RU2760835C2 - Agent inducing cell death for cells having braf gene mutations, agent suppressing growth of such cells, and pharmaceutical composition for the therapy of diseases caused by growth defect of such cells - Google Patents

Agent inducing cell death for cells having braf gene mutations, agent suppressing growth of such cells, and pharmaceutical composition for the therapy of diseases caused by growth defect of such cells Download PDF

Info

Publication number
RU2760835C2
RU2760835C2 RU2017139718A RU2017139718A RU2760835C2 RU 2760835 C2 RU2760835 C2 RU 2760835C2 RU 2017139718 A RU2017139718 A RU 2017139718A RU 2017139718 A RU2017139718 A RU 2017139718A RU 2760835 C2 RU2760835 C2 RU 2760835C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cell
gst
mutation
drug
cancer
Prior art date
Application number
RU2017139718A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2017139718A (en
RU2017139718A3 (en
Inventor
Йосиро НИИТСУ
Хироки НИСИТА
Original Assignee
Нитто Денко Корпорейшн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP2016078710A external-priority patent/JP6864990B2/en
Application filed by Нитто Денко Корпорейшн filed Critical Нитто Денко Корпорейшн
Publication of RU2017139718A publication Critical patent/RU2017139718A/en
Publication of RU2017139718A3 publication Critical patent/RU2017139718A3/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2760835C2 publication Critical patent/RU2760835C2/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • G01N33/5017—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity for testing neoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01018—Glutathione transferase (2.5.1.18)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Abstract

FIELD: medicine.
SUBSTANCE: method for inducing cell death of a cell having BRAF gene mutation, a method for suppressing cell growth of a cell having BRAF gene mutation, the application of a drug suppressing GST-π production for the treatment of cancer caused by cell growth defect, and the application of a drug suppressing GST-π production and BRAF inhibitor for the treatment of cancer caused by growth defect of a cell having BRAF gene mutation are proposed. A method for screening a drug for inducing cell death of a cell having BRAF gene mutation, and a method for screening a drug for suppressing cell growth of a cell having BRAF gene mutation are proposed.
EFFECT: proposed group of inventions provides for inducing cell death and suppressing cell growth of a cell having BRAF gene mutation.
10 cl, 6 dwg, 3 ex

Description

Область техникиTechnology area

Настоящее изобретение относится к агенту, индуцирующему клеточную гибель, для клетки, имеющей мутацию гена BRAF (например, тип раковой клетки), агенту, подавляющему рост такой клетки, и фармацевтической композиции для терапии заболевания, вызванного дефектом роста такой клетки, и, кроме того, относится к способу скрининга агента, индуцирующего гибель клеток, и/или агента, подавляющего клеточный рост.The present invention relates to an agent for inducing cell death for a cell having a mutation in the BRAF gene (for example, a type of cancer cell), an agent that inhibits the growth of such a cell, and a pharmaceutical composition for treating a disease caused by a growth defect in such a cell, and in addition, refers to a method for screening a cell death inducing agent and / or a cell growth inhibiting agent.

Уровень техникиState of the art

Ген BRAF представляет собой ген, кодирующий тип серин-треонин киназы, составляющей путь RAS-RAF-MAPK. Мутации в гене BRAF были зарегистрированы в различных опухолях. Например, мутация, в которой аминокислота валин замещена глутаминовой кислотой в положении 600 (V600E), обнаружен во многих раковых клетках. Известно, что BRAF, обладающий мутацией V600E, всегда активирует нисходящий сигнальный путь и вызывает рост клеток без внеклеточной стимуляции.The BRAF gene is a gene encoding a type of serine-threonine kinase constituting the RAS-RAF-MAPK pathway. Mutations in the BRAF gene have been reported in various tumors. For example, a mutation in which the amino acid valine is replaced by glutamic acid at position 600 (V600E) has been found in many cancer cells. It is known that BRAF with the V600E mutation always activates the downstream signaling pathway and induces cell growth without extracellular stimulation.

Например, ген BRAF, имеющий мутацию V600E, обнаруживается при многих колоректальных раках (от 5 до 15%) и меланоме (около 60%). Отметим, что при многих раках, таких как рак поджелудочной железы и колоректальный рак, с высокой частотой обнаруживаются мутации в гене KRAS. Белок KRAS представляет собой G-белки, локально присутствующие на внутренней поверхности клеточной мембраны. RAS, такие как KRAS, активируют RAF, такие как CRAF и BRAF, RAF последовательно активирует MEK, и MEK активирует MAPK, тем самым формируя каскад (Непатентная литература 1 и 2). Редкий случай включает мутацию BRAF и мутацию KRAS, поскольку мутация BRAF и мутация KRAS находятся во взаимоисключающей связи (Непатентная литература 3).For example, the BRAF gene with the V600E mutation is found in many colorectal cancers (5 to 15%) and melanoma (about 60%). Note that in many cancers, such as pancreatic cancer and colorectal cancer, mutations in the KRAS gene are found with a high frequency. The KRAS protein is a G-protein that is locally present on the inner surface of the cell membrane. RASs like KRAS activate RAFs like CRAF and BRAF, RAF sequentially activates MEK, and MEK activates MAPK, thereby forming a cascade (Non-Patent Literatures 1 and 2). A rare case includes a BRAF mutation and a KRAS mutation because the BRAF mutation and the KRAS mutation are mutually exclusive (Non-Patent Literature 3).

В настоящее время при раках с BRAF, имеющих мутацию V600E, считается эффективной терапия ингибитором против BRAF, имеющих мутацию V600E. Вемурафениб (PLX4032) и PLX4720 известны как такие ингибиторы. Однако раковые клетки могут приобретать устойчивость к этим ингибиторам при их непрерывном введении, что делает терапевтические эффекты ограниченными. Таким образом, для раковых клеток, имеющих мутацию в гене BRAF, востребованы более эффективные агенты, индуцирующие гибель клеток, и агенты, подавляющие рост, замещающие эти ингибиторы.Currently, in cancers with BRAF with the V600E mutation, it is considered effective therapy with an inhibitor against BRAF with the V600E mutation. Vemurafenib (PLX4032) and PLX4720 are known to be such inhibitors. However, cancer cells can acquire resistance to these inhibitors when administered continuously, which makes therapeutic effects limited. Thus, for cancer cells with a mutation in the BRAF gene, more effective agents that induce cell death and agents that suppress growth that replace these inhibitors are in demand.

Глутатион-S-трансфераза (GST), один из ферментов, катализирующих конъюгацию глутатиона, известен как фермент, конъюгирующий вещество, такое как лекарственное средство с глутатионом (GSH), в вещество на водной основе. GST, на основании аминокислотной последовательности, классифицируется на 6 типов изоферментов: α, μ, ω, π, θ и ξ. Из них, экспрессия GST-π (глутатион S-трансферазы пи, также называемая GSTP1), в частности, возрастает в различных раковых клетках и, как указывается, является возможным фактором устойчивости к некоторым противораковым агентам. На самом деле известно, что, когда антисмысловой ДНК или GST-π ингибитору против GST-π разрешено воздействовать на лекарственно-устойчивую систему раковых клеток, сверхэкспрессирующую GST-π, резистентность к лекарственному средству подавляется (Непатентная литература 4-6). Кроме того, в недавнем докладе, когда siРНК против GST-π разрешено воздействовать на GST-сверхэкспрессирующую андроген-независимую линию клеток рака предстательной железы, ее рост подавляется и апоптоз увеличивается (Непатентная литература 7).Glutathione S-transferase (GST), one of the enzymes that catalyzes the conjugation of glutathione, is known to conjugate a substance such as a glutathione drug (GSH) into a water-based substance. GST, based on amino acid sequence, is classified into 6 types of isoenzymes: α, μ, ω, π, θ, and ξ. Of these, the expression of GST-π (glutathione S-transferase pi, also called GSTP1), in particular, is increased in various cancer cells and, as indicated, is a possible factor of resistance to some anti-cancer agents. In fact, it is known that when an antisense DNA or GST-π inhibitor against GST-π is allowed to target a drug-resistant cancer cell system overexpressing GST-π, drug resistance is suppressed (Non-Patent Literature 4-6). In addition, in a recent report, when anti-GST-π siRNAs are allowed to target a GST-overexpressing androgen-independent prostate cancer cell line, its growth is suppressed and apoptosis is increased (Non-Patent Literature 7).

Кроме того, известно, что GST-π образует комплекс с c-Jun-N-терминальной киназой (JNK) и ингибирует активность JNK (Непатентная литература 8). Кроме того, известно, что GST-π участвует в S-глутатионилировании белков, связанном с реакциями клеточного стресса (Непатентная литература 9). Кроме того, GST-π, как известно, способствует защитному действию при гибели клеток, вызванной активными формами кислорода (ROS) (Непатентная литература 10). Как описано выше, подразумевается, что GST-π среди GST имеет различные особенности и функции.In addition, GST-π is known to complex with c-Jun-N-terminal kinase (JNK) and inhibit JNK activity (Non-Patent Literature 8). In addition, GST-π is known to be involved in S-glutathionylation of proteins associated with cellular stress responses (Non-Patent Literature 9). In addition, GST-π is known to promote a protective effect against cell death induced by reactive oxygen species (ROS) (Non-Patent Literature 10). As described above, the GST-π is understood to have various features and functions among the GSTs.

Сообщается, что, когда siРНК против GST-π разрешено воздействовать на систему раковых клеток, имеющую мутацию KRAS, активация Akt подавляется и аутофагия увеличивается, но индукция апоптоза примерно умеренная (Непатентная литература 11). В патентной литературе 1 раскрывается, что апоптоз раковых клеток можно индуцировать использованием лекарственного средства, подавляющего GST-π, и ингибитора аутофагии, такого как 3-метиладенин в качестве активных компонентов. Патентная литература 2 дополнительно раскрывает, что, когда одновременно ингибируется экспрессия GST-π и Akt, клеточный рост подавляется и индуцируется гибель клеток, и аутофагия, индуцированная ингибированием экспрессии GST-π, заметно подавляется одновременным ингибированием экспрессии Akt и тому подобное.It is reported that when the anti-GST-π siRNA is allowed to affect the cancer cell system having the KRAS mutation, Akt activation is suppressed and autophagy is increased, but the induction of apoptosis is approximately moderate (Non-Patent Literature 11). Patent Literature 1 discloses that apoptosis of cancer cells can be induced by using a GST-π suppressing drug and an autophagy inhibitor such as 3-methyladenine as active ingredients. Patent Literature 2 further discloses that when GST-π and Akt expression is simultaneously inhibited, cell growth is suppressed and cell death is induced, and autophagy induced by inhibition of GST-π expression is markedly suppressed by simultaneous inhibition of Akt expression and the like.

Однако в клетке, имеющей мутацию в гене BRAF, описанной выше, не обнаружено взаимосвязи между экспрессией GST-π и клеточным ростом или гибелью клеток, или роли GST-π в сигнальной трансдукции.However, in a cell having a mutation in the BRAF gene described above, no relationship was found between GST-π expression and cell growth or cell death, or a role for GST-π in signal transduction.

Список цитированияCitation list

Патентная литератураPatent Literature

Патентная литература 1: WO2012/176282Patent Literature 1: WO2012 / 176282

Патентная литература 2: WO2014/098210Patent Literature 2: WO2014 / 098210

Непатентная литератураNon-patent literature

Непатентная литература 1: Curr Top Microbiol Immunol. 2012; 355: 83-98Non-Patent Literature 1: Curr Top Microbiol Immunol. 2012; 355: 83-98

Непатентная литература 2: Curr Opin Pharmacol. 2008 Aug; 8(4): 419-26Non-Patent Literature 2: Curr Opin Pharmacol. 2008 Aug; 8 (4): 419-26

Непатентная литература 3: British Journal of Cancer (2013) 108, 1757-1764Non-Patent Literature 3: British Journal of Cancer (2013) 108, 1757-1764

Непатентная литература 4: Takahashi and Niitsu, Gan To Kagaku Ryoho. 1994; 21(7): 945-51Non-Patent Literature 4: Takahashi and Niitsu, Gan To Kagaku Ryoho. 1994; 21 (7): 945-51

Непатентная литература 5: Ban et al., Cancer Res. 1996; 56(15): 3577-82Non-patent Literature 5: Ban et al., Cancer Res. 1996; 56 (15): 3577-82

Непатентная литература 6: Nakajima et al., J Pharmacol Exp Ther. 2003; 306(3): 861-9Non-Patent Literature 6: Nakajima et al., J Pharmacol Exp Ther. 2003; 306 (3): 861-9

Непатентная литература 7: Hokaiwado et al., Carcinogenesis. 2008; 29(6): 1134-8Non-patent Literature 7: Hokaiwado et al., Carcinogenesis. 2008; 29 (6): 1134-8

Непатентная литература 8: Adler et. al, EMBO J. 1999, 18, 1321-1334Non-patent Literature 8: Adler et. al, EMBO J. 1999, 18, 1321-1334

Непатентная литература 9: Townsend, et.al, J. Biol. Chem. 2009, 284, 436-445Non-Patent Literature 9: Townsend, et al, J. Biol. Chem. 2009, 284, 436-445

Непатентная литература 10: Yin et.al, Cancer Res. 2000 60, 4053-4057Non-Patent Literature 10: Yin et al, Cancer Res. 2000 60, 4053-4057

Непатентная литература 11: Nishita et al., AACR 102nd Annual Meeting, Abstract No. 1065Non-patent Literature 11: Nishita et al., AACR 102nd Annual Meeting, Abstract No. 1065

Сущность настоящего изобретенияThe essence of the present invention

Техническая задачаTechnical challenge

В сложившейся ситуации, настоящее изобретение имеет целью предоставить агент, обладающий действием, индуцирующим клеточную гибель, и/или действием, подавляющим рост для клетки, имеющей мутацию в гене BRAF, предоставить фармацевтическую композицию для терапии заболевания, вызванного дефектом роста клетки, и предоставить способ скрининга агента, индуцирующего гибель клеток, и/или агента, подавляющего клеточный рост.In this situation, the present invention aims to provide an agent having a cell death inducing and / or growth inhibitory action for a cell having a mutation in the BRAF gene, to provide a pharmaceutical composition for the treatment of a disease caused by a cell growth defect, and to provide a screening method a cell death inducing agent and / or a cell growth inhibitory agent.

Решение задачиThe solution of the problem

Авторы настоящего изобретения провели подробные исследования с учетом вышеуказанной цели и обнаружили, что рост клеток интенсивно подавляется, когда GST-π подавляется в клетке, имеющей мутацию в гене BRAF, и рост клеток также интенсивно подавляется, когда GST-π подавляется даже в клетке, имеющей мутацию гена BRAF и устойчивой к традиционно известным ингибиторам BRAF, в результате чего было выполнено настоящее изобретение. Настоящее изобретение включает следующее.The inventors of the present invention conducted detailed studies with the above objective in mind, and found that cell growth is intensely suppressed when GST-π is suppressed in a cell having a mutation in the BRAF gene, and cell growth is also intensely suppressed when GST-π is suppressed even in a cell having a BRAF gene mutation. mutation of the BRAF gene and resistant to conventionally known BRAF inhibitors, as a result of which the present invention has been completed. The present invention includes the following.

(1) Агент, индуцирующий клеточную гибель для клетки, имеющей мутацию в гене BRAF, включающий лекарственное средство, подавляющее GST-π, в качестве активного компонента.(1) A cell death inducing agent for a cell having a mutation in the BRAF gene, including a GST-π suppressing drug as an active ingredient.

(2) Агент, подавляющий клеточный рост для клетки, имеющей мутацию в гене BRAF, включающий лекарственное средство, подавляющее GST-π, в качестве активного компонента.(2) A cell growth inhibiting agent for a cell having a mutation in the BRAF gene, including a GST-π inhibiting drug as an active ingredient.

(3) Агент по (1) или (2), где мутация представляет собой мутацию V600E.(3) The agent according to (1) or (2), wherein the mutation is a V600E mutation.

(4) Агент по (1) или (2), где клетка, имеющая мутацию в гене BRAF, представляет собой клетку, устойчивую к ингибитору BRAF.(4) The agent according to (1) or (2), wherein the cell having a mutation in the BRAF gene is a BRAF inhibitor resistant cell.

(5) Агент по (1) или (2), где лекарственное средство представляет собой вещество, выбранное из группы, состоящей из молекул РНК-интерференции, рибозимов, антисмысловых нуклеиновых кислот, ДНК/РНК-химерных полинуклеотидов и векторов, экспрессирующих по меньшей мере одно из них.(5) An agent according to (1) or (2), wherein the drug is a substance selected from the group consisting of RNA interference molecules, ribozymes, antisense nucleic acids, DNA / RNA chimeric polynucleotides and vectors expressing at least one of them.

