RU2748229C1 - Method for producing fumaric acid - Google Patents
Method for producing fumaric acid Download PDFInfo
- Publication number
- RU2748229C1 RU2748229C1 RU2020116864A RU2020116864A RU2748229C1 RU 2748229 C1 RU2748229 C1 RU 2748229C1 RU 2020116864 A RU2020116864 A RU 2020116864A RU 2020116864 A RU2020116864 A RU 2020116864A RU 2748229 C1 RU2748229 C1 RU 2748229C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fumaric acid
- jerusalem artichoke
- biomass
- hours
- production
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/44—Polycarboxylic acids
- C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению гидролизатов измельченных клубней топинамбура путем ферментативного гидролиза под действием комплекса ферментов целлюлаз совместно с экзоинулиназой для полного гидролиза целлюлозной и инулиновой матриц биомассы топинамбура, с последующим превращением гидролизата в фумаровую кислоту под действием иммобилизованного биокатализатора, содержащего клетки мицелиального гриба Rhizopus oryzae F1032. Способ обеспечивает совместное проведение различных стадий процесса биодеградации измельченной биомассы топинамбура до глюкозы и фруктозы, с последующим превращением в фумаровую кислоту.The invention relates to biotechnology, in particular to the production of hydrolysates of crushed Jerusalem artichoke tubers by enzymatic hydrolysis under the action of a complex of cellulase enzymes together with exoinulinase for complete hydrolysis of the cellulose and inulin matrices of Jerusalem artichoke biomass, followed by the transformation of the hydrolyzate into fumaric acid under the action of the cells of the immobilized biomass Rhizopus oryzae F1032. The method provides for the joint implementation of various stages of the biodegradation process of crushed Jerusalem artichoke biomass to glucose and fructose, followed by conversion into fumaric acid.
Топинамбур (Helianthus tuberosus) является перспективной сельскохозяйственной культурой по ряду показателей. При высокой урожайности по выходу углеводов топинамбур в два раза превосходит сахарную свеклу и другие культуры. Ценность топинамбура обусловлена биохимическим составом. Его клубни и наземная часть содержат большое количество пектина, инулина, олигофруктоз, пищевых волокон, белка, аминокислот, в том числе, незаменимых, витаминов, микро- и макроэлементов, азотистых веществ и пр. [Гулюк Н.Г., Лукин Н.Д., Пучкова Т.С., Пихало Д.М., Гулакова В.А. Об очистке экстракта из инулинсодержащего сырья. // Пищевая промышленность. - 2017. - №2. - С. 24-26]. Таким образом, использование нетрадиционного растительного сырья, такого как топинамбур, для получения полезных продуктов является актуальной задачей.Jerusalem artichoke (Helianthus tuberosus) is a promising crop for a number of indicators. With a high yield in terms of carbohydrate yield, Jerusalem artichoke is twice as great as sugar beet and other crops. The value of Jerusalem artichoke is due to its biochemical composition. Its tubers and ground part contain a large amount of pectin, inulin, oligofructose, dietary fiber, protein, amino acids, including essential vitamins, micro- and macroelements, nitrogenous substances, etc. [Gulyuk NG, Lukin ND ., Puchkova T.S., Pihalo D.M., Gulakova V.A. Purification of an extract from inulin-containing raw materials. // Food industry. - 2017. - No. 2. - S. 24-26]. Thus, the use of unconventional plant materials, such as Jerusalem artichoke, to obtain useful products is an urgent task.
Фумаровая кислота является коммерчески значимым продуктом, широко востребованным в различных отраслях промышленности, агропромышленном комплексе, в производстве биоразлагаемых полимеров [Xu, Q., Li, S., Huang, Н., & Wen, J. Key technologies for the industrial production of fumaric acid by fermentation // Biotechnology advances. - 2012. - T. 30. - №. 6. - C. 1685-1696. Gold R., Linker R. A., Stangel M. Fumaric acid and its esters: an emerging treatment for multiple sclerosis with antioxidative mechanism of action // Clinical Immunology. - 2012. - T. 142. - №. 1. - C. 44-48].Fumaric acid is a commercially significant product widely demanded in various industries, agro-industrial complex, in the production of biodegradable polymers [Xu, Q., Li, S., Huang, N., & Wen, J. Key technologies for the industrial production of fumaric acid by fermentation // Biotechnology advances. - 2012. - T. 30. - No. 6. - C. 1685-1696. Gold R., Linker R. A., Stangel M. Fumaric acid and its esters: an emerging treatment for multiple sclerosis with antioxidative mechanism of action // Clinical Immunology. - 2012. - T. 142. - No. 1. - C. 44-48].
Биотехнологический способ получения фумаровой кислоты характеризуется многими преимуществами перед традиционно используемым химическим синтезом, так как подразумевает низкую экологическую нагрузку, возможность использования возобновляемых источников сырья с низкой себестоимостью, мягкие условия реализации (низкие температуры), возможность переработки отходов и решение экологических задач.The biotechnological method for producing fumaric acid has many advantages over the traditionally used chemical synthesis, since it implies a low environmental load, the possibility of using renewable sources of raw materials with a low cost, mild implementation conditions (low temperatures), the possibility of waste recycling and solving environmental problems.
Помимо генномодифицированных микроорганизмов, требующих специальных условий культивирования и поддержания [Song C.W., Kim D.I., Choi S, Jang J.W., Lee S.Y. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of fumaric acid. // Biotechnol Bioeng., 2013, 110(7):2025-34, Xu G., Zou W., Chen X., Xu N., Liu L., Chen J. Fumaric acid production in Saccharomyces cerevisiae by in silico aided metabolic engineering. // PLoS One. 2012;7(12):e52086, Huang D., Wang R., Du W., Wang G., Xia M. Activation of glycerol metabolic pathway by evolutionary engineering of Rhizopus oryzae to strengthen the fumaric acid biosynthesis from crude glycerol. // Bioresour Technol. 2015;196:263-72], клетки мицелиального гриба рода Rhizopus являются единственными природными биокатализаторами процесса синтеза фумаровой кислоты из потребляемых клетками углеводов, содержащихся в гидролизатах растительного сырья [Ghosh, В., & Ray, R. R. (2011). Current commercial perspective of Rhizopus oryzae: a review. J Appl Sci, 11(14), 2470-2486. Xu, Q., Li, S., Huang, H., & Wen, J. Key technologies for the industrial production of fumaric acid by fermentation // Biotechnology advances. - 2012. - T. 30. - №. 6. - C. 1685-1696. Engel, C. A. R., Straathof, A. J., Zijlmans, T. W., van Gulik, W. M., & van der Wielen, L. A. Fumaric acid production by fermentation // Applied microbiology and biotechnology. - 2008. - T. 78. - №. 3. - C. 379-389].In addition to genetically modified microorganisms requiring special conditions for cultivation and maintenance [Song C.W., Kim D.I., Choi S, Jang J.W., Lee S.Y. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of fumaric acid. // Biotechnol Bioeng., 2013, 110 (7): 2025-34, Xu G., Zou W., Chen X., Xu N., Liu L., Chen J. Fumaric acid production in Saccharomyces cerevisiae by in silico aided metabolic engineering. // PLoS One. 2012; 7 (12): e52086, Huang D., Wang R., Du W., Wang G., Xia M. Activation of glycerol metabolic pathway by evolutionary engineering of Rhizopus oryzae to strengthen the fumaric acid biosynthesis from crude glycerol. // Bioresour Technol. 2015; 196: 263-72], the cells of the filamentous fungus of the genus Rhizopus are the only natural biocatalysts for the synthesis of fumaric acid from the carbohydrates consumed by the cells, contained in the hydrolysates of plant materials [Ghosh, B., & Ray, R. R. (2011). Current commercial perspective of Rhizopus oryzae: a review. J Appl Sci, 11 (14), 2470-2486. Xu, Q., Li, S., Huang, H., & Wen, J. Key technologies for the industrial production of fumaric acid by fermentation // Biotechnology advances. - 2012. - T. 30. - No. 6. - C. 1685-1696. Engel, C. A. R., Straathof, A. J., Zijlmans, T. W., van Gulik, W. M., & van der Wielen, L. A. Fumaric acid production by fermentation // Applied microbiology and biotechnology. - 2008. - T. 78. - No. 3. - C. 379-389].
