RU2734649C1 - Peptide having lynx1 protein activity (embodiments), pharmaceutical composition for treating anxiety disorders and depression or correction of cognitive disorders in neurodegenerative diseases, containing said peptide, and method of treating and correcting said disorders - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology; medicine.

SUBSTANCE: invention relates to biotechnology and medicine, particularly to peptides having Lynx1 protein activity, to a pharmaceutical composition for treating anxiety disorders, depression and correction of cognitive disorders in neurodegenerative diseases containing said peptide, and to a method of treating and correcting said disorders.

EFFECT: disclosed is a peptide having lynx1 protein activity, and a pharmaceutical composition for treating anxiety disorders and depression or correction of cognitive disorders in neurodegenerative diseases containing said peptide.

10 cl, 8 dwg, 5 ex

Description

Область техникиTechnology area

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности к пептидам, обладающим активностью белка Lynx1, фармацевтической композиции для лечения и коррекции когнитивных нарушений при нейродегенеративных заболеваниях, содержащей указанный пептид, и способу лечения и коррекции указанных нарушений.The present invention relates to biotechnology and medicine, in particular to peptides having the activity of the Lynx1 protein, a pharmaceutical composition for the treatment and correction of cognitive impairments in neurodegenerative diseases, containing the specified peptide, and a method for the treatment and correction of these disorders.

Предшествующий уровень техникиPrior art

Белок Lynx1, обнаруженный в мозге человека, относится к семейству белков Ly-6/uPAR и является эндогенным модулятором работы никотинового ацетилхолинового рецептора (нАХР) [Miwa JM, Ibanez-Tallon I, Crabtree GW, Sánchez R, Sali A, Role LW, Heintz N. (1999), Neuron, 23:105-114]. Известно, что экспрессия Lynx1 в коре головного мозга трансгенных мышей, моделирующих болезнь Альцгеймера (БА), снижена по сравнению с экспрессией Lynx1 в коре головного мозга мышей дикого типа [Thomsen M.S., Arvaniti M., Jensen M.M., Shulepko M.A., Dolgikh D.A., Pinborg L.H., Härtig W., Lyukmanova E.N., Mikkelsen J.D., (2016), Neurobiol. Aging, 46:13-21]. Известно, что водорастворимый домен белка человека Lynx1 (ws-Lynx1) взаимодействует с нАХР a7 типа [Lyukmanova E.N., Shenkarev Z.O., Shulepko M.A., Mineev K.S., D¢Hoedt D., Kasheverov I.E., Filkin S.Y., Krivolapova A.P., Janickova H., Dolezal V., Dolgikh D.A. и др (2011), J. Biol. Chem., 286:10618-10627].The Lynx1 protein found in the human brain belongs to the Ly-6 / uPAR family of proteins and is an endogenous modulator of the nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) [Miwa JM, Ibanez-Tallon I, Crabtree GW, Sánchez R, Sali A, Role LW, Heintz N. (1999) Neuron 23: 105-114]. It is known that Lynx1 expression in the cerebral cortex of transgenic mice simulating Alzheimer's disease (AD) is reduced compared to Lynx1 expression in the cerebral cortex of wild-type mice [Thomsen MS, Arvaniti M., Jensen MM, Shulepko MA, Dolgikh DA, Pinborg LH, Härtig W., Lyukmanova EN, Mikkelsen JD, (2016), Neurobiol. Aging 46: 13-21]. It is known that the water-soluble domain of the human protein Lynx1 (ws-Lynx1) interacts with nAChR a7 type [Lyukmanova EN, Shenkarev ZO, Shulepko MA, Mineev KS, D ¢ Hoedt D., Kasheverov IE, Filkin SY, Krivolapova AP, Janickova H., Dolezal V., Dolgikh DA et al (2011) J. Biol. Chem. 286: 10618-10627].

Различные формы b-амилоидного пептида (Ab) образуют бляшки при БА, а также угнетают другие функции ЦНС, включая работу a7-нАХР. Показано, что ws-Lynx1 конкурирует с олигомерами самой токсичной формы b-амилоидного пептида (Ab1-42) за связывание с a7-нАХР. На первичной культуре нейронов коры головного мозга мыши показано, что прединкубация с ws-Lynx1 снижает цитотоксический эффект Ab1-42 [Thomsen M.S., Arvaniti M., Jensen M.M., Shulepko M.A., Dolgikh D.A., Pinborg L.H.,

W., Lyukmanova E.N., Mikkelsen J.D. (2016), Neurobiol. Aging, 46:13-21]. Ws-Lynx1 также предотвращает снижение экспрессии эндогенного Lynx1 в первичной культуре нейронов, вызванное Ab1-42 [М.Л. Бычков, Н.А. Васильева, М.А. Шулепко, П.М. Балабан, М.П. Кирпичников, Е.Н. Люкманова, (2018), Acta Naturae, 3(38):61-66].Various forms of b-amyloid peptide (Ab) form plaques in AD, and also inhibit other functions of the central nervous system, including the work of a7-nAChR. It has been shown that ws-Lynx1 competes with oligomers of the most toxic form of b-amyloid peptide (Ab1-42) for binding to a7-nAChR. In a primary culture of mouse cerebral cortex neurons, it was shown that preincubation with ws-Lynx1 reduces the cytotoxic effect of Ab1-42 [Thomsen MS, Arvaniti M., Jensen MM, Shulepko MA, Dolgikh DA, Pinborg LH,

W., Lyukmanova EN, Mikkelsen JD (2016), Neurobiol. Aging 46: 13-21]. Ws-Lynx1 also prevents Ab1-42-induced downregulation of endogenous Lynx1 expression in primary neuronal culture [M.L. Bychkov, N.A. Vasilieva, M.A. Shulepko, P.M. Balaban, M.P. Kirpichnikov, E.N. Lyukmanova, (2018), Acta Naturae, 3 (38): 61-66].

В поведенческих тестах на когнитивные способности показано, что введение ws-Lynx1 интраназально мышам дикого типа и мышам, моделирующим БА, улучшает когнитивные процессы, уменьшает уровень тревожности и положительно влияет на процессы памяти [Bychkov M., Vasilyeva N., Andreev-Andrievsky A., Shulepko M., Popova A., Lagereva E., Zueva I., Petrov K., Kulbatskii D., Loktyushov E., Thomsen M., Dolgikh D., Shenkarev Z., Balaban P., Kirpichnikov M., Lyukmanova E. (2018), FEBS OPEN BIO, 8(Прил.1):262].In behavioral tests for cognitive abilities, it was shown that intranasal administration of ws-Lynx1 to wild-type and AD mice improves cognitive processes, reduces the level of anxiety, and has a positive effect on memory processes [Bychkov M., Vasilyeva N., Andreev-Andrievsky A. , Shulepko M., Popova A., Lagereva E., Zueva I., Petrov K., Kulbatskii D., Loktyushov E., Thomsen M., Dolgikh D., Shenkarev Z., Balaban P., Kirpichnikov M., Lyukmanova E. (2018), FEBS OPEN BIO, 8 (App. 1): 262].

В патентной заявке US20080221013 А1 заявлено применение белка Lynx1 для лечения неврологических нарушений.In patent application US20080221013 A1, the use of the Lynx1 protein for the treatment of neurological disorders is claimed.

Ws-Lynx1 является сравнительно большим белком (масса 8,4 кДа) и содержит пять дисульфидных связей, что значительно затрудняет его рекомбинантную продукцию или получение методами химического синтеза. Сложность и низкий выход процедуры ренатурации ws-Lynx1 [М.А. Шулепко, Е.Н. Люкманова, И.Е. Кашеверов, Д.А. Долгих, В.И. Цетлин, М.П. Кирпичников. (2011), Биоорг. хим., 37(5):609-615] не позволяет получать препарат белка в количествах, достаточных для доклинических и клинических исследований, а также для применения в качестве лекарственного средства.Ws-Lynx1 is a relatively large protein (weight 8.4 kDa) and contains five disulfide bonds, which significantly complicates its recombinant production or preparation by chemical synthesis. The complexity and low yield of the ws-Lynx1 renaturation procedure [M.A. Shulepko, E.N. Lyukmanova, I.E. Kasheverov, D.A. Dolgikh, V.I. Tsetlin, M.P. Kirpichnikov. (2011), Bioorg. chem., 37 (5): 609-615] does not allow to obtain a protein preparation in quantities sufficient for preclinical and clinical studies, as well as for use as a medicine.

В патентах США №№ 8,629,114, 9,522,193 и 9,913,915 раскрыты пептиды длиной 16, 12 и 17 аминокислот, соответственно, полученные на основании 17-тизвенного консервативного домена ws-Lynx1, а также их варианты, содержащие консервативные замены аминокислот. Показано использование этих пептидов для транспорта активных веществ, присоединённых к этим пептидам, через гематоэнцефалический барьер.US Pat. Nos. 8,629,114, 9,522,193 and 9,913,915 disclose peptides of 16, 12 and 17 amino acids in length, respectively, derived from the 17-nt conservative domain ws-Lynx1, as well as variants thereof containing conservative amino acid substitutions. The use of these peptides for the transport of active substances attached to these peptides across the blood-brain barrier has been shown.

Однако, до настоящего времени не было известно, обладает ли короткий пептид консервативного домена ws-Lynx1 активностью полноразмерного белка ws-Lynx1.However, it has not been known to date whether the short peptide of the ws-Lynx1 conserved domain has the activity of the full-length ws-Lynx1 protein.

Краткое описание настоящего изобретенияBrief description of the present invention

Технической проблемой, на решение которой направлено настоящее изобретение, является разработка простых в получении препаратов пептидов, обладающих свойствами белка ws-Lynx1. Технический результат, который достигается заявленным изобретением, это расширение арсенала средств, используемых для лечения тревожных расстройств, депрессии и коррекции когнитивных нарушений при нейродегенеративных заболеваниях.The technical problem to be solved by the present invention is the development of easy-to-obtain preparations of peptides having the properties of the ws-Lynx1 protein. The technical result, which is achieved by the claimed invention, is the expansion of the arsenal of tools used to treat anxiety disorders, depression and correction of cognitive impairment in neurodegenerative diseases.

