RU2759517C9 - Method for obtaining pharmaceutical sulfated glycosaminoglycans from biological tissues - Google Patents

Method for obtaining pharmaceutical sulfated glycosaminoglycans from biological tissues Download PDF

Info

Publication number
RU2759517C9
RU2759517C9 RU2021109071A RU2021109071A RU2759517C9 RU 2759517 C9 RU2759517 C9 RU 2759517C9 RU 2021109071 A RU2021109071 A RU 2021109071A RU 2021109071 A RU2021109071 A RU 2021109071A RU 2759517 C9 RU2759517 C9 RU 2759517C9
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
solution
carried out
membrane
sulfated glycosaminoglycans
washed
Prior art date
Application number
RU2021109071A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2759517C1 (en
Inventor
Марина Ивановна Борисенко
Юлия Владимировна Захаренко
Анастасия Сергеевна Малюгина
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью "АВЕО"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью "АВЕО" filed Critical Общество с ограниченной ответственностью "АВЕО"
Priority to RU2021109071A priority Critical patent/RU2759517C9/en
Publication of RU2759517C1 publication Critical patent/RU2759517C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2759517C9 publication Critical patent/RU2759517C9/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
    • C08B37/0027—2-Acetamido-2-deoxy-beta-glucans; Derivatives thereof
    • C08B37/003—Chitin, i.e. 2-acetamido-2-deoxy-(beta-1,4)-D-glucan or N-acetyl-beta-1,4-D-glucosamine; Chitosan, i.e. deacetylated product of chitin or (beta-1,4)-D-glucosamine; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0069—Chondroitin-4-sulfate, i.e. chondroitin sulfate A; Dermatan sulfate, i.e. chondroitin sulfate B or beta-heparin; Chondroitin-6-sulfate, i.e. chondroitin sulfate C; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Abstract

FIELD: pharmaceutical industry.
SUBSTANCE: invention relates to the pharmaceutical industry and can be used to obtain sulfated glycosaminoglycans from biological tissues. Raw materials are cleaned, disinfected with sodium hypochlorite, washed with water, and crushed. Alkaline hydrolysis is carried out until the precipitate is completely dissolved. The resulting mixture is neutralized by acidification to pH 5.5-6.5. Enzymatic hydrolysis is carried out using a complex of enzymes papain, trypsin and chymotrypsin at a temperature of 30-40°C. Enzymes are deactivated by heating to a temperature of 65-70°C and the hot solution is sequentially filtered on membranes with a pore size on the final membrane of no more than 0.2 mcm. Ultrafiltration of the enzymatic hydrolyzate is carried out on a membrane with a retention limit of 2.5 kDa. The product retained on the membrane is washed with sodium chloride solution and concentrated to obtain a solution of sulfated glycosaminoglycans. A solution of sulfated glycosaminoglycans is filtered through a membrane with a pore size of 0.2 mcm and used as a finished product or sent to obtain a dry finished product.
EFFECT: invention makes it possible to obtain pharmaceutical compositions with a given percentage of specific sulfated glycosaminoglycans, to use a wider range of low-value by-products from which chondroitin sulfates can be isolated, to increase the yield of the target product, to more fully isolate accompanying aGAGs (dermatan sulfate, keratan sulfate), and also to increase the purity of the final product.
4 cl, 2 tbl, 4 ex

Description

Изобретение относится к области фармацевтической промышленности и может быть использовано для получения сульфатированных гликозаминогликанов, таких как хондроитин-4-сульфат, хондроитин-6-сульфат, дерматансульфат, кератансульфат.The invention relates to the pharmaceutical industry and can be used to obtain sulfated glycosaminoglycans, such as chondroitin-4-sulfate, chondroitin-6-sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate.

Гликозаминогликаны являются главными компонентами многих тканей, включая хрящи, кожу, сухожилия, связки. Гликозаминогликаны были обнаружены в пупочном канатике, артериях, роговице глаза, в клапанах сердца и аорте, селезенке, мозге, слюне. Известно несколько типов сульфатированных гликозаминогликанов (сГАГ). Наиболее изучены четыре представителя: хондроитин-4-сульфат, хондроитин-6-сульфат, дерматансульфат, кератансульфат.Glycosaminoglycans are major components of many tissues, including cartilage, skin, tendons, and ligaments. Glycosaminoglycans have been found in the umbilical cord, arteries, cornea, heart valves and aorta, spleen, brain, and saliva. Several types of sulfated glycosaminoglycans (sGAGs) are known. Four representatives have been most studied: chondroitin-4-sulfate, chondroitin-6-sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate.

Функции сГАГ: замещение в структуре протеогликанов, подавление биосинтеза медиаторов воспаления, повышение биосинтеза компонентов матрикса, подавление синергического действия ферментов и кислородных радикалов, подавление апоптоза, маскирование вторичных антигенных детерминант, маскирование вторичных антигенных детерминант и подавление хемотаксиса, построение коллагеновых волокон, стимулируют синтез гиалуроната.sGAG functions: substitution in the structure of proteoglycans, suppression of the biosynthesis of inflammatory mediators, increased biosynthesis of matrix components, suppression of the synergistic action of enzymes and oxygen radicals, suppression of apoptosis, masking of secondary antigenic determinants, masking of secondary antigenic determinants and suppression of chemotaxis, building collagen fibers, stimulate the synthesis of hyaluronate.

СГАГ используют в фармакологии и косметологии как основные вещества, а также в сочетании с гиалуронатом натрия.SGAG is used in pharmacology and cosmetology as the main substance, as well as in combination with sodium hyaluronate.

Для получения сГАГ используют субпродукты: хрящи, связки, трахеи, кожу, жилы крупного рогатого скота, роговицу глаз, ткани морских гидробионтов. Состав конечного продукта зависит от используемых субпродуктов. Содержание тех или иных сГАГ варьирует в различных тканях, что приведено в таблице 1.Offal is used to obtain sGAG: cartilage, ligaments, trachea, skin, veins of cattle, eye cornea, tissues of marine hydrobionts. The composition of the final product depends on the offal used. The content of certain sGAGs varies in different tissues, which is shown in Table 1.

Таблица 1Table 1

Наименование сГАГName sGAG Молекулярная масса, ДаMolecular weight, Yes Где содержится или был обнаруженWhere is contained or was found Кератан-сульфатKeratan sulfate от 4×103 до 20×103 from 4×10 3 to 20×10 3 Впервые выделен из роговицы глаза, позднее найден и в других тканях, включая кости скелета. Обнаружено, что протеогликановые комплексы КС в скелете и роговице различаются структурно и имеют разный метаболизм. КС присутствует в центральной нервной системе, обнаружена его функция как регулятора регенерации нейронов. В роговице, по данным сравнительного исследования, содержится в 10 раз больше КС, чем в хряще, и в 2–4 раза больше, чем в какой-либо иной ткани.First isolated from the cornea of the eye, later found in other tissues, including skeletal bones. It was found that the proteoglycan complexes of the SC in the skeleton and cornea differ structurally and have different metabolism. CS is present in the central nervous system, and its function as a regulator of neuronal regeneration has been discovered. The cornea, according to a comparative study, contains 10 times more CS than cartilage, and 2–4 times more than any other tissue. Хондроитин-
4-сульфат (Х4С)Chondroitin-
4-sulfate (X4C) от 5×103 до 100×103 from 5×10 3 to 100×10 3 Содержится в хрящевых и костных тканях, в трахеях, сердечных перегородках, преобладает в тканях животных и человека (~70%).Contained in cartilaginous and bone tissues, in tracheas, cardiac partitions, prevails in tissues of animals and humans (~70%). Хондроитин-
6-сульфат (Х6С)Chondroitin-
6-sulfate (X6C) от 5×103 до 100×103 from 5×10 3 to 100×10 3 Содержится в хрящевых и костных тканях. Х6С преобладает в тканях гидробионтов (до 80%), ранее его получали из хрящей (плавников) акулыFound in cartilaginous and bone tissues. X6C predominates in the tissues of aquatic organisms (up to 80%), previously it was obtained from shark cartilage (fins) Дерматан-сульфат (ДС)Dermatan sulfate (DS) от 15×103 до 40×103 from 15×10 3 to 40×10 3 Преобладает в тканях кожи, также встречается в сердечных клапанах, сухожилиях и стенках артерий, легких, лошадиной аорте, пуповине, коже свиньи, слизистой оболочке кишечника свиней, селезенке, межпозвоночном диске, мениске и др.Predominant in skin tissues, also found in heart valves, tendons and walls of arteries, lungs, horse aorta, umbilical cord, pig skin, pig intestinal mucosa, spleen, intervertebral disc, meniscus, etc.

