RU2746171C2 - Device and method for magnetic fabrication - Google Patents
Device and method for magnetic fabrication Download PDFInfo
- Publication number
- RU2746171C2 RU2746171C2 RU2019131449A RU2019131449A RU2746171C2 RU 2746171 C2 RU2746171 C2 RU 2746171C2 RU 2019131449 A RU2019131449 A RU 2019131449A RU 2019131449 A RU2019131449 A RU 2019131449A RU 2746171 C2 RU2746171 C2 RU 2746171C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- biofabrication
- magnetic
- chamber
- bioprinter
- cuvette
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
- A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
- A61F2/02—Prostheses implantable into the body
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеThe technical field to which the invention relates
Изобретение относится к созданию трехмерных биологических и тканеинженерных конструкторов. В частности, изобретение относится к созданию конструктов из различных биоматериалов путем магнитной левитационной сборки в космическом пространстве.The invention relates to the creation of three-dimensional biological and tissue engineering constructors. In particular, the invention relates to the creation of constructs from various biomaterials by means of magnetic levitation assembly in outer space.
Предпосылки изобретенияBackground of the invention
Тканевая инженерия решает острую клиническую проблему - нехватку тканей и органов человека для трансплантации. Традиционная тканевая инженерия основана на концепции использования каркасов (скаффолдов), которая впервые появилась в статье Роберта Лангера и Джозефа Ваканти, опубликованной в журнале «Science» [Langer R. et al. Science. 1993 May 14;260(5110):920-6. Review]. Согласно этой статье каркас может быть определен как «временная и съемная опора», которая отличает его от не биоразлагаемых имплантатов и протезов.Tissue engineering solves an acute clinical problem - the lack of human tissues and organs for transplantation. Traditional tissue engineering is based on the concept of using scaffolds, which first appeared in an article by Robert Langer and Joseph Vacanti published in the journal Science [Langer R. et al. Science. 1993 May 14; 260 (5110): 920-6. Review]. According to this article, the framework can be defined as a "temporary and removable support", which distinguishes it from non-biodegradable implants and prostheses.
Биоразлагаемый каркас считается важнейшим и существенным элементом концептуальной основы технологии тканевой инженерии, которая позволяет производить биофабрикацию трехмерных тканевых конструктов и развивать промышленную тканевую инженерию [Hutmacher DW. Biomaterials. 2000 Dec; 21(24):2529-43].The biodegradable scaffold is considered the most important and essential element of the conceptual basis of tissue engineering technology, which allows biofabrication of three-dimensional tissue constructs and the development of industrial tissue engineering [Hutmacher DW. Biomaterials. 2000 Dec; 21 (24): 2529-43].
В последнее десятилетие появился новый альтернативный подход без использования каркасов [DuRaine GD. et al. Ann Biomed Eng. 2015 Mar; 43(3):543-54]. Несмотря на то, что разработчики этого нового подхода утверждают, что они используют подход без использования каркасов, на самом деле все же используются различные варианты «временной и съемной опоры», такие как съемные металлические иглы [Moldovan NI. et al. Tissue Eng Part В Rev. 2017 Jun; 23(3):237-244] или удаляемый гидрогель из агарозы [Norotte С. et al. Biomaterials. 2009 Oct; 30(30):5910-7], что, так или иначе, подрывает принципиальную концептуальную новизну предлагаемого подхода без использования каркасов. Таким образом, по крайней мере, концептуально, в этих методах используются традиционные временные каркасы и удаляемая опора.In the last decade, a new alternative approach without the use of frameworks has emerged [DuRaine GD. et al. Ann Biomed Eng. 2015 Mar; 43 (3): 543-54]. Despite the fact that the developers of this new approach claim that they are using a non-scaffold approach, in fact, various options for "temporary and removable support" are used, such as removable metal needles [Moldovan NI. et al. Tissue Eng Part B Rev. 2017 Jun; 23 (3): 237-244] or a removable hydrogel from agarose [Norotte C. et al. Biomaterials. 2009 Oct; 30 (30): 5910-7], which, one way or another, undermines the fundamental conceptual novelty of the proposed approach without the use of frameworks. Thus, at least conceptually, these methods use traditional temporary skeletons and removable support.
При создании трехмерных биологических органических, неорганических и тканеинженерных конструктов широко применяются аддитивные технологии. Современные аддитивные технологии, основанные на послойном нанесении биоматериалов, используют различные диспенсеры, причем для поддержки биоматериалов в определенных точках пространства необходимы опорные временные структуры: гидрогели, полимеры, металлические стержни и др.When creating three-dimensional biological organic, inorganic and tissue-engineered constructs, additive technologies are widely used. Modern additive technologies based on layer-by-layer application of biomaterials use various dispensers, and temporary support structures are required to support biomaterials at certain points in space: hydrogels, polymers, metal rods, etc.
Применение аддитивных технологий обладает рядом недостатков:The use of additive technologies has a number of disadvantages:
- продолжительность процесса печати,- the duration of the printing process,
- использование поддерживающего материала (скаффолда),- the use of a supporting material (scaffold),
- разрешающая способность печати зависит от применяемого инструмента печати.- the printing resolution depends on the printing tool used.
Существующие методы биофабрикации предлагают различные решения для сборки клеток в процессе построения моделей тканей, однако все они связаны с воздействием силы гравитации на печатаемые объекты, и до сих пор не было продемонстрировано ни одного метода, с помощью которого можно бы изготавливать тканевые конструкты в отсутствии гравитации в космосе.Existing biofabrication methods offer various solutions for cell assembly in the process of building tissue models, however, they all involve the effect of gravity on printed objects, and so far no method has been demonstrated that can be used to make tissue constructs in the absence of gravity in outer space.
В этом контексте, использование физических полей, таких как магнитные, акустические и электрические поля, в качестве временной и съемной опоры является, вероятно, одним из наиболее интересных и многообещающих вариантов подхода без использования каркасов. Более того, биофабрикация, основанная на использовании физических полей вместо твердых каркасов, представляет собой действительно инновационный подход без каркасов в тканевой инженерии.In this context, the use of physical fields such as magnetic, acoustic and electric fields as a temporary and removable support is probably one of the most interesting and promising options for a non-scaffold approach. Moreover, biofabrication, based on the use of physical fields instead of rigid scaffolds, represents a truly innovative scaffold-free approach in tissue engineering.
Первоначально магнитные поля привлекли гораздо больше внимания, чем другие физические поля в тканевой инженерии без скаффолдов и поддерживающих биоматериалов. Ошеломляющий феномен магнитной левитации живой лягушки в сильном магнитном поле, о котором сообщил Андре Гейм [Simon MD., Geim AK. Journal Applied Physics Vol. 87, N 9 1 May 2000 6200-6204], а также авторитетная работа группы Джорджа Уайтсайда [Mirica KA. et al. 2011 Sep 22; 23(36):4134-40] вызвали интерес и создали прочную основу для систематического изучения магнитной левитации различных объектов. Последующие прорывные исследования, демонстрирующие магнитную левитационную биосборку живых объектов, включая отдельные клетки и сфероиды тканей, были важной вехой в продвижении использования магнитных полей в биофабрикации и тканевой инженерии []. Новаторские работы из лаборатории Уткана Демирчи представили миниатюризацию технологии магнитной левитации до микрофлюидики [Tasoglu S. et al. Adv Healthc Mater. 2015 Jul 15;4(10): 1469-76, 1422]. Думрус с соавторами впервые продемонстрировали магнитную левитацию отдельных клеток и то, как их профиль изменяется при гибели клетки [Durmus NG. et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2015 Jul 14; 112(28):Е3661-8]. Эти новые результаты были позже подтверждены несколькими группами, и наша группа, например, сообщила о магнитной левитационной биосборке трехмерных тканевых инженерных конструктов без применения каркасов, меток и диспенсеров с использованием тканевых сфероидов из клеток хряща или хондросфер в качестве строительных блоков [Parfenov VA. et al. Biofabrication. 2018 Jun 18; 10(3):034104].Initially, magnetic fields received much more attention than other physical fields in tissue engineering without scaffolds and supporting biomaterials. The stunning phenomenon of magnetic levitation of a living frog in a strong magnetic field reported by André Geim [Simon MD., Geim AK. Journal Applied Physics Vol. 87, No. 9 1 May 2000 6200-6204], as well as the authoritative work of the group of George Whiteside [Mirica KA. et al. 2011 Sep 22; 23 (36): 4134-40] aroused interest and created a solid foundation for the systematic study of magnetic levitation of various objects. Subsequent breakthrough studies demonstrating magnetic levitation biassembly of living objects, including individual cells and tissue spheroids, were an important milestone in advancing the use of magnetic fields in biofabrication and tissue engineering []. Pioneering work from the laboratory of Utkan Demirchi presented the miniaturization of magnetic levitation technology to microfluidics [Tasoglu S. et al. Adv Healthc Mater. 2015 Jul 15; 4 (10): 1469-76, 1422]. Dumrus et al. Were the first to demonstrate the magnetic levitation of individual cells and how their profile changes upon cell death [Durmus NG. et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2015 Jul 14; 112 (28): E3661-8]. These new results were later confirmed by several groups, and our group, for example, reported on the magnetic levitation biassembly of three-dimensional tissue engineering constructs without the use of scaffolds, labels and dispensers using tissue spheroids from cartilage cells or chondrospheres as building blocks [Parfenov VA. et al. Biofabrication. 2018 Jun 18; 10 (3): 034104].
Однако для реализации магнитной левитационной биосборки необходимо использовать относительно токсичную парамагнитную среду, содержащую соль гадолиния. Возможный токсический эффект солей гадолиния может подорвать потенциальную предполагаемую ценность биофабрикации тканевых инженерных конструктов с использованием магнитной левитационной биосборки в качестве надежных in vitro трехмерных моделей тканей для фундаментальных и прикладных исследований и, таким образом, представляет собой проблему в продвижении магнитной левитационной биосборки.However, for the implementation of magnetic levitation bioassembly, it is necessary to use a relatively toxic paramagnetic medium containing the gadolinium salt. The potential toxic effect of gadolinium salts could undermine the potential purported value of biofabrication of tissue engineering constructs using magnetic levitation biassembly as reliable in vitro 3D tissue models for basic and applied research and thus presents a challenge in advancing magnetic levitation biassembly.
Таким образом, подход для создания трехмерных биологических органических, неорганических и тканеинженерных конструктов, основанный на управляемой магнитной седиментации или левитационной сборке конструкта в неоднородном магнитном поле из хаотично распределенных в рабочем объеме жидкой среды органических и неорганических материалов, является альтернативой к существующим. При этом магнитное поле выполняет функции временного физического каркаса. После фабрикации левитирующий конструкт продолжает находиться под воздействием поля до тех пор, пока не произойдет процесс его полной фабрикации (слияние с образованием единого конструкта).Thus, the approach for creating three-dimensional biological organic, inorganic and tissue-engineered constructs based on controlled magnetic sedimentation or levitation assembly of a construct in an inhomogeneous magnetic field from organic and inorganic materials randomly distributed in the working volume of a liquid medium is an alternative to the existing ones. In this case, the magnetic field acts as a temporary physical framework. After fabrication, the levitating construct continues to be under the influence of the field until the process of its complete fabrication takes place (merging with the formation of a single construct).
Известна фабрикация конструктов из тканевых сфероидов путем магнитной левитационной сборки, описанная в статье Parfenov VA. et al. Biofabrication. 2018 Jun 18; 10(3):034104. Использовались тканевые сфероиды, в частности хондросферы, изготовленные из суставных хондроцитов. Описанный в статье способ биосборки заключается в следующем. Кювету, заполненную парамагнитной жидкостью с тканевыми сфероидами, помещали в центр кольцевых постоянных магнитов, ориентированных друг к другу одноименными полюсами. Магнитная система обеспечивает генерацию магнитного поля с градиентом до 2,2 Т/см с локальным минимумом в центре рабочей зоны. В центре конструкции перпендикулярно оси магнитных колец было сделано цилиндрическое отверстие для наблюдения за процессом фабрикации с помощью 2-х цифровых камер CMOS, источников света и системы линз. Установка помещена в инкубатор для обеспечения соответствующего температурного режима. Парамагнитная жидкость состояла из среды с концентрацией соли Gd3+ 50 мМ.Known fabrication of constructs from tissue spheroids by magnetic levitation assembly, described in the article Parfenov VA. et al. Biofabrication. 2018
Однако данная магнитная система позволяет поддерживать жизнеспособность получаемого конструкта не более 24 часов из-за наличия в питательной среде солей гадолиния в высокой концентрации. Кроме того, для получения конструктов больших размеров такой концентрации солей гадолиния недостаточно.However, this magnetic system allows maintaining the viability of the resulting construct for no more than 24 hours due to the presence of high concentration of gadolinium salts in the nutrient medium. In addition, such a concentration of gadolinium salts is insufficient to obtain constructs of large sizes.
Теоретически существует три возможных способа снижения нежелательного токсического действия парамагнитной среды: i) выработка малотоксичного гадолиния или альтернативной парамагнитной среды; ii) выполнение левитационной биосборки в сильном магнитном поле; и iii) выполнение магнитной левитационной биосборки в условиях микрогравитации. Все эти три способа являются предметом систематических исследований.Theoretically, there are three possible ways to reduce the undesirable toxic effect of the paramagnetic medium: i) the production of low-toxic gadolinium or an alternative paramagnetic medium; ii) performing levitation biassembly in a strong magnetic field; and iii) performing magnetic levitation biassembly under microgravity conditions. All three of these methods are the subject of systematic research.
Таким образом, для фабрикации тканевых и органных конструктов больших размеров при нетоксичной концентрации парамагнетика необходимо либо использовать магнитные системы с интенсивностью магнитного поля до 30 Т (Магниты Биттера или сверхпроводящие магниты), обеспечивающие требуемый градиент магнитного поля на протяжении всего рабочего объема, либо использовать условия микрогравитации, например, на борту Международной Космической Станции (МКС). Однако данные решения остаются нерешенными и являются задачей биоинженерии.Thus, for fabrication of tissue and organ constructs of large sizes at a non-toxic concentration of paramagnets, it is necessary either to use magnetic systems with a magnetic field intensity of up to 30 T (Bitter magnets or superconducting magnets), providing the required magnetic field gradient throughout the entire working volume, or to use microgravity conditions , for example, aboard the International Space Station (ISS). However, these solutions remain unresolved and are the task of bioengineering.
Предположением настоящего изобретения является то, что магнитная левитационная биосборка в условиях микрогравитации в космосе может быть реализована при нетоксичных низких концентрациях солей гадолиния. Использование условий космической микрогравитации значительно снизит концентрацию солей Gd3+ и позволит также получать конструкты больших размеров. Таким образом, существует потребность в создании магнитного биопринтера, способного производить фабрикацию в условиях МКС с системой доставки биоматериалов на борт МКС, фиксации полученных конструктов в условиях космической микрогравитации и возврата конструктов на Землю.The assumption of the present invention is that magnetic levitation biassembly under microgravity conditions in space can be realized at non-toxic low concentrations of gadolinium salts. The use of conditions of space microgravity will significantly reduce the concentration of Gd 3+ salts and will also make it possible to obtain constructs of large sizes. Thus, there is a need to create a magnetic bioprinter capable of fabricating under ISS conditions with a system for delivering biomaterials to the ISS, fixing the resulting constructs in space microgravity and returning the constructs to Earth.
Раскрытие сущности изобретенияDisclosure of the essence of the invention
Настоящее изобретение посвящено разработке способа биофабрикации конструктов, а также разработке конструкции магнитного биопринтера и кюветы, которая предоставляла бы возможность загрузки биоматериалов, могла быть использована для их доставки на МКС и/или космическое пространство, для установки в зону, в которой под действием магнитных сил будут собираться частицы и в течение времени образовывать неразрывный слитый конструкт, при необходимости производить фиксацию полученных конструктов, а также обеспечивать возврат полученных материалов на Землю.The present invention is devoted to the development of a method for biofabrication of constructs, as well as to the development of a design for a magnetic bioprinter and a cuvette that would provide the ability to load biomaterials, could be used for their delivery to the ISS and / or outer space, for installation in a zone in which, under the influence of magnetic forces, to collect particles and over time form an inseparable merged construct, if necessary, fix the resulting constructs, as well as ensure the return of the received materials to the Earth.
Новый магнитный биопринтер был спроектирован, разработан и сертифицирован для проведения биологических исследований и разработок. Трехмерные тканевые конструкты впервые были изготовлены в космосе в условиях микрогравитации на основе тканевых сфероидов из хондроцитов человека с использованием магнитной левитационной биосборки при низких нетоксичных концентрациях парамагнитной среды.The new magnetic bioprinter has been designed, developed and certified for biological research and development. Three-dimensional tissue constructs were first fabricated in space under microgravity conditions based on tissue spheroids from human chondrocytes using magnetic levitation biassembly at low non-toxic concentrations of the paramagnetic medium.
Биосборка и последовательное слияние тканевых сфероидов показали хорошее соответствие разработанными прогнозными математическими моделями и компьютерному моделированию. Полученные трехмерные тканевые конструкты продемонстрировали хорошую жизнеспособность и высокую степень слияния сфероидов. Таким образом, представленные ниже данные убедительно свидетельствуют о том, что биофабрикация трехмерных тканевых конструктов без использования каркасов, основанная на использовании магнитных полей, является реальной альтернативой традиционным подходам, основанным на использовании каркасов, что указывает на новый перспективный путь исследований, который может значительно продвинуть разработку биофабрикации тканей. Магнитная левитационная биосборка трехмерных тканевых конструктов в космосе также может способствовать развитию науки о жизни в космосе, космической регенеративной медицины и обеспечению безопасного исследования космоса человеком.Bioassembly and sequential fusion of tissue spheroids showed good agreement with the developed predictive mathematical models and computer modeling. The resulting three-dimensional tissue constructs showed good viability and a high degree of spheroid fusion. Thus, the data presented below strongly indicate that biofabrication of three-dimensional tissue constructs without the use of scaffolds, based on the use of magnetic fields, is a real alternative to traditional approaches based on the use of scaffolds, which indicates a promising new research path that can significantly advance the development of biofabrication of tissues. Magnetic levitation biassembly of three-dimensional tissue constructs in space can also contribute to the development of life science in space, space regenerative medicine and ensuring safe human space exploration.
Одной из технических задач настоящего изобретения является разработка способа биофабрикации трехмерных конструктов из биоматериала путем магнитной левитационной сборки в космическом пространстве, обеспечивающего получение жизнеспособных биологических конструктов различных типов и размеров.One of the technical objectives of the present invention is to develop a method for biofabrication of three-dimensional constructs from a biomaterial by magnetic levitation assembly in outer space, which provides viable biological constructs of various types and sizes.
