RU2730839C1

RU2730839C1 - Method of producing a collagen-based coating by aerosol spraying from an aqueous dispersion

Info

Publication number: RU2730839C1
Application number: RU2019143993A
Authority: RU
Inventors: Юрий Александрович Поликарпов; Алексей Валентинович Ромашкин; Денис Дмитриевич Левин; Владимир Кириллович Неволин
Priority date: 2019-12-26
Filing date: 2019-12-26
Publication date: 2020-08-26

Abstract

FIELD: technological processes.SUBSTANCE: disclosed is a method of producing a collagen-based coating, comprising applying an aqueous dispersion of collagen on different surfaces, including on the surface of the implants, where the application is carried out by aerosol dispersion, wherein to remove residual amount of solvent from obtained coating is performed by heat treatment at temperature not exceeding temperature of denaturation of collagen, forming a coating of separate microdroplets, not forming continuous layer, in gas flow greater than liquid flow by not less than 3 orders, wherein an aqueous dispersion of collagen with a pH factor in range of 5 to 8 is used, and for its preparation, at first, mixing is performed, which ensures breakdown of conglomerates over 100 microns and homogeneity of collagen distribution by volume of dispersion with provision of sedimentation time of not less than 30 seconds, then ultrasound treatment with power 0.06 W/ml and duration of not more than 20 minutes and then performing centrifugation at not more than 200 g.EFFECT: reduced degree of damage of native fibrillar structure of collagen fiber during processing and application of dispersion, stabilization of collagen dispersion without using methods or reagents that break its fibrillar structure, as well as obtaining a dispersion containing mainly elongated structures of collagen (fiber), and method of forming coating from dispersion should have universality in relation to used substrates and scalability in relation to area of formed coating.1 cl, 4 ex, 4 dwg

Description

Изобретение относится к биоразлагаемым покрытиям с улучшенной биосовместимостью и может быть использовано для улучшения биоинтеграции имплантов, а также культивирования клеток. Биосовместимые и биоразлагаемые покрытия являются перспективными материалами для доставки лекарств, зубных протезов, тканевых каркасов и имплантов. Особое внимание уделяется биополимерам, которые встречаются в составе живых организмов, таким как полинуклеотиды (ДНК и РНК), полипептиды и полисахариды. В особенности интересны пептиды, представляющие собой соединение не менее двух и более остатков аминокислот, связанных пептидными связями -C(O)NH-. Полипептидами называют пептиды с последовательностью из более чем 20 аминоксилотньгх остатков [1]. Более высоким уровнем организации пептидов считаются белки, состоящие из не менее чем 50 аминокислотных остатков и имеющие молекулярную массу более 5000 дальтон [2]. В отличие от полисахаридов и полинуклеотидов, белки выполняют в клетках живых организмов гораздо более разнообразные функции. Особое внимание уделяется их защитной и структурной функции, которая полезна, например, во время процесса вживления имплантов. Данные функции обеспечивает коллаген - фибриллярный белок, являющийся основным компонентом межклеточного вещества соединительной ткани у животных и человека. Коллаген является основным белком в составе человеческого тела, его доля составляет от 25 до 45% белков во всем теле [3]. На текущий момент известно 28 типов коллагена, при этом самым распространенным считается фибриллярный коллаген I типа. Первичная структура коллагена состоит из трех полипептидных цепей, содержащих довольно большое количество глицина, пролина, оксипролина и аланина. Далее цепочка из аминокислот скручивается в левую спираль, образующей вторичную структуру, в каждом витке которой содержится три аминокислотных остатка. Три таких спирали объединяются в единую правозакрученную суперспираль, формируя третичную структуру (тропоколлаген), а стабилизация такой структуры обеспечивается водородными и ковалентными дисульфидными связями. Молекулярная масса тропоколлагена составляет не менее 300 кДа, а длина - 300 нм. В соединительных тканях человека происходит самосборка тропоколлагена в фибриллы, которые затем формируют волокна, которые дополнительно укрепляются за счет межмолекулярных поперечных связей. Волокна коллагена называются коллагеном I типа. Высокая структурная прочность и гибкость волокон коллагена обеспечивает его незаменимую роль в человеческом организме. Это объясняет интерес использования коллагена в качестве биоматериала во многих медицинских приложениях, например, для покрытия имплантов [4], регенерации тканей [5], в качестве шовного материала [6] и др. Коллаген обладает высокой биосовместимостью с человеческими органами, не вызывая иммуного ответа, и его возможно использовать также для транспортировки лекарств [7], при этом он будет являться не только непосредственно формой для доставки, но и стимулировать заживляющие процессы в организме. Кроме того, в зависимости от способов нанесения коллагена, возможен контроль за его диаметром и длиной, что обеспечивает широкие возможности применения таких покрытий. Коллаген I типа может быть нанесен различными методами - отливкой, лиофилезацией, электропрядением (электроспиннинг) и др. Формируемые покрытия из переплетенных волокон существенно повышают первичную фиксацию и рост клеток.The invention relates to biodegradable coatings with improved biocompatibility and can be used to improve the biointegration of implants, as well as cell culture. Biocompatible and biodegradable coatings are promising materials for drug delivery, dentures, tissue frameworks, and implants. Particular attention is paid to biopolymers that are found in living organisms, such as polynucleotides (DNA and RNA), polypeptides and polysaccharides. Of particular interest are peptides that are a compound of at least two or more amino acid residues linked by peptide bonds -C (O) NH-. Polypeptides are peptides with a sequence of more than 20 amino acid residues [1]. A higher level of peptide organization is considered to be proteins that consist of at least 50 amino acid residues and have a molecular weight of more than 5000 daltons [2]. Unlike polysaccharides and polynucleotides, proteins perform much more diverse functions in the cells of living organisms. Particular attention is paid to their protective and structural function, which is useful, for example, during the implantation process. These functions are provided by collagen, a fibrillar protein that is the main component of the intercellular substance of connective tissue in animals and humans. Collagen is the main protein in the human body, accounting for 25 to 45% of proteins throughout the body [3]. Currently, 28 types of collagen are known, with type I fibrillar collagen considered the most common. The primary structure of collagen consists of three polypeptide chains containing a fairly large amount of glycine, proline, hydroxyproline and alanine. Further, a chain of amino acids is twisted into a left helix, forming a secondary structure, each turn of which contains three amino acid residues. Three such helices unite into a single right-handed supercoil, forming a tertiary structure (tropocollagen), and the stabilization of this structure is provided by hydrogen and covalent disulfide bonds. The molecular weight of tropocollagen is at least 300 kDa, and the length is 300 nm. In human connective tissues, tropocollagen self-assembles into fibrils, which then form fibers, which are additionally strengthened by intermolecular cross-links. Collagen fibers are called type I collagen. The high structural strength and flexibility of collagen fibers ensures its irreplaceable role in the human body. This explains the interest in the use of collagen as a biomaterial in many medical applications, for example, for coating implants [4], tissue regeneration [5], as a suture material [6], etc. Collagen is highly biocompatible with human organs without inducing an immune response , and it can also be used to transport drugs [7], while it will be not only a direct form for delivery, but also stimulate the healing processes in the body. In addition, depending on the methods of collagen application, it is possible to control its diameter and length, which provides a wide range of applications for such coatings. Type I collagen can be applied by various methods - casting, lyophilization, electrospinning (electrospinning), etc. The formed coatings of intertwined fibers significantly increase the primary fixation and growth of cells.

