RU2731896C1 - Test system for analysing functional activity of antibodies against pd-1 and antibodies against pd-l1 - Google Patents

Test system for analysing functional activity of antibodies against pd-1 and antibodies against pd-l1 Download PDF

Info

Publication number
RU2731896C1
RU2731896C1 RU2019120893A RU2019120893A RU2731896C1 RU 2731896 C1 RU2731896 C1 RU 2731896C1 RU 2019120893 A RU2019120893 A RU 2019120893A RU 2019120893 A RU2019120893 A RU 2019120893A RU 2731896 C1 RU2731896 C1 RU 2731896C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
antibody
test system
cells
functional activity
antibodies against
Prior art date
Application number
RU2019120893A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Александр Николаевич Доронин
Александр Андреевич Гордеев
Валерий Владимирович Соловьев
Юрий Иванович Басовский
Алексей Евгеньевич Козлов
Яна Андреевна Смирнова
Мария Юрьевна Пучкова
Виктория Михайловна Екимова
Роман Алексеевич Иванов
Дмитрий Валентинович Морозов
Original Assignee
Закрытое Акционерное Общество "Биокад"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Закрытое Акционерное Общество "Биокад" filed Critical Закрытое Акционерное Общество "Биокад"
Priority to RU2019120893A priority Critical patent/RU2731896C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2731896C1 publication Critical patent/RU2731896C1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5041—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects involving analysis of members of signalling pathways
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

FIELD: biotechnology.
SUBSTANCE: invention relates to the field of biotechnology. Disclosed is a group of inventions comprising a test system for analysing the functional activity of the anti-PD-1 antibody or the anti-PD-L1 antibody (embodiments), kit containing said test system, using a test system for analysing functional activity of the anti-PD-1 antibody or the anti-PD-L1 antibody, using a kit for analysing the functional activity of the anti-PD-1 antibody or the anti-PD-L1 antibody, a method for analysing the functional activity of the anti-PD-1 antibody or the anti-PD-L1 antibody. Method for determining functional activity of an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody. In one embodiment, the test system comprises effector reporter cells having on their surface a functional CD3 complex, PD-1 and containing a reporter gene under the control of a CD3-dependent promoter, target cells representing on their surface PD-L1, an activator of the CD3-dependent signalling cascade, where the activator of the CD3-dependent signalling cascade is a bispecific antibody capable of binding to the CD3 complex.
EFFECT: invention extends the range of means for analysing the functional activity of the anti-PD-1 antibody or the anti-PD-L1 antibody.
16 cl, 12 dwg, 8 ex

Description

Область техники, к которой относится изобретениеThe technical field to which the invention relates

Изобретение относится к области биотехнологии и биоинженерии, в частности к тест-системам и их применению для анализа функциональной активности антител против PD-1 (aPD-1) и антител против PD-L1 (aPD-L1).The invention relates to the field of biotechnology and bioengineering, in particular to test systems and their use for analyzing the functional activity of antibodies against PD-1 (aPD-1) and antibodies against PD-L1 (aPD-L1).

Уровень техникиState of the art

Одним из наиболее перспективных подходов к активации терапевтического противоопухолевого иммунитета является блокада ингибиторных иммунных контрольных точек. Ингибиторные иммунные контрольные точки – это система механизмов, которые регулируют активацию иммунного ответа, препятствуя запуску аутоиммунных процессов, а также модулируют его, уменьшая вызванные иммунными клетками повреждения в органах и тканях. Опухолевые клетки могут использовать такие контрольные точки для предотвращения активации опухоль-специфических лимфоцитов, таким образом, приобретая устойчивость к действию иммунной системы. Поскольку многие из иммунных контрольных точек инициируются лиганд-рецепторными взаимодействиями, они могут блокироваться агентами, которые ингибируют эти взаимодействия. Одним из примеров таких агентов являются антитела против PD-1 (рецептор запрограммированной клеточной смерти 1) или антитела против PD-L1 (лиганда рецептора запрограммированной клеточной смерти 1). One of the most promising approaches to the activation of therapeutic antitumor immunity is the blockade of inhibitory immune checkpoints. Inhibitory immune checkpoints are a system of mechanisms that regulate the activation of the immune response, preventing the triggering of autoimmune processes, and modulating it, reducing damage caused by immune cells in organs and tissues. Tumor cells can use such checkpoints to prevent the activation of tumor-specific lymphocytes, thus gaining resistance to the action of the immune system. Since many of the immune checkpoints are initiated by ligand-receptor interactions, they can be blocked by agents that inhibit these interactions. One example of such agents are antibodies against PD-1 (programmed cell death receptor 1) or antibodies against PD-L1 (programmed cell death receptor 1 ligand).

PD-1 – белок, присутствующий преимущественно на активированных T-лимфоцитах. Взаимодействие PD-1+ (PD-1-положительных) лимфоцитов с клетками, несущими его природные лиганды PD-L1 или PD-L2 (лиганды рецептора запрограммированной клеточной смерти 1 и 2), блокирует активацию лимфоцитов (Freeman, G.J., Long, A.J., Iwai, Y., Bourque, K., Chernova, T., Nishimura, H., Fitz, L.J., Malenkovich, N., Okazaki, T., Byrne, M.C., Horton, H.F., Fouser, L., Carter, L., Ling, V., Bowman, M.R., Carreno, B.M., Collins, M., Wood, C.R., Honjo, T. (2000) Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation, J. Exp. Med., 192, 1027–1034, doi: 10.1084/jem.192.7.1027; Latchman, Y., Wood, C.R., Chernova, T., Chaudhary, D., Borde, M., Chernova, I., Iwai, Y., Long, A.J., Brown, J.A., Nunes, R., Greenfield, E.A., Bourque, K., Boussiotis, V.A., Carter, L.L., Carreno, B.M., Malenkovich, N., Nishimura, H., Okazaki, T., Honjo, T., Sharpe, A.H., Freeman, G.J. (2001) PD-L2 is a second ligand for PD-1 and inhibits T cell activation, Nat. Immunol., 2, 261–268, doi: 10.1038/85330). Это происходит вследствие образования комплекса PD-1 со своим лигандом, что вызывает ингибирование CD3-зависимой активации Т-лимфоцита (Sheppard, K.A., Fitz, L.J., Lee, J.M., Benander, C., George, J.A., Wooters, J., Qiu, Y., Jussif, J.M., Carter, L.L., Wood, C.R., Chaudhary, D. (2004) PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta, FEBS Lett., 547, 37–41, doi: 10.1016/j.febslet.2004.07.083). Известны белки, с которыми взаимодействует PD-1, и сигнальные каскады, на которые он влияет, но последовательность молекулярных взаимодействий, определяющих его активность, четко не определена (Bardhan, K., Anagnostou, T., Boussiotis, V.A. (2016) The PD1 : PD-L1/2 Pathway from Discovery to Clinical Implementation, Front. Immunol., 7, 550, doi: 10.3389/fimmu.2016.00550; Arasanz, H., Gato-Canas, M., Zuazo, M., Ibanez-Vea, M., Breckpot, K., Kochan, G., Escors, D. (2017) PD1 signal transduction pathways in T cells, Oncotarget, 8, 51936–51945, doi: 10.18632/oncotarget.17232). Такой механизм ингибирования иммунного ответа служит защитой от чрезмерной активации Т-лимфоцитов и развития аутоиммунных реакций, но в то же время может препятствовать развитию иммунного ответа на опухолевые клетки (Alsaab, H.O., Sau, S., Alzhrani, R., Tatiparti, K., Bhise, K., Kashaw, S.K., Iyer, A.K. (2017) PD-1 and PD-L1 Checkpoint Signaling Inhibition for Cancer Immunotherapy: Mechanism, Combinations, and Clinical Outcome, Front. Pharmacol., 8, 561, doi: 10.3389/fphar.2017.00561).PD-1 is a protein predominantly present on activated T lymphocytes. Interaction of PD-1 + (PD-1-positive) lymphocytes with cells carrying its natural ligands PD-L1 or PD-L2 (ligands of the programmed cell death receptor 1 and 2), blocks the activation of lymphocytes (Freeman, GJ, Long, AJ, Iwai, Y., Bourque, K., Chernova, T., Nishimura, H., Fitz, LJ, Malenkovich, N., Okazaki, T., Byrne, MC, Horton, HF, Fouser, L., Carter, L ., Ling, V., Bowman, MR, Carreno, BM, Collins, M., Wood, CR, Honjo, T. (2000) Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation, J. Exp. Med., 192, 1027–1034, doi: 10.1084 / jem.192.7.1027; Latchman, Y., Wood, CR, Chernova, T., Chaudhary, D., Borde, M., Chernova, I., Iwai, Y., Long, AJ, Brown, JA, Nunes, R., Greenfield, EA, Bourque, K., Boussiotis, VA, Carter, LL, Carreno, BM, Malenkovich, N., Nishimura , H., Okazaki, T., Honjo, T., Sharpe, AH, Freeman, GJ (2001) PD-L2 is a second ligand for PD-1 and inhibits T cell activation, Nat. Immunol., 2, 26 1-268, doi: 10.1038 / 85330). This is due to the formation of a complex of PD-1 with its ligand, which causes inhibition of CD3-dependent T-lymphocyte activation (Sheppard, KA, Fitz, LJ, Lee, JM, Benander, C., George, JA, Wooters, J., Qiu , Y., Jussif, JM, Carter, LL, Wood, CR, Chaudhary, D. (2004) PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70 / CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta, FEBS Lett., 547 , 37–41, doi: 10.1016 / j.febslet.2004.07.083). The proteins with which PD-1 interacts and the signaling cascades that it affects are known, but the sequence of molecular interactions that determine its activity is not clearly defined (Bardhan, K., Anagnostou, T., Boussiotis, VA (2016) The PD1 : PD-L1 / 2 Pathway from Discovery to Clinical Implementation, Front.Immunol., 7, 550, doi: 10.3389 / fimmu.2016.00550; Arasanz, H., Gato-Canas, M., Zuazo, M., Ibanez-Vea , M., Breckpot, K., Kochan, G., Escors, D. (2017) PD1 signal transduction pathways in T cells, Oncotarget, 8, 51936-51945, doi: 10.18632 / oncotarget.17232). This mechanism of inhibition of the immune response protects against excessive activation of T-lymphocytes and the development of autoimmune reactions, but at the same time, it can prevent the development of an immune response to tumor cells (Alsaab, HO, Sau, S., Alzhrani, R., Tatiparti, K. , Bhise, K., Kashaw, SK, Iyer, AK (2017) PD-1 and PD-L1 Checkpoint Signaling Inhibition for Cancer Immunotherapy: Mechanism, Combinations, and Clinical Outcome, Front.Pharmacol., 8, 561, doi: 10.3389 /fphar.2017.00561).

Блокирование взаимодействия PD-1/PD-L1, но не PD-1/PD-L2 с целью отмены негативной иммунной регуляции является одной из наиболее успешных стратегий борьбы с рядом онкологических заболеваний. В 2014 году были зарегистрированы первые терапевтические антитела против PD-1, в 2016 – против PD-L1 (Gong. J., Chehrazi-Raffle, A., Reddi, S., Salgia, R. (2018) Development of PD-1 and PD-L1 inhibitors as a form of cancer immunotherapy: a comprehensive review of registration trials and future considerations, J. Immunother. Cancer, 6, 8, doi: 10.1186/s40425-018-0316-z). К концу 2018 года зарегистрировано более 2000 клинических исследований препаратов, блокирующих взаимодействие PD-1/PD-L1 (Tang, J., Yu, J.X., Hubbard-Lucey, V.M., Neftelinov, S.T., Hodge, J.P., Lin, Y. (2018) Trial watch: The clinical trial landscape for PD1/PDL1 immune checkpoint inhibitors, Nat. Rev. Drug Discov., 17, 854–855, doi: 10.1038/nrd.2018.210).Blocking the PD-1 / PD-L1, but not PD-1 / PD-L2 interaction in order to reverse the negative immune regulation is one of the most successful strategies in the fight against a number of cancers. In 2014, the first therapeutic antibodies against PD-1 were registered, in 2016 - against PD-L1 (Gong. J., Chehrazi-Raffle, A., Reddi, S., Salgia, R. (2018) Development of PD-1 and PD-L1 inhibitors as a form of cancer immunotherapy: a comprehensive review of registration trials and future considerations, J. Immunother. Cancer, 6, 8, doi: 10.1186 / s40425-018-0316-z). By the end of 2018, more than 2000 clinical trials of drugs blocking the PD-1 / PD-L1 interaction were registered (Tang, J., Yu, JX, Hubbard-Lucey, VM, Neftelinov, ST, Hodge, JP, Lin, Y. (2018 ) Trial watch: The clinical trial landscape for PD1 / PDL1 immune checkpoint inhibitors, Nat. Rev. Drug Discov., 17, 854-855, doi: 10.1038 / nrd.2018.210).

Для характеристики терапевтических препаратов необходим метод определения их функциональной активности. Такой метод должен отражать механизм действия и позволять количественно сравнивать препараты между собой (Rockville, M.D. (2012) United States Pharmacopeia and National Formulary (USP 35-NF 30), United States Pharmacopeial Convention, 1032, 5160–5174). To characterize therapeutic drugs, a method for determining their functional activity is required. Such a method should reflect the mechanism of action and allow quantitative comparison of drugs with each other (Rockville, M.D. (2012) United States Pharmacopeia and National Formulary (USP 35-NF 30), United States Pharmacopeial Convention, 1032, 5160-5174).

Из уровня техники известен традиционный метод оценки противоопухолевых эффектов блокады моноклональных антител с использованием моделей животных путем фенотипического анализа опухолевых масс у мышей с опухолями среднего времени выживания, общей выживаемости мышей и т.д. (Lindauer, A., Valiathan, C., Mehta, K., Sriram, V., de Greef, R., Elassaiss-Schaap, J., & de Alwis, D. (2016) Translational Pharmacokinetic/Pharmacodynamic Modeling of Tumor Growth Inhibition Supports Dose-Range Selection of the Anti-PD-1 Antibody Pembrolizumab. CPT: Pharmacometrics & Systems Pharmacology, 6(1), 11–20. doi:10.1002/psp4.12130). Однако, такой анализ требует очень высоких денежных и временных затрат.A conventional method for assessing the antitumor effects of blockade of monoclonal antibodies using animal models by phenotypic analysis of tumor masses in mice with tumors, the average survival time, overall survival of mice, etc., is known from the prior art. (Lindauer, A., Valiathan, C., Mehta, K., Sriram, V., de Greef, R., Elassaiss-Schaap, J., & de Alwis, D. (2016) Translational Pharmacokinetic / Pharmacodynamic Modeling of Tumor Growth Inhibition Supports Dose-Range Selection of the Anti-PD-1 Antibody Pembrolizumab. CPT: Pharmacometrics & Systems Pharmacology, 6 (1), 11–20. Doi: 10.1002 / psp4.12130). However, such an analysis is very costly and time consuming.

Из уровня техники известны методы, основанные на использовании первичных клеток человека (Carven Gregory John, Dulos Gradus Johannes, Elassaiss-Schaap Jeroen (2012), Bioassays for determining PD-1 modulation, WIPO, WO2012018538). Однако, они являются неудобными и плохо воспроизводимыми (Hsieh, Y.T., Aggarwal, P., Cirelli, D., Gu, L., Surowy, T., Mozier, N.M. (2017) Characterization of FcγRIIIA effector cells used in in vitro ADCC bioassay: Comparison of primary NK cells with engineered NK-92 and Jurkat T cells, J. Immunol. Methods, 441, 56–66, doi: 10.1016/j.jim.2016.12.002). Methods based on the use of primary human cells are known in the art (Carven Gregory John, Dulos Gradus Johannes, Elassaiss-Schaap Jeroen (2012), Bioassays for determining PD-1 modulation, WIPO, WO2012018538). However, they are inconvenient and poorly reproducible (Hsieh, YT, Aggarwal, P., Cirelli, D., Gu, L., Surowy, T., Mozier, NM (2017) Characterization of FcγRIIIA effector cells used in vitro ADCC bioassay : Comparison of primary NK cells with engineered NK-92 and Jurkat T cells, J. Immunol. Methods, 441, 56-66, doi: 10.1016 / j.jim.2016.12.002).