Еще одной из технических задач настоящего изобретения является создание кюветы, которая должна быть предназначена для доставки, биофабрикации, фиксации и возврата биологических образцов на Землю. Кювета с биообразцами должна представлять собой конструкцию, состоящую из двух емкостей с рабочими растворами и камеры для биофабрикации. В некоторых частных вариантах воплощения изобретения каждая емкость с рабочим раствором должна иметь объем не менее 0,5 мл, а камера биофабрикации должна иметь объем не более 2 мл. В частных вариантах стенки камеры биофабрикации должны быть прозрачны.Another of the technical problems of the present invention is to create a cuvette that should be designed for delivery, biofabrication, fixation and return of biological samples to the Earth. The cuvette with biosamples should be a structure consisting of two containers with working solutions and a chamber for biofabrication. In some particular embodiments of the invention, each container with the working solution must have a volume of at least 0.5 ml, and the biofabrication chamber must have a volume of no more than 2 ml. In private versions, the walls of the biofabrication chamber should be transparent.
В конструкции кюветы с биобразцами должны быть сформированы каналы для перетеснения рабочих растворов в камеру для биофабрикации. Каждая емкость с рабочим раствором должна иметь персональный независимый шток. В некоторых частных вариантах воплощения изобретения конструкция камеры биофабрикации должна обеспечивать компенсацию объема не менее 1 мл.In the design of the cuvette with biosamples, channels must be formed for displacing the working solutions into the chamber for biofabrication. Each container with a working solution must have a personal independent stem. In some particular embodiments of the invention, the biofabrication chamber must be designed to compensate for a volume of at least 1 ml.
При этом разработанная кювета также может быть использована как для доставки и использования в космическом пространстве, так и в земных условиях.At the same time, the developed cuvette can also be used both for delivery and use in outer space and in terrestrial conditions.
Еще одной технической задачей настоящего изобретения является разработка магнитного биопринтера для печати в условиях космического пространства, в том числе на МКС и искусственных спутниках.Another technical problem of the present invention is the development of a magnetic bioprinter for printing in outer space, including the ISS and artificial satellites.
Магнитный биопринтер должен осуществлять сборку конструктов путем создания в рабочей зоне неоднородного магнитного поля с магнитной ямой в центре и размещения в рабочей зоне кювет с парамагнитной питательной средой и тканевыми сфероидами. Магнитный принтер должен иметь экранирующий от постоянного магнитного поля корпус. В некоторых вариантах воплощения изобретения уровень напряженности постоянного магнитного поля, создаваемый устройством, не должен превышать значения 8 кА/м на расстоянии 10 мм от корпуса прибора.A magnetic bioprinter must assemble constructs by creating a non-uniform magnetic field in the working area with a magnetic pit in the center and placing cuvettes with a paramagnetic nutrient medium and tissue spheroids in the working area. The magnetic printer must be shielded from a permanent magnetic field. In some embodiments of the invention, the level of the constant magnetic field generated by the device should not exceed 8 kA / m at a distance of 10 mm from the housing of the device.
Магнитный биопринтер должен обеспечивать, по меньшей мере:A magnetic bioprinter must provide at least:
- возможность установки, по меньшей мере, одной кюветы, в некоторых частных вариантах воплощения изобретения - шести кювет, с биообразцами при проведении сеанса космического эксперимента;- the ability to install at least one cuvette, in some particular embodiments of the invention - six cuvettes, with biosamples during a space experiment session;
- возможность извлечения и установки камер для видеорегистрации хода эксперимента;- the ability to remove and install cameras for video recording of the course of the experiment;
- возможность освещения шести кювет с биообразцами. В некоторых частных вариантах воплощения изобретения освещение может быть реализовано светодиодами белого света, питание светодиодов может быть реализовано от автономных источников питания, например, батарейки типа АА;- the ability to illuminate six cuvettes with biosamples. In some particular embodiments of the invention, the lighting can be implemented with white light LEDs, the power supply of the LEDs can be realized from autonomous power sources, for example, AA batteries;
- возможность установки и извлечения регистратора температуры.- the ability to install and remove the temperature recorder.
Еще одной технической задачей настоящего изобретения является разработка способа доставки биоматериалов в космическое пространство, а также для фиксации и возврата полученных трехмерных конструктов на Землю, который в частных вариантах воплощения, но не ограничиваясь, может осуществляться с использованием описанной в настоящем описании кюветы, обеспечивающего сохранную доставку биоматериала и трехмерных конструктов.Another technical objective of the present invention is to develop a method for delivering biomaterials into outer space, as well as for fixing and returning the obtained three-dimensional constructs to the Earth, which in particular embodiments, but not limited to, can be carried out using a cuvette described in this description, which ensures safe delivery biomaterial and three-dimensional constructs.
Технические задачи (технический результат) достигаются за счет предлагаемого способа биофабрикации трехмерных конструктов из биоматериала в космическом пространстве, включающего следующие последовательные этапы:Technical tasks (technical result) are achieved due to the proposed method of biofabrication of three-dimensional constructs from biomaterial in outer space, including the following sequential stages:
- активация биоматериала, заключенного в неадгезивный термообратимый биосовместимый гидрогель внутри камеры для биофабрикации, путем его охлаждения до температуры золь-гель перехода,- activation of a biomaterial enclosed in a non-adhesive thermo-reversible biocompatible hydrogel inside the biofabrication chamber by cooling it to the sol-gel transition temperature,
- перетеснение питательной среды, содержащей парамагнитные соли, в камеру биофабрикации,- displacement of the nutrient medium containing paramagnetic salts into the biofabrication chamber,
- помещение камеры для биофабрикации в магнитную систему биопринтера для магнитной левитационной сборки так, чтобы рабочий объем указанной камеры находился в центре неоднородного магнитного поля, создаваемого магнитной системой биопринтера; причем магнитную левитационную сборку осуществляют в центральной области неоднородного магнитного поля с наименьшими параметрами напряженности поля из хаотично распределенного в рабочем объеме камеры для биофабрикации биоматериала, растворенного в питательной среде с парамагнитными свойствами,- placing the chamber for biofabrication in the magnetic system of the bioprinter for the magnetic levitation assembly so that the working volume of the said chamber is in the center of the non-uniform magnetic field created by the magnetic system of the bioprinter; moreover, the magnetic levitation assembly is carried out in the central region of a non-uniform magnetic field with the lowest parameters of the field strength from a chaotically distributed in the working volume of the chamber for biofabrication of a biomaterial dissolved in a nutrient medium with paramagnetic properties,
- фиксация полученного трехмерного конструкта путем перетеснения фиксирующего раствора в камеру для биофабрикации.- fixation of the obtained three-dimensional construct by displacing the fixing solution into the chamber for biofabrication.
В частных вариантах воплощения изобретения в качестве биоматериала используют тканевые сфероиды или клетки.In particular embodiments of the invention, tissue spheroids or cells are used as a biomaterial.
В частных вариантах воплощения изобретения питательная среда с парамагнитными по отношению к биоматериалам свойствами содержит соли гадолиния (Gd3+).In particular embodiments of the invention, the nutrient medium with properties paramagnetic with respect to biomaterials contains gadolinium salts (Gd 3+ ).
В частных вариантах воплощения изобретения гидрогель имеет температуру золь-гель перехода 15-17°С так, при температуре выше температуры перехода гидрогель имеет более твердую структуру (структура желеобразная), а при температуре ниже температуры перехода гидрогель имеет более жидкую структуру.In particular embodiments of the invention, the hydrogel has a sol-gel transition temperature of 15-17 ° C, so, at a temperature above the transition temperature, the hydrogel has a harder structure (jelly-like structure), and at a temperature below the transition temperature, the hydrogel has a more liquid structure.
Технические задачи (технический результат) также достигаются за счет предлагаемой конструкции кюветы для биофабрикации трехмерных конструктов из биоматериала в космическом пространстве, которая содержитTechnical tasks (technical result) are also achieved due to the proposed design of a cuvette for biofabrication of three-dimensional constructs from biomaterial in outer space, which contains
- камеру для биофабрикации,- chamber for biofabrication,
- по меньшей мере, одну емкость для фиксирующего раствора,- at least one container for fixing solution,
- по меньшей мере, одну емкость для питательной среды с парамагнитными свойствами, причем каждая из емкостей имеет поршень для перетеснения, соответственно, фиксирующего раствора или питательной среды с парамагнитными свойствами, и соединена с камерой биофабрикации через канал с клапанным узлом для перетеснения фиксирующего раствора или питательной среды с парамагнитными свойствами в камеру биофабрикации, соответственно,- at least one container for a nutrient medium with paramagnetic properties, each of the containers has a piston for displacing, respectively, a fixing solution or a nutrient medium with paramagnetic properties, and is connected to the biofabrication chamber through a channel with a valve assembly for displacing the fixing solution or nutrient medium with paramagnetic properties into the biofabrication chamber, respectively,
причем емкости и камера биофабрикации выполнены с возможностью герметичного закрывания.moreover, the containers and the biofabrication chamber are made with the possibility of hermetically sealed.
В частных вариантах воплощения изобретения клапан клапанного узла емкости для фиксирующего раствора выполнен по принципу поршня, а клапан клапанного узла емкости для питательного раствора выполнен по принципу ниппельного клапана.In particular embodiments of the invention, the valve of the fixing solution container valve assembly is made according to the piston principle, and the valve of the nutrient solution container valve assembly is made according to the nipple valve principle.
В частных вариантах воплощения изобретения кювета имеет внутренний корпус, представляющий собой цельнолитую деталь, причем емкости с рабочими растворами сконфигурированы в верхней части корпуса, а камера биофабрикации сконфигурирована в нижней части корпуса.In particular embodiments of the invention, the cuvette has an inner body, which is a one-piece piece, and the containers with working solutions are configured in the upper part of the body, and the biofabrication chamber is configured in the lower part of the body.
В частных вариантах воплощения изобретения на нижней части внутреннего корпуса коаксиально установлены труба внутренняя, труба наружная, при этом один из торцов трубы наружной соединен со съемной крышкой, а внутри трубы внутренней установлен компенсатор.In particular embodiments of the invention, an inner pipe and an outer pipe are coaxially mounted on the lower part of the inner housing, while one of the outer pipe ends is connected to a removable cover, and an expansion joint is installed inside the inner pipe.
В частных вариантах воплощения изобретения стенки трубы внутренней и трубы наружной выполнены из оптически прозрачного материала.In particular embodiments of the invention, the walls of the inner tube and the outer tube are made of an optically transparent material.
В частных вариантах воплощения изобретения на верхней части внутреннего корпуса установлен внешний корпус, соединенный с внутренним корпусом посредством фиксирующих элементов с возможностью их разъема.In particular embodiments of the invention, an outer case is installed on the upper part of the inner case, which is connected to the inner case by means of fixing elements so that they can be detached.
В частных вариантах воплощения изобретения стенки камеры биофабрикации выполнены из оптически прозрачного материала.In particular embodiments of the invention, the walls of the biofabrication chamber are made of an optically transparent material.
В частных вариантах воплощения изобретения кювета включает одну емкость для фиксирующего раствора и одну емкость для питательной среды с парамагнитными свойствами.In particular embodiments of the invention, the cuvette includes one container for fixing solution and one container for a nutrient medium with paramagnetic properties.
Технические задачи (технический результат) также достигаются за счет предлагаемого биопринтера для фабрикации трехмерных конструктов из биоматериала в космическом пространстве, включающегоTechnical tasks (technical result) are also achieved due to the proposed bioprinter for fabricating three-dimensional constructs from biomaterial in outer space, including
- основание, выполненное в сечении в виде полуокружности, в котором радиально расположена по меньшей мере одна магнитная система, которая состоит из, по меньшей мере, двух соединенных одноименными полюсами неодимовых кольцевых магнитов,- a base made in cross-section in the form of a semicircle, in which at least one magnetic system is radially located, which consists of at least two neodymium ring magnets connected by the same poles,
при этом на внешней поверхности основания расположен, по меньшей мере, один портал с закрепленной на нем диафрагмой для установки кюветы по п. 2 в магнитную систему так, чтобы рабочий объем указанной камеры находился в центре неоднородного магнитного поля, создаваемого магнитной системой,while on the outer surface of the base there is at least one portal with a diaphragm fixed on it for installing the cuvette according to
- боковые, передний и задний защитные экраны, расположенные со всех сторон биопринтера, для экранирования магнитного поля.- side, front and rear protective screens located on all sides of the bioprinter to shield the magnetic field.
В частных вариантах воплощения изобретения в центре магнитной установки перпендикулярно оси кольцевых магнитов расположено сквозное отверстие для наблюдения за процессом фабрикации, а на переднем защитном экране напротив соответствующих отверстий для наблюдения за процессом фабрикации установлены цифровые камеры для мониторинга и фиксирования процесса фабрикации конструктов.In particular embodiments of the invention, in the center of the magnetic installation perpendicular to the axis of the ring magnets, there is a through hole for observing the fabrication process, and on the front protective screen opposite the corresponding holes for monitoring the fabrication process, digital cameras are installed to monitor and record the fabrication process.
В частных вариантах воплощения изобретения биопринтер содержит шесть магнитных установок.In particular embodiments of the invention, the bioprinter contains six magnetic devices.
В частных вариантах воплощения изобретения биопринтер дополнительно содержит блок освещения для освещения процесса фабрикации, регистратор температуры для регистрации температуры в камере биофабрикации и блок питания для всех электрических компонентов биопринтера.In particular embodiments of the invention, the bioprinter further comprises a lighting unit for lighting the fabrication process, a temperature recorder for recording the temperature in the biofabrication chamber, and a power supply unit for all electrical components of the bioprinter.
В частных вариантах воплощения изобретения биопринтер дополнительно содержит декоративные панели, расположенные с обеих сторон основания и установленные на переднем и заднем защитных экранах.In particular embodiments of the invention, the bioprinter further comprises decorative panels located on both sides of the base and mounted on the front and rear protective screens.
В частных вариантах воплощения изобретения геометрия кольцевых магнитов и геометрия сквозного отверстия выбирается исходя из требуемой формы конструкта.In particular embodiments of the invention, the geometry of the ring magnets and the geometry of the through hole are selected based on the desired shape of the construct.
Технические задачи (технический результат) также достигаются за счет предлагаемого применения вышеописанной кюветы для доставки биоматериалов в космическое пространство, а также для фиксации и возврата полученных трехмерных конструктов на Землю.Technical tasks (technical result) are also achieved through the proposed use of the above-described cuvette for delivering biomaterials into outer space, as well as for fixing and returning the obtained three-dimensional constructs to the Earth.
В частных вариантах воплощения изобретения биоматериал помещают в камеру биофабрикации кюветы вместе с неадгезивным термообратимым и биосовместимым гидрогелем, характеризующимся температурой золь-гель перехода 15-17°С так, при температуре выше температуры перехода гидрогель имеет более твердую структуру (структура желеобразная), а при температуре ниже температуры перехода гидрогель имеет более жидкую структуру.In particular embodiments of the invention, the biomaterial is placed in the biofabrication chamber of the cuvette together with a non-adhesive thermo-reversible and biocompatible hydrogel characterized by a sol-gel transition temperature of 15-17 ° C, so at a temperature above the transition temperature, the hydrogel has a more solid structure (jelly-like structure), and at a temperature below the transition temperature, the hydrogel has a more liquid structure.
Технические задачи (технический результат) также достигаются за счет предлагаемого способа доставки биоматериала в космическое пространство для биофабрикации трехмерных конструктов, в котором биоматериал помещают в емкость с неадгезивным термообратимым и биосовместимым гидрогелем, характеризующимся температурой золь-гель перехода 15-17°С так, что при температуре выше температуры перехода гидрогель имеет более твердую структуру (структура желеобразная), а при температуре ниже температуры перехода гидрогель имеет более жидкую структуру.Technical tasks (technical result) are also achieved due to the proposed method of delivery of biomaterial into outer space for biofabrication of three-dimensional constructs, in which the biomaterial is placed in a container with a non-adhesive thermo-reversible and biocompatible hydrogel characterized by a sol-gel transition temperature of 15-17 ° C so that at At temperatures above the transition temperature, the hydrogel has a harder structure (jelly-like structure), and at temperatures below the transition temperature, the hydrogel has a more liquid structure.
В частных вариантах воплощения изобретения в качестве гидрогеля используют гель на основе сополимера поли-N-изопропилакриламида и полиэтиленгликоля (PNIPAAm-PEG).In particular embodiments of the invention, a gel based on a copolymer of poly-N-isopropylacrylamide and polyethylene glycol (PNIPAAm-PEG) is used as a hydrogel.
В частных вариантах воплощения изобретения емкость представляет собой камеру биофабрикации вышеописанной кюветы.In particular embodiments of the invention, the container is a biofabrication chamber of the above-described cuvette.
Магнитно-левитационная биосборка трехмерных тканевых конструктов была выполнена впервые в условиях микрогравитации в космосе при нетоксичной концентрации парамагнитной среды. Приведенные ниже данные демонстрируют возможность быстрой биофабрикации без каркасов, с использованием магнитных полей в качестве технологической альтернативы традиционным подходам на основе скаффолдов в тканевой инженерии. Микрогравитация в космосе может стать идеальной средой для быстрой тканевой инженерии тканей и органов на космических станциях и будущих планетарных поселениях. Она может значительно продвинуть исследования в области космической жизни, основанные на использовании биофабрикации тканей и органов человека в условиях микрогравитации, позволит исследовать потенциальное негативное воздействие космического излучения на ткани человека, позволит разработать и испытать эффективные контрмеры против излучения и создать прочную основу для появляющейся космической регенеративной медицины и дальнейшее безопасное исследование космоса человеком.Magnetic-levitation biassembly of three-dimensional tissue constructs was performed for the first time under microgravity conditions in space with a non-toxic concentration of a paramagnetic medium. The data below demonstrate the possibility of fast biofabrication without scaffolds using magnetic fields as a technological alternative to traditional scaffold-based approaches in tissue engineering. Microgravity in space could be an ideal environment for rapid tissue engineering of tissues and organs in space stations and future planetary settlements. It can significantly advance research in the field of space life based on the use of biofabrication of human tissues and organs in microgravity, will allow to study the potential negative effects of cosmic radiation on human tissues, will allow to develop and test effective countermeasures against radiation and create a solid foundation for the emerging space regenerative medicine. and further safe exploration of space by humans.
Краткое описание чертежейBrief Description of Drawings
Признаки изобретения станут более очевидными на основе последующего подробного описания, в котором сделана ссылка на прилагаемые чертежи, на которых:The features of the invention will become more apparent on the basis of the following detailed description, in which reference is made to the accompanying drawings, in which:
На фиг. 1 изображены схематичный вид воплощения магнитной установки с характеристиками магнитного поля и с изображением поэтапной сборки конструктов из частиц в жидкости под действием конкретного варианта магнитного поля.FIG. 1 shows a schematic view of an embodiment of a magnetic installation with characteristics of a magnetic field and depicting a step-by-step assembly of constructs from particles in a liquid under the action of a specific version of a magnetic field.
Фиг. 1а - магнитная установка; фиг. 1b - магнитное поле, создаваемое магнитной установкой; фиг. 1с - поэтапная сборка конструкта; фиг. 1d - форма конструкта после сборки; фиг. 1е - кинетика сборки конструкта при различных концентрациях гадобутрола и температуре.FIG. 1a - magnetic installation; fig. 1b - magnetic field generated by the magnetic device; fig. 1c - phased assembly of the construct; fig. 1d - the form of the construct after assembly; fig. 1f - kinetics of construct assembly at various gadobutrol concentrations and temperatures.