Показано, что клиническая эффективность и безопасность зависит от природы и качества используемого для производства сырья, способов технологической переработки, степени очистки (Хондроитина сульфат натрия – примеси и проблемы стандартизации (обзор литературы) Е.Л. Комарова, С.В. Чернова, К.В. Касумова, М.С. Табачная, Л.В. Овсянникова, К.И. Эллер, «Российский биотерапевтический журнал», том 18, №1 (2019), с. 25-36).It has been shown that clinical efficacy and safety depend on the nature and quality of raw materials used for the production, methods of technological processing, degree of purification (Chondroitin sulfate sodium - impurities and problems of standardization (literature review) E.L. Komarova, S.V. Chernova, K. V. Kasumova, M. S. Tabachnaya, L. V. Ovsyannikova, K. I. Eller, Russian Journal of Biotherapy, Volume 18, No. 1 (2019), pp. 25-36.

Известны способы получения хондроитинсульфата из морских иглокожих, например, голотурий (заявка Японии 63-10601, 1988 г.) или хрящей животных ("Scand. Arch. Physrol." 1989. V.I, p.210-215), однако при этом получают неочищенные препараты, содержащие значительное количество примесей других полисахаридов и белков.Known methods for producing chondroitin sulfate from marine echinoderms, for example, holothurians (application of Japan 63-10601, 1988) or cartilage of animals ("Scand. Arch. Physrol." 1989. VI, p. 210-215), however, crude preparations containing a significant amount of impurities of other polysaccharides and proteins.

Известен способ, описанный в заявке FR 2491475 (1982 г.), при получении хондроитинсульфата А измельченные бычьи трахеи гидролизуют 1,25%-ным водным раствором пепсина при рH 4,5 и температуре 50oC в течение 12 ч, фермент инактивируют при 80-90oC, осадок отделяют центрифугированием, промывают горячей водой, промывные воды и надосадочную жидкость объединяют и последовательно обрабатывают сначала при рH 9-10, а затем при рH 6,5, нагревают до кипения, охлаждают, осадок отделяют, надосачную жидкость обрабатывают 5%-ным раствором цетилпиридинийхлорида, осадок отделяют, промывают метанолом, растворяют в воде, центрифугируют и осадок высушивают.A known method is described in the application FR 2491475 (1982), upon receipt of chondroitin sulfate A, crushed bovine tracheas are hydrolyzed with a 1.25% aqueous solution of pepsin at pH 4.5 and a temperature of 50 o C for 12 hours, the enzyme is inactivated at 80 -90 o C, the precipitate is separated by centrifugation, washed with hot water, the washings and the supernatant are combined and treated sequentially first at pH 9-10, and then at pH 6.5, heated to boiling, cooled, the precipitate is separated, the supernatant is treated with 5 % solution of cetylpyridinium chloride, the precipitate is separated, washed with methanol, dissolved in water, centrifuged and the precipitate is dried.

Известен способ получения хондроитинсульфата А, включающем ферментативный гидролиз бычьих трахей пепсином, инактивацию фермента при 80-90% отделение гидролизата центрифугированием, осаждение цетилпиридинийхлоридом, растворение осадка в воде и его сушку, гидролиз проводят 2-3 объемами 0,5-1%-ного раствора пепсина при 38-40°С и рH 1,5-2,0 в течение 4-6 ч, цетилпиридинийхлорид используют в количестве 2-4 г/л раствора, при этом перед осаждением гидролизат хроматографируют на колонке с диэтиламиноэтилцеллюлозой при использовании 1-2%-ной HCl в качестве элюента, а после растворения осадка в воде продукт высаливают хлоридом натрия из расчета 20-30 г/л при 2-4°С и целевой продукт получают обессоливанием диализом против воды при течение 12-16 ч (RU 2089557 С1, опубл. 10.09.1997).A known method for producing chondroitin sulfate A, including enzymatic hydrolysis of bovine trachea with pepsin, inactivation of the enzyme at 80-90% separation of the hydrolyzate by centrifugation, precipitation with cetylpyridinium chloride, dissolution of the precipitate in water and drying, hydrolysis is carried out with 2-3 volumes of a 0.5-1% solution pepsin at 38-40°C and pH 1.5-2.0 for 4-6 hours, cetylpyridinium chloride is used in an amount of 2-4 g/l of solution, while before precipitation, the hydrolyzate is chromatographed on a column of diethylaminoethylcellulose using 1-2 % HCl as an eluent, and after dissolving the precipitate in water, the product is salted out with sodium chloride at a rate of 20–30 g/l at 2–4°C, and the target product is obtained by desalting by dialysis against water for 12–16 h (RU 2089557 C1 , published 09/10/1997).

Известен способ получения хондроитинсульфата из носового хряща лосося, предусматривающий измельчение сырья, растворение хондроитинсульфата в щелочной среде, ферментативный гидролиз белков, отделение высокомолекулярной углеводной фракции осаждением от низкомолекулярных продуктов гидролиза белка, остающихся в растворе, промывку полученного осадка и сушку готового продукта (EP 1270599 A1, опубл. 02.01.2003).A known method for producing chondroitin sulfate from salmon nasal cartilage, which involves grinding raw materials, dissolving chondroitin sulfate in an alkaline medium, enzymatic hydrolysis of proteins, separating a high molecular weight carbohydrate fraction by precipitation from low molecular weight protein hydrolysis products remaining in solution, washing the resulting precipitate and drying the finished product (EP 1270599 A1, published 02.01.2003).

