RU2747627C1

RU2747627C1 - Recombinant pusb2-amq plasmid synthesising protein of bacillus amyloliquefaciens alpha-amylase and bacillus subtilis/pusb2-amq strain - producer of protein of bacillus amyloliquefaciens alpha-amylase

Info

Publication number: RU2747627C1
Application number: RU2020117399A
Authority: RU
Inventors: Ксения Вадимовна Старожилова; Андрей Павлович Рудометов; Дмитрий Николаевич Щербаков
Priority date: 2020-05-18
Filing date: 2020-05-18
Publication date: 2021-05-11

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: proposed is a pUSB2-AmQ plasmid. The size of the pUSB2-AmQ plasmid is 7495 base pairs. The pUSB2-AmQ plasmid is comprised of a number of structural elements. A synthetic promoter provides efficient transcription of controlled mRNA. The recombinant B. amyloliquefaciens α-amylase gene encodes a target recombinant protein. The bla sequence encodes a beta-lactamase protein. The bla sequence is a selectable marker for transformation of E. coli strains. The repB section provides replication initiation in B. subtilis strains. Chloramphenicolacetylase is a selectable marker for transformation of B. subtilis strains. The recombinant Bacillus subtilis strain WB800N/pUSB2-AmQ is obtained through transformation of the original strain by the pUSB2-AmQ plasmid. The strain provides production of α-amylase.

EFFECT: during cultivation, the Bacillus subtilis WB800N/pUSB2-AmQ strain provides synthesis of recombinant alpha-amylase of 90% of the total secreted Bacillus subtilis protein.

2 cl, 7 dwg, 5 tbl, 4 ex

Description

Изобретение относится к генетической конструкции (плазмиде), обеспечивающей синтез рекомбинантного белка - альфа-амилазы Bacillus amyloliquefaciens, предназначен для использования в пищевой (хлебобулочной), спиртовой промышленности и производстве моющих средств, и рекомбинантному штамму Bacillus subtilis - продуценту белка альфа-амилазы, который может быть использован в биотехнологии и пищевой промышленности.The invention relates to a genetic construct (plasmid) that provides the synthesis of a recombinant protein - alpha-amylase Bacillus amyloliquefaciens, intended for use in the food (bakery), alcohol industry and the production of detergents, and a recombinant strain of Bacillus subtilis - a producer of alpha-amylase protein, which can be used in biotechnology and food industry.

Альфа-амилаза – фермент, широко использующийся в промышленном масштабе с целью гидролиза крахмала для получения различных форм глюкозы и фруктозы. Альфа-амилаза является основным ферментом пищевой, спиртовой промышленности и при производстве моющих средств.Alpha-amylase is an enzyme widely used on an industrial scale to hydrolyze starch to produce various forms of glucose and fructose. Alpha-amylase is the main enzyme in the food, alcohol and detergent industries.

В хлебопекарной отрасли добавление Альфа-амилазы позволяет улучшить свойства теста. Альфа-амилазы катализируют расщепления внутренних 1,4-α-гликозидных связей в амилозе и амилопектине крахмала муки в более короткие декстрины, которые используются дрожжами в качестве питательных веществ в процессе брожения. Результатом является увеличение объема буханки, улучшение текстуры продукта и его вкусовых характеристик [1].In the bakery industry, the addition of Alpha-Amylase can improve the properties of the dough. Alpha-amylases catalyze the breakdown of the internal 1,4-α-glycosidic bonds in the amylose and amylopectin of flour starch into shorter dextrins, which are used by yeast as nutrients during fermentation. The result is an increase in the volume of the loaf, an improvement in the texture of the product and its taste characteristics [1].

В пивоварении и спиртовой промышленности применение амилаз позволяет осуществлять более глубокий ферментативный гидролиз углеводов (в частности, крахмала), тем самым полнее сбродить сусло до основного продукта - этилового спирта. В пивоварении использование ферментных препаратов позволяет экономить до 165 г ячменя при производстве каждого декалитра пива. Применение амилазы при производстве спирта дает возможность полностью отказаться от зернового солода и одновременно увеличить выход спирта из сырья на 1,5% при снижении себестоимости декалитра спирта [2].In the brewing and alcohol industry, the use of amylases allows for a deeper enzymatic hydrolysis of carbohydrates (in particular, starch), thereby more fully fermenting the wort to the main product - ethyl alcohol. In brewing, the use of enzyme preparations allows you to save up to 165 g of barley in the production of each decaliter of beer. The use of amylase in the production of alcohol makes it possible to completely abandon grain malt and at the same time increase the yield of alcohol from raw materials by 1.5% while reducing the cost of a decaliter of alcohol [2].

В производстве моющих веществ препараты альфа-амилазы используются как добавка для удаления углеводных загрязнений. Удаление крахмалосодержащих пятен с одежды и фарфора (при использовании посудомоечных машин) стало трудной задачей в домашнем хозяйстве. Даже при температуре выше 50°С крахмал практически нерастворим и его трудно удалить, и обычно встречаются остаточные крахмальные пятна. Решением этой проблемы может быть добавление препаратов амилазы к моющим средствам. Стирка белья и мытье посуды выполняются в довольно жестких, с точки зрения стабильности ферментов, условиях: высокая температура, щелочной рН и присутствие сильно окисляющихся соединений. Помимо способности противостоять этой среде, амилаза также должна быть совместима с поверхностно-активными веществами, хелатирующими кальций агентами и протеазами, присутствующими в моющем средстве.In the manufacture of detergents, alpha-amylase preparations are used as an additive to remove carbohydrate impurities. Removing starchy stains from clothes and porcelain (when using dishwashers) has become a difficult task in the household. Even at temperatures above 50 ° C, starch is practically insoluble and difficult to remove, and residual starch stains are common. The solution to this problem may be the addition of amylase preparations to detergents. Laundry and dishwashing are performed under rather harsh conditions in terms of enzyme stability: high temperature, alkaline pH and the presence of highly oxidizing compounds. In addition to being able to withstand this environment, the amylase must also be compatible with surfactants, calcium chelating agents and proteases present in the detergent.

Нативная (природная) альфа-амилаза имеет низкую активность и имеет недостаточное эффективное действие в моющих средствах, особенно если они используется на промышленных установках. Наиболее перспективными выглядят термоустойчивые амилолитические препараты. Применение таких ферментов позволяет увеличивать реакционную температуру (до 90°С), что позволяет минимизировать риск микробного загрязнения, уменьшает время реакции, что позволяет уменьшить расход энергии [3].Native (natural) alpha-amylase has low activity and has insufficient effective action in detergents, especially if they are used in industrial installations. The most promising are heat-resistant amylolytic drugs. The use of such enzymes makes it possible to increase the reaction temperature (up to 90 ° C), which minimizes the risk of microbial contamination, reduces the reaction time, which makes it possible to reduce energy consumption [3].

Привлекательной системой для получения препаратов альфа-амилазы является Bacillus subtilis. Эта система обладает преимуществами в качестве продуцента: общепризнанный безопасный статус (GRAS), легкие генетические манипуляции, использование данного организма позволяет получать рекомбинантный фермент в секретируемой форме, за счет этого снижаются расходы на выделение и очистку конечного продукта. Эффективность синтеза и секреции рекомбинантных белков в настоящее время может быть изменена в значительной степени за счет генно-инженерных манипуляций, конструирования экспрессионной кассеты, включающей последовательность промотера и сигнального пептида.Bacillus subtilis is an attractive system for preparing alpha-amylase preparations. This system has advantages as a producer: a generally recognized safe status (GRAS), easy genetic manipulation, the use of this organism allows the production of a recombinant enzyme in a secreted form, thereby reducing the cost of isolating and purifying the final product. The efficiency of synthesis and secretion of recombinant proteins at present can be changed to a large extent due to genetic engineering manipulations, construction of an expression cassette, including the sequence of the promoter and signal peptide.

Известны патентные заявки в которых описываются разработки векторов для продуцента Bacillus subtilis с целью получения ферментов: альфа-амилазы, бета-лактамазы и альфа- бета- интерферона (US 5010000, С12Р, 21/00, C12N, 15/00, 1/20, 9/86, опубл. 23.04.1991) (US 5010015, С12Р, 21/00, C12N, 15/00, 1/20, 9/86, опубл. 23.04.1991). В патенте не делают акцент на термостабильность, активность, а так же на получение большого количества белка, здесь рассматривается Bacillus subtilis, как новый продуцент этих ферментовKnown patent applications that describe the development of vectors for the producer of Bacillus subtilis in order to obtain enzymes: alpha-amylase, beta-lactamase and alpha-beta interferon (US 5010000, C12P, 21/00, C12N, 15/00, 1/20, 9/86, publ. 04/23/1991) (US 5010015, C12P, 21/00, C12N, 15/00, 1/20, 9/86, publ. 04/23/1991). The patent does not emphasize thermal stability, activity, as well as obtaining a large amount of protein, here Bacillus subtilis is considered as a new producer of these enzymes

Известны заявки на получение препарата альфа-амилазы в системе Bacillus amyloliquefaciens (RU 203689, C12N, 9/28, 15/32, 15/56,15/75, опубл. 30.11.1993) и в системе Bacillus subtilis (SU 1717633, A1, C12N, 15/18, опубл. 07.03.1992). Продуцент альфа-амилазы Bacillus amyloliquefaciens является устойчивым к фагам и позволяет получать высокий выход фермента. Альфа-амилаза полученная в системе Bacillus subtilis является конструкцией полученной из фрагментов генов альфа-амилазы Bacillus licheniformis и альфа-амилазы Bacillus amyloliquefaciens, это позволяет повысить термостабильность конечного продукта.Known applications for the preparation of alpha-amylase in the Bacillus amyloliquefaciens system (RU 203689, C12N, 9/28, 15/32, 15 / 56,15 / 75, publ. 30.11.1993) and in the Bacillus subtilis system (SU 1717633, A1 , C12N, 15/18, publ. 07.03.1992). The alpha-amylase producer of Bacillus amyloliquefaciens is resistant to phages and allows a high yield of the enzyme. The alpha-amylase obtained in the Bacillus subtilis system is a construct derived from the gene fragments of the Bacillus licheniformis alpha-amylase and the Bacillus amyloliquefaciens alpha-amylase, which makes it possible to increase the thermal stability of the final product.

