RU2736933C1 - Adjuvant - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to biotechnology and immunology, specifically to use of O-specific polysaccharide of marine bacteria Cobetia litoralis KMM 3890^T (OPS 1) or O-specific polysaccharide of marine bacteria Idiomarina abyssalis KMM 227^T (OSP 2) as an adjuvant for vaccines.

EFFECT: use of said polysaccharides enables inducing a T- and B-cell with a Th1/Th2 immune response profile in a mammalian body, id est they have considerable potential for amplification both cellular, and humoral immune answer without toxicity for an organism.

1 cl, 4 tbl, 4 ex

Description

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии и иммунологии, а именно к препаратам, стимулирующим антителообразование, и может быть использовано в области медицины и ветеринарии для конструирования и производства высокоэффективных вакцин.The proposed invention relates to biotechnology and immunology, namely to drugs that stimulate antibody production, and can be used in the field of medicine and veterinary medicine for the design and production of highly effective vaccines.

Современные вакцинные препараты в ряде случаев обладают недостаточной иммуногенностью из-за отсутствия в их составе патоген-ассоциированных молекулярных структур микроорганизмов, взаимодействующих с рецепторами клеток-эффекторов врожденного иммунитета [Семакова А.П., Микшис Н.И. Адъювантные технологии в создании современных вакцин // Проблемы особо опасных инфекций -2016. - №2. - С. 28-35]. Такие вакцины требуют включения в их состав современных природных или синтетических адъювантов, повышающих иммунный потенциал вакцин.Modern vaccine preparations in some cases have insufficient immunogenicity due to the absence in their composition of pathogen-associated molecular structures of microorganisms interacting with receptors of cells-effectors of innate immunity [Semakova AP, Mikshis NI Adjuvant technologies in the creation of modern vaccines // Problems of especially dangerous infections -2016. - No. 2. - S. 28-35]. Such vaccines require the inclusion in their composition of modern natural or synthetic adjuvants that increase the immune potential of the vaccines.

Адъюванты - вещества или смеси веществ, вызывающие усиление образования антител к сложным антигенам, таким как бактерии и вирусы. Адъюванты усиливают образование специфических антител, связывающих именно антигенные детерминанты возбудителя заболевания, тогда как иммуномодуляторы активизируют все компоненты иммунной системы.Adjuvants are substances or mixtures of substances that increase the production of antibodies to complex antigens such as bacteria and viruses. Adjuvants enhance the formation of specific antibodies that bind precisely the antigenic determinants of the causative agent of the disease, while immunomodulators activate all components of the immune system.

Известно, что иммунный ответ к различным антигенам требует участия разных типов иммунных реакций. Реакция организма на различные антигены проходит двумя путями: (1) через гуморально-опосредованный иммунитет, который включает стимуляцию В-клеток и продукцию антител или иммуноглобулинов, индуцирование Т-клеток (Th1 и Th2), и (2) через клеточно-опосредованный иммунитет, который также вовлекает Т-клетки, включая цитотоксические Т-лимфоциты.It is known that the immune response to different antigens requires the participation of different types of immune responses. The body's response to various antigens proceeds in two ways: (1) through humoral-mediated immunity, which includes the stimulation of B cells and the production of antibodies or immunoglobulins, induction of T cells (Th1 and Th2), and (2) through cell-mediated immunity, which also involves T cells, including cytotoxic T lymphocytes.

Так, ответ Th1 коррелирует с индукцией клеточного иммунитета, необходимого для защиты от внутриклеточных инфекционных агентов (бактерии, простейшие), и характеризуется продукцией цитокинов IL-2, IFN-γ, TNF-β и усиленной выработкой IgG2a, IgG2b, IgG3 у мышей [Seder R.A., Hill A.V. Vaccines against intracellular infections requiring cellular immunity. Nature. 2000. 406: 793-798.]. Ответ же Th2 контролирует гуморальный иммунитет, который эффективен для защиты от большинства бактериальных и ряда вирусных инфекций и характеризуется образованием цитокинов IL-3, IL-4, IL-5, IL-10 и усиленной продукцией IgG1 [McKee A.S., Munks M.W., Marrack P. How do adjuvants work? Important considerations for new generation adjuvants. Immunity. 2007. 27: 687-690. Coffman R. L., Sher A. and Seder R.A. Vaccine Adjuvants: Putting Innate Immunity to Work. Immunity. 2010. 33(4): 492-503.].Thus, the Th1 response correlates with the induction of cellular immunity necessary to protect against intracellular infectious agents (bacteria, protozoa), and is characterized by the production of cytokines IL-2, IFN-γ, TNF-β and increased production of IgG2a, IgG2b, IgG3 in mice [Seder RA, Hill AV Vaccines against intracellular infections requiring cellular immunity. Nature. 2000. 406: 793-798.]. The Th2 response controls humoral immunity, which is effective for protection against most bacterial and a number of viral infections and is characterized by the formation of cytokines IL-3, IL-4, IL-5, IL-10 and enhanced IgG1 production [McKee AS, Munks MW, Marrack P . How do adjuvants work? Important considerations for new generation adjuvants. Immunity. 2007.27: 687-690. Coffman R. L., Sher A. and Seder R. A. Vaccine Adjuvants: Putting Innate Immunity to Work. Immunity. 2010. 33 (4): 492-503.].

