RU2750584C1 - MODIFIED ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE AGAINST SARS-CoV-2 - Google Patents
MODIFIED ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE AGAINST SARS-CoV-2 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2750584C1 RU2750584C1 RU2020133748A RU2020133748A RU2750584C1 RU 2750584 C1 RU2750584 C1 RU 2750584C1 RU 2020133748 A RU2020133748 A RU 2020133748A RU 2020133748 A RU2020133748 A RU 2020133748A RU 2750584 C1 RU2750584 C1 RU 2750584C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cov
- antisense oligonucleotide
- virus
- rna
- sars
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к молекулярной биологии и может быть использовано для блокирования экспрессии РНК вблизи 5' конца генома вируса SARS-CoV-2, вызывающего заболевание новой коронавирусной инфекцией COVID-19. Данное изобретение обеспечивает высокоспецифичное связывание заявляемого антисмыслового олигонуклеотида с РНК с известной последовательностью нуклеотидов вблизи 5' конца генома вируса SARS-CoV-2.The invention relates to molecular biology and can be used to block the expression of RNA near the 5 'end of the genome of the SARS-CoV-2 virus, which causes the disease of the new coronavirus infection COVID-19. This invention provides highly specific binding of the claimed antisense oligonucleotide to RNA with a known nucleotide sequence near the 5 'end of the genome of the SARS-CoV-2 virus.
На сегодняшний день специфических противовирусных средств для огромного массива вирусов не существует. Однако разрабатываются методы специфического селективного «выключения» РНК, в том числе и вирусной, с помощью антисмысловых олигонуклеотидов. Принцип действия антисмысловых олигонуклеотидов заключается в ведении в организм больного препарата, содержащего однонитиевые цепочки ДНК, комплементарные какому-либо участку однонитиевой ДНК или РНК, например РНК вируса. Комплементарное связывание ДНК препарата и РНК вируса приводит к невозможности транскрипции и трансляции вирусной РНК и вырезанию блокированного участка РНК вируса РНКазой Н. Это останавливает синтез новых вирусных частиц и предотвращает внутриклеточное размножение вируса [Pharmacology of Antisense Drugs C. Frank Bennett, Brenda F. Baker, Nguyen Pham, Eric Swayze, and Richard S. Geary Annual Review of Pharmacology and Toxicology 2017 57:1, 81-105].To date, there are no specific antiviral agents for a huge array of viruses. However, methods are being developed for the specific selective "shutdown" of RNA, including viral, using antisense oligonucleotides. The principle of action of antisense oligonucleotides consists in administering to the patient's body a preparation containing single-stranded DNA chains complementary to any section of single-stranded DNA or RNA, for example, the RNA of a virus. The complementary binding of the drug's DNA and the RNA of the virus leads to the impossibility of transcription and translation of viral RNA and excision of the blocked portion of the RNA of the virus by RNase H. This stops the synthesis of new viral particles and prevents the intracellular reproduction of the virus [Pharmacology of Antisense Drugs C. Frank Bennett, Brenda F. Baker, Nguyen Pham, Eric Swayze, and Richard S. Geary Annual Review of Pharmacology and Toxicology 2017 57: 1, 81-105].
Некоторые противовирусные антисмысловые препараты были выпущены на рынок, например фомивирсен (Vitraven); - препарат против цитомегаловируса (Novartis), Миравирсен - препарат для лечения гепатита С (Santaris Pharma).Several antiviral antisense drugs have been marketed, such as fomivirsen (Vitraven); - a drug against cytomegalovirus (Novartis), Miravirsen - a drug for the treatment of hepatitis C (Santaris Pharma).
Некоторые противовирусные антисмысловые препараты были выпущены на рынок, например фомивирсен (Vitraven); - препарат против цитомегаловируса (Novartis), Миравирсен - препарат для лечения гепатита С (Santaris Pharma). В настоящее время клинические испытания в различных фазах проходят более 100 препаратов от различных заболеваний, основанных на применении антисмысловых олигонуклеотидов.Several antiviral antisense drugs have been marketed, such as fomivirsen (Vitraven); - a drug against cytomegalovirus (Novartis), Miravirsen - a drug for the treatment of hepatitis C (Santaris Pharma). Currently, more than 100 drugs for various diseases based on the use of antisense oligonucleotides are undergoing clinical trials in various phases.
