RU2753693C1 - Способ выявления повышенной клеточно-опосредованной цитотоксичности лимфоцитов у людей в условиях арктики - Google Patents

Способ выявления повышенной клеточно-опосредованной цитотоксичности лимфоцитов у людей в условиях арктики Download PDF

Info

Publication number
RU2753693C1
RU2753693C1 RU2020124876A RU2020124876A RU2753693C1 RU 2753693 C1 RU2753693 C1 RU 2753693C1 RU 2020124876 A RU2020124876 A RU 2020124876A RU 2020124876 A RU2020124876 A RU 2020124876A RU 2753693 C1 RU2753693 C1 RU 2753693C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
lymphocytes
cells
mediated cytotoxicity
people
increased cell
Prior art date
Application number
RU2020124876A
Other languages
English (en)
Inventor
Елизавета Юрьевна Шашкова
Оксана Евгеньевна Филиппова
Ольга Сергеевна Морозова
Любовь Станиславовна Щёголева
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр комплексного изучения Арктики имени академика Н.П. Лаверова Уральского отделения Российской академии наук
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр комплексного изучения Арктики имени академика Н.П. Лаверова Уральского отделения Российской академии наук filed Critical Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр комплексного изучения Арктики имени академика Н.П. Лаверова Уральского отделения Российской академии наук
Priority to RU2020124876A priority Critical patent/RU2753693C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2753693C1 publication Critical patent/RU2753693C1/ru

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/49—Blood
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области физиологии, иммунологии, лабораторной диагностики и предназначено для выявления повышенной клеточно-опосредованной цитотоксичности лимфоцитов у людей в условиях Арктики. В периферической венозной крови обследуемых лиц определяют общее число лимфоцитов и содержание средних лимфоцитов размером 8-12 мкм в составе лимфоцитограммы. При содержании общего числа лимфоцитов более 2,5×109 кл/л и средних лимфоцитов размером 8-12 мкм в лимфоцитограмме более 0,35×109 кл/л судят о повышенной клеточно-опосредованной цитотоксичности лимфоцитов. Изобретение позволяет выявить людей, имеющих риск патологии, связанной с вторичным экологически зависимым иммунодефицитом, склонностью к хронизации заболеваний бактериального и вирусного генеза. 8 пр.