На фиг. 2 изображено оборудование, состоящее из магнитного биопринтера и кювет. Фиг. 2а - разрез секции магнитного биопринтера. Фиг. 2b - схема установки кюветы в биопринтер. Фиг. 2с - внешний вид оборудования. Фиг. 2d - разрез секции кюветы. Фиг. 2е - электронный разрез установленной кюветы в биопринтер. Фиг. 2f - фотография космонавта с магнитным биопринтером со вставленными кюветами при установке биопринтера в термостат на 37°С.FIG. 2 shows the equipment consisting of a magnetic bioprinter and cuvettes. FIG. 2a is a sectional view of the magnetic bioprinter section. FIG. 2b is a diagram of the installation of the cuvette in the bioprinter. FIG. 2c - equipment appearance. FIG. 2d is a sectional view of the cuvette section. FIG. 2f - electronic section of the installed cuvette in the bioprinter. FIG. 2f - photograph of an astronaut with a magnetic bioprinter with inserted cuvettes when the bioprinter is installed in a thermostat at 37 ° C.
На фиг. 3 изображен предпочтительный вариант осуществления магнитного биопринтера.FIG. 3 depicts a preferred embodiment of a magnetic bioprinter.
На фиг. 4 изображен предпочтительный вариант осуществления кюветы.FIG. 4 shows a preferred embodiment of a cuvette.
На фиг. 5 приведены результаты экспериментальных данных. На фиг. 5а и 5b изображены фазоконрастные изображения первичных хондроцитов в 20-культуре при разных уровнях монослойности. На фиг. 5b представлено изображение первичных хондроцитов в 20-культуре после продолжительного культивирования. На фиг. 5с изображена визуализация окрашенных альциановым синим хондрогенно-дифференцированных сфероидов. На фиг. 5d представлена экспрессия коллагена типа II в дифференцированных сфероидах с иммуногистохимическим окрашиванием (ИГХ).FIG. 5 shows the results of the experimental data. FIG. 5a and 5b show phase contrast images of primary chondrocytes in 20-culture at different levels of monolayer. FIG. 5b shows an image of primary chondrocytes in 20-culture after prolonged culture. FIG. 5c depicts visualization of chondrogenically differentiated spheroids stained with alcian blue. FIG. 5d shows the expression of type II collagen in differentiated spheroids with immunohistochemical staining (IHC).
На фиг. 6 представлена оценка влияния геля Мебиол (Mebiol Gel) на хондросферы. Фиг. 6а - хондросфера после 72-часовой инкубации в Мебиол геле (анализ живых/мертвых клеток, живые клетки окрашиваются в зеленый цвет); фиг. 6b - количественная оценка жизнеспособности хондросфер после 72-часовой инкубации в Мебиол геле и среде культивирования с использованием набора CellTiter-Glo; фиг. 6с - распределение диаметров 2-хдневных хондросфер, фиг. 6d - хондросфера после 72 часов инкубации в среде культивирования (контроль); фиг. 6е - временная кривая межсферных углов для пар хондросфер при слиянии; фиг. 6f - округлость 2-хдневных хондросфер; фиг. 6g - характеристики термочувствительного гидрогеля до разбавления; фиг. 6h - характеристики термочувствительного гидрогеля после разбавления; фиг. 6i - вязкость чистого и разбавленного гидрогеля.FIG. 6 shows an assessment of the effect of Mebiol Gel on chondrospheres. FIG. 6а - chondrosphere after 72-hour incubation in Mebiol gel (analysis of living / dead cells, living cells are stained green); fig. 6b - quantitative assessment of the viability of chondrospheres after 72-hour incubation in Mebiol gel and culture medium using the CellTiter-Glo kit; fig. 6c - distribution of diameters of 2-day chondrospheres, fig. 6d - chondrosphere after 72 hours of incubation in the culture medium (control); fig. 6f - time curve of inter-sphere angles for pairs of chondrospheres at merging; fig. 6f - roundness of 2-day chondrospheres; fig. 6g - characteristics of the thermosensitive hydrogel before dilution; fig. 6h - characteristics of the thermosensitive hydrogel after dilution; fig. 6i - viscosity of pure and diluted hydrogel.
На фиг. 7 представлены морфологические исследования трехмерных тканевых конструктов, полученных после магнитной левитации в космосе, и влияние различных концентраций гадобутрола на морфологию хондросфер. Фиг. 7а - компьютерное моделирование последовательных этапов биосборки тканевых сфероидов в трехмерную конструкцию из ткани с использованием программного обеспечения «Surface Evolver»; фиг. 7b - морфология, гистология (окрашивание гематоксилин-эозином, ГЭ) и иммуногистохимия (Ki-67, Casp3) трехмерных тканевых конструктов, полученных в космическом эксперименте; фиг. 7g - иммуногистохимическое окрашивание хондросфер, подвергшихся воздействию 10 мМ и 50 мМ гадобутрола в течение 24 часов; фиг. 7h - изображения ПЭМ клеток в хондросферах без выдерживания в гадолинии и после воздействия 10 мМ и 50 мМ гадобутрола.FIG. 7 presents morphological studies of three-dimensional tissue constructs obtained after magnetic levitation in space, and the effect of various concentrations of gadobutrol on the morphology of chondrospheres. FIG. 7a - computer simulation of the sequential stages of biassembly of tissue spheroids into a three-dimensional tissue structure using the Surface Evolver software; fig. 7b - morphology, histology (staining with hematoxylin-eosin, HE) and immunohistochemistry (Ki-67, Casp3) of three-dimensional tissue constructs obtained in a space experiment; fig. 7g - immunohistochemical staining of chondrospheres exposed to 10 mM and 50 mM gadobutrol for 24 hours; fig. 7h - TEM images of cells in chondrospheres without incubation in gadolinium and after exposure to 10 mM and 50 mM gadobutrol.
На фиг. 8 схематически изображена схема космического эксперимента. Фиг. 8а - заправка кювет на Земле тканевыми сфероидами в термочувствительном неадгезивном гидрогеле, питательной средой с парамагнетиком и фиксирующим раствором (формалин); фиг. 8b - основные этапы проведения экспериментов на борту Российского сегмента МКС с использованием устройства для магнитной сборки и изготовления конструктов; фиг. 8с - кюветы, спустившиеся на Землю, уложенные в спускаемую укладку.FIG. 8 is a schematic diagram of a space experiment. FIG. 8a - filling cells on Earth with tissue spheroids in a thermosensitive non-adhesive hydrogel, a nutrient medium with a paramagnet and a fixing solution (formalin); fig. 8b - main stages of experiments onboard the ISS Russian Segment using a device for magnetic assembly and fabrication of constructs; fig. 8c - cuvettes descended to the Earth, laid in a descent stack.
На фиг. 9 схематично изображена магнитная установка с использованием магнита Биттера.FIG. 9 schematically shows a magnetic installation using a Bitter magnet.
Термины и определенияTerms and Definitions
Определения некоторых терминов, используемых в данном описании, приведены ниже. Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.Some of the terms used in this description are defined below. Unless otherwise specified, technical and scientific terms in this application have the standard meanings generally accepted in the scientific and technical literature.
В данном контексте термин «тканевые сфероиды» (или «сфероиды») относится к тканевым сфероидам, которые могут быть созданы из различных типов клеток. Так, например, сфероиды могут состоять из фибробластов, хондроцитов, кератиноцитов, первичных астроцитов, тироцитов, ММСК (мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки), клеток опухолевых линий (например, клеток человеческой меланомы), но не ограничиваясь ими. В некоторых вариантах воплощения метода могут быть использованы разные типы тканевых сфероидов (т.е. состоящих из разных типов клеток) для одновременной фабрикации.In this context, the term "tissue spheroids" (or "spheroids") refers to tissue spheroids that can be created from various types of cells. So, for example, spheroids can consist of fibroblasts, chondrocytes, keratinocytes, primary astrocytes, thyrocytes, MMSC (multipotent mesenchymal stromal cells), tumor cells (for example, human melanoma cells), but not limited to them. In some embodiments of the method, different types of tissue spheroids (i.e., composed of different types of cells) can be used to fabricate simultaneously.
В данном контексте термин «среда» относится к любой среде, предназначенной для культивирования и/или кристаллизации или перекристаллизации и выбираемой в зависимости от типа органических и/или неорганических материалов, используемых при создании конструктов.In this context, the term "environment" refers to any medium intended for cultivation and / or crystallization or recrystallization and selected depending on the type of organic and / or inorganic materials used in creating constructs.
Например, в качестве питательной среды может быть использована среда альфа-МЕМ для тканевых сфероидов из кератиноцитов, первичных астроцитов и клеток человеческой меланомы. В качестве питательной среды может быть использована среда DMEM для тканевых сфероидов из фибробластов, хондроцитов, ММСК, и клеток опухолевых линий. В качестве питательной среды может быть использована среда F-12 для тканевых сфероидов из тироцитов, культур клеток яичников китайского хомячка и клеток гибридомы. В качестве питательной среды может быть использована среда RPMI-1640 для тканевых сфероидов из лимфоидных клеток. В качестве питательной среды может быть использована среда DMEM/F12 для тканевых сфероидов из клеток поджелудочной железы.For example, an alpha-MEM medium for tissue spheroids from keratinocytes, primary astrocytes, and human melanoma cells can be used as a nutrient medium. As a nutrient medium, DMEM can be used for tissue spheroids from fibroblasts, chondrocytes, MMSCs, and tumor cells. As a nutrient medium, F-12 medium can be used for tissue spheroids from thyrocytes, cultures of Chinese hamster ovary cells and hybridoma cells. As a nutrient medium, RPMI-1640 medium for tissue spheroids from lymphoid cells can be used. As a nutrient medium, DMEM / F12 medium for tissue spheroids from pancreatic cells can be used.
При необходимости в среде могут быть растворены элементы, способствующие быстрому склеиванию органических и/или неорганических материалов после помещения в зону фабрикации.If necessary, elements can be dissolved in the medium that facilitate the rapid adhesion of organic and / or inorganic materials after being placed in the fabrication zone.
Также в среде растворяются соли парамагнетика в различных концентрациях. Концентрация парамагнетика выбирается в зависимости от конечного получаемого конструкта. Например, для получения конструктов из тканевых сфероидов, полученных из различных типов клеток путем левитационной магнитной сборки используется 0,1-50 мМ Gd3+.Also, paramagnetic salts dissolve in the medium in various concentrations. The concentration of the paramagnet is chosen depending on the final obtained construct. For example, to obtain constructs from tissue spheroids obtained from various types of cells by levitation magnetic assembly, 0.1-50 mM Gd 3+ is used .
В настоящем описании и в формуле изобретения термины «включает», «включает в себя» и другие их грамматические формы не предназначены для истолкования в исключительном смысле, а, напротив, используются в неисключительном смысле (т.е. в смысле «имеющий в своем составе»). В качестве исчерпывающего перечня следует рассматривать только выражения типа «состоящий из».In the present description and in the claims, the terms "includes", "includes" and their other grammatical forms are not intended to be construed in an exclusive sense, but, on the contrary, are used in a non-exclusive sense (i.e. in the sense of "having in its composition "). Only expressions of the type “consisting of” should be considered as an exhaustive list.
Подробное описание вариантов воплощения изобретенияDETAILED DESCRIPTION OF EMBODIMENTS OF THE INVENTION
Настоящее изобретение, в целом, направлено на осуществление магнитной левитационной биосборки в нетоксичной концентрации парамагнитной среды в условиях микрогравитации.The present invention is generally directed to the implementation of magnetic levitation biassembly in a non-toxic concentration of a paramagnetic medium under microgravity conditions.
Способ магнитной фабрикации различных органических и/или неорганических материалов путем магнитной левитационной сборки подразумевает использование диамагнитных частиц материалов, помещенных в парамагнитную среду, и зону, в которой под действием магнитных сил будут собираться частицы и в течение времени образовывать неразрывный конструкт.The method of magnetic fabrication of various organic and / or inorganic materials by means of magnetic levitation assembly involves the use of diamagnetic particles of materials placed in a paramagnetic medium, and a zone in which particles will collect under the action of magnetic forces and form an unbreakable construct over time.
В качестве органических и/или неорганических материалов используются тканевые сфероиды из различных типов клеток, а также клетки многоклеточных или одноклеточных организмов. Для придания среде парамагнитных свойств используются парамагнитные вещества, например, соли гадолиния (Gd3+) в различных концентрациях.Tissue spheroids from various types of cells, as well as cells of multicellular or unicellular organisms, are used as organic and / or inorganic materials. To impart paramagnetic properties to the medium, paramagnetic substances are used, for example, gadolinium salts (Gd 3+ ) in various concentrations.
Для осуществления способа магнитной фабрикации была разработана принципиальная схема реализации способа магнитной левитационной сборки путем создания неоднородного магнитного поля с областью наименьшей напряженности поля в центре. Для этого была создана магнитная установка, которая позволяет одновременно выполнять шесть магнитных левитационных экспериментов. Магнитная установка состоит из двух соединенных одноименными полюсами неодимовых магнитных колец, выполненных из сплава N52. Для проведения одновременных экспериментов возможно объединение нескольких пар магнитов в единую сборку. В центре конструкции перпендикулярно оси магнитных колец сделано цилиндрическое отверстие для наблюдения за процессом фабрикации. На фиг. 1 изображена магнитная установка (фиг. 1а) и магнитное поле, создаваемое данной магнитной установкой (фиг. 1б).To implement the method of magnetic fabrication, a schematic diagram of the implementation of the method of magnetic levitation assembly was developed by creating an inhomogeneous magnetic field with an area of the lowest field strength in the center. For this, a magnetic installation was created, which allows simultaneous execution of six magnetic levitation experiments. The magnetic installation consists of two neodymium magnetic rings connected by the same poles, made of alloy N52. For simultaneous experiments, it is possible to combine several pairs of magnets into a single assembly. A cylindrical hole is made in the center of the structure perpendicular to the axis of the magnetic rings to observe the fabrication process. FIG. 1 shows a magnetic installation (Fig. 1a) and the magnetic field created by this magnetic installation (Fig. 1b).
Изменяя форму магнитов (добавление отверстий, изменение ширины каждого магнита и т.д.) биопринтер можно использовать для получения конструктов из разных материалов различной заданной формы.By changing the shape of the magnets (adding holes, changing the width of each magnet, etc.), the bioprinter can be used to produce constructs from different materials of various predetermined shapes.
Так как направление магнитной силы зависит от градиента квадрата поля, в центре конструкции во всех трех направлениях наблюдается минимум всех трех пространственных компонентов напряженности магнитного поля.Since the direction of the magnetic force depends on the gradient of the square of the field, a minimum of all three spatial components of the magnetic field strength is observed in the center of the structure in all three directions.
В центр магнитной системы помещают кюветы с различной средой с разной концентрацией парамагнетика (Gd3+) и хаотично распределенных органических и/или неорганических частиц в данной среде. Концентрация парамагнетика зависит от плотности частиц и от вязкости среды. Кювета помещается в отверстие магнитной установки вдоль оси х (фиг. 1а).In the center of the magnetic system, cells are placed with different media with different concentrations of the paramagnet (Gd 3+ ) and randomly distributed organic and / or inorganic particles in this medium. The concentration of the paramagnet depends on the density of the particles and on the viscosity of the medium. The cuvette is placed in the hole of the magnetic device along the x-axis (Fig. 1a).
За счет разницы магнитных проницаемостей частиц и жидкости в неоднородном поле создается движущая магнитная сила в центр данной магнитной ловушки. В зависимости от соотношения проницаемостей, сила либо выталкивает частицы из области сильного магнитного поля в сторону слабого поля, либо действует в обратном направлении. Данная конструкция позволяет осуществлять процесс фабрикации или сборки единого конструкта из хаотично распределенных в среде различных органических и/или неорганических частиц. Тем самым происходит фабрикация различных органических и/или неорганических конструктов путем левитационной сборки в неоднородном магнитном поле. На фиг. 1с приведены изображения поэтапной сборки конструктов из частиц в жидкости под действием определенного варианта магнитного поля.Due to the difference in the magnetic permeabilities of particles and liquid in an inhomogeneous field, a driving magnetic force is created in the center of this magnetic trap. Depending on the ratio of permeabilities, the force either pushes particles out of the region of a strong magnetic field towards a weak field, or acts in the opposite direction. This design allows the fabrication or assembly of a single construct from various organic and / or inorganic particles randomly distributed in the environment. Thus, the fabrication of various organic and / or inorganic constructs takes place by means of levitational assembly in an inhomogeneous magnetic field. FIG. 1c shows images of the stage-by-stage assembly of constructs from particles in a liquid under the influence of a certain variant of a magnetic field.
Форма конструкта после сборки приведена на фиг. 1d. На фиг. 1е отражена кинетика сборки конструкта при различных концентрациях гадобутрола и температурах (стрелкой показана теоретически допустимая концентрация парамагнетика, которую можно использовать для сборки конструкта).The form of the construct after assembly is shown in FIG. 1d. FIG. 1f shows the kinetics of construct assembly at various concentrations of gadobutrol and temperatures (the arrow shows the theoretically permissible concentration of the paramagnet, which can be used to assemble the construct).
Для применения способа магнитной фабрикации на Международной Космической Станции и/или в космическом пространстве используются следующие устройства:To apply the magnetic fabrication method on the International Space Station and / or in outer space, the following devices are used:
- Магнитный биопринтер (фиг. 2с) «Organ.Aut», который внедрен и сертифицирован для использования на Международной космической станции (МКС),- Magnetic bioprinter (Fig. 2c) "Organ.Aut", which is implemented and certified for use on the International Space Station (ISS),
- Кювета для биофабрикации, доставки частиц на Международную Космическую Станцию и/или космическое пространство и спуска полученных конструктов на Землю (разрез секции кюветы показан на фиг. 2d).- A cuvette for biofabrication, delivery of particles to the International Space Station and / or outer space and descent of the resulting constructs to Earth (section of the cuvette section is shown in Fig. 2d).
Трехмерный магнитный биопринтер «Organ.Aut» (рис. 2с) и прикрепленные 6 кювет были специально разработаны для космических экспериментов по изучению трехмерной биофабрикации тканеинженерных конструктов, лежащих в основе самосборки живых тканей и органов в условиях микрогравитации с помощью магнитного поля.Three-dimensional magnetic bioprinter "Organ.Aut" (Fig. 2c) and attached 6 cuvettes were specially designed for space experiments to study the three-dimensional biofabrication of tissue engineering constructs that underlie self-assembly of living tissues and organs in microgravity using a magnetic field.
Данный конкретный вариант исполнения магнитного биопринтера осуществляет сборку конструктов путем создания в рабочей зоне неоднородного магнитного поля с магнитной ямой в центре. Данный конкретный вариант исполнения магнитного принтера имеет экранирующий от постоянного магнитного поля корпус.This particular embodiment of a magnetic bioprinter assembles constructs by creating an inhomogeneous magnetic field in the working area with a magnetic pit in the center. This particular embodiment of the magnetic printer has a permanent magnetic field shielding housing.
Данный конкретный вариант исполнения магнитного биопринтера обеспечивает:This particular embodiment of the magnetic bioprinter provides:
- возможность установки шести кювет с биообразцами при проведении сеанса магнитной фабрикации;- the ability to install six cuvettes with biosamples during a session of magnetic fabrication;
- возможность извлечения и установки камер для видеорегистрации хода эксперимента;- the ability to remove and install cameras for video recording of the course of the experiment;
- возможность освещения шести кювет с биообразцами.- the ability to illuminate six cuvettes with biosamples.