Антисмысловая РНК-терапия представляет собой развивающуюся стратегию специфического лечения новых и социально значимых заболеваний. Принцип угнетения РНК ранее изучался in vitro для сдерживания репликации высокопатогенных РНК- вирусов [. Spurgers K.B., C. Sharkey M., Warfield K.L., Bavari S. Oligonucleotide antiviral therapeutics: Antisense and RNA interference for highly pathogenic RNA viruses. Antiviral Res. 2008; 78(1): 26-36. doi: 10.1016/j-antiviral.2007.12.008]. Таким образом, учитывая предыдущий опыт терапии антисмысловыми олигонуклеотидами, можно предположить, что эта стратегия может быть применена в качестве антивирусного препарата путем связывания и расщепления РНК SARS-CoV-2. Учитывая, что SARS-CoV-2 является РНК-вирусом, который не интегрируется в геном хозяина, стратегия использования антисмысловых олигонуклеотидов, по мнению ряда авторов, может дать эффективные результаты [Lulla V. et al. (2020) Antisense oligonucleotides target a nearly invariant structural element from the SARS-CoV-2 genome and drive RNA degradation. bioRvix. https://doi.org/10.1101/2020.09.18.304139].Antisense RNA therapy is an evolving strategy for the specific treatment of emerging and socially significant diseases. The principle of RNA inhibition was previously studied in vitro to inhibit the replication of highly pathogenic RNA viruses [. Spurgers K.B., C. Sharkey M., Warfield K.L., Bavari S. Oligonucleotide antiviral therapeutics: Antisense and RNA interference for highly pathogenic RNA viruses. Antiviral Res. 2008; 78 (1): 26-36. doi: 10.1016 / j-antiviral.2007.12.008]. Thus, given the previous experience with antisense oligonucleotide therapy, it can be assumed that this strategy can be applied as an antiviral drug by binding and cleaving SARS-CoV-2 RNA. Considering that SARS-CoV-2 is an RNA virus that does not integrate into the host genome, the strategy of using antisense oligonucleotides, according to some authors, can give effective results [Lulla V. et al. (2020) Antisense oligonucleotides target a nearly invariant structural element from the SARS-CoV-2 genome and drive RNA degradation. bioRvix. https://doi.org/10.1101/2020.09.18.304139].
Предпосылки использования антисмысловой терапии при лечении Covid 19 существуют. Коронавирусные инфекции ранее уже вызывали вспышки эпидемий. В частности, вспышка атипичной пневмонии (тяжёлого острого респираторного синдрома) в Китае в 2002 – 2003 гг была вызвана коронавирусом SARS-CoV, вспышка ближневосточного респираторного синдрома (MERS) также была вызвана коронавирусом [Стовба Л.Ф., Лебедев В.Н., Петров А.А., Ручко В.М., Кулиш В.С., Борисевич С.В. Новый коронавирус, вызывающий заболевания человека// Проблемы особо опасных инфекций, 2015. - вып. 2. – С. 68 – 74].The prerequisites for the use of antisense therapy in the treatment of Covid 19 exist. Coronavirus infections have previously caused outbreaks of epidemics. In particular, the outbreak of SARS (severe acute respiratory syndrome) in China in 2002-2003 was caused by the SARS-CoV coronavirus, the outbreak of the Middle East respiratory syndrome (MERS) was also caused by the coronavirus [Stovba L.F., Lebedev V.N., Petrov A.A., Ruchko V.M., Kulish V.S., Borisevich S.V. A new coronavirus that causes human diseases // Problems of especially dangerous infections, 2015. - vol. 2. - S. 68 - 74].
