RU2728240C1 - Method for producing secreted fully functional phospholipase a2 in saccharomyces cerevisiae yeast, a precursor protein for implementing said method (versions) - Google Patents
Method for producing secreted fully functional phospholipase a2 in saccharomyces cerevisiae yeast, a precursor protein for implementing said method (versions) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2728240C1 RU2728240C1 RU2019139317A RU2019139317A RU2728240C1 RU 2728240 C1 RU2728240 C1 RU 2728240C1 RU 2019139317 A RU2019139317 A RU 2019139317A RU 2019139317 A RU2019139317 A RU 2019139317A RU 2728240 C1 RU2728240 C1 RU 2728240C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- phospholipase
- ala
- strain
- asp
- gcc
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и касается разработки способа получения секретируемой в дрожжах, полностью функциональной фосфолипазы А2.The invention relates to the field of biotechnology and concerns the development of a method for producing a fully functional phospholipase A2 secreted in yeast.
Фосфолипаза А2 (Pla2) катализирует гидролиз сложноэфирной связи во втором положении глицерофосфолипидов (фосфолипидов) - соединений, являющихся основными компонентами мембран всех живых клеток и по этой причине содержащихся во многих продуктах животного и растительного происхождения. Многообразие молекулярных форм фосфолипидов определяется типом фосфатной группы (холин, этаноламин, инозит или серии) и строением остатков жирных кислот.Phospholipase A2 (Pla2) catalyzes the hydrolysis of the ester bond in the second position of glycerophospholipids (phospholipids) - compounds that are the main components of the membranes of all living cells and for this reason are contained in many products of animal and plant origin. The variety of molecular forms of phospholipids is determined by the type of phosphate group (choline, ethanolamine, inositol, or series) and the structure of fatty acid residues.
Pla2 является одним из востребованных ферментов на рынке ферментных препаратов (ФП). В пищевой промышленности ее применяют для улучшения качества майонеза, дегуммирования растительных масел, изготовления хлебобулочных изделий, молочных продуктов, а также при производстве сыра [Бакланов 2008; & Dennis, 1982]. Другими областями применения Pla2 являются текстильная промышленность, кормопроизводство, а также синтез искусственных фосфолипидов, востребованных, в частности, в фармакологии и парфюмерии [De Maria et al., 2007; Hoogevest & Wendel, 2014; Liu et al., 2015]. Интенсивное использование Pla2 ожидают в топливно-энергетической промышленности для получения биодизеля [Cesarini et al., 2015].Pla2 is one of the demanded enzymes in the enzyme preparations (FP) market. In the food industry, it is used to improve the quality of mayonnaise, degumming vegetable oils, making bakery products, dairy products, and also in the production of cheese [Baklanov 2008; & Dennis, 1982]. Other areas of application of Pla2 are the textile industry, feed production, as well as the synthesis of artificial phospholipids, which are in demand, in particular, in pharmacology and perfumery [De Maria et al., 2007; Hoogevest & Wendel, 2014; Liu et al., 2015]. Intensive use of Pla2 is expected in the fuel and energy industry for biodiesel production [Cesarini et al., 2015].
Из числа ФП, содержащих Pla2 наиболее известны следующие:Among the FPs containing Pla2, the following are best known:
• ФП Maxapal® А2 (DSM), получаемый микробиологическим синтезом с использованием рекомбинантного штамма грибов Aspergillus niger,• EP Maxapal ® A2 (DSM) obtained by microbiological synthesis using a recombinant strain of Aspergillus niger fungi,
• ФП «DENAZYME PLA2» или «PLA2 Nagase» (Nagase Corporation), основу которого составляет Pla2 Streptomyces violaceoruber, получаемый микробиологическим синтезом с использованием продуцентов рода Streptomyces;• FP "DENAZYME PLA2" or "PLA2 Nagase" (Nagase Corporation), which is based on Pla2 Streptomyces violaceoruber, obtained by microbiological synthesis using producers of the genus Streptomyces;
• ФП «Lecitase L10» (Novozymes A/S), получаемый очисткой из поджелудочной железы свиней.• FP "Lecitase L10" (Novozymes A / S), obtained by purification from the pancreas of pigs.
ФП Pla2 получают с использованием природных или рекомбинантных штаммов-продуцентов. Однако, независимо от происхождения, коммерческие ФП Pla2 характеризуются высокой себестоимостью, которая обусловлена низкой продукцией, проистекающей из особенностей биосинтеза этого фермента, в частности, из его способности связывать и гидролизовать фосфолипиды клеточных мембран, вызывая их разрушение, приводящее к гибели продуцирующих клеток.FP Pla2 is obtained using natural or recombinant producer strains. However, regardless of the origin, commercial Pla2 EPs are characterized by a high cost, which is due to low production resulting from the features of the biosynthesis of this enzyme, in particular, from its ability to bind and hydrolyze phospholipids of cell membranes, causing their destruction, leading to the death of producing cells.
Преимущества природных продуцентов Pla2 обусловлены их относительно хорошей адаптацией к биосинтезу этого токсичного фермента [Sugiyama et. al. 2002; WO 2004/097012].The advantages of natural Pla2 producers are due to their relatively good adaptation to the biosynthesis of this toxic enzyme [Sugiyama et. al. 2002; WO 2004/097012].
Один из механизмов адаптации иллюстрируют грибные продуценты Pla2. Большинство из них синтезируют секретируемые Pla2 в виде незрелых про-ферментов с пониженной активностью. Их активация осуществляется внутриклеточно на поздних стадиях секреции под действием специализированных протеиназ. В результате из клеток в культуральную среду выходят зрелые, полностью активные Pla2 [WO 2004/097012]. Такая стратегия биосинтеза токсичных белков, способных в случае преждевременной активации нанести повреждения клеткам-продуцентам, широко распространена в природе, а также является традиционной для использования в биотехнологии.One of the adaptation mechanisms is illustrated by fungal Pla2 producers. Most of them synthesize secreted Pla2 in the form of immature pro-enzymes with reduced activity. Their activation is carried out intracellularly at the later stages of secretion under the action of specialized proteinases. As a result, mature, fully active Pla2 emerge from the cells into the culture medium [WO 2004/097012]. Such a strategy for the biosynthesis of toxic proteins, which, in the event of a premature activation, can cause damage to producing cells, is widespread in nature and is also traditional for use in biotechnology.
Известен также родственный способ продукции токсичных белков. От предыдущего он отличается тем, что продуцирующие клетки не обеспечивают внутриклеточного созревания и секретируют во внеклеточную среду про-ферменты, которые остаются в неактивном или слабоактивном состоянии в течение неопределенно долгого времени до момента активации. В этом случае про-ферменты называют зимогенами1, (1 Зимоген (zymogen) [греч. zyme - закваска и genes - порождающий, рождающийся] - функционально неактивный или слабоактивный профермент, который активируется при посттрансляционном удалении из молекулы фрагмента, способствующего поддержанию латентного состояния (напр., зимоген пепсиногена превращается в пищеварительный фермент пепсин при расщеплении на соответствующие пептиды)) и их активация осуществляется за пределами клеток под действием других ферментов, либо автокаталитически при изменении внешних условий (например, рН). В последнем случае говорят про самоактивируемый зимоген. В частности, в форме неактивных зимогенов продуцируются факторы свертывания крови животных [Stubbs & Bode 1994]. Получение фосфолипаз А2 в форме природных или искусственных зимогенов до сих пор не было известно.A related process for the production of toxic proteins is also known. It differs from the previous one in that the producing cells do not provide intracellular maturation and secrete pro-enzymes into the extracellular environment, which remain in an inactive or weakly active state for an indefinitely long time until the moment of activation. In this case, pro-enzymes are called zymogens 1 , ( 1 Zymogen [Greek zyme - ferment and genes - generative, emerging] - functionally inactive or weakly active zymogen, which is activated upon post-translational removal of a fragment from the molecule that contributes to maintaining a latent state ( for example, the pepsinogen zymogen is converted into the digestive enzyme pepsin upon splitting into the corresponding peptides)) and their activation is carried out outside the cells under the action of other enzymes, or autocatalytically when external conditions change (for example, pH). In the latter case, we speak of a self-activated zymogen. In particular, animal coagulation factors are produced in the form of inactive zymogens [Stubbs & Bode 1994]. The production of phospholipases A2 in the form of natural or artificial zymogens has not yet been known.
Еще одним способом природной адаптации организмов к биосинтезу Pla2 считается изменение фосфолипидного состава клеточных мембран и исключение из них компонентов, к которым продуцируемый фермент проявляет наибольшее сродство. В результате адаптации снижается токсическое действие Pla2 на клетку-хозяина и, как следствие, появляется возможность увеличения продукции фермента [Sugiyama et al., 2002].Another way of natural adaptation of organisms to Pla2 biosynthesis is the change in the phospholipid composition of cell membranes and the exclusion from them of the components to which the produced enzyme exhibits the greatest affinity. As a result of adaptation, the toxic effect of Pla2 on the host cell decreases and, as a consequence, it becomes possible to increase the production of the enzyme [Sugiyama et al., 2002].
Даже при наличии адаптации использование природных штаммов для производства Pla2 сопряжено с экономическими ограничениями. Как правило, для достижения высокого выхода фермента штамм-продуцент необходимо культивировать с использованием специального оборудования и комплексных сред, содержащих, в том числе, жировой компонент [Valero, 2012]. При этом организм-хозяин, как правило, синтезирует множество изоформ не только целевой Pla2, но и других липаз, которые изменяют специфичность и селективность ФП и способны ухудшать его свойства, а глубокая очистка целевого фермента представляется экономически неоправданной.Even with adaptation, the use of natural strains for Pla2 production comes with economic constraints. As a rule, to achieve a high yield of the enzyme, the producer strain must be cultivated using special equipment and complex media containing, among other things, a fat component [Valero, 2012]. In this case, the host organism, as a rule, synthesizes many isoforms not only of the target Pla2, but also of other lipases that change the specificity and selectivity of EP and can worsen its properties, and deep purification of the target enzyme seems to be economically unjustified.
В этой связи оптимальным способом увеличения производства высококачественных ФП является разработка рекомбинантных технологий, обеспечивающих экспрессию целевой Pla2 в клетках специально подобранного реципиентного микроорганизма.In this regard, the optimal way to increase the production of high-quality EP is the development of recombinant technologies that provide the expression of the target Pla2 in the cells of a specially selected recipient microorganism.
Будем различать рекомбинантные производные природных ферментов, аминокислотная последовательность которых идентична природным прототипам и не содержит целенаправленно-введенных искусственных модификаций, и рекомбинантные производные природных ферментов, аминокислотная последовательность которых была искусственно модифицирована в результате генно-инженерных манипуляций и не идентична природным прототипам. Будем называть первые РПМ(-), а вторые РПМ(+) природных ферментов.We will distinguish between recombinant derivatives of natural enzymes, the amino acid sequence of which is identical to natural prototypes and does not contain purposefully introduced artificial modifications, and recombinant derivatives of natural enzymes, the amino acid sequence of which was artificially modified as a result of genetically engineered manipulations and is not identical to natural prototypes. We will call the first RPM (-), and the second RPM (+) natural enzymes.
Также будем различать специфическую активность Pla2, выявляемую в специальных условиях, например, при постоянном рН, в присутствии высокой концентрации ионов кальция Са2+ на лецитиновом субстрате, солюбилизированного с использованием растворителя ПАВ «Тритон Х-100», а также специфическую активность, выявляемую на яичном желтке, не содержащем никаких посторонних добавок. Первую будем называть «специальной», а вторую - «собственной» активностью Pla2. Некоторые Pla2 обладают высокой «специальной» и низкой «собственной» активностью (Чеперегин с соавт. 2019). В то же время действие Pla2 на клетки в процессе биосинтеза и перспективы промышленного применения определяются уровнем «собственной», а не «специальной» активности, и полностью функциональная РПМ(+) Pla2 должна обладать показателями «специальной» и «собственной» активности, сходными с показателями природного фермента.We will also distinguish between the specific activity of Pla2, detected under special conditions, for example, at constant pH, in the presence of a high concentration of calcium ions Ca 2+ on a lecithin substrate, solubilized using a surfactant solvent "Triton X-100", as well as the specific activity detected on egg yolk that does not contain any extraneous additives. The first will be called "special", and the second - "own" activity Pla2. Some Pla2 have high "special" and low "intrinsic" activity (Cheperegin et al. 2019). At the same time, the effect of Pla2 on cells in the process of biosynthesis and the prospects for industrial application are determined by the level of “intrinsic” rather than “special” activity, and a fully functional RPM (+) Pla2 should have indicators of “special” and “intrinsic” activity similar to indicators of a natural enzyme.
В настоящее время дрожжи удерживают статус эффективных и продвинутых эукариотических систем экспрессии генов [Gasser et al. 2013; Singh et al. 2016; Zahrl et al. 2017; Raveendran et al. 2018]. Они обладают низким уровнем продукции собственных секретируемых белков, но при этом способны обеспечить эффективную секрецию в культуральную среду целевых рекомбинантных продуктов.Currently, yeast maintains the status of efficient and advanced eukaryotic gene expression systems [Gasser et al. 2013; Singh et al. 2016; Zahrl et al. 2017; Raveendran et al. 2018]. They have a low level of production of their own secreted proteins, but at the same time they are able to provide effective secretion into the culture medium of target recombinant products.
Известно, что, не обладая собственными фосфолипазами А2, дрожжи способны продуцировать РПМ(-) природных ферментов. В частности, известно о продукции в дрожжах РПМ(-) Pla2 индийской кобры Naja naja naja [Lefkowitz et al. 1999] и РПМ(-) Pla2 штамма бактерий 2917 S. violaceoruber [Liu et al. 2015]. Однако у этих РПМ(-) Pla2 зафиксирована низкая «специальная» активность, 50-80 ед/мг [Lefkowitz et al. 1999] и 170 ед/мг [Liu et al., 2015], что существенно ниже показателей высокоактивных Pla2, синтезируемых природными продуцентами, штаммом S.violaceoruber А-2688 - 1000 ед/мг [Sugiyama et. al. 2002; http://wayback.archive-it.org/7993/20171031055659/ https://www.fda.gov/downloads/Food/IngredientsPackadngLabeling/GRAS/NoticeInventon,/UCM263914.pdf] или штаммами грибов - 648 ед/мг и выше [WO 2004/097012], составляющих основу коммерческих препаратов. Кроме того, показано, что РПМ(-) Pla2 штамма бактерий 2917 S. violaceoruber обладает близким к нулю показателем «собственной» активности [Чеперегин с соавт. 2019]. В этой связи, даже несмотря на высокую продукцию, составлявшую 30 и 200 мг/л, соответственно, указанные РПМ(-) Pla2 должны быть отнесены к низкоактивным ферментам, а их потенциальное промышленное применение -к компромиссным технологиям.It is known that, lacking its own A2 phospholipases, yeast is capable of producing RPM (-) natural enzymes. In particular, it is known about the production of RPM (-) Pla2 in yeast of the Indian cobra Naja naja naja [Lefkowitz et al. 1999] and RPM (-) Pla2 bacterial strain 2917 S. violaceoruber [Liu et al. 2015]. However, these RPM (-) Pla2 recorded a low "special" activity, 50-80 U / mg [Lefkowitz et al. 1999] and 170 U / mg [Liu et al., 2015], which is significantly lower than the indicators of highly active Pla2 synthesized by natural producers, strain S. violaceoruber A-2688 - 1000 U / mg [Sugiyama et. al. 2002; http://wayback.archive-it.org/7993/20171031055659/ https://www.fda.gov/downloads/Food/IngredientsPackadngLabeling/GRAS/NoticeInventon , /UCM263914.pdf] or mushroom strains - 648 U / mg and above [WO 2004/097012], which form the basis of commercial preparations. In addition, it has been shown that RPM (-) Pla2 of bacterial strain 2917 S. violaceoruber has a close to zero indicator of "intrinsic" activity [Cheperegin et al. 2019]. In this regard, even in spite of the high production of 30 and 200 mg / l, respectively, the indicated RPM (-) Pla2 should be classified as low-activity enzymes, and their potential industrial application should be classified as compromise technologies.
