RU2723907C1 - Способ идентификации наркотических и психоактивных веществ в биосубстрате человека - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к хроматографическому анализу химических соединений и может быть использовано для идентификации и выявления наркотических и психоактивных веществ в биосубстрате человека. Способ идентификации наркотических и психоактивных веществ в биологических объектах, в котором образец биосубстрата человека в виде органа или фрагмента мышечной ткани измельчают до состояния гомогената и осуществляют его хромато-спектрометрическое исследование с регистрацией сигнала масс-спектрометра в виде профиля пиков анализируемых веществ на хроматограмме с последующим определением принадлежности каждого пика анализируемому веществу и сравнением с эталонными аналитическими характеристиками искомого вещества, при этом образец биосубстрата человека в виде гомогената перед хромато-спектрометрическим исследованием подвергают щелочному гидролизу и экстрагируют неполярным растворителем из щелочной среды для обеспечения оптимального соотношения сигнал/шум для целевых аналитов, затем полученный экстракт упаривают и при образовании вязкого маслянистого осадка его реэкстрагируют водным кислым раствором и далее целевые вещества извлекают из полученного водного раствора неполярным растворителем при щелочных значениях рН, а хромато-спектрометрическое исследование проводят в режиме регистрации SIM-спектров, причем набор ионов для SIM-регистрации выбирают из условия выбора всех фрагментов масс-спектра с интенсивностью более 1%. Техническим результатом является расширение арсенала технических средств для идентификации наркотических и психоактивных веществ в организме человека и повышение чувствительности и точности определения целевых аналитов. 1 ил.

Description

Изобретение относится к хроматографическому анализу химических соединений и может быть использовано для идентификации и выявления наркотических и психоактивных веществ в биосубстрате человека, в частности, фентанила, являющимся опиоидным анальгетикоми и мощным агонист μ-опиоидным рецептором, а также близких к нему по химическому строению и свойствам (слабополярных, устойчивых к щелочному гидролизу) 3-метилфенанила, карфентанила, ЛСД, трамадола, кетамина, промедола, диазепама и т.п.

Известно, что фентанил (1-(2-фенилэтил)-4-(N-пропионил фениламино)-пиперидин или N-[1-(2-фенилэтил)-4-пиперидил]пропионанилид) является наркотическим препаратом 4-анилидопиперидиновой серии, превосходящим морфин в 50-100 раз по силе анальгетического воздействия. Фентанил в сочетании с нейролептическими препаратами (дроперидол) широко применяется в анестезиологии как средство общего наркоза. В медицинской практике используют водные 0,005% растворы цитрата фентанила. Фентанил оказывает быстрое сильное, но короткое анальгетическое действие и обладает минимальной острой токсичностью. К настоящему времени на базе фентанила синтезирован целый ряд эффективных препаратов для внутривенного наркоза (алфентанил, суфентанил, ремифентанил), а также ряд его гомологов и аналогов, содержащих тиофеновое кольцо. К фентанилу могут развиться привыкание и болезненное пристрастие (физиологическая зависимость), что предопределяет его возможное наркотическое применение. Длительное употребление фентанила вызывает наркоманию.

Фентанил обычно используется для внутривенного введения, но, как и героин, может быть выкурен или принят интраназально. Поэтому выявление и идентификация фентанила в организме человека является актуальной проблемой.

Наиболее сложной задачей является определение препаратов группы фентанила в биологических объектах (плазме крови, моче, тканях и т.д.).

Доза фентанила, достаточная для достижения глубокого хирургического наркоза составляет от 2 до 50 мкг/кг (суммарная доза не более 0,5 мг) [5, 6, 15, 20]. При этом содержание фентанила в крови не превышает уровня 0,1-50 нг/мл, что требует применения высокочувствительных методов анализа: хромато-масс-спектрометрии (ХМС), газо-жидкостной хроматографии с селективным детектированием, высокоэффективной жидкостной хроматографии в том числе с радиоактивным и масс-селективным детектированием.

На практике возможны ситуации получения ограниченного объема и даже отсутствия образцов плазмы крови и мочи, а возможность использования тканей не дает достоверных результатов, в связи с чем возникает проблема более эффективного использования тканей для выявления и идентификации фентанила и его аналогов.

