RU2733948C2 - Composition for treating gynaecological and proctologic diseases accompanied by oxidative stress - Google Patents

Abstract

FIELD: chemistry.

SUBSTANCE: invention relates to chemical enzymology and chemical-pharmaceutical industry and is intended for treating gynaecological and proctologic diseases accompanied by oxidative stress. Composition for treating gynaecological and proctologic diseases accompanied by oxidative stress consists of an antioxidant active substance and a base. As an active substance, it contains particles obtained by mixing buffer solutions of the antioxidant enzyme superoxide dismutase in concentration of 2.5–10.0 mg/ml and polycation in concentration of 2.5–10.0 mg/ml, stirring and holding mixture, followed by addition of buffer solution of polyanion in concentration of 2.5–10.0 mg/ml, mixing and holding the obtained mixture, adding an aqueous solution of glutaric aldehyde, taken in an amount which provides a molar ratio with the amino groups of polycation of 0.3–1.5, holding the mixture, adding aqueous solution of sodium borohydride in concentration 1–2 mg/ml, cleaning mixture using membrane filtration system with transmission limit of 90–130 kilodalton, lyophilic drying of purified mixture and mixing lyophilizate with base. Polycation is selected from a group comprising protamine, polylysine and polyarginine. Polyanion is a block copolymer of polyglutamic acid and polyethylene glycol or a block copolymer of polyaspartic acid and polyethylene glycol. Components are used in claimed amounts.

EFFECT: use of the invention enables higher clinical effectiveness in inflammatory diseases and increases the duration of active substance release from composition from 12 to 18 hours.

1 cl, 8 ex

Description

Изобретение относится к области химической энзимологии и химико-фармацевтической промышленности и касается композиции, которая может быть использована при лечении гинекологических и проктологических заболеваний, сопровождающихся окислительным стрессом. Данная композиция в качестве действующего вещества содержит антиоксидантный фермент супероксиддисмутазу (СОД), покрытую внутренней оболочкой из поликатиона и внешней оболочкой из полианиона.The invention relates to the field of chemical enzymology and the chemical-pharmaceutical industry and relates to a composition that can be used in the treatment of gynecological and proctological diseases accompanied by oxidative stress. This composition as an active substance contains the antioxidant enzyme superoxide dismutase (SOD), coated with an inner shell of a polycation and an outer shell of a polyanion.

Известна композиция с антиоксидантными свойствами, которая может быть использована для лечения различных воспалительных, в том числе гинекологических и проктологических заболеваний млекопитающих, в т.ч. человека, сопровождающихся окислительным стрессом, состоящая из фармацевтически приемлемой добавки и действующего вещества - смеси антиоксидантного фермента пероксиредоксина и активатора дигидролипоевой кислоты (патент RU 2280448 С2, А61К 31/38 (2006.01), 2002, см. описание).Known composition with antioxidant properties, which can be used to treat various inflammatory, including gynecological and proctological diseases of mammals, incl. human, accompanied by oxidative stress, consisting of a pharmaceutically acceptable additive and an active substance - a mixture of the antioxidant enzyme peroxiredoxin and an activator of dihydrolipoic acid (patent RU 2280448 C2, A61K 31/38 (2006.01), 2002, see description).

Данная композиция содержит признаки, совпадающие с существенными признаками предлагаемого технического решения, такие как наличие в ее составе антиоксидантного фермента и использование в композиции лиофилизованной формы действующего вещества.This composition contains features that coincide with the essential features of the proposed technical solution, such as the presence of an antioxidant enzyme in its composition and the use of a lyophilized form of the active substance in the composition.

Известна композиция для лечения воспалительных заболеваний, пригодная для изготовления суппозиториев и состоящая из противовоспалительного действующего вещества - индометацина и основы (патент RU 2226091С1, А61К 31/38 (2006.01), 2002, см. описание).A known composition for the treatment of inflammatory diseases, suitable for the manufacture of suppositories and consisting of an anti-inflammatory active substance - indomethacin and a base (patent RU 2226091C1, A61K 31/38 (2006.01), 2002, see description).

Данная композиция содержит признак, совпадающий с существенными признаками предлагаемого технического решения, такой как наличие в ее составе противовоспалительного действующего вещества.This composition contains a feature that coincides with the essential features of the proposed technical solution, such as the presence in its composition of an anti-inflammatory active substance.

Наиболее близким к заявляемому является известная композиция для лечения гинекологических и проктологических заболеваний, сопровождающихся окислительным стрессом, состоящая из антиоксидантного действующего вещества 2-этил-6-метил-3-оксипиридина сукцинат (ЭМОС) и основы, выбранной из группы, включающей полиэтиленоксид 1500, полиэтиленоксид 400, масло какао и гидрогенизированные жиры, при следующем соотношении компонентов на одну свечу, г:Closest to the claimed composition is a known composition for the treatment of gynecological and proctological diseases accompanied by oxidative stress, consisting of the antioxidant active ingredient 2-ethyl-6-methyl-3-hydroxypyridine succinate (EMOS) and a base selected from the group consisting of polyethylene oxide 1500, polyethylene oxide 400, cocoa butter and hydrogenated fats, with the following ratio of components per candle, g:

ЭМОСEMOS 0,1-1,00.1-1.0 ОсноваThe basis 1,0-6,01.0-6.0

(Патент RU 2293558 С2, А61К 31/4425 (2006.01), 2005 - прототип, см. описание). Массовый состав известной композиции будет иметь следующий состав, мас. %:(Patent RU 2293558 C2, A61K 31/4425 (2006.01), 2005 - prototype, see description). The mass composition of the known composition will have the following composition, wt. %:

ЭМОСEMOS 1,6-501.6-50 ОсноваThe basis остальноеrest

Данная композиция содержит признак, совпадающий с существенным признаком предлагаемого технического решения, такой как наличие в ее составе антиоксидантного действующего вещества.This composition contains a feature that coincides with an essential feature of the proposed technical solution, such as the presence of an antioxidant active substance in its composition.

Композиция, используемая для лечения воспалительных заболеваний, сопровождающихся (обусловленных) окислительным стрессом, должна обладать относительно высокой антиоксидантной активностью у действующего вещества и обеспечивать пролонгированный выход действующего вещества в слизистую оболочку и мягкие ткани. Однако, проведенный контрольный опыт (пример 8) показал, что антиоксидантная активность ЭМОС относительно невелика и в прототипе указано, что пролонгированный выход действующего вещества (препарата) наблюдается в течение около 12 ч.The composition used for the treatment of inflammatory diseases accompanied (caused by) oxidative stress should have a relatively high antioxidant activity in the active substance and provide a prolonged release of the active substance into the mucous membrane and soft tissues. However, the conducted control experiment (example 8) showed that the antioxidant activity of EMOS is relatively low, and the prototype indicates that a prolonged release of the active substance (drug) is observed for about 12 hours.

Техническая проблема изобретения заключается в создании композиции для лечения гинекологических и проктологических заболеваний, лишенной вышеуказанных недостатков.The technical problem of the invention is to create a composition for the treatment of gynecological and proctological diseases, devoid of the above disadvantages.

Технический результат изобретения состоит в повышении эффективности композиции при лечении заболеваний и увеличении продолжительности выхода действующего вещества из композиции.The technical result of the invention consists in increasing the effectiveness of the composition in the treatment of diseases and increasing the duration of the release of the active substance from the composition.

Предварительно были проведены эксперименты с различными композициями, которые показали, что указанный технический результат достигается в том случае, когда композиция для лечения гинекологических и проктологических заболеваний, сопровождающихся окислительным стрессом, состоящая из антиоксидантного действующего вещества и основы, в качестве действующего вещества она содержит частицы, полученные путем смешения буферных растворов антиоксидантного фермента СОД в концентрации 2,5-10,0 мг/мл и поликатиона в концентрации 2,5-10,0 мг/мл, где поликатион выбирают из группы, включающей протамин, полилизин и полиаргинин, перемешивания и выдерживания смеси с последующими добавлением в нее буферного раствора полианиона в концентрации 2,5-10,0 мг/мл, где полианион представляет собой блок-сополимер (блок-СПЛ) полиглутаминовой кислоты (ПГ) и полиэтиленгликоля (ПЭГ) или блок-СПЛ полиаспарагиновой кислоты (ПА) и ПЭГ, перемешиванием и выдерживанием полученной смеси, добавлением в нее водного раствора глутарового альдегида, взятого в количестве, обеспечивающем его мольное соотношение с аминогруппами поликатиона 0,3-1,5, выдерживанием смеси, добавлением в смесь водного раствора боргидрида натрия в концентрации 1-2 мг/мл, очисткой смеси с использованием мембранной фильтрующей системы с пределом пропускания 90-130 килодальтон (кДа), лиофильной сушкой очищенной смеси и смешением лиофилизата с основой, при следующем соотношении компонентов, мас. %:Previously, experiments were carried out with various compositions, which showed that the specified technical result is achieved in the case when the composition for the treatment of gynecological and proctological diseases accompanied by oxidative stress, consisting of an antioxidant active substance and a base, as an active substance it contains particles obtained by mixing buffer solutions of the antioxidant enzyme SOD at a concentration of 2.5-10.0 mg / ml and a polycation at a concentration of 2.5-10.0 mg / ml, where the polycation is selected from the group consisting of protamine, polylysine and polyarginine, stirring and holding a mixture followed by the addition of a buffer solution of polyanion at a concentration of 2.5-10.0 mg / ml, where the polyanion is a block copolymer (block CPL) of polyglutamic acid (PG) and polyethylene glycol (PEG) or a block CPL of polyaspartic acid (PA) and PEG, stirring and maintaining the resulting mixture, adding an aqueous solution of glut araldehyde, taken in an amount that provides its molar ratio with the amino groups of the polycation 0.3-1.5, maintaining the mixture, adding an aqueous solution of sodium borohydride to the mixture at a concentration of 1-2 mg / ml, purifying the mixture using a membrane filter system with a limit transmission 90-130 kilodaltons (kDa), freeze drying of the purified mixture and mixing the lyophilisate with the base, with the following ratio of components, wt. %:

Действующее веществоActive substance 0,01-20,000.01-20.00 ОсноваThe basis остальноеrest

Предлагаемая композиция является новой и не описана в патентной и научно-технической литературе. Используемые в композиции частицы также является новыми.The proposed composition is new and is not described in the patent and scientific and technical literature. The particles used in the composition are also new.