Наиболее близкой к заявляемому изобретению является система для определения активности антител против PD-1 или антител против PD-L1, содержащая: (а) эффекторную клетку, представляющую на своей поверхности рецептор иммунной контрольной точки (ICR), Т-клеточный рецептор (TCR) и содержащую репортерный ген; и (b) антигенпрезентирующую клетку, представляющую на своей поверхности активатор Т-клеточного рецептора и лиганд иммунной контрольной точки (ICL); где ICR и ICL образуют комплекс ICR / ICL при взаимодействии. В ней в качестве активатора Т-клеточного рецептора использованы трансмембранные антитела против CD3 (Cong, M., Cheng Z.J., Karassina, N., Grailer, J., Fan, F. (2015) Systems and methods for assessing modulators of immune checkpoints, WIPO, WO2016081854). Однако, в данной системе отсутствует возможность варьирования концентрации активатора TCR для оптимизации системы. Если экспрессия встроенного репортерного гена не удовлетворяет требованиям, то необходимо делать линию антигенпрезентирующих клеток заново, что занимает несколько месяцев и требует дополнительных денежных затрат.Closest to the claimed invention is a system for determining the activity of antibodies against PD-1 or antibodies against PD-L1, containing: (a) an effector cell presenting on its surface the immune checkpoint receptor (ICR), T-cell receptor (TCR) and containing a reporter gene; and (b) an antigen-presenting cell presenting on its surface an activator of a T-cell receptor and an immune checkpoint ligand (ICL); where ICR and ICL form an ICR / ICL complex upon interaction. It uses transmembrane antibodies against CD3 as an activator of the T-cell receptor (Cong, M., Cheng ZJ, Karassina, N., Grailer, J., Fan, F. (2015) Systems and methods for assessing modulators of immune checkpoints, WIPO, WO2016081854). However, this system lacks the ability to vary the concentration of the TCR activator to optimize the system. If the expression of the inserted reporter gene does not meet the requirements, then it is necessary to make the line of antigen-presenting cells again, which takes several months and requires additional money.

Таким образом, целью данной работы стала разработка новой эффективной системы тестирования антител против PD-1 и антител против PD-L1, а также способа анализа антител против PD-1 и антител против PD-L1 с помощью данной тест-системы. Изобретение позволяет избежать дополнительных генно-инженерных работ, что делает его удобным в применении, и как следствие сократить временные и денежные затраты. Кроме того, изобретение позволяет оценивать ингибирующее влияние PD-1 на активацию CAR-T клеток, опосредованную химерным антигенным рецептором (CAR). Подход может быть использован при разработке препаратов на основе CAR для определения кандидатов CAR, ингибирующее влияние PD-1 на которые является минимальным.Thus, the aim of this work was to develop a new effective system for testing antibodies against PD-1 and antibodies against PD-L1, as well as a method for analyzing antibodies against PD-1 and antibodies against PD-L1 using this test system. The invention makes it possible to avoid additional genetic engineering work, which makes it convenient to use, and, as a consequence, to reduce time and money costs. In addition, the invention makes it possible to evaluate the inhibitory effect of PD-1 on the activation of CAR-T cells mediated by the chimeric antigen receptor (CAR). The approach can be used in the development of CAR-based drugs to identify CAR candidates whose inhibitory effect of PD-1 is minimal.

Краткое описание изобретенияBrief description of the invention

В заявляемом изобретении представлены тест-система и набор, предназначенные для анализа функциональной активности антител против PD-1 и антител против PD-L1. Изобретение также включает в себя применение указанных тест-системы и набора, способ анализа и способ оценки функциональной активности антител против PD-1 и антител против PD-L1 с использованием данной тест-системы.The claimed invention provides a test system and a kit designed to analyze the functional activity of antibodies against PD-1 and antibodies against PD-L1. The invention also includes the use of said test system and kit, an assay method and a method for evaluating the functional activity of anti-PD-1 antibodies and anti-PD-L1 antibodies using the test system.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к тест-системе для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, содержащая:In one aspect, the present invention provides a test system for analyzing the functional activity of an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody, comprising:

а. эффекторные репортерные клетки, имеющие на своей поверхности функциональный CD3 комплекс или его производное, PD-1, и содержащие репортерный ген под контролем CD3-зависимого промотора,and. effector reporter cells having on their surface a functional CD3 complex or its derivative, PD-1, and containing a reporter gene under the control of a CD3-dependent promoter,

б. клетки-мишени, представляющие на своей поверхности PD-L1,b. target cells presenting PD-L1 on their surface,

в. Активатор CD3-зависимого сигнального каскада,in. Activator of CD3-dependent signaling cascade,

где активатор CD3-зависимого сигнального каскада представляет собой биспецифическое антитело, способное связываться с CD3 комплексом.where the activator of the CD3-dependent signaling cascade is a bispecific antibody capable of binding to the CD3 complex.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к тест-системе для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, содержащей:In one aspect, the present invention provides a test system for analyzing the functional activity of an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody, comprising:

а. эффекторные репортерные клетки, имеющие на своей поверхности производное функционального CD3 комплекса, активатор CD3-зависимого сигнального каскада, PD-1, и содержащие репортерный ген под контролем CD3-зависимого промотора,and. effector reporter cells having on their surface a derivative of a functional CD3 complex, an activator of the CD3-dependent signaling cascade, PD-1, and containing a reporter gene under the control of a CD3-dependent promoter,

б. клетки-мишени, представляющие на своей поверхности PD-L1,b. target cells presenting PD-L1 on their surface,

где производным функционального CD3 комплекса и активатором CD3-зависимого сигнального каскада одновременно является химерный антигенный рецептор, включающий в себя домен CD3.where a derivative of a functional CD3 complex and an activator of the CD3-dependent signaling cascade is simultaneously a chimeric antigen receptor including the CD3 domain.

В некоторых вариантах биспецифическое антитело, способное связываться с CD3 комплексом, представляет собой растворимое антитело.In some embodiments, the bispecific antibody capable of binding to the CD3 complex is a soluble antibody.

В некоторых вариантах биспецифическое антитело, способное связываться с CD3 комплексом, представляет собой биспецифическое анти-CD3/анти-TAA антитело (aCD3/aTAA), в частности анти-CD3/анти-CD19 антитело, анти-CD3/анти-CD20 антитело.In some embodiments, the bispecific antibody capable of binding to the CD3 complex is an anti-CD3 / anti-TAA bispecific antibody (aCD3 / aTAA), in particular an anti-CD3 / anti-CD19 antibody, an anti-CD3 / anti-CD20 antibody.

В некоторых вариантах эффекторные репортерные клетки представляют собой Т-лимфоциты, в частности клетки Jurkat.In some embodiments, the effector reporter cells are T lymphocytes, particularly Jurkat cells.

В некоторых вариантах клетки-мишени представляют собой Raji или CHO-K1.In some embodiments, the target cells are Raji or CHO-K1.

В некоторых вариантах репортерный ген выбран из гена, кодирующего флюоресцентный или люминесцентный белок, в частности люциферазу.In some embodiments, the reporter gene is selected from a gene encoding a fluorescent or luminescent protein, such as luciferase.

В некоторых вариантах CD3-зависимый промотор выбран из NFAT-чувствительного промотора или NF-кB-чувствительного промотора.In some embodiments, the CD3-dependent promoter is selected from an NFAT-sensitive promoter or an NF-κB-sensitive promoter.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к набору для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, содержащему описанную выше тест-систему и при необходимости инструкцию.In one aspect, the present invention provides a kit for assaying the functional activity of an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody, comprising a test system as described above and, if necessary, instructions.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению описанной выше тест-системы для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1.In one aspect, the present invention relates to the use of a test system as described above for assaying the functional activity of an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению описанного выше набора для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1.In one aspect, the present invention relates to the use of a kit as described above for assaying the functional activity of an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, включающему:In one aspect, the present invention provides a method for analyzing the functional activity of an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody, comprising:

а. добавление к описанной выше тест-системе антитела против PD-1 или антитела против PD-L1,and. adding an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody to the above test system,

б. инкубацию,b. incubation,

в. измерение интенсивности сигнала продукта экспрессии репортерного гена,in. measuring the signal intensity of the reporter gene expression product,

г. обработку полученных данных.d. processing of the received data.

В некоторых вариантах обработка полученных данных в описанном выше способе включает установление значения ЕС50 антитела против PD-1 или антитела против PD-L1.In some embodiments, processing the data obtained in the method described above comprises determining an EC50 value of an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу определения функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, включающему:In one aspect, the present invention provides a method for determining the functional activity of an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody, comprising:

а. добавление к описанной выше тест-системе антитела против PD-1 или антитела против PD-L1,and. adding an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody to the above test system,

б. инкубацию,b. incubation,

в. измерение интенсивности сигнала продукта экспрессии репортерного гена,in. measuring the signal intensity of the reporter gene expression product,

г. обработку полученных данных, в том числе установление значения ЕС50 антитела против рецептора PD-1 или антитела против лиганда PD-L1,d. processing the data obtained, including determining the EC50 value of antibodies against PD-1 receptor or antibodies against ligand PD-L1,

д. расчет отношения экспериментально определенной EC50 стандартного образца, активность которого принимают за 100%, к экспериментально определенной EC50 сравниваемого антитела против рецептора PD-1 или антитела против лиганда PD-L1, умноженного на 100%.e. calculation of the ratio of the experimentally determined EC50 of a standard sample, the activity of which is taken as 100%, to the experimentally determined EC50 of the compared antibodies against PD-1 receptor or antibodies against ligand PD-L1, multiplied by 100%.

Краткое описание чертежейBrief Description of Drawings

Фиг. 1. Способы активации CD3 для системы тестирования ингибиторов взаимодействия PD-1/PD-L1. а – Эффекторная клетка имеет TCR, специфичный к комплексу пептид/MHC клетки-мишени. Их взаимодействие приводит к CD3-зависимой активации эффекторной клетки. б – Суперантиген связывает TCR эффекторной клетки и MHC-II антигенпрезентирующей клетки, имитируя взаимодействие TCR/MHC. в – Растворимые aCD3ε при взаимодействии с CD3 эффекторной клетки вызывают ее CD3-зависимую активацию. г – Трансмембранные aCD3ε, представленные на клетке активаторе, при контакте с эффекторной клеткой взаимодействуют с CD3 эффекторных клеток и вызывают в их CD3-зависимую активацию. д – В эффекторной клетке, имеющей CAR против TAA, содержащий сигнальный домен CD3ζ, при контакте с TAA+ (TAA положительной) клеткой-мишенью активируются CD3-зависимые сигнальные каскады. е – При контакте клетки-мишени с эффекторной клеткой связанное с TAA биспецифическое антитело против CD3 и TAA связывается с CD3 эффекторной клетки, что приводит к ее CD3-зависимой активации.FIG. 1. Methods for activating CD3 for the PD-1 / PD-L1 interaction inhibitor testing system. a - The effector cell has a TCR specific to the peptide / MHC complex of the target cell. Their interaction leads to CD3-dependent activation of the effector cell. b - Superantigen binds the TCR of the effector cell and the MHC-II of the antigen-presenting cell, mimicking the TCR / MHC interaction. c - Soluble aCD3ε, interacting with the CD3 of an effector cell, cause its CD3-dependent activation. d - Transmembrane aCD3ε, presented on the activator cell, upon contact with the effector cell, interact with the CD3 effector cells and cause their CD3-dependent activation. e - In an effector cell having an anti-TAA CAR containing the CD3ζ signaling domain, upon contact with a TAA + (TAA positive) target cell, CD3-dependent signaling cascades are activated. f - When the target cell contacts the effector cell, the TAA-bound anti-CD3 and TAA bispecific antibody binds to the CD3 of the effector cell, which leads to its CD3-dependent activation.

Фиг. 2. Сравнение эффективности CD3-зависимой стимуляции NFAT-сигнального каскада растворимыми активирующими агентами. Суспензию, состоявшую из указанной комбинации клеток Jurkat NFAT-FLuc PD-1 (J-PD-1), Raji (R), Raji PD-L1 (R-PD-L1), инкубировали в присутствии одного из активирующих агентов в указанной концентрации, а также в присутствии (+aPD-1), либо в отсутствие (–aPD-1) aPD-1 в концентрации 50 мкг/мл. Эффективность активации оценивали по уровню синтеза люциферазы путем измерения люминесценции.FIG. 2. Comparison of the efficiency of CD3-dependent stimulation of the NFAT signaling cascade with soluble activating agents. A suspension consisting of the specified combination of Jurkat NFAT-FLuc PD-1 (J-PD-1), Raji (R), Raji PD-L1 (R-PD-L1) cells was incubated in the presence of one of the activating agents at the indicated concentration, as well as in the presence of (+ aPD-1), or in the absence of (–aPD-1) aPD-1 at a concentration of 50 μg / ml. The activation efficiency was assessed by the level of luciferase synthesis by measuring the luminescence.

Фиг. 3. Зависимость активации репортерной системы от концентрации aCD3/aTAA. В клеточном тесте использовали суспензию клеток Jurkat NFAT-FLuc PD-1 (Jurkat-PD-1), содержавшую (кривые 2 и 3), либо не содержавшую (кривая 1) клетки Raji PD-L1 (Raji-PD-1). В случае кривой 3 – к клеткам добавляли в aPD-1 в концентрации 50 мкг/мл. В качестве активирующего агента использовали aCD3/aTTA1. Относительная активация (кривая 4) – отношение интенсивности люминесценции кривой 3 к кривой 2 для соответствующих концентраций aCD3/aTAA.FIG. 3. Dependence of the activation of the reporter system on the concentration of aCD3 / aTAA. In the cell test, a suspension of Jurkat NFAT-FLuc PD-1 (Jurkat-PD-1) cells, which contained (curves 2 and 3) or did not contain (curve 1) Raji PD-L1 (Raji-PD-1) cells, was used. In the case of curve 3, the cells were added to aPD-1 at a concentration of 50 μg / ml. ACD3 / aTTA1 was used as an activating agent. Relative activation (curve 4) is the ratio of the luminescence intensity of curve 3 to curve 2 for the corresponding concentrations of aCD3 / aTAA.

Фиг. 4. Зависимость активации репортерной системы от концентрации aCD3/aTAA. В клеточном тесте использовали суспензию клеток Jurkat NFAT-FLuc PD-1 (Jurkat-PD-1), содержавшую (кривые 2 и 3), либо не содержавшую (кривая 1) клетки Raji PD-L1 (Raji-PD-1). В случае кривой 3 – к клеткам добавляли в aPD-1 в концентрации 50 мкг/мл. В качестве активирующего агента использовали aCD3/aTАA2. Относительная активация (кривая 4) – отношение интенсивности люминесценции кривой 3 к кривой 2 для соответствующих концентраций aCD3/aTAA.FIG. 4. Dependence of the activation of the reporter system on the concentration of aCD3 / aTAA. In the cell test, a suspension of Jurkat NFAT-FLuc PD-1 (Jurkat-PD-1) cells, which contained (curves 2 and 3) or did not contain (curve 1) Raji PD-L1 (Raji-PD-1) cells, was used. In the case of curve 3, the cells were added to aPD-1 at a concentration of 50 μg / ml. ACD3 / aTAA2 was used as an activating agent. Relative activation (curve 4) is the ratio of the luminescence intensity of curve 3 to curve 2 for the corresponding concentrations of aCD3 / aTAA.