(6) Агент по (1) или (2), где клетка, имеющая мутацию в гене BRAF, представляет собой раковую клетку, высоко экспрессирующую GST-π.(6) The agent according to (1) or (2), wherein the cell having a mutation in the BRAF gene is a cancer cell highly expressing GST-π.

(7) Фармацевтическая композиция для терапии заболевания, вызванного дефектом роста клетки, имеющей мутацию в гене BRAF, содержащая агент по любому из вышеуказанных (1)-(6).(7) A pharmaceutical composition for treating a disease caused by a growth defect of a cell having a mutation in the BRAF gene, comprising an agent according to any of the above (1) to (6).

(8) Фармацевтическая композиция по (7), где заболевание представляет собой рак.(8) The pharmaceutical composition according to (7), wherein the disease is cancer.

(9) Фармацевтическая композиция по (8), где рак представляет собой рак, высоко экспрессирующий GST-π.(9) The pharmaceutical composition according to (8), wherein the cancer is a cancer highly expressing GST-π.

(10) Фармацевтическая композиция по (8), где раком является колоректальный рак или меланома.(10) The pharmaceutical composition according to (8), wherein the cancer is colorectal cancer or melanoma.

(11) Способ скрининга агента, индуцирующего клеточную гибель, и/или агента, подавляющего клеточный рост для клетки, имеющей мутацию в гене BRAF, включающий выбор лекарственного средства, подавляющего GST-π.(11) A method for screening a cell death inducing agent and / or a cell growth inhibiting agent for a cell having a mutation in the BRAF gene, comprising selecting a GST-π inhibiting drug.

(12) Способ для скрининга по (11), включающий этап контактирования тестируемого вещества с раковой клеткой, этап измерения уровня экспрессии GST-π в клетке и этап выбора тестируемого вещества в качестве лекарственного средства, подавляющего GST-π, когда уровень экспрессии снижен по сравнению со случаем, измеренным в отсутствие тестируемого вещества.(12) The method for screening according to (11), comprising the step of contacting a test substance with a cancer cell, the step of measuring the expression level of GST-π in the cell, and the step of selecting the test substance as a drug that suppresses GST-π when the expression level is reduced compared to with a case measured in the absence of a test substance.

Настоящее описание охватывает раскрытое содержание, описанное в патентной заявке JP No. 2015-84286 и в патентной заявке JP No. 2016-78710, которые являются основой приоритета настоящей заявки.The present description covers the disclosed content described in JP Patent Application No. 2015-84286 and JP Patent Application No. 2016-78710, which are the basis of the priority of this application.

Полезные эффекты настоящего изобретенияBeneficial Effects of the Present Invention

В соответствии с агентом, индуцирующим гибель клеток, по настоящему изобретению, гибель клеток может быть индуцирована очень интенсивно для клетки, имеющей мутацию в гене BRAF. Соответственно, агент, индуцирующий гибель клеток, по настоящему изобретению, может показывать очень высокую эффективность в качестве фармацевтической композиции для терапии заболевания, вызванного дефектом роста клетки, имеющей мутацию в гене BRAF.According to the cell death inducing agent of the present invention, cell death can be induced very intensely for a cell having a mutation in the BRAF gene. Accordingly, the cell death inducing agent of the present invention can be very effective as a pharmaceutical composition for the treatment of a disease caused by a growth defect of a cell having a mutation in the BRAF gene.

Кроме того, в соответствии с агентом, подавляющим клеточный рост, по настоящему изобретению клеточный рост может быть подавлен очень интенсивно для клетки, имеющей мутацию в гене BRAF. Соответственно, агент подавления роста клеток по настоящему изобретению может показывать очень высокую эффективность в качестве фармацевтической композиции для терапии заболевания, вызванного дефектом роста клетки, имеющей мутацию в гене BRAF.In addition, according to the cell growth suppressing agent of the present invention, cell growth can be suppressed very intensely for a cell having a mutation in the BRAF gene. Accordingly, the cell growth inhibitory agent of the present invention can be very effective as a pharmaceutical composition for the treatment of a disease caused by a growth defect of a cell having a mutation in the BRAF gene.

Кроме того, согласно способу скрининга в соответствии с настоящим изобретением можно выбрать лекарственное средство для индуцирования гибели клеток и/или для очень интенсивного подавления клеточного роста для клетки, имеющей мутацию в гене BRAF.In addition, according to the screening method according to the present invention, a drug can be selected to induce cell death and / or to suppress cell growth very vigorously for a cell having a mutation in the BRAF gene.

Краткое описание чертежейBrief Description of Drawings

[Фигура 1] Фиг. 1 представляет собой характерную диаграмму, показывающую результаты исследования эффекта подавления роста клеток, вызванного нокдауном GST-π в клеточной линии колоректального рака, имеющей мутацию в гене BRAF (результаты подсчета числа клеток, результаты вестерн-блоттинга).[Figure 1] FIG. 1 is a representative graph showing the results of a study of the inhibitory effect of cell growth caused by knockdown of GST-π in a colorectal cancer cell line having a mutation in the BRAF gene (cell count, Western blot).

[Фигура 2] Фиг. 2 представляет собой характерные диаграммы, показывающие результаты исследования эффекта подавления роста клеток, вызванного нокдауном GST-π в линии клеток меланомы, имеющей мутацию в гене BRAF (результаты подсчета числа клеток, результаты вестерн-блоттинга).[Figure 2] FIG. 2 is a representative diagram showing the results of a study of the inhibitory effect of cell growth caused by knockdown of GST-π in a melanoma cell line having a mutation in the BRAF gene (cell count, Western blot).

[Фигура 3] Фиг. 3 представляет собой характерную диаграмму, показывающую результаты исследования эффекта подавления клеточного роста, когда GST-π siРНК и ингибитор BRAF использовали в комбинации в линии клеток колоректального рака, имеющей мутацию в гене BRAF.[Figure 3] FIG. 3 is a representative diagram showing the results of a study of the effect of inhibiting cell growth when GST-π siRNA and a BRAF inhibitor were used in combination in a colorectal cancer cell line having a mutation in the BRAF gene.

[Фигура 4] Фиг. 4 представляют собой характерные диаграммы, показывающие результаты исследования эффектов подавления клеточного роста, когда GST-π siРНК и ингибитор BRAF использовали в комбинации в линии клеток меланомы, имеющей мутацию в гене BRAF.[Figure 4] FIG. 4 are representative diagrams showing the results of investigating the effects of cell growth suppression when GST-π siRNA and a BRAF inhibitor were used in combination in a melanoma cell line having a mutation in the BRAF gene.

[Фигура 5] Фиг. 5 представляет собой характерную диаграмму, показывающую результаты исследования эффекта подавления клеточного роста, вызванного нокдауном GST-π в линии клеток меланомы, имеющей мутацию в гене BRAF и резистентной к ингибитору BRAF.[Figure 5] FIG. 5 is a representative graph showing the results of a study of the inhibitory effect of cell growth caused by knockdown of GST-π in a melanoma cell line having a mutation in the BRAF gene and resistant to a BRAF inhibitor.

[Фигура 6] Фиг. 6 представляет собой фотографии электрофореза, показывающие результаты анализа вестерн-блоттинга экспрессии GST-π, когда GST-π был нокаутирован в клеточной линии меланомы, имеющей мутацию в гене BRAF и устойчивую к ингибитору BRAF.[Figure 6] FIG. 6 is an electrophoresis photograph showing the results of a Western blot analysis of GST-π expression when GST-π was knocked out in a melanoma cell line having a mutation in the BRAF gene and resistant to a BRAF inhibitor.

Описание вариантов осуществленияDescription of embodiments

Агент, индуцирующий клеточную гибель, и агент, подавляющий клеточный рост по настоящему изобретению, содержит лекарственное средство, подавляющее GST-π, в качестве активного компонента. Агент, индуцирующий клеточную гибель, и агент, подавляющий клеточный рост по настоящему изобретению, демонстрируют эффект индуцирования клеточной гибели и эффект подавления клеточного роста для клетки, имеющей мутацию в гене BRAF.The cell death inducing agent and the cell growth inhibiting agent of the present invention contains a GST-π inhibiting drug as an active ingredient. The cell death inducing agent and the cell growth inhibiting agent of the present invention exhibit a cell death inducing effect and a cell growth inhibiting effect for a cell having a mutation in the BRAF gene.

GST-π, при использовании в настоящем описании, относится к ферменту, который кодируется геномом GSTP1, и катализирует конъюгацию глутатиона. GST-π присутствует у различных животных, включая человека, и известна информация о его последовательности (например, человек: NM_000852 (NP_000843), крыса: NM_012577 (NP_036709), мышь: NM_013541 (NP_038569) и т. д. Цифры представляют собой номера базы данных NCBI, цифры вне круглых скобок являются нуклеотидными последовательностями, а числа в круглых скобках являются аминокислотными последовательностями). В качестве примера, нуклеотидная последовательность в кодирующей области гена GST-π человека, зарегистрированная в базе данных, представлена в SEQ ID NO:1 и аминокислотная последовательность в белке GST-π человека, кодируемом геном GST-π человека, представлена в SEQ ID NO:2.GST-π, as used herein, refers to an enzyme that is encoded by the GSTP1 genome and catalyzes the conjugation of glutathione. GST-π is present in various animals, including humans, and its sequence information is known (for example, human: NM_000852 (NP_000843), rat: NM_012577 (NP_036709), mouse: NM_013541 (NP_038569), etc. The numbers represent base numbers of the NCBI data, the numbers outside the parentheses are the nucleotide sequences and the numbers in the parentheses are the amino acid sequences). By way of example, the nucleotide sequence in the coding region of the human GST-π gene listed in the database is shown in SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence in the human GST-π protein encoded by the human GST-π gene is shown in SEQ ID NO: 2.

Следует отметить, что GST-π может быть определен специфической нуклеотидной последовательностью и аминокислотной последовательностью, как описано выше, но необходимо учитывать мутацию в нуклеотидной последовательности и аминокислотной последовательности (включая полиморфизмы), которые, возможно, должны быть рассмотрены вызванными между биологическими индивидуумами. А именно, GST-π не ограничивается белками, имеющими идентичную последовательность с аминокислотной последовательностью, зарегистрированной в базе данных, но включает в себя те, которые имеют равную функцию с GST-π и имеют последовательность с 1 или 2, или более, обычно 1 или несколько, для, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 различных аминокислот из вышеуказанной последовательности. Кроме того, GST-π также включает те, которые состоят из нуклеотидной последовательности, имеющую 70% или более, 80% или более, 90% или более, 95% или более, или 97% или более, идентичность с указанной специфической нуклеотидной последовательностью, и кодирующий белок, имеющий равную функцию с GST-π. Следует отметить, что специфическая функция GST-π, как описано выше, относится к активности фермента, катализирующего конъюгацию глутатиона.It should be noted that GST-π can be determined by a specific nucleotide sequence and amino acid sequence as described above, but it is necessary to consider a mutation in the nucleotide sequence and amino acid sequence (including polymorphisms), which may need to be considered caused between biological individuals. Namely, GST-π is not limited to proteins having an identical sequence to the amino acid sequence recorded in the database, but includes those having an equal function to GST-π and having a sequence with 1 or 2 or more, usually 1 or several, for, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 different amino acids from the above sequence. In addition, GST-π also includes those consisting of a nucleotide sequence having 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, or 97% or more identity with the specified specific nucleotide sequence, and a coding protein having equal function with GST-π. It should be noted that the specific function of GST-π, as described above, refers to the activity of an enzyme that catalyzes the conjugation of glutathione.

Следует отметить, что в настоящем описании фразы, такие как «при использовании в настоящем описании», «используемый в настоящем описании», «в настоящем описании» и «описанный в настоящем описании», означают, что последующие описания этих фраз применяются ко всем изобретениям, описанным в настоящем описании, если не указано иное. Кроме того, если не указано иное, все технические термины и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют то же значение, что и те, которые обычно понимаются специалистами в данной области техники. Все патенты, патентные публикации и другие публикации, цитируемые в настоящем документе, должны быть полностью включены в настоящее описание.It should be noted that in the present description, phrases such as "when used in the present description", "used in the present description", "in the present description" and "described in the present description" mean that the following descriptions of these phrases apply to all inventions. described in the present description, unless otherwise indicated. In addition, unless otherwise indicated, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as those commonly understood by those of ordinary skill in the art. All patents, patent publications, and other publications cited in this document are to be incorporated in their entirety in this description.

Примеры «лекарственное средство, подавляющее GST-π», используемые в настоящем описании, включают в себя, но не ограничиваются ими, лекарственные средства, подавляющие продуцирование и/или активность GST-π, и лекарственные средства, способствующие распаду и/или инактивации GST-π. Примеры лекарственных средств, подавляющих продуцирование GST-π включают, но не ограничиваются ими, молекулы РНК-интерференции, рибозимы, антисмысловые нуклеиновые кислоты, ДНК/РНК-химерные полинуклеотиды к ДНК, кодирующей GST-π, и векторы, экспрессирующие их.Examples of "GST-π suppressing drug" used herein include, but are not limited to, drugs that inhibit the production and / or activity of GST-π, and drugs that promote the degradation and / or inactivation of GST- π. Examples of drugs that suppress GST-π production include, but are not limited to, RNA interference molecules, ribozymes, antisense nucleic acids, DNA / RNA chimeric polynucleotides to DNA encoding GST-π, and vectors expressing them.

Кроме того, для лекарственного средства, подавляющего GST-π, могут быть использованы любые соединения, которые действуют на GST-π. Примеры таких пригодных для использования соединений включают органические соединения (аминокислоты, полипептиды или их производные, низкомолекулярные соединения, углеводы и высокомолекулярные соединения) и неорганические соединения. Кроме того, эти соединения могут быть природными или неприродными веществами. Примеры производного полипептида включают модифицированные полипептиды, полученные добавлением модифицирующей группы и вариантных полипептидов, полученных путем изменения аминокислотного остатка. Кроме того, эти соединения могут представлять собой одно соединение или химическую библиотеку, продукты экспрессии библиотеки генов, клеточные экстракты, супернатанты клеточной культуры, продукты ферментации микроорганизмов, экстракты морских организмов и растительные экстракты. А именно, «лекарственное средство, подавляющее GST-π» не ограничивается нуклеиновыми кислотами, такими как молекулы РНК-интерференции, но включает любые соединения.In addition, any compound that acts on GST-π can be used for the GST-π suppressing drug. Examples of such suitable compounds include organic compounds (amino acids, polypeptides or derivatives thereof, low molecular weight compounds, carbohydrates and high molecular weight compounds) and inorganic compounds. In addition, these compounds can be natural or unnatural substances. Examples of the derived polypeptide include modified polypeptides obtained by adding a modifying group and variant polypeptides obtained by altering an amino acid residue. In addition, these compounds can be a single compound or chemical library, gene library expression products, cell extracts, cell culture supernatants, microbial fermentation products, marine extracts, and plant extracts. Namely, the "GST-π suppressing drug" is not limited to nucleic acids such as RNA interference molecules, but includes any compounds.

Конкретные примеры лекарственного средства, подавляющего активность GST-π, включают, но не ограничиваются ими, вещества конъюгации GST-π, такие как глутатион, аналоги глутатиона (например, патентные документы WO 95/08563, WO 96/40205, WO 99/54346 и те, которые описаны в непатентной литературе 4 и т. д.), кетопрофен (непатентная литература 2), индометацин (Hall et al., Cancer Res. 1989; 49(22):6265-8), этакриновая кислота, пирипрост (Tew et al., Cancer Res. 1988;48 (13):3622-), анти-GST-π-антитела и доминантно-негативные мутанты GST-π. Эти препараты являются коммерчески доступными или могут быть соответствующим образом произведены на основе известных технологий.Specific examples of a drug that inhibit GST-π activity include, but are not limited to, GST-π conjugating agents such as glutathione, glutathione analogs (for example, patent documents WO 95/08563, WO 96/40205, WO 99/54346 and those described in Non-Patent Literature 4, etc.), ketoprofen (Non-Patent Literature 2), indomethacin (Hall et al., Cancer Res. 1989; 49 (22): 6265-8), ethacrynic acid, piriprost (Tew et al., Cancer Res. 1988; 48 (13): 3622-), anti-GST-π antibodies and dominant negative GST-π mutants. These drugs are commercially available or can be suitably manufactured using known technologies.

Лекарственное средство, подавляющие продуцирование или активность GST-π, предпочтительно представляет собой молекулы РНК-интерференции, рибозимы, антисмысловые нуклеиновые кислоты, ДНК/РНК-химерные полинуклеотиды к ДНК, кодирующей GST-π, или векторы, экспрессирующие их из-за высокой специфичности и низкой вероятности побочных эффектов.A drug that inhibits the production or activity of GST-π is preferably RNA interference molecules, ribozymes, antisense nucleic acids, DNA / RNA chimeric polynucleotides to DNA encoding GST-π, or vectors expressing them due to their high specificity and low likelihood of side effects.