Известно об эффективной экспрессии в дрожжах высокоактивных РПМ(+) Pla2 [Чеперегин с соавт. 2019]. Однако вследствие внесенных изменений эти РПМ(+) приобретают высокую «собственную» активность только в присутствии дополнительных количеств ионов кальция Са2+ [Чеперегин с соавт. 2019]. В отсутствие дополнительных количеств кальция эти РПМ(+) Pla2 являются низкоактивными ферментами, для применения которых требуются компромиссные технологии.It is known about the efficient expression in yeast of highly active RPM (+) Pla2 [Cheperegin et al. 2019]. However, due to the changes introduced, these RPM (+) acquire high "intrinsic" activity only in the presence of additional amounts of calcium ions Ca 2+ [Cheperegin et al. 2019]. In the absence of additional amounts of calcium, these RPM (+) Pla2 are low-activity enzymes that require trade-off technologies for their use.
Примеров разработки на основе дрожжей продуцентов РПМ(-) или РПМ(+) Pla2, обладающих высокой «собственной» активностью, в открытых источниках информации не обнаружено. В то же время именно они востребованы для промышленного производства.No examples of the development of yeast-based producers of RPM (-) or RPM (+) Pla2 with high "intrinsic" activity have been found in open sources of information. At the same time, it is they who are in demand for industrial production.
Природная Pla2 бактерий S. violaceoruber является уникальной ферментом, не имеющим «загрязняющей» липазной активности, в связи с чем ее использование снижает потери при дегуммировании масел [Liu et al., 2015]. Из источников информации известны две природные Pla2 S. violaceoruber: высокоактивная Pla2 штамма А-2688 [Sugiyama et. al., 2002], называемая далее Pla22 [Чеперегин с соавт. 2019], и низкоактивная Pla2 штамма 2917 [Liu et al., 2015]. Информация об экспрессии в дрожжах раскрыта для низкоактивной Pla2 [Liu et al., 2015], а также для РПМ(+) Pla22 [Чеперегин с соавт. 2019], на базе которой разработан негликозилированный вариант Pla22ng, несущий мутации Ser31Ala, Ser82Ala и Asn108Gln в сайтах N-гликозилирования [Чеперегин с соавт. 2019].Natural Pla2 of S. violaceoruber bacteria is a unique enzyme that does not have “polluting” lipase activity, and therefore its use reduces losses during degumming of oils [Liu et al., 2015]. From information sources, two natural Pla2 S. violaceoruber are known: highly active Pla2 strain A-2688 [Sugiyama et. al., 2002], hereinafter called Pla22 [Cheperegin et al. 2019], and low-activity Pla2 strain 2917 [Liu et al., 2015]. Information on expression in yeast has been disclosed for low-activity Pla2 [Liu et al., 2015], as well as for RPM (+) Pla22 [Cheperegin et al. 2019], on the basis of which a non-glycosylated variant of Pla22ng was developed, carrying mutations Ser31Ala, Ser82Ala and Asn108Gln in the sites of N-glycosylation [Cheperegin et al. 2019].
Последовательности вариантов Pla22 и Pla22ng фосфолипазы А2 используют в качестве основы для разработки заявляемого изобретения. Препарат природной высокоактивной фосфолипазы А2 штамма S. violaceoruber А-2688 [Sugiyama et. al., 2002], производят в форме коммерческого препарата «Pla2 Nagase».The sequences of the Pla22 and Pla22ng variants of phospholipase A2 are used as the basis for the development of the claimed invention. The preparation of natural highly active phospholipase A2 strain S. violaceoruber A-2688 [Sugiyama et. al., 2002], is produced in the form of a commercial preparation "Pla2 Nagase".
Задача заявляемой группы изобретений состоит в разработке способа получения в дрожжах Saccharomyces cerevisiae секретируемой полностью функциональной фосфолипазы А2.The objective of the claimed group of inventions is to develop a method for producing secreted fully functional phospholipase A2 in the yeast Saccharomyces cerevisiae.
Задача решена путем:The problem was solved by:
- разработки способа получения секретируемой полностью функциональной фосфолипазы А2, осуществляемого путем получения и введения в клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae генетической конструкции, кодирующей белок-предшественник, включающий последовательность нативной, содержащей сайты N-гликозилирования, или мутантной, не содержащей сайтов N-негликозилирования, фосфолипазы А2 штамма S. violaceoruber А-2688, содержащей инсерцию интеина между остатком глицина в позиции 75 и остатком серина в позиции 76, а также имеющей на N-конце дополнительный дипептид, состоящий из аминокислотных остатков серина и глицина, с последующим биосинтезом этого белка-предшественника и его автокаталитическим процессингом с образованием целевого продукта;- development of a method for obtaining a secreted fully functional phospholipase A2, carried out by obtaining and introducing into cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae a genetic construct encoding a precursor protein, including a sequence of native, containing N-glycosylation sites, or mutant, not containing N-non-glycosylation sites, phospholipase A2 strain S. violaceoruber A-2688 containing an intein insertion between the glycine residue at position 75 and the serine residue at position 76, as well as having an additional dipeptide at the N-terminus consisting of serine and glycine amino acid residues, followed by biosynthesis of this precursor protein and its autocatalytic processing with the formation of the target product;
- получения генетической конструкции, кодирующей белок-предшественник, содержащий инсерцию интеина PRP8 штамма Penicillium chrysogenum ВКПМ F-3 в составе нативной фосфолипазы А2 штамма Streptomyces violaceoruber А-2688, для осуществления заявляемого способа;- obtaining a genetic construct encoding a precursor protein containing an insertion of the intein PRP8 of the Penicillium chrysogenum VKPM F-3 strain as part of the native phospholipase A2 of the Streptomyces violaceoruber A-2688 strain, to implement the proposed method;
- получения генетической конструкции, кодирующей белок-предшественник, содержащий инсерцию интеина PRP8 штамма Penicillium chrysogenum ВКПМ F-3, несущего мутацию Cys11Tyr, в составе нативной фосфолипазы А2 штамма Streptomyces violaceoruber А-2688, для осуществления заявляемого способа;- obtaining a genetic construct encoding a precursor protein containing an insertion of the intein PRP8 of the Penicillium chrysogenum VKPM F-3 strain carrying the Cys11Tyr mutation, as part of the native phospholipase A2 of the Streptomyces violaceoruber A-2688 strain, for the implementation of the claimed method;
- получения генетической конструкции, кодирующей белок-предшественник, содержащий инсерцию интеина PRP8 штамма Neosartorya aurata NRRL 4378 в составе фосфолипазы А2 штамма Streptomyces violaceoruber А-2688, несущей мутации Ser31Ala, Ser82Ala и Asn108Gln, для осуществления заявляемого способа;- obtaining a genetic construct encoding a precursor protein containing an insertion of the PRP8 intein of the Neosartorya aurata NRRL 4378 strain as part of the A2 phospholipase of the Streptomyces violaceoruber A-2688 strain carrying the Ser31Ala, Ser82Ala and Asn108Gln mutations, to implement the claimed method;
- получения генетической конструкции, кодирующей белок-предшественник, содержащий инсерцию интеина PRP8 штамма Penicillium chrysogenum ВКПМ F-3, несущего мутацию Cys11Tyr, в составе фосфолипазы А2 штамма Streptomyces violaceoruber А-2688, несущей мутации Ser31Ala, Ser82Ala и Asn108Gln, для осуществления заявляемого способа.- obtaining a genetic construct encoding a precursor protein containing an insertion of the intein PRP8 of the Penicillium chrysogenum VKPM F-3 strain carrying the Cys11Tyr mutation as part of the phospholipase A2 of the Streptomyces violaceoruber A-2688 strain carrying the Ser31Ala, Ser82Gla and Asn8 mutations.
Способ получения секретируемой полностью функциональной фосфолипазы А2Method for producing secreted fully functional phospholipase A2
Решение задачи включает следующие этапы:The solution to the problem includes the following steps:
- используя методы молекулярной биологии и генетической инженерии, клонируют структурный ген интеина PRP8 штамма P. chrysogenum (Int4), интеина PRP8 штамма P. chrysogenum, несущего мутацию Cys11Tyr (Int4Y), и интеина PRP8 штамма N. aurata NRRL 4378 (Int5);- using the methods of molecular biology and genetic engineering, clone the structural gene of the PRP8 intein of the P. chrysogenum (Int4) strain, the PRP8 intein of the P. chrysogenum strain carrying the Cys11Tyr mutation (Int4Y), and the PRP8 intein of the N. aurata NRRL 4378 (Int5) strain;
- с использованием структурного гена, кодирующего РПМ(-) Pla22 [Чеперегин с соавт. 2019], получают генетические конструкции SEQ ID N1 и SEQ ID N2, кодирующие белок - предшественник для получения фосфолипазы А2 путем автокаталитического процессинга, представляющий собой гликозилированную фосфолипазу А2 штамма S. violaceoruber А-2688, содержащую инсерцию интеина Int4 или интеина Int4Y, соответственно, между остатком глицина в позиции 75 и остатком серина в позиции 76 и имеющую на N-конце дополнительный дипептид, состоящий из аминокислотных остатков серина и глицина;- using a structural gene encoding RPM (-) Pla22 [Cheperegin et al. 2019], genetic constructs SEQ ID N1 and SEQ ID N2 are obtained, encoding a precursor protein for obtaining phospholipase A2 by autocatalytic processing, which is a glycosylated phospholipase A2 of the S. violaceoruber A-2688 strain containing an insertion of intein Int4 or intein Int4Y, respectively, between a glycine residue at position 75 and a serine residue at position 76 and having an additional dipeptide at the N-terminus, consisting of the amino acid residues of serine and glycine;
- с использованием структурного гена, кодирующего РПМ(+) Pla22ng [Чеперегин с соавт. 2019], получают генетические конструкции SEQ ID N3 и SEQ ID N4, кодирующие белок - предшественник для получения фосфолипазы А2 путем автокаталитического процессинга, представляющий собой негликозилированную фосфолипазу А2 штамма А-2688 S. violaceoruber, несущую мутации S31A, S82A и N108Q и содержащую инсерцию интеина Int5 или интеина Int4Y, соответственно, между остатком глицина в позиции 75 и остатком серина в позиции 76 и имеющую на N-конце дополнительный дипептид, состоящий из аминокислотных остатков серина и глицина;- using the structural gene encoding RPM (+) Pla22ng [Cheperegin et al. 2019], the genetic constructs SEQ ID N3 and SEQ ID N4 are obtained, encoding a precursor protein for obtaining phospholipase A2 by autocatalytic processing, which is a non-glycosylated phospholipase A2 of the S. violaceoruber A-2688 strain carrying mutations S31A, S82A and N108Q and containing an insertion Int5 or intein Int4Y, respectively, between the glycine residue at position 75 and the serine residue at position 76 and having an additional dipeptide at the N-terminus consisting of the amino acid residues of serine and glycine;
- полученные генетические конструкции SEQ ID N1, SEQ ID N2, SEQ ID N3 и SEQ ID N4 вводят в клетки дрожжей S. cerevisiae. Для этого используют реципиентные штаммы, векторы, промоторы, лидерные области, которые идентичны или аналогичны описанным ранее [Чеперегин с соавт. 2019, RU 2460795 и RU 2522479] и не являются существенными признаками изобретения. В результате получают штаммы-продуценты заявляемых белков-предшественников;- the obtained genetic constructs SEQ ID N1, SEQ ID N2, SEQ ID N3 and SEQ ID N4 are introduced into the cells of the yeast S. cerevisiae. To do this, use recipient strains, vectors, promoters, leader regions, which are identical or similar to those described earlier [Cheperegin et al. 2019, RU 2460795 and RU 2522479] and are not essential features of the invention. As a result, producing strains of the claimed precursor proteins are obtained;
- осуществляют культивирование каждого из полученных штаммов дрожжей, содержащих генетические конструкции SEQ ID N1, SEQ ID N2, SEQ ID N3 и SEQ ID N4, для чего используют условия, обеспечивающие экспрессию этих конструкций, идентичные или аналогичные описанным ранее [Чеперегин с соавт. 2019, RU 2460795 и RU 2522479], не являющиеся существенными признаками изобретения. В результате культивирования каждого штамма получают культуральную жидкость, содержащую секретированный заявляемый белок-предшественник, который в результате автокаталитического процессинга образует целевой продукт; анализ активности которого доказывает, что он представляет собой полностью функциональную фосфолипазу А2.- carry out the cultivation of each of the obtained strains of yeast containing genetic constructs SEQ ID N1, SEQ ID N2, SEQ ID N3 and SEQ ID N4, for which the conditions are used to ensure the expression of these constructs, identical or similar to those described earlier [Cheperegin et al. 2019, RU 2460795 and RU 2522479], which are not essential features of the invention. As a result of cultivation of each strain, a culture liquid is obtained containing the secreted inventive precursor protein, which forms the target product as a result of autocatalytic processing; analysis of the activity of which proves that it is a fully functional phospholipase A2.
Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами:The invention is illustrated by the following figures:
Фиг. 1 - Схема конструирования фрагментов ДНК, кодирующих заявляемые белки-предшественники. Условные обозначения: pINT - плазмида pInt4, pInt4Y или pInt5; INT -последовательность ДНК, кодирующая интеин Int4, Int4Y или Int5; PlaN и PlaC - последовательности ДНК, кодирующие N-концевую (с 1 по 75 остаток) и С-концевую (с 76 по 122 остаток) части фосфолипазы А2 в составе заявляемых белков-предшественников; pPla - плазмиды pUC18x-Pla22 или pUC18x-Pla22ng; Pla-хх - последовательность ДНК, кодирующая заявляемый белок-предшественникFIG. 1 - Scheme for the construction of DNA fragments encoding the claimed precursor proteins. Legend: pINT - plasmid pInt4, pInt4Y or pInt5; INT-DNA sequence encoding intein Int4, Int4Y or Int5; PlaN and PlaC - DNA sequences encoding the N-terminal (from 1 to 75 residue) and C-terminal (from 76 to 122 residue) parts of phospholipase A2 as part of the claimed precursor proteins; pPla - plasmids pUC18x-Pla22 or pUC18x-Pla22ng; Pla-xx - DNA sequence encoding the claimed precursor protein
Фиг. 2. ПААГ-электрофореграмма белков культуральной жидкости дрожжей штаммов D-Pla22ng(Int5) и D-Pla22ng(Int4Y) до (-) и после (+) процессинга, проведенного в течение 69 часов при комнатной температуре. Показано положение белковых полос соответствующих белкам-предшественникам (Pla22ng(Int)), интеинам Int5 и Int4Y, а также зрелой фосфолипазе А2 (Pla22ng).FIG. 2. PAGE-electrophoregram of proteins of the culture fluid of yeast strains D-Pla22ng (Int5) and D-Pla22ng (Int4Y) before (-) and after (+) processing carried out for 69 hours at room temperature. The position of protein bands corresponding to precursor proteins (Pla22ng (Int)), inteins Int5 and Int4Y, as well as mature phospholipase A2 (Pla22ng) is shown.
