RU2741088C1 - Composition based on peas protein hydrolyzate for increasing specific producer cell lines productivity and method for production thereof - Google Patents
Composition based on peas protein hydrolyzate for increasing specific producer cell lines productivity and method for production thereof Download PDFInfo
- Publication number
- RU2741088C1 RU2741088C1 RU2019145327A RU2019145327A RU2741088C1 RU 2741088 C1 RU2741088 C1 RU 2741088C1 RU 2019145327 A RU2019145327 A RU 2019145327A RU 2019145327 A RU2019145327 A RU 2019145327A RU 2741088 C1 RU2741088 C1 RU 2741088C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- hydrolyzate
- solutions
- amount
- proteins
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
- C12N5/0043—Medium free of human- or animal-derived components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
- C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Область техникиTechnology area
Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к композиции для бессывороточных сред для увеличения продуктивности клеток млекопитающих при их культивировании, и может быть использовано при суспензионном культивировании клеток млекопитающих, а также для получения рекомбинантных антител IgG1 при экспрессии в клетках млекопитающих.The invention relates to biotechnology, in particular, to a composition for serum-free media for increasing the productivity of mammalian cells during their cultivation, and can be used for suspension cultivation of mammalian cells, as well as for obtaining recombinant IgG1 antibodies when expressed in mammalian cells.
Уровень техникиState of the art
В настоящее время разработано и успешно применяется несколько композиций и добавок для бессывороточных сред для культивирования широкого спектра эукариотических клеток, и, в частности, клеток линии СНО и ее производных. Однако необходимо отметить, что различные клеточные линии, полученные из исходной линии СНО, имеют специфический метаболизм и особенности использования питательных элементов. Известно, что при высокой плотности клеток (культуры) продукция рекомбинантных антител может снижаться из-за истощения среды культивирования клетками и вследствие этого рост культуры замедляется и останавливается, а культура погибает. С гибелью культуры останавливается специфическая продукция. Однако для целей промышленного культивирования фармацевтической индустрии требуется оптимизация уровня экспрессии иммуноглобулинов в СНО клетках. Некоторые авторы также сообщают об увеличении продукции терапевтических белков в клетках СНО и улучшении роста клеток СНО при внесении в бессывороточную среду культивирования добавок, представляющих собой гидролизаты белков растительного происхождения, в частности, - гидролизата белка риса (G. Bare*, Н. Charlier, L. De Nus, F. Verhoeye, Y-J. Schneider, S. Agathos and P. Thonart (2001) Effects of a Rice Protein Hydrolysate on Growth of CHO Cells and Production of Human Interferon-γ in a Serum-Free Medium. In: Lindner-Olsson E., Chatzissavidou N., Liillau E. (eds) Animal Cell Technology: From Target to Market. ESACT Proceedings, vol 1. Springer, Dordrecht). Подбор условий внесения гидролизата белка риса в среду культивирования позволил авторам разработать стратегию добавления гидролизата растительного происхождения к бессывороточной среде культивирования (Mols J, Peeters-Joris С, Agathos SN, Schneider YJ (2004) Origin of rice protein hydrolysates added to protein-free media alters secretion and extracellular proteolysis of recombinant interferon-gamma as well as CHO-320 cell growth. Biotechnol Lett. Jul; 26(13): 1043-6).Currently, several compositions and additives for serum-free media have been developed and successfully used for the cultivation of a wide range of eukaryotic cells, and, in particular, cells of the CHO line and its derivatives. However, it should be noted that different cell lines derived from the original CHO line have specific metabolism and specific nutrient utilization. It is known that at a high density of cells (culture), the production of recombinant antibodies may decrease due to depletion of the culture medium by cells, and as a result, the growth of the culture slows down and stops, and the culture dies. With the death of culture, specific production stops. However, for the purposes of industrial cultivation of the pharmaceutical industry, it is necessary to optimize the level of expression of immunoglobulins in CHO cells. Some authors also report an increase in the production of therapeutic proteins in CHO cells and an improvement in the growth of CHO cells when adding to a serum-free culture medium supplements that are hydrolyzates of plant proteins, in particular, rice protein hydrolyzate (G. Bare *, H. Charlier, L. De Nus, F. Verhoeye, YJ. Schneider, S. Agathos and P. Thonart (2001) Effects of a Rice Protein Hydrolysate on Growth of CHO Cells and Production of Human Interferon-γ in a Serum-Free Medium. In: Lindner -Olsson E., Chatzissavidou N., Liillau E. (eds) Animal Cell Technology: From Target to Market ESACT Proceedings,
По литературным данным гидролизаты дрожжей, как пример гидролизатов неживотного происхождения, способствуют значительному приросту продуктивности клеток линии СНО в бессывороточной среде культивирования (Mathilde Mosser, Isabelle Chevalot, Eric Olmos, Fabrice Blanchard, Romain Kapel, Eric Oriol, Ivan Marc and Annie (March 2013) Combination of yeast hydrolysates to improve CHO cell growth and IgG production Cytotechnology. Aug; 65(4): 629-641). Ряд других исследований подтверждают способность гидролизатов неживотного происхождения увеличивать клеточную плотность в процессе культивирования и специфическую продуктивность линий клеток на основе клеток СНО (Gupta AJ, Gruppen Н, Maes D, Boots JW, Wierenga PA. (2013) Factors causing compositional changes in soy protein hydrolysates and effects on cell culture functionality. J Agnc Food Chem. Nov 13;61(45):10613-25. doi: 10.1021/jf403051z. Epub 2013 Oct 29. Richardson J1, Shah B, Bondarenko PV, Bhebe P, Zhang Z, Nicklaus M, Kombe MC. (2015) Metabolomics analysis of soy hydrolysates for the identification of productivity markers of mammalian cells for manufacturing therapeutic proteins. Biotechnol Prog. 2015 Mar-Apr; 1(2): 522-31. doi: 10.1002/btpr.2050. Epub 2015 Jan 27.)According to the literature, yeast hydrolysates, as an example of non-animal hydrolysates, contribute to a significant increase in the productivity of CHO cells in a serum-free culture medium (Mathilde Mosser, Isabelle Chevalot, Eric Olmos, Fabrice Blanchard, Romain Kapel, Eric Oriol, Ivan Marc and Annie (March 2013) Combination of yeast hydrolysates to improve CHO cell growth and IgG production Cytotechnology.Aug; 65 (4): 629-641). A number of other studies confirm the ability of non-animal hydrolysates to increase cell density during cultivation and the specific productivity of CHO cell lines (Gupta AJ, Gruppen H, Maes D, Boots JW, Wierenga PA. (2013) Factors causing compositional changes in soy protein hydrolysates and effects on cell culture functionality. J Agnc Food Chem. Nov 13; 61 (45): 10613-25. doi: 10.1021 / jf403051z. Epub 2013 Oct 29. Richardson J1, Shah B, Bondarenko PV, Bhebe P, Zhang Z, Nicklaus M, Kombe MC. (2015) Metabolomics analysis of soy hydrolysates for the identification of productivity markers of mammalian cells for manufacturing therapeutic proteins. Biotechnol Prog. 2015 Mar-Apr; 1 (2): 522-31. Doi: 10.1002 / btpr .2050. Epub 2015 Jan 27.)
