RU2749741C1 - Ribonucleoprotein complex for human genome editing - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology.SUBSTANCE: invention relates to the field of biotechnology, in particular to a ribonucleoprotein complex for human genome editing by inserting a sequence of interest into it, which includes the protein spCas9 linked to sgRNA-PP7 with an encoded sequence that is linked to an effector chimeric protein.EFFECT: invention is effective in modeling human genetic diseases on cellular systems.1 cl, 4 dwg, 1 tbl

Description

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к генной инженерии. Данная система может быть использована в фундаментальных исследованиях клеточной биологии, а также при моделировании генетических заболеваний человека на клеточных системах.The invention relates to biology and medicine, namely to genetic engineering. This system can be used in fundamental research of cell biology, as well as in modeling human genetic diseases on cellular systems.

Основным методом бесшовного внесения интересующей ДНК-последовательности в клеточный геном является метод направленной гомологичной рекомбинации [Capecchi М.R. Altering the genome by homologous recombination. // Science. 1989. T. 244. №4910. C. 1288-92]. В данном методе используются донорные конструкции, содержащие выбранную для вставки ДНК последовательность между плечами гомологии - последовательностями, которые идентичны участкам, фланкирующим участок генома, в который будет проводиться вставка. Такая методика позволяет проводить очень точные модификации, но с низкой частотой: успешное встраивание последовательности в геном происходит в одной из 10⁵-10⁷ клеток [Capecchi Μ.R. Altering the genome by homologous recombination. // Science. 1989. T. 244. №4910. C. 1288-92]. Внесение двунитевого разрыва в выбранный для редактирования участок генома увеличивает эффективность вставки конструкции с плечами гомологии на несколько порядков [Bibikova Μ., Carroll D., Segal D.J., Trautman J.K., Smith J., Kim Y.-G., Chandrasegaran S. Stimulation of Homologous Recombination through Targeted Cleavage by Chimeric Nucleases // Mol. Cell. Biol. 2001. T. 21. №1. C. 289-297.; Plessis Α., Perrin Α., Haber J.E., Dujon B. Site-specific recombination determined by I-SceI, a mitochondrial group I intron-encoded endonuclease expressed in the yeast nucleus // Genetics. 1992. T. 130. №3. C. 451-460.; Rouet P., Smih F., Jasin M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. // Mol. Cell. Biol. 1994. T. 14. №12. C. 8096-106.; Rudin N., Sugarman E., Haber J.E. Genetic and physical analysis of double-strand break repair and recombination in Saccharomyces cerevisiae. // Genetics. 1989. T. 122. №3. C. 519-34].The main method of seamless introduction of the DNA sequence of interest into the cellular genome is the method of directed homologous recombination [Capecchi M.R. Altering the genome by homologous recombination. // Science. 1989. T. 244. No. 4910. S. 1288-92]. This method uses donor constructs containing the sequence selected for DNA insertion between homology arms - sequences that are identical to the regions flanking the genome region into which the insertion will be carried out. This technique allows for very precise modifications, but with a low frequency: successful insertion of a sequence into the genome occurs in one of 10 ⁵ -10 ⁷ cells [Capecchi Μ.R. Altering the genome by homologous recombination. // Science. 1989. T. 244. No. 4910. S. 1288-92]. Introducing a double-strand break into the region of the genome selected for editing increases the efficiency of insertion of a construct with homology arms by several orders of magnitude [Bibikova Μ., Carroll D., Segal DJ, Trautman JK, Smith J., Kim Y.-G., Chandrasegaran S. Stimulation of Homologous Recombination through Targeted Cleavage by Chimeric Nucleases // Mol. Cell. Biol. 2001. T. 21. No. 1. S. 289-297 .; Plessis Α., Perrin Α., Haber JE, Dujon B. Site-specific recombination determined by I-SceI, a mitochondrial group I intron-encoded endonuclease expressed in the yeast nucleus // Genetics. 1992. T. 130. No. 3. C. 451-460 .; Rouet P., Smih F., Jasin M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. // Mol. Cell. Biol. 1994. T. 14. No. 12. C. 8096-106 .; Rudin N., Sugarman E., Haber JE Genetic and physical analysis of double-strand break repair and recombination in Saccharomyces cerevisiae. // Genetics. 1989. T. 122. No. 3. S. 519-34].