Известно использование коллагена в качестве покрытия для высокопрочных хирургических швов [8]. Сердечник нити формируется из полиэтилена сверхвысокой молекулярной массы, а покрытие состоит из нативного или денатурированного коллагена. Благодаря коллагену такой шов обладает лучшей биосовместимостью с тканями человека, а полиэтилен обеспечивает необходимую прочность, в результате чего такой шов может быть использован в хирургических применениях.Collagen is known to be used as a coating for high-strength surgical sutures [8]. The core of the filament is formed from ultra-high molecular weight polyethylene, and the coating consists of native or denatured collagen. Due to collagen, such a suture has better biocompatibility with human tissues, and polyethylene provides the necessary strength, as a result of which such a suture can be used in surgical applications.

Известно несколько изобретений, связанных с покрытиями имплантов на основе волокон коллагена, повышающих регенерацию тканей и биоактивность ипользуемых материалов. В качестве материала имплантов часто выступает биоинертный титан [9], который, впрочем, не обладает существенными биоактивными свойствами, что требует применения различных биоактивных покрытий. Покрытия на основе коллагена [10] могут существенно влиять на дифференцировку и адгезию клеток, что, в свою очередь, влияет на время интеграции импланта в организме и регенерацию тканей вокруг него.There are several known inventions related to implant coatings based on collagen fibers, which increase tissue regeneration and bioactivity of the materials used. Bioinert titanium is often used as a material for implants [9], which, however, does not possess significant bioactive properties, which requires the use of various bioactive coatings. Collagen-based coatings [10] can significantly affect the differentiation and adhesion of cells, which, in turn, affects the integration time of the implant in the body and the regeneration of tissues around it.

Известен способ использования коллагенового материала для восстановления суставной ткани [11], охватывающий большое количество различных композиций раствора, который может содержать не только солюбилизированный коллаген, но и различные компоненты крови, для формирования различных материалов, от коллагеновых каркасов до геля, и способы их применения.A known method of using collagen material to restore joint tissue [11], covering a large number of different compositions of the solution, which may contain not only solubilized collagen, but also various blood components, for the formation of various materials, from collagen scaffolds to gel, and methods of their use.

Высокие биоактивные свойства коллагена могут быть использованы для формирования коллагенсодержащих имплантов [12]. Такие импланты необходимы для использования их, например, для лечения дефектов хряща in vitro. Растворы с низкой вязкостью могут вытекать из места нанесения до затвердевания, что снижает эффективность таких покрытий. Описанный имплант представляет собой пористую подложку с двумя слоями прекурсора гидрогеля, один из которых содержит коллагеном и пространственно отделен от другого. При взаимодействии с физиологическими жидкостями организма прекурсор переходит в гидрогель, формируя покрытие с нужным показателем вязкости.High bioactive properties of collagen can be used for the formation of collagen-containing implants [12]. Such implants are necessary for their use, for example, for the treatment of cartilage defects in vitro. Low viscosity solutions can flow out of the application site before curing, which reduces the effectiveness of such coatings. The described implant is a porous substrate with two layers of the hydrogel precursor, one of which contains collagen and is spatially separated from the other. When interacting with physiological body fluids, the precursor transforms into a hydrogel, forming a coating with the desired viscosity.

Предлагается также формировать губки или листы на основе коллагена, формирующие биоразлагаемые матрицы [13] для доставки лекарств или имплантирования непосредственно под или на кожу для ускорения регенерации клеток. Покрытие содержит в себе коллаген I, II и III типа в простом варианте изобретения или дополнительно пропитывается коллагеном IV и V типа или фибронектином, ламинином и другими факторами закрепления и роста клеток.It is also proposed to form collagen-based sponges or sheets that form biodegradable matrices [13] for drug delivery or implantation directly under or on the skin to accelerate cell regeneration. The coating contains collagen I, II and III types in a simple embodiment of the invention or is additionally impregnated with collagen IV and V types or fibronectin, laminin and other factors of cell fixation and growth.

Также известен способ формирования композиционных рассасываемых матриц на основе коллагена и хитозана [14]. Пленочные и губчатые материалы, полученные описываемым способом, затем могут быть использованы для выращивания клеток кожи человека. Недостатком данного патента является используемая обработка раствора коллагена и способ его нанесения. В качестве растворителя для коллагена в описываемом изобретении выступает 2%-ный водный раствор уксусной кислоты. Более того, в процессе нанесения предлагается использовать прогрев при температурах от 50 до 100°С. Оба этих фактора существенным образом влияют на фибриллярную структуру волокон коллагена, приводя к их деградации.Also known is a method for forming composite resorbable matrices based on collagen and chitosan [14]. Film and spongy materials obtained by the described method can then be used to grow human skin cells. The disadvantage of this patent is the used processing of the collagen solution and the method of its application. A 2% aqueous solution of acetic acid acts as a solvent for collagen in the described invention. Moreover, in the process of application, it is proposed to use heating at temperatures from 50 to 100 ° C. Both of these factors significantly affect the fibrillar structure of collagen fibers, leading to their degradation.

Известно множество способов не только формирования покрытий, но и способ формирования и обработка частиц или волокон коллагена. Один из них [15] предлагает способ формирования микрочастиц коллагена для повышения диспергируемости в воде. В другом случае [16] авторами изобретения предлагается способ формирования структуры коллагена, содержащей в себе волокна коллагена с контролируемым диаметром - от 1 до 5 мкм, при этом плотность волокон коллагена в такой структуре остается достаточно высокой (от 50 до 800 мг/см³), что позволяет говорить скорее о плотном слое коллагена.There are many known methods of not only forming coatings, but also a method of forming and processing collagen particles or fibers. One of them [15] proposes a method of forming collagen microparticles to increase water dispersibility. In another case [16], the authors of the invention propose a method for the formation of a collagen structure containing collagen fibers with a controlled diameter - from 1 to 5 microns, while the density of collagen fibers in such a structure remains quite high (from 50 to 800 mg / cm ³ ) , which allows us to speak rather of a dense collagen layer.