В ходе исследования небольших модифицированных пептидов, созданных на основании консервативного домена ws-Lynx1, циклизованных внутримолекулярной дисульфидной связью, содержащих от 15 до 21 остатка аминокислот, было обнаружено, что все исследованные пептиды, даже один из самых коротких пептидов, содержащий 15 остатков аминокислот консервативного домена ws-Lynx1, сохраняют активность белка ws-Lynx1 и улучшают когнитивные процессы, уменьшают уровень тревожности и положительно влияют на процессы памяти у мышей, моделирующих БА. При этом, такие короткие пептиды могут быть получены методом химического синтеза, что кардинально облегчает их получение в количествах, необходимых для применения в медицинских целях. Наличие только одной дисульфидной связи и замена метионинов на норлейцин значительно облегчает и оптимизирует процедуру ренатурации препаратов. Также модификация концевых аминокислот полученных пептидов позволяет увеличить их устойчивость и время жизни в организме пациента.During the study of small modified peptides based on the conserved domain ws-Lynx1 cyclized by an intramolecular disulfide bond containing from 15 to 21 amino acid residues, it was found that all the studied peptides, even one of the shortest peptides containing 15 amino acid residues of the conserved domain ws-Lynx1, preserve the activity of the ws-Lynx1 protein and improve cognitive processes, reduce the level of anxiety, and have a positive effect on memory processes in AD mice. Moreover, such short peptides can be obtained by the method of chemical synthesis, which radically facilitates their preparation in quantities required for medical use. The presence of only one disulfide bond and the replacement of methionines with norleucine greatly facilitates and optimizes the procedure for renaturation of drugs. Also, modification of the terminal amino acids of the obtained peptides makes it possible to increase their stability and lifetime in the patient's body.

Так было создано настоящее изобретение и решена проблема создания небольших пептидов, обладающих всеми свойствами препарата белка ws-Lynx1.So the present invention was created and the problem of creating small peptides with all the properties of the ws-Lynx1 protein preparation was solved.

Настоящее изобретение представляет собой циклический пептид, обладающий активностью белка Lynx1 и имеющий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1. Указанный цикл образован посредством дисульфидной связи между вторым и предпоследним остатками цистеина указанного пептида.The present invention is a cyclic peptide having Lynx1 protein activity and having the amino acid sequence SEQ ID NO: 1. Said ring is formed by a disulfide bond between the second and penultimate cysteine residues of said peptide.

Также настоящее изобретение представляет собой описанный выше пептид, выбранный из пептидов, имеющих последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2, 3, 4 или 5.Also, the present invention is a peptide as described above selected from peptides having the amino acid sequence SEQ ID NO: 2, 3, 4 or 5.

Также настоящее изобретение представляет собой описанный выше пептид, у которого карбоксильная группа последней аминокислоты модифицирована и представляет собой С-концевой амид.Also, the present invention is a peptide as described above, in which the carboxyl group of the last amino acid is modified and is a C-terminal amide.

Также настоящее изобретение представляет собой описанный выше пептид, у которого первая аминокислота указанного пептида дополнительно содержит защитную группу, выбранную из ацетильной группы, формильной группы, остатка пироглутаминовой кислоты, а также карбоновых кислот алифатического и ароматического рядов.Also, the present invention is a peptide as described above, wherein the first amino acid of said peptide additionally contains a protecting group selected from an acetyl group, a formyl group, a pyroglutamic acid residue, and carboxylic acids of the aliphatic and aromatic series.

Также настоящее изобретение представляет собой фармацевтическую композицию для лечения тревожных расстройств, депрессии и коррекции когнитивных нарушений при нейродегенеративных заболеваниях, содержащую эффективное количество описанного выше пептида и фармацевтически приемлемый носитель.Also, the present invention is a pharmaceutical composition for the treatment of anxiety disorders, depression and the correction of cognitive impairment in neurodegenerative diseases, containing an effective amount of the above-described peptide and a pharmaceutically acceptable carrier.

Также настоящее изобретение представляет собой описанную выше фармацевтическую композицию, в которой указанный пептид выбран из пептидов, имеющих последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2, 3, 4 или 5.Also, the present invention is a pharmaceutical composition as described above, wherein said peptide is selected from peptides having the amino acid sequence SEQ ID NO: 2, 3, 4 or 5.

Также настоящее изобретение представляет собой описанную выше фармацевтическую композицию для интраназального, внутривенного, перорального или сублингвального введения.Also, the present invention is a pharmaceutical composition as described above for intranasal, intravenous, oral or sublingual administration.

Также настоящее изобретение представляет собой способ лечения тревожных расстройств, депрессии и коррекции когнитивных нарушений при нейродегенеративных заболеваниях, включающий введение субъекту, имеющему когнитивные нарушения при нейродегенеративных заболеваниях, эффективного количества пептида по п. 1.Also, the present invention provides a method for treating anxiety disorders, depression and correcting cognitive impairments in neurodegenerative diseases, comprising administering to a subject having cognitive impairments in neurodegenerative diseases an effective amount of a peptide according to claim 1.

Также настоящее изобретение представляет собой описанный выше способ, в котором указанный пептид выбран из пептидов, имеющих последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2, 3, 4 или 5.Also, the present invention is a method as described above, wherein said peptide is selected from peptides having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 3, 4 or 5.

Также настоящее изобретение представляет собой описанный выше способ, в котором указанный пептид вводят в составе описанной выше фармацевтической композиции.Also, the present invention is a method as described above, wherein said peptide is administered in a pharmaceutical composition as described above.

Также настоящее изобретение представляет собой описанный выше способ, в котором указанную композицию вводят интраназально, внутривенно, перорально или сублингвально.Also, the present invention is a method as described above, wherein said composition is administered intranasally, intravenously, orally or sublingually.

Также настоящее изобретение представляет собой описанный выше способ, в котором нейродегенеративные заболевания выбраны из группы, включающей болезнь Альцгеймера, кортикобазальную дегенерацию, болезнь Пика, болезнь Паркинсона, деменцию с тельцами Леви, мультисистемную атрофию.Also, the present invention is a method as described above, wherein neurodegenerative diseases are selected from the group consisting of Alzheimer's disease, corticobasal degeneration, Pick's disease, Parkinson's disease, Lewy body dementia, multisystem atrophy.

Краткое описание чертежейBrief Description of Drawings

На Фиг. 1 изображена последовательность водорастворимого домена белка Lynx1 (ws-Lynx1) человека и пептидов на основе фрагментов его центральной петли согласно настоящему изобретению. Курсивом и подчеркиванием показаны искусственно добавленные или замененные остатки аминокислот. X - норлейцин. Линиями показаны циклы, образуемые дисульфидными связями белка Lynx1, а цикл у пептидов согласно настоящему изобретению, образуемый за счёт дисульфидной связи между вторым и предпоследним остатками цистеина.FIG. 1 shows the sequence of the water-soluble domain of the human Lynx1 protein (ws-Lynx1) and peptides based on fragments of its central loop according to the present invention. Artificially added or substituted amino acid residues are shown in italics and underlining. X is norleucine. The lines show the cycles formed by the disulfide bonds of the Lynx1 protein, and the cycle in the peptides according to the present invention, formed due to the disulfide bond between the second and penultimate cysteine residues.

На Фиг. 2 приведены результаты масс-спектрометрического анализа циклических пептидов cLy15 (А) и cLy21 (Б). Спектры были получены на времяпролетном масс-спектрометре MALDI-TOF, BRUKER Ultraflex (Германия), оборудованном Nd:YAG лазером. Полученные спектры показали соответствие молекулярной массы циклических пептидов расчетным значениям.FIG. 2 shows the results of mass spectrometric analysis of cyclic peptides (A) cLy15 and (B) cLy21. The spectra were obtained on a time-of-flight mass spectrometer MALDI-TOF, BRUKER Ultraflex (Germany), equipped with a Nd: YAG laser. The obtained spectra showed the correspondence of the molecular weight of the cyclic peptides to the calculated values.

На Фиг.3 приведены результаты исследования препаратов ws-Lynx1 и cLy15 на a7-нАХР экспрессированные в ооцитах X. laevis. Кривые доза-ответ для ингибирования аппроксимированы уравнением Хилла со следующими параметрами ws-Lynx1: IC50 = 49 мkM, nH = 1.1; cLy15: IC50=25 мkM, nH = 1.3. Данные показаны как среднее ± S.E.M. (n = 3 ооцита в каждом эксперименте).Figure 3 shows the results of the study of preparations ws-Lynx1 and cLy15 on a7-nAChR expressed in X. laevis oocytes . Dose-response curves for inhibition were fitted by Hill's equation with the following ws-Lynx1 parameters: IC50 = 49 mkM, nH = 1.1; cLy15: IC50 = 25 mkM, nH = 1.3. Data are shown as mean ± SEM (n = 3 oocytes in each experiment).

На Фиг. 4 показаны результаты исследования по изучению проникновения препаратов ws-Lynx1, cLy15 и cLy21 через гематоэнцефалический барьер у мышей при интраназальном введении. (A). Приведены изображения конфокальной микроскопии срезов мозга мышей после интраназального введения деионизированной воды (контроль) и препаратов CF647-ws-Lynx1 и CF647-cLy15. Ядра клеток окрашены Hoeschst3323 (черный цвет). Флуоресценция CF647 изображена оттенками серого цвета. Шкала 125 мкм. (Б). Сравнение ненормированных уровней флуоресценции CF647 (условные единицы) в области гиппокампа. Данные показаны как среднее ± S.E.M. (n = 5 мышей в каждой группе). * означает статистически значимые (p < 0.05) отличия от контрольной группы согласно однофакторному дисперсионному анализу (one-way ANOVA) и апостериорному критерию Даннетта.FIG. 4 shows the results of a study to study the penetration of drugs ws-Lynx1, cLy15 and cLy21 across the blood-brain barrier in mice after intranasal administration. (A). Shown are images of confocal microscopy of mouse brain slices after intranasal administration of deionized water (control) and CF647-ws-Lynx1 and CF647-cLy15 preparations. Cell nuclei are stained with Hoeschst3323 (black). Fluorescence of CF647 is shown in shades of gray. Scale 125 microns. (B). Comparison of unnormalized CF647 fluorescence levels (arbitrary units) in the hippocampus. Data are shown as mean ± S.E.M. (n = 5 mice per group). * means statistically significant (p <0.05) differences from the control group according to one-way analysis of variance (one-way ANOVA) and Dunnett's post hoc test.

На Фиг. 5 приведены результаты поведенческого теста «Открытое поле», показывающие анксиолитические (противотревожные) свойства препаратов ws-Lynx1 и cLy15 у мышей линии C57BL/6. Приведено количество визитов мышей в центральную область установки за 5 мин теста. Чем выше это значение, тем меньше уровень тревожности. Данные показаны как среднее ± S.E.M. (n = 12 мышей в каждой группе). * означает статистически значимые (p < 0.05) отличия от контрольной группы согласно однофакторному дисперсионному анализу (one-way ANOVA) и апостериорному критерию Даннетта.FIG. 5 shows the results of the Open Field behavioral test showing the anxiolytic (anti-anxiety) properties of the ws-Lynx1 and cLy15 preparations in C57BL / 6 mice. The number of visits of mice to the central area of the setup for 5 min of the test is given. The higher this value, the lower the level of anxiety. Data are shown as mean ± S.E.M. (n = 12 mice per group). * means statistically significant (p <0.05) differences from the control group according to one-way analysis of variance (one-way ANOVA) and Dunnett's post hoc test.

