RU2750816C1 - Method for producing recombinant cas13a-nuclease with collateral activity - Google Patents

Method for producing recombinant cas13a-nuclease with collateral activity Download PDF

Info

Publication number
RU2750816C1
RU2750816C1 RU2020117699A RU2020117699A RU2750816C1 RU 2750816 C1 RU2750816 C1 RU 2750816C1 RU 2020117699 A RU2020117699 A RU 2020117699A RU 2020117699 A RU2020117699 A RU 2020117699A RU 2750816 C1 RU2750816 C1 RU 2750816C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cas13a
nuclease
protein
target
purification
Prior art date
Application number
RU2020117699A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Николай Дмитриевич Дурманов
Сергей Викторович Кравченко
Андрей Валерьевич Лисица
Сергей Павлович Радько
Леонид Константинович Курбатов
Антон Николаевич Кривенко
Дмитрий Александрович Грядунов
Original Assignee
федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Тюменский государственный университет"
Федеральное Государственное Бюджетное Научное Учреждение "Научно-Исследовательский Институт Биомедицинской Химии Имени В.Н. Ореховича"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Тюменский государственный университет", Федеральное Государственное Бюджетное Научное Учреждение "Научно-Исследовательский Институт Биомедицинской Химии Имени В.Н. Ореховича" filed Critical федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Тюменский государственный университет"
Priority to RU2020117699A priority Critical patent/RU2750816C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2750816C1 publication Critical patent/RU2750816C1/en

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

FIELD: biotechnology.
SUBSTANCE: invention relates to a method for producing recombinant CAS13A-nuclease free of bacterial endotoxins, suitable for use in the CRISPR/Cas system.
EFFECT: producing a purified recombinant Cas13a-nuclease protein with functional collateral RNA activity, in a technologically simple way.
14 cl, 5 dwg

Description

Область техники.The field of technology.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам получения рекомбинантной CAS13A-нуклеазы свободной от бактериальных эндотоксинов, пригодной для использования в системе CRISPR/Cas.The invention relates to the field of biotechnology, in particular to methods for producing recombinant CAS13A nuclease free from bacterial endotoxins, suitable for use in the CRISPR / Cas system.

Уровень техники. State of the art.

CRISPR-нуклеазы являются частью молекулярных систем CRISPR-Cas (CRISPR, clustered regularly interspaced short palindromic repeats; Cas, CRISPR associated protein), ответственных за иммунитет бактерий и архей к чужеродным генетическим элементам, таким как бактериофаги и плазмиды (Источник [1]: Van der Oost J., Westra E.R., Jackson R.N., Wiedenheft B. //Nat. Rev. Microbiol. 2014. V. 12, № 7. P. 479-492. Источник [2]. Koonin E.V., Makarova K.S., Zhang F. //Curr. Opin. Microbiol. 2017. V. 37, P. 67-78.). CRISPR nucleases are part of the molecular systems CRISPR-Cas (CRISPR, clustered regularly interspaced short palindromic repeats; Cas, CRISPR associated protein) responsible for the immunity of bacteria and archaea to foreign genetic elements such as bacteriophages and plasmids (Source [1]: Van der Oost J., Westra ER, Jackson RN, Wiedenheft B. // Nat. Rev. Microbiol. 2014. V. 12, No. 7. P. 479-492 Source [2]. Koonin EV, Makarova KS, Zhang F . // Curr. Opin. Microbiol. 2017. V. 37, P. 67-78.).

Способность систем CRISPR-Cas селективно узнавать заданные последовательности ДНК и расщеплять их в определённых местах легла в основу наиболее широко распространённой на сегодня технологии направленного редактирования геномов, в первую очередь с использованием нуклеазы Cas9 и её генетически модифицированных вариантов (Источник [3]: Hsu P.D., Lander E.S., Zhang F. //Cell. 2014. V. 157, № 6, P. 1262-1278.). Селективность узнавания определяется формированием комплекса Cas-нуклеазы с направляющей РНК (нРНК, от англ. guide RNA, gRNA), которая содержит участок (спейсер), комплементарный участку таргетной ДНК (протоспейсер), и участок, ответственный за связывание с Cas-нуклеазой (повтор). При формировании гетеродуплекса «спейсер-протоспейсер» находящаяся в комплексе с нРНК Cas-нуклеаза расщепляет ДНК-мишень при наличии в непосредственной близости к протоспейсеру определённого нуклеотидного мотива (PAM, protospacer adjacent motif) (Источник [3]).The ability of CRISPR-Cas systems to selectively recognize given DNA sequences and cleave them in certain places formed the basis for the most widespread technology of directed genome editing today, primarily using the Cas9 nuclease and its genetically modified variants (Source [3]: Hsu PD, Lander ES, Zhang F. // Cell. 2014. V. 157, No. 6, P. 1262-1278.). Recognition selectivity is determined by the formation of a Cas nuclease complex with a guide RNA (nRNA, from the English guide RNA, gRNA), which contains a region (spacer) complementary to a target DNA region (protospacer) and a region responsible for binding to Cas nuclease (repeat ). During the formation of the “spacer-protospacer” heteroduplex, Cas nuclease, which is in a complex with nRNA, cleaves the target DNA in the presence of a certain nucleotide motif (PAM, protospacer adjacent motif) in close proximity to the protospacer (Reference [3]).

CRISPR-нуклеаза Cas13a (ранее известная как C2c2) принадлежит к VI типу CRISPR-Cas систем и обладает рядом особенностей, отличающих её от большей части CRISPR-нуклеаз, включая Cas9. Нуклеаза Cas13a является рибонуклеазой с функцией селективного узнавания таргетной молекулы РНК (через формирование комплементарного дуплекса спейсера нРНК с соответствующим участком РНК-мишени) с последующим её расщеплением, которое не зависит от наличия PAM (Источник [4]: Abudayyeh O.O., Gootenberg J.S., Konermann S., Joung J., Slaymaker I.M., Cox D.B., Shmakov S., Makarova K.S., Semenova E., Minakhin L., Severinov K., Regev A., Lander E.S., Koonin E.V., Zhang F. //Science. 2016. V. 353, № 6299. P. aaf5573. Источник [5]: Pickar-Oliver A., Gersbach C.A. //Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2019. V. 20. № 8, P. 490-507). После активации и расщепления РНК-мишени нуклеаза теряет специфичность (активность только в отношении РНК-мишени) и приобретает так называемую «коллатеральную активность» – начинает расщеплять любые молекулы РНК. При этом коллатеральная активность Cas13a проявляется в условиях in vitro и при гетерологичной коэкспрессии Cas13a и нРНК в бактериальных клетках, но отсутствует при их экспрессии в эукариотических клетках (Источник [6]: Abudayyeh O.O., Gootenberg J.S., Essletzbichler P., Han S., Joung J., Belanto J.J., Verdine V., Cox D.B.T., Kellner M.J., Regev A., Lander E.S., Voytas D.F., Ting A.Y., Zhang F. //Nature. 2017. V. 550. № 7675. P. 280-284.Источник [7]: Cox D.B.T., Gootenberg J.S., Abudayyeh O.O., Franklin B., Kellner M.J., Joung J., Zhang F. // Science. 2017. V. 358. № 6366. P. 1019-1027.). Следует отметить, что последнее создаёт основу для развития технологии направленного редактирования транскриптома (ibid).The Cas13a CRISPR nuclease (formerly known as C2c2) belongs to type VI CRISPR-Cas systems and has a number of features that distinguish it from most CRISPR nucleases, including Cas9. Cas13a nuclease is a ribonuclease with the function of selective recognition of the target RNA molecule (through the formation of a complementary duplex of the nRNA spacer with the corresponding region of the target RNA) followed by its cleavage, which does not depend on the presence of PAM (Source [4]: Abudayyeh OO, Gootenberg JS, Konermann S ., Joung J., Slaymaker IM, Cox DB, Shmakov S., Makarova KS, Semenova E., Minakhin L., Severinov K., Regev A., Lander ES, Koonin EV, Zhang F. // Science. 2016. V. 353, No. 6299. P. aaf5573 Source [5]: Pickar-Oliver A., Gersbach CA // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2019. V. 20. No. 8, P. 490-507 ). After activation and cleavage of the target RNA, the nuclease loses its specificity (activity only in relation to the target RNA) and acquires the so-called "collateral activity" - it begins to cleave any RNA molecules. At the same time, the collateral activity of Cas13a is manifested in vitro and during heterologous co-expression of Cas13a and nRNA in bacterial cells, but is absent during their expression in eukaryotic cells (Source [6]: Abudayyeh OO, Gootenberg JS, Essletzbichler P., Han S., Joung J., Belanto JJ, Verdine V., Cox DBT, Kellner MJ, Regev A., Lander ES, Voytas DF, Ting AY, Zhang F. // Nature. 2017. V. 550. No. 7675. P. 280-284 Source [7]: Cox DBT, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Franklin B., Kellner MJ, Joung J., Zhang F. // Science. 2017. V. 358. No. 6366. P. 1019-1027.). It should be noted that the latter provides the basis for the development of directed transcriptome editing technology (ibid).