Все описанные выше изобретения имеют существенные недостатки, ограничивающие из универсальность для использования. Большинство изобретений [8, 12-14, 16] связано с приготовлением раствора или суспензии коллагена в водном растворе с использованием кислот для его стабилизации. Однако это приводит к снижению пролиферативной активности клеток на таких покрытиях за счет создания кислой среды (со сниженным рН-фактором вблизи такого покрытия), токсичной для большинства клеток. Водородные связи, присутствующие в большом количестве в коллагене, в кислой и щелочной среде в значительной степени нарушаются. При интенсивном воздействии кислот и щелочей возможно разрушение ковалентных связей (гидролиз пептидных групп). Так, например, композитный материал PLGA/Коллаген, полученный с использованием коллагена в растворе с добавлением всего 0.5% по объему уксусной кислоты, не продемонстрировал существенного улучшения клеточного роста на своей поверхности [17]. Другим методом повышения стабилизации раствора коллагена в случае использования гидролизированного коллагена является его термическая обработка, которая также может приводить к подавлению роста клеток на покрытии на его основе [18]. Сохранение нативной фибриллярной структуры коллагеновых волокон является необходимым условием для обеспечения максимального увеличения скорости рост клеток на таком покрытии.All of the inventions described above have significant drawbacks limiting their versatility for use. Most of the inventions [8, 12-14, 16] are associated with the preparation of a solution or suspension of collagen in an aqueous solution using acids to stabilize it. However, this leads to a decrease in the proliferative activity of cells on such coatings due to the creation of an acidic environment (with a lowered pH factor near such a coating), toxic for most cells. Hydrogen bonds, which are present in large quantities in collagen, are largely disrupted in acidic and alkaline environments. Under intense exposure to acids and alkalis, the destruction of covalent bonds (hydrolysis of peptide groups) is possible. For example, the composite material PLGA / Collagen obtained using collagen in solution with the addition of only 0.5% by volume of acetic acid did not demonstrate a significant improvement in cell growth on its surface [17]. Another method of increasing the stabilization of collagen solution in the case of using hydrolyzed collagen is its heat treatment, which can also lead to suppression of cell growth on a coating based on it [18]. Preservation of the native fibrillar structure of collagen fibers is a prerequisite for maximizing the growth rate of cells on such a coating.

При этом также не всегда является целесообразным использование именно слоев на основе коллагена, так как даже малое содержание коллагена по подложке, в том числе отдельные волокна, может иметь значение для культивируемых клеток. Использование отдельных фибрилл коллагена вместо волокон также может существенно ускорить скорость закрепления на покрытии клеток и резорбции такого покрытия, что может быть полезно на коротких сроках культивирования клеток или заживлении небольших ран, уменьшения сроков регенерации тканей. Используемые методы заливки или центрифугирования для формирования покрытий на основе коллагена не позволяют формировать покрытия на больших площадях, так как с увеличением площади покрытия стоимость затрат на нанесение увеличивается в нелинейной прогрессии. Кроме того, толщина такого покрытия существенно зависит от материала подложки и, соответственно, его смачиваемости. Использование метода электроспиннинга позволяет снизить диаметр волокон коллагена и уменьшить количество используемого материала, однако и в этом случае используются кислоты для создания стабильной дисперсии, что также может приводить к деградации его структуры [19, 20].In this case, it is also not always advisable to use precisely layers based on collagen, since even a small content of collagen along the substrate, including individual fibers, can be important for cultured cells. The use of individual collagen fibrils instead of fibers can also significantly accelerate the rate of attachment to the cell coating and resorption of such a coating, which can be useful for short periods of cell cultivation or healing of small wounds, and reducing the time of tissue regeneration. The pouring or centrifugation methods used to form collagen-based coatings do not allow for the formation of coatings over large areas, since with an increase in the area of coverage, the cost of application costs increases in a non-linear progression. In addition, the thickness of such a coating depends significantly on the substrate material and, accordingly, on its wettability. The use of the electrospinning method makes it possible to reduce the diameter of collagen fibers and reduce the amount of material used; however, in this case, acids are used to create a stable dispersion, which can also lead to degradation of its structure [19, 20].

В патенте [21], который был выбран в качестве прототипа предлагаемого к патентованию изобретения, показан способ приготовления покрытий для улучшения роста клеток на культуральном пластике планшетов. Способ формирования такого покрытия включает в себя 3 стадии - подготовка суспензии из коллагеновых фибрилл, дозирование суспензии на лунки планшета для формирования цельного покрытия и высушивание покрытия под стерильным воздушным потоком и ультрафиолетовым излучением. Фибриллы оседают на дно лунок, вода испаряется благодаря воздушному потоку, а ультрафиолетовое излучение гарантирует стерильность такого покрытия. Однако данный метод обладает рядом существенных недостатков. В первую очередь, это использование солей (сульфата и гидроксида щелочного металла) и водного раствора кислоты (уксусной, лимонной, молочная, аскорбиновая или винная) в процессе обработки и подготовки суспензии. При этом указывается, что для хорошей растворимости рН фактор должен составлять от 3 до 4. Взаимодействие с кислотами и солями негативно отражается на фибриллярной структуре волокна коллагена. Кроме того, используемый метод, широковстречаемый и в других патентах, представляющий собой нанесение раствора коллагена методом закапывания и его сушку, имеет множество недостатков. Прежде всего это неоднородность по толщине формируемого покрытия, сложность формирования тонких пленок, весьма продолжительное время сушки слоя и сложность масштабирования процесса на большие площади или изделия сложной формы. Таким образом, обнаруживается необходимость в разработке более универсального метода нанесения и более щадящего метода обработки дисперсии волокон коллагена для их стабилизации.The patent [21], which was chosen as a prototype of the invention proposed for patenting, shows a method for preparing coatings to improve cell growth on plastic culture plates. The method of forming such a coating includes 3 stages - preparing a suspension of collagen fibrils, dosing the suspension on the wells of the plate to form an integral coating and drying the coating under sterile air flow and ultraviolet radiation. Fibrils settle to the bottom of the wells, water evaporates due to the air flow, and ultraviolet radiation guarantees the sterility of such a coating. However, this method has a number of significant disadvantages. First of all, this is the use of salts (sulfate and hydroxide of an alkali metal) and an aqueous solution of acid (acetic, citric, lactic, ascorbic or tartaric) in the process of processing and preparing the suspension. At the same time, it is indicated that for good solubility the pH factor should be from 3 to 4. Interaction with acids and salts negatively affects the fibrillar structure of collagen fiber. In addition, the method used, which is widely used in other patents, which is the application of a collagen solution by the method of instillation and drying, has many disadvantages. First of all, this is the heterogeneity in the thickness of the formed coating, the complexity of the formation of thin films, a very long drying time of the layer and the difficulty of scaling the process over large areas or products of complex shape. Thus, there is a need to develop a more universal method of application and a more gentle method of processing the dispersion of collagen fibers to stabilize them.