Пример 1. Клонирование структурного гена интеина Int4Example 1. Cloning of the Int4 intein structural gene
Фрагмент ДНК, кодирующий мини-интеин PRP8 P. chrysogenum (GeneBank АМ042015.1), называемый Int4, получают с использованием ПЦР. ПЦР осуществляют с использованием ДНК-полимеразы Phusion (ThermoFisher). Матрицей служит тотальная геномная ДНК штамма P. chrysogenum ВКПМ F-3, очищенная по стандартной методике [Kaiser et. al., 1994]. Фрагмент ДНК, кодирующий Int4 амплифицируют с использованием праймеров:A DNA fragment encoding the P. chrysogenum mini-intein PRP8 (GeneBank AM042015.1), called Int4, was obtained using PCR. PCR was performed using Phusion DNA polymerase (ThermoFisher). The matrix is the total genomic DNA of the P. chrysogenum VKPM F-3 strain, purified according to the standard method [Kaiser et. al., 1994]. The DNA fragment encoding Int4 is amplified using primers:
После открывания концов с использованием рестриктаз NcoI и XhoI амплифицированный фрагменты ДНК клонируют в лабораторном векторе pUC19mx, производном стандартного вектора pUC19, содержащем модифицированный полилинкер в окружении сайтов узнавания рестриктаз NcoI и XhoI.After opening the ends using the restriction enzymes NcoI and XhoI, the amplified DNA fragments are cloned into the laboratory vector pUC19mx, a derivative of the standard vector pUC19 containing the modified polylinker surrounded by the recognition sites of the restriction enzymes NcoI and XhoI.
В результате клонирования получают плазмиду pInt4, содержащую последовательность структурного гена интеина Int4.As a result of cloning, plasmid pInt4 containing the sequence of the structural gene of intein Int4 is obtained.
Пример 2. Клонирование структурного гена интеина Int4YExample 2. Cloning of the Int4Y intein structural gene
Фрагмент ДНК, кодирующий мутантный вариант мини-интеина PRP8 P. chrysogenum (GeneBank АМ042015.1), называемый Int4Y, клонируют, как описано в примере 1, но для амплификации используют праймеры:A DNA fragment encoding a mutant variant of the P. chrysogenum mini-intein PRP8 (GeneBank AM042015.1), called Int4Y, was cloned as described in example 1, but primers were used for amplification:
В результате клонирования получают плазмиду pInt4Y, содержащую последовательность структурного гена мутантного интеина Int4Y, содержащего замену Cys11Tyr.As a result of cloning, plasmid pInt4Y is obtained containing the sequence of the structural gene of the mutant intein Int4Y containing the Cys11Tyr substitution.
Пример 3. Синтез структурного гена интеина Int5Example 3. Synthesis of the structural gene of intein Int5
Фрагмент ДНК SEQ ID N1, кодирующий интеин Nau PRP8 штамма N. aurata NRRL 4378, называемый Int5, получают в виде синтетического BamHI/XhoI фрагмента ДНК. Этот фрагмент клонируют в лабораторной плазмиде pUC18x. В результате получают плазмиду pInt5, содержащую последовательность структурного гена интеина Int5.The DNA fragment SEQ ID N1 encoding the Nau PRP8 intein of the N. aurata NRRL 4378 strain, called Int5, is obtained as a synthetic BamHI / XhoI DNA fragment. This fragment is cloned into the laboratory plasmid pUC18x. The result is a plasmid pInt5 containing the sequence of the structural gene of intein Int5.
Пример 4. Конструирование гена Pla22Example 4. Construction of the Pla22 gene
Фрагмент ДНК, заключающий структурный ген фосфолипазы А2, называемый Pla22, кодирующий аминокислотную последовательность зрелой фосфолипазы А2 штамма S. violaceoruber А-2688 (GenBank АЕМ88445), получают с использованием ПЦР. Матрицей для ПЦР служит последовательность синтетического гена Pla2 [Чеперегин с соавт. 2019]. Фрагмент ДНК, содержащий этот ген, клонирован по сайтам BamHI/XhoI в векторе pUC18x, являющемся производным стандартного вектора pUC18 и содержащем в составе модифицировонного полилинкера сайт узнавания рестриктазы XhoI вместо сайта EcoRI.A DNA fragment enclosing the structural gene of phospholipase A2, called Pla22, coding for the amino acid sequence of mature phospholipase A2 of S. violaceoruber A-2688 (GenBank AEM88445) was obtained using PCR. The matrix for PCR is the sequence of the synthetic Pla2 gene [Cheperegin et al. 2019]. A DNA fragment containing this gene was cloned at the BamHI / XhoI sites in the pUC18x vector, which is a derivative of the standard pUC18 vector and contains the XhoI restriction endonuclease recognition site instead of the EcoRI site in the modified polylinker.
Искомый фрагмент ДНК получают в 2 этапа. На первом этапе с помощью ПЦР получают 2 перекрывающихся фрагмента ДНК:The desired DNA fragment is obtained in 2 stages. At the first stage, 2 overlapping DNA fragments are obtained using PCR:
- фрагмент 1 получают, используя праймер и -
- фрагмент 2 получают, используя праймер и - fragment 2 is obtained using a primer and
Амплифицированные фрагменты ДНК очищают из геля и на следующем этапе проводят ПЦР-опосредованное лигирование очищенных фрагментов ДНК. С этой целью проводят ПЦР с использованием смеси фрагментов 1 и 2 в качестве матрицы. Праймерами для амплификации служат N168 и N1272. Амплифицированный фрагмент ДНК элюируют из агарозного геля и после открывания концов с использованием рестриктаз BamHI и XhoI клонируют в плазмиде pUC18x, расщепленной по тем же сайтам. В результате клонирования получают плазмиду pUC18x-Pla22, в составе которой нуклеотидную последовательность клонированного гена подтверждают секвенированием.The amplified DNA fragments are purified from the gel, and the next step is PCR-mediated ligation of the purified DNA fragments. For this purpose, PCR is carried out using a mixture of
Полученная плазмида pUC18x-Pla22 содержит BamHI/XhoI фрагмент ДНК, кодирующий вариант Pla22 фосфолипазы А2, аминокислотная последовательность которой заключает остаток треонина в позиции 46 (замена Ser46Thr) и остатки фенилаланина и глицина на С-конце в позициях 121 и 122, соответственно (замена Leu121(PheGly)). Плазмиду pUCT8x-Pla22 используют для получения гена мутантного варианта фосфолипазы и для инсерции последовательностей ДНК, кодирующих интеины.The resulting plasmid pUC18x-Pla22 contains a BamHI / XhoI DNA fragment encoding the Pla22 variant of phospholipase A2, the amino acid sequence of which contains a threonine residue at position 46 (Ser46Thr substitution) and phenylalanine and glycine residues at the C-terminus at positions 121 and 122, respectively (Leu121 substitution (PheGly)). Plasmid pUCT8x-Pla22 is used to generate the gene for the mutant phospholipase variant and to insert DNA sequences encoding inteins.
Пример 5. Конструирование гена Pla22ngExample 5. Construction of the Pla22ng gene
Фрагмент ДНК, заключающий структурный ген Pla22ng, кодирующий мутантный вариант фосфолипазы, из аминокислотной последовательности которой исключают три сайта N-гликозилирования, получают с помощью ПЦР. В качестве матрицы для ПЦР используют ДНК плазмиды pUC18x-Pla22. ПЦР осуществляют в 2 этапа.A DNA fragment containing the Pla22ng structural gene encoding a mutant variant of phospholipase, from the amino acid sequence of which three N-glycosylation sites are excluded, is obtained by PCR. The DNA of the plasmid pUC18x-Pla22 was used as a template for PCR. PCR is carried out in 2 stages.
На первом этапе последовательность мутантного гена получают в виде 4 фрагментов ДНК, полученных с помощью ПЦР и имеющих попарно перекрывающиеся концы:At the first stage, the sequence of the mutant gene is obtained in the form of 4 DNA fragments obtained by PCR and having pairwise overlapping ends:
- фрагмент 1 получают, используя праймер и -
- фрагмент 2 получают, используя праймер и - fragment 2 is obtained using a primer and
- фрагмент 3 получают, используя праймер и - fragment 3 is obtained using a primer and
- фрагмент 4 получают, используя праймер и - fragment 4 is obtained using a primer and
Амплифицированные фрагменты ДНК очищают из геля, используя с этой целью набор Qiagen (Qiagen, cat. №28706).The amplified DNA fragments are purified from the gel using a Qiagen kit (Qiagen, cat. # 28706).
На следующем этапе проводят ПЦР-опосредованное лигирование 4 очищенных фрагментов ДНК. С этой целью проводят ПЦР с использованием смеси фрагментов 1, 2, 3 и 4 в качестве матрицы. Праймерами для амплификации служат N1346 и N169. Амплифицированный фрагмент ДНК элюируют из агарозного геля и после открывания концов с использованием рестриктаз BamHI и XhoI клонируют в плазмиде pUC18x (Пример 4), расщепленной по тем же сайтам. В результате клонирования получают плазмиду pUC18x-Pla22ng, в составе которой нуклеотидную последовательность клонированного гена подтверждают секвенированием.The next step is PCR-mediated ligation of 4 purified DNA fragments. For this purpose, PCR is carried out using a mixture of
Полученная плазмида pUC18x-Pla22ng содержит BamHI/XhoI фрагмент ДНК, кодирующий мутантную фосфолипазу, содержащую 3 замены: Ser31Ala, Ser82Ala и Asn108Gln, инактивирующие все 3 потенциальных сайта N-гликозилирования. Мутантный вариант фосфолипазы называют Pla22ng.The resulting plasmid pUC18x-Pla22ng contains a BamHI / XhoI DNA fragment encoding a mutant phospholipase containing 3 substitutions: Ser31Ala, Ser82Ala and Asn108Gln, inactivating all 3 potential N-glycosylation sites. The mutant phospholipase variant is called Pla22ng.
Плазмиду pUC18x-Pla22ng используют для инсерции последовательностей ДНК, кодирующих интеины.Plasmid pUC18x-Pla22ng is used to insert DNA sequences encoding inteins.
Пример 6. Получение фрагментов ДНК, кодирующих заявляемые интеин-содеожащие белки-предшественникиExample 6. Obtaining DNA fragments encoding the claimed intein-containing precursor proteins
Заявляемые белки-предшественники нативной, содержащей сайты N-гликозилирования, фосфолипазы А2, содержащие инсерции интеинов Int4 или Int4Y, называют Pla22(Int4) и Pla22(Int4Y), соответственно. Для получения последовательностей ДНК, кодирующих эти белки, используют плазмиду pUC18x-Pla22.The claimed proteins-precursors of the native, containing sites of N-glycosylation, phospholipase A2, containing insertions of inteins Int4 or Int4Y, are called Pla22 (Int4) and Pla22 (Int4Y), respectively. To obtain DNA sequences encoding these proteins, the plasmid pUC18x-Pla22 is used.
Заявляемые белки-предшественники мутантной, не содержащей сайтов N-негликозилирования, фосфолипазы А2, содержащие инсерции интеинов Int5 или Int4Y, называют Pla22ng(Int5) и Pla22ng(Int4Y), соответственно. Для получения последовательностей ДНК, кодирующих эти белки, используют плазмиду pUC18x-Pla22ng.The claimed proteins-precursors of the mutant phospholipase A2 containing no N-non-glycosylation sites containing insertions of Int5 or Int4Y inteins are called Pla22ng (Int5) and Pla22ng (Int4Y), respectively. To obtain DNA sequences encoding these proteins, the plasmid pUC18x-Pla22ng is used.
Для конструирования фрагментов ДНК, кодирующих заявляемые белки-предшественники, содержащие интеиновые инсерции, используют технологию ПЦР-опосредованного лигирования перекрывающихся последовательностей ДНК по схеме Фиг. 1. Для этого используют универсальные праймеры для амплификации dir и rev To construct DNA fragments encoding the inventive precursor proteins containing intein insertions, the PCR-mediated ligation of overlapping DNA sequences is used according to the scheme of FIG. 1. To do this, use universal primers for dir amplification and rev
Кроме них, для получения последовательностей ДНК, кодирующих белки-предшественники Pla22(Int4), Pla22(Int4Y) и Pla22ng(Int4Y), используют праймеры Р1 и Р2 а для получения последовательности ДНК, кодирующей белок-предшественник Pla22ng(Int5) используют праймеры Р1 и Р2 Для ПЦР используют ДНК-полимеразу Phusion (ThermoFisher Scientific, F-#F530S).In addition to them, primers P1 are used to obtain DNA sequences encoding the precursor proteins Pla22 (Int4), Pla22 (Int4Y) and Pla22ng (Int4Y) and P2 and to obtain the DNA sequence encoding the precursor protein Pla22ng (Int5) primers P1 and P2 For PCR, Phusion DNA polymerase (ThermoFisher Scientific, F- # F530S) was used.
В результате ПЦР-лигирования получают BamHI/XhoI фрагменты ДНК, заключающие последовательности ДНК SEQ ID N1, SEQ ID N2, SEQ ID N3 и SEQ ID N4, кодирующие заявляемые белки-предшественники Pla22(Int4), Pla22(Int4Y), Pla22ng(Int5) и Pla22ng(Int4Y), соответственно.As a result of PCR ligation, BamHI / XhoI DNA fragments are obtained containing the DNA sequences SEQ ID N1, SEQ ID N2, SEQ ID N3 and SEQ ID N4, encoding the claimed precursor proteins Pla22 (Int4), Pla22 (Int4Y), Pla22ng (Int5) and Pla22ng (Int4Y), respectively.
Эти фрагменты ДНК используют для конструирования экспрессионных плазмид, штаммов-продуцентов и получения соответствующих вариантов фосфолипазы А2.These DNA fragments are used to construct expression plasmids, producer strains and obtain corresponding variants of phospholipase A2.
Пример 7. Конструирование экспрессионных плазмид для биосинтеза заявляемых белков-предшественников в дрожжах S. cerevisiaeExample 7. Construction of expression plasmids for the biosynthesis of the claimed precursor proteins in the yeast S. cerevisiae
Экспрессионные плазмиды конструируют путем лигирования трех фрагментов ДНК.Expression plasmids are constructed by ligating three DNA fragments.
Фрагментом 1 служит XhoI/HindIII фрагмент ДНК лабораторного бирепликонного вектора pPDX3 [RU 2460795]. Данный фрагмент содержит, начиная от сайта XhoI: область терминации транскрипции гена CYC1 дрожжей S. cerevisiae; фрагмент ДНК, обеспечивающий репликацию и селекцию плазмид pPDX3 в клетках Е. coli; фрагмент ДНК эндогенной 2-мкм плазмиды дрожжей, обеспечивающий способность плазмид pPDX3 поддерживаться в клетках дрожжей S. cerevisiae в эписомном многокопийном состоянии; структурные гены URA3 и PGK1 дрожжей S. cerevisiae, обеспечивающие селективное поддержание плазмид pPDX3 в штаммах, имеющих соответствующие хромосомные мутации [RU 2460795, RU 2515913 и др.].
Фрагментом 2 является «регуляторный» HindIII/BglII фрагмент ДНК, кодирующий промотор GAL1, используемый для экспрессии, и лидерную область matHH, направляющую секрецию вариантов фосфолипазы А2 в дрожжах S. cerevisiae.Fragment 2 is the "regulatory" HindIII / BglII DNA fragment encoding the GAL1 promoter used for expression and the matHH leader region, directing the secretion of phospholipase A2 variants in S. cerevisiae yeast.