Фиг. 5. Зависимость активации репортерной системы от концентрации aPD-1 в присутствии различных активирующих агентов. В клеточном тесте использовали суспензию клеток Jurkat NFAT-FLuc PD-1 (кривые 1–3), либо Jurkat NFAT-FLuc PD-1 CAR (кривая 4) с добавлением клеток Raji PD-L1 (кривые 1, 2 и 4), либо CHO PDL1 tmaCD3 (кривая 3). В случае кривых 1 и 2 суспензия клеток содержала, соответственно, aCD3/aTAA1 и aCD3/aTAA2 в концентрации 1 нг/мл. Результаты приведены в значениях интенсивности люминесценции.FIG. 5. Dependence of the activation of the reporter system on the concentration of aPD-1 in the presence of various activating agents. The cell test used a suspension of Jurkat NFAT-FLuc PD-1 cells (curves 1–3), or Jurkat NFAT-FLuc PD-1 CAR (curve 4) with the addition of Raji PD-L1 cells (curves 1, 2, and 4), or CHO PDL1 tmaCD3 (curve 3). In the case of curves 1 and 2, the cell suspension contained, respectively, aCD3 / aTAA1 and aCD3 / aTAA2 at a concentration of 1 ng / ml. The results are given in terms of the luminescence intensity.

Фиг. 6. Зависимость активации репортерной системы от концентрации aPD-1 в присутствии различных активирующих агентов. В клеточном тесте использовали суспензию клеток Jurkat NFAT-FLuc PD-1 (кривые 1–3), либо Jurkat NFAT-FLuc PD-1 CAR (кривая 4) с добавлением клеток Raji PD-L1 (кривые 1, 2 и 4), либо CHO PDL1 tmaCD3 (кривая 3). В случае кривых 1 и 2 суспензия клеток содержала, соответственно, aCD3/aTAA1 и aCD3/aTAA2 в концентрации 1 нг/мл. Результаты приведены в единицах относительной активации. Относительную активацию определяли как отношение интенсивности люминесценции при данной концентрации aPD-1 к интенсивности люминесценции в варианте без добавления aPD-1 для каждого активатора.FIG. 6. Dependence of the activation of the reporter system on the concentration of aPD-1 in the presence of various activating agents. The cell test used a suspension of Jurkat NFAT-FLuc PD-1 cells (curves 1–3), or Jurkat NFAT-FLuc PD-1 CAR (curve 4) with the addition of Raji PD-L1 cells (curves 1, 2, and 4), or CHO PDL1 tmaCD3 (curve 3). In the case of curves 1 and 2, the cell suspension contained, respectively, aCD3 / aTAA1 and aCD3 / aTAA2 at a concentration of 1 ng / ml. Results are given in units of relative activation. The relative activation was determined as the ratio of the luminescence intensity at a given aPD-1 concentration to the luminescence intensity in the variant without adding aPD-1 for each activator.

Фиг. 7. Исследование специфичности репортерной системы. В клеточном тесте использовали aPD-1 (1), либо aPD-L1 (2), либо aCTLA4 (3), либо aHER2 (4) в указанных концентрациях. Исследование проводили согласно методике, описанной в разделе «функциональные тесты».FIG. 7. Investigation of the specificity of the reporter system. The cell test used aPD-1 (1), or aPD-L1 (2), or aCTLA4 (3), or aHER2 (4) at the indicated concentrations. The study was carried out according to the methodology described in the section "functional tests".

Фиг. 8. Использование разработанного клеточного теста для оценки специфической активности aPD-1 и aPD-L1. В клеточном тесте использовали aPD-1, исходные (1), либо проинкубированные в течении 1 ч при температуре 50 °С (2), 70 °С (3), либо 90 °С (4). Для вариантов (1–3) указаны соответствующие значения EC50. Исследование проводили согласно методике, описанной в разделе «функциональные тесты».FIG. 8. Using the developed cell test to assess the specific activity of aPD-1 and aPD-L1. The cell test used aPD-1, initial (1), or incubated for 1 h at 50 ° C (2), 70 ° C (3), or 90 ° C (4). For options (1-3), the corresponding EC50 values are indicated. The study was carried out according to the methodology described in the section "functional tests".

Фиг. 9. Использование разработанного клеточного теста для оценки специфической активности aPD-1 и aPD-L1. В клеточном тесте aPD-L1, исходные (1), либо проинкубированные в течении 1 ч при температуре 50 °С (2), 70 °С (3), либо 90 °С (4). Для вариантов (1–3) указаны соответствующие значения EC50. Исследование проводили согласно методике, описанной в разделе «функциональные тесты».FIG. 9. Using the developed cell test to assess the specific activity of aPD-1 and aPD-L1. In the cell test aPD-L1, initial (1), or incubated for 1 h at 50 ° C (2), 70 ° C (3), or 90 ° C (4). For options (1-3), the corresponding EC50 values are indicated. The study was carried out according to the methodology described in the section "functional tests".

Фиг. 10. Исследование линейного диапазона тест-системы. Сравнение ожидаемой и экспериментально определенной активности aPD-1. Измеряли EC50 заранее подготовленных разведений (в диапазоне концентраций 50 – 200 % относительно стандарта, активность которого принимали за 100%) антител. Экспериментально определенную активность рассчитывали, как отношение экспериментально определенной EC50 стандарта к EC50 для данной концентрации, умноженное на 100%.FIG. 10. Study of the linear range of the test system. Comparison of the expected and experimentally determined activity of aPD-1. The EC50 of the previously prepared dilutions (in the concentration range of 50-200% relative to the standard, the activity of which was taken as 100%) of antibodies was measured. The experimentally determined activity was calculated as the ratio of the experimentally determined EC50 of the standard to the EC50 for a given concentration, multiplied by 100%.

Фиг. 11. Исследование линейного диапазона тест-системы. Сравнение ожидаемой и экспериментально определенной активности aPD-L1. Измеряли EC50 заранее подготовленных разведений (в диапазоне концентраций 50 – 200 % относительно стандарта, активность которого принимали за 100%) антител. Экспериментально определенную активность рассчитывали, как отношение экспериментально определенной EC50 стандарта к EC50 для данной концентрации, умноженное на 100%.FIG. 11. Study of the linear range of the test system. Comparison of the expected and experimentally determined activity of aPD-L1. The EC50 of the previously prepared dilutions (in the concentration range of 50-200% relative to the standard, the activity of which was taken as 100%) of antibodies was measured. The experimentally determined activity was calculated as the ratio of the experimentally determined EC50 of the standard to the EC50 for a given concentration, multiplied by 100%.

Фиг. 12. Схема работы тест-системы для оценки функциональной активности aPD-1 и aPD-L1, основанная на использовании бисфецифических aCD3/aTAA. а – Система без добавления ингибиторов взаимодействия PD-1/PD-L1. При контакте эффекторной клетки и клетки-мишени aCD3/aTAA, связавшиеся с TAA клетки-мишени, взаимодействуют с CD3 эффекторной клетки, что активирует ее CD3-зависимый NFAT сигнальный каскад. При этом происходит взаимодействие PD-1 эффекторной клетки с PD-L1 клетки-мишени, что ингибирует активацию CD3-зависимого NFAT сигнального каскада. б – Добавленные в систему aPD-1 или aPD-L1 (в) связываются со своей мишенью, что блокирует взаимодействие PD-1/PD-L1 и реактивирует CD3-зависимый NFAT сигнальный каскад.FIG. 12. Scheme of the test system for assessing the functional activity of aPD-1 and aPD-L1, based on the use of bispecific aCD3 / aTAA. a - System without addition of inhibitors of PD-1 / PD-L1 interaction. Upon contact between the effector cell and the target cell, aCD3 / aTAA bound to the TAA target cell interact with the effector cell's CD3, which activates its CD3-dependent NFAT signaling cascade. In this case, the PD-1 effector cell interacts with the PD-L1 target cell, which inhibits the activation of the CD3-dependent NFAT signaling cascade. b - Added aPD-1 or aPD-L1 (c) to their target, which blocks the PD-1 / PD-L1 interaction and reactivates the CD3-dependent NFAT signaling cascade.

Определения и общие методыDefinitions and general methods

Если иное не определено в настоящем документе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, будут иметь значения, которые обычно понятны специалистам в данной области.Unless otherwise defined herein, scientific and technical terms used in connection with the present invention will have meanings that are usually understood by those of ordinary skill in the art.

Кроме того, если по контексту не требуется иное, термины в единственном числе включают в себя термины во множественном числе, и термины во множественном числе включают в себя термины в единственном числе. Как правило, используемая классификация и методы культивирования клеток, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики, аналитической химии, химии органического синтеза, медицинской и фармацевтической химии, а также гибридизации и химии белка и нуклеиновых кислот, описанные в настоящем документе, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Ферментативные реакции и способы очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителя, как это обычно осуществляется в данной области, или как описано в настоящем документе.In addition, unless the context requires otherwise, singular terms include plural terms, and plural terms include singular terms. Typically, the classifications and methods used for cell culture, molecular biology, immunology, microbiology, genetics, analytical chemistry, organic synthesis chemistry, medicinal and pharmaceutical chemistry, as well as protein and nucleic acid hybridization and chemistry described herein are well known to those skilled in the art and are widely used in this field. Enzymatic reactions and purification methods are carried out in accordance with the manufacturer's instructions, as is usually done in the art, or as described herein.

PD-1 является ингибиторным членом семейства рецепторов CD28, которое включает в себя также CD28 (Cluster of Differentiation 28), CTLA-4 (Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4), ICOS (Inducible T-cell COStimulator) и BTLA (B- and T-lymphocyte attenuator). PD-1 экспрессируется активированными В-клетками, Т-клетками и миелоидными клетками (Agata et al., supra; Okazaki et al. (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82; Bennet et al. (2003) J Immunol 170: 711-8). PD-1 является трансмембранным белком типа I 55 кДа, который является частью суперсемейства генов Ig (Agata et al. (1996) Int Immunol 8: 765-72). PD-1 содержит мембранопроксимальный иммунорецепторный ингибирующий мотив на основе тирозина (ITIM) и мембранодистальный мотив переключения на основе тирозина (ITSM) (Thomas, M.L. (1995) J Exp Med 181: 1953-6; Vivier, E и Daeron, M (1997) Immunol Today 18: 286-91). PD-1, хотя и является структурно сходным с CTLA-4, лишен мотива MYPPPY, который является критическим для связывания В7-1 и В7-2. Были идентифицированы два лиганда для PD-1, PD-L1 и PD-L2, которые, как было показано, отрицательно регулируют активацию Т-клеток после связывания с PD-1 (Freeman et al. (2000) J Exp Med 192: 1027-34; Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2: 261-8; Carter et al. (2002) Eur J Immunol 32: 634-43). Как PD-L1, так и PD-L2 являются гомологами В7, которые связываются с PD-1, но не связываются с другими членами семейства CD28.PD-1 is an inhibitory member of the CD28 receptor family, which also includes CD28 (Cluster of Differentiation 28), CTLA-4 (Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4), ICOS (Inducible T-cell COStimulator) and BTLA (B- and T-lymphocyte attenuator). PD-1 is expressed by activated B cells, T cells and myeloid cells (Agata et al., Supra; Okazaki et al. (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82; Bennet et al. (2003) J Immunol 170: 711-8). PD-1 is a 55 kDa type I transmembrane protein that is part of the Ig gene superfamily (Agata et al. (1996) Int Immunol 8: 765-72). PD-1 contains a tyrosine-based membrane-proximal immunoreceptor inhibitory motif (ITIM) and a tyrosine-based membrane-distal switching motif (ITSM) (Thomas, ML (1995) J Exp Med 181: 1953-6; Vivier, E and Daeron, M (1997) Immunol Today 18: 286-91). PD-1, although structurally similar to CTLA-4, lacks the MYPPPY motif, which is critical for B7-1 and B7-2 binding. Two ligands for PD-1, PD-L1 and PD-L2, have been identified that have been shown to negatively regulate T cell activation after binding to PD-1 (Freeman et al. (2000) J Exp Med 192: 1027- 34; Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2: 261-8; Carter et al. (2002) Eur J Immunol 32: 634-43). Both PD-L1 and PD-L2 are homologues of B7 that bind to PD-1 but do not bind to other members of the CD28 family.

PD-L1, также известный как кластер дифференцировки 274 (CD274) или гомолог 1 B7 (B7-H1), является трансмембранным белком 1 типа, массой 40 кДа. Состоит из 3 доменов: внеклеточного, представленного Ig V и C-подобными доменами (220), трансмембранного (21) и внутриклеточного (31). Он играет важную роль в супрессии иммунной системы в период беременности, при пересадке чужеродной ткани, некоторых заболеваниях, например, при гепатите. В нормальных условиях, в ответ на собственные антигены, в лимфатических узлах и селезенке аккумулируется некоторое количество антиген-специфичных CD8+ Т-эффекторных клеток, с целью предотвращения аутоиммунного процесса, формируются PD-1/PD-L1 или B7-1/PD-L1 комплексы, это приводит к передаче ингибиторного сигнала, снижающего пролиферацию данных CD8+ T-клеток в лимфоузлах. Таким образом PD-1/PD-L-взаимодействие является одним из ключевых в развитии иммунной толерантности.PD-L1, also known as differentiation cluster 274 (CD274) or homologue 1 B7 (B7-H1), is a type 1 transmembrane protein of 40 kDa. Consists of 3 domains: extracellular, represented by Ig V and C-like domains (220), transmembrane (21) and intracellular (31). It plays an important role in suppressing the immune system during pregnancy, in the transplantation of foreign tissue, in some diseases, for example, in hepatitis. Under normal conditions, in response to its own antigens, a certain amount of antigen-specific CD8 + T-effector cells accumulate in the lymph nodes and spleen, in order to prevent the autoimmune process, PD-1 / PD-L1 or B7-1 / PD-L1 are formed complexes, this leads to the transmission of an inhibitory signal that reduces the proliferation of these CD8 + T cells in the lymph nodes. Thus, PD-1 / PD-L interaction is one of the key ones in the development of immune tolerance.

Под термином «тест-система» в контексте данного изобретения подразумевается смесь компонентов для проведения анализа активности антител. Причем данная смесь может быть помещена в любое подходящее для этого устройство или емкость (микросферы, биочип, аналитические полоски, аффинные колонки, планшеты, пробирки и пр.).The term "test system" in the context of this invention means a mixture of components for assaying the activity of antibodies. Moreover, this mixture can be placed in any device or container suitable for this (microspheres, biochip, analytical strips, affinity columns, plates, test tubes, etc.).

Термин «набор» объединяет все комплектующие, в том числе саму тест-систему и при необходимости инструкцию проведения анализа.The term "kit" unites all components, including the test system itself and, if necessary, the instructions for the analysis.

Термин «антитело» или «иммуноглобулин» (Ig), как использовано в данном описании, включает целые антитела и любой антигенсвязывающий фрагмент (т.е. «антигенсвязывающую часть») или его отдельные цепи. Термин «антитело» используется здесь в самом широком смысле и конкретно охватывает человеческие, нечеловеческие (например, мышиные) и гуманизированные моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, моноспецифические антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), одноцепочечные антитела и фрагменты антител, если они проявляют желаемую биологическую активность. Антитела могут существовать как интактные иммуноглобулины, так и в виде модификаций различных форм, например, FabFc2, Fab, Fv, Fd, (FabN)2, Fv фрагмент, содержащий только легкие и тяжелые цепи вариабельных регионов, одноцепочечного антитела (например, scFv) и тому подобное. Тяжелая и легкая цепи Fv могут быть получены из одного и того же антитела или различных антител, тем самым производя химерную область Fv. Антитело может быть животного (в частности, мыши или крысы) или человеческого происхождения, может быть химерным или гуманизированным. «Антитела» согласно изобретению могут представлять собой антитела любого класса (например, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, предпочтительно IgG) или подкласса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2, предпочтительно IgG1).The term "antibody" or "immunoglobulin" (Ig), as used herein, includes whole antibodies and any antigen-binding fragment (ie, "antigen-binding portion") or individual chains thereof. The term "antibody" is used herein in its broadest sense and specifically encompasses human, non-human (eg, murine), and humanized monoclonal antibodies (including full length monoclonal antibodies), polyclonal antibodies, monospecific antibodies, multispecific antibodies (eg, bispecific antibodies), single chain antibodies, and fragments of antibodies if they exhibit the desired biological activity. Antibodies can exist both as intact immunoglobulins and in the form of modifications of various forms, for example, FabFc2, Fab, Fv, Fd, (FabN) 2, Fv fragment containing only light and heavy chains of variable regions, single chain antibodies (for example, scFv) and the like. Fv heavy and light chains can be derived from the same antibody or different antibodies, thereby producing a chimeric Fv region. The antibody can be of animal (in particular, mouse or rat) or human origin, can be chimeric or humanized. "Antibodies" according to the invention can be antibodies of any class (eg, IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, preferably IgG) or subclass (eg, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2, preferably IgG1).

