RU2768742C1 - Method of producing heterogeneous biocatalyst based on papain immobilized on ion-exchange resins - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to biotechnology and is a method of producing a heterogeneous biocatalyst based on papain immobilized on ion-exchange resins, including adsorption immobilization of papain in a buffer solution on an ion-exchange resin matrix, incubation at room temperature, washing formed precipitate with a buffer, wherein immobilization is carried out on a matrix of air-dry ion-exchange resin AV-16-GS, and the buffer solution for immobilisation is 0.05 M phosphate buffer.

EFFECT: disclosed is a method of producing a heterogeneous biocatalyst based on papain immobilized on ion-exchange resins.

1 cl, 5 dwg, 1 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в пищевой промышленности для тендеризации мяса и улучшения плавкости сыров.The invention relates to biotechnology and can be used in the food industry to tenderize meat and improve the melting of cheeses.

Папаин (КФ 3.4.22.2) - это протеолитический фермент, обладающий высокой каталитической активностью. Папаин получают из кожуры незрелой папайи Carica papaya. Он специфически расщепляет пептидную связь вблизи положительно заряженных остатков лизина и аргинина, а также фенилаланина. Энзим имеет молекулярную массу 23 кДа, стабилен при высоких температурах, активен в диапазоне рН 3-9.Papain (EC 3.4.22.2) is a proteolytic enzyme with high catalytic activity. Papain is obtained from the peel of the unripe papaya Carica papaya. It specifically cleaves the peptide bond near positively charged lysine and arginine residues, as well as phenylalanine. The enzyme has a molecular weight of 23 kDa, is stable at high temperatures, and is active in the pH range of 3-9.

Папаин широко используется в различных отраслях промышленности, таких как пищевая, фармацевтическая, в производстве кожи, моющих средств, для тендеризации рыбных и мясных продуктов. Он применяется для гидролиза мясного белка, особенно белка миофибрилл и соединительной ткани, используется в качестве осветляющего агента в пивоварении. Папаин может улучшить плавкость и растяжимость сыра Набулси, используемого в различных кондитерских изделиях [Study on industrial applications of papain: A succinct review / H.A. Shouket [et al.] // 1st International Conference on Energetics, Civil and Agricultural Engineering. - 2020. - V. 614. - P.7].Papain is widely used in various industries such as food, pharmaceutical, leather, detergent, fish and meat tenderization. It is applied to the hydrolysis of meat protein, especially the protein of myofibrils and connective tissue, and is used as a clarifying agent in brewing. Papain can improve the meltability and extensibility of Nabulsi cheese used in various confectionery [Study on industrial applications of papain: A succinct review / H.A. Shouket [et al.] // 1st International Conference on Energetics, Civil and Agricultural Engineering. - 2020. - V. 614. - P.7].

Ферменты - это высокоэффективные катализаторы, но применение их в свободной форме (в растворе) в промышленных масштабах является сложной задачей. Чтобы улучшить свойства энзимов такие как стабильность, специфичность, каталитическую активность и сродство к субстрату, используется их иммобилизация. К другим преимуществам иммобилизации относят возможность удаления фермента из системы в любой момент реакции, повторное использование биокатализаторов. Благодаря иммобилизации ферментов на нерастворимых носителях расширяются возможности их применения в различных отраслях, включая сельское хозяйство, пищевую, целлюлозно-бумажную, текстильную и фармацевтическую промышленность [Review on surface modification of nanocarriers to overcome diffusion limitations: An enzyme immobilization aspect / C.G. Malar [et al.] // Biochemical Engineering Journal. - 2020. - V. 158. - P. 8].Enzymes are highly efficient catalysts, but using them in free form (in solution) on an industrial scale is a challenge. Immobilization is used to improve enzyme properties such as stability, specificity, catalytic activity and substrate affinity. Other advantages of immobilization include the possibility of removing the enzyme from the system at any time of the reaction and the reuse of biocatalysts. Due to the immobilization of enzymes on insoluble carriers, the possibilities of their application in various industries are expanding, including agriculture, food, pulp and paper, textile and pharmaceutical industries [Review on surface modification of nanocarriers to overcome diffusion limitations: An enzyme immobilization aspect / C.G. Malar [et al.] // Biochemical Engineering Journal. - 2020. - V. 158. - P. 8].