На Фиг. 6 приведены результаты поведенческого теста «Ротарод или вращающийся стержень», показывающие улучшение моторной памяти, координации и баланса у мышей линии C57BL/6, получавших препараты ws-Lynx1 и cLy15. Приведено время удержания мыши на вращающемся стержне (сек) в зависимости от дня эксперимента. Данные показаны как среднее ± S.E.M. (n = 12 мышей в каждой группе). *, ** означает статистически значимые (p < 0.05, 0.01) отличия группы ws-Lynx1 от контрольной группы. #, ##, ### означает статистически значимые (p < 0.05, 0.01, 0.001) отличия группы cLy15 от контрольной группы согласно двуфакторному дисперсионному анализу (two-way ANOVA) и апостериорному критерию Даннетта.FIG. Figure 6 shows the results of the Rotarod or Rotating Rod behavioral test showing improvements in motor memory, coordination and balance in C57BL / 6 mice treated with ws-Lynx1 and cLy15. The time of holding the mouse on the rotating rod (sec) is given depending on the day of the experiment. Data are shown as mean ± S.E.M. (n = 12 mice per group). *, ** means statistically significant (p <0.05, 0.01) differences between the ws-Lynx1 group and the control group. #, ##, ### means statistically significant (p <0.05, 0.01, 0.001) differences between the cLy15 group and the control group according to two-way ANOVA and Dunnett's post hoc test.

На Фиг. 7 приведены результаты поведенческого теста на обонятельную память у мышей линии 2xTg-AD, моделирующих болезнь Альцгеймера. Тест проводили два дня. На первый день животному предъявляли незнакомый запах и измеряли время, необходимое для его обнюхивания. На второй день измеряли время необходимое для обнюхивания того же запаха. При формировании памяти это время уменьшалось. На рисунке показано время обнюхивание ольфакторной метки во второй день, нормализованное на время обнюхивания в первый день. Показаны следующие группы животных: Tg- не трансгенные однопометники, получавшие воду (положительный контроль); Tg+ трансгенные животные, получавшие воду (отрицательный контроль); а также трансгенные животные (Tg+) получавшие ws-Lynx1, cLy15 и cLy21. Данные показаны как среднее ± S.E.M. (n = 10-14 мышей в каждой группе). * означает статистически значимые (p < 0.05) отличия от контрольной группы (Tg+) согласно однофакторному дисперсионному анализу (one-way ANOVA) и апостериорному критерию Даннетта.FIG. 7 shows the results of a behavioral test for olfactory memory in 2xTg-AD mice simulating Alzheimer's disease. The test was carried out for two days. On the first day, the animal was presented with an unfamiliar smell and the time it took to sniff it was measured. On the second day, the time taken to sniff the same scent was measured. During the formation of memory, this time decreased. The figure shows the time of sniffing the olfactory mark on the second day, normalized to the time of sniffing on the first day. The following groups of animals are shown: Tg - non-transgenic littermates receiving water (positive control); Tg + transgenic animals treated with water (negative control); as well as transgenic animals (Tg +) treated with ws-Lynx1, cLy15 and cLy21. Data are shown as mean ± S.E.M. (n = 10-14 mice in each group). * means statistically significant (p <0.05) differences from the control group (Tg +) according to one-way analysis of variance (one-way ANOVA) and Dunnett's posterior test.

На Фиг. 8 приведены результаты поведенческого теста на формирование условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) у мышей линии 2xTg-AD, моделирующих болезнь Альцгеймера. Показана доля животных, не зашедших в процессе тестирования в темную камеру, у которых сформировался рефлекс пассивного избегания. Показаны следующие группы животных: Tg- нетрансгенные однопометники, получавшие воду (положительный контроль); Tg+ трансгенные животные, получавшие воду (отрицательный контроль); а также трансгенные животные (Tg+) получавшие ws-Lynx1, cLy15 и cLy21. (n = 10-14 мышей в каждой группе).FIG. 8 shows the results of a behavioral test for the formation of a conditioned passive avoidance reflex (CPAR) in 2xTg-AD mice simulating Alzheimer's disease. Shown is the proportion of animals that did not enter the dark chamber during testing, in which a passive avoidance reflex was formed. The following groups of animals are shown: Tg - non-transgenic littermates receiving water (positive control); Tg + transgenic animals treated with water (negative control); as well as transgenic animals (Tg +) treated with ws-Lynx1, cLy15 and cLy21. (n = 10-14 mice in each group).

Подробное описание настоящего изобретенияDetailed description of the present invention

Первым объектом настоящего изобретения является пептид, длиной от 15 до 21 аминокислоты, обладающий активностью белка Lynx1.The first object of the present invention is a peptide, 15 to 21 amino acids in length, having the activity of the Lynx1 protein.

Термин «пептид, обладающий активностью белка Lynx1» означает, что указанный пептид, также как полноразмерный водорастворимый домен белка человека Lynx1 (ws-Lynx1), обладает способностью к взаимодействию с нАХР a7 типа. Способность к взаимодействию с нАХР a7 типа может быть определена, например, как описано в [Miwa JM, Ibanez-Tallon I, Crabtree GW,

R, Sali A, Role LW, Heintz N. (1999), Neuron, 23:105-114] и [Lyukmanova E.N., Shenkarev Z.O., Shulepko M.A., Mineev K.S., D'Hoedt D., Kasheverov I.E., Filkin S.Y., Krivolapova A.P., Janickova H., Dolezal V., Dolgikh D.A. и др (2011), J. Biol. Chem., 286:10618-10627].The term "peptide having Lynx1 protein activity" means that said peptide, as well as the full-length water-soluble domain of the human Lynx1 protein (ws-Lynx1), has the ability to interact with type a7 nAChRs. The ability to interact with type a7 nAChR can be determined, for example, as described in [Miwa JM, Ibanez-Tallon I, Crabtree GW,

R, Sali A, Role LW, Heintz N. (1999), Neuron, 23: 105-114] and [Lyukmanova EN, Shenkarev ZO, Shulepko MA, Mineev KS, D'Hoedt D., Kasheverov IE, Filkin SY, Krivolapova AP, Janickova H., Dolezal V., Dolgikh DA et al (2011), J. Biol. Chem. 286: 10618-10627].

Также термин «пептид, обладающий активностью белка Lynx1» означает, что указанный пептид, также как полноразмерный ws-Lynx1, способен конкурировать с олигомерами самой токсичной формы b-амилоидного пептида (Ab1-42) за связывание с a7-нАХР. Способность к конкуренции с олигомерами самой токсичной формы b-амилоидного пептида (Ab1-42) за связывание с a7-нАХР может быть определена, например, как описано в [Thomsen M.S., Arvaniti M., Jensen M.M., Shulepko M.A., Dolgikh D.A., Pinborg L.H.,

W., Lyukmanova E.N., Mikkelsen J.D. (2016), Neurobiol. Aging, 46:13-21].Also, the term "peptide having the activity of the Lynx1 protein" means that this peptide, as well as the full-length ws-Lynx1, is able to compete with the oligomers of the most toxic form of b-amyloid peptide (Ab1-42) for binding to a7-nAChR. The ability to compete with oligomers of the most toxic form of b-amyloid peptide (Ab1-42) for binding to a7-nAChR can be determined, for example, as described in [Thomsen MS, Arvaniti M., Jensen MM, Shulepko MA, Dolgikh DA, Pinborg LH,

W., Lyukmanova EN, Mikkelsen JD (2016), Neurobiol. Aging 46: 13-21].

Также термин «пептид, обладающий активностью белка Lynx1» означает, что указанный пептид, также как полноразмерный ws-Lynx1, способен предотвращать снижение экспрессии эндогенного Lynx1 в первичной культуре нейронов, вызванное Ab1-42. Указанная активность может быть определена, например, как описано в [М.Л. Бычков, Н.А. Васильева, М.А. Шулепко, П.М. Балабан, М.П. Кирпичников, Е.Н. Люкманова, (2018), Acta Naturae, 3(38):61-66].Also, the term "peptide having Lynx1 protein activity" means that said peptide, as well as full-length ws-Lynx1, is able to prevent the decrease in the expression of endogenous Lynx1 in primary neuronal culture caused by Ab1-42. This activity can be determined, for example, as described in [M.L. Bychkov, N.A. Vasilieva, M.A. Shulepko, P.M. Balaban, M.P. Kirpichnikov, E.N. Lyukmanova, (2018), Acta Naturae, 3 (38): 61-66].

Пептид согласно настоящему изобретению имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1. Указанный пептид представлен в виде альтернатив модифицированного консервативного домена ws-Lynx1, предпочтительно содержащего остатки норлейцина вместо остатков метионина и дополнительно содержащего по одному остатку аминокислоты, предпочтительно глицина, на N- и на С-концах.The peptide according to the present invention has the amino acid sequence SEQ ID NO: 1. Said peptide is presented as alternatives to the modified conserved domain ws-Lynx1, preferably containing norleucine residues instead of methionine residues and additionally containing one amino acid residue, preferably glycine, on N- and C -the ends.

Ввиду того, что некоторые аминокислоты обладают высокой гомологией друг к другу, различия между такими аминокислотами не оказывают существенного влияния на трехмерную структуру пептида и его активность. Поэтому пептиды согласно настоящему изобретению также включают в себя варианты пептидов, обладающие активностью ws-Lynx1 и содержащие консервативные замены аминокислот. Примеры консервативных замен включают: замену Ala на Ser или Thr, замену Arg на Gln, His или Lys, замену Asn на Glu, Gln, Lys, His или Asp, замену Asp на Asn, Glu или Gln, замену Gln на Asn, Glu, Lys, His, Asp или Arg, замену Glu на Asn, Gln, Lys или Asp, замену Gly на Pro, замену His на Asn, Lys, Gln, Arg или Tyr, замену Ile на Leu, Met, Val или Phe, замену Leu на Ile, Met, Val или Phe, замену Lys на Asn, Glu, Gln, His или Arg, замену Met на Nle, Ile, Leu, Val или Phe, замену Phe на Trp, Tyr, Met, Ile или Leu, замену Ser на Thr или Ala, замену Thr на Ser или Ala, замену Trp на Phe или Tyr, замену Tyr на His, Phe или Trp, и замену Val на Met, Ile или Leu. Именно такая возможность консервативных замен в пептидах согласно настоящему изобретению отображена в последовательности аминокислот SEQ ID NO: 1.Due to the fact that some amino acids have high homology to each other, differences between such amino acids do not significantly affect the three-dimensional structure of the peptide and its activity. Therefore, the peptides of the present invention also include peptide variants having ws-Lynx1 activity and containing conservative amino acid substitutions. Examples of conservative substitutions include: substitution of Ala for Ser or Thr, substitution of Arg for Gln, His or Lys, substitution of Asn for Glu, Gln, Lys, His, or Asp, substitution of Asp for Asn, Glu or Gln, substitution of Gln for Asn, Glu, Lys, His, Asp or Arg, replace Glu with Asn, Gln, Lys or Asp, replace Gly with Pro, replace His with Asn, Lys, Gln, Arg or Tyr, replace Ile with Leu, Met, Val or Phe, replace Leu to Ile, Met, Val, or Phe, replace Lys with Asn, Glu, Gln, His or Arg, replace Met with Nle, Ile, Leu, Val or Phe, replace Phe with Trp, Tyr, Met, Ile or Leu, replace Ser by Thr or Ala, replacing Thr with Ser or Ala, replacing Trp with Phe or Tyr, replacing Tyr with His, Phe or Trp, and replacing Val with Met, Ile or Leu. It is this possibility of conservative substitutions in the peptides of the present invention that is reflected in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

Конкретными вариантами пептидов согласно настоящему изобретению являются пептиды, имеющие последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2, 3, 4 или 5.Specific variants of the peptides of the present invention are peptides having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 3, 4, or 5.

