RU2726207C1 - Method for combined measurement of concentration of peroxidase-positive cells (neutrophilic granulocytes) and sperm cells in human ejaculate using variations based on cytochemical staining - Google Patents
Method for combined measurement of concentration of peroxidase-positive cells (neutrophilic granulocytes) and sperm cells in human ejaculate using variations based on cytochemical staining Download PDFInfo
- Publication number
- RU2726207C1 RU2726207C1 RU2019136865A RU2019136865A RU2726207C1 RU 2726207 C1 RU2726207 C1 RU 2726207C1 RU 2019136865 A RU2019136865 A RU 2019136865A RU 2019136865 A RU2019136865 A RU 2019136865A RU 2726207 C1 RU2726207 C1 RU 2726207C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sperm
- ejaculate
- concentration
- goryaev
- cells
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
Область, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Изобретение относится к области медицины и может быть использовано при анализе биологических материалов, в частности для диагностики нарушений сперматогенеза и бесплодия в урологии, андрологии, онкологии при проведении функционального теста сперматозоидов для оценки их оплодотворяющей способности и для выявления этиопатогенеза патозооспермии.The invention relates to medicine and can be used in the analysis of biological materials, in particular for the diagnosis of disorders of spermatogenesis and infertility in urology, andrology, oncology during the functional test of spermatozoa to assess their fertilizing ability and to identify the etiopathogenesis of pathozoospermia.
Уровень техникиState of the art
Оценку и вычисление концентрации нейтрофильных гранулоцитов/пероксидазо-положительных лейкоцитов в эякуляте осуществляют помощью цитохимического окрашивания орто-толуидином (см. Руководство ВОЗ По исследованию и обработка эякулята человека. - издательство «КАПИТАЛ ПРИНТ», Москва, 2012, пятое издание, ISBN 978-5-905106-09-05 (раздел 2.18.1.5-1.7; рис. 2.14; 3.11).Assessment and calculation of the concentration of neutrophilic granulocytes / peroxidase-positive leukocytes in the ejaculate is carried out using cytochemical staining with ortho-toluidine (see the WHO Guidelines for the Study and Processing of Human Ejaculate. - CAPITAL PRINT Publishing House, Moscow, 2012, fifth edition, ISBN 978-5 -905106-09-05 (section 2.18.1.5-1.7; Fig. 2.14; 3.11).
Недостатки данного способа следующие:The disadvantages of this method are as follows:
1. отсутствует коммерчески доступный набор для окрашивания, реактив: как правило предлагается 6 реагентов, которые сложно купить в виду того, что они являются прекурсорами,1. there is no commercially available kit for staining, reagent: as a rule, 6 reagents are offered, which are difficult to buy in view of the fact that they are precursors,
2. сложно готовить к использованию, ввиду того, что современные лаборатории используют, как правило, исключительно готовые наборы реагентов и не имеет необходимого поверенного оборудования: весов, оборудования для титрования и тд.,2. It is difficult to prepare for use, due to the fact that modern laboratories use, as a rule, exclusively ready-made sets of reagents and do not have the necessary attorney equipment: scales, titration equipment, etc.,
3. используемый орто-толуидин является особо опасным канцерогеном, что обуславливает риск для здоровья персоналу,3. used ortho-toluidine is a particularly dangerous carcinogen, which causes a health risk to personnel,
4. результаты считают в усовершенствованном гемоцитометре Нейбауэра, который отсутствует на российском лабораторном рынке оборудования и расходных материалов с необходимым регистрационным удостоверением,4. the results are counted in an improved Neubauer hemocytometer, which is not available on the Russian laboratory market of equipment and supplies with the necessary registration certificate,
5. формула подсчета адаптирована к гемоцитометру Нейбауэра, что вызывает определенные трудности.5. The calculation formula is adapted to the Neubauer hemocytometer, which causes certain difficulties.
Известен способ оценки и вычисления концентрации нейтрофильных гранулоцитов(лейкоцитов)/пероксидазо-положительных клеток (ППК) в эякуляте. При его осуществлении используют полуколичественную оценку содержания лейкоцитов в эякуляте на тест-полоске с помощью иммунохроматографического метода, основанного на ферментативной активности лейкоцитарной эстеразы (без цитохимического окрашивания) (см. В.В. Долгов, С.А. Луговская, Н.Д. и др. Лабораторная диагностика мужского бесплодия. - М. - Тверь: ООО «Издательство «Триада», 2006. - 145 с., 199 ил., 5-94789-144-1. Стр. 70).A known method for assessing and calculating the concentration of neutrophilic granulocytes (leukocytes) / peroxidase-positive cells (PPC) in the ejaculate. In its implementation, a semi-quantitative assessment of the leukocyte content in the ejaculate on the test strip is used using the immunochromatographic method based on the enzymatic activity of leukocyte esterase (without cytochemical staining) (see V.V.Dolgov, S.A. Lugovskaya, N.D. and other Laboratory diagnosis of male infertility. - M. - Tver: LLC Triad Publishing House, 2006. - 145 p., 199 ill., 5-94789-144-1. Page 70).
Недостатки данного способа заключаются в следующем:The disadvantages of this method are as follows:
1. Способ позволяет осуществить только приблизительное определение концентрации и только нейтрофильных гранулоцитов/перокисидазо-положительных лейкоцитов в эякуляте,1. The method allows only an approximate determination of the concentration and only neutrophilic granulocytes / peroxidase-positive leukocytes in the ejaculate,
2. Не дает точного представления о наличии или отсутствии воспалительного процесса у мужчины.2. Does not give an accurate idea of the presence or absence of an inflammatory process in a man.
3. Метод определения - неколичественный (полуколичественный «на тест-полоске»: > или <1×106, что противоречит рекомендациям ВОЗ.3. The method of determination is non-quantitative (semi-quantitative “on the test strip”:> or <1 × 10 6 , which contradicts WHO recommendations.
4. Лейкоцитарная эстераза появляется в биожидкости при разрушении лейкоцитов, что может привести к ложноположительной диагностике (пиоспермии).4. Leukocyte esterase appears in the bioliquid during the destruction of leukocytes, which can lead to false positive diagnosis (pyospermia).
Известен способ количественной оценки содержания круглых клеток (нейтрофильных и других лейкоцитов, макрофагов, клеток сперматогенеза) (концентрации) без цитохимического окрашивания пероксидазо-положительных клеток/нейтрофильных гранулоцитов (лейкоцитов) в эякуляте (см. Е.Е. Братина. Протокол проведения спермиологического исследования. - Андрология и генитальная хирургия. - 2014, №1, с. 20).A known method for the quantitative assessment of the content of round cells (neutrophilic and other leukocytes, macrophages, spermatogenesis cells) (concentration) without cytochemical staining of peroxidase-positive cells / neutrophilic granulocytes (leukocytes) in the ejaculate (see EE Bratin. Protocol for conducting spermiological studies. - Andrology and genital surgery. - 2014, No. 1, p. 20).
Недостатки данного способа следующие.The disadvantages of this method are as follows.
1. Производится определение концентрации только круглых клеток (всех подряд), а не только нейтрофильных гранулоцитов/перокисидазо-положительных лейкоцитов в эякуляте.1. The concentration of only round cells (all in a row) is determined, and not only neutrophilic granulocytes / peroxidase-positive leukocytes in the ejaculate.
2. Метод не дает точного представления о наличии или отсутствии воспалительного процесса у мужчины.2. The method does not give an accurate idea of the presence or absence of an inflammatory process in a man.
3. Метод не приемлем для мониторинга содержания лейкоцитов в сперме.3. The method is not acceptable for monitoring the content of leukocytes in semen.
4. Идентификация лейкоцитов происходит путем субъективной оценки («на глаз») по косвенным идентификационным признакам, что не соответствует рекомендациям ВОЗ.4. The identification of leukocytes occurs by subjective assessment ("by eye") by indirect identification signs, which does not comply with WHO recommendations.
Известен способ определения концентрации сперматозоидов в 1 милилитре (мл) эякулята (см. Руководство ВОЗ По исследованию и обработка эякулята человека, издательство «КАПИТАЛ ПРИНТ», Москва, 2012, пятое издание, ISBN 978-5-905106-09-05 (раздел 2.7, 2.8.1, 2.8.4, стр. 34-47).A known method for determining the concentration of sperm in 1 milliliter (ml) of ejaculate (see WHO Guidelines for the study and treatment of human ejaculate, CAPITAL PRINT publishing house, Moscow, 2012, fifth edition, ISBN 978-5-905106-09-05 (section 2.7 , 2.8.1, 2.8.4, p. 34-47).
Недостатки данного способа следующие.The disadvantages of this method are as follows.
1. Вычисление концентрации осуществляется только сперматозоидов в 1 милилитре (мл) эякулята.1. The calculation of the concentration is carried out only sperm in 1 milliliter (ml) of ejaculate.
2. Подсчет проводят в усовершенствованном гемоцитометре Нейбауэра, которого нет на российском лабораторном рынке оборудования и расходных материалов с регистрационным удостоверением.2. Calculation is carried out in an improved Neubauer hemocytometer, which is not on the Russian laboratory market of equipment and supplies with a registration certificate.