В целом, иммунная реакция организма может упрощенно рассматриваться как реакция организма, основанная на специфичности В- и Т-клеток. Эти клетки могут приобретать специфическую реакционную способность после активации соответствующим специфическим антигеном и обладают механизмом памяти при возможном контакте с этим антигеном в будущем.In general, the immune response of the body can be simply considered as a response of the body based on the specificity of B and T cells. These cells can acquire specific reactivity after activation with the corresponding specific antigen and have a memory mechanism in case of possible contact with this antigen in the future.

Поэтому вакцинация против патогенов, направленная на то, чтобы значительно облегчить и ускорить образование долгоживущих Т- и В-клеток памяти и, как следствие, индукцию циркулирующих специфических протективных антител, является важной профилактической мерой. В настоящее время предпочтение отдается модификаторам функций рецепторов врожденного иммунитета и их сигнальных путей.Therefore, vaccination against pathogens, aimed at significantly facilitating and accelerating the formation of long-lived T and B memory cells and, as a consequence, the induction of circulating specific protective antibodies, is an important preventive measure. Currently, preference is given to modifiers of the functions of innate immunity receptors and their signaling pathways.

Среди множества различных групп веществ, потенциально обладающих адьювантными свойствами, обращают на себя внимание адъюванты на основе углеводов, т.к. они совместимы с живыми векторными вакцинами, безопасны, хорошо переносятся, а их производство не отличается трудоемкостью. Это, например, глюкановые, маннановые. хитозановые, мурамилдипептидные адъюванты [Курашова С.С. и др. Адъюванты на основе углеводов для производства вакцин / БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2018, Т. 18, №2. - С. 81-91].Among the many different groups of substances potentially possessing adjuvant properties, carbohydrate-based adjuvants attract attention. they are compatible with live vector vaccines, are safe, well tolerated and are not labor intensive to manufacture. These are, for example, glucan, mannan. chitosan, muramyldipeptide adjuvants [Kurashova S.S. et al. Adjuvants based on carbohydrates for the production of vaccines / BIO drugs. Prevention, diagnosis, treatment. 2018, Vol. 18, No. 2. - S. 81-91].

Известны адъювантные системы на основе сквалена (MF59), сапонина (ISCOMATRIX) и тому подобные, при использовании которых профиль иммунного ответа имеет смешанный Th1/Th2 тип [Nathalie Garcon et. al. Perspectives in Vaccinology. - 2011. - Vol. 1, №1. - P. 89-113; Sanders M.T. et al. ISCOMTM-based vaccines: The second decade. Immunol. Cell Biol. (2005).83, 119-128]. Однако с использованием в качестве адъюванта сквалена и минерального масла связывают развитие аутоиммунного и/или воспалительного синдрома [Vera-Lastra О. et. al. Autoimmune/inflammatory syndrome induced by adjuvants (Shoenfeld's syndrome): clinical and immunological spectrum // Expert review of clinical immunology. 2013. Vol.9(4). P. 361-373]. Вакцины с адъювантом MF59 повышают частоту местных реакций в виде припухлости в месте инъекции и миалгий [Schultze V. et al. Safety of MF59 adjuvant // Vaccine. - 2008. - V. 26(26). - P. 3209-3222].Known adjuvant systems based on squalene (MF59), saponin (ISCOMATRIX) and the like, when using which the immune response profile has a mixed Th1 / Th2 type [Nathalie Garcon et. al. Perspectives in Vaccinology. - 2011. - Vol. 1, no. 1. - P. 89-113; Sanders M.T. et al. ISCOMTM-based vaccines: The second decade. Immunol. Cell Biol. (2005) .83, 119-128]. However, the use of squalene and mineral oil as an adjuvant is associated with the development of an autoimmune and / or inflammatory syndrome [Vera-Lastra O. et. al. Autoimmune / inflammatory syndrome induced by adjuvants (Shoenfeld's syndrome): clinical and immunological spectrum // Expert review of clinical immunology. 2013. Vol.9 (4). P. 361-373]. Vaccines with adjuvant MF59 increase the frequency of local reactions in the form of swelling at the injection site and myalgias [Schultze V. et al. Safety of MF59 adjuvant // Vaccine. - 2008. - V. 26 (26). - P. 3209-3222].

В качестве перспективных адъювантов часто исследуются продукты бактериального происхождения, такие как липополисахариды (ЛПС) грамотрицательных бактерий. Известно, что бактериальный липополисахарид (ЛПС) является мощным стимулятором активации макрофагов и выработки провоспалительных цитокинов. Поскольку сам по себе ЛПС токсичен для человека, необходима модификация и/или комбинированное применение его с другими веществами в виде комплексов [US 2017326221 (А1), 16.11.2017; JP 2018131416 (А), 23.08.2018; WO 2004019975 (А2), 11.03.2004].Bacterial products such as lipopolysaccharides (LPS) of gram-negative bacteria are often studied as promising adjuvants. It is known that bacterial lipopolysaccharide (LPS) is a potent stimulator of macrophage activation and proinflammatory cytokine production. Since LPS itself is toxic to humans, it must be modified and / or combined with other substances in the form of complexes [US 2017326221 (A1), 16.11.2017; JP 2018131416 (A), 08/23/2018; WO 2004019975 (A2), 11.03.2004].