Известен также способ выделения сульфатированных гликозаминогликанов (RU 2304441 С1, опуб. 20.08.2007), который заключается в механической очистке биологической ткани, отмывке, гидролизе отмытой ткани активированным папаином, осаждением этанолом, при этом после механической очистки измельченную ткань промывают два раза нагретым фосфатным буфером в соотношении на 1 часть ткани 1,5–2 объема буфера и затем выдерживают в новой порции нагретого буфера в течение 15–30 минут, затем переваривают в растворе активированного папаина при нагревании в течение 6–24 часов, перевар охлаждают до 4°С и выдерживают при этой температуре в течение 2–24 часов, удаляют фильтрованием жиры и непереваренные остатки ткани, затем в течение времени от 10 до 24 часов селективно выделяют сульфатированные гликозаимногликаны на твердом носителе, полученном из коллагена костной ткани, носитель отмывают 0,05-0,1 н раствором соляной кислоты, обезжиривают, элюируют с носителя раствором 0,6-1,5 н минеральной соли в 0,8 н уксусной кислоте или 0,01-0,025 н раствором щелочи, осаждают сульфатированные гликозаминогликаны в этаноле, центрифугируют 15 минут при 1500 об/мин при 4°С, осадок отмывают этанолом или ацетоном, высушивают и стерилизуют.There is also known a method for isolating sulfated glycosaminoglycans (RU 2304441 C1, pub. 08/20/2007), which consists in mechanical cleaning of biological tissue, washing, hydrolysis of the washed tissue with activated papain, precipitation with ethanol, while after mechanical cleaning, the crushed tissue is washed twice with heated phosphate buffer in a ratio of 1.5–2 volumes of buffer to 1 part of tissue and then kept in a new portion of heated buffer for 15–30 minutes, then digested in a solution of activated papain when heated for 6–24 hours, the digest is cooled to 4 ° C and kept at this temperature for 2-24 hours, remove fats and undigested tissue residues by filtration, then for a period of 10 to 24 hours sulfated glycosaminoglycans are selectively isolated on a solid carrier obtained from bone tissue collagen, the carrier is washed with 0.05-0, 1 N hydrochloric acid solution, degreased, eluted from the carrier with a solution of 0.6-1.5 N mineral salt in 0.8 N acetic acid or 0.01-0.025 N alkali solution, sulfated glycosaminoglycans are precipitated in ethanol, centrifuged for 15 minutes at 1500 rpm at 4°C, the precipitate is washed with ethanol or acetone, dried and sterilized.

В данном способе используется метод селективной адсорбции сГАГ на твердом коллагеновом носителе с последующим элюированием. Данный метод является достаточно медленным, используются нерегенерируемые растворители (соляная кислота, уксусная кислота, щелочь). Также в данном способе используется без исключений этанол для получения конечного продукта. В данном способе невозможно получение конечного продукта с заданным процентным содержанием конкретных сульфатсодержащих гликозаминогликанов.This method uses the method of selective adsorption of sGAG on a solid collagen carrier, followed by elution. This method is quite slow, non-recoverable solvents are used (hydrochloric acid, acetic acid, alkali). Also in this method, without exception, ethanol is used to obtain the final product. In this method, it is impossible to obtain the final product with a given percentage of specific sulfate-containing glycosaminoglycans.

Наиболее близким к предложенному способу является способ получения хондроитина сульфата с применением ультрафильтрации (RU 2458134 С1, опубл. 10.08.2012), согласно которому хондроитина сульфат получают из тканей морских гидробионтов, предусматривающий подготовку сырья к ферментативному гидролизу, гидролиз протеолитическими ферментными препаратами с осаждением примеси белка и отделением осадка от раствора гидролизата, выделение целевого продукта посредством ультрафильтрации, при этом предварительно проводят щелочной гидролиз с нейтрализацией полученного раствора до рН 7 и отделением твердого осадка, в ферментативный гидролизат добавляют соль до значения не менее 0,1 моль/л, проводят ультрафильтрацию ферментативного гидролизата на мембране с пределом задержания 50 кДа и отделение высокомолекулярной примеси, полученный раствор при концентрации соли в нем не менее 0,1 моль/л подвергают ультрафильтрации на мембране с пределом задержания 5 кДа и отделяют низкомолекулярные вещества, удержанный на мембране хондроитина сульфат промывают на той же мембране дистиллированной водой до полного удаления солей, затем проводят промывку дистиллированной водой и концентрирование раствора хондроитина сульфата путем ультрафильтрации на мембране с пределом задержания 50 кДа. The closest to the proposed method is the method of obtaining chondroitin sulfate using ultrafiltration (RU 2458134 C1, publ. 08/10/2012), according to which chondroitin sulfate is obtained from the tissues of marine hydrobionts, providing for the preparation of raw materials for enzymatic hydrolysis, hydrolysis with proteolytic enzyme preparations with precipitation of protein impurities and separating the precipitate from the hydrolyzate solution, isolating the target product by ultrafiltration, while alkaline hydrolysis is first carried out with the neutralization of the resulting solution to pH 7 and separation of the solid precipitate, salt is added to the enzymatic hydrolyzate to a value of at least 0.1 mol/l, ultrafiltration of the enzymatic hydrolyzate on a membrane with a retention limit of 50 kDa and the separation of high molecular weight impurities, the resulting solution at a salt concentration of at least 0.1 mol/l is subjected to ultrafiltration on a membrane with a retention limit of 5 kDa and low molecular weight substances are separated, retained and on the membrane, chondroitin sulfate is washed on the same membrane with distilled water until the salts are completely removed, then washing with distilled water is carried out and the solution of chondroitin sulfate is concentrated by ultrafiltration on the membrane with a retention limit of 50 kDa.

Недостатками данного способа является невозможность получения различных сульфатированных гликозаминогликанов, таких как кератансульфата, дерматансульфата, т.к. используется мембрана при ультрафильтрации с достаточно большим размером пор, что приводит к потере кератансульфата и дерматансульфата. Также недостатками является сравнительно небольшой выход и невозможность использования широкого спектра субпродуктов, также невозможность контролировать состав конечного продукта.The disadvantages of this method is the impossibility of obtaining various sulfated glycosaminoglycans, such as keratan sulfate, dermatan sulfate, tk. a membrane is used in ultrafiltration with a sufficiently large pore size, which leads to the loss of keratan sulfate and dermatan sulfate. Also, the disadvantages are a relatively small yield and the inability to use a wide range of by-products, as well as the inability to control the composition of the final product.

Сульфатированные гликозаминогликаны (сГАГ) в тканях всегда присутствуют вместе, отличается лишь количественный состав. Промышленное разделение на отдельные сГАГ – сложный, длительный и затратный процесс, снижающий выход и возможность применения разнообразных малоценных субпродуктов. Целесообразно получение именно комплексов сГАГ, которые имеют большее сродство к тканям тела человека. Перспективно использование данных комплексов в косметологической практике для создания биологически совместимых гетерогенных матриксов, а также в офтальмологии.Sulfated glycosaminoglycans (sGAGs) are always present in tissues together, only the quantitative composition differs. Industrial separation into individual sGAGs is a complex, lengthy and costly process that reduces the yield and the possibility of using a variety of low-value by-products. It is expedient to obtain sGAG complexes, which have a greater affinity for the tissues of the human body. It is promising to use these complexes in cosmetology practice to create biologically compatible heterogeneous matrices, as well as in ophthalmology.

Данное изобретение решает техническую проблему получения фармацевтических композиций фармацевтического качества определенного состава с заданным процентным содержанием конкретных сульфатированных гликозаминогликанов, использования более широкого ассортимента малоценных субпродуктов, из которых можно выделить хондроитинсульфаты (4 и 6), повышения выхода целевого продукта, более полного выделения сопутствующих сГАГ (дерматансульфата, кератансульфата), а также повышение чистоты конечного продукта. This invention solves the technical problem of obtaining pharmaceutical compositions of pharmaceutical quality of a certain composition with a given percentage of specific sulfated glycosaminoglycans, using a wider range of low-value by-products from which chondroitin sulfates (4 and 6) can be isolated, increasing the yield of the target product, more complete isolation of concomitant sGAGs (dermatan sulfate , keratan sulfate), as well as increasing the purity of the final product.