3. Фиксация и разведение образца спермы происходит рабочим раствором, состоящим из сложной прописи химических веществ - прекурсоров (п. 2.7.5 руководства ВОЗ), которые не используются в современной клинико-диагностической лаборатории. Одним из таких прекурсоров является особо опасный канцероген - формалин.3. The fixation and dilution of the sperm sample occurs with a working solution consisting of a complex prescription of chemicals - precursors (paragraph 2.7.5 of the WHO guidelines), which are not used in a modern clinical diagnostic laboratory. One of these precursors is a particularly dangerous carcinogen - formalin.
4. Оценка требуемого разведения для дальнейшего подсчета концентрации сперматозоидов основана на сложных математических расчетах и адаптирована также к гемоцитометру Нейбауэра (Руководство ВОЗ, стр. 40-41 глава 2.8.1).4. Evaluation of the required dilution for further calculation of sperm concentration is based on complex mathematical calculations and is also adapted to the Neubauer hemocytometer (WHO Guide, pp. 40-41 chapter 2.8.1).
5. Все формулы для подсчета адаптированы к гемоцитометру Нейбауэра.5. All formulas for counting are adapted to the Neubauer hemocytometer.
Наиболее близким к заявляемому способу является способ измерения концентрации сперматозоидов в 1 милилитре (мл) эякулята, принятый в качестве прототипа (см. Е.Е. Братина. Протокол проведения спермиологического исследования. - Андрология и генитальная хирургия. - 2014, №1, с. 18-19).Closest to the claimed method is a method for measuring the concentration of spermatozoa in 1 milliliter (ml) of ejaculate, adopted as a prototype (see EE Bratina. Protocol for conducting spermiological studies. - Andrology and genital surgery. - 2014, No. 1, p. 18-19).
Согласно известному способу производят подготовку препарата, фиксацию эякулята, приготовление счетной камеры, заполнение окошек гемоцитометра эякулятом, осаждение сперматозоида в камере, определение количества больших квадратов, необходимых для подсчета сперматозоидов, измерение количества сперматозоидов в 1 миллилитре (мл) эякулята в препарате в камере Горяева и вынесение заключения.According to the known method, the preparation of the preparation is carried out, the ejaculate is fixed, the counting chamber is prepared, the ejaculate is filled in the hemocytometer windows, the sperm is deposited in the chamber, the number of large squares required for sperm counting is measured, the sperm count in 1 milliliter (ml) of ejaculate in the chamber and making an opinion.
Недостатки данного способа следующие.The disadvantages of this method are as follows.
1. Осуществляется только измерение концентрации сперматозоидов в 1 миллилитре (мл) эякулята.1. Only measurement of sperm concentration in 1 milliliter (ml) of ejaculate is carried out.
2. Фиксация и разведение образца спермы проводится несколькими рабочими растворами (50 г NaHCO3, 10 мл 36-40% раствора формальдегида (насыщенный раствор)). Один из них - прекурсор и является особо опасным канцерогеном формальдегидом. Фиксация физиологическим раствором долгая (до полной остановки подвижных клеток), что отражается на времени оборота теста в лаборатории/TAT (turn around time) и вносит дополнительные погрешности.2. The fixation and dilution of the sperm sample is carried out with several working solutions (50 g of NaHCO 3 , 10 ml of 36-40% formaldehyde solution (saturated solution)). One of them is a precursor and is a particularly dangerous carcinogen formaldehyde. The fixation with physiological saline is long (until the mobile cells completely stop), which is reflected in the laboratory turn-around time / TAT (turn around time) and introduces additional errors.
3. Оценка качества требуемого разведения для дальнейшего подсчета концентрации сперматозоидов многоэтапна и усложнена (с. 18: при приготовлении препарата (10 мкл, покровное стекло 22×22 мм), глубина препарата примерно 20 мкм. Используется специальный подсчет сперматозоидов в поле зрения для определения оптимального разведения. При диаметре поля зрения микроскопа (измерять объективом - микрометром) 500 мкм обнаружение 4 сперматозоидов в поле зрения примерно соответствует 1 млн/мл. Если диаметр поля зрения 250 мкм - 1 сперматозоид в поле зрения соответствует 1 млн/мл. В этом случае пользоваться табл. 2 следует после умножения количества обнаруженных сперматозоидов на 4).3. Evaluation of the quality of the required dilution for further calculation of sperm concentration is multi-stage and complicated (p. 18: when preparing the preparation (10 μl, coverslip 22 × 22 mm), the depth of the preparation is approximately 20 μm. A special sperm count is used in the field of view to determine the optimal With a microscope field of view diameter (measured with a micrometer lens) of 500 μm, the detection of 4 spermatozoa in the field of view approximately corresponds to 1 million / ml If the field of view diameter of 250 μm - 1 sperm in the field of view corresponds to 1 million / ml. Table 2 follows after multiplying the number of sperm detected by 4).
4. Этап определения количества больших квадратов, необходимых для подсчета сперматозоидов также усложняет процесс исследования, что отражается на ТАТ4. The step of determining the number of large squares required for sperm counting also complicates the research process, which is reflected in the TAT
Таким образом, известные способы являются низкоинформативными и малодостоверными, и соответственно стоит задача создания достоверной, простой, надежной и информативной методики анализа.Thus, the known methods are low informative and unreliable, and accordingly the task is to create a reliable, simple, reliable and informative analysis technique.
Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION
Изобретение направлено на решение задачи повышения диагностической достоверности.The invention is aimed at solving the problem of increasing diagnostic reliability.
Технический результат, достигаемый при использовании представленного способа, состоит в повышении диагностической точности результатов анализа, информативности и достоверности. Упрощается процесс подготовки и анализа биологического материала.The technical result achieved by using the presented method consists in increasing the diagnostic accuracy of the analysis results, information content and reliability. The process of preparation and analysis of biological material is simplified.
Технический результат достигается за счет того, что в способе исследования эякулята, включающем подготовку препарата для исследования и рабочего раствора, фиксацию эякулята, подготовку счетной камеры Горяева, осаждение клеток, определение количества больших квадратов, необходимых для подсчета лейкоцитов и сперматозоидов, подсчет количества лейкоцитов и сперматозоидов в эякуляте и вынесение заключения, используют единственный рабочий раствор для фиксации и разведения, который готовят путем размешивания проявителя и 10 мкл 30% перекиси водорода, препарат для исследования готовят путем помещения в пробирку эякулята и рабочего раствора при разведении по меньшей мере 1:10, перемешивают в течение 10 сек. и инкубируют при температуре 37 градусов в течение 30 минут, выполняют окрашивание эякулята раствором, включающим проявитель и 10 мкл 30% перекиси водорода, при этом сперматозоиды, клетки сперматогенеза, лимфоциты, моноциты, макрофаги, спермиофаги, гистиоциты, эритроциты, липоидные тельца, эпителии остаются бесцветными, выполняют окрашивание эякулята раствором эозина, 5% водный, и раствором нигрозина, 10% водный, при этом мертвые сперматозоиды окрашиваются в красный цвет, а живые остаются неокрашенными, выполняют окрашивание эякулята раствором из красителя азур-эозин по Романовскому и фиксатор-красителем эозин метиленовый синий по Май-Грюнвальду, при этом ядра клеток окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, цитоплазма гранулоцитов, эозинофилы, эритроциты окрашиваются в розовый цвет, головки сперматозоидов - в синий цвет с сиреневой или фиолетовой акросомальной частью, хвосты сперматозоидов - в нежно-сиреневый цвет, цитоплазматическая капля и шейка сперматозоида окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, заполняют препаратом две стороны счетной камеры Горяева для двукратного подсчета окрашенных лейкоцитов с последующим определением средней величины, удерживают счетную камеру Горяева в горизонтальном положении не менее 4 минут при комнатной температуре для осаждения клеток, и определяют концентрацию сперматозоидов в больших квадратах счетной камеры Горяева.The technical result is achieved due to the fact that in the method for the study of ejaculate, including the preparation of the drug for research and working solution, fixation of the ejaculate, preparation of the counting chamber of Goryaev, sedimentation of cells, determining the number of large squares required for counting leukocytes and sperm counts, counting the number of leukocytes and spermatozoa in the ejaculate and making a conclusion, use a single working solution for fixation and dilution, which is prepared by mixing the developer and 10 μl of 30% hydrogen peroxide, the preparation for the study is prepared by placing at least 1:10 in the tube of ejaculate and working solution in the tube, mix within 10 sec. and incubated at a temperature of 37 degrees for 30 minutes, the ejaculate is stained with a solution containing a developer and 10 μl of 30% hydrogen peroxide, while spermatozoa, spermatogenesis cells, lymphocytes, monocytes, macrophages, spermiophages, histiocytes, erythrocytes, lipoid bodies, epithelia colorless, the ejaculate is stained with a solution of eosin, 5% aqueous, and a nigrosin solution, 10% aqueous, while the dead spermatozoa are colored red, and the living remain unpainted, the ejaculate is stained with a solution of the azure-eosin stain according to Romanovsky and fixative dye eosin methylene blue according to May-Grunwald, with the nuclei of the cells staining blue-violet, the cytoplasm of granulocytes, eosinophils, erythrocytes staining pink, sperm heads blue with lilac or violet acrosomal part, sperm tails with soft lilac , cytoplasmic drop and sperm neck stained in blue-violet the second color, fill the drug with two sides of the Goryaev’s counting chamber for double counting of stained leukocytes with subsequent determination of the average value, hold the Goryaev’s counting chamber in a horizontal position for at least 4 minutes at room temperature to precipitate cells, and determine the sperm concentration in large squares of the Goryaev’s counting chamber.