Description

Изобретение относится к области физиологии, иммунологии, лабораторной диагностики и касается способа быстрого выявления повышенной клеточно-опосредованной цитотоксичности лимфоцитов у людей в условиях Арктики.
За последние годы развитие российской Арктики приобрело на государственном уровне статус крупного национального мегапроекта, призванного обеспечить долгосрочные геоэкономические и геополитические интересы развития России. Устойчивое развитие российских арктических территорий возможно лишь в том случае, если наряду с политическими и экономическими вопросами будет обеспечен значительный прогресс в условиях жизни и состоянии здоровья населения. Климатические изменения выступают в качестве фактора риска социально-экономического развития Арктики [Ревич Б.А., Харькова Т.Л., Подольная М.А. Динамика смертности и ожидаемой продолжительности жизни населения арктического / приарктического региона России в 1999-2014 годах // Экология человека. - 2017. - №9. - С. 48-58]. Иммунологическая реактивность жителей Арктики характеризуется повышенным уровнем иммуносупрессии, что выражается в увеличении содержания в крови лимфоцитов CD8+ в среднем у 22,73% взрослых практически здоровых людей (у детей 8,01%). Высокие уровни регистрации повышенной активности цитотоксических лимфоцитов были выявлены у жителей НАО, в городах Архангельск, Новодвинск и Северодвинск [Айвазова М.С. Физиологический статус иммунной системы у местных и иногородних студентов старших курсов вузов г. Архангельска: автореф. дис. … канд. биол. наук. - Архангельск, 2011. - 16 с.; Добродеева Л.К. Иммунологическое районирование. - Сыктывкар, 2001. - С.57; Щеголева Л.С. Резервные возможности иммунного гомеостаза у человека на Севере: автореф. дис. докт. биол. наук. - Архангельск, 2005. - 38 с.]. У коренных малочисленных народов Севера увеличение числа лимфоцитов CD8+ отмечается у 62,5% лиц, ведущих кочевой образ жизни, и у 45,3% оседлых жителей, у 67,3% лиц до 40 лет и у 59,0% лиц старше 40 лет [Иммунный гомеостаз у кочующего и оседлого населения европейского севера России: [+16] / Л.С. Щеголева, Т.Б. Сергеева, Е.Ю. Шашкова, О.Е. Филиппова; Федер. гос. бюджет. Учреждение науки Ин-т физиологии природ. Адаптаций Урал. Отд-ния Рос. Акад. наук. - Архангельск, 2016. - 102 с.: табл., ил. - ISBN 978-5-7536-0448-4.https://elibrary.ru/item.asp?id=381616241. Похожая картина наблюдается и относительно содержания в крови натуральных киллеров (NK): уровень клеток CD16+ сверх нормативных пределов выявлен у 45,8% людей, ведущих кочевой образ жизни, и у 40,0% оседлых жителей, у 53,8% лиц до 40 лет и у 44,3% лиц старше 40 лет [Сергеева Т.Б. Физиологическая значимость содержания цитотоксических лимфоцитов (CD8+, CD16+) в периферической крови у человека на Севере: автореф. дис.…канд. биол. наук. - Архангельск, 2015. - 18 с.; Добродеева Л.К., Филиппова О.Е., Балашова С.Н. Соотношение содержания иммунокомпетентных клеток в регуляции иммунного статуса человека, проживающего на Севере // Вестн. Урал. мед. академ. науки. 2014. №2(48). С. 132-134; Филиппова О.Е. Соотношение фенотипов лимфоцитов периферической крови у людей в процессе физиологической регуляции иммунного ответа: автореф. дис. … канд. биол. наук. Архангельск, 2015. 18 с.].
В ситуации патологических отклонений в состоянии здоровья жителей Арктики указанный дефект иммунологической реактивности значительно усугубляется. Так, усиление цитотоксической активности лимфоцитов CD16+ происходит у 73,2% людей с патологией системы кровообращения (среднее содержание клеток 0,52±0,05×109кл/л), у 65,3% лиц с болезнями органов дыхания (0,89±0,08×109кл/л), у 75,2% людей с заболеваниями органов пищеварения (0,57±0,09×109кл/л) [Добродеева Л.К., Жилина Л.П. Иммунологическая реактивность, состояние здоровья населения Архангельской области. - Екатеринбург: УрО РАН, 2004. - С. 113]. Можно предположить, что увеличение клеточно-опосредованной цитотоксичности лимфоцитов обусловлено воздействием на человека комплекса экстремальных климато-географических факторов Арктического региона. Данный комплекс включает сочетанное влияние низкого радиационного баланса, арктического воздуха с близкими к 0°С средними летними температурами при отрицательной среднегодовой температуре, сменяющие друг друга периоды полярного дня и полярной ночи [Проявление адаптации и дизадаптации у жителей Крайнего Севера / А.П. Авцын, А.Г. Марачев // Физиол. человека. - 1975. - №4. - С. 3-14; Агаджанян Н.А., Александров С.И., Аптикаева О.И. и др. Экология человека в изменяющемся мире / Под ред. В.А. Черепшева. - Екатеринбург: УрО РАН, 2006. - 562 с.]. Как следствие гиперфункции супрессорного звена иммунитета начинают появляться и нарастать концентрации ЦИК, иммуноглобулинов и аутоантител, формируется недостаточность фагоцитарной активности нейтрофилов и дефицит зрелых функционально активных CD3+ лимфоцитов [Добродеева Л.К. Влияние среды обитания на иммунологическую реактивность, медико-демографические показатели и заболеваемость населения Архангельской области / Л.К. Добродеева, Л.П. Жилина. - Архангельск, 2003. - С. 250; Щеголева Л.С. Содержание клеток CD8+ и CD16+ у жителей разных возрастных групп, проживающих в Арктической зоне / Л.С. Щеголева, Сергеева Т.Б. // Вестник Северного (Арктического) федерального университета. - 2015. - №1. - С. 76-83].
Из уровня техники известны способы получения цитотоксических клеток с активностью против клеток немелкоклеточного рака легкого [Патент РФ №2639514, опубл. 21.12.2017; Патент РФ №2577992, опубл. 20.03.2016]. Данные изобретения относятся к сфере биотехнологии и включают получение дендритных клеток из моноцитов периферической крови больного с последующим их культивированием совместно с фракцией мононуклеарных клеток. Описываемые аналоги изобретения ставят своей целью в условиях in vitro генерировать клоны цитотоксических лимфоцитов против опухолевых клеток определенной этиологии с последовательным применением комплекса различных цитокинов (GM-CSF, IL-1β, IL-4, L-12, IL-18, TNF-α).