Известен процесс культивирования клеток животных, продуцирующих сложные белки, в котором один пептон растительного происхождения или комбинация пептонов растительного происхождения подается в клеточную культуру, а также способ снижения токсического эффекта избытка аминокислот во время процесса культивирования клеток животных, продуцирующих сложные белки /СА2610315, C12N5/0018, 2006-12-07/.The known process of culturing animal cells producing complex proteins, in which one peptone of plant origin or a combination of peptones of plant origin is fed into the cell culture, as well as a method of reducing the toxic effect of excess amino acids during the process of culturing animal cells producing complex proteins / CA2610315, C12N5 / 0018 , 2006-12-07 /.
Известен способ, описывающий культивирование клеток-продуцентов в бессывороточной среде с применением растительных гидролизатов /JP 2014110794 А C12N9/6437-2014-06-19/. Описывает способ крупномасштабного получения полипептида в клетках эукариот, содержащихся в бессывороточной культуральной жидкости, причем указанный способ включает I фазу размножения указанных клеток, где клетки размножаются в первой жидкости для культивирования клеток, и II фазу продуцирования указанных клеток, где клетки присутствуют во второй жидкости для культивирования клеток, где каждая из жидкостей для культивирования клеток содержит гидролизат растительного белка и где соотношение между концентрацией гидролизата растительного белка (С1) в первой жидкости для культивирования клеток, а концентрация гидролизата растительного белка (С2) во второй жидкости для культивирования клеток составляет, по меньшей мере, 1,5: 1 (C1:С2).There is a known method describing the cultivation of producer cells in a serum-free medium using plant hydrolysates / JP 2014110794 A C12N9 / 6437-2014-06-19 /. Describes a method for large-scale production of a polypeptide in eukaryotic cells contained in a serum-free culture fluid, said method comprising a phase I of propagation of said cells, where the cells multiply in a first cell culture fluid, and a phase II of production of said cells, where cells are present in a second culture fluid cells, where each of the cell culture fluids contains a plant protein hydrolyzate and where the ratio between the concentration of the plant protein hydrolyzate (C1) in the first cell culture fluid and the concentration of the plant protein hydrolyzate (C2) in the second cell culture fluid is at least , 1.5: 1 (C1: C2).
Известен способ предсказания уровня продукции целевого белка при использовании гидролизатов растительного сырья и дрожжевого экстракта /US 2016327484 A1, GO 1 N21/6486, 2016-11-10/. Способ прогнозирования производительности характеристики гидролизата растительного или дрожжевого происхождения заключается в том, что растительный или дрожжевой гидролизат образца измеряют с применением двумерной флуоресцентной спектроскопии в виде порошка. Указанный способ содержит следующие этапы представления модели, основанные на заранее определенном значении производственного параметра. Для этой цели применяют учебный комплект, состоящий из заранее определенного производственного интересующего параметра (например, показателя объемной продуктивности, титра вируса или числа клеток) и используются данные флуоресцентной спектроскопии. Данные спектроскопической флуоресценции коррелируют со значениями производственного параметра, представляющего интерес для получения калибровочной модели или модели параметров применения многомерного анализа данных.A known method for predicting the level of production of the target protein when using hydrolysates of plant materials and yeast extract / US 2016327484 A1, GO 1 N21 / 6486, 2016-11-10 /. A method for predicting the performance of a characteristic of a hydrolyzate of plant or yeast origin is that the plant or yeast hydrolyzate of a sample is measured using two-dimensional fluorescence spectroscopy in powder form. The specified method contains the following stages of model presentation based on a predetermined value of the manufacturing parameter. For this purpose, a training kit consisting of a predetermined production parameter of interest (eg, volumetric productivity, virus titer, or cell number) is used and fluorescence spectroscopy data are used. Spectroscopic fluorescence data is correlated with the values of the manufacturing parameter of interest to obtain a calibration model or a parameter model of a multivariate data analysis application.
В перечисленных способах используется соевый или дрожжевой экстракт, методика получения которых не показана в полном объеме, уже достаточно полно описана в литературе или показатели ростовых характеристик, продуктивности и жизнеспособности недостаточно высоки в сравнении с полученным гидролизатом белка гороха.In the listed methods, soy or yeast extract is used, the method of obtaining which is not shown in full, is already quite fully described in the literature, or the indicators of growth characteristics, productivity and viability are not high enough in comparison with the obtained hydrolyzate of pea protein.
Известные питательные среды и ростовые добавки, предлагаемые для культивирования клеток СНО фирмами-производителями «Lonza», «Invitrogen», являются затратными с точки зрения финансов и времени доставки, так как изготавливаются за рубежом и импортируется в Российскую Федерацию. Например, среда CD OptiCHO («Invitrogen», США) предназначена для культивирования клеток линии СНО DG44, уже имеющих устойчивую продукцию рекомбинантного белка. Однако для масштабного биотехнологического производства требуется большое количество среды и добавок, из-за чего возрастает стоимость препаратов на основе антител.The well-known nutrient media and growth additives offered for the cultivation of CHO cells by the manufacturers Lonza and Invitrogen are costly in terms of finance and delivery time, since they are manufactured abroad and imported into the Russian Federation. For example, CD OptiCHO medium (Invitrogen, USA) is intended for cultivation of CHO DG44 cells, which already have stable production of recombinant protein. However, large scale biotech production requires a large amount of media and additives, which increases the cost of antibody-based drugs.
Известна среда IMDM (https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Formulation/i2510for.pdf) с определенным химическим составом, используемая для культивирования ряда клеточный культур при дополнении IMDM 10% фетальной сыворотки коров. Известна композиция ITS (Insulin-Transferrin-Selenium Supplement), включающая в себя в определенной концентрации белки инсулин, трансферрин и низкомолекулярный компонент селенит натрия, являющаяся стократным концентратом (https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/2672.pdf). Известно сочетание, позволяющее обеспечить рост клеток на среде IMDM при дополнении последней однократной концентрацией добавки ITS. Известен также ряд коммерческих добавок в бессывороточную среду культивирования клеток линии СНО, включающих гидролизаты растительного происхождения. Данные добавки являются комплексными. Состав таких композиций является коммерческой тайной и не раскрывается в публикациях.Known medium IMDM (https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Formulation/i2510for.pdf) with a certain chemical composition, used for the cultivation of a number of cell cultures with the addition of IMDM 10% fetal serum cows. Known composition ITS (Insulin-Transferrin-Selenium Supplement), which includes at a certain concentration of proteins insulin, transferrin and a low molecular weight component sodium selenite, which is a hundredfold concentrate (https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/ 2672.pdf). A combination is known that allows cells to grow on IMDM when supplemented with the last single concentration of ITS additive. There are also known a number of commercial additives in the serum-free medium for cultivating CHO cells, including hydrolysates of plant origin. These supplements are complex. The composition of such compositions is a trade secret and is not disclosed in publications.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Техническая проблема, решаемая заявляемым изобретением, заключается в разработке композиций бессывороточной среды культивирования на основе IMDM, что дает возможность использовать их для эффективной экспрессии стабильных клеточных линий продуцентов как IgG1, так и других рекомбинантных белков. Особенно это актуально для клеточных линий, продуцирующих IgG1, которые по причине сложностей в сборке полноценных молекул показывают более низкую продукцию в сравнении с продуцентами других рекомбинантных белков. Данная особенность проявляется в связи со сложностью синтеза длинных белковых последовательностей легкой и тяжелой цепей антитела, входящих в состав полноразмерного антитела, и сборки полноценного антитела из отдельных цепей полноразмерных молекул антитела. Позволяет заменить дорогостоящие питательные среды и добавки для культивирования клеточных линий продуцентов рекомбинантных белков, таких как IgG1.The technical problem solved by the claimed invention consists in the development of compositions of a serum-free culture medium based on IMDM, which makes it possible to use them for efficient expression of stable cell lines producing both IgG1 and other recombinant proteins. This is especially true for cell lines producing IgG1, which, due to the difficulties in assembling complete molecules, show lower production in comparison with producers of other recombinant proteins. This feature is manifested in connection with the complexity of the synthesis of long protein sequences of the light and heavy chains of antibodies that make up a full-length antibody, and the assembly of a full-fledged antibody from separate chains of full-length antibody molecules. Allows to replace expensive nutrient media and additives for the cultivation of cell lines producing recombinant proteins, such as IgG1.