Существует большое разнообразие полимерных матриц для иммобилизации энзимов. К одним из перспективных носителей относят ионообменные смолы. Ионообменные смолы - это нерастворимые полимеры, которые могут осуществлять ионный обмен. Иониты подразделяются на катионообменники (с анионными функциональными группами и положительно заряженными подвижными ионами) и анионообменники (с катионными функциональными группами и отрицательно заряженными подвижными ионами). Большинство ионообменных смол синтезированы из сшитых сополимеров полистирола и дивинилбензола, несущих ионообменные функциональные группы. Ионообменные смолы используются для очистки воды, извлечения металлов, замещения ионов, кислотно-основного катализа, в качестве сенсоров, или в виде твердых электролитов, в химической, пищевой промышленности, в производстве напитков, а также в энергетической, ядерной, полупроводниковой и фармацевтической промышленности [Biswas K., Ghosh S., Basu В. Ion-exchange Resins and Polypeptide Supported Catalysts: A Critical Review // Current Green Chemistry. - 2020. - V. 7. - P. 40-52].There is a wide variety of polymer matrices for enzyme immobilization. One of the promising carriers is ion-exchange resins. Ion exchange resins are insoluble polymers that can carry out ion exchange. Ion exchangers are divided into cation exchangers (with anionic functional groups and positively charged mobile ions) and anion exchangers (with cationic functional groups and negatively charged mobile ions). Most ion-exchange resins are synthesized from cross-linked copolymers of polystyrene and divinylbenzene bearing ion-exchange functional groups. Ion exchange resins are used for water treatment, metal extraction, ion displacement, acid-base catalysis, as sensors or as solid electrolytes, in the chemical, food, beverage, energy, nuclear, semiconductor, and pharmaceutical industries [ Biswas K., Ghosh S., Basu B. Ion-exchange Resins and Polypeptide Supported Catalysts: A Critical Review // Current Green Chemistry. - 2020. - V. 7. - P. 40-52].

В качестве прототипа служил способ получения гетерогенного препарата на основе папаина, обладающего регенерационными свойствами [Патент RU 2677873 С2, МПК A61K 38/48, A61K 47/30, А61Р 17/02, опубл. 22.01.2019, Бюл. №3], включающий обработку матрицы ионообменных волокон ВИОН АН-1 или ВИОН КН-1 раствором папаина, инкубирование, отличающийся тем, что для иммобилизации на ВИОН КН-1 используют 0.2 М ацетатный буфер (рН 4.5-5.5) или 0.05 М боратный буфер с добавлением KCl (рН 9.0-9.5), а для иммобилизации на ВИОН АН-1 - 0.05 М трис-глициновый (рН 9.0) или 0.05 М глициновый (рН 10.0) буфер в расчете 20 мл раствора фермента в концентрации 5 мг/мл на 1 г волокон, инкубирование проводится в течение 24 ч при комнатной температуре, образовавшийся осадок промывают использованным при иммобилизации буфером до отсутствия в промывных водах белка.The prototype was a method of obtaining a heterogeneous drug based on papain with regenerative properties [Patent RU 2677873 C2, IPC A61K 38/48, A61K 47/30, A61P 17/02, publ. 01/22/2019, Bull. No. 3], which includes processing the matrix of ion-exchange fibers VION AN-1 or VION KN-1 with a solution of papain, incubation, characterized in that 0.2 M acetate buffer (pH 4.5-5.5) or 0.05 M borate buffer is used for immobilization on VION KN-1 with the addition of KCl (pH 9.0-9.5), and for immobilization on VION AN-1 - 0.05 M tris-glycine (pH 9.0) or 0.05 M glycine (pH 10.0) buffer in the calculation of 20 ml of the enzyme solution at a concentration of 5 mg/ml per 1 g of fibers, incubation is carried out for 24 hours at room temperature, the precipitate formed is washed with the buffer used during immobilization until there is no protein in the washing water.

Заявляемое изобретение предназначено для расширения числа носителей, используемых для получения иммобилизованного папаина. Применение с этой целью ионообменных смол КУ-2, КУ-2-8 чС, IMAC-HP111, АВ-Д6-ГС, АВ-17-2П, PUROLITE А100, ЭДЭ-10П позволит получить биокатализатор с более высокой активностью и упростить процесс сорбции. Способ прост в исполнении, не требует предварительной активации носителя, а иммобилизованный папаин имеет высокую стабильность. В отличие от прототипа в заявляемом изобретении используются ионообменные смолы, а время сорбции сокращается с 24 до 2 часов, т.е. в 12 раз.The claimed invention is intended to expand the number of carriers used to obtain immobilized papain. The use of ion exchange resins KU-2, KU-2-8chS, IMAC-HP111, AV-D6-GS, AV-17-2P, PUROLITE A100, EDE-10P for this purpose will make it possible to obtain a biocatalyst with a higher activity and simplify the sorption process . The method is simple to perform, does not require preliminary activation of the carrier, and immobilized papain has a high stability. Unlike the prototype, the claimed invention uses ion-exchange resins, and the sorption time is reduced from 24 to 2 hours, i.e. 12 times.