Локусы, кодирующие нуклеазу Cas13a, были впервые идентифицированы в геномах пяти бактериальных таксонов: α-протеобактерии, Bacilli, Clostridia, Fusobacteria и Bacteroidetes (Источник [8]: Shmakov S., Abudayyeh O.O., Makarova K.S., Wolf Y.I., Gootenberg J.S., Semenova E., Minakhin L., Joung J., Konermann S., Severinov K., Zhang F., Koonin E.V. //Mol. Cell. 2015. V. 60. № 3. P. 385-397.). В настоящее время в экспериментальных исследованиях наиболее интенсивно используются Cas13a-нуклеазы, кодируемые геномами бактерий рода Leptotrichia (Источник 4;6. Источник [9]: Tambe A., East-Seletsky A., Knott G.J., Doudna J.A., O'Connell M.R. //Cell Rep. 2018. V. 24. № 4. P. 1025-1036. Источник [10]: East-Seletsky A., O'Connell M.R., Knight S.C., Burstein D., Cate J.H., Tjian R., Doudna J.A. //Nature. 2016. V. 538. № 7624. P. 270-273. Источник [11]: Gootenberg J.S., Abudayyeh O.O., Lee J.W., Essletzbichler P., Dy A.J., Joung J., Verdine V., Donghia N., Daringer N.M., Freije C.A., Myhrvold C., Bhattacharyya R.P., Livny J., Regev A., Koonin E.V., Hung D.T., Sabeti P.C., Collins J.J., Zhang F. //Science. 2017. V. 356. № 6336. P. 438-442.). Экспериментальное тестирование 15 ортологов Сas13a показало, что Cas13а-нуклеаза обнаруженная у вида Leptotrichia wadei, обозначаемая LwaCas13a, наиболее эффективно подавляет рост клеток Escherichia coli (E. coli) при гетерологичной коэкспрессии Сas13a и нРНК (источник [6]). Нуклеотидная последовательность гена нуклеазы LwaCas13a включает ~3,5 тыс. пар оснований и кодирует полипептид длиной 1162 аминокислотных остатка (а.о.); молекулярный вес белка составляет ≈138 кДa. Коллатеральная активность LwaCas13 была положена в основу способа ультрачувствительной детекции бактерий и вирусов, получившего название SHERLOCK (источник [11], источник [12]: Gootenberg J.S., Abudayyeh O.O., Kellner M.J., Joung J., Collins J.J., Zhang F. //Science. 2018. V. 360. № 6387. P. 439-444. Источник [13]: Kellner M.J., Koob J.G., Gootenberg J.S., Abudayyeh O.O., Zhang F. //Nat. Protoc. 2019. V. 14. № 10. P. 2986-3012.). В методе SHERLOCK на первом этапе проводится изотермическая амплификация целевого фрагмента нуклеиновой кислоты, а затем детекция продуктов амплификации с применением LwaCas13a в комплексе с нРНК. Коллатеральная активность LwaCas13a приводит к деградации добавленных в реакционную смесь коротких молекул РНК, меченных флуорофором и тушителем (РНК-субстрат или РНК-репортеры), с последующей регистрацией флуоресцентного сигнала (источник [11-13]). Все реакции не требуют специализированного оборудования, а детекция может проводиться в формате тест-полосок (при замене флуорофора на биотиновую или пероксидазную метку), что открывает перспективы для полевой диагностики бактериальных и вирусных патогенов (Источник [14]: Myhrvold C., Freije C.A., Gootenberg J.S., Abudayyeh O.O., Metsky H.C., Durbin A.F., Kellner M.J., Tan A.L., Paul L.M., Parham L.A., Garcia K.F., Barnes K.G., Chak B., Mondini A., Nogueira M.L., Isern S., Michael S.F., Lorenzana I., Yozwiak N.L., MacInnis B.L., Bosch I., Gehrke L., Zhang F., Sabeti P.C. //Science. 2018. V. 360. № 6387. P. 444-448.). Cas13a нклеаза и аналогичные ей CRISPR-нуклеазы, чья коллатеральная активность проявляется при селективном узнавании заданных последовательностей в таргетных ДНК и РНК, рассматриваются сегодня как основа для создания нового поколения биосенсоров c чувствительностью детекции на уровне единичных ДНК/РНК молекул (Источник [15]: Li Y., Li S., Wang J., Liu G. //Trends Biotechnol. 2019. V. 37. № 7. P. 730-743.).The loci encoding Cas13a nuclease were first identified in the genomes of five bacterial taxa: α-proteobacteria, Bacilli, Clostridia, Fusobacteria, and Bacteroidetes (Source [8]: Shmakov S., Abudayyeh OO, Makarova KS, Wolf YI, Gootenberg E JS, Semenova ., Minakhin L., Joung J., Konermann S., Severinov K., Zhang F., Koonin EV // Mol. Cell. 2015. V. 60. No. 3. P. 385-397.). Currently, Cas13a nucleases encoded by the genomes of bacteria of the genus Leptotrichia are most intensively used in experimental studies (Source 4; 6. Source [9]: Tambe A., East-Seletsky A., Knott GJ, Doudna JA, O'Connell MR / / Cell Rep. 2018. V. 24. No. 4. P. 1025-1036 Source [10]: East-Seletsky A., O'Connell MR, Knight SC, Burstein D., Cate JH, Tjian R., Doudna JA // Nature. 2016. V. 538. No. 7624. P. 270-273 Source [11]: Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, Essletzbichler P., Dy AJ, Joung J., Verdine V., Donghia N., Daringer NM, Freije CA, Myhrvold C., Bhattacharyya RP, Livny J., Regev A., Koonin EV, Hung DT, Sabeti PC, Collins JJ, Zhang F. // Science. 2017. V. 356. No. 6336. P. 438-442.). Experimental testing of 15 Cas13a orthologs showed that the Cas13a nuclease found in the species Leptotrichia wadei, designated LwaCas13a, most effectively suppresses the growth of Escherichia coli ( E. coli ) cells during heterologous coexpression of Cas13a and nRNA (source [6]). The nucleotide sequence of the LwaCas13a nuclease gene is ~ 3.5 kb and encodes a polypeptide with a length of 1162 amino acid residues (a.a.); the molecular weight of the protein is ≈138 kDa. The collateral activity of LwaCas13 was the basis for a method for ultrasensitive detection of bacteria and viruses called SHERLOCK (source [11], source [12]: Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J., Collins JJ, Zhang F. // Science 2018. V. 360. No. 6387. P. 439-444 Source [13]: Kellner MJ, Koob JG, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Zhang F. // Nat. Protoc. 2019. V. 14. No. 10 P. 2986-3012.). In the SHERLOCK method, at the first stage, isothermal amplification of the target nucleic acid fragment is carried out, and then the detection of amplification products using LwaCas13a in combination with nRNA. The collateral activity of LwaCas13a leads to degradation of short RNA molecules added to the reaction mixture, labeled with a fluorophore and a quencher (RNA substrate or RNA reporters), followed by registration of a fluorescent signal (source [11-13]). All reactions do not require specialized equipment, and detection can be carried out in the format of test strips (by replacing the fluorophore with a biotin or peroxidase label), which opens up prospects for the field diagnosis of bacterial and viral pathogens (Source [14]: Myhrvold C., Freije CA, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Metsky HC, Durbin AF, Kellner MJ, Tan AL, Paul LM, Parham LA, Garcia KF, Barnes KG, Chak B., Mondini A., Nogueira ML, Isern S., Michael SF, Lorenzana I ., Yozwiak NL, MacInnis BL, Bosch I., Gehrke L., Zhang F., Sabeti PC // Science. 2018. V. 360. No. 6387. P. 444-448.). Cas13a nklease and similar CRISPR nucleases, whose collateral activity manifests itself upon selective recognition of specified sequences in targeted DNA and RNA, are considered today as the basis for creating a new generation of biosensors with detection sensitivity at the level of single DNA / RNA molecules (Source [15]: Li Y., Li S., Wang J., Liu G. // Trends Biotechnol. 2019. V. 37. No. 7. P. 730-743.).

В настоящее время для получения рекомбинантной рибонуклеазы Cas-нуклеазы используют гетерологичную экспрессии в бактерий Escherichia coli. Для получения рекомбинантной рибонуклеазы Cas13a, требуемой чистоты, свободной от токсинов, используют трёхстадийную очистку, включающую последовательно стадии аффинной хроматографии (Strep-tag), ионнообменной хроматографии и эксклюзионной ВЭЖХ гель-фильтрации (Источники [11;12;13]). Экспрессия Cas13a-нуклеазы в клетках бактерии Escherichia coli отличается высоким выходом рекомбинантной рибонуклеазы Cas13a, обусловленной доступностью получения и воспроизведения бактерии Escherichia coli, однако фрагменты клеток бактерии Escherichia coli соединяются с получаемой Cas13a-нуклеазой и чистота получаемой Cas13a-нуклеазы недостаточна для применения, что требует выполнения дополнительной очистки Cas13a-нуклеазы от бактериальных экдотоксинов.Currently, heterologous expression in Escherichia coli bacteria is used to obtain recombinant ribonuclease Cas nucleases. To obtain the recombinant ribonuclease Cas13a of the required purity, free of toxins, a three-stage purification is used, including successively the stages of affinity chromatography (Strep-tag), ion exchange chromatography and size exclusion HPLC gel filtration (Sources [11; 12; 13]). Expression of Cas13a nuclease in the cells of Escherichia coli bacteria is characterized by a high yield of recombinant ribonuclease Cas13a due to the availability of production and reproduction of Escherichia coli bacteria; however, cell fragments of Escherichia coli bacteria combine with the produced Cas13a nuclease and the purity of the Cas13a nuclease obtained is insufficient for use, which requires additional purification of Cas13a nuclease from bacterial ecdotoxins.

Недостаток известного способа получения Cas13a-нуклеазы заключается в технологической сложности осуществления способа, необходимостью использования трёхстадийной очистки для обеспечения достаточной чистоты конечного препарата Cas13a-нуклеазы от бактериальных эндотоксинов. Требуется техническое обеспечение (оборудование) для выполнения последовательной очистки и доочистки путем аффинной хроматографии (Strep-tag), ионнообменной хроматографии и эксклюзионной ВЭЖХ (гель-фильтрации), что делает практическое использование Cas13a-нуклеазы труднодоступным, ограничивает возможности для ее широкого (массового) применения. The disadvantage of the known method for producing Cas13a-nuclease is the technological complexity of the implementation of the method, the need to use three-stage purification to ensure sufficient purity of the final preparation of Cas13a-nuclease from bacterial endotoxins. Technical support (equipment) is required to perform sequential purification and postpurification by affinity chromatography (Strep-tag), ion exchange chromatography and size exclusion HPLC (gel filtration), which makes the practical use of Cas13a nuclease difficult to access, limits the possibilities for its wide (mass) use ...

Задачей изобретения является повышение доступности очищенного (в интервале 80-90%) рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы с функциональной коллатеральной РНКазной активностью, способного расщеплять любые молекулы РНК. Обеспечение получения очищенного рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы с коллатеральной РНКазной активностью, технологически простым способом, снижающим потребность в использовании технического обеспечения (различного оборудования) и не требующим многостадийной доочистки препарата от бактериальных эндотоксинов.The objective of the invention is to increase the availability of purified (in the range of 80-90%) recombinant protein Cas13a-nuclease with functional collateral RNase activity, capable of cleaving any RNA molecule. Ensuring the production of a purified recombinant protein Cas13a-nuclease with collateral RNase activity in a technologically simple way that reduces the need for the use of technical support (various equipment) and does not require multi-stage additional purification of the drug from bacterial endotoxins.