В области терапии опухолевых заболеваний также известны способы прогнозирования неблагоприятного течения увеальной меланомы [Патент РФ №2698797, опубл. 30.08.2019] и прогрессирования рака пищевода [Патент РФ №2640954, опубл. 12.01.2018], в которых методом проточной лазерной цитофлуориметрии в качестве существенного признака изобретения определяют содержание цитотоксических лимфоцитов CD3+CD8+. В случае увеальной меланомы при содержании цитотоксических лимфоцитов в крови более 0,4×109/л и относительном содержании более 22% прогнозируют неблагоприятное течение заболевания. У больных раком пищевода прогностическое заключение делается на основании математических коэффициентов (K1, K2 и K3), для чего помимо клеток CD3+CD8+ в образцах ткани опухоли исследуется уровень лимфоцитов Tregs (CD4+CD25+CD127dim).
В хирургии, при прогнозе исхода черепно-мозговых травм различной степени тяжести применяется метод определения фенотипов иммунокомпетентных клеток по типу «Высушенная капля», отличающийся тем, что суждение о дефиците активности иммунокомпетентных клеток и прогноз развития посттравматических осложнений осуществляют у пострадавших в первые сутки с момента получения черепно-мозговой травмы, в сыворотке периферической венозной крови у пострадавших лиц с высокой цитотоксической активностью определяют содержание цитокина интерлейкин-2 (ИЛ 2) и концентрацию иммуноглобулина IgE, при содержании ИЛ 2 более 50,00 пк/мл и IgE более 100,00 МЕ/мл прогнозируют высокую вероятность риска развития осложнения [Патент РФ 2685552 https://elibrary.ru/item.asp?id=41021248. Опубл. 22.04.2019]. Заявленный способ осуществляется следующим образом. Кровь для исследования берется из локтевой вены в минимальном объеме 1-3 мл до 10 часов утра, натощак. Для количественного определения ИЛ 2 и иммуноглобулина Е используется сыворотка или плазма крови, анализируемая иммуноферментным методом с применением диагностического набора для ИФА. Результаты реакции определяются по оптической плотности ячеек микропланшета согласно инструкции производителя.
Таким образом, в указанных изобретениях активизация цитотоксических лимфоцитов в ассоциации с цитокинами изучается строго в динамике патологического процесса с целью прогнозирования его неблагоприятных последствий.
Предложенное нами изобретение включает определение повышенной клеточно-опосредованной цитотоксичности лимфоцитов у практически здоровых людей, проживающих и осуществляющих свою трудовую деятельность в экстремальных климато-географических условиях Арктики. Способ позволяет выявить людей, имеющих риск патологии, связанной с вторичным экологически зависимым иммунодефицитом, склонностью к хронизации заболеваний бактериального и вирусного генеза.
Известен способ раннего прогнозирования у практически здоровых мужчин, работающих вахтовым методом в Арктическом регионе возможной сердечно-сосудистой патологии [Патент РФ 2687067, опубл. 7.05.2019https://elibrary.ru/item.asp?id=381464551. включающий забор крови из вены у практически здоровых моряков-вахтовиков, определение фенотипов лимфоцитов периферической крови, определение иммунологического показателя и прогнозирование течения болезни, отличающийся тем, что выявляют риск формирования сердечно-сосудистой патологии у лиц со стажем работы в экстремальных профессиональных и климатических условиях Арктики более 5 лет, в периферической венозной крови определяют содержание цитотоксических лимфоцитов (CD8+), лимфоцитов с рецепторами к трансферрину (CD71+) и антигенам гистосовместимости II класса (HLA-DR), при содержании CD8+ более 0,40⋅109кл/л, CD71+ и HLA-DR+ менее 0,50⋅109кл/л прогнозируют раннюю высокую вероятность развития сердечно-сосудистой патологии.
Следует отметить, что известен способ быстрого выявления риска Т-хелперного дефицита у взрослых практически здоровых лиц различного социально-профессионального статуса (кочевые, оседлые) в условиях Арктики [Патент 2614702. Опубл. 27. 03.2017 https://elibrary,ru/item.asp?id=38261527]. Заявленный способ позволяет выявить людей, имеющих риск патологии, связанной с иммунодефицитом Т-хелперного звена иммунитета при профотборе для работы в экстремальных условиях Приарктического региона, а также с целью профилактики лиц, ведущих кочевой образ жизни, включающий забор крови из вены, определение соотношения отдельных фенотипов иммунокомпетентных клеток периферической крови, определение их активности и суждение о иммунодефиците, отличающийся тем, что определяют общее количество лимфоцитов, малых лимфоцитов в лимфоцитограмме и содержание зрелых функционально активных Т-клеток CD3, при содержании общего количества лимфоцитов меньше 1,5⋅109 кл/л и клеток CD3 меньше 1,5⋅109 кл/л судят о риске формирования Т-хелперного дефицита.
Известен способ оценки риска невынашивания беременности у женщин с привычным невынашиванием [Патент РФ №2657433, опубл. 13.06.2018], отличающийся тем, что у пациентки определяют цитотоксическую активность NK-клеток периферической крови в секреторной фазе менструального цикла в отношении клеток трофобласта линии Jeg-3 с применением 3 математических формул. Если значение цитотоксической активности NK-клеток у данных женщин превышает предварительно определенное значение цитотоксической активности NK-клеток у здоровых фертильных женщин в секреторной фазе менструального цикла (36%), оценивают высокий риск невынашивания беременности. Нужно отметить, что в ходе реализации указанного способа применяют современные и точные методы исследования, однако достаточно трудоемкие и долговременные по выполнению. Так, измерение цитотоксической активности NK-клеток для каждого пациента нужно проводить не менее чем в 4 повторах, а порядок лабораторной работы включает 40 пунктов пробоподготовки перед итоговым анализом на проточном цитофлюориметре. Помимо указанного прибора в перечне оборудования также необходимо иметь ламинарно-потоковый шкаф, набор механических дозаторов, центрифугу, термостат, вортекс, холодильник и СO2 инкубатор. Кроме того, использование данного способа ограничено только случаями невынашивания беременности у женщин с привычным невынашиванием. Предложенное нами изобретение можно осуществить в течение 2 часов рабочего времени одного лаборанта-исследователя с применением лишь стандартного гематологического анализатора и микроскопа. Это позволяет экономить производственные ресурсы диагностических медицинских учреждений, а также дает возможность определить повышенную клеточно-опосредованную цитотоксичность лимфоцитов у практически здоровых людей независимо от половой принадлежности.