Подавление GST-π может быть определено на основании экспрессии GST-π или активности, подавленной в клетке, по сравнению со случаем, когда ингибитору GST-π не разрешалось воздействовать. Экспрессия GST-π может быть оценена с помощью любых известных методов, таких как, без каких-либо ограничений, метод иммунной преципитации с использованием анти-GST-π антител, ИФА, ELISA, IRA, IRMA, метод вестерн-блоттинг, иммуногистохимический метод, иммуноцитохимический метод, метод проточной цитометрии, различные методы гибридизации, метод назерн-блоттинг, метод саузерн-блоттинг и различные методы ПЦР, в которых нуклеиновая кислота способна специфически гибридизоваться с нуклеиновой кислотой, кодирующей GST-π, или ее уникальным фрагментом, или транскриптом (например, мРНК), или сплайсированным продуктом нуклеиновой кислоты.Suppression of GST-π can be determined based on the expression of GST-π or activity suppressed in the cell as compared to the case where the GST-π inhibitor was not allowed to act. Expression of GST-π can be assessed using any known methods, such as, without any limitation, immune precipitation method using anti-GST-π antibodies, ELISA, ELISA, IRA, IRMA, Western blot method, immunohistochemical method, immunocytochemical method, flow cytometry method, various hybridization methods, Northern blotting method, Southern blotting method and various PCR methods in which a nucleic acid is capable of specifically hybridizing with a nucleic acid encoding GST-π, or its unique fragment, or transcript (for example , mRNA), or a spliced nucleic acid product.

Активность GST-π может быть оценена путем анализа известных активностей GST-π, таких как, без каких-либо ограничений, связывание с белками, такими как Raf-1 (в частности, фосфорилированный Raf-1) и EGFR (в частности, фосфорилированный EGFR) любыми известными способами, такими как метод иммунной преципитации, метод вестерн-блоттинг, масс-спектрометрия, метод аффинной адсорбции или метод поверхностного плазмонного резонанса (SPR).GST-π activity can be assessed by assaying known GST-π activities such as, without limitation, binding to proteins such as Raf-1 (in particular, phosphorylated Raf-1) and EGFR (in particular, phosphorylated EGFR ) by any known methods such as immune precipitation method, Western blotting method, mass spectrometry, affinity adsorption method or surface plasmon resonance (SPR) method.

Молекула РНК-интерференции при использовании в настоящем описании относится к любым молекулам, представляющим РНК-интерференцию, и включает в себя, но не ограничиваясь ими, двухцепочечные РНК, такие как siРНК (малая интерферирующая РНК), miРНК (микроРНК), shРНК (малая РНК, образующая шпильки), ddРНК (ДНК-направленная РНК), piРНК (Piwi-взаимодействующая РНК) и rasiРНК (ассоциированная с повторами siРНК), и их варианты. Эти молекулы РНК-интерференции коммерчески доступны или могут быть сконструированы и изготовлены на основе известной информации о последовательности, а именно, нуклеотидной последовательности, как указано в SEQ ID NO:1 и/или аминокислотной последовательности, как указано в SEQ ID NO:2. Кроме того, антисмысловая нуклеиновая кислота при использовании в настоящем описании включает РНК, ДНК, ПНК и их комплексы.RNA interference molecule, as used herein, refers to any molecules presenting RNA interference and includes, but not limited to, double-stranded RNAs such as siRNA (small interfering RNA), miRNA (microRNA), shRNA (small RNA forming hairpins), ddRNA (DNA directed RNA), piRNA (Piwi interacting RNA) and rasiRNA (associated with siRNA repeats), and their variants. These RNA interference molecules are commercially available or can be designed and made based on known sequence information, namely, the nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 1 and / or the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 2. In addition, antisense nucleic acid as used herein includes RNA, DNA, PNA, and complexes thereof.

ДНК/РНК-химерный полинуклеотид при использовании в настоящем описании включает в себя, но не ограничивается этим, двухцепочечные полинуклеотиды, состоящие из ДНК и РНК, ингибирующие экспрессию гена-мишени, как описано в патентной публикации JP (Kokai) No. 2003-219893 A.A DNA / RNA chimeric polynucleotide as used herein includes, but is not limited to, double-stranded polynucleotides composed of DNA and RNA that inhibit the expression of a target gene, as described in JP (Kokai) Patent Publication No. 2003-219893 A.

Количество активного компонента, добавляемого к агенту или композиции по настоящему изобретению, может представлять собой количество, индуцирующее гибель клеток, такую как апоптоз, и/или подавление роста клеток при введении агента или композиции. Кроме того, предпочтительнее количество, не вызывающее вредных эффектов, которые превосходят преимущества, получаемые от введения. Такое количество известно или соответствующим образом определяют с помощью анализа in vitro с использованием культивируемых клеток или анализа на модельном животном, таком как мышь, крыса, собака или свинья, и эти методы испытаний хорошо известны специалистам в данной области техники. Индукцию апоптоза можно оценить с помощью различных известных методов, используя обнаружение признака, характерного для апоптоза, такого как фрагментация ДНК, связывание аннексина V с клеточной мембраной, изменения потенциала на митохондриальной мембране или активация каспазы, или терминальное дезоксиуридиновое мечение концов (TUNEL). Кроме того, подавление роста клеток может быть оценено с помощью различных известных методов, таких как подсчет количества жизнеспособных клеток в течение времени, измерение размера, объема и массы опухоли, измерение количества синтеза ДНК, метод WST-1, BrdU (бромдеоксиуридин) или метод включения 3H-тимидина. Количество добавляемого активного компонента варьируется в зависимости от лекарственной формы агента и композиции. Например, когда несколько единиц композиции используют для однократного введения, количество активного компонента, добавляемого к единичной композиции, может быть одним из нескольких равных единиц количества активного компонента, необходимого для одного введения. Такое количество, которое должно быть добавлено, может быть соответствующим образом отрегулировано специалистами в данной области техники.The amount of active ingredient added to the agent or composition of the present invention can be an amount that induces cell death such as apoptosis and / or suppression of cell growth when the agent or composition is administered. In addition, an amount that does not cause harmful effects is preferable, which outweighs the benefits obtained from the administration. This amount is known or appropriately determined by an in vitro assay using cultured cells or an assay in a model animal such as a mouse, rat, dog or pig, and these test methods are well known to those skilled in the art. Induction of apoptosis can be assessed by various known methods using the detection of a feature characteristic of apoptosis, such as DNA fragmentation, binding of annexin V to the cell membrane, changes in mitochondrial membrane potential or caspase activation, or terminal deoxyuridine end-labeling (TUNEL). In addition, the inhibition of cell growth can be assessed using various known methods such as counting the number of viable cells over time, measuring the size, volume and mass of the tumor, measuring the amount of DNA synthesis, WST-1 method, BrdU (bromodeoxyuridine) method or inclusion method 3H-thymidine. The amount of active ingredient added will vary depending on the dosage form of the agent and the composition. For example, when multiple composition units are used for a single administration, the amount of active ingredient added to a single composition may be one of several equal units of the amount of active ingredient required for a single administration. The amount to be added can be appropriately adjusted by those skilled in the art.

Кроме того, добавление лекарственного средства, подавляющего GST-π, в качестве активного компонента, позволяет производить агент, индуцирующий гибель клеток, агент, подавляющий рост клеток, композицию, вызывающую клеточную гибель, или композицию, подавляющую клеточный рост.In addition, the addition of a GST-π inhibiting drug as an active ingredient allows the production of a cell death inducing agent, a cell growth inhibiting agent, a cell death inducing composition or a cell growth inhibiting composition.

Кроме того, лекарственное средство, подавляющее GST-π, используется для индукции гибели клеток или подавления клеточного роста. К тому же, может быть предусмотрен способ индуцирования гибели клеток или способ подавления роста клеток, включающий введение эффективного количества лекарственного средства, подавляющего GST-π.In addition, a drug that inhibits GST-π is used to induce cell death or suppress cell growth. In addition, a method for inducing cell death or a method for inhibiting cell growth may be provided, comprising administering an effective amount of a GST-π suppressing drug.

Следует отметить, что оба вышеуказанных метода индукции гибели клеток, такие как апоптоз или подавление роста клеток, могут быть in vitro или in vivo методами. Кроме того, лекарственное средство для этих методов описано выше, и эффективным количеством лекарственного средства может быть количество, которое индуцирует гибель клеток или подавляет клеточный рост в клетке, в которую вводится лекарственное средство. Кроме того, предпочтительнее количество, не вызывающее вредных эффектов, которые превосходят преимущества, получаемые от введения. Такое количество известно или может быть определено соответствующим образом, например, с помощью анализа in vitro с использованием культивируемых клеток и тому подобного, и метод анализа хорошо известен специалистам в данной области техники. Индукция гибели клеток или подавление роста клеток могут быть оценены различными известными методами, включая описанные выше. Вышеуказанное эффективное количество, когда лекарственное средство вводится в определенную группу раковых клеток, не обязательно должно быть количеством, которое всегда вызывает гибель клеток или подавление роста для всех клеток в клеточной группе. Например, указанное выше эффективное количество может быть количеством, которое вызывает апоптоз или подавление роста до 1% или более, 2% или более, 3% или более, 4% или более, 5% или более, 6% или более, 8% или более, 10% или более, 12% или более, 15% или более, 20% или более, или более 25%, или более клеток в вышеуказанной группе клеток.It should be noted that both of the above methods for inducing cell death, such as apoptosis or suppression of cell growth, can be in vitro or in vivo methods. In addition, the drug for these methods is described above, and the effective amount of the drug may be an amount that induces cell death or suppresses cell growth in a cell into which the drug is administered. In addition, an amount that does not cause harmful effects is preferable, which outweighs the benefits obtained from the administration. Such an amount is known or can be determined appropriately, for example, by an in vitro assay using cultured cells and the like, and the assay method is well known to those skilled in the art. The induction of cell death or inhibition of cell growth can be assessed by various known methods, including those described above. The above effective amount, when a drug is administered to a specific group of cancer cells, need not be an amount that always causes cell death or growth suppression for all cells in the cell group. For example, the above effective amount may be an amount that induces apoptosis or growth inhibition up to 1% or more, 2% or more, 3% or more, 4% or more, 5% or more, 6% or more, 8% or more, 10% or more, 12% or more, 15% or more, 20% or more, or more than 25% or more cells in the above group of cells.

Агент, индуцирующий гибель клеток, и агент, подавляющий клеточный рост по настоящему изобретению, действуют на клетку, имеющую мутацию в гене BRAF. Клетка, имеющая мутацию в гене BRAF, представляет собой клетку, демонстрирующую дефект роста из-за мутации в гене BRAF (как правило, раковые клетки).The cell death inducing agent and the cell growth inhibiting agent of the present invention act on a cell having a mutation in the BRAF gene. A cell with a mutation in the BRAF gene is a cell showing a growth defect due to a mutation in the BRAF gene (usually cancer cells).

В частности, агент, индуцирующий гибель клеток, и агент, подавляющий клеточный рост по настоящему изобретению, предпочтительно, применяют к клетке, высоко экспрессирующей GST-π (как правило, клетке рака, высоко экспрессирующей GST-π) среди клеток, демонстрирующих дефект роста из-за мутации в гене BRAF. Используемая здесь экспрессирующая GST-π раковая клетка означает клетку, имеющую значительно более высокий уровень экспрессии GST-π, по сравнению с нормальной клеткой, среди клеток, имеющих мутацию в гене BRAF, и демонстрирующая дефект клеточного роста. Следует отметить, что уровень экспрессии GST-π можно измерить в соответствии с обычным методом, таким как ОТ-ПЦР или микрочип.In particular, the cell death inducing agent and the cell growth suppressing agent of the present invention are preferably applied to a cell highly expressing GST-π (typically a cancer cell highly expressing GST-π) among cells showing a growth defect from - for mutations in the BRAF gene. As used herein, a GST-π expressing cancer cell means a cell having a significantly higher level of GST-π expression as compared to a normal cell among cells having a mutation in the BRAF gene and exhibiting a cell growth defect. It should be noted that the expression level of GST-π can be measured according to a conventional method such as RT-PCR or microchip.

Мутация в гене BRAF означает мутацию, такую как делеция, замещение, добавление, вставка в аминокислотной последовательности BRAF дикого типа и мутацию в участке контроля экспрессии гена BRAF. Следует отметить, что мутация в гене BRAF здесь является так называемой мутацией с приобретением функции. А именно, ген BRAF, имеющий мутацию (иногда называемый мутантным геном BRAF), включает гены, кодирующие мутантный BRAF с повышенной активностью серин-треонин киназы, вызванной мутацией. Кроме того, мутантный ген BRAF также включает те, которые имеют мутацию в участке контроля экспрессии и увеличенный уровень экспрессии по сравнению с геном BRAF дикого типа. А именно, клетка, экспрессирующая мутантный ген BRAF, имеет свойство постоянно поддерживать нисходящий сигнальный путь (например, сигнальный путь к MEK) от BRAF путем экспрессии мутантного BRAF или увеличения уровня экспрессии BRAF.A mutation in the BRAF gene means a mutation such as deletion, substitution, addition, insertion in the amino acid sequence of wild-type BRAF and a mutation in the control region of the BRAF gene. It should be noted that the mutation in the BRAF gene here is a so-called gain-of-function mutation. Namely, the BRAF gene having a mutation (sometimes referred to as a mutant BRAF gene) includes genes encoding a mutant BRAF with increased serine-threonine kinase activity caused by the mutation. In addition, the mutant BRAF gene also includes those having a mutation in the expression control region and an increased expression level compared to the wild-type BRAF gene. Namely, a cell expressing a mutant BRAF gene has the property of constantly maintaining a downstream signaling pathway (eg, a signaling pathway to MEK) from BRAF by expressing mutant BRAF or increasing the level of BRAF expression.

Примеры мутантного гена BRAF включают гены, кодирующие мутантный BRAF, где валин, кодируемый кодоном 600 в гене BRAF дикого типа, замещен глутаминовой кислотой (обозначается как V600E. В дальнейшем упоминается так же), в том числе V600D, V600G, V600K, V600M, V600R, V600L, G469A, G469V, D594N и V600insT (вставка T).Examples of a mutant BRAF gene include genes encoding a mutant BRAF where valine encoded by codon 600 in the wild-type BRAF gene is replaced with glutamic acid (referred to as V600E. Hereinafter referred to as the same), including V600D, V600G, V600K, V600M, V600R , V600L, G469A, G469V, D594N, and V600insT (inset T).

Агент, индуцирующий гибель клеток, и агент, подавляющий клеточный рост по настоящему изобретению, способны эффективно индуцировать гибель клеток или подавлять клеточный рост даже для раковой клетки, имеющей мутацию в гене BRAF, таким образом, эффективны в качестве компонентов фармацевтической композиции для заболевания, вызванного дефектом роста раковой клетки, имеющей мутацию в гене BRAF. Кроме того, лекарственная форма средства, подавляющего GST-π, в качестве активного компонента, позволяет получать фармацевтическую композицию для заболевания, вызванного дефектом роста раковой клетки, имеющей мутацию в гене BRAF. К тому же, болезнь, вызванная дефектом роста клетки, может быть подвергнута лечению и терапии путем введения эффективного количества полученной фармацевтической композиции субъекту, нуждающемуся в этом.The cell death inducing agent and the cell growth inhibiting agent of the present invention are capable of effectively inducing cell death or suppressing cell growth even for a cancer cell having a mutation in the BRAF gene, thus, are effective as components of a pharmaceutical composition for a disease caused by a defect. growth of a cancer cell with a mutation in the BRAF gene. In addition, the dosage form of the GST-π suppressing agent as an active ingredient makes it possible to obtain a pharmaceutical composition for a disease caused by a growth defect in a cancer cell having a mutation in the BRAF gene. In addition, the disease caused by a defect in cell growth can be treated and treated by administering an effective amount of the resulting pharmaceutical composition to a subject in need thereof.

Фармацевтическая композиция является эффективной для лечения причины заболевания, вызванного дефектом роста раковой клетки, имеющей мутацию в гене BRAF. Заболевание, вызванное раковой клеткой, имеющей мутацию в гене BRAF, не ограничено и включает в себя раки, высоко экспрессирующие GST-π, и во многих случаях, раки, имеющие мутацию в гене BRAF, включены в рак, высоко экспрессирующий GST-π.The pharmaceutical composition is effective for treating the cause of a disease caused by a growth defect in a cancer cell having a mutation in the BRAF gene. Disease caused by a cancer cell having a mutation in the BRAF gene is not limited to and includes cancers highly expressing GST-π, and in many cases, cancers having a mutation in the BRAF gene are included in cancers highly expressing GST-π.