Задачей изобретения является уменьшение степени повреждения нативной фибриллярной структуры коллагенового волокна в процессе обработки и нанесения дисперсии, стабилизация дисперсии коллагена без использования методов или реагентов, нарушающих его фибриллярную структуру, а также получение дисперсии, содержащей преимущественно удлиненные структуры коллагена (волокна). При этом используемый для решения задачи метод формирования покрытия из дисперсии должен обладать универсальностью по отношению к используемым подложкам и масштабируемостью по отношению к площади формируемого покрытия.The objective of the invention is to reduce the degree of damage to the native fibrillar structure of collagen fiber during processing and application of the dispersion, to stabilize the collagen dispersion without the use of methods or reagents that violate its fibrillar structure, as well as to obtain a dispersion containing mainly elongated collagen structures (fibers). In this case, the method of forming a coating from a dispersion used to solve the problem should be versatile in relation to the substrates used and scalable in relation to the area of the formed coating.

В настоящем изобретении предлагается использовать метод аэрозольного распыления для формирования покрытий на основе отдельных волокон коллагена с неповрежденной нативной фибриллярной структурой. При этом водная дисперсия коллагена, используемая для нанесения, имеет рН-фактор от 5 до 8, а для ее стабилизации предлагается использовать совокупность механических методов разделения частиц в коллоидных дисперсиях.In the present invention, it is proposed to use the aerosol spray method to form coatings based on individual collagen fibers with an intact native fibrillar structure. At the same time, the aqueous dispersion of collagen used for application has a pH factor of 5 to 8, and for its stabilization it is proposed to use a combination of mechanical methods for separating particles in colloidal dispersions.

В качестве исходного материала коллагена может быть использован любой коммерчески доступный порошок коллагена с содержанием коллагена не менее 99% по массе и размером частиц гранул менее 600 мкм. Верхняя граница размера гранул коллагена обоснована сложностью обработки таких гранул используемыми методами. Порошок коллагена диспергируется в дистиллированной или деионизованной воде (со степенью чистоты не менее 99,9% и рН-фактором 5-8, что обусловлено требованием минимальной степени денатурации коллагена а также максимальной температурной стабильности волокон в растворе [22]), при этом концентрация должна составлять не более 100 мг/мл, что объясняется сложностью обработки таких вязких растворов. Нижней границей исходной концентрации коллагена считается 5 мг/мл, так как при более низкой концентрации значительно усложняется возможность определения времени седиментации в процессе обработки, а также снижается эффективность приготовления итоговой дисперсии, пригодной для аэрозольного нанесения. Дальнейшая обработка состоит из трех последовательных этапов - перемешивания, ультразвуковой обработки и центрифугирования.As a starting material for collagen, any commercially available collagen powder with a collagen content of at least 99% by weight and a granule particle size of less than 600 μm can be used. The upper limit of the collagen granule size is justified by the complexity of processing such granules by the methods used. Collagen powder is dispersed in distilled or deionized water (with a purity of at least 99.9% and a pH of 5-8, which is due to the requirement for a minimum degree of collagen denaturation and maximum temperature stability of fibers in solution [22]), while the concentration should not more than 100 mg / ml, which is explained by the complexity of processing such viscous solutions. The lower limit of the initial collagen concentration is considered to be 5 mg / ml, since at a lower concentration, the possibility of determining the sedimentation time during processing becomes much more difficult, and the efficiency of preparing the final dispersion suitable for aerosol application decreases. Further processing consists of three sequential stages - mixing, ultrasonic treatment and centrifugation.

Перемешивание является первой стадией обработки водной дисперсии. Оно проводится для первичного разбиения крупных конгломератов до размеров не более 100 микрон. Перемешивание проводится до тех пор, пока время седиментации дисперсии будет составлять не менее 30 секунд. Данные условия обусловлены тем, что больший размер конгломератов приведет к невозможности аэрозольного распыления дисперсии.Stirring is the first step in processing the aqueous dispersion. It is carried out for the primary breakdown of large conglomerates to a size of no more than 100 microns. Stirring is carried out until the sedimentation time of the dispersion is at least 30 seconds. These conditions are due to the fact that the larger size of the conglomerates will lead to the impossibility of aerosol spraying of the dispersion.

Ультразвуковая обработка является гораздо более травмирующим методом обработки для волокон коллагена, снижая их длину и частично нарушая фибриллярную структуру, поэтому ее длительность не должна составлять более 20 минут, после которых происходят необратимые изменения структуры волокон в большей части обрабатываемого материала. Мощность ультразвуковой ванны, используемой для обработки, составляет около 0,06 Вт/мл, что объясняется необходимостью минимального воздействия на структуру волокна в процессе. После проведения перемешивания и ультразвуковой обработки дисперсия должна обладать временем седиментации не менее 60 секунд.Ultrasonic treatment is a much more traumatic method of treatment for collagen fibers, reducing their length and partially disrupting the fibrillar structure, therefore, its duration should not be more than 20 minutes, after which irreversible changes in the structure of the fibers occur in most of the processed material. The power of the ultrasonic bath used for processing is about 0.06 W / ml, which is explained by the need for minimal impact on the fiber structure during the process. After stirring and ultrasonic treatment, the dispersion should have a sedimentation time of at least 60 seconds.