Известна заявка на изобретение препарата протеазы и способ его получения (WO 91/02792, A1, C12N, 9/54, 15/57, 15/75, C11D, 3/386, опубл. 07.03.1991 г.) [6] у конечного продукта заявлена повышенная активность, устойчивость при высоких температурах и рН=7-10, а так же увеличенный выход фермента для использования в промышленности. В качестве продуцента используется культура Bacillus subtilis. Заявленные показатели достигаются за счет слияний между геном щелочной протеазы АТСС 53926 В. licheniformis и геном щелочной протеазы В. lentus, что позволяет получить ген несущий регуляторную область кодирующую сигнальный пептид, последовательность кодирующую пропептид и зрелую протеазу.Known application for the invention of a protease preparation and a method for its preparation (WO 91/02792, A1, C12N, 9/54, 15/57, 15/75, C11D, 3/386, publ. 03/07/1991) [6] the final product is declared to have increased activity, stability at high temperatures and pH = 7-10, as well as an increased yield of the enzyme for use in industry. Bacillus subtilis culture is used as a producer. The declared parameters are achieved due to fusions between the gene of the alkaline protease ATCC 53926 of B. licheniformis and the gene of the alkaline protease of B. lentus, which makes it possible to obtain a gene carrying a regulatory region encoding a signal peptide, a sequence encoding a propeptide and a mature protease.

В другом патенте (RU 2124559 С1, C12N, 15/76, 15/67, 15/66, С12Р, 21/02, опубл. 10.01.1999 г.) [5] в качестве продуцента альфа-амилазы предлагают использовать бактерии рода Streptomyces. Увеличение секреции фермента, предлагается получить за счет SAF-промотора (фактор активации вторичного метаболизма), он обладает плейотропным действием и более эффективен в экспрессии белка, чем другие известные промоторы. Разработка направлена только на повышение экспрессии белка, упуская из внимания улучшение свойств (например, термостабильность или повышение активности). В предлагаемом изобретении увеличение термостабильности и устойчивости к щелочным рН достигается за счет использования гена альфа-амилазы из Bacillus amyloliquefaciens, а повышение выхода фермента за счет использования синтетического промотера Bacillus subtilis.In another patent (RU 2124559 C1, C12N, 15/76, 15/67, 15/66, C12P, 21/02, publ. 01/10/1999) [5], bacteria of the genus Streptomyces are proposed to be used as a producer of alpha-amylase ... An increase in the secretion of the enzyme is proposed to be obtained due to the SAF-promoter (secondary metabolism activation factor), it has a pleiotropic effect and is more efficient in protein expression than other known promoters. The development is aimed only at increasing the expression of the protein, overlooking the improvement of properties (for example, thermostability or increased activity). In the present invention, an increase in thermal stability and resistance to alkaline pH is achieved through the use of the alpha-amylase gene from Bacillus amyloliquefaciens, and an increase in the yield of the enzyme through the use of a synthetic Bacillus subtilis promoter.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является заявка (RU 2661790, C2, C12N, 9/50, 15/75, 15/63, 15/62, 15/70, опубл. 19.07.2018 г.) [4] в которой предлагается экспрессионный вектор для получения различных вариантов белков, в том числе и альфа-амилазы. Предлагается несколько вариантов сигнальных пептидов для экспрессионной плазмиды, которые улучшают внеклеточную секрецию белка. Таким образом, авторы предлагают использовать в качестве продуцентов бактерии рода Bacillus или рода Actinomycetales. Так как в патенте предложена универсальная конструкция, эффективность этой конструкции для секреции амилазы может быть ограничена. Тогда как преимуществом изобретения является специализированная конструкция с «сильным» промотором и лидерной последовательностью амилазы, что обеспечивает эффективность секреции альфа-амилазы. Кроме того, предлагаемый вектор обладает высокой стабильностью при использовании в системе Bacillus.The closest analogue (prototype) is the application (RU 2661790, C2, C12N, 9/50, 15/75, 15/63, 15/62, 15/70, publ. 07/19/2018) [4] which proposes an expression vector for the production of various variants of proteins, including alpha-amylase. Several variants of signal peptides for expression plasmids have been proposed that improve extracellular protein secretion. Thus, the authors propose to use bacteria of the genus Bacillus or the genus Actinomycetales as producers. Since the patent proposes a versatile construct, the effectiveness of this construct for amylase secretion may be limited. Whereas the advantage of the invention is a specialized construct with a "strong" promoter and amylase leader sequence, which ensures the efficiency of alpha-amylase secretion. In addition, the proposed vector is highly stable when used in the Bacillus system.

Указанный технический результат достигается конструированием рекомбинантной плазмиды pUSB2-AmQ, размером 7517 пар оснований (п.о.) характеризующейся физической и генетической картой, представленной на фиг. - 3, обеспечивающей синтез рекомбинантного белка альфа-амилазы Bacillus amyloliquefaciens 55 кДа в клетках Bacillus subtilis, содержащей рекомбинантный ген белка альфа-амилазы Bacillus amyloliquefaciens, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:l от нуклеотида в положении 351 п.о. до нуклеотида в положении 1802 п.о., кодирующей целевой белок альфа-амилазы Bacillus amyloliquefaciensc полной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, встроенный по сайтам рестрикции AhlI и BseX3I в область полилинкера вектора pUSB2, содержащая сильный промотор и сигнальную последовательность, что обеспечивает эффективную наработку рекомбинантных белков и их экспорт в культуральную среду.The specified technical result is achieved by constructing a recombinant plasmid pUSB2-AmQ, 7517 base pairs (bp), characterized by the physical and genetic map shown in Fig. - 3, providing the synthesis of the recombinant protein of the alpha-amylase of Bacillus amyloliquefaciens 55 kDa in Bacillus subtilis cells, containing the recombinant gene of the protein of the alpha-amylase of Bacillus amyloliquefaciens, having the nucleotide sequence SEQ ID NO: l from the nucleotide at position 351 bp. to the nucleotide at position 1802 bp, encoding the target protein of Bacillus amyloliquefaciensc alpha-amylase with the complete amino acid sequence SEQ ID NO: 2, inserted at the AhlI and BseX3I restriction sites into the polylinker region of the pUSB2 vector, containing a strong promoter and signal sequence, which provides an effective production of recombinant proteins and their export to the culture medium.

Указанный технический результат достигается также созданием рекомбинантного штамма Bacillus subtilis WB800N/pUSB2-AmQ - продуцента белка альфа-амилазы Bacillus amyloliquefaciens, полученного трансформацией рекомбинантной плазмидой pUSB2-AmQ по п. 2.The specified technical result is also achieved by creating a recombinant strain of Bacillus subtilis WB800N / pUSB2-AmQ - the producer of the protein alpha-amylase Bacillus amyloliquefaciens obtained by transformation with the recombinant plasmid pUSB2-AmQ according to claim 2.

Заявляемый штамм Bacillus subtilis WB800N/pUSB2-AmQ - продуцент рекомбинатной альфа-амилазы, обеспечивающей катализ гидролиза крахмала и гликогена до олигосахаридов, и предназначенный для использования в детергентах, получают следующим образом.The inventive strain of Bacillus subtilis WB800N / pUSB2-AmQ - producer of recombinant alpha-amylase, providing catalysis of hydrolysis of starch and glycogen to oligosaccharides, and intended for use in detergents, is obtained as follows.

Для работы была выбрана альфа-амилаза Bacillus amyloliquefaciens. Это выбор был продиктован рядом параметров, которые характерны для этой альфа-амилазы, в частности термостабильность и устойчивость в щелочных средах.The alpha-amylase of Bacillus amyloliquefaciens was chosen for the work. This choice was dictated by a number of parameters that are characteristic of this alpha-amylase, in particular thermal stability and stability in alkaline environments.

Нуклеотидная последовательность, кодирующую альфа-амилазу Bacillus amyloliquefaciens была взята из базы данных GenBank [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/]. Для обеспечения высокого и стабильного выхода целевого продукта провели оптимизацию кодонного состава под систему экспрессии штамма Bacillus subtilis на сервере ThermoFisher [https://www.thermofisher.com/]. После оптимизации был проведен анализ различия частот использования кодонов, а так же негативных элементов с помощью серверов GenScript [https://www.genscript.com/tools/rare-codon-analysis] и EFMCalculator [http://barricklab.org/django/efm/]. Индекс Кодонной Адаптации (CAI) гена составил 0,93 (CAI=1,0 считается идеальным). Оптимизированная последовательность была синтезирована (SEQ.1).The nucleotide sequence encoding Bacillus amyloliquefaciens alpha-amylase was taken from the GenBank database [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/]. To ensure a high and stable yield of the target product, the codon composition was optimized for the expression system of the Bacillus subtilis strain on the ThermoFisher server [https://www.thermofisher.com/]. After optimization, the analysis of the difference in the frequencies of codon use, as well as negative elements, was carried out using GenScript servers [https://www.genscript.com/tools/rare-codon-analysis] and EFMCalculator [http://barricklab.org/django / efm /]. The Codon Adaptation Index (CAI) of the gene was 0.93 (CAI = 1.0 is considered ideal). The optimized sequence was synthesized (SEQ.1).