Авторы настоящего изобретения, в результате собственных исследований, пришли к решению, что задача получения рекомбинантной Cas13a-нуклеазы с функциональной активностью, способной расщеплять любые молекулы РНК, с достаточной степенью чистоты может быть успешно решена путем трансформации экспрессионного плазмидного вектора pET His6-TwinStrep-SUMO-LwaCas13a в клетки E.coli c последующим выделением и очисткой целевого белка Cas13a-нуклеазы путем использования аффинной или металл-хелатной хроматографии с использованием N-концевой полигистидиновой метки (6хHis-tag) и гравитационных хроматографических колонок. The authors of the present invention, as a result of their own research, came to the decision that the problem of obtaining a recombinant Cas13a nuclease with a functional activity capable of cleaving any RNA molecules, with a sufficient degree of purity, can be successfully solved by transforming the expression plasmid vector pET His6-TwinStrep-SUMO- LwaCas13a into E. coli cells, followed by isolation and purification of the target Cas13a-nuclease protein using affinity or metal-chelate chromatography using an N- terminal polyhistidine tag (6xHis-tag) and gravity chromatographic columns.

Плазмидный вектор pET His6-TwinStrep-SUMO-LwaCas13a идентичен плазмиде pC013 His6-TwinStrep-SUMO-LwCas13a, депонированной в репозиторий ADDGENE (www.addgene.org/90097), которая была сконструирована для гетерологичной экспрессии рекомбинантного белка LwaCas13a (источник [11]). Конструкция данного плазмидного вектора предполагает индуцированную экспрессию с Т7-промотора, при этом в последовательность целевого белка с N-конца включены последовательно 6xHis-tag/(Twin)Strep-tag/SUMO. Это позволяет проводить очистку рекомбинантного белка в одну стадию путем хроматографии. При этом выход целевого белка максимален с 2 (второй) по 6 (шестую) фракцию элюата с хроматографической колонки (фиг.1).The plasmid vector pET His6-TwinStrep-SUMO-LwaCas13a is identical to the plasmid pC013 His6-TwinStrep-SUMO-LwCas13a, deposited in the ADDGENE repository (www.addgene.org/90097), which was designed for heterologous expression of the recombinant protein Lwa [11] ... The construction of this plasmid vector assumes induced expression from the T7 promoter, while 6xHis-tag / (Twin) Strep-tag / SUMO are sequentially inserted into the sequence of the target protein from the N-terminus. This allows for the purification of the recombinant protein in one step by chromatography. In this case, the yield of the target protein is maximum from 2 (second) to 6 (sixth) fractions of the eluate from the chromatographic column (figure 1).

Технический результат, заключается в получении очищенного рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы с функциональной коллатеральной РНКазной активностью, технологически простым способом. Упрощение процедуры получения и очистки рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы с функциональной коллатеральной РНКазной активностью делает Cas13a-нуклеазы более доступными для практического применения и проведения исследований, что позволяет расширить возможности по разработке и практическому использованию диагностических биосенсорных систем нового поколения, в технике, связанной с распознаванием и редактированием генов.The technical result consists in obtaining a purified recombinant protein Cas13a-nuclease with functional collateral RNase activity in a technologically simple way. Simplification of the procedure for the production and purification of the recombinant protein Cas13a nuclease with functional collateral RNase activity makes Cas13a nucleases more accessible for practical application and research, which makes it possible to expand the possibilities for the development and practical use of new generation diagnostic biosensor systems in technology related to recognition and gene editing.

Технический результат достигается тем, что в способе получения рекомбинантной Cas13a-нуклеазы с коллатеральной активностью включающем трансформацию клеток бактерии Escherichia coli экспрессионным вектором, экспрессию и очистку целевого рекомбинантного белка Cas13a, очистку целевого рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы производят в одну стадию путем хроматографии.The technical result is achieved by the fact that in the method for producing recombinant Cas13a-nuclease with collateral activity, including the transformation of cells of the bacterium Escherichia coli with an expression vector, expression and purification of the target recombinant protein Cas13a, the purification of the target recombinant protein Cas13a-nuclease is performed in one stage by chromatography.

Предполагается, что очистку целевого рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы производят с использованием последовательности аминокислотных остатков, добавленной генно-инженерными методами к C- или N-концу рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы. Предусмотрено, что при очистке проводят оценку функциональной активности белка Cas13a-нуклеазы.It is assumed that the purification of the target recombinant Cas13a nuclease protein is performed using a sequence of amino acid residues added by genetic engineering methods to the C- or N-terminus of the recombinant Cas13a nuclease protein. It is envisaged that during the purification, the functional activity of the Cas13a-nuclease protein is evaluated.

Предполагается, что в экспрессионный вектор в последовательность гена белка добавляют последовательность нуклеотидов, кодирующую полигистидиновую метку His-tag на N- или С- конце белка, состоящую из шести или более аминокислотных остатков гистидина. Очистку целевого рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы производят в одну стадию путем аффинной хроматографии или металл-хелатной хроматографии. Предполагается, что применяют экспрессионный вектор pET His6-TwinStrep-SUMO-LwaCas13a который включает последовательность меток 6xHis-tag/(Twin)Strep-tag/SUMO.It is assumed that a nucleotide sequence encoding a polyhistidine His-tag at the N- or C-terminus of the protein, consisting of six or more histidine amino acid residues, is added to the protein gene sequence in the expression vector. Purification of the target recombinant protein Cas13a-nuclease is performed in one step by affinity chromatography or metal-chelate chromatography. It is assumed that the expression vector pET His6-TwinStrep-SUMO-LwaCas13a is used which includes the 6xHis-tag / (Twin) Strep-tag / SUMO tag sequence.

Предусмотрено, что очистку рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы производят путем аффинной хроматографии на сефарозе с иммобилизованным Strep-Tactin. It is envisaged that the purification of the recombinant protein Cas13a-nuclease is performed by affinity chromatography on Sepharose with immobilized Strep-Tactin.

Предусмотрено, что применяют аффинную хроматографию, основанную на специфическом взаимодействии добавленной последовательности с лигандом, иммобилизованном на твердофазном носителе.It is envisaged that affinity chromatography is used based on the specific interaction of the added sequence with a ligand immobilized on a solid phase support.

Предусмотрено, что очистку целевого рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы производят с использованием полигистидиновой аминокислотной последовательности и матрицы в виде крупнопорового кремния, заряженного ионами никеля или кобальта в качестве хелатирующего лиганда.It is envisaged that the purification of the target recombinant protein Cas13a-nuclease is performed using a polyhistidine amino acid sequence and a matrix in the form of large-pore silicon charged with nickel or cobalt ions as a chelating ligand.

Предполагается, что при очистке целевого рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы путем хроматографии, проводят оценку содержания целевого рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы с использованием гравитационных хроматографических колонок. Оценку целевого рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы во фракциях элюата с хроматографических колонок проводят с использованием гравитационных хроматографических колонок, содержащих хелатирующий лиганд, матрицу в виде крупнопорового кремния с заряженным Ni2+, обеспечивающих очистку белков с полигистидиновой меткой His-tag. It is assumed that when purifying the target recombinant protein Cas13a-nuclease by chromatography, the content of the target recombinant protein Cas13a-nuclease is assessed using gravity chromatographic columns. Evaluation of the target recombinant protein Cas13a-nuclease in the fractions of the eluate from chromatographic columns is carried out using gravity chromatographic columns containing a chelating ligand, a matrix in the form of large-pore silicon with charged Ni 2+ , providing the purification of proteins with a polyhistidine tag His-tag.

Предусмотрено, что бактерии Escherichia coli культивируют при 37°С, рост клеток контролируют измеряя оптическую плотность на 600 нм, при достижении D600 значения 0,6 в культуру добавляют индуктор экспрессии изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид до конечной концентрации 50 мкМ, экспрессию целевого рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы проводят течение 16 часов при 18°С, клетки бактерии осаждают центрифугированием, промывают фосфатно-солевым буфером. It is envisaged that Escherichia coli bacteria are cultivated at 37 ° C, cell growth is monitored by measuring the optical density at 600 nm, when D600 reaches 0.6, an expression inducer isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside is added to the culture to a final concentration of 50 μM, expression the target recombinant protein Cas13a-nuclease is carried out for 16 hours at 18 ° C, bacterial cells are precipitated by centrifugation, washed with phosphate-buffered saline.

Предусмотрено, что операции по получению целевого рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы проводят при +4°С, ресуспендируют клеточный осадок в колонке в буфере LEW, вносят лизоцим до конечной концентрации 1 мг/мл, фенилметансульфонил фторид до 1 мМ и ДНКаза до 1 мг/мл, инкубируют клетки бактерии Escherichia coli на льду в течение 30 минут, разрушают клетки бактерии Escherichia coli механическим способом с помощью френч-пресса, полученный гомогенат осветляют центрифугированием, наносят гомогенат на колонку, промывают колонку, связавшийся материал элюируют буфером, содержащим 250 мМ имидазола, последовательно собирают фракции объемом 0,5 мл, анализируют фракции путем электрофореза по Лэммли в 9% ПААГ с окраской красителем Кумасси G-250, оценивают относительное количество целевого рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы путем сопоставления площадей пиков, соответствующих белковым полосам на геле, после его денситометрии на гель-сканере, очищенный целевой белок Cas13a-нуклеазы переводят в буфер для хранения с использованием диализа.It is envisaged that the operations to obtain the target recombinant protein Cas13a-nuclease are carried out at + 4 ° C, the cell pellet is resuspended in the column in LEW buffer, lysozyme is added to a final concentration of 1 mg / ml, phenylmethanesulfonyl fluoride up to 1 mM and DNase up to 1 mg / ml , the cells of the Escherichia coli bacteria are incubated on ice for 30 minutes, the cells of the Escherichia coli bacteria are destroyed mechanically using a French press, the resulting homogenate is clarified by centrifugation, the homogenate is applied to the column, the column is washed, the bound material is eluted with a buffer containing 250 mM imidazole, sequentially collect fractions with a volume of 0.5 ml, analyze fractions by electrophoresis according to Laemmli in 9% PAGE with Coomassie G-250 staining, estimate the relative amount of the target recombinant protein Cas13a-nuclease by comparing the areas of the peaks corresponding to the protein bands on the gel, after its densitometry on gel scanner, the purified target protein Cas13a-nuclease is transferred to buffer storage space using dialysis.

