RU2727924C1 - Highly effective method for preparing dosage form of targeted action for therapy of malignant growths - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention relates to an anti-tumour agent which is a ready dosage form in the form of a lyophilizate for parenteral administration for targeted delivery of particles into the affected organs and tissues, as well as for prolonged action. Anti-tumour agent contains an alpha-hydroxybenzole propane acid derivative, a lactic and glycolic acid copolymer, an alpha-fetoprotein functional fragment and a cryoprotector.

EFFECT: invention provides higher effectiveness of the anti-tumour agent.

3 cl, 3 dwg, 2 tbl, 7 ex

Description

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯAPPLICATION AREA

Изобретение относится к области медицины, биологии, биотехнологии, молекулярной биологии, нанобиотехнологии и фармакологии, и представляет собой способ получения противоопухолевого средства для химиотерапии онкологических заболеваний, содержащее цитостатическое вещество - производное альфа-гидроксибензолпропановой кислоты, сополимер молочной и гликолевой кислот, рекомбинантный белок, являющийся функциональным фрагментом альфа-фетопротеина (АФП), моно- или дисахариды, причем компоненты в композиции находятся в определенном соотношении в масс. %. Изобретение обеспечивает адресную доставку цитостатического вещества в злокачественные новообразования, его пролонгированное высвобождение, увеличение противоопухолевого эффекта.The invention relates to the field of medicine, biology, biotechnology, molecular biology, nanobiotechnology and pharmacology, and is a method for producing an antineoplastic agent for chemotherapy of oncological diseases, containing a cytostatic substance - a derivative of alpha-hydroxybenzenepropanoic acid, a copolymer of lactic and glycolic acids, a recombinant protein that is functional fragment of alpha-fetoprotein (AFP), mono- or disaccharides, and the components in the composition are in a certain ratio in mass. %. The invention provides targeted delivery of the cytostatic substance to malignant neoplasms, its prolonged release, and an increase in the antitumor effect.

В качестве цитостатических веществ используются производные альфа-гидроксибензолпропановой кислоты, например, такие как паклитаксел, доцетаксел, кабазитаксел и пр. из таксанового ряда, сополимер молочной и гликолевой кислот выступает в качестве биодеградируемого полимера, моно- и дисахариды в качестве криопротектора, рекомбинантный белок, функциональный фрагмент альфа-фетопротеина (АФП) - в качестве векторной молекулы для адресной доставки. Противоопухолевое средство выполнено в виде лиофилизата, предназначенного для внутривенного введения, и обеспечивают адресное и пролонгированное действие.Derivatives of alpha-hydroxybenzenepropanoic acid are used as cytostatic substances, for example, such as paclitaxel, docetaxel, cabazitaxel, etc. from the taxane series, a copolymer of lactic and glycolic acids acts as a biodegradable polymer, mono- and disaccharides as a cryoprotectant, a recombinant protein, a functional fragment of alpha-fetoprotein (AFP) - as a vector molecule for targeted delivery. The antitumor agent is made in the form of a lyophilisate intended for intravenous administration and provides a targeted and prolonged action.

Изобретение способствует повышению противоопухолевого эффекта за счет адресной доставки, что повышает эффективность лечения и снижает общую неспецифическую токсичность противоопухолевого средства.The invention improves the antitumor effect due to targeted delivery, which increases the effectiveness of treatment and reduces the general nonspecific toxicity of the antitumor agent.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИLEVEL OF TECHNOLOGY

Из уровня техники известны системы направленной (адресной) доставки химиотерапевтических препаратов в виде полимерных или липосомальных форм, связанных (конъюгированных) с векторными молекулами, обладающими специфическим сродством к поверхности опухолевых клеток.The prior art known systems for the targeted (targeted) delivery of chemotherapeutic drugs in the form of polymeric or liposomal forms associated (conjugated) with vector molecules that have a specific affinity for the surface of tumor cells.

Известна работа Farokhzad О.С. с соавторами, в которой представлена система направленной доставки противоопухолевых препаратов на основе полимерных частиц PLGA-PEG-COOH к клеткам рака предстательной железы. В качестве векторной молекулы служил аптамер А10 PSMA, селективно связывающий внеклеточный участок простат-специфического антигена [1].The work of Farokhzad O.S. et al, which presents a system of targeted delivery of anticancer drugs based on PLGA-PEG-COOH polymer particles to prostate cancer cells. The A10 PSMA aptamer, which selectively binds the extracellular site of the prostate-specific antigen, served as a vector molecule [1].

Известны технические решения, защищенные патентами US 20130052134, WO 2013127949, CN 103745793, СА 2648099, в которых описаны способы конъюгации с использованием различных производных карбодиимида и где использованы сополимеры, такие как PEG-PLGA-PLL, DSPE-PEG-COOH, PLGA-b-PEG и т.п.Known technical solutions protected by patents US 20130052134, WO 2013127949, CN 103745793, CA 2648099, which describe methods of conjugation using various derivatives of carbodiimide and where copolymers are used, such as PEG-PLGA-PLL, DSPE-PEG-COOH, PLGA-b -PEG, etc.

Недостатком этих способов является относительно узкая область применения. Также основное отличие заключается в типе используемых полимеров и выборе векторных молекул.The disadvantage of these methods is their relatively narrow field of application. Also the main difference lies in the type of polymers used and the choice of vector molecules.

Известны также технические решения, защищенные патентами CN 101744789, РТ 1539976, WO 2010028217, US 7105158, US 6555110, в которых описаны способы конъюгации с применением карбодиимидов.Also known are technical solutions protected by patents CN 101744789, PT 1539976, WO 2010028217, US 7105158, US 6555110, which describe methods of conjugation using carbodiimides.

Недостатком этих изобретений является относительно большое время протекания основной реакции.The disadvantage of these inventions is the relatively long time of the main reaction.

Известен также способ, защищенный патентом US 7163698 В2, представляющий собой синтез полимера PLGA с использованием пептидных векторных молекул и активирующего агента EDC, при котором используют органические фазы во время реакции конъюгации для получения модифицированного полимера, после чего получают полимерные частицы.There is also known a method protected by US patent 7163698 B2, which is the synthesis of a PLGA polymer using peptide vector molecules and an activating agent EDC, in which organic phases are used during the conjugation reaction to obtain a modified polymer, after which polymer particles are obtained.

Известны также способы получения противоопухолевых препаратов с антителами, выступающих в качестве векторных систем [патенты WO 2016036794, WO 2014119624], в которых в качестве векторной молекулы используются антитела.There are also known methods for producing anticancer drugs with antibodies acting as vector systems [patents WO 2016036794, WO 2014119624], in which antibodies are used as a vector molecule.

Недостатком указанных изобретений является тот факт, что применяемые векторные молекулы не обеспечивают эффективную адресность в отношении опухолевых клеток-мишеней, а также характеризуются относительно низкой концентрацией действующего вещества в конечном препарате. Помимо этого, способы отличаются относительно высокой сложностью, вызванной необходимостью введения дополнительного линкера для получения векторной системы.The disadvantage of these inventions is the fact that the vector molecules used do not provide effective targeting against tumor target cells, and are also characterized by a relatively low concentration of the active substance in the final preparation. In addition, the methods are relatively complex due to the need to introduce an additional linker to obtain a vector system.

Известны также работы, в которых представлены результаты с использованием в качестве векторной молекулы бомбезина (BBN) (Hitesh et al., 2014), система направленной доставки на основе полимерных частиц с использованием моноклональных антител (Li et al., 2011) [2, 3].There are also known works that present the results using bombesin (BBN) as a vector molecule (Hitesh et al., 2014), a targeted delivery system based on polymer particles using monoclonal antibodies (Li et al., 2011) [2, 3 ].

В ряде других работ в качестве векторной молекулы для доставки противоопухолевых препаратов используют белок альфа-фетопротеин (АФП) человека, т.к. он имеет рецепторы на поверхности опухолевых клеток [4]. В патентах РФ представлены данные по разработке ряда препаратов на основе АФП и способах их получения из природных источников [RU 2121350 С1, 10.11.1998; RU 2123009 С1, 10.12.1998; RU 2154468 С1, 09.11.1999; RU 2105567 С1,27.02.1998].In a number of other works, human alpha-fetoprotein (AFP) protein is used as a vector molecule for the delivery of anticancer drugs. it has receptors on the surface of tumor cells [4]. The RF patents provide data on the development of a number of drugs based on AFP and methods of obtaining them from natural sources [RU 2121350 C1, 10.11.1998; RU 2123009 C1, 10.12.1998; RU 2154468 C1, 09.11.1999; RU 2105567 C1, 27.02.1998].

В патенте US 20090068115 описан способ активации карбоксильных групп полимерных частиц с использованием EDC, для чего проводят реакцию в 0.1 М буфере TEMED, рН 4.8, а также дальнейшую очистку с помощью диализа.US 20090068115 describes a method for activating the carboxyl groups of polymer particles using EDC, for which the reaction is carried out in 0.1 M TEMED buffer, pH 4.8, as well as further purification using dialysis.

Недостатком способа является относительно большие временные затраты.The disadvantage of this method is the relatively large time spent.

В патенте US 2010015051 описан способ конъюгации в водных средах в боратном буфере при слабокислых значениях рН, причем избыток белка трансферрина удаляют ультрацентрифугированием.US 2010015051 describes a method for conjugation in aqueous media in borate buffer at weakly acidic pH values, wherein the excess transferrin protein is removed by ultracentrifugation.

Недостатком способа является относительно большая сложность и относительно большие временные затраты.The disadvantage of this method is the relatively high complexity and relatively large time costs.

В патенте РФ [RU 2317102б C1, А61К 38/08, 20.02.2008] описано использование в качестве векторной молекулы пептида QMTOVNOG - аналога фрагмента альфа-фетопротеина. В частности, предложено применение пептида формулы QMTOVNOG, являющегося аналогом фрагмента α-фетопротеина с 472-й по 479-ю аминокислоту, способного избирательно захватываться опухолевыми клетками, в качестве векторной молекулы для направленной доставки противоопухолевых препаратов в опухолевые клетки. Кроме того, предложен конъюгат пептида формулы QMTOVNOG с доксорубицином, в котором доксорубицин ковалентно присоединен к указанному пептиду через тиоэфирную связь, в котором ковалентная тиоэфирная связь между ними создана путем взаимодействия SH-группы производного пептида, полученного реакцией пептида с N-гидроксисукцинимидным эфиром S-ацетилтиогликолевой кислоты, и двойной связи малеимидной группы гидразона доксорубицина, полученного реакцией доксорубицина с 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбонилгидразидом. Предложена также фармацевтическая композиция для лечения онкологических заболеваний, содержащая конъюгат доксорубицина с векторной молекулой в эффективном количестве и подходящий для внутривенного введения фармацевтический носитель, отличающаяся тем, что в качестве конъюгата доксорубицина она содержит предложенный конъюгат. Недостатком этого конъюгата является относительно низкая селективность действия в отношении опухолевых клеток-мишеней.The RF patent [RU 2317102b C1, A61K 38/08, 20.02.2008] describes the use of the QMTOVNOG peptide, an analogue of an alpha-fetoprotein fragment, as a vector molecule. In particular, the use of a peptide of formula QMTOVNOG, which is an analogue of a fragment of α-fetoprotein from 472 to 479 amino acids, capable of being selectively captured by tumor cells, as a vector molecule for targeted delivery of anticancer drugs to tumor cells is proposed. In addition, a conjugate of a peptide of formula QMTOVNOG with doxorubicin is proposed, in which doxorubicin is covalently attached to said peptide through a thioether bond, in which a covalent thioester bond between them is created by interaction of the SH-group of the peptide derivative obtained by the reaction of the peptide with N-hydroxysuccinimide ester thiogramide acid, and the double bond of the maleimide group of doxorubicin hydrazone, obtained by the reaction of doxorubicin with 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carbonylhydrazide. Also proposed is a pharmaceutical composition for the treatment of oncological diseases, containing a conjugate of doxorubicin with a vector molecule in an effective amount and a pharmaceutical carrier suitable for intravenous administration, characterized in that it contains the proposed conjugate as the doxorubicin conjugate. The disadvantage of this conjugate is the relatively low selectivity of action against tumor target cells.

Одним из близких к предложенной системе направленной доставки является противоопухолевой пептидный препарат, созданный на основе рекомбинантного фрагмента альфа-фетопротеина (АФП) человека. Препарат способен связываться с рецептором альфа-фетопротеина и ингибировать эстрадиол-индуцированный рост клеток гормонзависимых опухолей, а также выполнять функцию векторной молекулы для направленной доставки химитерапевтического препарата в опухолевые клетки [RU 2385537, C1, А61К 38/12, 20.10.2006].One of those close to the proposed targeted delivery system is an antitumor peptide preparation based on a recombinant fragment of human alpha-fetoprotein (AFP). The drug is able to bind to the alpha-fetoprotein receptor and inhibit estradiol-induced growth of hormone-dependent tumor cells, as well as perform the function of a vector molecule for targeted delivery of a chemotherapy drug to tumor cells [RU 2385537, C1, A61K 38/12, 20.10.2006].

Недостатком данного препарата является относительно низкая эффективность применения.The disadvantage of this drug is the relatively low effectiveness of the application.

В патенте [Ru 2630947 C1, А61К 38/16, А61К 31/00, А61Р 35/00, 05.08.2016] описан способ получения конъюгата с противоопухолевой активностью на основе рекомбинантного альфа-фетопротеина или его функционального фрагмента и противоопухолевого средства из антрациклинового ряда, характеризующийся тем, что получен в виде частиц из сополимеров молочной и гликолевой кислот с включенным в них противоопухолевым средством антрациклинового ряда путем взаимодействия -СООН групп частиц, активированных 1-этил-3-(3-диметиламинопропила)карбодиимидом и N-гидроксисукцинимидом при их не менее 5-кратном избытке по отношению к карбоксильным группам, с аминогруппами рекомбинантного белка альфа-фетопротеина, имеющего последовательности, выбранные из группы: SEQ1, SEQ2, SEQ3, SEQ4, не меньше, чем в эквимолярных количествах в отношении активированных карбоксильных групп, при рН от 7.4 до 9, с последующей очисткой на колонке с носителем Superose 12 с полным разделением продуктов реакции и выделением целевого конъюгата в чистом виде.The patent [Ru 2630947 C1, A61K 38/16, A61K 31/00, A61P 35/00, 05.08.2016] describes a method for producing a conjugate with antitumor activity based on a recombinant alpha-fetoprotein or its functional fragment and an antitumor agent from the anthracycline series, characterized by the fact that it is obtained in the form of particles from copolymers of lactic and glycolic acids with an antitumor agent of the anthracycline series included in them by the interaction of -COOH groups of particles activated by 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide and N-hydroxysuccinimide, with no less than 5-fold excess in relation to carboxyl groups, with amino groups of a recombinant protein of alpha-fetoprotein having sequences selected from the group: SEQ1, SEQ2, SEQ3, SEQ4, not less than in equimolar amounts in relation to activated carboxyl groups, at pH from 7.4 to 9, followed by purification on a column with a Superose 12 support with complete separation of reaction products and isolation of the target end pure conjugate.