Центрифугирование используется для механического разделения оставшихся неразбитых конгломератов от отдельных волокон коллагена. При этом центробежная сила не превышает 200 g, чтобы предотвратить осаждение всего материала коллагена. Не рекомендуется использовать центрифугирование с центробежной силой менее 50 g, так как это приведет к наличию в результирующей дисперсии волокон коллагена крупных конгломератов и пучков волокон. При этом длительность центрифугирования составляет не более 10 минут, чтобы предотвратить чрезмерное выпадение материала коллагена в осадок. После центрифугирования очищенная дисперсия отделяется от осадка на дне используемого сосуда и переливается в стерильную пробирку. Получившая дисперсия волокон коллагена обладает временем седиментации до двух часов, что позволяет проводить процесс нанесения без дополнительной обработки. По оценкам, концентрация волокон коллагена в таком растворе составляет не более 300 мкг/мл. При времени хранения дисперсии свыше двух часов возможно проведение дополнительной ультразвуковой обработки в течение 1 минуты, обеспечивающей равномерное перераспределение волокон коллаген по всему объеме дисперсии.Centrifugation is used to mechanically separate the remaining unbroken conglomerates from the individual collagen fibers. In this case, the centrifugal force does not exceed 200 g to prevent the deposition of all collagen material. It is not recommended to use centrifugation with centrifugal force less than 50 g, as this will lead to the presence of large conglomerates and fiber bundles in the resulting dispersion of collagen fibers. In this case, the duration of centrifugation is no more than 10 minutes in order to prevent excessive precipitation of collagen material. After centrifugation, the purified dispersion is separated from the sediment at the bottom of the used vessel and poured into a sterile tube. The resulting dispersion of collagen fibers has a sedimentation time of up to two hours, which allows the application process to be carried out without additional processing. It is estimated that the concentration of collagen fibers in such a solution is no more than 300 μg / ml. If the storage time of the dispersion is more than two hours, it is possible to carry out additional ultrasonic treatment for 1 minute, which ensures a uniform redistribution of collagen fibers throughout the entire volume of the dispersion.

Полученная дисперсия волокон коллагена обладает достаточно высокой стабильностью и готова для нанесения аэрозольным способом. Процесс нанесения представляет собой распыление полученной дисперсии на микрокапли за счет потока воздуха и/или ультразвуковых волн. Во время нанесения подложка, на которую осуществляется нанесение, нагревается до температур, не превьппающих температуру денатурации волокон коллагена, которая составляет около 50°С. Температура осаждающихся капель не должна превышать этого значения, иначе фибриллярная структура коллагена будет необратимо повреждена, что приведет к существенному ухудшению пролиферативной активности клеток на их поверхности. При этом, необходимо учитывать, что ввиду обдувания подложки потоком сжатого воздуха в процессе нанесения, реальная температура поверхности подложки может отличаться от температуры регистрируемой в среднем при нанесении, например посредством измерения термопарой области нагреваемого основания вблизи области нанесения, в меньшую сторону. Нагрев и поток газа необходимы для обеспечения своевременного испарения растворителя из объема осажденной микрокапли.The resulting dispersion of collagen fibers is sufficiently stable and ready for aerosol application. The application process is the spraying of the resulting dispersion onto microdroplets by means of a stream of air and / or ultrasonic waves. During application, the substrate to be applied is heated to temperatures not exceeding the denaturation temperature of the collagen fibers, which is about 50 ° C. The temperature of the precipitating drops should not exceed this value, otherwise the fibrillar structure of collagen will be irreversibly damaged, which will lead to a significant deterioration in the proliferative activity of cells on their surface. In this case, it should be borne in mind that due to the blowing of the substrate with a flow of compressed air during the application, the actual temperature of the substrate surface may differ from the temperature recorded on average during application, for example, by measuring the area of the heated base near the application area with a thermocouple, downward. Heating and gas flow are necessary to ensure timely evaporation of the solvent from the volume of the deposited microdroplet.

В процессе нанесения обеспечивается поток сжатого воздуха или иного газа не менее чем на 3 порядка больший, чем поток жидкости, для обеспечения формирования микроразмерных капель в процессе полета капли до подложки, а также обеспечения ускоренного испарения жидкости из объема микрокапель. Ввиду того, что температура нагрева подложки не должна превышать температуру денатурации коллагена, не всегда возможно обеспечить необходимую скорость испарения растворителя, в результате чего требуется сформировать поток воздуха для увеличения скорости испарения микрокапель. Подложка в процессе нанесения поддерживается в промежуточном состоянии между «жидким», когда растворитель полностью покрывает подложку и не успевает испариться, и «сухим», когда растворитель испаряется слишком быстро и покрытие формируется из сухих микрочастиц коллагена. Данный режим является наиболее оптимальным для формирования равномерных пленок, а отклонение от него приводит к существенным неоднородностям покрытия [23]. Так как максимальная температура подложки ограничена температурой денатурации коллагена, потоки воздуха или иного газа и жидкости (используемой дисперсии коллагена) в предложенном способе выбраны не слишком высокими, до 100 л/мин и до 1 мл/мин, соответственно. Для увеличения равномерности возможно снижение потока жидкости до 0,05 мл/мин. Меньшие значения потока жидкости могут привести к седиментации коллагена в дисперсии внутри распылительной форсунки и прекращению процесса нанесения. В таком случае для продолжения нанесения потребуется очистка распылительного устройства, что увеличит время нанесения.In the process of deposition, a flow of compressed air or other gas is provided that is at least 3 orders of magnitude greater than the flow of a liquid, to ensure the formation of micro-sized drops during the flight of the drop to the substrate, as well as to ensure accelerated evaporation of liquid from the volume of micro-drops. In view of the fact that the heating temperature of the substrate should not exceed the collagen denaturation temperature, it is not always possible to provide the required evaporation rate of the solvent, as a result of which it is required to form an air flow to increase the evaporation rate of microdroplets. During application, the substrate is maintained in an intermediate state between “liquid”, when the solvent completely covers the substrate and does not have time to evaporate, and “dry”, when the solvent evaporates too quickly and the coating is formed from dry collagen microparticles. This mode is the most optimal for the formation of uniform films, and deviation from it leads to significant inhomogeneities of the coating [23]. Since the maximum temperature of the substrate is limited by the temperature of collagen denaturation, the flows of air or other gas and liquid (used collagen dispersion) in the proposed method are chosen not too high, up to 100 l / min and up to 1 ml / min, respectively. To increase uniformity, it is possible to reduce the fluid flow to 0.05 ml / min Lower fluid flow rates can lead to sedimentation of collagen in dispersion inside the spray nozzle and interruption of the application process. In such a case, cleaning of the spray device will be required to continue application, which will increase the application time.