- возможность установки и извлечения регистратора температуры;- the ability to install and remove the temperature recorder;
- возможность замены батареек типа АА.- the ability to replace AA batteries.
На фиг. 2 изображено научное оборудование, состоящее из магнитного биопринтера 100 и кювет 200. Внешний вид оборудования представлен на фиг. 2с. Разрез секции магнитного биопринтера 100 показан на фиг. 2а, где условно обозначены: 110 - магнитная установка, состоящая из двух соединенных одноименными полюсами неодимовых магнитных колец; 120 - источник питания (в предпочтительном варианте осуществления источник питания выполнен в виде батареек типа АА), 130 - блок освещения; 140-портал для установки кюветы. Более подробно описание конструкции магнитного биопринтера будет приведено ниже.FIG. 2 shows a scientific equipment consisting of a
Конструкция кюветы 200, которая устанавливается в один из порталов магнитного биопринтера 100 (схема установки приведена на фиг. 2b) отражена на фиг. 2d, где 210 - кнопки-поршни впрыска питательной среды и зажим; 220 - поршни вторичного контура безопасности; 230 - объем для замка; 240 - объем для питательной среды; 250 - клапан для питательной среды; 260 - поршневой клапан для фиксатора; 270 - объем для тканевых сфероидов и термочувствительного гидрогеля. Электронный разрез установленной кюветы в биопринтер изображен на фиг. 2е. На фиг. 2f представлена фотография космонавта с магнитным биопринтером со вставленными кюветами при установке биопринтера в термостат на 37°С.The design of the
Предпочтительный вариант осуществления магнитного биопринтера 100 в разборном состоянии приведен на фиг. 3. Основным элементом данного магнитного биопринтера является основание 150 (фиг. 3), в котором находятся шесть магнитных установок.A preferred embodiment of a collapsible
Основание 150 выполнено в сечении в виде полуокружности, в котором радиально расположена по меньшей мере одна магнитная система 151, которая состоит из, по меньшей мере, двух соединенных одноименными полюсами неодимовых кольцевых магнитов 120.The
Корпус выполнен из алюминиевого сплава Д16Т ГОСТ 4784-98 путем механической обработки. Для фиксации магнитов используются прижимы, зафиксированные винтами М8 ГОСТ 11738-84 из нержавеющей стали 12Х18Н10Т. Усилие затяжки составляет 3Н*м. Прижимы выполнены из алюминиевого сплава Д16Т ГОСТ 4784-98 путем механической обработки.The body is made of aluminum alloy D16T GOST 4784-98 by machining. To fix the magnets, clamps are used, fixed with M8 screws GOST 11738-84 from stainless steel 12X18H10T. The tightening force is 3N * m. The clamps are made of aluminum alloy D16T GOST 4784-98 by machining.
Для экранирования магнитного поля предусмотрены задний и передний экраны 161, 162 (фиг. 3), боковые экраны 163 (фиг. 3), выполненные из магнитной нержавеющей стали 20X13 ГОСТ 5949-75. Крепление экранов к корпусу осуществляется винтами М4 из нержавеющей стали 12Х18Н10Т.For shielding the magnetic field, there are rear and
Для загрузки кювет 200 в биопринтер предусмотрены шесть порталов 170, выполненные в виде пластины и диафрагмы. Шесть порталов 170 снабжены механизмами открывания и закрывания и позволяют одновременно устанавливать до шести кювет в одном космическом эксперименте. Портал 170 (в закрытом виде) предназначен для защиты от попадания инородных частей в полости магнитного биопринтера.To load
Портал 170 (в открытом виде) служит для установки кювет 200 в магнитном биопринтере 100 и расположен на внешней поверхности основания 150 биопринтера так, чтобы рабочий объем камеры биофабрикации кюветы 200 находился в центре неоднородного магнитного поля, создаваемого магнитной системой 151.The portal 170 (open) serves to install the
Пластина портала 170 представляет собой прямоугольную деталь, которая выполнена из магнитной нержавеющей стали 20X13 ГОСТ 5949-75.The
Пластина служит для экранирования магнитного поля и крепления диафрагмы с защитной декоративной накладкой.The plate serves for shielding the magnetic field and fixing the diaphragm with a protective decorative strip.
Цифровая камера 130 предназначена для мониторинга и фиксирования процесса магнитной фабрикации конструктов.The
Модель цифровой камеры в предпочтительном варианте осуществления биопринтера -GoPro Hero 4 Silver, которая предназначена для видеозаписи.The digital camera model in the preferred embodiment of the bioprinter is GoPro Hero 4 Silver, which is designed for video recording.
Для освещения зон биофабрикации был спроектирован блок освещения (не показан на фиг. 3).A lighting unit (not shown in FIG. 3) was designed to illuminate the biofabrication zones.
Для питания блока освещения используются шесть батареек типа АА фирмы Durasell (не показаны на фиг. 3).Six AA batteries from Durasell (not shown in Fig. 3) are used to power the lighting unit.
При работе блок освещения потребляет мощность 2 Вт.During operation, the lighting unit consumes 2 watts of power.
Помимо этого, можно установить датчик температуры или рекордер.In addition, a temperature sensor or recorder can be installed.
Каждая кювета для доставки частиц на Международную Космическую Станцию и/или космическое пространство и спуска полученных конструктов на Землю предназначена для доставки, биофабрикации, фиксации и возврата конструктов. Каждая кювета должна содержать все необходимые материалы, обеспечивающие процессбиофабрикации, фиксацию результата и извлечение биологических образцов.Each cell for delivery of particles to the International Space Station and / or outer space and descent of the resulting constructs to Earth is designed for delivery, biofabrication, fixation and return of the constructs. Each cuvette should contain all the necessary materials for the biofabrication process, fixation of the result and extraction of biological samples.
Кювета 200 представляет собой конструкцию, состоящую из трех объемов: емкости 240 для питательной среды (для среды культивирования) (фиг. 4), емкости 280 для фиксирующего раствора (фиг. 4) и емкости (камеры) биофабрикации 270 (фиг. 4). В частных вариантах воплощения данные емкости представляют собой единую деталь, выполненную из поликарбоната. Форма детали цилиндрическая.The
Емкости могут быть выполнены в любой форме. В показанном варианте осуществления емкости имеют цилиндрическую форму со следующими характеристиками:The containers can be made in any shape. In the illustrated embodiment, the containers are cylindrical in shape with the following characteristics:
- Емкость для среды имеет объем 1±0,2 мл.- The medium container has a volume of 1 ± 0.2 ml.
- Емкость для фиксирующего раствора имеет объем 0,5±0,1 мл.- The container for the fixing solution has a volume of 0.5 ± 0.1 ml.
- Камера биофабрикации имеет объем 2±0,2 мл. Стенки камеры биофабрикации прозрачны, что позволяет проводить визуальный осмотр и видеозапись экспериментов.- The biofabrication chamber has a volume of 2 ± 0.2 ml. The walls of the biofabrication chamber are transparent, which allows visual inspection and video recording of experiments.
Две емкости 240, 280 индивидуально соединены с камерой биофабрикации 270, изолированной клапанами 240, 250 (фиг. 4), чтобы избежать нежелательной утечки среды культивирования и/или фиксирующего раствора в основную камеру. Емкости для питательной среды и фиксирующего раствора имеют свои собственные независимые внешние поршни 220 для нажатия пальцами.Two
В конструкции кюветы с биобразцами сформированы каналы для перетеснения рабочих растворов в камеру биофабрикации. Конструкция камеры биофабрикации обеспечивает компенсацию объема не менее 2 мл.In the design of the cuvette with biosamples, channels are formed for displacing working solutions into the biofabrication chamber. The design of the biofabrication chamber provides a volume compensation of at least 2 ml.
Емкость для среды и емкость для фиксирующего раствора имеют персональные независимые друг от друга поршни.The container for the medium and the container for the fixing solution have personal independent pistons.
Для предотвращения непроизвольного перетекания жидкостей из емкости для среды и емкости для фиксирующего раствора в камеру биофабрикации в данном исполнении конструкции предусмотрены клапанные узлы. Два клапана работают по-разному. Клапан, установленный в емкости с питательной средой, использует принцип клапана Шредера, когда избыточное давление в камере (вызванное нажатием внешнего плунжера) расширяет резиновый элемент, позволяя жидкости течь в камеру биофабрикации. Другой клапан, установленный в емкости для фиксации раствора, работает аналогично запорному клапану, где повышение давления смещает поршень клапана в открытом положении, очищая отверстие, позволяющее перенос жидкости из емкости к камере биофабрикации.To prevent the involuntary overflow of liquids from the container for the medium and the container for the fixing solution into the biofabrication chamber, in this design version, valve assemblies are provided. The two valves work differently. The valve, installed in the culture medium tank, uses the Schroeder valve principle, where the overpressure in the chamber (caused by pressing the external plunger) expands the rubber element, allowing the liquid to flow into the biofabrication chamber. Another valve, installed in the solution holding tank, works in a similar way to a check valve, where the increase in pressure moves the valve piston in the open position, clearing the opening that allows fluid transfer from the tank to the biofabrication chamber.
Клапан 250 выполнен по принципу ниппельного клапана. При нажатии на поршень емкости питательной среды внутри емкости возникает избыточное давление, под действием которого ниппель клапана пропускает жидкость в камеру биофабрикации.
Клапан (поз. 6 фиг. 3b) выполнен по принципу поршня. При нажатии на поршень емкости с фиксирующим раствором внутри емкости возникает избыточное давление, под действием которого клапан сдвигается, открывая зазор для протекания жидкости.The valve (pos. 6 fig. 3b) is made according to the piston principle. When the piston of the container with the fixing solution is pressed, an excess pressure arises inside the container, under the action of which the valve moves, opening the gap for the fluid to flow.
Такая разница в исполнениях необходима для обеспечения гарантированной полной изоляции фиксирующего раствора.This difference in designs is necessary to ensure the guaranteed complete isolation of the fixing solution.
Кювета помещается внутрь магнитного биопринтера (фиг. 2б) и после этого происходит процесс магнитной фабрикации. Более подробно, для сборки трехмерных тканевых конструктов кюветы с парамагнитной культуральной средой и тканевые сфероиды помещают в рабочую зону магнитного биопринтера, где к центру прикладывается неоднородное магнитное поле с магнитной ямой.The cuvette is placed inside a magnetic bioprinter (Fig. 2b) and then the process of magnetic fabrication takes place. In more detail, to assemble three-dimensional tissue constructs, cuvettes with a paramagnetic culture medium and tissue spheroids are placed in the working area of a magnetic bioprinter, where an inhomogeneous magnetic field with a magnetic well is applied to the center.
Описанные выше кюветы доставляют в космическое пространство, в частности, например, на МКС, на кораблях «Союз» и «Прогресс». Методика заправки кюветы следующая.The cells described above are delivered into outer space, in particular, for example, on the ISS, on the Soyuz and Progress spacecraft. The method of filling the cuvette is as follows.
В первую очередь осуществляют разборку кюветы, извлекая ее внутренний корпус. Далее снимают трубку внутреннего корпуса и извлекают поршни и компенсатор. Все составные части кюветы стерилизуют. Для заправки устанавливают поршень одной из емкостей (емкость №2) таким образом, чтобы поршень выступал за пределы емкости. Заполняют вторую емкость (емкость №1) до полного уровня заполнения, используя механическую пипетку или шприц. После чего в емкости №1 устанавливают поршень таким образом, чтобы вылет обоих поршней был одинаковым. Путем выкручивания заглушки поршня емкости №2 заправляют емкость №2 до полного уровня заполнения. Заглушку обратно вкручивают в поршень.First of all, the cuvette is disassembled by removing its inner case. Next, the tube of the inner case is removed and the pistons and compensator are removed. All components of the cuvette are sterilized. For refueling, set the piston of one of the containers (container No. 2) so that the piston protrudes beyond the container. Fill the second container (container # 1) to full fill level using a mechanical pipette or syringe. After that, a piston is installed in container No. 1 in such a way that the overhang of both pistons is the same. By unscrewing the plug of the piston of the container No. 2, fill the container No. 2 to the full filling level. The plug is screwed back into the piston.
Растворы для заправки кюветы представлены таблице 1.The solutions for filling the cuvette are presented in Table 1.
В камеру для биофабрикации помещают предварительно охлажденный гель с биоматериалом. Качество сфероидов перед заправкой кювет контролируется по параметрам жизнеспособности клеток и способности сфероидов сливаться в тканевый конструкт. Далее устанавливают компенсатор и помещают сборку в центрифугу, после чего выкручивают заглушку компенсатора. Осуществляют проверку герметичности сборки.A pre-cooled gel with biomaterial is placed in the biofabrication chamber. The quality of the spheroids before filling the cuvettes is controlled by the parameters of cell viability and the ability of the spheroids to fuse into a tissue construct. Next, the compensator is installed and the assembly is placed in a centrifuge, after which the compensator cap is unscrewed. Check the tightness of the assembly.
После доставки кюветы на МКС ее помещают в соответствующую магнитную систему биопринтера. Конструкт формируется, находясь в магнитном принтере; время выдержки для разных материалов конструкта разное - от 1 дня до месяца. По завершению процесса фабрикации кювету извлекают.After the cuvette is delivered to the ISS, it is placed in the appropriate magnetic system of the bioprinter. The construct is formed while in a magnetic printer; the exposure time for different materials of the construct is different - from 1 day to a month. At the end of the fabrication process, the cuvette is removed.
Полученный конструкт извлекается путем полного разбора кюветы на Земле.The resulting construct is extracted by completely disassembling the cuvette on Earth.
Процесс биофабрикации в кювете запускается нажатием кнопки «П1». После этого происходит перенос среды культивирования из ее емкости в зону камеры биофабрикации. Затем кювету помещают в порт магнитного биопринтера (фиг. 3b).The biofabrication process in the cuvette is started by pressing the "P1" button. After that, the culture medium is transferred from its container to the zone of the biofabrication chamber. Then the cuvette is placed in the port of the magnetic bioprinter (Fig. 3b).
Установленная кювета показана на фиг. 3d. После сборки кювета извлекается из порта, нажимается кнопка «П2», чтобы начать фиксацию конструкции.The installed cuvette is shown in FIG. 3d. After assembly, the cuvette is removed from the port, the "P2" button is pressed to start fixing the structure.
Принцип экспериментальной установки подразумевает создание локального минимума потенциала магнитного поля. Из-за неоднородности магнитного поля возникает магнитофоретическая сила. Это вызывает движение частиц от областей, где магнитное поле сильнее. Магнитная сила воздействует на частицы с нейтральными зарядами, которые имеют относительную проницаемость, отличную от фоновой жидкости. Тогда эффективная магнитная сила F, действующая на объект в неоднородном магнитном поле, будет описываться следующим соотношением:The principle of the experimental setup implies the creation of a local minimum of the magnetic field potential. Due to the inhomogeneity of the magnetic field, a magnetophoretic force arises. This causes the particles to move away from areas where the magnetic field is stronger. The magnetic force acts on particles with neutral charges, which have a relative permeability that is different from the background fluid. Then the effective magnetic force F acting on an object in an inhomogeneous magnetic field will be described by the following relation:
F=2πr3μ0μƒK∇(H2),F = 2πr 3 μ 0 μ ƒ K∇ (H 2 ),
где Н - магнитное поле, r - радиус частицы, μf - относительная проницаемость жидкости, μp - относительная проницаемость частицы (сфероидов), μ0 - магнитная постоянная, а K определяется как:where H is the magnetic field, r is the particle radius, μ f is the relative permeability of the liquid, μ p is the relative permeability of the particle (spheroids), μ 0 is the magnetic constant, and K is defined as:
В описанном ниже эксперименте относительная проницаемость жидкости и сфероидов очень близка к 1, поэтому магнитная сила, действующая на частицы, приблизительно линейно зависит от разницы между ними. Разница μp-μf определяет направление действия магнитной силы. В результате объекты будут выталкиваться в область с меньшей напряженностью поля (магнитной ловушкой) под действием магнитной силы.In the experiment described below, the relative permeability of the liquid and the spheroids is very close to 1, so the magnetic force acting on the particles is approximately linearly dependent on the difference between them. The difference μ p -μ f determines the direction of the magnetic force. As a result, objects will be pushed into an area with a lower field strength (magnetic trap) under the influence of a magnetic force.
Изобретение также относится к способу доставки биоматериала в космическое пространство, в котором биоматериал помещают в емкость с неадгезивным термообратимым и биосовместимым гидрогелем, характеризующимся температурой золь-гель перехода 15-17°С так, что при температуре ниже температуры перехода гидрогель имеет структуру золя (т.е. жидкую), а при температуре выше температуры перехода гидрогель имеет структуру неподвижного геля. Другими словами, при охлаждении гель представляет собой золь (обладает свойствами жидкостей), но становится более жестким гидрогелем при более высоких температурах. Золь-гель переход (англ. sol gel transition) - процесс превращения золя в гель, протекающий при увеличении концентрации частиц дисперсной фазы в золе или под влиянием иных внешних воздействий (в частности, изменения температуры).The invention also relates to a method for delivering a biomaterial into outer space, in which the biomaterial is placed in a container with a non-adhesive thermo-reversible and biocompatible hydrogel characterized by a sol-gel transition temperature of 15-17 ° C so that at a temperature below the transition temperature the hydrogel has a sol structure (i.e. i.e. liquid), and at a temperature above the transition temperature, the hydrogel has the structure of an immobile gel. In other words, when cooled, the gel is a sol (has the properties of liquids), but becomes a tougher hydrogel at higher temperatures. Sol-gel transition (eng. Sol gel transition) - the process of transformation of a sol into a gel, occurring with an increase in the concentration of particles of the dispersed phase in the ash or under the influence of other external influences (in particular, temperature changes).
Гидрогели представляют собой класс полимерных материалов, характеризующихся своей сетчатой структурой и высоким содержанием воды. Гидрогели многих видов нашли широкое применение в медицине и биологических исследованиях, ориентированных, но не ограничиваясь, трехмерным культивированием клеток, тканевой инженерией и доставкой лекарств.Hydrogels are a class of polymeric materials characterized by their network structure and high water content. Hydrogels of many types have found wide application in medicine and biological research, focused on, but not limited to, three-dimensional cell culture, tissue engineering and drug delivery.
Для применения в доставке биоматериала в космическое пространство гидрогель должен обладать следующими свойствами:For use in the delivery of biomaterials into outer space, a hydrogel must have the following properties:
неадгезивность (т.е. клетки или сфероиды не распластываются в данном геле),non-adhesiveness (i.e. cells or spheroids do not spread out in this gel),
термообратимость (т.е. при температуре 4-8°С й гель становиться жидким, при температуре выше 20°С гель затвердевает) иthermal reversibility (i.e. at a temperature of 4-8 ° C the gel becomes liquid, at a temperature above 20 ° C the gel hardens) and
биосовместимость (т.е. гель не наносит пагубного влияния на находящиеся в нем биоматериалы).biocompatibility (i.e. the gel does not have a detrimental effect on the biomaterials in it).
