which were injected with compound 1 or the reference drug, acetylsalicylic acid.

Таким образом (2S,4S)-4-амино-N-(4-фторфенил)пироглутаминовая кислота (1), обладает антиагрегантной, ноотропной и противотревожной активностью. В условиях экспериментального нарушения мозгового кровообращения проявляет выраженное церебропротекторное действие, которое превышает по выраженности таковое у препаратов сравнения – фасорацетама и цитиколина.Thus, (2S,4S)-4-amino-N-(4-fluorophenyl)pyroglutamic acid (1) has antiplatelet, nootropic and anti-anxiety activity. Under conditions of experimental disorders of cerebral circulation, it exhibits a pronounced cerebroprotective effect, which exceeds in severity that of the comparator drugs - fasoracetam and citicoline.

Пример 7. Исследование острой токсичности (2S,4S)-4-амино-N-(4-фторфенил)пироглутаминовой кислоты (1)Example 7 Acute Toxicity Study of (2S,4S)-4-amino-N-(4-fluorophenyl)pyroglutamic acid (1)

Острую токсичность, соединения 1 определяли при его однократном, внутрижелудочном введении в дозах 1000, 1500, 2000 и 3000 и 3500 мг/кг. Непрерывное наблюдение за животными осуществляли в течение нескольких часов, а затем мыши помещались в домашнюю клетку и в последующем осматривались 1 раз в день в течение 14 дней. Гибель 50% животных наблюдалось, только после введения патентуемого соединения в дозе 3500 мг/кг. Обозначенные результаты позволяют отнести патентуемое соединение к малотоксичным с большой широтой терапевтического эффекта (с учетом величины эффективной дозы в пределах 27 мг/кг).Acute toxicity of compound 1 was determined with its single intragastric administration at doses of 1000, 1500, 2000 and 3000 and 3500 mg/kg. Continuous observation of the animals was carried out for several hours, and then the mice were placed in a home cage and subsequently examined once a day for 14 days. The death of 50% of the animals was observed only after the administration of the patented compound at a dose of 3500 mg/kg. The indicated results make it possible to attribute the patented compound to low toxicity with a wide range of therapeutic effect (taking into account the value of the effective dose in the range of 27 mg/kg).

Claims (2)

(2S,4S)-4-амино-N-(4-фторфенил)пироглутаминовая кислота, обладающая церебропротекторным, ноотропным и антитромботическим действием (формула 1)(2S,4S)-4-amino-N-(4-fluorophenyl)pyroglutamic acid with cerebroprotective, nootropic and antithrombotic effects (formula 1)

.

.