В предлагаемом настоящим изобретении способе также предполагается проводить распыление итерационно, при этом между итерациями нанесения возможно проведение дополнительной сушки покрытия и/или очистки распылительного устройства. Сушка между итерациями позволяет увеличить поток жидкости в отдельной итерации нанесения на определенный участок площади подложки, что обеспечит более быстрое нанесение покрытия, что наиболее актуально при нанесении на подложки большой площади (большей чем площадь пятна распыления в одном положении распылительного узла и подложки). При этом во время паузы для сушки между итерациями температура нагрева подложки также не должна превышать температуры денатурации коллагена. Также между итерациями возможно проведение очистки распылительного устройства. При этом процессе может быть использован значительно больший объем дисперсии волокон коллагена, чем для нанесения, поэтому данная операция не является обязательной и нужна лишь в том случае, когда наблюдается существенно снижение потока жидкости во время нанесения.The method of the present invention also contemplates spraying iteratively, with additional drying of the coating and / or cleaning of the spraying device possible between application iterations. Drying between iterations allows you to increase the liquid flow in a separate iteration of application to a certain area of the substrate area, which will provide faster coating application, which is most important when applying a large area to substrates (larger than the area of the spray spot in one position of the spray assembly and the substrate). In this case, during the pause for drying between iterations, the heating temperature of the substrate should also not exceed the temperature of collagen denaturation. It is also possible to clean the spray device between iterations. In this process, a much larger volume of dispersion of collagen fibers can be used than for application, therefore this operation is not necessary and is only necessary if there is a significant decrease in fluid flow during application.

Покрытие, нанесенное таким способом, представляет собой отдельные волокна коллагена, образующие сетчатые структуры (Фиг. 1, 2). Волокна коллагена имеют длину до 15 мкм и диаметр 15-70 нм (в зависимости от количества фибрилл в волокне). При этом возможно наблюдение вторичной структуры коллагена (левозакрученной спирали) (Фиг. 3), а период структуры составляет 60-70 нм, что находится в соответствии с литературными данными [24] и доказывает неповрежденность фибриллярной структуры коллагена. При этом можно наблюдать остаточную долю низкомолекулярной составляющей коллагена (первичной структуры, не в форме волокон) в виде микрокапель вокруг отдельных волокон коллагена. Регулируя объем распыляемой дисперсии волокон коллагена возможно получение различного процента заполнения подложки волокнами от отдельных волокон до полного покрытия плотной сеткой, формирующей цельный слой.The coating applied in this way consists of individual collagen fibers forming network structures (Figs. 1, 2). Collagen fibers are up to 15 microns long and 15-70 nm in diameter (depending on the number of fibrils in the fiber). In this case, it is possible to observe the secondary structure of collagen (left-handed helix) (Fig. 3), and the period of the structure is 60-70 nm, which is in accordance with the literature data [24] and proves the intact fibrillar structure of collagen. In this case, you can observe the residual fraction of the low molecular weight component of collagen (primary structure, not in the form of fibers) in the form of microdroplets around individual collagen fibers. By adjusting the volume of the sprayed dispersion of collagen fibers, it is possible to obtain a different percentage of filling the substrate with fibers from individual fibers to complete coverage with a dense mesh that forms an integral layer.

Покрытия на основе коллагена также были исследованы на предмет улучшения роста клеток. Покрытие наносилось на полилактидный слой и затем на его поверхности и поверхности полилактидного слоя без покрытия культивировались нормальные эмбриональные фибробласты человека, составляющие основу соединительной ткани человека. Культивирование проходило в течение 48 часов в инкубаторе при оптимальных параметрах среды. Далее количество выращенных клеток оценивалось при помощи стандартного МТТ-теста по оптической плотности (Фиг. 4). Полилактидный слой с покрытием на основе неповрежденных волокон коллагена, нанесенных методом аэрозольного распыления, показал практически вдвое большее количество выращенных клеток, чем полилактидный слой без него и даже больше чем на образце контроля, в качестве которого выступало покровное стекло, выступающее подложкой для полилактидного слоя. Необходимо заметить, что даже столь малый процент заполнения подложки волокнами коллагена (не более 2%) оказал существенное влияние на первичное закрепление и рост клеток.Collagen-based coatings have also been investigated to improve cell growth. The coating was applied to the polylactide layer and then on its surface and the surface of the uncoated polylactide layer, normal human embryonic fibroblasts, which form the basis of human connective tissue, were cultured. Cultivation took place for 48 hours in an incubator with optimal environmental parameters. Further, the number of grown cells was assessed using a standard MTT test for optical density (Fig. 4). The polylactide layer with a coating based on intact collagen fibers applied by aerosol spraying showed almost twice the number of grown cells than the polylactide layer without it and even more than on the control sample, which was a cover glass serving as a substrate for the polylactide layer. It should be noted that even such a small percentage of the substrate filling with collagen fibers (no more than 2%) had a significant effect on the primary fixation and growth of cells.

Результатом предложенного способа нанесения покрытия на основе волокон коллагена является существенное улучшение роста клеток на таком покрытии, при этом также значительно снижается количество используемого материала. Кроме того, предложенный метод обработки дисперсии волокон коллагена не требует использования кислот для стабилизации дисперсии, что позволяет сохранить фибриллярную структуру коллагена. Метод нанесения легко может быть масштабирован для технологического производства для формирования покрытий большой площади и покрытий на изделиях сложной формы, а процент заполнения подложки и толщина формируемого покрытия может быть регулирована объемом распыляемой дисперсии в широких пределах.The result of the proposed coating method based on collagen fibers is a significant improvement in cell growth on such a coating, while also significantly reducing the amount of material used. In addition, the proposed method for processing a dispersion of collagen fibers does not require the use of acids to stabilize the dispersion, which makes it possible to preserve the fibrillar structure of collagen. The deposition method can be easily scaled for industrial production to form large-area coatings and coatings on products of complex shape, and the percentage of filling of the substrate and the thickness of the formed coating can be controlled by the volume of the sprayed dispersion over a wide range.

Изобретение иллюстрируется графическими материалами:The invention is illustrated by graphic materials:

Фиг. 1. АСМ-изображение покрытия на основе волокон коллагена, нанесенное на покровное стекло, представляющее собой отдельные волокна коллагена, покрывающие 1- 5% площади подложки.FIG. 1. AFM image of a coating based on collagen fibers applied to a cover glass, which is a separate collagen fibers covering 1-5% of the substrate area.