Большинство известных на сегодняшний день способов получения фумаровой кислоты подразумевают использование в качестве исходного сырья простых сахаров (глюкозы, ксилозы) [Engel, С.A. R., Straathof, A. J., Zijlmans, Т. W., van Gulik, W. М., & van der Wielen, L. A. Fumaric acid production by fermentation // Applied microbiology and biotechnology. - 2008. -T. 78. - №. 3. - C. 379-389] или полисахаридов на основе глюкозы (крахмал) [Moresi, М., Parente, Е., Petruccioli, М., & Federici, F. Fumaric acid production from hydrolysates of starch - based substrates // Journal of chemical technology and biotechnology. - 1992. - T. 54. - №. 3. - C. 283-290. Huang H, Li S, Xiong Q, Xu Q, Gu S. A method to control fungi morphology of the fermentation process. Chinese Patent CN 201110114771.X. 2011 May 5] в чистом виде.Most of the currently known methods for producing fumaric acid involve the use of simple sugars (glucose, xylose) as a raw material [Engel, C.A. R., Straathof, A. J., Zijlmans, T. W., van Gulik, W. M., & van der Wielen, L. A. Fumaric acid production by fermentation // Applied microbiology and biotechnology. - 2008. -T. 78. - No. 3. - C. 379-389] or glucose-based polysaccharides (starch) [Moresi, M., Parente, E., Petruccioli, M., & Federici, F. Fumaric acid production from hydrolysates of starch - based substrates // Journal of chemical technology and biotechnology. - 1992. - T. 54. - No. 3. - S. 283-290. Huang H, Li S, Xiong Q, Xu Q, Gu S. A method to control fungi morphology of the fermentation process. Chinese Patent CN 201110114771.X. 2011 May 5] in its pure form.
Более привлекательными являются способы биотрансформации углеводсодержащего возобновляемого сырья сложного состава, отличающегося невысокой себестоимостью и доступностью, в ряде случаев это могут быть также отходы каких-либо производств. Среди таких субстратов для получения ФК предлагаются в основном лигноцеллюлозосодержащие и крахмалосодержащие субстраты растительного происхождения: кукурузная солома [Xu Q., Li S., Fu Y., Tai C, Huang H. Two-stage utilization of corn straw by Rhizopus oryzae for fumaric acid production // Bioresource technology. - 2010. - T. 101. - №. 15. - C. 6262-6264.], пшеничная солома и осиновые опилки [Сенько О.В., Степанов Н.А., Маслова О.В., Лягин И.В., Ефременко Е.Н. Ресурсосберегающая биотехнология получения фумаровой кислоты из возобновляемого растительного сырья // Вестник КузГТУ. 2013. №1], кукурузная мука, картофель, жом маниоки [Carta, F. S., Soccol, C. R., Ramos, L. P., & Fontana, J. D. Production of fumaric acid by fermentation of enzymatic hydrolysates derived from cassava bagasse //Bioresource Technology. - 1999. - T. 68. - №. 1. - C. 23-28.], древесина эвкалипта [
Несмотря на то, что инулин - биополимер, который в отличие от крахмала и целлюлозы, состоит в основном из фруктозы с малыми примесями глюкозы, и клетки грибов рода Rhizopus могут выступать в качестве биокатализаторов процесса получения фумаровой кислоты не только из глюкозы, но и из ряда других моно- и дисахаров, в том числе фруктозы [
Основными ограничениями возможности практического использования альтернативных субстратов сложного состава, к которым относится возобновляемое сырье растительного происхождения, для получения фумаровой кислоты являются низкие значения следующих основных параметров процесса:The main limitations of the practical use of alternative substrates of complex composition, which include renewable raw materials of plant origin, for the production of fumaric acid are the low values of the following main process parameters:
- продуктивности процесса на стадии биосинтеза фумаровой кислоты;- the productivity of the process at the stage of fumaric acid biosynthesis;
- конечной концентрации продукта на стадии биосинтеза;- the final concentration of the product at the stage of biosynthesis;
- степени конверсии единицы субстрата в продукт;- the degree of conversion of a unit of substrate into a product;
- длительности эффективного использования биокатализаторов в процессе получения ФК;- the duration of the effective use of biocatalysts in the process of obtaining FA;
- высокая длительность процесса на стадии предобработки сырья.- high duration of the process at the stage of raw material preprocessing.
Грибной биокатализатор, обладающий рядом собственных гидролитических активностей [Ghosh, В., & Ray, R. R. (2011). Current commercial perspective of Rhizopus oryzae: a review. J Appl Sci, 77(14), 2470-2486], не в состоянии обеспечить полную глубокую биотрансформацию сложных углеводсодержащих субстратов в фумаровую кислоту. В качестве решения данной проблемы предлагается проведение предварительной предобработки исходного сырья с получением гидролизатов топинамбура - углеводов менее сложного состава, включающей ферментативную предварительную обработку или предобработку.A fungal biocatalyst with a number of intrinsic hydrolytic activities [Ghosh, B., & Ray, R. R. (2011). Current commercial perspective of Rhizopus oryzae: a review. J Appl Sci, 77 (14), 2470-2486], is unable to provide complete deep biotransformation of complex carbohydrate substrates into fumaric acid. As a solution to this problem, it is proposed to carry out preliminary pretreatment of the feedstock to obtain Jerusalem artichoke hydrolysates - carbohydrates of a less complex composition, including enzymatic pretreatment or pretreatment.
Химическая предобработка не обеспечивает полного разложения полисахаридов сложного состава и характеризуется наличием отходов производства, утилизация которых представляет довольно серьезную проблему. Подобная обработка приводит к накоплению в гидролизатах различных токсичных для клеток микроорганизмов веществ: фурфурола, оксиметилфурфурола, муравьиной кислоты [Nichols N.N., Sharma L.N., Mowery R.A., Chambliss C.K., Van Walsum G.P., Dien B.S., Iten L.B. Fungal metabolism of fermentation inhibitors present in corn stover dilute acid hydrolysate // Enzyme and Microbial Technology. - 2008. - T. 42. - №. 7. - C. 624-630].Chemical pretreatment does not provide complete decomposition of complex polysaccharides and is characterized by the presence of production waste, the disposal of which is a rather serious problem. Such treatment leads to the accumulation of various substances toxic to the cells of microorganisms in the hydrolysates: furfural, oxymethylfurfural, formic acid [Nichols N.N., Sharma L.N., Mowery R.A., Chambliss C.K., Van Walsum G.P., Dien B.S., Iten L.B. Fungal metabolism of fermentation inhibitors present in corn stover dilute acid hydrolysate // Enzyme and Microbial Technology. - 2008. - T. 42. - no. 7. - C. 624-630].
Большое развитие получили методы предобработки, основанные на взрывной дефибрации сырья по декомпрессионному принципу (паровой взрыв) [De Ban I., Nanna F., Braccio G. (2007) SO2-catalyzed steam fractionation of aspen chips for bioethahnol production: Optimization of the catalyst impregnation // Ind Eng Chem Res., V. 46, P. 7711-7720]. Исходное сырье подвергают кратковременному воздействию перегретого пара под давлением в присутствии или в отсутствие SO2 или СО2 и далее давление сбрасывают, что вызывает паровой взрыв материала. При таких условиях лигнин плавится, частично разрушается и выходит из структуры целлюлозы, кроме того, под действием парового взрыва происходит частичная дезинтеграция целлюлозы, а также гидролиз гемицеллюлоз. Однако недостатком такого метода является, с одной стороны, большой расход энергии и пара, а, с другой - образование трудно утилизируемых отходов (модифицированного лигнина).Methods of pretreatment based on explosive defibration of raw materials according to the decompression principle (steam explosion) [De Ban I., Nanna F., Braccio G. (2007) SO 2 -catalyzed steam fractionation of aspen chips for bioethahnol production: Optimization of the catalyst impregnation // Ind Eng Chem Res., V. 46, P. 7711-7720]. The feedstock is briefly exposed to superheated steam under pressure in the presence or absence of SO 2 or CO 2 and then the pressure is released, which causes a steam explosion of the material. Under these conditions, lignin melts, partially breaks down and leaves the structure of cellulose; in addition, under the action of a steam explosion, partial disintegration of cellulose occurs, as well as hydrolysis of hemicelluloses. However, the disadvantage of this method is, on the one hand, the high consumption of energy and steam, and, on the other hand, the formation of difficult to dispose of waste (modified lignin).