Адъювантная система AS04 представлена иммуномодулятором MPL -монофосфориллипидом А, профиль иммунного ответа которого имеет смешанный Th1/Th2 тип. Это очищенная, детоксицированная производная бактериальных липополисахаридов, адсорбированная на различных соединениях алюминия [Tino F. Schwarz, et al. Four-Year Follow-up of the Immunogenicity and Safety of the HPV-16/18 AS04-Adjuvanted Vaccine When Administered to Adolescent Girls Aged 10-14 Years // Journal of Adolescent Health. - 2012. - Vol. 50, №2. - P. 187-194].The adjuvant system of AS04 is represented by the immunomodulator MPL -monophosphoryl lipid A, the immune response profile of which has a mixed Th1 / Th2 type. It is a purified, detoxified derivative of bacterial lipopolysaccharides adsorbed on various aluminum compounds [Tino F. Schwarz, et al. Four-Year Follow-up of the Immunogenicity and Safety of the HPV-16/18 AS04-Adjuvanted Vaccine When Administered to Adolescent Girls Aged 10-14 Years // Journal of Adolescent Health. - 2012. - Vol. 50, no. 2. - P. 187-194].

Однако при использовании таких адъювантных систем часто возникают проблемы, вызванные их многокомпонентностью, трудностью унификации и невысокой стабильностью.However, when using such adjuvant systems, problems often arise due to their multicomponent nature, difficulty in unification, and low stability.

В настоящее время практически единственным коммерческим адъювантом, широко используемым при производстве вакцин, является гидроокись алюминия (и некоторые ее производные), применение которой обеспечивает интенсивную продукцию антител, практически независимую от вида антигена. Однако, как показали исследования, проведенные в последние годы, использование адъювантов на основе соединений алюминия, с которыми ассоциирован слабый антиген, приводит к индукции иммунитета по Th2-типу, и в итоге иммунитет направлен преимущественно против внеклеточных патогенов. Существенными недостатками адъювантов на основе соединений алюминия является то, что их использование в вакцинах может вызывать серьезные локальные и системные побочные эффекты, включая местные и системные реакции, риск развития болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных расстройств. Вследствие токсичности, соединения алюминия в составе вакцин способны провоцировать макрофагальный миозит, симптомы хронической усталости и др. [Christopher A., Shaw М., Aluminum hydroxide injections lead to motor deficits and motor neuron degeneration // Journal of Inorganic Biochemistry. 2009. Vol. 103. P. 1555-1562; Shaw C.A., Tomljenovic L. Aluminum in the central nervous system (CNS): toxicity in humans and animals, vaccine adjuvants, and autoimmunity // Immunol Res. 2013. Vol. 56(2-3). P. 304-316; Vera-Lastra O. et al. Autoimmune/inflammatory syndrome induced by adjuvants (Shoenfeld's syndrome): clinical and immunological spectrum // Expert review of clinical immunology. 2013. Vol. 9(4). P. 361-373; Gherardi RK et al. Macrophagic myofasciitis:an emerging entity. Groupe d'Etudes et Recherche sur les Maladies Musculaires Acquises etDysimmunitaires (GERMMAD) de 1' Association Francaise contre les Myopathies (AFM). Lancet. 1998 Aug 1; 352(9125):347-52].Currently, almost the only commercial adjuvant widely used in the production of vaccines is aluminum hydroxide (and some of its derivatives), the use of which provides intensive production of antibodies, almost independent of the type of antigen. However, as studies carried out in recent years have shown, the use of adjuvants based on aluminum compounds, with which a weak antigen is associated, leads to the induction of Th2-type immunity, and, as a result, immunity is directed mainly against extracellular pathogens. A significant disadvantage of aluminum adjuvants is that their use in vaccines can cause serious local and systemic side effects, including local and systemic reactions, the risk of Alzheimer's disease and other neurodegenerative disorders. Due to toxicity, aluminum compounds in vaccines can provoke macrophage myositis, symptoms of chronic fatigue, etc. [Christopher A., Shaw M., Aluminum hydroxide injections lead to motor deficits and motor neuron degeneration // Journal of Inorganic Biochemistry. 2009. Vol. 103. P. 1555-1562; Shaw C.A., Tomljenovic L. Aluminum in the central nervous system (CNS): toxicity in humans and animals, vaccine adjuvants, and autoimmunity // Immunol Res. 2013. Vol. 56 (2-3). P. 304-316; Vera-Lastra O. et al. Autoimmune / inflammatory syndrome induced by adjuvants (Shoenfeld's syndrome): clinical and immunological spectrum // Expert review of clinical immunology. 2013. Vol. 9 (4). P. 361-373; Gherardi RK et al. Macrophagic myofasciitis: an emerging entity. Groupe d'Etudes et Recherche sur les Maladies Musculaires Acquises et Dysimmunitaires (GERMMAD) de 1 'Association Francaise contre les Myopathies (AFM). Lancet. 1998 Aug 1; 352 (9125): 347-52].