Недостатком данного технического решения относительно предложенного противоопухолевого препарата является относительно низкая эффективность, обусловленная ограничением в применении препарата, а также сложный процесс очистки для получения конечного продукта.The disadvantage of this technical solution with respect to the proposed antitumor drug is relatively low efficiency due to the limitation in the use of the drug, as well as a complex purification process to obtain the final product.

Способ получения конъюгата полимеркапсулированного противоопухолевого агента из группы антрациклинов с активным фрагментом АФП, описанный в техническом решении [Ru 2630947 C1, А61К 38/16, А61К 31/00, А61Р 35/00, 05.08.2016], в частности способ получение конъюгата конъюгата с противоопухолевой активностью, характеризующийся тем, что -СООН группы полимерных частиц из сополимеров молочной и гликолевой кислот с включенным в них противоопухолевым средством антрациклинового ряда активируют 1-этил-3-(3-диметиламинопропила)карбодиимидом и N-гидроксисукцинимидом при их не менее 5-кратном избытке по отношению к карбоксильным группам, добавляют не больше 2 мкл 2-меркаптоэтанола и инкубируют 10 мин, затем добавляют рекомбинантный белок альфа-фетопротеина, имеющий последовательности, выбранные из группы: SEQ1, SEQ2, SEQ3, SEQ4, не меньше, чем в эквимолярных количествах в отношении активированных карбоксильных групп, доводят рН реакционной смеси до щелочных значений от 7,4 до 9, оставляют для перемешивания 30 мин, далее останавливают реакцию введением не более 2 мкл этаноламина, после чего реакционную смесь очищают на колонке с носителем Superose 12 с полным разделением продуктов реакции и выделяют целевой конъюгат в чистом виде, является близким по технологии к предложенному методу.The method of obtaining a conjugate of a polymer-encapsulated antitumor agent from the group of anthracyclines with an active fragment of AFP, described in the technical solution [Ru 2630947 C1, A61K 38/16, A61K 31/00, A61P 35/00, 05.08.2016], in particular the method of obtaining a conjugate of a conjugate with antitumor activity, characterized by the fact that -COOH groups of polymer particles from copolymers of lactic and glycolic acids with an antitumor agent of the anthracycline series included in them are activated by 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide and N-hydroxysuccinimide when they are at least 5-fold excess in relation to carboxyl groups, add no more than 2 μl of 2-mercaptoethanol and incubate for 10 minutes, then add a recombinant alpha-fetoprotein protein having sequences selected from the group: SEQ1, SEQ2, SEQ3, SEQ4, not less than in equimolar amounts with respect to activated carboxyl groups, bring the pH of the reaction mixture to alkaline values from 7.4 to 9, leave to stir stirring for 30 min, then the reaction is stopped by introducing no more than 2 μl of ethanolamine, after which the reaction mixture is purified on a column with a Superose 12 carrier with complete separation of reaction products and the target conjugate is isolated in pure form, which is close in technology to the proposed method.

Недостатком описанного способа получения является относительно узкая область применения, обусловленная тем, что он не может быть использован для получения противоопухолевого препарата, обладающего более высокой эффективностью и адресным действием.The disadvantage of the described method of obtaining is a relatively narrow area of application, due to the fact that it cannot be used to obtain an antitumor drug with a higher efficiency and targeted action.

Кроме того, описанный способ отличается внесением рекомбинантного белка альфа-фетопротеина, имеющего последовательности, выбранные из группы: SEQ1, SEQ2, SEQ3, SEQ4, не меньше, чем в эквимолярных количествах в отношении активированных карбоксильных групп полученных полимерных частиц, что приводит к необходимости отделения от избытка используемого векторного белка и более сложной технологии получения конечного продукта. Данный способ очистки на носителе Superose 12 не является препаративным и имеет ряд недостатков в силу сложности процесса.In addition, the described method is characterized by the introduction of a recombinant protein of alpha-fetoprotein having sequences selected from the group: SEQ1, SEQ2, SEQ3, SEQ4, not less than in equimolar amounts with respect to the activated carboxyl groups of the obtained polymer particles, which leads to the need for separation from excess of the used vector protein and more complex technology for obtaining the final product. This method of cleaning on a Superose 12 carrier is not preparative and has several disadvantages due to the complexity of the process.

Наиболее близким аналогом к предложенному препарату является патент [RU 2451509 C1, А61К 31/337, 27.05.2012], представляющий собой стабильные наночастицы и включающий цитостатик, биодеградирующий полимер, поверхностно-активное вещество, криопротектор и векторную молекулу для адресной доставки частиц в пораженные органы и ткани, при этом в качестве цитотостатического вещества содержит паклитаксел - 0,4÷1,0 мас. %, в качестве биодеградируемого полимера - сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA 50:50) - 14,0÷15,0 мас. %, в качестве поверхностно-активного вещества - сукцинилированный поливиниловый спирт - 3,5÷4,0 мас. %, в качестве векторной молекулы для адресной доставки частиц в пораженные органы и ткани - С-концевой домен альфа-фетопротеина (рЗдАФП) - 0,1÷0,3 мас. %, а в качестве криопротектора - D-маннит - 75,0÷80,0 мас. %.The closest analogue to the proposed drug is the patent [RU 2451509 C1, A61K 31/337, 05/27/2012], which is a stable nanoparticle and includes a cytostatic, biodegradable polymer, surfactant, cryoprotectant and vector molecule for targeted delivery of particles to affected organs and tissue, while as a cytotostatic substance contains paclitaxel - 0.4 ÷ 1.0 wt. %, as a biodegradable polymer - a copolymer of lactic and glycolic acids (PLGA 50:50) - 14.0 ÷ 15.0 wt. %, as a surfactant - succinylated polyvinyl alcohol - 3.5 ÷ 4.0 wt. %, as a vector molecule for targeted delivery of particles to the affected organs and tissues - the C-terminal domain of alpha-fetoprotein (r3dAFP) - 0.1 ÷ 0.3 wt. %, and as a cryoprotectant - D-mannitol - 75.0 ÷ 80.0 wt. %.

Недостатком наиболее близкого технического решения относительно предложенного противоопухолевого препарата является относительно низкая селективность действия в отношении опухолевых клеток, что снижает эффективность лечения и повышает общую токсичность при его применении. Низкая эффективность также обусловлена применением сукцинилированного поливинилового спирта, предположительно способствующего процессу конъюгации, низкое содержание цитостатического вещества в конечном продукте, а также использование альбумина, однако такое решение не способствовало в значительной степени увеличению адресного действия полученного препарата по различным показателям.The disadvantage of the closest technical solution to the proposed antitumor drug is the relatively low selectivity of action in relation to tumor cells, which reduces the effectiveness of treatment and increases the overall toxicity in its application. Low efficiency is also due to the use of succinylated polyvinyl alcohol, presumably contributing to the conjugation process, the low content of the cytostatic substance in the final product, as well as the use of albumin, but this decision did not significantly increase the targeted action of the resulting drug in various respects.

Наиболее близким к предложенному способу является способ получения препарата полимеркапсулированного противоопухолевого агента из группы таксанов с активным фрагментом АФП, описанный в том же техническом решении [RU 2451509 С1, А61К 31/337, 27.05.2012], в частности способ получения препарата на основе сополимера молочной и гликолевой кислот с доксорубицином, согласно которому 150.0 мг сополимера молочной и гликолевой кислот (PLGA-COOH 50/50), содержащего свободную концевую карбоксильную группу, растворяют в 1,5 мл хлороформа, к раствору добавляют 18.0 мг дициклогексилкарбодиимида и 10.0 мг N-гидроксисукцинимида (10-кратные молярные избытки по отношению к полимеру), реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре и отделяют от выпавшего осадка дициклогексилмочевины с помощью фильтрации, к смеси прибавляют 5.0 мкл триэтиламина и 7,5 мг доксорубицина гидрохлорида, реакционную смесь перемешивают в течение 15 ч, очистку реакционной смеси от избытка доксорубицина производят с помощью трехкратной экстракции 0.1 М водным раствором соляной кислоты, продукт реакции очищают преципитацией в ледяном метаноле, осадок собирают центрифугированием при 18 тыс. g в течение 30 мин, предварительно выпарив из раствора хлороформ под вакуумом.Closest to the proposed method is a method for preparing a polymer-encapsulated antitumor agent from the group of taxanes with an active AFP fragment, described in the same technical solution [RU 2451509 C1, A61K 31/337, 05/27/2012], in particular a method for preparing a preparation based on a dairy copolymer and glycolic acids with doxorubicin, according to which 150.0 mg of a copolymer of lactic and glycolic acids (PLGA-COOH 50/50) containing a free end carboxyl group is dissolved in 1.5 ml of chloroform, 18.0 mg of dicyclohexylcarbodiimide and 10.0 mg of N-hydroxysuccinimide are added to the solution (10-fold molar excess with respect to the polymer), the reaction mixture is stirred for 2 h at room temperature and separated from the precipitated dicyclohexylurea by filtration, 5.0 μl of triethylamine and 7.5 mg of doxorubicin hydrochloride are added to the mixture, the reaction mixture is stirred in for 15 h, purification of the reaction mixture from excess doxorubicin by is carried out using three-fold extraction with a 0.1 M aqueous solution of hydrochloric acid, the reaction product is purified by precipitation in ice-cold methanol, the precipitate is collected by centrifugation at 18 thousand g for 30 min, preliminarily evaporating chloroform from the solution under vacuum.

Недостатком наиболее близкого к предложенному способу является относительно узкая область применения, обусловленная тем, что он не может быть использован для получения противоопухолевого препарата, обладающего более высокой эффективностью, определяемой повышенной тропностью в отношении опухолевых клеток и более низкой токсичностью при его применении.The disadvantage of the closest to the proposed method is a relatively narrow area of application, due to the fact that it cannot be used to obtain an antitumor drug with a higher efficiency, determined by increased tropism towards tumor cells and lower toxicity during its use.

Кроме того, известный способ отличается и относительно большим временем проведения реакции. Дополнительно можно отметить, что поскольку операция очистки в известном способе заключается в центрифугировании и ультрафильтрации, то полученный препарат возможно отделить лишь от низкомолекулярных примесей и невозможно отделить несвязавшиеся молекулы белка, что может привести к снижению эффективности препарата за счет блокировки рецепторов на поверхности опухолевых клеток, что, в свою очередь, приводит к снижению уровня связывания целевого препарата.In addition, the known method is characterized by a relatively long reaction time. Additionally, it can be noted that since the purification operation in the known method consists in centrifugation and ultrafiltration, the resulting preparation can be separated only from low molecular weight impurities and it is impossible to separate unbound protein molecules, which can lead to a decrease in the effectiveness of the preparation due to blocking of receptors on the surface of tumor cells, which , in turn, leads to a decrease in the level of binding of the target drug.

Задачей, которая решается в предложенном изобретении, является разработка лекарственной формы противоопухолевого препарата, обладающего более высокой эффективностью применения за счет повышения тропности в отношении опухолевых клеток, увеличенном содержании цитостатического препарата, и снижения неспецифической токсичности при его применении, а также эффективного способа его получения с оптимизированными параметрами, позволяющего получать препаративные количества лекарственной формы.The task that is solved in the proposed invention is the development of a dosage form of an anticancer drug with a higher efficiency of use due to an increase in tropism in relation to tumor cells, an increased content of a cytostatic drug, and a decrease in nonspecific toxicity during its use, as well as an effective method for its production with optimized parameters, allowing to obtain preparative quantities of the dosage form.

Требуемый результат заключается в повышении эффективности путем обеспечения повышенной специфической активности к опухолевым клеткам, экспрессирующим рецепторы альфа-фетопротеина.The desired result is to increase the efficiency by providing increased specific activity to tumor cells expressing AFP receptors.

Требуемый результат достигается в противоопухолевом препарате, который представляет собой стабильные наночастицы и включает цитостатическое средство, биодеградируемый полимер, неорганические соли, криопротектор и векторную молекулу для адресной доставки препарата в пораженные органы и ткани.The desired result is achieved in an antitumor drug that is stable nanoparticles and includes a cytostatic agent, a biodegradable polymer, inorganic salts, a cryoprotectant, and a vector molecule for targeted drug delivery to the affected organs and tissues.

Кроме того, требуемый результат достигается тем, что противоопухолевый препарат в качестве цитостатического средства содержит производное альфа-гидроксибензолпропановой кислоты в масс. %: 4.5÷5.5.In addition, the desired result is achieved in that the antitumor drug as a cytostatic agent contains a derivative of alpha-hydroxybenzenepropanoic acid in the mass. %: 4.5 ÷ 5.5.

Кроме того, требуемый результат достигается тем, что противоопухолевый препарат в качестве биодеградируюемого полимера содержит сополимер молочной и гликолевой кислот в масс. %: 70.0÷72.1.In addition, the desired result is achieved by the fact that the anticancer drug as a biodegradable polymer contains a copolymer of lactic and glycolic acids in the mass. %: 70.0 ÷ 72.1.

Кроме того, требуемый результат достигается тем, что противоопухолевый препарат в качестве векторной молекулы для адресной доставки частиц в пораженные органы и ткани содержит С-концевой домен альфа-фетопротеина (r3D AFP) в масс. %: 12.3÷13.3.In addition, the desired result is achieved by the fact that the anticancer drug as a vector molecule for targeted delivery of particles to the affected organs and tissues contains the C-terminal domain of alpha-fetoprotein (r3D AFP) in the mass. %: 12.3 ÷ 13.3.

Кроме того, требуемый результат достигается тем, что противоопухолевый препарат в качестве криопротектора содержит D-маннитол в масс. %: 10.6-10.7.In addition, the desired result is achieved by the fact that the anticancer drug as a cryoprotectant contains D-mannitol in the mass. %: 10.6-10.7.

Кроме того, требуемый результат достигается тем, что в противоопухолевом препарате стабильные наночастицы выполнены в виде частиц со средним размером частиц не более 275 нм и диапазоном распределения - 150-550 нм.In addition, the desired result is achieved by the fact that stable nanoparticles in the antitumor drug are made in the form of particles with an average particle size of no more than 275 nm and a distribution range of 150-550 nm.