Поэтому в биокаталитических процессах большее предпочтение отдается методам, основанным на измельчении исходного сырья с использованием различных видов мельниц или блендеров и его последующая предобработка ферментными препаратами. Для ферментативной обработки чаще всего используются коммерческие препараты гидролитических ферментов: с β-глюкозидазной, амилоглюкозидазной, α-амилазной и целлюлазной активностью [Carta, F. S., Soccol, С.R., Ramos, L. P., & Fontana, J. D. Production of fumaric acid by fermentation of enzymatic hydrolysates derived from cassava bagasse // Bioresource Technology. - 1999. - T. 68. - №. 1. - C. 23-28, Liao, W., Liu, Y., Wen, Z., Frear, C, & Chen, S. (2008). Kinetic modeling of enzymatic hydrolysis of cellulose in differently pretreated fibers from dairy manure. Biotechnology and bioengineering, 101(3), 441-451, Yan, L., Zhang, H., Chen, J., Lin, Z., Jin, Q., Jia, H., & Huang, H. (2009). Dilute sulfuric acid cycle spray flow-through pretreatment of corn stover for enhancement of sugar recovery. Bioresource technology, 100(5), 1803 -1808].Therefore, in biocatalytic processes, more preference is given to methods based on grinding the feedstock using various types of mills or blenders and its subsequent pretreatment with enzyme preparations. For enzymatic treatment, commercial preparations of hydrolytic enzymes are most often used: with β-glucosidase, amyloglucosidase, α-amylase and cellulase activity [Carta, FS, Soccol, CR, Ramos, LP, & Fontana, JD Production of fumaric acid by fermentation of enzymatic hydrolysates derived from cassava bagasse // Bioresource Technology. - 1999. - T. 68. - No. 1.-C. 23-28, Liao, W., Liu, Y., Wen, Z., Frear, C, & Chen, S. (2008). Kinetic modeling of enzymatic hydrolysis of cellulose in differently pretreated fibers from dairy manure. Biotechnology and bioengineering, 101 (3), 441-451, Yan, L., Zhang, H., Chen, J., Lin, Z., Jin, Q., Jia, H., & Huang, H. (2009 ). Dilute sulfuric acid cycle spray flow-through pretreatment of corn stover for enhancement of sugar recovery. Bioresource technology, 100 (5), 1803-1808].
Доказано, что в процессах получения органических кислот, эффективнее использовать иммобилизованные продуценты, поскольку они толерантны к низким значениям рН среды, высоким концентрациям накапливающихся в культуральной жидкости органических кислот, присутствию прочих токсичных компонентов в окружающей среде, а также технологически привлекательны [Maslova, О. V., Sen'ko, О. V., Stepanov, N. A., Efremenko, Е. N. Lactic acid production using free cells of bacteria and filamentous fungi and cells immobilized in polyvinyl alcohol cryogel: A comparative analysis of the characteristics of biocatalysts and processes // Catalysis in Industry. - 2016. - T. 8. - №. 3. - C. 280-285. Efremenko E.N., Spiricheva O.V., Lozinsky V.I., Varfolomeev S.D. Rhizopus oryzae fungus cells producing L(+)-lactic acid: kinetic and metabolic parameters of free and PVA-cryogel-entrapped mycelium. // Appl. Microb. Biotech., V.72, 2006, p.480-485]. Использование биокатализаторов в иммобилизованном виде позволяет существенно увеличивать период его полуинактивации, повышать продуктивность процесса и получать более высокие конечные концентрации продукта.It has been proven that in the processes of obtaining organic acids, it is more efficient to use immobilized producers, since they are tolerant to low pH values of the medium, high concentrations of organic acids accumulating in the culture liquid, the presence of other toxic components in the environment, and are also technologically attractive [Maslova, O. V ., Sen'ko, O. V., Stepanov, NA, Efremenko, E. N. Lactic acid production using free cells of bacteria and filamentous fungi and cells immobilized in polyvinyl alcohol cryogel: A comparative analysis of the characteristics of biocatalysts and processes // Catalysis in Industry. - 2016. - T. 8. - No. 3. - C. 280-285. Efremenko E.N., Spiricheva O.V., Lozinsky V.I., Varfolomeev S.D. Rhizopus oryzae fungus cells producing L (+) - lactic acid: kinetic and metabolic parameters of free and PVA-cryogel-entrapped mycelium. // Appl. Microb. Biotech., V. 72, 2006, p. 480-485]. The use of immobilized biocatalysts makes it possible to significantly increase the period of its half-inactivation, increase the productivity of the process, and obtain higher final product concentrations.
Известен способ получения фумаровой кислоты из возобновляемого растительного сырья, основанный на биотрансформации ферментативно предобработанных целлюлозосодержащих отходов сельского хозяйства и деревообрабатывающей промышленности с использованием иммобилизованных в криогель поливинилового спирта клеток мицелиальных гриба Rhizopus oryzae F-1032 [Сенько О.В., Степанов Н.А., Маслова О.В., Лягин И.В., Ефременко Е.Н. Ресурсосберегающая биотехнология получения фумаровой кислоты из возобновляемого растительного сырья // Вестник КузГТУ. 2013. №1, Сенько О.В. Биокатализаторы в виде иммобилизованных в криогель поливинилового спирта клеток мицелиальных грибов в процессах получения органических кислот, биоэтанола, гидролитических ферментов и разложения фосфорорганических пестицидов: диссертация кандидата химических наук: 03.01.06 / Сенько Ольга Витальевна; Место защиты: Моск. гос. ун-т им. М.В. Ломоносова. Хим. фак. - Москва, 2013. - 170 с.], который по основным характеристикам процесса: степени конверсии единицы субстрата в фумаровую кислоту (до 0,35 гФК/г исх. субстрата) и длительности применения биокатализатора в периодических условиях на стадии биоконверсии компонентов ферментолизатов в фумаровую кислоту (до 480 ч), соизмерим или превосходит все известные способы получения фумаровой кислоты из возобновляемого растительного сырья [Liao, W., Liu, Y., Frear, С, & Chen, S.Co-production of fumaric acid and chitin from a nitrogen-rich lignocellulosic material-dairy manure-using a pelletized filamentous fungus Rhizopus oryzae ATCC 20344 // Bioresource technology. - 2008. - T. 99. - №. 13. - C. 5859-5866. B=Xu Q., Li S., Fu Y., Tai C, Huang H. Two-stage utilization of corn straw by Rhizopus oryzae for fumaric acid production // Bioresource technology. - 2010. - T. 101. - №. 15. - C. 6262-6264. C=Rodriguez -
К недостаткам прототипа относятся низкие значения показателей процесса:The disadvantages of the prototype include low values of process indicators:
- продуктивности процесса - до 0,73 г/л/ч;- process productivity - up to 0.73 g / l / h;
- конечной концентрации продукта на стадии биосинтеза - до 35 г/л;- the final concentration of the product at the stage of biosynthesis - up to 35 g / l;
- степени конверсии единицы субстрата в продукт - до 0,35 гФК/г сух. субстрата;- the degree of conversion of a unit of substrate into a product - up to 0.35 gFK / g dry. substrate;
- длительности эффективного использования биокатализаторов в процессе получения ФК - до 480 ч;- the duration of the effective use of biocatalysts in the process of obtaining FA - up to 480 h;
- длительности проведения стадии механической и ферментативной предобработки сырья - до 48 ч.- the duration of the stage of mechanical and enzymatic pretreatment of raw materials - up to 48 hours.
Техническая задача, на решение которой направлено данное изобретение, является способ сбраживания гидролизатов топинамбура с последующим получением фумаровой кислоты, включающий механическую и ферментативную предобработку растительной биомассы топинамбура и последующую биотрансформацию гидролизатов в фумаровую кислоту под действием грибного иммобилизованного биокатализатора.The technical problem to be solved by the present invention is a method for fermentation of Jerusalem artichoke hydrolysates with subsequent production of fumaric acid, including mechanical and enzymatic pretreatment of Jerusalem artichoke plant biomass and subsequent biotransformation of hydrolysates into fumaric acid under the action of an immobilized fungal biocatalyst.
В заявляемом техническом решении ферментативная обработка биомассы топинамбура ведется лиофилизованной культуральной жидкостью грибного штамма Penicillium verruculosum PVERINU18 BКПMF-1291, в которой присутствует гетерологичная экзоинулиназная активность для специфического расщепления инулинсодержащего биополимера клубневой биомассы топинамбура и комплекс ферментов для расщепления целлюлозы и гемицеллюлозы вегетативной части топинамбура [Рекомбинантный штамм (варианты) мицелиального гриба Penicillium verruculosum и способ получения ферментного препарата с его использованием (Патент RU 2646136 01.03.2018)].In the claimed technical solution, the enzymatic treatment of Jerusalem artichoke biomass is carried out with lyophilized culture liquid of the fungal strain Penicillium verruculosum PVERINU18 BKPMF-1291, in which there is a heterologous exoinulinase activity for the specific cleavage of inulin-containing biopolymer of tuberous plant biomass and heme biopolymer of biomass biomass and biomass variants) of the filamentous fungus Penicillium verruculosum and a method for producing an enzyme preparation using it (Patent RU 2646136 03/01/2018)].