Примеры включают, но не ограничиваются ими, саркомы, такие как фибросаркома, злокачественная фиброзная гистиоцитома, липосаркома, рабдомиосаркома, лейомиосаркома, ангиосаркома, саркома Капоши, лимфангиосаркома, синовиальная саркома, хондросаркома и остеосаркома, карциномы, такие как рак глаза, рак щитовидной железы (папиллярный рак), рак оболочек головного мозга, опухоль головного мозга, рак гипофиза, рак слюнных желез, рак головы и шеи, рак молочной железы, рак легких (немелкоклеточный рак), рак пищевода, рак желудка, рак двенадцатиперстной кишки, рак аппендикса, колоректальный рак, рак прямой кишки, рак печени, рак поджелудочной железы, рак желчного пузыря, рак желчного протока, рак анального канала, рак почки, рак мочеточника, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак полового члена, рак яичка, рак матки (рак эндометрия), рак яичников (серозный рак яичников), рак вульвы, рак влагалища и рак кожи (злокачественная меланома), и далее лейкоз и злокачественная лимфома. Следует отметить, что «рак» в настоящем изобретении включает эпителиальную злокачественную опухоль и неэпителиальную злокачественную опухоль. Рак в настоящем изобретении может присутствовать в любой части тела, включая мозг, голову и шею, грудь, конечность, легкие, сердце, вилочковую железу, пищевод, желудок, тонкую кишку (двенадцатиперстную кишку, тощую кишку, подвздошную кишку), толстую кишку (ободочную кишку, слепую кишку, аппендикс, прямую кишку), печень, поджелудочную железу, желчный пузырь, анус, почки, мочеточник, мочевой пузырь, предстательную железу, пенис, яичко, матку, яичник, вульву, влагалище, кожу, поперечнополосатую мышцу, гладкую мышцу, синовиальную мембрану, хрящ, кость, щитовидную железу, надпочечную железу, брюшину, брыжейку, костный мозг, кровь, сосудистую систему, лимфатическую систему, такую как лимфатический узел и лимфатическая жидкость.Examples include, but are not limited to, sarcomas such as fibrosarcoma, malignant fibrous histiocytoma, liposarcoma, rhabdomyosarcoma, leiomyosarcoma, angiosarcoma, Kaposi's sarcoma, lymphangiosarcoma, synovial sarcoma, carcinoma cancer), cancer of the lining of the brain, brain tumor, pituitary cancer, salivary gland cancer, head and neck cancer, breast cancer, lung cancer (non-small cell cancer), esophageal cancer, stomach cancer, duodenal cancer, appendix cancer, colorectal cancer , rectal cancer, liver cancer, pancreatic cancer, gallbladder cancer, bile duct cancer, anal cancer, kidney cancer, ureter cancer, bladder cancer, prostate cancer, penile cancer, testicular cancer, uterine cancer (endometrial cancer ), ovarian cancer (serous ovarian cancer), vulvar cancer, vaginal cancer and skin cancer (malignant melanoma), and then leukemia and malignant lymphoma. It should be noted that "cancer" in the present invention includes epithelial cancer and non-epithelial cancer. The cancer in the present invention can be present in any part of the body, including the brain, head and neck, chest, limb, lungs, heart, thymus, esophagus, stomach, small intestine (duodenum, jejunum, ileum), colon (colon intestine, cecum, appendix, rectum), liver, pancreas, gallbladder, anus, kidneys, ureter, bladder, prostate gland, penis, testicle, uterus, ovary, vulva, vagina, skin, striated muscle, smooth muscle , synovial membrane, cartilage, bone, thyroid, adrenal, peritoneum, mesentery, bone marrow, blood, vascular system, lymphatic system such as lymph node and lymphatic fluid.

В частности, агент, индуцирующий гибель клеток, и агент, подавляющий клеточный рост по настоящему изобретению, может эффективно индуцировать гибель клеток или подавлять клеточный рост даже для клетки, которая приобрела резистентность к ингибитору BRAF, среди клеток, имеющих мутацию в гене BRAF. Соответственно, агент, индуцирующий гибель клеток, или агент, подавляющий клеточный рост по настоящему изобретению, эффективен в качестве компонента фармацевтической композиции для заболевания, вызванного дефектом роста раковой клетки, имеющей мутацию в гене BRAF, и резистентностью к ингибитору BRAF. Кроме того, лекарственная форма средства, подавляющего GST-π, в качестве активного компонента, позволяет получать фармацевтическую композицию для заболевания, вызванного дефектом роста раковой клетки, имеющей мутацию в гене BRAF, и резистентностью к ингибитору BRAF. Кроме того, заболевание, вызванное дефектом роста клеток, можно лечить и подвергать терапии путем введения эффективного количества полученной фармацевтической композиции субъекту, нуждающемуся в этом, то есть пациенту с уменьшенным терапевтическим эффектом ингибитором BRAF.In particular, the cell death inducing agent and the cell growth inhibiting agent of the present invention can effectively induce cell death or suppress cell growth even for a cell that has acquired resistance to a BRAF inhibitor among cells having a mutation in the BRAF gene. Accordingly, a cell death inducing agent or a cell growth suppressing agent of the present invention is effective as a component of a pharmaceutical composition for a disease caused by a growth defect in a cancer cell having a mutation in the BRAF gene and resistance to a BRAF inhibitor. In addition, the dosage form of the GST-π suppressing agent as an active component makes it possible to obtain a pharmaceutical composition for a disease caused by a growth defect in a cancer cell having a mutation in the BRAF gene and resistance to a BRAF inhibitor. In addition, a disease caused by a defect in cell growth can be treated and treated by administering an effective amount of the resulting pharmaceutical composition to a subject in need thereof, that is, a patient with a reduced therapeutic effect with a BRAF inhibitor.

Используемый здесь ингибитор BRAF означает вещество, ингибирующее сигнальную трансдукцию от BRAF до нисходящего пути, в частности вещество, специально ингибирующее сигнальную трансдукцию, вызванную мутацией BRAF, имеющую мутацию с приобретением функции, описанную выше. Примеры известного ингибитора BRAF включают вемурафениб ((PLX4032), Cas No.: 918504-65-1, N-[3-[5-(4-хлорфенил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-карбонил]-2,4-дифторфенил]пропан-1-сульфонамид) и PLX4720 (Cas No.: 918505-84-7, N-[3-(5-хлоро-1Н-пирроло[2,3-b]пиридин-3-карбонил)-2,4-дифторфенил]пропан-1-сульфонамид).As used herein, a BRAF inhibitor means a substance that inhibits signal transduction from BRAF to the downstream pathway, in particular a substance that specifically inhibits signal transduction caused by a BRAF mutation, having the acquisition of function mutation described above. Examples of a known BRAF inhibitor include vemurafenib ((PLX4032), Cas No .: 918504-65-1, N- [3- [5- (4-chlorophenyl) -1H-pyrrolo [2,3-b] pyridine-3-carbonyl ] -2,4-difluorophenyl] propane-1-sulfonamide) and PLX4720 (Cas No .: 918505-84-7, N- [3- (5-chloro-1H-pyrrolo [2,3-b] pyridine-3 -carbonyl) -2,4-difluorophenyl] propane-1-sulfonamide).

Кроме того, примеры ингибитора BRAF включают регорафениб, дазатиниб, PLX-8394, BeiGene-283, PLX-3603, RG-7304 (CAS NO.: 213406-50-9), LY-3009120 (CAS NO.: 1454682-72-4), ребастиниб (Cas. No.: 1020172-07-9), аналоги 1Н-пиразоло[3,4-b]пиридин-5- карбоксамида, ASN-003, пролекарство вемурафениб, N-(тиофен-2-ил) производные бензамида, DCB-R0237, REDX-04988, EBI-907, EBI-945, госсипин, nanolipolee-007, TEW-0201, miРНК-3157 и производное тиазола (NMS-P186, NMS-P285, NMS-P349, NMS-P383, NMS-P396 и NMS-P730).In addition, examples of the BRAF inhibitor include regorafenib, dasatinib, PLX-8394, BeiGene-283, PLX-3603, RG-7304 (CAS NO .: 213406-50-9), LY-3009120 (CAS NO .: 1454682-72- 4), rebastinib (Cas.No .: 1020172-07-9), analogs of 1H-pyrazolo [3,4-b] pyridine-5-carboxamide, ASN-003, prodrug vemurafenib, N- (thiophen-2-yl) benzamide derivatives, DCB-R0237, REDX-04988, EBI-907, EBI-945, gossypine, nanolipolee-007, TEW-0201, miRNA-3157 and thiazole derivative (NMS-P186, NMS-P285, NMS-P349, NMS- P383, NMS-P396 and NMS-P730).

Кроме того, примеры ингибитора BRAF включают, помимо вышеуказанного, SB590885 (Cas No.: 405554-55-4, N,N-диметил-2-[4 -[(4Z)-4-(1-нитрозo-2,3-дигидроинден-5-илиден)-5-(1Н-пиридин-4-илиден)-1Н-имидазол-2-ил]фенокси]этанамин), ингибитор B-Raf 1 (Cas No.: 1093100-40-3, 1-N-(4-хлорфенил) -6-метил-5-N-[3-(7H-пурин-6-ил)пиридин-2-ил]изохинолин-1,5-диамин), B-Raf ингибитор 1 дигидрохлорид (Cas No.: 1191385-19-9, 1-N-(4-хлорфенил)-6-метил-5-N-[3-(7Н-пурин-6-ил)пиридин-2-ил]изохинолин-1,5-диамин; дигидрохлорид), дабрафениб (Cas No.: 1195765-45-7, N-[3-[5-(2-аминопиримидин-4-ил)-2-трет-бутил-1,3-тиазол-4-ил]-2-фторфенил]-2,6-дифторбензолсульфонамид), LGX818 (Cas No.: 1269440-17-6, метил N-[(2S)-1-[[4-[3-[5-хлор-2-фтор-3-(метансульфонамидо)фенил]-1-пропан-2-илпиразол-4-ил]пиримидин-2-ил]амино]пропан-2-ил]карбамат), HG6-64-1 (Cas No.: 1315329-43-1, см. патентный документ WO 2011/090738.), PF-04880594 (Cas No.: 1111636-35-1, 3-[[4-[1-(2,2-дифторэтил)-3-(1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-ил)пиразол-4-ил]пиримидин-2-ил]амино]пропаннитрил), ингибитор BRAF (Cas No.: 918505-61-0, N-[2,4-дифтор-3-(5-пиридин-3-ил-1Н-пирроло[2,3-b]пиридин-3-карбонил)фенил]пропан-2-сульфонамид), ингибитор B-Raf (Cas No.: 1315330-11-0, N-[4-[(4-этилпиперазин-1-ил)метил]-3-(трифторметил)фенил]-4-метил-3-[(6-метил-7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-ил)окси]бензамид), TAK-632 (Cas No.: 1228591-30-7), N-[7-циано-6-[4-фтор-3-[[2-[3-(трифторметил)фенил]ацетил]амино]фенокси]-1,3-бензотиазол-2-ил]циклопропанкарбоксамид, AZ 628 (Cas No.: 878739-06-1, 3-(2-цианопропан-2-ил)-N-[4-метил-3-[(3-метил-4-оксохиназолин-6-ил)амино]фенил]бензамид), RAF265 (Cas No.: 927880-90-8, 1-метил-5-[2-[5-(трифторметил)-1H-имидазол-2-ил]пиридин-4-ил]окси-N-[4-(трифторметил)фенил]бензимидазол-2-амин), CEP-32496 (Cas No.: 1188910-76-0, 1-[3-(6,7-диметоксихиназолин-4-ил)оксифенил]-3-[5-(1,1,1-трифтор-2-метилпропан-2-ил)-1,2-оксазол-3-ил]мочевина), GDC-0879 (Cas No.: 905281-76-7, 2-[4-[(1E)-1-гидроксиимино-2,3-дигидроинден-5-ил]-3-пиридин-4-илпиразол-1-ил]этанол), сорафениба тозилат (Cas No.: 475207-59-1, 4-[4-[[4-хлор-3-(трифторметил)фенил]карбамоиламино]фенокси]-N-метилпиридин-2-карбоксамид; 4-метилбензолсульфокислота), дабрафениба мезилат (Cas No.: 1195768-06-9, N-[3-[5-(2-аминопиримидин-4-ил)-2-трет-бутил-1,3-тиазол-4-ил]-2 фторофенил]-2,6-дифторобензолсульфонамид; метансульфокислота), CEP-32496 гидрохлорид (Cas No.: 1227678-26-3, 1-[3-(6,7-диметоксихиназолин-4-ил)оксифенил]-3-[5-(1,1,1-трифтор-2-метилпропан-2-ил)-1,2-оксазол-3-ил]мочевина; гидрохлорид) и сорафениб (Cas No.: 284461-73-0, 4-[4-[[4-хлор-3-(трифторметил)фенил]карбамоиламино]фенокси]-N-метилпиридин-2-карбоксамид).In addition, examples of the BRAF inhibitor include, in addition to the above, SB590885 (Cas No .: 405554-55-4, N, N-dimethyl-2- [4 - [(4Z) -4- (1-nitroso-2,3- dihydroinden-5-ylidene) -5- (1H-pyridin-4-ylidene) -1H-imidazol-2-yl] phenoxy] ethanamine), B-Raf 1 inhibitor (Cas No .: 1093100-40-3, 1- N- (4-chlorophenyl) -6-methyl-5-N- [3- (7H-purin-6-yl) pyridin-2-yl] isoquinoline-1,5-diamine), B-Raf inhibitor 1 dihydrochloride ( Cas No .: 1191385-19-9, 1-N- (4-chlorophenyl) -6-methyl-5-N- [3- (7H-purin-6-yl) pyridin-2-yl] isoquinoline-1, 5-diamine; dihydrochloride), dabrafenib (Cas No .: 1195765-45-7, N- [3- [5- (2-aminopyrimidin-4-yl) -2-tert-butyl-1,3-thiazole-4 -yl] -2-fluorophenyl] -2,6-difluorobenzenesulfonamide), LGX818 (Cas No .: 1269440-17-6, methyl N - [(2S) -1 - [[4- [3- [5-chloro- 2-fluoro-3- (methanesulfonamido) phenyl] -1-propan-2-ylpyrazol-4-yl] pyrimidin-2-yl] amino] propan-2-yl] carbamate), HG6-64-1 (Cas No. : 1315329-43-1, see patent document WO 2011/090738.), PF-04880594 (Cas No .: 1111636-35-1, 3 - [[4- [1- (2,2-difluoroethyl) -3 - (1H-pyrrolo [2,3-b] pyridin-5-yl) pyrazol-4-yl] pi rimidin-2-yl] amino] propanenitrile), BRAF inhibitor (Cas No .: 918505-61-0, N- [2,4-difluoro-3- (5-pyridin-3-yl-1H-pyrrolo [2, 3-b] pyridine-3-carbonyl) phenyl] propane-2-sulfonamide), B-Raf inhibitor (Cas No .: 1315330-11-0, N- [4 - [(4-ethylpiperazin-1-yl) methyl ] -3- (trifluoromethyl) phenyl] -4-methyl-3 - [(6-methyl-7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-4-yl) oxy] benzamide), TAK-632 (Cas No. : 1228591-30-7), N- [7-cyano-6- [4-fluoro-3 - [[2- [3- (trifluoromethyl) phenyl] acetyl] amino] phenoxy] -1,3-benzothiazole-2 -yl] cyclopropanecarboxamide, AZ 628 (Cas No .: 878739-06-1, 3- (2-cyanopropan-2-yl) -N- [4-methyl-3 - [(3-methyl-4-oxoquinazoline-6 -yl) amino] phenyl] benzamide), RAF265 (Cas No .: 927880-90-8, 1-methyl-5- [2- [5- (trifluoromethyl) -1H-imidazol-2-yl] pyridin-4- yl] oxy-N- [4- (trifluoromethyl) phenyl] benzimidazol-2-amine), CEP-32496 (Cas No .: 1188910-76-0, 1- [3- (6,7-dimethoxyquinazolin-4-yl ) oxyphenyl] -3- [5- (1,1,1-trifluoro-2-methylpropan-2-yl) -1,2-oxazol-3-yl] urea), GDC-0879 (Cas No .: 905281- 76-7, 2- [4 - [(1E) -1-hydroxyimino-2,3-dihydroinden-5-yl] -3-pyridin-4-ylpyrazole-1 -yl] ethanol), sorafenib tosylate (Cas No .: 475207-59-1, 4- [4 - [[4-chloro-3- (trifluoromethyl) phenyl] carbamoylamino] phenoxy] -N-methylpyridine-2-carboxamide; 4-methylbenzenesulfonic acid), dabrafenib mesylate (Cas No .: 1195768-06-9, N- [3- [5- (2-aminopyrimidin-4-yl) -2-tert-butyl-1,3-thiazole-4- yl] -2 fluorophenyl] -2,6-difluorobenzenesulfonamide; methanesulfonic acid), CEP-32496 hydrochloride (Cas No .: 1227678-26-3, 1- [3- (6,7-dimethoxyquinazolin-4-yl) oxyphenyl] - 3- [5- (1,1,1-trifluoro-2-methylpropan-2-yl) -1,2-oxazol-3-yl] urea; hydrochloride) and sorafenib (Cas No .: 284461-73-0, 4- [4 - [[4-chloro-3- (trifluoromethyl) phenyl] carbamoylamino] phenoxy] -N-methylpyridine-2-carboxamide).