Термин «антигенсвязывающая часть» антитела или «антигенсвязывающий фрагмент» (или просто «часть антитела» или «фрагмент антитела»), как использовано в данном описании, относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном. Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может выполняться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, включенных в термин «антигенсвязывающая часть» антитела, включают (i) Fab-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH 1; (ii) F(ab’)2-фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd- фрагмент, состоящий из доменов VH и CH 1; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH в едином плече антитела, (v) dAb-фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), который состоит из домена VH/VHH; и (vi) выделенная определяющая комплементарность области (CDR). Кроме того, две области Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются разными генами, они могут быть соединены при помощи рекомбинантных способов с использованием синтетического линкера, который дает возможность получать их в виде единой белковой цепи, в которой области VL и VH спариваются с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Предполагается, что такие одноцепочечные молекулы также включены в термин «антигенсвязывающая часть» антитела. Такие фрагменты антител получают с использованием общепринятых способов, известных специалистам в данной области, и эти фрагменты подвергают скринингу таким же образом, как и интактные антитела.The term "antigennegative portion" of an antibody or "antigennegative fragment" (or simply "portion of an antibody" or "antibody fragment"), as used herein, refers to one or more fragments of an antibody that retain the ability to specifically bind to an antigen. It has been shown that the antigen-binding function of an antibody can be performed by fragments of a full-length antibody. Examples of binding fragments included in the term “antigen binding portion” of an antibody include (i) a Fab fragment, a monovalent fragment consisting of the VL, VH, CL and CH 1 domains; (ii) an F (ab ') 2 fragment, a bivalent fragment containing two Fab fragments linked by a disulfide bridge in the hinge region; (iii) an Fd fragment consisting of the VH and CH 1 domains; (iv) an Fv fragment consisting of the VL and VH domains in a single arm of an antibody, (v) a dAb fragment (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), which consists of a VH / VHH domain; and (vi) an isolated complementarity determining region (CDR). In addition, the two regions of the Fv fragment, VL and VH, are encoded by different genes, they can be combined using recombinant methods using a synthetic linker, which makes it possible to obtain them as a single protein chain in which the VL and VH regions are paired to form monovalent molecules (known as single chain Fv (scFv); see, for example, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879 -5883). It is assumed that such single-chain molecules are also included in the term "antigennegative part" of the antibody. Such antibody fragments are obtained using conventional techniques known to those of skill in the art, and the fragments are screened in the same manner as intact antibodies.

Выражение «функциональная активность» по отношению к антителу или антигенсвязывающему фрагменту против PD-1 или PD-L1 по данному изобретению означает способность связываться с PD-1 или PD-L1 и препятствовать образованию комплекса PD-1/PD-L1.The expression "functional activity" with respect to an antibody or antigen-binding fragment against PD-1 or PD-L1 according to this invention means the ability to bind to PD-1 or PD-L1 and prevent the formation of a PD-1 / PD-L1 complex.

Термин «биспецифичное антитело» или «биспецифический антигенсвязывающий фрагмент» означает антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащие антигенсвязывающий домен или антигенсвязывающие домены, которые способны к специфическому связыванию с двумя различными эпитопами на одной биологической молекуле или способны к специфическому связыванию с эпитопами на двух различных биологических молекулах. Биспецифичное антитело также упоминается в настоящем документе, как обладающее «двойной специфичностью» или как являющееся антителом с «двойной специфичностью».The term "bispecific antibody" or "bispecific antigen-binding fragment" means an antibody or antigen-binding fragment containing an antigen-binding domain or antigen-binding domains that are capable of specifically binding to two different epitopes on the same biological molecule or capable of specific binding to two different biologic epitopes on the same biological molecule. A bispecific antibody is also referred to herein as being “dual specific” or as being “dual specific”.

Термин «моноклональное антитело» или «mAb» относится к антителу, которое синтезировано и выделено отдельной клональной популяцией клеток. Клональная популяция может быть клональной популяцией иммортализованных клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммортализованные клетки в клональной популяции являются гибридными клетками, гибридомами, которые обычно получают путем слияния отдельных В-лимфоцитов от иммунизированных животных с отдельными клетками лимфоцитарной опухоли. Гибридомы представляют собой тип сконструированных клеток и не встречаются в природе.The term "monoclonal antibody" or "mAb" refers to an antibody that is synthesized and isolated by a separate clonal population of cells. The clonal population can be a clonal population of immortalized cells. In some embodiments of the invention, the immortalized cells in the clonal population are hybrid cells, hybridomas, which are usually obtained by fusion of individual B lymphocytes from immunized animals with individual lymphocytic tumor cells. Hybridomas are a type of engineered cell and do not occur in nature.

Термин «растворимое антитело» относится к антителу, которое исходно является компонентом раствора. В отличие от трансмембранного антитела, которое исходно представлено на поверхности клеточной мембраны.The term "soluble antibody" refers to an antibody that is initially a component of a solution. In contrast to the transmembrane antibody, which is initially presented on the surface of the cell membrane.

Термин «ED50» («EC50») (50% эффективная доза/концентрация) относится к концентрациям препарата, при которых измеряемый максимально возможный биологический эффект достигается на 50% (может включать цитотоксичность).The term "ED50" ("EC50") (50% effective dose / concentration) refers to the concentrations of the drug at which the measurable maximum potential biological effect is achieved by 50% (may include cytotoxicity).

Термин «эффекторные клетки», используемый здесь, обозначает клетки, которые представляют на своей поверхности TCR, CD3, CAR, рецепторы Fc-фрагмента антител (FcR), B-клеточный рецептор (BCR), содержащие ITAM сигнальные мотивы, и осуществляют эффекторные функции. Примером природных эффекторных клеток являются T-лимфоциты, натуральные киллеры (NK), моноциты и т.д. Природные эффекторные клетки могут быть выделены из их природного источника, например, из цельной крови или PBMC. Также этот термин относится к другим клеткам, представляющим на своей поверхности TCR, CD3, CAR, FcR, BCR или их производные, содержащие ITAM сигнальные мотивы.The term "effector cells" as used herein refers to cells that present on their surface TCR, CD3, CAR, antibody Fc receptor (FcR), B cell receptor (BCR), containing ITAM signaling motifs and performing effector functions. Examples of natural effector cells are T lymphocytes, natural killer (NK) cells, monocytes, etc. Natural effector cells can be isolated from their natural source, such as whole blood or PBMC. This term also refers to other cells presenting on their surface TCR, CD3, CAR, FcR, BCR or their derivatives containing ITAM signaling motifs.

Термин «клетка-мишень», используемый здесь, обозначает клетку, с которой специфично связывается эффекторная клетка, что обеспечивает активацию ее эффекторных функций. Такие клетки представляют на своей поверхности главный комплекс гистосовместимости (MHC), другие трансмембранные или мембранно-связанные соединения, специфично связывающие TCR, CD3, FcR, CAR, BCR или их производные эффекторных клеток напрямую или опосредованно другими соединениями. Примером таких клеток могут быть B-лимфоциты, моноциты, дендритные клетки, иммортализованные клеточные линии и т.д.The term “target cell” as used herein means a cell to which an effector cell specifically binds to activate its effector functions. Such cells present on their surface the major histocompatibility complex (MHC), other transmembrane or membrane-bound compounds that specifically bind TCR, CD3, FcR, CAR, BCR or their derivatives of effector cells directly or indirectly by other compounds. Examples of such cells include B lymphocytes, monocytes, dendritic cells, immortalized cell lines, etc.

Термин «репортерный ген», используемый здесь, относится к гетерологичному гену, кодирующему репортерный белок, экспрессия которого находится под контролем регулируемого промотора, и продукт экспрессии которого может быть с легкостью определен и подвергнут количественной оценке, когда конструкцию, содержащую этот ген, вводят в ткани или клетки. Примеры репортерных белков, известных и используемых в данной области техники, включают люциферазу (Luc), зеленый флюоресцентный белок (GFP), хлорамфеникол-ацетилтрансферазу (САТ), β-галактозидазу (LacZ), β-глюкуронидазу (Gus), секретируемую эмбриональную щелочную фосфатазу (SEAP) и подобные. Гены селективных маркеров могут также считаться репортерными генами.The term "reporter gene" as used herein refers to a heterologous gene encoding a reporter protein, the expression of which is under the control of a regulated promoter, and the expression product of which can be easily identified and quantified when a construct containing this gene is introduced into tissues. or cells. Examples of reporter proteins known and used in the art include luciferase (Luc), green fluorescent protein (GFP), chloramphenicol acetyltransferase (CAT), β-galactosidase (LacZ), β-glucuronidase (Gus), secreted embryonic alkaline phosphatase (SEAP) and the like. Selectable marker genes can also be considered reporter genes.

Термины «промотор» и «промоторная последовательность» используются взаимозаменяемо и относятся к последовательности ДНК, способной к контролированию экспрессии кодирующей последовательности. Источниками промоторных последовательностей могут служить природные гены или комбинации их участков, отвечающих за контроль его экспрессии. Также промоторы могут включать и сегменты синтетической ДНК. Квалифицированным в данной области техники специалистам понятно, что различные промоторы могут управлять экспрессией гена в различных тканях или типах клеток, или на различных стадиях развития, или в ответ на различные условия окружающей среды или физиологические условия. Промоторы, обеспечивающие стабильную экспрессию гена в большинстве периодов времени, обычно именуют «конститутивными промоторами». Промоторы, которые вызывают экспрессию гена в специфическом типе клеток, обычно именуют «клеточноспецифическими» или «тканеспецифическими» промоторами. Промоторы, которые вызывают экспрессию гена на специфической стадии развития или клеточной дифференциации, обычно именуют «специфичными в отношении развития промоторами» или «специфичными в отношении клеточной дифференциации промоторами». Промоторы, которые индуцируются и вызывают экспрессию гена после воздействия или обработки клетки агентом, биологической молекулой, химическим веществом, лигандом, светом и подобными, которые индуцируют промотор, обычно именуют «индуцибельными промоторами» или «регулируемыми промоторами». Дополнительно признается, что, поскольку в большинстве случаев точные границы регуляторных последовательностей не вполне определены, фрагменты ДНК различных длин могут иметь одинаковую промоторную активность.The terms "promoter" and "promoter sequence" are used interchangeably and refer to a DNA sequence capable of controlling the expression of a coding sequence. The sources of promoter sequences can be natural genes or combinations of their regions responsible for the control of its expression. Also, promoters can include synthetic DNA segments. Those of skill in the art will understand that different promoters can direct gene expression in different tissues or cell types, or at different stages of development, or in response to different environmental or physiological conditions. Promoters that provide stable gene expression over most time periods are commonly referred to as "constitutive promoters". Promoters that cause the expression of a gene in a specific cell type are commonly referred to as "cell-specific" or "tissue-specific" promoters. Promoters that cause expression of a gene at a specific stage of development or cell differentiation are commonly referred to as "developmental-specific promoters" or "cell-differentiation-specific promoters". Promoters that are induced and cause gene expression after exposure to or treatment of a cell with an agent, biological molecule, chemical, ligand, light, and the like that induce a promoter are commonly referred to as "inducible promoters" or "regulated promoters". In addition, it is recognized that since in most cases the exact boundaries of regulatory sequences are not well defined, DNA fragments of different lengths may have the same promoter activity.

Промоторная последовательность обычно ограничена на своем 3' конце местом инициации транскрипции и простирается выше (в 5' направлении) с включением элементов, необходимых для инициации транскрипции на уровнях, определяемых выше фона. Внутри промоторной последовательности будут обнаруживаться место инициации транскрипции (подходящим образом определяемое, например, с помощью картирования с использованием нуклеазы S1), а также белоксвязывающие домены (консенсусные последовательности), ответственные за связывание РНК-полимеразы.The promoter sequence is usually limited at its 3 'end by the site of transcription initiation and extends upstream (in the 5' direction) to include elements necessary to initiate transcription at levels determined above background. Within the promoter sequence, the site of transcription initiation (suitably determined, for example, by mapping using S1 nuclease), as well as protein-binding domains (consensus sequences) responsible for binding of RNA polymerase, will be found.

Термин «функциональный CD3 комплекс», используемый здесь, относится к комплексу, представленному на поверхности эффекторной клетки и включающему в себя хотя бы одну субъединицу CD3 или ее производное, содержащее ITAM сигнальные мотивы, которые способны обеспечить активацию CD3-зависимых сигнальных каскадов. Производные CD3 комплекса – полипептиды, имеющие в своем составе аминокислотную последовательность белков, составляющих CD3 комплекс, или ее фрагменты.The term "functional CD3 complex" as used herein refers to a complex present on the surface of an effector cell and including at least one CD3 subunit or derivative thereof, containing ITAM signaling motifs that are capable of mediating the activation of CD3-dependent signaling cascades. Derivatives of the CD3 complex are polypeptides containing the amino acid sequence of proteins that make up the CD3 complex, or its fragments.

Термин «CD3» относится к мультипротеиновому комплексу на поверхности Т-лимфоцитов, являющемуся основным корецептором Т-клеточного рецептора. У млекопитающих образован 6 субъединицами: CD3γ, CD3δ, двумя CD3ε и двумя CD3ζ. В функции комплекса CD3 входит передача сигналов в клетку, а также стабилизация Т-клеточного рецептора на поверхности мембраны. Один из белков кластера дифференцировки.The term "CD3" refers to a multiprotein complex on the surface of T-lymphocytes, which is the major coreceptor of the T-cell receptor. In mammals, it is formed by 6 subunits: CD3γ, CD3δ, two CD3ε and two CD3ζ. The function of the CD3 complex is to transmit signals to the cell, as well as stabilize the T-cell receptor on the membrane surface. One of the proteins of the cluster of differentiation.

Термин «CD3-зависимый промотор» относится к промотору, который при активации одного или нескольких CD3-зависимых сигнальных каскадов обеспечивает экспрессию гена, который он контролирует.The term "CD3-dependent promoter" refers to a promoter that, when activated by one or more CD3-dependent signaling cascades, provides expression of the gene that it controls.

Термин «CD3-зависимый сигнальный каскад» относится к сигнальным каскадам, которые активируются в ответ на стимуляцию TCR, субъединиц CD3 или их производных, содержащих ITAM сигнальные мотивы. Примерами являются NFAT, NF-κB, Ras/MAPK, PKC и другие сигнальные каскады.The term "CD3-dependent signaling cascade" refers to signaling cascades that are activated in response to stimulation of TCR, CD3 subunits or derivatives thereof containing ITAM signaling motifs. Examples are NFAT, NF-κB, Ras / MAPK, PKC, and other signaling cascades.

Термин «опухоль-ассоциированный антиген» (TAA, опухолевый антиген) относится к антигенам, продуцируемым раковыми клетками и способным вызвать иммунный ответ организма. Эта способность делает опухолевые антигены важнейшим целевым объектом иммунотерапии рака. Кроме того, эти антигены являются одними из онкомаркеров, определяемых в диагностике рака.The term "tumor associated antigen" (TAA, tumor antigen) refers to antigens produced by cancer cells and capable of eliciting an immune response in the body. This ability makes tumor antigens an important target for cancer immunotherapy. In addition, these antigens are among the tumor markers determined in the diagnosis of cancer.