Фиг. 2. АСМ-изображение покрытия на основе волокон коллагена, нанесенное на полилактидный слой, представляющее собой отдельные волокна коллагена, покрывающие 2- 10% площади подложки.FIG. 2. AFM image of a coating based on collagen fibers applied to a polylactide layer, which are individual collagen fibers covering 2-10% of the substrate area.

Фиг. 3. АСМ-изображение неповрежденной фибриллярной структуры волокна коллагена с характерным периодом (300) с профилем сечения (301) в отмеченной области.FIG. 3. AFM image of an intact fibrillar structure of collagen fiber with a characteristic period (300) with a cross-sectional profile (301) in the marked area.

Фиг. 4. Гистограммы результатов измерения оптической плотности, полученные с помощью МТТ-теста, после культивирования клеток эмбриональных фибробластов человека на полилактидном слое без и с применением описываемого способа нанесения покрытия, а также сравнение с контрольным образцом, в качестве которого выступало покровное стекло.FIG. 4. Histograms of optical density measurement results obtained using the MTT test after culturing human embryonic fibroblast cells on a polylactide layer without and using the described coating method, as well as comparison with a control sample, which was a cover glass.

Примеры осуществления изобретенияExamples of implementation of the invention

Пример 1Example 1

Подготовка коллоидной дисперсии волокон коллагена осуществляется путем приготовления дисперсии с исходной концентрацией 15 мг/мл. Обработка дисперсии заключается в перемешивании в течение 15 минут, ультразвуковой обработки при мощности 0,06 Вт/мл и 47 кГц в течение 12 минут и центрифугировании при 100 g в течение 5 минут. Перед нанесением дисперсия проходит дополнительную ультразвуковую обработку при тех же параметрах в течение 1 минуты.The colloidal dispersion of collagen fibers is prepared by preparing a dispersion with an initial concentration of 15 mg / ml. The dispersion treatment consists in stirring for 15 minutes, ultrasonic treatment at a power of 0.06 W / ml and 47 kHz for 12 minutes and centrifugation at 100 g for 5 minutes. Before application, the dispersion undergoes additional ultrasonic treatment at the same parameters for 1 minute.

Нанесение дисперсии на подложку, в качестве которой выступает очищенное покровное стекло или представляющая собой полимер, или подложка, покрытая полимерным слоем, например полилактидом, осуществляется методом аэрозольного распыления. При этом подложка в процессе нанесения поддерживается при температуре 44-47°С, а поток жидкости составляет 0,05 мл/мин. Нанесение происходит непрерывно, объем распыляемой дисперсии составляет 3 мл.The dispersion is applied to a substrate, which is a cleaned cover glass or is a polymer, or a substrate coated with a polymer layer, for example polylactide, is carried out by aerosol spraying. In this case, the substrate during application is maintained at a temperature of 44-47 ° C, and the liquid flow is 0.05 ml / min. The application is continuous, the volume of the sprayed dispersion is 3 ml.

Способ позволяет формировать покрытие из отдельных волокон коллагена на подложке (Фиг. 1, 2, 3).The method makes it possible to form a coating of individual collagen fibers on a substrate (Figs. 1, 2, 3).

Пример 2Example 2

Методика подготовки и обработки дисперсии волокон коллагена аналогична описанному в примере 1.The procedure for preparing and processing the dispersion of collagen fibers is similar to that described in example 1.

Методика нанесения отличается тем, что происходит итерационно, с задержкой между итерациями на 3-5 секунд для дополнительной сушки и очистки распылительного устройства. При этом поток жидкости (расход дисперсии) составляет около 0,12 мл/мин. Объем распыляемой дисперсии и температура подложки остаются аналогичными примеру 1.The application technique differs in that it occurs iteratively, with a delay between iterations of 3-5 seconds for additional drying and cleaning of the spray device. In this case, the liquid flow (dispersion flow rate) is about 0.12 ml / min. The volume of the sprayed dispersion and the temperature of the substrate remain the same as in example 1.

Благодаря увеличению потока жидкости увеличивается длина волокон коллагена, осаждаемых на подложку.By increasing the fluid flow, the length of the collagen fibers deposited on the substrate increases.

Пример 3Example 3

Методика подготовки дисперсии волокон коллагена отличается тем, что исходная концентрация коллагена составляет 5 мг/мл, а длительность перемешивания и ультразвуковой обработки снижается до 10 и 6 минут, соответственно, при этом остальные параметры обработки остаются неизменными.The method for preparing a dispersion of collagen fibers differs in that the initial concentration of collagen is 5 mg / ml, and the duration of stirring and ultrasonic treatment is reduced to 10 and 6 minutes, respectively, while the other processing parameters remain unchanged.

Методика нанесения аналогична описанной в примере 1 или 2, с отличием в объеме распыляемой дисперсии в 6 мл.The application procedure is similar to that described in example 1 or 2, with a difference in the volume of the sprayed dispersion of 6 ml.

Благодаря снижению исходной концентрации волокон коллагена в растворе возможен более точный контроль за количеством волокон на поверхности подложки.By reducing the initial concentration of collagen fibers in the solution, a more accurate control over the amount of fibers on the substrate surface is possible.

Пример 4Example 4

Методика подготовки дисперсии волокон коллагена аналогичная описанной в примере 1, но отличается тем, что ультразвуковая обработка проводится в течение 20 минут, а центрифугирование при 200 g в течение 10 минут.The method for preparing a dispersion of collagen fibers is similar to that described in example 1, but differs in that ultrasonic treatment is carried out for 20 minutes, and centrifugation at 200 g for 10 minutes.

Методика нанесения аналогична описанной в примере 1.The application procedure is similar to that described in example 1.

По причине увеличения длительности ультразвуковой обработки, а также центрифугирования, в осадок выпадает практически весь материал в форме длинных волокон коллагена, а в дисперсии остается преимущественно низкомолекулярная составляющая коллагена (первичная структура молекул и короткие фрагменты волокон). Формируемое покрытие представляет собой слой низкомолекулярной составляющей коллагена с малым количеством коротких волокон коллагена.Due to the increase in the duration of ultrasonic treatment, as well as centrifugation, almost all the material in the form of long collagen fibers precipitates, and mainly the low-molecular component of collagen (primary molecular structure and short fiber fragments) remains in the dispersion. The formed coating is a layer of low-molecular-weight collagen with a small amount of short collagen fibers.

Источники информацииSources of information

1. McNaught A. D., McNaught A. D. Compendium of chemical terminology. - Oxford: Blackwell Science, 1997. - T. 1669.1. McNaught A. D., McNaught A. D. Compendium of chemical terminology. - Oxford: Blackwell Science, 1997. - T. 1669.