Заявляемый в настоящем изобретении способ выгодно отличается от способов известных из уровня техники, возможностью получения достаточно чистого рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы с функциональной коллатеральной РНКазной путем одностадийной очистки.The method claimed in the present invention compares favorably with the methods known from the prior art, the possibility of obtaining a sufficiently pure recombinant protein Cas13a-nuclease with a functional collateral RNase by one-step purification.

Изобретение поясняется графическими материалами:The invention is illustrated by graphic materials:

Фиг.1 –Фотография. ПААГ-электрофорез исходного гомогената клеток E. coli и фракций элюата при очистке целевого белка Cas13a-нуклеазы металл-хелатной хроматографией на колонках Protino Ni-TED 1000. 1 – гомогенат клеток, 2-6 – фракции элюата со второй по шестую. Целевой белок Cas13a-нуклеазы указан стрелкой. Слева показаны молекулярные массы в кДа.Fig. 1 - Photo. PAGE electrophoresis of the initial homogenate of E. coli cells and eluate fractions during purification of the target Cas13a-nuclease protein by metal-chelate chromatography on Protino Ni-TED 1000 columns. 1 - cell homogenate, 2-6 - eluate fractions from the second to the sixth. The target Cas13a nuclease protein is indicated by an arrow. Molecular weights in kDa are shown on the left.

Фиг.2 –График. Изменение относительной флуоресценции при инкубации флуоресцентно-меченного РНК-субстрата с целевым белком Cas13a-нуклеазы при 37ºС. Относительная флуоресценция вычислялась как отношение F/F0, F – флуоресценция в указанный момент времени, F0 – флуоресценция в начальный момент в отсутствии целевого белка Cas13a-нуклеазы. 1 – изменение флуоресценции в отсутствии РНК-мишени; 2, 3, 4, 5 и 6 – в присутствии 10, 25, 80, 250 и 800 нг суммарной РНК E. coli, соответственно. Показаны среднеарифметические значения и среднеквадратичные отклонения для трипликатных измерений.Fig. 2 - Graph. Change in relative fluorescence upon incubation of a fluorescently labeled RNA substrate with the target Cas13a nuclease protein at 37 ° C. The relative fluorescence was calculated as the F / F0 ratio, F is the fluorescence at the specified time point, and F0 is the fluorescence at the initial moment in the absence of the target Cas13a nuclease protein. 1 - change in fluorescence in the absence of target RNA; 2, 3, 4, 5, and 6 - in the presence of 10, 25, 80, 250, and 800 ng of total E. coli RNA, respectively. Shown are arithmetic mean values and standard deviations for triplicate measurements.

Фиг.3 – График. Изменение относительной флуоресценции (после 100 минутной инкубации флуоресцентно-меченного РНК-субстрата с целевым белком Cas13a-нуклеазы при 37ºС) как функция количества суммарной РНК E. coli.Fig. 3 - Graph. Change in relative fluorescence (after 100 min incubation of the fluorescently labeled RNA substrate with the target Cas13a nuclease protein at 37 ° C) as a function of the amount of total E. coli RNA.

Фиг.4 – График. Зависимость функциональной активности Cas13a-нуклеазы от времени хранения. 1 – кинетика относительной флуоресценции при инкубации флуоресцентно-меченного РНК-субстрата со свежеприготовленной Cas13a-нуклеазой; 2, 3, 4 и 5 – после её хранения при -80 ºС в течении 1, 2, 3,5 и 5 месяцев, соответственно. Количество суммарной РНК E. coli – 800 нг. Показаны среднеарифметические значения для трипликатных измерений; относительные среднеквадратичные отклонения не превышали 15%.Fig. 4 - Graph. Dependence of the functional activity of Cas13a nuclease on storage time. 1 - kinetics of relative fluorescence during incubation of a fluorescently labeled RNA substrate with freshly prepared Cas13a nuclease; 2 , 3 , 4 and 5 - after storage at -80 ºС for 1, 2, 3.5 and 5 months, respectively. The total amount of E. coli RNA is 800 ng. Shown are arithmetic mean values for triplicate measurements; the relative standard deviations did not exceed 15%.

Фиг.5 – Таблица. Последовательности олигонуклеотидов, использованных в работе. Последовательность, комплементарная последовательности Т7-промотера, показана курсивом. Полужирным шрифтом выделена последовательность спейсера. Fig. 5 - Table. The sequences of the oligonucleotides used in the work. The sequence complementary to the T7 promoter sequence is shown in italics. The spacer sequence is in bold.

Осуществление изобретения. Implementation of the invention.

Способ получения рекомбинантной Cas13a-нуклеазы с коллатеральной активностью включает трансформацию клеток бактерии Escherichia coli экспрессионным плазмидным вектором, экспрессию и очистку целевого рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы. Очистку целевого рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы производят в одну стадию путем хроматографии. Причем для очистки применяют (выбирают) аффинную хроматографию или металл-хелатную хроматографию.A method for producing a recombinant Cas13a nuclease with collateral activity includes transforming Escherichia coli bacterial cells with an expression plasmid vector, expressing and purifying the target recombinant Cas13a nuclease protein. Purification of the target recombinant protein Cas13a-nuclease is performed in one step by chromatography. Moreover, for purification, affinity chromatography or metal chelate chromatography is used (chosen).

Предполагается, что очистку целевого рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы производят с использованием последовательности аминокислотных остатков, добавленной генно-инженерными методами к C- или N-концу рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы. It is assumed that the purification of the target recombinant Cas13a nuclease protein is performed using a sequence of amino acid residues added by genetic engineering methods to the C- or N-terminus of the recombinant Cas13a nuclease protein.

В экспрессионный плазмидный вектор в последовательность гена белка предварительно добавляют последовательность нуклеотидов, кодирующую полигистидиновую метку His-tag на N- или С- конце белка, состоящую из шести или более аминокислотных остатков гистидина. Предполагается, что экспрессионный вектор pET His6-TwinStrep-SUMO-LwaCas13a включает последовательность меток 6xHis-tag/(Twin)Strep-tag/SUMO.A nucleotide sequence encoding a polyhistidine tag His-tag at the N- or C-terminus of the protein, consisting of six or more amino acid residues of histidine, is preliminarily added to the expression plasmid vector in the protein gene sequence. The expression vector pET His6-TwinStrep-SUMO-LwaCas13a is expected to include the 6xHis-tag / (Twin) Strep-tag / SUMO tag sequence.

Очистку целевого рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы производят с использованием полигистидиновой аминокислотной последовательности и матрицы в виде крупнопорового кремния, заряженного ионами никеля или кобальта в качестве хелатирующего лиганда. Purification of the target recombinant protein Cas13a-nuclease is performed using a polyhistidine amino acid sequence and a matrix in the form of large-pore silicon charged with nickel or cobalt ions as a chelating ligand.

Предусмотрено, что производят очистку рекомбинантного белка с путем аффинной хроматографии на сефарозе с иммобилизованным Strep-Tactin. В одном варианте осуществления способа применяют аффинную хроматографию, основанную на специфическом взаимодействии добавленной последовательности с лигандом, иммобилизованном на твердофазном носителе. Provided that produce the purification of the recombinant protein by affinity chromatography on Sepharose with immobilized Strep-Tactin. In one embodiment, the method employs affinity chromatography based on the specific interaction of the added sequence with a ligand immobilized on a solid phase support.

При очистке целевого рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы путем хроматографии, проводят оценку содержания целевого рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы с использованием гравитационных хроматографических колонок. Оценку целевого рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы во фракциях элюата с хроматографических колонок проводят с использованием гравитационных хроматографических колонок, содержащих хелатирующий лиганд, матрицу в виде крупнопорового кремния с заряженным Ni2+, обеспечивающих очистку белков с полигистидиновой меткой His-tag. Выход целевого рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы максимален с второй по шестую фракцию элюата с хроматографической колонки.When purifying the target recombinant protein Cas13a-nuclease by chromatography, the content of the target recombinant protein Cas13a-nuclease is estimated using gravity chromatographic columns. Evaluation of the target recombinant protein Cas13a-nuclease in the fractions of the eluate from chromatographic columns is carried out using gravity chromatographic columns containing a chelating ligand, a matrix in the form of large-pore silicon with charged Ni 2+ , providing the purification of proteins with a polyhistidine tag His-tag. The yield of the target recombinant protein Cas13a-nuclease is maximal from the second to sixth fractions of the eluate from the chromatographic column.

На первом этапе осуществляют трансформацию клеток бактерии Escherichia coli экспрессионным плазмидным вектором. Для бактериальной экспрессии белка Cas13a-нуклеазы используют плазмидный вектор pET His6-TwinStrep-SUMO-LwaCas13a, представленный компанией «Novoprolabs» (КНР; Кат. №V10159). Согласно спецификации поставщика, плазмидный вектор идентичен плазмиде pC013 His6-TwinStrep-SUMO-LwCas13a, депонированной в репозиторий ADDGENE (www.addgene.org/90097), который сконструирован гетерологичной экспрессии рекомбинантного белка LwaCas13a (Источник [11]). Конструкция данного плазмидного вектора pET His6-TwinStrep-SUMO-LwaCas13a предполагает индуцированную экспрессию с Т7-промотора, при этом в последовательность целевого белка с N-конца включены последовательно 6xHis-tag/(Twin)Strep-tag/SUMO. Это позволяет проводить очистку рекомбинантного белка белка Cas13a-нуклеазы в одну стадию путем применения либо металл-хелатной хроматографии, либо аффинной хроматографии на сефарозе с иммобилизованным Strep-Tactin. At the first stage, the cells of the Escherichia coli bacterium are transformed with an expression plasmid vector. For bacterial expression of the Cas13a nuclease protein, the plasmid vector pET His6-TwinStrep-SUMO-LwaCas13a available from Novoprolabs (PRC; Cat. No. V10159) was used. According to the supplier's specification, the plasmid vector is identical to the pC013 His6-TwinStrep-SUMO-LwCas13a plasmid deposited in the ADDGENE repository (www.addgene.org/90097), which is engineered to heterologously express the recombinant LwaCas13a protein (Reference [11]). The construction of this plasmid vector pET His6-TwinStrep-SUMO-LwaCas13a assumes induced expression from the T7 promoter, while 6xHis-tag / (Twin) Strep-tag / SUMO are sequentially inserted into the sequence of the target protein from the N-terminus. This makes it possible to purify the recombinant protein Cas13a-nuclease in one step using either metal chelate chromatography or affinity chromatography on Sepharose with immobilized Strep-Tactin.