Техническим результатом, достигаемым настоящим изобретением, является повышение специфической продуктивности при культивировании клеточных линий-продуцентов антител на основе СНО клеток в бессывороточных средах на основе IMDM.The technical result achieved by the present invention is to increase the specific productivity during cultivation of cell lines producing antibodies based on CHO cells in serum-free media based on IMDM.
Техническим результатом, достигаемым при решении заявленной технической проблемы, является повышение уровня продукции линией-продуцентом целевого белка культивирования в среду культивирования при культивировании на бессывороточных средах, что дает возможность использовать данную среду культивирования для эффективной экспрессии целевого белка культивирования в среду культивирования. Под термином «гидролизат» предполагается смесь компонентов (пептидов и аминокислот), полученных в результате проведения реакции гидролиза белковых порошков растений.The technical result achieved by solving the claimed technical problem is to increase the level of production by the line-producer of the target protein of cultivation into the cultivation medium during cultivation on serum-free media, which makes it possible to use this cultivation medium for efficient expression of the target protein of cultivation into the cultivation medium. The term "hydrolyzate" is a mixture of components (peptides and amino acids) obtained as a result of the hydrolysis reaction of plant protein powders.
Для решения заявленной технической проблемы и обозначенного технических результатов предлагается композиция для повышения специфической продуктивности клеточных линий-продуцентов антител на основе СНО клеток, содержащая IMDM и L-глутамин, Pluronic F-68, инсулин, трансферрин, селенит натрия, и гидролизата белков гороха, при следующем соотношении исходных компонентов на 1 литр, г:To solve the claimed technical problem and the indicated technical results, a composition is proposed to increase the specific productivity of cell lines producing antibodies based on CHO cells, containing IMDM and L-glutamine, Pluronic F-68, insulin, transferrin, sodium selenite, and pea protein hydrolyzate, when the following ratio of the starting components per 1 liter, g:
При этом компоненты, входящие в состав гидролизата белка гороха, имеют молекулярную массу не более 5 кДа.In this case, the components that make up the pea protein hydrolyzate have a molecular weight of no more than 5 kDa.
Предлагается также способ получения указанной композиции, включающий этап приготовления белков-растворов, экстрагирование белков, гидролиз, центрифугирование, при этом на этапе приготовления белков-растворов смешивают исходные компоненты, приготовление растворов белков-субстратов осуществляют в буфере, экстрагированный белок отделяют центрифугированием с последующим качественным и количественным анализом и подвергают гидролизу с папаином, останавливают реакцию с последующим количественным анализом, выпавший осадок удаляют, а экстрагированный белок фильтруют на мембране для отсечения молекул с молекулярной массой выше 5 кДа.A method for preparing the specified composition is also proposed, including the stage of preparation of protein solutions, extraction of proteins, hydrolysis, centrifugation, while at the stage of preparation of protein solutions, the initial components are mixed, the preparation of solutions of protein substrates is carried out in a buffer, the extracted protein is separated by centrifugation followed by qualitative and quantitative analysis and subjected to hydrolysis with papain, stop the reaction followed by quantitative analysis, the precipitate formed is removed, and the extracted protein is filtered on a membrane to cut off molecules with a molecular weight above 5 kDa.
Для получения композиции используют четырехкратный раствор исходных компонентов, состоящий из 0,004 М ЭДТА⋅Na2 (рН 6,2); 2 М NaCl; 0,05 М Cys⋅HCl; 4Х кратный 0,004 М ЭДТА.To obtain the composition, a fourfold solution of the starting components is used, consisting of 0.004 M EDTA⋅Na2 (pH 6.2); 2 M NaCl; 0.05 M Cys.HCl; 4X 0.004 M EDTA.
Буферные растворы гидролизата белка гороха используют с исходной концентрацией 0,6 мг/мл.Pea protein hydrolyzate buffer solutions are used with an initial concentration of 0.6 mg / ml.
Приготовление растворов белков-субстратов осуществляют в буфере 0.001 М ЭДТА⋅Na2 при рН 6,2, в концентрации 10-25 мг/мл, экстракцией в течение 8 часов при комнатной температуре на качалке (150 об/мин).The preparation of solutions of protein substrates is carried out in a buffer of 0.001 M EDTA⋅Na 2 at pH 6.2, at a concentration of 10-25 mg / ml, by extraction for 8 hours at room temperature on a shaker (150 rpm).
Центрифугирование осуществляют при 12 тыс.об/ мин в течение 40 мин.Centrifugation is carried out at 12 thousand rpm for 40 minutes.
Для качественного анализа определяют содержание белка по методу Брэдфорд с использованием реактива Bio-Rad, контроль экстрагированных растительных белков осуществляют электрофорезом в 12% ПААГ. Для что качественного контроля отбирают аликвоту белкового раствора, содержащую 30-50 мкг белка, 1/20 часть белкового раствора оставляют для контроля.For a qualitative analysis, the protein content is determined by the Bradford method using the Bio-Rad reagent, the control of the extracted plant proteins is carried out by electrophoresis in 12% PAGE. For quality control, an aliquot of the protein solution containing 30-50 μg of protein is taken, 1/20 of the protein solution is left for control.
Папаин предварительно растворяют в буфере 0.001 М ЭДТА, 0.005 М Cys, 0.06 мМ β-меркаптоэтанол, выдерживают в течение 30 мин перед добавлением в растворы белков-субстратов.Papain is preliminarily dissolved in a buffer of 0.001 M EDTA, 0.005 M Cys, 0.06 mM β-mercaptoethanol, and incubated for 30 min before adding substrate proteins to the solutions.
Протеолитическую реакцию останавливают кипячением на водяной бане в течение 10 мин с последующим охлаждением реакционной смеси при +7 С.The proteolytic reaction is stopped by boiling in a water bath for 10 min, followed by cooling the reaction mixture at +7 C.