Известен способ выявления и определения происхождения неизвестных веществ в спиртных напитках [RU 2392616, C1, G01N 30/02, 20.06.2010], при котором готовят пробу исследуемого напитка, подвергают ее ГХ/МС анализу, регистрируют масс-спектры и ассоциированные с ними хроматограммы и проводят распознавание компонентов сравнением с базой данных эталонных аналитических характеристик объекта, при этом, дополнительно готовят смесь стандартных веществ, и на ее основе готовят ряд модельных образцов путем введения стандартной смеси в интактный образец в разных концентрациях и анализируют образцы с известным введенным содержанием компонентов при температуре узла ввода 180°С, 250°С и 310°С, и при обнаружении в модельном образце неизвестное вещество квалифицируют как артефакт, образующийся при анализе, а при отсутствии его в модельных образцах готовят контрольный образец путем объединения всего ряда модельных образцов, анализируют его также при температуре узла ввода 180°С, 250°С и 310°С, регистрируют масс-спектры и ассоциированные с ними хроматограммы и при отсутствии в контрольном образце найденного неизвестного вещества его квалифицируют как маркер идентификации.

Недостатком способа является его относительно узкая область применения, поскольку он предназначен, преимущественно, для выявления и определения происхождения неизвестных веществ в суррогатных спиртсодержащих жидкостях или биологических объектах, содержащих летучие яды.

Известен также способ выявления неизвестных веществ в биологических жидкостях пациентов, принимавших наркотические или психотропные вещества [RU 2419788, С2, G01N 30/02, 27.09.2010], при котором готовят пробу исследуемого образца, подвергают ее ГХ/МС анализу, регистрируют масс-спектры образца, и ассоциированные с ними хроматограммы и проводят распознавание вещества сравнением с базой данных эталонных аналитических характеристик веществ, при этом, готовят три пробы исследуемого образца биологической жидкости - первую путем экстракции с перерастворением, вторую путем кислотного гидролиза и третью путем ферментативного гидролиза, причем, первую пробу подвергают ГХ/МС анализу в режиме градиента температуры 15°С/мин и данные анализируют путем сравнения с базой данных, по которой выявляют признаки неизвестного вещества (НВ), а именно - спектры с m/z, совпадающими с базовыми ионами наркотического или психотропного вещества или метаболитов, и содержание (НВ) в пробе, вторую пробу подвергают ГХ/МС анализу в режиме градиента температуры 25°С/мин и третью пробу подвергают ГХ/МС анализу также в режиме градиента температуры 15°С/мин и при увеличении содержания НВ в последних двух пробах по сравнению с первой, подвергают ГХ/МС анализу также в режиме градиента температуры 15°С/мин базовое наркотическое или психотропное вещество на присутствие в нем НВ, и при его отсутствии в базовом веществе, проверяют присутствие НВ в интактной биологической жидкости, для чего пробу ее готовят путем кислотного гидролиза и подвергают ГХ/МС анализу в режимах градиента температуры 15°С/мин и 25°С/мин и в случае обнаружения НВ в интактной биологической жидкости его квалифицируют как эндогенное, а при отсутствии признаков аликвоту первой пробы смешивают с пробой интактной биологической жидкости, готовят пробу путем кислотного гидролиза смеси, подвергают пробу ГХ/МС анализу в режимах градиента температуры 15°С/мин и 25°С/мин, определяют содержание НВ по результатам обоих режимов анализа и сравнивают его с содержанием НВ в первой пробе и при совпадающих значениях содержания НВ в указанных трех пробах квалифицируют НВ как новый, ранее неизвестный продукт метаболизма базового наркотического или психотропного вещества.

Недостатком этого способа также является его относительно узкая область применения, поскольку он предназначен, преимущественно, для выявления и определения происхождения неизвестных веществ в биологических жидкостях пациентов.

Кроме того, известен способ идентификации наркотических и психоактивных веществ в биологических жидкостях [RU 2390771, С12, G01N 30/86, 27.05.2010], при котором готовят пробу исследуемого образца, пропускают ее через хроматографическую колонку с неподвижной жидкой фазой и регистрируют сигналы детектора в виде профиля пиков анализируемых веществ на хроматограмме с последующим определением принадлежности каждого пика анализируемому веществу сравнением с эталонными аналитическими характеристиками вещества, при этом готовят две аликвоты пробы исследуемого образца - нативную и дериватизированную и каждую из них пропускают через колонку, по меньшей мере, в двух режимах кондиционирования параметров изменением градиента температуры, и, дополнительно, каждую из указанных аликвот пропускают через колонку с разделением потока при тех же режимах кондиционирования, далее регистрируют сигналы детектора на хроматограммах, выбирают на них пики со значениями асимметрии на 0,1, 0,5 и 0,6 высоты пика от основания ≤1,05, как наиболее соответствующие биномиальному распределению плотности вероятности и недеформированные влиянием фоновых компонентов, и идентифицируют определяемые вещества по отобранным пикам сопоставлением с эталонными аналитическими характеристиками определяемых веществ.