Экспрессионный плазмидный вектор pET His6-TwinStrep-SUMO-LwaCas13a трансформируют в штамм бактерии E. coli например Rosetta™ 2(DE3)pLysS Singles™ Competent Cells («Merck», Германия). Ночная культура (среда LB с добавлением ампициллина и хлорамфеникола в стандартных концентрациях) в количестве 2 мл вносят в 300 мл среды Terrific Broth (содержит 12 г/л триптона, 2 г/л пептона, 24 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л глицерина, 12,5 г/л K2HPO4 и 2,3 г/л KH2PO4), культивируют при 37°С. Рост клеток контролируют измерением оптической плотности на 600 нм (D 600). При достижении D 600 значения 0,6 в культуру добавляют индуктор экспрессии изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) до конечной концентрации 50 мкМ. The expression plasmid vector pET His6-TwinStrep-SUMO-LwaCas13a is transformed into a bacterial strain of E. coli, for example Rosetta ™ 2 (DE3) pLysS Singles ™ Competent Cells (Merck, Germany). Overnight culture (LB medium with the addition of ampicillin and chloramphenicol at standard concentrations) in an amount of 2 ml is added to 300 ml of Terrific Broth medium (contains 12 g / L tryptone, 2 g / L peptone, 24 g / L yeast extract, 5 g / L glycerol, 12.5 g / l K 2 HPO 4 and 2.3 g / l KH 2 PO 4 ), cultured at 37 ° C. Cell growth is monitored by measuring optical density at 600 nm ( D 600 ). When the D 600 value reaches 0.6, the expression inducer isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) is added to the culture to a final concentration of 50 μM.

Производят экспрессию целевого белка Cas13a-нуклеазы в течение 16 часов при 18˚С. Клетки бактерии осаждают центрифугированием (4000 g, 15 мин, 4°С), промывают фосфатно-солевым буфером (Phosphate Buffered Saline, «Sigma-Aldrich», США) и используют для получения целевого белка Cas13a-нуклеазы. Операции по получению целевого белка Cas13a проводят при +4°С. The target Cas13a-nuclease protein is expressed for 16 hours at 18 ° C. Bacterial cells are precipitated by centrifugation (4000 g , 15 min, 4 ° C), washed with phosphate buffered saline (Sigma-Aldrich, USA) and used to obtain the target Cas13a nuclease protein. The operations to obtain the target Cas13a protein are carried out at + 4 ° C.

Производят очистку целевого рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы. Очистку рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы осуществляют на хромотографических колонках, например Protino Ni-TED 1000 («Macherey-Nagel», Германия) в соответствии с протоколом производителя. Клеточный осадок ресуспендируют в буфере LEW (50 мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCl, pH 8.0) из набора к колонкам Protino Ni-TED 1000. Дополнительно в буфер вносят лизоцим (например «Sigma-Aldrich», США) до конечной концентрации 1 мг/мл, фенилметансульфонил фторид (phenylmethanesulfonyl fluoride, «Sigma-Aldrich», США) до 1 мМ и ДНКаза (DNase I, «Roche», Швейцария) до 1 мг/мл. После инкубации на льду в течение 30 минут клетки разрушают механическим способом с помощью френч-пресса («Thermo Electron Corporation», США). Полученный гомогенат осветляют центрифугированием – 20 000 g, 40 мин, 4°С. Осветлённый гомогенат наносят на колонку. После промывки колонки, связавшийся материал элюируют буфером, содержащим 250 мМ имидазола, последовательно собирая фракции объемом 0,5 мл. Фракции анализируют методом электрофореза по Лэммли в 9% ПААГ с окраской красителем Кумасси G-250 («Bio-Rad», США). Purification of the target recombinant protein Cas13a-nuclease is performed. Purification of the recombinant protein Cas13a-nuclease is carried out on chromatographic columns, for example, Protino Ni-TED 1000 (Macherey-Nagel, Germany) in accordance with the manufacturer's protocol. The cell pellet is resuspended in LEW buffer (50 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl, pH 8.0) from the set for Protino Ni-TED 1000 columns. Additionally, lysozyme is added to the buffer (for example, Sigma-Aldrich, USA) to a final concentration of 1 mg / ml, phenylmethanesulfonyl fluoride (Sigma-Aldrich, USA) up to 1 mM and DNase (DNase I, Roche, Switzerland) up to 1 mg / ml. After incubation on ice for 30 minutes, the cells are mechanically disrupted using a French press (Thermo Electron Corporation, USA). The resulting homogenate is clarified by centrifugation - 20,000 g , 40 min, 4 ° C. The clarified homogenate is applied to the column. After washing the column, the bound material is eluted with a buffer containing 250 mM imidazole, sequentially collecting 0.5 ml fractions. Fractions are analyzed by Laemmli electrophoresis in 9% PAGE with Coomassie G-250 dye (Bio-Rad, USA).

Относительное количество целевого рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы оценивают сопоставлением площадей пиков, соответствующих белковым полосам на геле, после его денситометрии на гель-сканере ImageScanner III («GE Healthcare», США). Очищенный аффинной хроматографией целевой белок Cas13a-нуклеазы переводят в буфер для хранения (600 мМ NaCl, 50 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 5% глицерин, 2 мМ DTT) с помощью диализа. Диализ проводят с использованием мембран SnakeSkin Dialysis Tubing 7000 MWCO («Thermo Fisher Scientific», США). Концентрации суммарного и целевого белка измеряют методом Брэдфорда, используя растворы БСА в качестве стандартов. Аликвоты раствора целевого белка хранят на -80°С.The relative amount of the target recombinant protein Cas13a-nuclease is estimated by comparing the areas of the peaks corresponding to the protein bands on the gel after densitometry on the ImageScanner III gel scanner (GE Healthcare, USA). The target Cas13a-nuclease protein purified by affinity chromatography is transferred to a storage buffer (600 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5% glycerol, 2 mM DTT) by dialysis. Dialysis is performed using SnakeSkin Dialysis Tubing 7000 MWCO membranes (Thermo Fisher Scientific, USA). The total and target protein concentrations are measured by the Bradford method using BSA solutions as standards. Store aliquots of the target protein solution at -80 ° C.

Для масс-спектрометрической идентификации целевого рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы представляющие интерес белковые полосы вырезают из полиакриламидного геля после ПААГ-электрофореза препаратов очищенного белка и содержащийся в них материал подвергают трипсинолизу в геле в соответствии с протоколом, описанным в (Источник [16] Shevchenko A., Tomas H., Havlis J., Olsen J.V., Mann M. //Nat. Protoc. 2006. V. 1. № 6. P. 2856-2860.). Полученную смесь пептидов анализируют на времяпролетном MALDI-TOF/TOF масс-спектрометре Bruker Ultraflex II («Bruker Daltonics», Германия) и методом тандемной хромато-масс-спектрометрии (LC-ESI-MS/MS) на масс-спектрометре Orbitrap Q-Exactive («Thermo Fisher Scientific», США), сочленённом с хроматографической системой Agilent HPLC 1100 Series (“Agilent Technologies”, США). В последнем случае используют аналитическую колонку Zorbax 300SB-C18 (“Agilent Technologies”, США) с обращенной фазой.For mass spectrometric identification of the target recombinant protein Cas13a nuclease, the protein bands of interest are excised from the polyacrylamide gel after PAGE electrophoresis of the purified protein preparations, and the material contained therein is subjected to gel trypsinolysis in accordance with the protocol described in (Reference [16] Shevchenko A. , Tomas H., Havlis J., Olsen JV, Mann M. // Nat. Protoc. 2006. V. 1. No. 6. P. 2856-2860.). The resulting mixture of peptides is analyzed on a time-of-flight MALDI-TOF / TOF mass spectrometer Bruker Ultraflex II (Bruker Daltonics, Germany) and by tandem gas chromatography-mass spectrometry (LC-ESI-MS / MS) on an Orbitrap Q-Exactive mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific, USA) coupled with an Agilent HPLC 1100 Series chromatographic system (Agilent Technologies, USA). In the latter case, a Zorbax 300SB-C18 analytical column (Agilent Technologies, USA) with a reversed phase is used.