Технический результат состоит в том, что способ обеспечивает сокращение длительности стадии ферментативной предобработки, повышение показателей продуктивности процесса и конечной концентрации продукта на стадии биоконверсии гидролизатов биомассы топинамбура в фумаровую кислоту, повышение удельного выхода фумаровой кислоты на единицу субстрата, а также увеличение длительности эффективного использования грибного биокатализатора. Изобретение может быть использовано в пищевой, косметической фармацевтической промышленности, агропромышленном комплексе, в производстве биоразлагаемых полимеров.The technical result consists in the fact that the method provides a reduction in the duration of the enzymatic pretreatment stage, an increase in the productivity of the process and the final concentration of the product at the stage of bioconversion of Jerusalem artichoke biomass hydrolysates into fumaric acid, an increase in the specific yield of fumaric acid per unit of substrate, as well as an increase in the duration of the effective use of the mushroom biocatalyst ... The invention can be used in the food, cosmetic pharmaceutical industry, agro-industrial complex, in the production of biodegradable polymers.
Преимуществом предлагаемого изобретения является повышение конечной концентрации продукта на стадии биосинтеза и степени конверсии единицы субстрата, а также снижение длительности стадии предобработки исходного сырья и увеличение длительности эффективного использования единицы биокатализатора, что в совокупности косвенно свидетельствует о снижении себестоимости единицы продукта.The advantage of the invention is an increase in the final concentration of the product at the stage of biosynthesis and the degree of conversion of a unit of substrate, as well as a decrease in the duration of the stage of pretreatment of the feedstock and an increase in the duration of effective use of a unit of biocatalyst, which together indirectly indicates a decrease in the cost of a unit of a product.
Сущность изобретения заключается в получении гидролизатов топинамбура путем их предварительного измельчения на волчке до размера частиц 20÷80 мкм, проведением ферментативной обработки в присутствии смеси гидролитических ферментов ферментным препаратом на основе грибного штамма Penicillium verruculosum PVERINU18 ВКПМ F-1291 в течение 3 ч при 50±5°С. Затем температуру среды снижают до 31±3°С и инициируют 42÷110 часовой процесс получения фумаровой кислоты введением в среду гранул криогеля поливинилового спирта (10% по объему), содержащих иммобилизованные клетки гриба Rhizopus oryzae.The essence of the invention lies in the production of Jerusalem artichoke hydrolysates by their preliminary grinding on a top to a particle size of 20 ÷ 80 μm, carrying out enzymatic treatment in the presence of a mixture of hydrolytic enzymes with an enzyme preparation based on the fungal strain Penicillium verruculosum PVERINU18 VKPM F-1291 for 3 hours at 50 ± 5 ° C. Then the temperature of the medium is reduced to 31 ± 3 ° C and the 42 ÷ 110 hour process of obtaining fumaric acid is initiated by introducing polyvinyl alcohol cryogel granules (10% by volume) containing immobilized cells of the fungus Rhizopus oryzae into the medium.
Указанный технический результат достигается в результате реализации следующих необходимых условий, выявленных экспериментально: использование в качестве растительного возобновляемого сырья измельченной биомассы клубней топинамбура, предобработанных в две стадии, в которых за предварительной инкубацией биомассы клубней топинамбура в 0,1 М натрий-ацетатном буфере с последующим доведение рН среды до 5,0 1М соляной кислотой следует дальнейшая ферментативная обработка под действием ферментного препарата рекомбинантного штамма мицелиального гриба Penicillium verruculosum PVERINU18 (ВКПМ F-1291), содержащего экзоинулиназу и базовые целлюлазы при 50°С в течение 3 ч. Последующая биотрансформация компонентов гидролизатов в фумаровую кислоту проводится под действием биокатализатора в виде иммобилизованных в криогель поливинилового спирта клеток гриба Rhizopus oryzae F1032, при этом проращивание грибных спор с целью повышения фруктокиназной (кетогексокиназной) активности грибного мицелия проводится в фруктозосодержащей питательной среде. Оказалось, что такое, ранее неизвестное, сочетание технологических операций, позволяет достигать лучших, чем у прототипа, конечных характеристик процесса.The specified technical result is achieved as a result of the implementation of the following necessary conditions identified experimentally: the use of crushed Jerusalem artichoke tubers biomass as a plant renewable raw material, pretreated in two stages, in which, after preliminary incubation of Jerusalem artichoke tubers biomass in 0.1 M sodium acetate buffer, followed by adding The pH of the medium is up to 5.0 with 1M hydrochloric acid, followed by further enzymatic treatment under the action of an enzyme preparation of the recombinant strain of the filamentous fungus Penicillium verruculosum PVERINU18 (VKPM F-1291), containing exoinulinase and basic cellulases at 50 ° C for 3 hours. Subsequent biotransformation of the components of hydrolysis fumaric acid is carried out under the action of a biocatalyst in the form of cells of the fungus Rhizopus oryzae F1032 immobilized in a cryogel of polyvinyl alcohol, while germination of fungal spores in order to increase the fructokinase (ketohexokinase) activity of the fungal mycelium is carried out I'm in a fructose nutrient medium. It turned out that such a previously unknown combination of technological operations makes it possible to achieve better than that of the prototype, the final characteristics of the process.
В заявляемом техническом решении, как и в прототипе, проводят измельчение и предварительную ферментативную предобработку растительного сырья. Это необходимо для снижения показателя вязкости среды и накопления в среде начальной концентрации сахаров, обеспечивающей условия, необходимые для начала функционирования клеток грибного биокатализатора в нужном направлении - биоконверсии сахаров, в частности фруктозы и глюкозы, в фумаровую кислоту. В случае высокой вязкости среды, сопровождающейся снижением степени аэрации клеток, отсутствии в среде углеводов и введения в нее клеток гриба Rhizopus oryzae последние оказываются лимитированы по наличию в среде биодоступного субстрата и кислорода, будучи склонными к изменению направления биокаталитического действия в неблагоприятных условиях культивирования, клетки переходят из активного метаболического состояния - биоконверсии компонентов среды в фумаровой кислоты, к сдвигу метаболических процессов в сторону образования другого продукта - этанола. Таким образом, перед внесением клеток в среду с растительным сырьем и ферментами, необходимо обеспечить наличие в среде субстрата и доступ кислорода для клеток. С этой целью проводят предварительную предобработку сырья в присутствии смеси ферментов при температуре 50°С, являющейся оптимальной для действия ферментов.In the claimed technical solution, as in the prototype, grinding and preliminary enzymatic pretreatment of plant raw materials are carried out. This is necessary to reduce the viscosity of the medium and accumulate the initial concentration of sugars in the medium, which provides the conditions necessary for the cells of the fungal biocatalyst to start functioning in the desired direction - the bioconversion of sugars, in particular fructose and glucose, into fumaric acid. In the case of a high viscosity of the medium, accompanied by a decrease in the degree of cell aeration, the absence of carbohydrates in the medium and the introduction of cells of the fungus Rhizopus oryzae into it, the latter are limited in the presence of a bioavailable substrate and oxygen in the medium, being prone to change the direction of biocatalytic action under unfavorable cultivation conditions, the cells move from an active metabolic state - bioconversion of medium components into fumaric acid, to a shift in metabolic processes towards the formation of another product - ethanol. Thus, before introducing cells into a medium with plant materials and enzymes, it is necessary to ensure the presence of a substrate in the medium and access to oxygen for the cells. For this purpose, preliminary preprocessing of raw materials is carried out in the presence of a mixture of enzymes at a temperature of 50 ° C, which is optimal for the action of enzymes.
В отличие от прототипа в заявляемом техническом решении в качестве растительного сырья используется биомасса клубней топинамбура и предназначенные для гидролиза инулинсодержащего сырья ферментные препараты рекомбинантных штаммов мицелиального гриба Penicillium verruculosum, содержащих экзо-, эндоинулиназы и целлюлазы, в частности, ферментный препарат на основе грибного штамма Penicillium verruculosum PVERINU18 BКПMF-1291. Ферментативную предобработку биомассы топинамбура проводят не 48 ч, а 3 ч в тех же условиях, что и в прототипе.In contrast to the prototype in the claimed technical solution, the biomass of Jerusalem artichoke tubers is used as a plant raw material and enzyme preparations of recombinant strains of the mycelial fungus Penicillium verruculosum containing exo-, endoinulinases and cellulases, in particular, an enzyme preparation based on fungal strain, intended for the hydrolysis of inulin-containing raw materials PVERINU18 BKPMF-1291. Enzymatic pretreatment of Jerusalem artichoke biomass is carried out not for 48 hours, but for 3 hours under the same conditions as in the prototype.