Технический результат усиливается за счет того, что определение концентрации сперматозоидов в больших квадратах счетной камеры Горяева проводят, используя разведение в соответствии с предварительной визуальной оценкой.The technical result is enhanced due to the fact that the determination of sperm concentration in large squares of the counting chamber of Goryaev is carried out using dilution in accordance with a preliminary visual assessment.
При малом количестве круглых клеток, оцененном предварительной визуальной оценкой, количество лейкоцитов определяют в 100 больших квадратах камеры Горяева и расчет проводят по формуле:With a small number of round cells, evaluated by a preliminary visual assessment, the number of leukocytes is determined in 100 large squares of the Goryaev chamber and the calculation is carried out according to the formula:
L=(а×250×10×1000)/(100×1000000*) [млн/мл]L = (a × 250 × 10 × 1000) / (100 × 1,000,000 *) [mln / ml]
где L - количество лейкоцитов в 1 мл эякулята, а - количество лейкоцитов в 100 больших квадратах.where L is the number of leukocytes in 1 ml of ejaculate, and is the number of leukocytes in 100 large squares.
При большом количестве круглых клеток, оцененном предварительной визуальной оценкой, количество лейкоцитов определяют в 40 больших квадратах камеры Горяева и расчет проводят по формуле:With a large number of round cells, estimated by a preliminary visual assessment, the number of leukocytes is determined in 40 large squares of the Goryaev chamber and the calculation is carried out according to the formula:
L=(а×250×10×1000)/(40×1000000) [млн/мл]L = (a × 250 × 10 × 1000) / (40 × 1,000,000) [ppm]
где а - количество лейкоцитов в 40 больших квадратах, 250 - объем одного большого квадрата, 10 - степень разведения спермы, 1000-1000 мкл в 1 мл эякулята, 40 - количество больших квадратов.where a is the number of leukocytes in 40 large squares, 250 is the volume of one large square, 10 is the degree of dilution of sperm, 1000-1000 μl in 1 ml of ejaculate, 40 is the number of large squares.
При малом количестве сперматозоидов, оцененном предварительной визуальной оценкой, определение концентрации сперматозоидов осуществляют в той стороне камере Горяева, где были подсчитаны лейкоциты при разведении препарата 1:10.With a small number of sperm, estimated by a preliminary visual assessment, the determination of sperm concentration is carried out in that side of the Goryaev’s chamber, where the leukocytes were counted at a dilution of 1:10.
Определение концентрации сперматозоидов в 5 больших квадратах камеры Горяева, разделенных на 16 малых, по диагонали проводят по формуле:Determination of sperm concentration in 5 large squares of the Goryaev chamber, divided into 16 small ones, is carried out diagonally according to the formula:
С=а×500000 [млн/мл],C = a × 500,000 [ppm],
где С - концентрация сперматозоидов в 1 мл эякулята, а - количество сперматозоидов в 5 больших квадратах по диагонали.where C is the concentration of sperm in 1 ml of ejaculate, and is the number of sperm in 5 large squares diagonally.
При большом количестве сперматозоидов, оцененном предварительной визуальной оценкой, увеличивают разведение препарата до 1:20, 1:40 или 1:80, добавляя к исследуемому препарату по 200 мкл рабочего раствора.With a large number of sperm cells, estimated by a preliminary visual assessment, increase the dilution of the drug to 1:20, 1:40 or 1:80, adding 200 μl of the working solution to the test drug.
Концентрацию сперматозоидов при большом количестве сперматозоидов, оцененном предварительной оценкой, определяют в 5 больших квадратах камеры Горяева, разделенных на 16 малых, по диагонали по формуле:The sperm concentration with a large number of sperm, estimated by a preliminary assessment, is determined in 5 large squares of the Goryaev’s chamber, divided into 16 small squares, diagonally according to the formula:
С=а×1000000 [млн/мл],C = a × 1,000,000 [ppm],
где С - концентрация сперматозоидов в 1 мл эякулята, а - количество сперматозоидов в 5 больших квадратах по диагоналиwhere C is the concentration of sperm in 1 ml of ejaculate, and is the number of sperm in 5 large squares diagonally
При большом количестве сперматозоидов в эякуляте, оцененном предварительной оценкой, увеличивают разведение до 1:40, 1:50, 1:80 или 1:100, каждый раз добавляя по 200 мкл рабочего раствора.With a large number of sperm in the ejaculate, as estimated by a preliminary assessment, dilution is increased to 1:40, 1:50, 1:80 or 1: 100, each time adding 200 μl of the working solution.
При увеличении разведения для подсчета концентрации сперматозоидов заполняют свободные квадраты камеры Горяева.With an increase in dilution, the free squares of the Goryaev chamber are filled to calculate sperm concentration.
При разведении эякулята в пропорции 1:40 и более, концентрацию сперматозоидов определяют в 5 больших квадратах камеры Горяева, разделенных на 16 малых квадратов по диагонали, по формуле:When diluting the ejaculate in a proportion of 1:40 or more, the sperm concentration is determined in 5 large squares of the Goryaev’s chamber, divided into 16 small squares diagonally, according to the formula:
С=(a×250×Р×1000)/(40×1000000) [млн/мл],C = (a × 250 × P × 1000) / (40 × 1,000,000) [million / ml],
где С - концентрация сперматозоидов в 1 мл эякулятаwhere C is the concentration of sperm in 1 ml of ejaculate
а - количество сперматозоидов в 5 больших квадратах по диагоналиa - sperm count in 5 large squares diagonally
Р - степень разведения спермы,P - semen dilution rate,
В качестве проявителя используют смесь натрия фосфорнокислого двузамещенного; калия фосфорнокислого однозамещенный; аммония хлористого; динатриевой соли этилендиаминотетрауксусной кислоты и бензидина.As the developer using a mixture of sodium phosphate disubstituted; potassium phosphate monosubstituted; ammonium chloride; disodium salt of ethylenediaminotetraacetic acid and benzidine.
Осуществляют контроль качества исследования, при этом в качестве положительного контроля при определении окраски лейкоцитов образцов эякулята используют цельную кровь, результаты окраски оценивают методом микроскопии.The quality control of the study is carried out, while whole blood is used as a positive control when determining the staining of leukocytes of ejaculate samples, staining results are evaluated by microscopy.
Описание графических материаловDescription of graphic materials
Сущность изобретения и возможность достижения технического результата будут более понятны из последующего описания со ссылками на фигуры графических материалов, где показано:The invention and the possibility of achieving a technical result will be more clear from the following description with reference to the figures of graphic materials, which show:
на фиг. 1 - 100 больших квадратов камеры Горяева, разделенных на 4 малых,in FIG. 1 - 100 large squares of the Goryaev’s chamber, divided into 4 small,
на фиг. 2 - 40 больших квадратов камеры Горяева, разделенных на 4 малых,in FIG. 2 - 40 large squares of Goryaev’s chamber, divided into 4 small,
на фиг. 3 - пять больших квадратов камеры Горяева, разделенных на 16 малых,in FIG. 3 - five large squares of the camera Goryaev, divided into 16 small,
на фиг. 4 - пять больших квадратов камеры Горяева, разделенных на 16 малых,in FIG. 4 - five large squares of the camera Goryaev, divided into 16 small,
на фиг. 5 - результаты клинического обследования по способу, принятому в качестве прототипа,in FIG. 5 - the results of a clinical examination according to the method adopted as a prototype,
на фиг.6 - результаты клинического обследования по предложенному способу.figure 6 - the results of a clinical examination of the proposed method.
Осуществление способаThe implementation of the method
В основе диагностического действия представленного способа лежит метод цитохимического окрашивания, используемый для анализа спермы человека согласно Руководству ВОЗ по исследованию и обработке спермы человека. Состав набора для осуществления способа содержит все необходимые компоненты, позволяющие стандартизовать выполнение рутинной спирограммы в условиях клинико-диагностической лаборатории. Процедура анализа состоит из пяти этапов с использованием следующих методов окрашивания, реагенты для которых входят в состав набора:The diagnostic action of the presented method is based on the cytochemical staining method used for analysis of human sperm according to the WHO Guidelines for the study and processing of human sperm. The composition of the kit for implementing the method contains all the necessary components to standardize the performance of a routine spirogram in a clinical diagnostic laboratory. The analysis procedure consists of five stages using the following staining methods, the reagents for which are part of the kit:
- окрашивание сперматозоидов и пероксидазо-положительных клеток (ППК)/нейтрофильных гранулоцитов в эякуляте;- staining of sperm and peroxidase-positive cells (PPC) / neutrophilic granulocytes in the ejaculate;
- окрашивание живых/мертвых сперматозоидов,- staining of live / dead sperm,
- окрашивание в целях дифференцировки морфологии сперматозоидов,- staining in order to differentiate sperm morphology,
- разжижения вязкого эякулята.- liquefaction of a viscous ejaculate.