Спектры пептидных масс, полученные методом MALDI-TOF масс-спектрометрии, сравнивают с теоретически ожидаемыми спектрами из базы данных NCBI при помощи веб-платформы Mascot Peptide Mass Fingerprint (“Matrix Science”, Великобритания), используют следующие параметры: погрешность определения массы (mass tolerance) моноизотопного, пропионамидирование цистеина считали фиксированной модификацией, окисление метионина – вариабельной, допускали один пропуск сайта трипсинолиза. В случае LC-ESI-MS/MS, масс-спектры обрабатывают с помощью программных продуктов SearchGUI (v. 3.3.16) (Источник [17]: Barsnes H., Vaudel M. Searchgui: //J. Proteome Res. 2018. V. 17. № 7. P. 2552-2555.) и PeptideShaker (v. 1.16.42) (Источник [18]: Vaudel M., Burkhart J.M., Zahedi R.P., Oveland E., Berven F.S., Sickmann A., Martens L., Barsnes H. //Nat. Biotechnol. 2015. V. 33. № 1. P. 22-24.). Поиск проводили тремя поисковыми алгоритмами (X! Tandem, MS-GF+ и OMSSA) (Источник [19]: Bjornson R.D., Carriero N.J., Colangelo C., Shifman M., Cheung K.H., Miller P.L., Williams K. //Proteome Res. 2008. V. 7, № 1. P. 293-299. Источник [20]: Kim S., Pevzner P.A. //Nat. Commun. 2014. V. 5. P. 5277. Источник [21]: Geer L.Y., Markey S.P., Kowalak J.A., Wagner L., Xu M., Maynard D.M., Yang X., Shi W., Bryant S.H. //J. Proteome Res. 2004. V. 3. № 5. P. 958-964.) в кастомизированных библиотеках белковых последовательностей, включающих последовательности белков E. coli K12 (Swiss-Prot, release 09-2019, 4533 белковые последовательности) и лабораторных белков-контаминантов cRAP (Swiss-Prot, release 01-2012, 115 последовательностей), а также последовательности белков L. wadei (штамм F0279; UniProt Proteome ID UP000016626, 2277 белков) и Leptotrichia buccalis (UniProt Proteome ID UP000001910; 2218 белков). При обработке результатов хромато-масс-спектрометрического анализа устанавливают следующие параметры поиска: погрешность определения массы пептидного иона – 10 ppm, фрагментного иона – 0,05 Да, один пропуск сайта трипсинолиза, фиксированная модификация – карбамидометилирование цистеина, вариабельная – окисление метионина. Белок считали идентифицированным, если удавалось детектировать не менее двух протеотипических пептидов, на каждый из которых приходилось не меньше 2 PSM (т.е. фактов совпадения теоретического спектра со спектром экспериментальным). Отсечение по ложноположительным идентификациям как для пептидов, так и для белков было установлено на уровне 1%.The peptide mass spectra obtained by MALDI-TOF mass spectrometry are compared with the theoretically expected spectra from the NCBI database using the Mascot Peptide Mass Fingerprint web platform (Matrix Science, UK), using the following parameters: mass tolerance ) monoisotopic, propionamidation of cysteine was considered a fixed modification, oxidation of methionine was variable, and one pass of the trypsinolysis site was allowed. In the case of LC-ESI-MS / MS, mass spectra were processed using SearchGUI software (v. 3.3.16) (Source [17]: Barsnes H., Vaudel M. Searchgui: // J. Proteome Res. 2018. V. 17. No. 7. P. 2552-2555.) And PeptideShaker (v. 1.16.42) (Source [18]: Vaudel M., Burkhart JM, Zahedi RP, Oveland E., Berven FS, Sickmann A., Martens L., Barsnes H. // Nat. Biotechnol. 2015. V. 33. No. 1. P. 22-24.). The search was carried out with three search algorithms (X! Tandem, MS-GF + and OMSSA) (Source [19]: Bjornson RD, Carriero NJ, Colangelo C., Shifman M., Cheung KH, Miller PL, Williams K. // Proteome Res. 2008. V. 7, No. 1. P. 293-299. Source [20]: Kim S., Pevzner PA // Nat. Commun. 2014. V. 5. P. 5277. Source [21]: Geer LY, Markey SP, Kowalak JA, Wagner L., Xu M., Maynard DM, Yang X., Shi W., Bryant SH // J. Proteome Res. 2004. V. 3. No. 5. P. 958-964.) in customized libraries of protein sequences, including sequences of E. coli K12 proteins (Swiss-Prot, release 09-2019, 4533 protein sequences) and laboratory protein contaminants cRAP (Swiss-Prot, release 01-2012, 115 sequences), as well as sequences proteins of L. wadei (strain F0279; UniProt Proteome ID UP000016626, 2277 proteins) and Leptotrichia buccalis (UniProt Proteome ID UP000001910; 2218 proteins). When processing the results of gas chromatography-mass spectrometric analysis, the following search parameters are set: the error in determining the mass of the peptide ion - 10 ppm, the fragment ion - 0.05 Da, one pass of the trypsinolysis site, fixed modification - carbamidomethylation of cysteine, variable - oxidation of methionine. A protein was considered identified if it was possible to detect at least two proteotypic peptides, each of which had at least 2 PSM (i.e., the facts of coincidence of the theoretical spectrum with the experimental spectrum). The cutoff for false positive identifications for both peptides and proteins was set at 1%.

Оценку функциональной активности выделенного белка проводят следующим образом. Для синтеза направляющей (нРНК) используют ДНК-матрицу D8R, содержащую на 3’-конце участок, комплементарный последовательности промотора ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага Т7, и олигонуклеотид T7F с последовательностью Т7-промотора (фиг.5). ДНК-олигонуклеотиды были синтезированы компанией «Синтол» (Россия). Эквимолярную смесь олигонуклеотидов D8R и T7F отжигают для формирования дуплекса и использовали для синтеза in vitro нРНК с помощью набора TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit («Thermo Fisher Scientific», США) согласно инструкции производителя. Очистку нРНК от примесей проводят смесью фенол/хлороформ/изоамиловый спирт 25:24:1 («Acros Organics», Бельгия) с последующим осаждением этанолом. Осадок растворяют в воде, свободной от нуклеаз, и концентрацию нРНК определяют на спектрофотометре NanoDrop 1000 («Thermo Fisher Scientific», США). Аликвоты раствора нРНК хранили на -80ºС. Последовательность нРНК представлена в таблице (фиг.5)Evaluation of the functional activity of the isolated protein is carried out as follows. For the synthesis of the guide (nRNA), a D8R DNA template is used, containing at the 3'-end a region complementary to the promoter sequence of the DNA-dependent RNA polymerase of phage T7, and a T7F oligonucleotide with the T7 promoter sequence (Fig. 5). DNA oligonucleotides were synthesized by Sintol (Russia). An equimolar mixture of D8R and T7F oligonucleotides is annealed to form a duplex and used for in vitro synthesis of nRNA using the TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific, USA) according to the manufacturer's instructions. Purification of nRNA from impurities is carried out with a phenol / chloroform / isoamyl alcohol mixture 25: 24: 1 (Acros Organics, Belgium) followed by precipitation with ethanol. The precipitate is dissolved in nuclease-free water, and the nRNA concentration is determined on a NanoDrop 1000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, USA). Aliquots of the nRNA solution were stored at -80 ° C. The sequence of nRNA is presented in the table (figure 5)

В качестве мишени для оценки эндонуклеазной активности полученного рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы используют рибосомную РНК 16S E. coli штамма XL1 Blue. Суммарную РНК E. coli выделяют с помощью реагента ExtractRNA («Евроген», Россия) согласно инструкции производителя. Реакционная смесь для оценки коллатеральной активности включает буфер (40 мМ Трис-HCl pH 7,3; 60 мМ NaCl; 6 мМ MgCl2), 45 нМ рекомбинантного белка, 22,5 нМ нРНК, 125 нМ субстрата из набора RNase Alert v2 («Thermo Fisher Scientific», США), 2 μL ингибитора РНКаз (Murine RNase Inhibitor, «New England Biolabs», Великобритания), 100 нг референсной РНК (Universal Human Reference RNA, “Agilent Technologies”, США) в качестве фона и различное количество суммарной РНК E. coli. Перед добавлением суммарной РНК E. coli, референсной РНК и субстрата из набора RNase Alert v2, смесь инкубировали в течение 15 мин при 37°C. После их добавления, реакционную смесь инкубируют 1,5-2 часа при 37°C. Флуоресценцию, возникающую при деградации субстрата из набора RNase Alert v2 для оценки РНКазной активности, детектируют с помощью планшетного ридера Infinite M200 PRO («TECAN», Швейцария), используя длины волн 490 нм и 520 нм для возбуждения и эмиссии, соответственно. Ribosomal RNA 16S of E. coli strain XL1 Blue is used as a target for evaluating the endonuclease activity of the obtained recombinant protein Cas13a nuclease. The total RNA of E. coli is isolated using the ExtractRNA reagent (Evrogen, Russia) according to the manufacturer's instructions. The reaction mixture for assessing collateral activity includes buffer (40 mM Tris-HCl pH 7.3; 60 mM NaCl; 6 mM MgCl 2 ), 45 nM recombinant protein, 22.5 nM nRNA, 125 nM substrate from the RNase Alert v2 kit (" Thermo Fisher Scientific ", USA), 2 μL RNase inhibitor (Murine RNase Inhibitor, New England Biolabs, UK), 100 ng of reference RNA (Universal Human Reference RNA, Agilent Technologies, USA) as a background and different amounts of total E. coli RNA. Before the addition of total E. coli RNA, reference RNA, and substrate from the RNase Alert v2 kit, the mixture was incubated for 15 min at 37 ° C. After adding them, the reaction mixture is incubated for 1.5-2 hours at 37 ° C. Fluorescence arising from degradation of the substrate from the RNase Alert v2 kit for assessing RNase activity is detected using an Infinite M200 PRO plate reader (TECAN, Switzerland) using wavelengths of 490 nm and 520 nm for excitation and emission, respectively.

Выход рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы при элюции с колонки максимален в третьей фракции (фиг. 1), при этом в первой и восьмой фракциях целевой белок полностью отсутствует. Существенное количество целевого рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы также присутствовует в четвёртой фракции. Материал третьей и четвертой фракций был объединён и использован для тестирования функциональной активности рекомбинантного белка как Cas13a-нуклеазы. Чистота препаратов рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы, полученных объединением третьей и четвёртой фракций элюата, лежит в интервале 80-90%. The yield of the recombinant protein Cas13a-nuclease during elution from the column is maximal in the third fraction (Fig. 1), while the target protein is completely absent in the first and eighth fractions. A significant amount of the target recombinant protein Cas13a nuclease is also present in the fourth fraction. The material of the third and fourth fractions was combined and used to test the functional activity of the recombinant protein as a Cas13a nuclease. The purity of the preparations of the recombinant protein Cas13a-nuclease obtained by combining the third and fourth fractions of the eluate is in the range of 80-90%.