2. Liebecq C. Biochemical nomenclature and related documents. - Portland Press, 1992.2. Liebecq C. Biochemical nomenclature and related documents. - Portland Press, 1992.

3. Di Lullo G. A. et al. Mapping the ligand-binding sites and disease-associated mutations on the most abundant protein in the human, type I collagen //Journal of Biological Chemistry. -2002. - T. 277. - №. 6. - C. 4223-4231.3. Di Lullo G. A. et al. Mapping the ligand-binding sites and disease-associated mutations on the most abundant protein in the human, type I collagen // Journal of Biological Chemistry. -2002. - T. 277. - No. 6. - C. 4223-4231.

4. Патент CA 2691412 A1.4. Patent CA 2691412 A1.

5. Патент ЕР 2073788 A2.5. Patent EP 2073788 A2.

6. Патент ЕР 2098253 В1.6. Patent EP 2098253 B1.

7. Патент JP 2013535485 А.7. Patent JP 2013535485 A.

8. Патент US 9186432 В2.8. Patent US 9186432 B2.

9. Патент RU 2435613.9. Patent RU 2435613.

10. Патент US 9370381.10. US patent 9370381.

11. Патент ЕР 2073788 А2.11. Patent EP 2073788 A2.

12. Патент СА 2755617 С.12. Patent CA 2755617 S.

13. Патент US 4703108 А.13. Patent US 4703108 A.

14. Патент RU 2431504 С2.14. Patent RU 2431504 C2.

15. Патент CN 109045362 А.15. Patent CN 109045362 A.

16. Патент ЕР 2803371 А1.16. Patent EP 2803371 A1.

17. Sadeghi-Avalshahr A. R. et al. Synthesis and characterization of PLGA/collagen composite scaffolds as skin substitute produced by electrospinning through two different approaches //Journal of Materials Science: Materials in Medicine. - 2017. - T. 28. - №. 1. - C. 14.17. Sadeghi-Avalshahr A. R. et al. Synthesis and characterization of PLGA / collagen composite scaffolds as skin substitute produced by electrospinning through two different approaches // Journal of Materials Science: Materials in Medicine. - 2017. - T. 28. - No. 1. - P. 14.

18. Rapa M. et al. Effect of hydrolyzed collagen on thermal, mechanical and biological properties of poly (lactic acid) bionanocomposites //Iranian Polymer Journal. - 2019. - T. 28. -№. 4. - C. 271-282.18. Rapa M. et al. Effect of hydrolyzed collagen on thermal, mechanical and biological properties of poly (lactic acid) bionanocomposites // Iranian Polymer Journal. - 2019. - T. 28. -№. 4. - S. 271-282.

19. Патент ЕР 1345743 B1.19. Patent EP 1345743 B1.

20. Matthews J. A. et al. Electrospinning of collagen nanofibers //Biomacromolecules. - 2002. - T. 3. - №. 2. - C. 232-238.20. Matthews J. A. et al. Electrospinning of collagen nanofibers // Biomacromolecules. - 2002. - T. 3. - No. 2. - S. 232-238.

21. Патент US 4656130 A - прототип.21. Patent US 4656130 A - prototype.

22. Hayashi Т., Nagai Y. Effect of pH on the stability of collagen molecule in solution //The Journal of Biochemistry. - 1973. - T. 73. - №. 5. - C. 999-1006.22. Hayashi T., Nagai Y. Effect of pH on the stability of collagen molecule in solution // The Journal of Biochemistry. - 1973. - T. 73. - No. 5. - C. 999-1006.

23. Abdellah A. et al. Spray deposition of organic semiconducting thin-films: Towards the fabrication of arbitrary shaped organic electronic devices //Organic Electronics. - 2010. - T. 11. - №. 6. - C. 1031-1038.23. Abdellah A. et al. Spray deposition of organic semiconducting thin-films: Towards the fabrication of arbitrary shaped organic electronic devices // Organic Electronics. - 2010. - T. 11. - No. 6. - C. 1031-1038.

24. Birk D. E. et al. Collagen type I and type V are present in the same fibril in the avian corneal stroma //The Journal of cell biology. - 1988. - T. 106. - №. 3. - C. 999-1008.24. Birk D. E. et al. Collagen type I and type V are present in the same fibril in the avian corneal stroma // The Journal of cell biology. - 1988. - T. 106. - No. 3. - C. 999-1008.

Claims

1. Способ получения покрытия на основе коллагена, включающий нанесение водной дисперсии коллагена на различные поверхности, в том числе на поверхности имплантов, отличающийся тем, что нанесение проводят путем аэрозольного распыления, при этом для удаления остаточного количества растворителя из получаемого покрытия осуществляют его термообработку при температуре, не превышающей температуру денатурации коллагена, формируя покрытие из отдельных микрокапель, не образующих сплошного слоя, в потоке газа большем, чем расход жидкости не менее чем на 3 порядка, при этом используют водную дисперсию коллагена с рН-фактором в диапазоне от 5 до 8, а для ее приготовления вначале производят перемешивание, обеспечивающее разбитие конгломератов свыше 100 микрон и однородность распределения коллагена по объему дисперсии с обеспечением времени седиментации не менее 30 секунд, затем ультразвуковую обработку с мощностью 0,06 Вт/мл и длительностью не более 20 минут и затем осуществляют центрифугирование при не более 200 g.1. A method of obtaining a collagen-based coating, including applying an aqueous dispersion of collagen on various surfaces, including the surface of implants, characterized in that the application is carried out by aerosol spraying, while to remove the residual amount of solvent from the resulting coating, it is heat-treated at a temperature not exceeding the collagen denaturation temperature, forming a coating of individual microdroplets that do not form a continuous layer, in a gas flow greater than the liquid flow rate by at least 3 orders of magnitude, while using an aqueous collagen dispersion with a pH factor in the range from 5 to 8, and for its preparation, first, stirring is performed, which ensures the breakdown of conglomerates over 100 microns and the uniformity of the distribution of collagen over the volume of the dispersion, ensuring the sedimentation time of at least 30 seconds, then ultrasonic treatment with a power of 0.06 W / ml and a duration of no more than 20 minutes and then centrifugation at no more than 200 g.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что нанесение осуществляется итерациями, причем каждая итерация нанесения включает в себя паузу, в которой продолжают термообработку покрытия.2. The method according to claim 1, characterized in that the application is carried out in iterations, and each iteration of the application includes a pause in which the heat treatment of the coating is continued.