После эпидемии атипичной пневмонии ряд авторов проводил исследования по влиянию антисмысловой терапии на подавление роста коронавирусов в исследуемых тканях [Neuman, B.W., Stein D.A., Kroeker A.D., Churchill M. J., Kim A.M., Kuhn P., Dawson P., Moulton H.M., Bestwick R.K., Iversen P.L., and Buchmeier M.J. Inhibition, escape, and attenuated growth of severe acute respiratory syndrome coronavirus treated with antisense morpholino oligomers. J. Virol. 2005. 79. P. 9665–9676.; Neuman, B.W., Stein D.A., Kroeker A.D., et al., Antisense Morpholino-Oligomers Directed against the 5` End of the Genome Inhibit Coronavirus Proliferation and Growth// Journal of virology, June 2004, Vol. 78, No. 11., p. 5891–5899; Renaud Burrer, Benjamin W. Neuman, Joey P. C. Ting, David A. Stein, Hong M. Moulton, Patrick L. Iversen, Peter Kuhn, and Michael J. Buchmeier. Antiviral Effects of Antisense Morpholino Oligomers in Murine Coronavirus Infection Models// Journal of virology, June 2007, Vol. 81, No. 11. p. 5637–5648]. В данных работах авторы среди нескольких последовательностей нашли наиболее эффективные ингибиторы вирусной транскрипции, подавляющие размножение коронавируса в клетках и предотвращающие заражение других клеток. Это антисмысловые блокаторы, комплементарные начальным нуклеотидам вирусной РНК - т.н. регуляторным последовательностям транскрипции TRS (по терминологии авторов) штамма коронавируса SARS-CoV-Tor2 (GenBank AY274119). Нуклеотидная последовательность исследованных антисмысловых препаратов представлена в табл. 1:After the SARS epidemic, a number of authors conducted studies on the effect of antisense therapy on suppressing the growth of coronaviruses in the studied tissues [Neuman, BW, Stein DA, Kroeker AD, Churchill MJ, Kim AM, Kuhn P., Dawson P., Moulton HM, Bestwick RK, Iversen PL, and Buchmeier MJ Inhibition, escape, and attenuated growth of severe acute respiratory syndrome coronavirus treated with antisense morpholino oligomers. J. Virol. 2005. 79. P. 9665-9676 .; Neuman, B.W., Stein D.A., Kroeker A.D., et al., Antisense Morpholino-Oligomers Directed against the 5` End of the Genome Inhibit Coronavirus Proliferation and Growth // Journal of virology, June 2004, Vol. 78, No. 11., p. 5891-5899; Renaud Burrer, Benjamin W. Neuman, Joey P. C. Ting, David A. Stein, Hong M. Moulton, Patrick L. Iversen, Peter Kuhn, and Michael J. Buchmeier. Antiviral Effects of Antisense Morpholino Oligomers in Murine Coronavirus Infection Models // Journal of virology, June 2007, Vol. 81, No. 11.p. 5637-5648]. In these works, among several sequences, the authors found the most effective inhibitors of viral transcription, suppressing the multiplication of coronavirus in cells and preventing infection of other cells. These are antisense blockers complementary to the initial nucleotides of the viral RNA - the so-called. regulatory transcription sequences TRS (in the terminology of the authors) of the SARS-CoV-Tor2 coronavirus strain (GenBank AY274119). The nucleotide sequence of the investigated antisense drugs is presented in table. one:
Таблица 1Table 1
Исследованные антисмысловые препараты (1)Antisense Drugs Investigated (1)
Указанные последовательности комплементарны следующим последовательностям нуклеиновой кислоты вируса (табл. 2):These sequences are complementary to the following viral nucleic acid sequences (Table 2):
Таблица 2table 2
Генетические таргетные последовательности генома коронавирусов для препаратов TRS1 и TRS2Genetic target sequences of the coronavirus genome for TRS1 and TRS2 preparations
* - стандартным является использование обозначения «Т» для урацила в РНК* - the standard is the use of the designation "T" for uracil in RNA
Авторы использовали морфолиновую модификацию боковой цепи для предотвращения разрушения антисмыслового олигонуклеотида и конъюгацию с аргининовым полипептидом для улучшения проникновения в инфицированные клетки.The authors used morpholine side chain modification to prevent degradation of the antisense oligonucleotide and conjugation to an arginine polypeptide to improve penetration into infected cells.
При сопоставлении данных нуклеотидных последовательностей (табл.2) с последовательностью генома вируса SARS-CoV-2 (CoVid-19) было обнаружено наличие данных последовательностей почти во всех штаммах вируса, выделенных у пациентов во время пандемии 2019-2020 гг.When comparing the data of nucleotide sequences (Table 2) with the genome sequence of the SARS-CoV-2 (CoVid-19) virus, the presence of these sequences was found in almost all virus strains isolated from patients during the 2019-2020 pandemic.