В качестве мишени для проверки функциональной активности очищенного белка используют рибосомную РНК 16S штамма XL1 Blue E. coli. Такой выбор определяется доступностью данного штамма и простотой получения суммарной РНК, в которой рибосомальная РНК 16S представляет одну из доминирующих компонент. Последовательности возможных нРНК были подобраны с помощью программы CRISPR-RT (Источник [22]: Zhu H., Richmond E., Liang C. //Bioinformatics. 2018. V. 34. № 1. P. 117-119.), исходя из того, что полученный рекомбинантный белок представляет рибонуклеазу LwaCas13a. Последующий анализ вторичной структуры предложенных программой CRISPR-RT последовательностей нРНК с помощью программы Mfold (Источник [23]: Zuker M. //Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. № 13. P. 3406-3415.) показал, что среди них присутствует значительное число последовательностей, у которых с высокой вероятностью могут образовываться нежелательные дуплексные участки между последовательностями спейсера и повтора. Такие дуплексы могут препятствовать формированию последовательностью повтора характерной шпилечной структуры, ответственной за взаимодействие с Cas13a (источник [11]). В результате проведённого анализа, последовательность нРНК, представленная в табл. (фиг.5), была выбрана как наиболее оптимальная. Последовательность спейсера данной нРНК комплементарна участку с 12 по 40 нуклеотид молекулы 16S РНК E. coli (протоспейсер). Ribosomal RNA 16S strain XL1 Blue E. coli is used as a target for testing the functional activity of the purified protein. This choice is determined by the availability of this strain and the ease of obtaining total RNA, in which the 16S ribosomal RNA is one of the dominant components. The sequences of possible nRNAs were selected using the CRISPR-RT program (Source [22]: Zhu H., Richmond E., Liang C. // Bioinformatics. 2018. V. 34. No. 1. P. 117-119.) from the fact that the resulting recombinant protein is ribonuclease LwaCas13a. The subsequent analysis of the secondary structure of the nRNA sequences proposed by the CRISPR-RT program using the Mfold program (Source [23]: Zuker M. // Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. No. 13. P. 3406-3415.) Showed that among they have a significant number of sequences, which with a high probability can form undesirable duplex regions between the sequences of the spacer and the repeat. Such duplexes can prevent the formation of a characteristic hairpin structure by the repeat sequence, which is responsible for the interaction with Cas13a (ref. [11]). As a result of the analysis, the nRNA sequence presented in table. (Fig. 5) was chosen as the most optimal. The sequence of the spacer of this nRNA is complementary to the region from 12 to 40 nucleotides of the 16S RNA molecule of E. coli (protospacer).

Оценка функциональной рибонуклеазной активности полученного рекомбинантного белка, проведённая с помощью набора для детекции рибонуклеазной активности RNase Alert v2, показала, что в отсутствии РНК-мишени белок не проявляет рибонуклеазной активности (фиг. 2). Однако при добавлении РНК-мишени наблюдается развитие флуоресцентного сигнала, связанное с расщеплением РНК-репортеров в результате появившейся рибонуклеазной активности. Таким образом, полученный рекомбинантный белок обладает мишень-зависимой коллатеральной рибонуклеазной активностью, типичной для Cas13a-нуклеаз. В серии последовательных разведений суммарной РНК E. coli была показана зависимость развития флуоресцентного сигнала от концентрации мишени, которая в логарифмических координатах может быть хорошо аппроксимирована линейной функцией (фиг. 3).Evaluation of the functional ribonuclease activity of the resulting recombinant protein, carried out using a kit for detecting ribonuclease activity RNase Alert v2, showed that in the absence of a target RNA, the protein does not exhibit ribonuclease activity (Fig. 2). However, when an RNA target is added, the development of a fluorescent signal is observed, associated with the cleavage of RNA reporters as a result of the emerging ribonuclease activity. Thus, the resulting recombinant protein possesses target-dependent collateral ribonuclease activity typical of Cas13a nucleases. In a series of serial dilutions of the total RNA of E. coli , the dependence of the development of the fluorescent signal on the concentration of the target was shown, which in logarithmic coordinates can be well approximated by a linear function (Fig. 3).

Экспрессия функционально активного рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы проводилась при 18°С. Тестировали температуры культивирования клеток после индукции экспрессии (от 18°С до 37°С) и их влияние на уровень экспрессии и функциональную активность целевого белка. Было установлено, что повышение температуры до 37°С приводит к тому, что целевой белок практически весь переходит в клетках в нерастворимую форму. Инкубация в температурном диапазоне от 25°С до 30°С позволяет получать Cas13a-нуклеазу в растворимой форме, однако при этом полученный рекомбинантный белок проявляет неспецифическую рибонуклеазную активность. Это проявляется в том, что рекомбинантная Cas13a-нуклеаза расщепляет РНК-репортеры в отсутствии РНК-мишени. Культивирование при 18°С приводит к относительно невысокому уровню экспрессии целевого белка (количество чистого белка, которое получается в этих условиях, составляет ~1 мг на 100 мл среды), оно обеспечивает экспрессию функционально активной Cas13a-нуклеазы. Expression of the functionally active recombinant protein Cas13a-nuclease was carried out at 18 ° C. The temperatures of cell cultivation after induction of expression (from 18 ° C to 37 ° C) and their effect on the expression level and functional activity of the target protein were tested. It was found that an increase in temperature to 37 ° C leads to the fact that almost all of the target protein is converted into an insoluble form in the cells. Incubation in the temperature range from 25 ° С to 30 ° С allows obtaining Cas13a-nuclease in a soluble form, however, the resulting recombinant protein exhibits nonspecific ribonuclease activity. This is manifested in the fact that the recombinant Cas13a nuclease cleaves RNA reporters in the absence of a target RNA. Cultivation at 18 ° C leads to a relatively low level of expression of the target protein (the amount of pure protein obtained under these conditions is ~ 1 mg per 100 ml of medium); it provides the expression of a functionally active Cas13a nuclease.

Таким образом, показано, что рекомбинантный белок Cas13a-нуклеазы с мишень-зависимой коллатеральной РНКазной активностью может быть получен после гетерологичной экспрессии в E. coli с помощью простой одностадийной очистки хроматографией с использованием N-концевой полигистидиновой метки. Это расширяет возможности исследования Cas13a-нуклеаз как основы для разработки диагностических биосенсорных систем нового поколения и их последующего практического использования. Thus, it has been shown that a recombinant Cas13a nuclease protein with target-dependent collateral RNase activity can be obtained after heterologous expression in E. coli by a simple one-step purification by chromatography using an N- terminal polyhistidine tag. This expands the possibilities of studying Cas13a nucleases as a basis for the development of new generation diagnostic biosensor systems and their subsequent practical use.

Способ обеспечивает получение очищенного рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы с функциональной коллатеральной РНКазной активностью, технологически простым способом. Упрощение процедуры получения и очистки рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы с функциональной коллатеральной РНКазной активностью делает Cas13a-нуклеазы более доступными для практического применения и исследований, что позволяет расширить возможности по разработке и практическому использованию диагностических биосенсорных систем нового поколения, в технике, связанной с распознаванием и редактированием генов. Способ выгодно отличается от известных из уровня техники способов возможностью получения достаточно чистого рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы с функциональной коллатеральной РНКазной с использованием простой одностадийной очистки путем металл-хелатной хроматографии или аффинной хроматографии, основанной на специфическом взаимодействии добавленной последовательности с лигандом, иммобилизованном на твердофазном носителе.EFFECT: obtaining purified recombinant protein Cas13a-nuclease with functional collateral RNase activity in a technologically simple way. Simplification of the procedure for the production and purification of the recombinant protein Cas13a-nuclease with functional collateral RNase activity makes Cas13a-nucleases more accessible for practical application and research, which makes it possible to expand the possibilities for the development and practical use of diagnostic biosensor systems of a new generation in techniques related to recognition and editing genes. The method compares favorably with the methods known from the prior art by the possibility of obtaining a sufficiently pure recombinant protein Cas13a-nuclease with a functional collateral RNase using a simple one-step purification by metal chelate chromatography or affinity chromatography based on the specific interaction of the added sequence with a ligand immobilized on a solid-phase carrier.

Claims (14)