Недостатком этого технического решения является его относительно узкая область применения, поскольку он предназначен, преимущественно, для выявления и определения неизвестных веществ в организме человека на основе исследований его биологических жидкостей. Это сужает арсенал технических средств, которые могут быть использованы для идентификации наркотических и психоактивных веществ в организме человека или в условиях отсутствия его биологических жидкостей.

Наиболее близким по технической сущности к предложенному является способ идентификации наркотических и психоактивных веществ в сложных биологических матрицах организма человека [RU 2705932, С1, G01N 30/86, 12.11.2019], согласно которому готовят образец биосубстрата человека в виде срезов волос или ногтевых пластин и осуществляют его первое предварительное масс-спектрометрическое исследование с регистрацией сигнала детектора масс-спектрометра в виде профиля пиков анализируемых веществ на хроматограмме с последующим определением принадлежности каждого пика анализируемому веществу сравнением с эталонными аналитическими характеристиками вещества, при этом, после проведения первого предварительного масс-спектрометрического исследования последовательно проводят еще N последующих предварительных масс-спектрометрических исследований, перед каждым из которых образец биосубстрата промывают метанолом, при этом после проведения предварительных масс-спектрометрических исследований измельчают образец биосубстрата человека до состояния пудры до долей миллиметров и проводят заключительное масс-спектрометрическое исследование, причем если при последовательном проведении предварительных масс-спектрометрических исследований наблюдается последовательное уменьшение массы анализируемых веществ и существенное увеличение их массы при заключительном масс-спектрометрическом исследовании, то принимают решение об идентификации этих веществ в биосубстрате человека.

Особенностью этого технического решения является то, что, число (N+1) предварительных масс-спектрометрических исследований равно 6, при масс-спектрометрическом анализе используют один пластиковый флакон емкостью 50 мл, а при промывке образца биосубстрата внесение и отбор метанола из пластикового флакона используют разовые дозаторы, при предварительном масс-спектрометрическом анализе принимают во внимание принадлежность каждого пика анализируемого вещества при сравнении с эталонной аналитической характеристикой этого вещества при уменьшения его массы при последующем предварительном анализе относительно предыдущего предварительного анализа не менее 10%, о существенном увеличении массы анализируемого вещества при заключительном масс-спектрометрическом анализе судят относительно того вещества, масса которого при заключительном масс-спектрометрическом анализе превышает массу при последнем предварительном анализе не менее чем на 100%.

Недостатком этого технического решения является его относительно узкая область применения, поскольку он предназначен, преимущественно, для выявления и определения неизвестных веществ в организме человека через биосубстрат в виде срезов волос или ногтевых пластин.

Это сужает арсенал технических средств, которые могут быть использованы для идентификации наркотических и психоактивных веществ в организме человека, например, через образцы органов или мышечных тканей при отсутствии биологического материала другого вида.

Задачей, которая решается в изобретении, является разработка способа выявления и идентификации наркотических и психоактивных веществ в организме человека с использованием в качестве объекта исследований образцы (органы или фрагменты мышечных тканей) с целью расширения арсенала технических средств, которые могут быть использованы для идентификации наркотических и психоактивных веществ с одновременным повышением чувствительности и точности определения целевых аналитов.

Требуемый технический результат заключается в расширении арсенала технических средств, которые могут быть использованы для идентификации наркотических и психоактивных веществ в организме человека с одновременным повышением чувствительности и точности определения целевых аналитов.