BLAST-анализ (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) показал 100% совпадение последовательности РНК у всех подтипов коронавирусов, что предполагает высокую консервативность данного участка генома коронавирусов. Это позволяет использовать для лечения коронавирусной инфекции те антисмысловые олигонуклеотидные последовательности TRS1 и TRS2, которые были исследованы в 2005 году.BLAST analysis (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) showed 100% coincidence of the RNA sequence in all coronavirus subtypes, which suggests a high conservatism of this region of the coronavirus genome. This makes it possible to use the antisense oligonucleotide sequences TRS1 and TRS2, which were studied in 2005, for the treatment of coronavirus infection.
Однако, начиная с середины марта 2020 года, в штаммах вируса наблюдается изменения, связанные с потерей участков с 5` конца. В частности, образец вируса MT263462 USA: WA 2020-03-23 не имел участков, обозначенных как trs1 и trs2. However, starting from mid-March 2020, changes have been observed in the virus strains associated with the loss of sites from the 5` end. In particular, the MT263462 USA: WA 2020-03-23 virus sample did not have the regions designated trs1 and trs2.
В связи с этим актуальным был проведен поиск антисмыслового олигонуклеотида, комплементарного участку консервативной олигонуклеотидной последовательности генома вируса SARS-CoV-2, присутствующего во всех штаммах.In this regard, the search for an antisense oligonucleotide complementary to a region of the conserved oligonucleotide sequence of the genome of the SARS-CoV-2 virus present in all strains was carried out.
Нуклеотидная последовательность, которую предполагалось блокировать у вируса SARS-CoV-2, была выбрана рядом с генами trs1 и trs2 на расстоянии четырех нуклеотидов от конечного участка (3`-конца) гена trs2. Такой выбор был обусловлен тем, что данная последовательность входит в участок сайта, регулирующего транскрипцию (transcription regulatory site, trs) и выключение данной последовательности также приведет к невозможности транскрипции. BLAST-анализ на ресурсе GenBank (NCBI) показал присутствие данной последовательности в геномах всех секвенированных образцов SARS-CoV-2. Данная последовательность имеет вид:The nucleotide sequence that was supposed to be blocked in the SARS-CoV-2 virus was selected next to the trs1 and trs2 genes at a distance of four nucleotides from the final region (3 'end) of the trs2 gene. This choice was due to the fact that this sequence is included in the region of the transcription regulatory site (trs) and switching off this sequence will also lead to the impossibility of transcription. BLAST analysis on the GenBank resource (NCBI) showed the presence of this sequence in the genomes of all sequenced SARS-CoV-2 samples. This sequence looks like:
5`–CTG TGT GGC TGT CAC TCG GCT5` – CTG TGT GGC TGT CAC TCG GCT
Комплементарная ей последовательность антисмыслового олигонуклеотидного препарата для лечения имеет вид:The complementary sequence of the antisense oligonucleotide preparation for treatment has the form:
5`–AGC CGA GTG ACA GCC ACA CAG5` – AGC CGA GTG ACA GCC ACA CAG
Выбор нуклеотидной последовательности вируса для блокирования антисмысловым препаратом также был продиктован минимальной способностью формировать нуклеотидные шпильки, препятствующие гибридизации участка РНК вируса и антисмыслового препарата. При расчете данной последовательности на олигокалькуляторе (Kibbe WA. 'OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator'. (2007) / Nucleic Acids Res. 35(webserver issue): May 25. http://www.basic.northwestern.edu/biotools/OligoCalc.html) было обнаружено, что на протяжении 210 нуклеотидов от 5`-конца последовательности вирусной РНК, нуклеотиды могут теоретически формировать 38 – 39 шпилек, из которых исследуемая нами последовательность может быть задействована в 6 шпильках, в то время, как последовательности trs1 и trs2 могут быть фрагментами 16 и 11 нуклеотидных шпилек, соответственно. Таким образом, по теоретическим расчетам нами предполагался более специфичный характер выбранной нуклеотидной последовательности для блокирования транскрипции и трансляции вирусного генома.The choice of the virus nucleotide sequence for blocking with an antisense drug was also dictated by the minimal ability to form nucleotide hairpins that prevent hybridization of the RNA region of the virus and the antisense drug. When calculating this sequence on an oligocalulator (Kibbe WA. 'OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator'. (2007) / Nucleic Acids Res. 35 (webserver issue): May 25. http://www.basic.northwestern.edu/biotools /OligoCalc.html), it was found that over 210 nucleotides from the 5 'end of the viral RNA sequence, nucleotides can theoretically form 38 - 39 hairpins, of which the sequence under study can be involved in 6 hairpins, while the trs1 sequence and trs2 can be fragments of 16 and 11 nucleotide hairpins, respectively. Thus, according to theoretical calculations, we assumed a more specific character of the selected nucleotide sequence for blocking the transcription and translation of the viral genome.