Снижение длительности этой стадии оказывается возможным за счет предлагаемого в заявляемом техническом решении использования биомассы топинамбура, которая предварительно инкубируется в 0,1 М натрий-ацетатном буфере в течение 1 часа при 40°С для разрыхления углеводной матрицы, что увеличивает доступ гидролитических ферментов к субстрату, с последующей доводкой рН биомассы до 5,0 путем добавления 1М соляной кислоты, что является оптимальным значением рН действия гидролитического комплекса ферментов. Использование ферментативных препаратов, более эффективных с точки зрения эффективности трансформации крупных полимерных молекул инулинсодержащего сырья до углеводов менее сложного строения, в том числе фруктозы и глюкозы, также способствует повышению эффективности получения сбраживаемых сахаров как базиса для микробиологической конверсии их в фумаровую кислоту. Длительность предварительной ферментативной обработки сырья в заявляемом способе определяется только гидролизуемой частью биомассы топинамбура (вегетативная - листья, стебли - 6 ч, или подземная - клубни - 3 ч). Состав ферментов в используемом ферментном препарате в заявляемом техническом решении, отличается от прототипа тем, что помимо целлюлаз, включает экзоинулиназу. Использование данного ферментного препарата позволяет осуществлять более глубокую и быструю предобработку биомассы топинамбура.Reducing the duration of this stage is possible due to the proposed in the claimed technical solution use of Jerusalem artichoke biomass, which is pre-incubated in 0.1 M sodium acetate buffer for 1 hour at 40 ° C to loosen the carbohydrate matrix, which increases the access of hydrolytic enzymes to the substrate, followed by adjusting the biomass pH to 5.0 by adding 1M hydrochloric acid, which is the optimal pH value for the action of the hydrolytic enzyme complex. The use of enzymatic preparations that are more effective in terms of the efficiency of transformation of large polymer molecules of inulin-containing raw materials to carbohydrates of a less complex structure, including fructose and glucose, also contributes to an increase in the efficiency of obtaining fermentable sugars as a basis for their microbiological conversion into fumaric acid. The duration of preliminary enzymatic processing of raw materials in the claimed method is determined only by the hydrolyzable part of the Jerusalem artichoke biomass (vegetative - leaves, stems - 6 hours, or underground - tubers - 3 hours). The composition of enzymes in the used enzyme preparation in the claimed technical solution differs from the prototype in that, in addition to cellulases, it includes exoinulinase. The use of this enzyme preparation allows for a deeper and faster preprocessing of Jerusalem artichoke biomass.
В заявляемом техническом решении, как и в прототипе, в среду, содержащую гидролизат топинамбура (частично предобработанное возобновляемое растительное сырье и гидролитические ферменты), вводят гранулы криогеля ПВС с иммобилизованными в них клетками грибного биокатализатора, которые предварительно формируют методом замораживания-оттаивания суспензии спор растворе ПВС. В техническом решении, как и в прототипе, используются для иммобилизации в криогель ПВС споры гриба Rhizopus oryzae F1032. Для формирования гранул нужной формы и размера готовят суспензию спор в растворе полимера, распределяют полученную суспензию в виде аликвот в емкости нужной формы и размера, которые далее помещают в морозильную камеру при -20°С, замораживают, выдерживают при этой температуре в течение 24 ч и размораживают при +8°С. Полученные в результате такой операции гранулы с иммобилизованными в криогель ПВС спорами помещают в питательную среду и проращивают их для получения иммобилизованного мицелия, который далее погружают в ферментолизаты растительного сырья и используют для биотрансформации компонентов в фумаровую кислоту. В отличие от прототипа, в заявляемом техническом решении в ходе проращивания мицелия используют питательную среду, повышающую фруктокиназную (кетогексокиназную) активность иммобилизованных клеток, и содержащую фруктозу в концентрации 50-80 г/л.In the claimed technical solution, as in the prototype, in an environment containing Jerusalem artichoke hydrolyzate (partially pretreated renewable plant material and hydrolytic enzymes), granules of PVA cryogel with immobilized cells of the fungal biocatalyst are introduced into them, which are preliminarily formed by freezing-thawing a suspension of spores in a PVA solution ... In the technical solution, as in the prototype, spores of the fungus Rhizopus oryzae F1032 are used for immobilization in the PVA cryogel. To form granules of the desired shape and size, a spore suspension is prepared in a polymer solution, the resulting suspension is distributed in the form of aliquots in a container of the desired shape and size, which are then placed in a freezer at -20 ° C, frozen, kept at this temperature for 24 hours and defrost at + 8 ° C. The resulting granules with spores immobilized in PVA cryogel are placed in a nutrient medium and germinated to obtain an immobilized mycelium, which is then immersed in fermentolysates of plant raw materials and used for biotransformation of components into fumaric acid. Unlike the prototype, in the claimed technical solution during the germination of the mycelium, a nutrient medium is used that increases the fructokinase (ketohexokinase) activity of immobilized cells and contains fructose at a concentration of 50-80 g / l.
Гранулы с иммобилизованными клетками гриба помещают, как и в прототипе, в той же концентрации в среду с предобработанной смесью ферментов растительной биомассой, которую предварительно охлаждают до 32°С.Granules with immobilized fungal cells are placed, as in the prototype, in the same concentration in a medium with a pretreated mixture of enzymes with plant biomass, which is pre-cooled to 32 ° C.
При той же длительности процесса, что и в прототипе (48 ч), заявляемое техническое решение позволяет улучшить технологические показатели процесса, в частности, поднять конечную концентрацию фумаровой кислоты, накапливающуюся в среде на стадии биосинтеза, и продуктивность процесса биосинтеза на 15-23% в зависимости от частей топинамбура, используемых в качестве сырья (см. Примеры).With the same duration of the process as in the prototype (48 hours), the claimed technical solution allows to improve the technological parameters of the process, in particular, to raise the final concentration of fumaric acid accumulating in the medium at the stage of biosynthesis, and the productivity of the biosynthesis process by 15-23% in depending on the parts of Jerusalem artichoke used as raw materials (see Examples).
Заявляемое техническое решение, обеспечивающее создание для грибного биокатализатора более эффективных условий его использования для получения фумаровой кислоты, обеспечивает возможность более длительного использования биокатализатора в периодических условиях (до 576-720 ч), чем в прототипе (до 480 ч).The claimed technical solution, which ensures the creation of more efficient conditions for its use for the production of fumaric acid for the fungal biocatalyst, provides the possibility of a longer use of the biocatalyst under periodic conditions (up to 576-720 hours) than in the prototype (up to 480 hours).
К условиям, позволяющим получить такой результат, относится использование в качестве исходного растительного сырья предобработанной биомассы топинамбура, и проведение ферментативной предобработки сырья с помощью ферментного препарата рекомбинантного штамма мицелиального гриба Penicillium verruculosum PVERINU18, содержащего экзоинулиназу и целлюлазы, а также использование на стадии биосинтеза фумаровой кислоты иммобилизованного грибного биокатализатора с высокой фруктокиназной (кетогексокиназную) активностью, активированной за счет проращивания спор в фруктозосодержащей питательной среде. Использование топинамбура в качестве исходного растительного сырья и биокатализатора с высокой фруктокиназной (кетогексокиназной) активностью позволяют по сравнению с прототипом сократить процесс биосинтеза минимум на 1 стадию (Схема 1), так как процесс биоконверсии фруктозы в фумаровую кислоту на 1 стадию короче, чем гликолиз.The conditions allowing to obtain such a result include the use of pretreated Jerusalem artichoke biomass as the initial plant raw material, and the enzymatic preprocessing of the raw material using an enzyme preparation of the recombinant strain of the mycelial fungus Penicillium verruculosum PVERINU18, containing exoinulinase and cellulase, as well as the use of fumaric acid fumaric acid at the stage of biosynthesis. fungal biocatalyst with high fructokinase (ketohexokinase) activity, activated by germination of spores in a fructose-containing nutrient medium. The use of Jerusalem artichoke as a starting plant material and a biocatalyst with high fructokinase (ketohexokinase) activity allows, in comparison with the prototype, to reduce the biosynthesis process by at least 1 stage (Scheme 1), since the process of bioconversion of fructose into fumaric acid is 1 stage shorter than glycolysis.