В организме опухолевые антигены являются результатом измененного генома раковой клетки. Из-за этих изменений возникают чуждые организму продукты генов или даже белки, которые, к примеру, существуют только в эмбриональный период развития. Эти чужеродные продукты – опухолевые антигены – могут находиться в цитоплазме клетки или на её поверхности, а также и во внеклеточном пространстве.In the body, tumor antigens are the result of an altered cancer cell genome. Because of these changes, gene products or even proteins alien to the body arise, which, for example, exist only during the embryonic period of development. These foreign products - tumor antigens - can be found in the cytoplasm of the cell or on its surface, as well as in the extracellular space.

Термин «NFAT» (ядерный фактор активированных T-лимфоцитов) относится к белкам семейства NFAT, которые являются факторами транскрипции, и клеточная локализация которых зависит от их фосфорилирования. В фосфорилированной форме NFAT локализуется в цитоплазме, при дефосфорилировании, вызванном, например, активацией CD3, происходит его переход в ядро, где он специфично связывается с определенными последовательностями ДНК в промоторах генов, что приводит к активации их экспрессии.The term “NFAT” (nuclear factor of activated T-lymphocytes) refers to proteins of the NFAT family, which are transcription factors and whose cellular localization depends on their phosphorylation. In the phosphorylated form, NFAT is localized in the cytoplasm; during dephosphorylation, caused, for example, by the activation of CD3, it is transferred to the nucleus, where it specifically binds to certain DNA sequences in gene promoters, which leads to the activation of their expression.

Выражение «NFAT-чувствительный промотор» или «NF-κB-чувствительный промотор» относится к промоторам, содержащим последовательности ДНК, с которыми специфично связываются соответствующие транскрипционные факторы, что активирует экспрессию генов, которые контролируются соответствующими промоторами. The expression "NFAT-sensitive promoter" or "NF-κB-sensitive promoter" refers to promoters containing DNA sequences to which the corresponding transcription factors bind specifically, which activates the expression of genes that are controlled by the corresponding promoters.

Термин «NF-κB» (ядерный фактор энхансера легкой цепи активированных B-лимфоцитов) относится к семейству белков NF-κB, которые являются факторами транскрипции, и клеточная локализация которых зависит от их фосфорилирования. В дефосфорилированной форме NF-κB локализуется в цитоплазме, при фосфорилировании NF-κB, вызванном, например, активацией CD3, происходит его переход в ядро, где он специфично связывается с определенными последовательностями ДНК в промоторах генов, что приводит к активации их экспрессии.The term "NF-κB" (nuclear light chain enhancer factor of activated B-lymphocytes) refers to the family of proteins NF-κB, which are transcription factors and whose cellular localization depends on their phosphorylation. In the dephosphorylated form, NF-κB is localized in the cytoplasm; upon phosphorylation of NF-κB, caused, for example, by CD3 activation, it is transferred to the nucleus, where it specifically binds to certain DNA sequences in gene promoters, which leads to the activation of their expression.

Термин «CAR» (химерный антигенный рецептор) относится к рекомбинантному гибридному белку, сочетающему фрагмент антитела, обладающему способностью избирательно связываться с конкретными антигенами, и сигнализирующие домены, способные активировать клетки, представляющие его на своей поверхности.The term "CAR" (chimeric antigen receptor) refers to a recombinant fusion protein that combines an antibody fragment with the ability to selectively bind to specific antigens and signaling domains capable of activating cells presenting it on their surface.

Термин «CAR-T» относится к Т-клеткам, представляющим CAR на своей поверхности.The term "CAR-T" refers to T cells presenting CARs on their surface.

Выражение «стандартный образец» относится к препарату, охарактеризованному по определенным параметрам, который используется в качестве препарата сравнения для определения аналогичных параметров исследуемых образцов.The expression "standard sample" refers to a drug characterized by certain parameters, which is used as a reference drug to determine similar parameters of the test samples.

Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к тест-системе для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, содержащей:In one aspect, the present invention provides a test system for analyzing the functional activity of an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody, comprising:

а. эффекторные репортерные клетки, имеющие на своей поверхности функциональный CD3 комплекс или его производное, PD-1, и содержащие репортерный ген под контролем CD3-зависимого промотора,and. effector reporter cells having on their surface a functional CD3 complex or its derivative, PD-1, and containing a reporter gene under the control of a CD3-dependent promoter,

б. клетки-мишени, представляющие на своей поверхности PD-L1,b. target cells presenting PD-L1 on their surface,

в. Активатор CD3-зависимого сигнального каскада,in. Activator of CD3-dependent signaling cascade,

где активатор CD3-зависимого сигнального каскада представляет собой биспецифическое антитело, способное связываться с CD3 комплексом.where the activator of the CD3-dependent signaling cascade is a bispecific antibody capable of binding to the CD3 complex.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к тест-системе для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, содержащей:In one aspect, the present invention provides a test system for analyzing the functional activity of an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody, comprising:

а. эффекторные репортерные клетки, имеющие на своей поверхности производное функционального CD3 комплекса, активатор CD3-зависимого сигнального каскада, PD-1, и содержащие репортерный ген под контролем CD3-зависимого промотора,and. effector reporter cells having on their surface a derivative of a functional CD3 complex, an activator of the CD3-dependent signaling cascade, PD-1, and containing a reporter gene under the control of a CD3-dependent promoter,

б. клетки-мишени, представляющие на своей поверхности PD-L1,b. target cells presenting PD-L1 on their surface,

где производным функционального CD3 комплекса и активатором CD3-зависимого сигнального каскада одновременно является химерный антигенный рецептор, включающий в себя домен CD3.where a derivative of a functional CD3 complex and an activator of the CD3-dependent signaling cascade is simultaneously a chimeric antigen receptor including the CD3 domain.

Тест-система для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1 должна состоять из эффекторных PD-1+ клеток и PD-L1. Функция PD-1-опосредованного ингибирования CD3-зависимой активации подразумевает, что эффекторная клеточная линия должна иметь функциональный CD3 комплекс на поверхности. Для оценки уровня CD3-зависимой активации и степени ее ингибирования удобно использовать репортерную систему, например, на основе использования репортерных генов, в качестве которых могут быть использованы гены, кодирующие флюоресцентный (GFP, RFP, BFP и т.д.) или люминесцентный (FLuc, RLuc, GLuc и т.д.) белок, в частности люциферазу светляка. Экспрессия репортерного гена должна осуществляться под контролем CD3-зависимого промотора. PD-1 при взаимодействии с PD-L1 способен подавлять NFAT и NF-κB сигнальные каскады, активируемые CD3 (Jutz, S., Leitner, J., Schmetterer, K., Doel-Perez, I., Majdic, O., Grabmeier-Pfistershammer, K., Paster, W., Huppa, J.B., Steinberger, P. (2016) Assessment of costimulation and coinhibition in a triple parameter T cell reporter line: Simultaneous measurement of NF-κB, NFAT and AP-1, J. Immunol. Methods, 430, 10–20, doi: 10.1016/j.jim.2016.01.007). A test system for the analysis of the functional activity of an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody should consist of effector PD-1 + cells and PD-L1. The function of PD-1-mediated inhibition of CD3-dependent activation implies that the effector cell line must have a functional CD3 complex on its surface. To assess the level of CD3-dependent activation and the degree of its inhibition, it is convenient to use a reporter system, for example, based on the use of reporter genes, which can be genes encoding fluorescent (GFP, RFP, BFP, etc.) or luminescent (FLuc , RLuc, GLuc, etc.) a protein, in particular firefly luciferase. Expression of the reporter gene must be under the control of the CD3-dependent promoter. PD-1, when interacting with PD-L1, is able to suppress NFAT and NF-κB signaling cascades activated by CD3 (Jutz, S., Leitner, J., Schmetterer, K., Doel-Perez, I., Majdic, O., Grabmeier -Pfistershammer, K., Paster, W., Huppa, JB, Steinberger, P. (2016) Assessment of costimulation and coinhibition in a triple parameter T cell reporter line: Simultaneous measurement of NF-κB, NFAT and AP-1, J Immunol. Methods, 430, 10-20, doi: 10.1016 / j.jim.2016.01.007).

В некоторых вариантах репортерный ген выбран из гена, кодирующего флюоресцентный или люминесцентный белок. В некоторых вариантах осуществления репортерный ген представляет собой люциферазу, бета-лактамазу, CAT, SEAP, флюоресцентный белок, генный продукт и др. В некоторых вариантах осуществления люциферазу выбирают из таковых, обнаруженных у Omphalotus olearius, светлячков (например, Photinus pyralis), Renilla reniformi, их мутантов, их частей, их вариантов и любых другие ферменты люциферазы, подходящие для описанных систем и способов.In some embodiments, the reporter gene is selected from a gene encoding a fluorescent or luminescent protein. In some embodiments, the reporter gene is luciferase, beta-lactamase, CAT, SEAP, fluorescent protein, gene product, etc. In some embodiments, the luciferase is selected from those found in Omphalotus olearius, fireflies (e.g., Photinus pyralis), Renilla reniformi , their mutants, their parts, their variants and any other luciferase enzymes suitable for the described systems and methods.

В некоторых вариантах CD3-зависимый промотор выбран из NFAT-чувствительного промотора или NF-кB-чувствительного промотора. Использование NFAT сигнального пути предпочтительнее, т.к. NF-κB сигнальный путь имеет множество других способов активации, т.е. является менее специфичным маркером CD3-зависимой активации (Pahl, H.L. (1999) Activators and target genes of Rel/NF-kappaB transcription factors, Oncogene, 18, 6853–6866, doi: 10.1038/sj.onc.1203239; Rao, A., Luo, C, Hogan, P.G. (1997) Transcription factors of the NFAT family: regulation and function, Annu. Rev. Immunol., 15, 707–747, doi: 10.1146/annurev.immunol.15.1.707; Vaeth, M., Feske, S. (2018) NFAT control of immune function: New Frontiers for an Abiding Trooper, F1000Res., 7, 260, doi: 10.12688/f1000research.13426.1). Также могут быть использованы Ras/MARK-чувствительный промотор, PKC-чувствительный промотор.In some embodiments, the CD3-dependent promoter is selected from an NFAT-sensitive promoter or an NF-κB-sensitive promoter. The use of the NFAT signaling pathway is preferable because The NF-κB signaling pathway has many other activation modes, i.e. is a less specific marker for CD3-dependent activation (Pahl, HL (1999) Activators and target genes of Rel / NF-kappaB transcription factors, Oncogene, 18, 6853-6866, doi: 10.1038 / sj.onc.1203239; Rao, A. , Luo, C, Hogan, PG (1997) Transcription factors of the NFAT family: regulation and function, Annu. Rev. Immunol., 15, 707-747, doi: 10.1146 / annurev.immunol. 15.1.707; Vaeth, M ., Feske, S. (2018) NFAT control of immune function: New Frontiers for an Abiding Trooper, F1000Res., 7, 260, doi: 10.12688 / f1000research.13426.1). The Ras / MARK-sensitive promoter, PKC-sensitive promoter can also be used.

NFAT-чувствительный промотор представляет собой последовательность ДНК, которая содержит одну или несколько последовательностей, с которой специфично связывается NFAT. При связывании NFAT-чувствительного промотора с фактором транскрипции NFAT (например, NFATcl, NFATc2, NFATc3, NFATc4 или NFAT5) транскрипция связанных последовательностей нуклеиновых кислот (например, нижестоящих генов) усиливается. Одним из примеров последовательности ДНК, специфично связываемой NFAT, является GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT (SEQ ID NO: 1) В некоторых вариантах осуществления промотор NFAT содержит повторы SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления промотор NFAT содержит один или несколько элементов ответа NFAT, имеющих по меньшей мере 50% (например, больше 50%, больше 60%, больше 70%, больше 80%, больше 90%, больше 95% и диапазоны в них) идентичность последовательности с SEQ ID NO: 1, где элементы ответа NFAT связываются с фактором транскрипции семейства NFAT для усиления транскрипции ассоциированных (например, нисходящих) генов.An NFAT-responsive promoter is a DNA sequence that contains one or more sequences to which NFAT binds specifically. When the NFAT-responsive promoter binds to an NFAT transcription factor (eg, NFATcl, NFATc2, NFATc3, NFATc4, or NFAT5), the transcription of the linked nucleic acid sequences (eg, downstream genes) is enhanced. One example of a DNA sequence that specifically binds NFAT is GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT (SEQ ID NO: 1) In some embodiments, the NFAT promoter comprises repeats of SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the NFAT promoter comprises one or more NFAT response elements having at least at least 50% (for example, more than 50%, more than 60%, more than 70%, more than 80%, more than 90%, more than 95% and their ranges) sequence identity with SEQ ID NO: 1, where the NFAT response elements bind to the factor transcription of the NFAT family to enhance the transcription of associated (eg, downstream) genes.

Для функциональных клеточных тестов предпочтительно использование иммортализованных клеточных линий, позволяющих избежать проблем с точностью и воспроизводимостью результатов, присущих методам анализа c использованием первичных клеток (Hsieh, Y.T., Aggarwal, P., Cirelli, D., Gu, L., Surowy, T., Mozier, N.M. (2017) Characterization of FcγRIIIA effector cells used in in vitro ADCC bioassay: Comparison of primary NK cells with engineered NK-92 and Jurkat T cells, J. Immunol. Methods, 441, 56–66, doi: 10.1016/j.jim.2016.12.002). Также это позволяет при помощи методов генной и клеточной инженерии создавать клетки с необходимым фенотипом.For functional cell tests, it is preferable to use immortalized cell lines to avoid problems with the accuracy and reproducibility of results inherent in assay methods using primary cells (Hsieh, YT, Aggarwal, P., Cirelli, D., Gu, L., Surowy, T. , Mozier, NM (2017) Characterization of FcγRIIIA effector cells used in vitro ADCC bioassay: Comparison of primary NK cells with engineered NK-92 and Jurkat T cells, J. Immunol. Methods, 441, 56-66, doi: 10.1016 / j.jim.2016.12.002). It also allows the creation of cells with the required phenotype using genetic and cell engineering methods.

В некоторых вариантах осуществления эффекторная клетка представляет собой Т-клетку, включая, но не ограничиваясь этим, клетки Jurkat, HuT-78, CEM, Molt-4 и т.д. В частности, предъявленным требованиям удовлетворяет человеческая клеточная линия Т-клеточного происхождения Jurkat, которая более 30 лет успешно используется в исследовании процессов CD3-зависимой активации. На ее основе в рамках данной работы создали стабильную клеточную линию Jurkat NFAT-FLuc PD-1, экспрессирующую ген, кодирующий PD-1, и содержащую в геноме репортерный ген, кодирующий люциферазу светляка под контролем NFAT-чувствительного промотора.In some embodiments, the effector cell is a T cell, including but not limited to Jurkat cells, HuT-78, CEM, Molt-4, etc. In particular, the human cell line of T-cell origin Jurkat, which has been successfully used for more than 30 years in the study of CD3-dependent activation processes, meets these requirements. On its basis, within the framework of this work, a stable cell line Jurkat NFAT-FLuc PD-1 was created, expressing the gene encoding PD-1, and containing in the genome a reporter gene encoding firefly luciferase under the control of an NFAT-sensitive promoter.

Помимо эффекторных клеток тест-система должна включать в себя PD-L1 и активатор CD3-зависимого сигнального каскада. Наиболее физиологичным является использование PD-L1+ (PD-L1-положительных) клеток-мишеней в качестве носителя PD-L1. В качестве клеток-мишеней могут быть использованы любые клетки, представляющие на своей поверхности PD-L1. В одном из вариантов воплощения изобретения клетки-мишени представляют собой производные клеточной линии Raji или CHO-K1, представляющие на своей поверхности PD-L1.In addition to effector cells, the test system must include PD-L1 and an activator of the CD3-dependent signaling cascade. The most physiological is the use of PD-L1 + (PD-L1-positive) target cells as a carrier of PD-L1. Any cells presenting PD-L1 on their surface can be used as target cells. In one embodiment, the target cells are derived from the Raji or CHO-K1 cell line, presenting PD-L1 on their surface.