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может использоваться в комбинации с другими активными компонентами, отличными от лекарственного средства, подавляющего GST-π. Используемые в комбинации здесь включают, например, введение других активных компонентов в виде отдельных фармацевтических препаратов и введение других активных компонентов в форме комбинированного агента, по меньшей мере, с одним из других лекарственных средств. Когда другие активные компоненты вводят в виде отдельных фармацевтических препаратов, препарат, содержащий другие активные компоненты, может быть введен перед другими препаратами, вместе с другими препаратами или после других препаратов.The pharmaceutical composition of the present invention can be used in combination with other active ingredients other than the GST-π suppressant drug. Used in combination herein include, for example, administering other active ingredients as separate pharmaceutical preparations and administering other active ingredients in the form of a combined agent with at least one of the other drugs. When other active ingredients are administered as separate pharmaceutical preparations, the preparation containing the other active ingredients can be administered before the other preparations, together with other preparations, or after other preparations.

Вышеуказанные ингибиторы BRAF могут быть соответствующим образом использованы для таких других активных компонентов. Кроме того, другие активные компоненты также включают эффективные для лечения заданного заболевания. Например, когда заболевание, подлежащее лечению, представляет собой рак, противораковый агент можно использовать в комбинации. Примеры противоракового агента включают алкилирующие агенты, такие как ифосфамид, гидрохлорид нимустина, циклофосфамид, дакарбазин, мелфалан и ранимустин, антиметаболиты, такие как гидрохлорид гемцитабина, эноцитабин, цитарабин-окфосфат, препараты цитарабина, тегафур-урацил, тегафур-гимерацил-отерацил калий комбинированные агенты (например, TS-1), доксифлуридин, гидроксикарбамид, фторурацил, метотрексат и меркаптопурин, противоопухолевые антибиотики, такие как гидрохлорид идарубицина, гидрохлорид эпирубицина, гидрохлорид даунорубицина, гидрохлорид доксорубицина, гидрохлорид пирарубицина, гидрохлорид блеомицина, сульфат пепломицина, гидрохлорид митоксантрона и митомицин С, алкалоиды, такие как этопозид, гидрохлорид иринотекана, динартрат винорелбина, гидрат доцетаксела, паклитаксел, сульфат винкристина, сульфат виндезина и сульфат винбластина, агенты гормональной терапии, такие как анастрозол, цитрат тамоксифена, цитрат торемифена, бикалютамид, флутамид и фосфат эстрамустина, комплексы платины, такие как карбоплатин, цисплатин (CDDP) и недаплатин, ангиогенные ингибиторы, такие как талидомид, неовастат и бевацизумаб и L-аспарагиназа.The above BRAF inhibitors can be suitably used for such other active ingredients. In addition, other active ingredients also include those that are effective for treating a given disease. For example, when the disease to be treated is cancer, the anticancer agent can be used in combination. Examples of an anticancer agent include alkylating agents such as ifosfamide, nimustine hydrochloride, cyclophosphamide, dacarbazine, melphalan and ranimustine, antimetabolites such as gemcitabine hydrochloride, enocitabine, cytarabine octophosphate, cytarabine preparations, teglafur-uracil (e.g. TS-1), doxifluridine, hydroxycarbamide, fluorouracil, methotrexate and mercaptopurine, antineoplastic antibiotics such as idarubicin hydrochloride, epirubicin hydrochloride, daunorubicin hydrochloride, doxorubicin pyronemicin hydrochloride and mitochloride hydrochloride hydrochloride alkaloids such as etoposide, irinotecan hydrochloride, vinorelbine dinarrate, docetaxel hydrate, paclitaxel, vincristine sulfate, vindesine sulfate and vinblastine sulfate, hormone therapy agents such as anastrozole, tamoxifen citrate, toremidine citrate, phosphates and bicalutamistramine complexes platinum such as carboplatin, cisplatin (CDDP) and nedaplatin, angiogenic inhibitors such as thalidomide, neovastat and bevacizumab, and L-asparaginase.

Когда активный компонент в каждом из агентов, композиций и способе лечения по настоящему изобретению, описанный в настоящем описании, представляет собой нуклеиновую кислоту, такую как молекула РНК-интерференции, рибозима, антисмысловая нуклеиновая кислота или ДНК/РНК-химерный полинуклеотид, которые могут быть использованы непосредственно в виде голой нуклеиновой кислоты или могут также поддерживаться различными векторами. Для вектора можно использовать любой из известных векторов, таких как плазмидные векторы, фаговые векторы, фагмидные векторы, космидные векторы, вирусные векторы. Вектор, который будет поддерживаться, предпочтительно, содержит, по меньшей мере, промотор, усиливающий экспрессию нуклеиновой кислоты, и нуклеиновая кислота в этом случае предпочтительно лигируется оперативно с промотором. Нуклеиновая кислота, лигированная оперативно с промотором, означает, что нуклеиновая кислота и промотор расположены так, что белок, кодируемый нуклеиновой кислотой, может быть соответствующим образом получен под действием промотора. Вектор может быть или не быть реплицируемым в клетке-хозяине, и транскрипция гена может быть проведена вне или внутри ядра в клетке-хозяине. В последнем случае нуклеиновая кислота может быть включена в геном клетки-хозяина.When the active component in each of the agents, compositions and method of treatment of the present invention described herein is a nucleic acid such as an RNA interference molecule, a ribozyme, an antisense nucleic acid, or a DNA / RNA chimeric polynucleotide that can be used directly in the form of naked nucleic acid, or can also be supported by various vectors. For the vector, you can use any of the known vectors, such as plasmid vectors, phage vectors, phagemid vectors, cosmid vectors, viral vectors. The vector to be supported preferably contains at least a promoter that enhances the expression of the nucleic acid, and the nucleic acid in this case is preferably operatively ligated to the promoter. A nucleic acid operably ligated with a promoter means that the nucleic acid and the promoter are positioned so that the protein encoded by the nucleic acid can be appropriately produced by the action of the promoter. The vector may or may not be replicable in the host cell, and transcription of the gene may be carried out outside or inside the nucleus in the host cell. In the latter case, the nucleic acid can be incorporated into the genome of the host cell.

Кроме того, активный компонент может также поддерживаться различными невирусными липидами или белковыми носителями. Такой носитель не ограничен и примеры включают холестерины, липосомы, промоторы антител, наночастицы циклодекстрина, слитые пептиды, аптамеры, биодеградируемые сополимеры и полимеры полимолочной кислоты, благодаря которым может быть увеличена эффективность внутриклеточного введения (например, см. Pirollo and Chang, Cancer Res. 2008; 68(5):1247-50 и т.д.). Особенно полезны катионные липосомы и полимеры (например, полиэтиленимин и т. д.). Другие примеры пригодного в качестве такого носителя полимера включают те, которые описаны в патентном документе US 2008/0207553 и US 2008/0312174.In addition, the active ingredient can also be supported by various non-viral lipids or protein carriers. Such a carrier is not limited, and examples include cholesterols, liposomes, antibody promoters, cyclodextrin nanoparticles, fusion peptides, aptamers, biodegradable copolymers and polylactic acid polymers, which can increase the efficiency of intracellular administration (for example, see Pirollo and Chang, Cancer Res. 2008 ; 68 (5): 1247-50, etc.). Cationic liposomes and polymers (eg polyethyleneimine, etc.) are particularly useful. Other examples of a polymer suitable as such a carrier include those described in US 2008/0207553 and US 2008/0312174.

Для каждой фармацевтической композиции по настоящему изобретению, описанной в настоящем описании, активный компонент может быть объединен с другими вспомогательными компонентами при условии, что эффекты активного компонента не будут затронуты. Примеры вспомогательного компонента включают другие химиотерапевтические агенты, фармакологически приемлемые носители, эксципиенты и растворители. Кроме того, в зависимости от пути введения и способа высвобождения лекарственного средства вышеуказанная композиция также может быть покрыта подходящим материалом, например, энтеросолюбильным покрытием или временным распадающимся материалом, или включается в подходящую систему высвобождения лекарственного средства.For each pharmaceutical composition of the present invention described in the present description, the active ingredient can be combined with other auxiliary ingredients, provided that the effects of the active ingredient are not affected. Examples of the adjuvant include other chemotherapeutic agents, pharmacologically acceptable carriers, excipients, and solvents. In addition, depending on the route of administration and the mode of drug release, the above composition may also be coated with a suitable material, for example, an enteric coating or a temporary disintegrating material, or incorporated into a suitable drug release system.

Каждый агент и композиция (включая каждую фармацевтическую композицию) по настоящему изобретению, описанные в настоящем описании, могут вводиться различными путями, включая как пероральные, так и парентеральные, и примеры пути введения включают, но не ограничиваются ими, пероральный, внутривенный, внутримышечный, подкожный, локальный, внутриопухолевый, внутриутробный, ректальный, внутриартериальный, интрапортальный, внутрижелудочковый, чрезслизистый, трансдермальный, интраназальный, внутрибрюшинный, внутрилегочный и внутриутробный, или может быть приготовлен в виде лекарственной формы, подходящей для каждого пути введения. Можно использовать любую известную лекарственную форму и способ приготовления (например, см. «Hyojun Yakuzaigaku» («Standard Pharmaceutics» на английском языке), edited by Yoshiteru Watanabe et al., Nankodo, 2003, и т. д.).Each agent and composition (including each pharmaceutical composition) of the present invention described herein can be administered by a variety of routes, including both oral and parenteral, and examples of the route of administration include, but are not limited to, oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous , local, intratumoral, intrauterine, rectal, intraarterial, intraportal, intraventricular, transmucosal, transdermal, intranasal, intraperitoneal, intrapulmonary and intrauterine, or can be prepared in a dosage form suitable for each route of administration. You can use any known dosage form and method of preparation (for example, see "Hyojun Yakuzaigaku" ("Standard Pharmaceutics" in English), edited by Yoshiteru Watanabe et al., Nankodo, 2003, etc.).

Лекарственная форма, подходящая для перорального введения, не ограничена, и примеры включают порошки, гранулы, таблетки, капсулы, растворы, суспензии, эмульсии, гели и сиропы, а примеры лекарственной формы, подходящей для парентерального введения, включают инъекции, такие как инъекции раствора, суспензионные инъекции, инъекции эмульсии и приготовленные для немедленного применения инъекции. Препарат для парентерального введения может быть в форме водного или неводного изотонического стерильного раствора или суспензии.A dosage form suitable for oral administration is not limited, and examples include powders, granules, tablets, capsules, solutions, suspensions, emulsions, gels and syrups, and examples of a dosage form suitable for parenteral administration include injections such as solution injections, suspension injections, emulsion injections and injections prepared for immediate use. A preparation for parenteral administration can be in the form of an aqueous or non-aqueous isotonic sterile solution or suspension.

Каждый агент или композиция (включая каждую фармацевтическую композицию) по настоящему изобретению, описанные в настоящем описании, могут также быть нацелены на определенную ткань или клетку. Целеуказание может быть достигнуто с помощью любого известного метода. Когда он предназначен для доставки к раку, примеры используемых методов включают в себя, но не ограничиваясь ими, пассивное целеуказание, в котором препарат, предпочтительно, имеет размер от 50 до 200 нм, в частности, от 75 до 150 нм, для получения эффектов EPR (повышенной проницаемости и удерживания) и активного целеуказания, в котором лиганд, такой как CD19, HER2, трансферриновый рецептор, рецептор фолиевой кислоты, рецептор VIP, EGFR (Torchilin, AAPS J. 2007; 9(2): E128-47), RAAG10 (патентная публикация JP (Kohyo) No. 2005-532050), PIPA (патентная публикация JP (Kohyo) No. 2006-506071) или KID3 (патентная публикация JP (Kohyo) No. 2007-529197), пептид, имеющий мотив RGD или мотив NGR, F3 или LyP-1 (Ruoslahti et al., J Cell Biol. 2010;188(6):759-68) используют в качестве таргетирующего агента. Кроме того, известно, что ретиноид и его производное полезны в качестве таргетирующего агента в раковой клетке (патентный документ WO 2008/120815), и, таким образом, можно также использовать носитель, содержащий ретиноид в качестве таргетирующего агента. Носители описаны в патентных документах WO2009/036368, WO 2010/014117 и WO 2012/170952, в дополнение к вышеуказанной литературе.Each agent or composition (including each pharmaceutical composition) of the present invention described herein can also target a specific tissue or cell. Targeting can be achieved using any known method. When it is intended for delivery to cancer, examples of methods used include, but are not limited to, passive targeting, in which the drug preferably has a size of 50 to 200 nm, in particular 75 to 150 nm, to obtain EPR effects (increased permeability and retention) and active targeting in which a ligand such as CD19, HER2, transferrin receptor, folate receptor, VIP receptor, EGFR (Torchilin, AAPS J. 2007; 9 (2): E128-47), RAAG10 (JP (Kohyo) No. 2005-532050), PIPA (JP (Kohyo) No. 2006-506071) or KID3 (JP (Kohyo) No. 2007-529197), a peptide having an RGD motif or motif NGR, F3 or LyP-1 (Ruoslahti et al., J Cell Biol. 2010; 188 (6): 759-68) is used as a targeting agent. In addition, it is known that the retinoid and its derivative are useful as a targeting agent in a cancer cell (patent document WO 2008/120815), and thus a carrier containing the retinoid as a targeting agent can also be used. Carriers are described in patent documents WO2009 / 036368, WO 2010/014117 and WO 2012/170952, in addition to the above literature.

Каждый агент или композиция (включая каждую фармацевтическую композицию) по настоящему изобретению, описанные в настоящем описании, могут поставляться в любой форме и, с точки зрения стабильности при хранении, могут быть предоставлены в форме приготовления для немедленного применения на медицинском участке или рядом с врачом и/или фармацевтом, медсестрой или другому медицинскому персоналу. Такая форма особенно полезна, когда агент или композиция по настоящему изобретению содержат компоненты, которые трудно хранить стабильно, такие как липиды, белки и нуклеиновые кислоты. В этом случае агент или композиция по настоящему изобретению предоставляется в 1 или 2, или более емкостях, содержащих по меньшей мере, один важный элемент, и подготовленный перед использованием, например, в течение 24 ч, предпочтительно до 3 ч, более предпочтительно, непосредственно перед использованием. Для подготовки можно подходящим образом использовать реагент, растворитель и оборудование для подготовки, обычно доступные на подготовительном участке.Each agent or composition (including each pharmaceutical composition) of the present invention described herein can be supplied in any form and, in terms of storage stability, can be provided in the form of a preparation for immediate use in a medical area or near a physician, and / or a pharmacist, nurse or other healthcare professional. This form is especially useful when the agent or composition of the present invention contains components that are difficult to store stably, such as lipids, proteins, and nucleic acids. In this case, the agent or composition of the present invention is provided in 1 or 2 or more containers containing at least one essential element and prepared before use, for example, within 24 hours, preferably up to 3 hours, more preferably just before using. Preparation can be suitably used with a reagent, solvent, and preparation equipment usually available at the preparation site.

Таким образом, настоящее изобретение относится к набору для подготовки композиции, содержащему 1 или 2, или более емкостей, содержащих активные компоненты, которые могут содержаться в каждом агенте или композиции по настоящему изобретению отдельно или в комбинации, а также необходимые элементы каждого агента или композиции для предоставления в виде такого набора. Набор по настоящему изобретению может включать, помимо вышеперечисленного, инструкции, описывающие способ подготовки и способ введения каждого агента или композиции по настоящему изобретению, такие как письменная информация и цифровой носитель данных, такой как CD или DVD. Кроме того, набор по настоящему изобретению может включать в себя все необходимые элементы для завершения каждого агента или композиции по настоящему изобретению, но не обязательно включать все элементы. Таким образом, набор по настоящему изобретению может не включать реагент и растворитель, обычно доступные на медицинском участке и экспериментальные средства, такие как стерилизованная вода, физиологический раствор и раствор глюкозы.Thus, the present invention relates to a kit for preparing a composition containing 1 or 2 or more containers containing active components that may be contained in each agent or composition according to the present invention separately or in combination, as well as the necessary elements of each agent or composition for providing in the form of such a set. The kit of the present invention may include, in addition to the above, instructions describing the method of preparation and the method of administration of each agent or composition of the present invention, such as written information and digital storage media such as a CD or DVD. In addition, the kit of the present invention may include all of the elements necessary to complete each agent or composition of the present invention, but does not need to include all of the elements. Thus, the kit of the present invention may not include the reagent and solvent commonly available in the medical area and experimental means such as sterilized water, saline and glucose solution.