Известно, что СОД обладает высокой антиоксидантной активностью, однако использование нативного фермента неэффективно с связи с его быстрой инактивацией в организме. При этом введение относительно больших доз нативного белка СОД в композициях нецелесообразно ввиду нежелательного иммунного ответа организма на чужеродный белок. Поэтому из научно-технической литературы известно, что СОД вводят, например, в кальций-фосфатные биодеградируемые наночастицы, покрытые дисахаридами (патент RU 2577236 C1, А61К 33/08, 2014).It is known that SOD has high antioxidant activity, however, the use of the native enzyme is ineffective due to its rapid inactivation in the body. At the same time, the introduction of relatively large doses of the native SOD protein in the compositions is impractical due to the undesirable immune response of the organism to the foreign protein. Therefore, it is known from scientific and technical literature that SOD is introduced, for example, into calcium-phosphate biodegradable nanoparticles coated with disaccharides (patent RU 2577236 C1, A61K 33/08, 2014).

Предлагаемая композиция может быть использована при получении различных лекарственных форм, например, суппозиторий, мазей, гелей и т.д., используемых при лечении гинекологических и проктологических заболеваний, сопровождающихся (обусловленных) окислительным стрессом, например, таких как вагинит, вульвит, вульвовагинит, цервицит, геморрой, проктит, парапроктит и т.д.The proposed composition can be used to obtain various dosage forms, for example, suppositories, ointments, gels, etc., used in the treatment of gynecological and proctological diseases accompanied (caused by) oxidative stress, such as vaginitis, vulvitis, vulvovaginitis, cervicitis , hemorrhoids, proctitis, paraproctitis, etc.

Все реагенты и расходные материалы (фильтрующие мембраны), использованные при получении предлагаемой композиции, коммерчески доступны. Так, СОД коммерчески доступна (http://sodferment.ru, ООО НПП «Ферментные технологии», Россия) и является известным антиоксидантным ферментом, инактивирующим супероксидные радикалы [McCord J. М., Fridovich I. Superoxide dismutase an enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein) // Journal of Biological chemistry. - 1969. - T. 244. - №. 22. - C. 6049-6055].All reagents and consumables (filter membranes) used in the preparation of the proposed composition are commercially available. So, SOD is commercially available (http://sodferment.ru, OOO NPP "Enzymatic Technologies", Russia) and is a well-known antioxidant enzyme that inactivates superoxide radicals [McCord J. M., Fridovich I. Superoxide dismutase an enzymic function for erythrocuprein ( hemocuprein) // Journal of Biological chemistry. - 1969. - T. 244. - No. 22. - C. 6049-6055].

Частицы, используемые в предлагаемой композиции, получают путем смешения буферных растворов поликатиона и СОД. При этом состав буферных растворов может быть различен и их рН может варьироваться и составлять, например, 5-8.The particles used in the proposed composition are obtained by mixing buffer solutions of the polycation and SOD. In this case, the composition of the buffer solutions can be different and their pH can vary and be, for example, 5-8.

При получении частиц концентрация СОД в использованном буферном растворе может быть различной и составлять 2,5-10,0 мг/мл. Концентрация коммерчески доступных (Sigma-Aldrich, США) вышеуказанных поликатионов в буферном растворе также может варьироваться и составлять 2,5-10,0 мг/мл. Следует отметить, что раствор поликатиона следует по каплям добавлять к раствору СОД при перемешивании. Если вышеуказанные растворы смешивать не по каплям, а, например, за один прием, то возрастает вероятность образования частиц с широким распределением по размеру, что нежелательно, поскольку это затрудняет очистку суспензии частиц. При этом количество использованных СОД и поликатиона может варьироваться, однако заряд СОД после модификации поликатионом должен быть положительным для обеспечения возможности последующего покрытия частиц слоем одного из вышеуказанных полианионов. После смешения компонентов полученную смесь необходимо выдерживать при перемешивании в течение, например, 25-40 мин для обеспечения возможности получение более однородных по размеру частиц, затем по каплям добавлять в нее водный буферный раствор блок-СПЛ. Если вышеуказанные растворы смешивать не по каплям, а, например, за один прием, то возрастает вероятность образования частиц с широким распределением по размеру, что нежелательно.When obtaining particles, the concentration of SOD in the used buffer solution can be different and amount to 2.5-10.0 mg / ml. The concentration of commercially available (Sigma-Aldrich, USA) of the above polycations in the buffer solution can also vary and amount to 2.5-10.0 mg / ml. It should be noted that the polycation solution should be added dropwise to the SOD solution with stirring. If the above solutions are mixed not dropwise, but, for example, in one step, then the probability of the formation of particles with a wide size distribution increases, which is undesirable since it makes it difficult to clean the particle suspension. In this case, the amount of SOD and polycation used can vary, however, the charge of SOD after modification with a polycation must be positive to ensure the possibility of subsequent coating of the particles with a layer of one of the above polyanions. After mixing the components, the resulting mixture must be kept under stirring for, for example, 25-40 minutes to provide the possibility of obtaining more uniform particles in size, then add an aqueous buffer solution of the block-SPL to it dropwise. If the above solutions are mixed not dropwise, but, for example, in a single step, then the probability of the formation of particles with a wide size distribution increases, which is undesirable.

Используемые при этом блок-сополимеры ПА - ПЭГ и ПГ - ПЭГ коммерчески доступны (http://www.alamanda-polymers.com/, Alamanda Polymers, США). При проведении данной стадии синтеза концентрация блок-СПЛ в буферном растворе может варьироваться и составлять 2,5-10,0 мг/мл. При этом общее количество ранее обработанной поликатионом СОД и блок-СПЛ может варьироваться, однако после повторной модификации заряд полученных частиц должен поменять знак, т.е. стать отрицательным.The block copolymers PA - PEG and PG - PEG used in this case are commercially available (http://www.alamanda-polymers.com/, Alamanda Polymers, USA). When carrying out this stage of the synthesis, the concentration of the block-CPL in the buffer solution can vary and be 2.5-10.0 mg / ml. In this case, the total amount of SOD and block SPL previously treated with the polycation can vary; however, after the repeated modification, the charge of the resulting particles should change sign, i.e. become negative.

Образование на частицах СОД внутреннего слоя поликатиона в ходе вышеуказанной обработки антиоксидантного фермента буферным раствором поликатиона, а также образование дополнительного внешнего слоя из блок-СПЛ в ходе обработки модифицированной СОД буферным раствором полианиона подтверждено методом тушения флуоресценции.The formation of an inner polycation layer on SOD particles during the above treatment of the antioxidant enzyme with a buffer solution of a polycation, as well as the formation of an additional outer layer from the block SPL during treatment of the modified SOD with a buffer solution of a polyanion was confirmed by the fluorescence quenching method.

После смешения вышеуказанных компонентов полученную смесь необходимо перемешивать и выдерживать в течение, например, 25-40 мин для обеспечения возможности получение более однородных по размеру частиц. При этом для обеспечения сохранности активности фермента выдерживание целесообразно проводить при пониженной относительно комнатной температуре, например, в холодильнике при 3-8°С.After mixing the above components, the resulting mixture must be stirred and held for, for example, 25-40 minutes to ensure the possibility of obtaining more uniform particle size. In this case, to ensure the preservation of the enzyme activity, it is advisable to hold the aging at a temperature lower than room temperature, for example, in a refrigerator at 3-8 ° C.

После окончания данной стадии синтеза в полученную смесь при перемешивании по каплям добавляют свежеприготовленный водный раствор глутарового альдегида, который, как известно, выступает в качестве неизбирательного сшивающего агента химических соединений, содержащих первичные аминогруппы [Migneault I. et al. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking //Biotechniques. - 2004. - T. 37. - №. 5. - C. 790-802.]. При этом экспериментально было показано, что для увеличения суммарного выхода СОД по активности у частиц и повышения стабильности значений активности СОД у частиц в процессе их хранения в отличие от вышеописанного аналога необходимо добавлять водный раствор глутарового альдегида, взятого в количестве, обеспечивающем его мольное соотношение с аминогруппами поликатиона 0,3-1,5. При этом концентрация раствора глутарового альдегида может быть различной. Затем для обеспечения полноты протекания ковалентного связывания (сшивки) аминогрупп полученную смесь необходимо выдерживать, например, в течение 8-12 ч при пониженной относительно комнатной температуре, например, в холодильнике при 3-8°С. После этого для повышения стабильности полученных частиц в вышеуказанную смесь при перемешивании по каплям добавляют избыток свежеприготовленного водного раствора боргидрида натрия с целью восстановления неустойчивых двойных связей между углеродом и азотом в полученных основаниях Шиффа с образованием стабильной ковалентной связи. При этом концентрация раствора боргидрида натрия может варьироваться и составлять 1-2 мг/мл.After the end of this stage of the synthesis, a freshly prepared aqueous solution of glutaraldehyde, which is known to act as an indiscriminate crosslinking agent for chemical compounds containing primary amino groups, is added dropwise to the resulting mixture with stirring [Migneault I. et al. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking // Biotechniques. - 2004. - T. 37. - No. 5. - C. 790-802.]. At the same time, it was experimentally shown that in order to increase the total yield of SOD in terms of the activity of particles and increase the stability of the values of SOD activity in particles during storage, in contrast to the above-described analogue, it is necessary to add an aqueous solution of glutaraldehyde taken in an amount that ensures its molar ratio with amino groups polycation 0.3-1.5. In this case, the concentration of the glutaraldehyde solution can be different. Then, to ensure the completeness of the covalent bonding (crosslinking) of amino groups, the resulting mixture must be kept, for example, for 8-12 hours at a reduced temperature relative to room temperature, for example, in a refrigerator at 3-8 ° C. After that, to increase the stability of the obtained particles, an excess of a freshly prepared aqueous solution of sodium borohydride is added dropwise to the above mixture with stirring in order to restore unstable double bonds between carbon and nitrogen in the obtained Schiff bases with the formation of a stable covalent bond. In this case, the concentration of sodium borohydride solution can vary and amount to 1-2 mg / ml.