Технический результат достигается способом получения сульфатированных гликозаминогликанов из биологических тканей, заключающимся в том, что сырье очищают, измельчают, проводят его щелочной гидролиз, полученную смесь нейтрализуют и проводят ферментативный гидролиз, проводят ультрафильтрацию ферментативного гидролизата, удержанный на мембране продукт промывают раствором хлорида натрия и концентрируют с получением раствора сульфатированных гликозаминогликанов, при этом, согласно изобретению, после очистки перед измельчением сырье обеззараживают гипохлоритом натрия, и промывают водой, щелочной гидролиз проводят до полного растворения осадка, нейтрализацию смеси проводят с последующим закислением до рН 5,5-6,5, ферментативный гидролиз проводят с использованием комплекса ферментов папаина, трипсина и химотрипсина при температуре 30-40°С, после чего дезактивируют ферменты нагреванием до температуры 65-70°С (указать интервал) и фильтруют горячий раствор последовательно на мембранах с размером пор на конечной мембране не более 0,2 мкм, ультрафильтрацию полученного ферментативного гидролизата проводят мембране с пределом задерживания 2,5 кДа, а полученный после промывания и концентрирования раствор сульфатированных гликозаминогликанов фильтруют через мембрану с размером пор 0,2 мкм и используют как готовый продукт или направляют на получение сухого готового продукта.The technical result is achieved by a method for obtaining sulfated glycosaminoglycans from biological tissues, which consists in the fact that the raw material is purified, crushed, alkaline hydrolysis is carried out, the resulting mixture is neutralized and enzymatic hydrolysis is carried out, ultrafiltration of the enzymatic hydrolyzate is carried out, the product retained on the membrane is washed with sodium chloride solution and concentrated with obtaining a solution of sulfated glycosaminoglycans, while, according to the invention, after cleaning before grinding, the raw material is disinfected with sodium hypochlorite and washed with water, alkaline hydrolysis is carried out until the precipitate is completely dissolved, the mixture is neutralized, followed by acidification to pH 5.5-6.5, enzymatic hydrolysis is carried out using a complex of papain, trypsin and chymotrypsin enzymes at a temperature of 30-40°C, after which the enzymes are deactivated by heating to a temperature of 65-70°C (specify the interval) and the hot solution is filtered sequentially on membranes with a size pores on the final membrane is not more than 0.2 µm, ultrafiltration of the resulting enzymatic hydrolyzate is carried out on a membrane with a retention limit of 2.5 kDa, and the solution of sulfated glycosaminoglycans obtained after washing and concentration is filtered through a membrane with a pore size of 0.2 µm and used as a finished product or sent to obtain a dry finished product.

Кроме того, предпочтительно использовать комплекс ферментов в виде раствора со следующими значениями концентрации: папаин 0,25-0,5 мас.%, трипсин 0,5-1 мас.%, химтрипсин 0,5-1 мас.%.In addition, it is preferable to use a complex of enzymes in the form of a solution with the following concentrations: papain 0.25-0.5 wt.%, trypsin 0.5-1 wt.%, chymtrypsin 0.5-1 wt.%.

Также предпочтительно проводить концентрирование до достижения концентрации 0,5-1% сульфатированных гликозаминогликанов.It is also preferable to carry out the concentration to achieve a concentration of 0.5-1% sulfated glycosaminoglycans.

При получении сухого готового продукта осуществляют осаждение этанолом из полученного после фильтрации раствора сульфатированных гликозаминогликанов и сушку полученного осадка. Upon receipt of a dry finished product, ethanol is precipitated from the solution of sulfated glycosaminoglycans obtained after filtration and the resulting precipitate is dried.

Техническим результатом предлагаемого способа по сравнению с прототипом является повышение выхода продукта вследствие использования комплекса ферментов и субпродукты гидролизуются практически полностью, что повышает эффективность отделения целевого продукта из смеси гидролизата, а также использование при ультрафильтрации мембраны с меньшим размером пор. Также техническим результатом предлагаемого способа по сравнению с прототипом является повышение чистоты конечного продукта в результате того, что раствор гидролизата последовательно фильтруют, прежде чем залить его в систему тангенцальной фильтрации на мембранах с размером пор на конечной мембране не более 0,2 мкм, ультрафильтрацию полученного ферментативного гидролизата проводят на мембране с пределом задерживания 2,5 кДа, а также полученный после промывания и концентрирования раствор сульфатированных гликозаминогликанов фильтруют через мембрану с размером пор 0,2 мкм. The technical result of the proposed method in comparison with the prototype is to increase the product yield due to the use of a complex of enzymes and by-products are hydrolyzed almost completely, which increases the efficiency of separating the target product from the hydrolyzate mixture, as well as the use of a membrane with a smaller pore size during ultrafiltration. Also, the technical result of the proposed method in comparison with the prototype is to increase the purity of the final product as a result of the fact that the hydrolyzate solution is sequentially filtered before pouring it into the tangential filtration system on membranes with a pore size on the final membrane of not more than 0.2 μm, ultrafiltration of the resulting enzymatic the hydrolyzate is carried out on a membrane with a retention limit of 2.5 kDa, and the solution of sulfated glycosaminoglycans obtained after washing and concentration is filtered through a membrane with a pore size of 0.2 μm.

Можно заранее установить, каким является %-ное содержание компонентов при использовании различного сырья в определенных рамках и получать композицию с содержанием компонентов, которое получается из определенного вида сырья. Кроме того, при использовании одновременно различных видов сырья процентное содержание в конечном продукте конкретного сГАГ будет зависеть от процентного содержания конкретного субпродукта на входе, так как в разных субпродуктах содержится разное количество определенного сГАГ. Так, например, в роговице содержится максимальное количество кератансульфата, и чем больше этого субпродукта в исходном сырье, тем больше кератансульфата в конечном продукте.It is possible to predetermine what the percentage content of components is when using different raw materials within certain limits and obtain a composition with a content of components that is obtained from a certain type of raw material. In addition, when using different types of raw materials at the same time, the percentage in the final product of a particular sGAG will depend on the percentage of a particular by-product at the input, since different by-products contain different amounts of a particular sGAG. So, for example, the cornea contains the maximum amount of keratan sulfate, and the more of this offal in the feedstock, the more keratan sulfate in the final product.

Предложенный способ осуществляется следующим образом.The proposed method is carried out as follows.

Подготовка материала. Особенностью данного способа является то, что в качестве субпродуктов для получения различных по составу фармацевтических композиций используют сырье, которое может иметь различный процентный состав субпродуктов, как это показано в таблице 2.Material preparation. A feature of this method is that as by-products for obtaining pharmaceutical compositions of various compositions, raw materials are used, which may have a different percentage of by-products, as shown in table 2.