В качестве альтернативы, первая аминокислота на N-конце пептидов согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать защитную группу, выбранную из ацетильной группы, формильной группы, остатка пироглутаминовой кислоты, также карбоновых кислот алифатического и ароматического рядов.Alternatively, the first amino acid at the N-terminus of the peptides of the present invention may additionally contain a protecting group selected from an acetyl group, a formyl group, a pyroglutamic acid residue, and aliphatic and aromatic carboxylic acids.

В случае получения пептидов согласно настоящему изобретению методом химического синтеза, карбоксильная группа последней аминокислоты указанного пептида может представлять собой С-концевой амид.In the case of obtaining peptides according to the present invention by chemical synthesis, the carboxyl group of the last amino acid of said peptide may be a C-terminal amide.

Как уже указывалось выше в разделе «Краткое описание настоящего изобретения», авторы настоящего изобретения обнаружили, что все исследованные пептиды, даже один из самых коротких пептидов, содержащий 15 остатков аминокислот консервативного домена ws-Lynx1, сохраняют активность белка ws-Lynx1 и улучшают когнитивные процессы, уменьшают уровень тревожности и положительно влияет на процессы памяти у мышей, моделирующих БА. При этом, такие короткие пептиды могут быть получены методом химического синтеза, что кардинально облегчает их получение в количествах, необходимых для применения в медицинских целях. Наличие только одной дисульфидной связи и замена метионинов на норлейцин значительно облегчает и оптимизирует процедуру ренатурации препаратов. Также модификация концевых аминокислот полученных пептидов позволяет увеличить их устойчивость и время жизни в организме пациента.As mentioned above in the section "Summary of the present invention", the authors of the present invention found that all the studied peptides, even one of the shortest peptides containing 15 amino acid residues of the conservative domain of ws-Lynx1, retain the activity of the ws-Lynx1 protein and improve cognitive processes , reduce the level of anxiety and have a positive effect on memory processes in AD mice. Moreover, such short peptides can be obtained by the method of chemical synthesis, which radically facilitates their preparation in quantities required for medical use. The presence of only one disulfide bond and the replacement of methionines with norleucine greatly facilitates and optimizes the procedure for renaturation of drugs. Also, modification of the terminal amino acids of the obtained peptides makes it possible to increase their stability and lifetime in the patient's body.

Пептиды, согласно настоящему изобретению, содержат цикл, образованный посредством дисульфидной связи между вторым и предпоследним остатками цистеина указанного пептида.The peptides according to the present invention contain a ring formed by a disulfide bond between the second and penultimate cysteine residues of said peptide.

Образование дисульфидной связи между вторым и предпоследним остатками цистеина указанного пептида для получения циклического пептида предпочтительно проводить на последней стадии химического синтеза, например, посредством удаления защитных групп с боковых цепей остатков цистеина и проведения реакции циклизации с использованием, например, тетрахлорметана и триэтиламина в N-метилпирролидоне (NMP), как это описано ниже в Примере 1.The formation of a disulfide bond between the second and the penultimate cysteine residues of said peptide to obtain a cyclic peptide is preferably carried out at the last stage of chemical synthesis, for example, by removing protective groups from the side chains of cysteine residues and carrying out a cyclization reaction using, for example, tetrachloromethane and triethylamine in N-methylpyrrolidone (NMP) as described below in Example 1.

Другим объектом настоящего изобретения являются фармацевтическая композиция для лечения тревожных расстройств, депрессии и коррекции когнитивных нарушений при нейродегенеративных заболеваниях, содержащая эффективное количество пептида или пептидов согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.Another object of the present invention is a pharmaceutical composition for the treatment of anxiety disorders, depression and the correction of cognitive impairments in neurodegenerative diseases, comprising an effective amount of a peptide or peptides according to the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier.

Такая фармацевтическая композиция предназначена для интраназального, внутривенного, перорального или сублингвального введения. Предпочтительной формой указанной фармацевтической композиции является водный раствор. Также фармацевтическая композиция может находиться в форме суспензий, назальных спреев, стерильных инъецируемых препаратов, например стерильных инъецируемых водных растворов или суспензий, или таблеток, капсул или саше для перорального введения.Such a pharmaceutical composition is intended for intranasal, intravenous, oral, or sublingual administration. A preferred form of said pharmaceutical composition is an aqueous solution. Also, the pharmaceutical composition can be in the form of suspensions, nasal sprays, sterile injectables, for example sterile injectable aqueous solutions or suspensions, or tablets, capsules or sachets for oral administration.

Фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой растворитель или диспергирующую среду, которая содержит, например, воду, водные солевые растворы.The pharmaceutically acceptable carrier can be a solvent or dispersing medium that contains, for example, water, aqueous saline solutions.

Композиции, предназначенные для введения интраназальным путём в виде капель, аэрозоля или путём ингаляции, или предназначенные для введения пероральным путём или сублингвально (подъязычное введение) приготавливают с помощью методов, хорошо известных в области технологии изготовления фармацевтических композиций, и они могут представлять собой растворы на основе физиологического раствора, содержащие бензиловый спирт или другие приемлемые консерванты, вещества, повышающие абсорбцию для увеличения биологической доступности, и/или другие солюбилизирующие или диспергирующие агенты, известные в данной области.Compositions intended to be administered intranasally in the form of drops, aerosol or by inhalation, or intended for administration by the oral route or sublingually (sublingual administration) are prepared using methods well known in the field of pharmaceutical composition technology, and they can be solutions based on saline, containing benzyl alcohol or other acceptable preservatives, substances that increase absorption to increase bioavailability, and / or other solubilizing or dispersing agents known in the art.

Композиции согласно настоящему изобретению также можно вводить внутривенно (как в виде болюса, так и путем инфузии), при этом все применяемые формы являются хорошо известными специалисту в области фармацевтики. Предназначенные для введения путем инъекции растворы или суспензии можно приготавливать с помощью известных методов с использованием приемлемых нетоксичных, пригодных для парентерального введения разбавителей или растворителей, таких как, вода, раствор Рингера или изотонический раствор хлорида натрия.The compositions of the present invention can also be administered intravenously (either as a bolus or as an infusion), all forms being used being well known to the person skilled in the art of pharmacy. Solutions or suspensions to be administered by injection may be prepared by known methods using suitable non-toxic, parenterally acceptable diluents or solvents such as water, Ringer's solution or isotonic sodium chloride solution.

Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению, предназначенные для перорального применения, могут находиться в форме отдельных стандартных дозируемых форм, таких как таблетки, капсулы или саше, каждая из которых содержит заранее определенное количество действующего вещества, в форме порошка или гранул, а также в форме раствора или суспензии в водной среде. Такие композиции можно приготавливать с помощью любых фармацевтических методов, при этом все методы включают стадию приведения действующего вещества в контакт с носителем, включающим один или несколько необходимых ингредиентов. В целом композиции приготавливают путем однородного и тщательного смешения действующего вещества с жидкими носителями или тонко измельченными твердыми носителями или с ими обоими и при необходимости путем придания продукту требуемой формы.Pharmaceutical compositions of the present invention for oral administration may be in the form of separate unit dosage forms such as tablets, capsules or sachets, each containing a predetermined amount of active ingredient, in the form of a powder or granules, or in the form of a solution or suspension in an aqueous medium. Such compositions can be prepared by any pharmaceutical method, all methods comprising the step of bringing the active substance into contact with a carrier comprising one or more of the required ingredients. In general, the compositions are prepared by uniformly and intimately mixing the active ingredient with liquid carriers or finely divided solid carriers, or both, and optionally shaping the product into the desired shape.

Таблетки, капсулы и саше могут также содержать связующее вещество, например трагакантовую смолу, аравийскую камедь, кукурузный крахмал или желатин; эксципиепты, например, вторичный кислый фосфат кальция; разрыхлитель, например, кукурузный крахмал, картофельный крахмал, альгиновая кислота; замасливатель, например, стеарат магния; и подслащивающее вещество, например, сахарозу, лактозу или сахарин.The tablets, capsules and sachets may also contain a binder such as gum tragacanth, gum arabic, corn starch or gelatin; excipients such as dibasic calcium phosphate; a baking powder such as corn starch, potato starch, alginic acid; a lubricant such as magnesium stearate; and a sweetener such as sucrose, lactose or saccharin.

Таблетку можно изготавливать путём прессования или литья под давлением, необязательно с использованием одного или нескольких вспомогательных ингредиентов. Спрессованные таблетки можно изготавливать с помощью соответствующей машины путём прессования действующего вещества, находящегося в свободно текучей форме, такой как порошок или гранулы, необязательно в смеси со связующим веществом, замасливателем, инертным разбавителем, поверхностно-активным веществом или диспергирующим агентом. Таблетки, получаемые путём отливки, можно изготавливать с помощью соответствующей машины путем литья под давлением с использованием смеси соединения, находящегося в порошкообразной форме, увлажненной инертным жидким разбавителем.The tablet can be made by compression or injection molding, optionally using one or more accessory ingredients. Compressed tablets can be made using a suitable machine by compressing the active substance in a free flowing form such as powder or granules, optionally in admixture with a binder, lubricant, inert diluent, surfactant or dispersing agent. Tablets obtained by molding can be made with a suitable injection molding machine using a mixture of the compound in powder form moistened with an inert liquid diluent.

Предпочтительными являются фармацевтические композиции, содержащие пептид или смесь пептидов, имеющих последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2, 3, 4 или 5.Preferred are pharmaceutical compositions containing a peptide or mixture of peptides having the amino acid sequence SEQ ID NO: 2, 3, 4, or 5.