В связи с этим было разработано множество специфичных ДНК-связывающих белков для внесения двунитевых разрывов в геном. Из них доминирующую роль на данный момент занимает система CRISPR-Cas9, специфичность которой задается короткой последовательностью гидовой РНК (sgRNA) [Cho S.W., Kim S., Kim J.M., Kim J.-S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease // Nat. Biotechnol. 2013. T. 31. №3. C. 230-232.; Cong L., Ran F.Α., Cox D., Lin S., Barretto R., Habib N., Hsu P.D., Wu X., Jiang W., Marraffini L.Α., Zhang F. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems // Science. 2013. T. 339. №6121. C. 819.; Jinek M., East Α., Cheng Α., Lin S., Ma E., Doudna J. RNA-programmed genome editing in human cells // Elife. 2013. T. 2. С.e00471].In this regard, a variety of specific DNA-binding proteins have been developed to introduce double-strand breaks into the genome. Of these, the dominant role is currently occupied by the CRISPR-Cas9 system, the specificity of which is set by a short sequence of guide RNA (sgRNA) [Cho S.W., Kim S., Kim J.M., Kim J.-S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease // Nat. Biotechnol. 2013. T. 31. No. 3. S. 230-232 .; Cong L., Ran F.Α., Cox D., Lin S., Barretto R., Habib N., Hsu PD, Wu X., Jiang W., Marraffini L.Α., Zhang F. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR / Cas Systems // Science. 2013. T. 339. No. 6121. C. 819 .; Jinek M., East Α., Cheng Α., Lin S., Ma E., Doudna J. RNA-programmed genome editing in human cells // Elife. 2013. T. 2. S. e00471].

Репарация внесенного эндонуклеазой двунитевого разрыва ДНК может проходить несколькими путями. Среди них путь гомологичной репарации может привести к встраиванию интересующей последовательности ДНК в геном, так как в этом пути в качестве матрицы может использоваться внесенная в клетку донорная ДНК.The DNA double-strand break introduced by endonuclease can be repaired in several ways. Among them, the path of homologous repair can lead to the insertion of the DNA sequence of interest into the genome, since in this pathway donor DNA introduced into the cell can be used as a template.

Одним из способов повышения эффективности вставки интересующей последовательности в геном является увеличение вероятности прохождения репарации двуцепочечного разрыва по пути гомологичной репарации. Для этого можно использовать искусственные системы, привлекающие к области ДНК разрыва белки, благоприятствующие гомологичной репарации.One of the ways to increase the efficiency of insertion of a sequence of interest into the genome is to increase the likelihood of double-strand break repair going through the homologous repair pathway. For this, artificial systems can be used that attract proteins to the region of DNA cleavage that favor homologous repair.

Среди белков, принимающих участие на ранних этапах гомологичной репарации, особый интерес вызывает CtIP белок, который связывает концевые участки ДНК и активирует резекцию 5' концов, взаимодействуя с MRN комплексом и Exol/Dna2 нуклеазами [Yeh С.D., Richardson С.D., Corn J.E. Advances in genome editing through control of DNA repair pathways // Nat. Cell Biol. 2019. T. 21. №12. C. 1468-1478].Among the proteins involved in the early stages of homologous repair, of particular interest is the CtIP protein, which binds the terminal regions of DNA and activates the resection of the 5 'ends, interacting with the MRN complex and Exol / Dna2 nucleases [Yeh CD, Richardson CD. , Corn JE Advances in genome editing through control of DNA repair pathways // Nat. Cell Biol. 2019. T. 21. No. 12. C. 1468-1478].

Было показано, что использование spCas9 белка, связанного через короткий линкер с эффекторным CtIP белком, может повышать эффективность встраивания интересующей последовательности в два раза [Charpentier Μ., Khedher Α.Η.Υ., Menoret S., Brion Α., Lamribet Κ., Dardillac Ε., Boix С, Perrouault L., Tesson L., Geny S., Cian A. De, Itier J. M., Anegon I., Lopez В., Giovannangeli C., Concordet J. P. CtIP fusion to Cas9 enhances transgene integration by homology-dependent repair // Nat. Commun. 2018. T. 9. №1. C. 1-11]. Однако повышение эффективности в такой системе значительно зависит от выбранного для редактирования участка ДНК и может полностью пропадать для некоторых вариантов sgRNA [Charpentier Μ., Khedher Α.Η.Υ., Menoret S., Brion Α., Lamribet K., Dardillac Ε., Boix С, Perrouault L., Tesson L., Geny S., Cian A. De, Itier J.M., Anegon I., Lopez В., Giovannangeli C., Concordet J.P. CtIP fusion to Cas9 enhances transgene integration by homology-dependent repair // Nat. Commun. 2018. T. 9. №1. С.1-11]. Разработка новой, более стабильной и эффективной системы позволяет расширить возможности применения геномного редактирования.It has been shown that the use of the spCas9 protein linked through a short linker to the effector CtIP protein can double the efficiency of insertion of the sequence of interest [Charpentier., Khedher Α.Η.Υ., Menoret S., Brion Α., Lamribet Κ. , Dardillac N., Boix C, Perrouault L., Tesson L., Geny S., Cian A. De, Itier JM, Anegon I., Lopez B., Giovannangeli C., Concordet JP CtIP fusion to Cas9 enhances transgene integration by homology-dependent repair // Nat. Commun. 2018. T. 9. No. 1. C. 1-11]. However, the increase in efficiency in such a system significantly depends on the selected DNA region for editing and may completely disappear for some sgRNA variants [Charpentier Μ., Khedher Α.Η.Υ., Menoret S., Brion Α., Lamribet K., Dardillac Ε. , Boix C, Perrouault L., Tesson L., Geny S., Cian A. De, Itier JM, Anegon I., Lopez B., Giovannangeli C., Concordet JP CtIP fusion to Cas9 enhances transgene integration by homology-dependent repair // Nat. Commun. 2018. T. 9. No. 1. P.1-11]. The development of a new, more stable and efficient system allows expanding the possibilities of genomic editing.