Ковалентное связывание глутарового альдегида с частицами СОД/поликатион/полианион было подтверждено инструментальными методами.The covalent binding of glutaraldehyde with SOD / polycation / polyanion particles was confirmed by instrumental methods.

Ввиду того, что точно описать строение полученных частиц после их обработки вначале раствором глутарового альдегида, затем раствором боргидрида натрия не представляется возможным, в предлагаемой композиции действующее вещество - полученный продукт охарактеризован способом его получения.In view of the fact that it is not possible to accurately describe the structure of the obtained particles after their processing, first with a solution of glutaraldehyde, then with a solution of sodium borohydride, in the proposed composition the active ingredient - the resulting product is characterized by the method of its preparation.

Перед получением композиции суспензию частиц очищают от побочных продуктов и не вступивших в реакцию реагентов с использованием мембранной фильтрующей системы. При этом можно использовать мембранную фильтрующую систему, например, в комбинации с перистальтическим насосом, подающим полученную суспензию частиц на мембрану (фильтр) под давлением, или применять центрифугирование с использованием помещенного в пробирку центрифуги ультрафильтрационного фильтра (мембраны). В последнем случае скорость вращения ротора центрифуги может варьироваться иPrior to preparing the composition, the particle suspension is purified from by-products and unreacted reagents using a membrane filter system. In this case, a membrane filtering system can be used, for example, in combination with a peristaltic pump, which supplies the obtained suspension of particles to a membrane (filter) under pressure, or centrifugation can be applied using an ultrafiltration filter (membrane) placed in a centrifuge. In the latter case, the speed of rotation of the rotor of the centrifuge can vary and

составлять, например, 3000-4000 оборотов (об) /мин. В отличие от аналога при этом используют мембранную фильтрующую систему с экспериментально подобранным пределом пропускания 90-130 кДа. То есть, например, мембрана с пределом пропускания 90 кДа пропускает вещества с молекулярной массой менее 90 кДа. Следует отметить, что при получении используемых частиц описанная в аналоге ультрафильтрационная мембрана с пределом пропускания 50 кДа не позволяет провести надлежащую очистку полученных частиц в связи с забивкой пор в мембране.be, for example, 3000-4000 revolutions (rpm) / min. In contrast to the analogue, a membrane filtering system with an experimentally selected transmittance limit of 90-130 kDa is used. That is, for example, a membrane with a 90 kDa cutoff permeates substances with a molecular weight of less than 90 kDa. It should be noted that when obtaining the particles used, the ultrafiltration membrane described in the analogue with a transmittance limit of 50 kDa does not allow proper purification of the obtained particles due to clogging of the pores in the membrane.

При очистке частиц с использованием центрифугирования в пробирку центрифуги помещают фильтр на основе ультрафильтрационной мембраны, заполненный аликвотой вышеописанной суспензии, с последующим введением перед каждой новой стадией центрифугирования дистиллированной воды.When cleaning particles using centrifugation, a filter based on an ultrafiltration membrane filled with an aliquot of the above suspension is placed in a centrifuge tube, followed by the introduction of distilled water before each new centrifugation step.

При использовании поточной фильтрующей системы в накопительную емкость наливают полученную суспензию частиц. Далее фильтруемая суспензия из накопительной емкости с помощью перистальтического насоса под давлением подается на фильтрационный картридж с мембраной с пределом пропускания 90-130 кДа и двигается вдоль мембраны. Часть жидкости с низкомолекулярными побочными продуктами и не вступившими в реакцию реагентами проходит сквозь поры фильтрующей системы и накапливается в емкости. Очищенные от низкомолекулярных компонентов частицы, не прошедшие сквозь мембрану, потоком жидкости рециркулируются обратно в накопительную емкость, где смешиваются с постоянно поступающей дистиллированной водой. В результате общая концентрация низкомолекулярных побочных продуктов и не вступивших в реакцию реагентов в накопительной емкости уменьшается. На завершающем этапе очистки останавливают подачу жидкости в накопительную емкость и может быть осуществлено концентрирование очищенной суспензии (уменьшение ее объема), например, в 2-4 раза.When using an in-line filtering system, the resulting suspension of particles is poured into the storage tank. Next, the filtered suspension from the storage tank is supplied under pressure to a filtration cartridge with a membrane with a transmission limit of 90-130 kDa using a peristaltic pump and moves along the membrane. Part of the liquid with low molecular weight by-products and unreacted reagents passes through the pores of the filter system and accumulates in the container. Particles cleaned of low-molecular-weight components, which did not pass through the membrane, are recirculated by the liquid flow back to the storage tank, where they are mixed with continuously supplied distilled water. As a result, the total concentration of low molecular weight by-products and unreacted reagents in the storage tank decreases. At the final stage of cleaning, the supply of liquid to the storage tank is stopped and the concentration of the purified suspension (reduction of its volume) can be carried out, for example, by 2-4 times.

Вышеописанный способ дает возможность получать водную суспензию частиц СОД / поликатион / полианион с определенным методом динамического светорассеяния средним гидродинамическим диаметром 90-200 нм. При этом погрешность измерений составляет не более 4%. Размер используемых в композиции частиц можно варьировать изменением рН и ионной силы использованного буферного раствора, например, изменением в буферном растворе концентрации NaCl.The above-described method makes it possible to obtain an aqueous suspension of SOD / polycation / polyanion particles with a certain dynamic light scattering method with an average hydrodynamic diameter of 90-200 nm. In this case, the measurement error is no more than 4%. The size of the particles used in the composition can be varied by changing the pH and ionic strength of the buffer used, for example, by changing the concentration of NaCl in the buffer.

Ввиду того, что полученные частицы предстоит смешивать с фармакологически приемлемой, как правило, гидрофильной или гидрофобной твердой основой, полученную суспензию частиц подвергают лиофильной сушке, которую проводят с помощью традиционной лиофильной сушилки или вакуумной камеры. При этом перед лиофильной сушкой в суспензию частиц могут быть введены фармакологически приемлемые стабилизаторы, в качестве которых могут быть использованы, например, аминокислоты, моно- или полисахариды, полипептиды или белки. В группу аминокислот могут входить, например, аланин и глицин. В группу моно- или полисахаридов могут входить, например, глюкоза, сахароза, лактоза, трегалоза, манноза. В качестве полипептидов или белков могут быть использованы альбумины. При этом используемые стабилизаторы также будут входить в качестве компонента в основу лекарственной формы.In view of the fact that the resulting particles are to be mixed with a pharmacologically acceptable, usually hydrophilic or hydrophobic solid base, the resulting suspension of particles is subjected to freeze drying, which is carried out using a conventional freeze dryer or vacuum chamber. In this case, before freeze drying, pharmacologically acceptable stabilizers can be introduced into the suspension of particles, which can be used, for example, amino acids, mono- or polysaccharides, polypeptides or proteins. The group of amino acids may include, for example, alanine and glycine. The group of mono- or polysaccharides may include, for example, glucose, sucrose, lactose, trehalose, mannose. Albumin can be used as polypeptides or proteins. In this case, the stabilizers used will also be included as a component in the base of the dosage form.

Анализ антиоксидантной активности проводят с использованием метода, в основе которого лежит реакция ингибирования автоокисления пирогаллола под действием СОД или ЭМОС [Marklund S., Marklund G. Involvement of the superoxide anion radical in the autoxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase // European journal of biochemistry. - 1974. - T. 47. - №. 3. - C. 469-474]. Измерения проводят в 96-луночном планшете. Предварительно лиофилизат диспергируют в буферном растворе с получением суспензии частиц с известной концентрацией, в воде растворяют ЭМОС. Для одного образца используют 8 лунок (один столбец). Последовательным разбавлением получают 8 точек объемом 20 мкл с концентрациями СОД 0,45-1000 мкг/мл или с концентрациями ЭМОС 0,02-50 мг/мл. В каждую из лунок добавляют 160 мкл 50 мМ Трис-буфера с рН 8,2 и 20 мкл раствора пирогаллола, полученного растворением навески пирогаллола в рассчитанном объеме ацетона с получением раствора с концентрацией 5 мг/мл и его разбавлением в 10 раз водой. Затем в течение 5 мин через каждые 30 сек с помощью спектрофотометра определяют изменение оптической плотности раствора от времени в результате окисления пирогаллола растворенным в воде кислородом в отсутствии и присутствии антиоксидантов и строят график зависимости скорости окисления пирогаллола от концентрации антиоксидантов в логарифмическом масштабе. С помощью программного обеспечения Origin 8.1 полученную зависимость аппроксимируют кривой «доза-ответ» и находят концентрацию, соответствующую 50%-ному ингибированию реакции (ЕС₅₀, мкг/мл). Далее рассчитывают активность СОД и ЭМОС по формуле: А=1000000/(20 * ЕС₅₀) [Ед/мг]. Выход СОД по активности у частиц определяют как отношение активности СОД у частиц к начальной активности используемого в синтезе раствора СОД и измеряют в процентах. Следует отметить, что активность зависит от концентрации раствора СОД, и снижается с ее уменьшением, а также от строения частиц и реагентов, используемых при их получении. Поэтому корректное сравнение значений активности СОД в частицах возможно проводить с учетом только вышеуказанных условий.The analysis of antioxidant activity is carried out using a method based on the reaction of inhibition of pyrogallol autoxidation under the influence of SOD or EMOS [Marklund S., Marklund G. Involvement of the superoxide anion radical in the autoxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase // European journal of biochemistry. - 1974. - T. 47. - No. 3. - C. 469-474]. Measurements are carried out in a 96 well plate. The lyophilisate is preliminarily dispersed in a buffer solution to obtain a suspension of particles with a known concentration, EMOS is dissolved in water. Use 8 wells for one sample (one column). By serial dilution, 8 points with a volume of 20 μl are obtained with SOD concentrations of 0.45-1000 μg / ml or with EMOS concentrations of 0.02-50 mg / ml. To each of the wells, 160 μl of 50 mM Tris buffer with pH 8.2 and 20 μl of a pyrogallol solution obtained by dissolving a weighed portion of pyrogallol in a calculated volume of acetone are added to obtain a solution with a concentration of 5 mg / ml and diluted 10 times with water. Then, within 5 minutes every 30 seconds, using a spectrophotometer, the change in the optical density of the solution from time to time is determined as a result of the oxidation of pyrogallol by oxygen dissolved in water in the absence and presence of antioxidants, and a graph of the dependence of the oxidation rate of pyrogallol on the concentration of antioxidants is plotted on a logarithmic scale. Using the Origin 8.1 software, the obtained dependence is approximated by the dose-response curve and the concentration corresponding to 50% inhibition of the reaction is found (EC ₅₀ , μg / ml). Next, the activity of SOD and EMOS is calculated according to the formula: A = 1,000,000 / (20 * EC ₅₀ ) [U / mg]. The yield of SOD by activity in particles is determined as the ratio of the activity of SOD in particles to the initial activity of the SOD solution used in the synthesis and is measured as a percentage. It should be noted that the activity depends on the concentration of the SOD solution, and decreases with its decrease, as well as on the structure of particles and reagents used in their preparation. Therefore, a correct comparison of the SOD activity values in particles can be carried out taking into account only the above conditions.