Эффективное количество в каждом способе лечения по настоящему изобретению, описанное в настоящем описании, представляет собой, например, количество, которое облегчает симптом заболевания или задерживает, или останавливает развитие заболевания, предпочтительно, количество, которое подавляет или излечивает заболевание. Кроме того, предпочтительнее количество, не вызывающее вредных эффектов, которое превосходят преимущества, получаемые от введения. Такое количество соответствующим образом определяют с помощью испытания in vitro с использованием культивируемых клеток или испытания на модельном животном, таком как мышь, крыса, собака или свинья, и эти методы испытаний хорошо известны специалистам в данной области техники. Доза лекарственного средства, используемого в способе лечения по настоящему изобретению, известна специалистам в данной области техники или может быть соответствующим образом определена вышеуказанными испытаниями.An effective amount in each method of treatment of the present invention described herein is, for example, an amount that alleviates a symptom of a disease or delays or stops the progression of a disease, preferably an amount that suppresses or cures the disease. In addition, an amount that does not cause harmful effects is preferable and outweighs the benefits obtained from administration. Such an amount is appropriately determined by in vitro testing using cultured cells or testing in a model animal such as a mouse, rat, dog or pig, and these test methods are well known to those skilled in the art. The dosage of the medicament used in the method of treatment of the present invention is known to those skilled in the art, or can be appropriately determined by the aforementioned tests.

Конкретная доза активного компонента, вводимого при способе лечения по настоящему изобретению, описанном в настоящем описании, может быть определена с учетом различных состояний субъекта, нуждающегося в лечении, таких как степень тяжести симптомов, общие состояния здоровья субъекта, возраст, масса тела, пол субъекта, диета, время и частота введения, вводимые совместно лекарственные средства, реактивность на терапии, лекарственная форма и соответствие терапии.The specific dose of the active ingredient administered in the method of treatment of the present invention described herein can be determined taking into account the various conditions of the subject in need of treatment, such as the severity of the symptoms, the general health of the subject, age, body weight, sex of the subject, diet, timing and frequency of administration, co-administered drugs, response to therapy, dosage form and appropriateness of therapy.

Путь введения включает различные пути, включая пероральный и парентеральный, такие как оральный, внутривенный, внутримышечный, подкожный, локальный, внутриопухолевый, ректальный, внутриартериальный, интрапортальный, внутрижелудочковый, чрезслизистый, трансдермальный, интраназальный, внутрибрюшинный, внутрилегочный и внутриутробный.The route of administration includes various routes, including oral and parenteral, such as oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous, local, intratumoral, rectal, intraarterial, intraportal, intraventricular, transmucosal, transdermal, intranasal, intraperitoneal, intrapulmonary, and intrauterine.

Частота введения варьируется в зависимости от свойства используемого агента или композиции и состояний субъекта, включая вышеуказанное, но может быть, например, несколько раз в день (более конкретно, два раза, 3, 4 или 5 раз, или более в день), раз в день, каждые несколько дней (точнее, каждые 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней), каждую неделю, каждые несколько недель (точнее, каждые 2, 3 или 4 недели).The frequency of administration will vary depending on the property of the agent or composition used and the conditions of the subject, including the above, but can be, for example, several times a day (more specifically, twice, 3, 4 or 5 times, or more times a day), once a day, every few days (more precisely, every 2, 3, 4, 5, 6 or 7 days), every week, every few weeks (more precisely, every 2, 3 or 4 weeks).

Термин «субъект», используемый в настоящем описании, означает любого биологического индивидуума, предпочтительно животных, еще более предпочтительно, млекопитающих, а также, более предпочтительно, людей. В настоящем изобретении субъект может быть здоровым или пораженным заболеванием, но, когда предполагается лечение конкретного заболевания, субъект обычно означает субъекта, который поражен или подвержен влиянию заболевания.The term "subject" as used herein means any biological individual, preferably animals, even more preferably mammals, and also, more preferably, humans. In the present invention, a subject may be healthy or affected by a disease, but when a particular disease is intended to be treated, the subject usually means a subject that is affected or affected by the disease.

Кроме того, термин «лечение», используемый в настоящем описании, включает в себя приемлемые с медицинской точки зрения все виды профилактического и/или терапевтического вмешательства с целью выздоровления, временной ремиссии или профилактики заболевания. Например, термин «лечение» включает в себя приемлемые с медицинской точки зрения вмешательства с различными целями, включая задержку или остановку развития заболевания, регрессирование или исчезновение поражения, предотвращение начала или предотвращение повторения.In addition, the term "treatment" as used herein includes all medically acceptable prophylactic and / or therapeutic interventions for the purpose of recovery, temporary remission, or prevention of disease. For example, the term "treatment" includes medically acceptable interventions for various purposes, including delaying or arresting the progression of a disease, regressing or resolving a lesion, preventing the onset or prevention of recurrence.

Лекарственное средство, подавляющее GST-π, демонстрирует индукцию гибели клеток и/или подавление клеточного роста для клетки, имеющей мутацию в гене BRAF, как описано выше. Таким образом, при использовании подавления GST-π как индикатора, можно скринировать агент, индуцирующий гибель клеток, и/или агент, подавляющий клеточный рост для клетки, имеющей мутацию в гене BRAF. А именно, вещество, способное подавлять GST-π, может быть веществом-кандидатом для агента, индуцирующего гибель клеток, и/или агента, подавляющего клеточный рост для клетки, имеющей мутацию в гене BRAF (как правило, раковые клетки).A drug that inhibits GST-π demonstrates the induction of cell death and / or suppression of cell growth for a cell having a mutation in the BRAF gene, as described above. Thus, by using suppression of GST-π as an indicator, a cell death inducing agent and / or a cell growth suppression agent can be screened for a cell having a mutation in the BRAF gene. Namely, a substance capable of inhibiting GST-π may be a candidate substance for a cell death inducing agent and / or a cell growth inhibiting agent for a cell having a mutation in the BRAF gene (usually cancer cells).

Например, тестируемое вещество контактирует с раковой клеткой, имеющей мутацию в гене BRAF, в качестве примера раковой клетки, для измерения уровня экспрессии GST-π в клетке. Когда уровень экспрессии в случае контакта с тестируемым веществом уменьшается по сравнению с уровнем экспрессии, измеренным в отсутствие тестируемого вещества, тестируемое вещество может быть выбрано в качестве вещества-кандидата для лекарственного средства, подавляющего GST-π.For example, a test substance is contacted with a cancer cell having a mutation in the BRAF gene, as an example of a cancer cell, to measure the expression level of GST-π in the cell. When the expression level upon contact with the test substance decreases compared to the expression level measured in the absence of the test substance, the test substance can be selected as a candidate substance for a GST-π suppressant drug.

Тестируемое вещество здесь не ограничено и может быть любым веществом. Тестируемое вещество может представлять собой односоставное вещество или смесь, состоящую из множества составляющих компонентов. Тестируемое вещество может содержать композицию, содержащую неустановленные вещества, такие как экстракт из микроорганизма или культуральная жидкость, или композицию, содержащую известные композиции в заданном соотношении компонентов. Кроме того, тестируемым веществом может быть любой из белков, нуклеиновых кислот, липидов, полисахаридов, органических соединений и неорганических соединений.The test substance is not limited here and can be any substance. The test substance can be a single substance or a mixture of many constituent components. The test substance may contain a composition containing unidentified substances, such as an extract from a microorganism or culture fluid, or a composition containing known compositions in a predetermined ratio of components. In addition, the test substance can be any of proteins, nucleic acids, lipids, polysaccharides, organic compounds, and inorganic compounds.

ПримерExample

Далее настоящее изобретение описано более подробно со ссылкой на примеры, но технический объем настоящего изобретения не ограничивается этим.Hereinafter, the present invention is described in more detail with reference to examples, but the technical scope of the present invention is not limited thereto.

[Пример 1][Example 1]

В настоящем примере изучался эффект подавления клеточного роста, когда лекарственному средству, подавляющему GST-π, было разрешено воздействовать на клетку, имеющую мутацию в гене BRAF. Во-первых, в качестве раковой клетки, имеющей мутацию (V600E) в гене BRAF, культивировали 1 тип клеточной линии колоректального рака (CACO-2) и 4 типа клеточных линий меланомы (A375, SK-MEL-28, A2058, Malme-3М) культивировали при 37°C в атмосфере, содержащей 5% СО2. Используемой средой были MEM + 20%, FBS + 0,1 мМ и NEAA для CACO-2, DMEM + 15% и FBS для A375, EMEM + 10% и FBS для SK-MEL-28, DMEM + 10% и FBS для A2058, и IMDM + 20% и FBS для Malme-3M, ко всем из которых был добавлен антибиотик.In the present example, the effect of suppressing cell growth was studied when a GST-π suppressing drug was allowed to act on a cell having a mutation in the BRAF gene. First, type 1 colorectal cancer cell line (CACO-2) and 4 types of melanoma cell lines (A375, SK-MEL-28, A2058, Malme-3M ) were cultured at 37 ° C in an atmosphere containing 5% CO 2 . The media used were MEM + 20%, FBS + 0.1 mM and NEAA for CACO-2, DMEM + 15% and FBS for A375, EMEM + 10% and FBS for SK-MEL-28, DMEM + 10% and FBS for A2058, and IMDM + 20% and FBS for Malme-3M, all of which had antibiotic added.

За день до трансфекции каждые клетки высевали в чашку Петри размером 100 мм, используя среду, свободную от антибиотиков, так что достигалось 10-20% монослоя. 600 пмоль GST-π siРНК (GGGAGGCAAGACCUUCAUUTT, siRNA ID#2385, Ambion (SEQ ID NO: 3)) добавляли к 1 мл среды «Opti-MEM I Reduced Serum Medium» (GIBCO) и осторожно перемешивали. Затем 35 мкл реактива «Lipofectamine RNAi MAX» (Invitrogen) разбавляли 1 мл среды «Opti-MEM I Reduced Serum Medium» (GIBCO) и осторожно перемешивали. Разведенные GST-π siРНК и «Lipofectamine RNAi MAX» осторожно смешивали, а затем инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Тем временем среду заменяли 10 мл среды «Opti-MEM I Reduced Serum Medium». После 10-мин инкубации к клеткам добавляли комплекс GST-π siРНК и «Lipofectamine RNAi MAX» и инкубировали при 37°C в атмосфере, содержащей 5% CO2. После 5-час инкубации среду заменяли на 10 мл свободной от антибиотика среды. Среду промывали PBS 1 ч после замены, клетки снимали с использованием 0,25% трипсина-ЭДТА (SIGMA) и суспендировали в среде, содержащей антибиотик. Клетки суспендировали в 5 мл среды и высевали в чашку Петри размером 60 мм (CACO-2: 0,4×105 клеток, A375: 1,0×105 клеток, SK-MEL-28: 0,2×105 клеток, A2058: 0,8×105 клеток, Malme-3M: 0,6×105 клеток).The day before transfection, each cell was plated into a 100 mm Petri dish using antibiotic-free medium so that 10-20% monolayer was achieved. 600 pmol GST-π siRNA (GGGAGGCAAGACCUUCAUUTT, siRNA ID # 2385, Ambion (SEQ ID NO: 3)) was added to 1 ml of Opti-MEM I Reduced Serum Medium (GIBCO) and mixed gently. Then 35 μl of Lipofectamine RNAi MAX reagent (Invitrogen) was diluted with 1 ml of Opti-MEM I Reduced Serum Medium (GIBCO) and gently mixed. The diluted GST-π siRNA and Lipofectamine RNAi MAX were carefully mixed and then incubated at room temperature for 10 min. In the meantime, the medium was replaced with 10 ml of Opti-MEM I Reduced Serum Medium. After 10 min incubation, the GST-π siRNA and Lipofectamine RNAi MAX complex was added to the cells and incubated at 37 ° C in an atmosphere containing 5% CO 2 . After a 5-hour incubation, the medium was replaced with 10 ml of antibiotic-free medium. The medium was washed with PBS for 1 h after replacement, the cells were harvested using 0.25% trypsin-EDTA (SIGMA) and suspended in the medium containing the antibiotic. The cells were suspended in 5 ml of medium and plated in a 60 mm Petri dish (CACO-2: 0.4 × 10 5 cells, A375: 1.0 × 10 5 cells, SK-MEL-28: 0.2 × 10 5 cells , A2058: 0.8 × 10 5 cells, Malme-3M: 0.6 × 10 5 cells).

Такую же операцию проводили в качестве контрольных экспериментов с использованием реактива «Scramble siRNA» (CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG, Hokkaido System Science Co., Ltd. (SEQ ID NO:4)) или «AllStars Negative Control siRNA» (siКонтроль) (QIAGEN). После трансфекции с помощью GST-π siРНК число клеток подсчитывалось на День 0 и День 5, соответственно.The same operation was performed as control experiments using the Scramble siRNA reagent (CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG, Hokkaido System Science Co., Ltd. (SEQ ID NO: 4)) or AllStars Negative Control siRNA (siControl) (QIAGEN). After transfection with GST-π siRNA, cell numbers were counted on Day 0 and Day 5, respectively.

Дополнительно, в настоящем примере, экспрессия GST-π была подтверждена вестерн-блоттингом, соответственно, когда GST-π siРНК разрешалось воздействовать на клетки CACO-2, клетки A375, клетки SK-MEL-28, клетки A2058 и клетки Malme-3M. А именно, используя клетки, собранные через 3 д после трансфекции GST-π siРНК, был проведен анализ вестерн-блоттинга на нокдаун GST-π. Собранные клетки сначала промывали холодным PBS, к которому добавляли холодный лизисный буфер (1% NP-40, 50 мМ Tris-HCl (рН 7,4), 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, дополненный реактивом «Mini EDTA-free» (Roche) и «PhosSTOP» (Roche)), охлаждали на льду и инкубировали в течение 30 мин для солюбилизации. Затем проводили центрифугирование при 4°C, 15000 об/мин в течение 15 мин, получая таким образом клеточный экстракт. В полученном клеточном экстракте количественно определяли белки с использованием набора «Micro BCA Protein Assay Kit» (Thermo SCIENTIFIC). Затем 20 мкг экстракта клеток денатурировали в условии восстановления и ДСН-ПААГ-электрофорез проводили с использованием «MULTIGEL II mini 4/20» (13 Вт) (Cosmo Bio) для разделения белков. После завершения ДСН-ПААГ-электрофореза белки транскрибировали на PVDF-мембрану с использованием устройства для блоттинга. Блоттинг-мембрану инкубировали в PBS с 5% снятого латекса/0,05% Tween 20 (сокращенно PBS-T) при 4°C в течение 16 ч для блокировки. Затем мембрану подвергали взаимодействию с «anti-GST-π» (MBL), разведенным в растворе «Membrane blocking Solution» (Invitrogen), при 4°C в течение 16 ч. Реакцию вторичного антитела проводили при комнатной температуре в течение 1 ч с использованием кроличьего антитела, помеченного пероксидазой хрена (HRP). Обнаружение полосы сигнала проводили на рентгеновской пленке методом хемилюминесценции с использованием реактивов «ECL Western Blocking Detection Reagents» (GE Healthcare). Промывку между каждой из операций проводили путем встряхивания в течение 5 мин, 4 раза, с использованием PBS-T.Additionally, in the present example, expression of GST-π was confirmed by Western blotting, respectively, when GST-π siRNA was allowed to act on CACO-2 cells, A375 cells, SK-MEL-28 cells, A2058 cells, and Malme-3M cells. Namely, using cells harvested 3 days after transfection with GST-π siRNA, a Western blot analysis for GST-π knockdown was performed. The harvested cells were first washed with cold PBS, to which was added cold lysis buffer (1% NP-40, 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, supplemented with Mini EDTA-free reagent (Roche ) and "PhosSTOP" (Roche)), cooled on ice and incubated for 30 min to solubilize. Then, centrifugation was performed at 4 ° C, 15000 rpm for 15 minutes, thereby obtaining a cell extract. In the obtained cell extract, proteins were quantified using the Micro BCA Protein Assay Kit (Thermo SCIENTIFIC). Then 20 μg of the cell extract was denatured under the condition of recovery, and SDS-PAGE-electrophoresis was performed using MULTIGEL II mini 4/20 (13 W) (Cosmo Bio) for protein separation. After completion of SDS-PAGE electrophoresis, proteins were transcribed onto a PVDF membrane using a blotting device. The blotting membrane was incubated in PBS with 5% skimmed latex / 0.05% Tween 20 (abbreviated as PBS-T) at 4 ° C for 16 h to block. Then the membrane was reacted with anti-GST-π (MBL) diluted in Membrane blocking Solution (Invitrogen) at 4 ° C for 16 h. The secondary antibody was reacted at room temperature for 1 h using rabbit antibody labeled with horseradish peroxidase (HRP). The detection of the signal band was carried out on X-ray film by chemiluminescence using ECL Western Blocking Detection Reagents (GE Healthcare). Washing between each of the operations was carried out by shaking for 5 minutes, 4 times, using PBS-T.