Технический результат заявленного изобретения заключается в разработке простого в исполнении, не требующего предварительной активации носителя способа получения гетерогенного биокатализатора на основе папаина, иммобилизованного на ионообменных смолах, позволяющего сократить время сорбционной иммобилизации до 2 часов, а также проводить ферментативные реакции с высокими скоростями и в условиях среды, отличающихся от физиологических, в том числе в так называемых «агрессивных» условиях.The technical result of the claimed invention consists in the development of an easy-to-execute method that does not require preliminary activation of the carrier for obtaining a heterogeneous biocatalyst based on papain immobilized on ion-exchange resins, which makes it possible to reduce the time of sorption immobilization to 2 hours, and also to carry out enzymatic reactions at high speeds and under environmental conditions. that differ from physiological ones, including in the so-called "aggressive" conditions.

В своей работе мы оптимизировали параметры для иммобилизации папаина адсорбционным методом на матрицах ионообменных смол с использованием различных буферов. Благодаря адсорбционной иммобилизации фермент приобретает свойства гетерогенного биокатализатора, становится более стабильным при изменении рН среды и температуры.In our work, we have optimized the parameters for the immobilization of papain by the adsorption method on matrices of ion exchange resins using various buffers. Due to adsorption immobilization, the enzyme acquires the properties of a heterogeneous biocatalyst and becomes more stable with changes in pH and temperature.

Технический результат достигается тем что, в способе получения гетерогенного биокатализатора на основе папаина, иммобилизованного на ионообменных смолах, включающем адсорбционную иммобилизацию папаина в буферном растворе на матрицу ионообменной смолы в соотношении 20 мл раствора папаина в концентрации 5 мг/мл на 1 г носителя, инкубацию при комнатной температуре с периодическим перемешиванием, промывку образовавшегося осадка буфером до отсутствия в промывных водах белка, согласно изобретению, иммобилизацию проводят на матрицу воздушно-сухой ионообменной смолы АВ-16-ГС, в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0.05 М фосфатный буфер, рН 11.0, инкубацию осуществляют в течение 2 часов, промывку образовавшегося осадка проводят 0.05 М трис-HCl буфером, рН 7.5.The technical result is achieved by the fact that, in a method for obtaining a heterogeneous biocatalyst based on papain immobilized on ion-exchange resins, including adsorption immobilization of papain in a buffer solution on an ion-exchange resin matrix in a ratio of 20 ml of papain solution at a concentration of 5 mg/ml per 1 g of carrier, incubation at room temperature with periodic stirring, washing the precipitate formed with a buffer until there is no protein in the washing water, according to the invention, immobilization is carried out on a matrix of air-dry ion-exchange resin AV-16-GS, 0.05 M phosphate buffer, pH 11.0, is used as a buffer solution for immobilization, incubation is carried out for 2 hours, the precipitate formed is washed with 0.05 M Tris-HCl buffer, pH 7.5.

Фиг. 1. Содержание белка (мг/г носителя) в препаратах папаина, иммобилизованного адсорбционным методом на ионообменных смолах с использованием следующих буферов: 1 - 0.05 М фосфатный с рН 6.5; 2 - 0.05 М глициновый с рН 9.0; 3 - 0.05 М фосфатный с рН 11.0; 4 - 0.05 М NaOH-KCL с рН 12.0.Fig. 1. Protein content (mg/g carrier) in preparations of papain immobilized by adsorption on ion-exchange resins using the following buffers: 1 - 0.05 M phosphate buffer pH 6.5; 2 - 0.05 M glycine with pH 9.0; 3 - 0.05 M phosphate with pH 11.0; 4 - 0.05 M NaOH-KCL pH 12.0.

Фиг. 2. Протеазная активность (ед/мл раствора) в препаратах папаина, иммобилизованного адсорбционным методом на ионообменных смолах с использованием следующих буферов: 1 - 0.05 М фосфатный с рН 6.5; 2 - 0.05 М глициновый с рН 9.0; 3 - 0.05 М фосфатный с рН 11.0; 4 - 0.05 М NaOH-KCL с рН 12.0.Fig. 2. Protease activity (u/ml solution) in preparations of papain immobilized by adsorption on ion-exchange resins using the following buffers: 1 - 0.05 M phosphate buffer pH 6.5; 2 - 0.05 M glycine with pH 9.0; 3 - 0.05 M phosphate with pH 11.0; 4 - 0.05 M NaOH-KCL pH 12.0.