На момент подачи заявки из открытых источников было известно о следующих наиболее близких аналогах.At the time of filing the application, the following closest analogs were known from open sources.

Известна система редактирования генома, использующая сшивку CtIP белка через короткий линкер с Cas9 белком (WO 2018162702, А1). Однако она показала ограниченную эффективность на клетках млекопитающих, что может объясняться конформационными ограничениями, которые накладывает прямая сшивка белков.A genome editing system is known that uses the cross-linking of the CtIP protein through a short linker with the Cas9 protein (WO 2018162702, A1). However, it has shown limited efficacy in mammalian cells, which may be due to the conformational limitations imposed by direct cross-linking of proteins.

В качестве прототипа нами выбрана система, предполагающая привлечение эффекторных белков репарации с помощью MS2 системы адаптеров [Tran N.-T., Bashir S., Li X., Rossius J., Chu V.Т., Rajewsky K.,

R. Enhancement of Precise Gene Editing by the Association of Cas9 With Homologous Recombination Factors // Front. Genet. 2019. T. 10. C. 2-5].As a prototype we have chosen a system involving the attraction of repair effector proteins using the MS2 adapter system [Tran N.-T., Bashir S., Li X., Rossius J., Chu V.T., Rajewsky K.,

R. Enhancement of Precise Gene Editing by the Association of Cas9 With Homologous Recombination Factors // Front. Genet. 2019. T. 10. C. 2-5].

Использование MS2 адаптеров для привлечения белков увеличивает эффективность вставки интересующей последовательности, однако ограничивает применение этой системы клеточными линиями, в которых не используются широко применяемые MS2 адаптеры.The use of MS2 adapters to attract proteins increases the efficiency of insertion of the sequence of interest, but limits the use of this system to cell lines that do not use the widely used MS2 adapters.

Проблемой, на решение которой направлено данное изобретение, является расширение арсенала средств для увеличения эффективности вставки целевых конструкций в геном человека.The problem to be solved by the present invention is the expansion of the arsenal of means for increasing the efficiency of insertion of target constructs into the human genome.

Технический результат заключается в расширении арсенала средств для увеличения эффективности вставки целевых конструкций в геном человека.The technical result consists in expanding the arsenal of tools for increasing the efficiency of insertion of target structures into the human genome.

Сущность изобретения заключается в следующем.The essence of the invention is as follows.

Предложен рибонуклеопротеиновый комплекс для редактирования генома человека, исключая клетки зародышевой линии человека, путем вставки в него интересующей последовательности, включающий белок spCas9, связанный с sgRNA-PP7, кодируемой последовательностью SEQ ID NO: 1, которая связана с эффекторным химерным белком, кодируемым последовательностью SEQ ID NO: 2.A ribonucleoprotein complex is proposed for editing the human genome, excluding human germline cells, by inserting a sequence of interest into it, including the spCas9 protein linked to sgRNA-PP7 encoded by SEQ ID NO: 1, which is linked to an effector chimeric protein encoded by SEQ ID NO: 2.

Разработанный рибонуклеопротеиновый комплекс может быть доставлен в клетку с помощью трансфекции или электропорации в виде двух векторов.The developed ribonucleoprotein complex can be delivered to the cell by transfection or electroporation in the form of two vectors.