Таким образом, в результате выполнения предлагаемой последовательности действий при заявляемых условиях реализуется биотехнологический способ сбраживания гидролизатов топинамбура с последующим получением фумаровой кислоты путем биоконверсии компонентов гидролизатов под действием иммобилизованных в криогель поливинилового спирта клеток гриба Rhizopus oryzae, в котором, в сравнении с прототипом:Thus, as a result of the implementation of the proposed sequence of actions under the stated conditions, a biotechnological method of fermentation of Jerusalem artichoke hydrolysates is implemented, followed by the production of fumaric acid by bioconversion of hydrolysate components under the action of cells of the fungus Rhizopus oryzae immobilized in a cryogel of polyvinyl alcohol, in which, in comparison with the prototype:
1. Сокращена длительность ферментативной предобработки биомассы растительного сырья с 48 ч до 4 ч за счет использования измельченной биомассы топинамбура и ферментного препарата на основе рекомбинантного штамма мицелиального гриба Penicillium verruculosum PVERINU18 BКПMF-1291, содержащего экзо-, эндоинулиназы и целлюлазы;1. The duration of enzymatic preprocessing of plant raw material biomass was reduced from 48 hours to 4 hours due to the use of crushed Jerusalem artichoke biomass and an enzyme preparation based on the recombinant strain of the mycelial fungus Penicillium verruculosum PVERINU18 BKPMF-1291, containing exo-, endoinulinase and cellulase;
2. Улучшены показатели процесса: продуктивности, конечной концентрации фумаровой кислоты, степени конверсии единицы субстрата в продукт, длительности эффективного использования грибного биокатализатора за счет оптимизированного состава ферментолизатов и использования биокатализатора в виде иммобилизованного грибного мицелия с повышенной фруктокиназную (кетогексокиназную) активностью.2. Improved process indicators: productivity, final concentration of fumaric acid, degree of conversion of a unit of substrate into a product, duration of effective use of the fungal biocatalyst due to the optimized composition of fermentolysates and the use of a biocatalyst in the form of immobilized fungal mycelium with increased fructokinase (ketohexokinase) activity.
Достижение в виде увеличенного срока эффективного использования иммобилизованных клеток на 20% и выше, отличающее заявляемое техническое решение от прототипа, позволяет решить важную экологическую и экономическую проблему, связанную с необходимостью утилизации отработанных иммобилизованных биокатализаторов за счет их более длительного использования.Achievement in the form of an increased effective use of immobilized cells by 20% or more, which distinguishes the claimed technical solution from the prototype, allows solving an important ecological and economic problem associated with the need to dispose of spent immobilized biocatalysts due to their longer use.
Контроль накопления метаболитов в среде осуществляют известными методами (хроматографическими и спектрофотометрическими) с привлечением стандартного аналитического оборудования.The accumulation of metabolites in the medium is controlled by known methods (chromatographic and spectrophotometric) using standard analytical equipment.
Приведенные примеры не охватывают все возможные варианты реализации заявляемого Технического решения для получения фумаровой кислоты, но всегда включают 2 основные стадии: предобработка биомассы топинамбура при использовании ферментных препаратов рекомбинантных штаммов мицелиального гриба Penicillium verruculosum с получением гидролизатов и последующая биоконверсия компонентов гидролизатов в фумаровую кислоту при использовании иммобилизованных в криогель поливинилового спирта клеток гриба Rhizopus oryzae F1032.The examples given do not cover all possible options for the implementation of the proposed Technical solution for the production of fumaric acid, but always include 2 main stages: pretreatment of Jerusalem artichoke biomass using enzyme preparations of recombinant strains of mycelial fungus Penicillium verruculosum with obtaining hydrolysates and subsequent bioconversion of hydrolyzate components into fumaric acid into the cryogel of polyvinyl alcohol cells of the fungus Rhizopus oryzae F1032.
Грибной биокатализатор может быть многократно использован в длительном биотехнологическом периодическом процессе. Так, например, после завершения одного рабочего цикла на стадии биосинтеза, среду, содержащую фумаровую кислоту, сливают через сетчатый фильтр, установленный в ферментере традиционной конфигурации, далее ее используют для выделения конечного продукта, а в ферментер вносят свежую порцию ферментолизатов, и осуществляют следующий рабочий цикл с использованием того же иммобилизованного грибного биокатализатора в тех же условиях.The fungal biocatalyst can be reused in a long-term biotechnological batch process. So, for example, after the completion of one working cycle at the biosynthesis stage, the medium containing fumaric acid is drained through a mesh filter installed in a fermenter of traditional configuration, then it is used to isolate the final product, and a fresh portion of fermentolysates is introduced into the fermenter, and the following working is carried out. cycle using the same immobilized fungal biocatalyst under the same conditions.
Таким образом, заявляемый Способ обеспечивает получение технического результата, который, в сравнении с прототипом, состоит в улучшении показателей процесса получения фумаровой кислоты из растительного сырья: сокращении длительности ферментативной предобработки сырья как минимум в 4 раза, увеличении продуктивности процесса на стадии биосинтеза, увеличении конечной концентрации фумаровой кислоты, получаемой за один цикл в периодическом процессе до 23%, увеличение степени конверсии единицы субстрата в фумаровоую кислоту до 43%, увеличении длительности эффективного использования грибного биокатализатора на стадии биосинтеза более чем в 1,6 раз.Thus, the claimed Method provides a technical result, which, in comparison with the prototype, consists in improving the performance of the process of obtaining fumaric acid from plant raw materials: reducing the duration of the enzymatic pretreatment of raw materials at least 4 times, increasing the productivity of the process at the biosynthesis stage, increasing the final concentration fumaric acid obtained in one cycle in a batch process up to 23%, an increase in the degree of conversion of a substrate unit into fumaric acid up to 43%, an increase in the duration of effective use of the fungal biocatalyst at the biosynthesis stage by more than 1.6 times.
Следует отметить, что углеводный состав различных частей топинамбура неодинаков, так, в клубнях углеводы составляют 78±2% от сухого вещества, в зеленой части - 20±1% [М.А. ЯЩУК, Е.В. СОЛОВЬЕВА ТОПИНАМБУР - СЫРЬЕ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА КОМБИКОРМОВ // ИЗВЕСТИЯ ВУЗОВ. ПИЩЕВАЯ ТЕХНОЛОГИЯ, №4, 2007. 57-58]. Согласно биохимическим реакциям, которые сопровождают процесс биотрансформации углеводов в фумаровую кислоту под действием клеток грибного биокатализатора, максимальное значение теоретически возможной степени конверсии единицы глюкозы в фумаровую кислоту составляет 0,63. Таким образом, кажущиеся на первый взгляд незначительными улучшения технических результатов, достигаемые при реализации заявляемого способа получения фумаровой кислоты по сравнению с прототипом, являются существенными, так как обеспечивают как минимум 70%-ную степень конверсии углеводов, содержащихся в исходном растительном сырье, в фумаровую кислоту от теоретически возможного уровня.It should be noted that the carbohydrate composition of various parts of Jerusalem artichoke is not the same, so, in the tubers carbohydrates are 78 ± 2% of dry matter, in the green part - 20 ± 1% [M.A. YASHCHUK, E.V. SOLOVIEVA TOPINAMBUR - RAW MATERIALS FOR THE PRODUCTION OF FODDER // Izvestia VUZOV. FOOD TECHNOLOGY, No. 4, 2007. 57-58]. According to the biochemical reactions that accompany the process of biotransformation of carbohydrates into fumaric acid under the action of the cells of the fungal biocatalyst, the maximum value of the theoretically possible degree of conversion of a unit of glucose into fumaric acid is 0.63. Thus, seemingly insignificant improvements in technical results achieved when implementing the proposed method for producing fumaric acid in comparison with the prototype are significant, since they provide at least a 70% degree of conversion of carbohydrates contained in the original plant material into fumaric acid from the theoretically possible level.
Краткое описание чертежейBrief Description of Drawings
Рис. 1. Биохимические стадии получения фумаровой кислоты из простых сахаров.Fig. 1. Biochemical stages of obtaining fumaric acid from simple sugars.
Рис. 2. Состав гидролизатов измельченных клубней топинамбура под действием ферментного препарата Penicillium verruculosum PVERINU18 в различных дозировках. Дозирование ферментного препарата по белку: 1-5 мг/г сухого веса субстрата, 2-10 мг/г сухого веса субстрата. Время реакции - 3 ч, 50°С, рН 5,0 (без дополнительного внесения буфера). Концентрация субстрата - 100 г/л.Fig. 2. Composition of hydrolysates of crushed Jerusalem artichoke tubers under the action of the enzyme preparation Penicillium verruculosum PVERINU18 in various dosages. Dosing of the enzyme preparation by protein: 1-5 mg / g dry weight of the substrate, 2-10 mg / g dry weight of the substrate. Reaction time - 3 h, 50 ° C, pH 5.0 (without additional buffer addition). Substrate concentration - 100 g / l.