Фиг. 3. Удельная протеазная активность (ед/мг белка) в препаратах папаина, иммобилизованного адсорбционным методом на ионообменных смолах с использованием следующих буферов: 1 - 0.05 М фосфатный с рН 6.5; 2 - 0.05 М глициновый с рН 9.0; 3 - 0.05 М фосфатный с рН 11.0; 4 - 0.05 М NaOH-KCL с рН 12.0.Fig. Fig. 3. Specific protease activity (u/mg of protein) in preparations of papain immobilized by the adsorption method on ion-exchange resins using the following buffers: 1 - 0.05 M phosphate, pH 6.5; 2 - 0.05 M glycine with pH 9.0; 3 - 0.05 M phosphate with pH 11.0; 4 - 0.05 M NaOH-KCL pH 12.0.

Фиг. 4. Эстеразная активность (ед/мл раствора) в препаратах папаина, иммобилизованного адсорбционным методом на ионообменных смолах с использованием следующих буферов: 1 - 0.05 М фосфатный с рН 6.5; 2 - 0.05 М глициновый с рН 9.0; 3 - 0.05 М фосфатный с рН 11.0; 4 - 0.05 М NaOH-KCL с рН 12.0.Fig. 4. Esterase activity (u/ml solution) in preparations of papain immobilized by adsorption on ion-exchange resins using the following buffers: 1 - 0.05 M phosphate buffer pH 6.5; 2 - 0.05 M glycine with pH 9.0; 3 - 0.05 M phosphate with pH 11.0; 4 - 0.05 M NaOH-KCL pH 12.0.

Фиг. 5. Удельная эстеразная активность (ед/мг белка) в препаратах папаина, иммобилизованного адсорбционным методом на ионообменных смолах с использованием следующих буферов: 1 - 0.05 М фосфатный с рН 6.5; 2 - 0.05 М глициновый с рН 9.0; 3 -0.05 М фосфатный с рН 11.0; 4 - 0.05 М NaOH-KCL с рН 12.0.Fig. Fig. 5. Specific esterase activity (u/mg of protein) in preparations of papain immobilized by the adsorption method on ion-exchange resins using the following buffers: 1 - 0.05 M phosphate with pH 6.5; 2 - 0.05 M glycine with pH 9.0; 3 -0.05 M phosphate with pH 11.0; 4 - 0.05 M NaOH-KCL pH 12.0.

Пример реализации способа.An example of the implementation of the method.

В качестве объекта исследования был выбран папаин (Sigma, США), субстратами для гидролиза служили азоказеин и N-α-бензоил-DL-аргинин-n-нитроанилид (BAPNA) (Sigma, США), носителями для иммобилизации - ионообменные смолы КУ-2, КУ-2-8 чС, IMAC-HP111, АВ-16-ГС, АВ-17-2П, PUROLITE А100, ЭДЭ-10П (Уральская химическая компания, Россия).Papain (Sigma, USA) was chosen as the object of study, azocasein and N-α-benzoyl-DL-arginine-n-nitroanilide (BAPNA) (Sigma, USA) served as substrates for hydrolysis, KU-2 ion-exchange resins served as substrates for immobilization. , KU-2-8 ChS, IMAC-HP111, AV-16-GS, AV-17-2P, PUROLITE A100, EDE-10P (Ural Chemical Company, Russia).