В нашей работе последовательность химерного эффекторного белка (SEQ ID NO: 2) была получена за счет сшивки последовательности белка РСР - белка адаптерной системы, полученной из бактериофага РР7 (123 а.о.), через линкер с NLS последовательностью для локализации белка в ядре (34 а.о.), с последовательностью гена человеческого CtIP белка (897 а.о.). Для облегчения считывания успешной экспрессии химерного эффекторного белка к его концу через Р2А-Т2А разрезающиеся последовательности был добавлен репортерный красный флуоресцентный белок mRuby. Эта конструкция была клонирована в pCS2+ вектор по сайтам рестрикции BamHI/XbaI. Карта вектора, несущего последовательность химерного эффекторного белка, представлена на фиг.1.In our work, the sequence of the chimeric effector protein (SEQ ID NO: 2) was obtained by stitching the sequence of the PCP protein - the protein of the adapter system obtained from the bacteriophage PP7 (amino acid residues 123) through a linker with the NLS sequence to localize the protein in the nucleus ( 34 aa), with the sequence of the human CtIP protein gene (897 aa). To facilitate the reading of the successful expression of the chimeric effector protein, the reporter red fluorescent protein mRuby was added to its end through the P2A-T2A cutting sequences. This construct was cloned into the pCS2 + vector at the BamHI / XbaI restriction sites. A map of the vector carrying the sequence of the chimeric effector protein is shown in FIG. 1.

Конструкция, несущая sgRNA-PP7 последовательность (SEQ ID NO: 1), которая была получена внесением двух РР7 шпилек в последовательность sgRNA, под U6 промотором, была клонирована в lentiCRISPR v2 вектор по сайтам рестрикции KpnI/NheI. Карта бицистронного вектора, несущего последовательность spCas9 белка и последовательность sgRNA-PP7 представлена на фиг.2.The construct carrying the sgRNA-PP7 sequence (SEQ ID NO: 1), which was obtained by introducing two PP7 hairpins into the sgRNA sequence, under the U6 promoter, was cloned into the lentiCRISPR v2 vector at the KpnI / NheI restriction sites. A map of a bicistronic vector carrying the spCas9 protein sequence and the sgRNA-PP7 sequence is shown in FIG. 2.

Для изменения места вставки интересующей последовательности в геном, целевой участок sgRNA из первых 20 нуклеотидов может быть клонирован в вектор по сайтам рестрикции BsmBI. Последовательность целевой части sgRNA может быть получена отжигом двух олигонуклеотидов. При дизайне олигонуклеотидов для отжига следует использовать 20 нуклеотидов непосредственно перед РАМ участком в выбранном для вставки месте в геноме. При отсутствии G нуклеотида в начале целевой последовательности, этот нуклеотид нужно внести перед целевой частью sgRNA для успешной транскрипции с U6 промотора. Для клонирования по BsmBI сайтам к олигонуклеотиду прямой направленности следует добавить САСС последовательность и к олигонуклеотиду обратной направленности -АААС последовательность.To change the insertion site of the sequence of interest into the genome, the target sgRNA region of the first 20 nucleotides can be cloned into the vector at the BsmBI restriction sites. The sequence of the target sgRNA portion can be obtained by annealing two oligonucleotides. When designing oligonucleotides for annealing, use 20 nucleotides just before the PAM site at the selected insertion site in the genome. In the absence of a G nucleotide at the beginning of the target sequence, this nucleotide must be inserted in front of the target portion of the sgRNA for successful transcription from the U6 promoter. For cloning at BsmBI sites, the CACC sequence should be added to the forward-directed oligonucleotide and the -AAAC sequence to the reverse-directed oligonucleotide.

Для успешного проведения вставки в геном требуется донорный вектор, несущий интересующую последовательностью. В качестве донора использовали конструкцию, несущую левое плечо гомологии к AAVS1 локусу (804 п.н.), SA сигнал акцептора сплайсинга, Т2А разрезающуюся последовательность, флуоресцентный зеленый EGFP белок (239 а.о.), сигнал полиаденилирования bGH poly(A) и правое плечо гомологии к AAVS1 локусу (804 п.н.). Эта конструкция была клонирована в pQE30 вектор по сайтам рестрикции XhoI/XbaI. Карта вектора, несущего донорную последовательность EGFP к AAVS1 локусу, представлена на фиг.3.A donor vector carrying the sequence of interest is required for successful insertion into the genome. A construct carrying the left arm of homology to the AAVS1 locus (804 bp), SA signal of the splicing acceptor, T2A cleavage sequence, fluorescent green EGFP protein (239 a.a.), polyadenylation signal bGH poly (A) and right shoulder homology to the AAVS1 locus (804 bp). This construct was cloned into the pQE30 vector at the XhoI / XbaI restriction sites. A map of the vector carrying the EGFP donor sequence to the AAVS1 locus is shown in FIG. 3.