Ниже приводятся конкретные примеры, иллюстрирующие заявляемое техническое решение.Below are specific examples illustrating the claimed technical solution.
В Таблице 1 приведены примеры возможной реализации заявляемого Способа сбраживания гидролизатов топинамбура с последующим получением фумаровой кислоты при использовании ферментных препаратов рекомбинантных штаммов мицелиального гриба Penicillium verruculosum PVERINU18 и биокатализатора в виде иммобилизованных в криогель поливинилового спирта клеток гриба Rhizopus oryzae F1032.Table 1 shows examples of possible implementation of the proposed Method for fermentation of Jerusalem artichoke hydrolysates with subsequent production of fumaric acid using enzyme preparations of recombinant strains of the filamentous fungus Penicillium verruculosum PVERINU18 and a biocatalyst in the form of cells of the fungus Ryheza10.
Пример 1. Получение гидролизатов топинамбура.Example 1. Obtaining hydrolysates of Jerusalem artichoke.
Эксперимент проводили в термостатируемой при заданной температуре ячейке, помещенной в шейкер "INNOVA 40 Thermo Shaker" (США). На первой стадии, в сухую, чистую тару объемом 50 мл помещают измельченную биомассу топинамбура и добавляют 1 М натрий-ацетатный буфер рН 5,0 так, чтобы конечная концентрация субстрата составила 100 г/л в пересчете на сухой вес субстрата, и концентрация буфера в смеси составила 0,1 М. Эксперимент проводили при постоянном перемешивании (250 об/мин). Через час инкубации при 40°С в образце определяли рН и доводили его до рН 5,0 раствором 1М соляной кислоты.The experiment was carried out in a thermostatted cell at a given temperature, placed in an
На следующей стадии проводили гидролиз под действием ферментного препарата инулиназ и целлюлаз Penicillium verruculosum PVERINU18 при 50°С. Для этого в реактор, содержащий подготовленную биомассу топинамбура, загружают ферментный препарат из расчета 5 и 10 мг белка ферментного препарата/г субстрата в пересчете на сухой вес субстрата. Гидролиз проводят в течение 3 часов, рН 5,0. По окончании процесса гидролизат отделяют от негидролизованной биомассы с помощью пресса. Состав продуктов определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Основными продуктами гидролиза клубней топинамбура являлись фруктоза, с небольшим выходом глюкозы.At the next stage, hydrolysis was carried out under the action of an enzyme preparation of inulinases and cellulases Penicillium verruculosum PVERINU18 at 50 ° C. To do this, an enzyme preparation is loaded into the reactor containing the prepared Jerusalem artichoke biomass at the rate of 5 and 10 mg of the enzyme preparation protein / g of the substrate in terms of the dry weight of the substrate. The hydrolysis is carried out for 3 hours, pH 5.0. At the end of the process, the hydrolyzate is separated from the non-hydrolyzed biomass using a press. The composition of the products was determined by high performance liquid chromatography. The main products of hydrolysis of Jerusalem artichoke tubers were fructose, with a small yield of glucose.
Состав гидролизатов измельченных клубней топинамбура под действием ферментного препарата Penicillium verruculosum PVERINU18 в различных дозировках представлен на рисунке 1.The composition of hydrolysates of crushed Jerusalem artichoke tubers under the action of the enzyme preparation Penicillium verruculosum PVERINU18 in various dosages is shown in Figure 1.
Пример 2. Способ получения фумаровой кислоты путем сбраживания (биоконверсии) гидролизатов топинамбура сорта Скороспелка в фумаровую кислоту под действием иммобилизованных в криогель ПВС клеток гриба Rhizopus oryzae 1032Example 2. A method of obtaining fumaric acid by fermentation (bioconversion) of Jerusalem artichoke hydrolysates of the Skorospelka variety into fumaric acid under the action of cells of the fungus Rhizopus oryzae 1032 immobilized in a PVA cryogel
Получают иммобилизованные в криогель ПВС споры мицелиального гриба R. oryzae F-1032. Для иммобилизации используют предварительно простерилизованный при 0,5 атм 12%-ый раствор ПВС в водопроводной воде. Суспензию спор, в физиологическом растворе смешивают с раствором ПВС так, чтобы ее содержание составляло 10% в итоговой смеси. Полученную суспензию спор мицелиального гриба R. oryzae F-1032 в растворе полимера заливают в дозирующее устройство и разливают в приемные устройства, которые далее охлаждают до -20°С в морозильной камере и выдерживают в замороженном состоянии не менее 16 ч. Гранулы с иммобилизованными в криогеле поливинилового спирта спорами размораживают при +8°С в течение 3-4 ч. Далее осуществляют проращивание спор путем погружения гранул в питательную среду, содержащую 70 г/л фруктозы, при 28°С в аэробных условиях в течение 48 ч. Сформированный иммобилизованный мицелий отделяют от культуральной жидкости фильтрованием.Spores of filamentous fungus R. oryzae F-1032 immobilized in PVA cryogel are obtained. For immobilization, a 12% PVA solution in tap water pre-sterilized at 0.5 atm is used. A spore suspension in saline is mixed with a PVA solution so that its content is 10% in the final mixture. The resulting suspension of spores of the filamentous fungus R. oryzae F-1032 in a polymer solution is poured into a dosing device and poured into receiving devices, which are then cooled to -20 ° C in a freezer and kept frozen for at least 16 hours. Granules with immobilized in cryogel polyvinyl alcohol spores are thawed at + 8 ° C for 3-4 hours. Then the spores are germinated by immersing the granules in a nutrient medium containing 70 g / l of fructose at 28 ° C under aerobic conditions for 48 hours. The formed immobilized mycelium is separated from the culture liquid by filtration.
Получение фумаровой кислоты осуществляется под действием иммобилизованных клеток мицелиального гриба в концентрации 65 г сух. в-в/л в аэробном реакторе с рабочим объемом 1 л, заполненным гидролизатом клубней топинамбура в количестве 0,3 л, полученном по примеру 1. При необходимости гидролизат предварительно разбавляют дистиллированной водой до достижения значения исходной концентрации восстанавливающих сахаров 70-100 г/л.The production of fumaric acid is carried out under the action of immobilized filamentous fungus cells at a concentration of 65 g dry. i-v / l in an aerobic reactor with a working volume of 1 l filled with a hydrolyzate of Jerusalem artichoke tubers in an amount of 0.3 l, obtained according to example 1. If necessary, the hydrolyzate is preliminarily diluted with distilled water until the initial concentration of reducing sugars reaches 70-100 g / l ...
Культивирование проводят аэробно при 32°С и перемешивании 200 об/мин в течение 48 ч. После завершения процесса жидкую фазу, содержащую фумаровую кислоту, отделяют от грибного биокатализатора и осадка фильтрованием. Гранулы грибного иммобилизованного биокатализатора и некоторые частицы субстрата в виде осадка оставляют в реакторе. Далее к нему добавляют новую порцию ферментолизата, и стадию биосинтеза получения фумаровой кислоты повторяют.The cultivation is carried out aerobically at 32 ° C and stirring at 200 rpm for 48 hours. After the completion of the process, the liquid phase containing fumaric acid is separated from the fungal biocatalyst and the sediment by filtration. The granules of the fungal immobilized biocatalyst and some of the substrate particles are left in the reactor in the form of a precipitate. Then a new portion of the fermentolysate is added to it, and the biosynthesis step for obtaining fumaric acid is repeated.
Конечная концентрация фумаровой кислоты и продуктивность процесса на стадии биосинтеза составляет- 43 г/л и 0,9 г/л/ч, что превышает уровень прототипа на 23%. Общая длительность последовательного использования грибного мицелия, иммобилизованного в криогель поливинилового спирта, в указанных условиях при периодическом режиме проведения процесса с использованием клубней топинамбура в качестве исходного сырья составляет 720 ч, что в 1,5 раза превосходит аналогичную характеристику прототипа.The final concentration of fumaric acid and the productivity of the process at the stage of biosynthesis is 43 g / l and 0.9 g / l / h, which exceeds the level of the prototype by 23%. The total duration of the sequential use of mushroom mycelium, immobilized in polyvinyl alcohol cryogel, under these conditions with a periodic mode of the process using Jerusalem artichoke tubers as a raw material is 720 hours, which is 1.5 times higher than the similar characteristic of the prototype.