Эффективное количество пептидов, применяемых для терапии, может варьироваться в зависимости от пути введения, состояния, подлежащего лечению, и серьезности подлежащего лечению состояния. Таким образом, режим доз с использованием пептидов согласно настоящему изобретению выбирают с учетом различных факторов, включающих тип, вид, возраст, вес, пол и медицинское состояние пациента; серьезность подлежащего лечению состояния; путь введения; почечную и печеночную функцию пациента. Лечащий врач или клиницист легко могут определить и назначить эффективное количество лекарственного средства, необходимое для лечения тревожных расстройств, депрессии и для коррекции когнитивных нарушений при нейродегенеративных заболеваниях. Достижение оптимальной концентрации лекарственного средства в том диапазоне, в котором оно обладает эффективностью и в котором не наблюдается токсического действия, можно осуществлять с использованием режима, учитывающего кинетику биодоступности лекарственного средства.The effective amount of peptides used for therapy can vary depending on the route of administration, the condition being treated, and the severity of the condition being treated. Thus, the dosage regimen using the peptides of the present invention is selected taking into account various factors, including the type, species, age, weight, sex, and medical condition of the patient; the severity of the condition being treated; route of administration; the renal and hepatic function of the patient. The attending physician or clinician can easily determine and prescribe the effective amount of a drug needed to treat anxiety disorders, depression, and to correct cognitive impairment in neurodegenerative diseases. Achievement of the optimal concentration of the drug in the range in which it is effective and in which no toxic effect is observed can be achieved using a regimen that takes into account the kinetics of drug bioavailability.

Следующим объектом настоящего изобретения является способ лечения тревожных расстройств, депрессии и коррекции когнитивных нарушений при нейродегенеративных заболеваниях. Указанный способ включает введение субъекту, у которого наблюдаются тревожные расстройства или состояние депрессии, или имеющему когнитивные нарушения при нейродегенеративных заболеваниях, эффективного количества пептида или пептидов согласно настоящему изобретению.Another object of the present invention is a method for the treatment of anxiety disorders, depression and the correction of cognitive impairment in neurodegenerative diseases. The method comprises administering to a subject experiencing anxiety or depression, or having cognitive impairment in neurodegenerative diseases, an effective amount of a peptide or peptides according to the present invention.

Нейродегенеративные заболевания, которые вызывают указанные когнитивные нарушения, подлежащие коррекции, выбраны из группы, включающей болезнь Альцгеймера, кортикобазальную дегенерацию, болезнь Пика, болезнь Паркинсона, деменцию с тельцами Леви, мультисистемную атрофию.Neurodegenerative diseases that cause these cognitive impairments to be corrected are selected from the group consisting of Alzheimer's disease, corticobasal degeneration, Pick's disease, Parkinson's disease, Lewy body dementia, multisystem atrophy.

Введение эффективного количества пептида или пептидов согласно настоящему изобретению субъекту в рамках способа согласно настоящему изобретению включает интраназальное, внутривенное, пероральное или сублингвальное введение фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению в зависимости от её вида.The administration of an effective amount of a peptide or peptides according to the present invention to a subject in the framework of the method according to the present invention includes intranasal, intravenous, oral or sublingual administration of the pharmaceutical composition according to the present invention, depending on its type.

Предпочтительным в способе согласно настоящему изобретению является введение фармацевтических композиций, содержащих пептид или смесь пептидов, имеющих последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2, 3, 4 или 5.Preferred in the method according to the present invention is the administration of pharmaceutical compositions containing a peptide or a mixture of peptides having the amino acid sequence SEQ ID NO: 2, 3, 4 or 5.

Настоящее изобретение более детально описано со ссылкой на примеры.The present invention is described in more detail with reference to examples.

ПримерыExamples of

Последующие примеры приведены для целей разъяснения сущности настоящего изобретения и не ограничивают каким-либо образом объём правовой охраны, определяемый формулой настоящего изобретения.The following examples are given for the purpose of explaining the essence of the present invention and do not limit in any way the scope of protection defined by the claims of the present invention.

Пример 1. Синтез циклопептидов cLy15 и cLy21Example 1. Synthesis of cyclopeptides cLy15 and cLy21

Твёрдофазный синтез линейных пептидил-полимеров Ly15 и Ly21, содержащих на остатках цистеина S-трет-бутилсульфенильные защитные группы (StBu) (Seq X), проводили согласно стандартным протоколам, используя Fmoc/tBu стратегию [Chan W. C., White P. D., (2000), Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach. Oxford, UK: Oxford University Press, 41-76]. Конверсию реакций ацилирования свободных аминогрупп контролировали с помощью хлоранилового теста и теста Кайзера. Для присоединения остатков Cys использовали защищенное производное Fmoc-Cys(StBu)-OH, синтезированное согласно протоколу, описанному в [Atherton E., Sheppard R. C. (1989), Solid Phase Peptide Synthesis a practical approach. 1-st edition. Oxford, UK: Information Press Ltd]. Снятие StBu защитных групп с боковых цепей остатков цистеина проводили с использованием 2-меркаптоэтанола в присутствии N-метилморфолина (NMM) в диметилформамиде (DMF) в атмосфере инертного газа.Solid-phase synthesis of linear peptidyl polymers Ly15 and Ly21 containing S-tert-butylsulfenyl protecting groups (StBu) (Seq X) on cysteine residues was carried out according to standard protocols using the Fmoc / tBu strategy [Chan WC, White PD, (2000), Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach. Oxford, UK: Oxford University Press, 41-76]. The conversion of the reactions of acylation of free amino groups was monitored using the chloranil test and the Kaiser test. For the attachment of Cys residues, the protected Fmoc-Cys (StBu) -OH derivative was used, synthesized according to the protocol described in [Atherton E., Sheppard R. C. (1989), Solid Phase Peptide Synthesis a practical approach. 1-st edition. Oxford, UK: Information Press Ltd]. Removal of StBu protecting groups from the side chains of cysteine residues was performed using 2-mercaptoethanol in the presence of N-methylmorpholine (NMM) in dimethylformamide (DMF) under an inert gas atmosphere.

Для получения циклических пептидов cLy15 и cLy21 прямо на смоле проводили реакцию циклизации с использованием тетрахлорметана и триэтиламина в N-метилпирролидоне (NMP). Наличие свободных S-H групп в пептидах, находящихся на полистироловом носителе, определяли с помощью теста Элмана. Снятие циклических пептидов со смолы проводили с помощью 95% трифторуксусной кислоты (TFA). Циклические пептиды cLy15 и cLy21 осаждали диэтиловым эфиром, осадок центрифугировали и сушили в среде инертного газа. Очистку целевых циклических пептидов проводили методом обращённо-фазовой ВЭЖХ на колонке Jupiter C4, А300, 4,6'250 мм (Phenomenex, США) в линейном градиенте концентрации ацетонитрила от 5% до 25% за 90 мин в присутствии 0,1%-ной TFA, скорость элюции - 0,2 мл/мин. Оптическую плотность элюата регистрировали при 230 нм. Идентичность полученных препаратов подтверждали методом МАЛДИ масс-спектрометрии (Фиг. 2).To obtain cyclic peptides cLy15 and cLy21, a cyclization reaction was carried out directly on the resin using carbon tetrachloride and triethylamine in N-methylpyrrolidone (NMP). The presence of free S-H groups in peptides on a polystyrene support was determined using the Elman test. Removal of cyclic peptides from the resin was performed using 95% trifluoroacetic acid (TFA). Cyclic peptides cLy15 and cLy21 were precipitated with diethyl ether, the precipitate was centrifuged and dried under inert gas. Purification of the target cyclic peptides was carried out by reversed-phase HPLC on a Jupiter C4, A300, 4.6'250 mm column (Phenomenex, United States) in a linear gradient of acetonitrile concentration from 5% to 25% for 90 min in the presence of 0.1% TFA, elution rate 0.2 ml / min. The optical density of the eluate was recorded at 230 nm. The identity of the obtained preparations was confirmed by MALDI mass spectrometry (Fig. 2).

Пример 2. Изучение взаимодействия циклического пептида cLy15 и ws-Lynx1 с a7-нАХР, экспрессированными в ооцитах X. laevis.Example 2. Study of the interaction of cyclic peptide cLy15 and ws-Lynx1 with a7-nAChR expressed in X. laevis oocytes.

Рекомбинантный белок ws-Lynx1 получали в клетках E. coli как описано в [М.А. Шулепко, Е.Н. Люкманова, И.Е. Кашеверов, Д.А. Долгих, В.И. Цетлин, М.П. Кирпичников. (2011), Биоорг. хим., 37(5):609-615]. Чистоту, гомогенность и корректный фолдинг белка проверяли с помощью ВЖЭХ, MALDI-MS, SDS-PAGE и ЯМР-спектроскопии.Recombinant protein ws-Lynx1 was obtained in E. coli cells as described in [M.A. Shulepko, E.N. Lyukmanova, I.E. Kasheverov, D.A. Dolgikh, V.I. Tsetlin, M.P. Kirpichnikov. (2011), Bioorg. chem., 37 (5): 609-615]. The purity, homogeneity and correct folding of the protein was verified by HPLC, MALDI-MS, SDS-PAGE and NMR spectroscopy.

Ооциты лягушки X. laevis были получены как описано в [Osmakov D.I., Koshelev S.G., Andreev Y.A., Dubinnyi M.A., Kublistki V.S., Efremov R.G., Sobolevsky A.I. and Kozlov S.A. (2018), Br. J. Pharmacol. 175:924-937]. В каждый ооцит была произведена инъекция 2.5-10 нг мРНК, кодирующей ген a7-нАХР человека. После инъекции ооциты содержали в течение 2-3 дней на 19°C и затем вплоть до 7 дней на 15°C в среде ND-96 с добавлением 50 мг/мл гентамицина. Среда ND-96 содержала (в мМ): 96 NaCl, 2 KCl, 1.8 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES, pH 7.4. Oocytes from frog X. laevis were obtained as described in [Osmakov DI, Koshelev SG, Andreev YA, Dubinnyi MA, Kublistki VS, Efremov RG, Sobolevsky AI and Kozlov SA (2018), Br. J. Pharmacol. 175: 924-937]. Each oocyte was injected with 2.5-10 ng of mRNA encoding the human a7-nAChR gene. After injection, the oocytes were kept for 2-3 days at 19 ° C and then up to 7 days at 15 ° C in ND-96 medium supplemented with 50 mg / ml gentamicin. The ND-96 medium contained (in mM): 96 NaCl, 2 KCl, 1.8 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES, pH 7.4.