При изменении места вставки интересующей последовательности в геном плечи гомологии должны быть подобраны так, чтобы совпадать с последовательностями, окружающими место для вставки. При этом рекомендуется выбирать плечи гомологии так, чтобы участок генома, попадающий в область вставки между плечами гомологии, не превышал 100 п.н., в идеале не превышал 10 п.н. Плечи гомологии не должны содержать целевой последовательности sgRNA или не должны содержать РАМ участка после него. При изменении последовательности, выбранной для встраивания в геном, она должна быть помещена в донорный вектор на место EGFP последовательности.When changing the insertion site of a sequence of interest into the genome, the homology arms must be matched to match the sequences surrounding the insertion site. In this case, it is recommended to select the homology arms so that the genome region that falls into the region of insertion between the homology arms does not exceed 100 bp, ideally does not exceed 10 bp. The homology arms must not contain the target sgRNA sequence or must not contain a PAM region after it. When changing the sequence selected for insertion into the genome, it must be inserted into the donor vector in place of the EGFP sequence.

В качестве примера использовали комплекс для проведения вставки EGFP гена в AAVS1 локус клеточной линии HEK293T. В качестве целевой последовательности был выбран TGTCCCTAGTGGCCCCACTG участок AAVS1 локуса. Для проверки эффективности комплекс был использован в сравнении с существующей MS2 системой адаптеров. Векторы, кодирующие комплексы и донорный вектор, несущий последовательность EGFP, были доставлены в клетку методом электропорации. После электропорации клетки проходили отбор пуромицином в течении трех дней. На четвертый день клетки подвергались анализу на проточном цитофлуориметре. Результаты проточной цитофлуориметрии редактируемых клеток представлены на фиг.4 и в таблице.As an example, a complex was used to insert the EGFP gene into the AAVS1 locus of the HEK293T cell line. The TGTCCCTAGTGGCCCCACTG region of the AAVS1 locus was selected as the target sequence. To test the efficiency, the complex was used in comparison with the existing MS2 adapter system. The vectors encoding the complexes and the donor vector carrying the EGFP sequence were delivered into the cell by electroporation. After electroporation, the cells were sampled with puromycin for three days. On the fourth day, the cells were analyzed on a flow cytometer. The results of flow cytometry of the edited cells are presented in figure 4 and in the table.

R2 областью обозначены EGFP/mRuby положительные клетки, которые прошли геномную вставку EGFP последовательности в AAVS1 локус и содержат химерный эффекторный белок. R3 областью обозначены mRuby положительные клетки, которые не прошли геномную вставку и содержат химерный эффекторный белок. Эффективность вставки рассчитывалась как отношение количества клеток в области R2 к общему количеству клеток в областях R2 и R3.The R2 region denotes EGFP / mRuby positive cells that have undergone genomic insertion of the EGFP sequence at the AAVS1 locus and contain a chimeric effector protein. The R3 region denotes mRuby positive cells that did not undergo genomic insertion and contain a chimeric effector protein. The insertion efficiency was calculated as the ratio of the number of cells in the R2 region to the total number of cells in the R2 and R3 regions.

Клетки, успешно получившие компоненты предлагаемой системы, встраивают интересующую последовательность в клеточный геном, что может быть использовано для моделирования наследственных заболеваний.Cells that have successfully received the components of the proposed system insert the sequence of interest into the cellular genome, which can be used to model hereditary diseases.

Отдельно стоит отметить, что увеличенная эффективность встраивания интересующей последовательности в геном позволит с большей легкостью изучать модели полигенетических заболеваний, вызванных изменениями в нескольких генах, среди которых различные формы диабета, рака и болезней сердца.Separately, it should be noted that the increased efficiency of insertion of the sequence of interest into the genome will make it easier to study models of polygenetic diseases caused by changes in several genes, including various forms of diabetes, cancer and heart disease.

Настоящее изобретение не предназначено для модификации генетической целостности клеток зародышевой линии человека, не предполагает использование человеческих эмбрионов.The present invention is not intended to modify the genetic integrity of human germline cells, nor does it imply the use of human embryos.