Пример.Example.
Синтез антисмыслового олигонуклеотида с фосфоротиоатной защитой боковой сахарофосфатной цепи 5`–AGCCGAGTGACAGCCACACAG был осуществлен по заказу компанией «Genterra», Москва (https://www.genterra.ru/synth.html). Синтез (medium-scale DNA) осуществлен с фосфоротиоатной защитой фосфатной группы между всеми нуклеотидами c очисткой обращено-фазовой ВЭЖХ (Паспорт на синтетические олигонуклеотиды №1312 от 14.04.2020). Общее количество синтезированного 21-членного олигонуклеотида составило 15,371 мг (2,38 мкмоль).The synthesis of an antisense oligonucleotide with phosphorothioate protection of the sugar-phosphate side chain 5` – AGCCGAGTGACAGCCACACAG was commissioned by Genterra, Moscow (https://www.genterra.ru/synth.html). Synthesis (medium-scale DNA) was carried out with phosphorothioate protection of the phosphate group between all nucleotides with purification by reversed-phase HPLC (Passport for synthetic oligonucleotides No. 1312 dated 04/14/2020). The total amount of synthesized 21-membered oligonucleotide was 15.371 mg (2.38 μmol).
Исследование токсичности и противовирусной активности было осуществлено по заказу в Испытательном центре контроля качества иммунобиологических лекарственных средств ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (Исследование №0044/20 от 11.09.2020).The study of toxicity and antiviral activity was carried out by order at the Test Center for Quality Control of Immunobiological Medicines of the Federal State Budgetary Institution NITsEM N.F. Gamalea "of the Ministry of Health of Russia (Study No. 0044/20 of 09/11/2020).
Исследование включало в себя исследование цитотоксического действия антисмыслового препарата, исследования противовирусной активности препарата при лечебной схеме введения препарата по выявлению РНК SARS-CoV-2 методом ПЦР в реальном режиме.The study included a study of the cytotoxic effect of an antisense drug, a study of the antiviral activity of the drug during a therapeutic regimen of drug administration to identify SARS-CoV-2 RNA by real-time PCR.
В экспериментальной работе использовалась перевиваемая линию клеток почки африканской зеленой мартышки (Chlorocebus aethiops) Vero-E6- которая была предоставлена Всероссийской Коллекцией клеточных культур при ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. Культивирование клеток осуществлялось на среде для выращивания клеток с добавлением фетальной бычьей сыворотки (FBS) (конечная концентрация - 10%).In the experimental work, the transplantable cell line of the kidney of the African green monkey (Chlorocebus aethiops) Vero-E6 was used; N.F. Gamalei »of the Ministry of Health of Russia. Cell cultivation was carried out on cell growth medium supplemented with fetal bovine serum (FBS) (final concentration 10%).
В исследованиях использовался пандемический штамм коронавируса человека SARS-CoV-2 «ГК2020/1» пассаж 4, с инфекционной активностью 106 ТЦИД50/мл (тканевых цитопатогенных доз) для клеток Vero Е6 из Государственной Коллекции вирусов РФ при ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.The studies used a pandemic strain of human coronavirus SARS-CoV-2 "GK2020 / 1" passage 4, with an infectious activity of 10 6 TCID 50 / ml (tissue cytopathogenic doses) for Vero E6 cells from the State Collection of Viruses of the Russian Federation at the Federal State Budgetary Institution "NITsEM im. N.F. Gamalei »of the Ministry of Health of Russia.
Вирус культивировался в культуре клеток Vero Е6 в течение 96 ч при 37°С в 5% атмосфере СО2. Инфекционная активность определялась согласно методам, рекомендованным ВОЗ.The virus was cultured in a Vero E6 cell culture for 96 h at 37 ° C in a 5% CO 2 atmosphere. Infectious activity was determined according to the methods recommended by the WHO.