Таблица 2table 2

СубпродуктOffal Содержание в сырье, %Content in raw materials, % Трахеи крупного рогатого скота (КРС)Trachea of cattle (cattle) 0 – 1000 - 100 Хрящи и синовиальные сумкиCartilage and bursae 0 – 1000 - 100 Хрящи носовой перегородки КРСCartilages of the nasal septum of cattle 0 – 1000 - 100 Клапаны сердцаHeart valves 0 – 1000 - 100 Сухожилия и связкиTendons and ligaments 0 – 1000 - 100 Кожа свиная, прошедшая мездрениеPig skin, minced 0 – 1000 - 100 Роговица глаз КРСThe cornea of the eye of cattle 0 – 1000 - 100

Вначале материал промывают в проточной воде для удаления крови, мусора. Материал тщательно обрезают от имеющихся на нем кусков жира и мяса. Особенностью данного способа является то, что материал обеззараживают веществами, содержащими активный хлор, предпочтительно раствором гипохлорита натрия с концентрацией 0,5–0,55% , вымачивая его в течение 24–36 часов в соотношении по массе 1 часть материала на 3–4 части раствора. После этого материал вынимают из раствора гипохлорита натрия и промывают дистиллированной водой 2–3 раза из расчета 1:1 по массе.First, the material is washed in running water to remove blood and debris. The material is carefully trimmed from pieces of fat and meat present on it. A feature of this method is that the material is disinfected with substances containing active chlorine, preferably with a solution of sodium hypochlorite with a concentration of 0.5–0.55%, soaking it for 24–36 hours in a ratio by weight of 1 part of the material to 3–4 parts solution. After that, the material is removed from the sodium hypochlorite solution and washed with distilled water 2–3 times at a rate of 1:1 by weight.

Измельчение. Материал пропускают через мясорубку и гомогенизируют в дисковом истирателе до размеров частиц 0,005-0,01 мм. Тщательность гомогенизации в значительной мере сказывается на выходе конечного продукта.Grinding. The material is passed through a meat grinder and homogenized in a disc grinder to a particle size of 0.005-0.01 mm. The thoroughness of homogenization greatly affects the yield of the final product.

Щелочной гидролиз. Особенностью данного способа является то, что щелочной гидролиз ведут при перемешивании при температуре 20–30°С в растворе гидроксида натрия с концентрацией 6,0–6,5% в течение 24–36 часов до полного растворения осадка. Для щелочного гидролиза берут 1 часть сырого материала на 1–2 части раствора гидроксида натрия по массе. Затем раствор нейтрализуют и закисляют до рН = 5,5 – 6,5 раствором соляной кислоты с концентрацией 0,5–1 моль/л.Alkaline hydrolysis. A feature of this method is that alkaline hydrolysis is carried out with stirring at a temperature of 20–30°C in a sodium hydroxide solution with a concentration of 6.0–6.5% for 24–36 hours until the precipitate is completely dissolved. For alkaline hydrolysis, take 1 part of raw material to 1-2 parts of sodium hydroxide solution by weight. Then the solution is neutralized and acidified to pH = 5.5 - 6.5 with a solution of hydrochloric acid with a concentration of 0.5-1 mol / l.

Ферментативный гидролиз. Особенностью данного способа является то, что после щелочного гидролиза на смесь действуют ферментативным папаин-трипсин-химотрипсиновым комплексом при соотношении ферментов по массе: папаина от 0,25% до 0,5%; трипсина от 0,5% до 1%; химотрипсина от 0,5% до 1%. На 1 л смеси после нейтрализации и закисления берут 100 мл раствора ферментного комплекса с общей концентрацией ферментов 2–3%. Ферментативный гидролиз ведут при температуре 30–40°С при перемешивании в течение 12–24 часов при поддержании рН = 5,5 – 6,5. По истечении заданного отрезка времени смесь нагревают до 70°С для дезактивации ферментов.enzymatic hydrolysis. A feature of this method is that after alkaline hydrolysis, the mixture is treated with an enzymatic papain-trypsin-chymotrypsin complex at a ratio of enzymes by weight: papain from 0.25% to 0.5%; trypsin from 0.5% to 1%; chymotrypsin from 0.5% to 1%. For 1 liter of the mixture after neutralization and acidification, 100 ml of an enzyme complex solution with a total enzyme concentration of 2–3% is taken. Enzymatic hydrolysis is carried out at a temperature of 30–40°C with stirring for 12–24 hours while maintaining pH = 5.5–6.5. After a predetermined period of time, the mixture is heated to 70°C to deactivate the enzymes.

Фильтрация. Особенностью данного способа является то, что смесь после ферментативного гидролиза нагрева не охлаждают, а сразу фильтруют на мембранах 1,2 мкм, затем 0,65 мкм, далее 0,45 ммк и далее 0,2 мкм. Стерильный фильтрат поступает в систему фильтрации по принципу обратного осмоса.Filtration. A feature of this method is that the mixture after enzymatic hydrolysis of heating is not cooled, but immediately filtered on membranes of 1.2 μm, then 0.65 μm, then 0.45 μm and then 0.2 μm. The sterile filtrate enters the filtration system on the principle of reverse osmosis.

Ультрафильтрация. Особенностью данного способа, является то, что раствор подвергают ультрафильтрационному разделению на мембране с молекулярно-массовым пределом задерживания 2,5 кДа для наиболее полного выхода сГАГ различной молекулярной массы и более полного удаления аминокислотно-белковой фракции и других примесей. Раствор после предыдущей нормальной фильтрации разбавляют в 2-3 раза стерильным раствором 0,9% хлорида натрия и вливают в тангенциальную установку. Раствор отмывают 2-3-кратным раствором 0,9% хлорида натрия от объема разбавленного раствора.Ultrafiltration. A feature of this method is that the solution is subjected to ultrafiltration separation on a membrane with a molecular weight retention limit of 2.5 kDa for the most complete release of sGAG of various molecular weights and a more complete removal of the amino acid-protein fraction and other impurities. The solution after the previous normal filtration is diluted 2-3 times with a sterile solution of 0.9% sodium chloride and poured into a tangential installation. The solution is washed with a 2-3-fold solution of 0.9% sodium chloride from the volume of the diluted solution.

Концентрирование. По окончании процесса отмывки начинают процесс концентрирования, для чего прекращают долив отмывочного раствора в систему ультрафильтрации, в результате чего происходит уменьшение объема не прошедшего через мембрану раствора, содержащего сГАГ, и концентрация его возрастает. Процесс ведут по достижении концентрации 0,5–2% целевого продукта в растворе.concentration. At the end of the washing process, the concentration process begins, for which the addition of the washing solution to the ultrafiltration system is stopped, as a result of which the volume of the solution containing sGAG that has not passed through the membrane decreases, and its concentration increases. The process is carried out upon reaching a concentration of 0.5–2% of the target product in solution.

Нормальная фильтрация на мембране 0,2 мкм. После концентрирования раствор фильтруют через мембрану 0,2 мкм. Полученный стерильный раствор комплекса целевых продуктов в физиологическом растворе хлорида натрия используют непосредственно, либо осаждают 96%-ным этанолом при объемном соотношении раствор:этанол = 1:3, затем осадок сушат, либо лиофильно сушат.Normal filtration on a 0.2 µm membrane. After concentration, the solution is filtered through a 0.2 μm membrane. The resulting sterile solution of the complex of target products in physiological sodium chloride solution is used directly, or precipitated with 96% ethanol at a volume ratio of solution:ethanol = 1:3, then the precipitate is dried or freeze-dried.