Для конструирования «регуляторного» фрагмента ДНК используют плазмиду pUC18x-GAL1matHH-GH, содержащую ген зрелого соматропина, слитый с фрагментом ДНК, кодирующим лидерный полипептид, включающий последовательности сигнального пептида mat и удвоенной про-области белка HSP150 дрожжей S. cerevisiae [RU 2460795].To construct a "regulatory" DNA fragment, the pUC18x-GAL1matHH-GH plasmid is used, which contains the mature somatropin gene fused with a DNA fragment encoding a leader polypeptide comprising the mat signal peptide sequences and the doubled pro-region of the S. cerevisiae yeast HSP150 protein [RU 2460795].
Конструирование проводят путем замещения NcoI/XhoI фрагмента ДНК плазмиды pUC18x-GAL1matHH-GH, кодирующего соматропин, на синтетический двуцепочечный фрагмент ДНК, заключающий сайт узнавания рестриктазы BglII и полученный в результате отжига двух олигонуклеотидов:Construction is carried out by replacing the NcoI / XhoI DNA fragment of the plasmid pUC18x-GAL1matHH-GH encoding somatropin with a synthetic double-stranded DNA fragment containing the BglII restriction enzyme recognition site and obtained by annealing two oligonucleotides:
В результате клонирования получают плазмиду pUC18x-GAL1matHH-(BglII), в составе которой в последовательности ДНК, кодирующей лидерный полипептид matHH, сконструирован сайт рестриктазы BglII, формируемый кодоном аргинина, входящим в сайт узнавания протеиназы Кех2, и кодоном серина, следующим непосредственно за кодоном аргинина.As a result of cloning, the plasmid pUC18x-GAL1matHH- (BglII) is obtained, in which, in the DNA sequence encoding the leader matHH polypeptide, the BglII restriction site is constructed, formed by the arginine codon, which is part of the Kex2 proteinase recognition site, and the serine codon immediately following the arginine codon ...
Плазмида pUC18x-GAL1matHH-(BglII) служит источником «регуляторного» HindIII/BglII фрагмента ДНК (Фрагмента 2).Plasmid pUC18x-GAL1matHH- (BglII) serves as the source of the "regulatory" HindIII / BglII DNA fragment (Fragment 2).
Фрагментом 3 служит BamHI/XhoI фрагмент ДНК заключающий последовательность ДНК SEQ ID N1 или SEQ ID N2 или SEQ ID N3 или SEQ ID N4, кодирующий заявляемый белок-предшественник Pla22(Int4), Pla22(Int4Y), Pla22ng(Int5) или Pla22ng(Int4Y), соответственно.Fragment 3 is a BamHI / XhoI DNA fragment containing the DNA sequence SEQ ID N1 or SEQ ID N2 or SEQ ID N3 or SEQ ID N4 encoding the claimed precursor protein Pla22 (Int4), Pla22 (Int4Y), Pla22ng (Int5) or Pla22ng (Int4Y ), respectively.
В частности,In particular,
- плазмиду pPDX3-Pla22(Int4) получают путем лигирования фрагментов 1 и 2, а также фрагмента 3, заключающего последовательность ДНК SEQ ID N1;- plasmid pPDX3-Pla22 (Int4) is obtained by ligating
- плазмиду pPDX3-Pla22(Int4Y) получают путем лигирования фрагментов 1 и 2, а также фрагмента 3, заключающего последовательность ДНК SEQ ID N2;- plasmid pPDX3-Pla22 (Int4Y) is obtained by ligating
- плазмиду pPDX3-Pla22ng(Int5) получают путем лигирования фрагментов 1 и 2, а также фрагмента 3, заключающего последовательность ДНК SEQ ID N3;- plasmid pPDX3-Pla22ng (Int5) is obtained by ligating
- плазмиду pPDX3-Pla22ng(Int4Y) получают путем лигирования фрагментов 1 и 2, а также фрагмента 3, заключающего последовательность ДНК SEQ ID N4.- plasmid pPDX3-Pla22ng (Int4Y) is obtained by ligating
Полученные экспрессионные плазмиды серии pPDX3 содержат в своем составе последовательности ДНК, кодирующие заявляемые белки-предшественники, слитые с последовательностями ДНК, кодирующими промотор GAL1 дрожжей S.cerevisiae и лидерный полипептид matHH, заключающий в своем составе удвоенную (НН) про-области белка HSP150 дрожжей S. cerevisiae. Эти плазмиды используют для трансформации клеток реципиентных штаммов дрожжей S. cerevisiae и наработки соответствующих образцов фосфолипазы А2.The resulting expression plasmids of the pPDX3 series contain DNA sequences encoding the inventive precursor proteins fused with DNA sequences encoding the S. cerevisiae yeast GAL1 promoter and the matHH leader polypeptide containing the doubled (HH) pro-region of the HSP150 protein of the yeast S cerevisiae. These plasmids are used for transformation of cells of recipient strains of S. cerevisiae yeast and production of corresponding samples of phospholipase A2.
Пример 8. Конструирование штаммов-продуцентов заявляемых белков-предшественников с использованием лабораторного реципиентного штамма beta-0 S. cerervisiaeExample 8. Construction of producer strains of the claimed precursor proteins using laboratory recipient strain beta-0 S. cerervisiae
Для конструирования штаммов-продуцентов клетки лабораторного реципиентного штамма S. cerervisiae beta-0 [Чеперегин с соавт. 2019] трансформируют с использованием полученных экспрессионных плазмид серии pPDX3. Трансформацию осуществляют с использованием литий ацетата как описано [Gietz & Schiestl 2007]. В результате трансформации получают штаммы-продуценты серии В. В частности,For the construction of cell-producing strains of the laboratory recipient strain S. cerervisiae beta-0 [Cheperegin et al. 2019] are transformed using the resulting expression plasmids of the pPDX3 series. The transformation is carried out using lithium acetate as described [Gietz & Schiestl 2007]. As a result of transformation, production strains of series B are obtained. In particular,
- в результате трансформации клеток лабораторного реципиентного штамма beta-0 S. cerervisiae плазмидой pPDX3-Pla22(Int4) получают штамм B-Pla22(Int4), который используют для биосинтеза белка-предшественника Pla22(Int4).- as a result of the transformation of the cells of the laboratory recipient strain beta-0 S. cerervisiae with the plasmid pPDX3-Pla22 (Int4), the strain B-Pla22 (Int4) is obtained, which is used for biosynthesis of the precursor protein Pla22 (Int4).
- в результате трансформации клеток лабораторного реципиентного штамма beta-0 S. cerervisiae плазмидой pPDX3-Pla22(Int4Y) получают штамм B-Pla22(Int4Y), который используют для биосинтеза белка-предшественника Pla22(Int4Y).- as a result of transformation of the cells of the laboratory recipient strain beta-0 S. cerervisiae with the plasmid pPDX3-Pla22 (Int4Y), the strain B-Pla22 (Int4Y) is obtained, which is used for the biosynthesis of the precursor protein Pla22 (Int4Y).
- в результате трансформации клеток лабораторного реципиентного штамма beta-0 S. cerervisiae плазмидой pPDX3-Pla22ng(Int5) получают штамм B-Pla22ng(Int5), который используют для биосинтеза белка-предшественника Pla22ng(Int5).- as a result of transformation of the cells of the laboratory recipient strain beta-0 S. cerervisiae with the plasmid pPDX3-Pla22ng (Int5), the strain B-Pla22ng (Int5) is obtained, which is used for biosynthesis of the precursor protein Pla22ng (Int5).
- в результате трансформации клеток лабораторного реципиентного штамма beta-0 S. cerervisiae плазмидой pPDX3-Pla22ng(Int4Y) получают штамм B-Pla22ng(Int4Y), который используют для биосинтеза белка-предшественника Pla22ng(Int4Y).- as a result of transformation of the cells of the laboratory recipient strain beta-0 S. cerervisiae with the plasmid pPDX3-Pla22ng (Int4Y), strain B-Pla22ng (Int4Y) is obtained, which is used for biosynthesis of the precursor protein Pla22ng (Int4Y).
Пример 9. Конструирование штаммов-продуцентов заявляемых белков-предшественников с использованием лабораторного реципиентного штамма S. cerervisiae D721WExample 9. Construction of producer strains of the claimed precursor proteins using a laboratory recipient strain S. cerervisiae D721W
Для конструирования штаммов-продуцентов клетки лабораторного реципиентного штамма S. cerervisiae D721W [RU 2460795] трансформируют с использованием полученных экспрессионных плазмид серии pPDX3. Трансформацию осуществляют по методу Ito [Ito et al. 1983]. В результате трансформации получают штаммы-продуценты серии D.To construct producer strains, cells of the laboratory recipient strain S. cerervisiae D721W [RU 2460795] are transformed using the obtained expression plasmids of the pPDX3 series. The transformation is carried out according to the method of Ito [Ito et al. 1983]. As a result of transformation, producer strains of the D series are obtained.
В частности,In particular,
- в результате трансформации клеток лабораторного реципиентного штамма D721W S. cerervisiae плазмидой pPDX3-Pla22(Int4) получают штамм D-Pla22(Int4), который используют для биосинтеза белка-предшественника Pla22(Int4).- as a result of transformation of the cells of the laboratory recipient strain D721W S. cerervisiae with the plasmid pPDX3-Pla22 (Int4), the strain D-Pla22 (Int4) is obtained, which is used for the biosynthesis of the precursor protein Pla22 (Int4).
- в результате трансформации клеток лабораторного реципиентного штамма D721W S. cerervisiae плазмидой pPDX3-Pla22(Int4Y) получают штамм D-Pla22(Int4Y), который используют для биосинтеза белка-предшественника Pla22(Int4Y).- as a result of transformation of the cells of the laboratory recipient strain D721W S. cerervisiae with the plasmid pPDX3-Pla22 (Int4Y), the strain D-Pla22 (Int4Y) is obtained, which is used for biosynthesis of the precursor protein Pla22 (Int4Y).
- в результате трансформации клеток лабораторного реципиентного штамма D721W S. cerervisiae плазмидой pPDX3-Pla22ng(Int5) получают штамм D-Pla22ng(Int5), который используют для биосинтеза белка-предшественника Pla22ng(Int5).- as a result of transformation of the cells of the laboratory recipient strain D721W S. cerervisiae with the plasmid pPDX3-Pla22ng (Int5), the strain D-Pla22ng (Int5) is obtained, which is used for the biosynthesis of the precursor protein Pla22ng (Int5).
- в результате трансформации клеток лабораторного реципиентного штамма D721W S. cerervisiae плазмидой pPDX3-Pla22ng(Int4Y) получают штамм D-Pla22ng(Int4Y), который используют для биосинтеза белка-предшественника Pla22ng(Int4Y).- as a result of the transformation of the cells of the laboratory recipient strain D721W S. cerervisiae with the plasmid pPDX3-Pla22ng (Int4Y), the strain D-Pla22ng (Int4Y) is obtained, which is used for the biosynthesis of the precursor protein Pla22ng (Int4Y).
Пример 10. Получение заявляемых белков-предшественников и продуктов их процессинга Для получения заявляемых белков-предшественников осуществляют культивирование сконструированных штаммов-продуцентов. С этой целью:Example 10. Obtaining the inventive precursor proteins and their processing products. To obtain the inventive precursor proteins, the designed producer strains are cultivated. To this end:
- штаммы-продуценты серии В культивируют на жидкой среде YPDG (дрожжевой экстракт - 1%; бактопептон - 2%; глюкоза - 2%; галактоза - 2%; вода - остальное) в течение 96 ч до стационарной фазы роста с использованием ротационного шейкера со скоростью 250 об/мин при температуре 22°С.- producer strains of series B are cultured in a liquid YPDG medium (yeast extract - 1%; bactopeptone - 2%; glucose - 2%; galactose - 2%; water - the rest) for 96 h until the stationary growth phase using a rotary shaker with speed of 250 rpm at a temperature of 22 ° C.
- штаммы-продуценты серии D культивируют на жидкой среде 223 (дрожжевой экстракт - 2%; бактопептон - 2%; глюкоза - 3%; вода - остальное) в течение 96 ч до стационарной фазы роста с использованием ротационного шейкера со скоростью 250 об/мин при температуре 22°С.- producer strains of the D series are cultivated in a liquid medium 223 (yeast extract - 2%; bactopeptone - 2%; glucose - 3%; water - the rest) for 96 hours before the stationary growth phase using a rotary shaker at a speed of 250 rpm at a temperature of 22 ° C.
По завершении культивирования штаммов-продуцентов обеих серий получают образцы культуральной жидкости, которые освобождают от клеток дрожжей путем центрифугирования в течение 10 мин с ускорением 16000 g и последующего переноса образцов над осадочной жидкости в подходящие чистые емкости.Upon completion of the cultivation of the producer strains of both series, samples of the culture fluid are obtained, which are freed from yeast cells by centrifugation for 10 minutes at an acceleration of 16000 g and subsequent transfer of the samples over the sedimentary liquid into suitable clean containers.
В результате получают свободные от клеток дрожжей обработанные образцы культуральной жидкости, каждый из которых содержит один из заявляемых белков-предшественников, Pla22(Int4) или Pla22(Int4Y) или Pla22ng(Int5) или Pla22ng(Int4Y), который не обязательно очищают и концентрируют, однако обязательно подвергают автокаталитическому процессингу.As a result, yeast cell-free treated culture fluid samples are obtained, each of which contains one of the claimed precursor proteins, Pla22 (Int4) or Pla22 (Int4Y) or Pla22ng (Int5) or Pla22ng (Int4Y), which is not necessarily purified and concentrated, however, they must undergo autocatalytic processing.
На фиг. 2 приведены результаты автокаталитического процессинга белков-предшественников Pla22ng(Int5) и Pla22ng(Int4Y), продуцированных штаммами D-Pla22ng(Int5) и D-Pla22ng(Int4Y), соответственно, который осуществляют при комнатной температуре в течение 69 часов.FIG. 2 shows the results of autocatalytic processing of the Pla22ng (Int5) and Pla22ng (Int4Y) precursor proteins produced by the D-Pla22ng (Int5) and D-Pla22ng (Int4Y) strains, respectively, which is carried out at room temperature for 69 hours.
В результате автокаталитического процессинга получают образцы целевого продукта.As a result of autocatalytic processing, samples of the target product are obtained.
Пример 11. Оценка «специальной» и «собственной» активности образцов целевого продуктаExample 11. Evaluation of "special" and "own" activity of samples of the target product
Определение «специальной» активности образцов целевого продукта проводят с использованием рН-титратора по методике «Инструментального определения активности в стандартных условиях с использованием рН-титратора» [Чеперегин с соавт. 2019]. Для калибровки используют образец коммерческого препарата «Pla2 Nagase». В результате измерения получают данные о величине «специальной» активности каждого образца целевого продукта, выраженной в единицах активности коммерческого препарата «Pla2 Nagase». Другими словами, получают данные об относительной активности каждого образца целевого продукта и контрольного препарата «Pla2 Nagase».The determination of the “special” activity of the samples of the target product is carried out using a pH titrator according to the method of “Instrumental determination of activity under standard conditions using a pH titrator” [Cheperegin et al. 2019]. For calibration, a sample of the commercial product Pla2 Nagase is used. As a result of the measurement, data is obtained on the value of the "special" activity of each sample of the target product, expressed in units of the activity of the commercial drug "Pla2 Nagase". In other words, data is obtained on the relative activity of each sample of the target product and the control preparation "Pla2 Nagase".
На основании полученных данных для каждого образца целевого продукта готовят контрольный образец «Pla2 Nagase», расчетное значение «специальной» активности которого равно активности соответствующего образца целевого продукта. В результате формируют экспериментальные пары, состоящие из образца целевого продукта и разведенного контрольного образца «Pla2 Nagase.On the basis of the data obtained for each sample of the target product, a control sample "Pla2 Nagase" is prepared, the calculated value of the "special" activity of which is equal to the activity of the corresponding sample of the target product. As a result, experimental pairs are formed, consisting of a sample of the target product and a diluted control sample "Pla2 Nagase.