Определение цитотоксического действия препарата в культуре клеток Vero Е6 проводилось с использованием 96-луночных культуральных плоскодонных планшетов, в которые помещали клетки Vero Е6 по 12000 кл./лунку в объеме 100 мкл свежеприготовленной полной среды. Культивирование проводилось 24 ч при температуре 37°С в атмосфере 5% СО2. После инкубации клеток с препаратами в течение 96 часов при температуре 37°С в атмосфере 5% СО2 визуально оценивалось состояние клеточного монослоя. Далее культуральная среда из планшетов удалялась и в каждую лунку к монослою культуры клеток добавлялось по 100 мкл среды для постановки реакции и 20 мкл раствора MTS. После инкубации в течение 3 часов при 37°С результаты учитывались на автоматическом ридере BIORAD при длине волны 490 нм. Референс-фильтр - 630 нм. Концентрация препаратов, уменьшающую значение оптической плотности при длине волны 490 нм на 50% по сравнению с контролем клеток, принималась за 50% цитотоксической дозы (СС50).Determination of the cytotoxic effect of the drug in the culture of Vero E6 cells was carried out using 96-well culture flat-bottomed plates, into which Vero E6 cells were placed at 12000 cells / well in a volume of 100 μl of freshly prepared complete medium. The cultivation was carried out for 24 h at a temperature of 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 . After incubation of cells with preparations for 96 hours at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2, the state of the cell monolayer was visually assessed. Then the culture medium was removed from the plates, and 100 μl of the medium for setting up the reaction and 20 μl of the MTS solution were added to each well to the monolayer of the cell culture. After incubation for 3 hours at 37 ° C, the results were recorded on an automatic reader BIORAD at a wavelength of 490 nm. Reference filter - 630 nm. The concentration of drugs that reduced the optical density at a wavelength of 490 nm by 50% compared to the control of cells was taken as 50% of the cytotoxic dose (CC 50 ).
Оценка противовирусной активности препарата учитывалась по снижению инфекционного титра вируса в культуре клеток Vero E6 по данным ПЦР РНК SARS-CoV-2, определяемых по порогу числа циклов реакции (cycle treshold, Ct) в различных разведениях исследуемого препарата.The assessment of the antiviral activity of the drug was taken into account by the decrease in the infectious titer of the virus in the culture of Vero E6 cells according to the PCR data of SARS-CoV-2 RNA, determined by the threshold for the number of reaction cycles (cycle treshold, Ct) in various dilutions of the test drug.
Исследование РНК SARS-CoV-2 методом ПЦР проводилось путем забора 200 мкл надосадочной жидкости лунок с разведениями препарата, выделения РНК параллельно с положительным и отрицательным контролем. Результатом исследования являлось заключение о наличии/отсутствии РНК SARS-CoV-2 в культуральной жидкости при воздействии препарата: наличие РНК SARS-CoV-2 (значение Ct более 0), отсутствие РНК SARS-CoV-2 (значение Ct отсутствует).The study of SARS-CoV-2 RNA by PCR was carried out by taking 200 μl of the supernatant from wells with drug dilutions, isolating RNA in parallel with positive and negative controls. The result of the study was the conclusion about the presence / absence of SARS-CoV-2 RNA in the culture liquid upon exposure to the drug: the presence of SARS-CoV-2 RNA (Ct value more than 0), absence of SARS-CoV-2 RNA (Ct value is absent).
Оценка цитотоксичности препарата в различных концентрациях определялось при инкубации препарата с клетками Vero Е6 в течение 96 ч с использованием красителя MTS и визуальной оценки клеточного монослоя. На основании данных, полученных при изучении цитотоксического действия тестируемой субстанции с использованием MTS в культуре клеток Vero Е6, была построена аналитическая кривая, из которой была определена СС50.Evaluation of the cytotoxicity of the drug at various concentrations was determined by incubating the drug with Vero E6 cells for 96 h using the MTS dye and visual assessment of the cell monolayer. Based on the data obtained in the study of the cytotoxic effect of the test substance using MTS in the culture of Vero E6 cells, an analytical curve was constructed, from which the CC 50 was determined.
Определение цитотоксичности субстанции антисмыслового олигонуклеотида при визуальной оценке состояния монослоя культуры клеток Vero Е6 под инвертированным микроскопом не выявило значительных изменений в морфологии клеток при концентрации вещества 2 мг/мл и ниже через 96 часов инкубирования препарата с клетками (табл. 3).Determination of the cytotoxicity of the antisense oligonucleotide substance by visual assessment of the state of the monolayer of the Vero E6 cell culture under an inverted microscope did not reveal significant changes in cell morphology at a substance concentration of 2 mg / ml and below after 96 hours of incubation of the drug with cells (Table 3).