Качественный контроль гидролизованных папаином растительных белков осуществляют электрофорезом в 12% ПААГ (восстанавливающие условия) с отбором пробы из реакционной смеси в тех же объемах как после их экстракции из порошка.The quality control of plant proteins hydrolyzed by papain is carried out by electrophoresis in 12% PAGE (reducing conditions) with sampling from the reaction mixture in the same volumes as after their extraction from the powder.
Для удаления осадка осуществляют доведение рН реакционной смеси до 7,2 и центрифугирование 12 тыс.об/ мин, 40 мин.To remove the precipitate, the pH of the reaction mixture is adjusted to 7.2 and centrifugation is 12 thousand rpm, 40 minutes.
Полученную смесь пропускают через ячейку с мембраной для отсечения компонентов с молекулярной массой выше 5 кДа.The resulting mixture is passed through a cell with a membrane to cut off components with a molecular weight above 5 kDa.
Количественно определяют полученный раствор методом Бредфорд, а качественный контроль осуществляют электрофорезом.The obtained solution is quantitatively determined by the Bradford method, and the qualitative control is carried out by electrophoresis.
Дополнительно для повышения плотности культуры клеток, повышения продолжительности их времени жизни в культуре и продуктивности осуществляют интервальное внесение раствор гидролизата белка гороха. Для интервального внесения используют исходный раствор гидролизата белка гороха в объеме изначального внесения, пересчитанного на объем культивирования.In addition, to increase the density of the cell culture, increase the duration of their lifetime in culture and productivity, an interval introduction of a pea protein hydrolyzate solution is carried out. For interval application, the initial solution of pea protein hydrolyzate is used in the volume of the initial application, recalculated for the volume of cultivation.
Изобретение включает разработанные многокомпонентные добавки к базовым бессывороточным средам IMDM (среда Искова IMDM - модификация среды Дульбекко) или DMEM, которые включают в себя раствор гидролизата белка гороха. Данное изобретение увеличивает продуктивность суспензионной культуры, повышает плотность культуры, увеличивает продолжительности времени культивирования и повышает уровень экспрессии рекомбинантных антител класса IgG1.The invention includes the developed multicomponent additives to basic serum-free media IMDM (Iskov's medium IMDM - modification of Dulbecco's medium) or DMEM, which include a pea protein hydrolyzate solution. This invention increases the productivity of the suspension culture, increases the density of the culture, increases the length of time of cultivation and increases the level of expression of recombinant antibodies of the IgG1 class.
Данное решение было найдено при использовании композиций к базовой бессывороточной среде. В качестве базовой бессывороточной среды использовали среду IMDM производства «Gibco», США; «БиолоТ», РФ и «ПанЭко», РФ.This solution was found when using compositions to a basic serum-free medium. As a basic serum-free medium, we used IMDM medium (Gibco, USA); Biolot, RF and PanEco, RF.
Заявляемая композиция для предотвращения агрегирования, повышения плотности и однородности культуры, повышению продуктивности включает растворы гидролизата белка гороха с исходной концентрацией 0,6 мг/мл.The claimed composition for preventing aggregation, increasing the density and uniformity of the culture, increasing productivity includes solutions of pea protein hydrolyzate with an initial concentration of 0.6 mg / ml.
Наилучший результат достигается при использовании композиции, содержащей гидролизат белка гороха, при этом раствор гидролизата белка гороха содержится в исходной концентрации 0,6 мг/мл.The best result is achieved when using a composition containing pea protein hydrolyzate, while the pea protein hydrolyzate solution is contained in an initial concentration of 0.6 mg / ml.
Впервые было установлено, что использование предлагаемой многокомпонентной добавки к базовой бессывороточной среде позволяет повысить плотность, время культивирования и продуктивность клеточных линий-продуцентов рекомбинантных антител клеток при их суспензионном культивировании.For the first time, it was found that the use of the proposed multicomponent additive to the basic serum-free medium allows to increase the density, cultivation time and productivity of cell lines producing recombinant antibodies of cells during their suspension cultivation.
Краткое описание чертежейBrief Description of Drawings
Изобретение иллюстрируют следующие графические материалы: Фиг. 1. Гистограмма зависимости концентрации и жизнеспособности линии клеток СНО DG44, продуцирующей рекомбинантные моноклональные антитела IgG1 - изотипа, во времени при добавлении гидролизата белка гороха в среду культивирования IMDM с добавлением однократного ITS. Каждая из сред была дополнена 8 Мм L-глутамина и 0,1% Pluronic F-68.The invention is illustrated by the following drawings: FIG. 1. Histogram of the dependence of the concentration and viability of the CHO DG44 cell line, producing recombinant monoclonal antibodies of IgG1 - isotype, in time when the pea protein hydrolyzate is added to the IMDM cultivation medium with the addition of a single ITS. Each of the media was supplemented with 8 Mm L-glutamine and 0.1% Pluronic F-68.
Фиг. 2. Гистограмма зависимости продуктивности рекомбинантных моноклональных антител IgG1-изотипа стабильной клеточной линией-продуцентом СНО DG44 во времени при добавлении гидролизата белка гороха в среду культивирования на основе IMDM. Каждая из сред была дополнена 8 Мм L-глутамина и 0,1% Pluronic F-68.FIG. 2. Histogram of the dependence of the productivity of recombinant monoclonal antibodies of the IgG1 isotype by a stable producing cell line CHO DG44 in time when the pea protein hydrolyzate is added to the culture medium based on IMDM. Each of the media was supplemented with 8 Mm L-glutamine and 0.1% Pluronic F-68.
Фиг. 3. Электрофореграмма в 12% ПААГ, в восстанавливающих условиях, водного экстракта белка гороха до (1) и после (2) гидролиза папаином.FIG. 3. Electropherogram in 12% PAGE, under reducing conditions, of an aqueous extract of pea protein before (1) and after (2) hydrolysis with papain.
Осуществление изобретенияImplementation of the invention
Изобретение иллюстрируется примерами конкретного выполнения, которые более подробно описывают возможность осуществления заявляемого изобретения с достижением заявляемого технического результата.The invention is illustrated by examples of specific implementation, which describe in more detail the possibility of implementing the claimed invention with the achievement of the claimed technical result.
Методика получения композиции из гидролизата белка гороха следующая, предназначенной для повышения специфической продуктивности клеточных линий-продуцентов антител на основе СНО клеток, следующая.The method for obtaining a composition from pea protein hydrolyzate is as follows, intended to increase the specific productivity of cell lines producing antibodies based on CHO cells, as follows.
1. Растворы 4Х кратный 0,004 М ЭДТА⋅Na2 (рН 6,2); 2 М NaCl; 0,05 М Cys⋅HCl; 4Х кратный 0,004 М ЭДТА.1. Solutions 4X 0.004 M EDTA ЭNa2 (pH 6.2); 2 M NaCl; 0.05 M Cys.HCl; 4X 0.004 M EDTA.
2. Приготовление растворов белков-субстратов (белковых порошков растений) проводили в буфере 0.001 М ЭДТА⋅Na2 (рН 6,2), в концентрации 10-25 мг/мл, экстракцией в течение ночи при комнатной температуре на качалке (150 об/мин).2. Preparation of solutions of protein substrates (plant protein powders) was carried out in a buffer of 0.001 M EDTA⋅Na 2 (pH 6.2), at a concentration of 10-25 mg / ml, by extraction overnight at room temperature on a shaker (150 rpm min).