Известен способ прогнозирования частой заболеваемости у детей раннего возраста с перинатальными поражениями ЦНС [Патент РФ №2338196, опубл. 10.11.2008], включающий определение относительного содержания CD16+ лимфоцитов в периферической венозной крови у ребенка после 1 года. При значении CD16+, равном 10,1% или более, прогнозируют частую заболеваемость ОРВИ у детей до 3-х лет. Данный способ учитывает прогнозирование частой заболеваемости только у детей раннего возраста с перинатальными поражениями ЦНС и не рассматривает вероятность повышения клеточно-опосредованной цитотоксичности лимфоцитов у практически здоровых людей трудоспособного возраста, проживающих и работающих в условиях Арктики.
Наиболее близким по достигаемому техническому результату можно считать способ оценки цитотоксической активности лимфоцитов натуральных киллеров (НК) [Патент РФ №2514019, опубл. 27.04.2014]. При этом рассматриваемый способ включает иное техническое решение поставленной задачи, нежели предложенное нами изобретение. Так, в ходе реализации прототипа из периферической крови обследуемых людей в градиенте плотности фиколл-верографина выделяют взвесь мононуклеарных клеток с последующей постановкой цитотоксического теста. Тест основан на инкубации НК-лимфоцитов и клеток-мишеней К-562 с дальнейшим подсчетом числа оставшихся, не деградированных клеток-мишеней. Учет производится на автоматическом анализаторе, настроенном на выявление клеток диаметром от 15 до 40 мкм, после чего по формуле рассчитывают индекс цитотоксичности. То есть фактически в прототипе осуществляется постановка клеточной реакции in vitro и на основании инструментального анализа ее результатов фиксируется относительный уровень цитотоксической активности НК-лимфоцитов.
Предложенный нами способ не предполагает подобных действий, происходит лишь регистрация уже существующего in vivo уровня содержания лимфоцитов с последующим суждением о наличии либо отсутствии повышенной клеточно-опосредованной цитотоксичности. Изобретение позволяет в обычных условиях гематологической лаборатории без дополнительных затрат на приобретение моноклональных сывороток, аппаратуры и материалов выявить повышенную клеточно-опосредованную цитотоксичность.
Выявлено, что активность иммунных реакций у обследуемых практически здоровых добровольцев (увеличение нормальных киллеров (CD16+), повышения концентраций цитотоксических лимфоцитов (CD8+) зависят от стажа работы и проживания в экстремальных климатических и профессиональных условиях [[Щеголева Л.С., Сергеева Т.Б., Шашкова Е.Ю., Филиппова О.Е. Иммунный гомеостаз у кочующего и оседлого населения Европейского Севера России. - Федер. гос. бюджет, учреждение науки Ин-т физиологии природ, адаптаций Урал, отд-ния Рос. акад. наук. - Архангельск, 2016. - 102 с.; Сергеева Т.Б. Адаптивный иммунный ответ у жителей Архангельской области и НАО старше 40 лет // Проблемы сохранения здоровья и обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения в Арктике: материалы II международной научно - практической конференции / под ред. С.А. Горбанева, Н.М. Фроловой - СПб.: Издательско-полиграфическая компания «Коста», 2019. - С. 182-185; Физиологические реакции лимфоидных клеток у жителей Арктического региона / О.С. Морозова, Е.В. Поповская, Т.Б. Сергеева и др. // Проблемы обеспечения экологической безопасности и устойчивое развитие арктических территорий: сб. материалов Всероссийской конф. с международным участием II Юдахинские чтения, (24-28 июня 2019). Архангельск: «ОМ-медиа», 2019. С.659-661. 1элекрон. опт. диск (CD-R). Загл. с вкладыша контейнера. Текст (визуальный): электронный. https://elibrary.ru/item.asp?id=41151327.
Однако, необходимость сопровождения данного способа сопряжена с многочисленными исследованиями, что в значительной степени повышает трудоемкость, временной период и экономические затраты описываемого аналога изобретения. Кроме того, указанный способ не содержит конкретного соотношения различных фенотипов иммунокомпетентных клеток с содержанием малых, средних и средних лимфоцитов размером 8-12 мкм периферической крови для суждения о риске развития высокой цитотоксической активности.
Задачей настоящего изобретения является разработка способа, позволяющего определить минимальное число иммунологических параметров, позволяющих выявить людей, имеющих риск повышенной клеточно-опосредованной цитотоксичности в экстремальных условиях Арктического региона, а также с целью профилактики развития вторичных экологически зависимых иммунодефицитов и их манифестных форм.
Технический результат состоит в том, что способ позволяет проводить скрининговую диагностику, сократить время и упростить методику прогнозирования риска формирования повышенной клеточно-опосредованной цитотоксичности, чреватой нарушением адаптивного иммунного ответа, проявляющегося не только ранним развитием вторичных экологически зависимых иммунодефицитов, склонности к хроническому течению заболеваний.
Технический результат достигается тем, что способ прогнозирования формирования повышенной клеточно-опосредованной цитотоксичности, включающий забор крови из вены, согласно изобретению, позволяет определить лимфоцитограмму и по ней судить о содержании и активности супрессоров CD8+ и нормальных киллеров CD16+, о снижении эффективности защиты в экстремальных условиях Арктики.
Поставленная цель достигается тем, что в крови практически здоровых людей, проживающих в условиях Арктики, определяют общее число лимфоцитов и содержание средних лимфоцитов размером 8-12 мкм в составе лимфоцитограммы в периферической венозной крови обследуемых лиц определяют общее число лимфоцитов и содержание средних лимфоцитов размером 8-12 мкм в составе лимфоцитограммы. При содержании общего числа лимфоцитов более 2,5×109 кл/л и средних лимфоцитов размером 8-12 мкм в лимфоцитограмме более 0,35×109 кл/л судят о повышенной клеточно-опосредованной цитотоксичности лимфоцитов.