Для обеспечения синтеза был сконструирован вектор pUSB2 (фиг. 4, 5). Для его конструирования были проведены последовательные встройки и удаления нуклеотидных последовательностей кодирующих регуляторные факторы (фиг. 4, 5).To ensure synthesis, a pUSB2 vector was constructed (Figs. 4, 5). For its construction were carried out sequential insertions and deletions of nucleotide sequences encoding regulatory factors (Fig. 4, 5).

В качестве продуцента была выбрана культура Bacillus subtilis, штамм WB800N которая обладает преимуществами в качестве продуцента: общепризнанный безопасный статус (GRAS), легкие генетические манипуляции, так же использование данного организма позволит получать рекомбинантный фермент в секретируемой форме, за счет этого снижаются расходы на выделение и очистку конечного продукта.The culture of Bacillus subtilis was chosen as a producer, the WB800N strain, which has advantages as a producer: generally recognized safe status (GRAS), easy genetic manipulations, as well as the use of this organism will make it possible to obtain a recombinant enzyme in a secreted form, thereby reducing the cost of isolation and purification of the final product.

При культивировании, штамм Bacillus subtilis WB800N/pUSB2-AmQ, обеспечивает синтез рекомбинантной альфа-амилазы 90% от общего секретируемого белка Bacillus subtilis (фиг. 7).When cultured, the Bacillus subtilis strain WB800N / pUSB2-AmQ provides the synthesis of recombinant alpha-amylase 90% of the total secreted protein of Bacillus subtilis (Fig. 7).

Указанный технический результат достигается благодаря оптимизации кодоного состава, наличие сильного промотора, который включает оптимизированную последовательность -35, -10 и +1 и отсутствие последовательности кодирующую белок репрессор LacI. Наличие белка репрессора LacI в составе экспрессионной кассеты обеспечивает контроль синтеза мРНК, но, в случае постоянного синтеза при интеграции, он оказывает отрицательное влияние.The specified technical result is achieved due to the optimization of the codon composition, the presence of a strong promoter, which includes an optimized sequence -35, -10 and +1 and the absence of a sequence coding for the LacI repressor protein. The presence of the LacI repressor protein in the expression cassette provides control of mRNA synthesis, but, in the case of constant synthesis during integration, it has a negative effect.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими фигурами. На фиг. 1 приведена нуклеотидная последовательность гена рекомбинантного белка альфа-амилазы. На фиг. 2 представлена схема альфа-амилазы Bacillus amyloliquefaciens, показаны сигнальная последовательность и зрелый фермент. На фиг. 3 изображена физическая и генетическая карта рекомбинантной плазмиды pUSB2-AmQ, содержащая последовательность белка альфа-амилазы Bacillus amyloliquefaciens. На фиг. 4, 5 изображено последовательное клонирование для получения плазмиды pUSB2-AmQ. На фиг. 6 представлена фотография электрофоретического разделения препаратов ДНК 1 - маркер М12; 2 - рекомбинантная плазмида pUSB-AmyQ, 3 - ПЦР-продукт Cat (последовательность хлорамфеникол ацетилтрансферазы); 4 - ПЦР-продукт Rep (последовательность репликативного белка. На фиг. 7 представлена фотография электрофоретического разделения препарата белка альфа-амилазы Bacillus amyloliquefaciens: 1 - маркер молекулярной массы; 2 - культуральная жидкость исходной культуры Bacillus subtilis (без плазмид); 3 - культуральная жидкость Bacillus subtilis содержащая плазмиду рНТ255; 4 -культуральная жидкость Bacillus subtilis содержащая плазмиду рНТ255-AmyQ без добавления индуктора; 5 - культуральная жидкость Bacillus subtilis содержащая плазмиду pHT255-AmyQ после индукции; 6 - культуральная жидкость Bacillus subtilis содержащая плазмиду pUSB2-AmQ после 3х часов культивирования; 7 - культуральная жидкость Bacillus subtilis содержащая плазмиду pUSB2-AmQ после 20 часов культивирования.The invention is illustrated by the following graphical figures. FIG. 1 shows the nucleotide sequence of the gene for the recombinant alpha-amylase protein. FIG. 2 is a schematic diagram of the alpha-amylase of Bacillus amyloliquefaciens showing the signal sequence and the mature enzyme. FIG. 3 shows the physical and genetic map of the recombinant plasmid pUSB2-AmQ containing the sequence of the Bacillus amyloliquefaciens alpha-amylase protein. FIG. 4, 5 depict sequential cloning to obtain plasmid pUSB2-AmQ. FIG. 6 shows a photograph of the electrophoretic separation of DNA preparations 1 - marker M12; 2 - recombinant plasmid pUSB-AmyQ, 3 - PCR product Cat (sequence of chloramphenicol acetyltransferase); 4 - PCR product Rep (sequence of replicative protein. Fig. 7 shows a photograph of the electrophoretic separation of the preparation of the protein alpha-amylase Bacillus amyloliquefaciens: 1 - molecular weight marker; 2 - culture fluid of the original culture of Bacillus subtilis (without plasmids); 3 - culture fluid Bacillus subtilis containing plasmid pHT255; 4 - culture liquid of Bacillus subtilis containing plasmid pHT255-AmyQ without adding an inductor; 5 - culture liquid of Bacillus subtilis containing plasmid pHT255-AmyQ after induction; 6 - culture liquid of Bacillus subtilis containing 2 hours of plasmid pUS 3 ; 7 - culture liquid of Bacillus subtilis containing plasmid pUSB2-AmQ after 20 hours of cultivation.

Для лучшего понимания сущности предлагаемого изобретения ниже приведены примеры его осуществления. Все стандартные генно-инженерные и микробиологические манипуляции, а также амплификацию и секвенирование ДНК проводили по известным методикам [7].For a better understanding of the essence of the invention, examples of its implementation are given below. All standard genetic engineering and microbiological manipulations, as well as DNA amplification and sequencing, were carried out according to known methods [7].

Пример 1. Синтез, клонирование и анализ фрагмента ДНК, включающего кодирующую последовательность гена альфа-амилазы.Example 1. Synthesis, cloning and analysis of a DNA fragment containing the coding sequence of the alpha-amylase gene.

Заявленный технический результат достигается за счет того, что заявляемая плазмида содержит следующие существенные для ее функционирования и экспрессии целевого белка структурные элементы: наличие сильного промотора, который включает оптимизированную последовательность -35, -10 и +1 и отсутствие последовательности кодирующую белок репрессор LacI. Наличие белка репрессора LacI в составе экспрессионной кассеты обеспечивает контроль синтеза мРНК, но, в случае постоянного синтеза при интеграции, он оказывает отрицательное влияние.The claimed technical result is achieved due to the fact that the claimed plasmid contains the following structural elements essential for its functioning and expression of the target protein: the presence of a strong promoter, which includes an optimized sequence -35, -10 and +1 and the absence of a sequence coding for the LacI repressor protein. The presence of the LacI repressor protein in the expression cassette provides control of mRNA synthesis, but, in the case of constant synthesis during integration, it has a negative effect.

Оптимизированная нуклеотидная последовательность гена альфа-амилазы AmyQ была синтезирована на автоматическом синтезаторе ABI 3400 DNA/RNA Synthesizer. Синтезированный ген был клонирован в составе клонирующего вектора pGH («ДНК синтез», г. Москва). Синтезированную плазмидную ДНК pGHAmyQ использовали в качестве матрицы для амплификации последовательности гена AmyQ. С помощью праймеров AmyQ-F и AmyQ-R в состав последовательности были внесены сайты гидролиза (таблица 1). Для проведения амплификации была использована высокоточная Pfu-полимераза (ООО «СибЭнзим»).The optimized nucleotide sequence of the AmyQ alpha-amylase gene was synthesized on an ABI 3400 DNA / RNA Synthesizer. The synthesized gene was cloned into the pGH cloning vector (DNA synthesis, Moscow). The synthesized pGHAmyQ plasmid DNA was used as a template to amplify the AmyQ gene sequence. Using the primers AmyQ-F and AmyQ-R, hydrolysis sites were introduced into the sequence (Table 1). High-precision Pfu-polymerase (OOO SibEnzyme) was used for amplification.

ПЦР проводили с использованием ПЦР-амплификатора «БИС» фирмы ООО БИС-Н (Россия). Реакционная смесь объемом 50 мкл содержала 20 нг ДНК (плазмида pGHAmyQ), 10 пкМ каждого праймера (AmyQ-F, AmyQ-R), смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дЦТФ, дТТФ, дГТФ по 2,5 мМ), 5 мкл10× буфера РпдДНК-полимеразы и 0.25 ед. Pfu ДНК-полимеразы. Реакцию осуществляли при следующих параметрах: денатурация и плавление 5 мин при 96°С, 30 циклов в которые входили денатурация и плавление 15 сек при 96°С, отжиг 20 с при 58°С и элонгация 2 мин при 72°С, продолжительность этапа элонгации программы рассчитывалась из расчета 1 минута на 1000 п.н. После завершения амплификации достройка концов ДНК осуществлялась при 72°С в течении 5 минут.PCR was performed using a BIS PCR amplifier manufactured by OOO BIS-N (Russia). The reaction mixture with a volume of 50 μl contained 20 ng of DNA (plasmid pGHAmyQ), 10 pM of each primer (AmyQ-F, AmyQ-R), a mixture of deoxynucleotide triphosphates (dATP, dCTP, dTTP, dGTP 2.5 mM each), 5 μl of 10 × RpdDNA buffer -polymerase and 0.25 units. Pfu DNA polymerase. The reaction was carried out under the following parameters: denaturation and melting for 5 min at 96 ° C, 30 cycles, which included denaturation and melting for 15 sec at 96 ° C, annealing for 20 sec at 58 ° C and elongation for 2 min at 72 ° C, the duration of the elongation stage the program was calculated at the rate of 1 minute per 1000 bp. After the completion of the amplification, the extension of the DNA ends was carried out at 72 ° C for 5 minutes.