Также, при добавлении в такой гидрогель питательной среды сверх того объема, которое необходимо для формирования гидрогеля, гидрогель теряет свое свойство термообратимости и остается жидким и при температурах выше золь-гель перехода (в связи с увеличением концентрации частиц дисперсной фазы в золе).Also, when a nutrient medium is added to such a hydrogel in excess of the volume that is necessary for the formation of a hydrogel, the hydrogel loses its thermo-reversibility property and remains liquid at temperatures above the sol-gel transition (due to an increase in the concentration of particles of the dispersed phase in the ash).
Дополнительным требованием к гидрогелям является прозрачность (для наблюдения за процессом биофабрикации), отсутствие биологических веществ, которые могут загрязнять биоматериал.An additional requirement for hydrogels is transparency (for monitoring the biofabrication process), the absence of biological substances that can contaminate the biomaterial.
В некоторых вариантах воплощения в качестве гидрогеля используют гель на основе сополимера поли-N-изопропилакриламида и полиэтиленгликоля (PNIPAAm-PEG).In some embodiments, a poly-N-isopropylacrylamide-polyethylene glycol copolymer gel (PNIPAAm-PEG) is used as the hydrogel.
В некоторых частных вариантах воплощения в качестве гидрогеля используют Mebiol Gel (Мебиол гель).In some particular embodiments, Mebiol Gel is used as the hydrogel.
Изобретение также относится к применению гидрогеля на основе сополимера поли-N-изопропилакриламида и полиэтиленгликоля (PNIPAAm-PEG) для доставки биоматериала в космическое пространство, в частности, изобретение относится к применению для этих целей гидрогеля Мебиол гель.The invention also relates to the use of a hydrogel based on a copolymer of poly-N-isopropylacrylamide and polyethylene glycol (PNIPAAm-PEG) for delivering a biomaterial into outer space, in particular, the invention relates to the use of a Mebiol gel hydrogel for these purposes.
Мебиол гель - термообратимый гелеобразующий полимер, представляющий собой сополимер, состоящий из термореактивных полимерных блоков [поли(N-изопропилакриламид-со-n-бутилметакрилат) поли(NIPAAm-со-ВМА)] и гидрофильные полимерные блоки (полиэтиленгликоль [ПЭГ]). Мебиол гель характеризуется его температурно-зависимыми динамическими вязкоупругими свойствами. Термореактивные блоки являются гидрофильными при температурах ниже температуры перехода золь-гель и гидрофобны при температурах, выше температуры золь-гель перехода. Гидрофобное взаимодействие приводит к образованию гомогенной трехмерной полимерной сети в воде. Температуру золь-гель-перехода можно контролировать, изменяя химическую композицию NIPAAm-co-BMA и PEG. Клетки или ткани могут быть помещены в жидкий раствор геля Мебиол при более низких температурах и культивированы.Mebiol gel is a thermo-reversible gel-forming polymer, which is a copolymer consisting of thermosetting polymer blocks [poly (N-isopropylacrylamide-co-n-butyl methacrylate) poly (NIPAAm-co-BMA)] and hydrophilic polymer blocks (polyethylene glycol [PEG]). Mebiol gel is characterized by its temperature-dependent dynamic viscoelastic properties. Thermosetting blocks are hydrophilic at temperatures below the sol-gel transition temperature and hydrophobic at temperatures above the sol-gel transition temperature. The hydrophobic interaction leads to the formation of a homogeneous three-dimensional polymer network in water. The sol-gel transition temperature can be controlled by changing the chemical composition of NIPAAm-co-BMA and PEG. Cells or tissues can be placed in liquid Mebiol gel solution at lower temperatures and cultured.
Свойства, очень благоприятные для применения в клеточных культурах и тканевой инженерии, привели к коммерциализации Mebiol® Gel, сополимера поли (N-изопропилакриламида) и поли (этиленгликоля) (PNIPAAm-PEG) для исследовательских целей в начале 2000-х годов.Properties very favorable for applications in cell culture and tissue engineering led to the commercialization of Mebiol® Gel, a copolymer of poly (N-isopropylacrylamide) and poly (ethylene glycol) (PNIPAAm-PEG) for research purposes in the early 2000s.
Отличительной особенностью Мебиол геля, в отличие от других коммерчески доступных гидрогелей, является его температурный золь-гель переход. При охлаждении Мебиол геля представляет собой золь (обращается как жидкость), но становится более жестким гидрогелем при более высоких температурах. На практике это означает чрезвычайно простую работу с клетками. Культуры высевают в охлажденный гель Мебиол и удобно извлекают путем охлаждения емкости для культивирования и центрифугирования. В гелеобразном состоянии высоколипофильная среда геля Мебиол представляет собой эффективную нишу для пролиферации клеток, взаимодействия между клетками, газо- и массообмена и защиты клеток и тканей от сил сдвига.A distinctive feature of Mebiol gel, in contrast to other commercially available hydrogels, is its temperature sol-gel transition. When cooled, the Mebiol gel is a sol (turns like a liquid), but becomes a harder hydrogel at higher temperatures. In practice, this means extremely simple cell handling. The cultures are plated in chilled Mebiol gel and conveniently removed by cooling the culture vessel and centrifugation. In the gel state, the highly lipophilic medium of Mebiol gel is an effective niche for cell proliferation, interaction between cells, gas and mass transfer, and protection of cells and tissues from shear forces.
Особенности Мебиол геля:Features of Mebiol gel:
• Простота в обращении.• Ease of handling.
• Нетоксичный, биосовместимый.• Non-toxic, biocompatible.
• 100% синтетический, без патогенов.• 100% synthetic, pathogen free.
• Высокая прозрачность для наблюдения за клетками.• High transparency for cell observation.
• Проверенная производительность.• Proven performance.
Известные применения Мебиол геля включают в себя:Known uses for Mebiol Gel include:
• Культивирование стволовых клеток и плюрипотентных стволовых клеток, наращивание и дифференцировка.• Cultivation of stem cells and pluripotent stem cells, growth and differentiation.
• Культивирование сфероидов.• Cultivation of spheroids.
• Имплантация клеток.• Cell implantation.
• Регенерация органов и тканей.• Regeneration of organs and tissues.
• Доставки лекарств.• Delivery of medicines.
• Применение для неклеточных культур.• Application for non-cellular cultures.
• Физические свойства.• Physical properties.
Мебиол гель готовят и используют согласно рекомендациям производителя.Mebiol gel is prepared and used according to the manufacturer's recommendations.
1. Регидратация: добавляют 10 или 50 мл холодного водного раствора, подходящего для конкретного применения (например, среда для культивирования, PBS), смачивая весь порошок из упаковки производителя. Колбу размещают в горизонтальном положении и оставляют на несколько часов при температуре 4°С, периодически осторожно встряхивая.1. Rehydration: add 10 or 50 ml of a cold aqueous solution suitable for the specific application (eg culture medium, PBS), wetting all powder from the manufacturer's packaging. The flask is placed in a horizontal position and left for several hours at a temperature of 4 ° C, occasionally shaking gently.
2. Культивирование клеток и восстановление: клетки или ткани добавляют в охлажденный Мебиол гель (в виде золя). Культивируют при 37°С. Восстановите клеток и тканей осуществляют путем охлаждения емкости для культивирования и добавления 30-40 мл/150-200 мл холодной жидкости для предотвращения гелеобразования. Проводят центрифугирование в холоде.2. Cell Culturing and Reconstruction: Cells or tissues are added to chilled Mebiol gel (as a sol). Cultivated at 37 ° C. Reconstitute cells and tissues by cooling the culture vessel and adding 30-40 ml / 150-200 ml of cold liquid to prevent gelation. Centrifugation is carried out in the cold.
Ниже приведены прогностические математические модели и компьютерное моделирование, описывающие магнитную левитационную биосборку и последовательные явления слияния сфероидов в тканях.Below are predictive mathematical models and computer simulations describing magnetic levitation biassembly and sequential spheroid fusion phenomena in tissues.
Взятые вместе, эти технологические достижения позволили впервые успешно внедрить магнитную левитационную биосборку на МКС при низких нетоксичных концентрациях гадолиния в тесном согласии с разработанными математическими моделями. Ниже представлены результаты первых экспериментов в области биофабрикации в космосе с помощью магнитной левитационной биосборки трехмерных тканевых конструктов из хондросфер в условиях микрогравитации в космосе.Taken together, these technological advances made it possible for the first time to successfully implement a magnetic levitation bio-assembly on the ISS at low non-toxic gadolinium concentrations in close agreement with the developed mathematical models. Below are the results of the first experiments in the field of biofabrication in space using a magnetic levitation biassembly of three-dimensional tissue constructs from chondrospheres under microgravity conditions in space.
Материалы и методыMaterials and methods
Неадгезивный гидрогель и среда для культивирования клетокNon-adhesive hydrogel and cell culture medium
При проведении экспериментов была использована агароза компании Helicon (Россия, кат. № Am-0710-0.1). Были использованы модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM, кат. №12491-015), физиологический раствор Дульбекко с фосфатным буфером (PBS, кат. №18912-014), эмбриональная телячья сыворотка (FBS, кат. №16000-044), антибиотик-антимикотик (кат. №15240-062), трипсин/ЭДТА (кат. №25200-114) компании Gibco (США). Был использован L-глютамин (кат. №F032) компании Paneco (Россия). Был использован параформальдегид (кат. №P6148-500G) компании Sigma (США). Использовался Гадовист (гадобутрол) компании Bayer (Германия). Использовался Мебиол гель (Mebiol Gel) (кат. № MBG-PMW20-5001) компании Cosmo Bio (Япония). Также был использован набор для анализа жизнеспособности 3D культур клеток CellTiter-Glo® (кат. №G9682) компании Promega (США).During the experiments, we used agarose from Helicon (Russia, cat. No. Am-0710-0.1). We used Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, cat. No. 12491-015), Dulbecco's saline with phosphate buffer (PBS, cat. No. 18912-014), fetal calf serum (FBS, cat. No. 16000-044), antimycotic antibiotic (cat. # 15240-062), trypsin / EDTA (cat. # 25200-114) from Gibco (USA). We used L-glutamine (cat. # F032) from Paneco (Russia). Paraformaldehyde (Cat. # P6148-500G) from Sigma (USA) was used. Gadovist (gadobutrol) from Bayer (Germany) was used. Used Mebiol Gel (Cat. No. MBG-PMW20-5001) from Cosmo Bio (Japan). A kit for the analysis of the viability of 3D cell cultures CellTiter-Glo® (cat. No. G9682) from Promega (USA) was also used.
Клеточная культураCell culture
При проведении экспериментов были использованы клетки хондроцитов человека (НСН) компании PromoCell (кат. № С-12710), которые выращивались в среде DMEM, содержащей 10% FBS с добавлением антибиотика/антимикотика и 2 мМ L-глютамина. Клетки инкубировали при 37°С во влажной среде, содержащей 5% CO2 и регулярно разделяли (пассировали) при состоянии монослоя 85-95%. Перенос клеток и приготовление клеточных суспензий проводили с использованием мягкой ферментативной диссоциации с 0,25% раствором трипсина/0,53 мМ ЭДТА. Во время культивирования морфологию и пролиферацию клеток наблюдали, используя инвертированную фазово-контрастную микроскопию (Фиг. S1). Клетки были свободны от микоплазменного загрязнения, что подтверждено протоколом окрашивания Hoechst 33258 (Sigma, кат. №861405).In the experiments, we used PromoCell human chondrocyte cells (HCH) (cat. No. C-12710), which were grown in DMEM medium containing 10% FBS supplemented with an antibiotic / antimycotic and 2 mM L-glutamine. The cells were incubated at 37 ° C in a humid environment containing 5% CO 2 and were regularly separated (passaged) at a monolayer state of 85-95%. Cell transfer and preparation of cell suspensions were performed using mild enzymatic dissociation with 0.25% trypsin / 0.53 mM EDTA. During culture, cell morphology and proliferation was observed using inverted phase contrast microscopy (Fig. S1). The cells were free of mycoplasma contamination as confirmed by the Hoechst 33258 staining protocol (Sigma cat # 861405).
Формирование тканевых сфероидов с помощью 3D чашек Петри MicroTissuesTissue Spheroid Formation Using MicroTissues 3D Petri Dishes
Тканевые сфероиды из хондроцитов (далее называемые «хондросферы») были сформированы с использованием микролунок 3D чашки Петри MicroTissues (MicroTissues 3D Petri dish micro-molds компании Sigma Aldrich, cat. № Z764019-6EA, имеющие 81 круглую лунку 800×800 мкм). Концентрация хондроцитов человека составляла 3,4×106 на 1 мл, в результате конечная концентрация составляла 8000 клеток на лунку/сфероид. Тканевые сфероиды инкубировали при 37°С во влажной среде, содержащей 5% CO2, в течение 2-х дней.Chondrocyte tissue spheroids (hereinafter referred to as “chondrospheres”) were formed using MicroTissues 3D Petri dish micro-wells (MicroTissues 3D Petri dish micro-molds from Sigma Aldrich, cat. No. Z764019-6EA, having 81 round 800 × 800 µm wells). The concentration of human chondrocytes was 3.4 x 10 6 per ml, resulting in a final concentration of 8000 cells per well / spheroid. Tissue spheroids were incubated at 37 ° C in a humid environment containing 5% CO 2 for 2 days.
Определение диаметра сфероидов и распределения округлости Диаметр и округлость хондросфер оценивались на второй день их формирования с помощью светлопольной микроскопии (инвертированный микроскоп Nikon Eclipse Ti-E, Япония) и оценены с использованием программного обеспечения Image J 1.48v (NIH, Bethesda, MD, USA).Determination of the spheroid diameter and distribution of roundness The diameter and roundness of chondrospheres were assessed on the second day of their formation using bright-field microscopy (Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope, Japan) and evaluated using Image J 1.48v software (NIH, Bethesda, MD, USA) ...
Оценка влияния Мебиол геля на жизнеспособность тканевых сфероидов Чтобы обеспечить безопасную доставку жизнеспособных тканевых сфероидов с Земли в космос, был использован коммерчески доступный термообратимый гидрогель «Mebiol» (Cosmo Bio, Japan). Поскольку во время доставки на МКС тканевые сфероиды необходимо включать в гель Мебиол на несколько дней, было оценено потенциальное токсическое действие геля Мебиол на тканевые сфероиды. Было разработано устройство, обеспечивающее безопасную доставку жизнеспособных тканевых сфероидов с Земли в космос, которое предотвращает нежелательное преждевременное слияние и распластывание (расхождение, растекание) тканевых сфероидов при транспортировке в космос. Выращенные в течение 2-х дней тканевые сфероиды помещали в Мебиол гель при комнатной температуре на 72 часа. Контрольные сфероиды инкубировали в полной культуральной среде при 37°С во влажной среде, содержащей 5% СО2. Жизнеспособность тканевых сфероидов оценивали с использованием набора CellTiter-Glo 3D в соответствии с протоколом производителя. При использовании набора CellTiter-Glo 3D люминесценция регистрировалась через 60 минут инкубации с использованием многоканального планшет-ридера VICTOR Х3 (Perkin Elmer, США).Evaluation of the effect of Mebiol gel on the viability of tissue spheroids To ensure the safe delivery of viable tissue spheroids from Earth to space, a commercially available thermo-reversible hydrogel Mebiol (Cosmo Bio, Japan) was used. Since tissue spheroids must be incorporated into Mebiol gel for several days during delivery to the ISS, the potential toxic effect of Mebiol gel on tissue spheroids was evaluated. A device has been developed that ensures the safe delivery of viable tissue spheroids from Earth into space, which prevents unwanted premature fusion and spreading (divergence, spreading) of tissue spheroids during transport into space. Tissue spheroids grown for 2 days were placed in Mebiol gel at room temperature for 72 hours. Control spheroids were incubated in complete culture medium at 37 ° C in a humid environment containing 5% CO 2 . The viability of tissue spheroids was assessed using the CellTiter-Glo 3D kit according to the manufacturer's protocol. When using the CellTiter-Glo 3D kit, luminescence was recorded after 60 minutes of incubation using a VICTOR X3 multichannel plate reader (Perkin Elmer, USA).
Качественную оценку жизнеспособности клеток в тканевых сфероидах проводили с использованием набора для окрашивания живых/мертвых клеток Live/Dead Cell Double Staining Kit (Sigma-Aldrich, США) в соответствии с протоколом производителя. Сфероиды инкубировали в растворе, содержащем красителей кальцеин AM и пропидиум йодид (PI), при 37°С в течение 1 часа. После промывания PBS, сфероиды визуализировали с помощью флуоресцентной микроскопии (Nikon Eclipse Ti-Е, Япония).A qualitative assessment of cell viability in tissue spheroids was performed using a Live / Dead Cell Double Staining Kit (Sigma-Aldrich, USA) according to the manufacturer's protocol. Spheroids were incubated in a solution containing calcein AM and propidium iodide (PI) dyes at 37 ° C for 1 hour. After washing with PBS, spheroids were visualized using fluorescence microscopy (Nikon Eclipse Ti-E, Japan).
Анализ слияния сфероидовFusion analysis of spheroids
Анализ слияния сфероидов проводили с использованием неадгезивных сфероидальных микропланшетов Corning (Corning, кат. №4520). Пары тканевых сфероидов помещали в одну лунку и инкубировали в течение 48 часов. Светлопольные изображения дублетов сфероидов были получены в точках 0,1,2, 4, 6, 24 и 48 часов с использованием микроскопа Nikon Eclipse Ti-Е. Межсферный угол измеряли с использованием программного обеспечения Image J 1.48v (NIH, Bethesda, MD, USA) и наносили на график как функцию времени с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA).Spheroid fusion assays were performed using Corning non-adhesive spheroidal microplates (Corning Cat. # 4520). Pairs of tissue spheroids were placed in one well and incubated for 48 hours. Brightfield images of doublets of spheroids were acquired at
Реологическое тестированиеRheological testing
Реологические измерения проводились в режиме колебательного сдвига с использованием ротационного реометра Anton-Paar MCR 501. Образцы чистого раствора Мебиол и рабочего раствора помещали между конусом (СР50-1 / TG-SN15826; d=0,05 мм) и пластиной диаметром 50 мм с зазором 0,5 мм. После охлаждения до +4°С края покрывали минеральным маслом для предотвращения обезвоживания. Температурная зависимость модуля накопления (С'), модуля потерь (G'') и комплексной вязкости (η*) измерялись с помощью температурной развертки (колебания) путем увеличения температуры от +4 до +37°С при скорости нагрева +5°С/мин. Частота и деформация сдвига поддерживались постоянными на уровне 10 рад/с и 1% соответственно. В каждой группе, были измерены по двадцать образцов.Rheological measurements were carried out in vibrational shear mode using an Anton-Paar MCR 501 rotary rheometer. Samples of pure Mebiol solution and working solution were placed between a cone (CP50-1 / TG-SN15826; d = 0.05 mm) and a plate 50 mm in diameter with a gap 0.5 mm. After cooling to + 4 ° C, the edges were covered with mineral oil to prevent dehydration. The temperature dependence of the storage modulus (C '), loss modulus (G' ') and complex viscosity (η *) were measured using a temperature sweep (oscillation) by increasing the temperature from +4 to + 37 ° C at a heating rate of + 5 ° C / min. The frequency and shear strain were kept constant at 10 rad / s and 1%, respectively. In each group, twenty samples were measured.