Определение концентрации белка в образцах проводят с помощью набора Micro ВСА™ Protein Assay Kit в соответствии с инструкцией производителя. Метод основан на колориметрическом определении комплекса бицинхониновой кислоты с ионами Cu⁺, образующегося путем восстановления ионов Cu²⁺ белками. Выход СОД по белку (ферменту) определяют как отношение конечной массы белка в суспензии частиц к начальной массе используемого белка в синтезе.Determination of protein concentration in samples is carried out using the Micro BCA ™ Protein Assay Kit according to the manufacturer's instructions. The method is based on the colorimetric determination of the complex of bicinchoninic acid with Cu ⁺ ions, formed by the reduction of Cu ^{2+ ions with} proteins. The SOD yield for protein (enzyme) is defined as the ratio of the final mass of protein in the suspension of particles to the initial mass of the protein used in the synthesis.

Суммарный выход СОД по активности вычисляют как произведение выхода СОД по активности и выхода СОД по белку.The total SOD yield by activity is calculated as the product of SOD yield by activity and SOD yield by protein.

Полученный лиофилизат целесообразно хранить при пониженной температуре в морозильной камере. Лиофилизат частиц может быть использован для получения средств для лечения гинекологических и проктологических заболеваний, например, суппозиториев (свечей), мазей, гелей и т.д. Указанные лекарственные формы могут быть получены путем смешения действующего вещества - лиофилизата частиц с основой, выбранной из группы, включающей в себя, например, полиэтиленоксид 1500, полиэтиленоксид 400, витепсол, твердые жиры, бутирол, ланоль, масло какао, гидрогенизированные жиры или желатин-глицериновая смесь и т.д. Суппозитории из вышеуказанной композиции могут быть получены, например, традиционными методами выливания или ручного формирования. Смесь вышеуказанных веществ может дополнительно содержать также стабилизаторы, консерванты и другие лекарственные препараты и т.д. В зависимости от вида и тяжести заболевания схема лечения с использованием вышеописанных лекарственных форм может быть также различна.It is advisable to store the resulting lyophilisate at a low temperature in a freezer. The lyophilisate of particles can be used to obtain agents for the treatment of gynecological and proctological diseases, for example, suppositories (suppositories), ointments, gels, etc. These dosage forms can be obtained by mixing the active substance - lyophilisate of particles with a base selected from the group including, for example, polyethylene oxide 1500, polyethylene oxide 400, witepsol, hard fats, butyrol, lanol, cocoa butter, hydrogenated fats or gelatin-glycerin mixture, etc. Suppositories of the above composition can be prepared, for example, by conventional pouring or hand-molding techniques. The mixture of the above substances may additionally also contain stabilizers, preservatives and other drugs, etc. Depending on the type and severity of the disease, the treatment regimen using the above-described dosage forms may also be different.

Для измерения показателей антиоксидантной активности биологических жидкостей была использована модельная система гемоглобин - Н₂О₂ - люминол. В качестве субстрата окисления в данной системе выступает люминол. При взаимодействии с активными формами кислорода люминол подвергается свободнорадикальному окислению, в ходе которого испускаются кванты света, которые регистрируются с помощью хемилюминометра. Введение в модельную систему антиоксидантов приводит к торможению свободнорадикального окисления люминола.To measure the indicators of the antioxidant activity of biological fluids, a model system hemoglobin - Н ₂ О ₂ - luminol was used. Luminol acts as an oxidation substrate in this system. When interacting with reactive oxygen species, luminol undergoes free radical oxidation, during which light quanta are emitted, which are recorded using a chemiluminometer. The introduction of antioxidants into the model system leads to inhibition of the free radical oxidation of luminol.

Измерение антиокислительной активности (АОА) в модельной системе гемоглобин - Н₂О₂ - люминол проводят следующим образом.Measurement of antioxidant activity (AOA) in the model system hemoglobin - Н ₂ О ₂ - luminol is carried out as follows.

Контрольная проба: в пробирку вносят 370 мкл 0,05 М фосфатного буфера (рН 7,4) и добавляют 50 мкл раствора 0,1 мМ люминола, 50 мкл раствора 5,0 мМ гемоглобина и тщательно перемешивают. Для инициирования реакции свободнорадикального окисления люминола добавляют 30 мкл раствора 0,98 мМ H₂O₂, перемешивают и точно фиксируют время внесения реактива. Пробирку помещают в хемилюминометр, с помощью которого регистрируют кинетику свободнорадикальной реакции в модельной системе.Control sample: 370 μl of 0.05 M phosphate buffer (pH 7.4) is added to the test tube and 50 μl of 0.1 mM luminol solution, 50 μl of 5.0 mM hemoglobin solution are added and mixed thoroughly. To initiate the reaction of free radical oxidation of luminol, add 30 μl of a solution of 0.98 mM H ₂ O ₂ , mix and accurately record the time of adding the reagent. The test tube is placed in a chemiluminometer, which is used to record the kinetics of the free radical reaction in the model system.

Опытная проба: в пробирку вносят 340 мкл 0,05 М фосфатного буфера (рН 7,4) и добавляют последовательно 50 мкл раствора 0,1 мМ люминола, 50 мкл раствора 5,0 мМ гемоглобина и 30 мкл исследуемого материала и тщательно перемешивают. Затем вносят 30 мкл раствора 0,98 мМ H₂O₂, фиксируют время внесения, перемешивают и регистрируют кинетику свободнорадикального окисления на хемилюминометре марки "Биотокс-7" (Россия, НПО Энергия).Experimental test: add 340 μl of 0.05 M phosphate buffer (pH 7.4) to a test tube and add successively 50 μl of a 0.1 mM luminol solution, 50 μl of a 5.0 mM hemoglobin solution and 30 μl of the test material and mix thoroughly. Then add 30 μl of a solution of 0.98 mM H ₂ O ₂ , record the time of addition, mix and record the kinetics of free radical oxidation on a chemiluminometer "Biotox-7" (Russia, NPO Energia).

Измеряемыми параметрами являются величина латентного периода и интенсивность хемилюминисценции. По величине латентного периода судят о значении АОА по отношению к гидроксильному радикалу, по величине максимальной интенсивности хемилюминисценции судят о значении АОА по отношению к супероксидному радикалу.The measured parameters are the value of the latency period and the intensity of chemiluminescence. The value of the latent period is used to judge the value of AOA in relation to the hydroxyl radical, and the value of AOA in relation to the superoxide radical is judged by the magnitude of the maximum intensity of chemiluminescence.

Испытания лекарственной формы на основе предлагаемой композиции были проведены на добровольцах.Tests of the dosage form based on the proposed composition were carried out on volunteers.

Преимущества предлагаемой композиции иллюстрируют следующие примеры.The advantages of the proposed composition are illustrated by the following examples.

Пример 1.Example 1.

Используемую в примере композицию получают следующим образом. В пластиковую пробирку объемом 15 мл помещают 1,80 мл раствора СОД с концентрацией 5,00 мг/мл в буферном растворе, содержащем гидрофосфат натрия и дигидрофосфат натрия с концентрациями 0,57 мг/мл и 0,11 мг/ мл, соответственно, с рН 7,4 с добавлением NaCl с концентрацией 130 мМ, затем туда при перемешивании по каплям добавляют 0,97 мл раствора поликатиона протамина с концентрацией 5,00 мг/мл в вышеописанном буферном растворе, что соответствует 32,8 мкмолям аминогрупп протамина, и полученную смесь выдерживают в течение 30 мин при перемешивании. После этого в полученный раствор при перемешивании по каплям добавляют 1,07 мл раствора полианиона блок-сополимера ПГ-ПЭГ с концентрацией 5,00 мг/мл в вышеописанном буферном растворе и полученную смесь при перемешивании выдерживают в течение 30 мин при 4°С. Затем в полученную смесь при перемешивании по каплям добавляют 0,90 мл свежеприготовленного водного раствора глутарового альдегида с концентрацией 0,4% по объему (39,6 мкмоль), что соответствует его мольному соотношению с аминогруппами поликатиона 1,2, и полученную смесь выдерживают в течение 10 ч при 4°С. После этого в вышеуказанную смесь при перемешивании по каплям добавляют 0,20 мл свежеприготовленного водного раствора боргидрида натрия с концентрацией 1,00 мг/мл. Для очистки суспензии полученных частиц используют поточную мембранную фильтрующую систему. Полученную суспензию наливают в накопительную емкость, откуда суспензия с помощью перистальтического насоса поступает на фильтрационный картридж, содержащий мембрану с пределом пропускания 90 кДа, и с большой скоростью двигается вдоль мембраны. Часть буферного раствора с низкомолекулярными побочными продуктами и не вступившими в реакцию реагентами проходит сквозь поры мембраны и накапливается в емкости. Остальная часть суспензии частиц, не прошедшая сквозь мембрану, рециркулируется обратно в накопительную емкость, где смешивается с постоянно поступающей дистиллированной водой.Used in the example, the composition is prepared as follows. 1.80 ml of SOD solution with a concentration of 5.00 mg / ml in a buffer solution containing sodium hydrogen phosphate and sodium dihydrogen phosphate with concentrations of 0.57 mg / ml and 0.11 mg / ml, respectively, are placed in a plastic test tube with a volume of 15 ml. pH 7.4 with the addition of NaCl with a concentration of 130 mM, then 0.97 ml of a solution of protamine polycation with a concentration of 5.00 mg / ml in the above buffer solution, which corresponds to 32.8 μmol of protamine amino groups, is added dropwise with stirring, and the resulting the mixture is kept for 30 minutes with stirring. Thereafter, 1.07 ml of a solution of the polyanion of the PG-PEG block copolymer with a concentration of 5.00 mg / ml in the above-described buffer solution is added dropwise to the resulting solution with stirring, and the resulting mixture is kept with stirring for 30 minutes at 4 ° C. Then 0.90 ml of a freshly prepared aqueous solution of glutaraldehyde with a concentration of 0.4% by volume (39.6 μmol), which corresponds to its molar ratio with the amino groups of the polycation 1.2, is added dropwise to the resulting mixture with stirring, and the resulting mixture is kept in for 10 h at 4 ° C. Thereafter, 0.20 ml of a freshly prepared aqueous solution of sodium borohydride with a concentration of 1.00 mg / ml is added dropwise to the above mixture with stirring. To purify the suspension of the obtained particles, an in-line membrane filter system is used. The resulting suspension is poured into a storage tank, from where the suspension, using a peristaltic pump, is fed to a filtration cartridge containing a membrane with a 90 kDa transmission limit, and moves at high speed along the membrane. Part of the buffer solution with low molecular weight by-products and unreacted reagents passes through the pores of the membrane and accumulates in the container. The rest of the suspension of particles, which did not pass through the membrane, is recirculated back to the storage tank, where it is mixed with continuously supplied distilled water.