--->--->

Перечень последовательностейSequence listing

<110> Федеральное государственное автономное образовательное учреждение<110> Federal State Autonomous Educational Institution

высшего образования «Российский национальный исследовательскийhigher education "Russian National Research

медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохраненияMedical University named after N.I. Pirogov "of the Ministry of Health

Российской Федерации (Federalnoe gosudarstvennoe autonomnoe obrazovatelnoeRussian Federation (Federalnoe gosudarstvennoe autonomnoe obrazovatelnoe

uchrezhdenie vysshego obrazovaniya «Rossijskij natsionalnyj issledovatelskijuchrezhdenie vysshego obrazovaniya «Rossijskij natsionalnyj issledovatelskij

meditsinskij universitet imeni N.I. Pirogova» Ministerstva zdravookhraneniyameditsinskij universitet imeni N.I. Pirogova »Ministerstva zdravookhraneniya

Rossijskoj Federatsii)Rossijskoj Federatsii)

<120> Рибонуклеопротеиновый комплекс для редактирования генома человека <120> Ribonucleoprotein complex for editing the human genome

<160> 2<160> 2

<210> SEQ ID NO: 1<210> SEQ ID NO: 1

<211> 165<211> 165

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная<213> Artificial

<220><220>

<223> Последовательность, кодирующая sgRNA-PP7<223> Sequence coding for sgRNA-PP7

<400> 1<400> 1

caccggagac gggataccgt ctctgtttta gagctaggcc taaggagttt atatggaaac 60caccggagac gggataccgt ctctgtttta gagctaggcc taaggagttt atatggaaac 60

ccttaggcct agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttggcct aaggagttta 120ccttaggcct agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttggcct aaggagttta 120

tatggaaacc cttaggccaa gtggcaccga gtcggtgctt ttttt 165tatggaaacc cttaggccaa gtggcaccga gtcggtgctt ttttt 165

<210> SEQ ID NO: 2<210> SEQ ID NO: 2

<211> 3162<211> 3162

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная<213> Artificial

<220><220>

<223> Последовательность, кодирующая химерный эффекторный белок<223> Chimeric effector protein coding sequence

<400> 2<400> 2

atgggttcca aaaccatcgt tctttcggtc ggcgaggcta ctcgcactct gactgagatc 60atgggttcca aaaccatcgt tctttcggtc ggcgaggcta ctcgcactct gactgagatc 60

cagtccaccg cagaccgtca gatcttcgaa gagaaggtcg ggcctctggt gggtcggctg 120cagtccaccg cagaccgtca gatcttcgaa gagaaggtcg ggcctctggt gggtcggctg 120

cgcctcacgg cttcgctccg tcaaaacgga gccaagaccg cgtatcgcgt caacctaaaa 180cgcctcacgg cttcgctccg tcaaaacgga gccaagaccg cgtatcgcgt caacctaaaa 180

ctggatcagg cggacgtcgt tgattccgga cttccgaaag tgcgctacac tcaggtatgg 240ctggatcagg cggacgtcgt tgattccgga cttccgaaag tgcgctacac tcaggtatgg 240

tcgcacgacg tgacaatcgt tgcgaatagc accgaggcct cgcgcaaatc gttgtacgat 300tcgcacgacg tgacaatcgt tgcgaatagc accgaggcct cgcgcaaatc gttgtacgat 300

ttgaccaagt ccctcgtcgc gacctcgcag gtcgaagatc ttgtcgtcaa ccttgtgccg 360ttgaccaagt ccctcgtcgc gacctcgcag gtcgaagatc ttgtcgtcaa ccttgtgccg 360

ctgggccgtc gtctcctggc aagcgctgga ggaggtggaa gcggaggagg aggaagcgga 420ctgggccgtc gtctcctggc aagcgctgga ggaggtggaa gcggaggagg aggaagcgga 420

ggaggaggta gcggacctaa gaaaaagagg aaggtggctg ctgctaccgg tatgaacatc 480ggaggaggta gcggacctaa gaaaaagagg aaggtggctg ctgctaccgg tatgaacatc 480

tcgggaagca gctgtggaag ccctaactct gcagatacat ctagtgactt taaggacctt 540tcgggaagca gctgtggaag ccctaactct gcagatacat ctagtgactt taaggacctt 540

tggacaaaac taaaagaatg tcatgataga gaagtacaag gtttacaagt aaaagtaacc 600tggacaaaac taaaagaatg tcatgataga gaagtacaag gtttacaagt aaaagtaacc 600

aagctaaaac aggaacgaat cttagatgca caaagactag aagaattctt caccaaaaat 660aagctaaaac aggaacgaat cttagatgca caaagactag aagaattctt caccaaaaat 660

caacagctga gggaacagca gaaagtcctt catgaaacca ttaaagtttt agaagatcgg 720caacagctga gggaacagca gaaagtcctt catgaaacca ttaaagtttt agaagatcgg 720

ttaagagcag gcttatgtga tcgctgtgca gtaactgaag aacatatgcg gaaaaaacag 780ttaagagcag gcttatgtga tcgctgtgca gtaactgaag aacatatgcg gaaaaaacag 780

caagagtttg aaaatatccg gcagcagaat cttaaactta ttacagaact tatgaatgaa 840caagagtttg aaaatatccg gcagcagaat cttaaactta ttacagaact tatgaatgaa 840