Компьютерное моделирование магнитного поляComputer simulation of the magnetic field
Трехмерное неоднородное статическое магнитное поле моделировалось с использованием мультифизической вычислительной программы COMSOL методом конечных элементов. Магнитное поле рассчитывали по материалу марки NdFeB магнита N38 (VG=1,21 Тл), а магнитные свойства парамагнитной среды были выбраны эквивалентными экспериментальным: они изменялись в зависимости от концентрации гадобутрола. Моделирование магнитного поля позволило рассчитать уравнение траектории частиц. Переходный расчет траекторий частиц проводился с использованием COMSOL «Модуль отслеживания частиц». Входе этого расчета были приняты во внимание следующие силы: магнитная сила, основанная на разнице между магнитной проницаемостью среды и частицы, сила сопротивления, влияющая на время сборки, и сила упругости взаимодействия частицы с частицей. Ввиду низких скоростей частиц для описания вязкого сопротивления использовался закон сопротивления Стокса. Физические характеристики частиц были выбраны в соответствии с предлагаемым экспериментом: диаметр частиц составлял 0,2 мм, их плотность принималась равной 1050 кг/м3, форма частиц предполагалась сферической, а общее количество моделируемых частиц составляло 400. Особенности парамагнитной жидкости были найдены экспериментально и оказались следующими: плотность составляла около 1000 кг/м3, динамическая вязкость п составляла 0,0474 Па⋅с при температуре 17°С. Рассчитанные скорости и траектории частиц хорошо соответствовали экспериментальным данным. Результирующие значения разницы между парамагнитной проницаемостью жидкости и сфероида μƒ - μp и вязкостью п при некоторых определенных температурах для концентраций 50 мкМ, 10 мкМ и 0,8 мкМ гадобутрола приведены в таблице 2.A three-dimensional inhomogeneous static magnetic field was simulated using the COMSOL multiphysics computational program using the finite element method. The magnetic field was calculated using the material of the NdFeB grade of the N38 magnet (VG = 1.21 T), and the magnetic properties of the paramagnetic medium were chosen to be equivalent to the experimental ones: they changed depending on the concentration of gadobutrol. Simulation of the magnetic field made it possible to calculate the equation for the trajectory of the particles. Transient computation of particle trajectories was performed using the COMSOL Particle Tracking Module. In this calculation, the following forces were taken into account: the magnetic force based on the difference between the magnetic permeability of the medium and the particle, the drag force affecting the assembly time, and the elastic force of the particle-particle interaction. Due to the low particle velocities, Stokes' law of resistance was used to describe the viscous resistance. The physical characteristics of the particles were selected in accordance with the proposed experiment: the diameter of the particles was 0.2 mm, their density was taken equal to 1050 kg / m 3 , the shape of the particles was assumed to be spherical, and the total number of simulated particles was 400. The features of the paramagnetic liquid were found experimentally and turned out to be as follows: the density was about 1000 kg / m 3 , the dynamic viscosity n was 0.0474 Pa · s at a temperature of 17 ° C. The calculated velocities and trajectories of the particles were in good agreement with the experimental data. The resulting values of the difference between the paramagnetic permeability of the liquid and the spheroid μ ƒ - μ p and the viscosity n at certain specific temperatures for concentrations of 50 μM, 10 μM and 0.8 μM gadobutrol are shown in Table 2.
Имитация эволюции поверхностиSimulated surface evolution
Процесс слияния тканевых сфероидов был проиллюстрирован с использованием программного обеспечения Surface Evolver с открытым исходным кодом, разработанного и подробно описанного ранее [Li F, Zhang С, Brakke KA, Lei Z. Sci Rep.2017; 7(1):1-11]. Тканевые сфероиды аппроксимировали и моделировали как шарообразные капли жидкости стандартного размера и объема. Первоначально положение близко контактирующих тканевых сфероидов было случайным. Процесс слияния тканевых сфероидов моделировался путем итерационного градиентного спуска, чтобы минимизировать поверхностную энергию с учетом ограничения постоянных объемов сфероидов, пока движение не остановилось. Скрипт эволюции создавал поверхности соприкосновения между сфероидами, где сфероиды соприкасались. Конфигурация достигла локального минимума энергии, но не обязательно глобального минимума. Были визуализированы прогрессивные изменения в форме одиночных сфероидов, контактирующих друг с другом, формирующих внутри уплотненные тканевые конструкты. Моделирование было выполнено с 40 тканевыми сфероидами.The fusion process of tissue spheroids was illustrated using the open source Surface Evolver software developed and detailed previously [Li F, Zhang C, Brakke KA, Lei Z. Sci Rep. 2017; 7 (1): 1-11]. Tissue spheroids were approximated and modeled as spherical liquid droplets of standard size and volume. Initially, the position of closely contacting tissue spheroids was random. The fusion process of tissue spheroids was simulated by iterative gradient descent to minimize surface energy while limiting the constant volumes of the spheroids until motion stopped. The evolution script created contact surfaces between the spheroids where the spheroids touched. The configuration has reached a local energy minimum, but not necessarily a global minimum. Progressive changes were visualized in the shape of single spheroids in contact with each other, forming dense tissue constructs inside. The simulation was performed with 40 tissue spheroids.
Биомеханическое тестированиеBiomechanical testing
Биомеханические свойства тканевых сфероидов измеряли с помощью микромасштабной системы тестирования сжатия параллельных пластин Microsquisher (CellScale, Канада) и соответствующего программного обеспечения SquisherJoy. Тканевые сфероиды были сформированы с использованием сфероидальных микропланшетов Corning (Corning, кат. №4520) в соответствии с протоколом производителя при конечных концентрациях 8000 клеток на сфероид. Сфероидальные микропланшеты Corning инкубировали при 37°С во влажной среде, содержащей 5% СО2 в течение 2-х дней. Затем 2х-дневные тканевые сфероиды помещали в Мебиол гель (Cosmo Bio, кат. № MBG-PMW20-5001) на 72 часа. Контрольные тканевые сфероиды инкубировали в полной культуральной среде при 37°С во влажной среде, содержащей 5% СО2. Для биомеханического тестирования тканевые сфероиды помещали в ванну, заполненную PBS, при 37°С и сжимали до 50% деформации в течение 20 с. Использовался микропучок диаметром 304,8 мкм (рекомендуемая максимальная сила 917 мН). Данные о силе-смещении, полученные в результате испытания на сжатие, были преобразованы в кривые напряжение-деформация, а нижняя часть кривой (деформация 0-20%) была использована для получения линии линейной регрессии и оценки модуля упругости. В каждой группе были измерены двадцать образцов тканевых сфероидов.The biomechanical properties of tissue spheroids were measured using a Microsquisher parallel plate compression testing system (CellScale, Canada) and the corresponding SquisherJoy software. Tissue spheroids were formed using Corning spheroidal microplates (Corning Cat # 4520) according to the manufacturer's protocol at a final concentration of 8000 cells per spheroid. Corning spheroidal microplates were incubated at 37 ° C in a humid environment containing 5% CO 2 for 2 days. Then, 2-day tissue spheroids were placed in Mebiol gel (Cosmo Bio, Cat. # MBG-PMW20-5001) for 72 hours. Control tissue spheroids were incubated in complete culture medium at 37 ° C in a humid environment containing 5% CO 2 . For biomechanical testing, tissue spheroids were placed in a bath filled with PBS at 37 ° C and compressed to 50% strain for 20 s. A microbeam with a diameter of 304.8 μm was used (the recommended maximum force is 917 mN). The force-displacement data obtained from the compression test was converted to stress-strain curves, and the lower part of the curve (0-20% strain) was used to obtain a linear regression line and estimate the elastic modulus. Twenty tissue spheroid samples were measured in each group.
Гистология и иммуногистохимияHistology and immunohistochemistry
Образцы, фиксированные формалином, помещали в изготовленные на заказ агарозные формы для стереомикроскопии (Nikon SMZ18, Япония) и затем помещали в парафин (Biovitrum, Россия). Серийные срезы толщиной 4 мкм нарезали с помощью Microtome HMS 740 (Thermo Fisher Scientific, США) и размещали на стекле, покрытом поли-L-лизином. Депарафинизацию проводили в ксилоле и в нисходящей батарее спиртов, извлечение антигена проводили с использованием протеиназы К (Sigma-Aldrich, США) в течение 20 минут. Дальнейшие процедуры выполнялись автоматически в системе Autostainer 360 (Thermo Fisher Scientific, США). Протокол включал инкубацию в растворе, блокирующем пероксидазу (10 минут), в растворе, блокирующем белок (10 минут), 30 минут - с первичными антителами, 10 минут - с вторичными антителами и 5-тиминутную обработку 3,3'-диаминобензидином (DAB). Промывку осуществляли в Трис-буфере (рН 6,0) с Твином 20. Первичные поликлональные кроличьи антитела к крысиному и человеческому маркерам Ki-67 и каспаза-3 антитела (оба компании Abbiotec, США) использовали в разведениях 1: 100. Ядра окрашивали гематоксилином Майера. Наконец, срезы обезвоживали и помещали в Bio-Mount (Bio Optica Milano S.P.A., Италия). Некоторые срезы обычно окрашивали гематоксилин-эозином (BioVitrum, Россия) и затем исследовали с помощью световой микроскопии (Nikon Eclipse Ti-E, Япония).Samples fixed with formalin were placed into custom agarose molds for stereomicroscopy (Nikon SMZ18, Japan) and then embedded in paraffin (Biovitrum, Russia). Serial sections with a thickness of 4 μm were cut using Microtome HMS 740 (Thermo Fisher Scientific, USA) and placed on glass coated with poly-L-lysine. Dewaxing was carried out in xylene and in a top-down battery of alcohols; antigen extraction was performed using proteinase K (Sigma-Aldrich, USA) for 20 minutes. Further procedures were performed automatically in the Autostainer 360 system (Thermo Fisher Scientific, USA). The protocol included incubation in a solution that blocks peroxidase (10 minutes), in a solution that blocks a protein (10 minutes), 30 minutes with primary antibodies, 10 minutes with secondary antibodies, and a 5-minute treatment with 3,3'-diaminobenzidine (DAB) ... Washing was carried out in Tris buffer (pH 6.0) with
Трансмиссионная электронная микроскопияTransmission electron microscopy
Для исследования с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) тканевые сфероиды фиксировали в 2,5% растворе глутаральдегида в 0,1 М фосфатном буфере, затем обрабатывали 1% раствором OsO4 в 0,1 М фосфатном буфере, обезвоживали в нисходящих спиртах и, наконец, в пропиленоксиде. После обезвоживания тканевые сфероиды помещали в смесь пропиленоксида и аралдита и затем в аралдит. Полутонкие и ультратонкие срезы получали с использованием ультра ми кротом a Leica еМ UC7 (Leica, Германия). Ультратонкие срезы получали с использованием ультра ми кротом а LKB-III (LKB, Швеция), а затем окрашивали 4% (вес/объем) водным раствором уранилацетата (40 минут при 37°С) и 0,04% (вес/объем) водным раствором цитрата свинца (Reynolds 1963) в течение 20 минут при комнатной температуре. Срезы исследовали на просвечивающем электронном микроскопе JEM 100CX-II (Jeol, Япония), оборудованном цифровой камерой ES500W Erlangshen (Gatan, United Kingdom) с использованием ускоряющего напряжения 80 кВт. Полутонкие срезы нарезали ультрамикротомом LKB-III (LKB, Швеция), окрашивали 1% толуидиновым синим и исследовали на световом микроскопе Leica DM 2500, оборудованном цифровой камерой Leica DFC 290 (Leica, Германия).For study using transmission electron microscopy (TEM), tissue spheroids were fixed in a 2.5% glutaraldehyde solution in 0.1 M phosphate buffer, then treated with 1% OsO 4 solution in 0.1 M phosphate buffer, dehydrated in descending alcohols, and finally , in propylene oxide. After dehydration, tissue spheroids were placed in a mixture of propylene oxide and araldite and then in araldite. Semi-thin and ultrathin sections were obtained using a Leica eM UC7 ultramole (Leica, Germany). Ultrathin sections were obtained using an LKB-III ultramole (LKB, Sweden), and then stained with 4% (w / v) aqueous uranyl acetate (40 minutes at 37 ° C) and 0.04% (w / v) aqueous lead citrate solution (Reynolds 1963) for 20 minutes at room temperature. Sections were examined on a JEM 100CX-II transmission electron microscope (Jeol, Japan) equipped with an ES500W Erlangshen digital camera (Gatan, United Kingdom) using an accelerating voltage of 80 kW. Semi-thin sections were cut with an LKB-III ultramicrotome (LKB, Sweden), stained with 1% toluidine blue, and examined on a Leica DM 2500 light microscope equipped with a Leica DFC 290 digital camera (Leica, Germany).
Окрашивание альциановым синимAlcian blue staining
Фиксированные сфероиды промывали PBS и окрашивали в течение ночи раствором алцианового синего (1% в 0,1 н. HCl). Результаты исследовали с использованием инвертированного светового микроскопа AxioVert 2 (Zeiss), оснащенного DSLR-камерой Nikon D610 (Nikon).The fixed spheroids were washed with PBS and stained overnight with alcian blue solution (1% in 0.1N HCl). The results were examined using an AxioVert 2 (Zeiss) inverted light microscope equipped with a Nikon D610 DSLR camera (Nikon).
Иммуногистохимическое окрашивание на коллаген II типаImmunohistochemical staining for collagen type II
Визуализацию коллагена типа II в сфероидах осуществляли с использованием набора системы обнаружения концентрированной пероксидазы Novocastra™ (код продукта RE7130-K, Leica Microsystems) в соответствии с протоколом производителя. Срезы сфероидов подвергали извлечению антигена путем инкубации в теплом (37°С) растворе трипсина в течение 30 мин. После промывки секций в деионизированной воде эндогенную пероксидазу нейтрализовали с помощью блока пероксидазы Novocastra™ (код продукта RE7101, Leica Microsystems). Неспецифическое связывание первичных и вторичных антител снижалось с помощью белкового блока Novocastra™ (код продукта RE7102, Leica Microsystems). Затем срезы инкубировали в течение 1 часа с оптимально разбавленным первичным антителом к коллагену типа II (код продукта NCL-COLL-Ilp, Novocastra™, Leica Microsystems) с последующей 30-минутной инкубацией с биотинилированным вторичным антителом (концентрированным биотинилированным вторичным антителом Novocastra™ (код продукта RE7108, Leica Microsystems) и 30-минутную инкубацию с конъюгатом стрептавидин-HRP Novocastra™ (код продукта RE7109, Leica Microsystems), конъюгатом стрептавидин-пероксидаза хрена (HRP), который связывается с биотином в молекуле антитела. Пероксидазная активность исследовалась с DAB (хромогенный субстрат HRP 3,3'-диаминобензидин), который был свежеприготовлен с использованием Novocastra™ DAB Chromogen (код продукта RE7105, Leica Microsystems) и Novocastra ™ субстратный буфер (код продукта RE7106, Leica Microsystems). После каждой инкубации (с блоком пероксидазы Novocastra ™, блоком белка Novocastra ™, первичным антителом, вторичным антителом и концентрированным стрептавидином-HRP Novocastra ™ срезы промывали в 0,5 М Трис-буфере, рН 7,6 (Sigma, США) в течение 2×5 минут. Наконец, срезы промывали в дистиллированной воде, окрашивали гематоксилином Novocastra™ (код продукта RE7107, Leica Microsystems), пропускали через серию возрастающих концентраций этанола (70%, 80%, 90%, 96%, 100%), инкубируют в ксилоле и погружают в Канадский бальзам (Canada balsam).Imaging of type II collagen in spheroids was performed using the Novocastra ™ Concentrated Peroxidase Detection System Kit (product code RE7130-K, Leica Microsystems) according to the manufacturer's protocol. Sections of spheroids were subjected to antigen extraction by incubation in warm (37 ° C) trypsin solution for 30 min. After rinsing the sections in deionized water, endogenous peroxidase was neutralized using a Novocastra ™ peroxidase unit (product code RE7101, Leica Microsystems). Nonspecific binding of primary and secondary antibodies was reduced using the Novocastra ™ protein block (product code RE7102, Leica Microsystems). The sections were then incubated for 1 hour with an optimally diluted primary antibody to collagen type II (product code NCL-COLL-Ilp, Novocastra ™, Leica Microsystems) followed by a 30-minute incubation with biotinylated secondary antibody (concentrated biotinylated secondary antibody Novocastra ™ (code RE7108, Leica Microsystems) and 30 min incubation with streptavidin-HRP Novocastra ™ conjugate (product code RE7109, Leica Microsystems), streptavidin-horseradish peroxidase (HRP) conjugate that binds to biotin in the antibody molecule (peroxidase activity tested. HRP chromogenic substrate 3,3'-diaminobenzidine) which was freshly prepared using Novocastra ™ DAB Chromogen (product code RE7105, Leica Microsystems) and Novocastra ™ substrate buffer (product code RE7106, Leica Microsystems) After each incubation (with Novocastra peroxidase unit ™, Novocastra ™ protein block, primary antibody, secondary antibody and concentrated st Reptavidin-HRP Novocastra ™ sections were washed in 0.5 M Tris buffer, pH 7.6 (Sigma, USA) for 2 × 5 minutes. Finally, the sections were washed in distilled water, stained with Novocastra ™ hematoxylin (product code RE7107, Leica Microsystems), passed through a series of increasing ethanol concentrations (70%, 80%, 90%, 96%, 100%), incubated in xylene and immersed in Canadian balsam (Canada balsam).
Статистический анализStatistical analysis
Статистические данные анализировали с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA) и представляли как среднее значение ± S.E.M. Тест дисперсионного анализа (ANOVA) был использован для определения значимых различий между средними значениями трех групп с Р<0,0001.Statistics were analyzed using GraphPad Prism software (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA) and presented as mean ± S.E.M. An analysis of variance (ANOVA) test was used to determine significant differences between the means of the three groups with P <0.0001.