Перед проведением иммобилизации исследуемые образцы ионообменных смол помещали в насыщенный раствор NaCl на 3-4 ч для предотвращения растрескивания гранул, далее сорбент переносили в колонку и промывали дистиллированной водой. Для удаления минеральных примесей ионит сначала обрабатывали растворами HCl в количестве 5 объемов на 1 объем смолы в нарастающей концентрации (0.5-3.0 М) до отсутствия ионов железа в промывных водах, а затем обработку соляной кислотой повторяли при соответствующем уменьшении концентрации кислоты и отмывали смолу дистиллированной водой до нейтральной реакции. Следующей стадией подготовки ионитов-носителей была обработка растворами гидроксида натрия в нарастающей концентрации 0.1-0.25 М, после которой смолы отмывали дистиллированной водой. Для более полного удаления примесей кислотно-щелочную обработку проводили троекратно. После очистки ионит переводили в требуемую ионную форму в той же колонке: для перевода катионита в Н⁺- форму использовали раствор 0.5 М HCl, для перевода анионита в ОН^- - форму - раствор 0.1 М NaOH в количестве 5 объемов раствора на 1 объем смолы [Горбунов Н.В. О кондиционировании катионитов / Н.В. Горбунов, Н.Г. Полянский. // Журнал физической химии. - 1978. - Т. 52, №5. - С. 1259-1262; Полянский Н.Г. Методы исследования ионитов / Н.Г. Полянский, Н.В. Горбунов, Н.Л. Полянская. - М.: Химия, 1976. - 208 с.]. Подготовленный таким образом носитель высушивали при комнатной температуре и хранили в емкости с плотно притертой крышкой [Создание гетерогенного ферментного препарата на основе иммобилизованной инулиназы из Helianthus tuberosus. Холявка М.Г. [и др.] // Биотехнология. - 2012. - №6. - С. 31-42].Before immobilization, the studied samples of ion exchange resins were placed in a saturated NaCl solution for 3–4 h to prevent cracking of the granules, then the sorbent was transferred to a column and washed with distilled water. To remove mineral impurities, the ionite was first treated with HCl solutions in an amount of 5 volumes per 1 volume of resin in increasing concentration (0.5–3.0 M) until there were no iron ions in the wash water, and then the treatment with hydrochloric acid was repeated with a corresponding decrease in the acid concentration and the resin was washed with distilled water to a neutral reaction. The next step in the preparation of carrier ion exchangers was treatment with sodium hydroxide solutions at increasing concentrations of 0.1–0.25 M, after which the resins were washed with distilled water. For a more complete removal of impurities, acid-base treatment was carried out three times. After purification, the ion exchanger was transferred to the required ionic form in the same column: a solution of 0.5 M HCl was used to transfer the cation exchanger to the H ⁺ - form, a solution of 0.1 M NaOH in the amount of 5 volumes of solution per 1 volume of resin was used to transfer the anion exchanger to the OH ^- form [ Gorbunov N.V. On the conditioning of cation exchangers / N.V. Gorbunov, N.G. Polyansky. // Journal of Physical Chemistry. - 1978. - T. 52, No. 5. - S. 1259-1262; Polyansky N.G. Methods for the study of ion exchangers / N.G. Polyansky, N.V. Gorbunov, N.L. Polyanskaya. - M.: Chemistry, 1976. - 208 p.]. The carrier prepared in this way was dried at room temperature and stored in a container with a tightly ground lid [Creation of a heterogeneous enzyme preparation based on immobilized inulinase from Helianthus tuberosus. Kholyavka M.G. [and others] // Biotechnology. - 2012. - No. 6. - S. 31-42].

Иммобилизацию папаина на матрице ионообменной смолы осуществляли адсорбционным методом. К 1 г воздушно-сухой ионообменной смолы добавляли 20 мл раствора фермента в концентрации 5 мг/мл, инкубировали в течение 2 часов. После окончания инкубации образовавшийся осадок промывали 0.05 М трис-HCl буфером, рН 7.5 до отсутствия в промывных водах белка (контроль осуществляли на спектрофотометре СФ-2000 при λ=280 нм).Papain was immobilized on an ion-exchange resin matrix by the adsorption method. To 1 g of air-dry ion-exchange resin was added 20 ml of enzyme solution at a concentration of 5 mg/ml, incubated for 2 hours. After the end of the incubation, the formed precipitate was washed with 0.05 M Tris-HCl buffer, pH 7.5 until the absence of protein in the washings (the control was carried out on an SF-2000 spectrophotometer at λ=280 nm).

Содержание белка в иммобилизованных препаратах папаина определяли методом Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - V. 193. - P. 265-275].The protein content in immobilized papain preparations was determined by the Lowry method [Lowry O.N., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - V. 193. - P. 265-275].