В качестве активатора CD3-зависимого сигнального каскада могут быть использованы биспецифическое антитело, способное связываться с CD3 комплексом, или CAR, включающий в себя домен CD3. CAR, являющийся производным CD3 комплекса, представляется на поверхности эффекторных репортерных клеток, одновременно является и активатором CD3-зависимого сигнального каскада.As an activator of the CD3-dependent signaling cascade, a bispecific antibody capable of binding to a CD3 complex, or a CAR containing the CD3 domain can be used. CAR, which is a derivative of the CD3 complex, appears on the surface of effector reporter cells, and is simultaneously an activator of the CD3-dependent signaling cascade.

В некоторых вариантах биспецифическое антитело, способное связываться с CD3 комплексом, представляет собой растворимое антитело. Т.е. растворимое биспецифическое антитело в данном варианте является отдельным компонентом тест-системы.In some embodiments, the bispecific antibody capable of binding to the CD3 complex is a soluble antibody. Those. the soluble bispecific antibody in this embodiment is a separate component of the test system.

В некоторых вариантах биспецифическое антитело, способное связываться с CD3 комплексом, представляет собой биспецифическое анти-CD3/анти-TAA антитело, в частности, анти-CD3/анти-CD19, анти-CD3/анти-CD20.In some embodiments, the bispecific antibody capable of binding to the CD3 complex is an anti-CD3 / anti-TAA bispecific antibody, in particular anti-CD3 / anti-CD19, anti-CD3 / anti-CD20.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к набору для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, содержащему описанную выше тест-систему и при необходимости инструкцию.In one aspect, the present invention provides a kit for assaying the functional activity of an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody, comprising a test system as described above and, if necessary, instructions.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению описанной выше тест-системы для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1.In one aspect, the present invention relates to the use of a test system as described above for assaying the functional activity of an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению описанного выше набора для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1.In one aspect, the present invention relates to the use of a kit as described above for assaying the functional activity of an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, включающему:In one aspect, the present invention provides a method for analyzing the functional activity of an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody, comprising:

а. добавление к описанной выше тест-системе антитела против PD-1 или антитела против PD-L1,and. adding an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody to the above test system,

б. инкубацию,b. incubation,

в. измерение интенсивности сигнала продукта экспрессии репортерного гена,in. measuring the signal intensity of the reporter gene expression product,

г. обработку полученных данных.d. processing of the received data.

В некоторых вариантах обработка полученных данных в описанном выше способе включает установление значения ЕС50 антитела против PD-1 или антитела против PD-L1. Экспериментально определенную активность рассчитывали, как отношение экспериментально определенной EC50 стандарта к EC50 проверяемого объекта для данной концентрации, умноженное на 100%.In some embodiments, processing the data obtained in the method described above comprises determining an EC50 value of an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody. The experimentally determined activity was calculated as the ratio of the experimentally determined EC50 of the standard to the EC50 of the test object for a given concentration, multiplied by 100%.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу определения функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, включающему:In one aspect, the present invention provides a method for determining the functional activity of an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody, comprising:

а. добавление к тест-системе по п. 1 антитела против PD-1 или антитела против PD-L1,and. adding an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody to the test system according to claim 1,

б. инкубацию,b. incubation,

в. измерение интенсивности сигнала продукта экспрессии репортерного гена,in. measuring the signal intensity of the reporter gene expression product,

г. обработку полученных данных, в том числе установление значения ЕС50 антитела против PD-1 или антитела против PD-L1,d. processing the data obtained, including determining the EC50 value of anti-PD-1 antibody or anti-PD-L1 antibody,

д. расчет отношения экспериментально определенной EC50 стандартного образца, активность которого принимают за 100%, к экспериментально определенной EC50 сравниваемого антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, умноженного на 100%.e. calculation of the ratio of the experimentally determined EC50 of a standard sample, whose activity is taken as 100%, to the experimentally determined EC50 of the compared anti-PD-1 antibody or anti-PD-L1 antibody, multiplied by 100%.

Такие анализы могут проводиться с использованием систем, способов, устройств, робототехники и другого оборудования, известного в данной области техники. Например, клетки-мишени и эффекторные клетки совместно культивируют в 96- или 384-луночных планшетах, и робототехнику используют для эффективного введения библиотеки тестируемых антител и для обнаружения сигнала репортера. В некоторых вариантах осуществления предоставляются компоненты, композиции, устройства, оборудование и т.д. (например, вместе с описанными здесь компонентами анализа (например, эффекторными клетками и клетками-мишенями)) для проведения анализов. В некоторых вариантах осуществления компоненты могут включать питательные среды, сыворотку, питательные добавки (например, достаточные для совместного культивирования клеток-мишеней и эффекторных клеток), буферы, репортерный субстрат (например, люциферин, коелентеразин или их производные и т.д.) средства контроля или стандартные образцы (например, положительные контроли, о которых известно, что они ингибируют взаимодействия PD-1 с PD-L1) и т.д.Such analyzes can be performed using systems, methods, devices, robotics, and other equipment known in the art. For example, target cells and effector cells are co-cultured in 96 or 384 well plates, and robotics are used to efficiently inject a test antibody library and to detect a reporter signal. In some embodiments, components, compositions, devices, equipment, etc. are provided. (eg, together with the assay components described herein (eg, effector cells and target cells)) for performing the assays. In some embodiments, the components may include nutrient media, serum, nutritional supplements (eg, sufficient for coculture of target cells and effector cells), buffers, a reporter substrate (eg, luciferin, colenterazine, or derivatives thereof, etc.) controls or standard samples (e.g., positive controls known to inhibit PD-1 interactions with PD-L1), etc.

В некоторых вариантах осуществления предусмотрены культуральные колбы и флаконы, микроцентрифужные пробирки, микропланшеты, включающие 96- и 384-луночные планшеты, считыватели, водяную баню, CO2-инкубатор, одноканальные и многоканальные пипетки и т.д. В некоторых вариантах осуществления предусмотрены робототехника для анализов с высокой пропускной способностью (например, выдача реагентов, организация образцов, обнаружение репортерных генов и т.д.), инструменты для обнаружения репортерных генов (например, флюориметр, люминометр, спектрофотометр, планшеты Taqman, ELISA и т.д.) и т.д.In some embodiments, culture flasks and flasks, microcentrifuge tubes, microplates including 96- and 384-well plates, readers, water bath, CO 2 incubator, single-channel and multi-channel pipettes, etc. are provided. In some embodiments, high throughput robotics (e.g., dispensing reagents, organizing samples, detecting reporter genes, etc.), tools for detecting reporter genes (e.g., fluorimeter, luminometer, spectrophotometer, Taqman plates, ELISA plates, etc.) are provided. etc.), etc.

В некоторых вариантах осуществления все или часть компонентов для выполнения анализа, описанного в данном документе, предоставляются в виде набора. Компоненты могут быть в отдельных контейнерах, которые упакованы вместе или отдельно для удобства или других соображений. В некоторых вариантах осуществления компоненты (например, клетки-мишени, эффекторные клетки и т.д.) предоставляются в заранее определенных количествах в соответствии с размером и / или количеством анализов, которые пользователь намеревается выполнить. В некоторых вариантах осуществления также предусмотрены принадлежности (например, сосуды, чашки и т.д.), инструкции, другие компоненты (например, буферы, контроли, носитель, субстрат для репортерного белка и т.д.) и т.д.In some embodiments, all or part of the components for performing the assay described herein are provided as a kit. Components can be in separate containers that are packaged together or separately for convenience or other considerations. In some embodiments, the components (eg, target cells, effector cells, etc.) are provided in predetermined amounts according to the size and / or number of assays that the user intends to perform. In some embodiments, accessories (eg, vessels, plates, etc.), instructions, other components (eg, buffers, controls, media, reporter protein substrate, etc.), etc. are also provided.

Тест-система может быть использована на стадии разработки aPD-1 и aPD-L1 для сравнения кандидатов, оценки их стабильности, а также характеристики серий терапевтического препарата для подтверждения их эквивалентности, требующей в большинстве случаев соответствия 80–125% активности относительно стандартного образца.The test system can be used at the development stage of aPD-1 and aPD-L1 to compare candidates, assess their stability, as well as characterize therapeutic batches to confirm their equivalence, which in most cases requires 80–125% activity relative to a standard sample.

Возможно дополнительное улучшение параметров данной тест-системы, например, за счет снижения фонового сигнала путем использования дестабилизированной версии репортерного белка люциферазы.It is possible to further improve the parameters of this test system, for example, by reducing the background signal by using a destabilized version of the luciferase reporter protein.

ПримерыExamples of

Материалы и методы.Materials and methods.

Реактивы Reagents

Среды DMEM/F12 и RPMI-1640 («ПанЭко», Россия); инактивированная эмбриональная бычья сыворотка («Gibco», США); классические моноклональные антитела против PD-1 человека, PD-L1 человека, цитотоксического Т-лимфоцит-ассоциированного белка 4 (CTLA4) человека (aCTLA4), рецептора эпидермального фактора роста человека 2 (HER2) (aHER2), биспецифические моноклональные антитела против CD3 человека и опухоль-ассоциированного антигена человека 1 (aCD3/aTAA1) и 2 (aCD3/aTAA2) («BIOCAD», Россия); мышиное моноклональное антитело против CD3 человека, клон HIT3a («BD», США); набор для детекции активности люциферазы ONE-Glo («Promega», США); стафилококковый энтеротоксин Б (SEB) («Toxin Technology», США).Environment DMEM / F12 and RPMI-1640 (PanEco, Russia); inactivated fetal bovine serum (Gibco, USA); classic monoclonal antibodies against human PD-1, human PD-L1, human cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 (CTLA4) (aCTLA4), human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) (aHER2), bispecific monoclonal antibodies against human CD3 and human tumor-associated antigen 1 (aCD3 / aTAA1) and 2 (aCD3 / aTAA2) (BIOCAD, Russia); mouse monoclonal antibody against human CD3, clone HIT3a (BD, USA); kit for detecting the activity of luciferase ONE-Glo ("Promega", USA); staphylococcal enterotoxin B (SEB) (Toxin Technology, USA).

Клеточные линии.Cell lines.

Клетки Jurkat, Raji и CHO-K1 культивировали при 37 °С в атмосфере с 5% CO2 в соответствующей питательной среде с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, в случае клеток Jurkat, Raji – в среде RPMI-1640, в случае CHO-K1 – в среде DMEM/F12. Все клеточные линии, использованные для инженерии, а также полученные на их основе репортерные линии, были протестированы на отсутствие контаминации микоплазмами набором VenorTM GeM Mycoplasma Detection Kit, PCR-based («Sigma Aldrich», США).Jurkat, Raji and CHO-K1 cells were cultured at 37 ° C in an atmosphere with 5% CO2 in an appropriate nutrient medium supplemented with 10% fetal bovine serum, in the case of Jurkat, Raji cells - in RPMI-1640 medium, in the case of CHO-K1 - in the DMEM / F12 environment. All cell lines used for engineering, as well as the reporter lines obtained on their basis, were tested for the absence of mycoplasma contamination with the VenorTM GeM Mycoplasma Detection Kit, PCR-based (Sigma Aldrich, USA).

Пример 1Example 1

Создание генетических конструкцийCreation of genetic constructs

Плазмидный вектор pOGI_NFAT-FLuc создан на основе вектора pOGI («BIOCAD», Россия), он содержит ген, кодирующий люциферазу светляка Photinus pyralis (FLuc), под контролем минимального промотора интерлейкина 2 (IL-2), содержащего 3 копии последовательностей, связывающих ядерный фактор активированных T-лимфоцитов (NFAT), а также экспрессионную кассету с геном устойчивости к гигромицину.The pOGI_NFAT-FLuc plasmid vector is based on the pOGI vector (BIOCAD, Russia); it contains the gene encoding the luciferase of the firefly Photinus pyralis (FLuc) under the control of the minimal promoter of interleukin 2 (IL-2) containing 3 copies of the sequences that bind nuclear factor of activated T lymphocytes (NFAT); and an expression cassette with the hygromycin resistance gene.

Плазмидные вектора pSX_tmaCD3, pSX_PD-1 и pSX_PD-L1 созданы на основе вектора pSX («BIOCAD», Россия). pSX_tmaCD3 содержит ген, кодирующий антитело OKT3 в формате одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv), слитое с трансмембранным доменом рецептора тромбоцитарного фактора роста, под контролем цитомегаловирусного (CMV) промотора, а также экспрессионную кассету с геном устойчивости к пуромицину. pSX_PD-1 содержит ген, кодирующий PD-1 человека, под контролем CMV промотора, а также экспрессионную кассету с геном устойчивости к генетицину (неомицину). pSX_PD-L1 содержит ген, кодирующий PD-L1 человека, под контролем CMV промотора, а также экспрессионную кассету с геном устойчивости к генетицину (неомицину).Plasmid vectors pSX_tmaCD3, pSX_PD-1, and pSX_PD-L1 were created on the basis of the pSX vector (BIOCAD, Russia). pSX_tmaCD3 contains the gene encoding the OKT3 antibody in the single-chain variable fragment (scFv) format fused to the transmembrane domain of the platelet growth factor receptor under the control of the cytomegalovirus (CMV) promoter, as well as an expression cassette with the puromycin resistance gene. pSX_PD-1 contains the gene encoding human PD-1 under the control of the CMV promoter, as well as an expression cassette with the gene for resistance to geneticin (neomycin). pSX_PD-L1 contains the gene encoding human PD-L1 under the control of the CMV promoter, as well as an expression cassette with the gene for resistance to geneticin (neomycin).

Пример 2Example 2

Создание стабильных клеточных линийCreation of stable cell lines

Клеточную линию Jurkat NFAT-FLuc создали путем электропорации клеток Jurkat вектором pOGI_NFAT-FLuc с последующей селекцией клеток на гигромицине Б. Из них отобрали резистентные клоны, показавшие максимальное увеличение экспрессии люциферазы при добавлении aCD3.The Jurkat NFAT-FLuc cell line was created by electroporation of Jurkat cells with the pOGI_NFAT-FLuc vector, followed by cell selection for hygromycin B. From them, resistant clones were selected that showed the maximum increase in luciferase expression upon addition of aCD3.

Клеточную линию Jurkat NFAT-FLuc PD-1 создали электропорацией клеток Jurkat NFAT-FLuc вектором pSX_PD-1 с последующей селекцией на генетицине. Целевые клоны отбирали по максимальному содержанию PD-1 на поверхности клеток, которое определяли с помощью проточного цитофлуориметра Guava 12HT («Millipore», США) после окрашивания клеток aPD-1.The Jurkat NFAT-FLuc PD-1 cell line was created by electroporation of Jurkat NFAT-FLuc cells with the pSX_PD-1 vector, followed by selection for geneticin. Target clones were selected based on the maximum PD-1 content on the cell surface, which was determined using a Guava 12HT flow cytometer (Millipore, United States) after staining the cells with aPD-1.

Клеточную линию Raji PD-L1 создали электропорацией клеток Raji вектором pSX_PD-L1 с последующей селекцией на генетицине. Целевые клоны отбирали по максимальному содержанию PD-L1 на поверхности клеток, которое определяли методом проточной цитофлуориметрии после окрашивания клеток aPD-L1.The Raji PD-L1 cell line was created by electroporation of Raji cells with the pSX_PD-L1 vector, followed by selection for geneticin. Target clones were selected based on the maximum PD-L1 content on the cell surface, which was determined by flow cytometry after staining the cells with aPD-L1.