Целевой продукт. Выход сГАГ составляет от 1 до 10% по массе сухого вещества к сырым субпродуктам. Содержание основных веществ 98,3–98,5 мас.%. Содержание белка 0,02–0,025 мас.%. Содержание гиалуроната натрия 0,5–1 мас.%. Процентное содержание хондроитин-4-сульфата, хондроитин-6-сульфата, дерматансульфата и кератансульфата колеблется от 10% до 98% в зависимости от соотношения различных субпродуктов в начальной субстанции. Все проценты указаны по массе.target product. The output of sGAG is from 1 to 10% by weight of dry matter to raw by-products. The content of basic substances is 98.3–98.5 wt.%. Protein content 0.02–0.025 wt.%. The content of sodium hyaluronate is 0.5–1 wt.%. The percentage of chondroitin-4-sulfate, chondroitin-6-sulfate, dermatan sulfate and keratan sulfate ranges from 10% to 98%, depending on the ratio of various by-products in the initial substance. All percentages are by weight.

Содержание компонентов в целевом продукте определяли с помощью ВЭЖХ и ИК–спектрометрии. Содержание основных веществ может составлять 98,3–98,5 мас.%. Содержание белка – 0,02–0,025 мас.%. Содержание гиалуроната натрия – 0,5–1 мас.%. Было показано, что содержание хондроитинсульфатов (4 и 6) может колебаться от 30% до 98,5%; дерматансульфатов от 0,5% до 20,5%; кератансульфатов 0,15% до 80,5%, что зависит от соотношения субпродуктов в сырье. Молекулярная масса компонентов в целевом продукте составляет от 2,5⋅103 Да до 100⋅103 Да. Вязкость 1% раствора составляет от 50 мПа⋅с до 230 мПа⋅с.The content of components in the target product was determined using HPLC and IR spectrometry. The content of basic substances can be 98.3–98.5 wt.%. The protein content is 0.02–0.025 wt.%. The content of sodium hyaluronate is 0.5–1 wt.%. It has been shown that the content of chondroitin sulfates (4 and 6) can range from 30% to 98.5%; dermatan sulfates from 0.5% to 20.5%; keratan sulfates 0.15% to 80.5%, depending on the ratio of offal in the raw material. The molecular weight of the components in the target product ranges from 2.5⋅10 3 Da to 100⋅10 3 Da. The viscosity of a 1% solution ranges from 50 mPa⋅s to 230 mPa⋅s.

Пример 1Example 1

Получение сГАГ из трахей КРС (100%)Obtaining sGAG from bovine trachea (100%)

Взяли 1 кг очищенных и промытых бычьих трахей. Залили раствором гипохлорита натрия в количестве 3,5 л, содержащего 0,5% гипохлорита натрия, и оставили для отбеливания и дезинфекции материала на 24 часа. Затем жидкость слили, трахеи промыли три раза по 1 л дистиллированной водой.We took 1 kg of cleaned and washed bovine trachea. Filled with a solution of sodium hypochlorite in the amount of 3.5 liters containing 0.5% sodium hypochlorite, and left to bleach and disinfect the material for 24 hours. Then the liquid was drained, the trachea was washed three times with 1 liter of distilled water.

Промытый материал пропустили через мясорубку. Измельченный материал поместили в дисковый истиратель. Измельчали в течение 20 минут. The washed material was passed through a meat grinder. The crushed material was placed in a disc grinder. Crushed for 20 minutes.

Кашеобразную массу залили 1 л раствора гидроксида натрия, содержащего 65 г основания (6,5%), поставили на мешалку. Суспензию гидролизовали в течение 36 часов при температуре 23°С при перемешивании.The mushy mass was poured into 1 liter of sodium hydroxide solution containing 65 g of base (6.5%), placed on a stirrer. The suspension was hydrolyzed for 36 hours at 23° C. with stirring.

Смесь нейтрализовали и закислили 1 молярным раствором соляной кислоты в объеме 1630 мл.The mixture was neutralized and acidified with 1 molar hydrochloric acid in a volume of 1630 ml.

В смесь влили раствор папаин-трипсин-химотрипсинового комплекса в объеме 363 мл, содержащего 1,452 г папаина (0,4%), 2,904 г трипсина (0,8%) и 2,904 г химотрипсина (0,8%). Ферментолиз проводили в течение 24 часов при температуре 35°С при рН = 5,5. По истечении заданного отрезка времени смесь нагрели до 70°С для дезактивации ферментов.A solution of papain-trypsin-chymotrypsin complex was poured into the mixture in a volume of 363 ml, containing 1.452 g of papain (0.4%), 2.904 g of trypsin (0.8%) and 2.904 g of chymotrypsin (0.8%). Fermentolysis was carried out for 24 hours at a temperature of 35°C at pH = 5.5. After a given period of time, the mixture was heated to 70°C to deactivate the enzymes.

Смесь после ферментативного гидролиза и нагрева не охлаждали, а сразу фильтровали на мембранах 1,2 мкм, затем 0,65 мкм, далее 0,45 мкм и далее 0,2 мкм.The mixture after enzymatic hydrolysis and heating was not cooled, but immediately filtered on membranes of 1.2 μm, then 0.65 μm, then 0.45 μm, and then 0.2 μm.

Стерильный фильтрат разбавили 12 литрами 0,9% раствора хлорида натрия и влили в систему тангенциальной фильтрации с мембраной 2,5 кДа.The sterile filtrate was diluted with 12 liters of 0.9% sodium chloride solution and poured into a tangential filtration system with a 2.5 kDa membrane.

В ходе процесса ультрафильтрации в систему влили еще 30 л 0,9% раствора хлорида натрия для промывки.During the ultrafiltration process, another 30 liters of 0.9% sodium chloride solution was poured into the system for flushing.

Раствор сконцентрировали до объема 8,2 л.The solution was concentrated to a volume of 8.2 liters.

Затем раствор профильтровали через мембрану 0,2 мкм. Получили прозрачный стерильный раствор с содержанием 1% сГАГ в растворе в 0,9%-ном растворе хлориде натрия. Выход целевого продукта составил 7,7% по массе. Содержание основных веществ 98,7 мас.%. Содержание хондроитинсульфатов 4, 6 составило 97,71 мас.%; дерматансульфатов – 0,43 мас.%; кератансульфатов – 0,015 мас.%; гиалуроната натрия – 0,55 мас.%. Содержание белка в сухом веществе составил 0,023 мас.%. Вязкость 1% раствора составила 230 мПа⋅с.The solution was then filtered through a 0.2 μm membrane. Received a clear sterile solution containing 1% sGAG in solution in 0.9% sodium chloride solution. The yield of the target product was 7.7% by weight. The content of basic substances 98.7 wt.%. The content of chondroitin sulfates 4, 6 was 97.71 wt.%; dermatan sulfates - 0.43 wt.%; keratan sulfates - 0.015 wt.%; sodium hyaluronate - 0.55 wt.%. The protein content in dry matter was 0.023 wt.%. The viscosity of a 1% solution was 230 mPa⋅s.

Пример 2.Example 2

Получение сГАГ из хрящей носовых перегородок КРС (50 %) и свиной кожи, прошедшей мездрение (50%).Obtaining sGAG from the cartilage of the nasal septa of cattle (50%) and porcine skin that has undergone skinning (50%).

Взяли 500 г очищенных и промытых хрящей носовых перегородок КРС и 500 г очищенной, промытой и прошедшей мездрение свиной кожи.We took 500 g of cleaned and washed cartilage of the nasal septa of cattle and 500 g of cleaned, washed and minced porcine skin.

Проводили процесс как описано в примере 1.The process was carried out as described in example 1.

Раствор сконцентрировали до объема 3 л.The solution was concentrated to a volume of 3 liters.

Затем раствор профильтровали через мембрану 0,2 мкм. Получили прозрачный стерильный раствор. The solution was then filtered through a 0.2 μm membrane. Received a clear sterile solution.