Готовый ПЦР-продукт и предварительно наработанную и очищенную плазмиду рНТ255, использованную для встройки обрабатывали эндонуклеазами рестрикции BamHI и XmaI («СибЭнзим», г. Новосибирск). Реакцию ферментативного гидролиза проводили в условиях рекомендованных производителем. В реакционной смеси на 25 мкл, содержащей 3 мкг ДНК добавляли 20 ед.а. фермента BamHI и фермента XmaI. Реакцию лигирования ДНК проводили с использованием ДНК-лигазы бактериофага Т4 («СибЭнзим», г. Новосибирск). Лигазной смесью трансформировали Е. coli штамм Stbl3.The finished PCR product and the previously developed and purified plasmid pHT255 used for insertion were treated with restriction endonucleases BamHI and XmaI (SibEnzyme, Novosibirsk). The enzymatic hydrolysis reaction was carried out under the conditions recommended by the manufacturer. In a 25 μl reaction mixture containing 3 μg of DNA, 20 units of a were added. enzyme BamHI and enzyme XmaI. The DNA ligation reaction was carried out using bacteriophage T4 DNA ligase (SibEnzyme, Novosibirsk). E. coli strain Stbl3 was transformed with the ligation mixture.

Отбор клонов на наличие вставки проводили при помощи ПЦР с колонии. Параметры реакции подбирали согласно длине нуклеотидной вставки (таблица 1). Реакционная смесь 50 мкл содержала 10 пкМ каждого праймера (AmyQ-F, AmyQ-R), смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дЦТФ, дТТФ, дГТФ по 2,5 мМ), 5 мкл 10×буфера Pfu ДНК-полимеразы, 0.25 ед. Pfu ДНК-полимеразы и одну трансформированную колонию с плазмидой pHT255-AmyQ. Реакцию осуществляли при следующих параметрах: денатурирация и плавление 5 мин при 96°С, 30 циклов в которые входили денатурация и плавление 15 сек при 96°С, отжиг 20 с при 58°С и элонгация 2 мин при 72°С, продолжительность подбирали из расчета 1 минута на 1000 п.н. После завершения амплификации достройка концов ДНК осуществлялась при 72°С в течение 5 минут. Разделение продуктов амплификации проводили в 1%-м агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием (0,5 мкг/мл)Selection of clones for the presence of an insert was performed using PCR from the colony. The reaction parameters were selected according to the length of the nucleotide insert (Table 1). The reaction mixture of 50 μl contained 10 pM of each primer (AmyQ-F, AmyQ-R), a mixture of deoxynucleotide triphosphates (dATP, dCTP, dTTP, dGTP 2.5 mM each), 5 μl of 10 × Pfu DNA polymerase buffer, 0.25 units. Pfu DNA polymerase and one transformed colony with plasmid pHT255-AmyQ. The reaction was carried out under the following parameters: denaturation and melting for 5 min at 96 ° С, 30 cycles, which included denaturation and melting for 15 sec at 96 ° С, annealing for 20 sec at 58 ° С and elongation for 2 min at 72 ° С, the duration was selected from calculation 1 minute per 1000 bp After the completion of the amplification, the extension of the DNA ends was carried out at 72 ° C for 5 minutes. Amplification products were separated in 1% agarose gel followed by staining with ethidium bromide (0.5 μg / ml)

Положительные колонии, вносили в 5 мл среды LB с ампициллином (50 мкг/мл) и растили в течение ночи при 37°С при 170 об/мин. Затем плазмидную ДНК выделяли из бактериальных клеток с помощью коммерческих наборов DNA minikit фирмы «Qiagen» согласно рекомендациям производителя. Структуру полученных плазмид подтверждали секвенированием. Секвенирование проводили по методу Сэнгера в ЦКП «Геномика» СО РАН (г. Новосибирск). При проведении анализа использовался набор CEQ2000 Dye Terminator Cycle Sequencing Kit и 16-капилярный автоматический секвенатор ABI 3130x1. Для выравнивания нуклеотидных и соответствующих им аминокислотных последовательностей данных участков использовалась программа BioEdit.Positive colonies were added to 5 ml of LB medium with ampicillin (50 μg / ml) and grown overnight at 37 ° C at 170 rpm. Then plasmid DNA was isolated from bacterial cells using commercial DNA minikit from Qiagen according to the manufacturer's recommendations. The structure of the resulting plasmids was confirmed by sequencing. Sequencing was performed according to the Sanger method at the Genomics Center for Collective Use of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences (Novosibirsk). The analysis used a CEQ2000 Dye Terminator Cycle Sequencing Kit and an ABI 3130x1 16-capillary automatic sequencer. The BioEdit program was used to align the nucleotide and corresponding amino acid sequences of these regions.

Полученная рекомбинантная плазмида pHT255-AmyQ (фиг. 4) стала первым этапом работы. Она содержит сильный промотор, который включает оптимизированную последовательность -35, -10 и +1, а также операторные области необходимые для строгой регуляции синтеза мРНК встраиваемых генов.The resulting recombinant plasmid pHT255-AmyQ (Fig. 4) was the first stage of work. It contains a strong promoter that includes an optimized -35, -10 and +1 sequence, as well as operator regions necessary for the strict regulation of mRNA synthesis of the inserted genes.

Следующим этапом стало удаление последовательности, кодирующей белок репрессор LacI. Полученную плазмиду pHT255-AmyQ обрабатывали эндонуклеазами BstsNI и EqeI(«СибЭнзим», г. Новосибирск).The next step was the deletion of the sequence encoding the LacI repressor protein. The resulting plasmid pHT255-AmyQ was treated with endonucleases BstsNI and EqeI (SibEnzyme, Novosibirsk).

После обработки эндонуклеазами рестрикции полученную ДНК очищали при помощи разделение в 1% геле агарозы. Бенд соответствующий целевому продукту вектор рНТ255 без последовательности гена белка репрессора (общая длина 8332 п.н.) вырезали и очищали при помощи набора для выделения продуктов ПЦР из реакционных смесей (Евроген, Москва). Затем проводили реакцию лигирования. Продуктами лигазной реакции трансформировали клетки Е. coli штамм NebStable.After treatment with restriction endonucleases, the resulting DNA was purified by separation in 1% agarose gel. The pHT255 vector bend corresponding to the target product without the repressor gene sequence (total length 8332 bp) was excised and purified using a kit for the isolation of PCR products from reaction mixtures (Evrogen, Moscow). Then the ligation reaction was carried out. The products of the ligase reaction were used to transform cells of E. coli strain NebStable.

Структуру полученных плазмид подтверждали секвенированием, как описано выше.The structure of the resulting plasmids was confirmed by sequencing as described above.

Наличие белка репрессора LacI в составе экспрессионной кассеты обеспечивает контроль синтеза мРНК, но, в случае постоянного синтеза при интеграции, он оказывает отрицательное влияние. В результате была получена плазмида pBSU-AmyQ (фиг. 4).The presence of the LacI repressor protein in the expression cassette provides control of mRNA synthesis, but, in the case of constant synthesis during integration, it has a negative effect. As a result, the plasmid pBSU-AmyQ was obtained (Fig. 4).

Полученную плазмиду pBSU-AmyQ использовали в качестве матрицы для амплификации продукта несущий альфа-амилазу и «сильный» синтетический промотер. Для проведения ПЦР использовали праймеры, несущие сайты гидролиза AhlI и BseX3I (таблица 2).The resulting plasmid pBSU-AmyQ was used as a template for amplification of the product carrying alpha-amylase and a "strong" synthetic promoter. For PCR, primers carrying the AhlI and BseX3I hydrolysis sites were used (Table 2).

Условия ПЦР были следующими, смесь содержала 20 нгр ДНК плазмиды pBSU-AmyQ, 10 пкМ каждого праймера (AmyQ-F, AmyQ-R), смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дЦТФ, дТТФ, дГТФ по 2,5 мМ), 5 мкл 10× буфера Pfu ДНК-полимеразы и 0.25 ед. Pfu ДНК-полимеразы. Реакцию осуществляли при следующих параметрах: денатурировали 3 мин при 95°С, амплифицировали в течении 30 циклов в которые входили денатурация 30 сек при 95°С, отжиг 30 с при 59°С и элонгация 3 мин 50 сек при 72°С, продолжительность подбиралась из расчета 1 минута на 1000 п. н. После завершения амплификации достройка концов ДНК осуществлялась при 72°С в течении 2 минут.The PCR conditions were as follows, the mixture contained 20 ng of pBSU-AmyQ plasmid DNA, 10 pM of each primer (AmyQ-F, AmyQ-R), a mixture of deoxynucleotide triphosphates (dATP, dCTP, dTTP, dGTP 2.5 mM each), 5 μl 10 × buffer Pfu DNA polymerase and 0.25 units. Pfu DNA polymerase. The reaction was carried out with the following parameters: denatured for 3 min at 95 ° C, amplified for 30 cycles, which included denaturation for 30 sec at 95 ° C, annealing for 30 sec at 59 ° C and elongation for 3 min 50 sec at 72 ° C, the duration was adjusted at the rate of 1 minute per 1000 bp After the completion of the amplification, the extension of the DNA ends was carried out at 72 ° C for 2 minutes.