В каждой экспериментальной паре проводят повторное измерение «специальной» активности. Результаты измерения активности образцов целевого продукта выражают в виде доли от активности соответствующего контрольного образца «Pla2 Nagase» и заносят в табл. 1.In each experimental pair, a repeated measurement of the "special" activity is carried out. The results of measuring the activity of the samples of the target product are expressed as a fraction of the activity of the corresponding control sample "Pla2 Nagase" and entered in table. 1.
Затем в каждой экспериментальной паре проводят измерение «собственной» активности разведенного контрольного образца «Pla2 Nagase» и образца целевого продукта. Измерение проводят по методике «Инструментального определения активности на яичном желтке» [Чеперегин с соавт. 2019]. Как и в случае измерения «специальной» активности, результаты измерения «собственной» активности образца целевого продукта выражают в виде доли от активности соответствующего контрольного образца «Pla2 Nagase» и заносят в табл. 1.Then, in each experimental pair, the "own" activity of the diluted control sample "Pla2 Nagase" and the sample of the target product are measured. The measurement is carried out according to the method of "Instrumental determination of activity on egg yolk" [Cheperegin et al. 2019]. As in the case of measuring the "special" activity, the results of measuring the "intrinsic" activity of the sample of the target product are expressed as a fraction of the activity of the corresponding control sample "Pla2 Nagase" and entered in the table. 1.
Результаты, приведенные в табл. 1 подтверждают, что заявляемый способ обеспечивает получение образцов целевого продукта, обладающих показателями «специальной» и «собственной» активности, сходными с показателями коммерческого препарата Pla2-Nagase. Наличие у образцов целевого продукта показателей «специальной» и «собственной» активности, сходных с показателями коммерческого препарата Pla2-Nagase, доказывает, что целевой продукт является полностью функциональной фосфолипазой А2.The results are shown in table. 1 confirm that the claimed method provides for obtaining samples of the target product with indicators of "special" and "intrinsic" activity, similar to those of the commercial drug Pla2-Nagase. The presence of “special” and “intrinsic” activity indicators in the samples of the target product, similar to those of the commercial drug Pla2-Nagase, proves that the target product is a fully functional phospholipase A2.
Преимущества заявляемого способа:The advantages of the proposed method:
- микробиологический синтез целевого продукта осуществляют с использованием дрожжей Saccharomyces cerevisiae, традиционно признаваемых безопасными для получения ферментов для пищевой промышленности, к которым относится фосфолипаза А2;- microbiological synthesis of the target product is carried out using the yeast Saccharomyces cerevisiae, traditionally recognized as safe for the production of enzymes for the food industry, which include phospholipase A2;
- способ позволяет получать нативную фосфолипазу А2, то есть содержащую сайты N-гликозилирования, или мутантную, то есть не содержащую сайтов N-гликозилирования;- the method allows to obtain native phospholipase A2, that is, containing N-glycosylation sites, or mutant, that is, not containing N-glycosylation sites;
- при осуществлении способа могут быть применены разные интеины, в том числе мутантные;- when implementing the method, different inteins can be used, including mutant ones;
- способ не требует больших трудозатрат, поскольку целевой продукт является секретируемым, а процесс образования целевого продукта из его предшественника - протекает самопроизвольно;- the method does not require large labor costs, since the target product is secreted, and the process of formation of the target product from its precursor proceeds spontaneously;
- способ не нуждается в использовании протеаз, поскольку процессинг белка-предшественника осуществляется на основе автокаталитического механизма;- the method does not require the use of proteases, since the processing of the precursor protein is carried out on the basis of an autocatalytic mechanism;
- способ обеспечивает получение целевого продукта, ключевые показатели которого, характеризующие не только «специальную», но и «собственную» активность, находятся на уровне показателей коммерческого препарата «Pla2-Nagase» и, таким образом, соответствуют показателям природной высокоактивной фосфолипазы А2.- the method ensures the receipt of the target product, the key indicators of which, characterizing not only "special", but also "own" activity, are at the level of indicators of the commercial drug "Pla2-Nagase" and, thus, correspond to the indicators of natural highly active phospholipase A2.
ЛитератураLiterature
Бакланов К.В. Совершенствование технологии высококалорийных майонезов - М: 2008, с. 23Baklanov K.V. Improving the technology of high-calorie mayonnaise - M: 2008, p. 23
Чеперегин С.Э., Санникова Е.П., Малышева А.В., Клебанов Ф.А., Козлов Д.Г. (2019) Высокоактивные модифицированные варианты рекомбинантной фосфолипазы А2 Streptomyces violaceoruber для эффективного биосинтеза в дрожжах. Биотехнология, 2019, Т. 35, №3, С. 30-41. doi: 10.21519/0234-2758-2019-35-3-30-41Cheperegin S.E., Sannikova E.P., Malysheva A.V., Klebanov F.A., Kozlov D.G. (2019) Highly active modified variants of the recombinant phospholipase A2 of Streptomyces violaceoruber for efficient biosynthesis in yeast. Biotechnology, 2019, T. 35, No. 3, S. 30-41. doi: 10.21519 / 0234-2758-2019-35-3-30-41
Cesarini S. Moving towards a Competitive Fully Enzymatic Biodiesel Process / S. Cesarini, F.I.J. Pastor, P.M. Nielsen, P. Diaz. // Sustainability. - 2015. - V.7 (6). - P. 7884-7903. doi: 10.3390/su7067884Cesarini S. Moving towards a Competitive Fully Enzymatic Biodiesel Process / S. Cesarini, F.I.J. Pastor, P.M. Nielsen, P. Diaz. // Sustainability. - 2015. - V.7 (6). - P. 7884-7903. doi: 10.3390 / su7067884
De Maria L., Vind J., , Svendsen A., Patkar S. (2007). Phospholipases and their industrial applications. Appl Microbiol Biotechnol, 74: 290-300. DOI 10.1007/s00253-006-0775-xDe Maria L., Vind J., , Svendsen A., Patkar S. (2007). Phospholipases and their industrial applications. Appl Microbiol Biotechnol 74: 290-300. DOI 10.1007 / s00253-006-0775-x
Gasser В., Prielhofer R., Marx H., et al. Pichia pastoris: protein production host and model organism for biomedical research. Future Microbiol., 2013, 8(2), 191-208. doi: 10.2217/fmb. 12.133.vGasser B., Prielhofer R., Marx H., et al. Pichia pastoris: protein production host and model organism for biomedical research. Future Microbiol. 2013, 8 (2), 191-208. doi: 10.2217 / fmb. 12.133.v
Gietz R.D., Schiestl R.H. Quick and easy yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc., 2007, 2 (1), 35-37. doi: 10.1038/nprot.2007.14Gietz R.D., Schiestl R.H. Quick and easy yeast transformation using the LiAc / SS carrier DNA / PEG method. Nat Protoc. 2007,2 (1) 35-37. doi: 10.1038 / nprot.2007.14
Hoogevest P., Wendel A. (2014). The use of natural and synthetic phospholipids as pharmaceutical excipients. Eur J Lipid Sci Technol., 116(9): 1088-1107. doi: 10.1002/ejlt.201400219.Hoogevest P., Wendel A. (2014). The use of natural and synthetic phospholipids as pharmaceutical excipients. Eur J Lipid Sci Technol. 116 (9): 1088-1107. doi: 10.1002 / ejlt.201400219.
Ito H., Fukuda Y., Murata K., Kimura A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol., 1983,153(1): 163-168.Ito H., Fukuda Y., Murata K., Kimura A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 1983,153 (1): 163-168.
Kaiser et. al. (1994) Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYKaiser et. al. (1994) Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY
Lefkowitz L.J., Deems R.A., Dennis E.A. (1999). Expression of Group IA Phospholipase A2 in Pichia pastoris: Identification of a Phosphatidylcholine Activator Site Using Site-Directed Mutagenesis. Biochemistry, 38, 14174-14184.Lefkowitz L.J., Deems R.A., Dennis E.A. (1999). Expression of Group IA Phospholipase A2 in Pichia pastoris: Identification of a Phosphatidylcholine Activator Site Using Site-Directed Mutagenesis. Biochemistry, 38, 14174-14184.
Liu A., Yu X.-W., Sha C, Xu Y. (2015). Streptomyces violaceoruber phospholipase A2: expression in Pichia pastoris, properties, and application in oil degumming. Appl Biochem Biotechnol, 17'5(6): 3195-3206. DOI 10.1007/s 12010-015-1492-7Liu A., Yu X.-W., Sha C, Xu Y. (2015). Streptomyces violaceoruber phospholipase A2: expression in Pichia pastoris, properties, and application in oil degumming. Appl Biochem Biotechnol, 17'5 (6): 3195-3206. DOI 10.1007 / s 12010-015-1492-7
A. and Dennis, E.A. (1982) Acyl and phosphoryl migration in lysophospholipids: importance in phospholipids synthesis and phospholipase activity, Biochemistry, 21: 1743-1750. A. and Dennis, EA (1982) Acyl and phosphoryl migration in lysophospholipids: importance in phospholipids synthesis and phospholipase activity, Biochemistry, 21: 1743-1750.
Raveendran S., Parameswaran В., Ummalyma S.B., Abraham A., Mathew A.K., Madhavan A., Rebello S., Pandey A. Applications of Microbial Enzymes in Food Industry. Food Technol Biotechnol, 2018, 56(1), 16-30. doi: 10.17113/ftb.56.01.18.5491.Raveendran S., Parameswaran B., Ummalyma S.B., Abraham A., Mathew A.K., Madhavan A., Rebello S., Pandey A. Applications of Microbial Enzymes in Food Industry. Food Technol Biotechnol, 2018, 56 (1), 16-30. doi: 10.17113 / ftb.56.01.18.5491.
Stubbs M.T., Bode W. Coagulation factors and their inhibitors. Curr Opin Struct Biol., 1994,4(6):823-832. doi:10.1016/0959-440x(94)90263-1Stubbs M.T., Bode W. Coagulation factors and their inhibitors. Curr Opin Struct Biol. 1994.4 (6): 823-832. doi: 10.1016 / 0959-440x (94) 90263-1
Singh R., Kumar M., Mittal A., Mehta P.K. Microbial enzymes: industrial progress in 21st century. 3 Biotech., 2016, 6(2), 174. doi: 10.1007/s13205-016-0485-8.Singh R., Kumar M., Mittal A., Mehta P.K. Microbial enzymes: industrial progress in 21st century. 3 Biotech., 2016, 6 (2), 174. doi: 10.1007 / s13205-016-0485-8.
Sugiyama M., Ohtan K., Izuhara M., Koike Т., Suzuki K., Imamura S., Misaki H. (2002). A Novel Prokaryotic Phospholipase A2. Characterization, gene cloning, and solution structure. The Journal of Biological Chemistry, 277(22): 20051-20058.Sugiyama M., Ohtan K., Izuhara M., Koike T., Suzuki K., Imamura S., Misaki H. (2002). A Novel Prokaryotic Phospholipase A2. Characterization, gene cloning, and solution structure. The Journal of Biological Chemistry, 277 (22): 20051-20058.
Valero F. (2012). Heterologous expression systems for lipases: A review. In Lipases and Phospholipases: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology; Sandoval, G., Ed.; Springer Science Business Media: New York, NY, USA, 2012; Volume 861, pp. 161-178.Valero F. (2012). Heterologous expression systems for lipases: A review. In Lipases and Phospholipases: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology; Sandoval, G., Ed .; Springer Science Business Media: New York, NY, USA, 2012; Volume 861, pp. 161-178.