Результаты на линии клеток колоректального рака показаны на Фиг. 1, а результаты на линии клеток меланомы показаны на Фиг. 2. Следует отметить, что на Фиг. 1 и 2 показаны результаты подсчета числа клеток и результаты анализа вестерн-блоттинга. Как показано на Фиг. 1 и 2, как в клеточной линии колоректального рака, так и линии клеток меланомы, способность к росту клеток заметно подавлялась из-за нокдауна GST-π GST-π siРНК, который является лекарственным средством, подавляющим GST-π, в раковых клетках, имеющих мутацию в гене BRAF. Мутация в гене BRAF была обнаружена в высоко злокачественных опухолях и, как известно, в колоректальных раках, как фактор неблагоприятного прогноза при неизменяемых колоректальных раках. У половины пациентов с меланомой имеются мутации в гене BRAF, и когда метастатический потенциал высок, смертность и злокачественность являются самыми высокими. Результаты настоящего примера показывают, что лекарственное средство, подавляющее GST-π, эффективено при подавлении клеточного роста раковых клеток, имеющих мутацию в гене BRAF, что повышает ожидания для новой терапии этих трудноизлечимых раковых заболеваний.The results on a colorectal cancer cell line are shown in FIG. 1 and the results on a melanoma cell line are shown in FIG. 2. It should be noted that in FIG. 1 and 2 show the results of cell counts and the results of Western blot analysis. As shown in FIG. 1 and 2, in both the colorectal cancer cell line and the melanoma cell line, the ability to grow cells was markedly suppressed due to the knockdown of GST-π GST-π siRNA, which is a GST-π suppressor drug, in cancer cells having mutation in the BRAF gene. A mutation in the BRAF gene has been found in highly malignant tumors and, as is known, in colorectal cancers, as a factor of poor prognosis in unchanged colorectal cancers. Half of melanoma patients have mutations in the BRAF gene, and when the metastatic potential is high, mortality and malignancy are highest. The results of this example show that a GST-π suppressing drug is effective in suppressing the cell growth of cancer cells having a mutation in the BRAF gene, raising expectations for a new therapy for these intractable cancers.

[Пример 2][Example 2]

В настоящем примере изучали эффект подавления клеточного роста, когда лекарственному средству, подавляющему GST-π, и ингибитору BRAF, разрешалось воздействовать на клетку, имеющую мутацию в гене BRAF.In the present example, the effect of suppressing cell growth was studied when a GST-π suppressing drug and a BRAF inhibitor were allowed to act on a cell having a mutation in the BRAF gene.

Во-первых, 1 тип клеточной линии колоректального рака (CACO-2) и 2 типа клеточных линий меланомы (SK-MEL-28 и A2058), соответственно, культивировали таким же образом, как в примере 1, и за день до трансфекции, высевали в чашку Петри размером 100 мм, используя среду, свободную от антибиотиков, так что достигалось 10-20% монослоя. 600 пмоль GST-π siРНК (GGGAGGCAAGACCUUCAUUTT, siRNA ID#2385, Ambion (SEQ ID NO:3)) добавляли к 1 мл среды «Opti-MEM I Reduced Serum Medium» (GIBCO) и осторожно перемешивали. Затем 35 мкл реактива «Lipofectamine RNAi MAX» (Invitrogen) разбавляли 1 мл среды «Opti-MEM I Reduced Serum Medium» (GIBCO) и осторожно перемешивали. Разведенные GST-π siРНК и «Lipofectamine RNAi MAX» осторожно смешивали, а затем инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Тем временем среду заменяли 10 мл среды «Opti-MEM I Reduced Serum Medium». После 10-мин инкубации к клеткам добавляли комплекс GST-π siРНК и «Lipofectamine RNAi MAX» и инкубировали при 37°C в атмосфере, содержащей 5% CO2. После 5-час инкубации среду заменяли на 10 мл свободной от антибиотика среды. Среду промывали PBS 1 ч после замены, клетки снимали с использованием 0,25% трипсина-ЭДТА (SIGMA) и суспендировали в среде, содержащей антибиотик. Клетки суспендировали в 5 мл среды и высевали в чашку Петри размером 60 мм (CACO-2: 0,4×105 клеток, SK-MEL-28: 0,2×105 клеток и A2058: 0,8×105 клеток). Такую же операцию проводили как контрольный эксперимент с использованием «AllStars Negative Control siRNA» (siКонтроль) (QIAGEN). На День 1 после трансфекции к среде добавляли PLX4720 (Selleck), ингибитор BRAF, чтобы достичь концентрации 40 мкM для CACO-2, 0,7 мкM для SK-MEL-28 и 10 мкM для A2058, и культивирование продолжали до Дня 5. Контроль, обработанный PLX4720, культивировали путем добавления растворителя DMSO (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Анализ роста проводили путем подсчета числа клеток с Дня 0 по День 5 после трансфекции.First, type 1 colorectal cancer cell line (CACO-2) and type 2 melanoma cell lines (SK-MEL-28 and A2058), respectively, were cultured in the same manner as in Example 1, and the day before transfection, were plated into a 100 mm Petri dish using antibiotic-free media so that 10-20% monolayer is achieved. 600 pmol GST-π siRNA (GGGAGGCAAGACCUUCAUUTT, siRNA ID # 2385, Ambion (SEQ ID NO: 3)) was added to 1 ml of Opti-MEM I Reduced Serum Medium (GIBCO) and mixed gently. Then 35 μl of Lipofectamine RNAi MAX reagent (Invitrogen) was diluted with 1 ml of Opti-MEM I Reduced Serum Medium (GIBCO) and gently mixed. The diluted GST-π siRNA and Lipofectamine RNAi MAX were carefully mixed and then incubated at room temperature for 10 min. In the meantime, the medium was replaced with 10 ml of Opti-MEM I Reduced Serum Medium. After 10 min incubation, the GST-π siRNA and Lipofectamine RNAi MAX complex was added to the cells and incubated at 37 ° C in an atmosphere containing 5% CO 2 . After a 5-hour incubation, the medium was replaced with 10 ml of antibiotic-free medium. The medium was washed with PBS for 1 h after replacement, the cells were harvested using 0.25% trypsin-EDTA (SIGMA) and suspended in the medium containing the antibiotic. The cells were suspended in 5 ml of medium and plated in a 60 mm Petri dish (CACO-2: 0.4 x 10 5 cells, SK-MEL-28: 0.2 x 10 5 cells and A2058: 0.8 x 10 5 cells ). The same operation was performed as a control experiment using the "AllStars Negative Control siRNA" (siControl) (QIAGEN). On Day 1 after transfection, PLX4720 (Selleck), a BRAF inhibitor, was added to the medium to reach a concentration of 40 μM for CACO-2, 0.7 μM for SK-MEL-28, and 10 μM for A2058, and culture continued until Day 5. Control treated with PLX4720 was cultured by adding DMSO solvent (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Growth analysis was performed by counting the number of cells from Day 0 to Day 5 after transfection.

На Фиг. 3 показан результат подсчета числа клеток CACO-2, на Фиг. 4 показаны результаты подсчета числа клеток SK-MEL-28 и A2058. Как видно на Фиг. 3, было высказано предположение о том, что по сравнению со случаем, когда GST-π siРНК разрешено воздействовать самостоятельно на клеточную линию колоректального рака (линия CACO-2, имеющая мутацию в гене BRAF), или случаем, когда PLX4720 разрешено воздействовать на клеточную линию колоректального рака вместе с siКонтролем, эффект подавления клеточного роста был значительным в том случае, когда GST-π siРНК и PLX4720 разрешено воздействовать в комбинации на такой клеточной линии. Кроме того, как показано на Фиг. 4, было высказано предположение о том, что по сравнению со случаем, когда GST-π siРНК разрешено воздействовать самостоятельно на клеточных линиях меланомы (SK-MEL-28 и A2058, имеющие мутацию в гене BRAF) или случаем, когда PLX4720 разрешено воздействовать на клеточные линии меланомы вместе с siКонтролем, эффект подавления клеточного роста был значительным в том случае, когда GST-π siРНК и PLX4720 разрешено воздействовать в комбинации на таких линиях клеток меланомы.FIG. 3 shows the result of counting the number of CACO-2 cells, FIG. 4 shows the results of cell counts for SK-MEL-28 and A2058. As seen in FIG. 3, it has been suggested that, compared with the case where GST-π siRNA is allowed to act on its own on a colorectal cancer cell line (line CACO-2 with a mutation in the BRAF gene), or when PLX4720 is allowed to act on a cell line colorectal cancer together with siControl, the cell growth inhibitory effect was significant when GST-π siRNA and PLX4720 were allowed to act in combination on such a cell line. In addition, as shown in FIG. 4, it has been suggested that, compared with the case where GST-π siRNA is allowed to act independently on melanoma cell lines (SK-MEL-28 and A2058, which have a mutation in the BRAF gene) or the case where PLX4720 is allowed to act on cell melanoma lines together with siControl, the cell growth inhibitory effect was significant when GST-π siRNA and PLX4720 were allowed to act in combination on such melanoma cell lines.

[Пример 3][Example 3]

В настоящем примере изучали эффект подавления клеточного роста, когда лекарственному средству, подавляющему GST-π, было разрешено воздействовать на клетку, имеющую мутацию в гене BRAF и устойчивость к ингибитору BRAF (клетка, резистентная к ингибитору BRAF).In the present example, the effect of suppressing cell growth was studied when a GST-π suppressing drug was allowed to act on a cell having a mutation in the BRAF gene and resistance to a BRAF inhibitor (a cell resistant to a BRAF inhibitor).

<Подсчет числа клеток><Counting the number of cells>

Клетки, резистентные к ингибитору BRAF, используемые в настоящем примере, получали следующим образом. Линию клеток меланомы A375, используемую в примере 1, инкубировали в среде DMEM, содержащей антибиотик, к которой добавляли 1-5 мкМ PLX4720 (Selleck) и 15% FBS при 37°C в атмосфере, содержащей 5% CO2 в течение 1 мес. Линия клеток, выжившая после 1-мес инкубации, определялась как устойчивые к PLX4720 клетки A375 и использовалась в настоящем примере.The BRAF inhibitor resistant cells used in the present example were prepared as follows. The A375 melanoma cell line used in Example 1 was incubated in antibiotic-containing DMEM to which 1-5 μM PLX4720 (Selleck) and 15% FBS were added at 37 ° C in an atmosphere containing 5% CO 2 for 1 month. The cell line that survived after 1 month of incubation was defined as PLX4720 resistant A375 cells and was used in the present example.

В настоящем примере за день до трансфекции устойчивые к PLX4720 клетки A375 клетки высевали в чашку Петри размером 100 мм, используя свободную от антибиотиков среду DMEM, содержащую 15% FBS, так что достигалась концентрация 0,5×106 клеток/10 мл. 600 пмоль GST-π siРНК (GGGAGGCAAGACCUUCAUUTT, siRNA ID#2385, Ambion (SEQ ID NO:3)) добавляли к 1 мл среды «Opti-MEM I Reduced Serum Medium» (GIBCO) и осторожно перемешивали. Затем 35 мкл реактива «Lipofectamine RNAi MAX» (Invitrogen) разбавляли 1 мл среды «Opti-MEM I Reduced Serum Medium» (GIBCO) и осторожно перемешивали. Разведенные GST-π siРНК и «Lipofectamine RNAi MAX» осторожно смешивали, а затем инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Тем временем среду заменяли 10 мл среды «Opti-MEM I Reduced Serum Medium». После 10-мин инкубации к клеткам добавляли комплекс GST-π siРНК и «Lipofectamine RNAi MAX» и инкубировали при 37°C в атмосфере, содержащей 5% CO2. После 5-час инкубации среду заменяли на 10 мл свободной от антибиотика среды DMEM, содержащей 15% FBS. Среду промывали PBS 2 ч после замены, клетки снимали с использованием 0,25% трипсина-ЭДТА (SIGMA) и суспендировали в среде DMEM, содержащей антибиотик и 15% FBS. Клетки в суспензии высевали в чашку Петри размером 60 мм, так что достигалась концентрация 1,0×105 клеток/5 мл. Такую же операцию проводили в качестве контрольных экспериментов с использованием реактива «Scramble siRNA» (CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG, Hokkaido System Science Co., Ltd. (SEQ ID NO:4)) или «AllStars Negative Control siRNA» (QIAGEN). После трансфекции с помощью GST-π siРНК число клеток подсчитывалось на День 0, 1, 2, 3, 4 и 5, соответственно.In the present example, the day before transfection, PLX4720-resistant A375 cells were plated into a 100 mm Petri dish using antibiotic-free DMEM containing 15% FBS so that a concentration of 0.5 x 10 6 cells / 10 ml was achieved. 600 pmol GST-π siRNA (GGGAGGCAAGACCUUCAUUTT, siRNA ID # 2385, Ambion (SEQ ID NO: 3)) was added to 1 ml of Opti-MEM I Reduced Serum Medium (GIBCO) and mixed gently. Then 35 μl of Lipofectamine RNAi MAX reagent (Invitrogen) was diluted with 1 ml of Opti-MEM I Reduced Serum Medium (GIBCO) and gently mixed. The diluted GST-π siRNA and Lipofectamine RNAi MAX were carefully mixed and then incubated at room temperature for 10 min. In the meantime, the medium was replaced with 10 ml of Opti-MEM I Reduced Serum Medium. After 10 min incubation, the GST-π siRNA and Lipofectamine RNAi MAX complex was added to the cells and incubated at 37 ° C in an atmosphere containing 5% CO 2 . After a 5 hour incubation, the medium was replaced with 10 ml of antibiotic-free DMEM medium containing 15% FBS. The medium was washed with PBS 2 h after replacement, the cells were harvested using 0.25% trypsin-EDTA (SIGMA) and suspended in DMEM medium containing the antibiotic and 15% FBS. The cells in suspension were plated in a 60 mm Petri dish, so that a concentration of 1.0 × 10 5 cells / 5 ml was achieved. The same operation was performed as a control experiment using a "Scramble siRNA" reagent (CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG, Hokkaido System Science Co., Ltd. (SEQ ID NO: 4)) or "AllStars Negative Control siRNA" (QIAGEN). After transfection with GST-π siRNA, cell numbers were counted on Day 0, 1, 2, 3, 4 and 5, respectively.

<Подтверждение экспрессии GST-π><Confirmation of GST-π expression>

Экспрессия GST-π была подтверждена вестерн-блоттингом, когда GST-π siРНК было разрешено воздействовать на устойчивые к PLX4720 клетки A375, как описано выше. А именно, используя клетки, собранные в каждый из указанных выше периодов после трансфекции GST-π siРНК, проводили анализ вестерн-блоттинга на нокдаун GST-π.Expression of GST-π was confirmed by Western blotting when GST-π siRNA was allowed to target PLX4720 resistant A375 cells as described above. Namely, using cells harvested at each of the above-mentioned periods after transfection with GST-π siRNA, a Western blot analysis for GST-π knockdown was performed.