Дизайн экспериментов в космосеSpace Experiment Design
Экспериментальный план исследования включал несколько последовательных шагов (фиг. 8). Тканевые сфероиды были изготовлены из хондроцитов в лаборатории на Земле на космодроме Байконур (Казахстан), а затем помещены в кюветы специального дизайна (фиг. 4), заполненные термообратимым гидрогелем, который обеспечивал жизнеспособность тканевых сфероидов и предотвращал их нежелательное преждевременное слияние и распластывание. После этого кюветы вместе с оригинальным магнитным биопринтером «Organ.Aut» были доставлены на российский сегмент Международной Космической Станции (МКС) российским космическим кораблем «Союз МС-11». На МКС космонавт нажал кнопку «П1» на кюветах (тем самым произвел впрыск к сфероидам питательной среды с парамагнетиком) и произвел охлаждение кюветы с тканевыми сфероидами до 15°C с помощью термостата, что привело к превращению термообратимого гидрогеля из геля в золь и, таким образом, обеспечило свободное движение тканевых сфероидов. После этого кюветы были помещены в магнитный биопринтер на два дня для выполнения биосборки в условиях магнитной левитации и для обеспечения слияние собранного тканевого конструкта. Для записи магнитной левитационной биосборки использовалась видеокамера, встроенная в магнитный биопринтер. Полученные трехмерные тканевые конструкты фиксировали в формалине путем нажатия кнопки П2 на кювете и хранили при комнатной температуре. Через 2 недели кюветы с фиксированными формалином трехмерными тканевыми конструктами были доставлены на Землю и отправлены на анализ.The experimental design of the study included several sequential steps (Fig. 8). Tissue spheroids were made from chondrocytes in a laboratory on Earth at the Baikonur cosmodrome (Kazakhstan), and then placed in specially designed cuvettes (Fig. 4) filled with a thermo-reversible hydrogel, which ensured the viability of tissue spheroids and prevented their unwanted premature fusion and spreading. After that, the cuvettes together with the original magnetic bioprinter "Organ.Aut" were delivered to the Russian segment of the International Space Station (ISS) by the Russian spacecraft "Soyuz MS-11". On the ISS, the astronaut pressed the "P1" button on the cuvettes (thereby injecting the nutrient medium with a paramagnet to the spheroids) and cooled the cell with tissue spheroids to 15 ° C using a thermostat, which led to the transformation of the thermo-reversible hydrogel from gel to sol and, thus thus, ensured the free movement of tissue spheroids. After that, the cuvettes were placed in a magnetic bioprinter for two days to perform biassembly under conditions of magnetic levitation and to ensure fusion of the assembled tissue construct. A video camera built into a magnetic bioprinter was used to record the magnetic levitation bioprinter. The obtained three-dimensional tissue constructs were fixed in formalin by pressing the P2 button on the cuvette and stored at room temperature. After 2 weeks, cuvettes with formalin-fixed three-dimensional tissue constructs were delivered to Earth and sent for analysis.
Математическое моделирование магнитного поля и компьютерное моделирование сборки конструктовMathematical modeling of the magnetic field and computer modeling of the assembly of constructs
Магнитное поле первоначально моделировалось с использованием программного обеспечения COMSOL (фиг. 1). Пример у-компоненты магнитного поля в плоскости xz показан на фиг. 1b, а расположение магнитной ловушки соответствует центру установки. Это показало, что наиболее эффективный способ сборки сфероидов состоял в том, чтобы поместить их в короткую трубку в центре магнитного поля, потому что за пределами центральной половины магнитной области магнитная сила выталкивает частицы в стороны.The magnetic field was originally simulated using COMSOL software (Fig. 1). An example of the y-component of the magnetic field in the xz plane is shown in FIG. 1b, and the location of the magnetic trap corresponds to the center of the installation. This showed that the most efficient way to assemble the spheroids was to place them in a short tube in the center of the magnetic field, because outside the central half of the magnetic field, the magnetic force pushes the particles to the sides.
Моделирование также позволило оценить кинетику сборки (фиг. 1е) и полное время сборки. Было обнаружено, что время сборки сильно зависит от парамагнитной вязкости и магнитной проницаемости. Сравнение результатов компьютерного моделирования и эксперимента показало, что наблюдается хорошее соответствие между временем сборки при концентрации гадобутрола 50 мМ и 10 мМ и температуре 17°С.Simulation also allowed the estimation of the assembly kinetics (Fig. 1f) and the total assembly time. The assembly time was found to be highly dependent on paramagnetic viscosity and permeability. Comparison of the results of computer simulation and experiment showed that there is a good agreement between the assembly time at a concentration of 50 mM and 10 mM gadobutrol and a temperature of 17 ° C.
Однако численное моделирование требует достаточно длительного времени для расчета единичного случая, поэтому для прогнозирования количественной зависимости времени сборки от параметров эксперимента была разработана теоретическая модель. Мы предположили, что на сфероиды воздействуют магнитные силы и препараты. В связи низкой скоростью движения зависимость описывалась законом Стокса. Затем можно написать уравнение движения частицы и оценить время сборки. По-видимому, это время зависит от начального положения каждой частицы, поэтому в общем случае можно найти соотношение, которое описывает продолжительность сборки с точностью до константы, и, кроме того, эта константа одинакова для частиц в аналогичном положении (или положения пробирки внутри магнита).However, numerical simulation requires a rather long time to calculate a single case, therefore, a theoretical model was developed to predict the quantitative dependence of the assembly time on the experimental parameters. We hypothesized that the spheroids are affected by magnetic forces and drugs. Due to the low speed of movement, the dependence was described by Stokes' law. Then you can write the equation of motion of the particle and estimate the assembly time. Apparently, this time depends on the initial position of each particle, therefore, in the general case, one can find a relation that describes the duration of the assembly up to a constant, and, in addition, this constant is the same for particles in a similar position (or the position of a test tube inside a magnet) ...
Результирующее уравнение для времени сборки выглядит следующим образом:The resulting equation for build time looks like this:
где L - ширина постоянного магнита, а Hmax - максимальное значение магнитного поля внутри магнитов. Из этого соотношения очевидно, что время сборки пропорционально отношению вязкости жидкости п к разности магнитной проницаемости μf - μp, которая линейно зависит от концентрации гадобутрола. Таким образом, зная точное время сборки для конкретной концентрации гадобутрола в среде, мы можем точно оценить время сборки той же системы с другой концентрацией гадобутрола. Ясно, что если Tass составляет несколько секунд или минут, то можно говорить о сборке частиц в конструкт, а если Tass составляет несколько часов или дней, то процесс сборки будет слишком медленным для целей эксперимента: при работе с биоматериалом частицы преобразовываются и становятся непригодными для использования быстрее, чем сливаются в конструкт.where L is the width of the permanent magnet, and H max is the maximum value of the magnetic field inside the magnets. From this relation it is obvious that the assembly time is proportional to the ratio of the fluid viscosity n to the difference in magnetic permeability μ f - μ p , which linearly depends on the concentration of gadobutrol. Thus, knowing the exact assembly time for a specific concentration of gadobutrol in the medium, we can accurately estimate the assembly time of the same system with a different concentration of gadobutrol. It is clear that if T ass is a few seconds or minutes, then we can talk about the assembly of particles into a construct, and if T ass is several hours or days, then the assembly process will be too slow for experimental purposes: when working with biomaterial, the particles are transformed and become unusable to be used faster than merging into a construct.
Была рассчитана зависимость времени сборки от концентрации гадобутрола в широком диапазоне значений (фиг. 1е). Теоретическая зависимость хорошо коррелирует с экспериментальными данными при концентрациях 50 мМ (~ 10 мин) и 10 мМ (~ 40 мин). Более того, можно оценить время сборки в 0,8 мМ растворе - согласно теоретическим данным это было бы около 10 часов, что очень много. Однако для ускорения сборки конструкта, как видно на графике фиг. 3е, можно понижать температуру сборки. Так, при понижении температуры сборки до 8°С, время сборки конструкта можно сократить до 5 часов, соответственно, если опустить температуру до 4°С, время сборки составит менее часа, что приемлемо для постановки эксперимента и для жизнеспособности клеток.Was calculated the dependence of the assembly time on the concentration of gadobutrol in a wide range of values (Fig. 1f). The theoretical dependence correlates well with the experimental data at concentrations of 50 mM (~ 10 min) and 10 mM (~ 40 min). Moreover, it is possible to estimate the assembly time in 0.8 mM solution - according to theoretical data, it would be about 10 hours, which is a lot. However, to speed up the assembly of the construct, as seen in the graph of FIG. 3e, the assembly temperature can be lowered. So, when the assembly temperature is lowered to 8 ° C, the assembly time of the construct can be reduced to 5 hours, respectively, if the temperature is lowered to 4 ° C, the assembly time will be less than an hour, which is acceptable for setting up an experiment and for cell viability.
Характеристика и жизнеспособность тканевых сфероидовCharacterization and Viability of Tissue Spheroids
Хондросферы были сформированы из хондроцитов человека с использованием микролунок 3D чашки Петри MicroTissues. Для оценки цитотоксичности геля Мебиол, используемого для безопасной доставки сфероидов с Земли в космос, 2-хдневные хондросферы помещали в гель Мебиол при комнатной температуре на 72 часа, после чего их жизнеспособность оценивали с использованием набора для окрашивания живых/мертвых клеток Live/Dead Cell Double Staining Kit (фиг. 6a,d) и набора CellTiter-Glo 3D (фиг. 6b). Качественная оценка жизнеспособности хондроцитов выявила одинаковое количество живых клеток в сфероидах, инкубированных в геле Мебиол, и в контрольных сфероидах. Количественная жизнеспособность клеток составила 97±6%. Эти результаты подтвердили отсутствие токсичности у геля Мебиол и возможность его использования для доставки сфероидов в космос.Chondrospheres were formed from human chondrocytes using MicroTissues 3D Petri dish microwells. To assess the cytotoxicity of Mebiol gel, used for the safe delivery of spheroids from Earth to space, 2-day chondrospheres were placed in Mebiol gel at room temperature for 72 hours, after which their viability was assessed using the Live / Dead Cell Double staining kit for living / dead cells Staining Kit (Fig. 6a, d) and CellTiter-Glo 3D Kit (Fig. 6b). A qualitative assessment of the viability of chondrocytes revealed the same number of living cells in the spheroids incubated in Mebiol gel and in the control spheroids. Quantitative cell viability was 97 ± 6%. These results confirmed the absence of toxicity in Mebiol gel and the possibility of its use for the delivery of spheroids into space.
Использование сфероидов в качестве строительных блоков требует стандартизации их размера и формы. Диаметр сфероидов (фиг. 6c,f) и округлость измеряли через 2 дня культивирования. Средний диаметр сфероида составлял 299,3±13,32 мкм. Средняя округлость сфероида была 0,911±0,053. Эти данные показали, что хондросферы имеют единую стандартизированную геометрию и могут использоваться для биофабрикации трехмерных тканей.The use of spheroids as building blocks requires standardization of their size and shape. The diameter of the spheroids (Fig. 6c, f) and the roundness were measured after 2 days of culture. The average spheroid diameter was 299.3 ± 13.32 μm. The average roundness of the spheroid was 0.911 ± 0.053. These data showed that chondrospheres have a single standardized geometry and can be used for biofabrication of three-dimensional tissues.
Реологические свойства гидрогеляRheological properties of the hydrogel
Температурная развертка (колебания) проводилась путем нагрева образцов от 4°С до 37°С при скорости нагрева +5°С/мин (фиг. 6g,h). Для обоих вариантов произошла трансдукция «золь-гель», но, в отличие от чистого раствора Мебиол, температура трансдукции которого «золь-гель» была 16,5±0,5°С (фиг. 6g), температура трансдукции для рабочего раствора была повышенной до 27,1°С±0,7°С (фиг. 4h). Когда температура постепенно увеличивалась до температуры гелеобразования образцов, значения G' и G'' быстро увеличивались из-за образования гидрогеля. Стоит отметить, что значения G' и G'' при 37°С достигли 903±37 Па и 206±19 Па для чистого раствора Мебиол и 6,3±1,2 Па и 2,3±0,6 Па для рабочего раствора. Кроме того, измерения вязкости также показали аналогичную тенденцию (фиг. 6i). При 4°С значения комплексной вязкости чистого раствора Мебиол и рабочего раствора составляли 0,211±0,05 Па⋅с и 0,97±0,04 Па⋅с соответственно. А при 37°С значения комплексной вязкости чистого раствора Мебиол и рабочего раствора составляли 936±21 Па-с и 6,77±0,53 Па⋅с соответственно.Temperature sweep (oscillation) was carried out by heating the samples from 4 ° C to 37 ° C at a heating rate of + 5 ° C / min (Fig. 6g, h). For both variants, sol-gel transduction occurred, but, in contrast to the pure Mebiol solution, whose sol-gel transduction temperature was 16.5 ± 0.5 ° C (Fig.6g), the transduction temperature for the working solution was increased to 27.1 ° C ± 0.7 ° C (Fig. 4h). As the temperature gradually increased to the gelation temperature of the samples, the G ′ and G ″ values rapidly increased due to the formation of the hydrogel. It should be noted that the values of G 'and G' 'at 37 ° C reached 903 ± 37 Pa and 206 ± 19 Pa for a pure Mebiol solution and 6.3 ± 1.2 Pa and 2.3 ± 0.6 Pa for a working solution ... In addition, the viscosity measurements also showed a similar trend (Fig. 6i). At 4 ° C, the values of the complex viscosity of the pure Mebiol solution and the working solution were 0.211 ± 0.05 Pa⋅s and 0.97 ± 0.04 Pa⋅s, respectively. And at 37 ° C, the values of the complex viscosity of the pure Mebiol solution and the working solution were 936 ± 21 Pa-s and 6.77 ± 0.53 Pa-s, respectively.
Магнитная левитационная биофабрикация трехмерных тканевых конструктовMagnetic Levitation Biofabrication of 3D Tissue Constructs
Магнитная левитационная биофабрикация трехмерных тканевых конструктов из тканевых сфероидов включает в себя два последовательных этапа. Во-первых, конфигурация магнитного поля в магнитном биопринтере заставляет тканевые сфероиды двигаться в одно месте и формировать сборку. На этой стадии тканевые сфероиды плотно упакованы, но все еще не имеют плотных контактов между клетками на поверхности сфероидов. На второй стадии тканевые сфероиды начинают сливаться и формируют трехмерные тканевые конструкты с различным уровнем уплотнения (фиг. 5а). Используемое программное обеспечение «Surface Evolver» позволяет визуализировать последовательные этапы слияния тканевых сфероидов. Сравнение реального изображения с компьютерным моделированием показывает, что полученные трехмерные тканевые конструкты представляют собой продвинутые стадии слияния тканевых сфероидов. Согласно данным моделирования, уровень полноты процесса слияния тканей сфероидов более 50% и в определенной области достигает даже почти 100% полноты процесса слияния тканей. Принимая это во внимание, удлинение времени биофабрикации позволяет полностью объединить тканевые сфероиды в один неделимый трехмерный тканевой конструкт.Magnetic levitation biofabrication of three-dimensional tissue constructs from tissue spheroids includes two sequential stages. First, the configuration of the magnetic field in a magnetic bioprinter causes tissue spheroids to move in one place and form an assembly. At this stage, tissue spheroids are tightly packed, but still lack tight junctions between cells on the surface of the spheroids. At the second stage, tissue spheroids begin to coalesce and form three-dimensional tissue constructs with different levels of compaction (Fig. 5a). The software used "Surface Evolver" allows visualization of the sequential stages of tissue spheroid fusion. Comparison of the real image with computer simulations shows that the resulting three-dimensional tissue constructs represent advanced stages of tissue spheroid fusion. According to the modeling data, the level of completeness of the spheroid tissue fusion process is more than 50% and in a certain area even reaches almost 100% of the completeness of the tissue fusion process. Taking this into account, the lengthening of the biofabrication time allows the complete integration of tissue spheroids into one indivisible three-dimensional tissue construct.
Жизнеспособность био-собранных трехмерных тканевых конструктов Демонстрация жизнеспособности трехмерных тканевых конструктов, изготовленных с использованием магнитной левитации при низкой концентрации потенциально токсичной парамагнитной среды - солей гадолиния - является критическим аспектом данного исследования. Жизнеспособность тканевых конструктов подтверждена различными методами. Гистологические и гистохимические исследования продемонстровали отсутствие признаков апоптоза и гибели клеток (фиг. 5b). Тот факт, что собранные в трехмерные тканевые конструкты тканевые сфероиды подвергаются процессу тканевого слияния, является еще одним прямым доказательством их жизнеспособности. Ранее было показано, что при токсических концентрациях солей гадолиния тканевые сфероиды не сливаются [Parfenov VA. et al. Biofabrication. 2018 Jun 18;10(3):034104]. В специально разработанных дополнительных экспериментах было показано, что при низких концентрациях солей гадолиния большинство клеток сохраняют неповрежденную нормальную ультраструктуру в тканевых сфероидах, тогда как при концентрации гадолиния (Gd) 50 мМ имеются свидетельства токсического действия в виде внутриклеточной дистрофии, включая маргинализацию хроматина, отек митохондрий и эндоплазматического ретикулума, накопление фагосом и множественных вакуолей внутриклеточной мембраны (фиг. 5с).Viability of Bio-Assembled 3D Tissue Constructs Demonstrating the viability of 3D tissue constructs made using magnetic levitation at a low concentration of a potentially toxic paramagnetic medium - gadolinium salts - is a critical aspect of this study. The viability of tissue constructs has been confirmed by various methods. Histological and histochemical studies showed no signs of apoptosis and cell death (Fig. 5b). The fact that tissue spheroids assembled into three-dimensional tissue constructs undergo tissue fusion is another direct evidence of their viability. It was previously shown that tissue spheroids do not fuse at toxic concentrations of gadolinium salts [Parfenov VA. et al. Biofabrication. 2018
Магнитный биопринтер, используемый в настоящем исследовании, представляет собой новое устройство, разработанное специально для экспериментов с магнитной левитацией на МКС. Это первое устройство, которое позволяет проводить эксперименты по магнитной левитации в условиях микрогравитации в космосе в надежной замкнутой системе. Стоит отметить, что это устройство было официально сертифицировано для использования в российском сегменте МКС. Несмотря на свою компактность, магнитный биопринтер позволяет одновременно выполнять 6 экспериментов, что дает возможность получать воспроизводимые и статистически значимые данные. Он прост в использовании и не требует длительного обучения пользователя. Видеокамеры, встроенные в магнитный биопринтер, позволяют регистрировать процессы сборки конструктов в процессе эксперимента. Магнитный биопринтер останется на российском сегменте МКС как минимум на 5 лет для постановки дальнейших экспериментов. Таким образом, эксперименты по биофабрикации 3D-конструктов на основе других типов клеток могут быть дополнительно выполнены без необходимости доставки всей системы, что значительно снижает затраты на доставку. С определенным уровнем автоматизации и разработкой дополнительного биосенсора устройство может быть модернизировано для использования с целью изучения влияния космического излучения на ткани человека в космосе без участия человека. В случае разработки полностью автоматизированной системы биомониторинга и биосенсорного анализа в реальном времени возврат образцов на Землю будет даже не нужен. В следующих экспериментах можно будет модифицировать кювету ультразвуковыми преобразователями для проведения экспериментов по комбинации магнитного и акустического полей при изготовлении структур с более сложной геометрией.The magnetic bioprinter used in this study is a new device designed specifically for magnetic levitation experiments on the ISS. It is the first device that allows experiments on magnetic levitation under microgravity conditions in space in a secure closed system. It should be noted that this device has been officially certified for use in the Russian segment of the ISS. Despite its compactness, the magnetic bioprinter allows 6 experiments to be performed simultaneously, which makes it possible to obtain reproducible and statistically significant data. It is easy to use and does not require extensive user training. Video cameras built into the magnetic bioprinter allow recording the assembly of constructs during the experiment. The magnetic bioprinter will remain on the Russian segment of the ISS for at least 5 years for further experiments. Thus, experiments on biofabrication of 3D constructs based on other cell types can be additionally performed without the need to deliver the entire system, which significantly reduces delivery costs. With a certain level of automation and the development of an additional biosensor, the device can be upgraded for use in order to study the effect of cosmic radiation on human tissues in space without human participation. If a fully automated system for biomonitoring and real-time biosensor analysis is developed, the return of samples to Earth will not even be necessary. In the next experiments, it will be possible to modify the cuvette with ultrasonic transducers to carry out experiments on the combination of magnetic and acoustic fields in the manufacture of structures with more complex geometry.