В итоге получают 2,50 мл очищенной суспензии частиц, у которых ядро из СОД покрыто внутренней оболочкой из протамина и внешней оболочкой из блок-СПЛ. Диаметр полученных частиц, определенный методом динамического светорассеяния, составляет 90 нм. Активность СОД у частиц в полученной суспензии равна 13500±1000 Ед/мл. Суммарный выход СОД по активности у частиц составляет 52%.As a result, 2.50 ml of a purified suspension of particles are obtained, in which the SOD core is covered with an inner shell of protamine and an outer shell of a block-SPL. The diameter of the obtained particles, determined by the method of dynamic light scattering, is 90 nm. The SOD activity of the particles in the resulting suspension is 13500 ± 1000 U / ml. The total yield of SOD in terms of the activity of particles is 52%.

Далее проводят лиофильную сушку полученной очищенной суспензии частиц. Суспензию переносят в круглодонную колбу, содержимое колбы замораживают при -78°С, после чего колбу соединяют с лиофильной сушилкой, в ловушку сушилки заливают жидкий азот и с помощью форвакуумного насоса внутри сушилки создают вакуум. В процессе сушки колба снаружи покрывается инеем из атмосферной влаги, и сушку осуществляют до тех пор, пока иней не исчезнет. Колбу с лиофилизатом снимают с сушилки, лиофилизат переносят в пластиковую пробирку с плотно прилегающей крышкой. Пробирку с полученным лиофилизатом хранят в морозильной камере при -18°С.Next, the resulting purified particle suspension is freeze-dried. The suspension is transferred into a round-bottom flask, the contents of the flask are frozen at -78 ° C, after which the flask is connected to a freeze dryer, liquid nitrogen is poured into the trap of the dryer, and a vacuum is created inside the dryer using a foreline pump. During the drying process, the outside of the flask is covered with frost from atmospheric moisture, and drying is carried out until the frost disappears. The flask with the lyophilisate is removed from the dryer, the lyophilisate is transferred into a plastic tube with a tight-fitting lid. The tube with the resulting lyophilisate is stored in a freezer at -18 ° C.

После хранения лиофилизата в течение одного года в морозильной камере при -18°С активность СОД у частиц снижалась на 8%, а размер частиц после диспергирования лиофилизата в воде практически не изменился.After storing the lyophilisate for one year in a freezer at -18 ° C, the SOD activity of the particles decreased by 8%, and the particle size after dispersing the lyophilisate in water practically did not change.

Для получения композиции 7,5 мг лиофилизата смешивают с 75,00 г желатин-глицериновой основы, состоящей из 8,50 г желатина, 47,00 г глицерина и 19,50 г воды. Получают композицию, в которой масс. % действующего вещества равен 0,01, а остальное основа, из которой формируют 20 суппозиториев массой по 3,00 г.To obtain a composition, 7.5 mg of the lyophilisate is mixed with 75.00 g of a gelatin-glycerin base, consisting of 8.50 g of gelatin, 47.00 g of glycerin and 19.50 g of water. Get a composition in which the mass. % of the active substance is 0.01, and the rest is the basis from which 20 suppositories weighing 3.00 g are formed.

Больная А., 29 лет. Диагноз: острый вагинит. Больной вводили внутривагинально по 1 суппозиторию 2 раза в день в течение 10 дней. Уже на 2-й день лечения наблюдали значительное уменьшение боли, зуда и чувства жжения, также явное уменьшение отечности и гиперемии наружных половых органов и слизистой влагалища.Patient A., 29 years old. Diagnosis: acute vaginitis. The patient was administered intravaginally 1 suppository 2 times a day for 10 days. Already on the 2nd day of treatment, a significant decrease in pain, itching and burning sensation was observed, as well as a clear decrease in edema and hyperemia of the external genital organs and vaginal mucosa.

Результаты опыта показывают, что полученная композиция может быть использована для лечения гинекологического заболевания, сопровождающегося окислительным стрессом.The results of the experiment show that the obtained composition can be used for the treatment of gynecological diseases accompanied by oxidative stress.

Пример 2.Example 2.

Используемую в примере композицию получают следующим образом. В пластиковую пробирку объемом 2000 мл помещают 450,0 мл раствора СОД с концентрацией 2,50 мг/мл в буферном растворе, содержащем гидрофосфат натрия и дигидрофосфат натрия с концентрациями 0,03 мг/мл и 0,57 мг/ мл соответственно, с рН 5 с добавлением NaCl с концентрацией 140 мМ, затем туда при перемешивании по каплям добавляют 242,5 мл раствора поликатиона полилизина с концентрацией 2,50 мг/мл в вышеописанном буферном растворе, что соответствует 4,0 ммолям аминогрупп поликатиона, и полученную смесь выдерживают в течение 25 мин при перемешивании. После этого в полученный раствор при перемешивании по каплям добавляют 267,5 мл раствора полианиона блок-сополимера ПГ-ПЭГ с концентрацией 2,50 мг/мл в вышеописанном буферном растворе, и полученную смесь при перемешивании выдерживают в течение 25 мин при 3°С. Затем в полученную смесь при перемешивании по каплям добавляют 112,5 мл свежеприготовленного водного раствора глутарового альдегида с концентрацией 0,1% по объему (1,2 ммоль), что соответствует мольному соотношению с аминогруппами поликатиона 0,3, и полученную смесь выдерживают в течение 8 ч при 3°С. После этого в вышеуказанную смесь при перемешивании по каплям добавляют 50,0 мл свежеприготовленного водного раствора боргидрида натрия с концентрацией 1,00 мг/мл. Очистку суспензии полученных частиц проводят аналогично примеру 1, однако используют мембрану с пределом пропускания 130 кДа.Used in the example, the composition is prepared as follows. In a plastic test tube with a volume of 2000 ml, 450.0 ml of SOD solution with a concentration of 2.50 mg / ml in a buffer solution containing sodium hydrogenphosphate and sodium dihydrogenphosphate with concentrations of 0.03 mg / ml and 0.57 mg / ml, respectively, with pH 5 with the addition of NaCl with a concentration of 140 mM, then 242.5 ml of a solution of polylysine polycation with a concentration of 2.50 mg / ml in the above-described buffer solution, which corresponds to 4.0 mmol of amino groups of the polycation, is added dropwise there with stirring, and the resulting mixture is kept in for 25 min with stirring. Thereafter, 267.5 ml of a solution of the polyanion of a block copolymer PG-PEG with a concentration of 2.50 mg / ml in the above-described buffer solution is added dropwise to the resulting solution with stirring, and the resulting mixture is kept with stirring for 25 minutes at 3 ° C. Then, 112.5 ml of a freshly prepared aqueous solution of glutaraldehyde with a concentration of 0.1% by volume (1.2 mmol), which corresponds to the molar ratio with the amino groups of the polycation of 0.3, is added dropwise to the resulting mixture with stirring, and the resulting mixture is kept for 8 h at 3 ° C. Thereafter, 50.0 ml of a freshly prepared aqueous solution of sodium borohydride with a concentration of 1.00 mg / ml is added dropwise to the above mixture with stirring. Purification of the suspension of the obtained particles is carried out analogously to example 1, however, a membrane with a transmission limit of 130 kDa is used.

В итоге получают 620,0 мл суспензии частиц, у которых ядро из СОД покрыто внутренней оболочкой из полилизина и внешней оболочкой из блок-СПЛ. Диаметр полученных частиц, определенный методом динамического светорассеяния, составляет 123 нм. Активность СОД у частиц в полученной суспензии равна 6500±1000 Ед/мл. Суммарный выход СОД по активности у частиц составляет 55%.As a result, 620.0 ml of a suspension of particles are obtained, in which the SOD core is covered with an inner shell of polylysine and an outer shell of block-SPL. The diameter of the obtained particles, determined by dynamic light scattering, is 123 nm. The SOD activity of the particles in the resulting suspension is 6500 ± 1000 U / ml. The total yield of SOD in terms of the activity of particles is 55%.

Далее проводят лиофильную сушку, полученной суспензии частиц аналогично примеру 1. Однако, в качестве стабилизатора в суспензию вводят 312,5 мл раствора мальтозы с концентрацией 21%.Next, freeze drying of the resulting suspension of particles is carried out analogously to example 1. However, as a stabilizer, 312.5 ml of maltose solution with a concentration of 21% is introduced into the suspension.

После хранения в течение одного года в морозильной камере при -18°С активность СОД у частиц снижалась на 4%, а размер частиц в суспензии после диспергирования лиофилизата в воде практически не изменился.After storage for one year in a freezer at -18 ° C, the SOD activity of the particles decreased by 4%, and the particle size in the suspension remained practically unchanged after the lyophilisate was dispersed in water.