1. Способ получения рекомбинантной Cas13a-нуклеазы с коллатеральной активностью, включающий трансформацию клеток бактерии Escherichia coli экспрессионным вектором, экспрессию и очистку целевого рекомбинантного белка Cas13a, отличающийся тем, что трансформацию клеток бактерии Escherichia coli осуществляют экспрессионным вектором pET His6-TwinStrep-SUMO-LwaCas13a, очистку целевого рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы производят в одну стадию путем хроматографии, с использованием полигистидиновой метки His-tag и гравитационных хроматографических колонок. 1. A method of producing a recombinant Cas13a nuclease with collateral activity, comprising transformation of Escherichia coli bacterial cells with an expression vector, expression and purification of the target recombinant Cas13a protein, characterized in that the transformation of Escherichia coli bacterial cells is carried out with the expression vector pET Hisas6-TwinStrep-SUMO-LwaCwaCwa Purification of the target recombinant protein Cas13a-nuclease is performed in one step by chromatography using a polyhistidine His-tag and gravity chromatographic columns. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что очистку целевого рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы производят в одну стадию путем аффинной хроматографии.2. The method according to claim 1, characterized in that the purification of the target recombinant protein Cas13a-nuclease is performed in one stage by affinity chromatography. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что очистку целевого рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы производят в одну стадию путем металл-хелатной хроматографии.3. The method according to claim 1, characterized in that the purification of the target recombinant protein Cas13a-nuclease is performed in one stage by metal-chelate chromatography. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в экспрессионный вектор в последовательность гена белка добавлена последовательность нуклеотидов, кодирующая полигистидиновую метку His-tag на N- или С-конце белка, состоящая из шести или более аминокислотных остатков гистидина.4. A method according to claim 1, characterized in that a nucleotide sequence encoding a polyhistidine tag His-tag at the N- or C-terminus of the protein, consisting of six or more amino acid residues of histidine, is added to the expression vector in the protein gene sequence. 5. Способ по п. 3, отличающийся тем, что очистку целевого рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы производят с использованием полигистидиновой аминокислотной последовательности и матрицы в виде крупнопорового кремния, заряженного ионами никеля или кобальта в качестве хелатирующего лиганда.5. The method according to claim 3, characterized in that the purification of the target recombinant protein Cas13a-nuclease is performed using a polyhistidine amino acid sequence and a matrix in the form of large-pore silicon charged with nickel or cobalt ions as a chelating ligand. 6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что очистку целевого рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы путем хроматографии производят с использованием последовательности аминокислотных остатков, добавленной генно-инженерными методами к C- или N-концу рекомбинантного белка. 6. The method according to claim 1, characterized in that the purification of the target recombinant protein Cas13a nuclease by chromatography is performed using a sequence of amino acid residues added by genetic engineering methods to the C- or N-terminus of the recombinant protein. 7. Способ по п. 2, отличающийся тем, что применяют аффинную хроматографию, основанную на специфическом взаимодействии добавленной последовательности с лигандом, иммобилизованным на твердофазном носителе.7. A method according to claim 2, characterized in that affinity chromatography based on the specific interaction of the added sequence with a ligand immobilized on a solid-phase carrier is used. 8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при очистке целевого рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы путем хроматографии проводят оценку содержания целевого рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы с использованием гравитационных хроматографических колонок. 8. The method according to claim 1, characterized in that during the purification of the target recombinant protein Cas13a nuclease by chromatography, the content of the target recombinant protein Cas13a nuclease is assessed using gravity chromatographic columns. 9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что экспрессионный вектор pET His6-TwinStrep-SUMO-LwaCas13a включает последовательность меток 6xHis-tag/(Twin)Strep-tag/SUMO.9. The method according to claim 1, wherein the expression vector pET His6-TwinStrep-SUMO-LwaCas13a comprises a 6xHis-tag / (Twin) Strep-tag / SUMO tag sequence. 10. Способ по п. 8, отличающийся тем, что оценку целевого рекомбинантного белка Cas13a-нуклеазы во фракциях элюата с хроматографических колонок проводят с использованием гравитационных хроматографических колонок, содержащих хелатирующий лиганд, матрицу в виде крупнопорового кремния с заряженным Ni2+, обеспечивающих очистку белков с полигистидиновой меткой His-tag. 10. The method according to claim 8, characterized in that the assessment of the target recombinant protein Cas13a-nuclease in fractions of the eluate from chromatographic columns is carried out using gravity chromatographic columns containing a chelating ligand, a matrix in the form of large-pore silicon with charged Ni 2+ , providing protein purification with a polyhistidine His-tag. 11. Способ по п. 2, отличающийся тем, что производят очистку рекомбинантного белка путем аффинной хроматографии на сефарозе с иммобилизованным Strep-Tactin. 11. The method according to claim 2, characterized in that the recombinant protein is purified by affinity chromatography on Sepharose with immobilized Strep-Tactin. 12. Способ по п. 1, отличающийся тем, что бактерии Escherichia coli с экспрессионным вектором культивируют при 37°С, рост клеток контролируют, измеряя оптическую плотность на 600 нм, при достижении D600 значения 0,6 в культуру добавляют индуктор экспрессии изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид до конечной концентрации 50 мкМ, экспрессию целевого белка проводят в течение 16 часов при 18°С, клетки осаждают центрифугированием, промывают фосфатно-солевым буфером.12. The method according to claim 1, characterized in that the Escherichia coli bacteria with the expression vector are cultivated at 37 ° C, the cell growth is controlled by measuring the optical density at 600 nm, when the D600 value reaches 0.6, the expression inducer isopropyl-β is added to the culture Β-D-1-thiogalactopyranoside to a final concentration of 50 μM, the expression of the target protein is carried out for 16 hours at 18 ° C, the cells are precipitated by centrifugation, washed with phosphate-buffered saline. 13. Способ по п. 1, отличающийся тем, что операции по получению целевого белка Cas13a-нуклеазы проводят при +4°С, ресуспендируют клеточный осадок в буфере LEW, вносят лизоцим до конечной концентрации 1 мг/мл, фенилметансульфонил фторид до 1 мМ и ДНКазу до 1 мг/мл, инкубируют клетки бактерии на льду в течение 30 минут, разрушают клетки бактерии механическим способом с помощью френч-пресса, полученный гомогенат осветляют центрифугированием, наносят гомогенат на колонку, промывают колонку, связавшийся материал элюируют буфером, содержащим 250 мМ имидазола, последовательно собирают фракции объемом 0,5 мл, анализируют фракции путем электрофореза по Лэммли в 9% ПААГ с окраской красителем Кумасси G-250, оценивают относительное количество целевого белка Cas13а путем сопоставления площадей пиков, соответствующих белковым полосам на геле, после его денситометрии на гель-сканере, очищенный целевой белок переводят в буфер для хранения с использованием диализа.13. The method according to claim 1, characterized in that the operations to obtain the target Cas13a-nuclease protein are carried out at + 4 ° C, the cell pellet is resuspended in LEW buffer, lysozyme is added to a final concentration of 1 mg / ml, phenylmethanesulfonyl fluoride up to 1 mM, and DNase to 1 mg / ml, bacterial cells are incubated on ice for 30 minutes, bacterial cells are destroyed mechanically using a French press, the resulting homogenate is clarified by centrifugation, the homogenate is applied to the column, the column is washed, the bound material is eluted with a buffer containing 250 mM imidazole , sequentially collect fractions with a volume of 0.5 ml, analyze the fractions by electrophoresis according to Laemmli in 9% PAGE with Coomassie G-250 staining, estimate the relative amount of the target Cas13a protein by comparing the areas of the peaks corresponding to the protein bands on the gel, after its densitometry on the gel -Scanner, the purified target protein is transferred to storage buffer using dialysis. 14. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при очистке проводят оценку функциональной активности белка Cas13a-нуклеазы.14. The method according to claim 1, characterized in that during the purification, the functional activity of the Cas13a-nuclease protein is assessed.
RU2020117699A 2020-05-29 2020-05-29 Method for producing recombinant cas13a-nuclease with collateral activity RU2750816C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020117699A RU2750816C1 (en) 2020-05-29 2020-05-29 Method for producing recombinant cas13a-nuclease with collateral activity

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020117699A RU2750816C1 (en) 2020-05-29 2020-05-29 Method for producing recombinant cas13a-nuclease with collateral activity

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2750816C1 true RU2750816C1 (en) 2021-07-05

Family

ID=76820182

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2020117699A RU2750816C1 (en) 2020-05-29 2020-05-29 Method for producing recombinant cas13a-nuclease with collateral activity

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2750816C1 (en)

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A.S. SAVINOVA et al., Cas13a: purification and use for viral RNA detection, Bulletin of the Russian State Medical University, 2018, no. 2, pp. 22-27. *
GOOTENBERG J.S. et al., Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2, Science, 2017, Vol.356, N6336, pp. 438-442. *
KOONIN E.V. et al., Diversity, classification and evolution of CRISPR-Cas systems, Current Opinion in Microbiology, 2017, Vol.37, pp.67-78. *
LIANG LIU et al., The Molecular Architecture for RNA-Guided RNA Cleavage by Cas13a, Cell, 2017, Vol.170, N4, pp.714-726. *
PICKAR-OLIVER A. et al., The next generation of CRISPR-Cas technologies and applications, Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2019, Vol.20, pp.490-507. *
САВИНОВА А.С. и др., Cas13a: очистка и использование для обнаружения вирусной РНК, Вестник Российского государственного медицинского университета, 2018, н.2, стр.22-27. GOOTENBERG J.S. et al., Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2, Science, 2017, Vol.356, N6336, pp. 438-442. KOONIN E.V. et al., Diversity, classification and evolution of CRISPR-Cas systems, Current Opinion in Microbiology, 2017, Vol.37, pp.67-78. PICKAR-OLIVER A. et al., The next generation of CRISPR-Cas technologies and applications, Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2019, Vol.20, pp.490-507. LIANG LIU et al., The Molecular Architecture for RNA-Guided RNA Cleavage by Cas13a, Cell, 2017, Vol.170, N4, pp.714-726. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2018081462A1 (en) Methods and compositions for rna mapping
Frechin et al. Yeast mitochondrial Gln-tRNAGln is generated by a GatFAB-mediated transamidation pathway involving Arc1p-controlled subcellular sorting of cytosolic GluRS
JP7093417B2 (en) How to regulate in vitro biosynthetic activity by knocking out the nuclease system
KR102346785B1 (en) Ligand identification by co-fractionation
CN116676291A (en) Endonuclease gene scissor and mediated gene editing system thereof
Zinnall et al. HDLBP binds ER-targeted mRNAs by multivalent interactions to promote protein synthesis of transmembrane and secreted proteins
Kurbatov et al. Single stage purification of CRISPR/cas13a nuclease via metal-chelating chromatography following heterologous expression with the preservation of collateral ribonuclease activity
Akanuma et al. Dynamic changes in the extracellular proteome caused by absence of a pleiotropic regulator AdpA in Streptomyces griseus
RU2750816C1 (en) Method for producing recombinant cas13a-nuclease with collateral activity
CN116410955B (en) Two novel endonucleases and application thereof in nucleic acid detection
Jackson et al. Proteomic analysis of interactors for yeast protein arginine methyltransferase Hmt1 reveals novel substrate and insights into additional biological roles
US20130210050A1 (en) Protease for proteomics
WO2006055040A2 (en) Identification of proteins in a genome
CN111394323B (en) Recombinant RecA protein and expression method and application thereof
Aivaliotis et al. High throughput two-dimensional blue-native electrophoresis: a tool for functional proteomics of cytoplasmatic protein complexes from Chlorobium tepidum
Nair et al. Characterization of the N-terminal domain of Mre11 protein from rice (OsMre11) Oryza sativa
US9719078B1 (en) Proteases for the production of N-terminal argininyl- and lysinyl-peptides and methods of use in protein analysis
US20170226561A1 (en) Mapping the spatial localization of cellular nucleic acids by proximity-dependent enzymatic tagging
Kever et al. Identification of Gip as a novel phage-encoded gyrase inhibitor protein featuring a broad activity profile
US11535834B2 (en) Recombinant nucleoside-specific ribonuclease and method of producing and using same
US20230125232A1 (en) Atp-dependent dna ligase
Allen et al. Engineering a functional NifDK polyprotein resistant to mitochondrial degradation
US20230151406A1 (en) Nucleic acid sequence detection by endonuclease digestion and mass spectrometry
Moliner-Cubel et al. Plasmodium RNA triphosphatase validation as antimalarial target
Lee et al. Characterization of thermostable deblocking aminopeptidases of archaeon Thermococcus onnurineus NA1 by proteomic and biochemical approaches