Заявленный нами способ осуществляется следующим образом. Кровь для исследования берется из локтевой вены в объеме 3 мл до 10 часов утра, натощак, в вакуумные пробирки Vacuette с антикоагулянтом K3EDTA. Общее содержание лимфоцитов выявляется на стандартном гематологическом анализаторе. В мазках крови, окрашенных по Романовскому - Гимзе, определяют лимфоцитограмму с выделением малых (диаметр клетки до 8 мкм), средних (8-12 мкм) и больших (более 12 мкм) лимфоцитов (по методу Алексеева Г.А., 1962). Учет лимфоцитограммы осуществляется при помощи микроскопа с иммерсионным увеличением объектива ×100 и окуляра ×10, с подсчетом 100 клеток на клавишных лабораторных счетчиках.
Предлагаемым способом были обследованы 178 человек в возрасте от 19 до 60 лет, практически здоровых на момент исследования в рамках НИР в период с 2009 по 2015 гг.: №01.2.00 101811; №01.20.0 601941 и Госрегистрации №01201354637. Обследование проводилось в условиях экспедиций в субъекты Арктической зоны РФ: п. Несь, НАО (2009 и 2011 гг.), 121 человек и г. Надым, ЯНАО (2015 г.), 57 человек с учетом образа жизни (кочевые, оседлые) и с письменного согласия респондентов. При этом соблюдались нормы биомедицинской этики в соответствии с документом «Этические принципы проведения медицинских исследований с участием людей в качестве субъектов исследования» (Хельсинская декларация Всемирной медицинской ассоциации 1964 г. (с изменениями и дополнениями 2013 г.). Комплекс лабораторных исследований включал определение в периферической крови абсолютного содержания лимфоцитов и их фенотипов. Содержание фенотипов лимфоцитов изучали с помощью непрямой иммунопероксидазной реакции с использованием моноклональных антител на препаратах лимфоцитов типа «высушенной капли» производства НПЦ МедБиоСпектр г. Москва. Результаты обработаны с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6.0» («StatSoft», США). Тип исследования ретроспективный, выборки случайные, одномоментные. Генеральная совокупность - жители севера Европейской территории России. Достоверность различий между группами оценивали с помощью параметрического t-критерия Стьюдента для независимых выборок и непараметрического критерия U-Манна-Уитни. Статистическая достоверность присваивалась при значении р<0,05. Корреляционный анализ проводился с выявлением коэффициента линейной корреляции Пирсона (г) и оценкой его достоверности р<0,05.
Проведенные исследования показали, что нормальное содержание CD8+ (0,2-0,4×109 кл/л) и CD16+ (0,03-0,5×109 кл/л) встречается у 35,65 и 43,85% обследуемых лиц соответственно, а повышенное содержание CD8+ (более 0,6×109 кл/л) и CD16+ (более 0,5×109 кл/л) встречается у 57,33 и 43,79% соответственно. Среднее содержание клеток CD8+ соответственно составило: 0,40±0,02 и 0,60±0,02×109 кл/л, р<0,001. Среднее содержание натуральных киллеров в группах составило: 0,30±0,01 и 0,53±0,02×109 кл/л, р<0,001. Выявлено, что у лиц с избытком концентрации цитотоксических клеток повышается общее содержание лейкоцитов, лимфоцитов и средних лимфоцитов размером 8-12 мкм в структуре лимфоцитограммы (в сравнении с людьми с нормальным уровнем цитотоксических клеток): соответственно с 5,8±0,23 до 7,8±0,48×109 кл/л; с 1,8±0,07 до 3,2±0,17±109 кл/л; с 0,21±0,02 до 0,45±0,04×109 кл/л (р<0,01). Анализ корреляционных зависимостей в группе лиц с избытком содержания цитотоксических лимфоцитов показал статистически значимую взаимосвязь между показателями CD8+ и общим содержанием лимфоцитов (r=0,78; р<0,05), CD8+ и средними лимфоцитами размером 8-12 мкм (r=0,67; р<0,05), CD16+ и общим содержанием лимфоцитов (r=0,76; р<0,05), CD16+ и средними лимфоцитами размером 8-12 мкм (r=0,65; р<0,05). Таким образом, увеличение в крови концентрации цитотоксических клеток у практически здоровых жителей Арктики ассоциировано с повышенными значениями общего содержания лимфоцитов и их средних форм размером 8-12 мкм в составе лимфоцитограммы.
Из литературы известно, что цитотоксические Т-лимфоциты, экспрессирующие рецептор CD8+, а также натуральные киллеры, осуществляют защиту организма от патогенных микроорганизмов и трансформированных опухолевых клеток путем непосредственного контакта с клеткой-мишенью. В случае отсутствия на мембране клетки-мишени «своих», присущих данному организму, молекул МНС I класса запускается механизм цитолиза. Данный механизм включает образование в месте контактного взаимодействия отграниченной синаптической зоны, куда клетки-эффекторы высвобождают гранулы с перфорином. Перфорин в присутствии Са2+ полимеризуется и делает в мембране клетки-мишени поры, через которые внутрь цитоплазмы поступает белок гранзим. Именно гранзим вызывает ферментативный клеточный лизис мишени путем активизации распада ее ДНК на фрагменты [Lieberman J. Cell death and immunity: the ABCs of granule-mediated cytotoxicity. New weapons in the arsenal / J. Lieberman // Nat. Rev. Immunol. - 2003. - Vol.3. - P. 361-370].
Следует отметить, что наряду с общим механизмом поражающего действия у цитотоксических клеток есть и свои отличия. Так, натуральные киллеры относятся к клеткам врожденного иммунитета и в их развитии в отличие от Т-лимфоцитов не требуется участие тимуса (лишь микроокружение костного мозга). Вместо антигенраспознающего Т-клеточного рецептора на поверхностной мембране NK клеток локализуются молекулы CD16+ и CD56+. Последняя представляет собой гомофильную адгезивную молекулу из семейства молекул адгезии клеток нервной системы (N-CAM) суперсемейства иммуноглобулинов. Рецептор CD16+ (FcγIIIR) в свою очередь выполняет функцию низкоафинного рецептора для Fc-фрагмента IgG.
Цитотоксические Т-лимфоциты распознают клетки-мишени за счет молекулы CD8+ (LT8, ICO-31), имеющей принадлежность к суперсемейству иммуноглобулинов. Распознавание осуществляется строго специфически, то есть под действием цитотоксических лимфоцитов гибнут только клетки, несущие определенный антиген. Для этого Т-лимфоцитам приходится увеличивать свою популяцию путем пролиферации и последующей дифференцировки. Для NK клеток цитолитическая активность неспецифична и может реализовываться в отношении различных антигенов [Ярилин А.А. Основы иммунологии: учебник. - М.: Медицина, 1999. - С. 357-360; Пинегин Б.В. NK-клетки: свойства и функции / Б.В. Пинегин, С.В. Дамбаева // Иммунология. - 2007. - №2. - С. 105-113].