Zahrl R.J., , Mattanovich D., Gasser B. Systems biotechnology for protein production in Pichia pastoris. FEMS Yeast Res., 2017, 17(7), fox068. doi: 10.1093/femsyr/fox068Zahrl RJ, , Mattanovich D., Gasser B. Systems biotechnology for protein production in Pichia pastoris. FEMS Yeast Res., 2017, 17 (7), fox068. doi: 10.1093 / femsyr / fox068
--->--->
Перечень последовательностейSequence listing
<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» Национального исследовательского центра «Курчатовский институт» (НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика)<110> Federal State Budgetary Institution "State Research Institute of Genetics and Selection of Industrial Microorganisms" of the National Research Center "Kurchatov Institute" (NRC "Kurchatov Institute" - GosNIIgenetics)
<120> Способ получения секретируемой полностью функциональной фосфолипазы А2 в дрожжах Saccharomyces cerevisiae, белок-предшественник для осуществления этого способа (варианты)<120> Method for producing secreted fully functional phospholipase A2 in yeast Saccharomyces cerevisiae , precursor protein for this method (variants)
<160> 4<160> 4
<210> 1<210> 1
<211> 852<211> 852
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial sequence for the synthesis of recombinant phospholipase A2 of Streptomyces violaceoruber strain А-2688 <213> Artificial sequence for the synthesis of recombinant phospholipase A2 of Streptomyces violaceoruber strain A-2688
<220><220>
<221> CDS<221> CDS
<222> (1)…(846)<222> (1) ... (846)
<223> Sequence encodes precursor of the recombinant phospholipase A2 <223> Sequence encodes precursor of the recombinant phospholipase A2
<221> misc_feature<221> misc_feature
<222> (1)…(6)<222> (1) ... (6)
<223> Sequence encodes additional dipeptide conjugated to the N-end of the recombinant phospholipase A2<223> Sequence encodes additional dipeptide conjugated to the N-end of the recombinant phospholipase A2
<221> misc_feature<221> misc_feature
<222> (1)…(241)<222> (1) ... (241)
<223> Sequence encodes N-terminal part of the recombinant phospholipase A2 <223> Sequence encodes N-terminal part of the recombinant phospholipase A2
<221> misc_feature<221> misc_feature
<222> (242)…(702)<222> (242) ... (702)
<223> Sequence encodes native intein PRP8 of Penicillium chrysogenum <223> Sequence encodes native intein PRP8 of Penicillium chrysogenum
<221> misc_feature<221> misc_feature
<222> (703)…(846)<222> (703) ... (846)
<223> Sequence encodes C-terminal part of the recombinant phospholipase A2 <223> Sequence encodes C-terminal part of the recombinant phospholipase A2
<221> misc_feature<221> misc_feature
<222> (847)…(852)<222> (847) ... (852)
<223> Sequence encodes recognition site for endonuclease XhoI<223> Sequence encodes recognition site for endonuclease XhoI
<400> 1<400> 1
TCC GGA GCT CCT GCC GAC AAG CCT CAG GTC CTG GCC AGT TTC ACC CAG 48TCC GGA GCT CCT GCC GAC AAG CCT CAG GTC CTG GCC AGT TTC ACC CAG 48
Ser Gly Ala Pro Ala Asp Lys Pro Gln Val Leu Ala Ser Phe Thr GlnSer Gly Ala Pro Ala Asp Lys Pro Gln Val Leu Ala Ser Phe Thr Gln
1 5 10 15 1 5 10 15
ACC AGT GCC AGT TCT CAG AAC GCC TGG CTG GCT GCC AAC CGT AAC CAG 96ACC AGT GCC AGT TCT CAG AAC GCC TGG CTG GCT GCC AAC CGT AAC CAG 96
Thr Ser Ala Ser Ser Gln Asn Ala Trp Leu Ala Ala Asn Arg Asn GlnThr Ser Ala Ser Ser Gln Asn Ala Trp Leu Ala Ala Asn Arg Asn Gln
20 25 30 20 25 30
AGT GCC TGG GCT GCC TAC GAG TTC GAC TGG AGT ACC GAC TTG TGT ACA 144AGT GCC TGG GCT GCC TAC GAG TTC GAC TGG AGT ACC GAC TTG TGT ACA 144
Ser Ala Trp Ala Ala Tyr Glu Phe Asp Trp Ser Thr Asp Leu Cys ThrSer Ala Trp Ala Ala Tyr Glu Phe Asp Trp Ser Thr Asp Leu Cys Thr
35 40 45 35 40 45
CAG GCC CCT GAC AAC CCT TTC GGT TTC CCT TTC AAC ACC GCC TGT GCC 192CAG GCC CCT GAC AAC CCT TTC GGT TTC CCT TTC AAC ACC GCC TGT GCC 192
Gln Ala Pro Asp Asn Pro Phe Gly Phe Pro Phe Asn Thr Ala Cys AlaGln Ala Pro Asp Asn Pro Phe Gly Phe Pro Phe Asn Thr Ala Cys Ala
50 55 60 50 55 60
CGT CAT GAC TTC GGT TAC CGT AAC TAC AAG GCT GCC GGT TGT CTC GCC 240CGT CAT GAC TTC GGT TAC CGT AAC TAC AAG GCT GCC GGT TGT CTC GCC 240
Arg His Asp Phe Gly Tyr Arg Asn Tyr Lys Ala Ala Gly Cys Leu AlaArg His Asp Phe Gly Tyr Arg Asn Tyr Lys Ala Ala Gly Cys Leu Ala
65 70 75 80 65 70 75 80
AAG GGG ACC CGT CTC TTG CGA TGC GAT GGA ACC GAG ATC AAT GTG GAA 288AAG GGG ACC CGT CTC TTG CGA TGC GAT GGA ACC GAG ATC AAT GTG GAA 288
Lys Gly Thr Arg Leu Leu Arg Cys Asp Gly Thr Glu Ile Asn Val GluLys Gly Thr Arg Leu Leu Arg Cys Asp Gly Thr Glu Ile Asn Val Glu
85 90 95 85 90 95
GAC GTG CGC GAA GGT GAC CTA CTT CTG GGT CCC GAT GGA GAG CCT CGC 336GAC GTG CGC GAA GGT GAC CTA CTT CTG GGT CCC GAT GGA GAG CCT CGC 336
Asp Val Arg Glu Gly Asp Leu Leu Leu Gly Pro Asp Gly Glu Pro ArgAsp Val Arg Glu Gly Asp Leu Leu Leu Gly Pro Asp Gly Glu Pro Arg
100 105 110 100 105 110
CGT GCA TTC AAC ATA GTG AAT GGC ATC GAC CGC CTG TAC CGC ATC AAG 384CGT GCA TTC AAC ATA GTG AAT GGC ATC GAC CGC CTG TAC CGC ATC AAG 384
Arg Ala Phe Asn Ile Val Asn Gly Ile Asp Arg Leu Tyr Arg Ile LysArg Ala Phe Asn Ile Val Asn Gly Ile Asp Arg Leu Tyr Arg Ile Lys
115 120 125 115 120 125
ATC GGC GGT GAG AAA GAG GAC CTT GTG GTG ACG CCG AAC CAT ATT CTG 432ATC GGC GGT GAG AAA GAG GAC CTT GTG GTG ACG CCG AAC CAT ATT CTG 432
Ile Gly Gly Glu Lys Glu Asp Leu Val Val Thr Pro Asn His Ile LeuIle Gly Gly Glu Lys Glu Asp Leu Val Val Thr Pro Asn His Ile Leu
130 135 140 130 135 140
GTG CTT TAT AGA GAG GAT GGT TCC AAG AAT GTG GAG AAG CAA ACG GTG 480GTG CTT TAT AGA GAG GAT GGT TCC AAG AAT GTG GAG AAG CAA ACG GTG 480
Val Leu Tyr Arg Glu Asp Gly Ser Lys Asn Val Glu Lys Gln Thr ValVal Leu Tyr Arg Glu Asp Gly Ser Lys Asn Val Glu Lys Gln Thr Val
145 150 155 160 145 150 155 160
GAG ATC ACT GCT GCC GAG TTT GCC GCG CTT TCT ACC GAG GAA AGA AGC 528GAG ATC ACT GCT GCC GAG TTT GCC GCG CTT TCT ACC GAG GAA AGA AGC 528
Glu Ile Thr Ala Ala Glu Phe Ala Ala Leu Ser Thr Glu Glu Arg SerGlu Ile Thr Ala Ala Glu Phe Ala Ala Leu Ser Thr Glu Glu Arg Ser
165 170 175 165 170 175
CTC TAT AGT GCC TTT ACA TCT CCT AGG GCT GAG AAG GGC GCC GAT GAT 576CTC TAT AGT GCC TTT ACA TCT CCT AGG GCT GAG AAG GGC GCC GAT GAT 576
Leu Tyr Ser Ala Phe Thr Ser Pro Arg Ala Glu Lys Gly Ala Asp AspLeu Tyr Ser Ala Phe Thr Ser Pro Arg Ala Glu Lys Gly Ala Asp Asp
180 185 190 180 185 190
TCG GCT CAA ACG CAC AGT TTC AAG ATT GAG CAA GTT AGC CTC GAA TCC 624TCG GCT CAA ACG CAC AGT TTC AAG ATT GAG CAA GTT AGC CTC GAA TCC 624
Ser Ala Gln Thr His Ser Phe Lys Ile Glu Gln Val Ser Leu Glu SerSer Ala Gln Thr His Ser Phe Lys Ile Glu Gln Val Ser Leu Glu Ser
195 200 205 195 200 205
GAG AAG ACA GAG TGG GCT GGT TTC CGA GTC GAC AAA GAT CAG CTT TAC 672GAG AAG ACA GAG TGG GCT GGT TTC CGA GTC GAC AAA GAT CAG CTT TAC 672
Glu Lys Thr Glu Trp Ala Gly Phe Arg Val Asp Lys Asp Gln Leu TyrGlu Lys Thr Glu Trp Ala Gly Phe Arg Val Asp Lys Asp Gln Leu Tyr
210 215 220 210 215 220
CTG CGT CAT GAC TAC CTT GTC CTG CAC AAC AGT TTC GAC GCC AAC AAG 720CTG CGT CAT GAC TAC CTT GTC CTG CAC AAC AGT TTC GAC GCC AAC AAG 720
Leu Arg His Asp Tyr Leu Val Leu His Asn Ser Phe Asp Ala Asn LysLeu Arg His Asp Tyr Leu Val Leu His Asn Ser Phe Asp Ala Asn Lys
225 230 235 240 225 230 235 240
AGT CGT ATC GAC AGT GCC TTC TAC GAG GAC ATG AAG CGT GTC TGT ACT 768AGT CGT ATC GAC AGT GCC TTC TAC GAG GAC ATG AAG CGT GTC TGT ACT 768
Ser Arg Ile Asp Ser Ala Phe Tyr Glu Asp Met Lys Arg Val Cys ThrSer Arg Ile Asp Ser Ala Phe Tyr Glu Asp Met Lys Arg Val Cys Thr
245 250 255 245 250 255
GGT TAC ACC GGT GAG AAG AAC ACC GCC TGT AAC AGT ACC GCC TGG ACC 816GGT TAC ACC GGT GAG AAG AAC ACC GCC TGT AAC AGT ACC GCC TGG ACC 816
Gly Tyr Thr Gly Glu Lys Asn Thr Ala Cys Asn Ser Thr Ala Trp ThrGly Tyr Thr Gly Glu Lys Asn Thr Ala Cys Asn Ser Thr Ala Trp Thr
260 265 270 260 265 270
TAC TAC CAG GCC GTC AAG ATC TTC GGT TAA CTCGAG 852TAC TAC CAG GCC GTC AAG ATC TTC GGT TAA CTCGAG 852
Tyr Tyr Gln Ala Val Lys Ile Phe Gly *** Tyr Tyr Gln Ala Val Lys Ile Phe Gly ***
275 280 275,280
<210> 2<210> 2
<211> 852<211> 852
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial sequence for the synthesis of recombinant phospholipase A2 of Streptomyces violaceoruber strain А-2688 <213> Artificial sequence for the synthesis of recombinant phospholipase A2 of Streptomyces violaceoruber strain A-2688
<220><220>
<221> CDS<221> CDS
<222> (1)…(846)<222> (1) ... (846)
<223> Sequence encodes precursor of the recombinant phospholipase A2 <223> Sequence encodes precursor of the recombinant phospholipase A2
<221> misc_feature<221> misc_feature
<222> (1)…(6)<222> (1) ... (6)
<223> Sequence encodes additional dipeptide conjugated to the N-end of the recombinant phospholipase A2<223> Sequence encodes additional dipeptide conjugated to the N-end of the recombinant phospholipase A2
<221> misc_feature<221> misc_feature
<222> (1)…(241)<222> (1) ... (241)
<223> Sequence encodes N-terminal part of the recombinant phospholipase A2 <223> Sequence encodes N-terminal part of the recombinant phospholipase A2
<221> misc_feature<221> misc_feature
<222> (242)…(702)<222> (242) ... (702)
<223> Sequence encodes mutant intein PRP8 of Penicillium chrysogenum, enclosing mutation Cys11Tyr<223> Sequence encodes mutant intein PRP8 of Penicillium chrysogenum , enclosing mutation Cys11Tyr
<221> misc_feature<221> misc_feature
<222> (703)…(846)<222> (703) ... (846)
<223> Sequence encodes C-terminal part of the recombinant phospholipase A2 <223> Sequence encodes C-terminal part of the recombinant phospholipase A2
<221> misc_feature<221> misc_feature
<222> (847)…(852)<222> (847) ... (852)
<223> Sequence encodes recognition site for endonuclease XhoI<223> Sequence encodes recognition site for endonuclease XhoI
<400> 2<400> 2
TCC GGA GCT CCT GCC GAC AAG CCT CAG GTC CTG GCC AGT TTC ACC CAG 48TCC GGA GCT CCT GCC GAC AAG CCT CAG GTC CTG GCC AGT TTC ACC CAG 48
Ser Gly Ala Pro Ala Asp Lys Pro Gln Val Leu Ala Ser Phe Thr GlnSer Gly Ala Pro Ala Asp Lys Pro Gln Val Leu Ala Ser Phe Thr Gln
1 5 10 15 1 5 10 15
ACC AGT GCC AGT TCT CAG AAC GCC TGG CTG GCT GCC AAC CGT AAC CAG 96ACC AGT GCC AGT TCT CAG AAC GCC TGG CTG GCT GCC AAC CGT AAC CAG 96
Thr Ser Ala Ser Ser Gln Asn Ala Trp Leu Ala Ala Asn Arg Asn GlnThr Ser Ala Ser Ser Gln Asn Ala Trp Leu Ala Ala Asn Arg Asn Gln
20 25 30 20 25 30
AGT GCC TGG GCT GCC TAC GAG TTC GAC TGG AGT ACC GAC TTG TGT ACA 144AGT GCC TGG GCT GCC TAC GAG TTC GAC TGG AGT ACC GAC TTG TGT ACA 144
Ser Ala Trp Ala Ala Tyr Glu Phe Asp Trp Ser Thr Asp Leu Cys ThrSer Ala Trp Ala Ala Tyr Glu Phe Asp Trp Ser Thr Asp Leu Cys Thr
35 40 45 35 40 45
CAG GCC CCT GAC AAC CCT TTC GGT TTC CCT TTC AAC ACC GCC TGT GCC 192CAG GCC CCT GAC AAC CCT TTC GGT TTC CCT TTC AAC ACC GCC TGT GCC 192
Gln Ala Pro Asp Asn Pro Phe Gly Phe Pro Phe Asn Thr Ala Cys AlaGln Ala Pro Asp Asn Pro Phe Gly Phe Pro Phe Asn Thr Ala Cys Ala
50 55 60 50 55 60
CGT CAT GAC TTC GGT TAC CGT AAC TAC AAG GCT GCC GGT TGT CTC GCC 240CGT CAT GAC TTC GGT TAC CGT AAC TAC AAG GCT GCC GGT TGT CTC GCC 240
Arg His Asp Phe Gly Tyr Arg Asn Tyr Lys Ala Ala Gly Cys Leu AlaArg His Asp Phe Gly Tyr Arg Asn Tyr Lys Ala Ala Gly Cys Leu Ala
65 70 75 80 65 70 75 80
AAG GGG ACC CGT CTC TTG CGA TAC GAT GGA ACC GAG ATC AAT GTG GAA 288AAG GGG ACC CGT CTC TTG CGA TAC GAT GGA ACC GAG ATC AAT GTG GAA 288
Lys Gly Thr Arg Leu Leu Arg Tyr Asp Gly Thr Glu Ile Asn Val GluLys Gly Thr Arg Leu Leu Arg Tyr Asp Gly Thr Glu Ile Asn Val Glu
85 90 95 85 90 95
GAC GTG CGC GAA GGT GAC CTA CTT CTG GGT CCC GAT GGA GAG CCT CGC 336GAC GTG CGC GAA GGT GAC CTA CTT CTG GGT CCC GAT GGA GAG CCT CGC 336