3. Экстрагированный белок из белковых порошков растений отделяли центрифугированием при 12 тыс.об/ мин в течение 40 мин. Далее использовали для гидролиза надосадочную жидкость, где определяли содержание белка по методу Брэдфорд (реактив Bio-Rad). Оценивали содержание экстрагированного белка в порошке. Качественный контроль экстрагированных растительных белков проводили электрофорезом в 12% ПААГ (восстанавливающие условия), отбирая аликвоту белкового раствора, содержащую 30-50 мкг белка. 1/20 часть белкового раствора оставляли для контроля, которую использовали на всех стадиях гидролиза без добавления папаина.3. The extracted protein from protein powders of plants was separated by centrifugation at 12 thousand rpm for 40 min. Then, the supernatant was used for hydrolysis, where the protein content was determined by the Bradford method (Bio-Rad reagent). The content of the extracted protein in the powder was estimated. The quality control of the extracted plant proteins was carried out by electrophoresis in 12% PAGE (reducing conditions), taking an aliquot of the protein solution containing 30-50 μg of protein. 1/20 of the protein solution was left as a control, which was used at all stages of hydrolysis without adding papain.
4. Папаин предварительно растворяли в буфере (0.001 М ЭДТА, 0.005 М Cys, 0.06 мМ β-меркаптоэтанол), выдерживали 30 мин (активация папаина) перед добавлением в растворы белков-субстратов.4. Papain was preliminarily dissolved in a buffer (0.001 M EDTA, 0.005 M Cys, 0.06 mM β-mercaptoethanol), kept for 30 min (papain activation) before adding substrate proteins to the solutions.
5. Реакционная смесь (для каждого вида растительного белка в отдельности) содержала белок-субстрат и папаин в соотношении белок : папаин = 1:20 (по количеству белка) в буфере 0,001 М ЭДТА⋅Na2 (рН 6.2) с 0,005 М Cys. Смесь выдерживали в течение 20 ч при 39 С в качалке (150 об/мин). Протеолитическую реакцию останавливали кипячением на водяной бане в течение 10 мин, затем охлаждали реакционную смесь при +7 С.5. The reaction mixture (for each type of plant protein separately) contained the substrate protein and papain in the ratio protein: papain = 1:20 (by the amount of protein) in a buffer of 0.001 M EDTA⋅Na2 (pH 6.2) with 0.005 M Cys. The mixture was kept for 20 h at 39 C in a shaker (150 rpm). The proteolytic reaction was stopped by boiling in a water bath for 10 min, then the reaction mixture was cooled at +7 C.
6. Качественный контроль гидролизованных папаином растительных белков проводили электрофорезом в 12% ПААГ (восстанавливающие условия), отбирая пробы из реакционной смеси в тех же объемах как после их экстракции из порошка.6. The qualitative control of plant proteins hydrolyzed by papain was carried out by electrophoresis in 12% PAGE (reducing conditions), taking samples from the reaction mixture in the same volumes as after their extraction from the powder.
7. Доводили рН реакционной смеси до 7,2, выпавший осадок удаляли центрифугированием (12 тыс.об/ мин, 40 мин). Определяли содержание белка по методу Бредфорд (Bio-Rad) в надосадочной жидкости и оценивали процент гидролиза белка по сравнению с соответствующим контролем без папаина, пропускали ее через ячейку с мембраной для отсечения молекул с молекулярной массой выше 5 кДа.7. The pH of the reaction mixture was brought to 7.2, the precipitate was removed by centrifugation (12 thousand rpm, 40 min). Protein content was determined by the Bradford method (Bio-Rad) in the supernatant and the percentage of protein hydrolysis was assessed in comparison with the corresponding control without papain, it was passed through a cell with a membrane to cut off molecules with a molecular weight above 5 kDa.
Количество полученных пептидов и аминокислот в гидролизате (молекулярной массой менее 5 кДа) определяли по количеству гидролизованного белка. АНАЛИЗThe amount of obtained peptides and amino acids in the hydrolyzate (molecular weight less than 5 kDa) was determined by the amount of hydrolyzed protein. ANALYSIS
ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВOBTAINED RESULTS
В предварительных результатах по гидролизу папаином растворенного порошка гороха в буфере мы установили, что основная часть белка, подвергающегося гидролизу папаином, находится в водной фазе. Более того, твердая фаза порошка частично сорбировала папаин и выводила его из реакции гидролиза.In the preliminary results on the hydrolysis of dissolved pea powder in buffer with papain, we found that the bulk of the protein hydrolyzed by papain is in the aqueous phase. Moreover, the solid phase of the powder partially sorbed papain and removed it from the hydrolysis reaction.
После экстракции белка из порошка проводили его количественную (Таблица 1) и качественную характеристику (Фиг. 3). Далее после их гидролиза папаином, останавливали реакцию кипячением, доводили рН до 7,2, чтобы в дальнейшем использовать в средах культивирования клеток, выпавший осадок удаляли центрифугированием и дальше не использовали. Отбирали пробы для качественной характеристики гидролизованного белка из супернатанта (надосадочная жидкость). Затем, надосадочную жидкость пропускали через ячейку с мембраной для отсечения молекул с молекулярной массой выше 5 кДа. Для верного подсчета гидролизованного белка (пептидов) осадок, полученный после гидролиза, подсушивали при +65 С, взвешивали и вычитали из количества первоначально экстрагированного белка. Белок, полученный при концентрировании на мембране выше 5 кДа (белок после гидролиза, таблица), также вычитали из количества первоначально экстрагированного белка. Белок, который составил разницу в результате вычитания осадка и белка с молекулярной массой более 5 кДа, мы отнесли гидролизованному белку на низкомолекулярные пептиды и аминокислоты, входящие в гидролизат, который использовали в качестве добавок неживотного происхождения в исследовании их влияния на пролиферативную активность клеток-продуцентов.After extraction of the protein from the powder, its quantitative (Table 1) and qualitative characteristics (Fig. 3) were carried out. Then, after their hydrolysis with papain, the reaction was stopped by boiling, the pH was adjusted to 7.2 for further use in cell culture media, the precipitate that formed was removed by centrifugation and was not used further. Samples were taken for the qualitative characterization of the hydrolyzed protein from the supernatant (supernatant). Then, the supernatant was passed through a cell with a membrane to cut off molecules with a molecular weight above 5 kDa. For correct counting of the hydrolyzed protein (peptides), the precipitate obtained after hydrolysis was dried at +65 C, weighed and subtracted from the amount of the initially extracted protein. The protein obtained by concentration on the membrane above 5 kDa (protein after hydrolysis, table) was also subtracted from the amount of initially extracted protein. The protein that made the difference as a result of the subtraction of the precipitate and the protein with a molecular weight of more than 5 kDa, we assigned the hydrolyzed protein to the low molecular weight peptides and amino acids included in the hydrolyzate, which was used as additives of non-animal origin in the study of their effect on the proliferative activity of producer cells.