Клеточную линию Jurkat NFAT-FLuc PD-1 CAR создали трансдукцией клеток Jurkat NFAT-FLuc PD-1 лентивирусными частицами, кодирующими химерный антигенный рецептор (CAR), соединенный пептидным линкером T2A с зеленым флюоресцентным белком (GFP) («BIOCAD», Россия). Пул клеток анализировали на наличие GFP-позитивных клеток методом проточной цитофлуориметрии.The Jurkat NFAT-FLuc PD-1 CAR cell line was created by transduction of Jurkat NFAT-FLuc PD-1 cells with lentiviral particles encoding a chimeric antigen receptor (CAR) linked by a peptide linker T2A with a green fluorescent protein (GFP) (BIOCAD, Russia). The cell pool was analyzed for the presence of GFP-positive cells by flow cytometry.

Клеточную линию CHO PD-L1 tmaCD3 создали трансфекцией клеток CHO-K1 вектором pSX_PD-L1 и pSX_tmaCD3 с последующей селекцией на генетицине и пуромицине. Клоны скринировали с помощью флюоресцентно меченных антител против PD-L1 и Fc-фрагмента антител человека методом проточной цитофлуориметрии. Целевые клоны отбирали по максимальному содержанию PD-L1 и трансмембранных aCD3 (tmaCD3) на поверхности клеток, которое определяли методом проточной цитофлуориметрии окрашиванием клеток aPD-L1 и антителами против Fc-фрагмента антител человека.The CHO PD-L1 tmaCD3 cell line was created by transfection of CHO-K1 cells with the pSX_PD-L1 and pSX_tmaCD3 vectors, followed by selection for Geneticin and Puromycin. Clones were screened using fluorescently labeled antibodies against PD-L1 and the Fc fragment of human antibodies by flow cytometry. Target clones were selected based on the maximum content of PD-L1 and transmembrane aCD3 (tmaCD3) on the cell surface, which was determined by flow cytometry by staining cells with aPD-L1 and antibodies against the Fc fragment of human antibodies.

Пример 3Example 3

Функциональные тестыFunctional tests

Тесты проводили в белых культуральных 96-луночных планшетах для работы с люминесценцией («SPL Life Sciences», Республика Корея). Если не указано другое, суспензия содержала 50 000 клеток Jurkat NFAT-FLuc PD-1 и 25 000 клеток Raji PDL1 на лунку и aCD3/aTAA1 в концентрации 1 нг/мл. В случае замены клеток Jurkat NFAT-FLuc PD-1 клетками Jurkat NFAT-FLuc PD-1 CAR, их количество также составляло 50 000 клеток на лунку. В случае замены клеток Raji PD-L1 клетками Raji, либо CHO PD-L1 tmaCD3, их количество также составляло 25 000 клеток на лунку. Конечный объем клеточной суспензии в лунке составлял 100 мкл, все компоненты суспензии готовили в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки. После добавления всех компонентов планшеты инкубировали в течение 16 ч при 37 °С в атмосфере с 5% CO2, далее измеряли интенсивность люминесценции в лунках с использованием набора ONE-Glo и планшетного ридера SPARK 20M («Tecan», Швейцария).The tests were carried out in white culture 96-well plates for luminescence (SPL Life Sciences, Republic of Korea). Unless otherwise indicated, the suspension contained 50,000 Jurkat NFAT-FLuc PD-1 cells and 25,000 Raji PDL1 cells per well and aCD3 / aTAA1 at a concentration of 1 ng / ml. When Jurkat NFAT-FLuc PD-1 cells were replaced with Jurkat NFAT-FLuc PD-1 CAR cells, their number was also 50,000 cells per well. In the case of replacing Raji PD-L1 cells with Raji cells, or CHO PD-L1 tmaCD3 cells, their number was also 25,000 cells per well. The final volume of the cell suspension in the well was 100 μl; all components of the suspension were prepared in RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum. After adding all the components, the plates were incubated for 16 h at 37 ° C in an atmosphere with 5% CO2, then the luminescence intensity in the wells was measured using the ONE-Glo kit and a SPARK 20M plate reader (Tecan, Switzerland).

Пример 4Example 4

Обработка данныхData processing

Для построения кривых зависимости величины активации клеток от концентрации указанного в эксперименте антитела использовали 4-х параметрическую логистическую аппроксимирующую функцию. Уравнение функции выглядит следующим образом:To plot the curves of the dependence of the magnitude of cell activation on the concentration of the antibody indicated in the experiment, a 4-parameter logistic approximating function was used. The function equation looks like this:

Figure 00000001
,
Figure 00000001
,

где x – концентрация антитела, в нг/мл; max – верхняя асимптота; min – нижняя асимптота; Hillslope – параметр кривизны; EC50 – значение полуэффективной концентрации, в нг/мл.where x is the concentration of the antibody, in ng / ml; max - upper asymptote; min is the lower asymptote; Hillslope - curvature parameter; EC50 is the value of the semi-effective concentration, in ng / ml.

Аппроксимацию и построение графиков проводили в программном пакете SigmaPlot, (SYSTAT Software). Из аппроксимирующего уравнения кривой определяли параметр полуэффективной концентрации (EC50). Измерения всех экспериментальных точек проводили как минимум в двух повторах. Точки, приведенные на рисунках, соответствуют среднему значению по всем повторам, планки погрешностей, приведенные на рисунках, – значениям стандартного отклонения для соответствующих повторов.The approximation and plotting were performed using the SigmaPlot software package (SYSTAT Software). The semi-effective concentration parameter (EC50) was determined from the curve fitting equation. All experimental points were measured in at least two repetitions. The points shown in the figures correspond to the average value for all repetitions, the error bars shown in the figures correspond to the standard deviation values for the corresponding repeats.

Пример 5Example 5

Выбор варианта активации CD3Selecting CD3 Activation Option

В ходе данной работы рассмотрены несколько вариантов активации CD3, которые могут быть использованы в тест-системе (фиг. 1):In the course of this work, several variants of CD3 activation were considered, which can be used in the test system (Fig. 1):

1. Взаимодействие T-клеточного рецептора (TCR) со специфичным ему комплексом пептида и главного комплекса гистосовместимости (MHC) является способом активации, наиболее близким к природному механизму действия (фиг. 1, а).1. Interaction of a T-cell receptor (TCR) with a specific complex of a peptide and a major histocompatibility complex (MHC) is the activation method that is closest to the natural mechanism of action (Fig. 1, a).

2. Суперантигены способны одновременно связывать β-цепь TCR с MHC класса 2 (MHC-II), что имитирует узнавание TCR комплекса MHC/пептид (фиг. 1, б). В качестве примера суперантигена в работе использовали SEB (стафилококковый энтеротоксин Б).2. Superantigens are able to simultaneously bind the β-chain of TCR with MHC class 2 (MHC-II), which mimics the recognition of the TCR complex MHC / peptide (Fig. 1, b). SEB (staphylococcal enterotoxin B) was used as an example of a superantigen.

3. Растворимые активирующие антитела против CD3ε наиболее часто используют для активации CD3 (фиг. 1, в).3. Soluble activating antibodies against CD3ε are most often used to activate CD3 (Fig. 1c).

4. Трансмембранные антитела против CD3ε, представленные на клетках-мишенях, обычно используют в описанных тест-системах для aPD-1 и aPD-L1 (фиг. 1, г).4. Transmembrane antibodies against CD3ε, presented on target cells, are usually used in the described test systems for aPD-1 and aPD-L1 (Fig. 1, d).

5. CAR+ (CAR-положительные) эффекторные клетки могут оказаться интересной альтернативой для тестирования aPD-1 и aPD-L1. Внутриклеточная часть CAR обычно включает в себя сигнальный домен CD3ζ, который обеспечивает активацию сигнальных каскадов, аналогичных полноразмерному CD3 комплексу (фиг. 1, д). Есть сообщения об усилении эффекта CAR-T терапии при ее совмещении с блокаторами PD-1/PD-L1.5. CAR + (CAR-positive) effector cells may prove to be an interesting alternative for testing aPD-1 and aPD-L1. The intracellular part of CAR usually includes the CD3ζ signaling domain, which provides activation of signaling cascades similar to the full-length CD3 complex (Fig. 1e). There are reports of increased effect of CAR-T therapy when combined with PD-1 / PD-L1 blockers.

6. Биспецифические aCD3/aTAA являются еще одним вариантом активации CD3 (фиг. 1, е). В одном из вариантов воплощения изобретения TAA (опухоль-ассоциированный антиген человека) выбран из TAA1 или TAA2, где TAA1 является CD20, TAA2 является CD19,6. Bispecific aCD3 / aTAA is another variant of CD3 activation (Fig. 1f). In one embodiment, the TAA (human tumor associated antigen) is selected from TAA1 or TAA2, where TAA1 is CD20, TAA2 is CD19,

Активация, опосредованная взаимодействием TCR с комплексом MHC/пептид, сложна с точки зрения практической реализации относительно других подходов и далее рассматриваться в данной работе не будет.Activation mediated by the interaction of TCR with the MHC / peptide complex is difficult from the point of view of practical implementation relative to other approaches and will not be considered further in this work.

Для определения оптимального варианта активации CD3 при разработке тест-системы сначала сравнили только растворимые активаторы: aCD3, aCD3/aTAA1, aCD3/aTAA2 и SEB (фиг. 2). Активаторы CD3 оценивали по двум параметрам: абсолютная активация (интенсивность люминесценции образца в системе, содержащей эффекторные клетки, клетки-мишени, активатор и aPD-1) и относительная активация (отношение интенсивности люминесценции образцов, содержащих эффекторные клетки, клетки-мишени, активатор и aPD-1, к интенсивности люминесценции аналогичных образцов, не содержащих aPD-1). Абсолютная активация тест-системы на основе aCD3/aTAA1 и aCD3/aTAA2 примерно в 2–3 раза больше, чем на основе aCD3 и SEB. При этом стоит отметить, что концентрации aCD3 и SEB, используемые в исследовании, превышают концентрацию биспецифических антител 1000 и 100 раз соответственно. Растворимые aCD3, в отличие от других описанных выше активаторов CD3, вызывают активацию всех эффекторных клеток, а не только тех, которые непосредственно взаимодействуют с клетками-мишенями. При использовании PD-L1+ клеток-мишеней опосредованное PD-1 подавление CD3-зависимой активации происходит не во всех эффекторных клетках. Это приводит к повышению фонового уровня сигнала в системе и, как следствие, низкому значению относительной активации. Относительная активация для тест-системы с использованием aCD3/aTAA1 и aCD3/aTAA2 составляет примерно 5–6 раз, aCD3 – 1,5 раза, SEB – 2 раза. Таким образом, aCD3 и SEB уступают биспецифическим антителам по абсолютной и относительной активации и не рассматривались в дальнейших исследованиях. Также суперантигены являются токсинами, что делает их использование нежелательным, если есть альтернативные варианты.To determine the optimal variant of CD3 activation during the development of the test system, only soluble activators were first compared: aCD3, aCD3 / aTAA1, aCD3 / aTAA2, and SEB (Fig. 2). CD3 activators were assessed by two parameters: absolute activation (the luminescence intensity of the sample in a system containing effector cells, target cells, an activator, and aPD-1) and relative activation (the ratio of the luminescence intensity of samples containing effector cells, target cells, an activator, and aPD -1 to the luminescence intensity of similar samples not containing aPD-1). The absolute activation of the test system based on aCD3 / aTAA1 and aCD3 / aTAA2 is approximately 2–3 times greater than that based on aCD3 and SEB. It should be noted that the concentrations of aCD3 and SEB used in the study exceed the concentration of bispecific antibodies 1000 and 100 times, respectively. Soluble aCD3, in contrast to the other CD3 activators described above, cause the activation of all effector cells, and not only those that directly interact with target cells. When PD-L1 + target cells are used, PD-1-mediated suppression of CD3-dependent activation does not occur in all effector cells. This leads to an increase in the background signal level in the system and, as a consequence, a low value of the relative activation. The relative activation for the test system using aCD3 / aTAA1 and aCD3 / aTAA2 is approximately 5-6 times, aCD3 - 1.5 times, SEB - 2 times. Thus, aCD3 and SEB are inferior to bispecific antibodies in absolute and relative activation and were not considered in further studies. Also, superantigens are toxins, which makes their use undesirable if there are alternatives.

Преимущество растворимых активаторов CD3 по сравнению с трансмембранными активирующими молекулами заключается в возможности подбора их оптимальной концентрации, что делает систему более гибкой (фиг. 3, фиг. 4). Максимальную кратность увеличения интенсивности люминесценции при добавлении aPD-1 наблюдали в диапазоне 0,1–1 нг/мл для обоих aCD3/aTAA. Для экспериментов использовали концентрацию aCD3/aTAA 1 нг/мл, при которой сохраняется максимальный уровень относительной активации и наблюдаются более высокие абсолютные значения интенсивности люминесценции.The advantage of soluble CD3 activators in comparison with transmembrane activating molecules lies in the possibility of selecting their optimal concentration, which makes the system more flexible (Fig. 3, Fig. 4). The maximum fold increase in the luminescence intensity upon addition of aPD-1 was observed in the range 0.1–1 ng / ml for both aCD3 / aTAA. For the experiments, the concentration of aCD3 / aTAA 1 ng / ml was used, at which the maximum level of relative activation is maintained and higher absolute values of the luminescence intensity are observed.

Далее мы сравнили 4 тест-системы, основанные на одном из следующих вариантов активации: двух вариантов aCD3/aTAA, клеток-мишеней с трансмембранным aCD3 (антителом против CD3) или CAR+ эффекторных клеток (фиг. 5, фиг. 6). По значениям абсолютной активации вариант с использованием CAR+ эффекторных клеток примерно в 5 раз превосходит варианты, основанные на aCD3/aTAA и клетках-мишенях с трансмембранным aCD3. Относительная активация в вариантах с aCD3/aTAA превосходит варианты с использованием трансмембранных молекул в 2-3 раза. При этом по относительной активации тест-система с использованием aCD3/aTAA1 превосходит систему на основе aCD3/aTAA2.Next, we compared 4 test systems based on one of the following activation options: two variants of aCD3 / aTAA, target cells with transmembrane aCD3 (anti-CD3 antibody) or CAR + effector cells (Fig. 5, Fig. 6). In terms of absolute activation values, the variant using CAR + effector cells is approximately 5 times superior to the variants based on aCD3 / aTAA and target cells with transmembrane aCD3. The relative activation in variants with aCD3 / aTAA exceeds the variants with the use of transmembrane molecules by 2-3 times. At the same time, in terms of relative activation, the test system using aCD3 / aTAA1 surpasses the system based on aCD3 / aTAA2.

Экспериментально показали, что из всех проверенных вариантов максимальная относительная активация при добавлении aPD-1 наблюдается при использовании биспецифических aCD3/aTAA в качестве активаторов CD3 (фиг. 2, фиг. 5, фиг. 6). Кроме того, к преимуществам их использования можно отнести низкий фоновый сигнал (в отличие от aCD3), исключение дополнительных генно-инженерных работ (в отличие от CAR и tmaCD3), нетоксичность (в отличие от суперантигенов).It was experimentally shown that of all the variants tested, the maximum relative activation upon addition of aPD-1 was observed when bispecific aCD3 / aTAA were used as CD3 activators (Fig. 2, Fig. 5, Fig. 6). In addition, the advantages of their use include a low background signal (in contrast to aCD3), the exclusion of additional genetic engineering work (in contrast to CAR and tmaCD3), and nontoxicity (in contrast to superantigens).

Тест-система, содержащая CAR качестве активаторов CD3, хоть и требует больше генно-инженерных работ по сравнению с тест-системой, содержащей биспецифические aCD3/aTAA антитела качестве активаторов CD3, позволяет оценивать ингибирующее влияние PD-1 на CAR-опосредованную активацию CAR-T клеток. Потенциально подход может быть использован для разработки препаратов на основе CAR.The test system containing CARs as CD3 activators, although it requires more genetic engineering work compared to the test system containing bispecific aCD3 / aTAA antibodies as CD3 activators, makes it possible to assess the inhibitory effect of PD-1 on CAR-mediated CAR-T activation. cells. The approach could potentially be used to develop CAR-based drugs.