Состав противоопухолевого препарата и его повышенная эффективность применения относительно известных препаратов аналогичного назначения обосновывается следующим.The composition of the anticancer drug and its increased efficiency of use relative to known drugs of a similar purpose is justified by the following.

Серьезным недостатком используемых в настоящее время противоопухолевых препаратов является их высокая общая токсичность. Химиотерапия онкологических заболеваний существующими сильнодействующими препаратами сопровождается выраженной интоксикацией организма больного и побочными эффектами, что существенно ограничивает возможности применения и использования в полной мере цитостатического и цитотоксического потенциала современных противоопухолевых средств. Возникновение токсических и побочных эффектов при проведении химиотерапии онкологических больных связано с низкой избирательностью существующих лекарств, необходимостью длительно поддерживать достаточно высокую терапевтическую дозу, что приводит к сильному отрицательному воздействию на здоровые органы и ткани.A serious disadvantage of currently used anticancer drugs is their high general toxicity. Chemotherapy of oncological diseases with existing potent drugs is accompanied by severe intoxication of the patient's body and side effects, which significantly limits the possibilities of using and fully utilizing the cytostatic and cytotoxic potential of modern anticancer drugs. The emergence of toxic and side effects during chemotherapy of cancer patients is associated with the low selectivity of existing drugs, the need to maintain a sufficiently high therapeutic dose for a long time, which leads to a strong negative effect on healthy organs and tissues.

Серьезной проблемой, снижающей эффективность химиотерапии злокачественных новообразований, является также множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) опухолевых клеток. Одной из основных причин МЛУ является гиперэкспрессия трансмембранных белков, относящихся к семейству ABC-транспортеров (MDR1, MRP1, BCRP и др.), выбрасывающих химиопрепараты, в том числе молекулы противоопухолевых препаратов, из клетки.Multiple drug resistance (MDR) of tumor cells is also a serious problem that reduces the effectiveness of chemotherapy for malignant neoplasms. One of the main causes of MDR is the overexpression of transmembrane proteins belonging to the family of ABC transporters (MDR1, MRP1, BCRP, etc.), which release chemotherapy drugs, including molecules of anticancer drugs, from the cell.

Один из способов решения данных проблем связан с созданием систем адресной доставки лекарственных веществ путем их включения в полимерные частицы или липосомы, имеющие размеры не более 500 нм. Высокая терапевтическая активность наносомальных препаратов при лечении онкологических заболеваний определяется способностью наночастиц обеспечивать пассивный направленный транспорт связанных с ними лекарственных веществ в опухоль. Пассивный направленный транспорт обусловлен большей уязвимостью поврежденных тканей для данных лекарств. В литературе это явление получило название «эффекта повышенной проницаемости и удерживания». Важным преимуществом данной технологии является ее гибкость, позволяющая варьировать свойства носителей лекарств в зависимости от локализации очага патологии.One of the ways to solve these problems is associated with the creation of systems for the targeted delivery of drugs by incorporating them into polymer particles or liposomes with sizes of no more than 500 nm. The high therapeutic activity of nanosomal drugs in the treatment of oncological diseases is determined by the ability of nanoparticles to provide passive targeted transport of drugs associated with them into the tumor. Passive directional transport is due to the greater vulnerability of damaged tissues to these drugs. In the literature, this phenomenon is called the "increased permeability and retention effect." An important advantage of this technology is its flexibility, which makes it possible to vary the properties of drug carriers depending on the localization of the pathological focus.

Сущность предложенного решения заключается в том, что создана готовая лекарственная форма цитотоксического препарата - производного альфа-гидроксибензолпропановой кислоты, на основе сополимера молочной и гликолевой кислот, содержащая белковую векторную молекулу r3D AFP, для адресной доставки препарата в опухолевые клетки.The essence of the proposed solution lies in the fact that a finished dosage form of a cytotoxic drug, a derivative of alpha-hydroxybenzenepropanoic acid, based on a copolymer of lactic and glycolic acids, containing a protein vector molecule r3D AFP, for targeted drug delivery to tumor cells has been created.

Получение частиц проводили с использованием биодеградируемого сополимера молочной и гликолевой кислот (молекулярная масса 3-17 кДа) и поливинилового спирта (ПВС) в качестве стабилизатора эмульсии. Наночастицы получали методом одинарного эмульгирования с использованием погружного гомогенизатора (24000 об/мин, 7 раз по 40 сек с перерывами по 20 сек).The particles were prepared using a biodegradable copolymer of lactic and glycolic acids (molecular weight 3-17 kDa) and polyvinyl alcohol (PVA) as an emulsion stabilizer. Nanoparticles were obtained by the method of single emulsification using a submersible homogenizer (24000 rpm, 7 times for 40 seconds with intervals of 20 seconds).

Свободную карбоксильную группу частиц связывали с аминогруппой векторного белка с использованием водорастворимого карбодиимида. Очистку и выделение готового продукта проводили с использованием гель-эксключионной хроматографии. Размеры полученной готовой лекарственной формы составляли не более 275 нм, а диапазон распределения - 150-550 нм.The free carboxyl group of the particles was linked to the amino group of the vector protein using a water-soluble carbodiimide. Purification and isolation of the finished product was carried out using gel exclusion chromatography. The dimensions of the obtained finished dosage form were no more than 275 nm, and the distribution range was 150-550 nm.

Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что для получения препарата используют способ, позволяющий получать лекарственную форму в препаративных количествах (не менее 7 г лиофилизата лекарственной формы), а лекарственная форма содержит производное альфа-гидроксибензолпропановой кислоты, сополимер молочной и гликолевой кислот, r3D AFP, неорганические соли и Д-маннитол в следующем соотношении % мас.:In addition, the required technical result is achieved by the fact that to obtain the drug using a method that allows you to obtain the dosage form in preparative quantities (at least 7 g of the lyophilisate of the dosage form), and the dosage form contains a derivative of alpha-hydroxybenzenepropanoic acid, a copolymer of lactic and glycolic acids, r3D AFP, inorganic salts and D-mannitol in the following% wt ratio:

- производное альфа-гидроксибензолпропановой кислоты- derivative of alpha-hydroxybenzenepropanoic acid - 4.5÷5.5- 4.5 ÷ 5.5 - r3D AFP- r3D AFP - 12.3÷13.3- 12.3 ÷ 13.3 - сополимер молочной и гликолевой кислот- copolymer of lactic and glycolic acids - 70.0÷72.1- 70.0 ÷ 72.1 - неорганические соли- inorganic salts - до 0.5- up to 0.5 - Д-маннитол- D-mannitol - 10.6÷10.7- 10.6 ÷ 10.7

На чертеже графических материалах представлены:The drawing contains graphic materials:

на фиг. 1 - аминокислотная последовательность рекомбинантного фрагмента АФП (r3D AFP) (SEQ1);in fig. 1 - amino acid sequence of the recombinant fragment of AFP (r3D AFP) (SEQ1);

на фиг. 2 - связывание (4°С) и интернализация (37°С) ЛФ-ФИТЦ, смесь ЛФ и r3D AFP-ФИТЦ (молярное соотношение 1 к 1), смесь ЛФ и r3D AFP-ФИТЦ (молярное соотношение 10 к 1), смесь ЛФ-ФИТЦ и полимерных частиц (НЧ) (массовое отношение ЛФ-ФИТЦ и частиц 1 к 1), смесь ЛФ-ФИТЦ и полимерных частиц (НЧ) (массовое отношение ЛФ-ФИТЦ и частиц 1 к 10) клетками линий SKOV3, SKVLB, Р388/РТХ, опухоли яичника крыс штамма ОЯ и лимфоцитами, оцениваемые по интенсивности флуоресценции клеток;in fig. 2 - binding (4 ° C) and internalization (37 ° C) LF-FITC, mixture of LF and r3D AFP-FITC (molar ratio 1 to 1), mixture of Lf and r3D AFP-FITC (molar ratio 10 to 1), mixture LF-FITC and polymer particles (NPs) (mass ratio of LF-FITC and particles 1 to 1), a mixture of LF-FITC and polymer particles (NPs) (mass ratio of LF-FITC and particles 1 to 10) by SKOV3, SKVLB cells, P388 / PTX, rat ovarian tumors of the OY strain and lymphocytes, assessed by the intensity of cell fluorescence;

на фиг. 3 - выживаемость клеток линий SKOV3, SKVLB, Р388/РТХ, опухоли яичника крыс штамма ОЯ и лимфоцитов периферической крови человека (Б) после 72 ч инкубации с ЛФ Паклитаксел-НК и препаратом сравнения - субстанция паклитаксел, оцениваемая по уровню IC50.in fig. 3 - survival of SKOV3, SKVLB, P388 / PTX cells, rat ovarian tumors of the OY strain and human peripheral blood lymphocytes (B) after 72 h of incubation with LF Paclitaxel-NK and a reference drug - paclitaxel substance, assessed by the IC50 level.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDESCRIPTION OF THE INVENTION

Способ получения конъюгата противоопухолевых препаратов с функциональным фрагментом рекомбинантного альфа-фетопротеина осуществляется следующим образом.The method of obtaining a conjugate of anticancer drugs with a functional fragment of a recombinant alpha-fetoprotein is carried out as follows.

Получаемый предложенным способом противоопухолевый препарат обеспечивает направленную доставку противоопухолевых препаратов непосредственно в опухолевые клетки, защищая их от воздействия резистентных механизмов и обеспечивая пролонгированный эффект.The antitumor drug obtained by the proposed method provides targeted delivery of anticancer drugs directly to tumor cells, protecting them from the effects of resistant mechanisms and providing a prolonged effect.

Заявленный способ предназначен для получения конъюгатов полимерных частиц, содержащих цитостатические препараты, с функциональным фрагментом рекомбинантного альфа-фетопротеина.The claimed method is intended for obtaining conjugates of polymer particles containing cytostatic drugs with a functional fragment of a recombinant alpha-fetoprotein.

Для получения конъюгатов использовали карбодиимидный способ. Этот способ отличается простотой, относительно небольшим временем проведения реакции, а также относительно приемлемыми условиями, в которых она протекает.To obtain conjugates, the carbodiimide method was used. This method is simple, relatively short reaction time, and relatively acceptable conditions under which it takes place.

Одним из методов лечения онкологических заболеваний является применение химиотерапевтических препаратов. На протяжении многих лет в качестве противоопухолевых веществ используются цитотоксические агенты из класса дитерпенов - таксаны [5]. Первые таксаны были выделены из растений рода Taxus (тис) в конце 60-х годов и имеют таксадиеновое ядро. Данные препараты активно используются при терапии злокачественных новообразований различного происхождения, таких как: саркомы, меланомы, карциномы и другие солидные опухоли.One of the methods of treating cancer is the use of chemotherapy drugs. For many years, cytotoxic agents from the diterpene class — taxanes — have been used as antitumor agents [5]. The first taxanes were isolated from plants of the genus Taxus (yew) in the late 1960s and have a taxadiene core. These drugs are actively used in the treatment of malignant neoplasms of various origins, such as sarcomas, melanomas, carcinomas and other solid tumors.

Основным механизмом действия препаратов класса таксанов (производные альфа-гидроксибензолпропановой кислоты) является нарушение функции микротрубочек. Таксаны связываясь со свободным тубулином, повышают скорость и степень его полимеризации, стимулируют сборку микротрубочек, стабилизируют сформировавшиеся микротрубочки, препятствуют деполимеризации тубулина и распаду микротрубочек. Образование чрезмерного количества микротрубочек и их стабилизация приводят к ингибированию динамической реорганизации сети микротрубочек, что в конечном итоге ведет к нарушению процесса формирования митотического веретена и ингибированию клеточного цикла в G2 и М-фазах митоза.The main mechanism of action of drugs of the class of taxanes (derivatives of alpha-hydroxybenzenepropanoic acid) is a dysfunction of microtubules. Taxanes bind to free tubulin, increase the rate and degree of its polymerization, stimulate the assembly of microtubules, stabilize the formed microtubules, and prevent tubulin depolymerization and microtubule disintegration. The formation of an excessive number of microtubules and their stabilization lead to inhibition of the dynamic reorganization of the microtubule network, which ultimately leads to disruption of the process of mitotic spindle formation and inhibition of the cell cycle in the G2 and M phases of mitosis.

Настоящее изобретение относится к терапевтическим комбинациям, содержащим препараты - производные альфа-гидроксибензолпропановой кислоты из таксанового ряда. К таковым относятся следующие препараты, не ограничивающие объема изобретения:The present invention relates to therapeutic combinations containing drugs - derivatives of alpha-hydroxybenzenepropanoic acid from the taxane series. These include the following drugs, which do not limit the scope of the invention:

1. «Паклитаксел» - цитостатический препарат, относящийся к таксанам. Его применяют для лечения рака яичников, рака молочной железы, немелкоклеточного рака легкого, рака мочеполовой сферы и саркомы Капоши [6-10].1. "Paclitaxel" is a cytostatic drug related to taxanes. It is used to treat ovarian cancer, breast cancer, non-small cell lung cancer, urogenital cancer, and Kaposi's sarcoma [6-10].

Механизм действия паклитаксела связан со способностью препарата стимулировать «сборку» микротрубочек из димерных молекул тубулина, стабилизировать их структуру и тормозить динамическую реорганизацию в интерфазе, что нарушает митотическую функцию клетки.The mechanism of action of paclitaxel is associated with the ability of the drug to stimulate the "assembly" of microtubules from dimeric tubulin molecules, stabilize their structure and inhibit dynamic reorganization in the interphase, which disrupts the mitotic function of the cell.

Однако, ввиду высокой токсичности паклитаксела, его применение сопряжено с рядом побочных эффектов: нейтропенией, тромбоцитопенией, анемией, снижением артериального давления, брадикардией, тахикардией, фиброзом легких, эмболией легочной артерии, артралгией, миалгией, тошнотой, рвотой, диареей, запором, увеличением активности печеночных трансаминази др.However, due to the high toxicity of paclitaxel, its use is associated with a number of side effects: neutropenia, thrombocytopenia, anemia, decreased blood pressure, bradycardia, tachycardia, pulmonary fibrosis, pulmonary embolism, arthralgia, myalgia, nausea, vomiting, increased diarrhea, constipation hepatic transaminases, etc.

2. «Доцетаксел» применяют для лечения операбельногорака молочной железы, метастатического или местно распространенного рака молочной железы, немелкоклеточного рака легких, рака яичников, рака предстательной железы, опухолей области головы и шеи [11, 12].2. Docetaxel is used to treat operable breast cancer, metastatic or locally advanced breast cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, head and neck tumors [11, 12].