Измерение протеазной активности папаина проводили на субстрате азоказеине (Sigma, США) [Sabirova A.R., Rudakova N.L., Balaban N.P., Ilyinskaya O.N., Demidyuk I.V., Kostrov S.V., Rudenskaya G.N., Sharipova M.R. A novel secreted metzincin metalloproteinase from Bacillus intermedins // FEBS Lett. - 2010 - V. 584 (21), P. 4419-4425]. К 50 мг иммобилизованного образца добавляли 200 мкл 0.05 М трис-HCl буфера с рН 7.5, 800 мкл азоказеина (0.5% в 0.05 М трис-HCl буфере, рН 7.5) и инкубировали 2 часа при 37°С. Далее добавляли 800 мкл трихлоруксусной кислоты (ТХУ) (5%), инкубировали 10 минут при 4°С, затем центрифугировали в течение 3 мин при 13 тыс об/мин для удаления негидролизованного азоказеина. К 1200 мкл супернатанта добавляли 240 мкл 3% NaOH для нейтрализации кислоты, после чего измеряли оптическую плотность опытной пробы при 410 нм в 10 мм кювете. Контрольная проба содержала 800 мкл азоказеина, 800 мкл ТХУ, 50 мг образца и 200 мкл буфера (иммобилизованный фермент в контрольную пробу вносили последним, остальные операции для нее делали аналогично опытным пробам).Papain protease activity was measured on azocasein substrate (Sigma, USA) [Sabirova A.R., Rudakova N.L., Balaban N.P., Ilyinskaya O.N., Demidyuk I.V., Kostrov S.V., Rudenskaya G.N., Sharipova M.R. A novel secreted metzincin metalloproteinase from Bacillus intermedins // FEBS Lett. - 2010 - V. 584 (21), P. 4419-4425]. To 50 mg of the immobilized sample, 200 µL of 0.05 M Tris-HCl buffer, pH 7.5, 800 µL of azocasein (0.5% in 0.05 M Tris-HCl buffer, pH 7.5) were added and incubated for 2 hours at 37°С. Next, 800 μl of trichloroacetic acid (TCA) (5%) was added, incubated for 10 minutes at 4°C, then centrifuged for 3 minutes at 13 thousand rpm to remove non-hydrolyzed azocasein. To 1200 μl of the supernatant, 240 μl of 3% NaOH was added to neutralize the acid, after which the optical density of the test sample was measured at 410 nm in a 10 mm cuvette. The control sample contained 800 μl of azocasein, 800 μl of TCA, 50 mg of the sample, and 200 μl of buffer (the immobilized enzyme was added last to the control sample, the remaining operations were performed similarly to the experimental samples).

Единицей протеазной активности служило количество папаина, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкМ азоказеина за 1 мин. Удельную протеазную активность рассчитывали по формуле:The unit of protease activity was the amount of papain, which hydrolyzes 1 μM of azocasein in 1 min under experimental conditions. Specific protease activity was calculated by the formula:

ПА=D*1000/120/200/С,PA=D*1000/120/200/C,

где ПА - протеазная активность препарата, мкМ/мин на 1 мг белка,where PA is the protease activity of the drug, µM/min per 1 mg of protein,

D - оптическая плотность раствора при 410 нм,D is the optical density of the solution at 410 nm,

С - концентрация белка в пробе, мг/мл, измеренная по методу Лоури,C - protein concentration in the sample, mg / ml, measured by the Lowry method,

120 - время инкубации в минутах,120 - incubation time in minutes,

200 - объем пробы, мкл,200 - sample volume, µl,

1000 - коэффициент для пересчета в мкМ.1000 - coefficient for conversion to µM.

Определение эстеразной активности папаина проводили на субстрате N-α-бензоил-DL-аргинин-n-нитроанилиде (BAPNA) [Erlanger D.F., Kokowski N., Cohen W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin // Arch. Biochem. Biophys. - 1961. - V. 95. - P. 271]. К 50 мг образца добавляли 400 мкл BAPNA (1 мг/мл) и 400 мкл 0.2 М фосфатного буфера с рН 7.4, содержащего 0.04 М раствор цистеина. Инкубировали раствор 2 часа при 37°С, останавливали реакцию 800 мкл 1 М HCl. Измеряли оптическую плотность образцов при длине волны 410 нм. Контрольная проба содержала 400 мкл BAPNA, 400 мкл 1 М HCl, 50 мг образца и 400 мкл буфера (иммобилизованный фермент в контрольную пробу вносили последним, остальные операции для нее делали аналогично опытным пробам).Papain esterase activity was determined on the substrate N-α-benzoyl-DL-arginine-n-nitroanilide (BAPNA) [Erlanger D.F., Kokowski N., Cohen W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin // Arch. Biochem. Biophys. - 1961. - V. 95. - P. 271]. To 50 mg of the sample, 400 µL of BAPNA (1 mg/mL) and 400 µL of 0.2 M phosphate buffer, pH 7.4, containing 0.04 M solution of cysteine, were added. The solution was incubated for 2 hours at 37°C, the reaction was stopped with 800 μl of 1 M HCl. The optical density of the samples was measured at a wavelength of 410 nm. The control sample contained 400 μl of BAPNA, 400 μl of 1 M HCl, 50 mg of the sample, and 400 μl of buffer (the immobilized enzyme was added last to the control sample, the rest of the operations were performed similarly to the experimental samples).