С учетом того, что в случае вирусных и многих микробных инфекций наиболее эффективным является иммунный ответ по Th1-типу, существует очевидная необходимость создания новых эффективных и безопасных адъювантов или адъювантных систем, лишенных побочных эффектов, для слабых антигенов.Considering that in the case of viral and many microbial infections, the Th1-type immune response is the most effective, there is an obvious need to create new effective and safe adjuvants or adjuvant systems free of side effects for weak antigens.

Морские грамотрицательные бактерии представляют собой богатый источник биологически активных веществ, которые могут быть использованы для разработки новых классов лекарственных субстанций, в т.ч. адъювантов вакцин. Адаптация микроорганизмов к морской среде была осуществлена путем разработки сложной серии процессов зарядки биомолекул, составляющих клетку, с тем, чтобы обеспечить правильную физиологию и функциональность в этих условиях. Молекулы липополисахаридов (ЛПС), составляющие огромную часть внешней мембраны грамотрицательных бактерий, представляют собой контакт между бактериальной клеткой и окружающей средой и играют существенную роль в адаптации организмов к специфическим условиям окружающей среды. ЛПС морских грамотрицательных бактерий в отличие от ЛПС наземных бактерий, часто проявляют низкую токсичность.Marine gram-negative bacteria are a rich source of biologically active substances that can be used to develop new classes of medicinal substances, incl. vaccine adjuvants. The adaptation of microorganisms to the marine environment has been accomplished through the development of a complex series of charging processes for the biomolecules that make up the cell in order to ensure correct physiology and functionality under these conditions. Lipopolysaccharide (LPS) molecules, which make up a huge part of the outer membrane of gram-negative bacteria, represent the contact between the bacterial cell and the environment and play an essential role in the adaptation of organisms to specific environmental conditions. LPS of marine gram-negative bacteria, in contrast to LPS of terrestrial bacteria, often exhibit low toxicity.

Задачей изобретения является расширение арсенала адъювантов, обладающих низкой токсичностью и способных стимулировать как клеточный, так и гуморальный иммунный ответ.The objective of the invention is to expand the arsenal of adjuvants with low toxicity and capable of stimulating both cellular and humoral immune responses.

Поставленная задача достигается применением О-специфического полисахарида морской грамотрицательной бактерии Cobetia litoralis KMM 3890^T (ОПС 1) или О-специфического полисахарида морской грамотрицательной бактерии Idiomarina abyssalis KMM 227^T (ОПС 2) в качестве адъюванта для вакцин.The task is achieved by using the O-specific polysaccharide of the marine gram-negative bacterium Cobetia litoralis KMM 3890 ^T (OPS 1) or the O-specific polysaccharide of the marine gram-negative bacterium Idiomarina abyssalis KMM 227 ^T (OPS 2) as an adjuvant for vaccines.

Описание применения ОПС 1 или ОПС 2 в качестве адъюванта для вакцин в доступной патентной и другой научно-технической литературе не обнаружено.The description of the use of OPS 1 or OPS 2 as an adjuvant for vaccines has not been found in the available patent and other scientific and technical literature.

О-специфические полисахариды у каждого вида микроорганизмов обладают уникальными структурными особенностями, определяющими их специфичность, вследствие чего адъювантное действие ОПС 1 и ОПС 2 не является очевидным фактом и обнаружено авторами впервые.O-specific polysaccharides in each type of microorganisms have unique structural features that determine their specificity, as a result of which the adjuvant effect of OPS 1 and OPS 2 is not an obvious fact and was discovered by the authors for the first time.

Технический результат, обеспечиваемый изобретением, заключается в способности ОПС 1 и ОПС 2 при введении антигена индуцировать в организме млекопитающего Т- и В-клетки с профилем иммунного ответа Th1/Th2 типа. Причем важнейшим преимуществом новых адъювантов заключается в отсутствии у них токсичности.The technical result provided by the invention consists in the ability of OPS 1 and OPS 2, upon administration of an antigen, to induce T and B cells with a Th1 / Th2 type immune response profile in the mammalian body. Moreover, the most important advantage of the new adjuvants is their lack of toxicity.

Предлагаемые в качестве адъювантов О-специфические полисахариды из липополисахаридов морских грамотрицательных бактерий отличаются наличием необычных кислых и N-ациламиносахаров, а также заместителей неуглеводной природы.O-specific polysaccharides from the lipopolysaccharides of marine gram-negative bacteria proposed as adjuvants are distinguished by the presence of unusual acidic and N-acylaminosaccharides, as well as non-carbohydrate substituents.

Бактериальные штаммы взяты из коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН (KMM).The bacterial strains were taken from the collection of marine microorganisms, TIBOCH FEB RAS (KMM).