Нами приведены частные примеры использования заявленного способа.
Пример 1. Доброволец С.Г.Х., 41 год, пол женский. Оседлый образ жизни. Место проживания ЯНАО, г. Надым. Вес 72 кг, рост 1,55 м, индекс массы тела 29,87 кг/м2. Обследование проводилось в 2015 г. При комплексном лабораторном обследовании периферической крови определено, что общее содержание лимфоцитов составляет 3,42×109 кл/л, средних лимфоцитов размером 8-12 мкм в составе лимфоцитограммы - 0,30×109 кл/л. На основании полученных данных сделан вывод о наличии повышенной клеточно-опосредованной цитотоксичности лимфоцитов. При контрольном параллельном исследовании фенотипической структуры лимфоцитов выявлено выраженное увеличение концентрации Т-лимфоцитов CD8+ 0,75×109 кл/л и CD16+ 0,54×109 кл/л. (относительно нормативных значений). Установленная закономерность подтверждена с использованием пакета прикладных программ «Statistica 10.0».
Пример 2. Доброволец Б.А.В., 44 года, пол женский. Оседлый образ жизни. Место проживания ЯНАО, г. Надым. Вес 85 кг, рост 1,76 м, индекс массы тела 27,50 кг/м2. При прохождении комплексного иммунологического обследования периферической крови в 2015 г. концентрация общего количества лимфоцитов 2,01×109 кл/л, средних лимфоцитов размером 8-12 мкм в составе лимфоцитограммы - 0,29×109 кл/л. При контрольном параллельном исследовании фенотипической структуры лимфоцитов выявлено выраженное увеличение концентрации Т-лимфоцитов CD8+ 0,46×109 кл/л и концентрации CD16+ 0,80×109 кл/л. (относительно нормативных значений). Сделан вывод о наличии повышенной клеточно-опосредованной цитотоксичности лимфоцитов. Установленная закономерность подтверждена с использованием пакета прикладных программ «Statistica 10.0».
Пример 3. Доброволец К.О.А., 43 года, пол женский. Оседлый образ жизни. Место проживания ЯНАО, г. Надым. Вес 77 кг, рост 1,70 м, индекс массы тела 26,64 кг/м2. При комплексном лабораторном обследовании периферической крови в 2015 г. определено, что общее содержание лимфоцитов составляет 3,42×109 кл/л, средних лимфоцитов размером 8-12 мкм в составе лимфоцитограммы - 0,37×109 кл/л. При исследовании фенотипической структуры лимфоцитов выявлено выраженное увеличение концентрации Т-лимфоцитов CD8+ 0,61×109 кл/л, CD16+ 1,19×109 кл/л. (относительно нормативных значений). Сделан вывод о наличии повышенной клеточно-опосредованной цитотоксичности лимфоцитов. Установленная закономерность подтверждена с использованием «Statistica 10.0».
Пример 4. Доброволец С.Л.К., 40 лет, пол женский. Оседлый образ жизни. Место проживания ЯНАО, г. Надым. Вес 110 кг, рост 1,65 м, индекс массы тела 40,44 кг/м2. Обследование проводилось в 2015 г. При лабораторном изучении периферической крови определено, что общее содержание лимфоцитов составляет 2,65×109 кл/л, средних лимфоцитов размером 8-12 мкм в составе лимфоцитограммы - 0,34×109 кл/л. Сделан вывод о наличии повышенной клеточно-опосредованной цитотоксичности лимфоцитов: при исследовании фенотипической структуры лимфоцитов выявлено выраженное увеличение концентрации Т-лимфоцитов CD8+ 0,58×109 кл/л, и CD16+ 0,55×109 кл/л. (относительно нормативных значений). Установленная закономерность подтверждена с использованием «Statistica 10.0».
Пример 5. Доброволец Л., 45 лет, пол мужской. Кочевой образ жизни. Место проживания НАО, п. Несь. При комплексном лабораторном обследовании периферической венозной крови в 2009 г., выявлено общее содержание лимфоцитов 3,28⋅109 кл/л, средних лимфоцитов размером 8-12 мкм в составе лимфоцитограммы - 0,28×109 кл/л. При контрольном параллельном исследовании фенотипической структуры лимфоцитов определено выраженное увеличение концентраций Т-лимфоцитов CD8+ 0,88⋅109 кл/л и NK клеток CD16+ 0,52⋅109 кл/л (относительно нормативных значений). Сделан вывод о наличии повышенной клеточно-опосредованной цитотоксичности лимфоцитов. Установленная закономерность подтверждена статистически (Statistica 10.0).
Пример 6. Доброволец В., 42 лет, пол мужской. Кочевой образ жизни. Место проживания НАО, п. Несь. При комплексном лабораторном обследовании периферической венозной крови в 2009 г., определено общее содержание лимфоцитов 1,76⋅109 кл/л., средних лимфоцитов размером 8-12 мкм в составе лимфоцитограммы - 0,35×109 кл/л. При контрольном параллельном исследовании фенотипической структуры лимфоцитов определено выраженное увеличение концентраций Т-лимфоцитов CD8+ 0,45⋅109 кл/л и NK клеток CD16+ 0,48⋅109 кл/л (относительно нормативных значений). Сделан вывод о наличии повышенной клеточно-опосредованной цитотоксичности лимфоцитов. Установленная закономерность подтверждена статистически (Statistica 10.0).
Пример 7. Доброволец В., 35 лет, пол мужской. Кочевой образ жизни. Место проживания НАО, п. Несь. При комплексном лабораторном обследовании периферической венозной крови в 2011 г., определено общее содержание лимфоцитов 4,69⋅109 кл/, средних лимфоцитов размером 8-12 мкм в составе лимфоцитограммы - 0,40×109 кл/л. При контрольном параллельном исследовании фенотипической структуры лимфоцитов определено выраженное увеличение концентраций Т-лимфоцитов CD8+ 0,89⋅109 кл/л и NK клеток CD16+ 0,66⋅109 кл/л (относительно нормативных значений). Сделан вывод о наличии повышенной клеточно-опосредованной цитотоксичности лимфоцитов. Установленная закономерность подтверждена статистически (Statistica 10.0).
Пример 8. Доброволец В., 31 год, пол мужской. Кочевой образ жизни. Место проживания НАО, п. Несь. При комплексном лабораторном обследовании периферической венозной крови в 2011 г., определено общее содержание лимфоцитов 1,98⋅109 кл/л., средних лимфоцитов размером 8-12 мкм в составе лимфоцитограммы - 0,28×109 кл/л. При контрольном параллельном исследовании фенотипической структуры лимфоцитов выявлено выраженное увеличение концентраций Т-лимфоцитов CD8+ 0,96⋅109 кл/л и NK клеток CD16+ 1,20⋅109 кл/л (относительно нормативных значений). Установленная закономерность подтверждена статистически (Statistica 10.0).