Готовый ПЦР-продукт и предварительно наработанную и очищенную акцепторную плазмиду pBE-S обрабатывали эндонуклеазами рестрикции AhlI и BseX3I («СибЭнзим», г. Новосибирск). Реакцию ферментативного гидролиза проводили в условиях, рекомендованных производителем. В реакционной смеси на 25 мкл 3 мкг ДНК обрабатывались 20 ед.а. фермента AhlI и фермента BseX3I. После обработки эндонуклеазами рестрикции полученную ДНК очищали при помощи разделение в 1% геле агарозы. Бенд соответствующий целевому продукту вырезали и очищали при помощи набора для выделения продуктов ПЦР из реакционных смесей (Евроген, Москва). Затем проводили реакцию лигирования. Продуктами лигазной реакции трансформировали клетки Е. coli штамм NebStable. Первичную проверку на наличие вставки проводили при помощи ПЦР с колонии. Разделение продуктов амплификации проводили в 1%-м агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием (0,5 мкг/мл).The finished PCR product and the previously developed and purified acceptor plasmid pBE-S were treated with restriction endonucleases AhlI and BseX3I (SibEnzyme, Novosibirsk). The enzymatic hydrolysis reaction was carried out under the conditions recommended by the manufacturer. In the reaction mixture for 25 μl, 3 μg of DNA were treated with 20 units of a. the AhlI enzyme and the BseX3I enzyme. After treatment with restriction endonucleases, the resulting DNA was purified by separation in 1% agarose gel. The band corresponding to the target product was excised and purified using a kit for the isolation of PCR products from reaction mixtures (Evrogen, Moscow). Then the ligation reaction was carried out. The products of the ligase reaction were used to transform cells of E. coli strain NebStable. The initial check for the presence of an insert was performed by colony PCR. Amplification products were separated in 1% agarose gel followed by staining with ethidium bromide (0.5 μg / ml).

Положительные колонии, вносили в 5 мл среды LB с ампициллином (50 мкг/мл) и растили в течение ночи при 37°С при 170 об/мин. Затем плазмидную ДНК выделяли из бактериальных клеток с помощью коммерческих наборов DNAminikit фирмы «Qiagen» согласно рекомендациям производителя. Структуру полученных плазмид подтверждали секвенированием, как было описано выше.Positive colonies were added to 5 ml of LB medium with ampicillin (50 μg / ml) and grown overnight at 37 ° C at 170 rpm. Then plasmid DNA was isolated from bacterial cells using commercial DNAminikit kits from Qiagen according to the manufacturer's recommendations. The structure of the resulting plasmids was confirmed by sequencing as described above.

Для оптимизации структуры плазмидного вектора было решено изменить один из генов резистентности, вместо последовательности гена устойчивости к канамицину было решено включить ген устойчивости к хлормафениколу. Полученную плазмиду pUSB-AmyQ обрабатывали эндонуклеазой EcoRI («СибЭнзим», г. Новосибирск). Затем проводили реакцию лигирования. Продуктами лигазной реакции трансформировали клетки Е. coli штамм NebStable. Проверку на наличие вставки проводили при помощи рестрикционного анализа с эндонуклеазой VneI.To optimize the structure of the plasmid vector, it was decided to change one of the resistance genes; instead of the sequence of the kanamycin resistance gene, it was decided to include the chlormaphenicol resistance gene. The resulting plasmid pUSB-AmyQ was treated with EcoRI endonuclease (SibEnzyme, Novosibirsk). Then the ligation reaction was carried out. The products of the ligase reaction were used to transform cells of E. coli strain NebStable. The check for the presence of the insert was performed by restriction analysis with VneI endonuclease.

Полученная плазмиду pUSB-Am использовали в качестве матрицы для амплификации репликативного белка герВ. Для проведения ПЦР использовали праймеры, несущие сайты гидролиза CciNI и MfeI (таблица 3).The resulting plasmid pUSB-Am was used as a template for amplification of the replicative gerB protein. For PCR, primers carrying the CciNI and MfeI hydrolysis sites were used (Table 3).

Условия ПЦР были следующими, смесь содержала 20 нгр ДНК плазмиды pUSB-Am, 10 пкМ каждого праймера (RepB-F, RepB-R), смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дЦТФ, дТТФ, дГТФ по 2,5 мМ), 5 мкл 10× буфера Pfu ДНК-полимеразы и 0.25 ед. Pfu ДНК-полимеразы. Реакцию осуществляли при следующих параметрах: денатурировали 3 мин при 95°С, амплифицировали в течении 30 циклов в которые входили денатурация 30 сек при 95°С, отжиг 30 сек при 56°С и элонгация 50 сек при 72°С, продолжительность подбиралась из расчета 1 минута на 1000 п.н. После завершения амплификации достройка концов ДНК осуществлялась при 72°С в течении 1 мин 30 сек.The PCR conditions were as follows, the mixture contained 20 ng of pUSB-Am plasmid DNA, 10 pM of each primer (RepB-F, RepB-R), a mixture of deoxynucleotide triphosphates (dATP, dCTP, dTTP, dGTP 2.5 mM each), 5 μl 10 × buffer Pfu DNA polymerase and 0.25 units. Pfu DNA polymerase. The reaction was carried out with the following parameters: denatured for 3 min at 95 ° C, amplified for 30 cycles, which included denaturation for 30 sec at 95 ° C, annealing for 30 sec at 56 ° C and elongation for 50 sec at 72 ° C, the duration was selected based on 1 minute per 1000 bp After the completion of the amplification, the extension of the DNA ends was carried out at 72 ° C for 1 min 30 sec.

Последовательность устойчивости к хлорамфениколу (Cat) получали путем амплификации с матрицы, в качестве которой была использована плазмида pHT255-AmyQ. Для проведения ПЦР использовали праймеры, несущие сайты гидролиза AatII и CciNI (таблица 4).The chloramphenicol resistance (Cat) sequence was obtained by amplification from a template using the plasmid pHT255-AmyQ. For PCR, primers carrying the AatII and CciNI hydrolysis sites were used (Table 4).

Условия ПЦР были следующими, смесь содержала 20 нгр ДНК плазмиды pBSU-AmyQ, 10 пкМ каждого праймера (Cat-A-F, Cat-C-R), смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дЦТФ, дТТФ, дГТФ по 2,5 мМ), 5 мкл 10× буфера Pfu ДНК-полимеразы и 0.25 ед. Pfu ДНК-полимеразы. Реакцию осуществляли при следующих параметрах: денатурировали 4 мин при 95°С, амплифицировали в течении 30 циклов в которые входили денатурация 30 сек при 95°С, отжиг 30 сек при 56°С и элонгация 2 мин 10 сек при 72°С, продолжительность подбиралась из расчета 1 минута на 1000 п.н. После завершения амплификации достройка концов ДНК осуществлялась при 72°С в течении 2 мин 30 сек.The PCR conditions were as follows, the mixture contained 20 ng DNA of plasmid pBSU-AmyQ, 10 pM of each primer (Cat-AF, Cat-CR), a mixture of deoxynucleotide triphosphates (dATP, dCTP, dTTP, dGTP 2.5 mM each), 5 μl 10 × buffer Pfu DNA polymerase and 0.25 units. Pfu DNA polymerase. The reaction was carried out under the following parameters: denatured for 4 min at 95 ° C, amplified for 30 cycles, which included denaturation for 30 sec at 95 ° C, annealing for 30 sec at 56 ° C and elongation for 2 min 10 sec at 72 ° C, the duration was adjusted at the rate of 1 minute per 1000 bp After the completion of the amplification, the extension of the DNA ends was carried out at 72 ° C for 2 min 30 sec.

Готовые ПЦР-продукты и предварительно наработанную и очищенную плазмиду pUSB-Am обрабатывали эндонуклеазами рестрикции AatII, CciNI и MfeI. («СибЭнзим», г. Новосибирск). Реакцию ферментативного гидролиза проводили в условиях, рекомендованных производителем. В реакционной смеси на 25 мкл 3 мкг ДНК обрабатывались 20 ед.а. фермента AatII, фермента CciNI и фермента MfeI.The finished PCR products and the previously generated and purified plasmid pUSB-Am were treated with restriction endonucleases AatII, CciNI, and MfeI. ("SibEnzyme", Novosibirsk). The enzymatic hydrolysis reaction was carried out under the conditions recommended by the manufacturer. In the reaction mixture for 25 μl, 3 μg of DNA were treated with 20 units of a. the AatII enzyme, the CciNI enzyme and the MfeI enzyme.

После обработки эндонуклеазами рестрикции полученную ДНК очищали при помощи разделение в 1% геле агарозы. Бенд соответствующий целевому продукту вырезали и очищали при помощи набора для выделения продуктов ПЦР из реакционных смесей (Евроген, Москва). Затем проводили реакцию лигирования. Продуктами лигазной реакции трансформировали клетки Е. coli штамм NebStable. Первичную проверку на наличие вставки проводили при помощи ПЦР с колонии. Разделение продуктов амплификации проводили в 1%-м агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием (0,5 мкг/мл).After treatment with restriction endonucleases, the resulting DNA was purified by separation in 1% agarose gel. The band corresponding to the target product was excised and purified using a kit for the isolation of PCR products from reaction mixtures (Evrogen, Moscow). Then the ligation reaction was carried out. The products of the ligase reaction were used to transform cells of E. coli strain NebStable. The initial check for the presence of an insert was performed by colony PCR. Amplification products were separated in 1% agarose gel followed by staining with ethidium bromide (0.5 μg / ml).