Единицей эстеразной активности служило количество папаина, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкМ N-α-бензоил-DL-аргинин-n-нитроанилида за 1 минуту. Удельную эстеразную активность рассчитывали по формуле:The unit of esterase activity was the amount of papain, which hydrolyzes 1 μM of N-α-benzoyl-DL-arginine-n-nitroanilide in 1 minute under experimental conditions. Specific esterase activity was calculated by the formula:

ЭА=D*1000/120/400/С,EA=D*1000/120/400/С,

где ЭА - эстеразная активность препарата, мкМ/мин на 1 мг белка,where EA is the esterase activity of the drug, µM/min per 1 mg of protein,

D - оптическая плотность раствора при 410 нм,D is the optical density of the solution at 410 nm,

С - концентрация белка в пробе, мг/мл, измеренная по методу Лоури,C - protein concentration in the sample, mg / ml, measured by the Lowry method,

120 - время инкубации в минутах,120 - incubation time in minutes,

400 - объем пробы, мкл,400 - sample volume, µl,

1000 - коэффициент для пересчета в мкМ.1000 - coefficient for conversion to µM.

Все экспериментальные исследования осуществляли минимум в 8-кратной повторности. Статистическая обработка полученных результатов проводилась при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента.All experimental studies were carried out in at least 8 replicates. Statistical processing of the obtained results was carried out at a significance level of 5% using Student's t-test.

При иммобилизации папаина на ионообменных материалах необходимо учитывать такие важные показатели, как заряды носителя и фермента. Значение pI папаина составляет 8.75 [Холявка М.Г. Практикум по биотехнологии: иммобилизованные биологические объекты в системе лабораторных работ / М.Г. Холявка, М.А. Наквасина, В.Г. Артюхов - Воронеж: Издательский дом ВГУ, 2017. - 161 с], поэтому в качестве иммобилизационной среды для его адсорбции на катионитах КУ-2, КУ-2-8 чС и IMAC-НР111 мы использовали 0.05 М фосфатный буфер с рН 6.5 и 0.05 М глициновый буфер с рН 9.0, а для иммобилизации на анионитах АВ-17-2П, АВ-16-ГС, ЭДЭ-10П и PUROLITE А100 применяли 0.05 М фосфатный буфер с рН 11.0 и 0.05 М NaOH-KCL буфер с рН 12.0. Результаты отражены на фиг. 1-5.When immobilizing papain on ion-exchange materials, it is necessary to take into account such important indicators as the charges of the carrier and the enzyme. The pI value of papain is 8.75 [Kholyavka M.G. Workshop on biotechnology: immobilized biological objects in the system of laboratory work / M.G. Kholyavka, M.A. Nakvasina, V.G. Artyukhov - Voronezh: VSU Publishing House, 2017. - 161 s], therefore, as an immobilization medium for its adsorption on cation exchangers KU-2, KU-2-8chS and IMAC-NR111, we used 0.05 M phosphate buffer with pH 6.5 and 0.05 M glycine buffer with pH 9.0, and 0.05 M phosphate buffer with pH 11.0 and 0.05 M NaOH-KCL buffer with pH 12.0 were used for immobilization on AV-17-2P, AV-16-GS, EDE-10P, and PUROLITE A100 anion exchangers. The results are shown in FIG. 1-5.

Наибольшее количество белка в гетерогенных препаратах (в мг на г носителя) наблюдалось при иммобилизации папаина адсорбционным методом на матрице АВ-16-ГС с NaOH-KCl буфером, рН 12.0 в качестве иммобилизационной среды (фиг. 1). Высокие значения общей протеазной активности (в ед на мл раствора) были зарегистрированы при иммобилизации фермента на матрицах АВ-16-ГС с фосфатным буфером, рН 11.0 и NaOH-KCl буфером, рН 12.0 (фиг. 2). Наибольшую удельную протеазную активность (в ед на мг белка) показали препараты папаина, иммобилизованного с помощью адсорбционного метода на матрице АВ-16-ГС с фосфатным буфером, рН 11.0 (фиг. 3).The highest amount of protein in heterogeneous preparations (in mg per g of carrier) was observed upon immobilization of papain by the adsorption method on an AV-16-GS matrix with NaOH-KCl buffer, pH 12.0 as an immobilization medium (Fig. 1). High values of total protease activity (in units per ml of solution) were recorded during immobilization of the enzyme on AV-16-GS matrices with phosphate buffer, pH 11.0 and NaOH-KCl buffer, pH 12.0 (Fig. 2). The highest specific protease activity (in units per mg of protein) was shown by preparations of papain immobilized using the adsorption method on an AB-16-GS matrix with phosphate buffer, pH 11.0 (Fig. 3).