ОПС 1 получен путем деградации ЛПС морской грамотрицательной бактерии Cobetia litoralis KMM 3890^T и состоит из разветвленных трисахаридных повторяющихся звеньев, состоящих из D-глюкозы (D-Glcp), D-маннозы (D-Manp) и сульфатированной по положению O-5 3-дезокси-D-манноокт-2-улозоновой кислоты (Kdop5S) [Kokoulin M.S. et al. Structure and anticancer activity of sulfated O-polysaccharide from marine bacterium Cobetia litoralis KMM 3880T // Carbohydrate Polymers. - 2016. - Vol. 154. - P 55-61]. Показано, что ОПС 1 ингибируют колониеобразование клеток меланомы человека SK-MEL-28 и колоректальной карциномы НТС-116.OPS 1 is obtained by degradation of the LPS of the marine gram-negative bacterium Cobetia litoralis KMM 3890 ^T and consists of branched trisaccharide repeating units consisting of D-glucose (D-Glcp), D-mannose (D-Manp) and sulfated at the O-5 position 3- deoxy-D-mannooct-2-ulosonic acid (Kdop5S) [Kokoulin MS et al. Structure and anticancer activity of sulfated O-polysaccharide from marine bacterium Cobetia litoralis KMM 3880T // Carbohydrate Polymers. - 2016. - Vol. 154. - P 55-61]. It was shown that OPS 1 inhibit the colony formation of human melanoma cells SK-MEL-28 and colorectal carcinoma HTS-116.

ОПС 2 получен путем деградации ЛПС морской грамотрицательной бактерии Idiomarina abyssalis KMM 227^T и характеризуется уникальной структурой. Он состоит из сульфатированных пентасахаридных повторяющихся звеньев и содержит два остатка 2-ацетамидо-2-дезокси-D-глюкуроновой кислоты (D-GlcpNAcA), L-рамнозы (L-Rhap), 2,4-диацетамидо-2,4,6-тридезокси-D-глюкозы (D-QuipNAc4NAc), а также сульфатированный по положению O-2 остаток 3,6-дидезокси-3-(4-гидроксибутирамидо)-D-глюкозы [D-Quip2S3N(4Hb)] [Kokoulin M.S. et. al. Idiomarina abyssalis KMM 227T containing a 2-O-sulfate-3-N-(4-hydroxybutanoyl)-3,6-dideoxy-d-glucose // Carbohydrate Research. - 2015. -Vol. 41. - P. 100-106]. Описание утилитарных свойств этого О-специфического полисахарида в доступной литературе отсутствует.OPS 2 was obtained by degradation of the LPS of the marine gram-negative bacterium Idiomarina abyssalis KMM 227 ^T and is characterized by a unique structure. It consists of sulfated pentasaccharide repeating units and contains two residues of 2-acetamido-2-deoxy-D-glucuronic acid (D-GlcpNAcA), L-rhamnose (L-Rhap), 2,4-diacetamido-2,4,6- trideoxy-D-glucose (D-QuipNAc4NAc), as well as sulfated at the O-2 position of the residue 3,6-dideoxy-3- (4-hydroxybutyramido) -D-glucose [D-Quip2S3N (4Hb)] [Kokoulin MS et. al. Idiomarina abyssalis KMM 227T containing a 2-O-sulfate-3-N- (4-hydroxybutanoyl) -3,6-dideoxy-d-glucose // Carbohydrate Research. - 2015. -Vol. 41. - P. 100-106]. There is no description of the utilitarian properties of this O-specific polysaccharide in the available literature.

Оценка токсичности ОПС 1 и ОПС 2 in vitro и in vivoEvaluation of the toxicity of OPS 1 and OPS 2 in vitro and in vivo

Цитотоксичность ОПС в экспериментах in vitro оценивали методом суправитальной окраски лимфоцитов периферической крови человека 0,2% раствором трипанового синего с последующим микроскопическим подсчетом в камере Горяева числа живых (неокрашенных) и погибших (синих) клеток из 100. Долю жизнеспособных клеток (N) определяют по формуле: N=1-(число окрашенных клеток/общее число клеток) х 100%.The cytotoxicity of OPS in in vitro experiments was assessed by the method of supravital staining of human peripheral blood lymphocytes with a 0.2% trypan blue solution, followed by microscopic counting in the Goryaev chamber of the number of live (unstained) and dead (blue) cells out of 100. The proportion of viable cells (N) is determined by formula: N = 1- (number of stained cells / total number of cells) x 100%.

При оценке цитотоксической активности ОПС по отношению к лимфоцитам периферической крови человека in vitro установлено, что исследованные ОПС 1 и ОПС 2 не оказывают токсического действия в диапазоне концентраций от 0,01 до 100 мкг/мл. Результаты представлены в таблице 1.When evaluating the cytotoxic activity of OPS in relation to human peripheral blood lymphocytes in vitro, it was found that the studied OPS 1 and OPS 2 do not have a toxic effect in the concentration range from 0.01 to 100 μg / ml. The results are shown in Table 1.