Транспортировка жизнеспособных тканевых сфероидов с Земли на МКС и предотвращение нежелательного предварительного слияния тканей во время доставки была одной из основных задач этого проекта. Это было достигнуто с помощью коммерческого термообратимого гидрогеля, который представляет собой гель при температуре 37°С и превращается в золь при низкой температуре (16°С) в закрытых кюветах (фиг. 6), пригодных для использования космонавтами. Полученные данные показали, что тканевые сфероиды могут выживать в течение нескольких дней (до 7 дней) в кюветах, заполненных термообратимым гидрогелем. Альтернативные подходы, такие как изготовление тканевых сфероидов из монослоев клеток, меченных магнитными наночастицами [Souza GR et al. Nat Nanotechnol. 2010 Apr; 5(4):291-6], или спонтанное образование тканевых сфероидов из монослоя в космосе, описанные группой Даниэлы Гримм [Aleshcheva G et al. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2016 Oct;119 Suppl 3:26-33], не позволяют обеспечить формирование достаточного количества тканевых сфероидов стандартного размера и формы для воспроизводимых экспериментов. Более того, открытые системы для манипулирования тканевыми сфероидами не подходят для МКС из-за строгих санитарных правил. Применение таких систем требует специального оборудования для культивирования стерильных клеток, а также соответствующих навыков космонавта по работе с клеточными культурами.Transporting viable tissue spheroids from Earth to the ISS and preventing unwanted tissue pre-fusion during delivery was one of the main objectives of this project. This was achieved using a commercial thermo-reversible hydrogel, which is a gel at 37 ° C and is converted to a sol at low temperature (16 ° C) in closed cells (Fig. 6) suitable for use by astronauts. The data obtained showed that tissue spheroids can survive for several days (up to 7 days) in cuvettes filled with a thermo-reversible hydrogel. Alternative approaches, such as the manufacture of tissue spheroids from monolayers of cells labeled with magnetic nanoparticles [Souza GR et al. Nat Nanotechnol. 2010 Apr; 5 (4): 291-6], or the spontaneous formation of tissue spheroids from a monolayer in space, described by the group of Daniela Grimm [Aleshcheva G et al. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2016 Oct; 119 Suppl 3: 26-33], do not allow the formation of a sufficient number of tissue spheroids of standard size and shape for reproducible experiments. Moreover, open systems for manipulating tissue spheroids are not suitable for the ISS due to strict sanitary regulations. The use of such systems requires special equipment for the cultivation of sterile cells, as well as the corresponding skills of the astronaut to work with cell cultures.
Основной мотивацией для проведения описанных экспериментов на космической станции было логическое предположение, что в условиях микрогравитации будет возможно обеспечить магнитную левитацию сфероидов тканей даже при низкой нетоксичной концентрации парамагнитной среды. Мы столкнулись с очевидной дилеммой. С одной стороны, использование парамагнитной среды крайне важно для обеспечения возможности магнитной левитации. С другой стороны, токсическое действие солей гадолиния, используемых в качестве парамагнитной среды, хорошо известно и подтверждено с помощью просвечивающей электронной микроскопии. В предыдущих публикациях магнитная левитация тканевых сфероидов достигалась при таких концентрациях солей гадолиния, которые могут подорвать практическую ценность биофабрикации тканевых конструктов как надежной трехмерной модели тканей in vitro. Используя гадолиний в концентрации 50 мкг, мы увидели типичные изменения клеточной ультраструктуры, аналогичные ранее описанным в токсикологических исследованиях гадолиния, включая маргинализацию ядерного хроматина, отек митохондрий и эндоплазматического ретикулума, накопление фагосом и множественных мембранных вакуолей, которые можно рассматривать как очевидные признаки вызванной гадолинием внутриклеточной дистрофии (фиг. 7). Однако при низкой концентрации солей гадолиния ультраструктура клеток практически не повреждалась. Более того, высокий уровень жизнеспособности тканевых сфероидов при низкой концентрации гадолиния подтверждает их неизменную способность сливаться в трехмерные тканевые конструкты.The main motivation for carrying out the described experiments on the space station was the logical assumption that under microgravity conditions it will be possible to provide magnetic levitation of tissue spheroids even at a low non-toxic concentration of the paramagnetic medium. We are faced with an obvious dilemma. On the one hand, the use of a paramagnetic medium is extremely important to enable magnetic levitation. On the other hand, the toxic effect of gadolinium salts used as a paramagnetic medium is well known and confirmed by transmission electron microscopy. In previous publications, magnetic levitation of tissue spheroids was achieved at concentrations of gadolinium salts that could undermine the practical value of biofabrication of tissue constructs as a reliable three-dimensional tissue model in vitro. Using gadolinium at a concentration of 50 μg, we saw typical changes in cellular ultrastructure, similar to those previously described in toxicological studies of gadolinium, including marginalization of nuclear chromatin, edema of mitochondria and endoplasmic reticulum, accumulation of phagosomes and multiple membrane vacuoles, which can be considered as obvious signs of intracellular gadolinium-induced dystrophy. (Fig. 7). However, at a low concentration of gadolinium salts, the cell ultrastructure was practically not damaged. Moreover, the high level of viability of tissue spheroids at a low concentration of gadolinium confirms their constant ability to fuse into three-dimensional tissue constructs.
Соответственно, нужно стремиться к снижению концентрации парамагнетика, однако нельзя бесконечно снижать концентрации, так как при снижении концентрации увеличивается время сборки конструкта и время сборки конструкта. Соответственно, можно принять, что время сборки менее получаса является приемлемым, значит, существует некая минимальная концентрация парамагнетика. Ввиду того, что в конечном растворе остается разбавленный термочувствительный гидрогель, то вязкость данной среды сильно зависит от температуры, следовательно, и скорость сборки сильно зависит от температуры. Наши данные показывает, что теоретически концентрацию в данной системе можно понизить до 0,8 мМ, при условии, что сборка будет происходить при температуре 4°С. При таких условиях сборка произойдет ориентировочно за 30 минут.Accordingly, it is necessary to strive to reduce the concentration of the paramagnet, however, the concentration cannot be infinitely reduced, since with a decrease in the concentration, the assembly time of the construct and the assembly time of the construct increase. Accordingly, it can be assumed that an assembly time of less than half an hour is acceptable, which means that there is a certain minimum concentration of the paramagnet. Due to the fact that a dilute thermosensitive hydrogel remains in the final solution, the viscosity of this medium strongly depends on temperature; therefore, the assembly rate also strongly depends on temperature. Our data show that, theoretically, the concentration in this system can be reduced to 0.8 mM, provided that the assembly takes place at a temperature of 4 ° C. Under these conditions, assembly will take approximately 30 minutes.
В будущем данная технология может позволить получить комбинированные конструкты из клеточного и неорганического материала, например из тканевых сфероидов и гранул кальций фосфата. Ввиду значительного различия по плотности этих материалов получить с помощью магнитной левитационной сборки конструкты в Земных условиях, используя даже сверхпроводящие магнитные системы или магниты Биттера, представляется очень затруднительным из-за предполагаемого сильного различия применяемой интенсивности магнитного поля, которое обеспечивает левитацию этих материалов.In the future, this technology may make it possible to obtain combined constructs from cellular and inorganic material, for example, from tissue spheroids and calcium phosphate granules. In view of the significant difference in the density of these materials, it is very difficult to obtain constructs with the help of a magnetic levitation assembly in Earth conditions, using even superconducting magnetic systems or Bitter magnets, due to the supposed strong difference in the applied intensity of the magnetic field, which ensures the levitation of these materials.
С другой стороны, комбинирование магнитного и акустического поля позволит получить конструкты более сложных геометрий, такие как кольцо или трубочка, что даст мощнейший скачок в развитии данного направления.On the other hand, the combination of magnetic and acoustic fields will allow to obtain constructs of more complex geometries, such as a ring or a tube, which will give a powerful leap in the development of this direction.
Таким образом, представленная здесь магнитная левитационная биосборка жизнеспособных тканевых инженерных конструктов была достигнута впервые при действительно нетоксичной концентрации гадолиния.Thus, the magnetic levitation biassembly of viable tissue engineering constructs presented here was achieved for the first time with a truly non-toxic concentration of gadolinium.
В результате проведенной работы была выполнена магнитная левитационная биосборка трехмерных тканевых конструктов из тканевых сфероидов (хондросфер) без использования каркасов, меток и диспенсеров в условиях микрогравитации. Было продемонстрировано, что использование термообратимого гидрогеля обеспечивает доставку жизнеспособных тканевых сфероидов на космическую станцию и предотвращает их нежелательное преждевременное слияние и распластывание. Новый оригинальный магнитный биопринтер был разработан, внедрен, сертифицирован и успешно протестирован для проведения биологических исследований в космосе. Магнитная левитационная биосборка жизнеспособных тканевых конструктов была выполнена в магнитном биопринтере при нетоксичной низкой концентрации парамагнитной среды - солей гадолиния. Биосборка тканевых конструктов и последовательное слияние тканевых сфероидов были реализованы в соответствии с разработанными прогностическими математическими моделями и компьютерным моделированием. Магнитная левитационная биосборка трехмерных тканевых конструктов из тканевых сфероидов в условиях микрогравитации при нетоксичной концентрации парамагнитной среды является важной вехой в продвижении нового подхода и открывает новые возможности для исследований в области тканевой инженерии - бескаркасной биофабрикации, основанной на использовании физических полей вместо традиционного подхода на основе твердых биоразлагаемых каркасов.As a result of this work, a magnetic levitation biassembly of three-dimensional tissue constructs from tissue spheroids (chondrospheres) was performed without the use of frames, marks and dispensers in microgravity conditions. It has been demonstrated that the use of a thermo-reversible hydrogel ensures the delivery of viable tissue spheroids to the space station and prevents their unwanted premature fusion and spreading. The new original magnetic bioprinter has been developed, implemented, certified and successfully tested for biological research in space. Magnetic levitation biassembly of viable tissue constructs was performed in a magnetic bioprinter at a non-toxic low concentration of a paramagnetic medium - gadolinium salts. The biassembly of tissue constructs and the sequential fusion of tissue spheroids were implemented in accordance with the developed predictive mathematical models and computer modeling. Magnetic levitation biassembly of three-dimensional tissue constructs from tissue spheroids under microgravity conditions with a non-toxic concentration of a paramagnetic medium is an important milestone in the advancement of a new approach and opens up new opportunities for research in the field of tissue engineering - frameless biofabrication based on the use of physical fields instead of the traditional approach based on solid biodegradable frames.
Предшествующее описание было приведено в виде реализации одного из вариантов настоящего устройства и метода. При этом следует понимать, что в такие варианты специалистом могут быть внесены многочисленные и различные модификации и изменения без отклонения от сущности настоящего устройства и метода, которая определяется исключительно прилагаемой формулой изобретения. Так, например, конструктивный элемент устройства, упомянутый здесь в единственном числе, следует понимать как не исключающий возможности наличия множественных элементов, если такое исключение не указано в явном виде или не следует из контекста.The previous description has been given in the form of an implementation of one of the variants of the present device and method. It should be understood that numerous and various modifications and changes can be made to such variants by a specialist without deviating from the essence of the present device and method, which is defined solely by the attached claims. Thus, for example, a structural element of a device mentioned herein in the singular should be understood as not precluding the possibility of having multiple elements, unless such exclusion is explicitly stated or follows from the context.
Следует также отметить, что конкретная компоновка конструктивных элементов магнитного биопринтера и кюветы в проиллюстрированных вариантах воплощения может быть изменена на другие различные альтернативные варианты воплощения. В различных вариантах воплощения могут использоваться разные количества некоего модуля или блока, может использоваться другой тип или типы некоего модуля или блока, некий модуль или блок может быть добавлен, или же некий модуль или блок может быть исключен.It should also be noted that the specific arrangement of structural elements of the magnetic bioprinter and cuvette in the illustrated embodiments may be changed to various other alternative embodiments. In different embodiments, different amounts of a certain module or block may be used, a different type or types of a certain module or block may be used, a certain module or block may be added, or a certain module or block may be excluded.
Следует четко понимать, что вышеприведенное описание предназначено для иллюстрации устройства настоящего устройства и метода, а не для ограничения объема его охраны. Например, вышеописанные варианты воплощения (и/или их признаки) могут использоваться в любой комбинации друг с другом. В дополнение к этому, могут быть проделаны многочисленные модификации для адаптации одного конкретного варианта воплощения к сведениям из различных других вариантов воплощения без отступления от объема охраны изобретения. Размеры, типы, ориентации, число и положения различных описанных здесь конструктивных элементов предназначены характеризовать параметры считающихся предпочтительными в настоящее время вариантов воплощения и являются ни в коем случае не ограничивающими, а просто примерными вариантами. После рассмотрения вышеприведенного описания специалисту в данной области техники станут очевидны многочисленные другие варианты и модификации изобретения в рамках сущности и объема охраны изобретения. Следовательно, объем охраны должен определяться с учетом лишь формулы изобретения, наряду с полным объемом эквивалентов, на которые эта формула изобретения дает право.It should be clearly understood that the above description is intended to illustrate the apparatus of the present apparatus and method, and not to limit its scope of protection. For example, the above described embodiments (and / or their features) can be used in any combination with each other. In addition, numerous modifications can be made to adapt one particular embodiment to those of various other embodiments without departing from the scope of the invention. The sizes, types, orientations, numbers and positions of the various structural elements described herein are intended to characterize the parameters of the currently considered preferred embodiments and are by no means limiting, but merely exemplary. Numerous other variations and modifications of the invention within the spirit and scope of the invention will become apparent to those skilled in the art upon review of the above description. Therefore, the scope of protection is to be determined by taking into account only the claims, along with the full scope of equivalents to which these claims are entitled.
Claims (33)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019131449A RU2746171C2 (en) | 2019-10-04 | 2019-10-04 | Device and method for magnetic fabrication |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019131449A RU2746171C2 (en) | 2019-10-04 | 2019-10-04 | Device and method for magnetic fabrication |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2019131449A3 RU2019131449A3 (en) | 2021-04-05 |
| RU2019131449A RU2019131449A (en) | 2021-04-05 |
| RU2746171C2 true RU2746171C2 (en) | 2021-04-08 |
Family
ID=75345874
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019131449A RU2746171C2 (en) | 2019-10-04 | 2019-10-04 | Device and method for magnetic fabrication |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2746171C2 (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2560393C2 (en) * | 2010-10-21 | 2015-08-20 | Органово, Инк. | Devices, systems and methods of making fabric |
-
2019
- 2019-10-04 RU RU2019131449A patent/RU2746171C2/en active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2560393C2 (en) * | 2010-10-21 | 2015-08-20 | Органово, Инк. | Devices, systems and methods of making fabric |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| GHIDINI T., Regenerative medicine and 3D bioprinting for human space exploration and planet colonisation, J Thorac Dis. 2018; 10 ( Suppl 20): S2363-S2375; DOI: 10.21037/jtd.2018.03.19. * |
| КАРАСЕВ С., Еда из 3D-биопринтера: на МКС планируется осуществить биопечать мяса, 3DNews, 05.03.2019; найдено в Интернет: { https://3dnews.ru/983791} , 13.10.2020. * |
| КАРАСЕВ С., Еда из 3D-биопринтера: на МКС планируется осуществить биопечать мяса, 3DNews, 05.03.2019; найдено в Интернет: { https://3dnews.ru/983791} , 13.10.2020. GHIDINI T., Regenerative medicine and 3D bioprinting for human space exploration and planet colonisation, J Thorac Dis. 2018; 10 ( Suppl 20): S2363-S2375; DOI: 10.21037/jtd.2018.03.19. РОССИЙСКАЯ Е., Биофабрикация живых тканей в космосе, тематическое приложение, выпуск 128, газета Калининградская правда, N 87 (18845), 9 августа 2018, с.7, найдено в Интернет: { https://kaliningradka-korolyov.ru/upload/uf/b1b/08707.pdf} , 03.02.2021. * |
| РОССИЙСКАЯ Е., Биофабрикация живых тканей в космосе, тематическое приложение, выпуск 128, газета Калининградская правда, N 87 (18845), 9 августа 2018, с.7, найдено в Интернет: { https://kaliningradka-korolyov.ru/upload/uf/b1b/08707.pdf} , 03.02.2021. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2019131449A3 (en) | 2021-04-05 |
| RU2019131449A (en) | 2021-04-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Parfenov et al. | Magnetic levitational bioassembly of 3D tissue construct in space | |
| Betsch et al. | Incorporating 4D into bioprinting: real‐time magnetically directed collagen fiber alignment for generating complex multilayered tissues | |
| Parfenov et al. | Scaffold-free, label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly | |
| Liu et al. | Development of a coaxial 3D printing platform for biofabrication of implantable islet‐containing constructs | |
| Huang et al. | Alginate hydrogel microencapsulation inhibits devitrification and enables large‐volume low‐CPA cell vitrification | |
| US10993433B2 (en) | Method of producing in vitro testicular constructs and uses thereof | |
| Chen et al. | Bio-tunable acoustic node assembly of organoids | |
| Campos et al. | Three-dimensional printing of stem cell-laden hydrogels submerged in a hydrophobic high-density fluid | |
| Correia et al. | Semipermeable capsules wrapping a multifunctional and self-regulated co-culture microenvironment for osteogenic differentiation | |
| Rayner et al. | Reconstructing the human renal vascular–tubular unit in vitro | |
| Xu et al. | In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth | |
| US20180273904A1 (en) | Spontaneously beating cardiac organoid constructs and integrated body-on-chip apparatus containing the same | |
| US11732241B2 (en) | Methods of producing in vitro liver constructs and uses thereof | |
| Guerzoni et al. | Cell encapsulation in soft, anisometric poly (ethylene) glycol microgels using a novel radical‐free microfluidic system | |
| Mi et al. | Construction of a liver sinusoid based on the laminar flow on chip and self-assembly of endothelial cells | |
| Rommel et al. | Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture | |
| Soman et al. | Femtosecond laser-assisted optoporation for drug and gene delivery into single mammalian cells | |
| Hakam et al. | Evaluation of fibrin-gelatin hydrogel as biopaper for application in skin bioprinting: An in-vitro study | |
| Parfenov et al. | Scaffold-free and label-free biofabrication technology using levitational assembly in a high magnetic field | |
| Rogal et al. | Autologous human immunocompetent white adipose tissue‐on‐chip | |
| Romero et al. | Protective polymer coatings for high-throughput, high-purity cellular isolation | |
| Sawyer et al. | Perfusion directed 3D mineral formation within cell-laden hydrogels | |
| Hu et al. | Manipulating cell adhesions with optical tweezers for study of cell-to-cell interactions | |
| Anil‐Inevi et al. | Magnetic levitation assisted biofabrication, culture, and manipulation of 3D cellular structures using a ring magnet based setup | |
| Lee et al. | Innovative cryopreservation process using a modified core/shell cell-printing with a microfluidic system for cell-laden scaffolds |