Наибольшая эстеразная активность препаратов (в ед на мл раствора) проявлялась при использовании носителя АВ-16-ГС с фосфатным буфером, рН 11.0 и NaOH-KCl буфером, рН 12.0 (фиг. 4). Наибольшую удельную эстеразную активность показал папаин, иммобилизованный с помощью адсорбционного метода на матрице АВ-16-ГС с фосфатным буфером, рН 11.0 (фиг. 5).The highest esterase activity of the preparations (in units per ml of solution) was manifested when using the carrier AB-16-GS with phosphate buffer, pH 11.0 and NaOH-KCl buffer, pH 12.0 (Fig. 4). The highest specific esterase activity was shown by papain immobilized using the adsorption method on an AB-16-GS matrix with phosphate buffer, pH 11.0 (Fig. 5).

Мы сравнили полученные результаты по определению содержания белка, протеазной и эстеразной активности для препаратов папаина, иммобилизованных на матрицах ионообменных смол КУ-2, КУ-2-8 чС, IMAC-HP111, АВ-16-ГС, АВ-17-2П, PUROLITE А100, ЭДЭ-10П. Оптимальное соотношение содержания белка (в мг на г носителя), общей протеазной и эстеразной активностей (в ед на мл раствора), удельной протеазной и эстеразной активностей (в ед на мг белка) выявлено при иммобилизации папаина на анионите АВ-16-ГС с фосфатным буфером, рН 11.0.We compared the results obtained for determining the protein content, protease and esterase activity for papain preparations immobilized on matrices of ion exchange resins KU-2, KU-2-8chS, IMAC-HP111, AV-16-GS, AV-17-2P, PUROLITE A100, EDE-10P. The optimal ratio of protein content (in mg per g of carrier), total protease and esterase activities (in units per ml of solution), specific protease and esterase activities (in units per mg of protein) was found during immobilization of papain on an AB-16-GS anion exchange resin with phosphate buffer, pH 11.0.

Из вышеизложенного материала следует, что среди апробированных нами вариантов иммобилизации для создания гетерогенных препаратов на основе папаина и ионообменных смол наиболее перспективным является адсорбция на анионите АВ-16-ГС с фосфатным буфером, рН 11.0.It follows from the above material that among the immobilization options tested by us for the creation of heterogeneous preparations based on papain and ion-exchange resins, the most promising is adsorption on the AV-16-GS anion exchanger with phosphate buffer, pH 11.0.

Claims (1)

Способ получения гетерогенного биокатализатора на основе папаина, иммобилизованного на ионообменных смолах, включающий адсорбционную иммобилизацию папаина в буферном растворе на матрицу ионообменной смолы в соотношении 20 мл раствора папаина в концентрации 5 мг/мл на 1 г носителя, инкубацию при комнатной температуре с периодическим перемешиванием, промывку образовавшегося осадка буфером до отсутствия в промывных водах белка, отличающийся тем, что иммобилизацию проводят на матрицу воздушно-сухой ионообменной смолы АВ-16-ГС, а в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0.05 М фосфатный буфер, рН 11.0, инкубацию осуществляют в течение 2 часов, промывку образовавшегося осадка проводят 0.05 М трис-HCl буфером, рН 7.5.A method for producing a heterogeneous biocatalyst based on papain immobilized on ion-exchange resins, including adsorption immobilization of papain in a buffer solution onto an ion-exchange resin matrix in a ratio of 20 ml of papain solution at a concentration of 5 mg/ml per 1 g of carrier, incubation at room temperature with occasional stirring, washing formed precipitate with a buffer until there is no protein in the washing water, characterized in that immobilization is carried out on a matrix of air-dry ion-exchange resin AB-16-GS, and 0.05 M phosphate buffer, pH 11.0 is used as a buffer solution for immobilization, incubation is carried out for 2 hours, washing the precipitate formed is carried out with 0.05 M Tris-HCl buffer, pH 7.5.

Images