Поставленная задача решается, а требуемый технический результат достигается тем, что, в способе, согласно которому образец биосубстрата человека в виде органа или фрагмента мышечной ткани измельчают до состояния гомогената и осуществляют его хромато-спектрометрическое исследование с регистрацией сигнала масс-спектрометра в виде профиля пиков анализируемых веществ на хроматограмме с последующим определением принадлежности каждого пика анализируемому веществу и сравнением с эталонными аналитическими характеристиками искомого вещества, согласно изобретению, образец биосубстрата человека в виде гомогената перед хромато-спектрометрическим исследованием подвергают щелочному гидролизу и экстрагируют неполярным растворителем из щелочной среды для обеспечения оптимального соотношения сигнал/шум для целевых аналитов, полученный экстракт упаривают и при образовании вязкого маслянистого осадка его реэкстрагируют водным кислым раствором и затем целевые вещества извлекают из полученного водного раствора неполярным растворителем при щелочных значениях рН, а хромато-спектрометрическое исследование проводят режиме регистрации SIM спектров, причем, набор ионов для SIM-регистрации выбирают из условия выбора всех фрагментов масс-спектра с интенсивностью более 1%.

На чертеже представлен пример хроматограммы при выявлении фентанила

Способ идентификации наркотических и психоактивных веществ в биосубстрате человека реализуется следующим образом.

Предложенный способ позволяет для решения поставленной задачи применить более простой, дешевый одноквадрупольный масс-спектрометрический детектор с газовым хроматографом без потери чувствительности, селективности и специфичности определения целевых аналитов.

Для этого путем щелочного гидролиза переводят экстрагируемые матричные компоненты в не экстрагируемую форму щелочным гидролизом, при котором достигают омыления липидов.

Для повышения чувствительности и специфичности детектирования для экстракции целевых аналитов применяют такой растворитель, который позволяет получить оптимальное соотношение степени экстракции целевых аналитов и фоновых компонентов. Например, использовать гексан, гептан, изооктан.

Для реэкстракции целевых аналитов в кислую среду проводят гидролиз, экстракцию в неполярный растворитель и последующую реэкстракцию.

Масс-спектрометрическое исследование проводят в режиме регистрации SIM спектров.

В качестве примера рассмотрим выявление в биосубстрате фентанила.

Для этого перед масс-спектрометрическим исследованием получают образец биосубстрата человека в виде гомогената. К 10 мл гомогената добавляют 20 мл деионизованной воды, 2 мл 10 М NaOH и выдерживают 20 мин при комнатной температуре, гидролизат экстрагируют 20 мл гексана или гептана, центрифугируют при 3000 об/мин, органический слой упаривают досуха и переносят жировой слой в виалу вместимостью 4 мл, добавляют 2 мл 0.1 М НСl и экстрагируют на вибромиксере в течение 1 мин, водный слой отделяют, доводят до рН 7-9 водным раствором аммиака и экстрагируют 2 мл гексана или гептана, органический слой отбирают и упаривают досуха, после чего сухой остаток дериватизируют или растворяют в 150 мкл эти л ацетата ацетонитрила и водят 1 мкл раствора в хроматограф.

При этом, при необходимости перед экстрагированием 20 мл гексана или гептана в гидролизат каплями вводят 100-200 мкл этанола 95%, а перед дериватизацией к сухому остатку добавляют смесь 30 мкл BSTFA и 70 мкл этилацетата и нагревают в течение 15 мин при 70°С с последующим охлаждением до комнатной температуры.

При использовании такой процедуры подготовки пробы гексан или гептан позволяют извлечь из щелочного гидролизата вещества группы фентанила и другие психоактивные вещества, содержащие азот в составе молекулы, устойчивые к щелочному гидролизу и сходные по полярности. В этом случае фоновые вещества экстрагируются в минимальной степени, что обеспечивает хорошее соотношение полезного сигнала и фона матрицы и позволяет достичь высокой чувствительности масс-спектрометрического исследования.

Другие растворители экстрагируют фоновые вещества в большей степени и чувствительность ухудшается. При твердофазной анализе наблюдалось загрязнение сорбента фоновыми липидными компонентами центрифугированной пробы, что не позволяло провести процесс твердофазной экстракции до конца.

На чертеже представлена хроматограмма, полученная на приборе в режиме SIM-SPECTRUM, где совпадение идентифицирующего и библиотечного спектров составляет 83%.

Способ идентификации фентанила в сложных биологических матрицах организма человека реализуется следующим образом.

Предварительно получают образец мышечной ткани человека

Примеры реализации способа.

Хромато-масс-спектрометрическое исследование биообъектов на наличие фентанила и его аналогов.

Измельчали ткань человека до состояния гомогената с частицами до долей миллиметра и к его пробе в объеме 10 мл гомогената добавляли 20 мл деионизованной воды, 2 мл 10 М NaOH и выдерживают 20 мин при комнатной температуре.