Механизм действия связан с накоплением тубулина в микротрубочках митотического веретена, что приводит к нарушению процессов их сборки и разборки. Нарушает клеточное деление в фазах G2 и М клеточного цикла. Доцетаксел долго сохраняется в клетках, где достигаются его высокие концентрации. Доцетаксел активен в отношении некоторых (но не всех) клеток, продуцирующих в избыточном количестве р-гликопротеин, который кодируется геном множественной устойчивости.The mechanism of action is associated with the accumulation of tubulin in the microtubules of the mitotic spindle, which leads to a violation of the processes of their assembly and disassembly. Violates cell division in the G2 and M phases of the cell cycle. Docetaxel persists for a long time in cells, where its high concentrations are reached. Docetaxel is active against some (but not all) cells that produce an excessive amount of p-glycoprotein, which is encoded by the multiple resistance gene.

Доцетаксел обладает рядом побочных эффектов, к которым можно отнести следующие: нейтропения, тромбоцитопения, аллергические реакции, повышенная активность печеночных трансаминаз, тошнота, рвота, диарея, анорексия, стоматит, нарушение сердечного ритма, повышение или понижение артериального давления, отдышка, и др.Docetaxel has a number of side effects, which include the following: neutropenia, thrombocytopenia, allergic reactions, increased activity of hepatic transaminases, nausea, vomiting, diarrhea, anorexia, stomatitis, heart rhythm disturbances, increased or decreased blood pressure, shortness of breath, etc.

Таким образом, существенным недостатком используемых в настоящее время противоопухолевых препаратов является их высокая токсичность, которая вызывает интоксикацию организма пациента, а также множественные побочные эффекты.Thus, a significant disadvantage of currently used anticancer drugs is their high toxicity, which causes intoxication of the patient's body, as well as multiple side effects.

Другим недостатком является возникновение у опухолевых клеток множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). Механизм МЛУ связан с гиперэкспрессией трансмембранных белков семейства ABC-транспортеров, которые способны удалять химиотерапевтические агенты из опухолевой клетки [13].Another disadvantage is the emergence of multidrug resistance (MDR) in tumor cells. The MDR mechanism is associated with the overexpression of transmembrane proteins of the ABC transporter family, which are capable of removing chemotherapeutic agents from the tumor cell [13].

Изобретение может быть применено для лечения опухолевых злокачественных новообразований при наличии на поверхности опухолевых клеток рецепторов к альфа-фетопротеину (АФП), а именно: для лечения аденокарциномы молочной железы человека линий MCF 7 и сублинии MCF 7 Adr, резистентной к антрациклиновым антибиотикам и таксанам; аденокарциномы яичника человека линии SKOV3, резистентной линии SKVLB и линии OVCAR 8; аденокарциномы предстательной железы человека линий LnCaP и Du145; немелкоклеточной карциномы легкого человека линии А549; мелкоклеточной карциномы легкого человека линии Н69 и пр.The invention can be used for the treatment of tumor malignant neoplasms in the presence of receptors for alpha-fetoprotein (AFP) on the surface of tumor cells, namely: for the treatment of human breast adenocarcinoma lines MCF 7 and subline MCF 7 Adr resistant to anthracycline antibiotics and taxanes; human ovarian adenocarcinoma of the SKOV3 line, the SKVLB resistant line and the OVCAR 8 line; adenocarcinoma of the human prostate gland of the LnCaP and Du145 lines; non-small cell lung carcinoma of the human line A549; small cell lung carcinoma of the human line H69, etc.

ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯTERMS AND DEFINITIONS

Термины «рак» и «злокачественная опухоль» относятся или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым клеточным ростом/пролиферацией. Примеры злокачественной опухоли включают без ограничения карциному, саркому, лимфому, бластому, и лейкоз. Более конкретные примеры таких злокачественных опухолей включают раке яичников, легкого, молочной железы, пищевода и верхних отделов желудка, карциномы, саркома Капоши и различные типы рака головы и шеи.The terms "cancer" and "malignant tumor" refer to or describe a physiological condition in mammals that is typically characterized by unregulated cell growth / proliferation. Examples of cancer include, but are not limited to, carcinoma, sarcoma, lymphoma, blastoma, and leukemia. More specific examples of such malignant tumors include ovarian, lung, breast, esophageal and upper stomach cancers, carcinomas, Kaposi's sarcoma, and various types of head and neck cancers.

Термин «противоопухолевая активность» означает активность конъюгата в отношении как гормоно-зависимых, так и гормоно-независимых опухолей.The term "antitumor activity" means the activity of the conjugate against both hormone-dependent and hormone-independent tumors.

Термины «химиотерапевтические препараты», «противоопухолевые препараты», «цитотоксическое средство» обозначают химические соединения, пригодные для лечения онкологических заболеваний, обладающие схожим механизмом действия, структурной формулой и физико-химическими свойствами. Данные термины включают цитотоксические агенты из класса дитерпенов - таксаны, такие как: паклитаксел, доцетаксел и кабазитаксел и пр.The terms "chemotherapeutic drugs", "antineoplastic drugs", "cytotoxic agent" denote chemical compounds suitable for the treatment of cancer, with a similar mechanism of action, structural formula and physicochemical properties. These terms include cytotoxic agents from the diterpene class - taxanes, such as: paclitaxel, docetaxel and cabazitaxel, etc.

«Химиотерапевтическим средством» является химическое соединение, которое можно использовать для лечения злокачественной опухоли. Примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие агенты, такие как тиотепа и CYTOXAN® цикло-фосфамид; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метилмеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилмеламин; ацетогенины (в частности, буллатацин и буллатацинон); дельта-9-тетрагидроканнабинол (дронабинол, MARPNOL®); бета-лапахон; лапахол; колхицины; бетулиновую кислоту; камптотецин (включая синтетический аналог топотекан (HYCAMTIN®), СРТ-11 (иринотекан, CAMPTOSAR®), ацетилкамптотецин, скополектин и 9-аминокамптотецин); бриостатин; каллистатин; СС-1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин); подофиллотоксин; подофиллиновую кислоту; тенипозид; криптофицины (в частности, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги KW-2189 и СВ1-ТМ1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид оксида мехлорэтамина, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимустин; антибиотики, такие как энедииновые антибиотики (например, калихеамицин, в частности калихеамицин гамма II и калихеамицин омега II (смотри, например, Agnew, Chemlntl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); динемицин, включая динемицин А; эсперамицин; а также хромофор неокарциностатина и родственные хромофоры хромопротеинов - энедииновые антибиотики), аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицин, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксору-бицин ADRIAMICIN® (включая морфолинодоксорубицин, цианоморфолинодоксорубицин, 2-пирролинодоксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофеноловую кислоту, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, пропионатдромостанолона, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; средства, подавляющие функции надпочечников, такие как аминоглютетимид, митотан, трилостан; компенсатор фолиевой кислоты, такой как фолиновая кислота; ацеглатон; гликозид альдофосфамид; аминолевулиновую кислоту; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазихон; элфорнитин; ацетат эллиптиния; эпотилон; этоглуцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидаинин; мейтанзиноиды, такие как мейтанзин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK® (JHS NaturalProducts, Eugene, OR); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновая кислота; триазиквон; 2,2',2-трихлортриэтиламин; трихотецены (в частности, токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангуидин); уретан; виндезин (ELDISINE®, FILDESIN®); дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид («ara-C»); тиотепа; таксоиды, например, паклитаксел TAXOL® (Bristol-MyersSquibb Oncology, Princeton, N.J.), не содержащий кремофора препарат паклитаксела на основе сконструированных связанных с альбумином наночастиц ABRAXANE TM (AmericanPharmaceuticalPartners, Schaumberg, Illinois) и доксетаксел TAXOTERE® (Rhone-PoulencRorer, Antony, France); хлорамбуцил; гемцитабин (GEMZAR®); 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин (VELBAN®); платину; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин (ONCOVIN®); оксалиплатин; лейковорин; винорелбин (NAVELBINE®); новантрон; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; ибандронат; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; капецитабин (XELODA®); фармацевтически приемлемые соли, кислоты и производные любого агента, указанного выше; а также комбинации двух или более указанных выше средств, такие как CHOP, сокращенное название комбинированной терапии циклофосфамидом, доксорубицином, винкристином и преднизолоном, и FOLFOX, сокращенное название схемы лечения оксалиплатином (ELOXATIN ТМ) в сочетании с 5-FU и лейковорином.A "chemotherapeutic agent" is a chemical compound that can be used to treat cancer. Examples of chemotherapeutic agents include alkylating agents such as thiotepa and CYTOXAN® cyclophosphamide; alkyl sulfonates such as busulfan, improsulfan, and piposulfan; aziridines such as benzodopa, carboquone, meturedopa, and uredopa; ethyleneimines and methylmelamines, including altretamine, triethylenemelamine, triethylenephosphoramide, triethylenethiophosphoramide, and trimethylmelamine; acetogenins (in particular, bullatacin and bullatacinone); delta-9-tetrahydrocannabinol (dronabinol, MARPNOL®); beta lapachone; lapachol; colchicines; betulinic acid; camptothecin (including the synthetic analogue topotecan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®), acetylcamptothecin, scopolectin and 9-aminocamptothecin); bryostatin; callistatin; CC-1065 (including its synthetic analogs adoselesin, carzelesin and bisellesin); podophyllotoxin; podophyllic acid; teniposide; cryptophycins (in particular, cryptophycin 1 and cryptophycin 8); dolastatin; duocarmycin (including synthetic analogues KW-2189 and CB1-TM1); eleutherobin; pankratistatin; sarcodictyin; spongystatin; nitrogen mustards such as chlorambucil, chlornaphazine, cholophosphamide, estramustine, ifosfamide, mechlorethamine, mechlorethamine oxide hydrochloride, melphalan, novembichin, fenesterol, prednimustine, trophosphamide, uramustine; nitrosoureas such as carmustine, chlorosotocin, fotemustine, lomustine, nimustine, and ranimustine; antibiotics such as enedyne antibiotics (eg calicheamicin, in particular calicheamicin gamma II and calicheamicin omega II (see, eg, Agnew, Chemlntl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dynemycin, including dynemycin A; esperamycin; as well as the neocarcinostatin chromophore and related chromoprotein chromophores - enediin antibiotics), aclacinomysins, actinomycin, autramycin, azaserin, bleomycins, cactinomycin, carbicin, carminomycin, carzinophilin, oxynomycin-5, dacinomycin-6 -norleucine, doxorubicin ADRIAMICIN® (including morpholinodoxorubicin, cyanomorpholine-doxorubicin, 2-pyrrolinodoxorubicin and deoxidoxorubicin), epirubicin, ezorubicin, idarubicin, marcellomycin, mytomycinamycin, olivycinamines, such as , rhodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimex, zinostatin, zorubicin; antimetabolites such as methotrexate and 5-fluorouracil (5-FU); folic acid analogs such as denopterin, methotrexate, pteropterin, trimetrexate; purine analogs such as fludarabine, 6-mercaptopurine, thiamiprine, thioguanine; pyrimidine analogs such as ancitabine, azacytidine, 6-azauridine, karmofur, cytarabine, dideoxyuridine, doxifluridine, enocitabine, floxuridine; androgens such as calusterone, dromostanolone propionate, epitiostanol, mepitiostan, testolactone; adrenal suppressants such as aminoglutethimide, mitotane, trilostane; folic acid compensator such as folinic acid; aceglatone; glycoside aldophosphamide; aminolevulinic acid; eniluracil; amsacrine; bestrabucil; bisanthrene; edatraxate; defopamine; demecolcine; diazichon; elfornithine; elliptinium acetate; epothilone; etoglucid; gallium nitrate; hydroxyurea; lentinan; lonidainin; maytansinoids such as maytansine and ansamitocins; mitoguazone; mitoxantrone; mopidanmol; nitraerine; pentostatin; phenamet; pyrarubicin; losoxantrone; 2-ethylhydrazide; procarbazine; polysaccharide complex PSK® (JHS NaturalProducts, Eugene, OR); razoxane; rhizoxin; sizophyran; spirogermanium; tenuazonic acid; triaziquon; 2,2 ', 2-trichlorotriethylamine; trichothecenes (in particular T-2 toxin, verracurin A, roridin A and anguidin); urethane; vindesine (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazine; mannomustine; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacytosine; arabinoside ("ara-C"); thiotepa; taxoids such as paclitaxel TAXOL® (Bristol-MyersSquibb Oncology, Princeton, NJ), Cremophor-free paclitaxel formulation based on engineered albumin-bound ABRAXANETM nanoparticles (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) and doxetaxel (Rhone-PteryrErErEr France); chlorambucil; gemcitabine (GEMZAR®); 6-thioguanine; mercaptopurine; methotrexate; platinum analogs such as cisplatin and carboplatin; Vinblastine (VELBAN®); platinum; etoposide (VP-16); ifosfamide; mitoxantrone; vincristine (ONCOVIN®); oxaliplatin; leucovorin; Vinorelbine (NAVELBINE®); novantrone; edatrexate; daunomycin; aminopterin; ibandronate; RFS 2000 topoisomerase inhibitor; difluoromethylornithine (DMFO); retinoids such as retinoic acid; capecitabine (XELODA®); pharmaceutically acceptable salts, acids and derivatives of any of the above agents; and combinations of two or more of the aforementioned agents such as CHOP, the abbreviation for combination therapy with cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine and prednisolone, and FOLFOX, the abbreviation for an oxaliplatin regimen (ELOXATIN TM) in combination with 5-FU and leucovorin.