Положительные колонии, вносили в 5 мл среды LB с ампициллином (50 мкг/мл) и растили в течение ночи при 37°С при 170 об/мин. Затем плазмидную ДНК выделяли из бактериальных клеток с помощью коммерческих наборов DNAminikit фирмы «Qiagen» согласно рекомендациям производителя. Структуру полученных плазмид подтверждали секвенированием.Positive colonies were added to 5 ml of LB medium with ampicillin (50 μg / ml) and grown overnight at 37 ° C at 170 rpm. Then plasmid DNA was isolated from bacterial cells using commercial DNAminikit kits from Qiagen according to the manufacturer's recommendations. The structure of the resulting plasmids was confirmed by sequencing.

Последним этапом стала встройка гена альфа-амилазы в полученный оптимизированный вектор pUSB-Am2. Плазмида pUSB-Am2 и плазмида pUSB-AmyQ обрабатывались эндонуклеазами рестрикции EcoRV и Xba.The last step was the insertion of the alpha-amylase gene into the resulting optimized pUSB-Am2 vector. Plasmid pUSB-Am2 and plasmid pUSB-AmyQ were digested with restriction endonucleases EcoRV and Xba.

После обработки эндонуклеазами рестрикции полученную ДНК очищали при помощи разделение в 1% геле агарозы. Бенд соответствующий целевому продукту вырезали и очищали при помощи набора для выделения продуктов ПЦР из реакционных смесей (Евроген, Москва). Затем проводили реакцию лигирования. Продуктами лигазной реакции трансформировали клетки Е. coli штамм NebStable. Проверку на наличие вставки проводили при помощи рестрикционного анализа с эндонуклеазой BamHI.After treatment with restriction endonucleases, the resulting DNA was purified by separation in 1% agarose gel. The band corresponding to the target product was excised and purified using a kit for the isolation of PCR products from reaction mixtures (Evrogen, Moscow). Then the ligation reaction was carried out. The products of the ligase reaction were used to transform cells of E. coli strain NebStable. The check for the presence of the insert was performed using restriction analysis with the endonuclease BamHI.

В завершении была получена оригинальная плазмида pUSB2-AmQ (фиг. 3) содержащая сильный промотор, что обеспечивает эффективную наработку рекомбинантных белков и экспорт в культуральную среду.Finally, the original plasmid pUSB2-AmQ was obtained (Fig. 3) containing a strong promoter, which ensures efficient production of recombinant proteins and export to the culture medium.

Секвенирование плазмидной ДНК положительных клонов в районе встройки гена альфа-амилазы позволило отобрать клоны с отсутствием дефектов встраиваемых генов (вставки, делеции, замены), после чего из отобранных клонов была наработана и выделена плазмидная ДНК (фиг.).Sequencing of the plasmid DNA of positive clones in the region of the alpha-amylase gene insertion made it possible to select clones without defects in the inserted genes (insertions, deletions, substitutions), after which plasmid DNA was generated and isolated from the selected clones (Fig.).

Пример 2. Получение рекомбинантного штамма Bacillus subtilis.Example 2. Obtaining a recombinant strain of Bacillus subtilis.

Полученной рекомбинантной плазмидой pUSB2-AmQ была проведена трансформация методом электропарации клеток B.subtilis WB800N. Культуру клеток в количестве 50 мл подращивали до OD_λ.600=0.2. о.е. Затем в культуру добавили 0,5 гр. трионина, 1 гр. глицил-глицина, 0,05 гр. триптофана и 15 мкл TWEEN 80 и инкубировали в течении часа при 30°С. После культуру клеток инкубировали 20 мин на льду. 50 мл культуры центрифугировали 10 мин 5000g при 4°С на центрифуге AvantiJ-30I. Осажденную биомассу Дважды промыли в 5 мл ЕР Buffer (0,5 М трегалоза, 0,5 М сорбитол, 0,5 М маннитол, 0,7 мМ MgCl, 0,5 мМ K₂HPO₄, 0,5 мМ KH₂PO₄, рН=7,4). После промывки ресуспендировали в 0,5 мл EPBuffer. 100 мкл суспензии клеток перенесли в 2 мл холодные кюветы для электропорации и добавили ДНК с расчетом 25 нг/мкл. Произвели электропорацию при 2,5 kV на электропораторе MicroPulser. К про электропорированным клеткам добавили питательную среду YTx2 с 0,5 М сорбитолом и 0,38 М маннитолом. Инкубировали 3 часа при 37°С. 50 и 200 мкл культуры высевали на чашки с агаризованной средой YTx2 содержащие 5 мкг/мл хлорамфеникола. Чашки помещали в термостат 30°С и инкубировали в течении ночи. На следующий день были идентифицированы отдельные колонии, содержащие плазмиду pUSB2-AmQ.The resulting recombinant plasmid pUSB2-AmQ was transformed by electroparating B. subtilis WB800N cells. The cell culture in an amount of 50 ml was grown to OD _λ.600 = 0.2. o.e. Then 0.5 g was added to the culture. trionin, 1 gr. glycyl-glycine, 0.05 gr. tryptophan and 15 μl TWEEN 80 and incubated for an hour at 30 ° C. After that, the cell culture was incubated for 20 min on ice. 50 ml of culture was centrifuged for 10 min at 5000g at 4 ° C in an AvantiJ-30I centrifuge. The precipitated biomass was washed twice in 5 ml of EP Buffer (0.5 M trehalose, 0.5 M sorbitol, 0.5 M mannitol, 0.7 mM MgCl, 0.5 mM K ₂ HPO ₄ , 0.5 mM KH ₂ PO ₄ , pH = 7.4). After washing, resuspended in 0.5 ml EPBuffer. 100 μl of the cell suspension was transferred to 2 ml cold electroporation cuvettes and DNA was added at a rate of 25 ng / μl. Electroporation was performed at 2.5 kV on a MicroPulser electroporator. The pro-electroporated cells were supplemented with YTx2 culture medium with 0.5 M sorbitol and 0.38 M mannitol. Incubated for 3 hours at 37 ° C. 50 and 200 μl of the culture were plated on plates with YTx2 agar medium containing 5 μg / ml of chloramphenicol. The dishes were placed in a thermostat at 30 ° C and incubated overnight. The next day, individual colonies were identified containing the plasmid pUSB2-AmQ.

Пример 3. Наработка биомассы pUSB2-AmQ и выделение рекомбинантной альфа-амилазыExample 3. Production of pUSB2-AmQ biomass and isolation of recombinant alpha-amylase

Полученные клоны B.subtilis штамма WB800N после электропорации рекомбинантной плазмидой pUSB2-AmQ наращивали в 5 мл среды YT×2 содержащей 5 мкг/мл хлорамфеникола в течение ночи. Полученную ночную культуру добавляли по 1,5 мл в колбы объемом 750 мл содержащих 150 мл среды YT×2 и растили до плотности OD_λ600=0,6. После этого продолжали культивирование в течение 16 часов при температуре 30°С, 170 об/мин. Биомассу бактериальных клеток отделяли от культуральной среды центрифугированием (7000 об/мин), в течение 10 мин, 4°С.The obtained clones of B. subtilis strain WB800N after electroporation with the recombinant plasmid pUSB2-AmQ were grown in 5 ml of YT × 2 medium containing 5 μg / ml of chloramphenicol overnight. The resulting overnight culture was added by 1.5 ml to 750 ml flasks containing 150 ml of YT × 2 medium and grown to a density OD _λ600 = 0.6. Thereafter, cultivation was continued for 16 hours at a temperature of 30 ° C, 170 rpm. The biomass of bacterial cells was separated from the culture medium by centrifugation (7000 rpm) for 10 min at 4 ° C.

Культуральную среду анализировали в 12% ПААГ на наличие целевого белка. Было показано, что целевой белок секретируется в культуральную среду (фиг. 7).The culture medium was analyzed in 12% PAGE for the presence of the target protein. It was shown that the target protein is secreted into the culture medium (Fig. 7).

Пример 4 Определение активности рекомбинантной альфа-амилазыExample 4 Determination of Recombinant Alpha-Amylase Activity