8. По результатам качественного контроля (Фиг. 3) мы отметили, что экстрагированные белки гороха равномерно гидролизуются на низкомолекулярные пептиды и аминокислоты: полностью исчезают только белки с молекулярной массой. 66 кДа, 40 и 35 кДа.8. Based on the results of qualitative control (Fig. 3), we noted that the extracted pea proteins are uniformly hydrolyzed into low molecular weight peptides and amino acids: only proteins with a molecular weight disappear completely. 66 kDa, 40 and 35 kDa.
В соответствии с указанной выше методикой получают композиции на основе гидролизата белков гороха, имеющую следующее компонентов:In accordance with the above procedure, a composition based on pea protein hydrolyzate is obtained, having the following components:
Водный раствор L-глутамина (200 мМ) - 40 мл;L-glutamine aqueous solution (200 mM) - 40 ml;
Водный раствор Pluronic F-68 (10%) - 10 мл;Pluronic F-68 water solution (10%) - 10 ml;
Комплексная белковая добавка ITS - 10 мл;Complex protein supplement ITS - 10 ml;
Буферный раствор гидролизата белков гороха (0,6 мг/мл) - 100 мл (состав подтвержден разницей между образцами, прошедшими процедуру гидролиза и не пошедшими таковой, а также фильтрованием через полупроницаемую мембрану с порами, не пропускающими частицы крупнее 5 кДа);Pea protein hydrolyzate buffer solution (0.6 mg / ml) - 100 ml (the composition is confirmed by the difference between the samples that underwent the hydrolysis procedure and did not go through the same, as well as filtration through a semipermeable membrane with pores that do not allow particles larger than 5 kDa to pass through);
Среды IMDM до одного литра (850 мл).IMDM media up to one liter (850 ml).
Пример 1. Повышение концентрации и жизнеспособности клеток стабильной клеточной линии СНО DG44, продуцирующей рекомбинантные моноклональные антитела IgG1-изотипа, при добавлении в бессывороточную среду культивирования композиции на основе гидролизата белка гороха, содержащая IMDM и L-глутамин, ITS, Pluronic F-68 и гидролизата белков гороха, при следующем соотношении компонентов на 1 литр, г:Example 1. Increasing the concentration and viability of cells of a stable CHO DG44 cell line producing recombinant monoclonal antibodies of the IgG1 isotype when a pea protein hydrolyzate composition containing IMDM and L-glutamine, ITS, Pluronic F-68 and a hydrolyzate is added to a serum-free culture medium pea proteins, with the following ratio of components per 1 liter, g:
В опыте используют суспензионную стабильную клеточную линию - продуцент рекомбинантных антител IgG1-изотипа, на основе клеточной линии СНО DG44 (dhfr-/-) (клетки яичников китайского хомячка). Клеточные культуры выращивают на бессывороточной базовой среде IMDM ("БиолоТ", РФ). Для определения влияния на продуктивность, плотность и жизнеспособность клеточных культур культивирования, эксперимент проводят в формате культур в 6-луночных планшетах в стандартных условиях выращивания при 37 С и 8% СO2 и 96% влажности при непрерывном перемешивании со скоростью 130 об/мин.The experiment uses a suspension stable cell line - a producer of recombinant antibodies of the IgG1 isotype, based on the CHO DG44 (dhfr - / -) cell line (Chinese hamster ovary cells). Cell cultures are grown on a serum-free basic IMDM medium (Biolot, RF). To determine the effect on the productivity, density and viability of cultured cell cultures, the experiment is carried out in the format of cultures in 6-well plates under standard growing conditions at 37 ° C and 8% CO2 and 96% humidity with continuous stirring at 130 rpm.
Для сравнения эффекта влияния на рост клеточных культур-продуцентов антител IgG1-изотипа в качестве дополнительного источника питательных веществ, используют гидролизат белка гороха и добавку инсулина-трансферрин-селенита натрия (ITS) фирмы «Gibco». Стандартная добавка ITS обычно применяется для повышения плотности культуры и стимулирования роста, однако является недешевым реагентом, что повышает затраты на производство терапевтических иммуноглобулинов.To compare the effect of influencing the growth of cell cultures producing antibodies of the IgG1 isotype as an additional source of nutrients, pea protein hydrolyzate and an insulin-transferrin-sodium selenite (ITS) supplement from Gibco are used. The standard ITS supplement is usually used to increase culture density and stimulate growth, but is not cheap and increases the cost of producing therapeutic immunoglobulins.
Для изучения влияния на рост СНО клеток, в среду для культивирования в IMDM добавляют гидролизат белка гороха: в исходной концентрации 0,6 мг/мл. Раствор гидролизата может быть добавлен более одного раза в пропорции 1:10 от объема культуры, в которую он добавляется.To study the effect on the growth of CHO cells, pea protein hydrolyzate is added to the culture medium in IMDM: at an initial concentration of 0.6 mg / ml. The hydrolyzate solution can be added more than once at a ratio of 1:10 to the volume of the culture to which it is added.
В качестве контроля используют культуру клеток, культивируемую в среде с добавлением инсулина-трансферрина-селенита (ITS). Увеличение плотности клеточной культуры происходит на 5-й день культивирования, причем увеличение роста находится в зависимости от количества разовых подкормок культуры. На Фиг. 1А показано увеличение плотности культуры клеток при добавлении гидролизата гороха в среду IMDM с ITS через 6 суток по сравнению с контрольным образцом. Плотность культуры линии клеток СНО DG44 (dhfr-/-), продуцирующей рекомбинантные моноклональные антитела IgG1-изотипа, увеличивалась в 1,4 раза, после однократного добавления, через 24 ч после инокуляции культуры, в среду IMDM с ITS раствора гидролизата белка гороха в исходной концентрации 0,6 мг/мл, в пропорции 1:10 от объема культуры. Плотность культуры линии клеток СНО DG44 (dhfr-/-), продуцирующей рекомбинантные моноклональные антитела IgG1-изотипа, увеличивалась в 2,1 раза, после троекратного добавления каждые 48 ч после первого добавления раствора, в базовую среду IMDM с ITS раствора гидролизата белка гороха в исходной концентрации 0,6 мг/мл, в пропорции 1:10 от объема культуры.A cell culture cultured in a medium supplemented with insulin-transferrin-selenite (ITS) was used as a control. The increase in the density of the cell culture occurs on the 5th day of cultivation, and the increase in growth depends on the number of single feeding of the culture. FIG. 1A shows an increase in the density of the cell culture upon the addition of pea hydrolyzate to the IMDM medium with ITS after 6 days in comparison with the control sample. The density of the culture of the CHO DG44 (dhfr - / -) cell line, producing recombinant monoclonal antibodies of the IgG1 isotype, increased 1.4 times, after a single addition, 24 h after inoculation of the culture, into IMDM medium with ITS of pea protein hydrolyzate solution in the initial concentration of 0.6 mg / ml, in a ratio of 1:10 of the culture volume. The density of the culture of the CHO DG44 (dhfr - / -) cell line, producing recombinant monoclonal antibodies of the IgG1 isotype, increased 2.1 times, after three times adding every 48 hours after the first addition of the solution, to the IMDM base medium with ITS of pea protein hydrolyzate solution in the initial concentration of 0.6 mg / ml, in a ratio of 1:10 of the culture volume.