Для получения композиции 11,3 г лиофилизата, содержащего мальтозу смешивают с 63,7 г формирующего компонента основы - масла какао. Получают композицию, содержащую 5,00 масс. % действующего вещества, а остальное основа. Суппозитории массой по 3,00 г из полученной композиции получают методом ручного формирования.To obtain a composition, 11.3 g of a lyophilisate containing maltose is mixed with 63.7 g of a forming base component - cocoa butter. Get a composition containing 5.00 mass. % of the active substance, and the rest is the basis. Suppositories weighing 3.00 g from the resulting composition are prepared by hand forming.

Больной М., 62 года. Диагноз: хронический геморрой, стадия обострения. Больному вводили по 1 суппозиторию в прямую кишку 2 раза в день в течение 7 дней. На 4-й день после начала лечения отмечено значительное улучшение состояния - кровотечение прекратилось, уменьшились боли и зуд в области заднего прохода. К концу курса лечения геморроидальный узел значительно уменьшился в размерах, воспаление было практически ликвидировано.Patient M., 62 years old. Diagnosis: chronic hemorrhoids, exacerbation stage. The patient was injected 1 suppository into the rectum 2 times a day for 7 days. On the 4th day after the start of treatment, a significant improvement was noted - bleeding stopped, pain and itching in the anus decreased. By the end of the course of treatment, the hemorrhoid had significantly decreased in size, the inflammation was practically eliminated.

Результаты опыта показывают, что полученная композиция может быть использована для лечения проктологического заболевания, сопровождающегося окислительным стрессом.The results of the experiment show that the obtained composition can be used for the treatment of proctological diseases accompanied by oxidative stress.

Пример 3.Example 3.

Используемую в примере композицию получают следующим образом. В пластиковую емкость объемом 7000 мл помещают 1800 мл раствора СОД с концентрацией 10,00 мг/мл в буферном растворе, содержащем гидрофосфат натрия и дигидрофосфат натрия с концентрациями 0,58 мг/мл и 0,04 мг/мл соответственно, с рН 8 с добавлением NaCl с концентрацией 150 мМ, затем туда при перемешивании по каплям добавляют 970 мл раствора поликатиона полиаргинина с концентрацией 10,00 мг/мл в вышеописанном буферном растворе, что соответствует 65,6 ммолям аминогрупп протамина, и полученную смесь выдерживают в течение 40 мин при перемешивании. После этого в полученный раствор при перемешивании по каплям добавляют 1070 мл раствора полианиона блок-сополимера ПГ-ПЭГ с концентрацией 10,00 мг/мл в вышеописанном буферном растворе, и полученную смесь при перемешивании выдерживают в течение 40 мин при 8°С. Затем в полученную смесь при перемешивании по каплям добавляют 1800 мл свежеприготовленного водного раствора глутарового альдегида с концентрацией 0,5% по объему (98,4 ммоль), что соответствует мольному соотношению с аминогруппами поликатиона 1,5, и полученную смесь выдерживают в течение 12 ч при 8°С. После этого в вышеуказанную смесь при перемешивании по каплям добавляют 200 мл свежеприготовленного водного раствора боргидрида натрия с концентрацией 2,00 мг/мл. Для очистки суспензии полученных частиц от побочных продуктов и не вступивших в реакцию реагентов в пробирки центрифуги помещают фильтр с ультрафильтрационной мембраной с пределом пропускания 100 кДа, затем фильтр вначале заполняют 5 мл полученной суспензии частиц, после чего туда добавляют 10 мл дистиллированной воды, пробирки с фильтром помещают в центрифугу и проводят центрифугирование в течение 12 мин при скорости вращения ротора центрифуги 3500 об/мин. После этого в пробирки повторно добавляют 10 мл дистиллированной воды, снова помещают в центрифугу и проводят повторное центрифугирование, затем снова добавляют 10 мл дистиллированной воды и осуществляют третье центрифугирование. Находящуюся над фильтром очищенную суспензию переносят в пластиковую пробирку и хранят при 8°С.Used in the example, the composition is prepared as follows. 1800 ml of SOD solution with a concentration of 10.00 mg / ml in a buffer solution containing sodium hydrogen phosphate and sodium dihydrogen phosphate with concentrations of 0.58 mg / ml and 0.04 mg / ml, respectively, with a pH of 8 s are placed in a plastic container with a volume of 7000 ml. by adding NaCl with a concentration of 150 mM, then 970 ml of a solution of polyarginine polycation with a concentration of 10.00 mg / ml in the above buffer solution, which corresponds to 65.6 mmol of amino groups of protamine, is added thereto with stirring, and the resulting mixture is kept for 40 min at stirring. Thereafter, 1070 ml of a solution of a polyanion of a block copolymer PG-PEG with a concentration of 10.00 mg / ml in the above-described buffer solution is added dropwise to the resulting solution with stirring, and the resulting mixture is kept with stirring for 40 minutes at 8 ° C. Then, 1800 ml of a freshly prepared aqueous solution of glutaraldehyde with a concentration of 0.5% by volume (98.4 mmol), which corresponds to the molar ratio with the amino groups of the polycation 1.5, is added dropwise to the resulting mixture with stirring, and the resulting mixture is kept for 12 hours at 8 ° C. Thereafter, 200 ml of a freshly prepared aqueous solution of sodium borohydride with a concentration of 2.00 mg / ml is added dropwise to the above mixture with stirring. To clean the suspension of the obtained particles from by-products and unreacted reagents, a filter with an ultrafiltration membrane with a transmission limit of 100 kDa is placed in the centrifuge tubes, then the filter is first filled with 5 ml of the resulting suspension of particles, after which 10 ml of distilled water are added there, tubes with a filter placed in a centrifuge and centrifuged for 12 minutes at a centrifuge rotor speed of 3500 rpm. After that, 10 ml of distilled water is re-added to the tubes, again placed in a centrifuge and re-centrifugation is carried out, then 10 ml of distilled water is added again and the third centrifugation is carried out. The purified suspension above the filter is transferred into a plastic tube and stored at 8 ° C.

В итоге получают 2500 мл суспензии частиц, у которых ядро из СОД покрыто внутренней оболочкой из полиаргинина и внешней оболочкой из блок-СПЛ. Диаметр полученных частиц, определенный методом динамического светорассеяния, составляет 196 нм. Активность СОД у частиц в полученной суспензии составляет 26200±1000 Ед/мл. Суммарный выход СОД по активности у частиц равен 47%.As a result, 2500 ml of a suspension of particles are obtained, in which the SOD core is covered with an inner shell of polyarginine and an outer shell of block SPL. The diameter of the resulting particles, determined by dynamic light scattering, is 196 nm. The SOD activity of the particles in the resulting suspension is 26200 ± 1000 U / ml. The total yield of SOD in terms of the activity of particles is 47%.

Лиофильную сушку, полученной суспензии частиц аналогично примеру 1, однако не используют стабилизатор.Freeze drying of the resulting suspension of particles analogously to example 1, however, no stabilizer is used.

После хранения в течение одного года в морозильной камере при -18°С активность СОД у частиц снижалась на 9%, а размер частиц в суспензии после диспергирования лиофилизата практически не изменился.After storage for one year in a freezer at -18 ° C, the SOD activity of the particles decreased by 9%, and the particle size in the suspension after dispersing the lyophilisate practically did not change.

Для получения композиции 15,0 г лиофилизата смешивают с 60,0 г основы, включающей в себя 15,0 г полиэтиленоксида 400 и 45,0 г полиэтиленоксида 1500. Получают композицию, в которой масс. % действующего вещества равен 20,00, а остальное основа. Из полученной композиции формируют суппозитории массой 3,0 г.To obtain a composition, 15.0 g of a lyophilisate is mixed with 60.0 g of a base comprising 15.0 g of polyethylene oxide 400 and 45.0 g of polyethylene oxide 1500. A composition is obtained in which the mass. % of the active substance is 20.00, and the rest is base. The resulting composition is used to form suppositories weighing 3.0 g.

Больная Л., 41 год. Диагноз: острый вульвит. Больной вводили по 1 суппозиторию 2 раза в день в течение 10 дней. На 4-й день после начала лечения наблюдали значительное улучшение состояния - отмечено значительное уменьшение боли, зуда и чувства жжения, констатировали уменьшение отечности и гиперемии наружных половых органов и слизистой влагалища.Patient L., 41 years old. Diagnosis: acute vulvitis. The patient was administered 1 suppository 2 times a day for 10 days. On the 4th day after the start of treatment, a significant improvement in the condition was observed - a significant decrease in pain, itching and burning sensation was noted, a decrease in edema and hyperemia of the external genital organs and vaginal mucosa was noted.

Результаты опыта показывают, что полученная композиция может быть использована для лечения гинекологического заболевания, сопровождающегося окислительным стрессом.The results of the experiment show that the obtained composition can be used for the treatment of gynecological diseases accompanied by oxidative stress.

Пример 4.Example 4.

Используемую в примере композицию получают следующим образом. Опыт проводят аналогично примеру 1, однако в качестве полианиона используют блок-сополимер ПА - ПГ.Used in the example, the composition is prepared as follows. The experiment is carried out analogously to example 1, however, a block copolymer PA - PG is used as a polyanion.

Диаметр полученных частиц, определенный методом динамического светорассеяния, составляет 153 нм. Активность СОД у частиц в полученной суспензии равна 13500±1000 Ед/мл. Суммарный выход СОД по активности у частиц составляет 52%. После хранения лиофилизата в течение одного года в морозильной камере при -18°С активность СОД у частиц снижалась на 7%, а размер частиц в суспензии после диспергирования лиофилизата в воде практически не изменился.The diameter of the obtained particles, determined by the method of dynamic light scattering, is 153 nm. The SOD activity of the particles in the resulting suspension is 13500 ± 1000 U / ml. The total yield of SOD in terms of the activity of particles is 52%. After storing the lyophilisate for one year in a freezer at -18 ° C, the SOD activity of the particles decreased by 7%, and the particle size in the suspension after dispersing the lyophilisate in water practically did not change.

Из полученного лиофилизата готовят суппозитории (свечи) аналогично примеру 1.From the resulting lyophilisate, suppositories (suppositories) are prepared analogously to example 1.