Также в указанное определение включены противогормональные средства, которые действуют, регулируя, уменьшая, блокируя или ингибируя эффекты гормонов, которые могут стимулировать рост злокачественной опухоли, и часто их используют в форме системного лечения или лечения на уровне целого организма. Они сами могут являться гормонами. Примеры включают антиэстрогены и избирательные модуляторы рецепторов эстрогена (SERM), включая, например, тамоксифен (включая тамоксифен NOLVADEX®), ралоксифен EVISTA®, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торемифен FARESTON®; антипрогестероны; понижающие регуляторы рецептора эстрогена (ERD); средства, которые функционируют, подавляя или прекращая работу яичников, например агонисты рилизинг-гормона лютеинизирующего гормона (LHRH), такие как ацетат лейпролида LUPRON® и ELIGARD®, ацетат гозерелина, ацетат бузерелина и триптерелин; другие антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид и бикалутамид; и ингибиторы ароматазы, которые ингибируют фермент ароматазу, которая регулирует продукцию эстрогена в надпочечниках, такие как, например, 4(5)-имидазолы, аминоглутетимид, ацетат мегестрола MEGASE®, эксеместан AROMASIN®, форместан, фадрозол, ворозол RIVISOR®, летрозол FEMARA® и анастрозол ARIMIDEX®. Кроме того, такое определение химиотерапевтических средств включает бисфосфонаты, такие как клодронат (например, BONEFOS® или OSTAC®), этидронат DIDROCAL®, NE-58095, золедроновую кислоту/золедронат ZOMETA®, алендронат FOSAMAX®, памидронат AREDIA®, тилудронат SKELID® или ризедронат ACTONEL®; а также троксацитабин (1,3-диоксолановый нуклеозидный аналог цитозина); антисмысловые олигонуклеотиды, в частности олигонуклеотиды, которые ингибируют экспрессию генов в путях передачи сигналов, вовлеченных в аномальную пролиферацию клеток, таких как, например, РKС-альфа, Raf, H-Ras и рецептор эпидермального фактора роста (EGF-R); вакцины, такие как вакцина THERATOPE® и вакцины для генной терапии, например вакцина ALLOVECTIN®, вакцина LEUVECTIN® и вакцина VAXID®; ингибитор топоизомеразы 1 LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; дитозилатлапатиниба (низкомолекулярный двойной ингибитор тирозинкиназ ErbB-2 и EGFR, также известный как GW572016); и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанных выше средств.Also included in this definition are anti-hormonal agents that act to regulate, reduce, block, or inhibit the effects of hormones that can stimulate cancer growth, and are often used in the form of systemic or whole-body treatment. They themselves may be hormones. Examples include antiestrogens and selective estrogen receptor modulators (SERMs), including, for example, tamoxifen (including NOLVADEX® tamoxifen), EVISTA® raloxifene, droloxifene, 4-hydroxy tamoxifen, trioxifene, keoxifene, LY117018, onapristone, and ON Toremifene; antiprogesterones; down regulators of the estrogen receptor (ERD); agents that function to suppress or stop ovarian function, for example, luteinizing hormone releasing hormone (LHRH) agonists such as LUPRON® and ELIGARD® leuprolide acetate, goserelin acetate, buserelin acetate and tripterelin; other antiandrogens such as flutamide, nilutamide and bicalutamide; and aromatase inhibitors that inhibit the enzyme aromatase, which regulates the production of estrogen in the adrenal glands, such as, for example, 4 (5) -imidazoles, aminoglutethimide, megestrol acetate MEGASE®, AROMASIN® exemestane, formestane, fadrozole, RIVISOR® vorozole, Fadrozole and anastrozole ARIMIDEX®. In addition, this definition of chemotherapeutic agents includes bisphosphonates such as clodronate (e.g. BONEFOS® or OSTAC®), DIDROCAL® etidronate, NE-58095, ZOMETA® zoledronic acid / zoledronate, FOSAMAX® alendronate, AREDIA® pamidronate SKEL, tiludronate risedronate ACTONEL®; as well as troxacitabine (1,3-dioxolane nucleoside cytosine analog); antisense oligonucleotides, in particular oligonucleotides, which inhibit the expression of genes in signaling pathways involved in abnormal cell proliferation, such as, for example, PKC-alpha, Raf, H-Ras, and epidermal growth factor receptor (EGF-R); vaccines such as THERATOPE® vaccine and gene therapy vaccines such as ALLOVECTIN® vaccine, LEUVECTIN® vaccine and VAXID® vaccine; a topoisomerase 1 inhibitor LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; ditosylatlapatinib (small molecule dual tyrosine kinase inhibitor ErbB-2 and EGFR, also known as GW572016); and pharmaceutically acceptable salts, acids or derivatives of any of the above agents.

ПРИМЕРЫ РЕАЛИЗАЦИИ ПРЕДЛОЖЕННОГО ИЗОБРЕТЕНИЯEXAMPLES OF IMPLEMENTATION OF THE PROPOSED INVENTION

Пример 1. Получение биомассы рекомбинантного фрагмента АФП (r3D AFP)Example 1. Obtaining a biomass of a recombinant AFP fragment (r3D AFP)

Работы с бактериальными штаммами проводили под ламинаром в стерильных условиях. Для трансформации использовали компетентные клетки Вl21 (DE3) фирмы Stratogen. Пробирку с клетками (0.1 мл) размораживали на льду, добавляли 5 мкл раствора плазмиды в концентрации 20 нг/мл и инкубировали 10-15 минут на льду, после чего подвергали тепловому шоку при 42°С в течение 2 минут. Затем пробирку помещали в лед на 30 с, далее добавляли 1 мл среды LB и инкубировали 30-45 минут при 37°С при перемешивании. Затем клетки осаждали центрифугированием (2000 g, 5 минут), удаляли 1 мл супернатанта, осадок ресуспендировали в оставшейся среде и высевали на чашки Петри с агаризованной средой LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). 2-3 колонии трансформантов помещали в 10 мл среды LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл) и инкубировали при 37°С при активном перемешивании в течение ночи. Из полученной жидкой культуры производили посев на чашку Петри с агаризованной средой LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Чашку инкубировали при 37°С в течение ночи. Из выросших колоний отбирали 6 наиболее крупных, каждую из которых помещали в 10 мл среды LB с добавлением ампициллина и инкубировали при 37°С. По достижении оптической плотности OD₆₀₀ от 0.5 до 1.2 единиц добавляют ИПТГ (изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида) до конечной концентрации от 0.1 до 2 мМ и инкубацию продолжают в течение 3 часов, после чего определяли уровень экспрессии целевого белка с помощью электрофореза в ПААГ. Полученную биомассу центрифугируют в течение 15 мин при 10000 RPM.Work with bacterial strains was carried out under a laminar under sterile conditions. For transformation, competent cells Bl21 (DE3) from Stratogen were used. A tube with cells (0.1 ml) was thawed on ice, 5 μl of a plasmid solution at a concentration of 20 ng / ml was added and incubated for 10-15 minutes on ice, after which it was subjected to heat shock at 42 ° C for 2 minutes. Then the tube was placed on ice for 30 s, then 1 ml of LB medium was added and incubated for 30-45 minutes at 37 ° C with stirring. Then the cells were pelleted by centrifugation (2000 g, 5 minutes), 1 ml of supernatant was removed, the pellet was resuspended in the remaining medium and plated on Petri dishes with agar LB medium containing ampicillin (100 μg / ml). 2-3 colonies of transformants were placed in 10 ml of LB medium containing ampicillin (100 μg / ml) and incubated at 37 ° C with vigorous stirring overnight. The resulting liquid culture was inoculated onto a Petri dish with agar LB medium containing ampicillin (100 μg / ml). The dish was incubated at 37 ° C overnight. The 6 largest colonies were selected from the grown colonies, each of which was placed in 10 ml of LB medium supplemented with ampicillin and incubated at 37 ° C. When the optical density of OD ₆₀₀ reaches 0.5 to 1.2 units, IPTG (isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside) is added to a final concentration of 0.1 to 2 mM and incubation is continued for 3 hours, after which the level of expression of the target protein was determined by electrophoresis in PAGE. The resulting biomass is centrifuged for 15 minutes at 10,000 RPM.

Пример 2. Очистка и выделение рекомбинантного фрагмента АФП (r3D AFP)Example 2. Purification and isolation of recombinant AFP fragment (r3D AFP)

Влажную биомассу (6 г) ресуспензировали в 100 мл буфера рН=8,0, содержащего 50 мМ фосфата натрия и 2 таблетки ингибиторов протеаз без ЭДТА (Roche). Далее добавляли лизоцим до концентрации 50 мг/л и инкубировали 10 мин при комнатной температуре, перемешивая стеклянной палочкой. Далее проводили ультразвуковую обработку 7 раз по 40 ударов при 0°С. Затем добавляли дезоксихолат натрия до 0,2% масс., и перемешивали 10 мин при комнатной температуре. Далее центрифугировали 10 мин в режиме 10000 об/мин. Собирали растворимую фракцию. Осадок несколько раз промывали фосфатным буфером и центрифугировали при 10000 об/мин. Осадок телец включения и растворимую фракцию хранили при -20°С. Осадок телец включения ресуспендировали в 10 мл солюбилизирующего буфера (150 мMNaCl, 10 мМ КН₂РO₄, 8 М мочевина, 12 мМмеркаптоэтанол, рН 7.4) и оставляли при перемешивании при комнатной температуре на 1 час. Полученный раствор центрифугировали (10000 об/мин, 10 мин) и использовали в дальнейшем для рефолдингасупернатант. Через колонку с носителем Superose 12 предварительно пропускали 5 объемов ренатурирующего буфера (150 MMNaCl, 10 мМ КН₂РO₄, 1 мМ GSSG, 5 мМ GSH, рН 8.5, +4°С). Затем готовили разведения солюбилизирующего буфера ренатурирующим, по 0,5 мл, до конечной концетрации мочевины в растворе 8, 6, 4, 2 и 0 М и меркаптоэтанола 12, 9, 6, 3, 0 мМ соответственно, и наносили на колонку, начиная с раствора с самой низкой концентрацией денатурирующих агентов. На подготовленную колонку наносили 2 мл солюбилизированного r3D AFP (k) (не более 20 мг), затем 0,5 мл солюбилизирующего буфера и элюировали целевой белок 3 объемами ренатурирующего буфера. Полученную фракцию диализовали против 1000-кратного объема фосфатно-солевого буфера при рН=8.5 и хранили при -70°С. Рекомбинантный белок дополнительно очищали с помощью металло-хелатной хроматографии на носителе содержащем ионы Ni²⁺ и, при необходимости, концентрировали с помощью концентрирующих ячеек.The wet biomass (6 g) was resuspended in 100 ml of pH 8.0 buffer containing 50 mM sodium phosphate and 2 tablets of protease inhibitors without EDTA (Roche). Then lysozyme was added to a concentration of 50 mg / L and incubated for 10 min at room temperature, stirring with a glass rod. Then, ultrasonic treatment was carried out 7 times, 40 strokes at 0 ° C. Then sodium deoxycholate was added to 0.2% by weight and stirred for 10 min at room temperature. Then it was centrifuged for 10 min at 10,000 rpm. Collected the soluble fraction. The precipitate was washed several times with phosphate buffer and centrifuged at 10,000 rpm. The precipitate of inclusion bodies and the soluble fraction were stored at -20 ° C. The precipitate of inclusion bodies was resuspended in 10 ml of solubilizing buffer (150 mMNaCl, 10 mM KH ₂ PO ₄ , 8 M urea, 12 mM mercaptoethanol, pH 7.4) and left under stirring at room temperature for 1 hour. The resulting solution was centrifuged (10,000 rpm, 10 min) and subsequently used for refolding the supernatant. 5 volumes of annealing buffer (150 MMNaCl, 10 mM KH ₂ PO ₄ , 1 mM GSSG, 5 mM GSH, pH 8.5, + 4 ° C) were preliminarily passed through a column with a Superose 12 carrier. Then, dilutions of the solubilizing buffer were prepared with annealing, 0.5 ml each, to the final concentration of urea in a solution of 8, 6, 4, 2, and 0 M and mercaptoethanol 12, 9, 6, 3, 0 mM, respectively, and applied to the column, starting from solution with the lowest concentration of denaturing agents. The prepared column was loaded with 2 ml of solubilized r3D AFP (k) (no more than 20 mg), then 0.5 ml of solubilizing buffer, and the target protein was eluted with 3 volumes of annealing buffer. The resulting fraction was dialyzed against 1000-fold volume of phosphate-buffered saline at pH = 8.5 and stored at -70 ° C. The recombinant protein was additionally purified by metal chelate chromatography on a support containing Ni ^{2+ ions} and, if necessary, concentrated using concentration cells.

Пример 3. Получение полимерных частиц с производным альфа-гидроксибензолпропановой кислотыExample 3. Obtaining polymer particles with a derivative of alpha-hydroxybenzenepropanoic acid

Для включения цитостатического вещества в состав наночастиц был использован метод одинарного эмульгирования [14, 15, 16]. Навеску 100.0 мг сополимера молочной и гликолевой кислот и 10.0 мг производного альфа-гидроксибензолпропановой кислоты растворяют в 5 мл хлористом метилене. Раствор по каплям добавляют к 50.0 мл 0,5% водного раствора поливинилового спирта. Полученную суспензию обрабатывают ультразвуком (24000 об/мин, 7 раз по 40 сек с перерывами по 20 сек) с помощью погружного гомогенизатора. С помощью роторного вакуумного испарителя удаляют органический растворитель. Далее раствор центрифугируют при 14000 g в течение 40 мин, осадок суспендируют в дистиллированной воде и лиофилизуют при 0,03-0,05 мбар в течение суток с добавлением 1% по массе D-маннита.To include a cytostatic substance in the composition of nanoparticles, the method of single emulsification was used [14, 15, 16]. A weighed portion of 100.0 mg of a copolymer of lactic and glycolic acids and 10.0 mg of a derivative of alpha-hydroxybenzenepropanoic acid are dissolved in 5 ml of methylene chloride. The solution is added dropwise to 50.0 ml of a 0.5% aqueous solution of polyvinyl alcohol. The resulting suspension is treated with ultrasound (24000 rpm, 7 times for 40 seconds with intervals of 20 seconds) using a submersible homogenizer. The organic solvent is removed using a rotary vacuum evaporator. Then the solution is centrifuged at 14000 g for 40 minutes, the precipitate is suspended in distilled water and lyophilized at 0.03-0.05 mbar during the day with the addition of 1% by weight of D-mannitol.

Количество производного альфа-гидроксибензолпропановой кислоты, включенного в состав наночастиц, определяют с помощью ВЭЖХ. Для определения концентрации производного альфа-гидроксибензолпропановой кислоты в полученном растворе используют хроматографическую систему высокого давления фирмы Waters W1525 с УФ-детектором Waters 2487 DUAL ABSORB ANCEDETEC-TOR (США) и колонку Hypersil-ODS 4,6 × 150 mm, 5 μn, 100 A (Phenomenex). В качестве подвижной фазы используют 60-% раствор ацетонитрила в воде (по объему) с добавлением фосфорной кислоты до 0,1%, детекцию производят при длине волны 227 нм.The amount of the derivative of alpha-hydroxybenzenepropanoic acid included in the nanoparticles is determined by HPLC. To determine the concentration of the derivative of alpha-hydroxybenzenepropanoic acid in the resulting solution, a high pressure chromatographic system from Waters W1525 with a Waters 2487 DUAL ABSORB ANCEDETEC-TOR UV detector (USA) and a Hypersil-ODS column 4.6 × 150 mm, 5 μn, 100 A are used (Phenomenex). A 60% solution of acetonitrile in water (by volume) with the addition of phosphoric acid to 0.1% is used as the mobile phase; detection is performed at a wavelength of 227 nm.