aggaatactc tacaggaaga aaataaaaag ctttctgaac aactccagca gaaaattgag 900aggaatactc tacaggaaga aaataaaaag ctttctgaac aactccagca gaaaattgag 900

aatgatcaac agcatcaagc agctgagctt gaatgtgagg aagacgttat tccagattca 960aatgatcaac agcatcaagc agctgagctt gaatgtgagg aagacgttat tccagattca 960

ccgataacag ccttctcatt ttctggcgtt aaccggctac gaagaaagga gaacccccat 1020ccgataacag ccttctcatt ttctggcgtt aaccggctac gaagaaagga gaacccccat 1020

gtccgataca tagaacaaac acatactaaa ttggagcact ctgtgtgtgc aaatgaaatg 1080gtccgataca tagaacaaac acatactaaa ttggagcact ctgtgtgtgc aaatgaaatg 1080

agaaaagttt ccaagtcttc aactcatcca caacataatc ctaatgaaaa tgaaattcta 1140agaaaagttt ccaagtcttc aactcatcca caacataatc ctaatgaaaa tgaaattcta 1140

gtagctgaca cttatgacca aagtcaatct ccaatggcca aagcacatgg aacaagcagc 1200gtagctgaca cttatgacca aagtcaatct ccaatggcca aagcacatgg aacaagcagc 1200

tatacccctg ataagtcatc ttttaattta gctacagttg ttgctgaaac acttggactt 1260tatacccctg ataagtcatc ttttaattta gctacagttg ttgctgaaac acttggactt 1260

ggtgttcaag aagaatctga aactcaaggt cccatgagcc cccttggtga tgagctctac 1320ggtgttcaag aagaatctga aactcaaggt cccatgagcc cccttggtga tgagctctac 1320

cactgtctgg aaggaaatca caagaaacag ccttttgagg aatctacaag aaatactgaa 1380cactgtctgg aaggaaatca caagaaacag ccttttgagg aatctacaag aaatactgaa 1380

gatagtttaa gattttcaga ttctacttca aagactcctc ctcaagaaga attacctact 1440gatagtttaa gattttcaga ttctacttca aagactcctc ctcaagaaga attacctact 1440

cgagtgtcat ctcctgtatt tggagctacc tctagtatca aaagtggttt agatttgaat 1500cgagtgtcat ctcctgtatt tggagctacc tctagtatca aaagtggttt agatttgaat 1500

acaagtttgt ccccttctct tttacagcct gggaaaaaaa aacatctgaa aacactccct 1560acaagtttgt ccccttctct tttacagcct gggaaaaaaa aacatctgaa aacactccct 1560

tttagcaaca cttgtatatc tagattagaa aaaactagat caaaatctga agatagtgcc 1620tttagcaaca cttgtatatc tagattagaa aaaactagat caaaatctga agatagtgcc 1620

cttttcacac atcacagtct tgggtctgaa gtgaacaaga tcattatcca gtcatctaat 1680cttttcacac atcacagtct tgggtctgaa gtgaacaaga tcattatcca gtcatctaat 1680

aaacagatac ttataaataa aaatataagt gaatccctag gtgaacagaa taggactgag 1740aaacagatac ttataaataa aaatataagt gaatccctag gtgaacagaa taggactgag 1740

tacggtaaag attctaacac tgataaacat ttggagcccc tgaaatcatt gggaggccga 1800tacggtaaag attctaacac tgataaacat ttggagcccc tgaaatcatt gggaggccga 1800

acatccaaaa ggaagaaaac tgaggaagaa agtgaacatg aagtaagctg cccccaagct 1860acatccaaaa ggaagaaaac tgaggaagaa agtgaacatg aagtaagctg cccccaagct 1860

tcttttgata aagaaaatgc tttccctttt ccaatggata atcagttttc catgaatgga 1920tcttttgata aagaaaatgc tttccctttt ccaatggata atcagttttc catgaatgga 1920

gactgtgtga tggataaacc tctggatctg tctgatcgat tttcagctat tcagcgtcaa 1980gactgtgtga tggataaacc tctggatctg tctgatcgat tttcagctat tcagcgtcaa 1980

gagaaaagcc aaggaagtga gacttctaaa aacaaattta ggcaagtgac tctttatgag 2040gagaaaagcc aaggaagtga gacttctaaa aacaaattta ggcaagtgac tctttatgag 2040

gctttgaaga ccattccaaa gggcttttcc tcaagccgta aggcctcaga tggcaactgc 2100gctttgaaga ccattccaaa gggcttttcc tcaagccgta aggcctcaga tggcaactgc 2100