Больная Т. 45 лет. Обратилась с жалобами на частое болезненное мочеиспускание, зуд и жжение в области гениталий, тянущие боли в промежности. Диагноз: хронический рецидивирующий цервицит, период обострения. Было назначено лечение предлагаемыми суппозиториями по 1 суппозиторию 2 раза в день в течение 7 дней. Спустя 2 дня было отмечено значительное уменьшение боли и чувства жжения. При повторном осмотре очаг воспалительного процесса значительно уменьшился. Назначено лечение в течение еще 5 дней, по истечении которых пациент полностью вылечился.Patient T., 45 years old. She complained of frequent painful urination, itching and burning in the genital area, pulling pains in the perineum. Diagnosis: chronic recurrent cervicitis, exacerbation period. Treatment with the proposed suppositories was prescribed, 1 suppository 2 times a day for 7 days. After 2 days, a significant reduction in pain and burning sensation was noted. On re-examination, the focus of the inflammatory process decreased significantly. Treatment was prescribed for another 5 days, after which the patient was completely cured.

Результаты опыта показывают, что полученная композиция может быть использованы для лечения гинекологического заболевания, сопровождающегося окислительным стрессом.The results of the experiment show that the obtained composition can be used for the treatment of gynecological diseases accompanied by oxidative stress.

Пример 5.Example 5.

Используемую в примере композицию получают следующим образом. Опыт проводят аналогично примеру 2, однако в качестве полианиона используют блок-сополимер ПА - ПГ.Used in the example, the composition is prepared as follows. The experiment is carried out analogously to example 2, however, a block copolymer PA - PG is used as a polyanion.

Диаметр полученных частиц, определенный методом динамического светорассеяния, составляет 118 нм. Активность СОД у частиц в полученной суспензии равна 7200±1000 Ед/мл. Суммарный выход СОД по активности у частиц составляет 47%. После хранения лиофилизата в течение одного года в морозильной камере при -18°С активность СОД у частиц снижалась на 6%, а размер частиц в суспензии после диспергирования лиофилизата в воде практически не изменился.The diameter of the obtained particles, determined by dynamic light scattering, is 118 nm. The SOD activity of the particles in the resulting suspension is 7200 ± 1000 U / ml. The total yield of SOD for the activity of particles is 47%. After storing the lyophilisate for one year in a freezer at -18 ° C, the SOD activity of the particles decreased by 6%, and the particle size in the suspension after dispersing the lyophilisate in water practically did not change.

Из полученного лиофилизата готовят суппозитории (свечи) аналогично примеру 2.From the obtained lyophilisate, suppositories (suppositories) are prepared analogously to example 2.

Больная К, 49 лет. Диагноз: вагинит, вызванный смешанной инфекцией. Было назначено лечение предлагаемыми суппозиториями по 1 суппозиторию 2 раза в день в течение 7 дней. При повторном осмотре воспаление отсутствовало, наблюдалось улучшение клинической картины.Patient K, 49 years old. Diagnosis: vaginitis caused by mixed infection. Treatment with the proposed suppositories was prescribed, 1 suppository 2 times a day for 7 days. On repeated examination, there was no inflammation, an improvement in the clinical picture was observed.

Результаты опыта показывают, что полученная композиция может быть использована для лечения гинекологического заболевания, сопровождающегося окислительным стрессом.The results of the experiment show that the obtained composition can be used for the treatment of gynecological diseases accompanied by oxidative stress.

Пример 6.Example 6.

Используемую в примере композицию получают следующим образом. Опыт проводят аналогично примеру 3, однако в качестве полианиона используют блок-сополимер ПА - ПГ.Used in the example, the composition is prepared as follows. The experiment is carried out analogously to example 3, however, a block copolymer PA - PG is used as the polyanion.

Диаметр полученных частиц, определенный методом динамического светорассеяния, составляет 186 нм. Активность СОД у частиц в полученной суспензии равна 24900±1000 Ед/мл. Суммарный выход СОД по активности у частиц составляет 49%. После хранения лиофилизата в течение одного года в морозильной камере при -18°С активность СОД у частиц снижалась на 5%, а размер частиц в суспензии после диспергирования лиофилизата в воде практически не изменился.The diameter of the obtained particles, determined by the method of dynamic light scattering, is 186 nm. The SOD activity of the particles in the resulting suspension is 24900 ± 1000 U / ml. The total yield of SOD in terms of the activity of particles is 49%. After storing the lyophilisate for one year in a freezer at -18 ° C, the SOD activity in the particles decreased by 5%, and the particle size in the suspension after dispersing the lyophilisate in water practically did not change.

Из полученного лиофилизата готовят суппозитории (свечи) аналогично примеру 3.From the obtained lyophilisate, suppositories (suppositories) are prepared analogously to example 3.

Больной Д., 56 лет. Диагноз: поверхностный проктит. Больному вводили по 1 суппозиторию 2 раза в день в течение 10 дней. В конце курса лечения наблюдалось купирование воспалительных процессов в тканях, уменьшение явления отека, исчезновение болевого синдрома, зуда, а также уменьшение отечности.Patient D., 56 years old. Diagnosis: superficial proctitis. The patient was administered 1 suppository 2 times a day for 10 days. At the end of the course of treatment, there was a relief of inflammatory processes in the tissues, a decrease in the phenomenon of edema, the disappearance of pain, itching, and a decrease in edema.

Результаты опыта показывают, что полученная композиция может быть использована для лечения гинекологического заболевания, сопровождающегося окислительным стрессом.The results of the experiment show that the obtained composition can be used for the treatment of gynecological diseases accompanied by oxidative stress.

Приведенные выше примеры показывают, что предлагаемая композиция может быть использована для эффективного лечения различных гинекологических и проктологических заболеваний, сопровождающихся окислительным стрессом. Ниже приведены примеры, которые подтверждают достижение вышеуказанного технического результата при использовании предлагаемой композиции.The above examples show that the proposed composition can be used for effective treatment of various gynecological and proctological diseases accompanied by oxidative stress. Below are examples that confirm the achievement of the above technical result when using the proposed composition.

Пример 7 (контрольный, по прототипу)Example 7 (control, prototype)

Для получения суппозиторий на основе описанной в прототипе композиции предварительно готовят основу. Для этого взвешивают 20 г масла какао, помещают в емкость для плавления основы и расплавляют в течение 20 мин при 60°С. Затем расплавленную основу охлаждают до 40°С, медленно добавляют в нее 1 г мелкодисперсного порошка ЭМОС и перемешивают до однородной массы, получая композицию с 5%-ным содержанием действующего вещества. Далее для получения суппозиториев композицию разливают в гнезда металлической формы, которую затем охлаждают при 4°С. В итоге одна свеча (суппозиторий) для лечения человека имеет в своем составе 0,15 г действующего вещества (5% по массе) и 2,85 г основы. Суппозитории массой 50 мг для лечения подопытных животных получали аналогичным образом.To obtain a suppository based on the composition described in the prototype, a base is preliminarily prepared. For this, 20 g of cocoa butter are weighed, placed in a vessel for melting the base and melted for 20 minutes at 60 ° C. Then the molten base is cooled to 40 ° C, 1 g of finely dispersed EMOS powder is slowly added to it and mixed until a homogeneous mass, obtaining a composition with a 5% active substance content. Further, to obtain suppositories, the composition is poured into cavities in a metal mold, which is then cooled at 4 ° C. As a result, one candle (suppository) for the treatment of a person contains 0.15 g of the active ingredient (5% by weight) and 2.85 g of the base. Suppositories weighing 50 mg for the treatment of experimental animals were obtained in a similar manner.

Для оценки выхода действующего вещества из композиции с использованием хемилюминесцентного метода проводят забор и анализ секрета слизистых оболочек влагалища до и после введения суппозиторий. Для этого одной группе здоровых людей, состоящих из трех человек, вводят интравагинально суппозитории, полученные с использованием предлагаемой композиции с 5%-ным содержанием действующего вещества, другой группе здоровых людей вводят суппозитории, полученные с использованием известной композиции по прототипу с 5%-ным содержанием действующего вещества - ЭМОС. Выделения отбирают тампоном до введения суппозиториев и через 12, 16, 18 ч после их введения. Спустя 12 ч АОА влаги по отношению к гидроксильному и супероксид радикалам после введения суппозиториев на основе ЭМОС была на 5% больше ее исходного уровня. Спустя 16 и 18 ч АОА влаги соответствовала исходным значениям АОА секрета слизистых оболочек. АОА выделений по отношению к гидроксильному и супероксид радикалам после использования суппозиториев на основе предлагаемой композиции через 12 ч была выше на 40% по сравнению с начальным уровнем, спустя 16 ч АОА превышала исходный уровень на 28%, после 18 ч использования суппозиториев АОА снизилась еще на 8%, и спустя 20 ч достигла исходных значений.To assess the release of the active substance from the composition using the chemiluminescent method, the secretion of the vaginal mucous membranes is collected and analyzed before and after the administration of the suppository. To do this, one group of healthy people, consisting of three people, is administered intravaginally suppositories obtained using the proposed composition with a 5% content of the active substance, another group of healthy people is injected with suppositories obtained using a known composition according to the prototype with a 5% content active substance - EMOS. Allocations are taken with a swab before the administration of suppositories and 12, 16, 18 hours after their administration. After 12 h, the AOA of moisture in relation to hydroxyl and superoxide radicals after administration of suppositories based on EMOS was 5% higher than its initial level. After 16 and 18 h, the moisture AOA corresponded to the initial values of the AOA of the secretion of the mucous membranes. AOA of secretions in relation to hydroxyl and superoxide radicals after using suppositories based on the proposed composition after 12 hours was 40% higher than the initial level, after 16 hours AOA exceeded the initial level by 28%, after 18 hours of using suppositories AOA decreased by another 8%, and after 20 hours reached the initial values.

Таким образом, у суппозиториев на основе предлагаемой композиции выход действующего вещества из композиции достигал 18 ч, тогда как у известной композиции он составлял 12 ч.Thus, for suppositories based on the proposed composition, the yield of the active substance from the composition reached 18 hours, while for the known composition it was 12 hours.

Пример 8Example 8

Оценку эффективности композиции проводили на примере лечения вагинита. Опыт осуществляют на традиционной модели вагинита у крыс по методике, описанной в (патент RU 2428173 C1, А61К 9/02 (2006.01), 2010, см. описание). При этом используют 20 белых беспородных самок крыс массой 190-210 г.Evaluation of the effectiveness of the composition was carried out on the example of the treatment of vaginitis. The experiment is carried out on a traditional model of vaginitis in rats according to the method described in (patent RU 2428173 C1, A61K 9/02 (2006.01), 2010, see description). In this case, 20 white outbred female rats weighing 190-210 g are used.