Токсичность ОПС в экспериментах in vivo оценивали на неинбредных мышах при внутрибрюшинном введении ОПС 1 и ОПС 2 в дозах от 5 мг/кг до 500 мг/кг с определением ЛД₅₀ по формуле Кербера в модификации [Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л. 1962. 234 с.]. Животным контрольной группы вводили 0,85% раствор NaCl. Наблюдение за животными осуществляли в течение 14 суток. Ежедневной регистрации подлежали гибель животных, данные осмотра, вес тела. По окончании срока наблюдения производилось вскрытие животных для оценки состояния внутренних органов.The toxicity of OPS in experiments in vivo was evaluated on non-inbred mice with intraperitoneal administration of OPS 1 and OPS 2 at doses from 5 mg / kg to 500 mg / kg with the determination of LD ₅₀ according to the Kerber formula in the modification [Ashmarin I. P., Vorobiev A. A. ... Statistical methods in microbiological research. L. 1962. 234 p.]. The animals of the control group were injected with 0.85% NaCl solution. The animals were observed for 14 days. Deaths of animals, examination data, body weight were subject to daily registration. At the end of the observation period, the animals were dissected to assess the state of the internal organs.

При оценке токсичности ОПС in vivo установлено, что однократное внутрибрюшинное введение мышам ОПС 1 и ОПС 2 в дозах до 500 мг/кг в течение 2-х недель эксперимента не вызывало гибели экспериментальных животных. Существенных отклонений в поведении мышей, в потреблении корма, воды, приросте массы тела не отмечено. Животные опытных групп нормально развивались и прибавляли в массе наравне с контрольными. Мыши были подвижны, шерстный покров и видимые слизистые чисты. Не наблюдалось нарушений координации движений, поведенческих реакций, угнетения дыхания, нарушений мышечного тонуса.When assessing the toxicity of OPS in vivo, it was found that a single intraperitoneal injection of OPS 1 and OPS 2 to mice at doses up to 500 mg / kg within 2 weeks of the experiment did not cause death of experimental animals. There were no significant deviations in the behavior of mice, in the consumption of food, water, and body weight gain. The animals of the experimental groups developed normally and gained weight on a par with the control ones. The mice were mobile, the coat and visible mucous membranes were clean. There were no violations of coordination of movements, behavioral reactions, respiratory depression, muscle tone disorders.

Показатели массы тела опытных мышей не имели статистически значимых отличий от аналогичных показателей у интактных животных. При вскрытии установлено, что внутренние органы, региональные лимфатические узлы у опытных мышей в пределах физиологической нормы. Результаты представлены в таблице 2.Body mass indices of experimental mice did not have statistically significant differences from those in intact animals. Autopsy revealed that the internal organs, regional lymph nodes in the experimental mice were within the physiological norm. The results are shown in Table 2.

Таким образом, введение экспериментальным животным образцов ОПС 1 и ОПС 2 в диапазоне доз от 5 до 500 мг/кг не вызывает видимых клинических проявлений интоксикации в течение всего периода наблюдения. При внутрибрюшинном введении срединная летальная доза (ЛД₅₀) ОПС 1 и ОПС 2 для мышей превышает 500 мг/кг.Thus, the introduction of OPS 1 and OPS 2 samples to experimental animals in the dose range from 5 to 500 mg / kg does not cause visible clinical manifestations of intoxication during the entire observation period. When administered intraperitoneally, the median lethal dose (LD ₅₀ ) of OPS 1 and OPS 2 for mice exceeds 500 mg / kg.

Изучение закономерности формирования иммунного ответа на вакцинную композицию с овальбумином (ОВА) под влиянием ОПС морских бактерийStudy of the regularities of the formation of the immune response to the vaccine composition with ovalbumin (OVA) under the influence of the OPS of marine bacteria

Проведена оценка специфического гуморального иммунного ответа (интенсивность и продолжительность) по уровню специфических сывороточных антител к овальбумину (ОВА) (стандартный антиген) у мышей под влиянием ОПС по сравнению с известным адъювантом (гидроксид алюминия).The assessment of the specific humoral immune response (intensity and duration) was carried out by the level of specific serum antibodies to ovalbumin (OVA) (standard antigen) in mice under the influence of OPS in comparison with a known adjuvant (aluminum hydroxide).