Измерения с двухэлектродной фиксацией потенциала проводили, используя усилитель GeneClamp500 (Axon Instruments, Великобритания) с удерживающим потенциалом - 50 мВ как описано в [Osmakov D.I., Koshelev S.G., Andreev Y.A., Dubinnyi M.A., Kublistki V.S., Efremov R.G., Sobolevsky A.I. and Kozlov S.A. (2018), Br. J. Pharmacol. 175:924-937]. Микроэлектроды заполняли 3 M KCl. В качестве внешнего раствора использовали среду ND-96. Токи через a7-нАХР вызывали 200 мс импульсами 100 мкМ ацетилхолина. Кривые доза-ответ для ингибирования a7-нАХР записывали, используя концентрации ws-Lynx1 и cLy15 в диапазоне 0 - 100 мкМ. В каждом эксперименте было использовано по три ооцита (n = 3). Анализ полученных кривых доза-ответ (Фиг. 3) показал, что концентрации полумаксимального ингибирования IC50 для ws-Lynx1 и cLy15 составляют 49 и 25 мкМ, соответственно. Это свидетельствует о способности изучаемых пептидов взаимодействовать с a7-нАХР.Measurements with two-electrode clamping were performed using a GeneClamp500 amplifier (Axon Instruments, UK) with a holding potential of 50 mV as described in [Osmakov D.I., Koshelev S.G., Andreev Y.A., Dubinnyi M.A., Kublistki V.S., Efremov R.G., Sobolevsky A.I. and Kozlov S.A. (2018), Br. J. Pharmacol. 175: 924-937]. The microelectrodes were filled with 3 M KCl. ND-96 medium was used as an external solution. The currents through a7-nAChR were induced by 200 ms pulses of 100 μM acetylcholine. Dose-response curves for inhibition of a7-nAChR were recorded using ws-Lynx1 and cLy15 concentrations in the 0-100 μM range. In each experiment, three oocytes were used (n = 3). Analysis of the obtained dose-response curves (Fig. 3) showed that the concentrations of the half-maximal inhibition IC50 for ws-Lynx1 and cLy15 are 49 and 25 μM, respectively. This indicates the ability of the studied peptides to interact with a7-nAChR.

Пример 3. Изучение проникновения циклических пептидов cLy15 и cLy21, а также ws-Lynx1, через гематоэнцефалический барьер при интраназальном введении.Example 3. Study of the penetration of cyclic peptides cLy15 and cLy21, as well as ws-Lynx1, through the blood-brain barrier after intranasal administration.

Препараты cLy15, cLy21 и ws-Lynx1 метили флуоресцентной меткой CF647 (Sigma-Aldrich) в соответствии с рекомендациями производителя метки. Очистку полученных флуоресцентных препаратов осуществляли методом ВЖЭХ на колонке Jupiter C4, А300, 4,6'250 мм (Phenomenex, США) в линейном градиенте концентрации ацетонитрила от 10% до 70% за 50 мин в присутствии 0,1%-ной TFA, скорость элюции - 1 мл/мин.The cLy15, cLy21, and ws-Lynx1 preparations were labeled with a CF647 fluorescent label (Sigma-Aldrich) according to the label manufacturer's recommendations. The obtained fluorescent preparations were purified by HPLC on a Jupiter C4, A300, 4.6'250 mm column (Phenomenex, United States) in a linear gradient of acetonitrile concentration from 10% to 70% in 50 min in the presence of 0.1% TFA, the rate elution - 1 ml / min.

Для эксперимента использовали мышей линии C57BL/6 (самцы, возраст 7 месяцев, вес ~ 30 гр). Двадцать животных случайным образом разделяли на четыре группы по пять животных в каждой (n = 5). Мыши из первой группы (контроль) получали по 3 мкл деионизированной воды интраназально; мыши из второй группы получали по 50 мкг CF647-ws-Lynx1, растворенного в 3 мкл деионизированной воды, интраназально; мыши из третьей группы получали по 10 мкг CF647-cLy15, растворённого в 3 мкл деионизированной воды, интраназально; мыши из четвёртой группы получали по 14 мкг CF647-cLy21, растворённого в 3 мкл деионизированной воды, интраназально.For the experiment, we used mice of the C57BL / 6 line (males, age 7 months, weight ~ 30 g). Twenty animals were randomly divided into four groups of five animals each (n = 5). Mice from the first group (control) received 3 μl of deionized water intranasally; mice from the second group received 50 μg of CF647-ws-Lynx1, dissolved in 3 μl of deionized water, intranasally; mice from the third group received 10 μg of CF647-cLy15, dissolved in 3 μl of deionized water, intranasally; mice from the fourth group received 14 μg of CF647-cLy21, dissolved in 3 μl of deionized water, intranasally.

Через 40-60 минут после введения препаратов животных анестезировали изофлураном и перфузировали транскардиально фосфатно-солевым буфером (PBS) в течение 15 мин, а затем 4% параформальдегидом (PFA) в течение 15 минут. После этого извлекали мозг животного и фиксировали в 4% PFA в течение 48 часов, а затем помещали в 30% раствор сахарозы на 72 часа. Корональные срезы целого мозга получали на ротационном микротоме Microm HM-360 (Thermo Scientific) и хранили в растворе PBS при +4°C. Срезы анализировали на конфокальном микроскопе Nikon Eclipse T2000E (x10 сухой объектив) (Фиг. 4А). Количественное измерение флуоресценции в отдельных областях мозга выполняли с помощью программы ImageJ (NIH, США). Полученные значения без дополнительной нормировки сравнивали с контрольными, используя однофакторный дисперсионный анализ (one-way ANOVA) и апостериорный критерий Даннетта. Согласно полученным данным (Фиг. 4Б) при интраназальном введении препаратов CF647-ws-Lynx1, CF647-cLy15, и CF647-cLy21 модельным животным наблюдалось статистически значимое повышение уровня флуоресценции на срезах мозга. Это свидетельствует об успешном прохождении препаратов через гематоэнцефалический барьер.40-60 minutes after drug administration, the animals were anesthetized with isoflurane and perfused transcardially with phosphate buffered saline (PBS) for 15 minutes, and then with 4% paraformaldehyde (PFA) for 15 minutes. After that, the brain of the animal was removed and fixed in 4% PFA for 48 hours, and then placed in a 30% sucrose solution for 72 hours. Whole brain coronal sections were obtained on a Microm HM-360 rotary microtome (Thermo Scientific) and stored in PBS solution at + 4 ° C. Sections were analyzed on a Nikon Eclipse T2000E confocal microscope (x10 dry objective) (Fig. 4A). Quantitative measurement of fluorescence in certain areas of the brain was performed using the ImageJ software (NIH, USA). The obtained values without additional normalization were compared with the control values using one-way analysis of variance (one-way ANOVA) and Dunnett's post hoc test. According to the data obtained (Fig. 4B), intranasal administration of CF647-ws-Lynx1, CF647-cLy15, and CF647-cLy21 to model animals showed a statistically significant increase in the level of fluorescence in brain slices. This indicates the successful passage of drugs through the blood-brain barrier.

Пример 4. Изучение влияния циклического пептида cLy15 и ws-Lynx1, на уровень тревожности и моторную память у модельных животных.Example 4. Study of the effect of cyclic peptide cLy15 and ws-Lynx1 on the level of anxiety and motor memory in model animals.

Тридцать шесть мышей линии C57BL/6 (самцы, возраст 7 месяцев, вес ~ 30 гр) случайным образом разделяли на три группы по 12 мышей в каждой (n = 12). Мыши из каждой группы в течение 11 дней каждый день получали интраназально различные вещества, растворенные в 3 мкл деионизированной воды. Мыши из первой группы (контроль) получали чистую воду. Мыши из второй и третьей групп получали по 50 мкг ws-Lynx1 (примерно 1,5 мг/кг) или по 10 мкг cLy15, соответственно.Thirty-six C57BL / 6 mice (male, 7 months old, weight ~ 30 g) were randomly divided into three groups of 12 mice each (n = 12). Mice from each group received various substances intranasally dissolved in 3 μl of deionized water every day for 11 days. Mice from the first group (control) received pure water. Mice from the second and third groups received 50 μg of ws-Lynx1 (approximately 1.5 mg / kg) or 10 μg of cLy15, respectively.

Помимо ежедневных манипуляций, мышей приучали к контакту с руками экспериментатора в течение 10 дней. На 11 день через 60 минут после введения препаратов проводили поведенческий тест «Открытое поле». Тестирование проводили на открытой площадке в приборе Multiconditioning (TSE, Германия). Животное помещали на открытую ярко освещенную площадку и регистрировали его активность на протяжении 5 минут. Параметры двигательной активности, такие как пройденное расстояние, время, проведенное в центре площадки, время перемещения, количество вертикальных стоек и т.п., регистрировались автоматически при помощи программного обеспечение TSE.In addition to daily manipulations, the mice were accustomed to contact with the experimenter's hands for 10 days. On the 11th day, 60 minutes after the administration of the drugs, the behavioral test "Open Field" was performed. Testing was carried out in an open area in a Multiconditioning device (TSE, Germany). The animal was placed on an open, brightly lit area and its activity was recorded for 5 minutes. Movement parameters, such as distance traveled, time spent in the center of the site, travel time, number of uprights, etc., were recorded automatically using TSE software.

Для оценки уровня тревожности анализировали число визитов животного в центральную область площадки. Чем выше это значение, тем меньше уровень тревожности. Полученные значения сравнивали с контрольными, используя однофакторный дисперсионный анализ (one-way ANOVA) и апостериорный критерий Даннетта. Согласно полученным данным (Фиг. 5) при интраназальном введении препаратов ws-Lynx1 и cLy15 модельным животным наблюдалось уменьшение уровня тревожности, которое для препарата cLy15 было статистически значимо (p < 0.05).To assess the level of anxiety, the number of animal visits to the central area of the site was analyzed. The higher this value, the lower the level of anxiety. The obtained values were compared with the control values using one-way ANOVA and Dunnett's post hoc test. According to the data obtained (Fig. 5), after intranasal administration of the ws-Lynx1 and cLy15 preparations to model animals, a decrease in the level of anxiety was observed, which was statistically significant for the cLy15 preparation (p <0.05).