Применение в качестве ростовой добавки раствора гидролизата белка гороха показывает также его пролонгированное действие на поддержание плотности клеточной культуры и времени роста в течение 9 дней в среде IMDM с ITS. При отсутствии гидролизата белка гороха в среде IMDM с ITS культивирования на 9-10-й день культивирования происходит существенное уменьшение плотности клеток и практическая гибель клеточной культуры (Фиг. 1А).The use of pea protein hydrolyzate solution as a growth additive also shows its prolonged effect on maintaining cell culture density and growth time for 9 days in IMDM medium with ITS. In the absence of pea protein hydrolyzate in the IMDM medium with ITS cultivation on the 9-10th day of cultivation, a significant decrease in cell density and a virtual death of the cell culture occur (Fig. 1A).
На Фиг. 1Б продемонстрировано влияние гидролизата белка гороха в исходной концентрации 0,6 мг/мл на жизнеспособность линии клеток СНО DG44 (dhfr-/-), продуцирующей рекомбинантные моноклональные антитела IgG1-изотипа, через 6 и 9 суток. Измерение концентрации клеток и их жизнеспособности проводят с использованием красителя 0,4% раствора в воде трипанового синего в камере Горяева. Во всех образцах этих клеток через 9 суток культивирования на среде IMDM с ITS наблюдали высокую степень жизнеспособности: свыше 83,6% и 88% для однократного и троекратного добавления раствора гидролизата белка гороха в среду культивирования, соответственно (Фиг. 1Б).FIG. 1B demonstrates the effect of pea protein hydrolyzate at an initial concentration of 0.6 mg / ml on the viability of the CHO DG44 (dhfr - / -) cell line producing recombinant monoclonal antibodies of the IgG1 isotype after 6 and 9 days. Measurement of the concentration of cells and their viability is carried out using a dye of 0.4% solution in water, trypan blue in a Goryaev chamber. In all samples of these cells, after 9 days of cultivation on IMDM medium with ITS, a high degree of viability was observed: over 83.6% and 88% for single and threefold addition of pea protein hydrolyzate solution to the cultivation medium, respectively (Fig. 1B).
Пример 2. Влияние композиции раствора гидролизата белка гороха на увеличение продуктивности стабильной клеточной линии СНО DG44 (dhfr-/-), продуцирующей рекомбинантные моноклональные антитела формы IgG1-изотипа.Example 2. Influence of the composition of the pea protein hydrolyzate solution on the increase in the productivity of the stable CHO DG44 (dhfr - / -) cell line, producing recombinant monoclonal antibodies of the IgG1 isotype form.
В опыте используют суспензионную стабильную клеточную линию - продуцент рекомбинантных антител IgG1-изотипа, на основе клеточной линии СНО DG44 (dhfr-/-) (клетки яичников китайского хомячка). Клеточные культуры выращивают на бессывороточной базовой среде IMDM ("ПанЭко", РФ). Для определения влияния на продуктивность, плотность и жизнеспособность клеточных культур культивирования, эксперимент проводят в формате статических культур в 6-луночных планшетах в стандартных условиях выращивания при 37 С и 8% СО2 и 96% влажности при непрерывном перемешивании на орбитальном шейкере с частотой 130 об/мин и диаметром орбиты равным 20 мм.The experiment uses a suspension stable cell line - a producer of recombinant antibodies of the IgG1 isotype, based on the CHO DG44 (dhfr - / -) cell line (Chinese hamster ovary cells). Cell cultures are grown on a serum-free basic IMDM medium (PanEco, Russia). To determine the effect on the productivity, density and viability of cell cultures of cultivation, the experiment is carried out in the format of static cultures in 6-well plates under standard growing conditions at 37 C and 8% CO 2 and 96% humidity with continuous stirring on an orbital shaker with a frequency of 130 vol. / min and orbit diameter equal to 20 mm.
Для определения влияния на продукцию антител IgG1 в бессывороточную базовую среду IMDM фирмы "ПанЭко" добавляют раствор гидролизата белка гороха в исходной концентрации 0,6 мг/мл в количестве в пропорции 10% от исходного объема среды культивирования. В качестве контрольного образца используют культуру клеток, выращенную в среде IMDM с ITS без добавок.To determine the effect on the production of IgG1 antibodies, a solution of pea protein hydrolyzate at an initial concentration of 0.6 mg / ml in a proportion of 10% of the initial volume of the cultivation medium is added to the PanEco serum-free base medium IMDM. As a control sample, a cell culture grown in IMDM medium with ITS without additives was used.
Продуктивность определяют методом ИФА на 6-й, 9-й и 14-й дни культивирования. На Фиг. 2 показано влияние композиции на увеличение продуктивности по сравнению с контрольным образцом, а также соотношение концентраций рекомбинантного антитела изотипа IgG1 при однократном и троекратном внесении гидролизата белка гороха. Внесение гидролизата в случае однократного внесения производили через 24 часа после высевания культуры клеток в питательную среду, а в случае трехкратного внесения - через 24, 72, 120 часов (1, 3, 5 дни культивирования). В контрольный образец вносился буфер, использованный для приготовления гидролизата, рН=7,4, в том же объеме, что и для внесения гидролизата троекратно. Буфер вносился троекратно. При использовании гидролизата белка гороха увеличение концентрации антител по сравнению с контролем составило 2,15 раза для однократного внесения гидролизата и 5,48 раза для его троекратного внесения.Productivity is determined by ELISA on the 6th, 9th and 14th days of cultivation. FIG. 2 shows the effect of the composition on the increase in productivity in comparison with the control sample, as well as the ratio of the concentrations of the recombinant antibody of the IgG1 isotype with a single and triple addition of pea protein hydrolyzate. The introduction of the hydrolyzate in the case of a single application was carried out 24 hours after sowing the cell culture into the nutrient medium, and in the case of three times application - after 24, 72, 120 hours (1, 3, 5 days of cultivation). The control sample was filled with the buffer used for the preparation of the hydrolyzate, pH = 7.4, in the same volume as for the addition of the hydrolyzate three times. The buffer was inserted three times. When using pea protein hydrolyzate, the increase in the concentration of antibodies in comparison with the control was 2.15 times for a single addition of the hydrolyzate and 5.48 times for its triple addition.
Пример 3. Методика получения гидролизатов неживотного происхождения. Использованные реактивы:Example 3. Procedure for obtaining hydrolysates of non-animal origin. Reagents used:
- Горох (Pisiva) (Hill Pharma Inc., США);- Peas (Pisiva) (Hill Pharma Inc., USA);
- Этилендиаминтетрауксусная кислота;- Ethylenediaminetetraacetic acid;
- гидроксид натрия;- sodium hydroxide;
- цистеин-НСl;- cysteine-HCl;
- хлорид натрия;- sodium chloride;
- β-меркаптоэтанол;- β-mercaptoethanol;
- мембрана 5 кДа (Millipore, США).- 5 kDa membrane (Millipore, USA).