Определение активности проводилось с помощью набора «Альфа-АМИЛАЗА-1-ОЛЬВЕКС» (ООО «ОЛЬВЕКС ДИАГНОСТИКУМ», Россия) предназначенного для количественного определения активности альфа-амилазы методом Каравея. Проведение анализа включает в себя приготовление образцов опытной и контрольной пробы. Для каждой пробы подготавливалось 0,5 мл рабочего раствора субстрата (РРС) включающий в себя 24 части буферного раствора (200 мМ фосфатный буфер с рН=6,90; 77 мМ NaCl; азид натрия 0,2 г/л) и 1 части концентрированного субстрата (крахмал картофельный 10 г/л; 100 мМ NaOH). РРС прогревали при температуре 37°С в течение 5 минут. К прогретому РРС для опытной пробы добавили 10 мкл исследуемого образца. РРС для опытной и контрольной пробы снова прогревали при 37°С в течение 5 минут. К прогретым пробам добавили 4 мл рабочего раствора соляной кислоты, приготовленный в соотношении 1:15 из дистиллированной воды и 1,6 М соляной кислоты. К контрольной пробе добавили 10 мкл исследуемого образца. Далее контрольную и опытную пробу смешивали с рабочим раствором йода, приготовленный в соотношении 7:1:2 из дистиллированной воды, концентрированного раствора йода (127 мМ KI, 35,06 мМ йод кристаллический) и 3,87 мМ раствора KF. Пробы тщательно перемешивали. У готовых проб измеряли оптическую плотность против дистиллированной воды при длине волны 630 нм в кювете с длиной оптического пути 1,0 см. Измерения проводились на спектрофотометре SmartSpecPlusBIORAD. Расчет активности (А, мг/с*л)) проводили по формуле:Determination of the activity was carried out using the set "Alpha-AMILASE-1-OLVEX" (LLC "OLVEX DIAGNOSTICUM", Russia) intended for the quantitative determination of the activity of alpha-amylase by the Karavei method. Analysis includes preparation of test and control samples. For each sample, 0.5 ml of a working substrate solution (PPC) was prepared, which included 24 parts of a buffer solution (200 mM phosphate buffer with pH = 6.90; 77 mM NaCl; sodium azide 0.2 g / L) and 1 part of concentrated substrate (potato starch 10 g / l; 100 mM NaOH). The PPC was heated at 37 ° C for 5 minutes. To the heated PPC for the experimental sample, 10 μL of the test sample was added. The PPC for the experimental and control samples was again heated at 37 ° C for 5 minutes. To the heated samples was added 4 ml of a working solution of hydrochloric acid, prepared in a ratio of 1:15 from distilled water and 1.6 M hydrochloric acid. To the control sample, 10 μl of the test sample was added. Then, the control and experimental samples were mixed with a working iodine solution prepared in a ratio of 7: 1: 2 from distilled water, concentrated iodine solution (127 mM KI, 35.06 mM crystalline iodine) and 3.87 mM KF solution. The samples were thoroughly mixed. The finished samples were measured for optical density against distilled water at a wavelength of 630 nm in a cuvette with an optical path length of 1.0 cm. The measurements were carried out on a SmartSpecPlusBIORAD spectrophotometer. The calculation of activity (A, mg / s * L)) was carried out according to the formula

где:Where:

Еоп. - оптическая плотность опытной пробы,Eop. - the optical density of the test sample,

Еконтр. - оптическая плотность контрольной пробы,Control. - the optical density of the control sample,

С - коэффициент пересчета на 1 мг крахмалаС - conversion factor for 1 mg of starch

t - коэффициент пересчета на 1 сек инкубацииt - conversion factor for 1 second of incubation

К - коэффициент пересчета на 1 л биологической жидкости.K is the conversion factor for 1 liter of biological fluid.

Аналитические характеристики:Analytical characteristics:

Линейность - от 3,0 до 55,0 мг/с*л.Linearity - from 3.0 to 55.0 mg / s * l.

Чувствительность - не более 2,0 мг/(с*л).Sensitivity - no more than 2.0 mg / (s * l).

Коэффициент вариации результатов - не более 10%.The coefficient of variation of the results is no more than 10%.

В культуральной среде Bacillus subtilis, не содержащей плазмиды, альфа-амилазной активности не обнаружено. Культуральная среда, содержащая плазмиду pHT255-AmyQ и культуральная среда содержащая плазмиду pUSB2-AmQ показали активность альфа-амилазы 18 ед/мл, в качестве сравнения использовали препарат альфа-амилазы Bacillus sp. (А6380 500 mg, Sigma).In the culture medium of Bacillus subtilis, which does not contain the plasmid, no alpha-amylase activity was detected. The culture medium containing the plasmid pHT255-AmyQ and the culture medium containing the plasmid pUSB2-AmQ showed an alpha-amylase activity of 18 U / ml, as a comparison, the alpha-amylase preparation of Bacillus sp. (A6380 500 mg, Sigma).

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВLIST OF USED SOURCES

1. Никитина Е.В., Решетник О.А., Губайдуллин Р.А. Биотехнологические аспекты применения амилолитических ферментов в пищевой промышленности // Вестник Казанского технологического университета. 2013. Т. 16. №. 13.1. Nikitina E.V., Reshetnik O.A., Gu***llin R.A. Biotechnological aspects of the use of amylolytic enzymes in the food industry // Bulletin of Kazan Technological University. 2013.Vol. 16.No. 13.

2. Высоцкая Н.И., Голета М.В., Каравская Л.И. Применение амилолитических ферментов в процессе спиртового брожения // Научное сообщество студентов XXI столетия. Естественные науки: сб. ст. по мат. XL VIII междунар. студ. науч.-практ. конф. №1(47). URL: https://sibac.info/archive/nature/l(47).pdf (дата обращения: 14.02.2019)2. Vysotskaya N.I., Goleta M.V., Karavskaya L.I. The use of amylolytic enzymes in the process of alcoholic fermentation // Scientific community of students of the XXI century. Natural Sciences: Sat. Art. by mat. XL VIII int. stud. scientific-practical conf. No. 1 (47). URL: https://sibac.info/archive/nature/l(47).pdf (date accessed: 14.02.2019)

3. Borchert Т.V. et al. Oxidation stable amylases for detergents //Progress in Biotechnology. Elsevier, 1995. Vol. 10. P. 175-179.3. Borchert T.V. et al. Oxidation stable amylases for detergents // Progress in Biotechnology. Elsevier, 1995. Vol. 10.P. 175-179.

4. Заявка РФ 2018/2661790, C2, C12N, 9/50, 15/75, 15/63, 15/62, 15/70, опубл. 19.07.2018 г.4. RF application 2018/2661790, C2, C12N, 9/50, 15/75, 15/63, 15/62, 15/70, publ. 19.07.2018

5. Заявка РФ 1999/2124559, CI, C12N, 15/76, 15/67, 15/66, С12Р, 21/02, опубл. 10.01.1999 г.5. RF application 1999/2124559, CI, C12N, 15/76, 15/67, 15/66, C12P, 21/02, publ. 10.01.1999

6. Заявка WO 1991/02792, A1, C12N, 9/54, 15/57, 15/75, C11D, 3/386, опубл. 07.03.1991 г.6. Application WO 1991/02792, A1, C12N, 9/54, 15/57, 15/75, C11D, 3/386, publ. 03/07/1991

7. Маниатис Т., Фрич Э, Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование, М.: Мир, 1984; Клонирование ДНК. Методы. Под ред. Д. Гловера, Пер. с англ. Москва. Мир. 1988. 479 с.7. Maniatis T., Fritsch E, Sambrook J. Molecular cloning, M .: Mir, 1984; DNA cloning. Methods. Ed. D. Glover, Per. from English Moscow. Peace. 1988.479 p.

8. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Sharf S.J., Higuehi R., Horn G.T., Mullis K.B., Eriich H.A. Science, 1988. V. 239. №4839. P. 487-4918. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Sharf S.J., Higuehi R., Horn G.T., Mullis K.B., Eriich H.A. Science, 1988. V. 239. No. 4839. P. 487-491

9. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1977. V. 74. P. 5463-5467.9. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1977. V. 74. P. 5463-5467.

Приложениеapplication

<110>АлтГУ<110> AltSU

<120>Рекомбинантная плазмида pUSB2-AmQ, обеспечивающая синтез белка альфа-амилазы Bacillus amyloliquefaciens, и штамм Bacillus subtilis/pUSB2-AmQ – продуцент белка альфа-амилазы Bacillus amyloliquefaciens <120> Recombinant plasmid pUSB2-AmQ, providing synthesis of Bacillus amyloliquefaciens alpha-amylase protein, and Bacillus subtilis / pUSB2-AmQ strain - producing Bacillus amyloliquefaciens alpha-amylase protein

<160> SEQ ID NO 2<160> SEQ ID NO 2

<210> SEQ ID NO:1 <210> SEQ ID NO: 1

<211> 1545<211> 1545

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223>Нуклеотидная последовательность гена AmQ рекомбинантного белка альфа-амилазы Bacillus amyloliquefaciens. <223> Nucleotide sequence of Bacillus amyloliquefaciens recombinant alpha-amylase protein AmQ gene.