Вагинит моделируют путем однократной внутривлагалищной аппликации ирританта (раздражителя), в качестве которого применяют комбинацию живичного скипидара с диметилсульфоксидом в массовом соотношении 1:1 в дозе 0,5 мл/100 г массы тела животного. Через 24 ч после введения ирританта начинают лечение животных. Суппозитории вводят во влагалище 2 раза в сутки в течение 7 дней. Животных предварительно делят на четыре экспериментальные группы: первая группа - животные без лечения, вторая группа - животные, которым вводят суппозитории, полученные с использованием описанной в прототипе композиции с 5%-ным содержанием ЭМОС, третья группа - животные, которым вводят суппозитории, полученные с использованием заявляемой композиции с 5%-ным содержанием частиц, четвертая группа - интактные (здоровые) крысы.Vaginitis is modeled by a single intravaginal application of an irritant (irritant), which is a combination of gum turpentine with dimethyl sulfoxide in a mass ratio of 1: 1 at a dose of 0.5 ml / 100 g of animal body weight. Treatment of animals is started 24 hours after the administration of the irritant. Suppositories are injected into the vagina 2 times a day for 7 days. The animals are preliminarily divided into four experimental groups: the first group - animals without treatment, the second group - animals that are injected with suppositories obtained using the composition described in the prototype with a 5% EMOS content, the third group - animals that are injected with suppositories obtained with using the claimed composition with a 5% content of particles, the fourth group - intact (healthy) rats.

Регистрируют динамику воспалительного процесса на 1-е, 3-й и 7-е сутки после аппликации ирританта. Кроме того, отслеживают поведение и общее состояние животных. Учитывают степень выраженности местной гиперемии в баллах: 0 баллов - видимая слизистая влагалища и кожа вокруг влагалища без изменений; 1 балл - легкая гиперемия видимой слизистой влагалища; 2 балла - выраженная гиперемия слизистой влагалища и кожи; 3 балла - выраженная гиперемия слизистой влагалища и признаки самоповреждения кожи. Также учитывают степень обильности выделений из влагалища в баллах: 0 баллов - выделений нет; 1 балл - слабые выделения при надавливании тампоном; 2 балла - умеренные выделения, смочена кожа вокруг влагалища; 3 балла - обильные выделения, смочена кожа вокруг влагалища и подстилка. В те же сроки оценивают гематологические маркеры воспалительного процесса - содержание лейкоцитов в крови у подопытных крыс и скорость оседания эритроцитов (СОЭ).The dynamics of the inflammatory process is recorded on the 1st, 3rd and 7th days after the application of the irritant. In addition, the behavior and general condition of the animals are monitored. The severity of local hyperemia in points is taken into account: 0 points - visible mucous membrane of the vagina and the skin around the vagina without changes; 1 point - slight hyperemia of the visible vaginal mucosa; 2 points - severe hyperemia of the vaginal mucosa and skin; 3 points - severe hyperemia of the vaginal mucosa and signs of self-harm of the skin. Also take into account the degree of abundance of vaginal discharge in points: 0 points - no discharge; 1 point - weak discharge when pressed with a tampon; 2 points - moderate discharge, the skin around the vagina is moistened; 3 points - profuse discharge, the skin around the vagina and the litter are moistened. At the same time, hematological markers of the inflammatory process are assessed - the content of leukocytes in the blood of experimental rats and the erythrocyte sedimentation rate (ESR).

У животных из всех экспериментальных групп через 24 ч после введения ирританта наблюдали выраженное беспокойство, выделения из влагалища и гиперемию видимой слизистой оболочки влагалища.In animals from all experimental groups, 24 hours after the administration of the irritant, severe anxiety, vaginal discharge and hyperemia of the visible vaginal mucosa were observed.

В первые сутки после моделирования вагинита животные из трех первых групп проявляли беспокойство, повышенную реакцию на внешние раздражители. У них наблюдали серозно-слизистые выделения из влагалища. Отклонения в поведении животных постепенно уменьшались к 3-у дню эксперимента.On the first day after modeling vaginitis, animals from the first three groups showed anxiety, increased reaction to external stimuli. They observed a serous-mucous discharge from the vagina. Deviations in the behavior of animals gradually decreased by the 3rd day of the experiment.

На 3-й сутки, в первой контрольной группе, состоящей из не получавших лечение крыс, не отмечалось положительной динамики, наблюдали гиперемию слизистой влагалища и умеренные выделения. В группах крыс, получавших суппозитории на основе ЭМОС и суппозитории на основе предлагаемой композиции, отмечали значительное снижение лейкоцитов в крови животных по сравнению с первыми сутками с начала лечения. Однако в группе животных, получавших суппозитории на основе ЭМОС, наблюдали выраженную гиперемию влагалища, и животные проявляли беспокойство.On the 3rd day, in the first control group, which consisted of untreated rats, no positive dynamics was observed, hyperemia of the vaginal mucosa and moderate discharge were observed. In groups of rats that received suppositories based on EMOS and suppositories based on the proposed composition, a significant decrease in leukocytes in the blood of animals was noted as compared to the first days from the beginning of treatment. However, in the group of animals that received suppositories based on EMOS, pronounced vaginal hyperemia was observed, and the animals showed anxiety.

На 7-е сутки в группе животных, получавших суппозитории на основе предлагаемой композиции, наблюдали значимое снижение общего количества лейкоцитов в крови, которое достигло значений, соответствующих группе интактных (здоровых) крыс, что свидетельствовало об успешном излечении заболевания, а также значения СОЭ у них не отличалась от изначального показателя и гиперемию не наблюдали. В группе животных, получавших суппозитории на основе ЭМОС, наблюдали легкую гиперемию влагалища. При этом общее количество лейкоцитов в крови хоть и снизилось, но не достигло начальных показателей, соответствующих группе интактных крыс, что свидетельствовало о продолжении воспалительного процесса.On the 7th day, in the group of animals receiving suppositories based on the proposed composition, a significant decrease in the total number of leukocytes in the blood was observed, which reached values corresponding to the group of intact (healthy) rats, which indicated a successful cure of the disease, as well as the ESR values in them did not differ from the initial indicator and hyperemia was not observed. In the group of animals that received suppositories based on EMOS, a slight hyperemia of the vagina was observed. At the same time, the total number of leukocytes in the blood, although it decreased, did not reach the initial values corresponding to the group of intact rats, which indicated the continuation of the inflammatory process.

Результаты опыта показывают, что композиция, в которой в качестве действующего вещества содержатся частицы СОД, обладает большей эффективностью при лечении воспалительных заболеваний по сравнению с композицией на основе ЭМОС.The results of the experiment show that the composition, which contains SOD particles as the active substance, is more effective in the treatment of inflammatory diseases in comparison with the composition based on EMOS.

Таким образом, из приведенных примеров видно, что предлагаемая композиция может быть использована для лечения гинекологических и проктологических заболеваний, сопровождающихся окислительным стрессом. При этом предлагаемая композиция по сравнению с прототипом действительно более эффективна при лечении воспалительных заболеваний и у нее продолжительность выхода действующего вещества из композиции повышается с 12 до 18 ч.Thus, from the above examples it can be seen that the proposed composition can be used for the treatment of gynecological and proctological diseases accompanied by oxidative stress. At the same time, the proposed composition compared to the prototype is indeed more effective in the treatment of inflammatory diseases and its duration of the release of the active substance from the composition increases from 12 to 18 hours.

Claims (2)

Композиция для лечения гинекологических и проктологических заболеваний, сопровождающихся окислительным стрессом, состоящая из антиоксидантного действующего вещества и основы, отличающаяся тем, что в качестве действующего вещества она содержит частицы, полученные путем смешения буферных растворов антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы в концентрации 2,5-10,0 мг/мл и поликатиона в концентрации 2,5-10,0 мг/мл, где поликатион выбирают из группы, включающей протамин, полилизин и полиаргинин, перемешивания и выдерживания смеси с последующими добавлением в нее буферного раствора полианиона в концентрации 2,5-10,0 мг/мл, где полианион представляет собой блок-сополимер полиглутаминовой кислоты и полиэтиленгликоля или блок-сополимер полиаспарагиновой кислоты и полиэтиленгликоля, перемешиванием и выдерживанием полученной смеси, добавлением в нее водного раствора глутарового альдегида, взятого в количестве, обеспечивающем его мольное соотношение с аминогруппами поликатиона 0,3-1,5, выдерживанием смеси, добавлением в смесь водного раствора боргидрида натрия в концентрации 1-2 мг/мл, очисткой смеси с использованием мембранной фильтрующей системы с пределом пропускания 90-130 килодальтон, лиофильной сушкой очищенной смеси и смешением лиофилизата с основой, при следующем соотношении компонентов, мас. %:Composition for the treatment of gynecological and proctological diseases accompanied by oxidative stress, consisting of an antioxidant active substance and a base, characterized in that as an active substance it contains particles obtained by mixing buffer solutions of the antioxidant enzyme superoxide dismutase at a concentration of 2.5-10.0 mg / ml and polycation at a concentration of 2.5-10.0 mg / ml, where the polycation is selected from the group including protamine, polylysine and polyarginine, stirring and maintaining the mixture, followed by adding a buffer solution of polyanion at a concentration of 2.5-10, 0 mg / ml, where the polyanion is a block copolymer of polyglutamic acid and polyethylene glycol or a block copolymer of polyaspartic acid and polyethylene glycol, stirring and maintaining the resulting mixture, adding an aqueous solution of glutaraldehyde, taken in an amount that provides its molar ratio with the amino groups of the polycation 0.3-1.5, withstanding mixing the mixture, adding an aqueous solution of sodium borohydride to the mixture at a concentration of 1-2 mg / ml, purifying the mixture using a membrane filter system with a transmission limit of 90-130 kilodaltons, freeze drying of the purified mixture and mixing the lyophilisate with the base, with the following ratio of components, wt ... %: Действующее веществоActive substance 0,01-20,000.01-20.00 ОсноваThe basis остальноеrest