Таблица 3Table 3
Цитотоксичность антисмыслового препарата в культуре клеток Vero E6Cytotoxicity of Antisense Drug in Vero E6 Cell Culture
Результаты исследования противовирусной активности препарата методом ПЦР представлены в табл. 4.The results of the study of the antiviral activity of the drug by PCR are presented in table. four.
Таблица 4Table 4
Противовирусная активности препарата методом ПЦР в реальном времени РНК SARS-CoV-2 по пороговому числу циклов (Ct) при разведении вируса 10Antiviral activity of the drug by real-time PCR RNA SARS-CoV-2 by the threshold number of cycles (Ct) at a virus dilution of 10 -4-four
Из представленных данных видно, что показатель Ct группы с добавлением препарата в дозировке 1,0 мг/мл составляет 13,8 по сравнению с группой контроля вируса (11,4 – 10,1).From the presented data, it can be seen that the Ct index of the group with the addition of the drug at a dosage of 1.0 mg / ml is 13.8 compared to the virus control group (11.4 - 10.1).
В ходе исследований был установлено, что антисмысловой олигонуклеотид малотоксичен для культуры клеток Vero E6. Величина 50% цитотоксической дозы CC50 была выше 2,0 мг/мл. При этом результаты визуального определения цитотоксичности препаратов (CC50) были сопоставимы с результатами определения СС50 с использованием витального красителя MTS. Таким образом, данный препарат является малотоксичным и безопасным для использования.In the course of research, it was found that the antisense oligonucleotide has low toxicity for the culture of Vero E6 cells. The 50% cytotoxic dose CC50 was greater than 2.0 mg / ml. At the same time, the results of visual determination of the cytotoxicity of drugs (CC50) were comparable to the results of determination of CC50 using the vital dye MTS. Thus, this drug is low-toxic and safe for use.
В результате исследования содержания РНК вируса при различных дозировках было обнаружено, что при дозировке препарата 0,001 – 0,1 мг/мл параметр Ct - количество циклов реакции амплификации (удвоения вирусной РНК), которое необходимо для достижения флуоресцентного сигнала составляет 10,3 – 11,2 циклов удвоения. Контрольные значения Ct в опыте с инфицированными клетками без добавления антисмыслового олигонуклеотида составили значения 11,4 - 10,1. При дозировке 1 мг/мл величина Ct составила 13,8. Это означает, что при дозировке препарата в 1 мг/мл для достижения флуоресцентного сигнала, эквивалентного контрольной группе потребовалось увеличить количество циклов амплификации в среднем на 2,4 - 3,7 цикла. Это свидетельствует о том, что дозировка препарата в 1 мг/мл не ингибировала полностью размножение вируса, но существенно снижала репликацию вирусной РНК. Снижение репликации вируса по расчету дополнительных циклов амплификации [9] составило диапазон в 5,3 – 13,0 раз (22,4 – 23,7). То есть при дозировке 1 мг/мл препарата вирусная нагрузка клеток может быть снижена в 5,3 – 13 раз.As a result of the study of the content of the RNA of the virus at various dosages, it was found that at a dosage of 0.001 - 0.1 mg / ml, the Ct parameter - the number of amplification reaction cycles (doubling of the viral RNA), which is necessary to achieve a fluorescent signal, is 10.3 - 11, 2 cycles of doubling. The control Ct values in the experiment with infected cells without the addition of antisense oligonucleotide were 11.4 - 10.1. At a dosage of 1 mg / ml, the Ct value was 13.8. This means that at a dosage of 1 mg / ml, in order to achieve a fluorescent signal equivalent to the control group, it was necessary to increase the number of amplification cycles by an average of 2.4 - 3.7 cycles. This indicates that the dosage of the drug in 1 mg / ml did not completely inhibit the multiplication of the virus, but significantly reduced the replication of viral RNA. The decrease in viral replication according to the calculation of additional amplification cycles [9] was in the range of 5.3 - 13.0 times (22.4 - 23.7). That is, at a dosage of 1 mg / ml of the drug, the viral load of cells can be reduced by 5.3 - 13 times.