Отделенную из рабочего реактора жидкую фазу, содержащую фумаровую кислоту, подтитровывают 1 М NaOH до рН 7÷8 и направляют на колонну АОН с анионообменным носителем АВ-17-8-чс.The liquid phase separated from the working reactor, containing fumaric acid, is titrated with 1 M NaOH to pH 7-8 and sent to the AOH column with anion-exchange carrier AV-17-8-chs.
Перед проведением процедуры очистки и выделения фумаровой кислоты готовят раствор элюента, содержащий 1 М NaCl. Перед помещением в колонну анионит АВ-17-8-чс два раза промывают двумя объемами дистиллированной воды, после чего его оставляют набухать в двух объемах 1 М раствора NaOH в течение 15-20 ч. Через 15-20 ч раствор щелочи заменяют на аналогичный и смесь интенсивно перемешивают. После такой обработки носитель промывают два раза двумя объемами дистиллированной воды. Для загрузки колонны анионитом к нему добавляют равный объем дистиллированной воды и полученную смесь заливают в колонну. Лишнее количество дистиллированной воды сливают.Before carrying out the procedure for purification and isolation of fumaric acid, an eluent solution containing 1 M NaCl is prepared. Before being placed in the column, the AB-17-8-chs anionite is washed twice with two volumes of distilled water, after which it is left to swell in two volumes of 1 M NaOH solution for 15-20 hours. After 15-20 hours, the alkali solution is replaced with a similar one and the mixture is vigorously stirred. After this treatment, the support is washed twice with two volumes of distilled water. To load the column with anion exchanger, an equal volume of distilled water is added to it and the resulting mixture is poured into the column. The excess amount of distilled water is drained off.
Фильтрат культуральной жидкости пропускают через колонну со скоростью 0,03 м/ч, после чего промывают колонну двумя объемами дистиллированной воды с той же скоростью. В элюате ферментативным способом определяют количество фумаровой кислоты. Затем через колонну пропускают два объема раствора элюента со скоростью 0,03-0,60 м/ч. После элюирования фумаровой кислоты через колонну пропускают два объема дистиллированной воды. Каждые 10 циклов через колонну также пропускают один объем 1 М NaOH или два объема 0,5 М, после чего промывают колонну двумя объемами дистиллированной воды.The culture liquid filtrate is passed through the column at a speed of 0.03 m / h, after which the column is washed with two volumes of distilled water at the same speed. In the eluate, the amount of fumaric acid is determined by an enzymatic method. Then, two volumes of the eluent solution are passed through the column at a rate of 0.03-0.60 m / h. After elution of the fumaric acid, two volumes of distilled water are passed through the column. Every 10 cycles, one volume of 1 M NaOH or two volumes of 0.5 M is also passed through the column, after which the column is washed with two volumes of distilled water.
Полученный раствор фумаровой кислоты подкисляют 0,1 М HCl и выдерживают при 4°С в течение 24 ч, а затем фильтруют. Полученную кристаллическую форму фумаровой кислоты сушат в сушильной установке при 100-120°С.The resulting fumaric acid solution is acidified with 0.1 M HCl and kept at 4 ° C for 24 hours and then filtered. The obtained crystalline form of fumaric acid is dried in a drying unit at 100-120 ° C.
Полученный продукт - фумаровую кислоту, расфасовывают в полипропиленовые или бумажные мешки и отправляют на хранение.The resulting product, fumaric acid, is packaged in polypropylene or paper bags and sent for storage.
Получение фумаровой кислоты при использовании заявленного технического решения может также осуществляться и в других условиях, указанных в Таблице 1, аналогично тому, как это описано в Примере 1.Obtaining fumaric acid using the claimed technical solution can also be carried out under other conditions indicated in Table 1, in the same way as described in Example 1.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020116864A RU2748229C1 (en) | 2020-05-22 | 2020-05-22 | Method for producing fumaric acid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020116864A RU2748229C1 (en) | 2020-05-22 | 2020-05-22 | Method for producing fumaric acid |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2748229C1 true RU2748229C1 (en) | 2021-05-21 |
Family
ID=76033913
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020116864A RU2748229C1 (en) | 2020-05-22 | 2020-05-22 | Method for producing fumaric acid |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2748229C1 (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2646136C2 (en) * | 2015-12-02 | 2018-03-01 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" (ФИЦ Биотехнологии РАН) | Recombinant strain of mycelial fungus penicillium verruculosum (versions) and a method of producing enzyme preparation with its use (variants) |
-
2020
- 2020-05-22 RU RU2020116864A patent/RU2748229C1/en active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2646136C2 (en) * | 2015-12-02 | 2018-03-01 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" (ФИЦ Биотехнологии РАН) | Recombinant strain of mycelial fungus penicillium verruculosum (versions) and a method of producing enzyme preparation with its use (variants) |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| CAROL A., ROA ENGEL et al. Fumaric acid production by fermentation, Appl. Microbiol. Biotechnol., 2008, (78), p. 379-389. * |
| CAROL A., ROA ENGEL et al. Fumaric acid production by fermentation, Appl. Microbiol. Biotechnol., 2008, (78), p. 379-389. СЕНЬКО О.В. и др. Русурсосберегающая биотехнология получения фумаровой кислоты из возобновляемого растительного сырья, Вестник КузГТУ, 2013, N 1, с. 111-113. СТАРОВОЙТОВ В.И. и др. Топинамбур - культура многоцелевого использования, Пищевая промышленность, 2013, N 4, с. 22-25. * |
| CARTA F.S. et al. Production of fumaric acid by fermentation of enzymatic hydrolysates derived from cassava bagasse, Bioresource Technology., 1999, v. 68, N 1, p. 23-28. * |
| СЕНЬКО О.В. и др. Русурсосберегающая биотехнология получения фумаровой кислоты из возобновляемого растительного сырья, Вестник КузГТУ, 2013, N 1, с. 111-113. * |
| СТАРОВОЙТОВ В.И. и др. Топинамбур - культура многоцелевого использования, Пищевая промышленность, 2013, N 4, с. 22-25. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Singh et al. | Comparative study on ethanol production from pretreated sugarcane bagasse using immobilized Saccharomyces cerevisiae on various matrices | |
| El-Tayeb et al. | Effect of acid hydrolysis and fungal biotreatment on agro-industrial wastes for obtainment of free sugars for bioethanol production | |
| Ji et al. | Fuels and chemicals from hemicellulose sugars | |
| KR101923598B1 (en) | Processing biomass | |
| CA2739704C (en) | Process for producing a sugar solution by combined chemical and enzymatic saccharification of polysaccharide enriched biomass | |
| CA2774142C (en) | Process for the preparation of a fermentation product from lignocellulose containing material | |
| Verma et al. | Impact of process parameters and plant polysaccharide hydrolysates in cellulase production by Trichoderma reesei and Neurospora crassa under wheat bran based solid state fermentation | |
| CA2694875A1 (en) | Cellulase enzyme based method for the production of alcohol and glucose from pretreated lignocellulosic feedstock | |
| HUE026873T2 (en) | Efficient lignocellulose hydrolysis with integrated enzyme production | |
| Hong et al. | Optimization of dilute sulfuric acid pretreatment of corn stover for enhanced xylose recovery and xylitol production | |
| Ling et al. | Corncob mild alkaline pretreatment for high 2, 3-butanediol production by spent liquor recycle process | |
| JP2011152079A (en) | Saccharifying fermentation system of cellulose-based biomass | |
| Liu et al. | Production of bioethanol from Napier grass via simultaneous saccharification and co-fermentation in a modified bioreactor | |
| Blanch et al. | Sugars and chemicals from cellulose | |
| Asachi et al. | Enhanced ethanol and chitosan production from wheat straw by Mucor indicus with minimal nutrient consumption | |
| Allen et al. | Lignocelluloses: an economical and ecological resource for bio-ethanol production-a review | |
| Parameswaran | Sugarcane bagasse | |
| Hassan et al. | Simultaneous saccharification and fermentation of lactic acid from empty fruit bunch at high solids loading | |
| Tanjore et al. | A systems view of lignocellulose hydrolysis | |
| JP5278991B2 (en) | Method for producing ethanol raw material and ethanol from lignocellulosic biomass | |
| Lin et al. | Ethanol production using the whole solid-state fermented sugarcane bagasse cultivated by Trichoderma reesei RUT-C30 supplemented with commercial cellulase | |
| RU2748229C1 (en) | Method for producing fumaric acid | |
| Vázquez-Vuelvas et al. | Fungal bioprocessing of lignocellulosic materials for biorefinery | |
| JP2022140397A (en) | Improved process for second generation lactic acid production | |
| Vellaichamy et al. | Fermentation technology: a viable tool for bio-conversion of lignocellulosic biomass into value-added products |