Затем раствор осадили 9 литрами 96%-ного этанола, охлажденного до температуры 4°С.The solution was then precipitated with 9 liters of 96% ethanol cooled to 4°C.

Материал высушили и получили 14,3 г сухого целевого продукта.The material was dried and 14.3 g of dry target product was obtained.

Выход целевого продукта составил 1,43%. Содержание основных веществ – 98,3 мас.%. Содержание белка в сухом веществе составило 0,025 мас.%. Вязкость 1% раствора составило 152 мПа⋅с. Содержание компонентов в целевом продукте определяли с помощью ВЭЖХ и ИК – спектрометрии. Содержание хондроитина сульфатов 4, 6 составило 89,4 мас.%; дерматансульфатов – 9,3 мас.%; кератансульфатов – 0,17 мас.%; гиалуроната натрия – 0,95 мас.%. The yield of the target product was 1.43%. The content of basic substances - 98.3 wt.%. The protein content in dry matter was 0.025 wt.%. The viscosity of a 1% solution was 152 mPa⋅s. The content of components in the target product was determined using HPLC and IR spectrometry. The content of chondroitin sulfates 4, 6 was 89.4 wt.%; dermatan sulfates - 9.3 wt.%; keratan sulfates - 0.17 wt.%; sodium hyaluronate - 0.95 wt.%.

Пример 3.Example 3

Получение сГАГ из роговицы глаз (100%).Obtaining sGAG from the cornea of the eyes (100%).

Взяли 1000 г очищенных и промытых роговиц КРС.We took 1000 g of cleaned and washed bovine corneas.

Проводили процесс как описано в примере 1.The process was carried out as described in example 1.

Раствор сконцентрировали до объема 2,6 л.The solution was concentrated to a volume of 2.6 liters.

Затем раствор профильтровали через мембрану 0,2 мкм. Получили прозрачный стерильный раствор. The solution was then filtered through a 0.2 μm membrane. Received a clear sterile solution.

Затем раствор осадили 7,8 литрами 96%-ного этанола, охлажденного до температуры 4°С.The solution was then precipitated with 7.8 liters of 96% ethanol cooled to 4°C.

Материал высушили и получили 10,9 г сухого целевого продукта.The material was dried and 10.9 g of dry target product was obtained.

Выход целевого продукта составил 1,09%. Содержание основных веществ – 98,45 мас.%. Содержание белка в сухом веществе составило 0,02 мас.%. Вязкость 1%-ного раствора составило 50 мПа⋅с. Содержание компонентов в целевом продукте определяли с помощью ВЭЖХ и ИК – спектрометрии. Содержание кератансульфата составило 77,8 мас.%; хондроитинсульфатов (4 и 6) – 18,2 мас.%; дерматансульфатов – 2,6 мас.%; гиалуроната натрия – 1,05 мас.%. The yield of the target product was 1.09%. The content of basic substances - 98.45 wt.%. The protein content in dry matter was 0.02 wt.%. The viscosity of a 1% solution was 50 mPa⋅s. The content of components in the target product was determined using HPLC and IR spectrometry. The content of keratan sulfate was 77.8 wt.%; chondroitin sulfates (4 and 6) - 18.2 wt.%; dermatan sulfates - 2.6 wt.%; sodium hyaluronate - 1.05 wt.%.

Пример 4.Example 4

Получение сГАГ из суставных хрящей (50%), синовиальных сумок (25%) и роговицы глаз (25%).Obtaining sGAG from articular cartilage (50%), synovial bursae (25%) and eye cornea (25%).

Взяли 500 г суставных хрящей КРС, 250 г синовиальных сумок КРС и 250 г роговицы глаз КРС.We took 500 g of bovine articular cartilage, 250 g of bovine synovial bags and 250 g of bovine eye cornea.

Проводили процесс как описано в примере 1.The process was carried out as described in example 1.

Раствор сконцентрировали до объема 4,5 л.The solution was concentrated to a volume of 4.5 liters.

Затем раствор профильтровали через мембрану 0,2 мкм. Получили прозрачный стерильный раствор.The solution was then filtered through a 0.2 μm membrane. Received a clear sterile solution.

Затем раствор осадили 13,5 литрами 96%-ного этанола, охлажденного до температуры 4°С.The solution was then precipitated with 13.5 liters of 96% ethanol cooled to 4°C.

Материал высушили и получили 55,7 г сухого целевого продукта.The material was dried and 55.7 g of dry target product was obtained.

Выход целевого продукта составил 5,57%. Содержание основных веществ – 98,35 мас.%. Содержание белка в сухом веществе составило 0,022 мас.%. Вязкость 1% раствора составило 97 мПа⋅с. Содержание компонентов в целевом продукте определяли с помощью ВЭЖХ и ИК – спектрометрии. Содержание кератансульфата составило 19,7 мас.%; хондроитинсульфатов (4 и 6) – 78,1 мас.%; дерматансульфата – 1,8 мас.%; гиалуроната натрия – 0,22 мас.%. The yield of the target product was 5.57%. The content of basic substances - 98.35 wt.%. The protein content in dry matter was 0.022 wt.%. The viscosity of a 1% solution was 97 mPa⋅s. The content of components in the target product was determined using HPLC and IR spectrometry. The content of keratan sulfate was 19.7 wt.%; chondroitin sulfates (4 and 6) - 78.1 wt.%; dermatan sulfate - 1.8 wt.%; sodium hyaluronate - 0.22 wt.%.

Claims (4)

1. Способ получения сульфатированных гликозаминогликанов из биологических тканей, заключающийся в том, что сырье очищают, измельчают, проводят его щелочной гидролиз, полученную смесь нейтрализуют и проводят ферментативный гидролиз, проводят ультрафильтрацию ферментативного гидролизата, удержанный на мембране продукт промывают раствором хлорида натрия и концентрируют с получением раствора сульфатированных гликозаминогликанов, отличающийся тем, что после очистки перед измельчением сырье обеззараживают гипохлоритом натрия, и промывают водой, щелочной гидролиз проводят до полного растворения осадка, нейтрализацию смеси проводят с последующим закислением до рН 5,5-6,5, ферментативный гидролиз проводят с использованием комплекса ферментов папаина, трипсина и химотрипсина при температуре 30-40°С, после чего дезактивируют ферменты нагреванием до температуры 65-70°С и фильтруют горячий раствор последовательно на мембранах с размером пор на конечной мембране не более 0,2 мкм, ультрафильтрацию полученного ферментативного гидролизата проводят мембране с пределом задерживания 2,5 кДа, а полученный после промывания и концентрирования раствор сульфатированных гликозаминогликанов фильтруют через мембрану с размером пор 0,2 мкм и используют как готовый продукт или направляют на получение сухого готового продукта.1. A method for obtaining sulfated glycosaminoglycans from biological tissues, which consists in the fact that the raw material is purified, crushed, alkaline hydrolysis is carried out, the resulting mixture is neutralized and enzymatic hydrolysis is carried out, ultrafiltration of the enzymatic hydrolyzate is carried out, the product retained on the membrane is washed with sodium chloride solution and concentrated to obtain a solution of sulfated glycosaminoglycans, characterized in that after cleaning, before grinding, the raw material is disinfected with sodium hypochlorite and washed with water, alkaline hydrolysis is carried out until the precipitate is completely dissolved, the mixture is neutralized, followed by acidification to pH 5.5-6.5, enzymatic hydrolysis is carried out using complex of papain, trypsin and chymotrypsin enzymes at a temperature of 30-40°C, after which the enzymes are deactivated by heating to a temperature of 65-70°C and the hot solution is filtered sequentially on membranes with a pore size on the final membrane of not more than 0.2 μm, ultrafiltration by The resulting enzymatic hydrolyzate is passed to a membrane with a retention limit of 2.5 kDa, and the solution of sulfated glycosaminoglycans obtained after washing and concentration is filtered through a membrane with a pore size of 0.2 μm and used as a finished product or sent to obtain a dry finished product. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют комплекс ферментов в виде раствора со следующими значениями концентрации: папаин 0,25-0,5 мас.%, трипсин 0,5-1 мас.%, химтрипсин 0,5-1 мас.%.2. The method according to p. 1, characterized in that a complex of enzymes is used in the form of a solution with the following concentrations: papain 0.25-0.5 wt.%, trypsin 0.5-1 wt.%, chymtrypsin 0.5- 1 wt%. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что концентрирование проводят до достижения концентрации 0,5-1% сульфатированных гликозаминогликанов.3. The method according to p. 1, characterized in that the concentration is carried out until a concentration of 0.5-1% sulfated glycosaminoglycans is reached. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что получение сухого готового продукта осуществляют путем осаждения этанолом из полученного после фильтрации раствора сульфатированных гликозаминогликанов и сушки полученного осадка.4. The method according to claim 1, characterized in that the preparation of a dry finished product is carried out by precipitation with ethanol from the solution of sulfated glycosaminoglycans obtained after filtration and drying the resulting precipitate.
RU2021109071A 2021-04-02 2021-04-02 Method for obtaining pharmaceutical sulfated glycosaminoglycans from biological tissues RU2759517C9 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2021109071A RU2759517C9 (en) 2021-04-02 2021-04-02 Method for obtaining pharmaceutical sulfated glycosaminoglycans from biological tissues