Claims (1)

  1. Способ выявления повышенной клеточно-опосредованной цитотоксичности лимфоцитов у людей в условиях Арктики, отличающийся тем, что в периферической венозной крови обследуемых лиц определяют общее число лимфоцитов и содержание средних лимфоцитов размером 8-12 мкм в составе лимфоцитограммы; при содержании общего числа лимфоцитов более 2,5×109 кл/л и средних лимфоцитов размером 8-12 мкм в лимфоцитограмме более 0,35×109 кл/л судят о повышенной клеточно-опосредованной цитотоксичности лимфоцитов.
RU2020124876A 2020-07-17 2020-07-17 Способ выявления повышенной клеточно-опосредованной цитотоксичности лимфоцитов у людей в условиях арктики RU2753693C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020124876A RU2753693C1 (ru) 2020-07-17 2020-07-17 Способ выявления повышенной клеточно-опосредованной цитотоксичности лимфоцитов у людей в условиях арктики

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020124876A RU2753693C1 (ru) 2020-07-17 2020-07-17 Способ выявления повышенной клеточно-опосредованной цитотоксичности лимфоцитов у людей в условиях арктики

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2753693C1 true RU2753693C1 (ru) 2021-08-19

Family

ID=77349351

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2020124876A RU2753693C1 (ru) 2020-07-17 2020-07-17 Способ выявления повышенной клеточно-опосредованной цитотоксичности лимфоцитов у людей в условиях арктики

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2753693C1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2810808C1 (ru) * 2023-02-21 2023-12-28 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр комплексного изучения Арктики имени академика Н.П. Лаверова Уральского отделения Российской академии наук (ФГБУН ФИЦКИА УрО РАН) Способ прогнозирования риска срыва адаптации у людей, работающих в неблагоприятных климатических условиях Арктики

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2514019C2 (ru) * 2012-06-06 2014-04-27 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр психического здоровья" Российской академии медицинских наук Способ оценки цитотоксической активности лимфоцитов натуральных киллеров
RU2614702C1 (ru) * 2016-05-16 2017-03-28 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр комплексного изучения Арктики Российской академии наук Способы быстрого выявления риска т-хелперного дефицита у людей в условиях арктики