Гидролизат экстрагировали 20 мл гексана или гептана, центрифугирировали при 3000 об/мин и органический слой упаривали досуха и перенесли жировой слой в виалу вместимостью 4 мл, после чего добавляли 2 мл 0.1 М НСl и экстрагировали на вибромиксере в течение 1 мин.

Далее водный слой отделяли, доводили до рН 7-9 водным раствором аммиака и экстрагировали 2 мл гексана или гептана, после чего органический слой отбирали и упаривают досуха, а сухой остаток дериватизироали или растворяли в 150 мкл этил ацетата ацетонитрила и водили 1 мкл раствора в инжектор хроматографа.

При этом, перед экстрагированием 20 мл гексана или гептана в гидролизат при необходимости каплями вводили 100-200 мкл этанола 95%. Кроме того, перед дериватизацией к сухому остатку при необходимости добавляли смесь 30 мкл BSTFA и 70 мкл этилацетата и нагревали в течение 15 мин при 70°С последующим охлаждением до комнатной температуры.

Идентификацию с использованием хроматограмм проводят, преимущественно, в режиме регистрации "SIM-SPECTRUM". Детектирование в режиме SIM имело существенные ограничения, поскольку не позволяло регистрировать полный спектр вещества, пригодный для библиотечной идентификации из-за технических возможностей, которые сняты в современных приборах. Поэтому о наличии определяемого вещества в пробе судят по соответствию измеренного и библиотечного времен удерживания, а также по соотношению площадей детектируемых трех фрагментных ионов. Однако, во многих случаях для подтверждения наличия вещества в пробе необходим именно полный спектр, который невозможно получить при детектировании малых концентраций. Для решения этой проблемы используют регистрацию в режиме "SIM-SPECTRUM", что позволяет обеспечить сканирование полного спектра целевого вещества с чувствительностью близкой к чувствительности детектирования в режиме мониторинга выбранных ионов (SIM). Для этого создают SIM метод, в который вносят не только интенсивные фрагменты масс-спектра, но и минорные, а также изотопные ионы, составляющие масс-спектр вещества.

Современные версии масс-спектрометрических детекторов позволяют регистрировать до 50 значений m/z в одном сегменте без потери чувствительности детектирования, что достаточно для регистрации полного масс-спектра, который складывается из ионов, выбранных для мониторинга в режиме SIM. Подобный подход наиболее эффективен для надежной идентификации малых концентраций веществ, имеющих неспецифичные масс-спектры.

В результате мы получаем высокую чувствительность на простом одноквадрупольном газовом хромато-масс-спектрометре, сравнимую с чувствительностью, которую можно было достичь только на тандемном трехквадрупольном детекторе. Такая чувствительность необходима, так как вещества группы фентанила употребляют в малых дозировках в 500-1000 раз меньше, чем героин.

Таким образом, в предложенном способе достигается требуемый технический результат, который заключается в расширении арсенала технических средств, которые могут быть использованы для идентификации наркотических и психоактивных веществ в организме человека с одновременным повышением чувствительности и точности определения целевых аналитов.

Claims (1)

1. Способ идентификации наркотических и психоактивных веществ в биологических объектах, согласно которому образец биосубстрата человека в виде органа или фрагмента мышечной ткани измельчают до состояния гомогената и осуществляют его хромато-спектрометрическое исследование с регистрацией сигнала масс-спектрометра в виде профиля пиков анализируемых веществ на хроматограмме с последующим определением принадлежности каждого пика анализируемому веществу и сравнением с эталонными аналитическими характеристиками искомого вещества, отличающийся тем, что образец биосубстрата человека в виде гомогената перед хромато-спектрометрическим исследованием подвергают щелочному гидролизу и экстрагируют неполярным растворителем из щелочной среды для обеспечения оптимального соотношения сигнал/шум для целевых аналитов, затем полученный экстракт упаривают и при образовании вязкого маслянистого осадка его реэкстрагируют водным кислым раствором и далее целевые вещества извлекают из полученного водного раствора неполярным растворителем при щелочных значениях рН, а хромато-спектрометрическое исследование проводят в режиме регистрации SIM-спектров, причем набор ионов для SIM-регистрации выбирают из условия выбора всех фрагментов масс-спектра с интенсивностью более 1%.

Images