Пример 4. Получение лекарственной формы (ЛФ) конъюгата полимерных частиц, содержащих цитостатический препарат, с рекомбинантным белком r3D AFP («Паклитаксел-НК»)Example 4. Obtaining a dosage form (DF) of a conjugate of polymer particles containing a cytostatic drug with a recombinant protein r3D AFP ("Paclitaxel-NK")

К 8 г полимерных частиц, полученных в примере 3, заранее отмытых от избытка поверхностно-активного вещества, растворенных в 1*PBS, добавляют водорастворимый карбодиимид и NHS (концентрация растворов 50 мг/мл в 1*PBS), затем к реакционной смеси добавляют 2-меркаптоэтанол, после чего к активированным полимерным частицам добавляют рекомбинантный белок r3D AFP не менее чем в 7-кратном недостатке в отношении активированных карбоксильных групп и доводят рН реакционной смеси до щелочных значений (от 7.4 до 9). Для остановки реакции вводят этаноламин (или любого аминопроизводного с аналогичными свойствами), после чего реакционную смесь очищают с использованием гель-экслюзионной хроматографии на колонке с носителем Sephadex G-25 с полным разделением продуктов реакции, и тем самым, выделением целевого продукта в чистом виде. Далее фракцию с очищенным продуктом реакции лиофилизируют с добавлением криопротектора (1 масс. %) в течение суток, после чего хранят в виде лиофилизата при -70С. Выход целевого продукта составляет не менее 7 г лиофилизата лекарственной формы.To 8 g of polymer particles obtained in example 3, previously washed from excess surfactant dissolved in 1 * PBS, add water-soluble carbodiimide and NHS (concentration of solutions 50 mg / ml in 1 * PBS), then add 2 -mercaptoethanol, after which the recombinant protein r3D AFP is added to the activated polymer particles in at least 7-fold deficiency with respect to activated carboxyl groups and the pH of the reaction mixture is adjusted to alkaline values (from 7.4 to 9). To stop the reaction, ethanolamine (or any amino derivative with similar properties) is introduced, after which the reaction mixture is purified using gel exclusion chromatography on a column with a Sephadex G-25 carrier with complete separation of the reaction products, and thus, the isolation of the target product in pure form. Next, the fraction with the purified reaction product is lyophilized with the addition of a cryoprotectant (1 wt%) for a day, after which it is stored as a lyophilisate at -70C. The yield of the target product is at least 7 g of the lyophilisate of the dosage form.

Количество производного альфа-гидроксибензолпропановой кислоты, в составе лиофилизата лекарственной формы, определяют с помощью ВЭЖХ. Для определения концентрации производного альфа-гидроксибензолпропановой кислоты используют хроматографическую систему высокого давления фирмы Waters W1525 с УФ-детектором Waters 2487 DUALАВSORBANCEDETECTOR (США) и колонку Hypersil-ODS 4,6 × 150 mm, 5 μm, 100 A (Phenomenex). В качестве подвижной фазы используют 60-% раствор ацетонитрила в воде (по объему) с добавлением фосфорной кислоты до 0,1%, детекцию производят при длине волны 227 нм.The amount of alpha-hydroxybenzenepropanoic acid derivative in the lyophilisate of the dosage form is determined by HPLC. To determine the concentration of the derivative of alpha-hydroxybenzenepropanoic acid, a Waters W1525 high pressure chromatographic system with a Waters 2487 DUALABSORBANCEDETECTOR UV detector (USA) and a Hypersil-ODS 4.6 × 150 mm, 5 μm, 100 A column (Phenomenex) are used. A 60% solution of acetonitrile in water (by volume) with the addition of phosphoric acid to 0.1% is used as the mobile phase; detection is performed at a wavelength of 227 nm.

Количество r3D AFP в составе лиофилизата лекарственной формы определяют с помощью SDS-PAGE электрофореза в восстанавливающих и не восстанавливающих условиях.The amount of r3D AFP in the lyophilisate of the dosage form is determined by SDS-PAGE electrophoresis under reducing and non-reducing conditions.

Пример 5. Исследование интернализации ЛФ «Паклитаксел-НК» опухолевыми клетками in vitroExample 5. Study of the internalization of LF "Paclitaxel-NK" by tumor cells in vitro

Связывание с поверхностью и интернализацию ЛФ исследовали с помощью проточной цитометрии. Для исследования интернализации наряду с обычной была использована ЛФ «Паклитаксел-НК», содержащая ФИТЦ-меченный рекомбинантный белок r3D AFP - r3D AFP-ФИТЦ (ЛФ-ФИТЦ). В качестве контрольных клеток, на поверхности которых рецепторы AFP отсутствуют, использовали мононуклеарные лейкоциты периферической крови человека. В качестве конкурентных ингибиторов связывания с рецептором АФП использовали r3D AFP-ФИТЦ и немодифицированные частицы, на основе которых получают ЛФ. Для исследования к суспензии клеток добавляли ЛФ-ФИТЦ, смесь ЛФ и r3D AFP-ФИТЦ (молярное соотношение 1 к 1), смесь ЛФ и r3D AFP-ФИТЦ (молярное соотношение 10 к 1), смесь ЛФ-ФИТЦ и полимерных частиц (массовое отношение ЛФ-ФИТЦ и частиц 1 к 1), смесь ЛФ-ФИТЦ и полимерных частиц (массовое отношение ЛФ-ФИТЦ и частиц 1 к 10) и инкубировали в течение 1 ч при 37°С (интернализация) или при 4°С (связывание с поверхностью).Surface binding and internalization of Lf were investigated using flow cytometry. To study internalization, along with the usual LF "Paclitaxel-NK" was used, containing FITC-labeled recombinant protein r3D AFP - r3D AFP-FITC (LF-FITC). Human peripheral blood mononuclear leukocytes were used as control cells on the surface of which AFP receptors are absent. As competitive inhibitors of binding to the AFP receptor, r3D AFP-FITC and unmodified particles were used, on the basis of which Lf was obtained. For the study, LF-FITC, a mixture of LF and r3D AFP-FITC (molar ratio 1 to 1), a mixture of LF and r3D AFP-FITC (molar ratio 10 to 1), a mixture of LF-FITC and polymer particles (mass ratio LF-FITC and particles 1 to 1), a mixture of LF-FITC and polymer particles (mass ratio of LF-FITC and particles 1 to 10) and incubated for 1 h at 37 ° C (internalization) or at 4 ° C (binding with surface).

По способности влиять на специфическую интернализацию ЛФ «Паклитаксел-НК», судят о ее способности взаимодействовать с рецептором АФП, то есть способности выполнять специфическое фармакологическое действие. Об уровне интернализации свидетельствуют средние значения флуоресценции клеток, инкубированных с образцами [17].According to the ability to influence the specific internalization of the LF "Paclitaxel-NK", it is judged about its ability to interact with the AFP receptor, that is, the ability to perform a specific pharmacological action. The level of internalization is evidenced by the average values of fluorescence of cells incubated with samples [17].

Из представленных на Фиг. 2 данных видно, что флуоресцентно меченая форма ЛФ (ЛФ-ФИТЦ) связывается с поверхностью и интернализуется всеми линиями клеток, за исключением контрольной. При этом добавление немеченой формы ЛФ к r3D AFP-ФИТЦ в эквимолярных по белку количествах или 10-кратном избытке, нарушало связывание и поступление последней в опухолевые клетки. Добавление избытка полимерных частиц к растворам r3D AFP-ФИТЦ и ЛФ-ФИТЦ не нарушало их поступления в опухолевые клетки.As shown in FIG. 2 data shows that the fluorescently labeled form of Lf (Lf-FITC) binds to the surface and is internalized by all cell lines, except for the control. At the same time, the addition of an unlabeled form of Lf to r3D AFP-FITC in amounts equimolar in protein or a 10-fold excess, disrupted the binding and entry of the latter into tumor cells. The addition of excess polymer particles to r3D AFP-FITC and LF-FITC solutions did not interfere with their entry into tumor cells.

Пример 6. Исследование цитотоксической активности ЛФ «Паклитаксел-НК» в отношении опухолевых клеток in vitroExample 6. Study of the cytotoxic activity of LF "Paclitaxel-NK" against tumor cells in vitro

Цитотоксическую активность ЛФ «Паклитаксел-НК» оценивали с помощью МТТ-теста по методу Mosmann после 72 ч инкубации клеток SKOV3, SKVLB, Р388/РТХ, опухоли яичника крыс штамма ОЯ и мононуклеарных лейкоцитов периферической крови с ЛФ и препаратом сравнения - субстанцией паклитаксела [18].The cytotoxic activity of Paclitaxel-NK LF was assessed using the MTT test according to the Mosmann method after 72 h of incubation of SKOV3, SKVLB, P388 / PTX cells, rat ovarian tumors of the OY strain, and peripheral blood mononuclear leukocytes with Lf and a reference drug - paclitaxel substance [18 ].

По цитотоксической активности ЛФ (выраженной в значении IC50 (концентрация агента при которой происходит ингибирование роста клеток на 50%)) в отношении опухолевых клеток судят о потенциальном специфическом и противоопухолевом эффекте in vivo.The cytotoxic activity of Lf (expressed as an IC50 value (the concentration of the agent at which cell growth is inhibited by 50%)) on tumor cells is judged on the potential specific and antitumor effect in vivo.

Цитотоксическую активность конъюгата оценивали с помощью МТТ-теста после 72 ч инкубации клеток SKOV3, SKVLB, Р388/РТХ, опухоли яичника крыс штамма ОЯ и лимфоцитов периферической крови человека с ЛФ «Паклитаксел-НК» и препаратом сравнения - субстанция паклитаксела, Фиг. 3.The cytotoxic activity of the conjugate was assessed using the MTT test after 72 h of incubation of SKOV3, SKVLB, P388 / PTX cells, rat ovarian tumors of the OY strain and human peripheral blood lymphocytes with Paclitaxel-NK LF and the reference drug paclitaxel substance, Fig. 3.

В целом, ЛФ и препарат сравнения проявляли схожий уровень цитотоксической активности, в частности в отношении клеток линий SKOV3 и Р388/PТХ, а также лимфоцитов. При этом следует отметить, что ЛФ проявляла значительно более высокий (IC50 73 нМ) уровень активности в отношении устойчивой линии SKVLB, ведение которой осуществлялось в присутствие поддерживающей концентрации паклитаксела, в отличие от препарата сравнения (IC50 312 нМ). Аналогичная, но менее выраженная картина была характерна в отношении клеток штамма ОЯ (IC50 ЛФ 59 нМ, IC50 препарата сравнения 196 нМ).In general, Lf and the reference drug exhibited a similar level of cytotoxic activity, in particular, against SKOV3 and P388 / PTX cells, as well as lymphocytes. It should be noted that Lf exhibited a significantly higher (IC50 73 nM) level of activity against the resistant SKVLB line, which was administered in the presence of a maintenance concentration of paclitaxel, in contrast to the reference drug (IC50 312 nM). A similar, but less pronounced picture was characteristic of cells of the OJ strain (IC50 Lf 59 nM, IC50 of the reference drug 196 nM).

Пример 7. Исследование специфической фармакологической активности ЛФ «Паклитаксел-НК» in vivoExample 7. Investigation of the specific pharmacological activity of "Paclitaxel-NK" LF in vivo

Изучение специфического фармакологического действия ЛФ «Паклитаксел-НК» проводили на самках мышей линий DBA/2 с привитой подкожно линией опухолевых клеток Р388/РТХ (1*106 кл/мышь), на ксенотрансплантатах клеток аденокарциномы яичника человека линии SKOV3 на самках мышей линии BALB/c nude, а также асцитной модели опухоли яичника крыс штамма ОЯ на самках крыс линии Wistar в 2-х дозах: ТД (терапевтическая доза) (24.57 мг/кг) и МПД (максимально переносимая доза) (245.7 мг/кг) при в/в введении (для крыс) и ТД (0.92 мг/кг) и МПД (9.2 мг/кг) при в/в введении (для мышей), определенных в ходе эксперимента по изучению острой токсичности ЛФ «Паклитаксел-НК» на крысах линии Wistar и мышах линии BALB/c.The study of the specific pharmacological action of the "Paclitaxel-NK" LF was carried out on female DBA / 2 mice with subcutaneously inoculated P388 / PTX tumor cell line (1 * 106 cells / mouse), on xenografts of human ovarian adenocarcinoma cells of the SKOV3 line on female BALB / mice c nude, as well as an ascites model of an ovarian tumor of the OY strain on female Wistar rats in 2 doses: TD (therapeutic dose) (24.57 mg / kg) and MTD (maximum tolerated dose) (245.7 mg / kg) with i.v. in the introduction (for rats) and TD (0.92 mg / kg) and MTD (9.2 mg / kg) with intravenous administration (for mice), determined during the experiment to study the acute toxicity of the drug "Paclitaxel-NK" on Wistar rats and BALB / c mice.

Частота введения препарата (1 раз в 5 суток) была подобрана исходя из данных полученных в ходе изучения фармакокинетики ЛФ «Паклитаксел-НК», а также в ходе изучения высвобождения паклитаксела. Опытным группам крыс внутривенно вводилась ЛФ «Паклитаксел-НК» в дозе в соответствующих для крыс или мышей ТД и МПД с периодичностью введения - одно внутривенное введение в 5 дней (3-х кратно). Препарат сравнения - субстанция паклитаксела, вводился в/в в аналогичных ТД и МПД дозах, рассчитанных по содержанию паклитаксела в ЛФ «Паклитаксел-НК» с периодичностью введения - одно внутривенное введение в 5 дней. Препараты вводились животным в виде суспензии в стерильном растворе натрия хлорида 0.9% для инъекций внутривенно с помощью одноразового шприца. Максимальный объем однократного введения не превышал 0.2 мл при внутривенном введении мышам и 0.5 мл при внутривенном введении крысам. В качестве контроля использовались животные с введением стерильного раствора натрия хлорида 0.9% для инъекций. Для каждого эксперимента было сформировано по 5 групп из самок крыс или мышей.The frequency of administration of the drug (1 time in 5 days) was selected based on the data obtained during the study of the pharmacokinetics of the drug "Paclitaxel-NK", as well as during the study of the release of paclitaxel. Experimental groups of rats were injected intravenously with LF "Paclitaxel-NK" in a dose corresponding to rats or mice TD and MTD with the frequency of administration - one intravenous injection every 5 days (3 times). The reference drug - paclitaxel substance, was injected intravenously in doses similar to TD and MTD, calculated by the paclitaxel content in the “Paclitaxel-NK” formulation with the frequency of administration - one intravenous injection every 5 days. The drugs were administered to animals in the form of a suspension in a sterile solution of sodium chloride 0.9% for injection intravenously using a disposable syringe. The maximum volume of a single injection did not exceed 0.2 ml when administered intravenously to mice and 0.5 ml when administered intravenously to rats. As a control, animals were used with the introduction of a sterile solution of sodium chloride 0.9% for injection. For each experiment, 5 groups of female rats or mice were formed.