Мышей-самцов BALB/c рандомизировали на 4 группы, иммунизированных соответственно: 1 группа - композицией ОВА с ОПС из морской бактерии Cobetialitoralis KMM 3890Т (образец 1); 2 группа - ОВА с ОПС из морской бактерии Idiomarinaabyssalis KMM 227Т (образец 2); 3 группа - ОВА с гидроокисью алюминия (лицензированный адъювант); 4 группа - ОВА с фосфатно-буферным раствором (ФБР). Суспензию ОВА с ОПС или с гидроксидом алюминия готовили путем смешивания или адсорбции на геле гидроксида алюминия в течение 1 часа. В качестве растворителя использовали ФБР рН 7,2. Животных иммунизировали внутрибрюшинно 3-х-кратно с интервалом 2 недели (0, 14, 28 дни) овальбумином (EndoFitTMOvalbumin, InvivoGenEuropa, USA) в дозе 100 мкг/мышь. Через 33-35 дней от начала иммунизации производили тотальный отбор крови из сонных артерий. В сыворотке крови определяли IgG, IgG1 and IgG2a антитела с применением тест-системы MouseAnti-OBA IgG, IgG1 and IgG2a AntibodyAssayKit (Chodrex, Inc) и выражали в log мкг/мл. Уровень цитокинов (IFN-γ, IL-2, IL-12, IL-10) в сыворотке крови мышей определяли с применением тест-систем MousePlatinum ELISA (eBioscience, Австрия). Результаты измеряли на микропланшетном ридере Multiscan RC (Labsystems, Финляндия) при 450 нм.Male BALB / c mice were randomized into 4 groups, immunized, respectively: group 1 - a composition of OVA with OPS from the marine bacterium Cobetialitoralis KMM 3890T (sample 1); Group 2 - OVA with OPS from the marine bacterium Idiomarinaabyssalis KMM 227T (sample 2); Group 3 - OVA with aluminum hydroxide (licensed adjuvant); Group 4 - OVA with phosphate buffered saline (PBS). A suspension of OVA with OPS or with aluminum hydroxide was prepared by mixing or adsorption on an aluminum hydroxide gel for 1 hour. PBS pH 7.2 was used as a solvent. Animals were immunized intraperitoneally 3 times with an interval of 2 weeks (0, 14, 28 days) with ovalbumin (EndoFitTM Ovalbumin, InvivoGenEuropa, USA) at a dose of 100 μg / mouse. After 33-35 days from the start of immunization, a total blood sample was taken from the carotid arteries. IgG, IgG1 and IgG2a antibodies were determined in blood serum using the MouseAnti-OBA IgG, IgG1 and IgG2a AntibodyAssayKit test system (Chodrex, Inc) and expressed in log μg / ml. The level of cytokines (IFN-γ, IL-2, IL-12, IL-10) in the blood serum of mice was determined using the MousePlatinum ELISA test systems (eBioscience, Austria). The results were measured on a Multiscan RC microplate reader (Labsystems, Finland) at 450 nm.

Анализ специфического иммунного ответа in vivo показал, что при иммунизации мышей ОВА под влиянием ОПС 1 и ОПС 2, содержание как общего иммуноглобулина (IgG), так и его изотипов (IgG1 и IgG2a) увеличивалось (р<0,01) по сравнению с контролем. Индекс стимуляции (ИС) иммунного ответа по общему IgG под влиянием ОПС 1 составил 25, под влиянием ОПС 2 - 65,9. Результаты представлены в таблице 3.Analysis of the specific immune response in vivo showed that when mice were immunized with OVA under the influence of OPS 1 and OPS 2, the content of both total immunoglobulin (IgG) and its isotypes (IgG1 and IgG2a) increased (p <0.01) compared to the control ... The stimulation index (IS) of the immune response for total IgG under the influence of OPS 1 was 25, under the influence of OPS 2 - 65.9. The results are shown in Table 3.

Под влиянием гидроокиси алюминия также выявлено значительное увеличение продукции IgG и его изотипов IgG1 и IgG2a (р<0,01). ИС иммунного ответа по общему IgG составил 33,8.Under the influence of aluminum hydroxide, a significant increase in the production of IgG and its isotypes IgG1 and IgG2a (p <0.01) was also revealed. The IC of the immune response for total IgG was 33.8.

Сравнение адъювантной активности ОПС 1 и гидроокиси алюминия показало, что эффект ОПС 1 по общему IgG и IgG1 аналогичен эффекту гидроокиси алюминия (р>0,05), а по IgG2a значимо превосходил таковой (р<0,01). Эффект ОПС 2 превосходил таковой гидроокиси алюминия по уровню общего IgG в 1,95 раза (р<0,05), также значимо превышал по уровню IgG1 (р<0,05) и по уровню IgG2a (р<0,01).Comparison of the adjuvant activity of OPS 1 and aluminum hydroxide showed that the effect of OPS 1 on total IgG and IgG1 is similar to the effect of aluminum hydroxide (p> 0.05), while for IgG2a it significantly exceeded that (p <0.01). The effect of OPS 2 exceeded that of aluminum hydroxide in terms of total IgG by 1.95 times (p <0.05), and also significantly exceeded in terms of IgG1 (p <0.05) and IgG2a (p <0.01).

Таким образом, как следует из таблицы 3, ОПС 1 и ОПС 2 проявляют адъювантную активность, усиливая специфический иммунный ответ к ОВА. Наибольший эффект оказывает ОПС 2.Thus, as follows from Table 3, OPS 1 and OPS 2 exhibit adjuvant activity, enhancing the specific immune response to OVA. OPS 2 has the greatest effect.