<400> 1<400> 1

ATGATCCAAAAACGCAAACGCACAGTTAGCTTTAGACTGGTTCTGATGTGCACACTGCTGTTTGTTTCACTGCCGATTACAAAAACATCAGCAGTTAATGGCACACTGATGCAGTATTTTGAATGGTATACACCGAATGATGGCCAACATTGGAAAAGACTGCAAAATGATGCAGAACATCTGAGCGATATTGGCATTACAGCAGTTTGGATTCCGCCTGCATATAAAGGCCTGTCACAATCAGATAATGGCTATGGACCGTATGATCTTTATGATCTGGGCGAATTTCAACAGAAAGGCACAGTCAGAACAAAATATGGCACAAAATCAGAACTGCAAGATGCAATTGGCTCACTGCATTCAAGAAATGTTCAAGTTTATGGCGACGTCGTCCTGAATCATAAAGCAGGCGCAGATGCAACAGAAGATGTTACAGCGGTTGAAGTTAATCCGGCAAATCGCAATCAAGAAACGAGCGAAGAATATCAGATTAAAGCGTGGACAGATTTTCGCTTTCCTGGCAGAGGCAATACATATTCAGACTTTAAATGGCATTGGTATCACTTTGATGGCGCAGATTGGGATGAAAGCAGAAAAATTTCACGCATCTTCAAATTTCGCGGAGAAGGCAAAGCATGGGATTGGGAAGTTTCATCAGAAAACGGCAACTATGACTATCTGATGTATGCGGATGTCGATTATGATCATCCTGATGTTGTTGCGGAAACAAAgAAATGGGGCATTTGGTATGCAAATGAACTGTCACTGGATGGCTTTAGAATTGATGCAGCGAAACACATCAAATTCTCATTTCTGAGAGATTGGGTTCAAGCAGTTAGACAAGCAACAGGCAAAGAGATGTTTACAGTTGCAGAATATTGGCAGAATAACGCAGGCAAACTGGAAAACTATCTGAACAAAACAAGCTTCAACCAGAGCGTTTTTGATGTTCCGCTGCATTTTAATCTGCAAGCAGCATCATCACAAGGCGGAGGCTATGATATGCGCAGACTGCTGGATGGCACAGTTGTTTCAAGACATCCGGAAAAAGCAGTCACATTTGTCGAAAACCATGATACACAACCGGGACAATCACTGGAATCAACAGTTCAAACATGGTTCAAACCGCTGGCATATGCATTTATTCTGACAAGAGAATCAGGCTATCCGCAAGTTTTcTACGGCGATATGTATGGAACAAAAGGCACGAGCCCGAAAGAAATTCCGTCACTGAAAGATAACATTGAGCCGATTCTTAAGGCACGCAAAGAATATGCGTATGGACCGCAACATGATTACATTGATCATCCGGACGTTATTGGCTGGACACGCGAAGGCGATTCATCAGCAGCAAAATCAGGCCTGGCAGCACTGATTACAGATGGCCCTGGCGGATCAAAAAGAATGTATGCAGGCCTGAAAAATGCTGGCGAAACATGGTATGATATTACAGGCAATAGAAGCGACACAGTCAAAATTGGATCAGATGGCTGGGGAGAATTTCATGTTAATGATGGCTCAGTCAGCATCTACGTCCAGAAATAA (1545 нуклеотида)ATGATCCAAAAACGCAAACGCACAGTTAGCTTTAGACTGGTTCTGATGTGCACACTGCTGTTTGTTTCACTGCCGATTACAAAAACATCAGCAGTTAATGGCACACTGATGCAGTATTTTGAATGGTATACACCGAATGATGGCCAACATTGGAAAAGACTGCAAAATGATGCAGAACATCTGAGCGATATTGGCATTACAGCAGTTTGGATTCCGCCTGCATATAAAGGCCTGTCACAATCAGATAATGGCTATGGACCGTATGATCTTTATGATCTGGGCGAATTTCAACAGAAAGGCACAGTCAGAACAAAATATGGCACAAAATCAGAACTGCAAGATGCAATTGGCTCACTGCATTCAAGAAATGTTCAAGTTTATGGCGACGTCGTCCTGAATCATAAAGCAGGCGCAGATGCAACAGAAGATGTTACAGCGGTTGAAGTTAATCCGGCAAATCGCAATCAAGAAACGAGCGAAGAATATCAGATTAAAGCGTGGACAGATTTTCGCTTTCCTGGCAGAGGCAATACATATTCAGACTTTAAATGGCATTGGTATCACTTTGATGGCGCAGATTGGGATGAAAGCAGAAAAATTTCACGCATCTTCAAATTTCGCGGAGAAGGCAAAGCATGGGATTGGGAAGTTTCATCAGAAAACGGCAACTATGACTATCTGATGTATGCGGATGTCGATTATGATCATCCTGATGTTGTTGCGGAAACAAAgAAATGGGGCATTTGGTATGCAAATGAACTGTCACTGGATGGCTTTAGAATTGATGCAGCGAAACACATCAAATTCTCATTTCTGAGAGATTGGGTTCAAGCAGTTAGACAAGCAACAGGCAAAGAGATGTTTACAGTTGCAGAATATTGGCAGAATAACGCAGGCAAACTGGAAAACTATCTGAACAAAACAAGCTTCAACCAGAGCGTTTTTGATGTTCCGCTGCATTTTAATCTGCAAGCAGCATCATCACAAGGCGGAGGCTATG ATATGCGCAGACTGCTGGATGGCACAGTTGTTTCAAGACATCCGGAAAAAGCAGTCACATTTGTCGAAAACCATGATACACAACCGGGACAATCACTGGAATCAACAGTTCAAACATGGTTCAAACCGCTGGCATATGCATTTATTCTGACAAGAGAATCAGGCTATCCGCAAGTTTTcTACGGCGATATGTATGGAACAAAAGGCACGAGCCCGAAAGAAATTCCGTCACTGAAAGATAACATTGAGCCGATTCTTAAGGCACGCAAAGAATATGCGTATGGACCGCAACATGATTACATTGATCATCCGGACGTTATTGGCTGGACACGCGAAGGCGATTCATCAGCAGCAAAATCAGGCCTGGCAGCACTGATTACAGATGGCCCTGGCGGATCAAAAAGAATGTATGCAGGCCTGAAAAATGCTGGCGAAACATGGTATGATATTACAGGCAATAGAAGCGACACAGTCAAAATTGGATCAGATGGCTGGGGAGAATTTCATGTTAATGATGGCTCAGTCAGCATCTACGTCCAGAAATAA (nucleotide 1545)

<210> SEQ ID NO:2 <210> SEQ ID NO: 2

<211>514<211> 514

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223>Аминокислотная последовательность AmQ рекомбинантного белка альфа-амилазы Bacillus amyloliquefaciens.<223> AmQ amino acid sequence of recombinant Bacillus amyloliquefaciens alpha-amylase protein.

<400> 2<400> 2

MIQKRKRTVSFRLVLMCTLLFVSLPITKTSAVNGTLMQYFEWYTPNDGQHWKRLQNDAEHLSDIGITAVWIPPAYKGLSQSDNGYGPYDLYDLGEFQQKGTVRTKYGTKSELQDAIGSLHSRNVQVYGDVVLNHKAGADATEDVTAVEVNPANRNQETSEEYQIKAWTDFRFPGRGNTYSDFKWHWYHFDGADWDESRKISRIFKFRGEGKAWDWEVSSENGNYDYLMYADVDYDHPDVVAETKKWGIWYANELSLDGFRIDAAKHIKFSFLRDWVQAVRQATGKEMFTVAEYWQNNAGKLENYLNKTSFNQSVFDVPLHFNLQAASSQGGGYDMRRLLDGTVVSRHPEKAVTFVENHDTQPGQSLESTVQTWFKPLAYAFILTRESGYPQVFYGDMYGTKGTSPKEIPSLKDNIEPILKARKEYAYGPQHDYIDHPDVIGWTREGDSSAAKSGLAALITDGPGGSKRMYAGLKNAGETWYDITGNRSDTVKIGSDGWGEFHVNDGSVSIYVQKMIQKRKRTVSFRLVLMCTLLFVSLPITKTSAVNGTLMQYFEWYTPNDGQHWKRLQNDAEHLSDIGITAVWIPPAYKGLSQSDNGYGPYDLYDLGEFQQKGTVRTKYGTKSELQDAIGSLHSRNVQVYGDVVLNHKAGADATEDVTAVEVNPANRNQETSEEYQIKAWTDFRFPGRGNTYSDFKWHWYHFDGADWDESRKISRIFKFRGEGKAWDWEVSSENGNYDYLMYADVDYDHPDVVAETKKWGIWYANELSLDGFRIDAAKHIKFSFLRDWVQAVRQATGKEMFTVAEYWQNNAGKLENYLNKTSFNQSVFDVPLHFNLQAASSQGGGYDMRRLLDGTVVSRHPEKAVTFVENHDTQPGQSLESTVQTWFKPLAYAFILTRESGYPQVFYGDMYGTKGTSPKEIPSLKDNIEPILKARKEYAYGPQHDYIDHPDVIGWTREGDSSAAKSGLAALITDGPGGSKRMYAGLKNAGETWYDITGNRSDTVKIGSDGWGEFHVNDGSVSIYVQK

Claims

1. Рекомбинантная плазмида pUSB2-AmQ размером 7495 пар оснований (п.о.), обеспечивающая синтез рекомбинантного белка α-амилазы Bacillus amyloliquefaciens размером 55 кДа в клетках Bacillus subtilis, характеризующаяся физической и генетической картой, представленной на фиг. 3, содержащая: синтетический промотор, обеспечивающий эффективную транскрипцию контролируемой мРНК; рекомбинантный ген α-амилазы Bacillus amyloliquefaciens с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1, встроенный по сайтам рестрикции Ahll и BseX3I в область полилинкера вектора pUSB и кодирующий целевой рекомбинантный белок; последовательность bla, кодирующую белок бета-лактамазу, являющуюся селективным маркером для трансформации штаммов Е. coli; участок repB, обеспечивающий инициацию репликации в штаммах Bacillus subtilis; белок устойчивости к хлорамфениколу Cat (chloramphenicol acetylase).1. Recombinant plasmid pUSB2-AmQ with a size of 7495 base pairs (bp), providing the synthesis of recombinant protein α-amylase Bacillus amyloliquefaciens size 55 kDa in Bacillus subtilis cells, characterized by the physical and genetic map shown in Fig. 3, containing: a synthetic promoter providing efficient transcription of controlled mRNA; a recombinant gene for α-amylase of Bacillus amyloliquefaciens with the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1, inserted at the Ahll and BseX3I restriction sites into the polylinker region of the pUSB vector and encoding the target recombinant protein; the bla sequence encoding the beta-lactamase protein, which is a selective marker for transformation of E. coli strains; site repB, providing the initiation of replication in strains of Bacillus subtilis; Cat chloramphenicol resistance protein (chloramphenicol acetylase).

2. Рекомбинантный штамм Bacillus subtilis WB800N/pUSB2-AmQ - продуцент рекомбинантного белка α-амилазы Bacillus amyloliquefaciens, полученный трансформацией рекомбинантной плазмидой pUSB2-AmQ по п. 1.2. Recombinant strain of Bacillus subtilis WB800N / pUSB2-AmQ - producer of recombinant protein α-amylase Bacillus amyloliquefaciens obtained by transformation with the recombinant plasmid pUSB2-AmQ according to claim 1.