В ходе исследований регистрировали продолжительность жизни экспериментальных животных, а также динамику формирования опухоли (при подкожной трансплантации).In the course of the studies, the lifespan of experimental animals was recorded, as well as the dynamics of tumor formation (with subcutaneous transplantation).

Расчет увеличения продолжительности жизни проводится по окончании исследования и гибели всех животных. Определяется средняя продолжительность жизни (СПЖ, дни) в группе и вычисляется показатель увеличения продолжительности жизни (УПЖ%) по формуле:The calculation of the increase in life expectancy is carried out at the end of the study and the death of all animals. The average life expectancy (life expectancy, days) in the group is determined and the indicator of the increase in life expectancy (life expectancy%) is calculated using the formula:

УПЖ% = (СПЖ_опыт - СПЖ_Конт)/СПЖ_конт × 100.ILS% = (ALS _experience - _Cont ALS) / ALS _pin × 100.

Количественные критерии активности:Quantitative activity criteria:

УПЖ% <25% 0UPL% <25% 0

УПЖ% 25-60% ±UPZh% 25-60% ±

УПЖ% 61-100% +UPZH% 61-100% +

УПЖ% 101-200% или 61-100% при однократном введении ++DL% 101-200% or 61-100% with a single injection ++

УПЖ% >100 + Излечение <50% или 101-200% при однократном введении +++DL%> 100 + Recovery <50% or 101-200% with a single dose +++

УПЖ% >200 + Излечение >50% или <50% при однократном введении +++.DL%> 200 + Recovery> 50% or <50% with a single dose +++.

Влияние на динамику роста опухолей для модели на основе линии Р388/РТХ рассчитывали по формуле:The effect on the dynamics of tumor growth for the model based on the P388 / PTX line was calculated using the formula:

ТРО% = (V_конт - V_опыт)/V_конт × 100;TPO% = (V _contact - V _experience ) / V _contact × 100;

для модели на основе линии SKOV3 (для сформированных опухолей, поскольку суспензию клеток вводят совместно с белками межклеточного матрикса) по формуле:for a model based on the SKOV3 line (for formed tumors, since the cell suspension is injected together with extracellular matrix proteins) according to the formula:

T/C% = V_опыт/V_конт × 100;T / C% = V _experience / V _cont × 100;

где V - средний объем опухоли (мм³ или см³) в получавшей препарат и контрольной группах, соответственно, на конкретный срок; Т - леченая группа; С - контрольная группа, Т/С - величина, обратная ТРО, используется в случаях, когда имеется стимуляция роста опухоли и во всех случаях лечения развившейся опухоли.where V is the average tumor volume (mm ³ or cm ³ ) in the treated and control groups, respectively, for a specific period; T - treated group; C - control group, T / C - inverse TPO, used in cases where there is stimulation of tumor growth and in all cases of treatment of a developed tumor.

ТРО и Т/С рассчитываются на 1, 7 и 14 сутки после окончания лечения.TPO and T / S are calculated on the 1st, 7th and 14th days after the end of treatment.

Количественные критерии оценки ингибирующего эффекта на опухолях животных:Quantitative criteria for assessing the inhibitory effect on animal tumors:

ТРО <20% 0SRW <20% 0

ТРО 20-80% ±TPO 20-80% ±

ТРО 51-80% +SRW 51-80% +

ТРО 81-90%++TPO 81-90% ++

ТРО 91-100% + <50% ПР/излечения +++TPO 91-100% + <50% PR / cure +++

ТРО 91-100% + >50% ПР/излечения ++++.TPO 91-100% +> 50% PR / cure ++++.

Количественные критерии оценки активности на ксенографтах опухолей человека:Quantitative criteria for assessing activity on xenografts of human tumors:

Т/С 51-100% 0T / S 51-100% 0

Т/С 36-50% +T / S 36-50% +

Т/С 21-35% ++T / C 21-35% ++

Т/С 6-20% +++T / S 6-20% +++

Т/С <5% ++++.T / C <5% ++++.

Модель на основе лимфолейкоза мыши линии Р388/РТХModel based on P388 / PTX mouse lymphocytic leukemia

Для выявления противоопухолевого эффекта ЛФ «Паклитаксел-НК» и препарата сравнения использовали модель солидного лимфолейкоза мышей DBA/2 линии Р388/РТХ линии при 3-х кратном введении препаратов (1 раз в 5 дней) в ТД и МПД. Клетки линии Р388/РТХ прививали подкожно (1*10⁶ кл/100 мкл). Лечение начинали через сутки после прививки опухолей. В ходе введения препаратов животные чувствовали себя хорошо, признаков интоксикации не выявлено.To reveal the antitumor effect of Paclitaxel-NK LF and the reference drug, we used a model of solid lymphocytic leukemia in DBA / 2 mice of the P388 / PTX line with 3-fold administration of drugs (1 time in 5 days) in TD and IVD. P388 / PTX cells were inoculated subcutaneously (1 * 10 ⁶ cells / 100 μl). Treatment began one day after tumor inoculation. During the administration of the drugs, the animals felt good, no signs of intoxication were found.

СПЖ контрольной группы животных составила 17.2 суток. В группе, получавшей препарат сравнения - субстанцию паклитаксела в ТД, наблюдалось УПЖ на 18%, в группе, получавшей МПД - на 12.8%. В группе, получавшей ЛФ в МПД наблюдалось УПЖ на 33.7%. Наиболее значимый эффект наблюдался в группе, получавшей ЛФ в ТД - УПЖ составило 60.5%.The life expectancy of the control group of animals was 17.2 days. In the group that received the comparison drug - the substance of paclitaxel in TD, there was an increase in life expectancy by 18%, in the group receiving IVD - by 12.8%. In the group receiving LF in the IVD, there was a 33.7% life cycle. The most significant effect was observed in the group that received LF in TD - UPL was 60.5%.

Показатели ТРО приведены в таблице 1.SRW indicators are given in Table 1.

Таким образом, наиболее выраженным противоопухолевым действием обладала ЛФ «Паклитаксел-НК» в ТД как по показателю УПЖ, так и ТРО.Thus, the most pronounced antitumor effect was possessed by LF "Paclitaxel-NK" in TD, both in terms of UPL and TPO.

Модель на основе опухоли яичника крыс штамма ОЯA model based on a rat ovarian tumor, strain OJ

Для выявления противоопухолевого эффекта ЛФ «Паклитаксел-НК» и препарата сравнения использовали модель опухоли яичника штамма ОЯ на крысах линии Wistar при 3-х кратном введении препаратов (1 раз в 5 дней) в ТД и МПД. Поскольку данный штамм не способен формировать солидную опухоль при подкожном введении, но при этом отличается быстрым развитием и экспрессией рецептора АФП, клетки штамма ОЯ прививали внутрибрюшинно (10*10⁶ кл/100 мкл). Лечение начинали на вторые сутки после прививки опухолей. В ходе введения препаратов животные чувствовали себя хорошо, признаков интоксикации не выявлено.To reveal the antitumor effect of the LF "Paclitaxel-NK" and the reference drug, we used a model of an ovarian tumor of the OY strain in Wistar rats with 3-fold administration of drugs (1 time in 5 days) in the TD and IVD. Since this strain is not capable of forming a solid tumor when administered subcutaneously, but at the same time is characterized by the rapid development and expression of the AFP receptor, the cells of the OO strain were inoculated intraperitoneally (10 * 10 ⁶ cells / 100 μl). Treatment began on the second day after tumor inoculation. During the administration of the drugs, the animals felt good, no signs of intoxication were found.

СПЖ контрольной группы животных составила 9.6 суток. В группе, получавшей препарат сравнения - субстанцию паклитаксела в ТД, наблюдалось УПЖ на 19.8%, в группе, получавшей МПД - на 11.4%. В группе, получавшей ЛФ в ТД наблюдалось УПЖ на 76%. Наиболее выраженный эффект наблюдался в группе, получавшей ЛФ в МПД - УПЖ составило 81.2%.The life expectancy of the control group of animals was 9.6 days. In the group receiving the comparison drug - the substance of paclitaxel in TD, there was an increase in life expectancy by 19.8%, in the group receiving IVD - by 11.4%. In the group receiving LF in TD, there was a 76% life cycle. The most pronounced effect was observed in the group that received LF in the IVD - the LF was 81.2%.

Таким образом, наиболее выраженным противоопухолевым действием по показателю УПЖ обладала ЛФ «Паклитаксел-НК» в МПД.Thus, LF "Paclitaxel-NK" in the IVD had the most pronounced antitumor effect in terms of UPL.

Модель на основе аденокарциномы яичника человека линии SKOV3Human Ovarian Adenocarcinoma Model SKOV3

Для выявления противоопухолевого эффекта ЛФ «Паклитаксел-НК» и препарата сравнения использовали модель подкожных ксенотрансплантатов клеток аденокарциномы яичника человека линии SKOV3 иммунодефицитным мышам линии BALB/cnude при 3-х кратном введении препаратов (1 раз в 5 дней) в ТД и МПД. Клетки линии SKOV3 прививали подкожно в виде суспензии в смеси белков внеклеточного матрикса (Matrigel) (1.5*10⁶ кл/100 мкл/мышь). Лечение начинали на вторые сутки после прививки опухолей. В ходе введения препаратов животные чувствовали себя хорошо, признаков интоксикации не выявлено.To reveal the antitumor effect of Paclitaxel-NK LF and the reference drug, a model of subcutaneous xenografts of human ovarian adenocarcinoma cells of the SKOV3 line to immunodeficient BALB / cnude mice with 3-fold administration of drugs (1 time in 5 days) in TD and IVD was used. SKOV3 cell line was inoculated subcutaneously as a suspension in a mixture of proteins of the extracellular matrix (Matrigel) (1.5 * June ¹⁰ cells / 100 ul / mouse). Treatment began on the second day after tumor inoculation. During the administration of the drugs, the animals felt good, no signs of intoxication were found.

СПЖ контрольной группы животных составила 33.3 суток. В группе, получавшей препарат сравнения - субстанцию паклитаксела в ТД, наблюдалось УПЖ на 9.9%, в группе, получавшей МПД - на 2.7%. В группе, получавшей ЛФ в МПД наблюдалось УПЖ на 39.6%. Наиболее значимый эффект наблюдался в группе, получавшей ЛФ в ТД - УПЖ составило 54%.The life expectancy of the control group of animals was 33.3 days. In the group that received the comparison drug - the substance of paclitaxel in TD, there was an increase in life expectancy by 9.9%, in the group receiving IVD - by 2.7%. In the group that received LF in the IVD, the LF was observed by 39.6%. The most significant effect was observed in the group receiving LF in TD - UPI was 54%.

Показатели Т/С% приведены в таблице 2.Indicators T / C% are shown in table 2.

Таким образом наиболее выраженным противоопухолевым действием по параметру УПЖ обладала ЛФ «Паклитаксел-НК» в ТД, обладая при этом наиболее высокими значениями Т/С% на 1-ые и 7-ые сутки измерения. В то же самое время, ЛФ в МПД проявляла наибольшее значение Т/С% на 14-ые сутки измерения.Thus, LF "Paclitaxel-NK" in TD had the most pronounced antitumor effect on the UPL parameter, while having the highest T / C% values on the 1st and 7th days of measurement. At the same time, LF in IVD showed the highest T / C% value on the 14th day of measurement.

Противоопухолевый препарат применяется путем введения пациентам с аденокарциномой яичника в форме стерильной суспензии в водно-солевом растворе (физраствор) внутривенно, под контролем уровня лейкоцитов периферической крови, курсами до элиминации злокачественных образований.The anticancer drug is used by administration to patients with ovarian adenocarcinoma in the form of a sterile suspension in an aqueous saline solution (saline) intravenously, under the control of the level of peripheral blood leukocytes, courses until the elimination of malignant tumors.

Таким образом, предложенный противоопухолевый препарат обладает повышенной эффективностью относительно известных препаратов аналогичного назначения.Thus, the proposed antitumor drug has increased efficiency relative to known drugs for similar purposes.