acgttgccca aagattcccc aggggagccc tgttcacagg aatgcatcat ccttcagccc 2160acgttgccca aagattcccc aggggagccc tgttcacagg aatgcatcat ccttcagccc 2160

ttgaataaat gctctccaga caataaacca tcattacaaa taaaagaaga aaatgctgtc 2220ttgaataaat gctctccaga caataaacca tcattacaaa taaaagaaga aaatgctgtc 2220

tttaaaattc ctctacgtcc acgtgaaagt ttggagactg agaatgtttt agatgacata 2280tttaaaattc ctctacgtcc acgtgaaagt ttggagactg agaatgtttt agatgacata 2280

aagagtgctg gttctcatga gccaataaaa atacaaacca ggtcagacca tggaggatgt 2340aagagtgctg gttctcatga gccaataaaa atacaaacca ggtcagacca tggaggatgt 2340

gaacttgcat cagttcttca gttaaatcca tgtagaactg gtaaaataaa gtctctacaa 2400gaacttgcat cagttcttca gttaaatcca tgtagaactg gtaaaataaa gtctctacaa 2400

aacaaccaag atgtatcctt tgaaaatatc cagtggagta tagatccggg agcagacctt 2460aacaaccaag atgtatcctt tgaaaatatc cagtggagta tagatccggg agcagacctt 2460

tctcagtata aaatggatgt tactgtaata gatacaaagg atggcagtca gtcaaaatta 2520tctcagtata aaatggatgt tactgtaata gatacaaagg atggcagtca gtcaaaatta 2520

ggaggagaga cagtggacat ggactgtaca ttggttagtg aaaccgttct cttaaaaatg 2580ggaggagaga cagtggacat ggactgtaca ttggttagtg aaaccgttct cttaaaaatg 2580

aagaagcaag agcagaaggg agaaaaaagt tcaaatgaag aaagaaaaat gaatgatagc 2640aagaagcaag agcagaaggg agaaaaaagt tcaaatgaag aaagaaaaat gaatgatagc 2640

ttggaagata tgtttgatcg gacaacacat gaagagtatg aatcctgttt ggcagacagt 2700ttggaagata tgtttgatcg gacaacacat gaagagtatg aatcctgttt ggcagacagt 2700

ttctcccaag cagcagatga agaggaggaa ttgtctactg ccacaaagaa actacacact 2760ttctcccaag cagcagatga agaggaggaa ttgtctactg ccacaaagaa actacacact 2760

catggtgata aacaagacaa agtcaagcag aaagcgtttg tggagccgta ttttaaaggt 2820catggtgata aacaagacaa agtcaagcag aaagcgtttg tggagccgta ttttaaaggt 2820

gatgaaagag agactagctt gcaaaatttt cctcatattg aggtggttcg gaaaaaagag 2880gatgaaagag agactagctt gcaaaatttt cctcatattg aggtggttcg gaaaaaagag 2880

gagagaagaa aactgcttgg gcacacgtgt aaggaatgtg aaatttatta tgcagatatg 2940gagagaagaa aactgcttgg gcacacgtgt aaggaatgtg aaatttatta tgcagatatg 2940

ccagcagaag aaagagaaaa gaaattggct tcctgctcaa gacaccgatt ccgctacatt 3000ccagcagaag aaagagaaaa gaaattggct tcctgctcaa gacaccgatt ccgctacatt 3000

ccacccaaca caccagagaa tttttgggaa gttggttttc cttccactca gacttgtatg 3060ccacccaaca caccagagaa tttttgggaa gttggttttc cttccactca gacttgtatg 3060

gaaagaggtt atattaagga agatcttgat ccttgtcctc gtccaaaaag acgtcagcct 3120gaaagaggtt atattaagga agatcttgat ccttgtcctc gtccaaaaag acgtcagcct 3120

tacaacgcaa tattttctcc aaaaggcaag gagcagaaga ca 3162tacaacgcaa tattttctcc aaaaggcaag gagcagaaga ca 3162

<---<---

Claims (1)

Рибонуклеопротеиновый комплекс для редактирования генома человека, исключая клетки зародышевой линии человека, путем вставки в него интересующей последовательности, включающий белок spCas9, связанный с sgRNA-PP7, кодируемой последовательностью SEQ ID NO: 1, которая связана с эффекторным химерным белком, кодируемым последовательностью SEQ ID NO: 2.A ribonucleoprotein complex for editing the human genome, excluding human germline cells, by inserting a sequence of interest into it, including the spCas9 protein linked to sgRNA-PP7 encoded by SEQ ID NO: 1, which is linked to an effector chimeric protein encoded by SEQ ID NO : 2.

Images