Пример 6Example 6

Характеристика тест-системыCharacteristics of the test system

Для доказательства специфичности выбранной тест-системы ее использовали для тестирования aPD-1, aPD-L1, aCTLA4 и aHER2 (фиг. 7). В выбранной тест-системе подавление CD3-зависимой активации обеспечивается наличием PD-1 на эффекторных клетках и PD-L1 на клетках-мишенях. Реактивация NFAT-зависимой экспрессии гена, кодирующего FLuc, происходит при добавлении aPD-1 или aPD-L1, но не aCTLA4 или aHER2, используемых в качестве отрицательного контроля. Кривые зависимости интенсивности люминесценции образцов от концентрации антител могут быть описаны 4-х параметрическим логистическим уравнением, что позволяет сравнивать исследуемые препараты по значениям EC50.To prove the specificity of the selected test system, it was used to test aPD-1, aPD-L1, aCTLA4 and aHER2 (Fig. 7). In the selected test system, suppression of CD3-dependent activation is ensured by the presence of PD-1 on effector cells and PD-L1 on target cells. Reactivation of NFAT-dependent expression of the gene encoding FLuc occurs upon the addition of aPD-1 or aPD-L1, but not aCTLA4 or aHER2 used as a negative control. The curves of the dependence of the luminescence intensity of the samples on the concentration of antibodies can be described by a 4-parameter logistic equation, which makes it possible to compare the studied preparations by the EC50 values.

Пример 7Example 7

Исследование стабильности образцов aPD-1 и aPD-L1Stability study of aPD-1 and aPD-L1 samples

По 50 мкл исходных растворов aPD-1 и aPD-L1 (c концентрацией 25 мг/мл) инкубировали в микропробирках объемом 200 мкл в ПЦР-амплификаторе («Bio-Rad», США) в течение 1 ч при указанных температурах. Исследование проводили как описано в примере 3 «Функциональные тесты».50 μL of the aPD-1 and aPD-L1 stock solutions (with a concentration of 25 mg / ml) were incubated in 200 μL microtubes in a PCR amplifier (Bio-Rad, USA) for 1 h at the indicated temperatures. The study was carried out as described in example 3 "Functional tests".

Для определения способности тест-системы различать препараты ингибиторов PD-1/PD-L1 с различной активностью мы использовали препараты aPD-1 и aPD-L1, которые были подвергнуты термическому стрессу (фиг. 8, фиг. 9). Наблюдается прямая зависимость между значениями EC50 и температуры, при которой были проинкубированы препараты. Таким образом система способна различать препараты aPD-1 и aPD-L1 с различным уровнем активности и может быть успешно использована для определения их стабильности.To determine the ability of the test system to distinguish between drugs of PD-1 / PD-L1 inhibitors with different activity, we used drugs aPD-1 and aPD-L1, which were subjected to thermal stress (Fig. 8, Fig. 9). There is a direct relationship between the EC50 values and the temperature at which the preparations were incubated. Thus, the system is able to distinguish between aPD-1 and aPD-L1 preparations with different levels of activity and can be successfully used to determine their stability.

Пример 8Example 8

Исследование линейного диапазона тест-системы.Study of the linear range of the test system.

Для сравнения ожидаемой и экспериментально определенной активности aPD-1 и aPD-L1 готовили разведения данных препаратов в концентрациях 200%, 140%, 70% и 50% относительно концентрации стандартного образца, максимальная конечная концентрация которого в тесте составляла 100 мкг/мл, его активность принимали за 100%. Исследование проводили, как описано в разделе «Функциональные тесты». Экспериментально определенную активность рассчитывали, как отношение экспериментально определенной EC50 стандарта к экспериментально определенной EC50 для данной концентрации, умноженное на 100%. To compare the expected and experimentally determined activities of aPD-1 and aPD-L1, dilutions of these drugs were prepared at concentrations of 200%, 140%, 70% and 50% relative to the concentration of a standard sample, the maximum final concentration of which in the test was 100 μg / ml, its activity was taken as 100%. The study was carried out as described in the Functional Tests section. The experimentally determined activity was calculated as the ratio of the experimentally determined EC50 of the standard to the experimentally determined EC50 for a given concentration, multiplied by 100%.

Тест-система может быть использована, если активность исследуемого образца совпадает с диапазоном, в котором система сохраняет линейную зависимость активности препарата от его концентрации. Для определения линейности тест-системы в диапазоне 50–200% были использованы препараты aPD-1 и aPD-L1 с ожидаемой активностью 50%, 70%, 100%, 140% и 200% относительно стандарта, активность которого принимали за 100% (фиг. 10, фиг. 11). Показано, что их активность в эксперименте схожа с ожидаемой. Система является линейной в диапазоне 50–200% относительно активности стандарта для aPD-1 и aPD-L1.The test system can be used if the activity of the test sample coincides with the range in which the system maintains a linear dependence of the drug activity on its concentration. To determine the linearity of the test system in the range of 50-200%, aPD-1 and aPD-L1 preparations were used with the expected activity of 50%, 70%, 100%, 140% and 200% relative to the standard, the activity of which was taken as 100% (Fig. . 10, fig. 11). It is shown that their activity in the experiment is similar to the expected one. The system is linear over the range of 50-200% relative to the activity of the aPD-1 and aPD-L1 standard.

Таким образом, разработанная тест-система, содержащая биспецифические aCD3/aTAA антитела в качестве активаторов CD3 (фиг. 12), характеризуется максимальной относительной активацией при добавлении aPD-1 среди всех проверенных вариантов (фиг. 2, фиг. 5, фиг. 6). Кроме того, к преимуществам ее использования можно отнести низкий фоновый сигнал (в отличие от aCD3), исключение дополнительных генно-инженерных работ (в отличие от CAR и tmaCD3), нетоксичность (в отличие от суперантигенов).Thus, the developed test system containing bispecific aCD3 / aTAA antibodies as CD3 activators (Fig. 12) is characterized by the maximum relative activation upon addition of aPD-1 among all tested variants (Fig. 2, Fig. 5, Fig. 6) ... In addition, the advantages of its use include a low background signal (as opposed to aCD3), the exclusion of additional genetic engineering work (as opposed to CAR and tmaCD3), and non-toxicity (as opposed to superantigens).

Claims (32)

1. Тест-система для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, содержащая:1. Test system for analyzing the functional activity of antibodies against PD-1 or antibodies against PD-L1, containing: а. эффекторные репортерные клетки, имеющие на своей поверхности функциональный CD3 комплекс, PD-1 и содержащие репортерный ген под контролем CD3-зависимого промотора,and. effector reporter cells with a functional CD3 complex, PD-1 on their surface and containing a reporter gene under the control of a CD3-dependent promoter, б. клетки-мишени, представляющие на своей поверхности PD-L1,b. target cells presenting PD-L1 on their surface, в. активатор CD3-зависимого сигнального каскада,in. activator of CD3-dependent signaling cascade, где активатор CD3-зависимого сигнального каскада представляет собой биспецифическое антитело, способное связываться с CD3 комплексом.where the activator of the CD3-dependent signaling cascade is a bispecific antibody capable of binding to the CD3 complex. 2. Тест-система для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, содержащая:2. Test system for analyzing the functional activity of antibodies against PD-1 or antibodies against PD-L1, containing: а. эффекторные репортерные клетки, имеющие на своей поверхности производное функционального CD3 комплекса, активатор CD3-зависимого сигнального каскада, PD-1 и содержащие репортерный ген под контролем CD3-зависимого промотора,and. effector reporter cells having on their surface a derivative of a functional CD3 complex, an activator of a CD3-dependent signaling cascade, PD-1 and containing a reporter gene under the control of a CD3-dependent promoter, б. клетки-мишени, представляющие на своей поверхности PD-L1,b. target cells presenting PD-L1 on their surface, где производным функционального CD3 комплекса и активатором CD3-зависимого сигнального каскада одновременно является химерный антигенный рецептор, включающий в себя домен CD3.where a derivative of a functional CD3 complex and an activator of the CD3-dependent signaling cascade is simultaneously a chimeric antigen receptor including the CD3 domain. 3. Тест-система по п. 1, где биспецифическое антитело, способное связываться с CD3 комплексом, представляет собой биспецифическое анти-СD3/анти-ТАА антитело.3. The test system of claim 1, wherein the bispecific antibody capable of binding to the CD3 complex is an anti-CD3 / anti-TAA bispecific antibody. 4. Тест-система по п. 3, где анти-СD3/анти-ТАА антитело выбрано из анти-CD3/aнти-CD19 антитела, анти-CD3/aнти-CD20 антитела.4. The test system of claim 3, wherein the anti-CD3 / anti-TAA antibody is selected from anti-CD3 / anti-CD19 antibody, anti-CD3 / anti-CD20 antibody. 5. Тест-система по пп. 1, 2, где эффекторные репортерные клетки представляют собой Т-лимфоциты.5. The test system according to PP. 1, 2, where the effector reporter cells are T lymphocytes. 6. Тест-система по п. 5, где Т-лимфоциты представляют собой Jurkat.6. The test system of claim 5, wherein the T lymphocytes are Jurkat. 7. Тест-система по пп. 1, 2, где клетки-мишени представляют собой Raji или СНО-K1.7. The test system according to PP. 1, 2, where the target cells are Raji or CHO-K1. 8. Тест-система по пп. 1, 2, где репортерный ген выбран из гена, кодирующего флюоресцентный или люминесцентный белок.8. Test system according to PP. 1, 2, where the reporter gene is selected from a gene encoding a fluorescent or luminescent protein. 9. Тест-система по п. 8, где люминесцентный белок представляет собой люциферазу.9. The test system of claim 8, wherein the luminescent protein is luciferase. 10. Тест-система по пп. 1, 2, где СD3-зависимый промотор выбран из NFAT-чувствительного промотора или NF-κВ-чувствительного промотора.10. Test system according to PP. 1, 2, where the CD3-dependent promoter is selected from an NFAT-sensitive promoter or an NF-κB-sensitive promoter. 11. Набор для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, содержащий тест-систему по любому из пп. 1-10, и при необходимости инструкцию.11. Kit for the analysis of the functional activity of antibodies against PD-1 or antibodies against PD-L1, containing a test system according to any one of paragraphs. 1-10, and if necessary instructions. 12. Применение тест-системы по любому из пп. 1-10 для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1.12. The use of a test system according to any one of paragraphs. 1-10 to analyze the functional activity of anti-PD-1 antibody or anti-PD-L1 antibody. 13. Применение набора по п. 11 для анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1.13. Use of the kit according to claim 11 for analyzing the functional activity of an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody. 14. Способ анализа функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, включающий:14. A method for analyzing the functional activity of an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody, comprising: а. добавление к тест-системе по любому из пп. 1-10 антитела против PD-1 или антитела против PD-L1,and. adding to the test system according to any one of paragraphs. 1-10 anti-PD-1 antibodies or anti-PD-L1 antibodies, б. инкубацию,b. incubation, в. измерение интенсивности сигнала продукта экспрессии репортерного гена,in. measuring the signal intensity of the reporter gene expression product, г. обработку полученных данных.d. processing of the received data. 15. Способ по п. 14, где обработка полученных данных включает установление значения ЕС50 антитела против PD-1 или антитела против PD-L1.15. The method of claim 14, wherein processing the obtained data comprises determining an EC50 value of an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody. 16. Способ определения функциональной активности антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, включающий:16. A method for determining the functional activity of an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody, comprising: а. добавление к тест-системе по любому из пп. 1-10 антитела против PD-1 или антитела против PD-L1,and. adding to the test system according to any one of paragraphs. 1-10 anti-PD-1 antibodies or anti-PD-L1 antibodies, б. инкубацию,b. incubation, в. измерение интенсивности сигнала продукта экспрессии репортерного гена,in. measuring the signal intensity of the reporter gene expression product, г. обработку полученных данных, в том числе установление значения ЕС50 антитела против PD-1 или антитела против PD-L1,d. processing the data obtained, including determining the EC50 value of anti-PD-1 antibody or anti-PD-L1 antibody, д. расчет отношения экспериментально определенной ЕС50 стандартного образца, активность которого принимают за 100%, к экспериментально определенной ЕС50 сравниваемого антитела против PD-1 или антитела против PD-L1, умноженного на 100%.e. calculation of the ratio of the experimentally determined EC50 of a standard sample, the activity of which is taken as 100%, to the experimentally determined EC50 of the compared anti-PD-1 antibody or anti-PD-L1 antibody, multiplied by 100%.
RU2019120893A 2019-07-04 2019-07-04 Test system for analysing functional activity of antibodies against pd-1 and antibodies against pd-l1 RU2731896C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019120893A RU2731896C1 (en) 2019-07-04 2019-07-04 Test system for analysing functional activity of antibodies against pd-1 and antibodies against pd-l1

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019120893A RU2731896C1 (en) 2019-07-04 2019-07-04 Test system for analysing functional activity of antibodies against pd-1 and antibodies against pd-l1

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2731896C1 true RU2731896C1 (en) 2020-09-09

Family

ID=72421809

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019120893A RU2731896C1 (en) 2019-07-04 2019-07-04 Test system for analysing functional activity of antibodies against pd-1 and antibodies against pd-l1

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2731896C1 (en)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2282191C2 (en) * 2004-06-07 2006-08-20 Уральский НИИ охраны материнства и младенчества Method of determining functional activity of antichlamydial antibodies
WO2012018538A2 (en) * 2010-07-26 2012-02-09 Schering Corporation Bioassays for determining pd-1 modulation
US20160169869A1 (en) * 2014-11-20 2016-06-16 Promega Corporation Systems and methods for assessing modulators of immune checkpoints

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2282191C2 (en) * 2004-06-07 2006-08-20 Уральский НИИ охраны материнства и младенчества Method of determining functional activity of antichlamydial antibodies
WO2012018538A2 (en) * 2010-07-26 2012-02-09 Schering Corporation Bioassays for determining pd-1 modulation
US20160169869A1 (en) * 2014-11-20 2016-06-16 Promega Corporation Systems and methods for assessing modulators of immune checkpoints

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bloemberg et al. A high-throughput method for characterizing novel chimeric antigen receptors in Jurkat cells
CN110431233B (en) System and method for massively parallel combinatorial analysis of single cells
US10598669B2 (en) Isolating cells expressing secreted proteins
Fuertes Marraco et al. Inhibitory receptors beyond T cell exhaustion
CN107106608B (en) Systems and methods for evaluating immune checkpoint modulators
US20240084253A1 (en) Method of assessing activity of recombinant antigen receptors
Hecht et al. ILDR2 is a novel B7-like protein that negatively regulates T cell responses
CN110678480A (en) Chimeric polypeptides and methods for altering their localization in cell membranes
Takheaw et al. Interaction of CD99 and its ligand upregulates IL-6 and TNF-α upon T cell activation
Zhou et al. 4IgB7‐H3 is the major isoform expressed on immunocytes as well as malignant cells
KR102499955B1 (en) Antibody Selection Method
US20220348657A1 (en) Bioassay for t-cell co-stimulatory proteins containing fc domains
Armour et al. Expression of human FcγRIIIa as a GPI-linked molecule on CHO cells to enable measurement of human IgG binding
RU2731896C1 (en) Test system for analysing functional activity of antibodies against pd-1 and antibodies against pd-l1
US20200174011A1 (en) Antigen receptor screening assay
Jeon et al. Establishment of HLA class I and MICA/B null HEK-293T panel expressing single MICA alleles to detect anti-MICA antibodies
US20220154174A1 (en) Method of Selecting for Antibodies
EP4226943A1 (en) Therapeutic agent for immune/inflammatory disease
US10042975B2 (en) Method for identifying antigen-specific antibodies in primate
Rydzek NF-κB/NFAT Reporter Cell Platform for Chimeric Antigen Receptor (CAR)-Library Screening
CN114787373A (en) Method of measuring cell-mediated killing by effectors
CN115667310A (en) CD 22-specific antibodies and uses thereof
AU2014324783A1 (en) Antigen receptor screening assay