В представленном способе в отличие от известных определение двух важнейших параметров спермограммы производится в одной пробирке. Фиксация и разведение образца спермы о проводится безвредным для аспирации верхними дыхательным путями и неканцерогенным раствором 30% Перекиси водорода. Перекись водорода 30% позволяет использовать рабочий раствор реагентов как для подсчета концентрации пероксидазо-положительных клеток (ППК) при разведении спермы 1:10, так и фиксировать подвижные клетки в целях последующего подсчета концентрации сперматозоидов при разведении эякулята от 1:10 и выше в больших квадратах камеры Горяева, используя соответствующие формулы.In the presented method, in contrast to the known methods, the determination of the two most important spermogram parameters is performed in one test tube. Fixation and breeding of a sperm sample is carried out by the upper respiratory tract, which is harmless to aspiration, and a non-carcinogenic solution of 30% hydrogen peroxide.
При этом объективизирована оценка требуемого разведения для дальнейшего подсчета концентрации сперматозоидов: «В случае если сперматозоиды лежат в монослоях (малое количество после предварительной визуальной оценки), то подсчет концентрации сперматозоидов необходимо проводить в этой же стороне камере Горяева, где были подсчитаны лейкоциты, то есть в прежнем разведении 1:10.At the same time, objective assessment of the required dilution for further calculation of sperm concentration is objective: “If the sperm are in monolayers (a small amount after a preliminary visual assessment), then the sperm concentration must be calculated in the same side of the Goryaev’s chamber, where leukocytes were counted, that is, in previous dilution 1:10.
В случае если сперматозоиды лежат в мультислоях (большое количество после предварительной визуальной оценки), то необходимо увеличить разведение до 1:20 и более путем добавления в пробирку №1 с исследуемым раствором еще 200 мкл рабочего раствора. В случае, если необходимо разведение 1:40, 1:80, то необходимо добавлять в пробирку №1 с существующим разведением каждый раз по 200 мкл рабочего раствора соответственно.If the sperm cells are in multilayers (a large number after a preliminary visual assessment), then it is necessary to increase the dilution to 1:20 or more by adding another 200 μl of the working solution to test tube No. 1 with the test solution. If a dilution of 1:40, 1:80 is necessary, then it is necessary to add to the tube No. 1 with the existing dilution each time 200 μl of the working solution, respectively.
Представлены вариативные формулы для расчета концентрации лейкоцитов и концентрации сперматозоидов в зависимости от результатов предварительной, более объективной оценки количества сперматозидов и разведения эякулята, основанного на ней.Variable formulas are presented for calculating the concentration of leukocytes and the concentration of spermatozoa, depending on the results of a preliminary, more objective assessment of the number of spermatozoa and dilution of ejaculate based on it.
Окончательный диагноз ставится врачом после полного клинического и лабораторного обследования пациента.The final diagnosis is made by the doctor after a complete clinical and laboratory examination of the patient.
При обработке образца спермы проявителем (реагент №1), Перекисью водорода 30% (реагент №2), клетки, содержащие пероксидазу (нейтрофильные лейкоциты), окрашиваются в коричневый цвет. Клетки, не содержащие пероксидазу (сперматозоиды, клетки сперматогенеза, лимфоциты, моноциты, макрофаги, спермиофаги, гистиоциты, эритроциты, липоидные тельца, эпителий) - не окрашиваются (остаются бесцветными).When processing a sperm sample with a developer (reagent No. 1), 30% hydrogen peroxide (reagent No. 2), cells containing peroxidase (neutrophilic white blood cells) are stained brown. Peroxidase-free cells (spermatozoa, spermatogenesis cells, lymphocytes, monocytes, macrophages, spermiophages, histiocytes, erythrocytes, lipoid bodies, epithelium) do not stain (remain colorless).
Реагент №2 позволяет использовать рабочий раствор реагента как для подсчета концентрации пероксидазо-положительных клеток (ППК) при разведении спермы 1:10, так и фиксировать подвижные клетки в целях последующего подсчета концентрации сперматозоидов при разведении эякулята от 1:10 и выше в больших квадратах камеры Горяева, используя соответствующие формулы.Reagent No. 2 allows you to use a working solution of the reagent both for counting the concentration of peroxidase-positive cells (PPC) when sperm is diluted 1:10, and to fix mobile cells for the subsequent calculation of sperm concentration when diluting ejaculate from 1:10 and higher in large squares of the chamber Goryaev using the appropriate formulas.
Подсчет концентрации круглых клеток (КК) исключен, к КК относятся клетки сперматогенеза различной степени зрелости, нейтрофильные лейкоциты (гранулоциты), лимфоциты, моноциты, макрофаги, спермиофаги, гистиоциты. Необходима только предварительная качественная оценка наличия КК в препарате.Counting the concentration of round cells (CC) is excluded; CC includes cells of spermatogenesis of various maturity, neutrophilic leukocytes (granulocytes), lymphocytes, monocytes, macrophages, spermiophages, histiocytes. Only a preliminary qualitative assessment of the presence of QC in the drug is required.
В результате взаимодействия спермы с Реагентом №3 (Раствор эозина, 5%) водный и Реагентом №4 (Раствор нигрозина, 10% водный), фон препарата окрашивается в темно-серый цвет, на котором четко видны окрашенные эозином в красный цвет мертвые сперматозоиды и неокрашенные (бесцветные) живые сперматозоиды, что позволяет произвести раздельный подсчет живых и мертвых сперматозоидов и определить их процентное соотношение.As a result of the interaction of sperm with Reagent No. 3 (Eosin Solution, 5%) water and Reagent No. 4 (Nigrosine Solution, 10% water), the background of the preparation turns dark gray, on which dead spermatozoa stained with eosin are clearly visible in red unpainted (colorless) live sperm, which allows for separate counting of live and dead sperm and determine their percentage.
Реагент №5 (Краситель азур-эозин по Романовскому) и Реагент №6 (Фиксатор-краситель эозин метиленовый синий по Май-Грюнвальду) специфично взаимодействуют с различными структурами клетки. При этом происходит окрашивание ацидофильных структур в разные тона красного цвета, базофильных структур - в тона от пурпурового до синего. Вследствие того, что различные клеточные структуры имеют разную рН и связываются с красителем с противоположной реакцией. Ядра клеток богаты нуклеиновыми кислотами, имеют кислую реакцию и окрашиваются красителем азур-эозин по Романовскому в сине-фиолетовый цвет. Цитоплазма гранулоцитов, зернистость эозинофилов, эритроциты содержат щелочные белки, поэтому окрашиваются красителем азур-эозин по Романовскому в розовый цвет. Головки сперматозоидов окрашиваются в синий цвет с сиреневой или фиолетовой акросомальной частью. Хвосты сперматозоидов окрашиваются в нежно-сиреневый цвет. Цитоплазматическая капля и шейка сперматозоида окрашиваются в сине-фиолетовый цвет.Reagent No. 5 (dye azur-eosin according to Romanovsky) and Reagent No. 6 (fixative-dye eosin methylene blue according to May-Grunwald) specifically interact with various cell structures. In this case, acidophilic structures are stained in different tones of red, basophilic structures in tones from purple to blue. Due to the fact that different cellular structures have different pH and bind to the dye with the opposite reaction. Cell nuclei are rich in nucleic acids, have an acid reaction and are stained with azure-eosin Romanovsky dye in blue-violet color. The cytoplasm of granulocytes, the granularity of eosinophils, and erythrocytes contain alkaline proteins, therefore, they are stained with the azure-eosin dye according to Romanovsky in pink. Sperm heads are stained blue with a lilac or violet acrosomal part. Sperm tails are painted in a pale lilac color. The cytoplasmic drop and sperm neck are stained blue-violet.
Реагент №7 (Фосфатно-солевой раствор бромелайна) представляет собой раствор для разжижения эякулята.Reagent No. 7 (Phosphate-saline solution of bromelain) is a solution for liquefying ejaculate.
Способ используется для комплексной оценки показателей спермограммы.The method is used for a comprehensive assessment of spermogram indicators.
В состав реагентов для комплексного анализа спермы входят:The reagents for the comprehensive analysis of sperm include:
- Реагент №1 (Проявитель - это бесцветная прозрачная жидкость, содержит Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный ХЧ концентрации 26,6 ммоль; Калий фосфорнокислый однозамещенный ХЧ концентрации 66,1 ммоль; Аммоний хлористый 4,62 ммоль; Динатриевая соль этилендиаминотетрауксусной кислоты 14,8 ммоль ЭДТУК - динатриевая соль DISSOLVINE NA2, Бензидин 2,5 ммоль);- Reagent No. 1 (The developer is a colorless transparent liquid, contains sodium phosphate disubstituted 12-water chemically concentrated 26.6 mmol; Potassium phosphate monosubstituted chemically pure 66.1 mmol; ammonium chloride 4.62 mmol; disodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid 14 mmol EDTA - disodium salt of DISSOLVINE NA2, Benzidine 2.5 mmol);
- Реагент №2 (Перекись водорода 30%)- Reagent No. 2 (
- Реагент №3 (Раствор эозина, 5% водный);- Reagent No. 3 (Eosin solution, 5% aqueous);
- Реагент №4(Раствор нигрозина, 10% водный);- Reagent No. 4 (Nigrosine solution, 10% aqueous);
- Реагент №5 (Краситель азур-эозин по Романовскому);- Reagent No. 5 (Dye azur-eosin according to Romanovsky);
- Реагент №6 (Фиксатор-краситель эозин метиленовый синий по Май-Грюнвальду);- Reagent No. 6 (Fixative-dye eosin methylene blue according to May-Grunwald);
- Реагент №7 (Фосфатно-солевой раствор бромелайна).- Reagent No. 7 (Phosphate-saline solution of bromelain).