Предложенный противоопухолевый препарат проявляет более высокую противоопухолевую активность по сравнению со свободным паклитакселом в отношении клеток линии SKVLB, резистентной к антрациклиновым антибиотикам, и опухолевым клеткам штамма ОЯ, поскольку лекарственное средство проникает внутрь резистентных MDR1+, минуя действие трансмембранных MDR-насосов. Более того, ЛФ «Паклитаксел-НК» проявляет более высокую, в сравнении со свободным паклитакселом, специфическую фармакологическую активность (выраженную в показателях УПЖ%, ТРО% и ТС%) in vitro на моделях аденокарциномы яичника крыс штамма ОЯ, модели устойчивого к паклитакселу лимфолейкоза мешей линии Р388/РТХ и модели ксенотрансплантатов линии SKOV3.The proposed antitumor drug exhibits a higher antitumor activity compared to free paclitaxel against SKVLB cells resistant to anthracycline antibiotics and tumor cells of the OY strain, since the drug penetrates into resistant MDR1 +, bypassing the action of transmembrane MDR pumps. Moreover, the LF "Paclitaxel-NK" exhibits a higher, in comparison with free paclitaxel, specific pharmacological activity (expressed in terms of UPL%, TPO% and TC%) in vitro on models of rat ovarian adenocarcinoma of the OY strain, a model of paclitaxel-resistant lymphocytic leukemia meshes of the P388 / PTX line and the xenograft model of the SKOV3 line.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫLIST OF REFERENCES

1. FarokhzadO.C. Targeted nanoparticle-aptamerbioconjugates for cancer chemotherapy in vivo / Farokhzad O.C., Cheng J., Teply B.A., Sherifi I., Jon S., Kantoff P.W. // Proceedings of the National Academy of Sciences - 103 (16) - 2006- P. 6315-63201. FarokhzadO.C. Targeted nanoparticle-aptamerbioconjugates for cancer chemotherapy in vivo / Farokhzad O.C., Cheng J., Teply B.A., Sherifi I., Jon S., Kantoff P.W. // Proceedings of the National Academy of Sciences - 103 (16) - 2006- P. 6315-6320

2. Hitesh Kulhari. Peptide conjugated polymeric nanoparticles as a carrier for targeted delivery of docetaxel / Hitesh Kulhari, Deep Pooja, ShwetaShrivastava et al. // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 117 - 2014- P. 166-1732. Hitesh Kulhari. Peptide conjugated polymeric nanoparticles as a carrier for targeted delivery of docetaxel / Hitesh Kulhari, Deep Pooja, ShwetaShrivastava et al. // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 117 - 2014- P. 166-173

3. Li Wang. Monoclonal antibody targeting MUC1 and increasing sensitivity to docetaxel as a novel strategy in treating human epithelial ovarian cancer / Li Wang, Hongmin Chen, Fen-gHua Liu et al. // Cancer Letters - 2011 - Volume 300 - Issue 2, 28 - P. 122-1333. Li Wang. Monoclonal antibody targeting MUC1 and increasing sensitivity to docetaxel as a novel strategy in treating human epithelial ovarian cancer / Li Wang, Hongmin Chen, Fen-gHua Liu et al. // Cancer Letters - 2011 - Volume 300 - Issue 2, 28 - P. 122-133

4. Моro R., Tcherkassova J., Song E. et al. // IVD Technology Magazine - 2005. - Vol. 11 - №54. Moro R., Tcherkassova J., Song E. et al. // IVD Technology Magazine - 2005. - Vol. 11 - No. 5

5. Урманчеева А.Ф. Таксаны в оптимальной химиотерапии рака яичника / Урманчеева А.Ф. // Актуальные вопросы клинической онкологии - 2003 - N 10. - С. 47-505. Urmancheeva A.F. Taxanes in optimal chemotherapy for ovarian cancer / Urmancheeva A.F. // Actual issues of clinical oncology - 2003 - N 10. - P. 47-50

6. Kampan N. Paclitaxel and its evolving role in the management of ovarian cancer. / Kampan N.C., Madondo M.T., McNally O.M., Quinn M., Plebanski M. // Biomed Res Int. - 2015 - Vol 7. - 21 pages6. Kampan N. Paclitaxel and its evolving role in the management of ovarian cancer. / Kampan N.C., Madondo M.T., McNally O.M., Quinn M., Plebanski M. // Biomed Res Int. - 2015 - Vol 7. - 21 pages

7. Luo T. Synthesis and In Vitro Evaluation of Polyethylene Glycol-Paclitaxel Conjugates for Lung Cancer Therapy. / Luo T, Magnusson J, Preat V, Frederick R, Alexander C, Bosquillon C, Vanbever R. // Pharm. Res. - 2016. - Vol. 33 - Issue 7 - P. 1671-1687. Luo T. Synthesis and In Vitro Evaluation of Polyethylene Glycol-Paclitaxel Conjugates for Lung Cancer Therapy. / Luo T, Magnusson J, Preat V, Frederick R, Alexander C, Bosquillon C, Vanbever R. // Pharm. Res. - 2016. - Vol. 33 - Issue 7 - P. 1671-168

8. Tourlaki A. Paclitaxel as first or second-line treatment for HIV-negative Kaposi's sarcoma: a retrospective study of 58 patients. / Tourlaki A, Germiniasi F, Rossi L, Veraldi S, Brambilla L. // J Dermatolog Treat. - 2019. - Vol.21 - P. 1471-17538. Tourlaki A. Paclitaxel as first or second-line treatment for HIV-negative Kaposi's sarcoma: a retrospective study of 58 patients. / Tourlaki A, Germiniasi F, Rossi L, Veraldi S, Brambilla L. // J Dermatolog Treat. - 2019. - Vol.21 - P. 1471-1753

9. Bharadwaj R. Topical delivery of paclitaxel for treatment of skin cancer. / Bharadwaj R, Das PJ, Pal P, Mazumder B. // Drug Dev. Ind. Pharm. - 2016. - Vol. 42(9) - P. 1482-14949. Bharadwaj R. Topical delivery of paclitaxel for treatment of skin cancer. / Bharadwaj R, Das PJ, Pal P, Mazumder B. // Drug Dev. Ind. Pharm. - 2016. - Vol. 42 (9) - P. 1482-1494

10. Ai B. Paclitaxel targets VEGF-mediated angiogenesis in ovarian cancer treatment. // Bin Ai, ZhixinBie, Shuai Zhang, Ailing Li. // J Cancer Res. - 2016. - Vol. 6(8) - P. 1624-1635.10. Ai B. Paclitaxel targets VEGF-mediated angiogenesis in ovarian cancer treatment. // Bin Ai, ZhixinBie, Shuai Zhang, Ailing Li. // J Cancer Res. - 2016. - Vol. 6 (8) - P. 1624-1635.

11. Cortes J. Docetaxel. / Jorge E. Cortes, Richard Pazdur. // Journal of Clinical Oncology - 1995. - Vol 13. - No 10. - P. 2643-265511. Cortes J. Docetaxel. / Jorge E. Cortes, Richard Pazdur. // Journal of Clinical Oncology - 1995. - Vol 13. - No 10. - P. 2643-2655

12. Crown J. Docetaxel: overview of an active drug for breast cancer. / Crown J. // Oncologist- 2001. - Vol. 6 - P. 1-4.12. Crown J. Docetaxel: overview of an active drug for breast cancer. / Crown J. // Oncologist - 2001. - Vol. 6 - P. 1-4.

13. Li W. Overcoming ABC transporter-mediated multidrug resistance: Molecular mechanisms and novel therapeutic drag strategies. / Li W, Zhang H, Assaraf Y.G, Zhao K, Xu X, Xie J, Yang D.H, Chen Z.S. // Drug Resist Updat. - 2016. - Vol. 27 - P. 14-2913. Li W. Overcoming ABC transporter-mediated multidrug resistance: Molecular mechanisms and novel therapeutic drag strategies. / Li W, Zhang H, Assaraf Y.G, Zhao K, Xu X, Xie J, Yang D.H, Chen Z.S. // Drug Resist Updat. - 2016. - Vol. 27 - P. 14-29

14. Северин E.C. Новые подходы к избирательной доставке лекарственных препаратов в опухолевые клетки. / Северин Е.С. // Успехи химии. - 2015. - Т. 84. - С. 43-6014. Severin E.C. New approaches to the selective delivery of drugs to tumor cells. / Severin E.S. // Advances in chemistry. - 2015 .-- T. 84 .-- S. 43-60

15. Северин Е.С. Проблемы и перспективы современной противоопухолевой терапии / Северин Е.С., Родина А.В. // Успехи биологической химии. - 2000. - Т. 46. - С. 43-6415. Severin E.S. Problems and prospects of modern antitumor therapy / Severin E.S., Rodina A.V. // Advances in biological chemistry. - 2000. - T. 46. - S. 43-64

16. Nikolskaya E.D. Preparation of temozolomide-loaded polymer particles and study of their antitumor activity in models of glioma and melanoma. IE. D. Nikolskaya, O.A. Zhunina, E.A. Vasilenko, N.G. Yabbarov, O.G. Tereshchenko, M.B. Sokol, V.I. Popenko, E.S. Severin // Russian Journal of Bioorganic Chemistry. - 2017. - Vol.43. - No. 5. - P. 552-56016. Nikolskaya E.D. Preparation of temozolomide-loaded polymer particles and study of their antitumor activity in models of glioma and melanoma. IE. D. Nikolskaya, O.A. Zhunina, E.A. Vasilenko, N.G. Yabbarov, O.G. Tereshchenko, M.B. Sokol, V.I. Popenko, E.S. Severin // Russian Journal of Bioorganic Chemistry. - 2017. - Vol.43. - No. 5. - P. 552-560

17. Гороховец H.B. Противоопухолевый пептидный препарат на основе фрагмента альфа-фетопротеина, его конъюгат, фармацевтическая композиция и способ лечения гормонзависимых опухолей. / Гороховец Н.В., Дигтярь А.В. и др. // Пат. RU 2285537 С; заявлено, 05.04.2005; опубл. 20.10.2006.17. Gorokhovets H.B. Antineoplastic peptide preparation based on an alpha-fetoprotein fragment, its conjugate, pharmaceutical composition and a method for treating hormone-dependent tumors. / Gorokhovets N.V., Digtyar A.V. et al. // Pat. RU 2285537 C; declared, 04/05/2005; publ. 20.10.2006.

18. Mossman Т. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. / Mossman T. // J.Immunol. Meth. - 1983. - Vol.65. - No. 1-2. - P. 55-63.18. Mossman T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. / Mossman T. // J. Immunol. Meth. - 1983. - Vol.65. - No. 1-2. - P. 55-63.

--->--->

Перечень последовательностейSequence listing

<110><110> Открытое акционерное общество «Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения»Open Joint Stock Company "All-Russian Scientific Center for Molecular Diagnostics and Treatment" <120><120> Высокоэффективный способ получения
лекарственной формы адресного действия
для терапии злокачественных новообразованийHighly efficient method of obtaining
targeted dosage form
for the treatment of malignant neoplasms <140> <140> <141> <141> <160><160> 11 <210><210> SEQ ID NO : 1SEQ ID NO: 1 <211><211> 243243 <212><212> PRTPRT <213><213> Escherichia coliEscherichia coli <220><220> <221><221> <222><222> <223><223> <400><400> Met Gly Tyr Gln Glu Leu Leu Glu Lys Cys Phe Gln Thr Glu Asn Pro Leu Glu Cys Gln Asp Lys Gly Glu Glu Glu Leu Gln Lys Tyr Ile Gln Glu Ser Gln Ala Leu Ala Lys Arg Ser Cys Gly Leu Phe Gln Lys Leu Gly Glu Tyr Tyr Leu Gln Asn Ala Phe Leu Val Ala Tyr Thr Lys Lys Ala Pro Gln Leu Thr Ser Ser Glu Leu Met Ala Ile Thr Arg Lys Met Ala Ala Thr Ala Ala Thr Cys Cys Gln Leu Ser Glu Asp Lys Leu Leu Ala Cys Gly Glu Gly Ala Ala Asp Ile Ile Ile Gly His Leu Cys Ile Arg His Glu Met Thr Pro Val Asn Pro Gly Val Gly Gln Cys Cys Thr Ser Ser Tyr Ala Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ser Leu Val Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Pro Ala Phe Ser Asp Asp Lys Phe Ile Phe His Lys Asp Leu Cys Gln Ala Gln Gly Val Ala Leu Gln Thr Met Lys Gln Glu Phe Leu Ile Asn Leu Val Lys Gln Lys Pro Gln Ile Thr Glu Glu Gln Leu Glu Ala Val Ile Ala Asp Phe Ser Gly Leu Leu Glu Lys Cys Cys Gln Gly Gln Glu Gln Glu Val Cys Phe Ala Glu Glu Gly Gln Lys Leu Ile Ser Lys Thr Arg Ala Ala Leu Gly Val Leu Glu His His His His His HisMet Gly Tyr Gln Glu Leu Leu Glu Lys Cys Phe Gln Thr Glu Asn Pro Leu Glu Cys Gln Asp Lys Gly Glu Glu Glu Leu Gln Lys Tyr Ile Gln Glu Ser Gln Ala Leu Ala Lys Arg Ser Cys Gly Leu Phe Gln Lys Leu Gly Glu Tyr Tyr Leu Gln Asn Ala Phe Leu Val Ala Tyr Thr Lys Lys Ala Pro Gln Leu Thr Ser Ser Glu Leu Met Ala Ile Thr Arg Lys Met Ala Ala Thr Ala Ala Thr Cys Cys Gln Leu Ser Glu Asp Lys Leu Leu Ala Cys Gly Glu Gly Ala Ala Asp Ile Ile Ile Gly His Leu Cys Ile Arg His Glu Met Thr Pro Val Asn Pro Gly Val Gly Gln Cys Cys Thr Ser Ser Tyr Ala Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ser Leu Val Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Pro Ala Phe Ser Asp Asp Lys Phe Ile Phe His Lys Asp Leu Cys Gln Ala Gln Gly Val Ala Leu Gln Thr Met Lys Gln Glu Phe Leu Ile Asn Leu Val Lys Gln Lys Pro Gln Ile Thr Glu Glu Gln Leu Glu Ala Val Ile Ala Asp Phe Ser Gly Leu Leu Glu Lys Cys Cys Gln Gly Gln Glu Gln Glu Val Cys Phe Ala Glu Glu Gly Gln Lys Leu Ile Ser Lys Thr Arg Ala Ala Leu Gly Val Leu Glu His His His His His His

<---<---

Claims (3)

1. Противоопухолевое средство, представляющее собой полимерные частицы и включающее цитостатическое вещество, биодеградирующий полимер, криопротектор и векторную молекулу для адресной доставки частиц в пораженные органы и ткани, отличающееся тем, что в качестве цитостатического вещества содержит паклитаксел -4.5÷5.5 мас. %, в качестве биодеградирующего полимера - сополимер молочной и гликолевой кислот - 70.0÷72.1 мас. %, в качестве векторной молекулы для адресной доставки частиц в пораженные органы и ткани - С-концевой домен альфа-фетопротеина (r3D AFP) - 12.3÷13.3 мас. %, а в качестве криопротектора - D-маннитол -10.6÷10.7 мас. %.1. An antitumor agent, which is a polymer particle and includes a cytostatic substance, a biodegradable polymer, a cryoprotectant and a vector molecule for targeted delivery of particles to affected organs and tissues, characterized in that it contains paclitaxel -4.5 ÷ 5.5 wt. %, as a biodegradable polymer - a copolymer of lactic and glycolic acids - 70.0 ÷ 72.1 wt. %, as a vector molecule for targeted delivery of particles to affected organs and tissues - C-terminal domain of alpha-fetoprotein (r3D AFP) - 12.3 ÷ 13.3 wt. %, and as a cryoprotectant - D-mannitol -10.6 ÷ 10.7 wt. %. 2. Противоопухолевое средство по п. 1, характеризующееся тем, что в качестве цитостатического вещества содержит паклитаксел, включенный в сополимеры молочной и гликолевой кислот.2. An antitumor agent according to claim 1, characterized in that it contains paclitaxel included in copolymers of lactic and glycolic acids as a cytostatic substance. 3. Противоопухолевое средство по п. 1, характеризующееся тем, что представляет собой готовую лекарственную форму в виде стабильных полимерных частиц размером не более 275 нм с диапазоном распределения 150-550 нм, представляющую собой лиофилизат для парентерального введения.3. The antitumor agent according to claim 1, characterized in that it is a finished dosage form in the form of stable polymer particles with a size of not more than 275 nm with a distribution range of 150-550 nm, which is a lyophilisate for parenteral administration.

Images