Для исследования моторной координации и баланса проводили поведенческий тест «Вращающийся стержень - ротарод» в приборе RotaRod (Columbus Instruments, США). Принцип теста заключается в том, что животное удерживает равновесие на пластиковом вращающемся стержне. Животное помещают на стержень, вращающийся с постоянной скоростью 5 вращений в минуту, включают ускорение 0,6 вращений в минуту и регистрируют время падения животного со стержня. Чем дольше животное способно удерживаться на стержне, тем лучше его координация. Для исследования формирования моторной памяти и обучения тест повторяли в течение 5 дней. Наблюдаемое увеличение времени удержания животного на стержне (Фиг. 6) свидетельствовало о формировании у животных моторной памяти. Результаты теста показали, что у животных, получавших cLy15 и ws-Lynx1, моторная память формируется лучше, чем у контрольных животных, получавших воду. Отличия между группами по сравнению с контролем постепенно нарастали и становились статистически значимыми на третий день. Отличия сохранялись вплоть до пятого дня измерений (Фиг. 6)To study motor coordination and balance, the behavioral test "Rotating rod - rotarod" was carried out in a RotaRod device (Columbus Instruments, USA). The principle of the test is that the animal maintains its balance on a plastic rotating rod. The animal is placed on a rod rotating at a constant speed of 5 rotations per minute, acceleration of 0.6 rotations per minute is turned on, and the time the animal falls from the rod is recorded. The longer the animal is able to stay on the rod, the better its coordination. To study the formation of motor memory and learning, the test was repeated for 5 days. The observed increase in the retention time of the animal on the rod (Fig. 6) indicated the formation of motor memory in the animals. The test results showed that animals treated with cLy15 and ws-Lynx1 developed motor memory better than control animals that received water. The differences between the groups in comparison with the control gradually increased and became statistically significant on the third day. The differences persisted until the fifth day of measurements (Fig. 6)

Пример 5. Изучение влияния препаратов циклических пептидов cLy15 и cLy21, а также ws-Lynx1 на формирование обонятельной памяти и условного рефлекса пассивного избегания у животных, моделирующих болезнь Альцгеймера.Example 5. Study of the influence of preparations of cyclic peptides cLy15 and cLy21, as well as ws-Lynx1 on the formation of olfactory memory and conditioned passive avoidance reflex in animals simulating Alzheimer's disease.

В качестве модели болезни Альцгеймера использовали 51 взрослого самца мышей линии B6C3-Tg (APP695) 85Dbo Tg (PSEN1) 85Dbo, экспрессирующих химерный белок-предшественник амилоида и мутант пресенилина-1 человека (2xTg-AD), а также 10 нетрансгенных однопометных самцов линии B6C3 (Tg-) (8 месяцев, вес 30-35 г). Обе мутации APP/PS1 связаны с ранним началом болезни Альцгеймера.51 adult male B6C3-Tg (APP695) 85Dbo Tg (PSEN1) 85Dbo mice expressing a chimeric amyloid precursor protein and a human presenilin-1 mutant (2xTg-AD), as well as 10 non-transgenic littermates of the B6C3 line (Tg-) (8 months, weight 30-35 g). Both APP / PS1 mutations are associated with early-onset Alzheimer's disease.

Мышей линии 2xTg-AD случайным образом разделяли на четыре группы, содержащих 12 - 14 мышей в каждой (n = 12-14). Мыши из каждой группы в течение 11 дней каждый день получали интраназально различные вещества, растворённые в 3 мкл деионизированной воды. Мыши из первой группы (отрицательный контроль) получали чистую воду. Мыши из второй, третьей и четвертой групп получали по 50 мкг ws-Lynx1 (примерно 1,5 мг/кг), по 10 мкг cLy15, или по 14 мкг cLy21, соответственно. В качестве положительного контроля использовали группу Tg- мышей (n = 10), которые получали по 3 мкл деионизированной воды интраназально в течение 13 дней.The 2xTg-AD mice were randomly divided into four groups, each containing 12-14 mice (n = 12-14). Mice from each group received various substances intranasally dissolved in 3 μl of deionized water every day for 11 days. Mice from the first group (negative control) received pure water. Mice from the second, third and fourth groups received 50 μg ws-Lynx1 (approximately 1.5 mg / kg), 10 μg cLy15, or 14 μg cLy21, respectively. As a positive control, a group of Tg mice (n = 10) were used, which received 3 μl of deionized water intranasally for 13 days.

Формирование обонятельной памяти исследовали по способности запоминать ольфакторный стимул и реагировать сниженным интересом на повторное предъявление той же ольфакторной метки на следующий день. Тестирование выполняли в клетке, на одну из стенок которой приклеивали квадрат из фильтровальной бумаги размером примерно 1 см2. Животное помещали в клетку на 10 минут для адаптации. Затем наносили мочу незнакомого самца на фильтровальную бумагу и оставляли животное в клетке еще на 2 минуты. Поведение животного регистрировали на видео, которое впоследствии анализировали, регистрируя количество подходов к ольфакторной метке и время пребывания у ольфакторной метки. Интерес к ольфакторной метке определяли в области 5х5 см около ольфакторной метки.The formation of olfactory memory was investigated according to the ability to memorize an olfactory stimulus and to respond with a reduced interest to the repeated presentation of the same olfactory label the next day. The testing was carried out in a cage, on one of the walls of which a square of filter paper of approximately 1 cm2 was glued. The animal was placed in a cage for 10 minutes for adaptation. Then, the urine of an unfamiliar male was applied to filter paper and the animal was left in the cage for another 2 minutes. The behavior of the animal was recorded on video, which was subsequently analyzed by recording the number of approaches to the olfactory tag and the residence time at the olfactory tag. Interest in the olfactory label was determined in the area 5x5 cm near the olfactory label.

Для оценки формирования обонятельной памяти время интереса к ольфакторной метке во второй день, нормализовали на время в первый день (Фиг. 7). Контрольные нетрансгенные животные на второй день в среднем тратили значительно меньше времени на обнюхивание знакомой метки (время обнюхивания на второй день 69% от первого дня). Трансгенные животные не проявляли признаков формирования обонятельной памяти (время обнюхивания на второй день 110% от первого дня). Группы трансгенных животных, получавшие ws-Lynx1, cLy15 и cLy21, тратили меньше времени на обнюхивание знакомого запаха (65%, 79% и 107% от первого дня). Полученные данные (Фиг. 7) свидетельствуют о восстановлении обонятельной памяти у животных, получавших cLy15 и ws-Lynx1. При интраназальном введении препарата ws-Lynx1 уменьшение времени обнюхивания метки было статистически значимо (p < 0.05)To assess the formation of olfactory memory, the time of interest in the olfactory label on the second day was normalized to the time on the first day (Fig. 7). On the second day, the control nontransgenic animals spent on average much less time sniffing the familiar mark (sniffing time on the second day was 69% of the first day). Transgenic animals showed no signs of olfactory memory formation (sniffing time on the second day was 110% of the first day). Groups of transgenic animals treated with ws-Lynx1, cLy15 and cLy21 spent less time sniffing the familiar scent (65%, 79% and 107% of the first day). The data obtained (Fig. 7) indicate the restoration of olfactory memory in animals treated with cLy15 and ws-Lynx1. Intranasal administration of ws-Lynx1 resulted in statistically significant decrease in tag sniffing time (p <0.05)

Исследование формирования условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) проводили с помощью прибора Multiconditioning (TSE, Германия). Тестирование проводили в двухкамерной коробке прибора, содержащей черную и белую камеры. На первом этапе животные знакомились с черно-белой камерой. На втором этапе проводилось обучение. На дне темной камеры размещали металлическую решетку, подключенную к электричеству. Животное помещали в светлую ярко освещенную камеру при закрытой дверце между камерами. Через 45 секунд дверца автоматически открывалась, после чего в течение 5 минут животное имело возможность зайти в черную камеру. После захода животного в черную камеру, дверца автоматически закрывалась. Спустя 15 секунд после закрытия дверцы в черной камере, на решетку подавался электростимул 0,6 mV, длительностью 3 секунды. Через 15 секунд животное извлекали из черной камеры. На следующий день после обучения проводили третий этап - тестирование. Животное снова помещали в светлую камеру с закрытой дверцей. Через 45 секунд дверца автоматически открывалась, после чего на протяжении 5 минут животное имело возможность свободно перемещаться между камерами. Регистрировали количество заходов животного в черную камеру.The formation of a conditioned passive avoidance reflex (CPAR) was studied using a Multiconditioning device (TSE, Germany). Testing was carried out in a two-chamber instrument box containing a black and a white chamber. At the first stage, the animals got acquainted with the black and white camera. At the second stage, training was carried out. A metal grid connected to electricity was placed at the bottom of the dark chamber. The animal was placed in a light, brightly lit chamber with the door closed between the chambers. After 45 seconds, the door automatically opened, after which, within 5 minutes, the animal had the opportunity to enter the black chamber. After the animal entered the black chamber, the door closed automatically. 15 seconds after the door in the black chamber was closed, an electrical stimulus of 0.6 mV was applied to the grating, lasting 3 seconds. After 15 seconds, the animal was removed from the black chamber. The next day after training, the third stage was carried out - testing. The animal was again placed in a light chamber with a closed door. After 45 seconds, the door opened automatically, after which, for 5 minutes, the animal was able to move freely between the chambers. The number of times the animal entered the black chamber was recorded.

Согласно полученным данным (Фиг. 8), контрольные животные, как моделирующие болезнь Альцгеймера (Tg+), так и нетрансгенные однопометники (Tg-) демонстрировали низкую обучаемость. Только у 20-30% животных из этих групп сформировался УРПИ. В то же время интраназальное введение препаратов ws-Lynx1, cLy15, и cLy21 приводило к значительному увеличению обучаемости. У 50-60% животных из этих групп сформировался УРПИ.According to the data obtained (Fig. 8), control animals, both simulating Alzheimer's disease (Tg +) and non-transgenic littermates (Tg-), showed low learning ability. Only 20-30% of animals from these groups developed passive avoidance reaction. At the same time, intranasal administration of drugs ws-Lynx1, cLy15, and cLy21 led to a significant increase in learning. In 50-60% of animals from these groups, passive avoidance reaction was formed.

Хотя настоящее изобретение было подробно описано со ссылкой на предпочтительные варианты его осуществления, для специалиста в данной области техники ясно, что могут быть сделаны различные замены и использованы различные эквиваленты, которые не выходят за рамки настоящего изобретения. Все процитированные в настоящем описании документы являются частью настоящей заявки, включённые в неё посредством ссылки.Although the present invention has been described in detail with reference to preferred embodiments thereof, it will be clear to one skilled in the art that various substitutions and various equivalents can be used without departing from the scope of the present invention. All documents cited in this description are part of this application, incorporated by reference.