Чувствительность и специфичность окрашивания клеток), как процентное содержание образцов, соответствующих паспортному значению - не менее 100%.The sensitivity and specificity of cell staining), as the percentage of samples corresponding to the passport value is not less than 100%.
Нормальное значение концентрации нейтрофильных лейкоцитов (ППК) согласно Руководству ВОЗ по исследованию и обработке спермы человека, 5-ая редакция (2010 год) не более 1,0×106 на 1 мл эякулята.The normal value of the concentration of neutrophilic leukocytes (AUC) according to the WHO Guidelines for the study and treatment of human sperm, 5th edition (2010) is not more than 1.0 × 10 6 per 1 ml of ejaculate.
Чрезмерное количество лейкоцитов в эякуляте (пиоспермия) может быть связано с инфекцией и плохим качеством спермы.Excessive white blood cell count in the ejaculate (pyospermia) may be due to infection and poor sperm quality.
Лейкоциты могут снижать подвижность сперматозоидов и нарушать целостность ДНК посредством оксидативного воздействия. Однако наблюдаемый уровень лейкоцитарного повреждения зависит от факторов, которые невозможно предположить, такие, как причина, время и анатомическая локализация инфильтрации лейкоцитов, а также происхождение лейкоцитов и их нахождение в активированном состоянии (Tomlinson et al., 1993; Aitken & Baker, 1995; Rossi & Aitken, 1997).White blood cells can reduce sperm motility and disrupt DNA integrity through oxidative effects. However, the observed level of leukocyte damage depends on factors that cannot be assumed, such as the cause, time and anatomical location of the leukocyte infiltration, as well as the origin of the leukocytes and their presence in the activated state (Tomlinson et al., 1993; Aitken & Baker, 1995; Rossi & Aitken, 1997).
Появление лейкоцитов в эякуляте в концентрации, выше пороговой, является поводом для более углубленного обследования мужчины.The appearance of leukocytes in the ejaculate in a concentration higher than the threshold is the reason for a more in-depth examination of the man.
Минимальным референсным значением концентрации сперматозоидов, согласно Руководству, ВОЗ по исследованию и обработке спермы человека, 5-ая редакция (2010 год), принято считать - 15×106 сперматозоидов на 1 мл эякулята.The minimum reference sperm concentration, according to the WHO Guidelines for the Study and Processing of Human Sperm, 5th edition (2010), is considered to be 15 × 10 6 sperm per 1 ml of ejaculate.
От концентрации сперматозоидов в сперме может зависеть оплодотворение и наступление беременности, она определяется объемом секретов семенных пузырьков и простаты (Eliasson, 1975) и не является особой мерой тестикулярной функции.Fertilization and the onset of pregnancy may depend on the concentration of sperm in the semen, it is determined by the volume of secrets of the seminal vesicles and the prostate (Eliasson, 1975) and is not a special measure of testicular function.
Представленным способом окрашиваются все клетки, имеющиеся в образце (интерференция при соблюдении требований инструкции по применению отсутствует). Интерпретация и последующий подсчет окрашенных клеток проводится врачом КЛД, обучившимся по соответствующей программе повышения квалификации продолжительностью не менее 18 часов («Практический курс спермограммы, 18 часов»; «Спермограмма. Основы цитологии осадка эякулята, 18 часов», «Анализ спермы человека, 36 часов») по направлению дополнительного профессионального образования по специальности 31.08.05 «Клиническая лабораторная диагностика» в уполнономоченных на проведение указанных программ образовательных организаций можно найти на сайте www.ssc-school.com.By the presented method, all cells present in the sample are stained (interference is not observed if the requirements of the instructions for use are observed). Interpretation and subsequent counting of stained cells is carried out by a KLD doctor who has studied according to an appropriate professional development program lasting at least 18 hours (“Practical spermogram course, 18 hours”; “Spermogram. Fundamentals of cytology of ejaculate sediment, 18 hours”, “Analysis of human sperm, 36 hours” ”) In the direction of further professional education in the specialty 31.08.05“ Clinical Laboratory Diagnostics ”in educational institutions authorized to conduct the indicated programs can be found on the website www.ssc-school.com.
При осуществлении способа используются пробирки конические градуированные, полипропиленовые, нестерильные 15 мл; стекла предметные толщ. 2,0±0,2 мм; стекла покровные 24×24 мм; шпатели для растяжки мазков лабораторные одноразовые; раствор для сброса использованного расходного материала; одноканальные автоматические дозаторы переменного объема 10-100 мкл наконечники к одноканальному автоматическому дозатору переменного объема 2-200 мкл; перчатки медицинские диагностические одноразовые (ГОСТ Р 52239); микроскоп; защитные очки; камера Горяева; пипетки Пастера; стеклянная палочка; лабораторный счетчик; цилиндры мерные вместимостью 25-1000 мл; секундомер, бумага фильтровальная.When implementing the method, conical graduated, polypropylene, non-sterile 15 ml tubes are used; glass subject thicknesses. 2.0 ± 0.2 mm; glass coverslips 24 × 24 mm; laboratory disposable smear spatulas; a solution for discharging used consumables; single-channel automatic dispensers of variable volume 10-100 μl; tips for single-channel automatic dispensers of variable volume 2-200 μl; medical diagnostic gloves, disposable (GOST R 52239); microscope; protective glasses; Goryaev’s camera; Pasteur pipettes; glass rod; laboratory counter; graduated cylinders with a capacity of 25-1000 ml; stopwatch, filter paper.
Определение производится из биологического образцов человека (семенная жидкость). Биологический материал «эякулят» для окрашивания набором рекомендуется хранить не более 12 часов при температуре от 25 до 37°С.The determination is made from biological samples of a person (seminal fluid). The biological material "ejaculate" for staining with a set is recommended to be stored for no more than 12 hours at a temperature of 25 to 37 ° C.
Для приготовления рабочего раствора необходимо: к флакону с Реагентом №1 (Проявитель) добавляют 10 мкл Реагента №2 (перекись водорода 30%) и перемешивают. Рабочий раствор возможно использовать в течение 24 часов после приготовления, при хранении 0-5 град.С. Если рабочий раствор не удается использовать полностью в течение указанного времени (в течение 24 часов после приготовления, при хранении от 0 до 5°С), допустимо замораживание аликвот рабочего раствора в течение 1 месяца с последующим однократным размораживанием перед проведением последующего исследования для окраски лейкоцитов и подсчета их концентрации.To prepare the working solution, it is necessary: 10 μl of Reagent No. 2 (
Реагенты №№3-7 готовы к использованию.Reagents No. 3-7 are ready for use.
Если разжижение эякулята не наступило в течение 60 минут, в пробирку со всей порцией эякулята вносят пипеткой Пастера равное количество Реагента №7 Фосфатно-солевой раствор бромелайна (развести образец эякулята в два раза), размешивают, не допуская образования пузырьков. Инкубируют пробирку в термостате при температуре 37°С 10 минут.If liquefaction of the ejaculate has not occurred within 60 minutes, an equal amount of Reagent No. 7 Phosphate-saline solution of bromelain (dilute the sample of ejaculate twice) is added to the tube with the entire portion of the ejaculate with a Pasteur pipette, stirred, avoiding the formation of bubbles. Incubate the tube in an incubator at 37 ° C for 10 minutes.
Процедура разжижения может влиять на биохимические показатели эякулята, его подвижность и морфологию сперматозоидов, поэтому использование процедуры должно быть записано.The liquefaction procedure can affect the biochemical parameters of the ejaculate, its motility and sperm morphology, so the use of the procedure must be recorded.
Разведение в два раза должно быть учтено при расчете концентрации сперматозоидов и лейкоцитов умножением полученных результатов на 2.Double dilution should be taken into account when calculating the concentration of sperm and white blood cells by multiplying the results by 2.
Для окраски ППК в эякуляте тщательно перемешивают образец спермы, не допуская образования пузырьков и пены. В пробирку помещают аликвоту из 20 мкл спермы и 180 мкл рабочего раствора рабочего раствора из реагентов 1-2 (разведение 1:10) - готовая смесь исследуемого препарата (Пробирка №1).To stain the AUC in the ejaculate, the sperm sample is thoroughly mixed, avoiding the formation of bubbles and foam. An aliquot of 20 μl of sperm and 180 μl of a working solution of a working solution of reagents 1-2 (dilution 1:10) is placed in a test tube — a finished mixture of the test drug (Test tube No. 1).
Перемешивают суспензию в пробирке в течение 10 сек. стеклянной палочкой и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минутStir the suspension in a test tube for 10 seconds. glass rod and incubated at room temperature for 30 minutes
После предварительного повторного перемешивания суспензии заполняют две стороны камеры Горяева для двукратного подсчета лейкоцитов с последующим определением средней величины (в целях минимизации ошибки). Для осаждения клеток удерживают камеру Горяева горизонтально не менее 4 минут при комнатной температуре.After preliminary re-mixing of the suspension, two sides of the Goryaev chamber are filled for double counting of leukocytes with subsequent determination of the average value (in order to minimize the error). To precipitate cells, the Goryaev chamber is held horizontally for at least 4 minutes at room temperature.
Оценивают заполненные камеры в световом микроскопе при увеличении ×200 или ×400.The filled chambers are evaluated in a light microscope at a magnification of × 200 or × 400.