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2514019C2 (ru) * 2012-06-06 2014-04-27 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр психического здоровья" Российской академии медицинских наук Способ оценки цитотоксической активности лимфоцитов натуральных киллеров
RU2614702C1 (ru) * 2016-05-16 2017-03-28 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр комплексного изучения Арктики Российской академии наук Способы быстрого выявления риска т-хелперного дефицита у людей в условиях арктики

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIU L. et al. Assessment of lymphocyte-mediated cytotoxicity using flow cytometry. Methods Mol Biol. 2004; 263: 125-40. *
СТАВИНСКАЯ О.А. Изменение активности апоптоза лимфоцитов при кратковременном общем охлаждении человека. Взаимосвязь с уровнем иммунного фона. Вестник уральской медицинской академической науки. 2018; 15(2): 309-315. *
ШЕРСТЕННИКОВА А.К. и др. Популяция лейкоцитов периферической крови, несущих молекулы адгезии, у больных псориазом. Экология человека. 2017; 12: 45-52. *
ШЕРСТЕННИКОВА А.К. и др. Популяция лейкоцитов периферической крови, несущих молекулы адгезии, у больных псориазом. Экология человека. 2017; 12: 45-52. СТАВИНСКАЯ О.А. Изменение активности апоптоза лимфоцитов при кратковременном общем охлаждении человека. Взаимосвязь с уровнем иммунного фона. Вестник уральской медицинской академической науки. 2018; 15(2): 309-315. LIU L. et al. Assessment of lymphocyte-mediated cytotoxicity using flow cytometry. Methods Mol Biol. 2004; 263: 125-40. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2810808C1 (ru) * 2023-02-21 2023-12-28 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр комплексного изучения Арктики имени академика Н.П. Лаверова Уральского отделения Российской академии наук (ФГБУН ФИЦКИА УрО РАН) Способ прогнозирования риска срыва адаптации у людей, работающих в неблагоприятных климатических условиях Арктики

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kurioka et al. Shared and distinct phenotypes and functions of human CD161++ Vα7. 2+ T cell subsets
Charles et al. Clonal B cells in patients with hepatitis C virus–associated mixed cryoglobulinemia contain an expanded anergic CD21low B-cell subset
Möttönen et al. CD4+ CD25+ T cells with the phenotypic and functional characteristics of regulatory T cells are enriched in the synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis
Zhao et al. Th17 immunity in patients with allergic asthma
Hou et al. Establishment of the reference intervals of lymphocyte function in healthy adults based on IFN-γ secretion assay upon phorbol-12-myristate-13-acetate/ionomycin stimulation
Rezvani et al. T-cell responses directed against multiple HLA-A* 0201-restricted epitopes derived from Wilms' tumor 1 protein in patients with leukemia and healthy donors: identification, quantification, and characterization
Azab et al. CD4+ CD25+ regulatory T cells (TREG) in systemic lupus erythematosus (SLE) patients: the possible influence of treatment with corticosteroids
Steinbach et al. Monocytes from systemic lupus erythematous patients are severely altered in phenotype and lineage flexibility
Bossowski et al. Lower proportions of CD4+ CD25high and CD4+ FoxP3, but not CD4+ CD25+ CD127low FoxP3+ T cell levels in children with autoimmune thyroid diseases
Duan et al. Disturbed Th17/Treg balance in patients with non-small cell lung cancer
Fonseca et al. Human peripheral blood gamma delta T cells: report on a series of healthy Caucasian Portuguese adults and comprehensive review of the literature
Cui et al. Changes in regulatory B cells and their relationship with rheumatoid arthritis disease activity
Wu et al. TGF-β1 contributes to CD8+ Treg induction through p38 MAPK signaling in ovarian cancer microenvironment
Xu et al. Changes of Treg-associated molecules on CD4+ CD25+ Treg cells in myasthenia gravis and effects of immunosuppressants
Canavan et al. Enriched Cd141+ DCs in the joint are transcriptionally distinct, activated, and contribute to joint pathogenesis
Christophersen et al. Healthy HLA-DQ2. 5+ subjects lack regulatory and memory T cells specific for immunodominant gluten epitopes of celiac disease
Zhang et al. Inhibition of the PI3K-Akt-mTOR signaling pathway in T lymphocytes in patients with active tuberculosis
Liang et al. Correlations of the expression of γδ T cells and their co-stimulatory molecules TIGIT, PD-1, ICOS and BTLA with PR and PIBF in the peripheral blood and decidual tissues of women with unexplained recurrent spontaneous abortion
Niccolai et al. Peripheral ENO1-specific T cells mirror the intratumoral immune response and their presence is a potential prognostic factor for pancreatic adenocarcinoma
Alemán et al. In Tuberculous Pleural Effusions, Activated Neutrophils Undergo Apoptosis and Acquire a Dendritic Cell–Like Phenotype
St-Laurent et al. Alveolar macrophage subpopulations in bronchoalveolar lavage and induced sputum of asthmatic and control subjects
Viëtor et al. Survival of donor cells 25 years after intrauterine transfusion
Ansari et al. Deregulated phenotype of autoreactive Th17 and Treg clone cells in pemphigus vulgaris after in-vitro treatment with desmoglein antigen (Dsg-3)
Teixeira-Carvalho et al. Cytokines, chemokine receptors, CD4+ CD25HIGH+ T-cells and clinical forms of human schistosomiasis
RU2753693C1 (ru) Способ выявления повышенной клеточно-опосредованной цитотоксичности лимфоцитов у людей в условиях арктики