--->--->

Перечень последовательностей, представленных в описании изобретенияList of sequences presented in the description of the invention

<110> Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и <110> Institute of Bioorganic Chemistry named after M.M. Shemyakin and

Ю.А.Овчинникова Yu.A. Ovchinnikova

<120> ПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ АКТИВНОСТЬЮ БЕЛКА LYNX1, (ВАРИАНТЫ), <120> PEPTIDE WITH PROTEIN LYNX1 ACTIVITY, (VERSIONS),

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ТРЕВОЖНЫХ РАССТРОЙСТВ И PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATMENT OF ANXIETY DISORDERS AND

ДЕПРЕССИИ ИЛИ КОРРЕКЦИИ КОГНИТИВНЫХ НАРУШЕНИЙ ПРИ DEPRESSION OR CORRECTION OF COGNITIVE DISORDERS IN

НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ, СОДЕРЖАЩАЯ УКАЗАННЫЙ ПЕПТИД, И NEURODEGENERATIVE DISEASES CONTAINING THE SPECIFIED PEPTIDE, AND

СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ И КОРРЕКЦИИ УКАЗАННЫХ НАРУШЕНИЙ METHOD FOR TREATMENT AND CORRECTION OF THE INDICATED DISORDERS

<130> ws-Lynx1 peptides<130> ws-Lynx1 peptides

<160> 6 <160> 6

<170> PatentIn version 3.5<170> PatentIn version 3.5

<210> 1<210> 1

<211> 21<211> 21

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Synthetic peptide<223> Synthetic peptide

<220><220>

<221> DISULFID<221> DISULFID

<222> (2)..(20)<222> (2) .. (20)

<220><220>

<221> MOD_RES<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)<222> (1) .. (1)

<223> Gly or Val or Met or Nle <223> Gly or Val or Met or Nle

<220><220>

<221> MOD_RES<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)<222> (3) .. (3)

<223> Nle or Ile or Leu or Met or deletion<223> Nle or Ile or Leu or Met or deletion

<220><220>

<221> MOD_RES<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)<222> (4) .. (4)

<223> Thr or Ser or Ala or deletion<223> Thr or Ser or Ala or deletion

<220><220>

<221> MOD_RES<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)<222> (5) .. (5)

<223> Thr or Ser or Ala or deletion<223> Thr or Ser or Ala or deletion

<220><220>

<221> MOD_RES<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)<222> (6) .. (6)

<223> Arg or Gln or Lys <223> Arg or Gln or Lys

<220><220>

<221> MOD_RES<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)<222> (7) .. (7)

<223> Thr or Ser or Ala<223> Thr or Ser or Ala

<220><220>

<221> MOD_RES<221> MOD_RES

<222> (8)..(8)<222> (8) .. (8)

<223> Tyr or Phe or Trp<223> Tyr or Phe or Trp

<220><220>

<221> MOD_RES<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)<222> (9) .. (9)

<223> Tyr or Phe or Trp<223> Tyr or Phe or Trp

<220><220>

<221> MOD_RES<221> MOD_RES

<222> (10)..(10)<222> (10) .. (10)

<223> Thr or Ser or Ala<223> Thr or Ser or Ala

<220><220>

<221> MOD_RES<221> MOD_RES

<222> (11)..(11)<222> (11) .. (11)

<223> Pro or Gly or Ala<223> Pro or Gly or Ala

<220><220>

<221> MOD_RES<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)<222> (12) .. (12)

<223> Thr or Ser or Ala<223> Thr or Ser or Ala

<220><220>

<221> MOD_RES<221> MOD_RES

<222> (13)..(13)<222> (13) .. (13)

<223> Arg or Gln or Lys<223> Arg or Gln or Lys

<220><220>

<221> MOD_RES<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)<222> (14) .. (14)

<223> Nle or Ile or Leu or Met<223> Nle or Ile or Leu or Met

<220><220>

<221> MOD_RES<221> MOD_RES

<222> (15)..(15)<222> (15) .. (15)

<223> Lys or Asn or Gln or Arg<223> Lys or Asn or Gln or Arg

<220><220>

<221> MOD_RES<221> MOD_RES

<222> (16)..(16)<222> (16) .. (16)

<223> Val or Ile or Leu <223> Val or Ile or Leu

<220><220>

<221> MOD_RES<221> MOD_RES

<222> (17)..(17)<222> (17) .. (17)

<223> Ser or Thr or Ala or deletion<223> Ser or Thr or Ala or deletion

<220><220>

<221> MOD_RES<221> MOD_RES

<222> (18)..(18)<222> (18) .. (18)

<223> Lys or Asn or Gln or Arg or deletion<223> Lys or Asn or Gln or Arg or deletion

<220><220>

<221> MOD_RES<221> MOD_RES

<222> (19)..(19)<222> (19) .. (19)

<223> Ser or Thr or Ala or deletion<223> Ser or Thr or Ala or deletion

<400> 1<400> 1

Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10 15 1 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Cys Gly Xaa Xaa Xaa Cys Gly

20 20

<210> 2<210> 2

<211> 21<211> 21

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Synthetic peptide<223> Synthetic peptide

<220><220>

<221> DISULFID<221> DISULFID

<222> (2)..(20)<222> (2) .. (20)

<220><220>

<221> MOD_RES<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)<222> (3) .. (3)

<223> Nle<223> Nle

<220><220>

<221> MOD_RES<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)<222> (14) .. (14)

<223> Nle<223> Nle

<400> 2<400> 2

Gly Cys Xaa Thr Thr Arg Thr Tyr Tyr Thr Pro Thr Arg Xaa Lys Val Gly Cys Xaa Thr Thr Arg Thr Tyr Tyr Thr Pro Thr Arg Xaa Lys Val

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Lys Ser Cys Gly Ser Lys Ser Cys Gly

20 20

<210> 3<210> 3

<211> 19<211> 19

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Synthetic peptide<223> Synthetic peptide

<220><220>

<221> DISULFID<221> DISULFID

<222> (2)..(18)<222> (2) .. (18)

<220><220>

<221> MOD_RES<221> MOD_RES

<222> (13)..(13)<222> (13) .. (13)

<223> Nle<223> Nle

<400> 3<400> 3

Gly Cys Thr Thr Arg Thr Tyr Tyr Thr Pro Thr Arg Xaa Lys Val Ser Gly Cys Thr Thr Arg Thr Tyr Tyr Thr Pro Thr Arg Xaa Lys Val Ser

1 5 10 15 1 5 10 15

Lys Cys Gly Lys Cys Gly

<210> 4<210> 4

<211> 17<211> 17

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Synthetic peptide<223> Synthetic peptide

<220><220>

<221> MOD_RES<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)<222> (12) .. (12)

<223> Nle<223> Nle

<400> 4<400> 4

Gly Cys Thr Arg Thr Tyr Tyr Thr Pro Thr Arg Xaa Lys Val Ser Cys Gly Cys Thr Arg Thr Tyr Tyr Thr Pro Thr Arg Xaa Lys Val Ser Cys

1 5 10 15 1 5 10 15

Gly Gly

<210> 5<210> 5

<211> 15<211> 15

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Synthetic peptide<223> Synthetic peptide

<220><220>

<221> DISULFID<221> DISULFID

<222> (2)..(14)<222> (2) .. (14)

<220><220>

<221> MOD_RES<221> MOD_RES

<222> (11)..(11)<222> (11) .. (11)

<223> Nle<223> Nle

<400> 5<400> 5

Gly Cys Arg Thr Tyr Tyr Thr Pro Thr Arg Xaa Lys Val Cys Gly Gly Cys Arg Thr Tyr Tyr Thr Pro Thr Arg Xaa Lys Val Cys Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

<---<---

Claims (10)

1. Пептид, обладающий активностью белка Lynx1 и имеющий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, где карбоксильная группа последней аминокислоты необязательно модифицирована и указанная модификация представляет собой С-концевой амид, и первая аминокислота указанного пептида необязательно дополнительно содержит защитную группу, выбранную из ацетильной группы, формильной группы, остатка пироглутаминовой кислоты или карбоновой кислоты алифатического или ароматического ряда.1. Peptide having Lynx1 protein activity and having the amino acid sequence SEQ ID NO: 1, where the carboxyl group of the last amino acid is optionally modified and said modification is a C-terminal amide, and the first amino acid of said peptide optionally further contains a protecting group selected from an acetyl group , a formyl group, a pyroglutamic acid residue or a carboxylic acid of an aliphatic or aromatic series. 2. Пептид по п. 1, отличающийся тем, что указанный пептид выбран из пептидов, имеющих последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2-4 или 5.2. The peptide of claim 1, wherein said peptide is selected from peptides having the amino acid sequence SEQ ID NO: 2-4 or 5. 3. Фармацевтическая композиция для лечения тревожных расстройств, депрессии и коррекции когнитивных нарушений при нейродегенеративных заболеваниях, содержащая эффективное количество пептида по п. 1 или 2 и фармацевтически приемлемый носитель.3. A pharmaceutical composition for the treatment of anxiety disorders, depression and the correction of cognitive impairments in neurodegenerative diseases, comprising an effective amount of a peptide according to claim 1 or 2 and a pharmaceutically acceptable carrier. 4. Фармацевтическая композиция по п. 3, где указанный пептид выбран из пептидов, имеющих последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2-4 или 5.4. The pharmaceutical composition of claim 3, wherein said peptide is selected from peptides having the amino acid sequence SEQ ID NO: 2-4 or 5. 5. Фармацевтическая композиция по п. 3 или 4 для интраназального, внутривенного, перорального или сублингвального введения.5. A pharmaceutical composition according to claim 3 or 4 for intranasal, intravenous, oral or sublingual administration. 6. Способ лечения тревожных расстройств, депрессии и коррекции когнитивных нарушений при нейродегенеративных заболеваниях, включающий введение субъекту, имеющему когнитивные нарушения при нейродегенеративных заболеваниях, эффективного количества пептида по п. 1.6. A method of treating anxiety disorders, depression and correction of cognitive impairments in neurodegenerative diseases, comprising administering to a subject having cognitive impairments in neurodegenerative diseases an effective amount of the peptide according to claim 1. 7. Способ по п. 6, где указанный пептид выбран из пептидов, имеющих последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2-4 или 5.7. The method according to claim 6, wherein said peptide is selected from peptides having the amino acid sequence SEQ ID NO: 2-4 or 5. 8. Способ по п. 6 или 7, отличающийся тем, что указанный пептид вводят в составе фармацевтической композиции по пп. 3-5.8. The method according to claim 6 or 7, characterized in that said peptide is administered in the pharmaceutical composition according to claims. 3-5. 9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что указанную композицию вводят интраназально, внутривенно, перорально или сублингвально.9. A method according to claim 8, wherein said composition is administered intranasally, intravenously, orally or sublingually. 10. Способ по п. 6, отличающийся тем, что нейродегенеративные заболевания выбраны из группы, включающей болезнь Альцгеймера, кортикобазальную дегенерацию, болезнь Пика, болезнь Паркинсона, деменцию с тельцами Леви, мультисистемную атрофию.10. The method according to claim 6, characterized in that the neurodegenerative diseases are selected from the group consisting of Alzheimer's disease, corticobasal degeneration, Pick's disease, Parkinson's disease, Lewy body dementia, multisystem atrophy.

Images