Собранные клетки сначала промывали холодным PBS, к которому добавляли холодный лизисный буфер (1% NP-40, 50 мМ Tris-HCl (рН 7,4), 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, дополненный реактивом «Mini EDTA-free» (Roche) и «PhosSTOP» (Roche)), охлаждали на льду и инкубировали в течение 30 мин для солюбилизации. Проводили центрифугирование при 4°C, 15000 об/мин в течение 15 мин, получая таким образом клеточный экстракт. В полученном клеточном экстракте количественно определяли белки с использованием набора «Micro BCA Protein Assay Kit» (Thermo SCIENTIFIC). Затем 20 мкг экстракта клеток денатурировали в условии восстановления и ДСН-ПААГ-электрофорез проводили с использованием «MULTIGEL II mini 4/20» (13 Вт) (Cosmo Bio) для разделения белков. После завершения ДСН-ПААГ-электрофореза белки транскрибировали на PVDF-мембрану с использованием устройства для блоттинга. Блоттинг-мембрану инкубировали в PBS с 5% снятого латекса/0,05% Tween 20 (сокращенно PBS-T) при 4°C в течение 16 ч для блокировки. Затем мембрану подвергали взаимодействию с «anti-GST-π» (MBL), разведенным в растворе «Membrane blocking Solution» (Invitrogen), при 4°C в течение 16 ч. Реакцию вторичного антитела проводили при комнатной температуре в течение 1 ч с использованием кроличьего антитела, помеченного пероксидазой хрена (HRP). Обнаружение полосы сигнала проводили на рентгеновской пленке методом хемилюминесценции с использованием реактивов «ECL Western Blocking Detection Reagents» (GE Healthcare). Промывку между каждой из операций проводили путем встряхивания в течение 5 мин, 4 раза, с использованием PBS-T.The harvested cells were first washed with cold PBS, to which was added cold lysis buffer (1% NP-40, 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, supplemented with Mini EDTA-free reagent (Roche ) and "PhosSTOP" (Roche)), cooled on ice and incubated for 30 min to solubilize. Centrifugation was carried out at 4 ° C, 15000 rpm for 15 minutes, thus obtaining a cell extract. In the obtained cell extract, proteins were quantified using the Micro BCA Protein Assay Kit (Thermo SCIENTIFIC). Then 20 μg of the cell extract was denatured under the condition of reduction and SDS-PAGE-electrophoresis was performed using MULTIGEL II mini 4/20 (13 W) (Cosmo Bio) for protein separation. After completion of SDS-PAGE electrophoresis, proteins were transcribed onto a PVDF membrane using a blotting device. The blotting membrane was incubated in PBS with 5% skimmed latex / 0.05% Tween 20 (abbreviated as PBS-T) at 4 ° C for 16 h to block. Then the membrane was reacted with anti-GST-π (MBL) diluted in Membrane blocking Solution (Invitrogen) at 4 ° C for 16 h. The secondary antibody was reacted at room temperature for 1 h using rabbit antibody labeled with horseradish peroxidase (HRP). The signal band was detected on X-ray film by chemiluminescence using ECL Western Blocking Detection Reagents (GE Healthcare). Washing between each of the operations was carried out by shaking for 5 minutes, 4 times, using PBS-T.

<Результат><Result>

В последние годы клеточная линия меланомы с приобретенной резистентностью к ингибитору BRAF, понимается как связанная с рецидивом меланомы. Соответственно, GST-π был нокаутирован с использованием резистентных к PLX4720 A375 для исследования того, способствует ли GST-π зависимости CRAF в резистентной к ингибитору BRAF меланоме. Измерение клеточного роста клеток выявило заметный эффект подавления роста (Фис. 5). Когда был подтвержден нокдаун GST-π, экспрессия GST-π было подавлена на День 2 и День 3 (Фиг. 6).In recent years, a melanoma cell line with acquired resistance to a BRAF inhibitor has been understood to be associated with melanoma recurrence. Accordingly, GST-π was knocked out using PLX4720-resistant A375 to investigate whether GST-π contributes to CRAF dependence in BRAF inhibitor-resistant melanoma. Measurement of cell growth of cells revealed a marked growth inhibitory effect (Fig. 5). When GST-π knockdown was confirmed, GST-π expression was suppressed on Day 2 and Day 3 (Fig. 6).

Настоящий пример показывает, что рост клеток, имеющих мутацию в гене BRAF и устойчивость к ингибитору BRAF (клетка, резистентная к ингибитору BRAF), был эффективно подавлен. Согласно результатам, можно ожидать эффекта для предотвращения или уменьшения заболеваний, в которых резистентная к BRAF клетка является фактором, например, рецидива меланомы.This example shows that the growth of cells having a mutation in the BRAF gene and resistance to a BRAF inhibitor (a cell resistant to a BRAF inhibitor) was effectively suppressed. According to the results, an effect can be expected to prevent or reduce diseases in which a BRAF-resistant cell is a factor, such as recurrence of melanoma.

Все публикации, патенты и патентные заявки, приведенные здесь, должны быть включены сами по себе в настоящее описание посредством ссылки.All publications, patents, and patent applications cited herein are to be incorporated by themselves into this description by reference.

Claims (16)

1. Способ индукции клеточной гибели клетки, имеющей мутацию в гене BRAF, включающий этап введения лекарственного средства, подавляющего продукцию GST-π, где клетка, имеющая мутацию в гене BRAF, представляет собой клетку, устойчивую к ингибитору BRAF, и где лекарственное средство представляет собой вещество, выбранное из группы, состоящей из молекул РНК-интерференции, рибозимов, антисмысловых нуклеиновых кислот, ДНК/РНК-химерных полинуклеотидов к ДНК, кодирующей GST-π, и векторов, экспрессирующих по меньшей мере одно из них.1. A method of inducing cell death of a cell having a mutation in the BRAF gene, comprising the step of administering a drug that suppresses the production of GST-π, where the cell having a mutation in the BRAF gene is a cell resistant to a BRAF inhibitor, and where the drug is a substance selected from the group consisting of RNA interference molecules, ribozymes, antisense nucleic acids, DNA / RNA chimeric polynucleotides to DNA encoding GST-π, and vectors expressing at least one of them. 2. Способ подавления клеточного роста клетки, имеющей мутацию в гене BRAF, включающий этап введения лекарственного средства, подавляющего GST-π, где клетка, имеющая мутацию в гене BRAF, представляет собой клетку, устойчивую к ингибитору BRAF, и где лекарственное средство представляет собой вещество, выбранное из группы, состоящей из молекул РНК-интерференции, рибозимов, антисмысловых нуклеиновых кислот, ДНК/РНК-химерных полинуклеотидов к ДНК, кодирующей GST-π, и векторов, экспрессирующих по меньшей мере одно из них.2. A method of inhibiting cell growth of a cell having a mutation in the BRAF gene, comprising the step of administering a drug that suppresses GST-π, where the cell having a mutation in the BRAF gene is a BRAF inhibitor-resistant cell, and where the drug is a substance selected from the group consisting of RNA interference molecules, ribozymes, antisense nucleic acids, DNA / RNA chimeric polynucleotides to DNA encoding GST-π, and vectors expressing at least one of them. 3. Способ по п. 1 или 2, где мутация представляет собой мутацию V600E.3. The method of claim 1 or 2, wherein the mutation is a V600E mutation. 4. Способ по п. 1 или 2, где клетка, имеющая мутацию в гене BRAF, представляет собой раковую клетку, высокоэкспрессирующую GST-π.4. The method according to claim 1 or 2, wherein the cell having the mutation in the BRAF gene is a cancer cell highly expressing GST-π. 5. Применение лекарственного средства, подавляющего продукцию GST-π, для лечения рака, вызванного дефектом роста клетки, имеющей мутацию в гене BRAF, где клетка, имеющая мутацию в гене BRAF, представляет собой клетку, устойчивую к ингибитору BRAF, и где лекарственное средство представляет собой вещество, выбранное из группы, состоящей из молекул РНК-интерференции, рибозимов, антисмысловых нуклеиновых кислот, ДНК/РНК-химерных полинуклеотидов к ДНК, кодирующей GST-π, и векторов, экспрессирующих по меньшей мере одно из них.5. The use of a drug that suppresses the production of GST-π for the treatment of cancer caused by a growth defect of a cell having a mutation in the BRAF gene, where the cell having the mutation in the BRAF gene is a BRAF inhibitor resistant cell, and where the drug is is a substance selected from the group consisting of RNA interference molecules, ribozymes, antisense nucleic acids, DNA / RNA chimeric polynucleotides to DNA encoding GST-π, and vectors expressing at least one of them. 6. Применение по п. 5, где рак представляет собой рак, высокоэкспрессирующий GST-π.6. Use according to claim 5, wherein the cancer is a cancer highly expressing GST-π. 7. Применение по п. 5, где раком является колоректальный рак или меланома.7. Use according to claim 5, wherein the cancer is colorectal cancer or melanoma. 8. Способ скрининга лекарственного средства для индукции клеточной гибели клетки, имеющей мутацию в гене BRAF, включающий8. A method for screening a drug for inducing cell death of a cell having a mutation in the BRAF gene, comprising этап контактирования тестируемого вещества с раковой клеткой, имеющей мутацию в гене BRAF и устойчивой к ингибитору BRAF, the stage of contacting the test substance with a cancer cell that has a mutation in the BRAF gene and is resistant to a BRAF inhibitor, этап измерения экспрессионного уровня продукции GST-π в клетке и the step of measuring the expression level of GST-π production in the cell, and этап выбора тестируемого вещества в качестве лекарственного средства, подавляющего продукцию GST-π, когда уровень экспрессии снижен по сравнению со случаем, измеренным в отсутствие тестируемого вещества, где лекарственное средство представляет собой вещество, выбранное из группы, состоящей из молекул РНК-интерференции, рибозимов, антисмысловых нуклеиновых кислот, ДНК/РНК-химерных полинуклеотидов к ДНК, кодирующей GST-π, и векторов, экспрессирующих по меньшей мере одно из них.a step of selecting a test substance as a drug that suppresses the production of GST-π, when the expression level is reduced compared to the case measured in the absence of the test substance, where the drug is a substance selected from the group consisting of RNA interference molecules, ribozymes, antisense nucleic acids, DNA / RNA chimeric polynucleotides to DNA encoding GST-π, and vectors expressing at least one of them. 9. Способ скрининга лекарственного средства для подавления клеточного роста клетки, имеющей мутацию в гене BRAF, включающий 9. A method for screening a drug for suppressing cell growth of a cell having a mutation in the BRAF gene, comprising этап контактирования тестируемого вещества с раковой клеткой, имеющей мутацию в гене BRAF и устойчивой к ингибитору BRAF,the stage of contacting the test substance with a cancer cell that has a mutation in the BRAF gene and is resistant to a BRAF inhibitor, этап измерения экспрессионного уровня продукции GST-π в клетке и the step of measuring the expression level of GST-π production in the cell, and этап выбора тестируемого вещества в качестве лекарственного средства, подавляющего продукцию GST-π, когда уровень экспрессии снижен по сравнению со случаем, измеренным в отсутствие тестируемого вещества, и где лекарственное средство представляет собой вещество, выбранное из группы, состоящей из молекул РНК-интерференции, рибозимов, антисмысловых нуклеиновых кислот, ДНК/РНК-химерных полинуклеотидов к ДНК, кодирующей GST-π, и векторов, экспрессирующих по меньшей мере одно из них.a step of selecting a test substance as a drug that suppresses the production of GST-π, when the expression level is reduced compared to the case measured in the absence of the test substance, and where the drug is a substance selected from the group consisting of RNA interference molecules, ribozymes , antisense nucleic acids, DNA / RNA chimeric polynucleotides to DNA encoding GST-π, and vectors expressing at least one of them. 10. Применение лекарственного средства, подавляющего продукцию GST-π, и ингибитора BRAF, где лекарственное средство представляет собой вещество, выбранное из группы, состоящей из молекул РНК-интерференции, рибозимов, антисмысловых нуклеиновых кислот, ДНК/РНК-химерных полинуклеотидов к ДНК, кодирующей GST-π, и векторов, экспрессирующих по меньшей мере одно из них, для лечения рака, вызванного дефектом роста клетки, имеющей мутацию в гене BRAF.10. The use of a drug that suppresses the production of GST-π, and a BRAF inhibitor, where the drug is a substance selected from the group consisting of RNA interference molecules, ribozymes, antisense nucleic acids, DNA / RNA chimeric polynucleotides to DNA encoding GST-π, and vectors expressing at least one of them, for the treatment of cancer caused by a defect in the growth of a cell having a mutation in the BRAF gene.
RU2017139718A 2015-04-16 2016-04-15 Agent inducing cell death for cells having braf gene mutations, agent suppressing growth of such cells, and pharmaceutical composition for the therapy of diseases caused by growth defect of such cells RU2760835C2 (en)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015084286 2015-04-16
JP2015-084286 2015-04-16
JP2016078710A JP6864990B2 (en) 2015-04-16 2016-04-11 A cell death inducer for cells having a BRAF gene mutation, a growth inhibitor of the cells, and a pharmaceutical composition for treating a disease caused by abnormal growth of the cells.
JP2016-078710 2016-04-11
PCT/JP2016/062090 WO2016167340A1 (en) 2015-04-16 2016-04-15 Cell death inducing agent for cells having braf gene mutation, agent for inhibiting proliferation of said cells and pharmaceutical composition for treating patient suffering from effects of abnormal proliferation of said cells

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2017139718A RU2017139718A (en) 2019-05-16
RU2017139718A3 RU2017139718A3 (en) 2019-10-02
RU2760835C2 true RU2760835C2 (en) 2021-11-30

Family

ID=57127072

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2017139718A RU2760835C2 (en) 2015-04-16 2016-04-15 Agent inducing cell death for cells having braf gene mutations, agent suppressing growth of such cells, and pharmaceutical composition for the therapy of diseases caused by growth defect of such cells

Country Status (3)

Country Link
CN (1) CN116271056A (en)
RU (1) RU2760835C2 (en)
WO (1) WO2016167340A1 (en)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2947411T3 (en) 2017-10-26 2023-08-08 Xynomic Pharmaceuticals Inc Crystalline salts of a B-RAF kinase inhibitor field

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103619355A (en) * 2011-06-21 2014-03-05 日东电工株式会社 Apoptosis-inducing agent
WO2015001345A1 (en) * 2013-07-05 2015-01-08 Ucl Business Plc Methods for treating cancer

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6340162B2 (en) * 2012-12-20 2018-06-06 日東電工株式会社 Apoptosis inducer

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103619355A (en) * 2011-06-21 2014-03-05 日东电工株式会社 Apoptosis-inducing agent
WO2015001345A1 (en) * 2013-07-05 2015-01-08 Ucl Business Plc Methods for treating cancer

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SHAO Y. et al. BH3-only protein silencing contributes to acquired resistance to PLX4720 in human melanoma. Cell Death Differ. 2012 Dec; 19(12): 2029-39. *
TURLEY C.K. et al. GSTP1 Suppression Induces Apoptosis in Melanoma Cells Independent of BRAF Mutational Status. Journal of Surgical Research. 2012 Feb; 172(2): 229. *
ФЕДЯНИН М. Ю. и др. Перспективы лечения больных раком толстой кишки с мутацией в гене braf. Онкологическая колопроктология. 2014. N 3 [Найдено 20.09.2019] [он-лайн]. Найдено из Интернет: URL: https://cyberleninka.ru/article/n/perspektivy-lecheniya-bolnyh-rakom-tolstoy-kishki-s-mutatsiey-v-gene-braf . *
ФЕДЯНИН М. Ю. и др. Перспективы лечения больных раком толстой кишки с мутацией в гене braf. Онкологическая колопроктология. 2014. N 3 [Найдено 20.09.2019] [он-лайн]. Найдено из Интернет: URL: https://cyberleninka.ru/article/n/perspektivy-lecheniya-bolnyh-rakom-tolstoy-kishki-s-mutatsiey-v-gene-braf . TURLEY C.K. et al. GSTP1 Suppression Induces Apoptosis in Melanoma Cells Independent of BRAF Mutational Status. Journal of Surgical Research. 2012 Feb; 172(2): 229. SHAO Y. et al. BH3-only protein silencing contributes to acquired resistance to PLX4720 in human melanoma. Cell Death Differ. 2012 Dec; 19(12): 2029-39. *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2017139718A (en) 2019-05-16
RU2017139718A3 (en) 2019-10-02
CN116271056A (en) 2023-06-23
WO2016167340A1 (en) 2016-10-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7471361B2 (en) Cell death inducer for cells having BRAF gene mutation, proliferation inhibitor for said cells, and pharmaceutical composition for treating diseases caused by abnormal proliferation of said cells
AU2011371755B2 (en) Apoptosis-inducing agent
CA2895690C (en) Apoptosis-inducing agent comprising suppressors of gst-.pi. and akt
AU2015368496B2 (en) Cell death-inducing agent, cell growth-inhibiting agent, and pharmaceutical composition for treatment of disease caused by abnormal cell growth
US10780107B2 (en) Agent for inducing cell death, agent for suppressing cell proliferation, and pharmaceutical composition used for treatment of disease resulting from abnormal cell proliferation
EP3159009B1 (en) Inhibitors of gst-pi and rb1cc1 for use in the treatment of cancer
RU2760835C2 (en) Agent inducing cell death for cells having braf gene mutations, agent suppressing growth of such cells, and pharmaceutical composition for the therapy of diseases caused by growth defect of such cells
JP2021183618A (en) Cytostatic agent and pharmaceutical composition for treating or preventing cancer containing the same