Claims (2)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020133748A RU2750584C1 (en) | 2020-10-14 | 2020-10-14 | MODIFIED ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE AGAINST SARS-CoV-2 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020133748A RU2750584C1 (en) | 2020-10-14 | 2020-10-14 | MODIFIED ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE AGAINST SARS-CoV-2 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2750584C1 true RU2750584C1 (en) | 2021-06-29 |
Family
ID=76820192
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2020133748A RU2750584C1 (en) | 2020-10-14 | 2020-10-14 | MODIFIED ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE AGAINST SARS-CoV-2 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2750584C1 (en) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20120258126A1 (en) * | 2008-10-02 | 2012-10-11 | Dako Denmark A/S | Molecular Vaccines for Infectious Disease |
JP2020514370A (en) * | 2017-03-17 | 2020-05-21 | キュアバック アーゲー | RNA vaccines and immune checkpoint inhibitors for combination anti-cancer therapy |
RU2733361C1 (en) * | 2020-07-14 | 2020-10-01 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) | Agent for inhibition of replication of sars-cov-2 virus mediated by rna interference |
-
2020
- 2020-10-14 RU RU2020133748A patent/RU2750584C1/en active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20120258126A1 (en) * | 2008-10-02 | 2012-10-11 | Dako Denmark A/S | Molecular Vaccines for Infectious Disease |
JP2020514370A (en) * | 2017-03-17 | 2020-05-21 | キュアバック アーゲー | RNA vaccines and immune checkpoint inhibitors for combination anti-cancer therapy |
RU2733361C1 (en) * | 2020-07-14 | 2020-10-01 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) | Agent for inhibition of replication of sars-cov-2 virus mediated by rna interference |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7176737B2 (en) | Excision of retroviral nucleic acid sequences | |
DK168061B1 (en) | WITH MRNA HYBRIDIZABLE ANTI-VIRAL AGENT | |
EP2355832B1 (en) | Compositions and methods for treating retrovirus infections | |
WO2017192172A1 (en) | Rna guided eradication of varicella zoster virus | |
JPH08500481A (en) | Methods and agents for inhibiting viral replication | |
Kafaie et al. | Mapping of nucleocapsid residues important for HIV-1 genomic RNA dimerization and packaging | |
US20060293267A1 (en) | Dual functional oligonucleotides for use as anti-viral agents | |
US20240000824A1 (en) | Oligonucleotides containing 2'-deoxy-2'fluoro-beta-d-arabinose nucleic acid (2'-fana) for treatment and diagnosis of retroviral diseases | |
McDonagh et al. | In vitro inhibition of feline coronavirus replication by small interfering RNAs | |
Yang et al. | Small interfering RNAs targeting the rabies virus nucleoprotein gene | |
US20160281089A1 (en) | Prevention of viral infectivity | |
RU2750584C1 (en) | MODIFIED ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE AGAINST SARS-CoV-2 | |
TWI670064B (en) | Antiviral agent and method for treating viral infection | |
US11666562B2 (en) | Ilaprazole for inhibiting the release of enveloped viruses from cells | |
WO2013162350A2 (en) | Circular antiviral rna | |
CN116724110A (en) | Recombinant oncolytic virus and construction method and application thereof | |
Goryachev et al. | Potential Opportunity of Antisense Therapy of COVID-19 on an in Vitro Model | |
NO322063B1 (en) | The use of a compound which at least partially inhibits the activity of protein p53 to produce a pharmaceutical composition intended for the treatment and / or prevention of neurodegenerative diseases. | |
Pfeifer et al. | Formation of a small ribonucleoprotein particle between Tat protein and trans-acting response element in human immunodeficiency virus-infected cells | |
Acchioni et al. | Fighting HIV-1 Persistence: At the Crossroads of Shoc-K and B-Lock”. Pathogens 2021, 10, 1517 | |
de Freitas | Functional Characterization of Unassigned African Swine Fever Virus Proteins Putatively Involved in Transcription and Replication towards an Efficient Vaccine Design | |
Anwar et al. | Monkeypox: A Timely Update on the Global Outbreak, Transmission, Viral Replication, Vaccination and Clinical Strategies | |
EP3268473B1 (en) | Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of filovirus infections | |
Seo et al. | Protection against lethal vaccinia virus infection in mice using an siRNA targeting the A5R gene | |
CN113855693A (en) | Use of 3-deazaadenosine |