Для оценки уровня экспрессии рекомбинантных белков и степени их очистки необходимы:To assess the level of expression of recombinant proteins and the degree of their purification, it is necessary:
- персульфат аммония;- ammonium persulfate;
- N,N,N,N'-тетраметилетилендиамин;- N, N, N, N'-tetramethylethylenediamine;
- акриламид, бис-акриламид;- acrylamide, bis-acrylamide;
- додецилсульфат натрия;- sodium dodecyl sulfate;
- Кумасси синий R250;- Coomassie blue R250;
- уксусная кислота;- acetic acid;
- этиловый спирт;- ethanol;
- предокрашенный белковый маркер MW 19.0-118.0 кДа (Thermo Scientific, США).- prestained protein marker MW 19.0-118.0 kDa (Thermo Scientific, USA).
Для очистки гидролизатов от высокомолекулярных примесей необходимы:To purify hydrolysates from high molecular weight impurities, you need:
- Система ультрафильтрации Amicon 50 с мембраной- Ultrafiltration system Amicon 50 with membrane
- рН-метр (Hanna Instruments, Германия);- pH meter (Hanna Instruments, Germany);
- прибор для элетрофореза mini Protein (Bio-Rad, США)- device for electrophoresis mini Protein (Bio-Rad, USA)
- система высокой очистки воды (Milli-Q, Millipore);- high water purification system (Milli-Q, Millipore);
- весы лабораторные;- laboratory scales;
- рН-метр;- pH meter;
- мешалки магнитные для приготовления буферных растворов;- magnetic stirrers for the preparation of buffer solutions;
- центрифуги «микро» и «мини» с возможностью охлаждения до 4°С для концентрирования образцов и центрифугирования растворов (AG Eppendorf Centrifuge 5810 R, Германия).- centrifuges "micro" and "mini" with the possibility of cooling to 4 ° C for concentration of samples and centrifugation of solutions (AG Eppendorf Centrifuge 5810 R, Germany).
Таким образом, заявленная композиция на основе гидролизата белков гороха, содержащая IMDM, ITS, L-глутамина и раствор гидролизата при добавлении бессывороточную среду культивирования позволяет повысить концентрации и жизнеспособности клеток стабильной клеточной линии СНО, увеличить продуктивность стабильной клеточной линии СНО.Thus, the claimed composition based on pea protein hydrolyzate containing IMDM, ITS, L-glutamine and a hydrolyzate solution, with the addition of a serum-free culture medium, can increase the concentration and viability of cells of a stable CHO cell line, increase the productivity of a stable CHO cell line.
Claims (16)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019145327A RU2741088C1 (en) | 2019-12-30 | 2019-12-30 | Composition based on peas protein hydrolyzate for increasing specific producer cell lines productivity and method for production thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019145327A RU2741088C1 (en) | 2019-12-30 | 2019-12-30 | Composition based on peas protein hydrolyzate for increasing specific producer cell lines productivity and method for production thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2741088C1 true RU2741088C1 (en) | 2021-01-22 |
Family
ID=74213248
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019145327A RU2741088C1 (en) | 2019-12-30 | 2019-12-30 | Composition based on peas protein hydrolyzate for increasing specific producer cell lines productivity and method for production thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2741088C1 (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014110794A (en) * | 2005-02-11 | 2014-06-19 | Novo Nordisk Health Care Ag | Production of polypeptide in serum-free cell culture liquid containing plant protein hydrolysate |
-
2019
- 2019-12-30 RU RU2019145327A patent/RU2741088C1/en active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014110794A (en) * | 2005-02-11 | 2014-06-19 | Novo Nordisk Health Care Ag | Production of polypeptide in serum-free cell culture liquid containing plant protein hydrolysate |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| G. BARE et al., Effects of a Rice Protein Hydrolysate on Growth of CHO Cells and Production of Human Interferon-γ in a Serum-Free Medium, In: Lindner-Olsson E., Chatzissavidou N., Lullau E. (eds) Animal Cell Technology: From Target to Market. ESACT Proceedings, Springer, Dordrecht, 2001, vol. 1, р.217-218. * |
| АЛИЕВ Т.К. и др., Влияние различных компонентов среды культивирования на продукцию рекомбинантных антител в СНО клетках в условиях стабильной и транзиентной экспрессии, Современные проблемы науки и образования, издательский дом Академия Естествознания, Пенза, 2012, N 5, 2012, с.284. * |
| БАЛАБАШИН Д.С., Анализ базовых сред для культивирования линий клеток и получения рекомбинантных белков, Сборник материалов международных научно-практических конференций, ИП Коротких Алиса Анатольевна, Москва, 2018, с.125-130. * |
| БАЛАБАШИН Д.С., Анализ базовых сред для культивирования линий клеток и получения рекомбинантных белков, Сборник материалов международных научно-практических конференций, ИП Коротких Алиса Анатольевна, Москва, 2018, с.125-130. АЛИЕВ Т.К. и др., Влияние различных компонентов среды культивирования на продукцию рекомбинантных антител в СНО клетках в условиях стабильной и транзиентной экспрессии, Современные проблемы науки и образования, издательский дом Академия Естествознания, Пенза, 2012, N 5, 2012, с.284. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7377316B2 (en) | Methods for harvesting mammalian cell cultures | |
| JP6603628B2 (en) | Improved cell culture media | |
| CN107429227A (en) | Cell culture medium | |
| KR101362805B1 (en) | Improved cell culture medium | |
| EP2501799B1 (en) | Production of glycoproteins with low n-glycolylneuraminic acid (neu5gc) content | |
| US12018070B2 (en) | Methods of shifting an isoelectric profile of a protein product and uses thereof | |
| TWI832345B (en) | Methods for increasing mannose content of recombinant proteins | |
| CN110343666B (en) | Feed supplement culture medium for CHO cell culture and preparation method and application thereof | |
| CN103080300A (en) | Dipeptides to enhance yield and viability from cell cultures | |
| CN113088480B (en) | Culture medium for CHO cells and application thereof | |
| BR112016002622B1 (en) | CELL CULTURE MEDIA AND USE OF SELENIUM | |
| BR112015022682B1 (en) | METHOD TO CULTIVATE CELLS AND PRODUCE A PROTEIN | |
| CN108925137A (en) | cell culture medium | |
| Spearman et al. | Components of yeast (Sacchromyces cervisiae) extract as defined media additives that support the growth and productivity of CHO cells | |
| CN104293729A (en) | Efficient serum-free culture medium | |
| RU2741088C1 (en) | Composition based on peas protein hydrolyzate for increasing specific producer cell lines productivity and method for production thereof | |
| RU2741086C1 (en) | Composition based on hydrolyzate of sunflower protein for increasing specific productivity of producer cell lines and method for production thereof | |
| US10196665B2 (en) | Cell culture medium and methods for enhancing recombinant antibody purity | |
| CN108823267B (en) | Method for regulating acid peak content of antibody secreted by CHO-K1 expression system | |
| JP6108170B2 (en) | Cell culture media | |
| CN105018425A (en) | Animal derived component-free peripheral blood lymphocyte medium | |
| Eliasson | Regulation of arginase activity in Chang's liver cells in tissue culture | |
| Rekena et al. | Factors affecting chinese hamster ovary cell proliferation and viability | |
| KR20220066970A (en) | Concentrated perfusion medium | |
| US10526631B1 (en) | Method of reducing serine for asparagine misincorporation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20210525 Effective date: 20210525 |