Для уточнения преимущественного типа ответа (тенденции к развитию Th1 или Th2) было рассчитано соотношение IgG1/IgG2a. Соотношение изотипов IgG1/IgG2a (мкг/мл) под влиянием исследуемых образцов ОПС 1 и ОПС 2 составляет соответственно 2,5 и 1,3, что свидетельствует об активации обеих эффекторных субпопуляций Т-лимфоцитов (Th1 и Th2).To clarify the predominant type of response (tendency to develop Th1 or Th2), the ratio IgG1 / IgG2a was calculated. The ratio of IgG1 / IgG2a isotypes (μg / ml) under the influence of the studied samples OPS 1 and OPS 2 is 2.5 and 1.3, respectively, which indicates the activation of both effector subpopulations of T-lymphocytes (Th1 and Th2).

Под влиянием гидроокиси алюминия этот показатель составил 23,3, что свидетельствует о преимущественной продукции IgG1, т.е. об активации Th2, и, следовательно, о преимущественной стимуляции гуморального иммунного ответа.Under the influence of aluminum hydroxide, this figure was 23.3, which indicates the predominant production of IgG1, i.e. activation of Th2, and, consequently, preferential stimulation of the humoral immune response.

Также изучено влияние ОПС на продукцию про- и противовоспалительных цитокинов - интерлейкинов-2, 10, 12 и интерферона-γ (IL-2, IL-10, IL-12, IFN-γ) у мышей, иммунизированных ОВА, по сравнению с гидроксидом алюминия.We also studied the effect of OPS on the production of pro- and anti-inflammatory cytokines - interleukins-2, 10, 12 and interferon-γ (IL-2, IL-10, IL-12, IFN-γ) in mice immunized with OVA, compared with hydroxide aluminum.

У животных, иммунизированных вакцинными композициями ОВА с образцами ОПС 1 и ОПС 2, наблюдалось усиление продукции Th1-ассоциированного цитокина IFN-γ (р<0,05), применение гидроокиси алюминия в качестве адъюванта не оказывало влияния на уровень IFN-γ по сравнению с контролем (р>0,05). Такая же тенденция выявлена в отношении регуляторного цитокина IL-12. В отношении Th2-ассоциированного цитокина IL-10 ОПС 1 и ОПС 2, а также гидроокись алюминия оказывали стимулирующее влияние на его продукцию (р<0,05). Результаты представлены в таблице 4.

In animals immunized with OVA vaccine compositions with OPS 1 and OPS 2 samples, an increase in the production of Th1-associated cytokine IFN-γ (p <0.05) was observed, the use of aluminum hydroxide as an adjuvant did not affect the level of IFN-γ compared with control (p> 0.05). The same trend was found for the regulatory cytokine IL-12. With respect to Th2-associated cytokine IL-10, OPS 1 and OPS 2, as well as aluminum hydroxide, had a stimulating effect on its production (p <0.05). The results are shown in Table 4.

В итоге, под влиянием ОПС 1 и ОПС 2 выявлены повышенные уровни Th1-ассоциированных цитокинов (INF-γ, IL-2) и Th2-цитокина (IL-10), а также регуляторного цитокина IL-12, что свидетельствует об активации обеих эффекторных субпопуляций Т-лимфоцитов (Th1 и Th2). Под влиянием гидроксида алюминия выявлено усиление продукции только Th2-цитокина (IL-10).As a result, under the influence of OPS 1 and OPS 2, increased levels of Th1-associated cytokines (INF-γ, IL-2) and Th2-cytokine (IL-10), as well as the regulatory cytokine IL-12, were revealed, which indicates the activation of both effector subpopulations of T-lymphocytes (Th1 and Th2). Under the influence of aluminum hydroxide, an increase in the production of only Th2 cytokine (IL-10) was revealed.

Таким образом, исследуемые ОПС из морских бактерий Cobetialitoralis KMM 3890Т и Idiomarinaabyssalis KMM 227Т нетоксичны, действуют как адъюванты, стимулируя смешанный Th1 (IgG2a, INF-γ, IL-2) и Th2 (IgG1, IL-10) иммунный ответ, т.е. обладают значительным потенциалом для усиления как клеточного, так и гуморального иммунного ответа. Предлагаемые О-специфические полисахариды из морских грамотрицательных бактерий можно считать эффективными и безопасными кандидатами в адъюванты для вакцин.Thus, the studied OPS from the marine bacteria Cobetialitoralis KMM 3890T and Idiomarinaabyssalis KMM 227T are non-toxic, act as adjuvants, stimulating mixed Th1 (IgG2a, INF-γ, IL-2) and Th2 (IgG1, IL-10) immune responses, i.e. ... have significant potential to enhance both cellular and humoral immune responses. The proposed O-specific polysaccharides from marine gram-negative bacteria can be considered effective and safe candidates for vaccine adjuvants.

Claims (1)

Применение О-специфического полисахарида морской грамотрицательной бактерии Cobetia litoralis KMM 3890^T или О-специфического полисахарида морской грамотрицательной бактерии Idiomarina abyssalis КММ 227^T в качестве адъюванта для вакцин.Application of the O-specific polysaccharide of the marine gram-negative bacterium Cobetia litoralis KMM 3890 ^T or the O-specific polysaccharide of the marine gram-negative bacterium Idiomarina abyssalis KMM 227 ^T as an adjuvant for vaccines.