Asp Val Arg Glu Gly Asp Leu Leu Leu Gly Pro Asp Gly Glu Pro ArgAsp Val Arg Glu Gly Asp Leu Leu Leu Gly Pro Asp Gly Glu Pro Arg
100 105 110 100 105 110
CGT GCA TTC AAC ATA GTG AAT GGC ATC GAC CGC CTG TAC CGC ATC AAG 384CGT GCA TTC AAC ATA GTG AAT GGC ATC GAC CGC CTG TAC CGC ATC AAG 384
Arg Ala Phe Asn Ile Val Asn Gly Ile Asp Arg Leu Tyr Arg Ile LysArg Ala Phe Asn Ile Val Asn Gly Ile Asp Arg Leu Tyr Arg Ile Lys
115 120 125 115 120 125
ATC GGC GGT GAG AAA GAG GAC CTT GTG GTG ACG CCG AAC CAT ATT CTG 432ATC GGC GGT GAG AAA GAG GAC CTT GTG GTG ACG CCG AAC CAT ATT CTG 432
Ile Gly Gly Glu Lys Glu Asp Leu Val Val Thr Pro Asn His Ile LeuIle Gly Gly Glu Lys Glu Asp Leu Val Val Thr Pro Asn His Ile Leu
130 135 140 130 135 140
GTG CTT TAT AGA GAG GAT GGT TCC AAG AAT GTG GAG AAG CAA ACG GTG 480GTG CTT TAT AGA GAG GAT GGT TCC AAG AAT GTG GAG AAG CAA ACG GTG 480
Val Leu Tyr Arg Glu Asp Gly Ser Lys Asn Val Glu Lys Gln Thr ValVal Leu Tyr Arg Glu Asp Gly Ser Lys Asn Val Glu Lys Gln Thr Val
145 150 155 160 145 150 155 160
GAG ATC ACT GCT GCC GAG TTT GCC GCG CTT TCT ACC GAG GAA AGA AGC 528GAG ATC ACT GCT GCC GAG TTT GCC GCG CTT TCT ACC GAG GAA AGA AGC 528
Glu Ile Thr Ala Ala Glu Phe Ala Ala Leu Ser Thr Glu Glu Arg SerGlu Ile Thr Ala Ala Glu Phe Ala Ala Leu Ser Thr Glu Glu Arg Ser
165 170 175 165 170 175
CTC TAT AGT GCC TTT ACA TCT CCT AGG GCT GAG AAG GGC GCC GAT GAT 576CTC TAT AGT GCC TTT ACA TCT CCT AGG GCT GAG AAG GGC GCC GAT GAT 576
Leu Tyr Ser Ala Phe Thr Ser Pro Arg Ala Glu Lys Gly Ala Asp AspLeu Tyr Ser Ala Phe Thr Ser Pro Arg Ala Glu Lys Gly Ala Asp Asp
180 185 190 180 185 190
TCG GCT CAA ACG CAC AGT TTC AAG ATT GAG CAA GTT AGC CTC GAA TCC 624TCG GCT CAA ACG CAC AGT TTC AAG ATT GAG CAA GTT AGC CTC GAA TCC 624
Ser Ala Gln Thr His Ser Phe Lys Ile Glu Gln Val Ser Leu Glu SerSer Ala Gln Thr His Ser Phe Lys Ile Glu Gln Val Ser Leu Glu Ser
195 200 205 195 200 205
GAG AAG ACA GAG TGG GCT GGT TTC CGA GTC GAC AAA GAT CAG CTT TAC 672GAG AAG ACA GAG TGG GCT GGT TTC CGA GTC GAC AAA GAT CAG CTT TAC 672
Glu Lys Thr Glu Trp Ala Gly Phe Arg Val Asp Lys Asp Gln Leu TyrGlu Lys Thr Glu Trp Ala Gly Phe Arg Val Asp Lys Asp Gln Leu Tyr
210 215 220 210 215 220
CTG CGT CAT GAC TAC CTT GTC CTG CAC AAC AGT TTC GAC GCC AAC AAG 720CTG CGT CAT GAC TAC CTT GTC CTG CAC AAC AGT TTC GAC GCC AAC AAG 720
Leu Arg His Asp Tyr Leu Val Leu His Asn Ser Phe Asp Ala Asn LysLeu Arg His Asp Tyr Leu Val Leu His Asn Ser Phe Asp Ala Asn Lys
225 230 235 240 225 230 235 240
AGT CGT ATC GAC AGT GCC TTC TAC GAG GAC ATG AAG CGT GTC TGT ACT 768AGT CGT ATC GAC AGT GCC TTC TAC GAG GAC ATG AAG CGT GTC TGT ACT 768
Ser Arg Ile Asp Ser Ala Phe Tyr Glu Asp Met Lys Arg Val Cys ThrSer Arg Ile Asp Ser Ala Phe Tyr Glu Asp Met Lys Arg Val Cys Thr
245 250 255 245 250 255
GGT TAC ACC GGT GAG AAG AAC ACC GCC TGT AAC AGT ACC GCC TGG ACC 816GGT TAC ACC GGT GAG AAG AAC ACC GCC TGT AAC AGT ACC GCC TGG ACC 816
Gly Tyr Thr Gly Glu Lys Asn Thr Ala Cys Asn Ser Thr Ala Trp ThrGly Tyr Thr Gly Glu Lys Asn Thr Ala Cys Asn Ser Thr Ala Trp Thr
260 265 270 260 265 270
TAC TAC CAG GCC GTC AAG ATC TTC GGT TAA CTCGAG 852TAC TAC CAG GCC GTC AAG ATC TTC GGT TAA CTCGAG 852
Tyr Tyr Gln Ala Val Lys Ile Phe Gly *** Tyr Tyr Gln Ala Val Lys Ile Phe Gly ***
275 280 275,280
<210> 3<210> 3
<211> 852<211> 852
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial sequence for the synthesis of recombinant phospholipase A2 of Streptomyces violaceoruber strain А-2688, enclosing mutations Ser31Ala, Ser82Ala и Asn108Gln <213> Artificial sequence for the synthesis of recombinant phospholipase A2 of Streptomyces violaceoruber strain A-2688, enclosing mutations Ser31Ala, Ser82Ala and Asn108Gln
<220> <220>
<221> CDS<221> CDS
<222> (1)…(873)<222> (1) ... (873)
<223> Sequence encodes precursor of the recombinant phospholipase A2 <223> Sequence encodes precursor of the recombinant phospholipase A2
<221> misc_feature<221> misc_feature
<222> (1)…(6)<222> (1) ... (6)
<223> Sequence encodes additional dipeptide conjugated to the N-end of the recombinant phospholipase A2<223> Sequence encodes additional dipeptide conjugated to the N-end of the recombinant phospholipase A2
<221> misc_feature<221> misc_feature
<222> (1)…(241)<222> (1) ... (241)
<223> Sequence encodes N-terminal part of the recombinant phospholipase A2 <223> Sequence encodes N-terminal part of the recombinant phospholipase A2
<221> misc_feature<221> misc_feature
<222> (242)…(723)<222> (242) ... (723)
<223> Sequence encodes mutant intein PRP8 of the strain Neosartorya aurata NRRL 4378<223> Sequence encodes mutant intein PRP8 of the strain Neosartorya aurata NRRL 4378
<221> misc_feature<221> misc_feature
<222> (724)…(867)<222> (724) ... (867)
<223> Sequence encodes C-terminal part of the recombinant phospholipase A2 <223> Sequence encodes C-terminal part of the recombinant phospholipase A2
<221> misc_feature<221> misc_feature
<222> (847)…(852)<222> (847) ... (852)
<223> Sequence encodes recognition site for endonuclease XhoI<223> Sequence encodes recognition site for endonuclease XhoI
<400> 3<400> 3
TCC GGA GCT CCT GCC GAC AAG CCT CAG GTC CTG GCC AGT TTC ACC CAG 48TCC GGA GCT CCT GCC GAC AAG CCT CAG GTC CTG GCC AGT TTC ACC CAG 48
Ser Gly Ala Pro Ala Asp Lys Pro Gln Val Leu Ala Ser Phe Thr GlnSer Gly Ala Pro Ala Asp Lys Pro Gln Val Leu Ala Ser Phe Thr Gln
1 5 10 15 1 5 10 15
ACC AGT GCC AGT TCT CAG AAC GCC TGG CTG GCT GCC AAC CGT AAC CAG 96ACC AGT GCC AGT TCT CAG AAC GCC TGG CTG GCT GCC AAC CGT AAC CAG 96
Thr Ser Ala Ser Ser Gln Asn Ala Trp Leu Ala Ala Asn Arg Asn GlnThr Ser Ala Ser Ser Gln Asn Ala Trp Leu Ala Ala Asn Arg Asn Gln
20 25 30 20 25 30
GCT GCC TGG GCT GCC TAC GAG TTC GAC TGG AGT ACC GAC TTG TGT ACA 144GCT GCC TGG GCT GCC TAC GAG TTC GAC TGG AGT ACC GAC TTG TGT ACA 144
Ala Ala Trp Ala Ala Tyr Glu Phe Asp Trp Ser Thr Asp Leu Cys ThrAla Ala Trp Ala Ala Tyr Glu Phe Asp Trp Ser Thr Asp Leu Cys Thr
35 40 45 35 40 45
CAG GCC CCT GAC AAC CCT TTC GGT TTC CCT TTC AAC ACC GCC TGT GCC 192CAG GCC CCT GAC AAC CCT TTC GGT TTC CCT TTC AAC ACC GCC TGT GCC 192
Gln Ala Pro Asp Asn Pro Phe Gly Phe Pro Phe Asn Thr Ala Cys AlaGln Ala Pro Asp Asn Pro Phe Gly Phe Pro Phe Asn Thr Ala Cys Ala
50 55 60 50 55 60
CGT CAT GAC TTC GGT TAC CGT AAC TAC AAG GCT GCC GGT TGT CTC GCC 240CGT CAT GAC TTC GGT TAC CGT AAC TAC AAG GCT GCC GGT TGT CTC GCC 240
Arg His Asp Phe Gly Tyr Arg Asn Tyr Lys Ala Ala Gly Cys Leu AlaArg His Asp Phe Gly Tyr Arg Asn Tyr Lys Ala Ala Gly Cys Leu Ala
65 70 75 80 65 70 75 80
AAA GGT ACT AGA TTA TTG AGA TAT GAT GGT TCT GAA ATT GAA GTT CAA 288AAA GGT ACT AGA TTA TTG AGA TAT GAT GGT TCT GAA ATT GAA GTT CAA 288
Lys Gly Thr Arg Leu Leu Arg Tyr Asp Gly Ser Glu Ile Glu Val GlnLys Gly Thr Arg Leu Leu Arg Tyr Asp Gly Ser Glu Ile Glu Val Gln
85 90 95 85 90 95
GAT GTC AAA GAA GGT GAT TTG TTA TTG GGT CCA GAT GGA GGT CCA AGA 336GAT GTC AAA GAA GGT GAT TTG TTA TTG GGT CCA GAT GGA GGT CCA AGA 336
Asp Val Lys Glu Gly Asp Leu Leu Leu Gly Pro Asp Gly Gly Pro ArgAsp Val Lys Glu Gly Asp Leu Leu Leu Gly Pro Asp Gly Gly Pro Arg
100 105 110 100 105 110
AGA GCT TTT AAC ATA GTT TCA GGT GAA GAT AGG TTG TAT AGA GTT AAG 384AGA GCT TTT AAC ATA GTT TCA GGT GAA GAT AGG TTG TAT AGA GTT AAG 384
Arg Ala Phe Asn Ile Val Ser Gly Glu Asp Arg Leu Tyr Arg Val LysArg Ala Phe Asn Ile Val Ser Gly Glu Asp Arg Leu Tyr Arg Val Lys
115 120 125 115 120 125
ATT GAC GGT TCT GTT GAG GAT TTA GTT GTT ACT CCT AAT CAT ATC TTG 432ATT GAC GGT TCT GTT GAG GAT TTA GTT GTT ACT CCT AAT CAT ATC TTG 432
Ile Asp Gly Ser Val Glu Asp Leu Val Val Thr Pro Asn His Ile LeuIle Asp Gly Ser Val Glu Asp Leu Val Val Thr Pro Asn His Ile Leu
130 135 140 130 135 140
GTC TTT CAT AGA GAA CAG AAA GCT AGG GAT AAA GAA GAT GAT CAA TTG 480GTC TTT CAT AGA GAA CAG AAA GCT AGG GAT AAA GAA GAT GAT CAA TTG 480
Val Phe His Arg Glu Gln Lys Ala Arg Asp Lys Glu Asp Asp Gln LeuVal Phe His Arg Glu Gln Lys Ala Arg Asp Lys Glu Asp Asp Gln Leu
145 150 155 160 145 150 155 160
CCA GAA TCT TAT GAC ACA GTT GAA ATG ACA GCA GCT GAG TTT GCT GCT 528CCA GAA TCT TAT GAC ACA GTT GAA ATG ACA GCA GCT GAG TTT GCT GCT 528
Pro Glu Ser Tyr Asp Thr Val Glu Met Thr Ala Ala Glu Phe Ala AlaPro Glu Ser Tyr Asp Thr Val Glu Met Thr Ala Ala Glu Phe Ala Ala
165 170 175 165 170 175
TTA TCT GCT GAA GAT AGA TCA AGA TAT AGA GCA TTC AGG TCT CCA TCT 576TTA TCT GCT GAA GAT AGA TCA AGA TAT AGA GCA TTC AGG TCT CCA TCT 576
Leu Ser Ala Glu Asp Arg Ser Arg Tyr Arg Ala Phe Arg Ser Pro SerLeu Ser Ala Glu Asp Arg Ser Arg Tyr Arg Ala Phe Arg Ser Pro Ser
180 185 190 180 185 190
TTC GAT TTG TCT GAA AAA GCT GTA CCT ACT AAT CAC AGA TTT GCT ATT 624TTC GAT TTG TCT GAA AAA GCT GTA CCT ACT AAT CAC AGA TTT GCT ATT 624
Phe Asp Leu Ser Glu Lys Ala Val Pro Thr Asn His Arg Phe Ala IlePhe Asp Leu Ser Glu Lys Ala Val Pro Thr Asn His Arg Phe Ala Ile
195 200 205 195 200 205
AAG GAT ATT AGA TTA GAA TTG GAG ACT ACT GAA TGG GCA GGA TTT AGA 672AAG GAT ATT AGA TTA GAA TTG GAG ACT ACT GAA TGG GCA GGA TTT AGA 672
Lys Asp Ile Arg Leu Glu Leu Glu Thr Thr Glu Trp Ala Gly Phe ArgLys Asp Ile Arg Leu Glu Leu Glu Thr Thr Glu Trp Ala Gly Phe Arg
210 215 220 210 215 220
GTC GAT AAA GAT CAA TTG TAT TTG AGG CAT GAT TAC TTA GTT TTG CAT 720GTC GAT AAA GAT CAA TTG TAT TTG AGG CAT GAT TAC TTA GTT TTG CAT 720
Val Asp Lys Asp Gln Leu Tyr Leu Arg His Asp Tyr Leu Val Leu HisVal Asp Lys Asp Gln Leu Tyr Leu Arg His Asp Tyr Leu Val Leu His
225 230 235 240 225 230 235 240
AAT AGT TTC GAC GCC AAC AAG GCT CGT ATC GAC AGT GCC TTC TAC GAG 768AAT AGT TTC GAC GCC AAC AAG GCT CGT ATC GAC AGT GCC TTC TAC GAG 768
Asn Ser Phe Asp Ala Asn Lys Ala Arg Ile Asp Ser Ala Phe Tyr GluAsn Ser Phe Asp Ala Asn Lys Ala Arg Ile Asp Ser Ala Phe Tyr Glu
245 250 255 245 250 255
GAC ATG AAG CGT GTC TGT ACT GGT TAC ACC GGT GAG AAG AAC ACC GCC 816GAC ATG AAG CGT GTC TGT ACT GGT TAC ACC GGT GAG AAG AAC ACC GCC 816
Asp Met Lys Arg Val Cys Thr Gly Tyr Thr Gly Glu Lys Asn Thr AlaAsp Met Lys Arg Val Cys Thr Gly Tyr Thr Gly Glu Lys Asn Thr Ala
260 265 270 260 265 270
TGT CAG AGT ACC GCC TGG ACC TAC TAC CAG GCC GTC AAG ATC TTC GGT 864TGT CAG AGT ACC GCC TGG ACC TAC TAC CAG GCC GTC AAG ATC TTC GGT 864
Cys Gln Ser Thr Ala Trp Thr Tyr Tyr Gln Ala Val Lys Ile Phe GlyCys Gln Ser Thr Ala Trp Thr Tyr Tyr Gln Ala Val Lys Ile Phe Gly
275 280 285 275 280 285
TAA CTCGAG 873TAA CTCGAG 873
******
<210> 4<210> 4
<211> 852<211> 852
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial sequence for the synthesis of recombinant phospholipase A2 of Streptomyces violaceoruber strain А-2688, enclosing mutations Ser31Ala, Ser82Ala и Asn108Gln <213> Artificial sequence for the synthesis of recombinant phospholipase A2 of Streptomyces violaceoruber strain A-2688, enclosing mutations Ser31Ala, Ser82Ala and Asn108Gln
<220> <220>
<221> CDS<221> CDS
<222> (1)…(846)<222> (1) ... (846)
<223> Sequence encodes precursor of the recombinant phospholipase A2 <223> Sequence encodes precursor of the recombinant phospholipase A2
<221> misc_feature<221> misc_feature
<222> (1)…(6)<222> (1) ... (6)
<223> Sequence encodes additional dipeptide conjugated to the N-end of the recombinant phospholipase A2<223> Sequence encodes additional dipeptide conjugated to the N-end of the recombinant phospholipase A2
<221> misc_feature<221> misc_feature
<222> (1)…(241)<222> (1) ... (241)
<223> Sequence encodes N-terminal part of the recombinant phospholipase A2 <223> Sequence encodes N-terminal part of the recombinant phospholipase A2