Нейтрофильные лейкоциты, окрашиваются в коричневый цвет т.к. содержат пероксидазу.Neutrophilic white blood cells, stained brown. contain peroxidase.
Клетки, не содержащие пероксидазу (сперматозоиды, клетки сперматогенеза, лимфоциты, моноциты, макрофаги, спермиофаги, гистиоциты, эритроциты, липоидные тельца, эпителий) не окрашиваются в коричневый цвет (остаются бесцветными).Peroxidase-free cells (spermatozoa, spermatogenesis cells, lymphocytes, monocytes, macrophages, spermiophages, histiocytes, erythrocytes, lipoid bodies, epithelium) do not stain brown (remain colorless).
Подсчитывают число ППК в квадратах камеры Горяева с помощью лабораторного счетчика.Count the number of PPC in the squares of the Goryaev chamber using a laboratory counter.
Подсчет концентрации лейкоцитов/ППК осуществляется двумя вариантамиThe calculation of the concentration of leukocytes / PPC is carried out in two ways
1-ый вариант если круглые клетки (КК) расположены в монослоях (не большое/малое количество после предварительной визуальной оценки), лейкоциты (ППК) считаются в 100 больших квадратах камеры Горяева.The first option is if round cells (CC) are located in monolayers (not a large / small amount after a preliminary visual assessment), white blood cells (PPC) are counted in 100 large squares of the Goryaev’s chamber.
Расчет проводят по формуле:The calculation is carried out according to the formula:
L=(а×250×10×1000)/(100×1000000*) [млн/мл]L = (a × 250 × 10 × 1000) / (100 × 1,000,000 *) [mln / ml]
где L - количество лейкоцитов (ППК) в 1 мл эякулята, а - количество лейкоцитов (ППК) в 100 больших квадратах, 250 - 
Сокращенный вариант формулы:A shortened version of the formula:
L=а/40 [млн/мл]L = a / 40 [ppm]
*При пересчете на млн/мл (установленные ВОЗ единицы измерения), необходимо полученный результат разделить на 1000000.* When converted to million / ml (WHO units), the result must be divided by 1,000,000.
На фиг. 1 показано 100 больших квадратов камеры Горяева, разделенных на 4 малых.In FIG. 1 shows 100 large squares of Goryaev’s chamber, divided into 4 small ones.
Пример: при подсчете в 100 больших квадратах камеры Горяева было обнаружено 35 ППК. Расчет концентрации лейкоцитов (ППК) в 1 мл спермы L=35/40=0,875 млн/мл.Example: when counting in 100 large squares of the Goryaev’s camera, 35 PPK were found. The calculation of the concentration of leukocytes (PPC) in 1 ml of semen L = 35/40 = 0.875 million / ml.
2-ой вариант подсчета концентрации ППК2nd option for calculating the concentration of PPC
Если круглые клетки (КК) расположены в мультислоях (большое количество после предварительной визуальной оценки), можно считать клетки в 40 больших квадратах (20 квадратов вверху сетки и 20 - внизу). Расчет вести по формуле:If round cells (CC) are located in multilayers (a large number after a preliminary visual assessment), then cells can be counted in 40 large squares (20 squares at the top of the grid and 20 at the bottom). The calculation is carried out according to the formula:
L=(а×250×10×1000)/(40×1000000) [млн/мл]L = (a × 250 × 10 × 1000) / (40 × 1,000,000) [ppm]
где а - количество лейкоцитов (ППК) в 40 больших квадратах, 250 - 
Сокращенный вариант формулы:A shortened version of the formula:
L=а×0,0625 [млн/мл]L = a × 0.0625 [ppm]
Пример: при подсчете в 40 больших квадратах камеры Горяева было обнаружено 25 ППК. Расчет концентрации лейкоцитов (ППК) в 1 мл спермы L=25×0,0625=1,5625 млн/мл.Example: when counting in 40 large squares of the Goryaev’s camera, 25 PPK were found. The calculation of the concentration of leukocytes (PPC) in 1 ml of semen L = 25 × 0.0625 = 1.5625 million / ml.
На фиг. 2 показано 40 больших квадратов камеры Горяева, разделенных на 4 малых.In FIG. 2 shows 40 large squares of Goryaev’s chamber, divided into 4 small ones.
Расчет концентрации сперматозоидов в эякулятеCalculation of the concentration of sperm in the ejaculate
1. В случае если сперматозоиды лежат в монослоях (малое количество после предварительной визуальной оценки), то подсчет концентрации сперматозоидов проводят в этой же стороне камере Горяева, где были подсчитаны лейкоциты, то есть в прежнем разведении 1:10.1. If spermatozoa lie in monolayers (a small amount after a preliminary visual assessment), then the concentration of sperm is carried out in the same side of the Goryaev’s chamber, where leukocytes were counted, that is, in the previous dilution of 1:10.
2. Оценивают заполнение камеры в световом микроскопе при увеличении ×200 или ×400.2. Assess the filling of the camera in a light microscope at a magnification of × 200 or × 400.
3. Подсчитывают число сперматозоидов с помощью лабораторного счетчика.3. Count the number of sperm using a laboratory counter.
4. Подсчитывают не менее двух сторон камеры Горяева для того, чтобы достичь приемлемо низкой ошибки.4. At least two sides of the Goryaev camera are counted in order to achieve an acceptable low error.
Расчет ведут по 1-ому варианту:The calculation is carried out according to the 1st option:
1-ый вариант подсчета концентрации сперматозоидов1st variant of sperm count
При разведении эякулята 1:10 концентрация сперматозоидов определяется в 5 больших квадратах (фиг. 3) камеры Горяева, разделенных на 16 малых, по диагонали. Расчет проводят по формуле:When diluting the ejaculate 1:10, the sperm concentration is determined in 5 large squares (Fig. 3) of the Goryaev’s chamber, divided into 16 small ones, diagonally. The calculation is carried out according to the formula:
С=а×500000 [млн/мл]C = a × 500,000 [ppm]
где С - концентрация сперматозоидов в 1 мл акулята, а - количество сперматозоидов в 5 больших квадратах по диагоналиwhere C is the concentration of sperm in 1 ml of the shark, and is the number of sperm in 5 large squares diagonally
На фиг. 3 показано 5 больших квадратов камеры Горяева, разделенных на 16 малых.In FIG. 3 shows 5 large squares of Goryaev’s chamber, divided into 16 small ones.
Пример: при подсчете в 5 больших квадратах по диагонали камеры Горяева было обнаружено 135 сперматозоидов. Расчет концентрации сперматозоидов в 1 мл спермы С=135×500 000=67,5 млн/мл.Example: when counting in 5 large squares on the diagonal of the Goryaev’s chamber, 135 spermatozoa were detected. Calculation of the concentration of sperm in 1 ml of sperm C = 135 × 500,000 = 67.5 million / ml.
В случае если сперматозоиды лежат в мультислоях (большое количество после предварительной визуальной оценки), необходимо увеличить разведение до 1:20 и более путем добавления в пробирку №1 с исследуемым раствором еще 200 мкл рабочего раствора. В случае, если необходимо разведение 1:40, 1:80, то необходимо добавлять в пробирку №1 с существующим разведением каждый раз по 200 мкл рабочего раствора соответственно.If the sperm cells are in multilayers (a large amount after a preliminary visual assessment), it is necessary to increase the dilution to 1:20 or more by adding another 200 μl of the working solution to test tube No. 1 with the test solution. If a dilution of 1:40, 1:80 is necessary, then it is necessary to add to the tube No. 1 with the existing dilution each time 200 μl of the working solution, respectively.
При дополнительном разведении рабочего раствора для подсчета концентрации сперматозоидов необходимо заполнять новые свободные камеры Горяева.With additional dilution of the working solution to calculate the concentration of sperm, it is necessary to fill in the new free chambers of Goryaev.
После предварительного аккуратного повторного перемешивания суспензии заполняют камеру Горяева. Для осаждения клеток удерживают камеру Горяева горизонтально не менее 4 минут при комнатной температуре.After preliminary careful re-mixing, the suspensions fill the Goryaev chamber. To precipitate cells, the Goryaev chamber is held horizontally for at least 4 minutes at room temperature.
Оценивают заполненную камеру в световом микроскопе при увеличении ×200 или ×400.The filled chamber is evaluated under a light microscope at a magnification of × 200 or × 400.
Подсчитывают число сперматозоидов с помощью лабораторного счетчика.Count the number of sperm using a laboratory counter.
Подсчитывают не менее двух сторон камеры Горяева для того, чтобы достичь приемлемо низкой ошибки.At least two sides of the Goryaev camera are counted in order to achieve an acceptable low error.
Расчет ведут по 2-ому варианту подсчета концентрации сперматозоидов:The calculation is carried out according to the 2nd option for calculating the concentration of sperm:
При разведении эякулята 1:20, концентрацию сперматозоидов считают также в 5 больших квадратах (фиг. 4) камеры Горяева, разделенных на 16 малых, по диагонали. Расчет проводят по формуле:When diluting the ejaculate 1:20, the sperm concentration is also counted in 5 large squares (Fig. 4) of Goryaev’s chamber, divided into 16 small ones, diagonally. The calculation is carried out according to the formula:
С=а×1000000 [млн/мл]C = a × 1,000,000 [ppm]
где С - концентрация сперматозоидов в 1 мл эякулята, а - количество сперматозоидов в 5 больших квадратах по диагоналиwhere C is the concentration of sperm in 1 ml of ejaculate, and is the number of sperm in 5 large squares diagonally
На фиг. 4 показано 5 больших квадратов камеры Горяева, разделенных на 4 малых.In FIG. 4 shows 5 large squares of Goryaev’s chamber, divided into 4 small ones.