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2021109071A RU2759517C9 (en) 2021-04-02 2021-04-02 Method for obtaining pharmaceutical sulfated glycosaminoglycans from biological tissues

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2759517C1 RU2759517C1 (en) 2021-11-15
RU2759517C9 true RU2759517C9 (en) 2022-01-20

Family

ID=78607226

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2021109071A RU2759517C9 (en) 2021-04-02 2021-04-02 Method for obtaining pharmaceutical sulfated glycosaminoglycans from biological tissues

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2759517C9 (en)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3936351A (en) * 1973-06-14 1976-02-03 Opocrin S.R.L. Method for preparing glucoronyl-glucosamino-glycan sulphates exhibiting antilipasaemic activity
RU2118524C1 (en) * 1996-07-02 1998-09-10 Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" Method of sulfated glycoseaminoglycans preparing
RU2155025C1 (en) * 1999-12-14 2000-08-27 Панасюк Андрей Федорович Method of preparing biocompatible dental material
RU2278655C1 (en) * 2005-04-15 2006-06-27 Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная компания ВИТАФОРМ-Р" Method for production of biocompatible dental material
RU2304441C1 (en) * 2005-10-27 2007-08-20 Дмитрий Алексеевич Саващук Method for obtaining sulfated glycosaminoglycans out of biological tissues
US7943764B2 (en) * 2005-10-27 2011-05-17 Dimitry Alekseevich Savaschuk Method for producing sulphated glycosaminoglycans from biological tissues
RU2458134C1 (en) * 2010-12-27 2012-08-10 ФГУП Полярный научно-исследовательский институт морского рыбного хозяйства и океанографии им. Н.М. Книповича (ФГУП ПИНРО) Method of producing chondroitin sulphate from sea hydrobiont tissue

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3936351A (en) * 1973-06-14 1976-02-03 Opocrin S.R.L. Method for preparing glucoronyl-glucosamino-glycan sulphates exhibiting antilipasaemic activity
RU2118524C1 (en) * 1996-07-02 1998-09-10 Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" Method of sulfated glycoseaminoglycans preparing
RU2155025C1 (en) * 1999-12-14 2000-08-27 Панасюк Андрей Федорович Method of preparing biocompatible dental material
RU2278655C1 (en) * 2005-04-15 2006-06-27 Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная компания ВИТАФОРМ-Р" Method for production of biocompatible dental material
RU2304441C1 (en) * 2005-10-27 2007-08-20 Дмитрий Алексеевич Саващук Method for obtaining sulfated glycosaminoglycans out of biological tissues
US7943764B2 (en) * 2005-10-27 2011-05-17 Dimitry Alekseevich Savaschuk Method for producing sulphated glycosaminoglycans from biological tissues
RU2458134C1 (en) * 2010-12-27 2012-08-10 ФГУП Полярный научно-исследовательский институт морского рыбного хозяйства и океанографии им. Н.М. Книповича (ФГУП ПИНРО) Method of producing chondroitin sulphate from sea hydrobiont tissue

Also Published As

Publication number Publication date
RU2759517C1 (en) 2021-11-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Abdallah et al. Hyaluronic acid and Chondroitin sulfate from marine and terrestrial sources: Extraction and purification methods
CA2435392C (en) Desiccated avian sternal cartilage powder
CN112410392A (en) Extraction method and application of type I collagen
WO2007131424A1 (en) Method for preparing low molecular weight proteoglycan and collagen compositions, its products and uses
KR20170055645A (en) Preparing method of atelocollagen and succinylated atelocollagen
CA3099905A1 (en) Methods for producing collagen
KR101916759B1 (en) The Method of High-yield and High-purity Manufacturing of Allo-collagen Composition Extracted From Human origin
RU2759517C9 (en) Method for obtaining pharmaceutical sulfated glycosaminoglycans from biological tissues
US20050130272A1 (en) Mucopolysaccharides and process for producing the same
KR100647033B1 (en) Process for preparing sterilized pure water-soluble collagen peptide
JPS5837001A (en) Production of hyaluronic acid
JP5043215B1 (en) Type II collagen obtained by a simple extraction method from sturgeon notochord
KR20070063096A (en) Manufacturing method for chondroitin sulfate from feet of fowl
Matinong et al. Collagen Extraction from Animal Skin. Biology 2022, 11, 905
KR20040108147A (en) producing method of protein hydrolysates from fish scale
WO2023082523A1 (en) Method for improving extraction rate of chondroitin sulfate prepared from tilapia skull
JP3521238B2 (en) Type I collagen with high hydroxylation ratio
RU2562581C1 (en) Method of producing biologically active agent from sea cucumber, having general tonic and immunomodulating properties
RU2304441C1 (en) Method for obtaining sulfated glycosaminoglycans out of biological tissues
JPS6284025A (en) Production of hydrolyzed placenta-insoluble protein having fibroblast cell proliferation promoting action
US20190263891A1 (en) Process for isolating bioactive biomolecules from animal by-products
Kuleshova et al. Glycosaminoglycans of the trabecular meshwork of the eye in primary juvenile glaucoma
KR102502522B1 (en) Method for extracting extracellular matrix and collagen from adipose tissue
CN109601881A (en) A kind of formula food and preparation method thereof enhancing joint bone density
JP7138873B2 (en) Methods for producing collagen-containing compositions and collagen isolates

Legal Events

Date Code Title Description
TK4A Correction to the publication in the bulletin (patent)

Free format text: CORRECTION TO CHAPTER -FG4A- IN JOURNAL 32-2021 FOR INID CODE(S) (54)

TH4A Reissue of patent specification