<221> misc_feature<221> misc_feature
<222> (242)…(702)<222> (242) ... (702)
<223> Sequence encodes mutant intein PRP8 of Penicillium chrysogenum, enclosing mutation Cys11Tyr<223> Sequence encodes mutant intein PRP8 of Penicillium chrysogenum , enclosing mutation Cys11Tyr
<221> misc_feature<221> misc_feature
<222> (703)…(846)<222> (703) ... (846)
<223> Sequence encodes C-terminal part of the recombinant phospholipase A2 <223> Sequence encodes C-terminal part of the recombinant phospholipase A2
<221> misc_feature<221> misc_feature
<222> (847)…(852)<222> (847) ... (852)
<223> Sequence encodes recognition site for endonuclease XhoI<223> Sequence encodes recognition site for endonuclease XhoI
<400> 4<400> 4
TCC GGA GCT CCT GCC GAC AAG CCT CAG GTC CTG GCC AGT TTC ACC CAG 48TCC GGA GCT CCT GCC GAC AAG CCT CAG GTC CTG GCC AGT TTC ACC CAG 48
Ser Gly Ala Pro Ala Asp Lys Pro Gln Val Leu Ala Ser Phe Thr GlnSer Gly Ala Pro Ala Asp Lys Pro Gln Val Leu Ala Ser Phe Thr Gln
1 5 10 15 1 5 10 15
ACC AGT GCC AGT TCT CAG AAC GCC TGG CTG GCT GCC AAC CGT AAC CAG 96ACC AGT GCC AGT TCT CAG AAC GCC TGG CTG GCT GCC AAC CGT AAC CAG 96
Thr Ser Ala Ser Ser Gln Asn Ala Trp Leu Ala Ala Asn Arg Asn GlnThr Ser Ala Ser Ser Gln Asn Ala Trp Leu Ala Ala Asn Arg Asn Gln
20 25 30 20 25 30
GCT GCC TGG GCT GCC TAC GAG TTC GAC TGG AGT ACC GAC TTG TGT ACA 144GCT GCC TGG GCT GCC TAC GAG TTC GAC TGG AGT ACC GAC TTG TGT ACA 144
Ala Ala Trp Ala Ala Tyr Glu Phe Asp Trp Ser Thr Asp Leu Cys ThrAla Ala Trp Ala Ala Tyr Glu Phe Asp Trp Ser Thr Asp Leu Cys Thr
35 40 45 35 40 45
CAG GCC CCT GAC AAC CCT TTC GGT TTC CCT TTC AAC ACC GCC TGT GCC 192CAG GCC CCT GAC AAC CCT TTC GGT TTC CCT TTC AAC ACC GCC TGT GCC 192
Gln Ala Pro Asp Asn Pro Phe Gly Phe Pro Phe Asn Thr Ala Cys AlaGln Ala Pro Asp Asn Pro Phe Gly Phe Pro Phe Asn Thr Ala Cys Ala
50 55 60 50 55 60
CGT CAT GAC TTC GGT TAC CGT AAC TAC AAG GCT GCC GGT TGT CTC GCC 240CGT CAT GAC TTC GGT TAC CGT AAC TAC AAG GCT GCC GGT TGT CTC GCC 240
Arg His Asp Phe Gly Tyr Arg Asn Tyr Lys Ala Ala Gly Cys Leu AlaArg His Asp Phe Gly Tyr Arg Asn Tyr Lys Ala Ala Gly Cys Leu Ala
65 70 75 80 65 70 75 80
AAG GGG ACC CGT CTC TTG CGA TAC GAT GGA ACC GAG ATC AAT GTG GAA 288AAG GGG ACC CGT CTC TTG CGA TAC GAT GGA ACC GAG ATC AAT GTG GAA 288
Lys Gly Thr Arg Leu Leu Arg Tyr Asp Gly Thr Glu Ile Asn Val GluLys Gly Thr Arg Leu Leu Arg Tyr Asp Gly Thr Glu Ile Asn Val Glu
85 90 95 85 90 95
GAC GTG CGC GAA GGT GAC CTA CTT CTG GGT CCC GAT GGA GAG CCT CGC 336GAC GTG CGC GAA GGT GAC CTA CTT CTG GGT CCC GAT GGA GAG CCT CGC 336
Asp Val Arg Glu Gly Asp Leu Leu Leu Gly Pro Asp Gly Glu Pro ArgAsp Val Arg Glu Gly Asp Leu Leu Leu Gly Pro Asp Gly Glu Pro Arg
100 105 110 100 105 110
CGT GCA TTC AAC ATA GTG AAT GGC ATC GAC CGC CTG TAC CGC ATC AAG 384CGT GCA TTC AAC ATA GTG AAT GGC ATC GAC CGC CTG TAC CGC ATC AAG 384
Arg Ala Phe Asn Ile Val Asn Gly Ile Asp Arg Leu Tyr Arg Ile LysArg Ala Phe Asn Ile Val Asn Gly Ile Asp Arg Leu Tyr Arg Ile Lys
115 120 125 115 120 125
ATC GGC GGT GAG AAA GAG GAC CTT GTG GTG ACG CCG AAC CAT ATT CTG 432ATC GGC GGT GAG AAA GAG GAC CTT GTG GTG ACG CCG AAC CAT ATT CTG 432
Ile Gly Gly Glu Lys Glu Asp Leu Val Val Thr Pro Asn His Ile LeuIle Gly Gly Glu Lys Glu Asp Leu Val Val Thr Pro Asn His Ile Leu
130 135 140 130 135 140
GTG CTT TAT AGA GAG GAT GGT TCC AAG AAT GTG GAG AAG CAA ACG GTG 480GTG CTT TAT AGA GAG GAT GGT TCC AAG AAT GTG GAG AAG CAA ACG GTG 480
Val Leu Tyr Arg Glu Asp Gly Ser Lys Asn Val Glu Lys Gln Thr ValVal Leu Tyr Arg Glu Asp Gly Ser Lys Asn Val Glu Lys Gln Thr Val
145 150 155 160 145 150 155 160
GAG ATC ACT GCT GCC GAG TTT GCC GCG CTT TCT ACC GAG GAA AGA AGC 528GAG ATC ACT GCT GCC GAG TTT GCC GCG CTT TCT ACC GAG GAA AGA AGC 528
Glu Ile Thr Ala Ala Glu Phe Ala Ala Leu Ser Thr Glu Glu Arg SerGlu Ile Thr Ala Ala Glu Phe Ala Ala Leu Ser Thr Glu Glu Arg Ser
165 170 175 165 170 175
CTC TAT AGT GCC TTT ACA TCT CCT AGG GCT GAG AAG GGC GCC GAT GAT 576CTC TAT AGT GCC TTT ACA TCT CCT AGG GCT GAG AAG GGC GCC GAT GAT 576
Leu Tyr Ser Ala Phe Thr Ser Pro Arg Ala Glu Lys Gly Ala Asp AspLeu Tyr Ser Ala Phe Thr Ser Pro Arg Ala Glu Lys Gly Ala Asp Asp
180 185 190 180 185 190
TCG GCT CAA ACG CAC AGT TTC AAG ATT GAG CAA GTT AGC CTC GAA TCC 624TCG GCT CAA ACG CAC AGT TTC AAG ATT GAG CAA GTT AGC CTC GAA TCC 624
Ser Ala Gln Thr His Ser Phe Lys Ile Glu Gln Val Ser Leu Glu SerSer Ala Gln Thr His Ser Phe Lys Ile Glu Gln Val Ser Leu Glu Ser
195 200 205 195 200 205
GAG AAG ACA GAG TGG GCT GGT TTC CGA GTC GAC AAA GAT CAG CTT TAC 672GAG AAG ACA GAG TGG GCT GGT TTC CGA GTC GAC AAA GAT CAG CTT TAC 672
Glu Lys Thr Glu Trp Ala Gly Phe Arg Val Asp Lys Asp Gln Leu TyrGlu Lys Thr Glu Trp Ala Gly Phe Arg Val Asp Lys Asp Gln Leu Tyr
210 215 220 210 215 220
CTG CGT CAT GAC TAC CTT GTC CTG CAC AAC AGT TTC GAC GCC AAC AAG 720CTG CGT CAT GAC TAC CTT GTC CTG CAC AAC AGT TTC GAC GCC AAC AAG 720
Leu Arg His Asp Tyr Leu Val Leu His Asn Ser Phe Asp Ala Asn LysLeu Arg His Asp Tyr Leu Val Leu His Asn Ser Phe Asp Ala Asn Lys
225 230 235 240 225 230 235 240
GCT CGT ATC GAC AGT GCC TTC TAC GAG GAC ATG AAG CGT GTC TGT ACT 768GCT CGT ATC GAC AGT GCC TTC TAC GAG GAC ATG AAG CGT GTC TGT ACT 768
Ala Arg Ile Asp Ser Ala Phe Tyr Glu Asp Met Lys Arg Val Cys ThrAla Arg Ile Asp Ser Ala Phe Tyr Glu Asp Met Lys Arg Val Cys Thr
245 250 255 245 250 255
GGT TAC ACC GGT GAG AAG AAC ACC GCC TGT CAG AGT ACC GCC TGG ACC 816GGT TAC ACC GGT GAG AAG AAC ACC GCC TGT CAG AGT ACC GCC TGG ACC 816
Gly Tyr Thr Gly Glu Lys Asn Thr Ala Cys Gln Ser Thr Ala Trp ThrGly Tyr Thr Gly Glu Lys Asn Thr Ala Cys Gln Ser Thr Ala Trp Thr
260 265 270 260 265 270
TAC TAC CAG GCC GTC AAG ATC TTC GGT TAA CTCGAG 852TAC TAC CAG GCC GTC AAG ATC TTC GGT TAA CTCGAG 852
Tyr Tyr Gln Ala Val Lys Ile Phe Gly *** Tyr Tyr Gln Ala Val Lys Ile Phe Gly ***
275 280 275,280
<---<---
Claims (5)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2019139317A RU2728240C1 (en) | 2019-12-03 | 2019-12-03 | Method for producing secreted fully functional phospholipase a2 in saccharomyces cerevisiae yeast, a precursor protein for implementing said method (versions) |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2019139317A RU2728240C1 (en) | 2019-12-03 | 2019-12-03 | Method for producing secreted fully functional phospholipase a2 in saccharomyces cerevisiae yeast, a precursor protein for implementing said method (versions) |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2728240C1 true RU2728240C1 (en) | 2020-07-28 |
Family
ID=72085697
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2019139317A RU2728240C1 (en) | 2019-12-03 | 2019-12-03 | Method for producing secreted fully functional phospholipase a2 in saccharomyces cerevisiae yeast, a precursor protein for implementing said method (versions) |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2728240C1 (en) |
-
2019
- 2019-12-03 RU RU2019139317A patent/RU2728240C1/en active
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
GASSER B. et al., Pichia pastoris: protein production host and model organism for biomedical research, Future Microbiology, 2013, Vol.8, N2, pp.191-208 * |
LEFKOWITZ L. J. et al., Expression of Group IA Phospholipase A2inPichia pastoris: Identification of a Phosphatidylcholine Activator Site Using Site-Directed Mutagenesis, Biochemistry, 1999, Vol.43, N38, pp.14174-14184. * |
VIND J. et al., Phospholipases and their industrial applications, Applied Microbiology and Biotechnology, 2007, Vol.74, pp.290-300. * |
ВЕЛЬКОВ В.В., С-реактивный белок и липопротеин-ассоциированная фосфолипаза А2: новые факты и новые возможности для диагностики и стратификации сердечно-сосудистых рисков, Клинико-лабораторный консилиум, 2009, т.31, н.6, стр.28-33 * |
ЧЕПЕРЕГИН С.Э. и др, Высокоактивные модифицированные варианты рекомбинантной фосфолипазы А2 Streptomyces violaceoruber для эффективного биосинтеза в дрожжах, БИОТЕХНОЛОГИЯ, 2019, т.35, н.3, стр.30-41 * |
ЧЕПЕРЕГИН С.Э. и др, Высокоактивные модифицированные варианты рекомбинантной фосфолипазы А2 Streptomyces violaceoruber для эффективного биосинтеза в дрожжах, БИОТЕХНОЛОГИЯ, 2019, т.35, н.3, стр.30-41. ВЕЛЬКОВ В.В., С-реактивный белок и липопротеин-ассоциированная фосфолипаза А2: новые факты и новые возможности для диагностики и стратификации сердечно-сосудистых рисков, Клинико-лабораторный консилиум, 2009, т.31, н.6, стр.28-33. VIND J. et al., Phospholipases and their industrial applications, Applied Microbiology and Biotechnology, 2007, Vol.74, pp.290-300. GASSER B. et al., Pichia pastoris: protein production host and model organism for biomedical research, Future Microbiology, 2013, Vol.8, N2, pp.191-208. LEFKOWITZ L. J. et al., Expression of Group IA Phospholipase A2inPichia pastoris: Identification of a Phosphatidylcholine Activator Site Using Site-Directed Mutagenesis, Biochemistry, 1999, Vol.43, N38, pp.14174-14184. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP1275711B1 (en) | Lipase/acyltransferase from Candida parapsilosis | |
US10738288B2 (en) | Efficient phospholipase C mutant that does not rely on zinc ions | |
US7247463B2 (en) | Enzymes with lipase/acyltransferase activity, nucleic acids encoding the same and methods of use thereof | |
CN101993861A (en) | Recombinant expression of carboxyl esterase | |
CN108239648B (en) | Method for efficiently expressing rhizomucor miehei lipase | |
WO2007105264A1 (en) | Novel phospholipase c | |
JP5438259B2 (en) | Yeast presenting Candida antarctica-derived lipase B on the cell surface | |
RU2728240C1 (en) | Method for producing secreted fully functional phospholipase a2 in saccharomyces cerevisiae yeast, a precursor protein for implementing said method (versions) | |
RU2716087C1 (en) | Phospholipase a2 for expression in yeast (embodiments) | |
US7229817B2 (en) | Recombinant porcine liver esterases, their use and a method for the production thereof | |
Simatupang et al. | Lipolytic activity of Itb1. 1 and Lk3 thermostable lipases expressed in Escherichia coli and Pichia pastoris | |
EP1130100A1 (en) | Modified lipolytic enzymes and their use | |
KR102181315B1 (en) | Mutant lipases of Rhizomucor miehei having enhanced transesterification activity and a method of producing the lipase | |
JP2017060424A (en) | Lipases, polynucleotides, recombinant vectors, transformants, methods of producing lipase, methods of hydrolyzing glycerolipid and methods of producing glycerolipid hydrolysate | |
KR101837130B1 (en) | Novel lipase from yeast Candida butyri SH-14 and the Use thereof | |
Kim et al. | Constitutive overexpression of Pseudoalteromonas carrageenovora arylsulfatase in E. coli fed-batch culture | |
KR101596435B1 (en) | Lipase of Bacillus pumilus from the Antarctic | |
JP4679923B2 (en) | New phospholipase C | |
Wicka-Grochocka et al. | Cloning, expression in Komagataella phaffii, and biochemical characterization of recombinant sequence variants of Pseudomonas sp. S9 GDSL-esterase | |
JP5302189B2 (en) | Sphingomyelinase | |
JP6857927B1 (en) | Phosphatidylglycerol-specific novel enzyme | |
EP2784160B1 (en) | Novel gene derived from mud flat metagenome and novel protein obtained therefrom showing coactivity of phospholipase and lipase | |
WO2012105565A1 (en) | Enzyme and method of production therefor | |
JP5330334B2 (en) | Enzyme for food | |
KR0180570B1 (en) | Novel plasmid pkle and mass production method of lipase by using the same |