Пример: при подсчете в 5 больших квадратах по диагонали камеры Горяева было обнаружено 135 сперматозоидов. Расчет концентрации сперматозоидов в 1 мл спермы С=135 млн/мл.Example: when counting in 5 large squares on the diagonal of the Goryaev’s chamber, 135 spermatozoa were detected. Calculation of the concentration of sperm in 1 ml of sperm C = 135 million / ml.
Далее проводят дифференциальную диагностику живых и мертвых сперматозоидов (окраска по Блюму) образцов эякулята:Next, a differential diagnosis of live and dead spermatozoa (Blum stain) of ejaculate samples is carried out:
Для этого эякулят тщательно перемешивают. Наносят стеклянной палочкой 1 каплю на предметное стекло. Рядом наносят 2 капли раствора эозина (Реагент №3 Раствор эозина, 5% водный). Каплю эякулята перемешивают с раствором эозина и выдерживают 5 секунд. Добавляют 3 капли раствора нигрозина (Реагент №4 Раствор нигрозина, 10% водный), перемешивают и выдерживают 5 секунд. Шпателем лабораторным готовят тонкий мазок.For this, the ejaculate is thoroughly mixed. Apply 1 drop on a glass slide with a glass rod. 2 drops of an eosin solution are applied nearby (Reagent No. 3 Solution of eosin, 5% aqueous). A drop of ejaculate is mixed with a solution of eosin and incubated for 5 seconds. Add 3 drops of a nigrosin solution (Reagent No. 4 Nigrosine solution, 10% aqueous), mix and incubate for 5 seconds. A thin smear is prepared with a laboratory spatula.
Мазок высушивают и микроскопируют при увеличении ×400 (объектив ×40, окуляр ×10).The smear is dried and microscopic at a magnification of × 400 (lens × 40, eyepiece × 10).
В результате окраски:As a result of painting:
- мертвые сперматозоиды при окрашивании реагентами 3 и 4 окрашиваются в красный цвет.- dead sperm when stained with
- живые сперматозоиды при окрашивании реагентами 3 и 4 не окрашиваются (остаются бесцветные).- live sperm cells when stained with
Далее проводится окраска сперматозоидов образцов эякулята по Романовскому:Next, staining of sperm samples of ejaculate according to Romanovsky:
Делают мазки на предметных стеклах, высушивают на воздухе либо в термостате при температуре не выше 37°С до исчезновения влажного блеска. Фиксируют высушенные препараты неразведенным раствором фиксатора-красителя по Май-Грюнвальду (Реагент №6 Фиксатор-краситель эозин метиленовый синий по Май-Грюнвальду) - наливают неразбавленный раствор фиксатора-красителя так, чтобы он покрыл весь мазок в течение 1-2 мин. Смывание фиксатора перед окраской не требуется.Make smears on slides, dry in air or in a thermostat at a temperature of no higher than 37 ° C until the wet shine disappears. Fix the dried preparations with an undiluted solution of fixer-dye according to May-Grunwald (Reagent No. 6 Fixer-dye eosin methylene blue according to May-Grunwald) - pour undiluted solution of fixer-dye so that it covers the entire smear for 1-2 minutes. Flushing of the retainer before painting is not required.
Непосредственно перед окраской мазков готовят рабочий раствор красителя: смешивают раствор красителя (Реагент №5 Краситель азур-эозин по Романовскому) с деоинизированной/дистиллированной водой в соотношении 1+4 (1:5) (на 10 мл красителя 40 мл воды). Полученный рабочий раствор красителя можно хранить до 5-7 суток в закрытом контейнере. На фиксированные мазки эякулята наливают рабочий раствор красителя, по истечении 15-20 мин препараты промывают деоинизированной/дистиллированной водой, высушивают и микроскопируют.A dye working solution is prepared immediately before the smears are painted: a dye solution is mixed (Reagent No. 5 Azure-eosin dye according to Romanovsky) with de-ionized / distilled water in a ratio of 1 + 4 (1: 5) (per 10 ml of
При превышении времени фиксации фиксатором-красителем может произойти чрезмерное высыхание его на мазке крови и выпадение точечных кристаллов красящего вещества, видимых в поле зрения микроскопа и мешающих проведению микроскопического исследования. При появлении этого эффекта необходимо уменьшить время фиксации.If the fixation time with the fixative-dye is exceeded, it can excessively dry on a blood smear and precipitate dot crystals of the dye, which are visible in the field of view of the microscope and interfere with microscopic examination. When this effect appears, it is necessary to reduce the fixation time.
Результаты окраски оценивают методом микроскопии.Staining results are evaluated by microscopy.
Головки сперматозоидов при окрашивании реагентами 5 и 6 окрашиваются в синий цвет с сиреневой или фиолетовой акросомальной частью.Sperm heads when stained with reagents 5 and 6 are colored blue with a lilac or violet acrosomal part.
Хвосты сперматозоидов при окрашивании реагентами 5 и 6 окрашиваются в нежно-сиреневый цвет.Sperm tails when stained with reagents 5 and 6 are painted in a pale lilac color.
Цитоплазматическая капля и шейка сперматозоида при окрашивании реагентами 5 и 6 окрашиваются в сине-фиолетовый цвет.The cytoplasmic drop and neck of the sperm when stained with reagents 5 and 6 are colored in blue-violet.
Учет результатов. Контроль качества.Accounting for results. Quality control.
В качестве положительного контроля при определении окраски форменных элементов образцов эякулята, используют цельную кровь. Цельная кровь должна использоваться в течение не более 24 часов после сбора (при хранении более 2 часов, хранить при температуре от 2 до 8°С; температура хранения от 20 до 25°С допустима менее двух часов; замораживание не допускается) и не должна содержать никаких добавок, таких как антикоагулянты. Тестируемая кровь будет содержать различные типы лейкоцитов, в том числе окрашенные в коричневый цвет в этой реакции. Некоторые будут неокрашенными. Таким образом, один и тот же препарат контрольного образца будет иметь как положительные контроль - окрашенные в коричневый цвет лейкоциты (гранулоциты), так и отрицательный контроль - неокрашенные лейкоциты. Для отдельного отрицательного контроля, выполняют анализ без использования перекиси. В этом протоколе анализируемая кровь будет содержать неокрашенные лейкоциты.Whole blood is used as a positive control when determining the color of the shaped elements of ejaculate samples. Whole blood should be used for no more than 24 hours after collection (when stored for more than 2 hours, stored at a temperature of 2 to 8 ° C; storage temperature of 20 to 25 ° C is allowed for less than two hours; freezing is not allowed) and should not contain no additives like anticoagulants. The test blood will contain various types of white blood cells, including brown ones in this reaction. Some will be unpainted. Thus, the same preparation of the control sample will have both positive controls — brown-colored leukocytes (granulocytes), and negative controls — unpainted leukocytes. For a separate negative control, an analysis is performed without the use of peroxide. In this protocol, the blood sample will contain unpainted white blood cells.
В качестве примера, на фиг. 5 и фиг. 6 приведены реальные результаты практических клинических исследований по способу, принятому в качестве прототипа и по предлагаемому способу. Цель обследования - определить причину бесплодия.As an example, in FIG. 5 and FIG. 6 shows the actual results of practical clinical research by the method adopted as a prototype and by the proposed method. The purpose of the examination is to determine the cause of infertility.
Сравнение результатов обследования, полученных в соответствии с известным и представленным способами (фиг. 5 и 6), позволяет сделать следующее заключение:Comparison of the survey results obtained in accordance with the known and presented methods (Fig. 5 and 6), allows us to make the following conclusion:
1) Анализ спермы (спермограммы) мужчины 39 лет от 01.10.2019 г, выполненный в клинике, выявил незначительные изменения в подвижности сперматозоидов - "Астенозооспермия".1) An analysis of sperm (spermograms) of a 39-year-old male from 10/01/2019, performed at the clinic, revealed insignificant changes in sperm motility - “Asthenozoospermia”.
2) Анализ спермы (спермограммы) того же мужчины 39 лет от 05.10.2019 г, выполненный экспертами Международной Школы Цитологии представленным способом выявил:2) Analysis of sperm (spermogram) of the
более глубокие нарушения фертильностиdeeper fertility disorders
мужчины: "Олигостенотератозооспермия. Некрозооспермия"men: "Oligostenoteratozoospermia. Necrosoospermia"
наличие воспаления, которое может являться причиной мужского бесплодия, а также свидетельствовать об асимптомном течении вируса папилломы человека высокого канцерогенного риска (hrHPV): "Пиоспермия"the presence of inflammation, which can be the cause of male infertility, as well as evidence of the asymptomatic course of the human carcinogenic virus papilloma virus (hrHPV): "Pyospermia"
Исследование представленным способом позволило назначить квалифицированное лечение.The study of the presented method allowed to appoint a qualified treatment.
Таким образом, применение представленного способа позволяет исключить недостатки, присущие известным способам, представленный способ имеет следующие преимущества:Thus, the application of the presented method allows to eliminate the disadvantages inherent in the known methods, the presented method has the following advantages:
1.Обеспечивает определение двух важнейших параметров спермограммы в одной пробирке что повышает производительность диагностики и объективность контроля.1. Provides the determination of the two most important spermogram parameters in one test tube, which increases the diagnostic performance and objectivity of the control.
2. Фиксация и разведение образца спермы проводятся безвредным для аспирации верхними дыхательным путями и не канцерогенным раствором 30% Перекиси водорода.2. The fixation and dilution of the sperm sample are carried out by the upper respiratory tract, which is harmless to aspiration, and not a carcinogenic solution of 30% hydrogen peroxide.
3. Реагент №2, применяемый в предлагаемом способе, (перекись водорода 30%) позволяет использовать рабочий раствор реагента как для подсчета концентрации пероксидазо-положительных клеток (ППК) при разведении спермы 1:10, так и фиксировать подвижные клетки в целях последующего подсчета концентрации сперматозоидов при разведении эякулята от 1:10 и выше в больших квадратах камеры Горяева, используя соответствующие формулы, что повышает объективность и достоверность результатов диагностики.3. The reagent No. 2 used in the proposed method (
4. Объективизирована оценка требуемого разведения для дальнейшего подсчета концентрации сперматозоидов:4. Objective assessment of the required dilution for further calculation of sperm concentration:
- В случае если сперматозоиды лежат в монослоях (малое количество после предварительной визуальной оценки), то подсчет концентрации сперматозоидов необходимо проводить в этой же стороне камере Горяева, где были подсчитаны лейкоциты, то есть в прежнем разведении 1:10.- If the sperm cells are in monolayers (a small amount after a preliminary visual assessment), then the sperm concentration must be calculated in the same side of the Goryaev’s chamber, where the leukocytes were counted, that is, in the previous dilution of 1:10.
- В случае если сперматозоиды лежат в мультислоях (большое количество после предварительной визуальной оценки), то необходимо увеличить разведение до 1:20 и более путем добавления в пробирку №1 с исследуемым раствором еще 200 мкл рабочего раствора. В случае, если необходимо разведение 1:40, 1:80, то необходимо добавлять в пробирку №1 с существующим разведением каждый раз по 200 мкл рабочего раствора соответственно.- If the sperm cells are in multilayers (a large number after a preliminary visual assessment), then it is necessary to increase the dilution to 1:20 or more by adding another 200 μl of the working solution to test tube No. 1 with the test solution. If a dilution of 1:40, 1:80 is necessary, then it is necessary to add to the tube No. 1 with the existing dilution each time 200 μl of the working solution, respectively.
5. Представлены вариативные модели для расчета концентрации лейкоцитов и концентрации сперматозоидов в зависимости от результатов предварительной, более объективной оценки количества сперматозидов и разведения эякулята, основанного на ней, что повышает объективность и достоверность результатов диагностики.5. Variable models are presented for calculating the concentration of leukocytes and the concentration of spermatozoa depending on the results of a preliminary, more objective assessment of the number of spermatozoa and dilution of ejaculate based on it, which increases the objectivity and reliability of the diagnostic results.
Claims (20)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019136865A RU2726207C1 (en) | 2019-11-18 | 2019-11-18 | Method for combined measurement of concentration of peroxidase-positive cells (neutrophilic granulocytes) and sperm cells in human ejaculate using variations based on cytochemical staining |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019136865A RU2726207C1 (en) | 2019-11-18 | 2019-11-18 | Method for combined measurement of concentration of peroxidase-positive cells (neutrophilic granulocytes) and sperm cells in human ejaculate using variations based on cytochemical staining |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2726207C1 true RU2726207C1 (en) | 2020-07-09 |
Family
ID=71510083
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019136865A RU2726207C1 (en) | 2019-11-18 | 2019-11-18 | Method for combined measurement of concentration of peroxidase-positive cells (neutrophilic granulocytes) and sperm cells in human ejaculate using variations based on cytochemical staining |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2726207C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114295452A (en) * | 2021-12-31 | 2022-04-08 | 力因精准医疗产品（上海）有限公司 | Human sperm morphological staining reagent and staining method |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002095375A1 (en) * | 2001-05-24 | 2002-11-28 | M.E.S. Medical Electronic Systems Ltd. | Semen analysis |
| RU2247371C2 (en) * | 2003-03-26 | 2005-02-27 | Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии Восточно-Сибирского научного центра Сибирского отделения Российской Академии медицинских наук | Method for predicting male sterility |
| RU2568845C1 (en) * | 2014-05-30 | 2015-11-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарёва" | Method of assessment of genetic full-value of sperm |
-
2019
- 2019-11-18 RU RU2019136865A patent/RU2726207C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002095375A1 (en) * | 2001-05-24 | 2002-11-28 | M.E.S. Medical Electronic Systems Ltd. | Semen analysis |
| RU2247371C2 (en) * | 2003-03-26 | 2005-02-27 | Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии Восточно-Сибирского научного центра Сибирского отделения Российской Академии медицинских наук | Method for predicting male sterility |
| RU2568845C1 (en) * | 2014-05-30 | 2015-11-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарёва" | Method of assessment of genetic full-value of sperm |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| Singh, D.K. et al. Factors influencing semen analysis in case of infertility // Indian Journal of Public Health Research and Development. - 2018. - V.9. - N.12. - P.85-91. * |
| В. В. Евдокимов и др. Подвижность сперматозоидов при воздействии перекиси водорода. АНДРОЛОГИЯ И ГЕНИТАЛЬНАЯ ХИРУРГИЯ 1. - 2015. - с.69-72. * |
| Руководство ВОЗ По исследованию и обработке эякулята человека ПЯТОЕ ИЗДАНИЕ. // Изд. "КАПИТАЛ ПРИНТ". - Москва. - 2012., стр.106-108, * |
| ЧАСТЬ 3. Новикова И.А. / Введение в клиническую лабораторную диагностику: учебное пособие // Вышэйшая школа. - Минск. - 2018. - 365 с., стр.314. * |
| Шатохина И.С. и др. / Уч. Пособие: ИССЛЕДОВАНИЕ ЭЯКУЛЯТА. - Москва. - 2014., стр.9-11. * |
| Шатохина И.С. и др. / Уч. Пособие: ИССЛЕДОВАНИЕ ЭЯКУЛЯТА. - Москва. - 2014., стр.9-11. Руководство ВОЗ По исследованию и обработке эякулята человека ПЯТОЕ ИЗДАНИЕ. // Изд. "КАПИТАЛ ПРИНТ". - Москва. - 2012., стр.106-108, ЧАСТЬ 3. Новикова И.А. / Введение в клиническую лабораторную диагностику: учебное пособие // Вышэйшая школа. - Минск. - 2018. - 365 с., стр.314. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114295452A (en) * | 2021-12-31 | 2022-04-08 | 力因精准医疗产品（上海）有限公司 | Human sperm morphological staining reagent and staining method |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Shaw et al. | 'Routine urinalysis': Is the dipstick enough? | |
| Williams et al. | Urine and stone analysis for the investigation of the renal stone former: a consensus conference | |
| Lammers et al. | Double-blind prospective study comparing two automated sperm analyzers versus manual semen assessment | |
| EP3321677B1 (en) | Blood test kit and analyzing method using the same | |
| Schumann et al. | Usefulness of macroscopic urinalysis as a screening procedure: a preliminary report | |
| US11079718B2 (en) | Specific malaria detection with digital holographic microscopy | |
| Tomlinson et al. | CASA in the medical laboratory: CASA in diagnostic andrology and assisted conception | |
| KR20180016512A (en) | Blood test kit and blood analysis method | |
| Howanitz et al. | Practices for identifying and rejecting hemolyzed specimens are highly variable in clinical laboratories | |
| Edition | Examination and processing of human semen | |
| RU2726207C1 (en) | Method for combined measurement of concentration of peroxidase-positive cells (neutrophilic granulocytes) and sperm cells in human ejaculate using variations based on cytochemical staining | |
| Lolekha et al. | Value of the anion gap in clinical diagnosis and laboratory evaluation. | |
| Mortimer | Laboratory standards in routine clinical andrology | |
| Sikka et al. | Standardized semen analysis and quality control management for multicenter male reproductive toxicology clinical trials | |
| Cooper | Semen analysis | |
| CN108133754A (en) | The forecasting system of bleeding risk after a kind of thrombolysis | |
| US20110312015A1 (en) | RAPID THROMBOCHEK TEST KIT BASED ON WHOLE BLOOD SCREENING TEST TO DETECT PLATELET HYPERAGGREGATION AT A TEMPERATURE OF 37ºC IN THE CLINICAL LABORATORY | |
| Moazzam et al. | From basic to contemporary semen analysis: limitations and variability. | |
| EP3321679B1 (en) | Blood analysis method | |
| Nordhoff et al. | Semen Analysis | |
| Ramos-Rincón et al. | Medical diagnosis in resource-poor tropical countries | |
| Randall | “This stud’sa dud!”-Canine semen evaluation protocols and pitfalls | |
| Srivastava et al. | Estimates of Sperm Motility | |
| RU2557983C1 (en) | Diagnostic technique for electromagnetic exposure | |
| Ridley et al. | Considerations for microscopic examination of urine |